DE69834828T2

DE69834828T2 - Verfahren zur konstruktion von agonisten und antagonisten des igf-rezeptors (1-462)

Info

Publication number: DE69834828T2
Application number: DE69834828T
Authority: DE
Inventors: David John Macedon BENTLEY; Jane Leah Somerton Park COSGROVE; John Maurice South Caulfield FRENKEL; Peter Thomas Brunswick GARRETT; Jean Lynne Brunswick LAWRENCE; Meizhen Scoresby LOU; Oscar George North Balwyn LOVRECZ; Moreton Neil Lilydale McKERN; Archibald The Estate of Peter Peter TULLOCH; Wesley Colin Carlton WARD
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
Priority date: 1997-11-27
Filing date: 1998-11-27
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2018-11-28
Also published as: EP1034188A4; WO1999028347A1; ATE328903T1; WO1999028347A8; JP2001525339A; DE69834828D1; EP1034188B1; EP1034188A1; US7020563B1; CA2311926A1

Description

Gebiet der Erfindung:
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Rezeptorstruktur und Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf des Gebiet der Verwendung der Rezeptorstruktur IGF-1R (1–462), um die Struktur von verwandten Rezeptoren vorherzusagen und zur Verwendung der bestimmten Strukturen und vorhergesagten Strukturen um Agonisten und Antagonisten der Polypeptidliganden auszuwählen und auf diese zu screenen.
Hintergrund der Erfindung:
Insulin ist das Peptidhormon, welches die Glukoseaufnahme und Metabolismus reguliert. Die zwei Arten von Diabetes mellitus sind entweder mit der Unfähigkeit Insulin zu produzieren, aufgrund der Zerstörung der pankreatischen Inselzellen (Homo-Delarche, F. & Boitard, C., 1996, Immunol. Today 10: 456–460) oder mit einem schwachen Glukose-Metabolismus, welcher entweder von einer Insulinresistenz an den Zielgeweben, oder von einer inadäquaten Insulinsekretion durch die Inseln oder einer fehlerhaften Leberfunktion resultiert, assoziiert (Taylor, S. I. et al., 1994, Diabetes, 43: 735–740).
Die Insulinartigen Wachstumsfaktoren 1 und 2 (IGF-1 und 2) sind strukturell mit Insulin verwandt, sind aber im Gewebewachstum und in der Entwicklung wichtiger als im Metabolismus. Sie werden hauptsächlich in der Leber als Reaktion auf Wachstumshormon, aber auch in den meisten anderen Geweben gebildet, wo sie als parakrine/autokrine Regulatoren wirken. Die IGFs sind starke Mitogene, und sind in eine Vielzahl von physiologischen Zuständen und bestimmte Krebse eingebunden (Baserga, R., 1996, TibTech 14: 150–152, Baserga R., et al., 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1332: F105–F126).
Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) ist ein kleines Polypeptid Zytokin, welches mit der Insulin/IGF-Familie nicht verwandt ist. Es stimuliert merklich die Proliferation von Epithelgeweben, und ist ein Mitglied einer größeren Familie von strukturell-verwandten Zytokinen, wie z. B. transformierender Wachstumsfaktor α, Amphiregulin, Betacellulin, Heparin-bindender EGF und einige virale Genprodukte. Ein anormales EGF-Familie-Signalwirkung ist ein Charakteristikum von einigen bestimmten Krebsen (Soler, C. & Carpenter, G., 1994 In Nicola, N. (ed) Guidebook to Cytokines and Their receptors", Oxford Univ. Press, Oxford, pp 194–197; Walker, F. & Burgess, A. W., 1994, In Nicola, N. (ed) Guidebook to Cytokines and Their receptors", Oxford Univ. Press, Oxford, pp 198–201).
Jeder dieser Wachstumsfaktoren vermittelt seine biologische Wirkung durch die Bindung an den entsprechenden Rezeptor. Der IR, IGF-1R und der Insulin Rezeptor-related Rezeptor (IRR), für welchen der Ligand nicht bekannt ist, sind eng miteinander verwandt, und werden als die Insulin Rezeptor Unterfamilie bezeichnet. Eine große Menge an Informationen bezüglich der Primärstruktur von den Mitgliedern dieser Insulin Rezeptor Unterfamilie ist nun verfügbar (Ebina, Y., et al., 1985 Cell 40: 747–758; Ullrich, A, et al., 1985, Nature 313: 759–761; Ullrich, A. et al., 1986, EMBO j 5: 2503–2512; Shier, P. & Watt, V. M., 1989, J. Biol. Chem. 264: 14605–14608) und der Identifikation von einigen ihrer funktionellen Domänen (für Reviews siehe De Meyts, P. 1994, Diabetologia 37: 135–148; Lee, J. & Pilch, P. F. 1994 Amer. J. Physiol. 266: C319–C334.; Schaffer, L. 1994, Eur. J. Biochem. 221: 1127–1132). IgF-1R, IR und IRR sind Mitglieder der Tyrosinkinase Rezeptor Superfamilie und sind eng mit dem epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) Unterfamilie verwand, mit welcher sie eine beträchtliche Sequenzidentität in der extrazellulären Region sowie in der cytoplasmatischen Kinasedomäne teilen (Ullirch, A. et al., 1984 Nature 309: 418–425; Ward, C. W. et al., 1995 Proteins: Structure Function & Genetics 22: 141–153). Sowohl die Insulin als auch die EGF Rezeptor-Unterfamilien haben eine ähnliche Anordnung von zwei homologen Domänen (L1 und L2), die durch eine Cys-reiche Region von etwa 160 Aminosäuren, welche 22–24 Cys-Reste enthält, getrennt sind (Baja, M., et al., 1987 Biochim. Biophys. Acta 916: 220–226; Ward, C. W. et al., 1995 Proteins: Structure Function & Genetics 22: 141–153). Der C-terminale Bereich der IGF-1R Ektodomäne (Reste 463–906) weist vier Domänen auf: eine Verbindungsdomäne, zwei Fibronectin Typ 3 (Fn3)-Wiederholung, und eine Insert-Domäne (O'Bryan, J. P. et al., 1991 Mol Cell Biol 11: 5016–5031). Der C-terminale Bereich der EGFR-Ektodomäne (Reste 477–621) besteht einzig aus einer zweiten Cys-reichen Region, die 20 Cys-Reste enthält (Ullrich, A. et al., 1984, Nature 309: 418–425).
Es ist wenig über die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur der Ektodomänen dieser Rezeptor-Unterfamilien bekannt. Im Gegensatz zu Mitgliedern der EGFR-Unterfamilie, welche transmembrane Monomere sind, die bei der Ligandenbindung dimerisieren, sind die IR Unterfamilienmitglieder Homodimere, die durch Disulphidbindungen zusammen gehalten werden. Die extrazelluläre Region der IR/IGF-1R/IRR Monomere enthält eine α-Kette (~703 bis 735 Aminosäurereste) und 192–196 Reste der β-Kette. Es gibt ein ~23 Reste langes Transmembransegment, welches von dem cytoplasmatischen Teil (354 bis 408 Aminosäuren) gefolgt wird, welcher die katalytische Tyrosinkinase-Domäne, die von juxtamembrane und C- Schwanz regulatorischen Regionen flankiert ist, enthält, und für die Vermittlung aller Rezeptor-spezifischer Funktionen verantwortlich ist (White, M. f. & Kahn, C. R. 1994 J. Biol. Chem. 269: 1–4). Die chemischen Analysen des Rezeptors weisen darauf hin, dass die α-Kette mit der β-Kette über eine einzige Disulphidbindung verbunden ist, wobei das IR dimer durch zumindest zwei α-α Disulphidbindungen gebildet wird (Finn, F. M., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 419–423; Chiacchia, K. B., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 1178–1182; Schaffer, L & Ljungqvist, L.; 1992, Biochem. Biophys, Res. Comm. 189: 650–653; Sparrow, L. G., et al., 1997, J. Biol. Chem. 47: 29460–29467).
Obwohl die dreidimensionalen (3D) Strukturen der Liganden EGF, TGF-α (hommel, U., et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 271–282), Insulin (Dodson, E. J., et al., 1983, Biopolymers 22: 281–291), IGF-1 (Sato, A., et al., 1993, Int J Peptide Protein Res 41: 433–440) und IGF-2 (Torres, A. M., et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 385–401) bekannt sind, und eine Vielzahl analytischer und funktioneller Studien über die Ligandenbindung an EGFR (Soler, C & Carpenter, G., 1994 In Nicola (ed) Guidebook to Cytokines and Their Receptors", Oxford Univ. Press, Oxford, ppp 194–197), IGF-1R und IR (siehe De Meyts, P., 1994, Diabetologia, 37: 135–148) durchgeführt wurden, wurde der Mechanismus der Ligandenbindung und die nachfolgende Transmembran-Signalwirkung noch nicht gelöst.
Die Liganden-induzierte, Rezeptor-vermittelte Phosphorylierung ist der Signalisierungsmechanismus durch welchen die meisten Zytokine, Polypeptid-Hormone und Membran-verankerten Liganden ihre biologische Wirkung ausüben. Die primäre Kinase kann Teil des intrazellulären Bereichs des Transmembran-Rezeptor-Proteins sein, wie beim Tyrosinkinase-Rezeptor (für einen Review siehe Yarden, Y., et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57: 433–478) oder dem Ser/Thr Kinase Rezeptor (Alevizopoulos, A. & Mermod, N., 1997, BioEssays, 19: 581–591) oder kann nicht-kovalent mit dem cytoplasmatischen Schwanz des(r) Transmembranproteins(e) assoziiert sein um den Rezeptorkomplex zu bilden, wie beim hämopoietischen Wachstumsfaktor Rezeptor der Fall ist (Stahl, N., et al., 1995. Science 267: 1349–1353). Das Endergebnis ist dasselbe, die Ligandenbindung führt zur Rezeptordimerisierung oder Oligomerisierung oder zu einer konformativen Veränderung in vorbestehenden Dimeren oder Oligomeren, und was in der Aktivierung der kovalent-angehefteten oder nicht-kovalent assozierten Proteinkinase-Domänen durch Transphosphorylierung resultiert (Hunter T., 1995, Cell, 80: 225–236).
Es ist gezeigt worden, dass viele Onkogene zu den Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder zu Molekülen in den Signalübertragungswegen homolog sind (Baserga, R., 1994 Cell, 79: 927–930; Hunter, T., 1997 Cell, 88: 333–346). Eines der besten Beispiele ist v-Erb (verwandt zu EGFR). Da die Überexpression etlicher Wachstumsfaktorrezeptoren in einer Liganden-abhängigen Transformation resultiert, ist eine alternative Strategie für Onkogene die Expression der Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder ihrer Liganden zu regulieren oder direkt an die Rezeptor zu binden, um die gleiche Wirkung zu stimulieren (Baserga, R., 1994, Cell, 79: 927–930). Beispiele sind v-Src, welches IGF-1R intrazellulär aktiviert; c-Myb, welche Zellen durch Erhöhen der Expression von IGF2R transformiert; und SV40 T Antigen, welches mit IGF-1R wechselwirkt und die Sekretion von IGF-1 erhöht (nachzulesen bei Baserga, R., 1994 Cell, 79: 927–930). Zellen, bei denen der IGF-1R gestört oder deletiert ist, können durch das SV40 T-Antigen nicht transformiert werden. Wenn Onkogene Wachstumsfaktoren und ihre Rezeptoren aktivieren, dann sollten Tumorsuppressorgene die gegenteilige Wirkung haben. Ein gutes Beispiel ist das Wilm's Tumorsuppressorgen, WT1, welches die Expression von IGF-1R unterdrückt (Drummond, J. A., et al., 1992, Science, 257: 275–277). Zellen die durch Onkogene angetrieben sind zu proliferieren, werden einer starken Apoptose unterzogen, wenn die Wachstumsfaktor Rezeptoren abgetragen sind, da sie im Gegensatz zu normalen Zellen, nicht in der Lage zu sein scheinen, sich aus dem Zellzyklus zurückzuziehen und in die G₀-Phase einzutreten (Baserga, R., 1994 Cell, 79: 927–930).
Der Insulinartige Wachstumsfaktor-1 Rezeptor (IGF-1R) ist einer von vielen Wachstumsfaktorrezeptoren, der die Proliferation der Säugetierzellen reguliert. Seine Allgegenwart und bestimmte einzigartige Aspekte seiner Funktion machen IGF-1R jedoch zu einem idealen Ziel für die spezifische therapeutische Interventionen gegenüber abnormalem Wachstum, mit sehr geringer Auswirkung auf die normalen Zellen (siehe Baserga, R., 1996, TIBTECH, 14: 150–152). Der Rezeptor wird durch IGF1, IGF2 und Insulin aktiviert, und spielt eine wichtige Rolle in der zellulären Proliferation in zumindest drei Arten: es ist für das optimale Wachstum von Zellen in vitro und in vivo essentiell; etliche Zelltypen benötigen IGF-1R, um den transformierten Zustand aufrechtzuerhalten; und aktiviertes IGF-1R hat eine schützende Wirkung gegenüber dem apoptotischen Zelltod (Baserga, R., 1996, TIBTECH, 14: 150–152). Diese Eigenschaften allein, machen es zu einem idealen Ziel für therapeutische Interventionen. Transgene Experimente haben gezeigt, dass IGF-1R keine absolute Voraussetzung für das Zellwachstum ist, aber für die Etablierung des tranformierten Zustands essentiell ist (Baserga, R., 1994 Cell, 79: 927–930). In etlichen Fällen (humanes Glioblastom, humanes Melanom, humanes Brustkarzinom, humanes Lungkarzinom, humanes Ovarialkarzinom, humanes Rhabdomyosarkom, Maus-Melanom, Maus Leukämie, Ratten Glioblastom, Ratten Rhabdomyosarkom, Hamster-Mesotheliom) kann der transformierte Phänotyp durch die Verminderung der Expression von IGF-1R unter Verwendung von Antisense zu IGF-1R (Baserga, R., 1996, TIBTECH 14: 150–152); oder durch das Eingreifen von Antikörper zu IGF-1R in seine Funktion (humanes Brustkarzinom, humanes Rhabdomyosarkom) oder durch dominante Negative von IGF-1R (Ratten Glioblastom; Baserga, R., 1996 TIBTECH 14: 150–152) umgekehrt werden.
Wenn die IGF-1R Funktion beeinträchtigt ist, werden drei Auswirkungen beobachtet: Tumorzellen werden einer massiven Apoptosis unterzogen, welche in der Inhibition der Tumorgenesis resultiert; überlebende Tumorzellen werden durch eine spezifische Immunantwort beseitigt; und eine solche Wirtsreaktion kann eine Regression eines etablierten Wildtyp-Tumors verursachen (Resnicoff M., et al. 1995, Cancer Res. 54: 2218–2222). Diese Auswirkungen und die Tatsache, dass die Wechselwirkungen mit der IGF-1R Funktion eine beschränkte Auswirkung auf normale Zellen haben (teilweise Inhibierung des Wachstums ohne Apoptosis) machen den IGF-1R zu einem einzigartigen Ziel für die therapeutische Intervention (Baserga, R., 1996 TIBTECH 14: 150–152). Zusätzlich ist IGF-1R stromabwärts von vielen anderen Wachstumsfaktor-Rezeptoren, welches es zu einem noch allgemeineren Ziel macht. Die Implikation dieser Ergebnisse ist, dass wenn die Anzahl an IGF-1Rs auf Zellen vermindert werden kann oder ihre Funktion antagonisiert werden kann, Tumore zu wachsen aufhören und immunologisch entfernt werden können. Diese Studien begründen, dass IGF-1R-Antagonisten therapeutisch sehr wichtig sein werden.
Viele Krebszellen haben konstitutiv-aktive EGFR (Sandgree, E. P. et al., 1990. Cell. 61: 1121–135; Karnes, W. E. J., et al., 1992, Gastroenterology, 102: 474–485) oder andere EGFR Familienmitglieder (Hines, N. E., 1993, Semin. Cancer Biol. 4: 19–26). Erhöhte Konzentrationen an aktiviertem EGFR tritt bei Blasen-, Brust-, Lungen- und Gehirntumoren auf (Harris, A. L., et al., 1989, In Furth & Greaves (eds), The Molecular Diagnostics of human cancer. Cold Spring Harbor Lab. Press, CSH, NY, pp353–357). Antikörper gegen EGFR können die Ligandenaktivierung von EGFR (Sato, J. D., et al., 1983 Mol. Biol. Med. 1: 511–529) und das Wachstum von vielen Epithelzelllinien (Aboud-Pirak E., et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 85: 1327–1331) inhibieren. Patienten, die wiederholte Dosen eines humanisierten chimären Anti-EGFR Monoklonalen Antikörper erhielten, zeigten Anzeichen einer Krankheitsstabilisierung. Die großen benötigten Dosen und die Produktionskosten eines humaniserten monoklonalen Antikörpers beschränken wahrscheinlich die Anwendung dieser Art von Therapie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Entwicklung von EGF Antagonisten attraktive Antikrebswirkstoffe sein werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die gegenwärtigen Erfinder haben jetzt hinsichtlich des Insulinartigen Wachstumsfaktor Rezeptor IGF-1R (1–462) 3D Strukturinformationen erhalten. Diese Information kann verwendet werden, um die Struktur von verwandten Mitgliedern der Insulin Rezeptorfamilie vorherzusagen und stellt eine rationale Basis für die Entwicklung von Liganden für spezifische therapeutische Anwendungen bereit.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Entwickeln einer Verbindung, die in der Lage ist, ein Molekül der Insulin-Rezeptor Familie zu binden und eine Aktivität, die durch das Molekül vermittelt wird zu modulieren, einschließlich der Schritte des Bewertens der sterochemischen Kompementarität zwischen der Verbindung und der Rezeptorstelle des Moleküls, und Testen der Verbindung auf ihr Fähigkeit eine Aktivität, die durch das Molekül vermittelt wird, zu modulieren, bereit, wobei die Rezeptorstelle besteht aus:

(a) Den Aminosäuren 1 bis 462 der Rezeptors für IGF-1 mit den atomaren Koordinaten wie in 1 gezeigt ist; oder
(b) Einer Teilmenge der Aminosäuren, mit den atomaren Koordinaten.

Die Phrase „Insulin Rezeptorfamilie" umfasst, zum Beispiel, IGF-1R, IR und IRR. Im Allgemeinen zeigen Insulin Rezeptorfamilienmitglieder ähnliche Domänenanordnungen und teilen eine signifikante Sequenzidentität (vorzugsweise zumindest 40% Identität).
