JP2002507892A

JP2002507892A - ヒト・アデニル酸シクラーゼのクローニングおよび特性評価

Info

Publication number: JP2002507892A
Application number: JP50728799A
Authority: JP
Inventors: トムリンソン，ジェイムズ，エー．
Original assignee: シーオーアールセラピューティクスインコーポレイテッド
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 1998-07-01
Publication date: 2002-03-12
Also published as: EP0996711A1; CA2294366A1; WO1999001546A1; AU8274498A; US6436672B1

Abstract

(57)【要約】ヒトアデニル酸シクラーゼをコードするＤＮＡ配列が開示される。また、アデニル酸シクラーゼのアミノ酸配列も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト・アデニル酸シクラーゼのクローニングおよび特性評価発明の分野本発明は、ヒト・アデニル酸シクラーゼをコードするＤＮＡに関する。また、本発明は、該ＤＮＡによりコードされるアデニル酸シクラーゼに関する。本明細書においてヒトＶ型アデニル酸シクラーゼ（ｈＡＣ５）ポリペプチドと称する、この酵素は、Ｖ型アデニル酸シクラーゼ活性を促進、或いは阻害のいずれかしうるアゴニストおよびアンタゴニストを探索するための手段として使用することができる。このような化合物は、（１）前記酵素の異所性活性に起因する疾病、および（２）Ｖ型アデニル酸シクラーゼの活性を促進、或いは阻害することによってその症状が改善されうる疾病を治療するための治療的用途を有する。また、本発明は、ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼをコードする、単離された全ヒト遺伝子、精製されたヒトＶ型アデニル酸シタラーゼの遺伝子組換え生産のための方法、および該方法により生産されたタンパク質、ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼの全体またはその一部の領域に対する抗体、ベクター、ヌクレオチドプローブ、およびヒトＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子により形質転換された宿主細胞、さらにこれらを診断薬および治療薬等の各種試薬として使用することに関する。発明の背景アデニル酸シクラーゼ群は、主として、多種多様なファミリーを形成する膜結合型Ｇタンパク結合受容体群が各々に対応する細胞外のホルモンやプロテアーゼにより活性化されることに呼応して、ＡＴＰをｃＡＭＰへ変換することにより、主要な第二メッセンジャーである3',5'-環状アデノシン−リン酸（ｃＡＭＰ）の細胞内合成反応を引き起こす。Ｇタンパク結合受容体の信号伝達は、アルファ（Ｇ_α）およびベータ／ガンマ（Ｇ_α）のサブユニットから構成される、結合されたヘテロ３量体Ｇタンパク複合体を介して起こる。Ｇ_αは受容体への刺激を受けると、ＧＴＰをＧＤＰと交換して、Ｇ_βγおよび受容体から解離し、そしてアデニル酸シクラーゼを含む、種々のエフェクターを直接的に調節するに至る。複数のファミリーのＧ_α蛋白が同定されており、このうち２つのファミリーについては、アデニル酸シクラーゼ活性調節に関する機能に基づき、全てのアデニル酸シクラーゼを活性化するＧ_αsファミリー、一方、全てではないが大部分のアデニル酸シクラーゼを阻害するＧ_αiファミリーと命名されている。これらＧ_α蛋白は、それぞれ、独自の組織分布を有し、且つ、アデニル酸シクラーゼの受容体特異的な調節を可能とする結合受容体のサブセットを有する。さらなる研究により、アデニル酸シクラーゼ活性が組織内で調節されうる他の機構が提案されてきた。この概念は、アデニル酸シクラーゼにそれぞれ独自の遺伝子座を有するいくつかのアイソフォーム（亞型）が存在し、特有の組織分布、および細胞内信号伝達に対して相異なる一群の反応を示すという知見に由来している。現在までに、主として齧歯類において、Ｉ〜ＩＸ型の９種の別個のアイソフォームが特性決定されており、それぞれが特有の調節機能および組織特異的分布を示す。アデニル酸シクラーゼの構造は詳細に研究されており、想定ドメインについて標準的な命名法が与えられている。位相幾何学的には、アデニル酸シクラーゼの各アイソフォームは類似しており、細胞内側Ｎ末端に付随する２つの６重膜貫通領域、大きな細胞質ループ（ＩＣＤＩＩＩ、またはより一般的には「Ｃ₁」と呼ばれる）、および大きな細胞内側Ｃ末端（より一般的には「Ｃ₂」と呼ばれる）を有する。前記Ｎ末端と前記Ｃ₁ループとの間の膜貫通領域は、一般的には「Ｍ１」と呼ばれている。Ｍ１領域は３つの細胞外ドメイン(ＥＣＤＩ、IIおよびIII )、２つの細胞内ドメイン(ＩＣＤＩおよびII)、そして６つの膜貫通ドメイン（ＴＭI、II、III、ＩＶ、ＶおよびＶＩ）を有する。前記Ｃ₁ループと前記Ｃ末端との間の領域は「Ｍ２」と呼ばれる。Ｍ２領域は３つの細胞外ドメイン(ＥＣＤＩＶ、ＶおよびＶＩ)、２つの細胞内ドメイン(ＩＣＤＩＶおよびＶ)、そして６つの膜貫通ドメイン（ＴＭＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩ）を有する。前記Ｎ末端は、一般的に「Ｎ₁」および「Ｎ₂」と命名される２つの領域に分割される。前記大きなＣ₁細胞質ループも同様に、長い「Ｃ_1a」領域、および短い「Ｃ_1b」領域の２領域に分割される。最後に、前記Ｃ末端は長い「Ｃ_2a」領域および短い「Ｃ_2b」領域に分割される。これらの領域についての詳しい解説は、ＢｒｏａｃｈらＷＯ９５／３００１２に見出され、これを参考文献として本明細書に援用する。前記Ｃ_1aおよびＣ_2a領域のアミノ酸配列は、異なるアイソフォーム間で共通に保存されている。一方、前記Ｎ末端、Ｃ末端、Ｃ_1b およびＣ_2b領域は、種々のアイソフォーム間で最も多様性を示す。配列および機能の類似性に基づいて、これらのアイソフォーム類はアデニル酸シクラーゼの６つの相異なるクラスに分かれる。Ｖ型はＶＩ型と同一のクラスであり、アイソフォーム間で最大レベルの多様性が見られる膜貫通領域でさえ配列の類似性を示す。Ｖ型は圧倒的に、心臓および脳組織で発現される。ＶＩ型はもうすこし広い分布を有するが、その主な発現もまた心臓および脳組織中である。ＶＩ型のようにＶ型は、Ｃ_2bを欠くが、他のアイソフォームより比較的長いＮ末端と、比較的短いＣ末端を有する。アデニル酸シクラーゼのアイソフォーム間で活性に多様性があることにより、さらにそれらの組織分布および広がりの差異によって、組織特異的なｃＡＭＰレベルの調節に貢献しているであろう。異なるアデニル酸シクラーゼ間での明瞭な構造上および生化学的性状の差異を利用して、アイソフォームに特異的な、または選択的なモジュレーター（調節因子）が発見されうると期待されている。これは、選択された組織における各アイソフォームの割合と分布についての知識と相俟って、組織特異的或いは組織選択的な薬剤のいずれかを開発できる手段を提供する。何故なら、アイソフォーム特異的なモジュレーターは、該アイソフォームの分布に関して組織特異性を有するであろうと期待されるからである。組織選択的な薬剤の開発の鍵となるのは、それぞれのアイソフォームの組織特異的分布および広がりに関わる情報を得ることである。現在までに得られているこの情報のほとんどは、ヒトの多くの組織でいくつかの選択されたｍＲＮＡ（例えば、Ｖ型）が測定されてきたにもかかわらず、ヒト以外の数種の動物種におけるアイソフォームｍＲＮＡレベルについてである。ヒト組織中のタンパク質アイソフォームの分布について情報を得ることは、ｍＲＮＡのデータとの比較により、すでに存在する標的の情報を強化しするか、或いは異なったアイソフォーム種へと目を向けさせることができるので、この領域での薬学的研究の重要な側面と見なされている。現在までに、遺伝子の全長がクローニングされているのは以下の３種のヒトアデニル酸シクラーゼみである。すなわち、ＩＩ型アデニル酸シクラーゼ(Strenge lら、Hum．Genet．90:126-130(1992))、ＶＩＩ型アデニル酸シクラーゼ(Nomura ら、DNA Research 1:27-35(1994))、およびＶＩＩＩ型アデニル酸シクラーゼ(De ferら、FEBS Letters 351:109-113(1994))である。Ｖ型は、イヌ心臓からクローニングされた(Ishikawaら、Jour．Biol．Chem.26 7(19):13553-13557(1992)，WO93/05061)。そのヒトアイソフォームは今日までクローニングされていない。発明の要約本発明の一側面は、図１（配列番号２）のアミノ酸配列を含む単離および精製されたヒトＶ型アデニル酸シクラーゼ（ｈＡＣ５）ポリペプチドである。本発明のもう一つの側面は、前記ｈＡＣ５ポリペプチドをコードする単離および精製された核酸である。本発明のさらにもう一つの側面は、図１（配列番号１）のヌクレオチド配列を含み、且つ生物活性ｈＡＣ５ポリペプチド、またはその断片をコードする単離および精製された核酸である。