JPH07503611A - ソマトスタチン受容体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ２２、真核宿主細胞としてさらに定義される請求項１９の組換え宿主細胞。

２３、原核宿主細胞としてさらに定義される請求項２０の組換え宿主細胞。

２４．１！母細胞としてさらに定義される請求項２０の組換え宿生細胞。

２５、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントが、組 換え宿主細胞内において機能する調製シグナルの転写制御の下にあり、その調節 シグナルは全ての必要な転写および転写後修飾がなされるようにソマトスタチン 受容体ポリペプチドの発現を適切に制御するものである請求項１９〜２１の組換 え宿主細胞。

２６、ソマトスタチン受容体ポリペプチドの製法であって、請求項２１〜２５の いずれかによる組換え宿主細胞であり、該ポリペプチドを発現することができる 細胞を生産すること、該ポリペプチドを発現するために適当な条件下に宿主細胞 を培養すること、および該ポリペプチドを回収することを含む方法。

２７、宿生細胞がさらに真核宿主細胞を包含する請求項２６の方法。

２８　真核細胞がさらにＣＯ３−１細胞を包含する請求項２６の方法。

２９、宿主細胞がさらに原核細胞を包含する請求項２６の方法。

３０、原核細胞がさらに大腸菌ＤＨ５α株の細菌細胞を包含する請求項２６の方 法。

３１、ソマトスタチン受容体ポリペプチドと相互作用する能力のある候補物質を 検定するための方法であって、該ポリペプチドと該候補物質との相互作用を検定 しつる形のポリペプチドを生産することのできる宿主中でソマトスタチン受容体 ポリペプチドを発現すること、該ポリペプチドを該候補物質に暴露させること、 および該ポリペプチドと該候補物質との反応を評価することを含む方法。

３２、この評価工程が、該ポリペプチドをＸ線結晶解析に適当な条件下で結晶化 すること、および該ポリペプチドをＸ線結晶解析することをさらに包含する請求 項２７の方法。

３３、さらに、該評価段階が、望ましいソマトスタチン様相互作用を持つ候補物 質と、望ましくないソマトスタチン様相互作用を持たない候補物質とを判別でき る評価法をも含む、請求項２７の方法。

３４、望ましくないソマトスタチン様相互作用がさらにインツユリン代謝の阻害 を含む請求項２７の方法。

３５、望ましくないソマトスタチン様相互作用がさらにグルカゴン代謝の阻害を 含む請求項２７の方法。

３６、該評価段階がさらに１またはそれ以上の単離された組換えソマトスタチン 受容体ポリペプチドと相互作用する選択的能力を持つ候補物質を特定できる評価 法を含む請求項２７の方法。

明細書 ソマトスタチン受容体 本発明は、一般的に、ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）群の組成物およびそれ らを得る方法に関する。本発明はまた、ソマトスタチン受容体群をコードするＤ ＮＡ配列、それら配列を担持する組換えベクター、該配列またはベクターのいず れかを含有する組換え宿主細胞、および組換えソマトスタチン受容体ポリペプチ ドに関する。特定の具体的な態様において、本発明は、少な（とも３種類の異な るソマトスタチン受容体、即ち５ＳＴＲＩ、５ＳＴＲ２および５ＳＴＲ３を、ヒ トＤＮＡを含む様々な起源からクローニングし、機能的に発現させることに関す る。本発明はまた、診断、医薬デザインおよび治療適用に用いるために、候補物 質の中からソマトスタチン受容体ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニス トなどを選択し、改良するために設計されたアッセイに、単離した組換え受容体 ポリペプチドを用いる方法に関する。

ソマトスタチンは最初、視床下部抽出物から単離された、脳下垂体前葉から分泌 される強力な成長ホルモン阻害作用を有するテトラデカペプチドであることが示 された［ブラゾウら（Ｂｒａｚｅａｕ　ｅｔ　ａｌ、　）　１９７３］。その後 の研究で、このホルモンが広範囲に分布しており、中枢神経系、および胃、腸、 および膵臓などの身体の末梢組織に存在することが明らかになった［ライヒリン ら（Ｒｅｉｃｈｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　）１９８３］。ソマトスタチンは、組織 特異的な様々な生理学的効果を表すことが知られている（Ｒｅｉｃｈｌｉｎ　１ ９８３）。それは、例えば、神経伝達物質としての機能と、ホルモンとしての機 能である。そのホルモン作用には多（の脳下垂体、膵臓、および胃腸ホルモン、 およびその他の分泌性タンパク質（蛋白質）の放出制御が含まれる。これらの理 由により、天然ソマトスタチンによる患者の治療には、多くの、そして望ましく ない作用があり得る。今日、そのような薬物を完成する唯一の方法は、全動物研 究を行うか、これら受容体の粗単難物を用いることである。

ソマトスタチンはソマトスタチン様ペプチドファミリーのメンバーである［ブラ ディロールら（Ｐｒａｄｙｒｏｌ　ｅｔ　ａｌ、　）　１９８０；ニッシユら（ Ｅｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、）　１９８０コ。

ソマトスタチンの２つの基本的な生物活性形であるソマトスタチン−１４とソマ トスタチン−２８は、９２アミノ酸からなる前駆体であるプロソマトスタチン［ シュンら（Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）　１９８２］の組織特異的タンパク質加水 分解法によって得られた。同様に、ソマトスタチン−１４およびソマトスタチン −２８は様々な組織で、様々な濃度で見い出されることが知られている。

ソマトスタチン−１４およびソマトスタチン−２８は標的組織に対して共通の効 果を有し得るが、それらは異なる能力を有し、そのことは、それらの作用が異な る受容体を介することを示している（Ｒｅｉｃｈｌｉｎ、　１９８３）。例えば 、ソマトスタチン−１４は、比較的、グルカゴンおよび胃酸分泌に選択的である と思われるが、ソマトスタチン−２８はむしろ成長ホルモン、インシュリンおよ び膵臓外分泌の特異的な阻害物質であると思われる［ロス（ｌａｓｓ）　１９８ ９］。

ソマトスタチン受容体 ソマトスタチン−１４およびソマトスタチン−２８は、多くの場合ＧＴＰ−結合 （Ｇ）タンパク質と結合（カップリング）していると考えられる高親和性受容体 との結合を介して、その生物活性を発揮する［ライシンら（Ｒｅｉｓｉｎｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　）１９ｇ５ニルイスら（Ｌｅｗｉｓｅ　ｅｔ　ａｌ、）　１９８５ ］　ｏ薬理学的研究で、ソマトスタチン受容体には少なくとも２つのサブタイプ があることが示された［スリガンド（Ｓｒｉｋａｎｔ）およびバタル（Ｐａｔｅ ｌ）　１９８１；　）ランら（Ｔｒａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　１９８５コ。この ソマトスタチン受容体の２つのサブタイプはソマトスタチン−１４およびソマト スタチン−２８のいずれかに選択的な受容体を反映していると推測される。ソマ トスタチン受容体は他の膜貫通型シグナル受容体に類似すると予測される。

そのような膜貫通型シグナル系の多（は、少な（とも３個の膜結合タンパク質成 分；　（ａ）細胞表面受容体；　（ｂ）イオンチャンネルまたは酵素アデニル酸 ンクラーゼのようなエフェクター；および（Ｃ）受容体およびそのエフェクター の両方と結合している、グアニンヌクレオチド結合調節タンパク質（またはＧタ ンパク質）、からなる。

Ｇタンパク質と結合した受容体は、光、匂い、ペプチドホルモンおよび神経伝達 物質などの様々な細胞外シグナルの作用を媒介する。そのような受容体は、種々 の生物で、酵母やヒトなどの様々な進化状態の動物で同定される。はぼ全てのＧ タンパク質−カッブリング受容体は、相互に配列類似性を有し、全て、脂質２重 層を貫通する、７個の疎水性（および潜在的にａ−へリックス）セグメントから なる、類似のトポロジーモチーフを共有すると考えられている［ドールマンら（ Ｄｏｈｌ＋＊ａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　１９８７；　Ｄｏｈｌｗａｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、　１９９１］。

７回膜貫通セグメント受容体と結合したＧタンパク質はすべて、かさを低くする ために３個のしっかりと会合したサブユニット、α、βおよびγ（１，＋１＋１ ）からなる。アゴニストが受容体に結合した後、Ｇタンパク質に立体配座の変化 が伝達され、その結果α−サブユニット結合のＧＤＰとＧＴＰとの交換、および βγ−サブユニットからの解離が起きる。ＧＴＰ結合形のα−サブユニットは、 通常、エフェクター変調部分（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｍｏ ｉｅｔｙ）である。シグナル増幅は、単一の受容体が多くのＧタンパク質分子活 性化能力を有することに起因しており、Ｇα−ＧＴＰが幾つかのエフェクターの 触媒サイクルを刺激することに起因している。

調節Ｇタンパク質ファミリーは、多くの異なるα−サブユニット（ヒトで２０以 上）からなり、それは、より小さいプールであるβ−およびγ−サブユニット（ それぞれ４個以上）と会合している［ストロスマン（Ｓｔｒｏｔｈｍａｎ）およ びンモン（Ｓｉｓｏｎ）　１９９１１６即ち、様々なα−サブユニットの標的化 または機能は、それらが会合しているβγ−サブユニットに依存しているかもし れないが、おそらく、α−サブユニットにおける相違によって様々なＧタンパク 質オリゴマーを識別している考えられる（Ｓｔｒｏｔｈｍａｎ　ａｎｄ　Ｓｉｍ ｏｎ、　１９９１）　。

幾つかのソマトスタチン受容体が、少なくとも部分的に精製された（Ｐａｔｅｌ 　ｅｔａｔ、、　１９９０）。これらの研究では、天然に存在するソマトスタチ ン受容体のリガンドの類似体（即ち、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似 体）を用いて、様々な化学的および光学親和性クロスリンカ−類を用いる、ラッ トの脳、脳下垂体、外分泌膵臓および副腎皮質の膜ソマトスタチン受容体とのク ロスリンク（交差結合）を行った。２つの主要な５８−ｋＤａおよび２７−ｋＤ ａのソマトスタチン受容体タンパク質が同定された。これらのタンパク質は、組 織特異的な分布を示した。５８−ｋＤａタンパク質は脳下垂体、副腎、および外 分泌膵臓における優勢形（全標識タンパク質の約９０％）であり、２７−ｋＤａ タンパク質は脳の基本的なソマトスタチン受容体（全標識タンパク質の約８０％ ）であった。３２−ｋＤａおよび４２−ｋＤａの２つのマイナーな、特異的に標 識されたソマトスタチン受容体タンパク質が、それぞれ、脳および膵臓のみに、 見い出された。

同じ２つのリガンドを用い、これらの研究者は、ソマトスタチン−２８およびソ マトスタチン−１４と比較的優先的な結合を示す細胞系からソマトスタチン受容 体を特性化した。５８−ｋＤａ、４２−ｋＤａおよび２７−ｋＤａの３つの特異 的ソマトスタチン受容体タンパク質がそのような細胞系の１つ（ＡｔＴ−２０細 胞）で同定された。対照的に、ＧＨ，細胞内では、５８−ｋＤａ種でなく、２７ −ｋＤａタンパク質が優勢な成分であった。これらの主要およびマイナーなタン パク質のラベル化はＧＴＰおよびソマトスタチン−１４による阻害に敏感であり 、それらの推定のソマトスタチン受容体タンパク質としての特異性を証明してい た。

最近、ヒーら（Ｈｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９）は、Ｄ−Ｔｒｐ’５Ｓ−１４ アフイニテイーカラムを用い、ラットの脳およびＡｔＴ−２０細胞から、界面活 性剤で可溶化した６０ｋＤａソマトスタチン受容体タンパク質を精製した。この タンパク質のサイズはバテルら（Ｐａｔｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　）　、彼らも、ラ ットの脳およびＡｔＴ−２０細胞から、５８−ｋＤａ受容体をクロスリンクし、 精製することに成功したが、のそれと一致している。即ち、ソマトスタチン−１ ４およびソマトスタチン−２８と高親和性および高特異性で結合し、薬理学的受 容体としての資格を有する、５８−６０ｋＤａの同じようなサイズのタンパク質 が、２つの異なる研究グループにより、２つの異なる組織から、２つの異なる方 法で精製された。しかもそのサイズは他のクローンされたＧ−タンパク質−結合 膜受容体のそれと一致した。

レイル−デスマーら（Ｒｅｙｌ−Ｄｅｓａ＋ａｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８ ９）は、抗受容体モノクローナル抗体を用い、ヒト胃細胞系ＨＧＴ１から９０ｋ Ｄａの異なるサイズのソマトスタチン受容体タンパク質を均一にまで精製した。

ＡｔＴ−２０細胞から単離した無傷の５８−ｋＤａタンパク質の配列決定の試み は、最初、Ｎ−末端のブロックによって失敗に終わった。従って、これらの研究 者らは、脳５８−ｋＤａタンパク質をトリプシン処理した。消化物を高速液体ク ロマトグラフィーによって分析した。消化物対照には存在しない多くのペプチド ピークが同定された。これらピークの内、タンパク質２０−４０ピコモルを含有 する最大の４ピークの各々を配列決定した。従来知られていなかった、１６−２ ３アミノ酸残基のペプチド配列が得られた。これらフラグメントの最大のものは Ｇ、タンパク質ファミリーと相同な部分配列を示した。しかし、配列はどの既知 のＧタンパク質にも相当せず、残りのトリプシン処理断片（トリブチツクフラグ メント）はＧタンパク質となんらの類似性も示さなかった。

従って、トリブチツクフラグメントの１つがＧ、タンパク質と部分配列において 相同であることは、偶然の一致である、あるいは、多分、最近特性化されたシグ ナル認識粒子受容体などの他のＧＴＰ−結合受容体［フノリ−（Ｃｏｎｎｏｌｌ ｙ）およびギルモア（Ｇｉｌｓｏｒｅ）　１９８９］に相当する５８−ｋＤａソ マトスクチン受容体のＧタンパク質関連構造を示していると考えることができる 。バテルらが単離した３２−ｋＤａタンパク質は配列決定できなかった（Ｄｏｈ ｌｍａｎ、　１９９１）。

細胞培養および薬理学的手法の改良により、さらに、近年では、分子クローニン グおよび遺伝子発現技術の発展により、既に同定されていた受容体の新規なサブ タイプ、サブサブタイプなど、多くの新しい７回膜貫通型セグメント受容体が特 性化された。アドレナリン性α１−およびα２−受容体は、かつて、各々単一の 受容体種からなると考えられていたが、現在では各々が少なくとも３つの別個の 遺伝子によってコードされていることが分かっている［コビルカら（Ｋｏｂｉｌ ｋａ　ｅｔａｌ、）　１９８７；　レーガンら（Ｒｅｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、　） 　１９８８；コツチアら（Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ　ｅｔ　ａｌ、）　１９８８；　 口７スネー（Ｌｏｍａｓｎｅｙ）　１９９０コ。薄暗い所での視覚を伝える網膜 杆細胞内のロドプシンのほか、色を伝える非常に似通った３つの錐体色素がクロ ーンされた［ナサンスら（Ｎａｔｈａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、）　１９８６ａ：　Ｎ ａｔｈａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６ｂ］。

Ｇ−タンパク質−カッブリング受容体ファミリーの全メンバーは、Ｇ−タンパク 質−カッブリング受容体ファミリーの他のメンバーと相同であるように思われ（ 例、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、タキキニンなど）、各々は、７回膜 貫通型セグメントトポロン−を共有するように見える。

７回膜貫通型セグメント受容体を相互に比較すると、アミノ酸配列の保存に関し て認識できるパターンが認められる。膜貫通型ドメインは、しばしば、最も似通 っているが、Ｎ−Ｃ末端領域および膜貫通型セグメントＶおよびＶｌを連結しテ イル細胞質内ループは全（異なっている（Ｄｏｈｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８７）。

例えば、キナーゼ類およびＧタンパク質類などの細胞質内タンパク質との相互作 用には、受容体の膜貫通型ドメインを連結している疎水性ループが関与している と予測される。しかしながら、機能保全の故に７つの膜貫通型セグメント受容体 の中で、どの性質が保存されているか、そして、どの異なる性質が新しい機能へ の構造的適応を表しているかを決定することが挑戦の対象であった。これらの考 えを試験するために、組換えＤＮＡ、および置換および欠失突然変異体の構築の ための遺伝子発現法の使用、並びにハイブリッドまたはキメラ受容体の使用など の様々な戦略が用いられた（ＤｈｏｌＩｌａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９９１）。

