DE68927854T2

DE68927854T2 - Insulinomimetrische eigenschaften und insulin-rezeptor-bindestellen-peptide

Info

Publication number: DE68927854T2
Application number: DE68927854T
Authority: DE
Inventors: Meyts Pierre De
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 1988-06-30
Filing date: 1989-06-30
Publication date: 1997-10-16
Anticipated expiration: 2009-07-01
Also published as: EP0378671B1; AU3982289A; DE68927854D1; JPH03501487A; AU630882B2; EP0378671A1; WO1990000562A1; EP0378671A4

Description

Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part-Anmeldung Serial No. 213,918, eingereicht am 30. Juni 1988 mit dem Titel "Insulin Receptor Binding Site", und auch eine Continuation- in-part-Anmeldung Serial No. 292,099, eingereicht am 30. Dezember 1988, mit dem Titel "Insulinomimetic and Insulin Receptor Binding Site Peptides". Die Beschreibung, Zeichnungen und Ansprüche dieser Anmeldungen werden durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen.

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf die Aminosäurerestsequenzen, die das menschliche Insulinmolekül oder das insulinähnliche Wachstumsfaktor I(IGF-I)-Molekül binden, und auflineare mit insolinmimetischen Eigenschaften ausgestattete Peptide, die gleiche oder ähnliche Sequenzen einschließen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die cDNA sowohl des Insulins und des IGF-I-Rezeptors sind kloniert und sequenziert worden. Die Expression in Säugetierzellen der biologisch aktiven Rezeptoren ist erreicht worden. Vergleiche US-A-4,761,371; Ebina, et al., Cell 46:747-758 (1985); Ullrich, et al., Nature 313:756-761 (1985) und Ullrich, et al., EMBC J. 5: 2503-2512 (1986). Ebina und Ullrich verwenden verschiedene Sequenzzahlen. Die Ullrich Sequenzzahlen werden ausschließlich hier verwendet.
Die Rezeptoren sind Glykoproteine, welche aus einem Heterotetramer zwei extrazellulärer α-Untereinheiten und zwei transmembraner β-Untereinheiten bestehen, welche sowohl einen extrazellulären als auch einen intrazellulären Abschnitt haben. Die α-Untereinheiten enthalten die Insulinbindungsstelle. Es ist einleuchtend, daß jede α-Untereinheit eine Bindungsstelle enthalten kann. Der Insulinrezeptor hat eine Homologie mit dem IGF-I-Rezeptor und mit dem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor, dem menschlichen c-erb-2-Onkogen und der v-ros-onkogen kodierten Tyrosinkinase.
Die Kenntnis der Rezeptorstruktur ist auf die sich von c-DNA- Klonieren herleitende Primärsequenz beschränkt. Diese Information hat wenig Anhaltspunkte hinsichtlich der genauen Lokalisierung der Insulin- oder IGF-I-Bindungsdomän der α-Untereinheiten erzeugt, von denen jede mehr als 700 Aminosäurereste enthält. Es ist keine definitive Information hinsichtlich der Sekundär- oder Tertiärstruktur der Rezeptoren erhältlich.
Die Entdeckung der insulinähnlichen Peptide ist eine lange große Herausforderung für die diabetisbezogene pharmazeutische Industrie gewesen. Anscheinend ist die einzige vorhergehende Beschreibung eines linaren Peptids, das auf eine insulinähnliche Aktivität hinweist, in den Veröffentlichungen von Weitzel, et a., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 352:1005-1013 (1971); ibid., 1735-1738 (1971 ; ibid., 357:187-200 (1976) auffindbar. Diese Veröffentlichungen berichten, daß der terminale Abschnitt der Insulin B-Kette aktiv ist. Diese Behauptung wurde nie durch andere bestätigt. Geradezu gegensätzlich ist der C-terminale Abschnitt de B-Kette (B23-30) als Negativkontrolle in Experimenten verwendet worden, welche die insulinähnlichen Peptide der vorliegenden Erfindung zeigen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt die Identifizierung der bei der Bindung von Insulin- oder IGF-I-Molekülen involvierten Rezeptordomänen, die Aminosäuresequenzen solcher Domänen und ihre Sekundär- und Tertiärstruktur bereit. Sie beinhaltet natürliche und synthetische Fragmente solcher Domänen und Sequenzen, welche wirksam bei der Durchführung der Bindung und Erkennung des Insulin- oder IGF-I-Moleküls durch die Rezeptoren sind, sowie physikalische und grafische Darstellungen dieser Domänen.