本発明のさらにもう一つの側面は、図１（配列番号１）のヌクレオチド配列を含み、可溶性の生物活性ｈＡＣ５ポリペプチド断片をコードする単離および精製された核酸である。本発明の別の側面は、下記の診断および治療の両方の用途を有する、ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼをコードするヒト遺伝子にも関する。本発明に包含されるのは、図１のアミノ酸配列を含むか、または図１のヌクレオチド配列と実質的なホモロジーを有する遺伝子によってコードされる、タンパク質またはペプチドと実質的なホモロジーを有するタンパク質またはポリペプチドであって、ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼと同様の特性を示すものである。本発明のさらにもう一つの側面は、図１（配列番号１）のヌクレオチド配列を有する核酸を発現ベクターに組み込むこと、該ベクターで宿主細胞を形質転換すること、そして該形質転換された宿主細胞を、遺伝子の発現を結果としてもたらす条件下で培養することを含む、ｈＡＣ５を生産する方法である。図面の簡単な説明図１（Ａ〜Ｈ）は、ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼのＤＮＡ（配列番号１）、および演繹されたアミノ酸配列（配列番号２）を示す。全コード配列に加えて５ ’側および３’側の非翻訳配列部分が示されている。全配列は、Ｔａｑポリメラーゼを用いたｄｉｄｅｏｘｙシークエンシング法により双方向に２回づつ決定した。発明の詳細な説明定義本発明の特定の実施の形態をさらに進んで記載する前に、いくつかの用語を定義する。本明細書中で「実質的に純粋」および「単離された」という用語は、天然の夾雑物または天然に付随する成分から分離されたタンパク質を表現するのに用いる。典型的には、モノマーのタンパク質は、試料の少なくとも約６０乃至７０％が単一のポリペプチド骨格を示すとき実質的に純粋である。一部の変異体または化学的修飾があっても、典型的には、ほぼ同一のポリペプチド配列を共有する。実質的に純粋なタンパク質は、典型的には、約８５乃至９０％以上のタンパク質試料を含み、好ましくは、少なくとも約９５％を含み、さらに好ましくは約９９％以上の純度である。純度は、典型的にはポリアクリルアミドゲル上で、染色によって決定した均質性をもって測定する。ある種の目的のためには、より高い精度が望まれ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または同様の精製手段を利用する。しかし、殆どの目的には、単なるクロマトグラフィー・カラム、またはポリアクリルアミドゲルが純度検定に用いられる。可溶性か、膜結合したかにかかわらず、本発明は、実質的に純粋な調製物を提供する。本明細書中の構造および機能の記載に部分的に基づき、生体物質からそれらを単離する様々な方法が考案される。さらに、化学的に合成された、またはそれが天然に由来する細胞と異なる細胞系で合成されたタンパク質は、実質的に純粋であろう。前記用語は、異種哺乳動物細胞、大腸菌等のバクテリア細胞、その他の原核細胞生物中で合成されたタンパク質および核酸を表現するのにも用いられる。本明細書中で用いる、「ハイブリダイゼーション」（ハイブリダイズする）および「特異性」（特異的な）の二つの用語は、ヌクレオチド配列に関して、互いに交換的に用いられる。２つのヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズしあう能力は、該２つの配列の相補性の度合いに依存し、これを言い換えれば、ヌクレオチド対合の符合（マッチ）する割合に依存する。一定の配列中で、別の配列に相補的なヌクレオチド数が多いほど、相互のハイブリダイゼーションの度合いが大きくなる。ハイブリダイゼーション度は、温度、溶媒比、塩濃度等を含む条件の厳格性（ストリンジェンシー）にも依存する。特に「選択的ハイブリダイゼーション」とは、本発明の１つのポリヌクレオチドの標的へのハイブリダイゼーション度が完全な、または、ほぼ完全な相補性を要求する条件を意味する。ハイブリダイゼーション培地中に存在する他の核酸に対しての結合に比較して、本発明のヌクレオチドが標的に特異的に結合することを保証するためには、前記相補性が充分に高くなければならない。選択的ハイブリダイゼーションにおいては、相補性は９０〜１００％であり、好ましくは９５〜１００％であり、より好ましくは１００％である。「ストリンジェントな条件」とは、（１）洗浄に低いイオン強度と高温、例えば、０．０１５ＭＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム（sodiumtitrat e）・０．１％ＮａＤｏｄＳＯ₄、５０℃、を採用する、或いは（２）ハイブリダイゼーションにフォルムアミドのような変性試薬、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含む５０％（容積比）フォルムアミド、４２℃、を採用する。別の例は、５０％フォルムアミド、５×０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５ｍＭクエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波破処理したサケ精子ＤＮＡ(５０ｍｇ／ｍｌ)、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、１０％硫酸デキストラン、４２℃、ウォッシュに４２℃、０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＣを使用することである。「単離された」核酸とは、核酸の原料から他のポリペプチドをコードする、混在する核酸と分離され、そして同定された核酸である。前記核酸は、診断アッセイに有用であると当該技術分野で知られ、また記載されているいずれかの標識を用いて、診断用およびプローブ用に標識されてもよい。好適な実施の形態本発明は、本明細書中で「ｈＡＣ５」と呼ばれる、ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼに関する。図１は、ｈＡＣ５ポリペプチドをコードするクローンのＤＮＡ配列とともに演繹されたアミノ酸配列を示す。本明細書中で用いる、「ｈＡＣ５ポリペプチド」または「ｈＡＣ５酵素」なる用語は、実施例１に記載されたクローンに含まれるヒトＶ型アデニル酸シクラーゼと共通の生物活性を有するすべてのアデニル酸シクラーゼを指す。この「共通の生物活性」とは、エフェクター機能または交差反応を示す抗原性を包含するが、これに限定されない。前述のように、Ｖ型アデニル酸シクラーゼは、ＶＩ型と同一のクラスであり、主に心臓および脳組織で発現される。Ｖ型アデニル酸シクラーゼは、他の知られているアイソフォームと同様の推定構造を有する。すなわち、６つの細胞外ドメイン、５つの細胞内ドメイン、４つ小ループと１つの細胞質大ループ、および細胞内のＮ末端およびＣ末端である。しかしながら、Ｖ型アデニル酸シクラーゼは、ＶＩ型のように、それはＣ_2b領域を欠くので、より大きいＮ末端および比較的短いＣ末端を有するという点で他のアデニル酸シクラーゼアイソフォーム類から区別されうる。他の哺乳動物アイソフォーム群（Ｉ〜ＩＶおよびＶＩ〜ＩＸ型）においては、膜関連の二次構造の多くはよく保存されている。ｈＡＣ５ポリペプチドの一部は、同様に保存されている。本発明の範囲は、図１（配列番号１）に示すｈＡＣ５ｃＤＮＡの正確な配列、またはその用途に限定されない。本発明は、前記配列に対する、当業者に周知であるような欠失、挿入、および置換を含むある種の改変を意図する。例えば、本発明は、図１のｃＤＮＡ配列の内、一つまたは複数のコドンを、天然型タンパク質におけるアミノ酸と化学的に同等であるアミノ酸をコードするコドンによって置換することを意図する。化学的同等性は、例えば、疎水性または親水性、電荷、サイズ、残基が環状であるか非環状であるか、芳香族か非芳香族か、などの一つまたは複数の特徴に基づいて決定される。従って、例えば、中性の極性アミノ酸をコードするコドンを他の中性の極性アミノ酸をコードするコドンで置き換えることができ、天然物と同等の生物活性を有する生産物を生産することがかなり期待できる。アミノ酸残基は、一般に４つのグループに大別されうる。酸性残基は、親水性であり生理的ｐＨにおいてＨ⁺を失うことにより負の電荷を持つ。塩基性残基もまた親水性であるが、生理的ｐＨにおいてＨ⁺と会合するため正の電荷を持つ。中性非極性残基は、疎水性であり生理的ｐＨにおいては荷電されていない。中性極性残基は、親水性であり生理的ｐＨにおいては荷電されていない。さらに、アミノ酸残基は、環状か非環状か、芳香族か非芳香族か、該残基の側鎖の置換基に関しての自明な分類、および分子の大小としても分類されうる。カルボキシル基の炭素を含めて、全炭素数４以下であれば、「小型」と見なされる。当然ながら、小型残基は、常に非芳香族である。天然に存在するアミノ酸のうち、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性である。アルギニンおよびリジンは、塩基性で非環状である。ヒスチジンは塩基性で環状である。グリシン、セリンおよびシステインは中性、極性であり、小型である。