受容体サブタイプ、Ｇタンパク質類、およびエフアクタ−の数が増えるに伴って 、これらの受容体のリガンド結合およびＧタンパク質認識特性の特性化が重要な 研究分野となってきた。長い間、複数の受容体が単一のＧタンパク質と結合でき 、アドレナリン性β、−およびα２−受容体と結合するエビネフィリンの場合の ように、単一のりガントが複数の機能的に異なる受容体サブタイプと結合するこ とが分かった。さらに、同様の、受容体およびエフアクタ−結合特異性を有する Ｇタンパク質も同定された。例えば、ヒトＧ、の３つの種がクローンされ［イト ウら（Ｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ、）　１９８８］　、交互の（１つおきの）ｍＲＮ ＡスプライシングによりＧ、の多（の変異体が得られることが分かった［コザサ ら（Ｋｏｚａｓａ　ｅｔ　ａｌ、　）１９８８］。ムスカリン様およびアドレナ リン性α２−受容体のクローニングおよび過剰生産は単一の受容体サブタイプが 、細胞内で高レベルに発現されると、１以上のタイプのＧタンパク質とカップリ ングすることが示された。

この複雑さおよび見かけ上の機能の退化から、基本的に重要な疑問は、いかにし て、そしてどのような条件下で、Ｇタンパク質が複数の受容体からのシグナルを 系統づけ、それらを適当なエフアクタ−に指令するか、ということである。伝統 的な方法は、精製受容体とＧタンパク質成分をインビトロで再構成することであ る。残念ながら、精製法は、極く限られた数の受容体サブタイプおよびその同族 のＧタンパク質の精製でしか成功しない。別法として、クローンした受容体の特 性化および受容体Ｇタンパク質のカップリング特異性の解明に、ヘテロローガス 発現系が、より一般的な有用性を持ち得る［マルレロら（Ｍａｒｕｌｌｏ　ｅｔ 　ａｌ、　）　１９８８：ベイエツトら（Ｐａｙｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　 １９９０；キングら（Ｋｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　）　１９９０１゜このタイプの 研究は、ソマトスタチン−関連疾患における治療法の設計に成功するために必要 である。

最近、酵母細胞内で哺乳類のアドレナリン性β、−受容体およびＧ、α−サブユ ニットが同時に発現され（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）るような、酵母細胞発 現系が開発された（Ｋｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０）。いかなるヒト組織 よりも数百倍高いレベルのアドレナリン性β、−受容体の発現が達成され、適切 な親和性、特異性および立体選択性のリガンド結合が示された。さらに、成長阻 害の負荷、形態学的変化、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　１ａｃｚ 遺伝子（β−ガラクトシダーゼをコードする）と融合したフェロモン反応性プロ モーター（ＦＵＳＩ）の誘導などの幾つかの基準に基づいて、フェロモンシグナ ル伝達経路のアドレナリン性β２−受容体を介する活性化が証明された（Ｋｉｎ ｇ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０）。

最後に、他の関連サブタイプなしに、単一受容体のみを発現させることは、たと え単離した、非組換え哺乳類細胞内でも、しばしば達成不可能である。即ち、そ のような内因性受容体が存在しない微生物内（例、酵母細胞または突然変異哺乳 類細胞）での発現は、サブタイプ選択性薬物のスクリーニングおよび評価のため に有用である（Ｍａｒｕｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８；　Ｐａｙｅｔｔｅ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０；　Ｋｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、B １９９０）。

即ち、ソマトスタチン受容体の研究に古典的な遺伝子学の標準的な方法を適用す ることは相当困難であり、たとえ分子生物学の強力な技術でさえも適用は困難で ある。とりわけ、個々のソマトスタチン受容体をコードするＤＮＡ配列を同定す る方法が必要である。そのような、単離された組換え配列が得られれば、従来困 難であった、イソフオーム特異性ソマトスタチン受容体アゴニストおよびアンタ ゴニストを設計し、試験することに伴う困難な問題の解決が可能になるかもしれ ない。

発明の要約 本発明は、組換えソマトスタチン受容体を得、用いるために必要な、ＤＮＡセグ メント、純化ポリペプチド、抗体を得る方法、クローニング法および組換え宿主 細胞を用いる方法を、初めて提供する。即ち、従来技術から明らかに、分子生物 学における古典的な遺伝学および技術による標準的な方法の適用が直面する問題 点、例えば、ソマトスタチン受容体の分子量が様々であることなどが克服された 。従って、本発明は、一般的に、ヒトおよびマウス両起源のソマトスタチン受容 体を含む受容体の製造のための組成物（成分）および方法に関する。

本発明の実質的な利益を達成するために、種々の、新規な物質の組成物および方 法を提供する。本発明が提供する組成物には、ソマトスタチン受容体ポリペプチ ドをコードするＤＮＡを含有する（組み込まれた）組換えベクター、ソマトスタ チン受容体をコードする単離されたＤＮＡセグメント、ソマトスタチン受容体ポ リペプチドそのもの、およびソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするＤ ＮＡを含有する（組み込まれた）組換え宿生細胞が含まれる。本発明の方法は、 ソマトスタチン受容体ポリペプチドおよびそれに対する抗体の製造、ソマトスタ チン受容体ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストのような試験候補物 質のスクリーニングアッセイであって、候補物質の中から、望ましくない性質に 対し、望ましい性質を有する候補物質を識別できるアッセイ、候補物質から１つ または他のソマトスタチン受容体ポリペプチドに特異的な物質を選択できるアッ セイ、およびソマトスタチン受容体ポリペプチドの構造と機能の相互関係を調査 する方法を含む。

本発明の意味から、ソマトスタチン受容体ポリペプチドという語句は、本発明に よって可能になったソマトスタチン受容体ポリペプチドと生物学的および免疫学 的同一性を有するペプチドまたはタンパク質を指す。例えば、そのような受容体 ポリペプチドは、本発明でヒトおよびマウス起源から誘導されたものを包含する 。本発明のアミノ酸配列が、現時点で配列決定されている既知のソマトスタチン 受容体ポリペプチドに関する唯一の、正確な長さおよび正確な性質を示すことか ら、本発明のソマトスタチン受容体ポリペプチドは一般に本発明が提供するアミ ノ酸配列の任意のものを指すものとする。しかしながら、本発明はより短いまた は長いペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を排除するものでなく、実際、 それらペプチドまたはタンパク質が、例えば、本明細書で同定したソマトスタチ ン受容体ポリペプチドのいずれかに対するポリクローナル抗血清によって定義さ れる、生物学的活性および／または交差免疫学的反応性を有する限り、それらの 製造または使用をも可能ならしめるものである。例えば、当業者ならば理解する ように、他の哺乳類起源と同様、特定の種の異なる組織起源などの、種々の真核 性供給源から、本発明の方法を用いて組み換えソマトスタチン受容体ポリペプチ ドを得ることができる。

ＤＮＡ　セグメント 本明細書で開示する組換えベクターは、本発明の方法および組成物を用い、ソマ トスタチン受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含有する。その ようなりＮＡ上セグメントいう語句は、該セグメントを非−ソマトスタチン受容 体ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントから区別するに十分な長さの、ソ マトスタチン受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを包含するもの である。本発明のソマトスタチン受容体ポリペプチドは、任意の形のソマトスタ チンまたはその類似体と結合し得る、任意のソマトスタチン受容体ポリペプチド と理解され得る。さらに、本発明のソマトスタチン受容体ポリペプチドは特定の 供給源に限定されない。本明細書に開示したように、本発明の方法および組成物 は、例えば、ヒトおよびマウス起源からの５ＳＴＲＩ−３の同定および単離を可 能にする。このように、本発明は、様々な供給源からのソマトスタチン受容体ポ リペプチド群を一般的に検出および単離すると同時に、２つの別個の供給源から の３つの種を個々に同定する方法を提供する。本発明の組成物および方法を用い て、ソマトスタチン受容体ポリペプチドファミリーの多数の種が検出および単離 できると考えられる。現在、この受容体ポリペプチドファミリーの少なくとも４ つのメンバーを、本発明の組成物および方法を用いて得ることができると考えら れている。本発明のＤＮＡセグメントは、アミノ酸の相対的ヒドロパン−スコア の変換などを考慮して選択される変化を有するアミノ酸配列変異のような、様々 なアミノ酸配列変異を有する、生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドを コードしていてもよい。これらの変異配列は天然起源から単離されるか、本明細 書開示の配列から、部位−特異的突然変異誘発などの突然変異誘発法を用いて誘 導したもので良い。

ある一般的な観点から、本発明は、ベクターおよびＤＮＡ断片を含む、ソマトス タチン受容体ポリペプチドをコードする配列を有する、ＤＮＡセグメントの製造 および使用に関する。本発明のＤＮＡセグメントは、勿論、本発明のソマトスタ チン受容体ポリペプチドの発現に用いることができる。

ある態様では、ベクターは、ソマトスタチン受容体ポリペプチドを表す配列を示 す任意の配列番号のアミノ酸を含有するソマトスタチン受容体ポリペプチドの、 少なくとも有用な部分をコードする、実質上、精製されたＤＮＡ断片を含有する 。

５ＳＴＲＩのためのソマトスタチン受容体ポリペプチドの場合、本発明により、 ヒト（配列番号２）およびマウス（配列番号４）ポリペプチドの両者が得られた 。

同様に、ヒト５ＳＴＲ２およびマウス５ＳＴＲ２も本発明によって得られ、それ ぞれ、配列番号６および８に記載されている。さらに、ヒト５ＳＴＲ３ポリペプ チドは配列番号１０に、マウス５ＳＴＲ３は配列番号１２に記載されている。

本発明のある態様では、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡ を示した様々な配列番号の任意のものの配列を含有する、短いおよび長いＤＮＡ 断片には、例えば、真核性および原核性組換えクローンバンクのスクリーニング のための短いＤＮＡ断片ハイブリダイゼーションプローブとしての使用など、別 の用途が見いだされる。どのような事象でも、約１４ヌクレオチドの短いストレ ッチの、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す任意 の配列番号の配列に対応する断片は、これらまたは他の態様における用途を有す ることが見い出されるであろう。５ＳＴＲＩ−３のための配列番号の、任意のソ マトスタチン受容体ＤＮＡ配列と共通の、またはそのいずれかと相補的な、少な くとも約１４ヌクレオチドのストレッチを有すれば、１つのＤＮＡセグメントは 、通常、ソマトスタチン受容体積のＤＮＡと優先的にハイブリダイズ（バイブリ ド化）する能力、特に、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０２Ｍクエン酸ナ トリウム、ｐＨ７，４（約５０℃）のやや強いストリンジェントーの下で、ハイ ブリダイズする能力を有する。

通常、そのような相補的あるいは共通なストレッチは、安定なハイブリッドを形 成する能力を確実に持つが、ある態様では、より長いストレッチの相補ＤＮＡが 望ましいと判明するかもしれない。即ち、例えば、２０．３０または４０塩基長 さの、より長いストレッチの相補配列を有するＤＮＡセグメントの使用が望まれ ることもある。勿論、用いる相補配列が長ければ長いほど、ノゾブリダイゼーン ヨンの可能性が太き（、ハイブリダイゼーション（バイブリド化）プロコトルは より強度（ストリンジェント）である。

即ち、本発明のＤＮＡ配列を、オリゴヌクレトチドブローブとして用い、ソマト スタチン受容体ポリペプチドまたは遺伝子を有すると考えられるＤＮＡ供給源に ハイブリダイズさせることができる。通常、オリゴヌクレオチドをそのような受 容体遺伝子を有することが疑われるＤＮＡ供給源にハイブリダイズさせることで 、プローブを行う。ある場合には、プローブは単一のプローブのみからなり、他 の場合には、プローブは、ソマトスタチン受容体ポリペプチドのあるアミノ酸配 列または配列群に基（プローブの集まりで構成されているがもじれず、その多様 性によって遺伝子コード特有の重複性を満たすであろう。

このような方法でプローブするためのＤＮＡの適当な供給源は、ソマトスタチン 受容体ポリペプチドを発現することができる、目的の細胞系のゲノムライブラリ ーであろう（例、ヒト膵臓島細胞）。または、ＤＮＡの供給源は、目的の細胞系 からの全ＤＮＡを含有するであろう。本発明のハイブリダイゼーション法によっ て候補ＤＮＡセグメントが同定されれば、陽性クローンが得られたかどうかを、 例えば、さらにハイブリダイゼーションし、配列決定し、かっ／または発現させ 、試験することで確認することが望まれるかもしれない。

または、これらのセグメントを、あるＤＮＡ配列群と本明細書に開示したソマト スフチン受容体セグメントのＤＮＡ配列との類似性に依存する他の方法と同様、 下記の種々の方法で、以下のようにして用いることができる：　（１）患者の細 胞から得たＤＮＡ内の正常および異常なりＮＡ配列の検出のための診断道具とじ て、（２）ソマトスタチン受容体ファミリーの他のメンバーおよび近縁タンパク 質の配列を含有する可能性のあるＤＮＡライブラリーから、そのような配列を検 出し、単離するための手段として：　（３）近縁の配列を増幅するために近縁配 列とハイブリダイズさせるためのプライマーとして：　（４）天然のソマトスタ チン受容体ＤＮＡ配列を変化させるためのプライマーとして。

ベクタ一 本発明は、１つの実施態様として、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコード する配列を有するＤＮＡセグメントを含有する組換えベクターを提供する。その ようなベクターは当該技術分野の当業者に周知の、ソマトスタチン受容体ポリペ プチドをコードしており、宿主細胞を安定に形質転換することができる適当なり ＮＡ上セグメント含有する、任意のベクターであってよい。そのようなベクター は、ｐ　ＣＭＶ　６　ｂおよびｐｃＭＶ６ｃなどのｐＣＭＶファミリーの哺乳類 発現ベクター（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ　ＣＡ）を 含む。ある場合には、そして特異的に、これらの個々の哺乳類発現ベクターの場 合には、得られた構築物を、ｐＳＶ２ｎｅｏのような選択可能マーカーを含有す るベクターと一緒にコトランスフエクンヨン（同時トランスフェクション）する 必要がある。ＤＧ４４のような、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズハムス ター卵巣細胞系へのコトランスフエクンヨンで、そのような発現ベクターに組み 込んだＤＮＡにより、ソマトスタチンポリペプチドを発現するクローンを検出す ることができるであろう。

本発明は、１つの実施態様として、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコード する配列であって、それぞれ、ヒトおよびマウス５ＳＴＲＩポリペプチドに相当 する、配列表の配列番号２または４のいずれかに記載の配列のアミノ酸番号１− ３９１のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡセグメン トを含有するベクターを提供する。該組換えベクターはまた、ソマトスタチン受 容体ポリペプチドであって、それぞれ、ヒトおよびマウス５ＳＴＲ２ポリペプチ ドに相当する、配列表の配列番号６または８のいずれかに記載の配列のアミノ酸 番号１−３６９のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡ セグメントを含有していてもよい。さらに、該組換えベクターは、その配列に、 ソマトスタチン受容体ポリペプチドであって、それぞれ、ヒトおよびマウス５Ｓ ＴＲ３ポリペプチドに相当する、配列表の配列番号１０のアミノ酸番号１−４１ ８のアミノ酸を含むポリペプチド、または配列表の配列番号１２のアミノ酸番号 １−４２８のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含有 していてもよい。加えて、当該技術分野の当業者ならば理解することであるが、 本発明によって同定、クローニング並びに配列決定が可能になった、他のソマト スタチン受容体ポリペプチドもベクターに組み込むことができ、従って、それら も本発明の範囲に包含される。

ベクターに関しては、本発明のＤＮＡ配列を組み込むことができる多くのベクタ ーが知られている。例えば、ベクターｐＵｃ１８は特に価値あることが証明され た。同様に、近縁のベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９は、本発明の ある実施態様、特に、ノブオキシ配列決定において有用である。

従って、組換えベクターおよび単離したセグメントは、上記のソマトスタチン受 容体ポリペプチドの任意のものの、基本的なソマトスタチン受容体ポリペプチド 暗号領域自身を様々に含有するか、そのようなソマトスタチン受容体ポリペプチ ドの基本的な暗号領域における選択された変更または修飾を有する暗号領域を含 有していてもよい。あるいは、そのようなベクターまたは断片は、基本的な暗号 領域を含有しつつ、より大きいタンパク質またはポリペプチドをコードしていて もよい。いずれの場合でも、生物学的な機能の等優性と同様、コドンの重複性の 故に、本発明は、この点に関して、上記のポリペプチド配列に対応する特定のＤ ＮＡ配列に限定されるものではないことが理解されるであろう。

上記の組換えベクターは、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするＤＮ Ａ自身を量産する手段、並びにコードされたタンパク質およびペプチドを生産す る手段として有用である。本発明のソマトスタチン受容体ポリペプチドを組換え 法で製造する場合、シャトルシステムとして、原核性または真核性発現を用いる ことができる。しかしながら、原核性システムでは、通常、前駆体タンパク質が 正しくプロセッシングされず、特に、そのようなシステムは膜結合真核性タンパ ク質を正しくプロセッシングしないので、さらに開示した発明による教示から真 核性ソマトスタチン受容体ポリペプチドが理解されるので、そのような配列を真 核性宿主内で発現させることが望まれるかもしれない。しかしながら、ＤＮＡセ グメントが真核性のソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードしている場合で も、原核性発現の適用の可能性も幾らかあることは理解される。従って、本発明 は、真核性および原核性細胞間のシャトルベクターと組み合わせて用いることが できる。細菌性および真核性宿主細胞を用いることができるそのようなシステム は本明細書に開示されている。

