JP2000506166A

JP2000506166A - リガンド結合に対する応答のモジュレーションに関与するレセプタ由来のペプチド

Info

Publication number: JP2000506166A
Application number: JP9531953A
Authority: JP
Inventors: レナートオルソン; タタイナナヴレンダ
Original assignee: リセプトロン
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 2000-05-23
Also published as: WO1997032899A1; AU2071397A; CA2248255A1; US6333031B1; US20030078202A1; US6346390B1; EP0909275A1; US20020160013A1

Abstract

(57)【要約】レセプタの細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列を有し、かつMHCクラスＩ抗原由来の調節ペプチドに対する配列類似性を有するオリゴペプチドは、対応するレセプタに対するリガンド結合の生理的応答性を高める。これらのオリゴペプチドは、不十分なまたは不適当なレセプタ応答を含む諸疾患の診断および治療において、並びにレセプタの表面発現に影響を与える薬物候補のスクリーニングにおいて使用される。同様に、薬物スクリーニングにとって有用なものは、該調節ペプチドに対応する配列が、変性されもしくは除去されている、変性レセプタ分子である。

Description

【発明の詳細な説明】リガンド結合に対する応答のモジュレーションに関与するレセプタ由来のペプチド緒言技術分野本発明の分野は細胞表面レセプタによる、リガンドに対する応答のモジュレーションに関する。背景ホルモン、レセプタおよび応答細胞間の複雑な調節的バランスは、多細胞生物の機能修正にとって重要である。巧妙な環境的および遺伝的因子は、このバランスを崩壊する可能性があり、しばしば疾患をもたらす。分子生物学の進歩は、医学的に重要なホルモンが治療上有用な量で入手できることを意味している。このようなものとしては、ヒト成長ホルモン、インシュリンー様成長ホルモン、インシュリン、表皮成長因子、および多くのその他のものが挙げられる。経済的におよび医学的に極めて重要な状態は、インシュリン耐性であり、これは極めて多様な臨床的諸疾患、例えば糖尿病、肥満および幾つかの型の高血圧の基本的特徴である。非−インシュリン依存性糖尿病患者は、末梢組織におけるインシュリン耐性を呈する。彼等は、骨格筋における準正常なグルコース利用を示し、ここで骨格筋の細胞膜を横切るグルコース輸送は、グルコース代謝の律速段階である。欠陥が、糖尿病状態にある骨格筋内でのインシュリン依存性グルコース輸送に存在する可能性があり、ここでは低レベルのグルコース輸送体４タンパク(GLUT4)が観測される。脂肪および筋肉細胞において、インシュリンは、主として細胞間貯蔵サイトから形質膜への、該GLUT4グルコース輸送体の再配列を促進することによって、迅速且つ劇的なグルコース取り込みの増大を刺激する。インシュリン耐性は、また細胞レベルでのインシュリン活性における欠陥によるものとすることもできる。インシュリンレセプタは、インシュリンと該レセプタのα−サブユニット領域との結合により活性化され、細胞間β−サブユニット領域の自己ホスホリル化を生ずる。この活性化されたインシュリンレセプタはシグナルカスケードに影響を与える可能性のある、サイトゾルレセプタ基質とカップリングして、多面性ホルモン応答をもたらす。シグナル伝達経路に関与する殆どのタンパクは、未だ知られていないが、その各々はインシュリン耐性の種々の態様においてある役割を演じている可能性がある。インシュリン耐性の不均一な特性は、該シグナル伝達経路の「上流」に作用し得る処置を極めて魅力あるものとする。というのは、多くの異なる病状が単一の薬物で治療可能であるからである。特定のペプチドが、幾つかのホルモンに対する細胞応答を高めることが、以前に明らかにされた。この作用は、対応するホルモンレセプタのインターナリゼーションの阻害によるものとされている。インシュリン刺激によるグルコース摂取は、これらのペプチドを応答細胞に添加することにより増大し、インシュリン依存性およびインシュリン耐性糖尿病に関連する改良された治療法の可能性をもたらす。この高められた応答性は、また他のホルモンを包含する療法においても活用できる。インシュリンおよび他のホルモンの活性を高める薬剤の特異性の改善は、その治療上の利益にとってかなり興味あるものである。このようなペプチドのレセプタ分子への作用サイトは、薬物の評価および設計のために興味深いものである。関連する文献幾つかのグループが、インターナリゼーションに関与する残基に対するグルコース輸送体およびインシュリンレセプタを検討した。Rajagopalan等(Biochem.Bi ophys.Res.Commun.，1995，211:714-8）は、残基GPYL950-953が支配的なエンドサイトーシスシグナルとして、かつ配列NPEY957-960が第二のシグナルとして機能することを見出した。Levy-Toledano等(Biochem．Biophys．Acta，1993,1220: 1-14）は、C-末端から43-113アミノ酸の範囲に位置する構造ドメインが、完全な細胞において、インシュリン刺激自己ホスホリレーションおよびシグナル伝達のために必要であることを示唆した。Verhey等(J．Cell Biol.，1995，130: 1071-9）は、種々の準細胞局在化およびグルコース輸送体のイソ型のホルモン− 応答性に関与する配列を同定した。インシュリンに対する応答において、細胞表面まで輸送する細胞内貯蔵プールに対する正確な局在化にとっては、GLUT4のC00 H-末端30アミノ酸で十分である。 1995年１月31日付けの米国特許第5,385,888号は、表面レセプタ活性のクラスＩ MHCペプチドモジュレーションを記載している。国際特許公開PCT/US94/09189 に記載されこのデータは、これらのペプチドが生物学的に活性であるためには、規則的な配座をもつ必要があることを示唆している。このようなペプチドの組成および用途は、更に国際公開PCT/US93/01758に記載されている。これらペプチドは更に国際公開PCT/US89/00876にも開示されている。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子による、レセプタインターナリゼーションの調節は、Olsson等(Proc．Natl．Acad．Sci.，1994，91:9086-90)により示された。該主要生体適合遺伝子複合体クラスＩタンパク(MHC-I)のαＩドメイン由来のタンパクは、幾つかのレセプタのインターナリゼーションを阻害し、結果として該細胞表面上の活性レセプタの定常状態数を増大する。MHC-Iは、細胞表面レセプタ活性の調節に関与している。Stagsted等(J．Biol．Chem.，1993，268 :22809-13)は、このようなペプチドがグルコース輸送体(GLUT4)およびインシュリン−刺激細胞におけるインシュリン−様成長因子II(IGF-II)レセプタのインターナリゼーションを阻害することを立証している。発明の概要細胞表面レセプタタンパクにおける、インターナリゼーションに関与する細胞質外領域を決定するための方法並びに組成物を提供する。この領域におけるアミノ酸配列の同定は、レセプタインターナリゼーションを調節する生理活性化合物についての、薬物スクリーニングアッセイの設計を可能とする。該レセプタの細胞外ドメインの該当部分のアミノ酸配列を、少なくとも実質的に含むオリゴペプチドは、リガンド結合のための、細胞表面レセプタの応答を調節する。該レセプタ由来のペプチドは、該主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原由来の、前に記載された調節ペプチドに対する配列類似性をもつ。本発明の方法並びに組成物は、不十分なまたは不適当なレセプタ応答が関与する諸疾患の診断および治療、並びにレセプタの表面発現に影響を及ぼす候補薬物のスクリーニングにおいて利用する。同様に薬物スクリーニングのために有用なのは、変性されたレセプタ分子であり、ここで該調節ペプチドに対応する配列は変性されもしくは除去されている。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関するデータベース文献該ヒトインシュリン応答性グルコース輸送体(GLUT4)をコードする完全mRNA配列はゲンバンク(Genbank)承認番号M20747を有し、Fukumoto等(J．