Ein ertragreicher Aspekt der Erfindung ist die Entdeckung, daß die menschliche Insulinrezeptordomäne per se insulinomimetisch ist und daß sie kürzere Sequenzen enthält, welche ähnlich ausgebildet sind. Synthetische und gereinigte natürliche Aminosäuresequenzen, von denen viele insulinomimetisch sind und insgesamt oder teilweise eine Bindungsstelle für das menschliche Insulin- und IGF-I-Molekül darstellen, werden bereitgestellt.
Die Erfindung beinhaltet die Entdeckung, daß die Rezeptordomäne stark in Lösung aggregiert mit offensichtlicher Fähigkeit einen intakten Insulinrezeptor an Zellen zu binden und ihn mit erhaltener insulinähnlicher Aktivität zu aktivieren, e.g. die Aktiverung der Lipogenese in isolierten Rattenadipozyten.
Ein andere Aspekt der Erfindung beinhaltet Derviate und Modifikationen solcher Peptide, zum Beispiel gekürzte Sequenzen der für die Bindung oder insulinomimetische Wirkung und Zyklisierung oder Derivatisierung erforderlichen Minimalstruktur, um im gastrointestinalen Trakt die Löslichkeit zu vermitteln oder zu erhöhen.
Die insulinomimetischen Peptide der Erfindung und deren Derivate und Modifaktionen können Diabetispatienten anstelle von Insulin, entweder subcutan, intranasal oder oral verabreicht werden. Diese Peptide der Erfindung sind nützlich in biochemischen in vitro- und in vivo-Experimenten, um den Mechanismus der Insulinaktivität zu studieren.
Nachfolgend sind die physikalischen und grafischen Darstellungen der räumlichen oder dreidimensionalen Struktur dieser Peptide beispielhaft angegeben. Eine mögliche Verwendung solcher Darstellungen ist als Schablone für die Entwicklung insulinomimetischer und anderer Arzneimittel.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1A ist eine Computerdarstellung der Insulindimergrenzfläche.
Figur 1B ist ein Computermodell der Insulinsequenz B19-30 eines Insulinmonomers an der Dimergrenzfläche, die durch Sequenz 83-94 des Insulinrezeptors ersetzt ist.
Figur 2 zeigt die Homologie verschiedener Rezeptorfragmente mit dem C-terminalen Ende der Insulin B-Kette.
Figur 3 ist eine Computerdarstellung der Sekundärstruktur und des Wasserbehandlungsprofils der α-Untereinheit.
Figuren 4A-4D sind Computerdarstellungen aus 4 verschiedenen Winkeln der α-Untereinheitensequenz, welche die Reste 83-94 einschließt.
Figuren 5A-5D sind ähnliche Computerdarstellungen von 2 verschiedenen Winkeln der Gesamtdomäne einschließlich der Reste 83-94 in einer β-Faltblattstruktur und Resten 95-103 in einer α-Helix entsprechend Figur 3.
Figur 6 ist eine Insulinauswahlkurve mit einem synthetischen Rezeptorpeptid.
Figur 7 zeigt die Homologie zwischen den C-terminalen Enden des Insulins und der IGF-I-B-Kette und Rezeptoren für Insulin, IGF-I und EGF.
Figuren 8A und 8B sind grafische Darstellungen des Insulin- Insulin-Dimerpaars und der Insulin-Insulin Rezeptordomäne einschließlich der Reste 83-94. Figur 8C ist eine grafische Darstellung des IGF-I-Rezeptordomän-Insulinpaars. In jeder der Figuren erscheint die grafische Darstellung des "Insulins" von rechts.
Figuren 9A-D sind grafischen Darstellungen aus 4 verschiedenen Winkeln der IGF-I-Rezeptordomäne, einschließlich der Reste 77- 97.
Figur 10 zeigt den insulinomimetischen Effect gewisser Rezeptorpeptide.
Figur 11 zeigt den Konzentrationsbereich über welchen ein Peptid der Sequenz 1 an Insulin bindet.
Figur 12 zeigt, daß die lipogene Aktivität eines Sequenz V- Peptids durch den polyklonalen Anti-Insulinantikörper Sigma #1-8510 inaktiviert wird.
Figur 13 zeigt, daß die Stimulierung der Fettzellenlipogenese durch das Peptid des Sequenz V durch Staurosporin und Sphingosin blockiert wird.
Die biografische Computersoftware wurde verwendet, um alle computererzeugten grafischen Darstellungen der Figuren zu erzeugen.