Mit „stereochemische Komplementarität" meinen wir, dass die biologisch aktive Substanz oder ein Teil davon, mit der Furche in der Rezeptorstelle, in der Weise der klassischen „Schloss-und-Schlüssel"-Visualisierung, korreliert.
In einer bevorzugten Ausführungsform nach diesem Aspekt der Erfindung, ist die Verbindung aus einer bekannten Verbindung, die aus einer Datenbank identifiziert wurde, ausgewählt oder modifiziert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, ist die Verbindung so entworfen, dass sie die Struktur des Rezeptormoleküls wie in 1 dargestellt ist, komplementiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, weist die Verbindungen strukturelle Regionen auf, die in der Lage sind engen Kontakt mit den Aminosäurenresten an der Rezeptoroberfläche, welche die Rinne auskleiden, wie in 2 abgebildet, herzustellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, weist die Verbindung eine Stereochemie auf, so dass sie mit beiden, der L1 und L2 Domäne der Rezeptorstelle interagieren kann.
In einer weiteren Ausführungsform, weist die Verbindung eine Stereochemie auf, so dass sie mit der L1 Domäne eines ersten Monomers des Rezeptor Homodimers und mit der L2 Domäne des anderen Monomers des Rezeptor Homodimers interagieren kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verändert die Interaktion der Verbindung mit der Rezeptorstelle die Position von zumindest einer der L1, L2 oder Cystein-reichen Domänen des Rezeptormoleküls relativ zu der Position von zumindest einer der anderen Domänen. Vorzugsweise, interagiert die Verbindung mit dem β-Faltblatt der L1 Domäne des Rezeptormoleküls, wodurch sie eine Veränderung der Position der L1 Domäne relativ zu der Position der Cystein-reichen Domäne oder von der L2 Domäne bewirkt. Alternativ, interagiert die Verbindung mit der Rezeptorstelle in der Region der Schnittstelle zwischen der L1 Domäne und der Cystein-reichen Domäne des Rezeptormoleküls, wodurch bewirkt wird, dass die L1 Domäne und die Cystein-reiche Domäne sich von einander weg bewegen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, interagiert die Verbindung mit der Hinge-Region zwischen der L2 Domäne und der Cystein-reichen Domäne des Rezeptormoleküls, wodurch eine Veränderung in der Position der L2 Domäne und der Cystein-reichen Domäne relative zueinander bewirkt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die stereochemische Komplementarität zwischen der Verbindung und der Rezeptorseite so, dass die Verbindung eine K_b für die Rezeptorstelle von weniger als 10^–6 M aufweist, noch bevorzugter kleiner als 10^–8 M ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, weist die Verbindung die Fähigkeit auf, eine durch das Rezeptormolekül vermittelte Aktivität zu erhöhen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform oder der erste Aspekt der gegenwärtigen Erfindung, weist die Verbindung die Fähigkeit auf, eine durch das Rezeptormolekül vermittelte Aktivität zu verringern. Vorzugsweise ist die stereochemische Interaktion zwischen der Verbindung und der Rezeptorstelle adaptiert, um die Bindung eines natürlichen Liganden des Rezeptormoleküls an die Rezeptorstelle zu verhindern. Es ist bevorzugt, dass die Verbindung einen K_i von weniger als 10^–6 M, noch bevorzugter weniger als 10^–8 M, und noch bevorzugter weniger als 10^–9 M aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der gegenwärtigen Erfindung ist der Rezeptor IGF-1R oder der Insulin-Rezeptor.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die gegenwärtige Erfindung ein computerunterstütztes Verfahren zum Ermitteln potentieller Verbindungen bereit, die in der Lage sind, an ein Molekül der Insulin Rezeptor Familie zu binden und um eine durch dieses Molekül vermittelte Aktivität zu modulieren, unter Verwendung eines programmierten Computers einschließlich eines Prozessors, einem Eingabegerät, und einem Ausgabegerät, einschließlich der Schritte von:

a) Eingeben von Daten in den programmierten Computer durch das Eingabegerät, welche die atomaren Koordinaten des IGF-1R (1–462) Moleküls, wie in 1 dargestellt ist, oder einer Teilmenge davon aufweisen;
b) Erzeugen mittels Computerverfahren eines Satzes an atomaren Koordinaten einer Struktur, welche stereochemische Komplementarität zu den atomaren Koordinaten der IGF-1R Stelle, wie sie in 1 dargestellt sind, oder einer Teilmenge davon besitzt, wodurch eine Kriteriendatei erzeugt wird;
c) Vergleichen der Kriteriendatei mit einer chemischen Strukturen Computer Datenbank mittels Prozessor;
d) Auswählen von chemischen Strukturen, welche strukturell ähnlich einem Teil der Kriteriendatei sind aus der Datenbank mittels Computerverfahren;
e) Ausgeben der ausgewählten chemischen Strukturen auf dem Ausgabegerät, welche ähnlich einem Teil der Kriteriendatei sind;

In einer bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts, beinhaltet der programmierte Computer ein Datenspeichersystem, welches eine Datenbank von chemischen Strukturen enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts, wird das Verfahren verwendet, um potentielle Verbindung zu ermitteln, welche die Fähigkeit haben eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu verringern.
In noch einer bevorzugten Ausführungsform weist das computerunterstütztes Verfahren weiters den Schritt des Auswählens einer oder mehrerer chemischer Strukturen von Schritt (e) auf, welche mit der Rezeptorstelle des Moleküls in einer Weise interagieren, welche die Bindung eines natürlichen Ligand an die Rezeptorstelle verhindert.
In noch einer bevorzugten Ausführungsform, weist das computerunterstütztes Verfahren, weiters den Schritt des Gewinnens einer Verbindung mit der in den Schritten (d) und (e) ausgewählten chemischen Struktur, und Testen der Verbindung auf die Fähigkeit eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu verringern, auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wird das computerunterstützte Verfahren verwendet, um potentielle Verbindungen zu ermitteln, welche die Fähigkeit eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu erhöhen, aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, weist das computerunterstützte Verfahren weiters den Schritt des Gewinnens eines Moleküls mit der in den Schritten (d) und (e) ausgewählten chemischen Struktur, und Testen der Verbindung auf die Fähigkeit eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu erhöhen, auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform nach dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung, ist der Rezeptor IGF-1R, oder der Insulin-Rezeptor.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen einer mutmaßlichen Verbindung bereitgestellt, welche die Fähigkeit die Aktivität eines Rezeptors der Insulin Rezeptor Familie zu modulieren, aufweist, einschließlich der Schritte der Ermittlung einer mutmaßlichen Verbindung durch ein Verfahren nach dem ersten oder zweiten Aspekt, und Testen der Verbindung auf die Fähigkeit eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu erhöhen oder zu verringern
In einer bevorzugten Ausführungsform nach dem dritten Aspekt, wird der Test in vitro durchgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform nach dem dritten Aspekt, ist der Test eine Hochdurchsatzuntersuchung.
In einer bevorzugten Ausführungsform nach dem dritten Aspekt, wird der Test in vivo durchgeführt.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1. IGF-1R Reste 1–462 in Form von atomaren Koordinaten, die auf eine Auflösung von 2.6 Å (durchschnittliche Genauigkeit ≈ 0,3 Å) verfeinert wurden. Die Koordinaten sind auf ein kartesisches System mit orthogonalen Achsen bezogen.
2. Darstellung der Reste, die die Rinne des IGF-1R Rezeptorfragments 1–462 auskleiden.
3. Gelfiltrationschromatographie von affinitätsgereinigtem IGF-1R/462 Protein. Das Protein wurde auf einer Superdex S200 Säule (Pharmacia), die an ein BioLogic L. C. System (Biorad) angeschlossen ist, äquilibriert und eluiert mit 0,8 ml/min mit 40 mM Tris/150 nM NaCl/0,02% NaN3, wobei der pH auf 8,0 eingestellt wurde. (a) Das Protein, welches in Peak 1 eluiert enthielt angesammeltes IGF-1R/462 Protein, Peak 2 enthielt monomere Proteine und Peak 3 enthielt das c-myc Undecapeptid, welches für die Elution von der Mab 9E10 Immunaffinitätssäule verwendet wurde. (b) Nicht-reduzierte SDS-PAGE der Fraktion 2 von IGF-1R/462, die nachfolgend an die Superdex S200 (1a) erhalten wurde. Standardproteins sind angedeutet.
4. Ionenaustauschchromatographie von affinitätsgereinigter, verkürzter IGF-1R Ektodomäne. Eine Mischung von Gradient und isokratischer Eluionschromatographie wurde auf einer Resource Q Säule (Pharmacia), die an ein BioLogic System (Biorad) angeschlossen ist, unter Verwendung von 20 nM Tris/ph 8,0 als Puffer A und derselbe Puffer mit 1 M NaCl als Puffer B durchgeführt. Proteinlösung in TBSA wurde zumindest 1:2 mit Wasser verdünnt und auf die Säule mit 2 ml/min geladen. Die Elution wurde mittels Absorption (280 nm) und Leitfähigkeit (mS/cm) überwacht. Das Zielprotein (Peak 2) eluierte isokratisch mit 20 mM Tris/0,14 M Nacl pH 8,0. Einsatz: isoelektrischens Fokusiergel (ph 3–7; Novex Australia Pty Ltd) der Fraktion 2. Der pI wurde mit 5,1 von Standardproteinen (nicht gezeigt) abgeschätzt.
5. Polypeptid-Faltung für die Reste 1–462 von IGF-1R. Die L1-Domäne ist vom N-terminalen Ende betrachtet, oben und L2 ist unten. Der Raum im Zentrum ist ausreichend groß um IGF-1 aufzunehmen. Helices sind durch gewickelte Bänder, und b-Stränge als Pfeile dargestellt. Cystein-Seitenketten sind als Ball-und-Stock, wobei die Linien Disulfid-Brücken zeigen, dargestellt.
6, Aminosäuresequenzen von IGF-1R und verwandten Proteinen. a, L1 und L2 Domänen von humanem IGF-1R und IR werden, basierend auf einer Sequenzausrichtung für die zwei Proteine und eine strukturelle Ausrichtung für die L1 und L2 Domänen gezeigt. Positionen, die Konservierungs-physiko-chemische Eigenschaften von Aminosäuren zeigen sind eingerahmt, die Reste die in der strukturellen Ausrichtung verwendet wurden, werden in kursivgedruckter Times und die Reste, welche die Trp 176 Tasche bilden sind in fettgedruckter Times dargestellt. Sekundäre Strukturelemente für L1 (über der Sequenz) und L2 (darunter) sind als Zylinder für Helices und Pfeile für β-Stränge angedeutet. Die Stränge sind schattiert (hell, mittel und dunkelgrau) gemäß den β-Faltblättern, zu welchen sie gehören. Disulfid-Bindungen sind ebenfalls angegeben. b, Cys-reiche Domänen von humanem IGF-1R, IR und EGFR (Domänen 2 und 4) sind auf der Basis von Sequenz und Strukturbetrachtungen ausgerichtet. Sekundäre Strukturelemente und Disulfid-Bindungen sind über der Sequenz angegeben. Die strichlierte Bindung ist nur in IR vorhanden. Unterschiedliche Arten vom Disulfid-gebundenen Module sind unterhalb der Sequenz als offene, gefüllte oder unterbrochene Linien markiert. Eingerahmte Reste zeigen die Konservierung von physiko-chemischen Eigenschaften und strukturell konservierten Resten für Module 4–7 sind in kursivgedruckten Times dargestellt. Die Reste vom EGFR, welche nicht dem Muster entsprechen sind in Kleinbuchstaben, wobei mögliche Disulfid-Bindungen darunter angedeutet sind, und das konservierte Trp 176 und das semi-konservierte Gln 182 sind fettgedruckt Times.
7. Stereoansicht einer Überlagerung von der L1 (weiß) und der L2 (schwarz)-Domäne. Die Reste-Nummern darüber sind für L1 und die darunter für L2. Die Seitenkette von Trp 176, welches in den Kern von L1 herausragt ist als Ball-und-Stock dargestellt.
8. Schematisches Diagramm, welches die Assoziation der drei β-Finger-Motiven zeigt. Die β-Stränge sind als Pfeile und die Disulfid-Bindungen als zickzack gezeichnet.
9. Die Sequenzausrichtung von hIGF-1R, hIR und hIRR Ektodomänen, welche durch die Verwendung des PileUp-Programms des Software-Packetes der Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA abgeleitet wurde. Für die Zuordnung von homologen 3D Strukturen siehe 6.
10. Gelfiltrationschromatographie der Insulin Rezeptor Ektodomäne und MFab Komplexe. Das hIR-11 Ektodomänen-Dimer (5–20 mg) wurde mit MFab-Derivaten (jedes 15–25 mg) von den anti-hIR Antikörpern 18-44, 83-7 und 83-14 komplexiert (Soos et al., 1986). Die Elutionsprofile wurden von Proben, welche auf die Superdex S200-Säule (Pharmacia) geladen wurden, die mit einem BioLogic Chromatographie-System (Biorad) verbunden war, erzeugt und wurden bei 280 nm überwacht. Die Säule wurde mit 0,8 ml/min mit 40 mM Tris/150 nM Natriumchlorid/0,02% Natriumazid-Puffer, der auf pH 8,0 eingestellt wurde, eluiert: Profil 0, hIR-11 Ektodomäne; Profile 1, Ektodomäne mit MFab 18-44 gemischt; Profil 2, Ektodomäne mit MFab 18-44 und MFab 83-14 gemischt; Profil 3, Ektodomäne mit MFab 18-44, MFab 83-14 und MFab 83-7 gemischt. Die scheinbare Masse jedes Komplexes wurde aus einem Diagramm der folgenden Standardproteine bestimmt: Thyroglobulin (660 kDa), Ferritin (440 kDA), bovines Gamma-Globulin (158 kDa), Rinderserumalbumin (67 kDa), Hühnerovalbumin (44 kDa) und Pferde-Myoglobin (17 kDa).
11. Schematische Darstellung der Elektronmikroskopiebilder des hIR Ektodomänen-Dimers.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wir beschreiben hierin die Expression, Reinigung, und Kristallisation eines rekombinanten, verkürzten IGF-1R Fragments (Reste 1–462), welches die L1-Cystein reiche-L2 Region der Ektodomäne enthält. Die ausgewählte Verkürzungspositions ist gerade stromabwärts der Exon 6/Exon 7-Verbindung (Abbott, A. M., et al., 1992. J. Biol Chem., 267: 10759–10763), und tritt an einer Position auf, an welcher die Sequenzen der IR und der EGFR-Familien merklich voneinander abweichen (Ward, C. W., et al., 1995, Proteins: Struct., Funct., Genet, 22: 141–153; Lax, I., et al., 1988, Molec. Cellul. Biol. 8: 1970–1978), was darauf hinweist, dass es eine Domänegrenze darstellt. Um die Auswirkungen einer Glycosylierung zu beschränken, wurde das IGF-1R Fragment in Lec8 Zellen exprimiert, einer Glycosylierungsmutante der Chinesischen Hamster Ovarium (CHO)-Zellen, dessen definierter Glycosylierungsfehler N-gekoppelte Oligosaccharide, die am N-Acetylglucosamin-Rest distal zu den Mannose-Resten verkürzt sind, erzeugt (Stanley, P. 1989, Molec. Cellul. Biol. 9: 377–383). Ein solcher Ansatz hat die Glycoprotein-Kristallisation erleichtert (Davis, S. J., et al., 1993, Protein Eng. 6: 229–232; Liu, J. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 33639–33646).
Das hierin beschribene IGF-1R Konstrukt beinhaltet ein c-myc Peptid-Tag (Hoogenboom, H. R., et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133–4137), welches durch das Mab 9E10 erkannt wird (Evan, G. I., et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 3610–3616), wodurch ermöglicht wird, dass das exprimierte Produkt durch Peptidelution von einer Antikörper Affinitätssäule gefolgt von einer Gelfiltration über eine Superdex S200 gereinigt werden kann. Die gereinigten Proteine kristallisierten unter einem unvollständigem Matrix-Screen (sparse matrix screen) (Jancarik, J- & Kim. S.-H., 1991, J. Appl. Cryst. 24: 409–411), die Kristalle waren jedoch von unterschiedlicher Qualität waren, wobei die Besten auf 3,0–3,5 Å beugten. Die isokratische Gradientenelution durch Anionenaustauschchromatogaphie ergab Protein, welches weniger heterogen war und ergab Kristalle die von ausreichender Qualität waren, um die Struktur der ersten drei Domänen des humanen IGF-1R zu bestimmen.
Das IGF-1R Fragment bestand aus den Resten 1–462 des IGF-1R, welches über eine Enterokinase spaltbare Pentapeptid-Sequenz mit einem elf Reste-langen c-myc-Peptid-Tag am C-terminalen Ende verbunden ist. Das Fragment wurde in Lec8-Zellen durch kontinuierliche Medienperfusion in einem Bioreaktor unter Verwendung von porösen Trägerscheiben exprimiert. Es wurde in das Kulturmedium sekretiert und durch Peptidelution von einer Anti-c-myc-Antikörper Säule gefolgt von einer Superdex S200 Gelfiltration gereinigt. Das Rezeptorfragment band zwei Anti-IGF-1R monoklonale Antikörper, 24–31 und 24–60, welche konformative Epitope erkennen, jedoch konnte nicht gezeigt werden, dass sie IGF-1 oder IGF-2 binden. Kristalle wurden als rhombische Prisma in 1.7 M Ammoniumsulfat bei pH 7,5 gezüchtet, wobei die Besten auf 3,0–3,5 Å beugten. Weitere Reinigung durch isokratische Elution von einer Anionenaustauschersäule ergab Protein, welches bessere, auf 2,6 Å beugende, Qualitätkristalle ergaben, welche für eine Röntgenstrukturbestimmung geeignet waren.
Die Struktur dieses Fragments (IGF-1R Reste 1–462; L1-Cys reiche-L2-Domänen) wurden bei einer Auflösung von 2,6 Å durch Röntgenbeugung bestimmt. Die L-Domänen nahmen jeweils eine kompakte Form, welche aus einer einzelsträngigen rechtsgängigen β-Helix besteht, an. Die Cys-reiche Region ist aus acht Disulfid-gebundenen Modulen aufgebaut, von denen sieben eine stäbchenförmige Domäne bilden, wobei die Module in einer neuartigen Weise assoziiert sind. Im Zentrum dieser einigermaßen langgestreckten Struktur ist ein Raum, der durch als drei Domänen gebunden ist, und von ausreichender Größe ist, um eine Ligandmolekül aufzunehmen. Funktionelle Studien an IGF-1R und anderen Mitglieder der Insulin Rezeptor Familie zeigen, dass die hauptsächlich für die Hormonbindung verantwortlichen Regionen sich auf dieser zentralen Stelle abbilden.