Biol．Chem.， 1989，264:7776-7779）により公開された。該ヒトインシュリンレセプタをコードする完全mRNA配列は、ゲンバンク(Genbank)承認番号A18657を有し、国際特許出願WO/91/17253において公開されている。ヒトレプチンレセプタをコードする完全mRNA配列はゲンバンク(Genbank)承認番号U43168を有し、Tartaglia等のCell ，1995，83:1263-1271に公開されている。ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF) レセプタをコードするDNA配列は、EMBL承認番号M59820、M38027、X55720およびX 55721を有し、Larsen等のJ．Exp．Med.，1990，172:1559-1570に公開されている。ヒトインターロイキン２(IL-2)レセプタの完全配列はスイスプロット(Swisspr ot)承認番号P01589を有し、Leonard等のNature，1984，311:626-631に公開されている。ヒト表皮成長因子(EGF)レセプタの完全配列は、スイスプロット(Swissp rot)承認番号P00533を有し、Ullrich等のNature，1984，309:418-425により公開されている。他の細胞表面レセプタに関する配列も公知であり、当業者は容易に入手できる。公知のHLAおよびH-2対立遺伝子の配列は、Kabat等のSciences of Proteinsof Inlmunological Interest，N.I.H.公開番号91-3242，Vol．1,pp.738-740,761，7 70-771，779-780，788-789 802-804に見出すことができる。特別な態様の説明本発明は、細胞表面レセプタの細胞外部分上の配列、即ち「インターナリゼーション配列」が、相互に結合して、該レセプタのインターナリゼーションを阻止するという発見に基づくものである。幸運にも、該インターナリゼーション配列はリガンド結合に直接関与していない。かくして、該インターナリゼーション配列の効果的な二量体化またはオリゴマー化は、これら配列を模倣するオリゴペプチドの設計を可能とする。従って、これら配列を模倣するオリゴペプチドは、該レセプタの該インターナリゼーションを阻止し、結果として該細胞表面上に極めて多数のレセプタを与えるのに有用である。この細胞表面上のレセプタ数の増加または安定化は、リガンド結合の高い有効性をもたらす可能性がある。このことは、低下した結合またはシグナル発生が問題となる、多数の疾病状態における治療上の関連性をもつ。例えば、リガンドシグナル発生の高い効率が望ましいような、ホルモン感受性が低下しまたは該ホルモンの産生が減少する多数の疾患がある。例えば、非−インシュリン依存性の糖尿病(NIDDM)がこの状態にある。対象とする細胞表面レセプタは、リガンド結合に応答して、細胞質内に取り込まれ、もしくは細胞質内で再循環される。一般的に、調節ペプチドは調節すべきレセプタの配列を由来とするであろう。対象とする配列は、該細胞外表面のレセプタ領域に相当するが、通常は直接リガンド結合には関与せず、即ちリガンドと接触することはない。レセプタの配列および細胞膜内での該レセプタの位置決定は、当分野で公知である。このような情報は、上に引用した如き公開されたデータベースを通して入手できる。従って、本発明は調節オリゴペプチドを提供し、該オリゴペプチドは、細胞表面レセプタの細胞外ドメインの一部の配列と少なくとも実質的に同一である、アミノ酸配列をもつインターナリゼーション配列を含む。一般的に、これらオリゴペプチドは、また主要組織適合遺伝子座クラスＩ抗原の生理活性オリゴペプチドに対する配列類似性をも有する（米国特許第5,385,888号に記載されており、これを本発明の参考とする）。これらのオリゴペプチドは、該対応するレセプタに対するリガンド結合の効果を調節し、結果として該リガンドの生理的作用を増強する。これらインターナリゼーション配列は、まずMHCクラスＩ抗原のα₁-ドメインの配列に対する相同性によって同定される。MHCクラスＩ抗原は、ヒトMHCクラスＩ抗原およびその哺乳動物等価物、例えばマウスのH-2座のクラスＩ抗原、特にH-2 ＤおよびＫ等を含む。ヒトMHCクラスＩ抗原は、HLA-A、ＢおよびＣを含む。より一層興味深いものは、該α-1ドメインの多形領域のアミノ酸配列、より詳しくはアミノ酸55〜90、通常60〜90、より具体的には62〜90である。該α-1ドメインの68-85領域、より具体的には62-85または72-82の領域が特に興味深いことが分かった。特に興味深い一つのMHC配列は、ERETQIAKGNEQSFRVDLRTLLR(SEQ ID NO:1;米国特許第5,385,888号）である。従って、これら領域に対する配列類似性をもつオリゴペプチドが好ましい。これら配列、特にSEQ ID NO:１における配列を利用して、細胞表面レセプタの任意の数の配列を、相同領域について走査する。適当な細胞表面レセプタはインシュリンレセプタ、インシュリンー様成長因子レセプタ、ヒト成長ホルモンレセプタ、グルコース輸送体、トランスフェリンレセプタ、表皮成長因子レセプタ、低密度リポタンパクレセプタ、表皮成長因子レセプタ、レプチンレセプタ、インターロイキンレセプタ、例えばIL-1レセプタ、IL-2レセプタ等を包含するが、これらに制限されない。配列解析に関するアルゴリズムは当分野で公知であり、Al tschul等のJ．Mol．Biol.，1990，215:403-10に記載されているBLAST;Torelli & RobottiのCompt．Appl．Biosci.，1994，10:3-5に記載されているADVANCES& ADA M;Pearson & LipmanのP.N.A.S.，1988，85:2444-8に記載されているFASTAを包含する。この配列類似性は、ウイスコンシンパッケージ(Wisconsin Package),バージョン8.0-OpenVMS,ジェネティックスコンピュータグループ(Genetics Computer Group)を利用して決定できる。好ましくは、対象とするレセプタ領域のアミノ酸配列は、少なくとも約10%の配列同一性、およびしばしば少なくとも約20%の配列同一性をもつであろう。この配列同一性は少なくとも約35%およびしばしば少なくとも約45%であろう。これらの例は例示的な類似性探索の結果を与える。対象とする例示的なレセプタ由来のアミノ酸配列は、(SEQ ID NO:2)TWLGRQGPE GPSSIPPGTLTTLW(ヒトグルコーストランスポーター，GLUT4）;(SEQ ID NO:3)KTDS QILKELEESSFRKTFEDYLH(ヒトインシュリンレセプタ);(SEQ ID NO:4)GRGNEKKPSSVR ALSIVLPIVLLVF(ヒトLDLレセプタ);(SEQ ID NO:5)KTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLH(ヒトインシュリン−様成長因子レセプタ);(SEQ ID NO:6)KKENKIVPSKEIVWWM NLAEKIP(ヒトレプチンレセプタ);(SEQ ID NO:7)EKKPVPWESHNSSETCGLPTLVQTY(ヒトGCSFレセプタ);(SEQ ID NO:8)YKEGTMLNCECKTGFRRIKSGSLY(ヒトインターロイキン２レセプタ);(SEQ ID NO:9)LLEGEPREFVENSECIQCHPECLP(ヒト表皮成長因子レセプタ);および(SEQ ID NO:12)EYELQYKEVNETKWKMMDPILTTSVPVY（ヒト成長因子レセプタ)を包含する。該対象とするレセプタ配列、即ち該インターナリゼーション配列は、活性モチーフ配列として、少なくとも８個のアミノ酸、通常は少なくとも約12個のアミノ酸、より一般的には少なくとも約18個のアミノ酸、かつ約40個末満のアミノ酸、より一般的には30個末満のアミノ酸を含むであろう。当業者には理解されるであろうように、該インターナリゼーション配列は、変性オリゴペプチドまたは変性レセプタとして、変性することができ、ここで該レセプタは変性されたインターナリゼーション配列で造られる。好ましい態様において、該調節オリゴペプチドの該インターナリゼーション配列は、変更される。好ましくは、いかなる変性も、該対応するレセプタに対する該インターナリゼーション配列の生物学的活性、即ちインターナリゼーションまたは凝集を実質的に変更することはない。このことは、本明細書に記載される結合アッセイを利用して容易にテストすることができる。例えば、アミノ酸置換、挿入および欠失を行うことができる。一態様においては、アミノ酸置換を行う。