組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドの発現が望まれ、真核性宿主が想定さ れているとき、真核性複製起点を有するプラスミドのようなベクターを用いるこ とが最も望ましい。加えて、真核性システムでの発現を目的とする場合、ソマト スタチン受容体をコードする配列を、チャイニーズハムスターの卵巣細胞と一緒 に用いられるプロモーターのような、有効な真核性プロモーターに接近し、その コントロール下に位置させることが望まれる。それが真核性、原核性のいずれで あれ、コード化配列をプロモーターの制御下に置くには、通常、タンパク質の適 切な翻訳読み枠くの５“末端を、選択したプロモーターの３゛側または下流、約 １−約５０ヌクレオチドの範囲に位置させることが望ましい。さらに、真核性発 現が想定されるとき、通常、ソマトスタチン受容体ポリペプチドを含有する転写 ユニット内に、適切なポリアデニル化部位を組み込むことが望ましい。通常、ポ リアデニル化部位はタンパク質の約３０−２，０００ヌクレオチド下流で転写終 止側の前に位置させる。

従って、ある好ましい態様では、本発明のベクター内で、ソマトスタチン受容体 ポリペプチドをコードする配列は、有効なプロモーターに隣接し、その制御下に 位置する。ベクターは当業者に周知の原核性プロモーターを含有する、原核性宿 主細胞内での発現に適合させたベクター類であってよい。あるいは、ベクターは 当業者に良く知られた、真核性プロモーターを含有し、さらにカルボキシ末端ア ミノ酸の３°に位置し、コードされているタンパク質の転写単位内にポリアデニ ル化シグナルを有するベクターであってよい。

本発明はまた、配列表の配列番号１．３．５．７．９または１１に記載のＤＮＡ 配列を含有する様々な組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞の本質は、原核性ま たは真核性のいずれであってもよい。いずれの場合でも、ソマトスタチン受容体 ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは特定の宿主細胞内で機能的な制御 シグナルをも有することが理解される。

好ましい実施態様には、組換え真核性細胞が含まれる。ヒトソマトスタチン受容 体ポリペプチドの生産が目的の場合、とりわけヒト組織から導かれた真核細胞系 が望ましい。

ソマトスタチン遺伝子およびポリペプチドの単離本発明はまた、組換えおよび非 組換え、両供給源からのソマトスタチン受容体ポリペプチドの単離法を提供する 。そのようなタンパク質は通常、配列番号２または４のいずれかの、アミノ酸番 号１−３９１に対応するアミノ酸配列、または配列番号６または８のいずれかの 、アミノ酸番号１−３６９に対応するアミノ酸配列を含有する。

しかしながら、本発明方法は、少なくとも配列番号１０のアミノ酸１−４１８を 含有するソマトスタチン受容体ポリペプチドのヒト膵臓高細胞からの単離に奏功 することが証明された。同様に、本発明の方法を用いて、少なくとも、配列番号 １２のアミノ酸１−４２８を含有する、マウスＤＮＡからのソマトスタチン受容 体ポリペプチドが単離された。当業者には明らかなことであるが、これらのソマ トスタチン受容体ポリペプチド群は、本明細書に詳細に記載したソマトスタチン 受容体１または２のいずれかとアミノ酸配列において異なるポリペプチドに対応 する。当業者にとって、同じ（明らかであり、本発明の技術背景において特に指 摘したように、少なくとも部分的に精製された様々なソマトスタチン受容体があ る。既述のごとく、５８ｋＤａおよび２７ｋＤａの、少なくとも２つの主要なソ マトスタチン受容体タンパク質が同定された。さらに、３２ｋＤａおよび４２ｋ Ｄａの特異的にラベルされたソマトスタチン受容体タンパク質も同定された。

同様に、既述のごとくζヒト胃細胞系から、９ＱｋＤａソマトスクチン受容体タ ンパク質が、均質にまで、精製された。

このように、ソマトスタチン受容体活性を有する異なる分子量のポリペプチドが 本発明によって示された。さらに、本発明により入手可能となった様々なソマト スタチン受容体における分子量の相違は、グリコリル化が様々であることに関連 するかもしれず、あるいはそのような相違は、おそら（ヒト、腸または特定の組 織に特有の、全体として異なるソマトスタチン受容体形を表しているのかもしれ ない。即ち、先行文献に記載の様々な分子量の異なるソマトスタチン受容体ポリ ペプチドは、ソマトスタチン受容体活性を有すると予測され、しかも実質上同様 のＤＮＡまたはアミノ酸配列を有し得る。活性の相違は、実際、アミノ酸鎖自身 の一次構造の相違に起因するかもしれず、あるいは、任意の数の翻訳後修飾に起 因するかもしれない。しかしながら、分子量の相違をもたらすような翻訳後また は修飾に関係な（、本発明で得た配列を表している場合、そのようなタンパク質 は、本発明に従って得ることができることを、当業者ならば理解するであろう。

当業者はそのようなタンパク質が組換えＤＮＡ分子中によりコードされている場 合、適当な宿主細胞および遺伝子的アプローチが得られれば、それを用いて直接 、ソマトスタチン受容体ポリペプチドを合成することができることを理解するで あろう。

さらに、そのようなポリペプチドはある実施態様で用いる抗体を調製するために 用い得る。そのような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいず れであっても良く、いずれの場合でも、本発明のポリペプチドのいずれかと免疫 学的に反応し得る抗体を表す。そのような抗体が一度調製されれば、その抗体を 、発現ライブラリーと一緒に用い、ソマトスタチン受容体様ファミリーポリペプ チドの他のメンバーのスクリーニングを行うことができる。

ソマトスタチンポリペプチドの発現 従って、本発明は、組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドを製造する方法を 提供する。この方法は、組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドを発現するこ とができる組換え宿主細胞の使用を含む。さらに、本発明の組換えソマトスタチ ン受容体ポリペプチドを製造する方法は、ポリペプチドの発現に適した条件下で 宿生細胞を培養することを含む。最後に、特許請求にかかる製造法は、このよう ；こして発現されたポリペプチドを収集することをも含む。

本発明方法は、特に、配列番号２．４．６．８．１０、または１２のいずれかに 明示されたポリペプチドのいずれかに対応するポリペプチドを得る場合に適用す ることができる。しかしながら、本発明方法は、上記のいずれかに記載のポリペ プチドと実質上類似のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードす る遺伝子の単離をも意図する。特定の態様において、該方法は、通常、ソマトス タチン受容体ポリペプチドを発現し得る細胞の選択、とりわけ、チャイニーズハ ムスター卵巣細胞におけるそのような細胞の選択を含む。しかしながら、本発明 方法には、酵母細胞、ヒト細胞系、および当業者に既知の他の細胞系などの様々 な細胞を用いることができる。勿論、本発明方法は、通常、そのような細胞を、 ソマトスタチン受容体ポリペプチドが実質的な量、産生されるよう、培養するこ とを含む。

次いで、ある種の一般的な態様として、本発明は、組換えソマトスタチン受容体 ポリペプチドの製造方法を提供する。まず、本発明の方法および組成物を用いて ポリペプチドを発現することができる、組換え宿主細胞細胞を製造する。次いで 、宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する。最後に、本発明の 方法および組成物を用いて組換えポリペプチドを回収する。

組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドを用いるアッセイこれらの方法によっ て発現された組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドは様々なスクリーニング アッセイに用いられる。例えば、本発明の方法および組成物を用い、ソマトスタ チン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの候補物質を試験するための スクリーニングアッセイが導かれる。候補物質は、ソマトスタチン受容体ポリペ プチドと相互作用するか、あるいは、結合または他の分子内相互作用により、ソ マトスタチン受容体ポリペプチドを調節する物質である。

ある場合には、そのような候補物質は、受容体のアゴニストであり、他の場合に は、受容体ポリペプチドと相互作用してアゴニスト的に寄与する。他の場合には 、そのような物質は、アゴニスト的およびアンタゴニスト的な性質を併有してい るか、他の方法でソマトスタチン受容体を調節し得る。

本発明のスクリーニングアッセイには、通常、受容体の機能を阻害するか、さも なくば修飾する候補物質のスクリーニングのような、受容体の活性に影響する候 補物質の能力の測定が含まれる。一般に、この方法は、受容体ポリペプチドを組 換え的に製造し、候補物質の酵素機能に影響する能力を測定するために、該組換 えポリペプチドを該物質を用いて試験することを含む。本発明の好ましい実施態 様は、ヒト受容体の酵素活性に影響する物質であり、ヒト内で用いるために適し た物質を同定するために、候補物質をスクリーニングすることに関する。

候補物質を同定するための典型的なスクリーニングアッセイでは、受容体ポリペ プチドを得るための出発起源として、通常粗ホモジネートの形に調製された、同 じ組換え発現宿主を用いることが望ましいであろう。受容体を発現している組換 え細胞を、例えば本明細書に記載された、望ましいバッファーで洗浄し、ホモジ ナイズする。典型的なアッセイでは、細胞ホモジネートから得たある量のタンパ ク質を、少量の適当なｐＨの適当なバッファー中に入れる。アゴニストまたはア ンタゴニストのような候補物質を、その混合物に好都合な濃度、加え、候補物質 と受容体ポリペプチドとの相互反応を監視する。

受容体のための基質として適当な既知物質を用いる場合、前記の方法で、組換え 的に製造された受容体の基準活性を得る。次いで、受容体機能の抑制物質または 改変物質を試験するために、受容体に対する作用を試験すべき候補物質を混合物 に加える。次いで、候補物質の存在又は非存在下で行った反応を比較することに より、受容体の正常な機能に対する候補物質の効果に関する情報を得ることがで きる。

従って、本発明はまた、当業者に、ソマトスタチン受容体ポリペプチドの作用を 改変する能力を有する候補物質を同定するための、１またはそれ以上の方法から なる方法論を提供する。

１つの態様では、そのようなアッセイはソマトスタチンの望ましい性質を有する が、インシュリンまたはグルカゴン放出阻害作用のようなソマトスタチンの望ま しくない性質を持たない、あるいはその逆の性質を有する候補物質を区別するこ とができるように設計されていてよい。他の態様では、ソマトスタチン受容体の アゴニストまたはアンタゴニストのような被験候補物質のスクリーニングアッセ イは、１またはそれ以上のソマトスタチン受容体ポリペプチドと相互作用する選 択的な能力を有するが、該ポリペプチドは、本発明で同定された他のソマトスタ チン受容体ポリペプチドと、実質上、重なる（オーバーラツプする）活性を持た ない候補物質の同定に用いられる。

さらに、候補物質の試験のためのスクリーニングアッセイは、ソマトスタチンと 受容体との構造活性相関関係の調査を可能にするものであり得る。それは、例え ば、受容体と相互作用し得るかそれを調節し得る、天然に存在するホルモンまた は他の物質の結合の研究対そのような分子の受容体への結合によって引き起こさ れる活性の研究である。ある態様では、候補物質または他の分子とソマトスタチ ン受容体ポリペプチドとの相互作用を評価する手段として、Ｘ−線結晶学的研究 を行うために、本発明のポリペプチドを結晶化することができる。例えば、本発 明の精製組換えポリペプチドを適当な形で結晶化すると、Ｘ−線結晶学による分 子内相互作用の検出が可能になるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、ヒト５ＳＴＲＩおよび２のアミノ酸配列の比較である。アミノ酸はそれ らの１文字省略形で示されている。アステリスク（※）は、同一アミノ酸である ことを、棒（−）は、化学的に類似残基であることを表す。このアラインメント をクローンで表わすために、ギャップを導入した。７つの推定の膜貫通領域（Ｍ ｌ−Ｍ７）が示されている。Ｇ−タンパク質−結合受容体スーパーファミリーに 保存されているアミノ酸残基をボールド文字で示した。

図２は［［ｌ１２！］ヨード−Ｔｙｒ”］−７マトスタチンー１４の、５ＳＴＲ Ｉおよび５ＳＴＲ２を発現しているＣＨＯ細胞への結合を示す。Ａ：ヒト５ＳＴ Ｒ１によってトランスフェクトされた細胞：Ｂ：マウス５ＳＴＲ２によってトラ ンスフェクトされた細胞。データ（２回の測定の平均値）は、阻害物質の不在下 で結合した放射性標識リガンドに関する計算値（対照結合、パネルＡについては １４２５ｃｐｍ、パネルＢについては２０８０ｃｐｍ）に関して規格化され、非 特異的結合（１μＭソマトスタチンー１４の存在下、結合した放射性標識、両方 の場合に２２５ｃｐｍ）に関して補正した。それぞれ、１μＭソマトスタチンー １４の存在下での結合阻害。曲線は結合部位の単一集団とのりガント相互作用に 関してモデル化されている。

図３はヒトおよびマウスのゲノムＤＮＡのサザーンプロット分析の結果を示す。

材料および方法の項に記載のごとく、ヒトおよびマウスのゲノムＤＮＡｌ０μｇ をＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフ ィルターにプロットし、ｓ！Ｐ−標識ヒト５ＳＴＲＩプローブとノゾブリダイズ させた。ヒトおよびマウスの５ＳＴＲＩおよび２遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ断 片は矢印で示されている。

図４はヒト組織内の５ＳＴＲＩおよびＳＳＴＲ２ｍＲＮＡのノーザンプロット分 析の結果を示す。全ＲＮＡ２０μｇをグリオキザールで変性し、１％アガロース ゲルで電気泳動し、ナイロンメンプランにプロットし、３２ｐ−標識ヒト５ＳＴ Ｒ１（Ａ）またはヒト５ＳＴＲ２（Ｂ）プローブとハイブリダイズさせた。

好ましい実施態様の説明 以下に詳細に説明するように、本発明の組成物および方法は、受容体分子の正確 な配列の起源に無関係に、一般的にソマトスタチン受容体に適用可能である。

従って、以下に使用し説明する多くの一般的に適用可能な技術がある。さらに、 ヒトおよびマウス起源の、幾つかの特殊なソマトスタチン受容体ポリペプチドへ の、該一般的方法の適用可能性を例示する。

宿主細胞培養およびベクター類 勿論、まず、ＤＮＡ配列のクローニングおよび本発明に有用なベクターの構築に は、一般に、原核性宿主が好ましい。例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉＫ　１２株は特に 有用である。使用可能な他の微生物株には、例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉＢおよびＥ 、　ｃｏｌｉＸｌ　７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、３１５３７）がある。勿論、これ らの例は、制限を意図するものでなく、例示に過ぎない。

発現にも原核性細胞が使用できる。上記の株、並びにＥ、　ｃｏｌｉＫ３１１０ 　（Ｆ−、ラムダ、栄養要求性、ＡＴＣＣＮｏ、２７３３２５）　、例えば、Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｕｓのようなパンラス、または５ａｌｉ＋ｏｎｅ ｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたは５ｅｒｒａｔｕｓ　ｍａｒｃｅｓａｎｓ のような他の腸内細菌、あるいは様々なｐ　５ｅｕｄｏｓｏｎａｓが使用できる 。

通常、宿主細胞に適合する種から導かれたレプリコンおよび制御配列を有するプ ラスミドベクターを、これらの宿主細胞と一緒に用いることが好ましい。ベクタ ーは普通、複製部位、並びに形質転換された細胞内で表現型選択を可能にするマ ーキング配列を与える。例えば、Ｅ、　ｃｏ］ｉは、一般に、Ｅ、　ｃｏｌｉ種 から導かれたｐＢＲ３２２［ポリバーら（Ｂｏｌｉｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　 １９７７］を用いて形質転換される。ｐＢＲ，３２２はアンビンリンおよびテト ラサイクリン耐性のための遺伝子を有し、従って、形質転換された細胞を容易に 同定する方法を提供する。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物プラスミドまたは ファージは、それ自身のタンパク質の発現のために微生物機構が用いるプロモー ターを有するか、有するように改変されねばならない。

組換えＤＮＡ構築に最も普通に用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ （ベニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム［チャンら（Ｃｈａ ｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　）　１９７８；イタクラら（Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ 、　）　１９７７；ゲラデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌｅｔ　ａｔ、）　１９７９；　 Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０１およびトリプトファン（ＴＲＰ） プロモーター／ステム［ＥＰＯＡＰＰＩ、　Ｐｕｂｌ、　Ｎｏ、　００３６７７ ６：　シーベンリスト（Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、　）　１９８０ １が含まれる。これらは最も普通に用いられるが、他の微生物プロモーターも発 見され、用いられ、その詳細なヌクレオチド配列は公開されており、当業者はそ れらをプラスミドベクターと機能的に連結（ｌｉｇａｔｅ）することができる（ Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０）。