アラニンは中性、非極性であり、小型である。スレオニン、アスパラギンおよびグルタミンは中性、極性、大型で非芳香族である。チロシンは中性、極性、大型で芳香族である。バリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンは中性、非極性、大型で非芳香族である。フェニルアラニンおよびトリプトファンは、中性、非極性、大型で芳香族。プロリンは、事実上は中性、非極性であり、大型、環式で非芳香族であるが、ペプチド鎖二次コンフォメーションによる知られた効果のため特別なケースであり、したがって上記に定義されたグループには包含されない。遺伝子コードによってコードされない普通によく出くわすアミノ酸もある。以下は、一例として挙げるのであってこれらに限定されない。中性、非極性、小型のサルコシン、ベータ・アラニン、2,3-ジアミノプロピオン酸およびアルファ・アミノイソブチル酸；中性、非極性、大型で非芳香族であるｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、ノルロイシンおよびシクロヘキシルアラニン；塩基性で非環式のオルニチン；酸性のシステイン酸；中性、極性の大型で非芳香族であるシトルリン、アセチルリジン、およびメチオニンスルフオキシド；中性、非極性の大型で芳香族であるフェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チェニルアラニンおよび1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸。通常、本明細書でクレームされる前記ｈＡＣ５ポリペプチドは、図１に開示されたｈＡＣ５配列に対し全体で、少なくとも７５％のアミノ酸配列の同一性を有することが好ましく、少なくとも８０％の同一性を有することがより好ましく、少なくとも９０％の同一性を有することがさらに好ましく、少なくとも９５％の同一性を有することが最も好ましい。とりわけ本明細書でクレームされる前記ｈＡＣ５ポリペプチド、またはポリペプチド断片のＮ末端、Ｃ_1bおよびＣ_2b領域は、図１に開示されたｈＡＣ５配列に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性を有することが好ましく、そして少なくとも９５％の同一性を有することが最も好ましい。配列の「同一性」若しくは「ホモロジー」とは、前記ｈＡＣ５ポリペプチドの配列と同一である候補配列中での、配列同一性の一部として、いかなる保存的な置換も考慮に入れず、必要であれば欠失を導入し、％ホモロジー値が最大となるように両者を整列した上でのアミノ酸残基の比率として本明細書で定義される。ｈＡＣ５配列のＮ末端、Ｃ末端若しくは内部の伸張、欠損または挿入は、ホモロジーに影響を与えると解釈される。このように、本発明の主題であるクレームされたｈＡＣ５ポリペプチドは、次のものを包含する。すなわち、ｈＡＣ５アミノ酸配列を有する分子；図１のｈＡＣ５配列に由来する、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０若しくは４０アミノ酸残基の連続する配列を有する前記分子の断片であって、ｈＡＣ５ポリペプチドの特徴を示すもの；図１のｈＡＣ５配列のアミノ酸配列変異体、またはそれの上記に定義した断片であって、Ｎ末端側、Ｃ末端側またはその内部（平行化欠失（parallel deletion）を含む）に一つのアミノ酸残基を挿入したもの；図１のｈＡＣ５配列のアミノ酸配列変異体、またはそれの上記に定義した断片であって、少なくとも一つの残基で置換され、且つｈＡＣ５ポリペプチドの特徴を示すものである。特に、興味があるのは、ｈＡＣ５ポリペプチドがＩ〜ＩＶおよびＶＩ〜ＩＸ型から多様化している領域に一致するペプチドである。ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、次のものを包含する。すなわち、例えば、相同組換え、位置特異的突然変異誘発法、またはＰＣＲ突然変異誘発法による予め定めた変異を含むもの；ｈＡＣ５ポリペプチドの天然変異体；ｈＡＣ５ポリペプチド誘導体またはその断片であって、該ｈＡＣ５またはその断片について、置換、化学的、酵素的、または天然には存在しない基（例えば、酵素または放射性同位元素等の検出可能な基）を用いる他の適切な手段により共有結合で修飾されたもの；ｈＡＣ５の糖鎖付加変異体（適当なアミノ酸の欠失、挿入、若しくは置換による、任意の糖鎖付加部位の欠失または挿入）；ｈＡＣ５ポリペプチドまたはその断片の可溶化体である。さらに、本発明は、ｈＡＣ５ポリペプチドを、例えば診断法での使用のためにタグ（標識分子）することを含む。タグ化のタイプおよび方法は、当該技術分野において周知であり、例えば６つのヒスチジンタグを使用することである。Ｖ型アイソフォームのいくつかの領域は、他のアデニル酸シクラーゼアイソフォーム類と高度に保存されている。従って、例えば細胞外ドメイン、膜貫通領域、短い細胞内ドメイン等の高度に保存された領域について、欠失、挿入、とりわけ置換を含む配列変更のほとんどは、他のアイソフォームに同様の変化を加えたものとは異なって、ｈＡＣ５ポリペプチドの特性に根本的な変化をもたらすことは期待できないと考えられる。しかしながら、変更を加えるに先立って前記の配列変更の正確な影響を予測するのが難しいとき、いかなる配列変更の影響も通常のスクリーニングアッセイによって評価されるであろうということを当業者は理解している。本発明のペプチド化合物を記載するのに用いる命名法は、Ｎ末端アミノ基がペプチド中の各アミノ酸残基の左側で、カルボキシル基が右側であるとする従来の慣行に従う。本発明の選らばれた特定の実施の形態を表す化学式において、前記Ｎ末端基およびカルボキシ末端基は、しばしば特にそう示されないけれども、特記されなければ生理的ｐＨ値でとるであろう形態にあると理解される。従って、特定の実施例または一般式のいずれでも、必ずしも特記されたり、明示されてはいないが、生理的ｐＨにおいてＮ末端Ｈ⁺ ₂およびＣ末端Ｏ^-が存在すると理解される。アミノ酸残基の側鎖上にある遊離の官能基も、アミド化、アシル化若しくは他の置換によって修飾されうる。これによって例えば、活性に影響を及ぼすことなく化合物の溶解性を変化させることができる。アミノ酸がＣ末端を形成するとき、本発明の化合物のすべては、薬学的に許容される塩類またはエステル類の形態である。前記塩類は、例えばＮａ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ⁺²、Ｍｇ⁺²等であり、前記エステル類は、一般的に炭素１〜６を有するアルコールのエステルである。本発明のペプチドのすべてにおいて、一つ若しくは複数のアミド結合（−ＣＯ −ＮＨ）は、例えば、−ＣＨ₂ＮＨ-、−ＣＨ₂Ｓ−、−ＣＨ₂ＣＨ₂、−ＣＨ＝ＣＨ−(シスおよびトランス)、−ＣＯＣＨ₂−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ ＳＯ−等の同配体（isostere）である別の結合で、随意に置換されてよい。この置換は、当該技術分野で公知の方法によって行いうる。下記の文献は、これらの代替結合基を含むペプチド類似体の製法を説明している。Spatola，Vega Data 1 (3)“Peptide Backbone Modifications”(一般的総説)(1983年３月)；Spatola“ Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins,”B.Wein stein編,Marcel Dekker,NewYork，p.267(1983)(一般的総説);Morley，J.S.,Tren ds Pharm Sci，pp.463-468(一般的総説)(1980)；Hudsonら、Int J PeptProt Res 14:177-185(-CH₂NH-,-CH₂CH₂-)(1979);Spatolaら、Life Sci 38:1243-1249(-CH₂ -S)(1986)；Hannm J Chem Soc Perkin Trans I 307-314(-CH-CH-,シスおよびトランス)(1982)；Almquistら、J Med Chem 23:1392-1398(-COCH₂)(1980);Jenning s-Whiteら、Tetrahedron Lett 23:2533(-COCH₂−)(1982);Szelkeら、欧州特許EP 45665(1982)CA:97:39405(1982)(-CH(OH)CH₂-);Holladayら、Tetrahedron Lett 4 :4401-4404(-C(OH)CH₂-)(1983)；およびHruby，Life Sci 31:189-199(-CH₂-S−) (1982)。ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼペプチドは、当該技術分野で周知であるような古典的な蛋白質化学の手法を用いて精製することができる。例えば、レクチンアフィニティー・クロマトグラフィー工程に、続いて、配位子のシステイン残基を介してビオチンに結合（コンジュゲート）されている配位子を利用する高度に特異的なリガンドクロマトグラフィー操作を用いてもよい。別法として、前記６つのヒスチジンでタグされたｈＡＣ５ポリペプチドを、ニッケルカラムクロマトグラフィーを用いて精製してもよい。