JPH03501487A

JPH03501487A - インシュリン模倣物およびインシュリンリセプター結合部位ペプチド

Info

Publication number: JPH03501487A
Application number: JP1508014A
Authority: JP
Inventors: デメイツ，ピエール
Original assignee: シティ・オブ・ホープ
Priority date: 1988-06-30
Filing date: 1989-06-30
Publication date: 1991-04-04
Also published as: EP0378671A1; AU630882B2; EP0378671A4; WO1990000562A1; AU3982289A; DE68927854T2; DE68927854D1; EP0378671B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】インシュリン模倣物およびインシュリンリセブター結合部位ペプチド皿１土星本発明は１９８８年６．月３０日出願の「インシュリンリセブター結合部位」の名称の米国特許出願Ｎｏ、２１３．９１８のＣＩＰ出願であり、１９８８年１２月３０日に出願された「インシュリン模造物およびインシュリンリセブター結合部位ペプチド」の名称の米国特許出願Ｎｏ、２９２，０９９のＣＩＰ出願である。

１皿立立互本発明はヒトインシュリン分子もしくはインシュリン様−成長因子Ｉ　（ＩＧＦ −１）分子を結合するアミノ酸残基配列およびインシュリン構造物特性をあたえられた線状ペプチド（同一または類似の配列を含む）に関する１王立１１インシユリンおよびＩ　ＧＦ−Ｉリセブターの両者のＣＤＮＡはクローン化され配列決定されている。生物学的に活性なりセブターの哺乳類細胞中での発現も達成されている。米国特許４，７６１゜３７１号、エビナ（Ｅｂｉｎａ）　ら、Ｃｅ　１１，４６　：　７４７−７５８　（１９８５）；ウルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１３ニア５６−７６１　（１９８５）；およびウルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）ら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、５　：　２５０３−２５１２　（１９８６）を参照。エビナおよびウルリッチは、異なる配列番号を用いている。ウルリッチの配列番号のみを本明細書中では使用する。

これらのりセブターは、二つの細胞外αサブユニットおよび細胞外および細胞内部分の両者を有する二つの膜貫通βサブユニットのへテロテトラマーにより構成されている。αサブユニットはインシュリン結合部位を含んでいる。各αサブユニットは一つの結合部位を持っているらしい。インシュリンリセブターはＩＧＦ −１リセプターとのホモロジーを有し、また表皮成長因子リセブター、ヒトα− ｅｒｂ−２腫瘍遺伝子（オンコジーン）、およびｖ−ｒｏｓ腫瘍遺伝子にコードされるチロキシンキナーゼとホモロジーを有する。

リセブターの構造の知識はｃＤＮＡクローニングから推定される一次配列に限られていた。この情報は各々７００以上のアミノ酸残基を有する各αサブユニットのインシュリンまたはＩ　ＧＦ−Ｉ結合ドメインの正確な位置決めに関するでかがりを殆ど与えていない。また、リセブターの二次または三次構造に関する決定的情報も存在しない。

インシュリン様ペプチドの発見は、糖尿病関係の製薬工業において、長い間大きな課題であった。明らかに、インシュリン様活性を有すると言われていた線状ペプチドを記載した先行技術は、ワイツェル（Ｗｅｉｔｚｅｌ）ら、Ｈｏｐｐｅ− ８ｙｅｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３５２：１ｏ０５−１０１３　（１９７１）：同、１７３５−１’１３８　（１９７１）；同、３５７　：１８７−２００　（１９７６）のみである。これらの文献はインシュリンのβ− 鎖の末端部分が活性であることを報告している。この報告は他の研究者らによって確認されていない。逆に、本発明のインシュリン様ペプチドを明らかにした実験において、β−鎖のＣ末端部分（Ｂ２３−３０）はネガティブコントロールとして用いられた。

ｌ肌旦皇１本発明はインシュリンまたはＩＧＦ−Ｉ分子の結合に関するリセブター領域（ドメイン）の同定、そのような領域のアミノ酸残基配列およびそれらの二次および三次構造に関する。本発明は、リセブターによるインシュリンまたはＩＧＦ−１分子の結合および認識を生じるに有効な、上記ドメインおよび配列の天然および合成フラグメント、ならびにこれらドメインの物理的およびグラフィックな表示に関する。そのようなフラグメントおよびそれから由来する鋳型（テンプレート）を、例えばインシュリン模倣薬剤の設計に用いることが、本発明の目的である。