Eine andere Gruppe hat die Kristallisation eines verwandten Rezeptors, der EGFR, in einem Komplex mit seinem Liganden EGF berichtet (Weber, W., et al., 1994, J Chromat. 679: 181–189). Man stieß jedoch mit diesen Kristallen, welche nur auf 6 Å beugten, auf Schwierigkeiten, da dies für die Bestimmung der atomaren Auflösungsstruktur dieses Komplexes (Weber, W., et al., 1994, J. Chromat 679: 181–189) oder für die Erzeugung von genauen Modellen von Struktur-verwandten Rezeptordomänen wie z. B. IGF-1R und IR durch Homologie-Modellierung nicht ausreichend ist.
Die gegenwärtigen Erfinder haben 3D Strukturinformationen über Zytokinrezeptor entwickelt, um ein genaueres Verständnis zu ermöglichen, wie die Bindung des Liganden zu der Signalübertragung führt. Solche Informationen stellen eine rationale Grundlage für die Entwicklung von Liganden für spezifische therapeutische Anwendungen bereit, etwas was vorher nicht von verfügbaren Sequenzdaten de novo vorhergesagt werden konnte.
Der exakte Mechanismus, welche der Bindung von Agonisten und Antagonisten an die IGF-1R Stelle zugrunde liegt, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Die Bindung von Liganden an die Rezeptorstelle, vorzugsweise mit einer Affinität in der Größenordnung von 10^–8 M oder höher, wird jedoch angenommen, dass sie sich aus erhöhter stereochemischer Komplementarität relativ zu natürlich vorkommenden IGF-1 Liganden ergibt.
Eine solche stereochemische Komplementarität gemäß der gegenwärtigen Erfindung, ist für ein Molekül, das zu den internen Steitenoberfächenreste passt, die die Rinne der Rezeptorstelle auskleiden, charakteristisch, wie durch die in 1 wiedergegebenen Koordinaten spezifiziert ist. Die Reste, die die Rinne auskleiden, sind in 2 abgebildet. Mit „Passen" meinen wir, das die identifizierten Bereiche mit den Oberflächenresten interagieren, zum Beispiel, über Wasserstoffbindungen oder durch Enthalpie-reduzierende Van der Waals-Interaktionen, welche die Desolvation der biologisch aktiven Substanz innerhalb der Rinne in einer Art fördern, die die Zurückhaltung der biologisch aktiven Substanz innerhalb der Rinne energetisch begünstigt.
Substanzen, die zu der Form der Rezeptorstelle komplementär sind, die durch die Aminosäuren charakterisiert sind, welche an den in 1 wiedergegebenen Koordinaten positioniert sind, können in der Lage sein, an die Rezeptorstelle zu binden, und wenn die Bindung ausreichend stark ist, die Bindung des natürlich vorkommenden Liganden zu der Stelle im Wesentlichen verhindern.
Es wird verständlich sein, dass des nicht notwendig ist, das die Komplementarität zwischen Ligand und der Rezeptorstelle sich über alle Reste, die die Rinne auskleiden, erstreckt, um die Bindung des natürlichen Liganden zu inhibieren.
Im Allgemeinen, kann die Entwicklung eines Moleküls, welches die stereochemische Komplementarität besitzt, mittels Techniken, die die Passform zwischen Molekül und Zielrezeptor entweder chemisch oder geometrisch optimieren, erreicht werden. Bekannte Techniken dieser Art sind von Sheridan und Venkataraghavan, Acc. Chem. Res. 1987 20: 322; Goodford, J. Med. Chem. 1984 27: 557; Beddell, Chem. Soc. Reviews 1985, 279; Hol, Angew. Chem. 1986 25: 767 und Verlinde C. L. M. J & Hol, W. G. J. Structure 1994, 2: 577 geprüft worden. Siehe ebenso Blundell et al., Nature 1987 326: 347 (drug development based on information regarding receptor structure).
Folglich gibt es zwei bevorzugte Ansätze um ein Molekül gemäß der gegenwärtigen Erfindung zu entwickeln, welches die Form des IGF-1R oder einem verwandten Rezeptormoleküls komplementiert. Beim geometrischen Ansatz ist die Anzahl von internen Freiheitsgraden (und die entsprechenden lokalen Minima in dem molekularen Konformationsraum) reduziert, wenn nur die geometrischen (harten Kugeln) Interaktionen von zwei starren Körper betrachtet wird, wobei ein Körper (die aktive Stelle) „Taschen" oder „Rinnen" enthält, welche die Bindungsstelle für den zweiten Körper (das komplementäre Molekül, wie z. B. Ligand) bilden. Der zweite bevorzugte Ansatz bedingt die Bewertung von Interaktionen von respektiven chemischen Gruppen („Sonden") mit der aktiven Stelle an Probenpositionen innerhalb und um die Stelle herum, was in einem Feld von Energiewerten resultiert, von welchen dreidimensionale Konturoberflächen bei ausgewählten Energieniveaus erzeugt werden können.
Der geometrische Ansatz wurde von Kuntz et al., J. Mol. Biol. 1982 161: 269 erläutert, dessen Algorithmus für die Ligandenentwicklung in einem kommerziellen Software-Paket implementiert ist, welches durch die Mitglieder des Universitätsverwaltungsrats der Universität von Kalifornien verteilt wird und weiters in einem Dokument, mit dem Titel „Overview of the DOCK Package, Version 1.0, welches vom Verteiler bereitgestellt wird, beschrieben ist.
Gemäß dem Kuntz Algorithmus ist die Form des durch die IGF-R1 Stelle dargestellten Hohlraums als eine Reihe von überlappenden Kugeln mit unterschiedlichen Radien definiert. Eine oder mehrere bestehende Datenbanken für kristallographische Daten, wie z. B. das Cambridge Structural Database System, welches von der Cambridge Universität (University Chemical Laboratory, Lensfinle Road, Cambridge CB2 1EW, U. K.) geführt wird und die Protein Datenbank, welche von dem Brookhaven National Laboratory (Chemistry Dept. Upton, NY 11973, U.S.A) geführt wird, werden dann auf Moleküle durchsucht, welche die so definierte Form annähern.
Auf diese Art identifizierte Moleküle, auf der Basis von geometrischen Parametern, können dann modifiziert werden, um die Kriterien, die mit der chemischen Komplementarität, wie Wasserstoffbindung, ionische Interaktionen und Van der Waals Interaktionen assoziiert sind, zu erfüllen.
Der chemische-Sonden-Ansatz für die Ligandenentwicklung ist, zum Beispiel, in Goodford, J. Med. Chem. 1985 28: 849 beschrieben, und ist in mehreren kommerziellen Softwarepacketen, wie GRID (Produkt der Molecular Discovery Ltd., West Way house, Elms Parade, Oxford OX2 9LL, England) implementiert. Gemäß diesem Ansatz, werden die chemischen Voraussetzungen für ein Stellen-komplementäres Molekül anfangs durch sondieren der aktiven Stelle (wie über die atomaren Koordinaten, die in 1 gezeigt sind, dargestellt) mit unterschiedlichen chemischen Sonde wie z. B. Wasser, eine Methylgruppe, einem Amin-Stickstoff, einem Carboxyl-Sauerstoff und einem Hydroxyl, identifiziert. Die begünstigten Stellen für die Interaktion zwischen der aktiven Stelle und jeder Sonde werden so bestimmt, und von den resultierenden dreidimensionalen Mustern von solchen Stellen kann ein mutmaßliches komplementäres Molekül erzeugt werden.
Der chemische-Sonden-Ansatz ist speziell für das Definieren von Varianten von einem Molekül, von dem bekannt ist, das es an den Zielrezeptor bindet, nützlich. Dementsprechend, wird von der kristallographischen Analyse des an die Rezeptorstelle gebundenen IGF1 erwartet, dass sie nützliche Informationen in Bezug auf die Interaktion zwischen dem Urform-Liganden und der interessierenden aktiven Stelle liefert.
Zu Programmen, die für das Durchsuchen von dreidimensionalen Datenbanken geeignet sind, um Moleküle, die ein gewünschtes Pharmakophor tragen, zu identifizieren, zählen: MACCS-3D und ISIS/JD (Molecular Design Ltd., San Leandro, CA), ChemDBS-3D (Chemical Design Ltd., Oxford, U. K.) und Sybyl/3DB Unity (Tripos Associates, St. Louis, MO).
Zu Programmen, die für die Parmakophor-Auswahl und Entwicklung geeignet sind, zählen: DISCO (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), Catalyst (Bio-CAD Corp., Mountain View, Ca), und Chem DBS-3D (Chemical Design Ltd., Oxford, U. K.).
Datenbanken für chemische Strukturen sind von einer Vielzahl von Quellen einschließlich Cambridge Crystallographic Data Centre (Cambridge, U. K.) und Chemical Abstract Service (Columbus, OH) erhältlich.
De novo Entwicklungsprogramme beinhalten Ludi (Biosym Technologies Inc., San Diego, CA), Sybyl (Tripos Associates) und Aladdin (Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA).
Der Fachmann wird erkennen, dass die Entwicklung eines Nachahmens eine leichte strukturelle Veränderung oder Anpassung einer chemischen Struktur, welche unter Verwendung der Verfahren der Erfindung entwickelt oder identifiziert wurde, erfordern kann.
Die Erfindung kann in Hardware oder Software, oder ein Kombination von beiden implementiert werden. Vorzugsweise wird die Erfindung jedoch in einem Computerprogramm implementiert, welches mit programmierbaren Computern, die jeweils einen Prozessor, ein Datenspeichsystem (einschließlich flüchtiger und nicht-flüchtiger Speicher und/oder Speicherelemente), zumindest ein Eingabegerät, und zumindest ein Ausgabegerät aufweisen, ausgeführt wird. Ein Programmcode wird auf die Eingabedaten angewandt, um die oben beschriebenen Funktionen auszuführen und Ausgabeinformationen zu erzeugen. Die Ausgabeinformation wird auf ein oder mehrere Ausgabegeräte in bekannter Weise angewandt. Der Computer kann, zum Beispiel, ein Personal-Computer, Mikrocomputer, oder Arbeitsstation von konventionellem Design sein.
Jedes Programm ist vorzugsweise in eine höhere prozessuale oder Objekt-orientierte Programmiersprache implementiert, um mit einem Computersystem zu kommunizieren. Die Programme können jedoch, wenn gewünscht, in eine Programmumwandlungs- oder Maschinensprache implementiert werden. In jedem Fall, kann die Programmiersprache eine kompilierte oder interpretierte Sprache sein.
Jedes solche Computerprogramm wird vorzugsweise in einem Speichermedium oder Gerät gespeichert (z. B. ROM oder magnetische Diskette), welches für einen allgemeinen oder für Spezialzwecke programmierbaren Computer lesbar ist, für das Konfigurieren und Betreiben des Computers, wenn das Speichermedium oder -gerät von dem Computer gelesen wird, um die hierin beschriebenen Prozeduren durchzuführen. Es kann auch in Betracht gezogen werden, das erfindungsgemäße System als Computer-lesbares Speichermedium zu implementieren, welches mit einem Computerprogramm konfiguriert ist, wobei das Speichermedium so konfiguriert ist, dass es einen Computer veranlasst in einer spezifischen und vorbestimmten Art zu arbeiten, um die hierin beschriebenen Funktionen auszuführen.
Verbindungen die gemäß den Verfahren der gegenwärtigen Erfindung entwickelt wurden, können mit einer Vielzahl von in vitro und in vivo Untersuchungen zur Hormonfunktion bewertet werden. Zum Beispiel, kann die Identifikation von IGF-1R Antagonisten unter Verwendung einer Festphasen-Rezeptorbindungsuntersuchung durchgeführt werden. Potentielle Antagonisten können auf ihre Fähigkeit die Bindung von Europium-markierten IGF Liganden an lösliches, rekombinantes IGF-1R in einem auf Mikroplatten basierenden Format zu inhibieren, durchsucht werden. Europium ist ein Lanthanid-Fluorophor, dessen Gegenwart unter Verwendung zeitlich aufgelöster Fluorometrie gemessen werden kann. Die Sensitivität diese Untersuchung entspricht jener, die mit Radioisotopen erreicht wird, die Messung ist schnell und wird in einem Mikroplattenformat durchgeführt, um eine hohen Probendurchsatz zu ermöglichen, und der Ansatz gewinnt weitläufige Akzeptanz als das Verfahren der Wahl in der Entwicklung von Screens für Rezeptor Agonisten/Antagonisten (siehe Apell et. al. J. Biomolec. Screening 3: 19–27, 1998: Inglese et. al. Biochemistry 37: 2372–2377, 1998).
Die Bindungsaffinität und Inhibitorwirksamkeit kann für Inhibitorkandidaten unter Verwendung der Biosensor-Technologie gemessen werden.
Die IGF-1R Antagonisten können auf ihre Fähigkeit die Rezeptoraktivität zu modulieren unter Verwendung von auf Zellen-basierenden Untersuchungen, welche ein stabil transfiziertes, auf IGF-1 reagierendes Reportergen eingebaut haben, getestet werden (Souriau, C., Fort P., Roux P., Hartlex, O., LeFranc, M-P. und Weill, M., 1997. Nucleic Acid Res- 25, 1585–1590). Ein auf IGF-1 reagierendes, Luciferase Reportergen wurde zusammengesetzt und in 293 Zellen transfiziert. Die Untersuchung adressiert die Fähigkeit von IGF-1, das Reportergen in der Gegenwart neuartiger Liganden zu aktivieren. Es bietet eine schnelle Analyse (Ergebnisse innerhalb 6–8 Stunden nach Hormon-Exposition), mit hohem Durchsatz (Untersuchung kann in einem 96-Kammer Format für die automatische Zählung durchgeführt werden) unter Verwendung eines äußerst sensitiven Erfassungssystems (Chemilumineszenz). Sobald Verbindungskandidaten identifiziert wurden, kann ihre Fähigkeit die Signalübertragung über das IGF-1R zu antagonisieren, unter Verwendung einer Reihe von Routine in vitro zellulären Untersuchungen bewertet werden, wie z. B. die Inhibierung der IGF-1 vermittelten Zellproliferation, die Induktion der Apoptosis in Gegenwart von IGF-1 und die Ablation des IGF-1 getriebenen anheftungsunabhänigigen Zellwachstums in weichem Agar (D'Ambrosio, C., Ferber, A., Resnicoff, M. und Baserga, R., 1996, Cancer Res. 56, 4013–4020). Solche Untersuchungen können mit der P6 Zelllinie, einer Zelllinie die aufgrund der konstitutiven Überexpression von IGF-1R stark auf IGF reagiert, durchgeführt werden (45–50.000 Rezeptoren/Zelle, [Pietrzkowski, Z., Sell, C., Lammers, R., Ullrich, A. und Baserga, R., 1992, Cell Growth Diff. 3, 199–205]). Die Wirksamkeit von jedem Antagonist als ein Tumortherapeutikum kann letztendlich in vivo in Tieren, die isogene Tumortransplantate oder Tumor-Heterotransplantate tragen, wie beschrieben getestet werden (Resnicoff, M., Burgaud, J-L., Rotman, H. L., Abraham, D. und Baserga, R., 1995, Cancer Res, 55, 3739–3741; Resnicoff, M., Sell, C., Rubini, M., Coppola, D., Ambrose, D., Baserga, R. und Rubin, R., 1994, Cancer Res. 54: 2218–2222).
Tumor-Wachstums-Inhibierungsuntersuchungen können um ein Nacktmaus-Heterotransplantat-Modell herum, unter Verwendung einer Reihe von Zelllinien, entwickelt werden. Die Auswirkungen der Rezeptor Antagonisten und Inhibitoren auf das Wachstum von subkutanen Tumoren können getestet werden.
Eine weitere Verwendung der Struktur des hierin beschriebenen IGF-1R Fragments ist die Erleichterung der Strukturbestimmung von verwandten Proteinen, wie z. B. einem größeren Fragment dieses Rezeptors, einem anderen Mitglied der Insulin Rezeptorfamilie oder einem Mitglied der EGF Rezeptorfamilie. Diese neue Struktur kann entweder das Protein allein oder in Komplex mit seinem Liganden sein. Für kristallographische Analysen wird dies unter Verwendung des Verfahrens des molekularen Ersatzes in einem Programm wie XPLOR erreicht (Brunger, Meth. Enzym. 1997 276: 558–580, Navaza und Saludjian, ebd. 581–594, Tong und Rossman, ebd, 594–611, Bentley, ebd. 611–619). Bei diesem Verfahren werden Beugungsdaten von einem kristallinen Protein unbekannter Struktur gesammelt. Eine Transformation dieser Daten (Patterson Funktion) wird mit einer Patterson Funktion, die von einer bekannten Struktur berechnet wurde, verglichen. Zuerst wird die eine Patterson Funktion auf der anderen rotiert, um die richtige Orientierung des unbekannten Moleküls in dem Kristall zu bestimmen. Die Translationsfunktion wird dann berechnet, um die Lage des Moleküls hinsichtlich der Kristallachsen zu bestimmen. Sobald das Molekül richtig in der Einheitszelle positioniert worden ist, können die Anfangsphasen für die experimentellen Daten berechnet werden. Diese Phasen sind für die Berechnung einer Elektronendichtekarte, von welcher Strukturunterschiede beobachtet werden können und für die Verfeinerung der Struktur notwendig. Aufgrund von Beschränkungen in dem Verfahren, müssen die Suchmoleküle zu dem, welches bestimmt werden soll, verwandt sein. Es ist jedoch ausreichend, wenn nur ein Teil der unbekannten Struktur (z. B. < 50%) zu dem Suchmolekül ähnlich ist. Folglich kann die dreidimensionale Struktur von IGF- 1R Reste 1–462 verwendet werden die Strukturen zu lösen, die aus verwandten Rezeptoren bestehen, um, wie oben umrissen, ein Programm für die Arzneimittelentwicklung zu ermöglichen.
Zusammenfassend, können die allgemeinen Prinzipien der Rezeptor-basierenden Arzneimittelentwicklung von Fachleuten unter Verwendung der oben wiedergegebenen kristallographischen Ergebnisse verwendet werden, um Liganden von IGF-1R oder anderen verwandten Rezeptoren herzustellen, die eine ausreichende stereochemische Komplementarität haben, um eine hohe Affinitätsbindung zu der Rezeptorstelle aufzuweisen.
Die gegenwärtige Erfindung wird weiter unten unter Bezugnahme zu den folgenden, nicht-einschränkenden Beispielen beschrieben.