本の一つの実施の形態は、ｈＡＣ５ポリペプチドの生産に関連した組換え材料に関する。ｈＡ５を生産する一つの方法は、図１（配列番号１）のヌクレオチド配列を有する核酸を発現ベクターに組み込むこと、前記ベクターで宿主細胞を形質転換すること、そして該形質転換された宿主細胞を、遺伝子の発現を結果としてもたらす条件下で培養することからなる。適当な発現ベクターは、ｐｃ３ｈＡＣ６を含む。宿主細胞の例として、バクテリア、ウイルス、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞株が挙げられる。好適な宿主細胞は「ＨＥＫ-２９３」と呼ばれるヒト胎児細胞株である。また、本発明は、その表面にｈＡＣ５を提示するか、または発現するように培養することができるトランスフエタト細胞を用いることも意図する。かくして、以下に記載されるように、本発明は、これらの細胞、または重要なｈＡＣ５の断片をスクリーニング手段に用いてインビホで各種の候補化合物をｈＡＣ５活性についてその効果を評価する、天然型ｈＡＣ５と化合物の相互作用のためのアッセイ系を提供する。本発明の別の実施の形態は、可溶性ｈＡＣ５断片の生産に関連した組換え材料に関する。これらは、ｈＡＣ５ポリペプチドの活性部分、特に前記Ｃ１およびＣ２（Ｃ末端）細胞内ループを発現するように培養することができる、例えば大脳菌等のトランスフェクト細胞を含む。これらの可溶性断片を精製し、そして再構成して酵素活性をうることができる。このことは他のアイソフォームからの類似のドメインを用いて実証された。Whisnantら、Proc．Natl．Acad .Sci.:93:6621-6625(1996)を参照。このような可溶性断片は、スクリーニング手段として用い、各種の候補化合物のｈＡＣ５活性についての効果を評価することができる。トランスフェクション用の適当な細胞としてＳｆ−９細胞、酵母細胞およびほとんどの哺乳動物細胞が挙げられる。ｈＡＣ５ポリペプチドの組換え生産は、図１に記載のｈＡＣ５をコードするヌクレオチド配列またはその縮退類似体を用いることを含む。下記のように、天然型配列を回収するか、或いは既知の天然型配列のかなりの部分をプローブに用いることによって、核酸を調製することができる。代替的に、当該技術分野で周知の手順を用いて新規合成することができる。前記核酸は、所望の宿主に適した発現ベクターに連結され、その後適合性のある細胞に形質転換で導入される。バクテリア細胞の形質転換に使用するのに適したベクターは、当該技術分野において周知である。プラスミドおよび例えば、ラムダファージ等のバクテリオファージが大腸菌等のバタテリア宿主用のベクターとして一般的に用いられている。ウィルスベクターは、外部性ＤＮＡの発現用に哺乳動物および昆虫細胞中で使用するのに適している。哺乳動物細胞はＳＶ４０またはポリオーマウィルスで容易に形質転換される。培養液中の昆虫細胞は、バキュロウィルス発現ベクターで形質転換されうる。適当な酵母ベクター系として酵母セントロメアプラスミド、酵母エピソマルプラスミドおよび酵母インテグレーティング（integrating)プラスミドが挙げられる。別法として、当該技術分野において周知であるような手法を用いて核酸を宿主細胞に直接導入してもよい。細胞は、ｈＡＣ５ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に好ましい条件下で培養され、その後ｈＡＣ５を表面に提示する細胞が集菌される。適当な真核宿主細胞として、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、および昆虫細胞が挙げられる。適当な原核宿主細胞として、例えば、大腸菌および枯草菌等のバクテリア細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、ラット−２繊維芽細胞株、ヒト胎児腎２９３細胞株、およびＳｆ−９等の昆虫細胞系が挙げられる。本発明は、１つのｈＡＣ５ポリペプチドをコードするか、またはそれに相補的である核酸にも関する。これらの核酸を用いて、診断用または潜在的な治療用に、組換え細胞培養物中で前記ポリペプチドを生産することができる。さらに別の側面では、本発明は、標識された若しくは標識されていない、ｈＡＣ５をコードする単離された核酸分子、或いはｈＡＣ５をコードする核酸配列に相補的であるかまたはストリンジェントな条件下ハイブリダイズする核酸配列を提供する。本発明の単離された核酸分子は、他の既知のアデニル酸シクラーゼアイソフォームをコードする核酸配列、またはそれに相補的である核酸配列を除外する。本発明は、次のものを提供する。すなわち、ベクターによって形質転換された宿主に認識される制御配列に働くように結合された、ｈＡＣ５をコードする核酸を含む複製可能なベクター；前記ベクターで形質転換された宿主細胞；細胞表面に、または可溶性断片としてｈＡＣ５の生産を実行するためにｈＡＣ５をコードする核酸分子を使用する方法であって、形質転換された宿主細胞の培養物中で該核酸分子を発現し、そして該細胞から回収することを含む方法である。前記核酸配列は、ｈＡＣ５をコードする核酸分子用のハイブリダイゼーションアッセイにも有用である。本発明のさらに別の実施の形態に従えば、次の方法が記載される。すなわち、ｈＡＣ５をコードする核酸配列を含む細胞のＤＮＡに、転写調節因子（例えば、エンハンサー、またはサイレンサー）を、該ｈＡＣ５をコードする核酸配列にその転写に影響を与えるのに充分に近接し、そして方向性を持って挿入することからなり、加えて随意に前記転写調節因子およびｈＡＣ５をコードする核酸配列を含む細胞を培養することからなる工程を有する、ｈＡＣ５を生産する方法である。また、本発明は、次のものを包含する。すなわち、ｈＡＣ５ポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞；前記コード配列にその転写に影響を与えるのに充分に近接し、そして方向性を持った外部性転写調節因子；それによって認識される制御配列に働くように結合された、ｈＡＣ５をコードする核酸配列を含む宿主細胞である。また、本発明はｈＡＣ５ポリペプチドをコードする核酸分子の転写が増強されたか、或いは減少された細胞をうる方法であって、該核酸分子を含む細胞を提供すること；前記細胞に転写調節因子を導入すること；そして前記細胞を、前記核酸分子の転写が増強されているか、或いは減少されている細胞を求めてスクリーニングすることを含む方法を提供する。本発明で使用されるヒトＶ型アデニル酸シクラーゼ核酸は、次のようにして製造できる。ｈＡＣ５ポリペプチドをコードするか、ｈＡＣ５ポリペプチドをコードする核酸配列に相補的であるか、そのような核酸にハイブリダイズしてストリンジェントな条件下、安定して結合されたままでいるか、図１に示す演繹されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％配列同一性、より好ましくは８５％配列同一性を共有するポリペプチドをコードするかのいずれかであるＲＮＡ、またはＤＮＡをｈＡＣ５「核酸」と定義する。それは、典型的には少なくとも約１０ヌクレオチドの長さであり、そして好ましくはｈＡＣ５に関係ある生物学的または免疫学的活性を有する。特に意図するのは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンス分子であり、また同様に天然源に由来するか或いは合成されたかにかかわらず代替的な骨格に基づくか、または代替的な塩基を含む核酸である。特に興味あるのは、その天然型のシグナル配列を含むか、必ずしも含まない全長の分子をコードする１つのｈＡＣ５核酸である。本明細書で初めて開示された、前記演繹されたアミノ酸配列を用いて選ばれたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし、そして必要ならばその５’コード末端で完全であるＤＮＡを確保するために従来のプライマー伸張操作を用いることによって全長タンパク質をコードする核酸が得られる。このようなクローンは、元来の配列のリーディングフレーム中の開始コドンの存在によって容易に特定される。ｈＡＣ５ポリペプチドのアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、下記のように、または当該技術分野で公知の様々な方法で製造される。これらの方法は、次のものを含むがそれらに限定されない。すなわち、天然源からの単離（天然アミノ酸配列の変異体の場合）、或いはオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異法、ＰＣＲ突然変異法、および前に調製した変異体またはｈＡＣ５の非変異体版のカセット突然変異法によっての製造である。核酸類を単離および処理操作する手法は、例えば次の文献に開示されている。すなわち、米国特許５０３０５７６号、米国特許５０３０５７６号、および国際公開ＷＯ９４／１１５０４およびＷＯ９３／０３１６２である。また、Sambrook ら、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",第２版,Cold Spring Harbor Pr ess,Cold Spring Harbor，NY，1989およびAusubelら"Current Protocols in Mol ecular Biology"，第２巻，Wiley-Interscience，New York，1987を参照。