IDENTIFIZIERUNG DER INSULINREZEPTORBINDUNGSDOMÄNE

Die Insulinmolekul B-Kettenreste B23-26, Gly-Phe-Phe-Tyr sind direkt bei einer Rezeptorbindungsdomäne involviert. Es ist auch bekannt, daß die C-terminalen Abschnitte der monomeren Insulin B-Ketten inter se binden, um das Insulindimer zu bilden. Aus einer Studie der Dimergrenzfläche (vergleiche Figur 1A) kann geschlossen werden, daß eine Rezeptorsequenz für die Interaktion in einer ähnlichen Weise mit dem gleichen C- terminalen Abschnitt des Insulinmonomers
(i) zwei oder drei Phe- oder Tyr-Ketten enthalten würde,
(ii) eine gewisse Homologie mit dem C-terminalen Ende der Insulin B-Kette haben kann,
(iii) in einer hydrophoben Umgebung sein würde, und
(iv) in einer β-Faltblattsekundärstruktur sein würde.
Eine Untersuchung der bekannten Sequenz der Rezeptor α-Untereinheit zeigt verschiedene Dehnungen, die zumindest zwei oder drei Phe- oder Tyr-Ketten in enger Nachbarschaft enthalten. Von diesen wurde die 88-91 (Phe-Phe-Asn-Tyr)-Dehnung ausgewählt, da:
(i) Wie Figur 2 zeigt, die Sequenz 84 bis 91 fünf homologe Reste zu den invarianten oder zumeist invarianten Insulinresten 20 bis 26 hat.
(ii) Wie Figur 3 zeigt, eine computererzeugte Sekundärstruktur und ein Wasserbehandlungsprofil der α-Untereinheit zeigt, daß das Rezeptorsegment 78-94, das die Phe-Phe-Asn-Tyr-Sequenz enthält, ein β-Faltblatt ist, das von einem helicalen Abschnitt 95-103 gefolgt wird, und daß die gesamte Sequenz stark hydrophob ist.
Ein synthetisches 18 Aminosäurepeptid entsprechend der Rezeptorsequenz 88-103 wurde auf einem festen Träger unter Verwendung der p-Alkoxybenzylesterankerbindung von Wang, S.S., J.Am.Chem.Soc. 95: 1328-1333 (1973) synthetisiert. Die Aminosäuren waren durch die N-Fluorneylmethoxycarbonylamino (Fmoc)- Gruppe aminogeschützt. Die Seitenketten waren mit t-Butyl oder anderen geeigneten Schutzgruppen geschützt. Nach der Synthese wurde das Peptid von dem festen Träger durch geeignete Lösungsmittel enthaltende Trifluoressigsäure und andere das Peptid während der Spaltung schützende Reagenzien abgespalten. Das Peptid wurde anschließend durch eine Sephadex-G-10-Säule hindurchgeleitet und die Endreinigung unter Verwendung einer C-18-Säule auf einem HPLC-System erreicht. Das genaue Molekulargewicht des Peptids wurde durch ein Hochauflösungsmassenspektrometer bestätigt. Es wurde als hoch hydrophob gefunden, wie es durch die im wesentlichen Unlöslichkeit in weniger als 90 % Dimetyhlsulfoxid (DMSO) bewiesen wurde. In Wasser bildete das Peptid in hohen Konzentrationen eine gelähnliche Suspension und präzipitierte schließlich als transparent kristallin erscheinende Strukturen.
Die Aminosäurereste in diesem Peptid sind wie durch die folgende Sequenz I dargestellt:
Zum Test der Insulinbindung wurde eine Wassersuspension des Peptids bei Raumtemperatur mit einem Tracer aus ¹²&sup5;I-Insulin inkubiert, gefolgt von einfacher Zentrifugation. Von dem Peptid wurde gefunden, daß es bis 30 % des Tracers bindet. Die Bindung war durch einen Überschuß unmarkierten Insulins ersetztbar (vergleiche Figur 6). Die apparente Dissoziiationskonstante war 6 x 10&supmin;&sup7; M. Die unspezifische Bindung war vernachlässigbar. Das Peptid band auch ¹²&sup5;I-IGF 1, aber weniger gut, während ¹²&sup5;I-EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) und ¹²&sup5;I-hGH (menschliches Wachstumshormon) keine spezifische Bindung zeigten. Diese Daten entsprechen gut den Vorhersagen der Sequenzhomologien in Figur 7.