Beispiel 1
Expression, Reinigung und Kristallisation des IGF-1R Fragments
Mehrere Faktoren behindern die makromolekulare Kristallisation einschließlich der Probenauswahl, Reinheit, Stabilität, Löslichkeit (McPherson, A., et al., 1995, Structure 3: 759–768; Gilliland, G. L., & Ladner, J. E., 1996, Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 595–603), und der Natur und des Ausmaßes der Glycosylierung (Davis, S. J., et al., 1993, Protein Eng. 6: 229–232). Anfängliche Ansätze, um Strukturdaten des löslichen IGF-1R Ektodomänen (Reste 1–906) Proteins zu erhalten, welches in Lec8 Zellen exprimiert (Stanley, P. 1989, Molec. Cellul. Biol. 9: 377–383) und durch Affinitätschromatographie gereinigt wurde, ergab große, gut-geformte Kristalle (1,0 mm × 0,2 mm × 0,2 mm), welche kein erkennbares Röntgenbeugungsmuster ergaben (nicht veröffentlichte Daten). Auf ähnliche Schwierigkeiten stieß man mit Kristallen der strukturell-verwandten epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) Ektodomäne, welche nur auf 6 Å beugte, was für die Bestimmung einer atomaren Auflösungsstruktur unzureichend ist (Weber, W. et al, 1994, J Chromat 679: 181–189). Dies hat uns veranlasst, nach einem Fragment von IGF-1R zu suchen, welches für röntgenkristallographische Studien zugänglicher ist.
Das exprimierte Fragment (Reste 1–462) weist die L1-Cystein reiche-L2 Region der Ektodomäne auf. Die ausgewählte Verkürzungsposition bei Val462 ist vier Reste stromabwärts zu der Exon6/Exon7 Verbindung (Abbott, A. M., et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 10759–10763), und tritt an einer Position auf, an welcher sich die Sequenzen von IR und die strukturell verwandten EGFR-Familien merklich abweichen (Lax, I., et al., 1988, Molec Cell biol. 8: 1970–1978; Ward, C. W., et al., 1995, Proteins: Struct., Funct., Genet. 22: 141–153), was darauf hinweist, dass es eine Domängrenze darstellt. Die Expressionsstrategie beinhaltete die Verwendung des pEE14 Vektors (Bebbington, C. R. & Hentschel, C. C. G., 1987, In: Glover, D. M., ed. DNA Cloning, Academic Press, San Diego, vol 3, p163) in Glycosidase-defekten Lec8 Zellen (Stanley, P., 1989, Molec. Cellul. Biol. 9: 377–383), welche N-gekoppelte Oligosaccharide, denen die terminale Galactose und N-Acetylneuraminsäurereste fehlen, erzeugten (Davis, S. J., et al., 1993, Protein Eng. 6: 229–232; Liu, T., et al., 1996, J Biol Chem 271: 33639–33646). Das Konstrukt enthielt ein C-terminalen c-myc Affinitätstag (Hoogenboom, H. R., et al., 1991, Nucl Acis Res. 19: 4133–4137), welches die Immunaffinitätsreinigung durch spezifische Peptidelution erleichtert und aggressive Reinigungsbedingungen vermeidet. Diese Verfahren ergaben ein Protein, welches nach einem weiteren Gelfiltrations-Reinigungschritt leicht kristallisierten. Dies stellt ein allgemeines Protokoll bereit, um die Kristallisationsaussichten für labile, Mulitdomänen-Glycoproteine zu erhöhen.
Die Struktur dieses Fragments ist von beträchtlichem Interesse, da es die wichtigsten Determinanten, welche die Insulin und IGF-1 Bindungsspezifität bestimmen, enthält (Gustafson, T. A. & Rutter, W. J., 1990, J. Biol. Chem. 265: 18663–18667; Andersen, A. S., et al., 1990, Biochemistry, 29: 7363–7366; Schumacher, R., et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 19288–19295; Schumacher, R., et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1087–1094; Schäffer, L., et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 3044–3047; Williams, P. F., et al., 1995., J. Biol. Chem. 270: 3012–3016), und sehr ähnlich zu einem IGF-1R Fragment ist (Reste 1–486), von dem berichtet wurde, dass es als starkes, dominantes Negativ für etliche Wachstumfunktionen agiert und welches die Apoptosis von Tumorzelle in vivo induziert (D'Ambrosio, C. et al., 1996, Cancer Res. 56: 4013–4020).
Das Expressionsplasmid pEE14/IGF-1R/462 wurde durch Einfügen der Oligonukleotidekassette:
welche eine Enterokinase Spaltungsstelle, ein c-myc Epitop-Tag (Hoogenboom, H. R., et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133–4137) und ein Stopp-Kodon, in die AatII-Stelle (innerhalb Kodon 462) der Igf-1r cDNA in dem Säugetier Expressionsvektor pECE kodiert (Ebina, Y., et al., 1985, Cell, 40: 747–758; freundlicherweise von W. J. Rutter, UCSF, USA zur Verfügung gestellt) und Einfügen der DNA, die die 5' 1521 bp der cDNA (Ullrich, A., et al., 1986, EMBO J. 5: 2503–2512) aufweist, welche an die Oligonukleotid-Kasette ligiert ist, in die EcoRI-Stelle des Säugetier Plasmid-Expressionsvektors pEE14 (Bebbington, C. R., & Hentschel, C. C. G., 1987, In Glover, D. M., ed. DNA Cloning, Academic Press, San Diego, Vol. 3, p163; Celltech ltd., UK) konstruiert. Das Plasmid pEE14/IGF-1R/462 wurde in Lec8 mutante CHO Zellen, welche von der Amerikanischen Sammlung von Gewebekulturen (CRL: 1737) erhalten wurden, unter Verwendung von Lipofectin (Gibco-BRL) transfiziert (Stanley, P., 1989, Molec. Cellul. Biol. 9: 377–383). Die Zelllinien wurden nach der Transfektion in glutaminfreiem Medium (Glascow Modifizierung des Eagle's Mediums (GMEM; ICN Biomedicals, Australia) und 10% dialysiertem FCS (Sigma, Australien), welches 25 μM Methioninsulphoxim (MSX; Sigma, Australien) enthielt, wie beschrieben, aufrechterhalten (Bebbington, C. R. & Hentschel, C. C. G., 1987, In Glover, D. M., ed. DNA Cloning, Academic Press, San Diego, Vol. 3, p163). Die Transfektanten wurden auf Proteinexpression mittels Western blotting und Sandwich enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) (Cosgrove, L., et al., 1995) unter Verwendung des monoklonalen Anitkörpers (Mab) 9E10 (Evan et al., 1985) als Einfangantikörper, und entweder biotinyliertem Anti-IGF-1R Mab 24-60 oder 24-31 für die Ermittlung (Soos et al., 1992, Geschenke von Ken Siddle, Universität von Cambridge, U. K.) durchsucht. Die Kultivierung im großen Maßstab von ausgewählten Klonen, die IGF-1R/462 exprimieren, wurde in einem Celligen Plus Bioreaktor (New Brunswick Scientific, USA), welcher 70 g Fibra-Cel Scheiben (Sterilin, UK) als Träger in einem Arbeitsvolumen von 1,25 L enthält, durchgeführt. Die kontinuierliche Perfusionskultur wurde unter Verwendung von GMEM Medium, welches mit nicht essentiellen Aminosäuren, Nukleosiden, 25 μM MSX und 10% FCS ergänzt war, für 1 bis 2 Wochen aufrechterhalten, gefolgt von dem mehr angereicherten DMEM/F12 ohne Glutamin, mit den selben Ergänzungen für die nächsten 4–5 Wochen. Der Fermentationsproduktionsdurchgang wurde dreimal unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt, und resultierte in einer geschätzten Gesamtausbeute von 50 mg Rezeptorprotein aus 430 L geerntetem Medium. Das Zellwachstum war während der anfänglichen Fermentationsphasen, als GMEM Medium verwendet wurde, schlecht, verbesserte sich jedoch anschließend an den Wechsel zu dem mehr angereicherten Medium drastisch. Die Zielproteinproduktivität war im Wesentlichen während der Periode von ~100 bis 700 Stunden der 760 Stunden Fermentation konstant, wie durch ELISA unter Verwendung von Mab 9E10 als Einfangantikörper und biotinyliertem Mab 24-31 als Entwicklungsantikörper gemessen wurde.
Lösliches IGF-1R/462 Protein wurde aus geerntetem Fermentationsmedium durch Affinitätschromatographie auf Säulen, die, wie vom Hersteller empfohlen, durch Koppeln von Mab 9E10 an Divinylsulfon-aktivierten Agarosekügelchen hergestellt waren (Mini Leak; Kem En Tec, Dänemark), gewonnen. Mini-Leak niedere und mittlere Affinitätssäulen mit einer Antikörperbeladung von 1,5–4,5 mg/ml von hydrierter Matrix wurden erhalten, wobei der Beladungsbereich von 2,5–3 mg/ml die optimale Leistung ergibt (Daten nicht gezeigt). Mab9E10 wurde durch züchten von Hybridomazellen (Amerikanische Sammlung von Gewebekulturen) in serumfreien Medium im Celligen Plus Bioreaktor hergestellt und der sekretierte Antikörper (4 g) unter Verwendung von Protein A Glasskügelchen gewonnen (Prosep-A, Bioprocessing Limited, USA). Das geerntete Kulturmedium, welches das IGF-1R/462-Protein enthielt, wurde mit Tris-HCl (Sigma) auf pH 8,0 eingestellt, 0,02% (Gew.-%-Vol.-%) in Natriumazid hergestellt und mit 3–5 ml/min über 50 ml Mab 9E10 Antikörpersäulen bei 4°C geleitet. Gebundenes Protein wurde durch Rezyklieren einer Lösung von 2–10 mg des Undecamers c-myc-Peptids EQKLISEEDLN (Hoogenboom et al., 1991) in 20 ml Tris gepufferter Salzlösung, welche 0,02% Natriumazid enthält (TBSA) gewonnen. Zwischen 65% und 75% des Produkts wurde vom Medium, wie durch ELISA bestimmt, gewonnen, wobei weitere 15–25% durch einen zweiten Durchgang durch die Säule gewonnen wurden. Die Peptid Rezirkulation (~10-mal) durch die Säule eluierte das gebundene Protein effizienter als eine einzige, langsamere Elution. Das restliche gebundene Protein wurde mit Natriumzitrat-Puffer bei pH 3,0 in 1 M Tris HCl pH 8,0 eluiert, um das Eluens zu neutralisieren, und die Säulen wurden mit TBSA reäquilibriert.
Die Gelfiltration über Superdex S200 (Pharmacia, Schweden) von affinitätsgereinigtem Material zeigte einen dominanten Proteinpeak bei ~63 kDa, zusammen mit einer kleineren Menge von aggregiertem Protein (3a). Das Peak-Protein wanderte im Wesentlichen als zwei eng-beanstandete Banden in einer reduzierten Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophore (SDA-PAGE; 3b), reagierte sowohl mit Mab 24-60 als auch mit Mab 24-31 im ELISA positiv, und ergab eine einzelne Sequenz, welche den N-terminalen 14 Resten von IGF-1R entspricht. Es konnte keine Bindung von IGF-1 oder IGF-2 in einer Festplattenbindungsuntersuchung festgestellt werden (Cosgrove et al., 1995, Protein Express Purif. 6: 789–798). Das IGF-1R/462 Fragment wurde weiters durch Ionenaustauschchromatographie auf einer Resource Q (Pharmacia, Schweden) gereinigt. Unter Verwendung flacher Salzgradienten, wurde angereichertes Protein in der am langsamsten wandernden SDS-PAGE Bande erhalten (Daten nicht gezeigt), welches relativ große, wohlgeformte Kristalle bildete (siehe unten). Die isoelektrische Fokussierung zeigte das Vorhandensein einer Haupt- und zweier Nebenisoformen. Protein, welches mit einer Resource Q mit einem isokratischen Elutionsschritt von 0,14 M NaCl in 20 nM TrisCl bei pH 8,0 (Fraktion 2, 4) gereinigt wurde, zeigte eine geringere Heterogenität in der isoelektrischen Fokussierung (4, Einsatz) und SDS-PAGE (Daten nicht gezeigt), und erzeugte Kristalle von ausreichender Qualität für die Strukturbestimmung (siehe unten).
Kristalle wurden durch die hängende-Tropfen Methode durch Konzentrationsausgleich über die Dampfphase (hanging drop vapour-diffusion method) unter Verwendung von gereinigtem Protein, welches in Centricon 10 Konzentratoren (Amicon Inc, USA) auf 5–10 mg/ml in 10–20 nM Tris-HCl pH 8,0 und 0,02% (Gew.-%/Vol.-%) Natriumazid, oder 100 mM Ammoniumsulfat und 0,02% (Gew.-%/Vol.-%) Natriumazid konzentriert wurde. Die Kristallisationsbedingungen wurden zunächst unter Verwendung von dem Factorial Screen identifiziert (Jancarik, J. & Kim, S.-H., 1991, J Appl Cryst 24: 409–411) und dann optimiert. Die Kristalle wurden auf einem M18XHF Drehanodengenerator (Siemens, Deutschland), welcher mit Frank-Spiegel (MSC, USA) und RAXIS IIC und IV Bildplatten-Detektoren (Rigaku, Japan) ausgerüstet war, untersucht.
Von dem ursprünglichen Kristallisationsscreen dieses Proteins, wuchsen die Kristalle in einer Woche etwa 0,1 mm in Größe. Nach der Verfeinerung der Bedingungen, konnten Kristalle mit bis zu 0,6 × 0,4 × 0,4 mm aus einer Lösung von 1,7–2,0 M Ammoniumsulfat, 0,1 M HEPES pH 7,5 gezüchtet werden. Die Kristalle variierten hinsichtlich der Form und Beugungsqualität beträchtlich, wuchsen hauptsächlich als rhombische Prismen mit einem Längen zu Breiten-Verhältnis von bis zu 5:1, aber manchmal als rhombische Bipyramiden, wobei die letztere Form begünstigt wird, wenn Material, welches von Mab 9E10 Säulen bei pH 3,0 eluiert wurde, verwendet wird. Jeder Kristall zeigte geringfügige Gitterfehler in der Form von schwachen Linien vom Zentrum zu den Eckpunkten. Protein von aufgelösten Kristallen erschien nicht unterschiedlich zu der Proteinstammlösung zu sein, wenn es auf einer isoelektrischen Fokussierung laufen gelassen wurde. Die Kristalle beugten bei der Röntgenuntersuchung auf 3,0–4,0 Å und es wurde herausgefunden, dass sie zu der Raumgruppe P2₁2₁2₁ mit a = 76,8 Å, b = 99,0 Å, c = 119,6 Å gehören. Im Beugungsmuster offenbart sich die oben bemerkte Kristallvariabilität in einer großen (1–2°) und anisotropen Mosaikbreite, mit einer begleitenden Streuung der Auflösung. Um die Qualität der Kristalle zu verbessern, wurde sie in der Gegenwart verschiedener Zusätze gezüchtet oder wurden rekristallisiert. Diese Verfahren verfehlten die Kristallqualität im Wesentlichen zu verbessern, obwohl durch Rekristallisation größere Kristalle erhalten wurden. Die Variabilität der Kristallqualität schien auf der Proteinheterogenität zu beruhen, wie durch die Beobachtung demonstriert wurde, dass höher gereinigtes Protein, welches von Resource Q Säulen isokratisch eluiert wurde und nur eine Hauptbande bei der isoelektrischen Fokussierung zeigte (4, Einsatz), Kristalle von ausreichender Qualität für die Strukturbestimmung erzeugte. Diese Kristalle beugten zu einer 2,6 Å Auflösung mit Zelldimensionen, a = 77,0 Å, b = 99,5 Å, c = 120,1 Å und einer Mosaikbreite von 0,5°. Schwermetallderivate der IGF-1R/462 Kristalle wurden erhalten und führten zu der Bestimmung der atomaren Auflösungsstruktur dieses Fragments, welches die L1, Cystein-reiche und L2-Domänen des humanen IGF-1R enthält.
Beispiel 2
Struktur des IGF-1R/1–462
Die Kristalle wurden auf –170°C in einer Mutterlauge, welche 20% Glycerol, 2,2 M Ammoniumsulfat und 100 mM Tris bei pH 8,0 enthält, kryo-gekühlt. Native und Derivat-Beugungsdaten wurden auf Rigaku RAXIS IIc oder IV Flachendetektoren unter Verwendung von Kupper Kα-Strahlung von einem Siemens Drehanodengenerators mit Yale/MSC Spiegeloptik aufgezeichnet. Die Raumgruppe war P2₁2₁2₁ mit a = 77,39 Å, b = 99,72 Å, und c = 120,29 Å. Die Daten wurden mittels DENZO und SCALEPACK reduziert (Otwinowski, Z. Minor, W., 1996, Mode. Meth. Enzym. 276: 307–326). Die Beugung war für alle untersuchten Kristalle merklich anisotrop.
Die Phasierung wurde durch Multipler Isomorpher Ersatz (MIR) mit PROTEIN (Steigeman, W. Dissertation (Technische Universität München, 1974)) unter Verwendung von anormaler Streuung für sowohl UO2 und PIP Derivate durchgeführt. Die Statistik für die Datensammlung und Phasierung sind in Tabelle 1 gegeben. In der anfänglichen MIR Karte konnten Proteinregionen und Lösungsmittel eindeutig gesehen werden, doch der Weg des Polypeptids war keineswegs offensichtlich. Diese Karte wurde einer Lösungsmittelabflachung und einem Histogramm-Vergleich in DM unterzogen (Cowtan, K., 1994, Joint CCP4 und ESF-EACBM Newslett. Protein Crystallogr. 31: 34–38). Die Struktur wurde unter Verwendung von O (Jones, T. A., et a., 1991, Acta Crystallogr. A47: 110–119) verfolgt und wiederhergestellt und mit X-PLOR 3.851 (Brunger, A. T., 1996, X-PLOR Reference manual 3.851, Yale Univ., New Haven, CT) verfeinert. Nach 5 Runden Umbau und Energieminimierung fiel der R-Faktor auf 0,279 und Rfrei = 0,359 für Daten 7–2,6 Å Auflösung. Das derzeitige Modell enthält 458 Aminosäuren und 3 N-gekoppelte Kohlenhydrate, jedoch keine Lösungsmittelmoleküle. Für Reste mit B(Ca) > 70, sind Å atomare Positionen weniger zuverlässig (37–42, 155–159, 305, 336–341, 404–406, 453–458). Es gibt eine schwache Elektronendichte für die Reste 459–461, aber der c-myc-Schwanz erscheint völlig ungeordnet.