本発明の根本的観点は、ヒトインシュリンリセプタードメインがインシュリン模倣物そのものであり、そして同様の性質をもつより短い配列を含むという発見である。合成アミノ酸残基配列および精製天然アミノ酸残基配列（その多くはインシュリン様であり、且つ全体または一部でヒトインシュリンおよびＩＧＦ−Ｉ分子の結合部位を構成する）が提供される。

本発明はりセブタードメインが溶液中で強く凝集し、確かに細胞上の健全インシュリンリセブターに結合してこれを活性化してインシュリン様活性を示し、例えば単離したラット脂肪細胞の脂質合成を活性化するという発見を含む。

本発明の他の観点は、そのようなペプチドの誘導体および修飾物を含み、例えば結合またはインシュリン様活性に要求される最小限の構造を持つ短い配列、および消化管内での溶解性を付与または高めるための環化または誘導化体を含む。

本発明のインシュリンペプチドおよびその誘導体および修飾物は、糖尿病患者にインシュリンの代わりに、皮下、経鼻、もしくは経口投与出来る。本発明のこれらのペプチドはインビボおよびインビトロでインシュリン活性のメカニズムを研究するための生化学実験に有用である。

本発明のさらなる観点は、これらのペプチドの空間的もしくは三次元的構造の物理的またはグラフィック表示およびそのような表示をインシュリン様薬剤および他の薬剤の設計の鋳型として用いることをも包含する。

ｆｉｌλ脱１− 第１Ａ図は、インシュリンニ量体の対向面（インターフェイス）のコンビニ−ターグラフィックによるモデルである。

第１Ｂ図は、二量体インターフェイスの一つのインシュリンモノマーをインシュリンリセブターの配列８３−９４に置換したインシュリン配列Ｂ１９−３０のコンピューターグラフィックによるモデルである。

第２図は、種々のりセプターフラグメントとインシュリンβ鎖のＣ末端とのホモロジーの説明図である。

第３図は、コンピューターで描いたαサブユニットの二次構造および親水性程度の様相を示す。

第４Ａ図〜４Ｄ図は、残基８３−９４を含むαサブユニット配列の４つの異なる角度からのコンピューターグラフィックによるモデルである。

第５Ａ図〜５Ｂ図は、同様に、β−シート構造中の残基８３−９４およびα−へリックス中の残基９５−１０８を含む第３図に一致する完全ドメインの、２つの異なる角度からのコンピューターグラフィックによるモデルである。

第６図はインシュリンと合成リセブターペプチドとの競合曲線である。

第７図は、インシュリンのＣ末端、ＩＧＦ−Ｉのβ鎖、およびインシュリン、ＩＧＦ−ＩおよびＥＧＦに対する各リセブターのホモロジーを示す。

第８Ａ図および８Ｂ図は、インシュリン−インシュリンのダイマ一対のコンピューターグラフィックによる表示およびインシュリンと残基８３−９４を含むリセブタードメインの対のコンピューターグラフィック表示である。第８Ｃ図は、ＩＧＦ−Ｉリセブタードメインーインシュリン対のコンピューターグラフィックによる表示である。各第８図において、「インシュリン」は右側にグラフィック表示されている。

第９Ａ−９Ｄ図は、残基７７−９７を含むＩＧＦ−１リセブタードメインの４つの異なる角度からのグラフィックモデルである。

第１０図は、リセブターベブチドのあるもののインシュリン模倣効果を示す。

第１１図は、配列工のペプチドがインシュリンに結合する濃度範囲を示す。

第１２図は、配列Ｖのペプチドによる脂肪合成活性が、抗インシュリンポリクローン抗体であるシグマ＃１−８５１０で不活化されることを示す。

第１３図は、配列■のペプチドによる脂肪細胞の脂肪合成の活性化が、スタウロスポリンおよびスフィンゴシンにより阻害されることを示す。

上記図面に含まれる全てのコンピューターグラフィックモデルの作成には、バイオグラフコンピューターソフトウェア（Ｂｉｏｇｒａｐｈ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ｓ。