Die Erfindung beinhaltet Modifikationen der Sequenz 1, in welchen zusätzliche Reste entsprechend den vorhergehenden und nachfolgenden Abschnitten der Rezeptor-α-Untereinheit vorliegen. Zum Beispiel beinhaltet die Erfindung eine Sequenz II, welche ebenfalls die Reste 83-85 der Insulinrezeptor α-Untereinheit wie folgt beinhaltet:
Die Erfindung beinhaltet auch eine Modifikation des Sequenz I, in welcher ein oder mehrere zusätzliche Rest(e) an einem oder beiden Ende(n) der Sequenz hinzugefügt werden, um die Löslichkeit zu erhöhen. Spezifisch betrachtet die Erfindung eine Sequenz III, welche
beinhaltet, in welcher x und y jeweils 0, 1 oder 2 sind, unter der Voraussetzung, daß zumindest x oder y 1 ist.
Eine zusätzliche Sequenz IV ist aus ähnlichen Löslichkeitsgründen synthetisiert worden:
Wie es sich aus der Untersuchung ergibt, wurde Sequenz IV durch Einschluß der Rest 83-85 hergestellt, Hinzufügung eines LYS am N-Terminus und Ersatz des negativ geladenen GLU in Position 103 durch LYS, wodurch zwei positiv geladene Reste, LYS-ARG und LYS-LYS jeweils am N- und C-Terminus gebildet wurden.
Die Sequenzen V, VI und VII sind Modifikationen der Sequenz IV, die durch Ersatz von PHE-PHE bei 88-89 durch LEU-PHE (Sequenz V), PHE-LEU (Sequenz VI) und LEU-LEU (Sequenz VII) erhalten wurden.
Die Erfindung beinhaltet weiter Sequenzen I bis VII, die an Polystyrol-Beads oder andere feste Träger gekoppelt sind, zur Verwendung bei Festphasen-Assays und an Keyhole-Limpet-Hemocyanin zur Verwendung bei der Herstellung von Sequenzantikörpern. Eingeschlossen ist auch die Synthese eines Oligonucleotids, das den Sequenz I- oder II-Peptiden entspricht, und ihre Expression in E. coli als Teil eines Fusionsproteins mit zum Beispiel β-Galactosidase oder Dihydrofolatreduktase. Die Fusion kann auch an einer synthetischen IGG-Bindungsdomäne von Staphyloccocus aureus Protein A (vergleiche Lowenalder, B., et al. Gene 58:87-97 (1987)) erfolgen, um Sequenzantikörper für die Verwendung bei der Durchführung von physikalischen Studien wie Röntgenstrukturanalyse zu erzeugen.
Figur 1B zeigt den Ersatz der Seitenketten der Reste CYSB¹&sup9;, GLUB²¹, GLYB²³ und B26-30 eines der in der Figur 1A gezeigten Insulinmonomers durch die Seitenketten der Reste, die homologe Positionen in der Insulinrezeptorsequenz besetzen, spezifisch durch ARG 83, SER 85, LEU 87 und ASN-TYR-ALA-LEU-VAL. Insbesondere zeigt Figur 1B ein molekulargrafisches Modell der Insulinsequenz B19-B30 eines Insulinmonomers an der Dimergrenzfläche, das durch Sequenz 83-94 des Insulinrezeptors ersetzt wurde. Die Ähnlichkeit zu der Insulindimergrenzfläche, Figur 1A, ist bemerkenswert.
Diese Daten zeigen, daß die Reste 83-94 der α-Untereinheit des Insulinrezeptors zumindest einen wirksamen Abschnitt einer Domäne beinhalten, der bei der Bindung der aktiven Seite des Insulinmoleküls involviert ist.