Das 1–462 Fragment besteht aus dem N-terminalen drei Domänen des IGF-1R (L1, Cys-reich, L2) und enthält Bereiche des Moleküls, welche die Ligandenspezifität diktieren (17–23). Das Molekül nimmt eine einigermaßen langestreckte Struktur (ungefähr 40 × 48 × 105 Å) wobei die Domäne 2 (Cys-reiche Region) entlang der Länge der Domäne 1 (L1) in Kontakt ist, jedoch nur wenig Kontakt mit der dritten Domäne (L2) besteht (siehe 5). Dies lässt einen Raum im Zentrum des Moleküls von ungefähr 24 Å × 24 Å × 24 Å, welcher an drei Seiten durch die drei Domänen des Moleküls gebunden ist. Der Raum ist von ausreichender Größe, um den Ligand, IGF-1, aufzunehmen. Tabelle 1: Zusammenfassung der kristallographischen Daten

^a PIP: Di-μ-iodbis(ethylendiamin)diplatindinitrat, UO₂Ac₂, Uranylacmetat
^b R_merge = Σ_hΣ_j|I_h,j – I_h|/Σ_hΣ_jI_h, wobei I_h,j eine Intensitätsmessung und I_h die mittlere Intensität für diese Reflektion h ist,
^c R_cullis = Σ_h||F_PH – F_P| – |F_Hber||/Σ_h||F_PH| – |F_P||, wobei F_PH, F_P bzw. F_Hber sind abgeleitete, native und Schweratom-Strukturfaktoren für zentrale Reflektionen h sind,
^d Phasing Power = Σ_h|F_Hber|/Σ_hε, wobei F_Hber oben definiert ist, und ε ist das Fehlen der Schließung.
^e FOM (Berwertungskriterium: figure of merit) = <cos(Δα_h)>, wobei (Δα_h) der Fehler im Phasenwinkel für Reflektion h ist. Werte sind vor und nach der Dichtemodifikation bei 3,0 bzw. 2,8 Å Auflösung angegeben
^f R_Krist und R_frei sind in Brunger, A. T., XPLOR Referenzmanual 3,851 (Yale Univ., New Haven, CT, 1996) definiert.
^g Standardabweichungen von idealen Bindungen und winkelbezogenen (1–3) Abständen

Die L Domänen
Jede der L Domänen (Reste 1–150 und 300–460) nimmt eine kompakte Form (24 × 32 × 37 Å) ein, die aus einer einzelsträngigen rechtsgängigen β-Helix besteht und an den Enden durch kurze α-Helices und Disulfidbindungen abgeschlossen ist. Der Körper der Domänen sieht wie ein Brotlaib aus, wobei die Basis von einem flachen sechssträngigen β-Faltblatt, 5 Reste lang gebildet ist, und die Seiten sind 3 Reste lange β-Faltblätter (5 und 6). Der obere Teil ist irregulär, ist jedoch an Stellen für die zwei Domänen ähnlich. Die zwei Domänen sind mit einer Standardabweichung in Cα-Postionen von 1,6 Å für 109 Atome überlagerbar (7). Obwohl diese Faltung an andere β-Helix Proteine erinnert, ist es viel einfacher und kleiner und mit weniger Einzelheiten, und folglich stellt es eine neue Superfamilie von Domänen dar. Ein beträchtlicher Unterschied zwischen den zwei Domänen ist, dass der Indolring von Trp 176 der Cys-reichen Region (6B) in den hydrophoben Kern der L1 eingesetzt ist, und die C-terminale Helix ist nur verkümmert (8). Das Sequenzmotiv von Resten für die Insulin Rezeptorfamilie, welche die Trp-Tasche in L1 bilden, kommt in L2 nicht vor (6a). Im EGF-Rezeptor jedoch, welcher eine zusätzliche Cys-reiche Region nach der L2 Domäne (14,15) aufweist, kann das Taschenmotiv in beiden L-Domänen gefunden werden und das Trp ist in beiden Cys-reichen Regionen konserviert (6b).
Die wiederholende Natur der β-Helix ist in der Sequenz wiedergespiegelt und die ersten fünf Wendungen wurden von Bajaj, M. et al. (1987, Biochim. Biophys. Acta 916: 220–226) richtig identifiziert, die konservierten Gly Reste, welche in den Wendungen gefunden werden, bilden eine Unterkante der Domäne. Ihre Schlussfolgerungen über die Faltung waren jedoch inkorrekt. Die „helixartigen" Wiederholungen sind tatsächlich ein Paar von Krümmungen an der oberen Kante der Domäne. In ihrem Motiv V, ist das Gly nicht in einer Krümmung, wird aber von einer Einfügung einer konservierten Schleife von 7–8 Resten gefolgt (siehe 6a). Glycin ist in den Gly-Krümmungen strukturell wichtig, da Mutationen dieser Reste das -Falten des Rezeptors aufweist (van der Vorm, E. R., et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 66–71; Wertheimer, E. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 7587–7592).
Der Vergleich der L Domänen mit anderen rechtsgängigen β-Helix-Strukturen wie z. B. Pectatlyase (Yoder, M. D., et al. 1993, Struktur, 1: 241–251–1507) und das p22 Tailspike-Protein (Steinbacher, S., et al., 1997, J. Mol. Biol. 267: 865–880) zeigt einige bemerkenswerte Ähnlichkeiten sowie Unterschiede. In allen Fällen waren die Enden der Domänen durch α-Helices abgeschlossen, die L-Domänen hatten jedoch ebenfalls eine Disulfid-Bindung an jedem Ende um die Termini zu halten. Die anderen β-Helix-Domänen sind beträchtlich länger und weisen eine signifikante Verdrehung ihrer Faltblätter auf, während die L-Domänen flache Faltblätter aufweisen. Obwohl die Größe der Helixwiederholungen ähnlich sind (hier 24–25 Reste vs. 22–23 für Pectatlyase) sind die Querschnitte recht unterschiedlich. Die L-Domänen haben einen rechteckigen Querschnitt, während Pectatlyase und p22 Tailspike Protein V-förmig sind, und einige, teilweise recht große, Kreuzungen aufweisen (Yoder, M. D., et al., 1993, Structure; 1: 241–251–1507; Steinbacher, S., et al., 1997, J. Mol. Biol. 267: 865–880). Ein gemeinsames Merkmal in dem hydrophoben Kern ist das Stapeln von aliphatischen Resten von aufeinander folgenden Wendungen der β-Helix, und in der Nähe des C-Terminus von jeder L-Domäne ist eine kurze Asn-Leiter, welche an die lange in der Pectatlyase beobachtete Asn-Leiter erinnert (Yoder, M. D., et al., 1993, Structure 1: 241–251–1507). An der gegenüberliegenden Seite der L-Domänen haben die Gly-Krümmung, sowie die zwei Krümmungen und das Faltblatt, die vorangehenden, in anderen β-Helix Domänen kein Gegenstück. Obwohl die L-Domänen auf ähnlichen Prinzipien wie andere β-Helix Domänen aufgebaut sind, stellen sie eine getrennte Superfamilie dar.
Die Cys-reiche Domäne
Die Cys-reiche Domäne ist aus acht Disulfid-gebundenen Modulen aufgebaut (6b), wobei die erste von diesen Stellen am Ende von L1 sitzt, während die verbleibenden ein gekrümmtes Stäbchen, welches diagonal über L1 verläuft und L2 erreicht, bilden (5). Die Stränge in den Modulen 2–7 verlaufen annähernd rechtwinkelig zu der Achse des Stäbchens in einer Weise, die eher zu Laminin (Stetefeld, J., et al., 1996, J. Mol. Biol. 257: 644–657) als zu TNF Rezeptor (Banner, D. W., et al., 1993, Cell, 73: 431–445) ähnlich ist, jedoch ist die modulare Anordnung der Cys-reichen Domäne unterschiedlich zu jenen in anderen Cys-reichen Proteinen, von denen die Strukturen bekannt sind. Die ersten 3 Module des IGF-1R haben einen gemeinsamen Kern, der ein Paar von Disulfidbindungen enthält, zeigen jedoch eine beträchtliche Variation in den Schleifen (6b). Der Zusammenhang dieser Module ist der gleiche wie für die erste Hälfte von EGF (Cys 1–3 und 2–4), jedoch scheint ihre Struktur nicht eng mit einem beliebigen Mitglied der EGF-Familie verwandt zu sein. Module 4 bis 7 haben ein unterschiedliches Motiv, einem β-Finger, und stimmen am besten mit den Resten 2152–2168 von Fibrillin (Dowling. A. K., et al., 1996, Cell, 85: 597–605) überein. Jedes ist aus drei Polypeptid-Strängen aufgebaut, wobei das erste und das dritte Disulfid-gebunden sind, und die letzten zwei ein β-Band bilden. Das β-Band von jedem β-Finger Modul reiht sich antiparallel auf, um ein fest verdrehtes 8-strängiges β-Faltblatt (5 und 8) zu bilden. Modul 6 weicht von dem gemeinsamen Muster ab, wobei das erste Segment durch eine α-Helix ersetzt ist, gefolgt von einer großen Schleife, welche wahrscheinlich eine Rolle in der Ligandenbindung spielt (siehe unten). Da Modul 5 am meisten zu Modul 7 ähnlich ist, ist es möglich, dass die vier Module von einer seriellen Genduplikation entstanden. Das letzte Modul ist eine Disulfid-gekoppelte Krümmung von fünf Resten.
Die Tatsache, dass die zwei wichtigsten Arten von Cys-reichen Modulen getrennt auftrennten, impliziert, dass diese die minimalen Baueinheiten von Cys-reichen Domänen, die in mehreren Proteinen gefunden werden, sind. Obwohl es nur 16 Reste aufweisen kann, ist das Motiv der Module 4 bis 7 eindeutig verschieden, und in der Lage eine reguläre langgestreckte Struktur zu bilden. Folglich kann in Erwägung gezogen werden, dass Cys-reiche Domänen, wie z. B. diese, aus Wiederholungseinheiten gebildet sind, wobei jede aus einer kleinen Anzahl von Modulen aufgebaut ist.
Hormonbindung
Es wurden Versuche unternommen die IGF-1 (und Insulin) Bindungsstelle zu lokalisieren indem natürliche (Taylor, S. L, 1992, Diabetes, 41: 1473–1490) und ortsspezifische Mutanten (Williams, P. F., et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 3012–3016; Mynarcik, D. C. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 2439–2442; Mynarcik, D. C., et al., 1997, J. biol. Chem. 272: 2077–2081), chimäre Rezeptoren untersucht wurden (Andersen, A. S. et al., 1990, Biochemistry 29: 7363–7366; Gustafson, T. A., & Rutter, W. J., 1990, J. Biol. Chem. 265: 18663–18667; Schäffer, L., et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 3044–3047; Schumacher, R., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1087–1094; Kjeldsen, T., et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4404–4408) und durch Vernetzungstudien (Wedekind, F., et al., 1989, Biol. Chem Poppe-Seyler, 370: 251–258; Fabry, M., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8950–8956; Waugh, S. M., et al., 1989, Biochemistry, 28: 3448–3458; Kurose, T., et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 29190–29197–34). IGF-1R/IR Chimäre zeigen nicht nur welche Regionen der Rezeptoren für die Ligandenspezifität verantwortlich sind, sonder stellen auch ein wirksames Mittel zum Identifizeiren von einigen Teilen der Hormonbindungstelle bereit. Paradoxerweise, sind die Regionen, welche die Spezifität kontrollieren, für Insulin und IGF-1 nicht dieselben. Das Austauschen der ersten 68 Reste des IGF-1R mit denen von IR, verleiht dem chimären IGF-1R eine Insulin-bindende Fähigkeit (Kjeldsen, T., et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci; USA, 88: 4404–4408), und das Austauschen der Reste 198–300 in der Cys-reichen Zone von IR mit den entsprechenden Resten 191–290 von IGF-1R ermöglicht dem chimären Rezeptor IGF-1 zu binden (Schäffer, L., et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 3044–3047). Folglich kann ein Rezeptor konstruiert werden, welcher sowohl IGF-1 als auch Insulin mit nahezu nativer Affinität bindet. Es ist von der Struktur her klar, dass wenn das Hormon im zentralen Raum gebunden ist, dass es mit beiden dieser Regionen in Kontakt treten kann. Aus der Analyse on einer Reihe von Chimären, welche von Gustafson, T. A., & Rutter, W. J. (J. Biol. Chem. 265: 18663–18667, 1990) untersucht wurden, kann die Spezifität-Bestimmungsgröße in der Cys-reichen Region weiters auf die Reste 223–274 beschränkt werden. Diese Region entspricht den Modulen 4–6 und beinhaltet eine große und einigermaßen mobile Schleife (Reste 255–263, Mittelwert B[Cα Atome] = 57 Å2), welche sich in den zentralen Raum erstreckt (siehe 5). Diese Schleife ist im IR um vier Reste größer, und ist durch eine zusätzliche Disulfidbindung stabilisiert (Schäffer, L. & Hansen, P. H., 1996, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 104, Suppl. 2, 89). Die größere Schleife von IR kann dazu dienen, um IGF-1 von der Hormonbindungsstelle auszuschließen, während dem kleineren Insulinmolekül ermöglicht wird zu binden. Es ist interessant anzumerken, dass der homologe Teil des Moskito IRs, welcher eine Schleife aufweist, die um 2 Reste größer ist als die des Säugetier IRs, ebenfalls Insulin, nicht jedoch IGF-1 zu binden scheint (Graf, R., et al., 1997, Insect Molec. Biol. 6: 151–163). Die Analyse der Struktur deutet darauf hin, dass die Insulin/I GF-1 Spezifität durch Reste in dieser Schleife (Aminosäuren 253–272 in IGF-1R; Aminosäuren 260–283 in IR) kontrolliert ist.
Da Chimäre nur die Reste, die zwischen den zwei Rezeptoren verschieden sind, adressieren, kann eine präzisere Analyse der Stelle von Einzelstellen-Mutanten erhalten werden. Insbesondere wurden von einer Alanin-Ersatzstudie vier Regionen von L2, welche für die Insulinbindung wichtig sind, identifiziert (Williams, P. F., et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 3012–3016). Die ersten drei sind an ähnlichen Positionen von drei aufeinander folgenden Wendungen der β-Helix und die vierte liegt auf der konservierten Wölbung auf dem großen β-Faltblatt. Deshalb gibt es einen Abdruck für die Insulinbindung an die L1' Domäne, welche auf der ersten Hälfte des großen β-Faltblattes, welches dem zentralen Raum zugewandt ist, liegt. Weiters entlang des Faltblattes angeordnete Reste, welche im IGF-1R konserviert sind, können ebenfalls wichtig sein. Die konservierte Substitution von Leucin zu Methionin am Rest 119 von IR (113 von IGF-1R) verursacht eine milde Form von Leprechaunismus (Hone, J., et al., 1994, J. Med. Genet. 31, 715–716). Dieser Rest ist verdeckt, und die Mutation könnte die benachbarten Reste stören, um die Insulinbindung zu beeinflussen.
Die Achse der L2 Domäne ist senkrecht zu der von der L1 Domäne, und das N-terminale Ende ihrer β-Helix wird der Hormonbindungstelle präsentiert. Die bisher einzige auf dieser Oberfläche der L2 Domäne untersuchte Mutation ist der natürlich vorkommende IR-Mutant, S323L, welcher das Rabson-Mendehall-Syndrom und schwere Insulin-Resistenz verursacht (Roach, P., 1994, Diabetes 43: 1096–1102). Da diese Mutante nur die Insulinbindung und nicht die Zelloberflächenexpression beeinflusst, ist der Rest 323 von IR (Rest 313 von IGF-1R) wahrscheinlich an oder in der Nähe der Bindungsstelle. Dieser Rest liegt strukturell in der Mitte einer Region (Reste 309–318 von IGF-1R) die sowohl in IR als auch in IGF-1R konserviert ist, und die umgebende Region, 332–345 (von IGF-1R) ist ebenfalls in diesen Rezeptoren (6a) gut konserviert. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass diese Region einen Teil der Hormonbindungstelle bildet, ohne dass diese bei Chimären entdeckt worden wäre. Es ist interessant anzumerken, dass in dieser Region IRR nicht so gut wie in den anderen zwei Rezeptoren konserviert ist (Shier, P. & Watt, V. M., 1989, J. Biol. Chem. 264: 4605–14608).
Der Abstand von dieser mutmaßlichen Hormonbindungsregion auf L2 zu der, welche auf L1 gefunden wird, beträgt etwa 30 Å (5). Somit scheinen L1 und L2 zu weit auseinander zu sein um IGF-1 oder Insulin zu binden. In der Kristallstruktur ist jedoch eine tiefe Spalte zwischen Teil der Cys-reichen Domäne (Rest 262) und L2 (Rest 305), und diese Spalte wird durch eine Schleife eines benachbarten Moleküls belegt. Somit erscheint es wahrscheinlich, dass die Position der L2 Domäne in der Rezeptorstruktur oder dem Hormon-Rezeptorkomplex eine unterschiedliche Position in Bezug auf die Cys-reiche Domäne, denn die in dem Kristall gefunden wird, annimmt. Die erforderliche Bewegung um L2 ausreichend dicht an L1 heranzubringen ist gering, nämlich eine Rotation von ungefähr 25° um Rest 298.
Eine Reihe von IR Mutanten sind identifiziert worden, welche konstitutiv den Rezeptor aktivieren, und die Mehrheit von diesen werden in der α-Kette gefunden. Kurioserweise beinhalten alle α-Ketten Mutanten Veränderung zu oder von Prolin oder der Deletion von einer Aminosäure, was impliziert, dass sie lokale strukturelle Umordnungen verursachen. Die Mutation R86P ist ähnlich zum Wildtyp, jedoch reduziert R86P die Zelloberflächenexpression und Insulinbindung während sie konstitutiv die Autophosphorylierung aktiviert (Grønskov, K. et al., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 905–911). Die Prolin-Mutation stört wahrscheinlich die auf 87 vorangehenden Reste, welche in der Verbindung zwischen L1 und der Cys-reichen Domäne liegen, könnte aber auch die Insulinbindung beeinflussen. Die Reste 233, 281, 244 und 247 von IR in der Cys-reichen Domäne sind in IGF-1R nicht konserviert (6b), dennoch verursachen L233P (Klinkhamer, M. P. et al., 1989, EMBO J. 8, 2503–2507), Deletion von N281 (Debois-Mouthon, C., et al., 1996, J. Clin. Endochronol. Metab. 81, 719–727) oder die dreifach Mutante P243R, P244R und H247D (Rafaeloff, R., et al., 1989, J. Biol. Chem. 264, 15900–15904) eine konstitutive Kinase Aktivierung. Aufgrund ihrer Lage, erscheint es wahrscheinlich, dass jede der drei Mutanten die Faltung einer β-Finger-Domäne und wiederum die strukturelle Integrität der stäbchenartigen Cys-reichen Domäne aufweisen. Diese strukturellen Auswirkungen dieser Mutationen könnte für die gesamte Rezeptor-Ektodomäne signifikant sein, da das Stören der L1/Cys-reichen Schnittstelle oder das Verzerren der stäbchenartigen Domäne, die relative Position von L1 und der cys-reichen Domäne in diesem Zusammenhang beeinflussen könnte.