ｆｔｗａｒｅ）を使用した。

インシュリンリセ　ター　Ａドメインのロインシュリン分子のβ−鎖残基Ｂ２３ −２６のＧＩｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙ　ｒは、リセブター結合ドメインに直接合まれている。また、インシュリンβ鎖モノマーのＣ末端部分は、同−鏡開で結合してインシュリンダイマーを形成することも知られている。ダイマーインターフェイスの研究（第１Ａ図参照）から、インシュリンモノマーの同じＣ末端部分に同様な様式で相互作用するためのりセブターは、（ｉ）２〜３個のＰｈｅまたはＴｙｒ鎖を有し；（ｉｉ）インシュリンβ鎖のＣ末端にある程度のホモロジーを有し；（ｉｉ）疏水性環境内にあり；そして（ｉｖ）β−シート二次構造を有する；であろうと予測される。

リセブターのαサブユニットの既知配列を調査したところ、少なくとも２もしくは３個のＰ　ｈ　ｅまたはＴｙｒ鎖を近接して有する種々の部分（ストレッチ）の存在が認められる。こられのうち、８８−９１のストレッチ（Ｐｈｅ−Ｐｈｅ −Ａｓｎ−Ｔｙ　ｒ）を選択した。その理由は次のとおりである：（ｉ）第２図に示されているように、８４−９１の配列は、不変もしくは殆ど不変のインシュリン残基２０−２６に対してホモロガスな５残基を有している。

（ｔｉ）第３図に示されているように、αサブユニットのコンピューターによる二次構造および親水性程度の様相は、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ配列を含むリセブターセグメント７８−９４はβ−シートでその後にヘリックス部分９５ −１０３が続いていること、および配列全体が主に疏水性であることを示唆している。

リセブター配列８６−１０３に相当する１８アミノ酸からなる合成ペプチドは、ワンプ（Ｗａｎｇ）、Ｓ、Ｓ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、９５：１３２８−１３３３　（１９７３）のｐ−アルコキシベンジルエステル　アンカー結合法を用いて、固体支持体上で合成した。アミノ酸のアミノ基は、Ｎ−フルオレニルメトキシ−カルボニルアミノ基（Ｆｍｏ　ｃ）で保護した。側鎖はｔ−ブチルまたは他の適当な保護基で保護した。合成の後、ペプチドをトリフルオロ酢酸および開裂の間にペプチドを保護する他の試薬を含む適当な溶媒で固体支持体から開裂した。次いでペプチドをセファデックス−〇ＩＯに通し、そして最終的にＨＰＬＣ系でＣ−１８カラムを用いて精製した。ペプチドの正確な分子量は、高分解能質量分析機で確咳した。ペプチドは９０％より低いジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に実質的に不溶性であることから、高度に疏水性であることがわかった。高濃度での水中では、ペプチドはゲル様懸濁物を生じ、最終的に透明な結晶様構造の沈澱を生じた。

このペプチドのアミノ酸残基は、次の配列！で表される配列中に存在する。

ＡＲＧ−ＬＥＵ−ＰＨＥ−ＰＨＥ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＶＡＬ− ＩＬＥ−ＰＨＥ−ＧＬＵ−ＭＥＴ−ＶＡＬ−ＨＩＳ−ＬＥＤ−ＬＹＳ−ＧＬＵインシユリンに対する結合を調べるため、このペプチドの水溶液を室温で１２５１ −インシュリンのトレーサーとインキユベートシ、簡単に遠心分離した。ペプチドはこの結合は過剰量の未標識インシュリンによって置換可能であった。第６図参照。見掛けの解離定数は〜６Ｘ１０−’Ｍであった。非特異的結合は無視できる程度であった。ペプチドはまた”’Ｉ−ＩＧＦ−１にも結合したがインシュリンよりも弱く、一方ｘｚｓＩ−ＥＧＦ（表皮増殖因子）および””Ｉ−ｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）は特異的結合を示さなかった。これらのデータは、第７図の配列ホモロジーからの予測と良く一致した。