原核性微生物に加えて、酵母培養のような真核性微生物も用いることができる。

真核性微生物のうち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅま たは普通のパン酵母が最も一般的に用いられるが、多くの他の株も普通に用いる ことができる。５ａｃｃｈａｒｏ■ｙｃｅｓ内での発現のためには、例えば、プ ラスミド’に’Ｒｐ７が一般に用いられるしメンコムら（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ 　ｅｔ　ａｌ、　）　１９７９；キンゲスマンら（Ｋｉｎｇｓｍａｎ　ｅｔ　ａ ｌ、）　１９７９：チェンバーら（Ｔｓｃｈｅ＋ａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　１ ９８０１　ｏこのプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の 突然変異体株、例えば、ＡＴＣＣＮｏ、４４０７６またはＲＥＰ４−１、に選択 マーカーを与える廿ｐ１遺伝子を既に含有している（Ｊｏｎｅｓ、　１．９７７ ）。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ損傷の存在は、トリプトファン の不在下に増殖することによって形質転換体を検出する有効な環境を提供する。

酵母ベクター内の適当な促進配列（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）に は、３−ホスホグリセラードキナーゼ［ヒララマンら（Ｂｉｔｚｍａｎ　ｅｔ　 ａｌ、）　１９８０］　、または例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３ −リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、 ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグ リセラードムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホ スホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ等の他の解糖酵素類［ヘスら（Ｉ ｌｅｓｓ　ｅｔ　ａｉ、）　１９６８；ホランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ　ｅｔａｌ 、）　１９７８］のためのプロモーターが含まれる。適当な発現ベクターの構築 には、ｍＲＮＡのポリアデニル化と停止のために、発現ベクター内の、発現が望 まれる配列の３゛側にこれらの遺伝子を伴う終止配列を連結する。増殖条件によ って転写がコントロールされるという利点を有する他のプロモーター類は、アル コールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸ホスフアターゼ、窒素代謝 に関連した分解酵素、および上記の、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ ゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関連する酵素類のプロ モーター領域である。酵母に適用可能なプロモーター、複製起点、および終止配 列を含有する任意のプラスミドが好ましい。

微生物に加えて、多細胞生物からの細胞の培養物も宿主として用いられる。基本 的には、を推動物または無を推動物のいずれでも、そのような細胞培養は有用で ある。しかしながら、を推動物細胞に興味があり、培養（組織培養）によるを推 動物細胞の増殖は、最近では日常的な工程となっている［クルス（Ｋｒｕｓｅ） およびペーダーリン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）　１９７３］。そのような有用な宿主 細胞系の例として、ＡｔＴ−２０、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、およびＷ２Ｂ５、ＢＨＫ、Ｃ０８Ｍ６、ＣＯ ３−７，２９３、およびＭＤＣＫ細胞系を挙げることができる。そのような細胞 のための発現ベクターは通常、任意の必要なリポソーム結合部位、ＲＮＡスプラ イス部位、ポリアデニル化部位、および転写終止配列と共に、（所望により）複 製起点、発現されるべき遺伝子の前に位置するプロモーターを含有する。

哺乳類細胞内での使用のための発現ベクターのコントロール機能は、しばしばウ ィルス性物質によって提供される。例えば、通常用いられるプロモーターはポリ オーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス、そして最も頻繁には、シミ アンウィルス４０　（ＳＶ４０）から導かれる。ＳＶ４０ウィルスの早期および 後期プロモーター類は、ＳＶ４０ウィルス複製起点をも含有する断片としてウィ ルスから容易に手に入るので、特に有用である［ファイヤースら（Ｆｉｅｒｓ　 ｅｔ　ａｌ、　）１９７８コ。ＳＶ４０のＨｉｎｄＩＩＩ部位からウィルス複製 起点のＢｇ１１部位に至る約２５０ｂｐの配列を含有する限り、より小さいか大 きい、ＳＶ４０断片も用いられる。さらに、通常、所望の遺伝子配列を伴ってい るプロモーターまたはコントロール配列も、該コントロール配列が宿主細胞系に 適合する限り、その使用は可能であり、しばしば望ましい。

複製起点はＳＶ４０または他のウィルス起源（例、ポリオーマ、アデノ、■ＳＶ 、ＢＰＶ、ＣＭＶ）から導かれる外因性起点をベクターの構築により提供するか 、または宿主細胞染色体複製機構から提供される。ベクターが宿主細胞の染色体 に組み込まれる場合、しばしば後者で十分である。

ｐ　ＣＭ　Ｖ真核発現ベクター ｐｃＭ■プラスミドは本発明における特殊な用途を持つ一連の哺乳類発現ベクタ ーである。このベクターは実質的に全ての培養細胞における使用のために設計さ れたものであり、ＳＶ４０で形質転換されたサルＣＯ５細胞系では極めてよ（作 用する。ｐｃＭＶｌ、２．３および５ベクターは各プラスミド中で前記ポリリン カー領域におけるある種の独特な制限部位について互いに相違する。ｐＣＭｖ４ ベクターはこれら４種のプラスミドとはポリリンカーより前の配列中に翻訳エン ハンサ−を含む点で相違する。これらは一連のｐｃＭＶ１〜５のベクターから直 接誘導されたものではないが、機能的に類似なｐＣＭＶ６ｂおよびＣベクターは カリフォルニア州エマリービルのチロン社から購入でき、ポリリンカー領域の向 きが互いに逆である点を除いて同一である。

ｐＣＭＶプラスミドの共通な成分は次の通りである。ベクターのバックボーンは ｐＴＺ１８Ｒ（ファルマンア社）であり、単一鎖ＤＮＡ産生のためのバクテリオ ファージｆ１複製起点およびアンピンリン耐性遺伝子を含む。ＣＭＶ領域は強力 な促進制御領域であるヒトのサイトメガロウィルス（Ｔｏｗｎｅ株）のメジャー 即時型初期遺伝子（Ｔｈｏｍｓｅｎなど、１９８４；Ｂｏｓｈａｒｔなど、１９ ８５）の−７６０から＋３までのヌクレオチドからなる。ポリリンカー領域はア プライド・ピオンステム社の機器でも合成しうる。ヒト生長ホルモン断片（ｈＧ Ｈ）はこの遺伝子（Ｓｅｅｂｕｒｇ、１９８２）の配列１５３３から２１５７ま でが示す転写停止およびポリアデニル化シグナルを含む。この断片にはＡｌｕ中 間反復ＤＮＡ配列がある。最後に、ＳＶ４０複製起点およびｐｃＤ−Ｘプラスミ ド（ＢｉｎｄｌｌからＰｓｔｌまでの断片）から誘導される早期型領域プロモー ター−エンハンサ−は（Ｏｋａｙａｍａなど、１９８３）に記載がある。この断 片におけるプロモーターは転写がＣＭＶ／ｈＧＨ発現カセットから遠ざかる向き に進行するような方向に向いている。

ｐｃＭｖプラスミドは制限酵素部位がポリリンカー内で独特であることおよび翻 訳エンハンサ−の存在または不在により互いに区別される。出発ｐＣＭＶ１プラ スミドは進行的に修飾されてポリリンカー中の部位数の増加で独特となった。

ｐＣＭＶ２を創るために、ｐｃＭＶｌの２個のＥｃｏＲ１部位の１個を破壊した 。

ｐＣＭ〜′３を創るために、ｐｃＭＶｌを５Ｖ４０ｆＪ域から短いセグメント（ ＳｔｕｌからＥｃｏＲＩ）を除去してポリリンカー中のＰｓｔｌ、５ａｌｌおよ びＢａｍＨ１部位が独特になった。ｐ　ＣＭ　Ｖ　４を創るため、ｍＲＮＡの５ °−非翻訳領域に対応するＤＮＡの合成断片を〜’ＭＶプロモーターから転写し た。配列は蛋白質合成における開始因子のための要件を減少させることによって 翻訳エンハンサーとしての役をする（Ｊｏｂｌｉｎｇなど、１９８７　；Ｂｒｏ ｗｎ　ｉｎｇなど、１９８８）　。ｐＣＭＶ５を創ルタメ、ｐｃＭＶｌの５Ｖ４ ０起源領域からＤＮＡのセグメント（ＨｐａｌからＥｃｏＲＩ）を除去して出発 ポリリンカー中のすべての部位を独特にした。

ｐＣＭＶベクターはサルのＣＯ５細胞、マウスのＬ細胞、ＣＨＯ細胞およびＨｅ Ｌａ細胞で用いられた。数種の互いの比較において、それらはＣＯ８細胞ではＳ Ｖ４０を背景とするベクターよりも５倍から１０倍高い発現水準を与えた。ｐＣ Ｍ〜７ベクターはＬＤＬ受容体、核因子１、Ｇ、α蛋白質、蛋白質ホスファター ゼ、ンナブトフィンン、ンナブンン、インツユリン受容体、流感へマグルチニン 、アンドロゲン受容体、ステロール２６−ヒドロキシレース、ステロイド１７− および２１−ヒドロキシレース、チトウロームＰ−４５０オキシドレダクテース 、ベーター交感神経作用性受容体、葉酸受容体、コレステロール側鎖分解酵素、 および他のｃＤＮＡ類の宿主を発現するために用いられた。これらのプラスミド 内のＳＶ４０プロモーターは優性に選択可能なマーカーのような他の遺伝子を発 現するためにも用いることができることは注目すべきである。最後に、Ｈｉｎｄ ｌｌとＰｓｔｌの部位の間にあるポリリンカー内には偽翻訳開始を起こすＡＴＧ 配列がある。このコドンは発現プラスミドでは可能であれば避けるべきである。

親のｐＣＭＶｌおよびｐＣＭＶ４ベクターの構造および使用を記載した報告が出 版されている（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎなど、１９８９ｂ）。

核酸バイブリド化の態様 前記のように、ある側面では、本発明が提供するＤＮＡ配列情報は選ばれたソマ トスタチン受容体遺伝子の遺伝子配列と特異的にバイブリド化する能力を持つ相 対的に短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列を産生させる。これらの側面で、たとえ ば配列番号１．３．５．７．９または１１に示す配列のような、適当な長さの核 酸プローブは選択されたソマトスタチン受容体配列の考慮に基づいて製造される 。そのような核酸プローブをソマトスタチン受容体遺伝子配列に特異的にハイブ リド化する能力は種々の態様において特定的な用途を与える。最重要には、与え られた標品内の相補的配列の存在を検出するための種々の検定法にプローブを用 いることができる。しかし、突然変異体積プライマーの製造のための配列情報の 使用または他の遺伝子的構築物生産における使用のためのプライマーを含む、ど ちらの使用も想到できる。

本発明によるある利益を得るために、バイブリド化研究または検定のために用い る好適な核酸配列は、配列番号１．３．５．７．９または１１のようなソマトス タチン受容体配列の少な（とも１４から４０位のヌクレオチド鎮に相補的である 配列を含む。長さが少なくとも１４ヌクレオチドというサイズは断片が安定で選 択的な二重らせん分子を形成するに十分な長さであろうことを確実にするのに役 立つ。長さが１４塩基より大きい鎖への相補的配列を持つ分子は一般に好適であ り、ハイブリッドの安定性および選択性を増すために、および得られる）−イブ リッド分子の品質と程度を改善するために、より長い／％イブリド化分子を用い つる。所望の場合、１４から２０ヌクレオチドまたはさらに長い遺伝子−相補的 鎖を持つ核酸分子を設計するのが一般に好まれる。そのような断片は、例えば、 直接化学的手段により、ここに参考として引用する米国特許第４６０３１０２号 のＰＣＲ技術のような核酸再生産技術の応用により、または組換え生産のために 選択した配列を組換えベクターへの導入により容易に製造しうる。

それ故、本発明のヌクレオチド配列は遺伝子の相補的鎖と二重らせん分子を選択 的に形成するその能力のために用いつる。想到した応用に従い、標的配列のため のプローブの種々の程度の選択性を達成するため、種々のハイブリッド化条件の 採用が望ましい。高度の選択性を要する応用のためには、ハイブリッドを形成す るために、一般に相対的に厳密な条件を採用することが望ましい。例えば、５０ ℃〜７０℃で０．０２Ｍ〜０．１５Ｍ−ＮａＣ１によって得られるような相対的 に低塩および／または高温度条件、を選択するであろう。これらの条件は殊に選 択的であり、プローブと鋳型または目的鎖との間のミスマツチは、あっても僅か しか許さない。

勿論、ある種の応用のためには、例えば、背景となる鋳型にバイブリド化した突 然変異体プライマー鎖を用いて突然変異体を生産することを望む時、または関連 物、官能均等物のようなものの配列をコードするソマトスタチン受容体を分離し ようとする時には、ヘテロ二重らせんの形成を許すために厳密さがより少ないバ イブリド化条件が典型的に必要とされるであろう。この場合には、２０℃から５ ５℃の範囲の温度で０．１５Ｍ〜０，９Ｍ塩のような条件を採用することを望み つる。その際、交差−ハイブリッド物は対照バイブリド化に対して陽性にバイブ リド化したノブナルとして容易に特定することができる。どの場合も、高温と同 様にしてハイブリッド二重らせんを不安定化するために役立つホルムアミドの量 を増加して添加することにより、条件はさらに厳密にすることができることは一 般的に認識されている。かくして、バイブリド化条件は容易に再現され、一般に は所望する結果に依存して選べる方法になるであろう。

ある種の態様において、本発明の核酸配列をバイブリド化を測定する標識のよう な適当な手段と組合わせて採用することが有利であろう。検出しつるシグナルを 与えることのできる放射性、酵素的またはアビジン／ビオチンのような他のリガ ンドを含む広範な種類の適当な標識手段が当業界で知られている。好適な態様に おいては、放射能または他の環境的に望ましくない試薬の代わりにウレアーゼ、 アルカリホスファダーゼまたはパーオキシダーゼのような酵素タグを採用するこ とを望むようである。酵素タグの場合、相補的核酸含有標品との特定のハイブリ ッド化を特定するヒトの眼または分光光学的に可視である方法を与えるために採 用できる熱量測定されるインディケータ−基質が公知である。

一般に、ここに記載するハイブリッド化プローブは液相および固相を用いるハイ ブリッド化の両態様における試薬として有用であることが想到される。固相を含 む態様では、被検ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）は選択されたマトリックスまたは表 面に吸着か、でなければ結合される。この結合した単一鎖核酸に次に選択したブ ローブで所望の条件下に特定のハイブリッド化を行う。選択した条件は必要な特 定の限定（例えば、Ｇ十Ｃ含量、標的核酸の型、核酸の起源、バイブリド化プロ ーブのサイズなどに依存する）に基づく特定の環境に依存するであろう。非特異 的に結合したプローブ分子を除くためにハイブリッド化表面を洗浄後、ラベルを 用いて特異的ハイブリッド化を検出するか、または定量する。

生物学的機能が均等なアミノ酸残基 前記の通り、所望の場合にはソマトスタチン受容体ポリペプチドの構造に修飾お よび変化を加えて、同様なまたはそうでなくてもさらに望ましい性質を持つ分子 を得ることができる。そのような変化は野生型分離体に存在しうるかまたは以下 に記載するような部位特異的突然変異誘発を用いて合成的に導入しつる。

例えば、蛋白質構造におけるある種のアミノ酸残基を、抗体の抗原結合領域のよ うな構造（または、たとえば、基質分子の結合部位）の反応性結合能に認めつる 減少なしに他のアミノ酸残基に置換しうる。蛋白質の生物学的機能の活性を決定 するのは反応性結合能および蛋白質の性質であるから、蛋白質配列（または、も ちろん、その背景となるＤＮＡコード配列）にある種のアミノ酸配列置換をして も、同様なまたは対抗する性質（たとえば、アンタゴニスト対アゴニスト）を持 つ蛋白質を得ることさえできる。発明者は種々の変化をペプチドの配列（または 背景となるＤＮＡ）にもたらしうると考えている。

蛋白質における生物学的反応性機能を与えることについてのアミノ酸残基の親水 性係数の重要性は、ここに参考のために引用するＫｙｔｅなと（１９８２）また はＨｏｐｐの米国特許第４５５４１０１に、ある種のアミノ酸残基は同様な親水 性係数またはスコアを持つ他種アミノ酸残基と同様な生物学的活性を保持しつつ 置換しうることを発見したと一般的に論述されている。次表に示すのは、アミノ 酸残基に与えられた親水性と電荷の性質に基づ（アミノ酸残基の親水性係数であ る。アミノ酸残基の相対的な親水性の性質が、得られる蛋白質の第二次構造を決 定し、それによって蛋白質と基質分子との相互作用を決定すると信じられている 。