L1 ist weiters impliziert worden, da herausgefunden wurde, dass die Deletion von K121, auf der gegenüberliegenden Seite von L1, aus der Cys-reichen Domäne eine Autoposphorylierung verursacht (Jospe, N. et al., 1994, J. Clin. Endochronol. Metab. 79, 1294–1302). Im Gegensatz dazu beeinflusst diese Mutation die Insulinbindung nicht. Somit ergibt sich ein möglicher Mechanismus für die Insulinbindung und Signalübertragung. Wenn Insulin zwischen L1 und L2 bindet, modifiziert es die relative Position von L1 und der Cys-reichen Domäne im Rezeptor, vielleicht durch eine Gelenksbewegung zwischen L2 und der Cys-reichen Domäne, wie oben vorgeschlagen wurde, und die strukturelle Umordnung wird über die Plasmamembran übertragen. In der Abwesenheit von Insulin kann dasselbe Signal durch Mutationen in der Cys-reichen Region oder an der L1/Cys-reichen Verbindung initiiert werden, jedoch auf Kosten der Insulinbindung. Das Signal kann direkter durch Mutationen auf der gegenüberliegenden Seite von L1 initiiert werden, welche die Interaktion von L1 mit anderen Teilen der Ektodomäne beeinflussen, möglicherweise die andere Hälfte des Rezeptordimers.
Ligandenstudien
Obwohl es keine strukturellen Informationen über einen IGF-1/IGF-1R-Komplex gibt, wurde in einer Reihe von Studien die Natur dieser Interaktion untersucht. Die Ergebnisse von Vernetzungsexperimenten mit IGF-1 und Insulin und ihren verwandten Rezeptoren sind mit der Hormonbindungsstelle, wie oben vorgeschlagen, vereinbar. Zum Beispiel kann B29 von Insulin mit der Cys-reichen Region (Reste 205–316) (Yip, C. C., et al., 1988, Biochim. Biophys. Res. Commun. 157: 321–329) oder der L1 Domäne (Wedekind, F., et al., 1989, Bio. Chem. Hoppe-Seyler, 370: 251–258) vernetzt werden. Diese zwei Regionen sind jedoch einigermaßen gut getrennt, und diese Studien können darauf hinweisen, dass B29 mobil ist. Andere Studien bilden diese Stelle leider nicht mehr so präzise ab.
Analoga und ortsspezifische Mutanten von IGF-1 und IGF-2 waren mehr von Erfolg gekrönt. IGF-1 und IGF2 enthalten in Bezug auf Insulin zwei zusätzliche Regionen, Die C-Region zwischen B und A und ein D Peptid am C-Terminus. Bei IGF-1 reduzierte der Austausch der C Region durch ein vier Gly-Linker die Affinität für IGF-1R um einen Faktor von 40, jedoch erhöhte sich die Affinität für IR fünffach (Bayne, M. L., et al., 1988, J. Biol. Chem. 264: 11004–11008). Die Veränderungen der Affinität sind mit der Deletion von IGF-1 komplementierenden Unterschieden in der Cys-reichen Regionen von IGF-1R und IR, wie oben festgestellt, vereinbar. Mutationen von Resten auf beiden Seiten der C-Region (Rest 24 für IGF-1 (Cacieri, M. A., et al., 1988, Biochemistry 27: 3229–3233), Reste 27, 43 für IGF-1, (Sakano, K., et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 20626–20635)) haben ebenfalls schädliche Wirkungen auf die Affinität des Hormons für IGF-1R, wie Verkürzungen des nahe liegenden D Peptids in IGF-2 haben (Roth, B. V., et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 181: 907–914).
Insulin ist weitgehend mutiert worden. Bindungstudien (zusammengefasst in Kristensen, C. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 12978–12983) weisen darauf hin, dass Insulin seinen Rezepter über eine hydrophobe Stelle (Reste A2, A3, A19, B8, B11, B12, B15 und möglicher weise B23 & B24) binden kann. Diese Stelle ist jedoch normalerweise verdeckt, und erfordert das Entfernen des C-Terminus der B-Kette von der betrachteten Position. Unter der Annahme, dass IGF-1, IGF-2 und Insulin ihre Rezeptoren in derselben Orientierung binden, weisen diese Daten auf eine ungefähre Orientierung des Hormons, wenn es an den Rezeptor gebunden ist, hin.
Ein bemerkenswertes Merkmal von IGF-1 und IGF-2 ist die große Anzahl von geladenen Resten und ihre ungleiche Verteilung über die Oberfläche. Basische Reste werden hauptsächlich in der C-Region gefunden und in Lösung ist diese Region sowohl in IGF-1 als auch IGF-2 nicht wohl-geordnet (Sato, A., et al., 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41: 433–440; Torres, A. M., et al., 1995, J. Mol. Bio. 248: 385–401). Im Gegensatz dazu, hat die Bindungsstelle des Rezeptors eine ziemlich große Stelle an sauren Resten und zwar in der Ecke, wo die Cys-reiche Domäne die L1 verlässt. Andere saure Reste, welche für diesen Rezeptor spezifisch sind, werden entlang der Innenfläche der Cys-reichen Domäne und der Schleife (Reste 255–263), welche sich von Modul 6 erstreckt, gefunden. Es ist somit möglich, dass elektrostatische Wechselwirkungen eine wichtige Rolle in der IGF-1 Bindung spielen, wobei die C-Region an die saure Stelle der Cys-reichen Region in der Nähe von L1 bindet und die saure Stelle auf der anderen Seite des Hormons ist in Richtung einer kleinen Stelle von basischen Resten (Reste 307–310) am N-terminalen Ende von L2 gerichtet.
Obwohl die Struktur von diesem Fragment signifikante Informationen über die Natur der Hormonbindungsstelle ergibt, ist von Reste außerhalb dieser Region gezeigt worden, dass sie die Bindung des Liganden beeinflussen. Eine Reihe von Studien haben die Reste 704–715 von IR impliziert (Mynarcik, D. C. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 2439–2442; Kurose, T., et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 29190–29197). Diese Reste könnten mit Insulin über eine der in der derzeitigen Struktur offen gelassenen Seiten in Kontakt treten. Unter Verwendung von am B1 Rest markierten Insulin, vernetzte Fabry, M. et al. (1992, J. Biol. Chem. 267: 8950–8956) Insulin mit dem Fragment 390–488, von welchem Teile nicht in der Nähe der Stelle, wie beschriebenen ist, sind. Die Erklärung dafür könnte sein, dass entweder die Region 390–488 zu der Hormonbindungsstelle zurückreicht, oder diese Region ein anderes Hormon, welches an die andere Hälfte des Rezeptors gebunden ist, berühren könnte. Weitere strukturelle Informationen sind vonnöten, um festzustellen, wie diese anderen Regionen das Hormon berühren und um zu erklären, wie die Bindung des Hormons an die Kinase innerhalb der Zelle kommuniziert wird.
Die hierin vorgelegte Struktur der L1-Cys-reiche-L2-Domänen von IGF-1R stellt die erste strukturelle Information für den extrazellulären Bereich eines Mitglieds der Insulinrezeptorfamilie dar. Die L Domänen zeigen ein neuartige Faltung, welche zu der EGF Rezeptorfamilie gehört, und die modulare Architektur der Cys-reichen Domäne impliziert, dass kleinere Baueinheiten verwendet werden sollten, um die Zusammensetzung der Cystein-reichen Domänen zu beschreiben. Dieses Fragment beinhaltet die bedeutendste Spezifitätsbestimmungsgröße der Rezeptoren dieser Klasse für ihre Liganden. Es hat eine längliche Struktur mit einem Raum in der Mitte, welche den Ligand aufnehmen könnte. Die drei Seiten dieser Stelle entsprechen Regionen, die mit der Hormonbindung in Zusammenhang gebracht wurden. Obwohl andere Stellen in der Rezeptor Ektodomäne vorhanden sind, welche mit dem Ligand interagieren, gibt uns diese Struktur eine anfängliche Ansicht, wie das Insulin, IGF-1, und IGF-2 mit ihren Zelloberflächenrezeptoren interagieren können, um ihre metabolischen und mitogenen Wirkungen zu kontrollieren.
Durch solche Informationen werden wertvolle Einsichten in die Struktur der entsprechenden Domänen des IRs und des Insulin Rezeptor-related Rezeptors sowie von Mitgliedern der verwandten EGFR Familie bereitgestellt (Bajaj, M., et al. 1987, Biochim Biophys Acta 916: 220–226; Ward, C. W., et al., 1995, Proteins: Struct Funct Genet 22: 141–153).
Beispiel 3
Vorhersage der 3D Struktur der entsprechenden Domänen von IRR und IR, basierend auf der Struktur des IGF-1R Fragments.
Die Sequenzidentitäten zwischen den verschiedenen Mitgliedern der Insulin-Rezeptorfamilie sind ausreichend, um genaue Sequenzausrichtungen zu ermöglichen, um die 3D Struktur-Vorhersage durch Homologie-Modellierung zu erleichtern. Die Ausrichtungen der Ektodomänen von humanem IGF-1R, IR, und IRR sind in 9 gezeigt.
Beispiel 4
Einzelmolekül-Bildgebung der humanem Insulin-Rezeptorektodomäne und seiner Fab Komplexe
Klonierung und Expression von hIR-11 Ektodomän-Protein
Ein Klon voller Länge der humanen IR Exon-11 Form (hIR-11) wurde durch Austauschen eines AatII-Fragmentes, Nukleotide 1195 bis 2987, des Exon +11 Klons (plasmid pET; Ellis et al., 1986; Geschenk von Dr. W. J. Rutter, UCSF) von hIR (Ebina et al., 1985, Cell 40, 747–758) mit einem äquivalenten AatII-Fragments von einem Plasmid (pHIR/P12-1, ATCC 57493), welches Teile der extrazellulären Domäne und die gesamte cytoplasmatische Domäne von hIR-11 (Ullrich et al., 1985, Nature 313, 756–761) kodiert, hergestellt. Das Ektodomän-Fragment von hIR-11 (2901 bp, kodiert die 27 Reste Signalsequenz und Reste His1-Asn914) wurde durch SalI und SspI Verdau und Einfügen in einen Säugetier Expressionsvektor PEE6.HCNV-GS (Celltech Limited, Slough, Berkshire, UK) hergestellt, in welchen ein Stopp-Kodon Linker eingefügt wurde, wie vorher (Cosgrove et al., 1995, Protein Expression and Purification 6, 789–798) für die hIR Exon +11 Ektodomäne beschrieben ist.
Das resultierende rekombinante Plasmid pHIR II (2 μg) wurde in glycosylierungsdefiziente Chinesische Hamster Ovarium (Lec 8) Zellen (Stanley, 1989, Molec. Cellul. Biol. 9, 377–383) mittels Lipofection (Gibco-BRL) transfiziert. Nach der Transfektion, wurden die Zellen in glutaminfreiem Medium GMEM (ICN Biomedicals, Australia), wie zuvor beschrieben (Bebbington & Hentschel, 1987, In DNA Cloning (Glover, D., ectodomain.), Vol III, Academic Press, San Diego; Cosgrove et al., 1995, Protein Expression and Purification 6, 789–798) aufrechterhalten. Exprimierende Zelllinien wurden für Wachstum in GMEM mit 25 μM Methioninsulfoximin (MSX, Sigma) ausgewählt. Transfektanten wurden auf Proteinexpression mittels Sandwich-ELISA mit anit-IR monoklonalen Antikörpern 83-7 und 83-14 gescreent. Die metabolische Markierung von Zellen, Immunausfällungen, Insulinbindungsuntersuchungen und Scatchard Analysen wurden, wie vorher für die Exon +1 Form der hIR Ektodomäne beschrieben (Cosgrove et al., 1995, Protein Expression and Purification 6, 789–798), durchgeführt.
Herstellung und Reinigung der hIR-11 Ektodomäne
Der ausgewählte Klon (Inokulum von 1,28 × 10⁸ Zellen) wurde in einer mit 10 g Fibracel Scheibenträgern gepackten Spinner-Flasche in 500 ml 10% fötales Kälberserum (FCS) und 25 μM MSX enthaltendem GMEM Medium gezüchtet. Der Selektionsdruck wurde für die Dauer der Kultur aufrechterhalten.
Die Ektodomäne wurde von geerntetem Medium durch Affinitätschromatographie an immobilisiertem Insulin gewonnen, und durch Gelfiltrationchromatographie an Superdex S200 (Pharmacia; 1 × 40 cm) in 0,02% Natriumazid enthaltender Tris-gepufferter Salzlösung (TBSA) weiters gereinigt, wie vorher beschrieben (Cosgrove et al., 1995, Protein Expression and Purification 6, 789–798). Die Lösungen der gereinigten hIR-11 Ektodomäne wurden vor der Verwendung bei 4°C gelagert.
Herstellung von Fab Fragmenten und ihren Komplexen mit Ektodomänen
Die Reinigung von Mabs 83-7, 83-14 und 18-44 aus Ascitenflüssigkeit durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A-Sepharose, und die Herstellung von Fabs basierten auf den Methodologien, die in Coligan et al., 1993, Current Protocols in Immunology, Vol 1, pp 2.7.1–2.8.9, Greene Publishing Associates & Wiley – Interscience, John Wiley und Sons beschrieben sind. Das Fab wurde aus monoklonalem Antikörper durch Mercuripapain-Verdau für 1 bis 4 Stunden, gefolgt von der Gelfiltration an Superdex S200 hergestellt. Die Produkte wurden durch reduzierende und nicht-reduzierende SDS-PAGE überwacht. Für 83-7 Mab, einem IgG Typ 1 monoklonalen Antikörper, wurde das durch dieses Verfahren isolierte bivalente (Fab)2' zu monovalentem FAB 83-7 unter milder Reduktion mit nM L-Cystein·HCl in 100 nM Tris pH 8,0 reduziert (Coligan et al., 1993, Current Protocols in Immunology, Vol 1, pp 2.7.1–2.8.9, Greene Publishing Associates & Wiley – Interscience, John Wiley and Sons).
Komplexe von Fab mit hIR-11 Ektodomäne wurden durch Mischen von ~2,5 bis 3,5 molarer Überschuss an Fab mit hIR-11 Ektodomäne bei Umgebungstemperatur in TBSA bei pH 8,0 hergestellt. Nach 1–3 Stunden wurde der Komplex von ungebundenem Fab durch Gelfiltration über eine Superdex S200 Säule im selben Puffer getrennt.
Elektronenmikroskopie
Unkomplexierte hIR-11 Ektodomäne und die oben beschriebenen Fab Komplexe wurden in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Konzentration in der Größenordnung von 0,01–0,03 mg/ml verdünnt. Vor der Verdünnung wurde 10% Glutaraldehyd (Fluka) zum PBS hinzugefügt, um eine endgültige Konzentration von 1% Glutaraldehyd zu erreichen. Tropfen von ~3 ml dieser Lösung wurden auf einen dünnen Kohlenstofffilm auf 700 mesh Goldgitter, nach Glimmentladung in Stickstoff für 30 s aufgetragen. Nach 1 Minute wurde die überschüssige Proteinlösung abgezogen, gefolgt von der Auftragung und Rücknahme von 4–5 Tropfen eines negativen Färbemittels (2% Uranylacetat (Agar), 2% Uranylformat (K und K), 2% Kaliumphosphowolframat (Sondieren und Stucture) mit KOH auf pH 6,0 eingestellt oder 2% Methylaminwolframat (Agar) mit NH4OH auf pH 6,8 eingestellt). In den Fällen der sowohl Uranylacetat- als auch Uranylfomatfärbung, wurde eine Zwischenwaschung mit 2 oder 3 Tropfen PBS vor der Auftragung des Färbemittels eingefügt. Die Gitter wurden luftgetrocknet und dann mit einer 60 kV Beschleunigungsspannung in einem JEOL 100B Transmissionselektronenmikroskop bei einer Vergrößerung von 100.000 × untersucht. Es wurde herausgefunden, dass es eine typische Dicke an negativem Färbemittel gab, in welchem die Fabs äußerst leicht gesehen wurden. Es mussten daher Bereiche für die Photographie von bestimmten Zonen des Gitters ausgewählt werden. Die elektonenmikroskopische Aufnahmen wurden auf einem Kodak SO-163-Film aufgenommen und in unverdünntem Kodak D19 Entwickler entwickelt. Die Elektron-optische Vergrößerung wurde unter identischen Bildgebungsbedingungen kalibriert, indem Einzelmolekülbilder eines Antigen-Antikörper-Komplex des Influenza-Virus Neuraminidase-Kopfs und NC10 MFab aufgezeichnet wurde (Tulloch et al., 1986, J. Mol. Biol. 190, 215–225; Malby et al., 1994. Structure, 2, 733–746).
Bildverarbeitung
Elektronenmikroskopische Aufnahmen, welche Partikel in einer beschränkten Anzahl von identifizierbaren Projektionen zeigen, wurden für die Digitalisierung ausgewählt. Die Mikroaufnahmen wurden auf einem Perkin-Eimer Model 1010 GMS PDS Flachbett-Abtast-Mikrodensitometer mit einer Abtastöffnung (Quadrat) Größe von 20 mm und einer Schrittzunahme von 20 mm, was einer Entfernung von 0,2 nm auf der Probe entspricht, digitalisert. Die Partikel wurden von den digitalisierten Aufnahmen unter Verwendung der interaktiven Fensterungseinrichtungen des SPIDER Bildverarbeitungssystem ausgewählt (Frank et al., 1996, J Struct. Biol. 116, 190–199). Die Partikel wurden auf einen optischen Dichtebereich von 0,0–2,0 skaliert und mittels des PSPC reference-free alignment Algorimthums ausgerichtet (Marco et al., 1996, Ultramicroscopy, 66, 5–10). Die Mittelwerte wurden dann über eine Teilmenge korrekt ausgerichteter Partikel berechnet, welche interaktiv, als charakteristisch für eine Einzelansicht des Partikels, ausgewählt wurden. Das hier dargestellte endgültige durchschnittliche Bild wird aus einer Bibliothek von 94 Bildern abgeleitet.