ｈＡＣ５ポリペプチドの単離、組換え生産法および特性決定によってｈＡＣ５を用いるアッセイ系の設計が可能になる。ｈＡＣ５をその表面に提供する単離細胞が入手可能になり、宿主細胞の表面に該酵素を提示し発現を可能とする、ｈＡＣ５をコードする組換えＤＮＡが入手可能になると、ｈＡＣ５の活性に影響を及ぼす候補薬剤（アゴニスト−作動薬およびアンタゴニスト−拮抗薬の両方）の能力を評価する貴重な手段としてこれらの細胞が利用可能になる。このように、本発明は、候補薬剤のアゴニストおよびアンタゴニストとしての活性をスクリーニングするために単離または遺伝子組換えで生産されたｈＡＣ５を利用するアッセイ系に関する。このアッセイは、特にこれらの候補治療剤がｈＡＣ５に対して所望の効果を有することを確認するのに有用である。これらの性状の判定は、他のアデニル酸シクラーゼアイソフォームに対する薬剤の特異性を評価するのに必須である。前記宿主細胞は、典型的には動物細胞、さらに典型的には哺乳動物細胞である。前記アッセイで有用であるためには、該細胞はｈＡＣ５が細胞表面に提示されるか、または可溶性の断片として発現されることを可能にする細胞内メカニズムをもたなければならない。（１）細胞表面にｈＡＣ５の提示を作り、候補薬剤が酵素に結合するか、またはさもなければ酵素の活性に影響を及ぼすかを評価するアッセイに直接、該細胞を使用できるようにするか、或いは（２）精製し、そして再構成してスクリーニングアッセイに有用な酵素的に活性な化合物をうることができる可溶性断片としてｈＡＣ５を生産するかのいずれかするために、ｈＡＣ５ポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡを発現する動物宿主細胞を培養してコードする核酸の発現を実行する。ｈＡＣ５活性に影響を及ぼす化合物を同定するのにいくつかの可能な戦略がある。ｈＡＣ５ｃＤＮＡの過剰発現は、安定した細胞株から多量の膜粗調製物を単離する手段を提供することができる。ＨＥＫ−２９３細胞がこの目的のために特に有用であることが見出されている。この系では測定可能な酵素活性は、圧倒的に組換えｈＡＣ５の発現からであろう。生成物（ｃＡＭＰ）の形成を測るための９６ウエルのシンチレーション近接型アッセイで酵素活性を検出する高感度、再現性よい、高スループットのスクリーニング系が望ましい。利用できる多数のスクリーニングアッセイがある。例えば、ｈＡＣ５の基底（刺激されていない）活性は、ｈＡＣ５酵素のアゴニストとアンタゴニストの両方を検出する方法として測定することができる。さらに、最も関連ある生理学的な活性化因子であるヘテロ３量体Ｇ蛋白サブユニット（Ｇ_as）による前記酵素の刺激は、活性化した（ＧＴＰｇＳ結合）組換えウシＧ_as（バクテリアから発現され精製された）を用いて、ｈＡＣ５ポリペプチドのＧ_as刺激を阻害する他の化合物が同定されるかもしれないという期待のもとにアッセイできる。フォルスコリンまたはフォルスコリン類似体等のその他の刺激因子も用いることができる。「ヒット」すなわち、これらのスクリーニングのいずれかでｈＡＣ５に影響を及ぼす化合物は、標的アイソフォームに関連する化合物に焦点をあてるのを助けるために他のアッセイにおいてさらに評価されことになる。潜在的治療剤としての候補化合物を評価する別の方法は、典型的には結合アッセイのようなスクリーニングを基本とするアプローチを含み、そこで該候補化合物（例えば、ペプチドまたは小さい有機化合物）がｈＡＣ５酵素の触媒サブユニットに結合するかどうか、或いはどの程度結合するか測定するために試験される。好ましくは、組換えｈＡＣ５を発現する哺乳動物細胞株またはその形質膜調製物が前記アッセイで用いられることになる。例えば、候補アンタゴニストは、ｈＡＣ５への結合に関して標識されたアゴニストまたはアンタゴニストのいずれか、例えば標識フォルスコリンまたは標識フォルスコリン類似体と競合する。候補化合物の濃度を変化させて、一定濃度の標識アゴニストまたはアンタゴニストとともに供給する。それから確立された手法を用いて標識物質の結合の阻害を測定することができる。この測定は、さらに関連付けられｈＡＣ５に結合する候補化合物の量および力価を決定する。ｈＡＣ５活性に影響を及ぼす化合物を同定する別の方法は、ｈＡＣ５酵素上の２つの特徴ある部位のいずれか一方を標的とした、ヌクレオチド骨格に基づく合成化合物のラショナルデザインである。これらのうちの１つが活性部位（ＡＴＰが基質であり、ｃＡＭＰが生成物である）であり、そして他の１つが別のＰ部位である。純粋な或いは粗酵素調製物のいずれとでもアデニンヌクレオシド−３’ −ポリフォスフェートが最大の阻害活性を示すことが報告されている。関連するアプローチとして、アイソフォーム特異的効果を示すフォルスコリン類似体の設計を試みることができるであろう。さらに、上記のアッセイを用いて候補薬剤のｈＡＣ５活性を促進するか、または阻害する能力を直接試験できる。一旦リード候補化合物が同定されと、アイソフォーム特異性が小分子モジュレーターで達成されることを実証する目的で、ほとんどの、そして好ましくはすべてのヒト・アデニル酸シクラーゼアイソフォームをモニターするアッセイ系を開発するのが望ましい。これらのアッセイを用いて存在するか（例えば、フォルスコリン類似体またはＰ部位阻害剤）、或いは新たに発見された小分子モジュレーターを評価し、そして異なるアデニル酸シクラーゼアイソフォームについて構造活性相関（ＳＡＲ）を決定する。また、このようなアッセイは、他のアデニル酸標的の特異的または選択的モジュレーターを評価するのにも用いることができ、そして全細胞アッセイを使用すれば、リード候補化合物のバイオアベイラビリティを設計し、そして生物活性を問題にするのに有用な洞察を提供する。また、ｈＡＣ５は、組織検体中の前記ｈＡＣ５酵素の異常発現を検出することによる疾病および疾患の診断用のアッセイで用途がある。本発明の別の側面は、ｈＡＣ５の天然に存在する形態を模倣するｈＡＣ５アゴニストに関する。これらのアゴニストは、前記アッセイ系の実行可能性を立証するために上記アッセイにおいて対照試薬として有用である。さらに、ｈＡＣ５のアゴニストは、インビホで疾病を治療するのに有用な効果を示す。本発明の別の側面は、ｈＡＣ５ポリペプチドの改変された形態であるｈＡＣ５アンタゴニストに関する。このようなアンタゴニストは、ｈＡＣ５に結合し、そして酵素―基質相互作用を、それらのｈＡＣ５への結合をブロックすることにより阻害する。本発明の範囲内にある別グループの化合物は、ｈＡＣ５基質のアンタゴニストである。すなわち、これらは基質阻害剤である。これら両タイプのアンタゴニストは、ともにｃＡＭＰ生成のような酵素―基質相互作用に基づく事象を減少させるか、または仲介するのに有用性がある。さらに別の第２のグループのアンタゴニストは、ｈＡＣ５の特定の部分に結合するように設計された抗体を含む。ポリクロナール抗体も本発明によって意図されるけれども、一般的に、これらはｈＡＣ５のある所望の領域に高度に特異的なモノクロナール抗体の調製物である。以下、さらに詳しく説明されるが、前記抗体はｈＡＣ５酵素のイムノアッセイにおいて、例えば遺伝子組換え系で遺伝子がうまく発現するか評価するのに有用でもある。前記アゴニストおよびアンタゴニストの両方において、好ましい実施の形態は、ｈＡＣ５遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有するクラスの化合物である。また、本発明は１、２、３またはそれ以上のアミノ酸残基が遺伝的にコードされないものによって置換されている化合物を包含する。また、本発明に包含されるのは、これら特定のペプチドをコードする単離されたＤＮＡ分子である。酵素の細胞外ドメインが細胞外活動、例えば酵素調節に鍵となる役割を果たすと考えられている。従って、その配列が図１アミノ酸配列および図４のヒドロパシー分析から近似されうる前記ｈＡＣ５の細胞外ドメインに、全体または一部が対応するアミノ酸配列を有するアゴニストおよびアンタゴニストを本発明は包含する。ｈＡＣ５のＮ末端、またはＣ末端、またはその配列が図１のアミノ酸配列および前記ヒドロパシー分析から近似されうるｈＡＣ５の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の１つに、結合することによって前記酵素の機能に影響を及ぼすアゴニストおよびアンタゴニストをも本発明は包含する。他のアデニル酸シクラーゼ類において、前記ＴＣＤＩＶおよびカルボキシ末端領域は、酵素活性、或いはＧ_αまたはフォルスコリン相互作用で役割を果たすことが示されている。例えば、Whisnantら、前出を参照。従って、ｈＡＣ５のＩＣＤＩＶおよびカルボキシ末端領域のアミノ酸配列の全体または一部は、前記酵素に結合し、酵素活性またはＧ_as相互作用を阻害できる抗体或いはペプチドを設計するのに特に有用であろうと期待される。アデニル酸シクラーゼ類およびアイソフォーム活性に影響を及ぼすその因子の理解が増すにつれて、ラショナルな医薬品設計が薬学研究の実行可能な代替法になりつつある。アデニル酸シクラーゼの２つの保存された細胞内ドメイン（前記Ｃ₁およびＣ₂ドメイン）が会合し活性な酵素を形成すると考えられている。