アミノ酸残基　親水性係数　アミノ酸残基　親水性係数イソロイノン　４５　セ リン　−０．８バリン　４．２　チロノン　−１，３ ０インン　３．８　プロリン　−１，６・フェニルアラニン　２８　ヒスチジン 　−３．２ンステイン／ンスチン　２５　グルタミン酸　−３，５メチオニン　 １．９　グルタミン　−３，５７ラニン　１．８　アスパラギン酸　−３，５グ リノン　−０４アスパラギン　−３．５スレオニン　−０，７リジン　−３９ トリプトフアン　−０９アルギニン　−４５アミノ酸残基の親水性係数が基礎と なるアミノ酸残基の値と±２、より好ましくは±１以内にある時には、この変化 は同様な、また多分改良された機能的活性を持つ蛋白質を与えることが提案され ている。それで、例えば、親水性係数＋４゜５を持つイソロイシン残基はバリン 残基（＋４．　２）またはロイシン残基（＋３゜８）に置き換えても、同様な生 物学的活性を持つ蛋白質を得ることができると提案されている。また、このスケ ールの逆の末端ではりジン残基（−３，９）はアルギニン残基（−４，５）など に置き換えることができると提案されている。

従って、これらのアミノ酸残基置換は一般にはＲ基置換基の相対的な近似性、例 えば大きさ、親電子的性質、電荷などの側面に基づいている。一般に、前記種々 の性質を考慮に入れた置換例は次のものを含む：Ａｈａ　Ｇｌｙ；Ｓｅｒ　Ｉｌ ｅ　Ｌｅｕ；ＶａｌＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ；ＶａｌＡｓｎ　Ｇｌｎ； Ｈ４ｓ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＡｓｐ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ：Ｌｅｕ：ＴｒｙＣｙ ｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　５ｅｒ Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ Ｇｌｙ　Ａｈａ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ；ＰｈｅＨｉｓ　Ａｓｎ；Ｇｌｎ　Ｖａｌ　ｌ ｉｅ；Ｌｅｕ部位特異的突然変異誘発は背景であるＤＮＡの特異的な突然変異誘 発によってその配列から誘導された第二世代蛋白質または生物学的機能的に均等 な蛋白質またはペプチドの製造に有用な技術である。前記のように、この変化は アミノ酸残基置換を望む時には好ましいであろう。この技術はさらに、例えば、 前記考慮の１つまたはそれ以上を導入してＤＮＡにヌクレオチド１個またはそれ 以上の配列変化を導入することによって、配列変種を製造し、試験する容易な能 力を提供する。部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異ならびに十分な数の 隣接ヌクレオチドのＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列を用 いることにより、欠失連結部の両側を横断する安定な二重らせんを形成するため に十分な大きさと配列のプライマー配列を与え、突然変異体の製造を可能にする 。典型的には、長さ約１７から２５ヌクレオチドであって、変えるべき配列の連 結部の両側的５から１０残基を有するプライマーが好適である。

一般に、部位特異的突然変異誘発は当業者によ（公知であり、例として、Ａｄｅ 　Ｉｍａｎなど（１９８３）を挙げられる。認識されるように、この技術は典型 的には一重鎖および二重鎖型の両方で存在するファージベクターを採用する。部 位特異的突然変異誘発に有用な典型的なベクターはＭ１３ファージ（Ｍｅｓｓｉ ｎｇなど、１９８１）のようなベクターを含む。これらのファージは商業的に容 易に入手可能で、使用法は当業者には一般的に公知である。

一般に、本文の部位特異的突然変異誘発で、第一にその配列内に選択したソマト スタチン受容体ポリペプチド配列の全部または一部をコードするＤＮＡ配列を含 む一重鎖ベクターを製造する。所望の突然変異配列を持つオリゴヌクレオチドブ ライマーを一般的には合成的、例えば、Ｃｒｅａなと（１９７８）の方法、によ り製造する。このプライマーを次に一重鎖ベクターにアニールして大腸菌ポリメ ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片のようなりＮＡ重合酵素を作用させて突然変異を保 持した鎖の合成を完了する。それで、一方の鎮が元の非突然変異配列をコードし 、第二の鎮が所期の突然変異を持つヘテロ二重鎖を形成する。このヘテロニ重鎮 ベクターを用いて次に大腸菌細胞のような適当な細胞を形質転換し、突然変異が 誘発された配列を持つ組換えベクターを含むクローンを選択する。

スクリーニング検定法 本発明の重要な側面の一つは受容体の機能を阻害またはそうでなければ修飾また は変更しうる物質を特定するためのスクリーニング検定法における組換え的に製 造したソマトスタチン受容体ポリペプチドの使用である。組換え的に製造した受 容体の使用は天然起源の受容体は極少量しか存在せず、精製が困難であることが 証明されているので殊にに有益である。さらに、これはヒトの受容体、殊に今ま でにはなかったヒト膵臓の小島受容体、の入手を容易にした。本発明者はヒト受 容体ポリペプチド配列はマウスのような他種から得た受容体とは僅かに異なり、 その上、種々のソマトスタチン受容体ポリペプチド（ＳＳＴＲＩ〜３）が互いに 相違することを発見した。この重要性は極めて明瞭である。それが、たとえば、 ヒトの酵素を阻害を機能する、化合物をめて探す時、スクリーニング検定法には ヒトの受容体ポリペプチドを用いるべきであり、殊に、問題のヒトに特異的な５ ＳＴＲを用いることが望まれるからである。

本発明のスクリーニング検定法は、好適な態様では、それが生産された組換え宿 主から直接に得た受容体ポリペプチドを採用することが有利である。これは最も 好ましくは単に選択したポリペプチドを組換え宿主、典型的には真核宿主、内に 発現させ、続いて酵素を含む粗製ホモジエネートを製造して達成される。粗製ホ モジェ不一トの一部を次に受容体の適当なエフェクター、たとえば、ソマトスタ チン、オクトレオチド、など（たとえば、ここに参考のために特に引用するＬａ ｍｂｅｒｔＳなど、ソマトスタチンおよびその類似体の癌の診断および処置にお ける役割、Ｅｎｄｏｃ　ｒ　１ｎｅ−Ｒｅｖ　ｉ　ｅｗｓ１１２　（４）：　４ ５０〜４８２、参照）を検定すべき候補物質と共に混合する。候補物質の存在下 または不在下での選択したエフェクターの結合を比較して、候補物質の結合性能 に関する情報を得ることができる。

本発明のスクリーニング検定法は殆どソマトスタチンの望ましい側面を模倣しつ つ、このホルモンの望ましくない側面を排除しながら有用な試薬を特定するため に設計されるであろうから、好適な検定は通常のエフェクターとしてソマトスタ チンを採用するであろう。

本発明の受容体ポリペプチドへの候補物質の効果を測定するために採用される広 範な態様があり、本発明は、その方法のどの一つにも限定されないと信じる。

しかし、結合されるべき受容体ポリペプチドの性能を測定できる系を採用し、ま た、特定物質に採用するエフェクターにより修飾することは、一般に好ましいで あろう。採用し得る一方法では、得られるエフェクター／受容体錯体において定 量的に保持されるように標識された標識エフェクターを用いる。有利な方策には ＋１Ｓ１．　＋４（，３Ｈのような放射能標識であって、エフェクターおよび得 られる錯体の双方で直接定量しうる。

好適な検定において、蛋白質、エフェクターおよび候補物質を含む混合物を所定 の時間インキュベートし、得られたインキュベート混合物を混合物中に残存する 非結合エフェクターを生成したエフェクター／受容体錯体から分離するための分 離法にかける。次に、各々、たとえば候補化合物を添加しなかった対照に対して 、各々の量を単純に測定する。速度データをめる時はこの測定を種々な時点で行 う。これから、受容体の機能を変化または修飾する候補物質の性能を測定しうる 。

エフェクター／受容体錯体からエフェクターを分離するために採用することので きる多数の技術が公知であり、そのような方法は、すべて本発明の範囲内に含ま れるものである。薄層クロマトグラフィー法（ＴＬＣ）　、ＨＰＬＣ，分光光学 術、ガスクロマトグラフィー／質量分析術またはＮＭＲ分析の使用。この技術は どれもエフェクターと錯体とを分別できる限り、そして基質および生成物を特定 または定量することによるような酵素機能の測定に用いることができる限り、採 用できると認識される。

エフェクター／受容体錯体それ自身も、Ｘ線結晶解析のような技術の対象である 。候補物質が医薬の作用機序としてエフェクター分子と置き替わるとき、置き替 えおよびその受容体への効果を観察するために設計された研究は殊に有益となろ う。

実施例 実施例は本発明の好適な繋様を例示するために記載する。下記実施例のある種の 側面は本発明の実施においてよく作動するように本発明者によって発見または意 図された技術および操作について記載される。これらの実施例は発明者の標準的 な実験室的慣例を使用して例示する。本開示および当業者の一般的水準に照らし 、以下の実施例が説明のみを意図したものであり、本発明の本質と範囲から逸脱 することなしに無数の変化、修飾および改変を採用できることを当業者は認識方 法をＳａｍｂｒｏｏｋなど（１９８９）に記載され、および前に報告された（Ｆ ｕｋｕｍｏｔｏなど、１９８８）ように実施した。ヒト膵臓小島をＡＳＭ消化お よびＦｉｃｏ１１精製により、無菌的製造法を用い、−管当り２００００小島づ つを凍結し、−７０℃（この物質はｌ５ｌｅｔ”ｒ’ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ ｏｎ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ワシントン大学医学部、セントルイス、ＭＯ６３ １１０から最も容易に入手しつる）に維持した。チオシアン酸グアニジニウム／ ＣｓＣ１法（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、１９８９）を用いてＲＮＡを分離した。

ＤＮＡ配列決定は適当なりＮＡ断片をＭ１３ｍｐｌ　８または１９にサブクロー ニング後にジデオキシヌクレオチド鎮終結法（Ｓａｎｇｅｒなど、１９８０）に より、行った。開鎖とも配列決定した。

全ヒト膵臓小島ＲＮＡ１０μｇをオリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＡＭＶ−逆転 写酵素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　・Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ社 、タンパ、ＦＬ）とを用いて逆転写した。Ｇ蛋白質と共役する受容体に関する配 列をＰＣＲとＬｉｂｅｒｔなど、１９８９に記載の変性オリゴヌクレオチドブラ イマーとを用いて増幅した。ＰＣＲ生成物を１％低低融湿温アガロースゲル上で 分離し、４００塩基対と５００塩基対の間のＤＮＡ断片をアガロースから溶出し 、Ｍ１３ｍｐ１８に連結し、配列決定した。ｈＧＰＲ８１と命名した新規Ｇ蛋白 質共役受容体をコードするＰＣＲ生成物をニックトランスレーションにより３２ Ｐで標識し、これをヒトゲノムライブラリー（Ｌａｗｎなど、１９７８）を検索 するために用いてこの新種の７−貫膜ファミリーの受容体をコードする遺伝子を 分離した。標準的バイブリド化条件［４２℃：１６時間、５０％ホルムアミド、 ５ｘＳＳＣ１２×デンハート溶液、２０ｍＭ−燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６， ５，０，１％ドデンル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌ超音波照射および変性 鮭精巣ＤＮＡおよび１０％硫酸デキストラン（Ｋａｙａｎｏなど、１９８８）コ を用い、濾過体をオートラジオグラフィーの前に５０℃でＯ，ｌＸ５ＳＣおよび ０゜１％ＳＤＳ中で洗浄した。マウスの５ＳＴＲＩおよびヒトおよびマウスの５ ＳＴＲ２遺伝子をヒトおよびマウスのゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ社、ラホヤ、ＣＡ）から前記のハイブリッド化によって分離した。

発現技術 ヒト５ＳＴＲＩ遺伝子の１．　５　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ／Ｘｍｎ　Ｉ断片およびマウ ス５ＳＴＲ２遺伝子の１．２ｋｂ−Ｘｂａｌ断片をそれぞれ哺乳類発現ベクター ｐ　ＣＭＶ　６ｂおよび５ｃ　（Ｃｈ　ｉ　ｒｏｎ社、エマエリ−ビル、ＣＡ、 のＢ、Ｃｈａｐｍａｎ博士の提供）に導入した。得られた構築物をｐ　Ｓ　Ｖ　 ２　ｎ　ｅ　ｏとともにジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ）細胞系、ＤＧ４４にリポフエクチン試薬（ＧＩＢＣＯ・ＢＲＬ、ガイ ザースバーグ、ＭＤ）を用いて共（コ）トランスフェクトした。安定なトランス フェクトントを選び、Ｇ４１８４００ｕｇ／ｍ］を含むａ−ＭＥＭ　（ＧＩＢＣ Ｏ−ＢＲＬ）中に保持した。各細胞系を６穴の直径３５ｍｒｎ板に３７℃で密集 成長させた。細胞を１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ。

５ｍＭ　ＫＨｚＰＯ４，５ｍＭ−ＭｇＣ］、、１５０ｍＭ−ＮａＣ］および１％ （Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン（全てｐＨ７，４）を含む緩衝液で洗浄し、同じ 緩衝液中、２２℃に３０分間２２℃で安定化した。細胞をバチドラジン（１ｍｇ ／ｍｌ）および「口」２５］　−３−ドーＴｒｙ”］　−］ソフトスタチンー１ ４（５００００ｃｐｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、アーリントンハイツ、ＩＬ）単独 、またはソマトスタチン−１４またはソマトスタチン−２８（Ｂａｃｈｅｍ、フ ィラデルフィア、ＰＡ）とともに含む緩衝液１ｍｌ中で図２に示す濃度で３０分 間２２℃で二種のインキュベートをした。インキュベートした細胞を水冷緩衝液 ２ｍｌで２回洗浄し、３Ｍ−酢酸中の８Ｍ−尿素１ｍｌで溶解した。懸濁した細 胞を管に移し、穴を同一溶液１ｍｌで洗浄し、集めた抽出物の放射能をガンマ・ カウンターを用いて測定した。

クローニングの結果 Ｇ蛋白質−共役受容体をコードするヒト膵臓小島ＲＮＡ中のメツセンジャーＲＮ Ａ配列を前記のようにＰＣＲ法を用いて増幅した。ＰＣＲ生成物をクローンして 、配列を決定し、二つの推定上の新規受容体をコードするクローンを得、ｈＧＰ Ｒ８１および１５と命名した。配列決定した２４個の異なるクローンのうち、１ ９個はｈＧＰＲ８１を、および３個はｈＧＰＲｉ５をコードしており、残りのク ローン２個の配列はＧ蛋白質共役受容体スーパーファミリー（Ｄｏｈｌｍａｎな ど、１９９１）のメンバーものとは無関係であった。Ｇ蛋白質共役受容体をコー ドする遺伝子はイントロンを欠損することが多い（Ｋｏｂｉｋａなど、１９８７ ）ので、これらの２個の新受容体をコードする遺伝子を分離して配列決定した。

ｈＧＰＲ８１をコードするゲノム断片の配列は３９１アミノ酸残基をコードする １１７３ｂｐの開いた読み枠（配列番号１および２参照）を示した、Ｍ、＝４２ ６５７゜ この蛋白質は７個の推定上の膜貫通ドメインおよび第一の膜スパニングセグメン トの前にある細胞外ＮＨ２−末端セグメントを持ち、３個のＮに結合するグリコ ジル化のための共通部位を持っ（Ａｓｎ’、Ａｓｎ”およびＡ　ｓ　ｎ　”）。

細胞内にあると予言されている領域には２個の環状ＡＭＰ−依存性蛋白質カイネ ース（Ｋｅｍｐなど、１９９０）（Ｔｈｒ””およびＳ　ｅ　ｒ”’）　＋７＋ ための推定上の燐酸化部位がある。細胞内Ｃ０ＯＨ末端ドメインもセリンおよび スレオニンが豊富であってセリン／スレオニン蛋白質カイネース（Ｓｉｂｌｅｙ など、１９８７）のための基質として役立っているかもしれない。加えるに、Ｇ 蛋白質共役受容体スーパーファミリー内に保存されている数個のアミノ酸残基（ Ｄｏｈｌｍａｎなど、１９９１；Ｆｉｎｄｌａｙなど、１９９０）もｈＧＰＲ８ １に保存されている（図１）。

ｈＧＰＲ８１がイントロンを欠く遺伝子によってコードされていることを確認す るため、マウス同族体のための遺伝子を分離し、配列決定した。ヒトおよびマウ ス蛋白質のアミノ酸残基配列の間には９９％の同一性があった。この高度の配列 同一性はこの蛋白質の全ドメインが機能的に重要であることを示唆する。