Biochemische Charakterisierung der exprimierten hIR-11 Ektodomäne
Das untersuchte rekombinante Protein entsprach to den ersten 914 Resten der 917 Rest Ektodomäne der Exon-11 Form des humanen Insulin-Rezeptors (Ullrich et al., 1986, Nature 313, 756–761). Es wurde durch SDS-PAGE und Autoradiographie von immungefälltem Produkt von metabolisch-markierten Zellen gezeigt, dass das exprimierte Protein als homodimerer Komplex mit einer Masse von ~270–320 kDa existiert, welches unter reduzierenden Bedingungen in die monomeren α und β'-Untereinheiten mit den entsprechenden scheinbaren Massen von ~120 kDa und ~35 kDa (Daten nicht gezeigt) dissoziiert.
Gereinigte hIR-11 Ektodomäne, die in Lec8 Zellen exprimiert und durch Affinitätschromatographie an einer Insulinaffinitätssäule gereinigt wurde, eluierte als ein symmetrischer Peak an einer Superdex S200 Gelfiltrationssäule (10). Das Protein eluierte mit einer scheinbaren Masse von 400 kDa, die von einer Standardkurve, die durch die Elutionspositionen von Standardproteinen erzeugt wurde (nicht gezeigt), berechnet wurde. Wie von Proteinen, die in Lec 8 Zellen exprimiert werden, dessen Glycosylierungsdefekt verkürzte Oligosaccharide erzeugt (Stanley, 1989, Molec. Cellul. Biol. 9, 377–383) erwartet wird, ist dieser Wert kleiner als die scheinbare Masse (450–500 kDa), wie für die in Wildtyp CHO-K1 Zellen exprimierte hIR +11 Ektodomäne berichtet ist (Jonson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85, 7516–7520; Cosgrove et al., 1995, Protein Expression and Purification 6, 789–798).
Die Radiountersuchung der Insulinbindung an gereinigte Ektodomäne ergab lineare Scatchard Diagramme und Kd Werte von 1,5–1,8 10^–9 M, ähnlich zu den für die hIR-11 Ektodomäne berichteten Werten von 2,4–5,0 × 10^–9 M (Andersen et al., 1990, Biochemistry 29, 7363–7366; Markussen et al., 1991, J. Biol Chem. 266, 18814–18818; Schaffer, 1994, Eur. J. Biochem. 221, 1127–1132) und den für die hIR +11 Ektodömane berichteten Werte von ~1,0–5,0 × 10^–9 M (Schaefer et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 23393–23402; Whittaker et al., 1994, Molec. Endocrinol. 8, 1521–1527; Cosgrove et al., 1995, Protein Expression und Purification 6, 789–798).
Expression der hIGF-1R Ektodomäne
Die Klonierung, Expression und Reinigung dieses Proteins verwendete Elemente die zu jenen für die hIR-11 Ektodomäne beschriebenen gebräuchlich sind (Cosgrove et al., 1995, Protein Expression und Purification 6, 789–798), und ergab gereinigtes Produkt, welches durch Rezeptor-spezifische Mabs 17-69, 24-31 und 24-60 erkannt wurde (Soos et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 12955–63) und bestand aus α und β' Untereinheiten mit Massen ähnlich zu jene für die hIR Ektodomäne.
Herstellung der hIR-11Ektodomäne/MFab Komplexe
Ein Komplex aus hIR-11 Ektodomäne und Fab vom Antikörper 83-14 eluierte als symmetrischer Peak von 460–500 kDa (10), so wie aus einer Mischung von hIR-11 Ektodomäne mit Fab vom Antikörper 18-44 und einer Mischung Mischung von hIR-11 Ektodomäne mit Fab 83-7 hergestellte Komplexe es taten (nicht gezeigt). Ein Co-Komplex der Ektodomäne mit Fabs von den Antikörpern 18-44 und 83-14 eluierte bei 620 kDa, so wie Co-Komplexe mit MFabs 83-14/83-7 und ein anderer mit MFabs 83-7/18-44 es taten (nicht gezeigt). Ein Komplex aus der hIR-11 Ektodomäne mit allen drei MFab Derivaten, 18-44, 83-7 und 83,14, eluierte mit einer scheinbaren Masse von ~710 kDa (10).
Elektronenmikroskopie
Abbilden der hIR-11 und hIGF-1R Ektodomänen
Die Einzelmolekülbildgebung von unkomplexierter, dimerer hIR-11 Ektodomäne wurde unter einer Vielzahl von negativen Färbungsbedinugen durchgeführt, welche unterschiedliche Aspekte der Struktur der molekularen Hülle betonen. Die bei dieser Untersuchung erhaltenen Bilder sind in 11 abgebildet.
Die am wenigsten aggressive oder durchdringende Färbung war Kaliumphosphowolframat (KPT), welche konsistente kugelförmige Partikel mit sehr wenig interner Struktur mit Ausnahme des Vorschlags einer Teilung in zwei parallele Balken zeigte. Die Färbung mit Methylaminwolframat zeigte ebenfalls die parallelen Balkenbilder.
Weitere Untersuchungen unter Verwendung von zunehmend mehr durchdringenden, aber auch potentiell mehr zerstörenden, Färbemittel bestätigten die obigen Beobachtungen. Die Färbung mit Uranylacetat und Uranylformat zeigte die Trennung der parallelen Balken am eindeutigsten, jedoch zeigte Uranylacetat Anzeichen der Zerstörung der Partikelstruktur, i.e eine Abnahme der Konsistenz der Partikelform und eine Tendenz der Partikel entwirrt und denaturiert auszuschauen trotzdem sie vor der Färbung einer chemisch Vernetzung ausgesetzt worden sind. In dickeren gefärbten Bereichen, waren parallele Balken vorherrschend, wobei in dünner gefärbten Region U-förmige Partikel identifiziert werden konnten, die mitunter die parallelen Balkenstrukturen zahlenmäßig übertrafen (siehe 11).
Abbilden der mit 83-7 MFab komplexierten hIR-11 Ektodomäne
Dieser Komplex war aufgrund der Konsistenz der Partikelform besonders bemerkenswert, insbesondere unter sanfteren Färbungsbedingungen die durch Färbemittel wie z. B. KPT und Methylaminwolframat ermöglicht wurden. Die Partikel wurden interpretiert als wären sie nach dem lufttrockenen auf dem Kohlenstoffträgerfilm in den Darstellungen, die sie präsentierten, durch die beinahe diametrisch gegenüberliegenden Bindungen der zwei Fab Arme an das Antigen eingeschränkt worden, um eine höchst gestreckte Komplexstruktur zu bilden. Unter diesen Bedingungen konnten drei eindeutige Darstellungen erkannt werden (siehe 11). Zwei Darstellungen (interpretiert als von oben nach unten/von unten nach oben) zeigen die Fab Arme im Uhrzeiger- und gegen den Uhrzeigersinn als Erweiterungen der parallelen Platten mit zweifacher Symmetrie versetzt. Die dritte Darstellung zeigt ein Bild mit den zwei Fab Armen in Reihe annähernd durch das Zentrum des Rezeptors an seinen gegenüberliegenden Seiten, als Seitenprojektion der Bindung in halber Höhe der Platten interpretiert.
Die Verwendung der aggressiven Uranylfärbung, welche bei niederen pHs arbeitet, zeigte, jedoch auf Kosten der Partikelmorphologie, interne Strukturen der molekularen Hülle. Zum Beispiel zeigte die Färbung mit Uranylacetat oder Uranylformat, dass parallele Balken in Partikeln gesehen werden können, in welchen die Fab Arme entweder im Uhrzeiger- oder gegen den Uhrzeigersinn versetzt sind, aber nicht wo die dazwischenliegende zentrale oder axiale Position der zwei Fab Arme in Projektion abgebildet ist. Diese Beobachtungen zeigen die 83-7 MFab Bindung annähernd in halber Höhe der Seitenkanten jeder hIR-11 Ektodomänplatte. Das durch Mab 83-7 erkannte Epitop wurde auf der Cys-reichen Region, Reste 191–297, durch die Analyse von chimären Rezeptoren, abgebildet (Zhang and Roth, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9858–9862).
Abbilden der mit entweder 83-14 MFab oder 18-44 MFab komplexierten hIR-11 Ektodomäne
Komplexe wurden mit Fabs von dem am meisten Insulin-nachahmenden Antikörper Mab 83-14 gebildet. Projektionen, die die Fab Arme zeigen, welche an die Basis der U-förmigen Partikel gebundenen sind und von diesen in der Nähe der Basis wegstehen, wurden identifiziert. Ein zweites Feld von Partikeln zeigte Objekte, die aus zwei parallelen Balken zusammengesetzt waren, wie für die schmucklose Ektodomäne beobachtet wurde, wobei die Fab Armen schräg von den diametrisch gegenüberliegenden Extremitäten vorstehen (siehe 11). Ähnliche, aber weniger ausgeprägte Bilder wurden beobachtet, wenn MFab 18-44 an die hIR-11 Ektodomäne gebunden war. Das Epitop für Mab 83-14 befindet sich zwischen den Resten 469–592 (Pringent et al., 1990) in der verbindenden Domäne. Diese Domäne enthält eine der Disulfidbindungen (Cys524–Cys524) zwischen den zwei Monomeren in dem IR Dimer (Schaffer and Ljungqvist, 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 189, 650–653). Das Epitop für Mab 18-44 ist ein lineares Epitop, Reste 765–770 (Pringent et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 9970–9977) in der β-Kette, in der Nähe des Endes der Insert Domäne (O'Bryan et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11, 5016–5031). Die Insert-Domäne enthält die zweite Disulfidbindung, die die zwei Monomere im IR Dimer verbindet (Sparrow et al., 1997, J Biol. Chem, 272, 29460–29467).
Abbilden der hIR-11 Ektodomäne, die mit zwei verschiedenen MFabs pro Monomer co-komplexiert wurde.
Der Doppelkomplex der hIR-11 Ektodomäne mit MFabs 83-7 und 18-44 wurde mit 2% KPT bei pH 6,0 gefärbt und offenbarte die molekularen Hüllen. Die Partikel erschienen in ihrer Form komplex, und können eine Reihe von verschiedenen Orientierungen auf dem Kohlenstoffträgerfilm annehmen, was zu einer Reihe von verschiedenen Projektionen in der Aufnahme führt. Die vorherrschende Darstellung ist von einer asymmetrischen X-Form (einige Beispiele sind eingekreist). Es zeigt die 83-7 MFab-Arme an gegenüberliegenden Ende der parallelen Balken gebunden, wobei die zwei 18-44 MFabs als kürzere Projektionen erscheinen, die sich von beiden Seiten jeder Ektodomäne erstrecken.
Die Bilder des Doppelkomplexes der hIR-11 Ektodomäne mit 83-7 und 83-14 MFabs ergab X-förmige Bilder, ähnlich zu jenen, die mit dem 83-7/18-44 Doppelkomplex gesehen wurden. Im Gegensatz dazu, stellte der Doppelkomplex der hIR-11 Ektodomäne mit 18-44 und 83-14 MFabs nicht die oben beschriebenen, charakteristischen asymmetrischen X-Formen dar. Stattdessen erschien die molekulare Hülle in vielen Darstellungen verlängert zu sein, mit nur gelegentlichen X-förmigen Projektionen. Während eine detaillierte Interpretation dieser Bilder voreilig sein würde, ist es klar, dass die MFabs 18-44 und 83-14, zwei der wirksameren der Insulin-nachahmenden Antikörper (Prigent et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 9970–9977), gleichzeitig an den Rezeptor binden können.
Abbilden der hIR-11 Ektodomäne, die mit drei verschiedenen MFabs pro Monomer co-komplexiert wurde.
Ein Feld von Partikeln von der Aufnahem der hIR-11 Ektodomäne wurde gleichzeitig mit MFabs 83-7, 83-14 und 18-44 komplexiert. In den dickeren Färbemittel-Regionen war die molekulare Hülle X-förmig, und schaute jenen der Doppelkomplexe von der hIR-11 Ektodomäne mit entweder 83-7 und 18-44 oder 83-7 und 83-14 ähnlich. In den dünner gefärbten Regionen jedoch waren Partikel mit größerer Komplexität sichtbar, und es war gelegentlich möglich zu erkennen, dass es in der Tat mehr als vier an das Ektodomänen-Dimer gebundene MFabs gibt.
Die Einzelmolekülbildgebung der hierin dargestellten hIR-11 Ektodomäne, weist auf eine molekulare Hülle für diese dimere Spezies hin, die signifikant unterschiedlich zu jenen in allen bisherigen veröffentlichten Studien ist. Jedoch ist eine zweifelsfreie Bestimmung der molekularen Hülle sogar von der gegenwärtigen Studie nicht ganz eindeutig möglich. Ein bedeutender erschwerender Faktor ist hier die relative Fragilität der exprimierten Ektodomäne gewesen, wenn sie den Härten der Elektronenmikroskopievorbereitung durch Negativfärbung ausgesetzt war. Zum Beispiel, wies die Färbung mit Kaliumphosphowolframat (KPT, pH 6,0–7,0) häufig auf eine Denaturierung der dimeren Moleküle hin, wenn aber geeignete Bedingungen erfüllt wurden, konnte scheinbar gute interpretierbare Bilder der molekularen Hülle erhalten werden; die Färbung mit Methylaminwolframat (pH ~7,0) förderte die besten KPT Bilder der molekularen Hülle, hatte jedoch das Anzeiche einer Schwellung der molekularen Struktur bei neutralem pH; und die sauren-pH Färbemittel Uranylacetat (pH ~4,2) und Uranylformat (pH ~3,0) schienen, mit ihrer Fähigkeit die Ektodomäne zu durchdringen, nicht so sehr die molekulare Hülle zu illuminieren, sondern eher die Zonen hoch projizierter Proteindichten innerhalb des Dimers.
Eine Verbindung von Eindrücken von diesen verschiedenen Färbungsregimen hat zu der folgenden Interpretation der Einzelmolekülbilder dieser schmucklosen, nackten Dimeren gefüht: das überwiegend angetroffene dimere molekulare Bild war hier jenes von „parallelen Balken" der projizierten Proteindichte. Diese Darstellung ist in der Tat so vorherrschend, dass es vermuten lässt, dass es entweder eine einzige Orientierung der Moleküle auf dem glimmentladenen Kohlenstoffträgerfilme gibt, oder dass dieser Eindruck von parallelen Dichtebalken eine Mischung von oberflächlich ähnlichen Strukturprojektionen darstellt, wobei die Feinheit von diesen verschiedenen Projektionen durch die relative grobe Auflösung dieser direkten Einzelmolekülbildgebung maskiert ist. Der Eindruck von parallelen Balken der projizierten Energiedichte ist besonders in Regionen mit dicker Negativfärbung vorherrschend. Eine zweite Darstellung der molekularen Hülle, die in Regionen mit dickerer Färbung merklich weniger gut dargestellt ist, aber in Regionen mit dünnerer Färbung vorherrschend ist, ist die von „offenen" Us und Vs. Diese zwei Darstellungen der hIR-11-Ektodomäne wurden durch die Einzelmolekülbildgebung der hIGF-1R Ektadomäne unter vergleichbaren Bedingungen für die Negativfärbung gefördert.
Wenn die Annahme getroffen wird, dass diese zwei erkennbaren projizierten Darstellungen, jene der parallelen Balken und offenen Us/Vs, zwei unterschiedliche Darstellungen desselben dimeren Moleküls sind, eine Annahme die durch die MFab Komplex-Bildgebung stark unterstützt wird, kann ein grobes Modell der molekularen Hülle vernünftig begründet werden. Die Modellstruktur ist annähernd die eines Würfels, der aus zwei beinahe parallelen Platten hoher Proteindichte, getrennt durch eine tiefe Spalte von niederer Protein Hauptketten- und Seitenkettendichte, die von dem Färbemittel durchdrungen werden kann, aufgebaut ist und durch eine mittlere Färbemittel-ausschließende Dichte, in der Nähe, was hier als ihre Basis angenommen wird, (d. h. nächst zu der Membran-verankernden Region) verbunden ist. Die Breite der Spalte niederere Dichte scheint in der Größenordnung von 30–35 Å zu sein, ausreichend um die Bindung des Insulinmoleküls mit einem Durchmesser von ca. 30 Å aufzunehmen, obwohl wir keinen elektronenmikroskopischen Beweis haben, um die Insulinbindung in dieser Spalte gegenwärtig zu unterstützen.
Es ist durch die Bildgebung von gebundenem 83-7 MFab festgestellt worden, dass es eine dimere zweifache Achse, die normal zu der Membranoberfläche zwischen diesen Dichteplatten ist, gibt. Die Dimerbilder zeigen gelegentlich eine relative Versetzung der Dichtebalken, die hier als beschränkte Kapazität für ein Scheren der verbindenden Zone zwischen den zwei Platten entlang ihrer, zu der Membran parallelelen, horizontalen Achse interpretiert wird; andere Bilder zeigen Balken die von der Parallelen verzerrt sind, was eine beschränkte Kapazität für die Platten, um unabhängig um die zweifach Achse wieder über die verbindende Zone zu rotieren, impliziert. Jede dieser zwei Beobachtungen weist auf eine relativ flexible Verbundenheit zwischen den Dimerplatten in der Membran-proximalen Region der mittleren Proteindichte hin, welche möglicherweise zu dem Transmembransignalisierungsprozess beitragen könnte.
Die ungefähren gesamt gemessenen Abmessungen des Ektodomän-Dimers sind 110 × 90 × 120 Å, die gegen die Abmessungen von abgebildeten Influenza Neuraminidaseköpfe, die von den gelösten Röntgenstrukturen bekannt sind, kalibriert wurden (Varghese et al., 1983, Nature 303, 35–40). Es ist anzumerken, dass es hier eine Kompatibilität zwischen den Molekulargewichten und den molekularen Abmessungen dieser zwei molekularen Spezies gibt: die kompakten tetrameren Influenza Neuraminidaseköpfe mit einem Mr ~200 kDa besetzen ein Volumen von beinahe 100 × 100 × 60 Å; die mehr offenen, hier abgebildeten, dimeren Insulin Rezeptor Ektodomänen mit ähnlichem Mr ~240 kDa besetzen ein Volumen von ungefähr 110 × 90 × 120 Å, annähernd das Doppelte der Neruaminidaseköpfe, wobei es das etwas höhere Molekulargewicht und den im Wesentlichen zentralen Spalt niederer Dichte aufnimmt.