IDENTIFIZIERUNG DER IGF-I-REZEPTORBINDUNGSDOMANE

Die Involvierung der Sequenz VII der IGF-I-Rezeptorreste 77- 97, die homolog der Insulinrezeptorsequenz 83-103 bei der IGF- I-Bindung sind, wird durch das Nachfolgende bewiesen:
(i) Insulin und IGF-I binden jeweils an die anderen Rezeptoren.
(ii) Die Sequenz B23-26 des Insulinmoleküls ist in dem IGF-I- Moleküls konserviert (GLY-PHE-TYR-PHE anstelle von GLY-PHE- PHE-TYR).
(iii) Die Sequenz 83-97 des Insulinrezeptors ist im IGF-I- Rezeptor hoch konserviert.
(iv) Das synthetische Peptid (Sequenz 1) bindet IGF-I.
(v) Figur 8C, eine grafische Darstellung, zeigt den Ersatz der Seitenketten der Reste CYSB¹&sup9;, GLUB²¹, GLYB²³ und B²&sup6;&supmin;³&sup0; einer der in Figur 1A gezeigten Insulinmonomere durch die Seitenketten der Reste, die homologe Positionen in der IGF-I-Rezeptorsequenz besetzen, spezifisch durch ARG, TRP, LYS, LEU und ASN-TYR-ALA-LEU-VAL, und zeigt auch eine bemerkenswerte Ahnlichkeit zu der Insulindimergrenzfläche.
Demgemäß beinhaltet die Erfindung auch die folgende Sequenz VII des IGF-I-Rezeptors:
Die Erfindung kann verwendet werden, um weitere physikalische und grafischen Darstellungen der Sequenz VIII bereitzustellen, um bei der Planung von Arzneimittel verwendet zu werden.

DEMONSTRATION DER INSULINOMIMETISCHEN EIGENSCHAFTEN

Die insulinomimetischen Eigenschaften der Peptide der Erfindung werden demonstriert durch:
1. Die Fähigkeit dieser Peptide im Vergleich zu Insulin, die Inkorporation von 3-[³H]-Glucose in die Lipide isolierter Rattenadipozyten zu stimulieren.
2. Eine Demonstration, daß das Insulinoctapeptid B23-30 vollständig inaktiv in dem gleichen Lipogenese-Assay (Figur 10) ist.
3. Eine Demonstration, daß die lipogenetische Aktivität der Peptide durch einen polyklonalen Insulinantikörper inaktiviert wird, was auf ein strukturell ähnliches Peptid und Insulinepitope (Figur 12) hinweist.
4. Die lipogenetische Aktivität der Peptide wird ähnlich der des Insulins durch die Kinase C-Inhibitoren Sphingosin und Staurosporin inhibiert, was auf ähnliche Wege der Wirkung (Figur 13) hinweist.
5. Ein Peptid mit der Insulinrezeptorsequenz 81-91 ist vollständig inaktiv, was darauf hinweist, daß der Bereich 92- 103 wichtig für die Beobachtung des insulinomimetischen Effekts ist. Darüberhinaus blockiert ein Antikörper gegen die Peptidsequenz 81-91 nicht die lipogenetische Wirkung der Sequenz V.