発現結果 膜貫通セグメントＭＳ−Ｍ６を結合する短い細胞質ループの存在はペプチドホル モンとニューロペプチドを結合するＧ蛋白質共役受容体の特徴（Ｅ、　Ｍ、　Ｒ 。

ＳＳ、１９９０）なので、膵臓小島からのホルモン分泌を調節することが知られ ているペプチドをｈＧＰＲ８１のためのリガンドとして試験した。Ｘｅｎｏｐｕ ｓ・１ａｅｖｉｓのオオサイト（Ｋａｙａｎｏなど、１９９０）に試験管内で転 写したＲＮＡを注入し、ウィルスペプチド［カルシトニン遺伝子関連ペプチド、 胃抑制ポリペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１−（７〜３６アミド ）および血管作動性小腸ベブチドコに反応する基礎または促進ＣへＭＰ濃度の変 化またはＣａ”流出（Ｗｉ　ｌ　Ｉ　ｉ　ａｍｓなど、１９８８）（アンジオテ ンシンＩ　Ｉ。

ボンベシン、コレンストキニンおよびバソブレ／ン）を検定することによりｈＧ ＰＲ８１のためのりガントを特定する最初の試みは不成功であった。放射能標識 ペプチド（ガラニン、グルカゴンおよびソマトスタチン）の一過性にｈＧＰＲ８ １を発現するＣＯ３−７細胞への結合も試みた。

トランスフェクトした細胞を［［Ｉ”’］−ヨードーＴｙｒ］−ソマトスタチン −１４とインキュベートし、板をオートラジオグラフィーにかけた時、過剰の非 標識化ソマトスタチン−１４の添加で競合される陽性のシグナルが検出され、ｈ ＧＰＲ８１がソマトスタチン受容体であることが示唆され、５ＳＴＲＩと命名さ れた。

５ＳＴＲＩの薬理学的性質を、この受容体を安定に発現するＣＨＯ細胞で検討し た。これらの細胞は［［Ｉ”’］−ヨードーＴｙｒ］−ソマトスタチン−１４に ２ａ）がソマトスタチン−２８よりもソマトスタチン−１４について高い親和性 で特異的に結合し、半一最高反応の阻害濃度（ＩＣ５゜）値おのおの１５および ４．７ｎＭを持つことを示した。これらの値はソマトスタチン−１４および−２ ８の親和性として野生型受容体について以前に報告された値（Ｓｒｉｋａｎｔな ど、１９８１　；Ｔｒａｎなど、１９８５；５ｃｈｏｎｂｒｕｎｎなど、１９８ ３）に近似している。

実施例１１　：　５ＳＴＲ２のクローニングおよび発現クローニング技術および 結果 ヒト５ＳＴＲＩプローブのＥｃｏＲＩ消化ヒトＤＮＡのサウザーンプロットへの ハイブリッド化は１４ｋｂに強いシグナルを示し、この値はこの遺伝子を含むＥ ｃｏＲＩ断片に期待される大きさであり、また、〉２３．１８．８．４および７ ．８ｋｂの断片には弱いハイブリッド化を示した（図３）。このプローブはまた 〉２３．１３，５．８．６および８．２ｋｂのマウスＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化に おける多重断片にもバイブリド化する。期待されるものに加えてハイブリダイズ 化断片の存在はアドレナリン作動性およびドパシン作動性受容体について以前に 記載された（Ｋｏｂｉｌｋａなど、１９８７；Ｂｕｎｚｏｗなど、１９８８）よ うに一群のソマトスタチン受容体があることを示唆する。

われわれはヒトおよびマウスのゲノムライブラリーをヒト５ＳＴＲＩプローブで 検索し、第二の推測上のソマトスタチン受容体をコードする遺伝子を分離し、５ ＳＴＲ２と命名した；ヒトおよびマウスの５ＳＴＲ２を含むＥｃｏＲＩ断片はそ れぞれ１８および８．２ｋｂであり、図３に示した。ヒト５ＳＴＲ２遺伝子のヌ クレオチド配列は１１０７ｂｐのオープンリーディングフレームを示し、３６９ −アミノ酸残基蛋白質をコードする（Ｍ、＝４１３０５）（配列番号５および６ 参照）、７個の膜貫通セグメント、細胞外ＮＨ２末端セグメントに４個の推測上 のＮ−グリコリル化部位（Ａｓｎ’、Ａｓｎ”、Ａｓｎ”およびＡｓｎ５２）お よびｃＡＭＰ依存性蛋白質カイネースにより燐酸化され得るもの（Ｋｏｂｉｌｋ ａなど、１９８７）（Ｓｅｒ２５’）１個を持ツ。ヒトとマウスとの５ＳＴＲ２ のアミノ酸残基配列の間には９４％の同一性がある。

ヒ）ＳＳＴＲ１および２のアミノ酸残基配列の比較はこれら２種の受容体の間に ４６％の同一性と７０％の近似性を示した（図１）。同一性最高領域は膜貫通ド メイン、特にＭｌ、Ｍ２およびＭｌにあり、多分、これらの領域はりガント結合 に関与していることを暗示する。５ＳＴＲ２の薬理学的性質は、５ＳＴＲＩとソ マトスタチン−１４および−２８に対する高い親和性については類似している。

ＩＣ５゜値はそれぞれ１．６および５．２ｎＭである（図２ｂ）。

発現技術および結果 ５ＳＴＲＩおよび２の組織分布をＲＮＡブロッティング法により検査した。ヒト ５ＳＴＲ１のｍＲＮＡは大きさ４．８ｋｂであり、空腸および胃で最高濃度を示 しく図４ａ）、ヒト小島ＲＮＡにも容易に検出された（資料提示せず）。低濃度 のＳＳＴＲ１ｍＲＮＡは結腸、結腸癌および腎臓にある。ＳＳＴＲ１ｍＲＮＡは 側頭葉の一部から調製したヒト大脳ＲＮＡのノーザンプロットには検出されなか ったが、マウス全脂から調製したＲＮＡのプロットには容易に見出すことができ 、このサブタイプの受容体は脳で発現されることを示した（資料提示せず）。

５ＳＴＲ２の組織分布は５ＳＴＲＩのそれとは極めて相違した。ヒト８８丁Ｒ２ ｍＲＮＡは大脳および腎臓で最高１度に発現され、両組織において、８．５およ び２．５ｋｂの転写物が５ＳＴＲ２プローブとバイブリド化した（図４ｂ）。低 濃度のＳＳＴＲ２ｍＲＮＡは空腸、肝癌、結腸、結腸癌および肝臓にも検出され た。ＳＳＴＲ２ｍＲＮＡもラットの膵臓小島にも存在しく資料提示せず）、膵臓 小島は５ＳＴＲＩおよび２の両方を発現することを暗示している。

この結果はソマトスタチンの生物学的効果がソマトスタチン受容体ファミリーの 組織特異的発現により媒介されることを示す。クローニングおよびサザンブロト ット研究はこの遺伝子群は多分４メンバーからなることを示す。これらの受容体 のうちの２個、５ＳＴＲＩおよび２の配列およびリガンド結合性能が測定された 。両方ともソマトスタチン−１４および−２８に類似の親和性を持つが、それら の配列は驚くほど相違している。この配列の多様性はその受容体を異なる細胞内 エフェクター系に結合することによる（Ｄｏｒｆ　１　ｉｎｇｅｒなど、１９８ ３；Ｗａｎｇなど、１９８９）ソマトスタチンの多様な生物学的効果（Ｓ、Ｒｅ １ａｈ　Ｉ　ｉｎ、１９８３）に基づくものであろう。５ＳＴＲ１および５ＳＴ Ｒ２（７）クローニングは交差結合分析（Ｓｕｓｉｎ＋など、１９８６；Ｓａｋ ａｍｏｔ。

など、１９８８；Ｋｉｍｕｒａなど、１９８９　；Ｔｈｅ　ｒｍｏｓなど、１９ ９０）により決定されるソマトスタチン受容体の不均質性およびソマトスタチン 機能の機構と調節について分子的根拠のよりよい理解をもたらすであろう。加え るに、これらは特異的な診断および治療的応用（Ａ、Ｖ、５ｃｈａ　Ｉ　Ｉｙ、 １９８８　；Ｌａｍｂｅ　ｒ　ｔ　ｓなど、１９９０）のための選択的な類似体 の開発を加速するに違いない。

実施例１１　Ｔ　：　５ＳＴＲ３のクローニングおよび発現５ＳＴＲ２のクロー ニング発現と同様な方法で、ＥｃｏＲＩ消化ヒトＤＮＡのサザンブロソトへのヒ ト５ＳＴＲＩプローブのハイブリッド化は強いシグナルを、この遺伝子を含むＥ ｃｏＲＩ断片に期待されつる大きさである１４ｋｂに示し、また、〉２３．１８ ．８．４および７．８ｋｂの断片には弱いノ＼イブリ・リド化を示した。このプ ローブは〉２３．１３５．８．６および８．２ｋｂのマウスＤＮＡのＥｃｏＲＩ 消化物中の多重断片にも／１イブリド化した。予期されるものに加えて、ハイブ リッド化断片の存在は、アドレナリン作動性およびド／＜ミノ作動性受容体につ いて以前に記載された（Ｋｏｂｉｌｋａなど、１９８７；ＢｕｎｚＱＷなど、１ ９８８）ようにソマトスタチン受容体のファミリーがあることを示唆する。

ヒトおよびマウスのライブラリーを前記の５ＳＴＲＩプローブで検索して、第三 の推測上のソマトスタチン受容体をコードする遺伝子を分離し、５ＳＴＲ３と命 名し、ヒト５ＳＴＲ３遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片は８，４ｋｂ、マウス遺伝子 のそれは２３ｋｂである。ヒト５ＳＴＲ３遺伝子のヌクレオチド配列は４１８− アミノ酸残基蛋白質配列をコードする少なくとも１２５４ｂｌ）で、オーブン１ ノーデイングフレーム（配列番号９および１０）であることが判明した。マウス ５ＳＴＲ３配列の全１７９４ｂｐ配列（配列番号１１および１２）も同様に得ら れた。

実施例■ｖ：診断的／治療的応用 異なるソマトスタチン受容体蛋白質の分離および精製が可能となったので、与え られて、診断的または治療的な応用に使用するために可能性のある好適な性質を 持つ候補作動薬（アゴニスト）および拮抗薬（アンタゴニスト）のような候補物 質を検索するために設計された方法にこれらの蛋白質を用いることが可能になる 。

例えば、最近（Ｄｏｈｌｍａｎなど、１９９１）により記載されたように、受容 体サブタイプ、Ｇ蛋白質およびエフェクター数の増加につれて、受容体のリガン ド結合およびＧ蛋白質認識の性質解明が診断的および治療的企業にとって重要な 課題となっている。ここに記載する通り、再構成実験は受容体が様々な程度の特 異性で多重（およびある場合には機能的に異なる）Ｇ蛋白質に結合できること（ Ｋａｎａｈｏなど、１９８４）を初めて示した。

例えば、ムスカリン性およびαｚＡＲのクローニングおよび過剰生産が一個の受 容体サブタイプが細胞内で高濃度に発現した時、一つ以上の型のＧ蛋白質と結合 するであろうことを示すに到った。これら受容体の各々について、作動薬処理は アデニルサイクレースの阻害およびホスホイノシチド代謝の刺激の両方を導いた 。最後に、各Ｇ蛋白質は１個以上のエフェクター、Ｇ１、を刺激することが示さ れ、例えば、アデニルサイクレースに加え、カルシウムチャネルを調節している ことが報告されている。これらの著者はこの複雑さおよび表面的な機能の縮重が あると、基本的に重要な問題は如何にして、そして如何なる条件下に、Ｇ蛋白質 が多重受容体からの信号を組織化しそれらを適当なエフェクターに向けることが できるのかであると指摘している。

通常の方法は精製した受容体とＧ蛋白質成分を試験管内でを再構成することであ った。不幸にも、これらの著者が指摘したように、精製法は非常に限られた数の 受容体サブタイプについてのみ成功しており、Ｇ蛋白質も同様である。一方、今 までに特定されたソマトスタチン受容体のクローニングおよび配列決定が本発明 により可能になったので、異型の発現系が、クローンした受容体の特徴付けおよ び受容体−Ｇ蛋白質結合特異性の解明においてより一般的な有用性を有すであろ う。− 最近、この系が酵母細胞内に導入され、ここでは哺乳類のβｚＡＲおよびＧ。

α−サブユニットの遺伝子を共発現する（Ｋ　ｉ　ｎ　ｇなど、１９９０）。ヒ トの組織が達する濃度のどれよりも数百倍高い濃度に達するβｚＡＲの発現およ びリガンド結合は適切な親和性、特異性および立体選択性があることが証明され た。

さらに、β２−ＡＲを介するフェロモン信号トランスダクション経路の活性化は 成育速度の変化、形態学的変化および大腸菌１ａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシデ ースをコードする）に融合したフェロモン反応性プロモーター（ＦＵＳＩ）を含 む数種の判断基準により証明された。

β！ＡＲ及びＧ、αの発現による酵母フェロモン反応の経路を調節する能力には 、このような受容体の構造的および機能的特徴付けを大きく加速する潜在力を持 つ。成長速度またはβ−ガラクトシデース誘導を記録することにより、突然変異 体受容体の性質を速やかに試験できる。加えるに、ここに可能となった分離した 組換えソマトスタチン受容体はソマトスタチンの好ましい性質を持つが、インシ ュリンの阻害またはグルカゴンの放出およびこの逆のようなソマトスタチンの望 ましくない性質を欠いている候補物質を判別できる。さらに、同じソマトスタチ ン受容体ファミリーの他のものよりソマトスタチン受容体蛋白質１種またはそれ 以上と相互作用する選択的能力を持つ候補物質を特定するために前記のような系 を用いることが本出願により可能になった。

そこで、例えば、特定の共通の細胞系にクローンされ、発現された一群のソマト スタチン受容体を用い、そのような一群の受容体蛋白質を様々な候補物質に接触 させることができる。このような検索検定の結果は、例えば、５ＳＴＲＩとは相 互作用をすることができるが、５ＳＴＲ２または５ＳＴＲ３とは相互作用をしな い候補物質暮見つけることを可能にする。

さらに、本出願により可能となった、単離された組換えソマトスタチン受容体と 比較した時、ソマトスタチンの構造−活性相関を研究することが可能になる。

このような研究は個々のソマトスタチン受容体と結合する作動薬および拮抗薬の ような候補物質を特定するめの結合研究を含むばがってなく、それの受容体への 結合とは別に、ソマトスタチン受容体における活性を刺激する候補物質を見出す ための研究をも含む。

その上、Ｄｏｈ　Ｉｍａｎなど、１９９１が指摘したように、推測上のＧ蛋白質 のための他の遺伝子として、本出願により得られる結合受容体が単離され、未確 認遺伝子産物への活性を持つリガンドを確認するための一連のリガンドの検索が 容易にできる。これらの著者が指摘するように、他の関連サブタイプの不在下の 単一受容体の発現はしばしば野生型哺乳類細胞では達成不能である。そこで、微 生物中または内在受容体を欠く分離真核細胞中での発現はサブタイプ選択的薬物 （Ｍａｒｕｌｌｏなど、１９８８　：Ｐａｙｅｔｔｅなど、１９９０　；Ｋｉｎ ｇなど、１９９０）の探索または評価のために有用である。

本発明の組成物および方法を用いる療法も可能である。ここに、参考のために引 用するＬａｍｂｅ　ｒ　ｔ　ｓなど、ソマトスタチンおよびその同族体の癌の診 断および処！における役割、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｖｉｅｗｓ、１２　（４ ）＋４５０〜４８２は用いうる少なくともい（つかの潜在的な診断および治療操 作法を概説している。そして、そこに見られるように、ヒトのソマトスタチン受 容体を持つ人腫瘍が多数検出されている。このような腫瘍は下垂体癌：内分泌腺 性膵臓癌：カルンノイド：傍神経節腫、褐色細胞腫、髄質甲状腺癌、および小細 胞肺癌を含む池のｒＡＰＵＤオマ」、神経芽腫；髄膜腫およびグリア由来脳腫瘍 を含む脳腫瘍、メルケル細胞腫瘍、乳癌、腺癌、ならびにリンパ腫および「活性 」白血球を含む。

文献リスト 以下に列挙する文献は、本明細書に用いた方法論、技術および／または組成物の ための背景を補充し、説明し提供するがそれらを教示するために、本明細書に引 用して組み込まれたものである。