一般的に、生物学的活性にとって重要な残基は、変更されないかもしくは保存性の変更を行うことが好ましい。必須の残基は、公知の突然変異誘発技術を利用し、次いで活性または結合アッセイを行うことにより、例えば該インターナリゼーション配列内の単一のアミノ酸残基を、脂肪族アミノ酸、例えばセリン、アラニン、グリシン、バリン等と置換することにより変更する、走査突然変異誘発技術を利用することにより評価できる。同様に、約３個以下の置換または欠失を行い、また該変更は、該活性モチーフ中のアミノ酸の数の、約20%(数基準)を越えない、通常は約10%(数基準)以下であることが好ましい。しかしながら、非−必須残基のみを変更した場合、この数値はより高くなる可能性がある。好ましいのは、当分野で公知の、大きな疎水性基：イソロイシン、ロイシン、バリンおよびフェニルアラニン内での、セリンとスレオニンとの間、グリシンとアラニン、アスパラギンとグルタミン、アスパラギン酸とグルタミン酸、またはリジン、アルギニンとヒスチジンとの間の置換を包含する、保存性置換である。幾つかの態様においては、非−保存性の置換を実施する。該インターナリゼーション配列内の変性に加えて、該オリゴペプチドは、当業者には理解されるであろうように、追加の配列を含むことができる。例えば、該オリゴペプチドは、1)システインまたはリジン等の、有利な結合サイトを与え、 2)安定性を高め、3)特定のレセプタと結合し、4)サイト特異的な作用を与え、5) 精製の容易性をもたらし（例えば、エピトープまたは精製(His₆)タッグ）、6)物理的特性（例えば、溶解性、電荷等）を変更し、もしくは7)配座を安定化する等のために、伸張することかできる。該オリゴペプチドは、融合タンパクとして、非−野性型のフランキング領域と、結合基によりまたはシステイン（ジスルフィド）またはペプチド結合を介する共有結合により結合することができる。このオリゴペプチドは、種々の二官能性試薬、例えばマレイミド安息香酸、メチルジチオ酢酸、メルカプト安息香酸、S-ピリジルジチオプロピオネート等を介して結合できる。該オリゴペプチドはアミノ酸の鎖のN-またはC-末端における単一のアミノ酸と結合でき、あるいは内部的に結合できる。例えば、本発明のペプチドは免疫原タンパク、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン等と共有結合的に結合して、本発明のオリゴペプチドに対する抗体産生を容易にすることができる。また、本発明のオリゴペプチドは、他のペプチドまたはタンパクと関連して発現でき、該連鎖の内部、N-またはC-末端の一部となる。種々の発現後の変性も可能である。例えば、適当なコード配列を使用して、ファルネシル化またはプレニル化することができ、結果として本発明のペプチドは１つの末端の脂質基に結合し、かつ脂質膜、例えばリポソームに挿入できるであろう。本発明のオリゴペプチドは、ポリエチレングリコリル化(PEGylated)することができ、ここで該ポリエチレンオキシ基は、血流における高い寿命をもたらす。該対象のオリゴペプチドは、また他のタンパク、例えばIgGイソタイプのFcと結合して、相補的結合を増強し、あるいはリシン、アブリン、ジフテリア毒素等の毒素の特にＡ鎖と結合することができる。該オリゴペプチドは、サイト特異的作用する抗体と結合することができる。結合技術については、例えば米国特許第3, 817,837号、同第3,853,914号、同第3,850,752号、同第3,905,654号、同第4,156, 081号、同第4,069,105号および同第4,043,989号を参照のこと。これらを本発明の参考とする。本発明の該調節オリゴペプチドのオリゴマーも、製造できる。例えば、薬物スクリーニングについて興味あるオリゴペプチドは、1)対象とするレセプタ領域の少なくとも実質的な配列を有するオリゴペプチド、2)対象とする該レセプタ領域の配列および該主要組織適合遺伝子座クラスＩ抗原の生理活性オリゴペプチドのアミノ酸配列をもつ、MHC/レセプタオリゴペプチドヘテロダイマー、および3)一般的にはヘッド〜テイルダイマーとしての、レセプタ由来のオリゴペプチドホモダイマー（ここでは、１〜３個の小さな中性アミノ酸のスペーサーが、２つの活性なペプチド配列間に存在できる）を包含するが、これらに限定されない。一旦同定したら、該インターナリゼーション配列を含む該オリゴペプチドは、公知の技術、例えば合成（例えば、ベックマンモデル(Beckman Model)990ペプチド合成装置または他の市販の合成装置の使用）に従って、調製することができる。ぺプチドは、組み換え法によって直接製造でき（Sambrook等のMolecular Clon ing:A Laboratory Manual,CSHL Press,Cold pring Harbor,NY,1989を参照のこと）または例えば特異的結合対の一つであるタンパクに対する融合タンパクとして製造でき、該融合タンパクの精製は、アフィニティー試薬によって可能であり、次いで通常は所定のペプチドを生成するように操作されたサイトにて、タンパク分解酵素により開裂される（例えば、Driscoll等のJ.Mol．Bio.，1993,232:342- 350を参照のこと）。好ましい一態様においては、該レセプタに含まれる該インターナリゼーション配列を、変性レセプタを形成するように変更する。該レセプタの変性された形状において、調節配列（即ち、該インターナリゼーション配列）に対応する該配列は挿入、置換または欠失を含んでおり、結果として該レセプタの、リガンド結合に応答した取り込み能力が変更される。この変性は、完全なオリゴペプチド配列、またはその一部の欠失または置換を含むことができる。興味ある置換は、上で概説したような走査(scanning)突然変異をも含む。有利には、この変性は組み換えDNA技術を利用して実施する。該所定のレセプタをコードするDNA配列は、種々の源から得ることができ、あるいは刊行物から入手できる配列情報由来のプローブを使用して、cDNAライブラリーから得ることもできる。クローン化した遺伝子のインビトロ変異誘発技術は公知であり、サイト特異的変異誘発法は、Sambrook等の上記文献，pp.15.3-15.108;Weiner等，Gen e，1993，126:3541;Sayers等，Biotechniques，1992，13:592-6;Jones & Winist orfer,Biotechniques，1992，12:528-30;Barton等，Nucleic Acids Res.,1990， 18:7349-55;Marotti & Tomich,Gene Anal.Tech.，1989,6:67-70;およびZhu，Ana l．Biochem.，1989，177:1204に見出すことができる。例えば、ある配列を除去するためには、該領域に跨がるプライマーを工夫する。ハイブリダイゼーションの際に、除去すべき該領域は、一本鎖ループを形成する。このループは、ヌクレアーゼ消化により切断し、適当なポリメラーゼを使用して該プライマーから伸張させることができる。発現のためには、該DNA配列を適当な発現ベクターに挿入する。ここで、本来の転写開始領域を使用するか、あるいは外因性の転写開始領域、即ち通常存在する染色体中の遺伝子と結合しているプロモータ以外のプロモータを使用することができる。該プロモータは、インビトロでの組み換え法により、あるいは該配列の染色体への相同性組み込みの結果として導入することができる。広範な転写開始領域が、様々な発現宿主に対して知られている。一般的に、該発現宿主内で機能する選別可能なマーカーが存在するであろう。該プロモータは、対象とする遺伝子の該コード配列と、機能可能な状態で結合して、翻訳可能なmRNA転写体を生成する。発現ベクターは、該プロモータ配列近傍に位置する、有利な制限サイトを有し、非相同のタンパクをコードする核酸配列の挿入をもたらす。適当な発現ベクター中の該プロモータは、構成的または誘導的であり得る。発現ベクターは融合タンパク産生をもたらし、ここで該外因性融合ペプチドは付随的な機能性、即ち高いタンパク合成機能、安定性、規定された抗血清との反応性、酵素マーカー、例えばβ−ガラクトシダーゼ等を与える。該発現ベクターを、宿主細胞内で形質転換する。該発現宿主は、原核または真核細胞、特にE.コリ、B.ズブチリス、酵母細胞、哺乳動物細胞、例えばCOSおよびCHO細胞、HeLa細胞、L(tk-)一次培養物、昆虫細胞、アフリカツメガエル(Xeno pus laevis)卵母細胞等を含むことができる。特に好ましい宿主細胞は哺乳動物細胞である。一旦生成されたら、該オリゴペプチドおよび変性レセプタは、多数の用途における利用が見出される。好ましい一態様において、該オリゴペプチドは、哺乳動物細胞の細胞表面レセプタ応答のインターナリゼーションを阻害する方法において利用される。