Beispiel 1

Vergleichender Lipogenese-Assay

Die Fähigkeit der Sequenzen IV bis VII zur Stimulierung der Inkorperation von 3-[³H]-Glucose in Lipide isolierter Rattenadipozyten wurde mit der des Insulins verglichen.
Der Lipogenese-Assay wurde gemäß Smal, et al., J.Biol.Chem. 262:11071-11079 (1987) durchgeführt. Präparierte Epididymis- und retroperitonale Fettpolster wurden unter heftigem Schütteln bei 37ºC während 30 Minuten mit Kollagenase (1,0 mg/ml) in Krebs-Ringer-Heps (KRH)-Puffer, pH 7,4, 35 mg/ml dialysiertem Rinderserumalbumin (BSA), 0,27 mM Glucose verdaut. Nach Filtration durch Käseleinen und vier Waschungen in KRH mit 10 mg/ml BSA wurden die Adipozyten während 4 Stunden bei 37ºC in demselben Puffer präinkubiert.
Der Lipogenese-Assay wurde 3-fach in 6 ml Polyethylenviolen durch sukzessive Zugabe von 400 ml der Adipozytensuspension (80 x 10³ Zellen/ml), 50 µl KRH-Puffer, pH 7,4 (1% BSA, 0,27 mM Glucose) ohne Hormon (Basislipogenese) oder mit Insulin oder mit sich von Rezeptor ableitenden Peptiden bei den angegebenen Konzentrationen und 50 µl 3-[³H]-Glucose in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml durchgeführt. Die Violen wurden 2 Stunden bei 37ºC unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Inkubation wurde durch die Zugabe von 5 ml/Röhre eines Toluolszintillators (1 Liter Toluol + 0,3 g 1,4bis[2-(4- methyl-5-phenyloxazolyl)]benzol und 5 g 2,5-Diphenyloxazol unter heftigem Schütteln (30 s, um die Zellen zu brechen) unterbrochen, gefolgt durch eine Ruhepause von zumindest einer Stunde, um die Extraktion der Lipide in die Toluolphase vor dem Zählen zu ermöglichen. Die Zählwirksamkeiten für die verschiedenen Proben wurden durch intere Standardizierung mit gequenchten tritierten Standards gemessen. Die Inkorporation von D-[3-³H]-Glucose in die Lipide wird in cpm x 10&supmin;³/Röhre ± 1 Standardabweichung ausgedrückt.
Wie in Figur 10 gezeigt, stimulierten alle 4 Peptide die Lipogenese in einem Ausmaß nahe der Insulinwirkung. Die relative Fähigkeit der 4 Peptide variiert in einem gewissen Ausmaß von Experiment zu Experiment, möglicherweise aufgrund einer etwas beschränkten Löslichkeit. Die Konzentration der erforderlichen Peptide war erheblich höher als die des Insulins (beachte die zwei verschiedenen horizontalen Skalen).