アデルマンら（Ａｄｅｌ＋ｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８３）　ＤＮＡ２ ：１８３アンダーソンら（＾ｎｄｅｒｓｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８９ ）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４二ｇ２２２ポリバーら（Ｂｏｌｉｖ ａｒ　ｅｔ　ａｔ、、　）　（１９７７）　Ｇｅｎｅ　２：９５ポシヤルトら（ Ｂｏｓｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１：５２１ブ ラウンら（Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９９０）＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、 　Ｐｈｙｓｆｏｌ　５２：１９７ブラウニングら（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ　ｅｔ　ａ ｌ、　）　（１９８８）　ＪＢＣ２６３：９６３０パンシー（Ｂｕｎｚｏｗ、　 Ｊ、　Ｒ，）　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３３６：７８ ３セリオンら（Ｃｅｒｉｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８５）　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　ｃｈｅｗ、　２６０：１４９３チヤンら（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　 ）　（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　３７５：６１５コノリーら（Ｃｏｎｎｏｌｌ ｙ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８９）　Ｃｅ１ｌ　５７：５９９コテツチアら（ Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８ｇ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｌ、Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５ニア１５X コテソチアら（Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９９０）　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：２W９６ クレアら（Ｃｒｅａ　ｅｔ　ａｌ、　、　）　（１９７ｇ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｔ ｌ、　＾（ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７５：５７６５デイクソンら（Ｄｉｘ ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１ニア５ドールマ ン（Ｄｏｈｌｍａｎ）　（１９ｇ？）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：２６ ５７ドールｖン（Ｄｏｈｌｍａｎ、　＋１．　Ｇ、）　（１９９１）＾ｎｎｕ、 　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｈｅ＋＋、　６０：］］６６−１７０；１７４−ｓ１７６６ ５３−６８８ ドルフイン（Ｄｏｌｐｈｉｎ）　（１９９０）＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓ ｉｏｌ、　５２：２４３ドルフリンガーら（Ｄｏｒｆｌｉｎｇｅｒ、　Ｌ、　Ｊ 、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８３）　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１３：１ ５５P エモーチンら（Ｅｍｏｔｊｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８９）　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４５：１１１８ＥＰＯ＾ｐｐ１．　Ｐｕｂｌ、　Ｎｏ、　００３６７７ ６エツンユら（Ｅｓｃｈ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８０）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７７：６８２７フイアーズら（Ｆ ｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　）　（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２７３＋１１ ３フアインドレイら（Ｆｉｎｄｌａｙ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９９０） 　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｓｃｉ。

１１：４９２ フリールら（Ｆｒｉｅｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４　ニア９２O フクモトら（Ｆｕｋｕｍｏｔｏ、　［１，ｅｔ　ａｌ、）　（１９８ｇ）　Ｐｒ ｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５：５４３４ ボッデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　）　（１９７９）　Ｎａｔｕｒ ｅ　２８１：５４４ゴツデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　、　）　（１ ９８０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　８：４０５７ヒーら（ Ｂｅ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８９）　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　ＡＣＩＩ（１ ，Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＆６：１４８０ヘスら（Ｈｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、）　（１ ９６８）　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　７：１４９ヒツツマンら （ＨｉｔｚｅＬｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、）　（１９８０）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅ＋ｅ、　２５５：２０７３オーランドら（Ｂｏｌｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、 　、　）　（１９７ｇ）　ＢｉｏｃｈｅＩＩＩｉｓｔｒｙ　１７：４９００ハバ ードら（Ｈｕｂｂａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９５８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　４４：１３０イタクラら（Ｉｔａｋｕｒａ 　ｅｔ　ａｌ、、）　（１９７７）　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８：１０５６イト ウら（Ｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８１１１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅ＋ａ、　２６３：６６５６ジヨブリンら（Ｊｏｂｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　） 　（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２５：６２２ジヨーンズ（Ｊｏｎｅｓ、　） 　（１９７７）　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５：１２カナホら（Ｋａｎａｈｏ　ｅｔ 　ａｌ、　）　（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５９ニア３７ ８カヤノら（Ｋａｙａｎｏ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８８）　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３：１５２４５カヤノら（Ｋａｙａｎｏ、　Ｔ、　 ｅｔ　ａｌ、）　（１９９０）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、　２６５：１ ３２７６ケンブら（Ｋｅｅｐ、　Ｂ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９９０） 　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１５：３４２キムラら（Ｋｉｍ ｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ａ、　 ２６４ニア０３３キングら（Ｋｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９９０）　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２５０：１２１キングズマンら（Ｋｉｎｇｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、 、）　（１９７９）　Ｇｅｎｅ、　７：１４］コビルカら（Ｋｏｂｉｌｋａ　Ｂ 、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８７）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、 　２６２ニア３２１コザサら（Ｋｏｚａｓａ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８８） 　Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ８５：２０８１クル ーゼおよびパターラン（Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　ｅｄｓ、 　（１９７３）　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ。

＾ｃａｄｅ＋ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ カイトおよびトウーリトル（Ｋｙｔｅ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｒ，Ｆ、　Ｄｏｏｌ ｉｔｔｅ　（１９８２）　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、１５７＋１０５ ランパーツら（Ｌａｍｂｅｒｔｓ、　Ｓ、マ　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９９ ０）　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　ｌｅｄ、　３２３：１２４a ローンら（Ｌａｗｎ、Ｒ，Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、）　（１９７８）　Ｃｅ１ｌ　 １５：１１５フルイスら（Ｌｅｗｉｓ、Ｄ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８ ５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８３：９０３T リパートら（Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８９）　５ｃｉ ｅｎｅ　２４４：５６９０−マスネイら（Ｌｏｍａｓｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　） 　（１９９０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７： ５０X４ マルローら（Ｍａｒｕｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎ ｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　８５ニア５５１メツシングら０１ｅｓ ｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓ ｉｕ＋＊　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅモ浮撃■■ ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、編者；ワルトン（Ａ　Ｉａｌｔｏｎ ）、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１９８P） モスらＣＭｏ５ｓ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８８）Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ 、　６１＋３０３ネーサンスら（Ｎａｔｈａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８ ６Ａ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２＋１９３ネーサンスら（Ｎａｔｈａｎｓ　ｅｔ 　ａｌ、　）　（１９８６Ｂ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：２０３オカヤマら（ Ｏｋａｙａａ＋ａ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８３）　ＭｃＢ　３：２８０ベイエ ツトら（Ｐａｙｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９９０）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ ｔ、２６６：２１ベイチルら（Ｐａｔｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９９０）　 Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　３９：６３ペラルタら（Ｐａｒａｌｔａ　ｅｔ　ａｌ、 　）　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３４：４３４ブラデイロールら（Ｐｒａ ｄａｙｒｏｌ、　ｅｔ　ａｌ、、）　（１９８０）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１ ０９：５５リーガンら（Ｒｅｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８８）　Ｐｒｏｃ 、　Ｎｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５：６３０１ライクリン（Ｒｅ ｉｃｈｌｉｎ、　Ｓ、、　Ｎ、、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、）　（１９８３ ）　３０９：１４９５−１５５１゜リーンンら（Ｒｅｊ、５ｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ 、）　（１９８５）　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、　２ ３２：２７５レイルーデズマーら（Ｒｅｙｌ−Ｄｅｓ＋ｏａｒｓ　ｅｔ　ａｌ、 ）　（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４＋１８７８９０ス（ Ｒｏｓｓ、　Ｅ、Ｍ、）　（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３ ４４ニア０７サカモト（Ｓａｋａｍｏｔｏ、　Ｃ，）　（１９８８）　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｎ、　２６３：１４４４１サンプｏ−７りら（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ奄獅■ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ） サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８０）　Ｊ、　輩 ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４２＋１６１シャリ−（Ｓｃｈａｌｌｙ、　Ａ、　Ｖ、 ）　（１９８ｇ）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４８．６９７７ンＢンプランら（ Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８３）　Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌｏｇｙ　１１３：１５５９ンユルツら（Ｓｃｈｕｌｔｚｅ　ｅｔ　ａｌ 、）　（１９９０）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　５２：２７５ ツユビンら（Ｓｃｈｖｉｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９９０）　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５：８１８３ンーバーグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）　（１９ｇ ２）　ＤＮＡ　］：２３９セノグレスら（Ｓｅｎｏｇｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、）　 （１９９０）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５：４５０７ンエンら（Ｓ ｈｅｎ、　Ｌ−Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、）　（１９ｇ２）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１１３＾７９：４５７T ／ブレー（Ｓｉｂｌｅｙ、Ｄ、　Ｒ，）　（１９ｇ？）　Ｃｅ１ｌ　４８：９１ ：（ンーベンリストら（Ｓｉｅｂｖｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、）　（１９８ ０）　Ｃｅ１１．２０：２６９スリガンドおよびパテル（Ｓｒｉｋａｎｔ、　Ｃ １Ｂ、　＆　Ｐａｔｅｌ、　Ｙ、　Ｃ，）　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ ｎｄｏｎ）２９４：２５９ ステインク：ｌ　ン（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ、　、　）　（１９７ ９）　Ｎａｔｕｒｅ　２８２：３９スノニら（Ｓｕｓｉｎｉ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ 、）　（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩ＋＋、２６１：１６７３８サポ ら（Ｓｚａｂｏ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９９０）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、Ｔ’ｈ ｙｓｉｏ１．５２＋２９３サーモスら（Ｔｈｅｒｍｏｓ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、 ）　（１９９０）＾ｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２５９．　Ｅ２１６トムス ンら（Ｔｈｏｍｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８４）　ＰＮＡＳ　８１：６ ５９トランら（Ｔｒａｎ、　Ｖ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８５）　５ｃ ｉｅｎｃｅ、　２２８：４９２ドローベンら（Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ 、）　（１９９０）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　５２：２５７サ イら（Ｔｓａｉ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、　２５９：１５３２０チエンバーら（Ｔｓｃｈｅｗｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、 　）　（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１０：１５７ウオルド（ｌａｉｄ）　（１９６ ８）　Ｎａｔｕｒｅ　２１９＋８００　ｅｔ　ａｌ、　）ウォン（ｆａｎｇ、　 Ｈ，−Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８６：９６１６ワス（ｌａｓｓ、　Ｊ、Ａ、Ｈ，、）　（ １９８９）　ｊｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｉｏｇｙ、　ｗＡ者：デグル−ト（Ｄｅ ｇｒｏｏｔ）、　k。

Ｊ（Ｗ、　Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ）、 　１：１５２ウイーラーら（ｆｈｅｅｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９７７） 　Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＬＩＳＡ　７４：４２３W ウイリアムズら（Ｔｉｌｌｉａｍｓ、　Ｊ、＾、　ｅｔ　ａｔ、）　（１９８８ ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ８５：４９３９ 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）特許出願人：　ベル、グリーム・アイヤマダ、ユウイチロウ セイノ、ススム （ｉｆ）発明の名称：ソマトスタチン受容体（ｉｉｉ）配列の数：１２ （ｉｖ）連絡先： （＾）住所ニア−ノルド、ホワイト・アンド・ダーキー（Ｂ）通り：ピーオー・ ボックス４４３３番（Ｃ）市：ヒユーストン （Ｄ）国：アメリカ合衆国 （Ｅ）　ＺＩＰ：　７７２ＬＱ （リコンピューター解読書式： （＾）媒体型：ブロツピーディスク （Ｂ）コンピューター：　ｌＢ１１　ＰＣ適合（Ｃ）オペレーティング・システ ム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　ＰａｔｅｎｔＩｎ　 Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＄１．２５（ｖｉ）本出願のデー タ： （Ａ）出願番号：　１１３０７／８１６．２８３（Ｂ）出願口：　１９９１年１ ２月３１日（Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：バーカー、ディピッド・エル（ｉｘ）電話連絡先情報： （＾）電話番号：　５１２−３２０−７２００（Ｂ）ファックス番号：　５１２ −４７４−７５７７（Ｃ）テレックス番号：　７９−０９２４（２）配列番号ｌ の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ：　１６３４塩基対 （Ｂ）配列の型二核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （［１）　）ボロジー；直鎮状 （ｉＤ配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列；配列番号１： ＴＧＡＱＣＣｆｉＡｋＡ　Ｇ＾ＧＧＧＣＣＡＧＡ　ＡＴＱＡＧＡ＾ＧＧＧＡ＾ｃ ｃｃｃｃｃａτ　ＧＣにに＾＃＾　ｃａａτＡτＣＣ八Ｃ１■W０ ｃｃｃｃζζＡＧＯＧＴＧＣＴＧＴＣＧＧＧ　へτ入ＡＣＧτ（Ｘｌｉｉ：ＱＣ τＸ＾Ｃ＾ＣＴＣ＾Ｃ＾ＧＣＣＴτ　ＴＧ＾Ｘ＾ＧＯ＾　１S４０ （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３９１アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列のｍ類：蛋白質 （ｘｉ）配列：配列番号２： Ｍａｔ　ｔｈ＠Ｐｒｏ　Ａｊｎ　ＣＬｙ　Ｔｈｒ　ＡＪｂ＆　Ｓａｔ　ｇｓｒ　 Ｐｒｏ　ｓｉｒ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　ＰＴｏ　Ｓｉｒ　Ｐｒ。

ｌ　Ｓ　１０　１３ ｓａｒ　Ｐｒｏ　ｃｌｙ　Ｓａｒ　Ｃｙｍ　ＣＬｙ　ＧＬｕ　ＧＬｙ　ＧＬｙ　 ＧＬｙ　Ｓｅｒ　＾ｘｑ　Ｃ１ｙ　Ｐｃ口　Ｃ１ｙ　八１ａＧＡＹ　Ａ１１ｌ　 Ａ１１ｌ　＾ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｈｍｔ、ＧＬｕ　（ｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ 　Ａｓｎ　入１畠Ｂａｒ　にｉｎ　＾１■ ３５　４Ｑ　４５ ａｎｙ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　５１１ｒ　Ｇｌｕ　ＧＬｙ　Ｇｉｎ　ＧＬｙ　Ｍａｔ 　八Ｌａ　ＨＬｍ　Ｌｅｕ　ＸＬｅ　Ｓｉｒ　Ｐｈｅ　ＸＬ■ ５ｏ　ｓｓ　ｇ。

Ｔｙｒ　１Ｉａｒ　ＶａＬ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌ＠ｕ　ＶａＬ　ＧＬｙ　Ｌａｕ 　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　ＡＪｎＳｓｒ　Ｍ・ｔ　ｖａＬ工１・６５　７０　７５　１ １Ｇ Ｔｙｔ　ＶａＬ　ＺＬａ　Ｌ＠ｕ　＾ｘｑ　Ｔｙｒ　Ｊｕａ　Ｌｙｓ　Ｍｅ乞（ 、ｙｓ　τｔ＋ｒ　入Ｌｍ　Ｔｈｅ　入ｓｎ　工１−丁ｙｒ工Ｌ＠　Ｌａｕ　Ａ ｓｎ　Ｌ＠ｕ　八Ｌａ　工Ｌ＠ＡＬａ　Ａｊｐ　（ｌｕ　Ｌａｕ　ｆ、壷ｕ　Ｍ ａｔ　Ｌｅｕ　５＊ｒ　Ｖａｌ　ｉ’ｒ■ １００　１０５　ＬＬＱ Ｐｈ＠　Ｌｓｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｅ　Ｓｇａｒ　Ｔｈｒ　！、ｓｕ　Ｌ＠ｕ　ｋｘ ｑ　ＨＬｍ　でｔｇ　Ｐｒａ　ｔｈｅ　ＧＬｙ　入Ｌａ　Ｌ≠■ ！１ｍ　Ｔｙｒ：　Ｃｙｍ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　Ｂａｒ　Ｖａｌ 　Ｍｐ　Ａｘｑ〒ｙＨＶａｎ　鉱息Ｖ龜Ｉ　ＶａＬ１４５　１５０　Ａｓｓ　１ ６０ Ｈ１ｓ　Ｐｒｏ　ｒｌ＊　Ｌｙｍ　入１ａＡ↓ａ　＾ｔｑ　Ｔｙｒ　Ｎ：ｑ　入 ！：ｑ　Ｐｒｏ　Ｔｈｅ　ＶａＬ　Ａ１１ｌ　Ｌｙｍ　リａP Ｖ１１Ｌ　νａＬ　Ｐｈｅ　Ｓａｔ　ｋｘｑ　Ｔｈｅ　ＡＬＩＩ　ＡＬａ　Ａｓ ｎ　Ｓｓｒ　＾ｓｐ　ＧＬｙτｈｒ　ＶａＬ　ＡＬａ　Ｃｙ■ Ｌ９Ｓ　２００　２０５ Ｌ＊ｕ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　ＶａＬ　Ｌａｕ　ｆＬ＊　ｆｌ−人１ａ　Ｌｙｓ　Ｍ ＩＩｅ　入ｒｑ　Ｈａ仁　Ｖａｌ　八Ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓス４５　２５０　２ ５５ （２）配列番号３の情報− （ｉ）配列の特徴・ （＾）配列の長さ：　１２６５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）　Ｍの数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類、　ｃＤＮＡ （スｉ）配列；配列番号３： 丁（４ＡＧＣＣ？？Ｇ　ＡＧｅＣ？ＡＣｉＧｔｌ；Ａ　ＧＧＧＣＧＣＡＧＡＣＮ ＡｆｉＪｔＪＪＪ：：Ｇ　ＣＭＧＯＴＧＡＧＣＧＣＣＣＣＡfＣＣＧ　６Ｇ （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ＝３９１アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：蛋白質 （ｘ４）配列：配列番号４： Ｈａｔ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ａｊｎ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓ紅　Ｓａｔ：　 ＰｃＯＳａｔ　Ｓａｃ　Ｓａｔ：　ｐｒｏ　≦・ｒＰτＯＩ　Ｓ　１０　ｉｓ Ｓ＠ｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｃｙｍ　ＧＬｙ　（：Ｌｕ　（ｉｌｙ　ＡＬ ａ　Ｃｙ露Ｓ＠ｔ　Ｍｑ　ＧＬｙ　ｋｏ　ＧＬｙ　Ｓ＠ｒスＯ２５コ０ ＧＬｙ　Ａｌａ　＾ｉｌｌ　ＡＪＧＩ　Ｇｌｙ　ＭｓＣＧＬｕ　ＣＬｕ　Ｐｒｏ 　ＧＬｙ　へｒｇＡ磨ｉ　ＡＬａ　Ｓａｒ　ａＬｎ　Ａ１ｎＧＬｙτｈｒ　Ｌａ ｕ　５＠ｒ　ＧＬｕ　ＧＬｙ　ＣＬｎ　ＧＬｙ　Ｓｉｒ　ＡＬＩＩ　ＨＬｓ　ｔ 、ｓｕ　ＸＬＩＩ　Ｓ・ｒ　９ｈ＊　Ｋk・ Ｓｏ　５５　６０ Ｔｙｒ　ＳＥＸ　ＶａＬ　Ｖａｌ　ｃｙｇ　Ｌａｕ　ＶａＬ　Ｇｌｙ　１．＠ｕ 　ｃｙｓ　Ｇｌｙ　ＡＪｎ　Ｓａｒ　Ｈａｔ　ＶＩＩＬ工１E ６５　〕６　７５　１１０ τｙｒ　ＶａＬ　ＺＬａ　Ｌｅｕ　Ａｒ９　Ｔｙｔ　ＡＬａ　Ｌｙ＠　ｓｅｔ　 Ｌｙｍ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ｔｈｅ　Ａｓｎ　１１・　τｙｒ＠Ｓ　９０　９５ ！λ−Ｌ＠１１　Ｊｕｎ　Ｌａｕ　入Ｌａ　ＺＬｅ　ＡＬ直　入鳳ｐ　にＬｕ　 Ｌｍｕ　Ｌａｕ　にａｔ　Ｌｓｕ　Ｓａｔ　ＶａＬ　Ｐｒ。