この方法は、本発明によれば、明細書に定義したようなオリゴペプチドを、細胞表面レセプタを発現する哺乳動物細胞に添加することを含む。該レセプタと結合する該リガンドの添加の際に（同時にまたは周期的に）、該オリゴペプチドは該レセプタのインターナリゼーションを阻害する。従って、好ましい態様では、該オリゴペプチドを治療の目的で投与する。本発明のオリゴペプチドはホルモンに対する細胞応答を高めるように作用し、該ホルモンは、該オリゴペプチドに対応する表面膜レセプタに結合し、例えばインシュリン応答は、オリゴペプチドSEQ ID NO:3により高められ、グルコース輸送は、該オリゴペプチドSEQ ID NO:2によって高められる。インシュリン、インシュリン−様成長因子、ヒト成長ホルモン、グルコース輸送体、トランスフェリン、表皮成長因子、低密度リポタンパク、ヒト成長ホルモンおよび表皮成長因子を包含するホルモンは、本発明によれば、明細書では「治療ホルモン」と呼ぶ。本発明の４オリゴペプチドによる治療ホルモンに対する細胞応答性の増強は、このようなホルモンに対して非−応答性、例えば耐性であるような患者の応答性を改善する手段を与える。本発明のオリゴペプチドは、該治療ホルモンの自然のレベルに対する応答性の増強を必要とする患者に投与できる。あるいはまた、本発明のオリゴペプチドは治療ホルモンと共に、患者に投与することもできる。特に興味深いものは、インシュリン耐性の治療であり、これはグルコース輸送におけるまたはインシュリンに対する細胞性応答における欠陥と関連している可能性がある。本発明のオリゴペプチドの投与はインシュリン療法に対する応答性を改善する。同様に、ヒト成長ホルモンの増強は、特に興味深いものである。ヒト成長ホルモンは、一般に臨床的な状況の幾つかにおいては、注射可能な薬物として与えられ、別の療法は内在性ホルモンの応答性を高めることを含む。治療のためには、本発明のオリゴペプチドは、局所的にまたは非経口的に、例えば特定のサイトにおける注射、例えば皮下、腹腔内、静脈内、経鼻、経皮等による注射によって投与できる。注射用処方は、生理的に許容される媒体、例えば水、塩水、PBS、水性エタノール、水性エチレングリコール等を含むであろう。使用可能な水溶性の保存剤は、重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸塩、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、硼酸フェニル水銀、パラベン類、ベンジルアルコールおよびフェニルエタノールを包含する。これらの試薬は、各々約0.001〜約５重量％および好ましくは約0.01〜約２重量％の範囲の量で存在できる。使用できる適当な水溶性緩衝剤は、アルカリまたはアルカリ土類金属の炭酸塩、燐酸塩、重炭酸塩、酒石酸塩、硼酸塩、酢酸塩、琥珀酸塩等、例えば燐酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、硼酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウムである。カルボキシメチルセルロース等の添加剤を、担体として、約0.01〜約５重量％の量で使用することができる。該処方は該処方物の目的、該レセプタ活性を調節するのに使用する特定の態様、意図する治療等に応じて変えることができる。該処方はパッチ、カプセル、リポソーム、遅効性被覆剤、ピルを包含することができ、あるいは連続的投与のためにポンプ内で処方することも可能である。特定の用量は、公知の方法に従って経験的に決定できる。例えば、Harrisonの“Principles of Inte rnal Medicine”,第11版，Braunwald等編，McGraw Hill Book Co.，NY，1987を参照のこと。一般的に、本発明のオリゴペプチドの治療上有効な用量は、宿主体重１kg当たり、約0.005-10mg、より一般的には約0.01-1mgの範囲内にある。このような用量は、該治療ホルモンの作用を、通常少なくとも50%程度高めるのに十分である。投与は毎日であり得、通常は投与される薬物の濃度に依存して、１日当たり１回程度あるいはそれ以上、あるいは週１回程度の低頻度であり得る。本発明のオリゴペプチドは単独で、あるいは該治療ホルモンとの組み合わせで投与できる。該ホルモンは通常の治療上有効な用量で投与でき、または該用量は、該オリゴペプチドによる増強を補償するために、50%程度まで、通常は25%程度まで減じることができる。該宿主は、家畜、ペット、実験動物および霊長類、特にヒトを包含する、任意の哺乳動物であり得る。その量は、一般的に該ペプチドの半減期に応じて調節でき、ここで該範囲の低い部分における用量が使用でき、その場合には該ペプチドが長い半減期を有し、あるいはデポ剤として与えることができ、該デポ剤は、例えば該ペプチドを長期間に渡り維持できるマトリックス、例えばコラーゲンマトリックス中に導入された粒子を含む徐放性組成物、あるいは長期間に渡り実質的に連続的な割合で、該ペプチドを連続的に注入するポンプの使用によって投与できる。Hellerの“Biodegradable Polymers in Controlled Drug Delive ry”：CRC Critical Reviews in Therapeutic Drua Carrier Systems,Vol．1,CR C Press，Boca Raton，FL，1987，pp.39-90は、制御された薬物放出のための封入を記載し、またDi Coloは”Biomaterials“，1992，13:850-856において疎水性ポリマーからの制御された薬物の放出を記載している。好ましい態様においては、本発明のオリゴペプチド、変性されたレセプタおよび該変性されたレセプタを含有する細胞を、スクリーニングアッセイにおいて使用する。レセプタのこの領域におけるアミノ酸配列の同定は、レセプタインターナリゼーションを調節する化合物に関する、薬物スクリーニングアッセイの設計を可能とする。薬物スクリーニングアッセイは、目的の配列情報およびペプチド組成物、例えばタンパク、オリゴペプチドおよびその合成誘導体を使用して、細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節する薬剤を同定する。表面レセプタインターナリゼーションを調節することのできる薬物の候補を、まず該薬物候補の、完全なレセプタとの結合に対して、生理活性オリゴペプチドとの競合能につき、あるいは対象としてのレセプタ由来のオリゴペプチドに対するオリゴペプチドの結合を妨害する能力についてスクリーニングすることによって同定される。かくして、好ましい一態様においては、該方法はインターナリゼーション配列を含有する細胞表面レセプタと候補生理活性薬剤とを結合し、該候補薬剤の該インターナリゼーション配列との結合を測定する工程を含む。ここで使用する「細胞表面レセプタ」なる用語は、通常リガンド結合の際に取り込まれる、多数の細胞表面レセプタの何れかを意味する。適当な細胞表面レセプタは、インシュリンレセプタ、グルコース輸送体レセプタ、LDLレセプタ、インシュリンー様成長因子レセプタ、レプチン(leptin)レセプタ、GCSFレセプタ、IL-2レセプタを包含するインターロイキンレセプタ、表皮成長因子レセプタ、および成長ホルモンレセプタを包含するがこれらに限定されない。好ましい態様は、ヒト細胞表面レセプタを使用するが、他の哺乳動物レセプタも使用可能であり、例えばマウス、ラットおよび霊長類を包含する。細胞表面レセプタの定義に含まれるものは、自然に発生する配列のアミノ酸置換、挿入、または欠失である。好ましくは、これらは該レセプタの生理活性を変更しないが、本明細書で定義したように、幾つかの例においては、該レセプタの生理活性を変更することが望ましい場合がある。更に、細胞表面レセプタのこの定義に含まれるものは、細胞表面レセプタの一部であり、即ち完全な長さのレセプタを使用でき、あるいはその機能的部分を使用できる。好ましい態様においては、該機能的ドメインは、少なくともリガンド結合ドメインおよびインターナリゼーション配列を含み、結果としてリガンドが該レセプタに結合した際に生ずる配座変化は、依然として起こるであろう。一般的に、ここに記載の方法の好ましい態様においては、該細胞表面レセプタは、単離サンプル受容領域を有する不溶性の支持体（例えば、マイクロタイタープレート、アレイ等）に拡散不能に結合されている。この不溶性支持体は、ペプチドまたはレセプタを結合できる任意の組成のものであり得、容易に可溶性物質から分離でき、さもなければ該スクリーニング法全体に対して相容性である。このような支持体の表面は充実性または多孔質であり得、また任意の有利な形状のものであり得る。