Die hier vorgeschlagene, annähernd kubische kompakte Struktur niederer Auflösung, weicht im Wesentlichen von dem T-förmigen Modell, welches von Christiansen et al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 249–252) und Tranum-Jensen et al., (1994, J. Membrane Biol. 140, 215–223) für den ganzen Rezeptor vorgeschlagenen wurde und dem verlängerten Modell, welches von Schaefer et al. (1992, J. Biol. Chem. 267, 23393–23402) für die lösliche Ektodomäne vorgeschlagen wurde, ab. Signifikanterweise, stellten diese vorigen Studien keine überzeugenden unabhängigen elektronenmikroskopischen Beweise bereit, dass ihre abgebildeten Objekte tatsächlich Insulinrezeptor war.
In der vorliegenden Studie, wurde die Identität der abgebildeten Moleküle als hIR-11 Ektodomäne durch das Abbilden von Komplexen des Dimers mit Fabs von den drei bekannten konformativen Mabs gegen natives hIR, 83-7, 83-14 und 18-44 bestätigt (Soss et al., 1986, Biochem. J 235, 199–208; 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5217–5221), die einzeln oder in Kombination gebunden waren. In allen diesen Beispielen, zeigte praktisch jedes Partikel im Sichteld eine MFab Dekoration durch Bindung an konformative Epitope, wodurch nicht nur die Identität der abgebildeten Partikel sondern auch die konformative Integrität der exprimierten Ektodomäne ermittelt wurde. Weiters zeigte die Reinheit und Einheitlichkeit dieser hIR-11 Ektodomänenzubereitungen, sowohl nackt als auch dekoriert, und hier durch Elektronenmikroskopie visualisiert, ihre hohe Eignung für Röntgenkristallisierungsversuche.
Die bekannte Flexibilität der Fab Arme erschwert die Bild zu Bild Variabilität über das limitierte Ausmaß hinaus, welche bereits für die undekorierten dimeren Ektodomänen beschrieben wurde, wodurch jegliche präzise Interpretation dieser Antigen-Antikörper-Komplexe verkompliziert wird. Ebenso macht eine solche molekulare Flexibilität jede Einzelmolekülcomputerbild-Mittelung, um die Bildinterpretation zu erleichtern, weitgehend unzweckmäßig, und wird in zunehmendem Maß mit den hier untersuchten Antigen-Antikörper-Komplexen höherer Ordnung unzweckmäßiger.
Die am leichtesten interpretierbaren dieser Bilder, welche die geringste Bild-zu-Bild Variabilität zeigen, sind jene des 83-7 MFabs, die an Dimere, in denen der Antigen-Antikörper Komplex, zufällig, in seinen Rotationsfreiheitsgraden auf dem Kohlenstoffträgerfilm eingeschränkt ist, gebunden sind. Viele projizierte Bilder zeigen die zwei Fab Arme annähernd in Line durch das Zentrum des Antigens auf ihren gegenüberliegenden Seiten, das als Seitenprojektion des Bindens auf halber Höher der Platten von ihrer Membran-proximalen Basis interpretiert wird. Andere Bilder-Teilmengen zeigen die zwei Fab Arme nach wie vor parallel, allerdings mit einer zweifachen Symmetrie im Uhrzeiger- oder gegen den Uhrzeigersinn versetzt, wobei jeder Fab in etwa einer Erweiterung von einer der parallelen Antigendichtebalken entspricht, das hier als Projektionen von oben oder von unten entlang der 2-fachen Achse darstellend, interpretiert wird. Die dritte Projektion, entlang der Achse der Fab Arme, konnte aufgrund der eingeschränkten Geometrie dieses molekularen Komplexes nicht abgetastet werden. Diese Beobachtungen schlagen eine Bindung von 83-7 MFab annähernd in halber Höhe der Seitenkanten der hIR-11 Ektodomänenplatten vor. Dies ermöglicht dann einen anfänglichen Versuch das 83-7 MFab Epitop räumlich abzubilden, welches auf die Reste 191–297 in der Cys-reichen Region des Insulinrezeptors Sequenz-kartiert wurde (Zhang and Roth, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9858–9862). Die räumliche Trennung und relative Orientierung der zwei Bindungsepitope des Mab 83-7 auf dem hIR-11 Ektodomänen-Dimer, wie hier angedeutet ist, erscheint mit dem Vorschlag, dass Mab 83-7 intramolekular an hIR binden kann, nicht übereinzustimmen (O'Brien et al., 1987, Biochm J. 6, 4003–4010).
Die Dekoration des Ektodomänen-Dimers mit 83-7 MFab etablierte, dass die zwei Platten hoher Proteindicht in einer 2-fachen Symmetrie angeordnet sind. Auf der anderen Seite, ermöglichte die Dekoration mit entweder 83-14 oder 18-44 MFab, die Abtastung der dritten Projektion des Ektrodomän-Dimers, die durch die 83-7 MFab Bindung behindert war. Signifikanterweise, stellte diese dritte Darstellung eindeutig die U-förmige Projektion des hIR-11 Ektodomänen-Dimers fest, etwas welches nur mit den undekorierten Ektodomänen-Bildern angenommen werden konnte. Weiters hat diese Projektion eine ungefähre räumliche Abbildung nahe an der Basis des U-förmigen Dimers für die Epitope ermöglicht, welche durch 83-14 MFab (Reste 469–592, verbindende Domäne) und 18-44 MFab (Reste 765–770, B-Ketten Insert-Domäne, Exon 11 plus Nummerierung, Prigent et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 9970–9977) erkannt werden.
Der Modellstruktur innewohnend ist die Implikation, dass, mit der normal zu der Membranoberfläche ausgerichteten zweifachen Achse, der Mund der Spalte niederer Dichte, wo die Insulinbindung auftreten kann, am Entferntesten von dem Transmembrananker liegen würden, während die Zone mittlerer Dichte, welche die zwei Platten hoher Dichte verbindet, in nächste Nähe zu der Membran sein würde. Es ergibt sich aus diesem Modell, dass die L1/Cys-reichen/L2-Domänen (Baja et al., 1997, Biochim. Biophys. Acta 916, 220–226; Ward et al., 1995, Proteins: Struct., Funct., Genet. 22, 141–153), welche den Großteil der Insulinbindungsregion aufweisen (see Mynarcik et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 2077–2081), am wahrscheinlichsten in den von der Membran entfernten oberen Hälften der zwei Platten liegt, während die Membran-nahen unteren Hälften die Verbindungsdomänen, die Fibronectin-artigen Domänen, die Insert-Domänen und die Interketten-Disulfidbindungen enthalten (Schaffer and Ljungqvist, 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun, 189, 650–653; Sparrow et al., 1997, J. Biol Chem, 272, 29460–29467). Eine solche Anordnung von Domänen wird durch die Bilder, die mit der Einzel-MFab-Dekoration gesehen werden, unterstützt, das 83-7 MFab Epitop in der Cys-reichen Region ist räumlich annähernd in halber Höhe der Seitenkante der Ektodomänplatten abgebildet, und die 83-14 und 18-44 MFab Epitope (Verbindungsdomäne bzw. β-Ketten Insert-Domäne) in der Nähe der Basis der Platten abgebildet ist. Unsere Präferenz ist, dass ein einzelnes a-bc Monomer eine einzelne Platte besetzt, obwohl die Möglichkeit, dass sich ein einzelnes Monomers über zwei Proteindichteplatten spreizt, nicht abgetan werden kann.
Die komplexeren Bilder, die die Co-Bindung von zwei, und sogar mehr noch von allen drei MFabs an jedes Monomer des Ektodomän-Dimers einschließen, sind in Bezug auf die relative Domänenanordnung innerhalb des Monomers gegenwärtig nicht leicht interpretierbar, nicht zuletzt aufgrund der Schwierigkeit, Bedingungen für die Negativfärbung zu finden, die gleichzeitig die Integrität der Fab Bindung aufrechterhalten und trotzdem erkennbare und wiedergebbare Details der internen Struktur der dimeren IR Ektodomäne hervorheben.
Die hier dargestellten Daten demonstrieren die Fähigkeit der Einzelmolekülbildgebung, eine anfängliche Einsicht in die Topologie von Multidomänstrukturen, wie z. B. die Ektodomäne von hIR zu ermöglichen, und den Wert, diese Technik mit der Anheftung von entweder einem oder mehreren monoklonalen Fabs pro Monomer zu kombinieren als ein potentielles Mittel für die Epitop-, und Domänkartierung der Struktur. Durch Abbilden von Fab Komplexen von anderen Mitgliedern der Familie, wie z. B. hIGF-1R Ektodomäne, und Kombinieren verfügbarer Sequenz-kartierter Epitopinformationen mit jenen, die hierin präsentiert wurden, sollte ein umfassenderes Verständnis der Domänenanordnungen innerhalb der IR-Familien-Ektodomänen verfügbar sein.
Beispiel 5
Strukturbasierende Entwicklung von Liganden für den IGF Rezeptor als potentieller Inhibitor der IGF Bindung
Die Struktur des IGF Rezeptors kann als Filter oder Screen betrachtet werden, um potentielle Liganden für den Rezeptor zu einwickeln oder zu evaluieren. Fachleute können eine Reihe von bekannten Verfahren für die de novo Ligandentwicklung verwenden, wie z. B. GRID, GREEN, HSITE, MCSS, HINT, BUCKETS, CLIX, LUDI, CAVEAT, SPLICE, HOOK, NEWLEAD, PRO_LIGAND, ELANA, LEGEND, GenStar, GrowMol, GROW, GEMINI, GroupBuild, SPROUT, und LEAPFROG, um potentielle Agonisten oder Antagonisten für IGF-1R zu erzeugen. Zusätzlich, kann die IGF-1R Struktur als Suchanfrage für Datenbanksuchen für mögliche Liganden benutzt werden. Die durchsuchten Datenbanken können existieren, z. B. ACD, Cambridge Crystallographic, NCI oder virtuell sein. Virtuelle Datenbanken, welche eine sehr große Anzahl (derzeit bis zu 10¹²) von chemisch sinnvollen Strukturen enthalten, können von Fachleuten unter Verwendung von Techniken wie z. B. DBMaker, ChemSpace, TRIAD und ILIAD erzeugt werden.
Die IGFR Struktur enthält eine Vielzahl von Stellen, in welche mutmaßliche Liganden binden können. Dem Fachmann bekannte Suchstrategien können verwendet werden, um mutmaßliche Liganden für diese Stellen zu identifizieren. Beispiele von zwei geeigneten Suchstrategien sind unten beschreiben.
(i) Datenbanksuche
Die Eigenschaften von Schlüsselteilen der mutmaßlichen Stelle können als Suchabfrage für die Datenbanksuche verwendet werden. Zum Beispiel, kann die Unity 2.x Datenbank-Software verwendet werden. Eine flexible 3D Suche kann ablaufen, in welcher ein „Directed-Tweak"-Algorithmus verwendet wird, um Konformationen niederer Energie von potentiellen Liganden zu finden, welche die Suchabfrage erfüllen.
(ii) De novo Entwicklung von Liganden
Der in das Software-Packet, Sybyl Version 6.4.2 (Tripos Associates, St. Louis) eingebaute Leapfrog Algorithmus kann verwendet werden, um mögliche Liganden für die IGF-1R Stellen zu entwickeln. Die Koordinaten der Reste um die Stelle können von der Röntgenstruktur genommen werden, Wasserstoffe und Ladungen (Kollman all atom dictionary charges) können hinzugefügt werden. Von der Größe, Form und Eigenschaften der Stelle, können eine Reihe von möglichen Liganden vorgeschlagen werden. Leapfrog kann verwendet werden, um die Konfromation von Liganden und Position auf der Stelle zu optimieren, um die wahrscheinliche Stärke der Bindungsinteraktionen mit IGF-1R zu reihen, und um mögliche Modifikationen an den Strukturen, welche eine verbesserte Bindung haben würden, vorzuschlagen.
Es ist ebenfalls möglich, Liganden, die in Lage sind mit mehr als einer Stelle zu interagieren, zu entwickeln. Ein möglicher Weg wie das gemacht werden könnte, ist durch Anheften von flexiblen Linkern an Liganden, die für spezifische Stellen entwickelt wurden, sodass sie an diese binden. Die Linker können in einer solchen Art angeheftet werden, dass sie die Bindung an individuelle Stellen nicht stören.

Claims

Verfahren zum Entwerfen einer Verbindung, welche in der Lage ist an ein Molekül der Insulin Rezeptor Familie zu binden und um eine durch dieses Molekül vermittelte Aktivität zu modulieren, einschließlich der Schritte der Abschätzung der stereochemischen Komplementarität zwischen der Verbindung und der Rezeptorstelle des Moleküls, und Testen der Verbindung auf die Fähigkeit eine durch dieses Molekül vermittelte Aktivität zu modulieren, wobei die Rezeptorstelle aus: a) den Aminosäuren 1 bis 462 des Rezeptors für IGF-1; mit den atomaren Koordinaten wie sie in 1 dargestellt sind; oder b) einer Teilmenge der Aminosäuren mit den atomaren Koordinaten. besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung von einer bekannten Verbindung die aus einer Datenbank ermittelt wurde ausgewählt oder modifiziert wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung entworfen wurde, so dass sie die Struktur des Rezeptormoleküls wie in 1 dargestellt ist, komplementiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbindung strukturelle Regionen aufweisen, die in der Lage sind engen Kontakt mit den Aminosäurenresten an der Rezeptoroberfläche, welche die Rinne auskleiden, herzustellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindung eine Stereochemie aufweist, so dass sie mit beiden, der L1 und L2 Domäne der Rezeptorstelle interagieren kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindung eine Stereochemie aufweist, so dass sie mit der L1 Domöne eines ersten Monomers des Rezeptor Homodimers; und mit der L2 Domäne des anderen Monomers des Rezeptor Homodimers interagieren kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Interaktion der Verbindung mit der Rezeptorstelle die Position von zumindest einer der L1, L2 oder Cystein-reichen Domänen des Rezeptormoleküls relativ zu der Position von zumindest einer der anderen Domänen verändert.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Verbindung mit dem P-Faltblatt der L1 Domäne des Rezeptormoleküls interagiert, wodurch eine Veränderung der Position der L1 Domäne relativ zu der Position der Cystein-reichen Domäne oder von der L2 Dömane bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Verbindung mit der Rezeptorstelle in der Region der Schnittstelle zwischen der L1 Domäne und der Cystein-reichen Domäne des Rezeptormoleküls interagiert, wodurch bewirkt wird, dass die L1 Domäne und die Cystein-reiche Domäne sich von einander weg bewegen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Verbindung mit der Hinge-Region zwischen der L2 Domäne und der Cystein-reichen Domäne des Rezeptormoleküls interagiert, wodurch eine Veränderung in der Position der L2 Domäne und der Cystein-reichen Domäne relative zueinander bewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die stereochemische Komplementarität zwischen der Verbindung und der Rezeptorseite so ist, dass die Verbindung eine K_b für die Rezeptorstelle von weniger als 10^–6 M aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei K_b kleiner als 10^–8 M ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Verbindung die Fähigkeit aufweist, eine durch das Rezeptormolekül vermittelte Aktivität zu erhöhen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Verbindung die Fähigkeit aufweist, eine durch das Rezeptormolekül vermittelte Aktivität zu verringern.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die stereochemische Interaktion zwischen der Verbindung und der Rezeptorstelle adaptiert ist, um die Bindung eines natürlichen Liganden des Rezeptormoleküls an die Rezeptorstelle zu verhindern.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Verbindung einen K_i von weniger als 10^–6 M aufweist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Verbindung einen K_i von weniger als 10^–8 M aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Verbindung einen K_i von weniger als 10^–9 M aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Rezeptor IGF-1R ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Rezeptor der Insulin-Rezeptor ist.
Computerunterstütztes Verfahren zum Ermitteln potentieller Verbindungen, die in der Lage sind, an ein Molekül der Insulin Rezeptor Familie zu binden und um eine durch dieses Molekül vermittelte Aktivität zu modulieren, unter Verwendung eines programmierten Computers einschließlich eines Prozessors, einem Eingabegerät, und einem Ausgabegerät, einschließlich der Schritte von: a) Eingeben von Daten in den programmierten Computer durch das Eingabegerät, welche die atomaren Koordinaten des IGF-1R (1–462) Moleküls, wie in 1 dargestellt ist, oder einer Teilmenge davon aufweisen; b) Erzeugen mittels Computerverfahren eines Satzes an atomaren Koordinaten einer Struktur, welche stereochemische Komplementarität zu den atomaren Koordinaten der IGF-1R Stelle, wie sie in 1 dargestellt sind, oder einer Teilmenge davon besitzt, wodurch eine Kriteriendatei erzeugt wird; c) Vergleichen der Kriteriendatei mit einer chemischen Strukturen Computer Datenbank mittels Prozessor; d) Auswählen von chemischen Strukturen, welche strukturell ähnlich einem Teil der Kriteriendatei sind aus der Datenbank mittels Computerverfahren; e) Ausgeben der ausgewählten chemischen Strukturen auf dem Ausgabegerät, welche ähnlich einem Teil der Kriteriendatei sind;
Computerunterstütztes Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Verfahren verwendet wird, um potentielle Verbindung zu ermitteln, welche die Fähigkeit haben eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu verringern.
Computerunterstütztes Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, welches weiters den Schritt des Auswählens einer oder mehrerer chemischer Strukturen von Schritt (e) beinhaltet, welche mit der Rezeptorstelle des Moleküls in einer Weise interagieren, welche die Bindung eines natürlichen Ligand an die Rezeptorstelle verhindert.
Computerunterstütztes Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, welches weiters den Schritt des Gewinnens einer Verbindung mit der in den Schritten (d) und (e) ausgewählten chemischen Struktur, und Testen der Verbindung auf die Fähigkeit eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu verringern, aufweist.
Computerunterstütztes Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Verfahren verwendet wird um potentielle Verbindungen zu ermitteln, welche die Fähigkeit eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu erhöhen, aufweisen.
Computerunterstütztes Verfahren nach Anspruch 25, welches weiters den Schritt des Gewinnens eines Moleküls mit der in den Schritten (d) und (e) ausgewählten chemischen Struktur, und Testen der Verbindung auf die Fähigkeit eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu erhöhen, aufweist.
Computerunterstütztes Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei der Rezeptor IGF-1R ist.
Computerunterstütztes Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei der Rezeptor der Insulin Rezeptor ist.
Verfahren zum Screenen einer mutmaßlichen Verbindung, welche die Fähigkeit die Aktivität eines Rezeptors der Insulin Rezeptor Familie zu modulieren, aufweist, einschließlich der Schritte der Ermittlung einer mutmaßlichen Verbindung durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 29, und Testen der Verbindung auf die Fähigkeit eine durch den Rezeptor vermittelte Aktivität zu erhöhen oder zu verringern.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Test in vitro durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Test eine Hochdurchsatzuntersuchung ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Test in vivo durchgeführt wird.