本発明は、リヤブタ−αサブユニットの前の部分および後ろの部分に相当する付加的残基が存在するような配列Ｉの修飾物も包含する。例えば、本発明は配列■ を含み、次に示すとおりこの配列にはインシュリンリヤブタ−αサブユニットの８３から８５の残基も含まれているＡＲＧ−ＧＬ　Ｙ−３Ｅ　Ｒ−ＡＲＧ−ＬＥＵ−ＰＨＥ−ＰＨＥ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＬＥ　ＩＪ−ＶＡＬ−ＩＬ　Ｅ −ＰＨＥ−ＧＬＵ−ＭＥＴ−ＶＡＬ−Ｈｌ５−ＬＥＵ−ＬＹＳ−ＧＬＵ本発明はさらに、溶解性を高めるために一方もしくは両方の末端に一つもしくはそれ以上の付加的°残基を有する配列！の修飾物も包含する。詳細には、次の配列ｍの修飾物が意図される：（ＬＹＳ）ｘ　−ＡＲＧ−ＬＥＵ−ＰＨＥ−ＰＨＥ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＬＡ− ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＩＬＥ−ＰＨＥ−ＧＬＵ−８６８７ｇ８Ｂ９　９０　１１９２　９３　９４　９５　９６　９７ＮＥＴ−ＭＡＬ−ＨＩＳ−ＬＥＤ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−（ＬＹＳ）　ｖ（式中、Ｘおよびｙは各々０，１゜または２であり、但しＸおよびｙの一方は１である）。

さらに配列■も同様に溶解性の理由から合成された：ＬＹＳ−ＡＲＧ−ＧＬＹ− ＳＥＲ−ＡＲＧ−ＬＥＤ−ＰＨＥ−ＰＨＥ−ＡＳＷ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＬＥＤ− ８３８４８５８’６　８７　８１ｉ１　８９　９０　９１　９２　９３ＶＡＬ− ＩＬＥ−Ｐ）ＩＥ−ＧＬＵ−ＭＥＴ−ＶＡＬ−）１１Ｓ−ＬＥＤ−ＬＹＳ−ＬＹＳこの式を見れば理解されるように、配列■は残基８３−８５を含み、Ｌｙｓ’ をＮ末端に一つ付加し、そして負に荷電した１０３゛位のＧｌｕをＬｙｓに変えて、それぞれＮ末端およびＣ末端に二つの陽性に荷電した残基Ｌｙｓ−ＡｒｇおよびＬ　ｙ　ｓ　−Ｌ　ｙ　ｓが作成されている。

配列■、■および■は、配列■の修飾物であり、８８−８９のＰｈｅ−Ｐｈｅを、Ｌｅｕ−Ｐｈｅに（配列Ｖ）、Ｐｈｅ−Ｌｅ’ｕに（配列■）およびＬｅｕ− Ｌｅｕに（配列■）に変化させて作成した。

本発明はさらに、固相アッセイに用いるためにポリスチレンビーズま°たは他の固体支持体に結合した配列ｌないし■、および配列に対する抗体を作成するためにキイホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に結合した配列Ｉないし■をも包含する。同様に配列ｌまたは ■のペプチドに相当するオリゴヌクレオチドの合成および該オリゴヌクレオチドを、例えば、β−ガラクトシダーゼまたはジヒドロ葉酸リダクターゼとの融合蛋白質の一部として大腸菌で発現させることも包含する。融合は、Ｘ線結晶構造解析のような物理的研究の実施に用いるための、配列に対する抗体を製造するために、スタフィロコッカス・アウレウスのプロティンＡからの合成ＩｇＧ−結合ドメイン（ローラエンアルダ−（Ｌｏｗｅｎａｌｄｅｒ）。

Ｂ、ら、Ｇｅｎｅ、５８　：　８７−９７　（１９８７）を参照）への融合であってもよい。

第１Ｂ図は、第１Ａ図に示したインシュリンモノマーの一ツノ残基ＣＹＳ”９、ＧＬＵ””　、ＧＬＹ””　およびＢ２６−３０の側鎖を、インシュリンリセブター配列の中のホモロガスな位置を占める残基の側鎖により、具体的にはＡＲＧ８３，５ＥＲ８５，ＬＥＵ８７およびＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＶＡＩ４”置換したものを示す。さらに具体的には、第１Ｂ図は、インシュリンダイマーインターフェイスのモノマーの一つをインシュリンリセブターの配列８３−９４に置換した、インシュリン配列Ｂ１９−８３０の分子グラフィックモデルを示す。第１Ａ図におけるインシュリンダイマーインターフェイスとの類似性は、非常に顕著である。