適当な不溶性支持体の例は、マイクロタイタープレート、アレイ、膜およびビーズを包含する。典型的には、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、ポリサッカライド、ナイロンまたはニトロセルロースから作成される。マイクロタイタープレートおよびアレイが、特に有利である。というのは、多数のアッセイを、少量の試薬およびサンプルを使用して、同時に実施することを可能とするからである。該ペプチドまたは他のタンパクの特別な結合方法は、これが本発明の試薬および方法全体に対して相容性である限り、決定的なものではなく、該ペプチドの活性を維持し、かつ非−拡散性である。好ましい結合方法は、抗体の使用（これは、該レセプタが該支持体と結合する際に、該リガンド結合サイトまたはインターナリゼーション配列を立体的に遮断しない）、「粘着性」またはイオン性の支持体への結合、化学的架橋法等を包含する。該ペプチドまたはレセプタの結合に引き続き、過剰の未結合物質を洗浄により除去する。次いで、該サンプル受容領域を、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼインまたは他の無害なタンパクと共にインキュベートすることにより遮断できる。好ましい態様においては、該細胞表面レセプタにより結合したリガンドまたは類似体も、該アッセイに添加することができる。即ち、例えばインシュリンレセプタを使用する場合、該リガンドはインシュリンであり、またヒト成長ホルモンレセプタを使用する場合には、該リガンドはヒト成長ホルモンである。当業者には理解されるであろうように、リガンド類似体を使用することも可能である。候補生理活性薬剤をこのアツセイで添加する。新規な結合剤は、特異的抗体、化学ライブラリーのスクリーニングにおいて同定された非−天然の結合剤、ペプチド類似体等を包含し、特に興味深いのは、ヒトの細胞に対して低毒性の薬剤に対するスクリーニングアッセイである。多岐に渡るアッセイを、この目的のために利用することができ、標識されたインビトロタンパク−タンパク結合アッセイ、電気泳動による移動度シフトアッセイ、タンパク結合に関するイムノアッセイ等を包含する。本明細書で使用する「薬剤(agent)」なる用語は、任意の分子、例えばタンパク質、オリゴペプチド、小さな有機分子、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド等の、リガンド結合に応答して、細胞表面レセプタインターナリゼーションを直接または間接的に変更する能力を有する分子を意味する。一般的には、複数のアッセイ混合物を、種々の薬剤濃度にて実行して、該種々の濃度に対する示差的応答を達成する。典型的には、これら濃度の一つが負のコントロール、即ちゼロ濃度または検出限界以下の濃度として機能する。候補薬剤は、多数の化学物質群を包含するが、典型的にはこれらは有機分子、好ましくは100ダルトンを越えかつ約2,500ダルトン未満の分子量をもつ小さな有機化合物である。候補薬剤はタンパクとの構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの化学官能基を含む。該候補薬剤は、しばしば１以上の上記官能基で置換された、環状炭素またはヘテロ環構造および／または芳香族または多環式芳香族構造を含む。候補薬剤は、また生体分子中にも見出され、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造的類似体または組み合わせを包含する。候補薬剤は合成または天然産化合物のライブラリーを含む多岐に渡る源から得られる。例えば、多岐に渡る有機化合物および生体分子のランダムなおよび管理された合成のために、種々の手段が利用でき、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を包含する。あるいはまた、バクテリア、真菌、植物および動物からの抽出物としての、天然化合物のライブラリーを利用することができ、あるいは容易に製造することかできる。更に、天然または合成により生成したライブラリーおよび化合物は、公知の化学的、物理的または生化学的手段によって容易に変性される。公知の薬理学的薬剤は管理されたまたはランダムな変性、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化に付して、構造的な類似体を生成することができる。該候補生理活性薬剤の、該レセプタに対する結合の測定は、多数の方法で実施できる。一態様においては、該候補生理活性薬剤を標識し、結合を直接測定する。ここで使用する「標識された(labeled)」なる用語は、該化合物を、直接または間接的に、検出可能なシグナルを与える、例えば放射性同位元素、蛍光発光性物質、酵素、抗体、磁性粒子等の粒子、化学発光物質等のラベルで標識すること意味する。該スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、１種以上の該物質をラベルと結合することができ、該ラベルは、直接または間接的に検出可能なシグナルを与えることができる。種々のラベルは、放射性同位元素、蛍光発光性物質、特異的結合分子、磁性粒子等の粒子等を包含する。特異的結合分子は、ビオチンとストレプタビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン等の対を含む。該特異的結合物質については、その相補的物質は、通常公知の手順により検出できる分子で標識されるであろう。幾つかの態様においては、該成分の一つのみを標識する。例えば、該オリゴペプチドは、¹²⁵Iを用いてチロシン位で標識できる（例えば、該ヒトGLUT4のインターナリゼーション配列、インシュリン、IGF-1、G-CSF、IL- 2およびhGHレセプタは、全てチロシン残基を含む）。また、１以上の成分を異なるラベルで標識することができ、例えば該オリゴペプチドに対しては¹²⁵Iを使用し、また該候補薬剤に対しては発蛍光団を使用することができる。好ましい一態様においては、該候補生理活性薬剤の結合は、競合的結合アッセイを使用して測定される。この態様において、該競合物質は、ここに記載したようなオリゴペプチドである。一態様においては、該候補生理活性薬剤を標識する。レセプタが存在する場合には、該候補生理活性薬剤または該オリゴペプチドを、まず結合を可能とするのに十分な時間、該レセプタに添加する。インキュベーションは、最適活性の達成を容易にする任意の温度にて、典型的には４〜40℃にて実施することができる。インキュベート時間は最適活性を達成するように選択されるが、迅速かつ高い処理量でのスクリーニングを容易にすべく最適化することができる。典型的には、 0.1〜１時間で十分であろう。過剰の試薬は、一般的には除去または洗い流す。次いで、第二の成分を添加し、結合を表す該標識成分の有無を追跡する。好ましい一態様においては、該オリゴペプチドを最初に添加し、次いで該候補生理活性薬剤を添加する。該オリゴペプチドの置換は、該候補生理活性薬剤が該インターナリゼーション配列に結合していることの指標であり、かくして該レセプタのインターナリゼーションを調節できる。この態様において、何れかの成分を標識できる。従って、例えば該オリゴペプチドを標識した場合、洗液中のラベルの存在は該薬剤による置換を示す。また、該候補生理活性薬剤を標識した場合には、該支持体上の該ラベルの存在が置換を表す。別の態様においては、該候補生理活性薬剤をまず添加し、インキュベートし、洗浄し、次いで該オリゴペプチドを添加する。該オリゴペプチドによる結合が存在しないことは、該生理活性薬剤が高いアフィニティーで該レセプタと結合していることを示す可能性がある。従って、該候補生理活性薬剤を標識した場合には、該支持体上におけるラベルの存在は、オリゴペプチド結合の欠如と共に、該候補生理活性薬剤が該インターナリゼーション配列と結合可能であり、該レセプタのインターナリゼーションを調節できることを示す可能性がある。好ましい一態様においては、これら方法は、細胞表面レセプタ、該レセプタと結合するリガンド、および本明細書に記載のオリゴペプチドを組み合わせて、テスト混合物を生成する。該候補生理活性薬剤を、該テスト混合物に添加し、該候補生理活性薬剤と、該レセプタのインターナリゼーション配列との結合を測定する。この態様においては、該オリゴペプチドまたは該候補生理活性薬剤の一方または両者を標識し、好ましい態様においては、標識したオリゴペプチドを使用して、該ラベルの置換が、該候補生理活性薬剤との結合を表すようにする。好ましい態様においては、これらの方法は、レセプタの該インターナリゼーションを調節することのできる、生理活性薬剤の同定のための示差スクリーニングを含む。この態様において、該方法は、第一サンプル中に、細胞表面レセプタ、リガンド、およびオリゴペプチドの組み合わせを含む。