Beispiel II

Peptidbindungskonzentrationsbereich

Der Konzentrationsbereich, über den ein Peptid der Sequenz 1 an Insulin bindet, ist in Figur 11 gezeigt, ist ähnlich zu dem Konzentrationsbereich, über den die Peptide IV bis VII als aktiv gesehen werden, wie er in Figur 10 gezeigt ist.
Um die durch Figur 11 gezeigten Daten bereitzustellen, wurde ¹²&sup5;I-Insulin (1 x 10&supmin;¹¹ M) über Nacht bei Raumtemperatur in der Abwesenheit oder Gegenwart von 10 µg/ml unmarkiertem Insulin mit den angezeigten Konzentrationen der Peptide in Assaypuffer (100 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5 mM KCL, 1,2 mM MGSO&sub4;, 1 mM EDTA, 10 mM Glucose, 15 mM NaC&sub2;H&sub3;O&sub2;, 1 % Rinderserumalbumin, pH 7,6) inkubiert. Gebundener und freier Tracer wurde durch Zentrifugieren der Peptidsuspension bei 10 000 rpm während 10 Minuten in einer Becknan Mikrofuge abgetrennt. Die Pellets wurden in einem γ-Counter gezählt.

Beispiel III

Inhibierung der Peptidelipogeneseaktivität durch Anti-Insulin- Antikörper

Figur 12 zeigt, daß die lipogenetische Aktivität eines Sequenz V-Peptids durch den polyklonalen Anti-Insulin-Antikörper Sigma #1-8510 inaktiviert wird.
Um die durch Figur 12 dargestellten Daten bereitzustellen, wurde ein Lipogenese-Assay in der Abwesenheit des Hormons (Basis) oder mit 10 µg/ml Insulin oder 10 µg/ml Peptid V, in der Abwesenheit oder Gegenwart eines Anti-Insulin-Antikörpers bei einer Verdünnung von 1:500 wie er gemäß Beispiel 1 im Detail beschrieben wurde, durchgeführt.

Beispiel IV

Inhibierung der peptidlipogenen Aktivität durch Kinase C- Inhibitoren

Die anhängige Anmeldung Serial No. 216,379 von 08. Juli 1988 ist vollständig durch Bezugnahme aufgenommen. Diese Anmeldung lehrt, daß die Stimulierung der Fettzellenlipogenese von Insulin reversibel durch die Wirkung eines Kinase C-Inhibitors wie Kinase C oder Staurosporin blockiert wird.
Figur 13 zeigt ein vergleichbares Ergebnis mit dem Peptid der Sequenz V.
Zum Erzeugen der in Figur 13 gezeigten Daten wurde ein Lipogenese-Assay in der Abwesenheit eines Hormons (Basis), oder mit 10 µg/ml Insulin oder 100 µg/ml des Peptids V, in der Abwesenheit oder Gegenwart des Kinaseinhibitors Staurosporin (10 µg/ml) oder Sphingosin (100 µM), wie er in Detail gemäß Beispiel 1 beschrieben ist, durchgeführt.