このデータは、インシュリンクセブタ−αサブユニットの残基８３−９４は、インシュリン分子の活性部位を結合することに関与するドメインの少なくとも有効部分を含むこと、を示唆する。

Ｉ　ＧＦ−１リセプター　合ドメインの石Ｉ　ＧＦ−１結合において、インシュリンリセブター配列８３−１０３とホモロガスなＩ　ＧＦ−Ｉリセプター残基７７−９７の配列■が関与することは次のことから証明される：（ｉ）インシュリンおよびＩ　ＧＦ−Ｉは互いのりセブターに結合する。

（ｉｉ）インシュリン分子の配列Ｂ２３−２６はＩＧＦ−１分子中に保存されている（ＧＬＹ−ＰＲＥ−ＰＨＥ−ＴＹＲの代わりにＧＬＹ−ＰＨＥ−ＴＹＲ−ＰＨＥ）（ｆｕ）インシュリンリセブターの配列８３−９７はＩＧＦ−Ｉリダクターゼで高度に保存されている。

（ｉｖ　）合成ペプチド（配列Ｉ）はＩＧＦ−Ｉに結合する。

（Ｖ）第８Ｃ図は、第１Ａ図に示したインシュリンモノマーの一つの残基ＣＹＳ ”ｌ＠、ＧＬＵ”’　、ＧＬＹ”３およびＢｚｅ−ｇｏの側鎖を、Ｉ　ＧＦ−Ｉリセプター配列の中のホモロガスな位置を占める残基の側鎖により、具体的にはＡＲＧ、ＴＲＰ、ＬＹＳ、ＬＥＵおよびＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＶＡＬで置換したものを示し、さらに又、インシュリンダイマーインターフェイスとの顕著な類似性を示している。

したがって、本発明はまた、次のＩＧＦ−Ｉリセブターの配列■：ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＴＲＰ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＰＨＥ−ＴＹＲ−ＡＳＮ−Ｔ　ＹＲ −ＡＬ　Ａ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＩＬＥ−ＰＨＥ−ＧＬＵ−ＭＥＴ−ＴＨＲ−ＡＳＮ−ＬＥＤ−ＬＹＳ−ＡＳＰにも関する。

本発明はまた、配列■の物理的およびグラフィック表示および該表示を薬剤の設計に用いることをも包含する本発明のペプチドのインシュリン模倣特性は次のことから証明される：１、これらのペプチドが、インシュリンと比較して、単離されたラットの脂肪細胞の脂肪への３−［”Ｈ］グルコースの取り込みを刺激する能力。

２、インシュリンオクタペプチドであるＢ２３−３０が、同様の脂肪合成アッセイにおいて全く不活性であるという観察（第１図）。

３、このペプチドの脂肪合成活性が、ポリクローナルインシュリン抗体によって不活性化されるという観察が、構造的に類似なペプチドおよびインシュリンエピトープを示唆すること（第３図）。

４．このペプチドの脂肪合成活性が、インシュリン同様にキナーゼＣ阻害剤であるスフィンゴシンおよびスタウロスポリンによって阻害されることは、類似の作用経路を示唆すること（第４図）。

５、インシュリンリセブター配列８１−９１を有するペプチドが全く不活性であることは、領域９２−１０３がインシュリン模倣効果の観察に重要であることを示唆すること。さらに、ペプチド配列８１−９１に対する抗体は、配列■の脂肪合成効果を阻害しないこと。