第二のサンプルは、候補生理活性薬剤、細胞表面レセプタ、リガンド、およびオリゴペプチドを含む。該オリゴペプチドの結合はこれら両サンプルについて測定し、これら２つのサンプル間の結合における変化または差異が、該レセプタのインターナリゼーションを調節できる薬剤の存在を示す。即ち、該オリゴペプチドの結合が該第一のサンプルと該第二のサンプルとで異なる場合、該薬剤は該インターナリゼーション配列と結合可能である。また、好ましい態様では、本来のレセプタには結合するが、変性されたレセプタ、例えば該インターナリゼーション配列が除去されたものには結合し得ない薬物候補を同定するための示差スクリーニングを利用する。興味ある該レセプタ配列の構造をモデル化することができ、また合理的な薬物設計において使用して、該サイトと相互作用する薬剤を合成することができる。レセプタのインターナリゼーションに影響を与える薬物候補も、薬物を、対象とするレセプタを由来とするオリゴペプチドの、選択された表面レセプタのインターナリゼーションに及ぼす効果を高めもしくは減ずる能力についてスクリーニングすることにより同定される。スクリーニングは、生理活性MHC-由来のオリゴペプチドの、該対象のオリゴペプチドとの結合を阻害する薬剤を見出すために、実施することができ、ここで該薬剤は該対象のオリゴペプチドを誘導した、該レセプタのインターナリゼーションを調節することができるであろう。これは、上記方法を利用して実施されるが、該オリゴペプチドを、MHCクラスＩ抗原のα1-ドメイン由来の配列、例えばSEQ ID NO:１で置換する。該薬物候補および変動する濃度の、該対象とするレセプタ由来のオリゴペプチドを、支持体結合ペプチドを含有するサンプル受容領域各々に添加する。該添加されたオリゴペプチドは、該支持体に結合されたオリゴペプチドと実質上同様なアミノ酸配列をもつものであり、かつ標識されている。活性ペプチドおよび活性ペプチドの競合的結合に関する正のコントロールは、それぞれ標識された活性ペプチド単独および標識された活性ペプチドと未標識の不活性ペプチドとの混合物を含むサンプルを含有する。標識された活性ペプチドと、該結合ぺプチドと凝集しない未標識の不活性ペプチドとを含有するサンプルは、ぺプチドとの競合的結合に関する負のコントロールとして機能する。好ましくは、コントロールおよびテストサンプル全ては、少なくとも３回のテストに付され、統計的に有意な結果を得る。全てのサンプルのインキュベーションは、該標識した活性ペプチドと該支持体−結合ペプチドとの間の結合にとって十分な時間実施する。インキュベーションに引き続き、全てのサンプルを洗浄して、非− 特異的結合物質を除去し、結合した標識ペプチドの量を測定する。例えば、該ペプチドの標識において放射性ラベルを使用した場合には、該サンプルをシンチレーションカウンタで計数して、結合した標識ペプチドの量を測定する。該薬物候補を含有するテストサンプルにおいては、該支持体１−結合ペプチドまたはレセプタと結合した、標識した活性ペプチドの量が、競合的結合に対する正のコントロールサンプルの値の範囲内であり、かつ競合結合に対する負のコントロールサンプルの値よりも有意に低かった場合には、該テストサンプル中の該薬物候補は、該支持体−結合ペプチドに上首尾で競合的に結合できる。このような競合的結合が可能な薬物候補は、レセプタの細胞表面発現の調節を媒介する可能性がある。種々の他の試薬も、このスクリーニングアッセイで使用することができる。これらは、塩、アルブミン等の中性タンパク、洗浄剤等の試薬を包含し、これらは最適のタンパク−タンパク結合を容易化し、および／または非−特異的なまたはバックグラウンド相互作用を減ずるために使用できる。また、該アッセイの効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗−微生物剤等を使用することができる。該成分の混合物は、所定の結合を与える任意の順序で添加できる。薬理活性をもつ化合物は、リガンド結合に応答して、細胞表面レセプタのインターナリゼーションを増強または阻止することができる。本発明のオリゴペプチドに相当する該レセプタ上のサイトに対する結合は、本発明のオリゴペプチドの同族レセプタとの結合を妨害する能力同様に、かかる活性の指標である。該所定の薬理活性をもつ化合物は、上記のように、生理的に許容される担体と共に、宿主に投与できる。該阻害剤は種々の方法で、経口、皮下、腹腔内、血管内経路等の非−経口経路で投与することができる。導入の様式に依存して、該化合物は様々な方法で処方できる。該処方における治療上活性な化合物の濃度は、約0.1-10 0重量％の範囲で変えることができる。該薬理組成物は種々の形状、例えば顆粒剤、錠剤、ピル、坐剤、カプセル剤、懸濁剤、軟膏、ローション剤等の形状で調製できる。製薬グレードの有機または無機担体および／または経口および局所用途用に適した希釈剤を使用して、該治療上活性な化合物を含有する組成物を作成できる。当分野で公知の希釈剤は、水性媒体、植物および動物油脂を包含する。安定化剤、湿潤および乳化剤、浸透圧を変えるための塩または十分なpH値を設定するためのバッファー、および皮膚透過促進剤を、補助的薬物として使用できる。従って、リガンドの細胞表面レセプタに対する結合の生理的作用を、かかる生理活性レセプタ由来のオリゴペプチド、オリゴペプチドホモダイマー、およびMH C/レセプタオリゴペプチドヘテロダイマーの投与によって高める方法を提供する。これらの方法は、不十分なまたは不適当なレセプタ応答に関連する諸疾患の診断および治療において使用する。データは、該レセプタのインターナリゼーションが、本発明のオリゴペプチドの存在により阻止され、結果として該細胞表面における多数のレセプタおよびリガンド結合の高い有効性がもたらされる。以下の実施例は、上記本発明の利用法をより十分に説明し、かつ本発明の種々の局面を実施するために意図された最良の態様を提示するのに役立つ。これら実施例は、本発明の真の範囲を何等限定するものではなく、寧ろ例示の目的で与えられるものと理解すべきである。ここに引用された参考文献の全てについて、その全体を本発明の参考とする。実施例実施例１レセプタインターナリゼーションに関与する、細胞表面レセプタの外部ドメイン上の領域を決定するために、配列類似性の比較を実施した。これらの比較は、市販品として入手可能なウイスコンシンパッケージ(Wisconsin Package),バージョン8.0-openVMS，Genetics Computer Groupを使用して実施した。完全なレセプタ配列は、前に記載した“Database References for Nucleotide and Amino Aci dSequences”に記載されているような、公的なデータベースから入手した。該類似性は、Dayhoffにより測定され、かつGribskov&Burgessにより規格化された(Nucl．Acid Res.，1986，14:6745-6763)ように、アミノ酸間の進化距離に基づいている。Smith&Watermanの「局所的相同性」アルゴリズム(Advances in A pplied Mathematics，1981，2:482-289)は、２つの配列間の最良のセグメント類似性を見出す。 SEQ ID NO:１と、該細胞表面レセプタ、即ちヒトGLUT4輸送体、ヒトインシュリンレセプタ、ヒトLDLレセプタ、ヒトIGF-1レセプタ、ヒトIL-2レセプタ、ヒトレプチン(OB)レセプタ、ヒトG-CSFレセプタ、ヒトインシュリン−様成長因子レセプタおよびヒト表皮成長因子レセプタとの間の類似性の検討は、該レセプタ領域の配列SEQ ID NO:2〜SEQ ID NO:９が、該MHC生理活性ペプチド配列に対する最高の類似度をもつものと決定した。実施例２方法インシュリンレセプタの変性と発現。該データベースレファレンスおよびEbin a等(Cell，1985，40:747-758)に記載されているように、pCR3発現べクター(Invi trogen,カタログNo．K3000-01）を有する、該ヒトインシュリンレセプタ遺伝子を、HeLa細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。エレクトロポレーション法は、Boggs等の文献(Ex．Hematol.，1986，149:988-994)に記載されている。このトランスフェクションした細胞において、該レセプタはインシュリン依存性インターナリゼーションを示す。該インシュリンレセプタの突然変異型を、除去すべき領域に跨がる増幅プライマーを使用して、残基713〜740(SEQ ID NO:10:PKTDSQILKELEESSFRKTFEDYLHNV)を除去することによって生成した。