これは発現された組換えＣ₁およびＣ₂ドメインの両方を組合せた研究で実証された。Ｃ₁およびＣ₂ドメインのいずれか単独では実質的な活性を持たないので、両方が酵素活性を再構成するのに必要である。フォルスコリンとＧ_asをたすと、前記２つのドメインの会合を増加させることによって、前記系を刺激する。２つの別々のドメインの会合に依存する酵素活性をモニターするアッセイを設計することによって、アンタゴニストに対してより高い感度が付与されることが期待される。何故なら、多分より容易に乱されるであろうからである。他の研究によって、前記細胞内ドメインの保存された領域からの配列からなるペプチドは、洗浄性の可溶化酵素調製物の阻害剤として作用することが実証されている。本発明は、活性に関与するかもしれないモジュレーターの領域の範囲を定めるために小分子阻害剤の設計に導くペプチドウオーキング（配列彷徨）戦略を用いることを意図する。最後に、特性決定されていない、生理学的アデニル酸シクラーゼ、特にアイソフォーム特異性を示すものについての知識は、新規ＡＣモジユレーターの同定用の新しいアッセイを提供する。これらモジュレーターの多くはタンパク質であり、そしてそのあるものは、酵母の２ハイブリッド系で「餌」としてアデニル酸シクラーゼ配列を用いながら同定できるかもしれないと期待される。別法として、アデニル酸シクラーゼ抗体に捕まるとアデニル酸シクラーゼと共沈殿するタンパク質を同定できる。本発明のペプチドアゴニストおよびアンタゴニストは、好ましくは長さ約１０〜１００アミノ酸であり、さらに好ましくは長さ２５〜７５アミノ酸である。これらのペプチドは、当該技術分野で周知の標準的な固相または液相ペプチド合成を用いて容易に調製することができる。さらに、前記ペプチドをコードするＤＮＡは、商業的に入手可能なオリゴヌクレオチド合成機器を用いて合成することができ、そして標準的な組換え生産系を用いて遺伝子操作的に製造される。前記ペプチドに遺伝子でコードされないアミノ酸が含まれることになるとき、固相ペプチド合成を用いる製造が必要である。本発明の別の側面は、診断および治療の双方の用途を持つ抗体に属する。抗体はｈＡＣ５ポリペプチドの特定の領域に結合することにより、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる。これらの抗体は、また、例えば遺伝子の発現を測定するイムノアッセイ等、ｈＡＣ５の存在量を検出するイムノアッセイでの用途も考えられる。一般に、アデニル酸シクラーゼに対する抗体、また、さらに重要である、アデニル酸シクラーゼの特定のアイソフォームを認識しうる抗体は、アデニル酸シクラーゼ蛋白の組織分布および広がりを評価するための有用な手段である。アデニル酸シクラーゼアイソフォーム間の相違点である領域およびこれらの領域の抗原としての可能性を同定することにより、免疫処置に利用するために、これらの配列に対する合成ペプチド或いは組換えタンパク質を創造することが可能である。得られる抗体群は、前記免疫原のユニークな性質および他の発現されたアイソフォームとの反応性に基づく特異性について特性決定されることになろう。種々の組織中のアイソフォーム蛋白の検出は、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット法により容易にモニターすることができる。しかしながら、免疫組織化学分析もまた有用であろう。この情報は、興味あるアデニル酸シタラーゼ標的を特定するのに有用であり、例えば、心臓血管系の疾病、喘息、肥満症における標的等対する有用な治療戦略について貴重な洞察を提供する。本発明の抗体は、当該技術分野で周知である手法によって調製することができる。該抗体はモノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよいが、ｈＡＣ５に対して高度に特異的であり、そしてｈＡＣ５ポリペプチドの全体またはその一部領域に対しこしらえることができるモノクローナル抗体であることが好ましい。抗体は、ポリペプチドが十分な長さを持つ場合は、ペプチドのハプテン（免疫原）単体を、或いは、所望ならばまたは必要に応じて、免疫原性を増強するために適当なキャリアに結合させて、適合する哺乳類宿主（典型的にはウサキ、ラット、マウス、ヤギ、ヒト等）に適切な免疫化プロトコルに則り免疫処置することにより調製される。典型的には、免疫原はｈＡＣ５ポリペプチドのうち抗体の標的となるべく意図する一部分を含む。重要な領域は、ｈＡＣ５酵素の細胞外ドメインに相当する領域、任意のタンパク分解切断領域、および活性化に必須である細胞外ドメインセグメントのうちの任意のものを含む。例えば、ウシ血清アルブミン、スカシガイ・ヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリア、またはその他のキャリア・タンパク質との免疫原抱合体（コンジュゲート）を調製する方法は、当該技術分野で周知である。ある場合には、例えばカルボジイミド試薬を用いる直接コンジュゲーションが効果的であるが、他の場合には、ハプテンへの接近性を提供するためにＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌｄ社(イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ)によって供給されるもの等、結合試薬を用いることが望ましい。ハプテンは、例えば、キャリアへの結合を容易にするためにシステイン残基でＮ末端またはＣ末端を延長するか、或いはシステイン残基をさしいれることができる。所望の免疫原を宿主に、適当な期間にわたり適当なアジュバントを用いて注射により投与し、続いて、血清を採取する。免疫処置の期間中、抗体価を測定し、抗体形成の適否を判定する。ポリクローナル抗体は、多くの診断および研究目的に適しており、そして容易に調製される。モノクローナル抗体が治療用途にはしばしば好まれ、そして維持したハイブリッド細胞系でさらに分泌されたタンパク質を回収することにより調製される。一般に知られているように、Kohle，Milstein Nature 256:495-497(1 975)に記載された方法またはその改変法によってリンパ球または牌臓細胞を不死化し、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株を作成できる。その後、抗原が感作免疫原またはｈＡＣ５をその表面に発現する細胞であるイムノアッセイ法で不死化細胞株をスクリーニングする。所望の抗体を分泌することが確認された細胞は、インビトロまで培養するか、または腹水中で生産することが可能である。抗体は、それから培養上清または腹水液の上清から回収する。別法として、抗体を組換え技術によって調製することができる。すなわち、天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を最小限コードするヌクレオチド配列またはその変異体版のクローニングおよび発現である。ｈＡＣ５の所望の領域に特異的に結合する抗体の領域は、複数の種に由来する領域を有するキメラ体として生産することもできる。抗体は完全なイムノブロブリンまたはその断片を含んでいてもよいし、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭ等の種々のクラスおよびアイソタイプを含む。断片とは、Ｆａｂ。ＦＶ、Ｆ(ａｂ’)₂、Ｆａｂ’その他を含む。自然本来の抗体と同様、免疫学的に有意な部分を含む前記モノクローナル断片または前記ポリクローナル抗血清は、アンタゴニストとして使用できる。Fab、Fab'、F(ab')₂断片等の免疫学的に活性な断片を使用することは、これらの断片がイムノグロブリン全体とは異なる免疫原性を有し、且つ、イムノグロブリンの定常ドメインから生じる生物活性を帯びていないため、特に治療目的の用途において、好ましいことがある。このようにして生産された抗体は、単にｈＡＣ５ポリペプチドに対しての潜在的アゴニストまたはアンタゴニストとして、本発明のアッセイにおいてアゴニストまたはアンタゴニストとしての役割を果たす意味で有用であるばかりでなく、ｈＡＣ５酵素を検出するイムノアッセイにも有用である。このようにして、これらの抗体は、イメージング試薬とカップリング反応させて被検者に投与することができ、対象とする組織におけるｈＡＣ５の発現が過少であるか過剰であるかを確かめるために局在する抗体の検出を可能にする。さらに、これらの試薬はインビトロで、例えば組換え宿主細胞表面上でのｈＡＣ５の生産が好結果であることを検出するのに有用である。本発明のさらに別の側面は、本発明の化合物および抗体を含む薬学的組成物に関する。本発明のアゴニストおよびアンタゴニストは、次の分野で治療的用途を有する。すなわち、（１）例えば、副腎、心臓または脳に通常、見出されるが、組織中のｈＡＣ５酵素の異所性活性に起因する疾病を治療すること、（２）症状がｈＡＣ５の活性を促進するか、或いは阻害することによって改善されうる疾病を治療することである。本発明のペプチドアゴニストおよびアンタゴニストは、当該技術分野で周知であるような全身投与用の従来の製剤で投与することができる。典型的な製剤は、例えば、Remington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Co.,Easton PA ,最新版で見つかるであろう。