Beispiel V

Aktivität der Insulinrezeptorsequenz 92-103

Dieses Beispiel zeigt die insulinomimetische Aktivität der Insulinrezeptorsequenz 92-103 (Sequenz IX):
Der erste Aspekt dieses Beispiels ist, daß die Insulinrezeptorsequenz 81-91 lipogenetisch völlig inaktiv ist. Wenn das Peptid mit der Sequenz 81-91 anstelle der Peptide IV bis VII in dem in Beispiel 1 beschriebenen Experiment verwendet wird, wird die Lipogenese nicht über die Basis hinaus stimuliert.
Ein zweiter Aspekt des Beispiels ist, daß ein Antikörper gegen Peptid 81-91 unfähig ist, die Wirkung des Peptids der Sequenz V zu blockieren.
Eine weitere spezifische Ausführungsform der Erfindung beinhaltet synthetische gereinigte Peptidesequenzen entsprechend der Sequenz IX und insulinomimetische Arzneimittel, die solche Peptide enthalten.
Die Erfindung kann verwendet werden, um:
ein dreidimensionales Molekülmodell einschließlcih der Reste 83-94 der α-Untereinheit des Insulinrezeptors, wie er in jeder der Figuren 4A, 4B, 4C oder 4D gezeigt ist,
ein dreidimensionales Molekülmodell, das zumindest soviel des durch die Figuren 4A, 4B, 4C, 4D, 5A oder 5B gezeigten grafischen Modells enthält, wie es wirksam ist, um das menschliche Insulinmolekül zu binden,
eine grafische Darstellung, welche durch einen Computer erzeugt werden kann, von zumindest so vielen der Reste 83-94 der α-Untereinheit des Insulinrezeptors, wie er wirksam ist, um das menschliche Insulinmolekül zu binden,
die Computer erzeugten grafischen Darstellungen gemäß den Figuren 4A, 4B, 4C oder 4D,
ein dreidimensionales Molekülmodell einschließlich der Reste 77-97 des IGF-I-Rezeptors, wie er durch jede der Figuren 9A, 9B, 9C oder 9D gezeigt ist,
ein dreidimensionales Molekülmodell, das zumindest so viel des durch die Figuren 9A, 9B, 9C oder 9D gezeigten grafischen Modells enthält, wie es wirksam ist, um das IGF-I-Molekül zu binden,
eine grafische Darstellung, welche durch einen Computer erzeugt werden kann, von zumindest so vielen der Reste 77-97 des IGF-I-Rezeptor, wie er wirksam ist, um das menschliche Insulinmolekül zu binden,
die Computer erzeugte grafische Darstellung gemäß den Figuren 9A, 9B, 9C und 9D, und
ein dreidimensionales Molekülmodell, das zumindest so viel des durch die Figuren 5A oder 5B gezeigten grafischen Modells enthält, wie es wirksam ist, um das menschliche Insulinmolekül zu binden,
bereitzustellen.

Claims

-1. Gereinigtes natürliches oder synthetisches Peptid, dessen Aminosäuresequenz die Sequenz 1:

oder die Sequenz II:

oder die Sequenz III:

ist, worin x und y jeweils 0, 1 oder 2 sind, unter der Voraussetzung, daß zumindest x oder y 1 ist,

das das menschliche Insulinmolekül bindet und insulinmimetische Aktivität hat, oder ein aktives Fragment irgendeiner der Sequenzen I, II oder III.
2. Nicht natürlich vorkommendes Peptid, dessen Aminosäuresequenz

oder

ist, worin x und y jeweils 0, 1 oder 2 ist, unter der Voraussetzung, daß zumindest ein x oder y 1 ist, oder

oder

oder

oder

ist.
3. Gereinigtes oder synthetisches Fragment der menschlichen Insulinrezeptor-α-Untereinheit, das Sequenz I gemäß Anspruch 1 umfaßt, wobei dieses Fragment eine ternäre Struktur, wie durch irgendeine der Figuren 4A, 4B, 4C, 4D, 5A oder 5B gezeigt, und insulinmimetische Aktivität hat.
4. Gereinigtes natürliches oder synthetisches Peptid, dessen Aminosäuresequenz die Sequenz VIII:

ist, oder ein aktives Fragment davon, das das insulinähnliche Wachstumsfaktor-I-Molekül bindet und das IGF-I-ähnliche Aktivität besitzt.
5. Insulinmimetisches Arzneimittel enthaltend ein Peptid oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Insulinmimetisches Arzneimittel enthaltend eine synthetische oder gereinigte Aminosäurerestsequenz entsprechend irgendeiner der Sequenzen I bis IX, worin:

die Sequenzen I, II und III wie in Anspruch 1 definiert sind;

die Sequenz IV wie folgt ist:

die Sequenzen V, VI und VII Modifikationen der Sequenz IV sind, wobei Phe-Phe bei 88-89 durch Leu-Phe (Sequenz V), durch Phe-Leu (Sequenz VI) und durch Leu-Leu (Sequenz VII) ersetzt wurden;

die Sequenz VIII wie in Anspruch 4 definiert ist; und

die Sequenz IX wie folgt ist:

Ala-Leu-Val-Ile-Phe-Glu-Met-Val-His-Leu-Lys-Glu