この欠失突然変異体:mIRを、HeLa細胞にトランスフェクションし、次いで該・IRのインターナリゼーションをテストした。IR インターナリゼーションの測定：レセプタインターナリゼーションは、本質的にStagsted等の文献(Cell，1990，62:297-307)に記載のようにして実施した。簡単に説明すれば、106細胞/mlの該トランスフェクションした細胞液50μ１を、第１表に示した如く、10μＭのペプチドの存在下または不在下で、625pMの¹²⁵I− 標識したインシュリンと共に、37℃にて、振盪水浴中でインキュベートし、次いで最終体積を100μｌとした。次に、これら細胞を50μlのKRHB(pH7.2)（酸洗浄せず）、あるいは50μlのKRHB(pH2.0)（酸洗浄）で希釈し、氷上で５分間インキュベートした。該細胞を、最終的にシリコーン油の上部で遠心処理することにより収穫し、遊離のおよび細胞−結合放射能両者を測定した。脂質細胞中のグルコース輸送：これらペプチドの生理活性を、記載された(Stags ted等，J.Biol．Chem.，1991，266:12844-12847)如く、ラット脂質細胞中へのグルコースの取り込みに及ぼすその効果により測定した。簡単に説明すれば、ラット脂質細胞は副皐丸脂質パッドから得、5%のウシ血清アルブミンを含むクレブスーリンゲル(Krebs-Ringer)HEPESバッファー(KRH)中に、10%(最終)なるリポクリット(lipocrit)にて懸濁した。このペプチドの効果は、インシュリン(10nM)により最高に刺激された細胞中で測定した。37℃にて30分間平衡化した後、該細胞を37℃にて30分間、バッファー（基本）、10nMインシュリン＋ペプチドと共にインキュベートした。¹⁴C-D-グルコースを添加し、該細胞を更に30分間インキュベートし、油上で収穫した。生物学的活性を、ドーズ−依存性曲線によって測定して、EC₅₀値を内挿により求めた。ここで、インシュリン作用の最大の増強（インシュリンのみによる最大を約40%越える）を100%とした。該ペプチドの多くは、3 0μＭを越える高濃度ではテストしなかった。30μＭにおいて20%末満だけ、該最大のインシュリン作用を増強したペプチドは、不活性であると考えた。ペプチド：これらペプチドを、フェニルアセタミドメチル(PAM)樹脂上で、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)モデル430Aペプチド合成装置のt- BocNMP/HOBtプロトコールを使用して、あるいはp-アルコキシベンジルアルコール(Wang)樹脂上で、ミリゲン／バイオサーチ(Milligen/Biosearch)モデル9600合成装置の改良されたFmoc/B0Pプロトコールを使用して、段階的に製造した。これら所定のペプチドは、配列解析、アミノ酸組成、および高速原子衝撃マススペクトル法により確認した。これらペプチドは、１mMの母液を、37℃にて0.1MのNaCl 中で一夜インキュベートすることにより活性化させた(Stagsted等，J．Biol．Ch em.，1991，266:12844-12847)。結果レセプタインターナリゼーションに及ぼすペプチドの効果：インシュリンレセプタおよび変異させたインシュリンレセプタに関するインターナリゼーションの速度は、ペプチド：SEQ ID NO:3，KTDSQILKELEESSFRKTFEDYLH(pepIR)およびSEQ ID NO:11，GNEQSFRVDLRTLLRYAGGGNEQSFRVDLRTLLRYA(DS-A85)の存在下または不在下で測定した。得られたデータを以下の第２表に示す。ここで数値は取り込まれたレセプタの割合(%)を示す。これらデータは、変異インシュリンレセプタmIRが、インシュリン結合の際に取り込まれず、一方野性型のIRの50%以上は30分以内に取り込まれることを示している。該pepIRペプチドは、DS-A85と同程度にレセプタインターナリゼーションを阻害する。グルコースの取り込みに及ぼすペプチドの効果：最大のインシュリン刺激における、pepIRの添加は、グルコース取り込みに有意な作用を及ぼさなかったが、このことはpepIRがGLUT4のインターナリゼーションに影響を与えないことを示している。グルコース取り込みは、10μＭのインシュリンの添加により14±３倍高められる。インシュリン＋10μＭのDS-A85ペプチドは、グルコースの取り込みを22 ±４倍高め、一方でインシュリン＋10μＭのpepIRは、グルコースの取り込みを1 2±４倍高めるが、この結果はインシュリン単独と有意な差を示さない。 10μＭ濃度におけるGLUT4pep(SEQ ID NO:2)は、該トランスフェクションした細胞による、インシュリンレセプタインターナリゼーションに影響を与えない。ペプチドの存在下で、取り込みレセプタの割合(%)は、６±９であり、ペプチドの不在下で、これは64±７である。このペプチドは、最大インシュリン刺激におけるグルコース取り込みに及ぼす効果により示されるように、GLUT4のインターナリゼーションを阻害する。10μＭのインシュリンの存在下で、グルコース取り込みの増強は、12±４倍であった。この増強は、GLUT4pepの添加により24±２まで増大した。従って、該ペプチドはGLUT4のインターナリゼーションを阻害するが、インシュリンレセプタの阻害は生じないものと考えられる。上記結果から、細胞表面レセプタの細胞外ドメインの配列を有し、かつMHCクラスＩ抗原の領域を有するオリゴペプチドが、該対応するレセプタのインターナリゼーションを阻害する上で有効であることは明らかである。これらのペプチドは、インシュリン等のホルモンに対する細胞性応答を高める上で、治療上有用である。本明細書で引用した全ての刊行物および特許出願を、各個々の刊行物および特許出願が具体的にかつ各々について参考文献としてここに組み込まれると記載した如く、ここに参考文献として組み入れる。以上本発明を、理解を明確なものとする目的で、例示および実施例により幾分詳細に説明してきたが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付した請求の範囲の精神並びに範囲を逸脱することなしに、幾つかの変更並びに改良を行うことが可能であることを容易に理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 (31)優先権主張番号０８／７８８，８２０ (32)優先日平成９年１月23日(1997．1．23) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 細胞表面レセプタの細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を有する、少なくとも約８個のアミノ酸および約40末満のアミノ酸をもつインターナリゼーション配列を含み、該細胞表面レセプタを発現する細胞と結合した場合に、該細胞表面レセプタに対するリガンド結合の効果を増強することを特徴とする、オリゴペプチド。 2. 該オリゴペプチドが、MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの配列と、少なくとも約35%の配列類似性を有する、請求の範囲第１項に記載のオリゴペプチド。 3. MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの該配列が、SEQ ID NO:１である、請求の範囲第２項に記載のオリゴペプチド。 4. 該細胞表面レセプタが、インシュリン応答性グルコース輸送体、インシュリンレセプタ、レプチンレセプタ、低密度リポタンパクレセプタ、インシュリン− 様成長因子レセプタ、顆粒球コロニー刺激因子レセプタ、インターロイキン２レセプタ、ヒト成長ホルモンレセプタおよび表皮成長因子レセプタからなる群から選ばれる、請求の範囲第１項に記載のオリゴペプチド。 5. 該細胞表面レセプタがヒト由来のものである、請求の範囲第４項に記載のオリゴペプチド。 6. SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、SEQ ID NO:７、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９およびSEQ ID NO:12からなる群から選ばれるオリゴペプチド。 7. 哺乳動物細胞の細胞表面レセプタ応答のインターナリゼーションを阻害する方法であって、該哺乳動物細胞に、細胞表面レセプタの細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を有する、少なくとも約８個のアミノ酸および約40未満のアミノ酸をもつインターナリゼーション配列を含むオリゴペプチドを添加する工程を含み、該細胞表面レセプタを発現する細胞と結合した場合に、該オリゴペプチドが、リガンド結合の際に、レセプタインターナリゼーションを阻害することを特徴とする、上記方法。 