１１五上Ａ　アッセイの配列■ないし■が単離されたラット脂肪細胞の脂肪内への３−［”Ｈ］グルコースの取り込みを刺激する能力を、インシュリンの能力と比較した。

脂肪合成アッセイはスマル（Ｓｍａ　１）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２：１１０７１−１１０７９　（１９８７）によって行った。切除した畢丸および腹膜後の脂肪パッドを、激しい攪拌下に３７℃で３０分間、クレブスーリンゲルーヘベス緩衝液（ＫＲＨ）、ｐＨ７，４，３５ｍｇ／Ｍ１透析ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０゜２７ｍＭグルコース中のコラゲナーゼ（１、０ｍｇ　／　ｙｄ　）で消化した。チーズ布でろ過し、１０■／Ｎ１のＢＳＡを含むＫＲＨで４回洗浄した後、脂肪細胞を同じ緩衝液で３７℃４時間予備インキュベートした。

脂肪合成アッセイは３連で、６７ａ１のポリエチレンバイアル中で、４００μｍの脂肪細胞懸濁液（８０Ｘ１０”細胞／−）、ホルモン無添加（基礎脂肪合成）または指示された濃度のインシュリンもしくはりセブターー誘導ペプチドを添加した５０μｌのＫＲＨ緩衝液ｐＨ７，４（１％ＢＳＡ、０゜２７ｍＭグルコース）、および５０μｍのＤ−［３−”　Ｈ］−グルコースを、全量０．５−中で連続的に添加して行われた。このバイアルを穏やかな攪拌下に３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションはトルエンシンチレータ−（１１のトルエン＋０．３ｇの１，４−ビス［２−（４−メチル−５−フェニルオキサシリル）］ベベンジおよび５ｇの２，５−ジフェニルオキサゾール）をバイアル当たり５Ｍ１、激しい攪拌下で（細胞を破砕するため３０秒）添加して中断し、少なくとも１時間静置して、カウント前に脂肪がトルエン層へ抽出されるようにした。異なるサンプルのカウント効率は、冷却トリチウムスタンダード（ｑ　ｕ　ｅ　ｎ　ｃｈｅｄ　ｔｒｉｔｉａｔｅｄ　５ｔａｎｄａｒｄｓ）による内部標準化で測定した。脂肪へのＤ−［３−”　Ｈ］−グルコースの取り込みは、ｃ　ｐｍＸ　１０−”／チューブ±標準偏差で表示した。

第１０図に示すとおり、４種のペプチド全てが、インシュリンの効果に近い程度に脂肪合成を刺激した。４つのペプチドの相対効果は実験間である程度変動したが、これはおそらく多少限られた溶解性のためであろう。要求されるペプチドの濃度はインシュリンの濃度よりも遥かに高かった（二つの横軸のスケールの違いに注意）。

皇ｌ丞エペ　チド　Ａ配列Ｉのペプチドがインシュリンに結合する濃度範囲は第１１図に示されており、第１０図に示されているペプチド■ないし■が活性である濃度範囲に似ている。

第１１図に示したデータを得るためには　１２５　ニーインシュリン（Ｉ　Ｘ　１０−１”　Ｍ）を室温で一夜、１０μｇ／−の未標識インシュリンの不存在下または存在下で、指示した濃度のペプチドとともに、アッセイ緩衝液（１００ｍＭヘペス、１２０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣｌ、１．２ｉ＋Ｍ　ＭｇＳＯ４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭグルコース、１５ｍＭＮ　ａ　Ｃｚ　Ｈａ　Ｏ２，１％ウシ血清アルブミン。

ｐＨ７，６）中でインキュベートした。結合および遊離トレーサーは、ペプチド懸濁液をベックマン社の小型遠心機で１０゜０００ｒｐｍ、１０分間で分離した。ペレットについて、γ−カウンター中で測定を行った。

ス」１匹１− 一インシュリン　によるベ　チドの　Ａ　に旦工玉旦！第１２図は、配列Ｖのペプチドの脂肪合成活性がシグマ社のポリクローナル抗− インシュリン抗体＃ｌ−８５１０により不活性化されることを示す。