全身投与の好ましい形態は、典型的には静脈経由による注射を含む。皮下、筋肉、または腹腔内等の他の注射経路もまた使用することができる。ごく最近、ペプチドの全身投与用の別の手段が考案され、それは胆汁酸塩、フシジン酸または他の洗剤等の透過剤を用いる経粘膜投与および経皮投与を含む。さらに、腸溶製剤またはカプセル化製剤に適切に配合されると、経口投与もまた可能である。また、これらの化合物の投与は、軟膏、泥膏、ゲル等の形状で局所そして／または局在化投与であってよい。要求される用量の範囲は、ペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、患者の状態および担当医の判断による。しかしながら、適当な用量の範囲は患者の体重あたり０．１〜１００μｇ／ｋｇの範囲である。しかし、使用可能なペプチドの種類および各種投与経路の異なる効率を考慮して、必要な用量における広範囲な変化が予期されるべきである。例えば、経口投与は、静脈注射による投与より高い用量が必要であると予期されるであろう。これらの用量レベルでの変化は、当該技術分野でよく理解されているように、最適化のための標準の経験的な作業を用いて調整できる。また、本発明はｈＡＣ５をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子の翻訳の転写に干渉することによりｈＡＣ５の発現をブロックするか、または調節するための各種の手法を治療、予防および研究に使用することにも関する。これは、細胞中でｈＡＣ５の発現を阻害若しくは制御する方法であって、ｈＡＣ５をコードするＤＮＡに対して、またはｈＡＣ５をコードするＤＮＡの発現を制御するＤＮＡに対してアンチセンスである、或いはそれらと３本鎖ヘリックスを形成するオリゴヌクレオチドを、ｈＡＣ５の発現を阻害若しくは制御するのに充分な量で前記細胞に提供し、それによって該発現を阻害若しくは制御することからなる方法を含む。次の方法もまたこれに含まれている。被検者中でｈＡＣ５の発現を阻害若しくは制御する方法であって、ｈＡＣ５をコードするＤＮＡに対して、またはｈＡＣ５をコードするＤＮＡの発現を制御するＤＮＡに対してアンチセンスである、或いはそれらと３本鎖ヘリックスを形成するオリゴヌクレオチドを、ｈＡＣ５の発現を阻害若しくは制御するのに充分な量で前記被検者に投与し、それによって該発現を阻害若しくは制御することからなる方法である。上記の方法でのアンチセンス分子または３本鎖ヘリックス形成分子は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。以下、これらの用途をさらに詳しく説明する。細胞におけるアンチセンスＲＮＡの構造的発現は、哺乳動物および植物で約２０の異なる遺伝子の発現を阻害することが示されてきた。そのリストは引き続き増加している。Hamborら、J．Exp．Med．168:1237-1245(1988);Holtら、Proc．N atl．Acad．Sci．83:4794-4798(1986);Izantら、Cell 36:1007-1015(1984);Izan tら、Science 229:345-352(1985)およびDe Benedettiら、Proc．Natl．Acad．Sc i．84:658-662(1987)。アンチセンス効果の可能な機構は、翻訳の阻害またはスプライシングの防止であり、それらの両方ともインビトロで観察されてきた。スプライシングの干渉はイントロン配列の使用を可能にする(Hunroe，EMBO．Ｊ．７:2523-2532(1988))。該配列はより少なく保存されているはずであり、その為１つの種のタンパク質の発現を阻害するが、別の種においてその同族体を阻害しない、より高度の特異性を結果としてもたらす。治療的遺伝子の制御は「アンチセンス」アプローチを用いて達成されるが、そこで細胞または生物体中の標的遺伝子の機能が、好ましくはオリゴヌクレオチドであり、該特定の標的遺伝子の発現を阻害するために特異的に作用するアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡのトランスフェクションによってブロックされる。前記アンチセンスＲＮＡの配列は、それが阻害しようともくろむ前記遺伝子またはｍＲＮＡのセグメントに実質的に相補性がある、完全なまたは好ましくは部分アンチセンスＲＮＡ転写体となるように設計されている。その作用がスプライシング、転写、または翻訳のどのレベルにあるかにかかわらず、アンチセンスＲＮＡが前記標的遺伝子（またはｍＲＮＡ）にハイブリダイズでき、そして該標的遺伝子の機能を阻害できるように相補性は充分でなければならない。過剰な実験をすることなく当業者によって容易に識別可能であるが、阻害の程度は、阻害するのに、或いは前記細胞を、標的遺伝子を発現不可能にするほど充分でなくてはならない。アンチセンスアプローチが特定の遺伝子発現をブロックするのに採用されうるいくつかの知られた機構の１つにすぎないことを当業者は認識するであろう。「アンチセンス」という用語は、ＲＮＡ配列と同様にそれをコードするＤＮＡ配列を意図する。前記ＲＮＡ配列は、該アンチセンスＲＮＡが、ｍＲＮＡの翻訳が阻害されるようにアンチセンスＲＮＡと該ｍＲＮＡとの間に分子ハイブリダイゼーションを起こすためにそれに対して特異的である特定のｍＲＮＡ分子に充分に相補性がある。このようなハイブリダイゼーションは、インビボ条件下、すなわち細胞の内部でおこらねばならない。アンチセンスＲＮＡの作用は、細胞中で遺伝子発現の特異的な阻害を結果としてもたらす。Alberら、“Molecular Biolo gy OF The Cell”，第２編，Garland Publishing，Inc.，New York，NY(1989)、特に195〜196頁を参照。本発明のアンチセンスＲＮＡは、コード配列、３’若しくは５’非翻訳領域、またはその他のイントロン配列を含む、標的ｍＲＮＡのいくつかの部分のどこにハイブリダイゼーション可能であってよい。好ましいアンチセンスＲＮＡは、ｈｍＲＮＡに相補的であるものである。当業者にとって容易に認識できるように、本発明で要求されるホモロジーの最小量は、他のｍＲＮＡ分子の機能および他の遺伝子の発現に影響を及ぼすことなく、特定の標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションとその翻訳または機能の阻害を結果としてもたらすのに充分なものである。アンチセンスＲＮＡは、プロモーターを含む適当な制御配列とともに該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡが配置されたベクターとの形質転換、またはトランスフェクションによって細胞に運搬される。「３本鎖ヘリックス」または「トリプレックス」アプローチは、２本鎖ＤＮＡの主溝に結合し、共直線状トリプレックスを形成する合成オリゴヌクレオチドの製造を含む。このようなトリプレックス形成は、細胞増殖を制御そして阻害することができる。例えば、Hoganら、米国特許5176996号;Cohenら、Sci．Amer．Dec 1994，p.76-82;Helene，Anticancer Drug 6:565-584(1991);Maher IIIら，Anti sense Res．Devel．1:227-281(Fall 1991);およびCrookら編"Antisensereserach and Applications"，CRC Press，1993を参照。前記すべては、参考文献として援用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドがトリプレックス形成によって２本鎖ＤＮＡ標的に、遺伝子制御領域内で結合でき、それによって転写開始を抑制するという発見に、前記アプローチは部分的に基づいている(Cooneyら，Science 241:4 56(1988))。本発明は、例えばＨｏｇａｎら（前出）の方法を利用して、強固にそして特異的に、ｈＡＣ５をコードするＤＮＡの一部、またはその制御配列からなる２本鎖ＤＮＡ標的に結合するオリゴヌクレオチドを設計する。従って、このようなトリプレックスオリゴヌクレオチドは、この遺伝子の発現を選択的に操作するための１つのクラスの薬剤として使用することができる。そこで本発明は、細胞取りこみと標的ｈＡＣ５コーディングＤＮＡ配列またはその制御配列の２本鎖ＤＮＡへの結合に充分な量で、オリゴヌクレオチドが前記２本鎖ＤＮＡに結合し共直線状トリプレックスを形成するように細胞に、オリゴヌクレオチドを提供するか、或いは被検者に合成オリゴヌクレオチドを投与することに向けられている。本方法は、インビトロまたはインビボにおいて細胞上でｈＡＣ５酵素の発現を阻害するのに使用される。好ましくは、標的配列がＲＮＡ転写出発点に近接してＤＮＡドメイン内に配置される。本方法は、この酵素の発現に依存する細胞の増殖を阻害するのにも使用できる。また、本方法はこのようなトリプレックス形成合成オリゴヌクレオチドを投与することによって細胞上で発現するｈＡＣ５の相対的な量または割合を変化させるのに使用してもよい。以下の実施例は、例示のためであり、本発明を制限することを意図しない。実施例１ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーの構築とスクリーニングヒト心臓全体をｍＲＮＡのソースとして使用した。ライブラリーはＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社（カタログ番号ＨＬ３０２６ａ）の市販品を購入した。ライブラリーはラムダｇｔ１０ファージに加えて、オリゴｄＴプライマーおよびランダムプライマーの両方を使用して調製した。ラムダｇｔ１０ライブラリーの一次スクリーニングはジェントル・ウォッシュ（あまりストリンジェントでない条件）で行った。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを標準的な条件で行った。適当なＰＣＲＡＣ断片をプローブとして使用した。前記プローブを³²Ｐ−ｄＣＴＰを用いランダムプライマー法により放射標識した。ハイブリダイゼーション後、ブロットをストリンジェントな条件を増しつつウォッシュし、それからオートラジオグラフィーを行った。１個の陽性クローンを得た。次ぎの工程は、前記クローン中のインサートに全長ｃＤＮＡが含まれることを確認することであった。ヒト心臓ライブラリーから得られたすべての陽性クローンを適当なプラスミドにサブクローニングした。制限酵素マップを作成後、これらをさらにサブクローニングし、ユニバーサルプライマーまたは合成オリゴマーを用いてシークェンシングした。シークェンシングはＳｅａｑｕｅｎａｓｅ(Tab orら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:4767-4771(1987))を用い、双方向に２回行った。クローンをそれら自身で用いるか、またはシークェンシングした。そこでＰＣＲプライマーを生成するのに用いた。前記ＰＣＲプライマーを用いてＲＡＣＥ・ＰＣＲ法（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）（Frohman，M.A.，Methods Enzymol.218:3 40-362(1991))により、ヒト心臓ｍＲＮＡから対象となるさらなるクローンを得た。特に興味のある１つのクローンをプローブとして用い、別のヒト心臓ライブラリーをスクリーニングした。さらに数個のクローンを得た。シークェンシングした結果、３７８３塩基のオープンリーディングフレームが翻訳終結コドンであるＴＧＡまで一続き（リードスルー）である（図１）ことが判明した。このようにして、前記クローンは、１２６１アミノ酸のタンパク質をコードする。前記ｃＤＮＡの全コーディング部分およびその演繹されたアミノ酸配列を図１（それぞれ配列番号１および２）に示す。これらのクローンからの１つ以上の断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入したｐｃＤＮＡ３にサブクローニングした。全長ｃＤＮＡを含む発現ベクターを命名した。「ＳＵＲＥ」と命名した適当な大腸菌株に挿入したこの発現ベクターの試料を「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」に基づき、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive， Rockvill，Md．20852）に1997年月日付で、寄託し、寄託番号ＡＴＣＣ番を付与された。実施例２ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼのクローニングと発現当該技術分野において周知であるような組換えＤＮＡ技術を用いる適当な発現システム中、心臓Ｖ型アデニル酸シクラーゼｃＤＮＡをクローニングし、発現することによってヒトＶ型アデニル酸シクラーゼを生産した。精製したプラスミドをＨＥＫ-293細胞に電気穿孔法を用いてトランスフェクションした。前記細胞を適当な増殖媒地中で増殖し、それから洗浄した。トリプシン溶液を加えた後、細胞を保温し、回収し、そして増殖培地に再懸濁した。精製したプラスミドを電気穿孔キュベットに加えた。細胞を前記ＤＮＡに加え、混合液にパルス電圧を印加した。細胞−ＤＮＡ混合液を適当な増殖培地中にプレーティングした。プレートを保温した後、細胞を選択培地に置いた。１２６１アミノ酸を有するｈＡＣ５をその二次構造についてＫｙｔｅらの方法（J．Mol．Biol．157：105-132(1982)）で解析した。ＧｅｎｅＷｏｒｋ２．４５版ソフトウェア（IntelliGenetics，Inc.、Mountain View；California）を用いてハイドロパシー・プロットを得、このアデニル酸シクラーゼアイソフォームの膜関連構造を同定した。Ｋｙｔｅら方法（前出）をウィンドウサイズを５と設定して用いた。前記ハイドロパシー・プロット（図示せず）では膜貫通スパン領域を表す１３個のピークが出現した。ピーク１〜１２が膜貫通スパン領域を表す。この結果から前記アデニル酸シクラーゼアイソフォームが１２個の膜貫通スパン領域、並びに中央部分および末端に位置する大きい細胞質ループを持つ構造をしており、これは既に同定されたアイソフォームの構造一致することが指摘される。膜貫通部のうち５番目（９番目と１０番目の膜貫通スパン領域との間）の細胞外ループが最大である。「−１」と命名したピークは、Ｎ末端に対応する。他のすべてのアイソフォームでは、Ｎ末端は細胞内である。ハイドロパシー・プロット上のピーク「−１」の出現は、このアイソフォームのＮ末端が細胞外である可能性を提示する。実施例３ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼの評価ＨＥＫ-293細胞を用いた安定発現系においてｈＡＣ５の生化学的特性を決定した。全コード配列を含むアデニル酸シクラーゼｃＤＮＡ断片を適当なプラスミド中に挿入した。アッセイを行い、ｃＡＭＰ生成物の形成を測定した。前記ＤＮＡによって発現されたｈＡＣ５酵素は活性であることが分かった。実施例４ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼの組織分布ｈＡＣ５の組織分布を測定するため、各組織からのｍＲＮＡを用いてＮｏｒｔｈｅｒｎブロッティングを行った。グアニジユウムナトリウム（guanidium sodi um）およびオリゴｄＴカラムを用いて各ヒト組織からメッセンジャーＲＮＡを精製した。ブロットはプローブを加える前に、適当な溶液中で、プレハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションを行い、続いてストリンジェントな条件を漸増させながらウォッシュを行った。ブロットは、それからオートラジオグラフィーにかけた。Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット解析の結果から、ｈＡＣ５は心臓および脳組織で圧倒的に発現していることが示された。脳が心臓よりいくらか少ない発現を示す。特許、学会誌の論文、および教科書を含む上記で引用および言及された全ての文献は、「援用する」と明言されているか否かにかかわらず本明細書の記載に参考文献として援用される。今、本発明を充分に記述し終わって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そして過剰な実験をすることなしに、広範囲の等価なパラメーター、濃度、および条件の中で同じことが実施できることを当業者は認識するであろう。本発明は、特定の実施の形態に関連付けて説明されてきたが、さらなる変更が可能であることが理解されるであろう。この応用は、本発明の原則に一般的に従い、そして本発明が属する技術分野の中で公知または慣用的である実施の範囲内に入り、添付された請求の範囲の範囲内に次のように以下記載された必須の特徴に応用できるような、本開示からの逸脱を含む本発明のいかなる変形、使用、または改変をも包含することを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．図１（配列番号２）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする単離および精製されたヒトＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド。２．ヒトＶ型アデニル酸シタラーゼをコードすることを特徴とする単離および精製された核酸。３．図１（配列番号１）のヌクレオチド配列を含み、且つ生物活性ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼをコードすることを特徴とする単離および精製された核酸。４．可溶性の生物活性ヒトＶ型アデニル酸シクラーゼペプチド断片をコードすることを特徴とする、請求項３に記載の核酸。５．請求項２に記載の核酸を発現ベクターに組み込むこと、前記ベクターで宿主細胞を形質転換すること、そして該形質転換された宿主細胞を、遺伝子の発現を結果としてもたらす条件下で培養することを含むことを特徴とするヒトＶ型アデニル酸シクラーゼの生産方法。６．前記宿主細胞がバクテリア、ウイルス、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞株からなることを特徴とする、請求項５に記載の方法。７．前記宿主細胞ＨＥＫ-２９３細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。