8. 該オリゴペプチドが、MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの配列と、少なくとも約35%の配列類似性を有する、請求の範囲第７項に記載の方法。 9. MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの該配列が、SEQ ID N0:１である、請求の範囲第８項に記載の方法。 10．該細胞表面レセプタが、インシュリン応答性グルコース輸送体、インシュリンレセプタ、レプチンレセプタ、低密度リポタンパクレセプタ、インシュリン− 様成長因子レセプタ、顆粒球コロニー刺激因子レセプタ、インターロイキン２レセプタ、ヒト成長ホルモンレセプタおよび表皮成長因子レセプタからなる群から選ばれる、請求の範囲第７項に記載の方法。 11．該細胞表面レセプタがヒト由来のレセプタである、請求の範囲第10項記載の方法。 12．該オリゴペプチドの配列がSEQ ID N0:２、SEQ ID N0:３、SEQ ID N0:４、SE Q ID NO:５、SEQ ID NO:６、SEQ ID NO:７、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９および SEQ ID NO:12からなる群から選ばれる、請求の範囲第10項に記載の方法。 13．変性された細胞表面レセプタを含み、該変性が細胞外ドメインの領域のインターナリゼーション配列におけるアミノ酸配列置換、挿入または除去を含み、かつ該変性された配列が、少なくとも約８個のアミノ酸および約40未満のアミノ酸を含むものであり、該細胞表面レセプタの、リガンド結合に応答する取り込み能力が、該変性により変えられる、ことを特徴とする哺乳動物細胞。 14．該細胞表面レセプタが、インシュリン応答性グルコース輸送体、インシュリンレセプタ、レプチンレセプタ、低密度リポタンパクレセプタ、インシュリンー様成長因子レセプタ、顆粒球コロニー刺激因子レセプタ、インターロイキン２レセプタ、ヒト成長ホルモンレセプタおよび表皮成長因子レセプタからなる群から選ばれる、請求の範囲第13項に記載の細胞。 15．該細胞表面レセプタがヒト由来のレセプタである、請求の範囲第14項記載の細胞。 16.該変性が、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、SEQ ID NO:７、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９およびSEQ ID NO:12からなる群から選ばれる配列の除去を含む、請求の範囲第11項に記載の細胞。 17．細胞表面レセプタのインターナリゼーション配列を決定する方法であって、該細胞表面レセプタと、MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの該配列との間の配列類似性をもつ領域について検索する工程を含み、該インターナリゼーション配列が、該細胞表面レセプタのインターナリゼーションに関与していることを特徴とする、上記方法。 18．該オリゴペプチドが、MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの該配列と、少なくとも約35%の配列類似性を有する、請求の範囲第17項に記載の方法。 19．MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの該配列が、SEQ ID N0:１である、請求の範囲第18項に記載の方法。 20．細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節できる生理活性薬剤についてスクリーニングする方法であって、 a) 第一のサンプル中で、該細胞表面レセプタにより結合するリガンドの存在下で、候補生理活性薬剤と、請求の範囲第13項に記載の細胞とを結合させ、 b) 第二のサンプル中で、該細胞表面レセプタにより結合したリガンドの存在下で、候補生理活性薬剤と、非−変性状態の該細胞表面レセプタを含む細胞とを結合させ、および c) 該候補薬剤と、該第一および第二サンプル中との結合を測定し、該薬剤の該第二サンプル中の結合の、該第一サンプル中の結合に対する変化が、該薬剤が該細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節できることを示すことを特徴とする、上記方法。 21．細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節できる生理活性薬剤についてスクリーニングする方法であって、細胞表面レセプタと候補生理活性薬剤とを結合させ、および該候補薬剤と、該細胞表面レセプタのインターナリゼーション配列との結合を測定することを特徴とする、上記方法。 22．該測定を、請求の範囲第１項に記載のオリゴペプチドを使用した、競合的結合を検討することにより行う、請求の範囲第21項に記載の方法。 23．該候補生理活性薬剤または該オリゴペプチドの何れかを標識する、請求の範囲第22項に記載の方法。 24．該細胞表面レセプタが、完全な長さの該細胞表面レセプタを含む、請求の範囲第21項に記載の方法。 25．細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節できる生理活性薬剤についてスクリーニングする方法であって、 a)i)該細胞表面レセプタと、 ii)該細胞表面レセプタと結合するリガンドと、 iii)請求の範囲第１項に記載のオリゴペプチドと、ここで該オリゴペプチドは該細胞表面レセプタのインターナリゼーション配列と結合するを組み合わせ、 b)該テスト混合物に、候補生理活性薬剤を添加し、 c)該候補生理活性薬剤と該インターナリゼーション配列との結合を測定する工程を含み、該候補生理活性薬剤と該インターナリゼーション配列との結合が、該薬剤が、該細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節できることを示す、ことを特徴とする上記方法。 26．該オリゴペプチドを標識する、請求の範囲第25項に記載の方法。 27．該候補生理活性薬剤を標識する、請求の範囲第25項に記載の方法。 28．該細胞表面レセプタが、完全な長さの該細胞表面レセプタを含む、請求の範囲第25項に記載の方法。 29．細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節できる生理活性薬剤についてスクリーニングする方法であって、 a)第一のサンプル中で、該細胞表面レセプタと、該細胞表面レセプタと結合するリガンドと、請求の範囲第１項に記載のオリゴペプチドとを結合させ、 b)第二のサンプル中で、候補生理活性薬剤と、該細胞表面レセプタと、該細胞表面レセプタと結合するリガンドと、請求の範囲第１項に記載のオリゴペプチドとを結合させ、 c)該オリゴペプチドと、該第一および第二のサンプル中の該細胞表面レセプタとの結合を測定する工程を含み、該オリゴペプチドの該第二サンプル中の結合の、該第一サンプル中の結合に対する変化が、該薬剤が該細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節できることを示す、ことを特徴とする上記方法。 30．細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節できる生理活性薬剤についてスクリーニングする方法であって、 a)第一のサンプル中で、請求の範囲第１項に記載のレセプタ由来のオリゴペプチドと、MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの配列を有する生理活性ペプチドとを結合させ、 b)第二のサンプル中で、候補生理活性薬剤と、請求の範囲第１項に記載のレセプタ由来のオリゴペプチドと、MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの配列を有する生理活性ペプチドとを結合させ、および c)該レセプタ由来のオリゴペプチドと、該第一および第二のサンプル中のMHC クラスＩ抗原のα1-ドメインの配列を有する該生理活性ペプチドとの結合を測定する工程を含み、該第二サンプル中の該結合の、該第一サンプル中の結合に対する変化が、該薬剤が該細胞表面レセプタのインターナリゼーションを調節できることを示す、ことを特徴とする上記方法。 31．MHCクラスＩ抗原のα1-ドメインの該配列が、SEQ ID NO:１である、請求の範囲第22項に記載の方法。