第１２図に示されているデータを得るためには、実施例Ｉで詳細に説明した脂肪合成アッセイを、１　：　５００希釈の抗−インシュリン抗体の不存在下または存在下で、ホルモンの不存在下（基礎）または１０μｇ／１１ｄｌのインシュリンもしくは１０μｇ／−のペプチドＶの存在下キナーゼＵによるペプチド　合　の且１９８８年７月８日に出願された米国特許出願２１６．３７９号の記載の方法を用いた。該米国特許出願は、インシュリンによる脂肪細胞の脂肪合成の刺激は、キナーゼＣまたはスタウロスポリンのようなキナーゼＣ阻害剤により可逆的に阻害されることを示している。

第１３図は配列Ｖのペプチドによる同様な結果を示している。

第１３図の結果を得るためには、実施例工で詳細に説明した脂肪合成アッセイを、キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン（１０μｇ　／ｄ）またはスフィンゴシン（１００μＭ）の不存在下または存在下で、ホルモンの不存在下（基礎）または１１０Ａｔ／ｄのインシュリンもしくは１００μｇ／Ｎ１のペプチドＶの存在下で行った。

本実施例は、インシュリンリセプター配列９２−１０３（配列■）：ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＩＬＥ−ＰＨＥ−ＧＬＵ−ＭＥＴ−ＶＡＬ−ＨＩＳ− ＬＥＵ−ＬＹＳ−ＧＬＵのインシュリン模倣活性を示す。

本実施例の第一の観点は、インシュリンリセブター配列８１ないし９１は、脂肪合成活性が全く存在しないことである。具体的には、配列８１−９１のペプチドをペプチド■ないし■の代わりに用いて、実施例■の実験を行っても、脂肪合成は基礎合成値を越えては刺激されない。

本実施例の第二の観点は、ペプチド８１−９１に対する抗体は配列Ｖのペプチドの効果を阻害することができないことである。

本発明のさらなる具体的態様は配列■に相当する合成および純化ペプチド配列、そのようなペプチドを含むインシュリン模倣薬剤、および該薬剤を投与して糖尿病およびそれに関連する病気を治療をすることも包含する。

浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　３−２ＦＩＧ、　４Ｃ：　ＦＩＧ。４Ｄ浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし） −吉　４ト／）−りｌし浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）Ｓ１日Ｉ目１哩］巳目浄書（内容に変更なし）１肪へゑつ込Ｊれ穴　’Ｈ−７’ルコース（ＣＰＭ／４ｚ−アＸ　１０−’！　Ｉｓ、Ｄ、＞浄書（内容に変更なし）絽＋／）Ｃ門浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　１２浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　１３手続補正書彷幻ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２８３０２、発明の名称３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所氏　名　デメイッ、ビニール４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区国際調査報告 ”ｍ−１１１−ａｌ　ａｔｍａ＋ｍ　−、ｐ（７／（３５５９／Ｑ２１１３Ｑ− Ｉ針＾・１−〜嗣＾・−鴫４−一叫＠、ＰＣＴ１口Ｓ８９１０２８１０Ｇｒｏｕｐ　Ｙ　−Ｐ＠ｐｔｕ＠Ｓ　（Ｎａｔｕｒａｌ　ｏｒ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ）− ｃｌａｉ：＝、ｇ　’−４゜Ｇｒｏｕｐ　Ｖ　−人ｓｙｎ辷ｈｅｔｉａ　ｐｅｐセｉｄ唸　ｆｒａｇｍｅｎｌ：　ｏｆ　！ＧＦ−１−ｃｌａｉｍ　１６゜Ｇｒｏｕｐ　Ｖ！Ｈ−Ｉｎｌｌｕｌｉ閲飄１１１１１１：ｉｅ　ｄｒｕｇ　ｃｌａｉｍ　２６゜Ｓｕｂｇｒｏｕｐｓｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　Ｘ−ＸＸ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトインシュリン分子に結合する配列Ｉまたは配列ＩＩまたは配列ＩＩＩの実質的に一部から構成される精製天然ペプチドもしくは合成ペプチド。
２．配列Ｉからなる精製された天然アミノ酸配列。
３．配列ＩＩからなる精製された天然アミノ酸配列。
４．アミノ酸配列Ｉまたはアミノ酸配列ＩＩまたはアミノ酸配列ＩＩＩから実質的になる、合成ペプチド。
５．少なくともヒトインシュリン分子に結合するために有効なだけの配列Ｉの部分からなり、且つ第４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、５Ａまたは５Ｂ図のいずれかに示された三次元構造を有する、ヒトインシュリンリセプターのα−サブユニットの精製フラグメントまたは合成フラグメント。
６．第４Ａ、４Ｂ、４Ｃまたは４Ｄ図のいずれかに示された、インシュリンリセプターのα−サブユニットの残基８３−９４を含む三次元分子モデル。
７．第４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、５Ａまたは５Ｂ図に示されたグラフィックモデルの、少なくともヒトインシユリン分子に結合するために有効な部分を含む、三次元分子モデル。
８．インシュリンリセプターのα−サブユニットの残基８３−９４の、少なくともヒトインシュリン分子に結合するために有効な部分の、グラフィック表示。
９．コンピューターで作成された、請求項８記載のグラフィック表示。
１０．第４Ａ、４Ｂ、４Ｃまたは４Ｄ図に示された、コンピューターで作成されたグラフィック表示。
１１．インシュリンリセプターのα−サブユニットの残基８３−９４の、少なくともヒトインシュリン分子に結合するために有効な部分のグラフィック表示を鋳型として用いて、インシュリン模倣薬剤を設計する方法。
１２．グラフィック表示がコンピューターで作成されたものである請求項１１記載の方法。
１３．第４Ａ、４Ｂ、４Ｃまたは４Ｄ図に示されたグラフィック表示が使用される請求項１１記載の方法。
１４．インシュリン様成長因子Ｉ分子に結合する配列ＩＶの一部から実質的になる、精製天然ペプチドまたは合成ペプチド。
１５．配列ＩＶからなる精製天然アミノ酸配列。
１６．配列ＩＶの少なくともＩＧＦ−Ｉ分子に結合するのに有効な部分からなり、且つ第９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄ図に示した三次元構造を有する、インシュリン様成長因子Ｉリセプターの精製フラグメントまたは合成フラグメント。
１７．第９Ａ、９Ｂ、９Ｃまたは９Ｄ図のいずかに示したＩＧＦ−１リセプターの残基７７−９７を含む三次元分子モデル。
１８．第９Ａ、９Ｂ、９Ｃまたは９Ｄ図に示したグラフィックモデルの、少なくともＩＧＦ−Ｉ分子に結合する部分からなる、三次元分子モデル。
１９．ＩＧＦ−Ｉリセブターの残基７７−９７の、少なくともヒトインシュリン分子に結合するために有効な部分の、グラフィック表示。
２０．コンピューターが作成した請求項１９に記載のグラフィック表示。
２１．第９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄ図に示された、コンピューターによるグラフィック表示。
２２．ＩＧＦ−Ｉリセプターの残基７７−９７の、少なくともＩＧＦ−Ｉ分子に結合するために有効な部分のグラフィック表示を鋳型として用いることよりなる、薬剤の設計方法。
２３．グラフィック表示がコンピューターにより作成されたものである、請求項２２記載の方法。
２４．第９Ａ、９Ｂ、９Ｃまたは９Ｄ図に記載されたグラフィック表示を用いる、請求項２３記載の方法。
２５．ヒトインシュリン結合部位の一部に相当する合成または精製アミノ酸配列からなる、インシュリン模倣薬剤。
２６．配列１ないしＩＸのいずれか一つに相当する合成または精製アミノ酸配列からなる、インシュリン模倣薬剤。
２７．ヒトインシュリンリセプターの結合部位を含むアミノ酸配列からなる、インシュリン模倣薬剤。
２８．第５Ａまたは５Ｂ図に示した三次元構造を有する、ヒトインシユリンα− サブユニットの精製もしくは合成フラグメント。
２９．第５Ａまたは５Ｂ図に示したグラフィック表示の、少なくともヒトインシュリン分子に結合するために有効な部分からなる、三次元分子モデル。
３０．インシュリン結合部位またはインシュリン様成長因子Ｉ結合部位を含む、ヒトインシュリンリセプターのαサブユニットのアミノ酸配列の単離されたフラグメント。
３１．実質的に次の群：【配列があります】および【配列があります】および【配列があります】および【配列があります】および【配列があります】および【配列があります】から選択されるアミノ酸配列から実質的に構成される非天然ペプチド。