ｐＨｌｌ　Ｌ＠１１　ＶＩＩＬ　Ｔｈｅ　ＳＥＸ　Ｔｈｅ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｍ ｑ　ＨＬｓ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　ＰＩＴ＠　ＧＬｙ　八ｌａ　k＊ｕ １１５　、１２０　１２５ Ｌａｕ　ＣＦ　ｋｒｑ　Ｌａｕ　ＶａＬ　Ｌａｕ　ｓ＠ｒνａＬ　ｋｓｐ　ＡＬ ａ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　ＭＥ　Ｐｈｓτｈｒ　５ａｔ１３Ｏ１，ｓＬ４０ ｆｉｇ　’！７ｒ　Ｃｙｍ　ｆ、ｓｕ　Ｔｈｅ　ＶａＬ　Ｌｍｕ　Ｓａｔ　Ｖａ Ｌ　入１９　人に９　Ｔｙｒ　ＶｉＬ　人工＆Ｖ龜１　リ亀P ＩＩＬｍＰｒｏ工ＬａＬｙｓＡｌａＡＬａＡｒｇ丁ｙｒｍｇ°ＡｒｇＰｒｏτｈ ｒＶ畠１＾工晶シｙｓＶ龜１１６５　ｌフｏ　１７５ ＶａＬ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｓｕ　Ｓａｔ　 Ｌａｕ　ｚａｕ　Ｖａｌ　工ｉｓ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　工１・１ｉｌｏ　１日５　 １９０ ＶａＬ　ＶａＬ　Ｐｈａ　Ｓａｔ　入ｒｑ　Ｔｈｒ、ＡＬａ　ＡＬａ　入ｓｎ　 ｓａｒ　入ｓｐ　ＣＬｙ　Ｔｈｅ　ＶｉＬ　ＡＬａ　Ｃｙｓ＾ｓｎＭａｔＬ＠ｕ ＭａｔＰｒｏＧＬｕＰｒｏＡＬａＧｉｎ入ｘｑＴｒｐＬｅｕＶａｌｄｌｙＰｈｓ ＶａＬＬ＊ｕ　Ｑｒ　Ｔｈｅ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｍｅｔ　ＧＬｙ　Ｐｈａ　Ｌａ ｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ｖａｌ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｅｌｓ　Ｃｙｓ２λＳ　１３０ 　２３５　２４０ Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　丁ｙｒ　ＶａＬ　Ｌａｕ　ｕｓ　ＺＬａ　入Ｌａ　Ｌｙｅ　Ｍ ｔ　八ｚｇ　１４１１ｔ　ＶＡ１　八ｌｉＬ・ｕ　ｚｙｍＡｌａ　ＧＬＹ　Ｔｒ ｐ　Ｇｉｎ　ＧＬｎ　ＡＩ’９　Ｋ、７ｍ　ｍｇ　ｓａｒ　ＧＬｕ　Ａｒ９　ｒ 、ｙ１工１・Ｔｈｅ　Ｌａｕ　Ｍ＠ｔＶａＬ　Ｍｅｔ　Ｍａｔ　Ｖａｌ　ｖａＬ 　Ｍａｔ　ｖａｌ　Ｐｈａ　ＶＩＩＬ　工ｉｓ　Ｃｙｍ　Ｔｒｐ　１４ｓｔ　Ｐ ｒｏ　Ｐｈｍ　？凾■ ２７５　２＠０　２１１％ ＶａＬ　Ｖｉｌ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　ＶａＬ　Ａｊｎ　ｖａＬ　Ｐｈａ　ＡＬａ　 ｃＬｕ　ＧＬｎ　入１ｐ　Ｍｉｌ　八１ａτｈｒ　ＶａＬス９０　２９５　３０ ０ ５＠ｔＧＬｎＬ＊ｕ５＠ｒＶａ１工１・Ｌ＊ｕＣＬｙＴｙｒＡＬａＡｊｎｈｅＣ ｙｍＡＬａ八５ｎＰｒ。

コ０５　へ　コ１０　３１５　３２０ ｒｉｌｌ　Ｌａｕ　１′ｙｒ　ＧＬｙ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　ＳＥＸ：　ＡＪｐ　Ａ ｊｌｌ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　ＡＸｑ　５＠ｔ　Ｐｈａ　Ｇｌｎ@ｋｒｑ ３２５　ココＯコ３５ Ｉ−Ｌａ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｌ＠＋ａ　ＳＥＸ　Ｔｒｐ　Ｈｏｔ　八１ｐ　八ｓ ｎ　入１１人Ｌａ　ＧＬｕ　ＣＬｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　入１■ ３４０３４５コ５０ Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ｔ、ｓｕ　Ｌｙｍ　Ｓａｔ　八ｒｇ 　へ１畠　Ｔ２ＣＳＥＸ：　ＶａＬ　ＧＬｕ　Ａｊｐ　ＰｈE コ５５　コｇｏ　３６５ Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＣＬｕ　ＪＪｎ　Ｌａｕ　（：Ｌｕ　Ｓａｔ　ＧＬｙ　（Ｌｙ 　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ａｒ９　人ｓｎ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　ａｙ■ コア０コフ５３８゜ 入Ｌａ　ＳＥＸ　入ｒｑ　ＺＬａ　Ｓａｔ　Ｔｈｅ　（、＊ｕココ５　３９０ （２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ：　１３５１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （の鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号５： ＧＴｔＴＣＡＣｆＴ？　ＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡＣＣＴｋＴＧＣＴＡＡＣＡ ＧＣＴＧＴ　ＧＣＣｋＡＣＣＣＴＡ　ＴＣＣτ＾ＴＡτＣＣPｌｌ１２０ （２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特＠： （＾）配列の長さ＝３６９アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （１１）配列の種類：蛋白質 （ｘｉ）配列：配列番号６： Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ＾ｌａ　Ａｊｐ　ＣＬｕ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａｊｎ　ａ ｎｙ　ＳＥＸ　Ｈｉｍτｈ【丁ｒｐ　Ｌｍｕ　Ｓ・ｒｌ　Ｓ　１０　１５ ’ｎａ　Ｔｙｒ　ＶａＬ　ＺＬａ　Ｌａｕ　Ｍ９　ＴＹＴＡＬ＆　１．７ｍ　＋ −ｎｔ　Ｌｙｓτｈｒ工１拳τｈｒ　Ａｍｎ　ｎ１１６５　フＯフ５　８０ ＶａＩ　ＨＬｓ　Ｐｒｏ　ＨＬｓ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　ＡＬａ　ＬＹ＃　Ｔｒｐ　 ｐｓｑ　ＡＸｑ　Ｐｒｏ　八ｒｑ　丁ｈｒ　入１轟　Ｌｙｓ８・ｔｒｉ・　Ｔｈ ｅ　Ｈａセ　入ｉｌｌ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　ｄａｙ　ＶａＬ　Ｓａｒ　Ｌｓｕ　ｕ ｕ　ＶａＩ　ＨＬｓ　Ｌｓｕ　Ｐｒ。

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（ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ：　１２９６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数−二本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：　ｃＤＮ＾ （ｘｉ）配列：配列番号９： ↑丁％ＧＧＣ？Ｃ丁　入ＣτＴＣＣＴＧＯＴ　ＱＣτＧＧＣＧＣＴＧ　ＣＣＣτ 八丁ＧへＣＡ　ＡＣＡＧＣテＧＴＧＣＣＬ八へｃｃｃ八へｒ■@ｆｆ６０ ＣＴτ丁入τ０ＯＣＴ　〒ζＣＴＣ？：ＣＴＡ　ＣＣＧＣｆＣ＾ＡＧ　ＣＡＧＧ ＧＣｆｆｉｃｃ　ＧＣＡ＃ＣＣ？　ａｃｔｃｃｃｃｃｃｃ　P０２０ （２）配列番号１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ：４１８アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｘｉ）配列：配列番号ｌＯ： ｉ’ｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＶａＬ　１’ｈ＠　Ｓ＠ｔ　ＧＬｙ　ｖａＬ　ＩＰ ｒｏ　Ａｒｇ　ａｎｙ　Ｍｅｔ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　ｅｙｅ　gＬｍ （２）配列番号１１の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ：　１７９６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮ＾ （ｘｉ）配列：配列番号１１： 入ＴＣＧＧＱＣＴＣＴ　Ｇ）ｍＴＧＧｃＭ：　ｋＴＮＷｋＧＧＴｃ　ＴＣＴＡＡ ＧＴＴＣｋ　ＡＡ（ｉｇＡＣ？　ＧＧ’！’Ｃ’！’Ｃ（：■≠煤@ｇ。

（２）配列番号１２の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ＝４２８アミノ酸　、（Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｘｉ）配列：配列番号１２： ＶａＬ　入ｒｑ　人１ａ　Ｐｒｏ　！＠ｒ　Ｃｙｍ　Ｇｉｎ　Ｔｔｐ　ＶａＬ　 ＧＬｎ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ａ１蟲　（”Ｙ＠　ａｔｎ　ＡＪh９ 人Ｑ　Ｍｑ　Ａｒｇ　ｓｅｘ　Ｇｉｕ　ｋｒｑ　ｋｒｑ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｒ ９　Ｍｕ　ＶａＬ　Ｖａｌ　人１轟　ＶａＬ　Ｖａｉ２６０　２６５　２）Ｏ Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｐｈ＠ＶａＬ　Ｌ＠ｕ　ＣｙｓτｒｐＨａ！、ｐｒｏ　Ｐｈ＊ τｙｒ　Ｌｓｕ　Ｌｅａ　Ａｓｎ　工Ｌ・Ｖ晶１Ｊｕｎ　ｖａｔ　Ｖａｌ　Ｃｙ ｓ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｐｈａ　ｐｈ ＊　ａｎｙ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ２９０　ス９５　コ００ Ｐｈｓ　Ｌｓｕ　ＶａＬ　ＶａＩ　Ａ１１ｌ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　ＡＬａ 　Ａｓｎ　ｓｓｒ　Ｃｙｓ　ＡＬａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＺＬE ３０５　３１０　３１５　コ２゜ Ｌ＠ｕ　Ｔｙｒ　ｄｌｙ　Ｐｈ＠Ｌｓｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｍｑ　Ｐｈ＠Ｌｙｓ 　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＰＭ　ｋｒｑ　ｋｒｑ　！ｉｓコ２５３コ０ココ５ Ｌａｕ　Ｌ＠ｕ　ｋｘｑ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　Ａｘｑ　Ａｒｇ　ＸＬ＊　ｋｒｑ　 ｇｅｒ　Ｇｉｎ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｔｙ　Ｓａｔ　Ｇ１Dｙ ３４０コ４５コ５０ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｄＬｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｋｕ　ＯＬｕ　ＣＬｕ　 Ａｓｐ　にＧＬｕ　ＣＬｕ　ＧＬｕ　ＧＬｕ　Ｇｉｕ　Ａｒ■ ３５５　コロ０　コロＳ 入ｒｑＣＬｕＧｌｕＣ１ｕＯＬｕＩＮｘｑ＾ｒｇＭｓｔＧｌｎｋｒｑＧＬｙＧｉ ｎＧｉｕＨａｔＡ１ｎＯＬｙコア０　コツ５　コ８０ Ａｒｇ　Ｌ＠ｕ　！ｆ＠ｒ　Ｇｉｎ　ＩＬ＊　ＡｌａＧｉｎ　ＡＬａ　Ｇｌｙτ ｈｒ　ｓ＠ｒ　ＧＬｙ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　ｆｌｒ口紅９３＋１５　３９０　３９ ５　４００ 対数　ペプチドルモル濃度 対数　ペプチドルモル濃度 ４．４− ２．３− フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／１９　 ７２３６−４８ １／２１　７２３６−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ２１１０８　９１６１−４Ｂ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｂ　８３１０−２Ｊ３３１５６６　９０１５−２Ｊ ／／　Ａ　６１　Ｋ　３９／３９５　９２８４−４Ｃ（Ｃ１２Ｎ　１５１０９　 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｎ　１５１００　ＺＮＡ　Ａ Ｃ１２Ｒ１：９１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードする配列を持つＤＮＡセグメン トを含有する組換えベクター。 ２．配列が配列番号２または４のどちらかのアミノ酸残基１から３９１を含むポ リペプチドをコードする、またはそのポリペプチドが配列番号６または８のどち らかのアミノ酸残基１から３６９を含むか、またはそのポリペプチドカ配列番号 １０のアミノ酸残基１から４１８を含むか、またはそのポリペプチドが配列番号 １２のアミノ酸残基１から４２８を含む、請求項１のベクター。 ３．配列が実質的に配列番号２または４のどちらかのアミノ酸残基１から３９１ からなるポリペプチドをコードする、またはそのポリペプチドが配列番号６また は８のどちらかのアミノ酸残基１から３６９を含むか、またはそのポリペプチド が配列番号１０のアミノ酸残基１から４１８を含むか、またはそのポリペプチド が配列番号１２のアミノ酸残基１から４２８を含むものである、請求項２のベク ター。 ４．ソマトスクチン受容体ポリペプチドをコードする配列が有効なプロモーター に隣接し、かつその制御下に位置する請求項１のベクター。 ５．プロモーターが原核性プロモーターを含み、ベクターが原核宿主内での発現 に適応している請求項４のベクター。 ６．プロモーターが真核性プロモーターを含み、ベクターが真核宿主内での発現 に適応しており、且つ、該ベクターがカルボキシ末端−アミノ酸残基の３′位で 、そしてコードされたポリペプチドの転写ユニット内にポリアデニル化シグナル をさらに含有している請求項４のベクター。 ７．ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードする配列を持つ単離されたＤＮ Ａセグメント。 ８．配列が配列番号２または４のどちらかのアミノ酸残基１から３９１に対応す るポリペプチドをコードする、またはそのポリペプチドが配列番号６または８の どちらかのアミノ酸残基１から３６９を含むか、またはそのポリペプチドが配列 番号１０のアミノ酸残基１から４１８を含むか、またはそのポリペプチドが配列 番号１２のアミノ酸残基１から４２８を含む、請求項７の単離されたＤＮＡセグ メント。 ９．配列が実質的に配列番号２または４のどちらかのアミノ酸残基１から３９１ からなるポリペプチドをコードする、またはそのポリペプチドが配列番号６また は８のどちらかのアミノ酸残基１から３６９を含むか、またはそのポリペプチド が配列番号１０のアミノ酸残基１から４１８を含むか、またはそのポリペプチド が配列番号１２のアミノ酸残基１から４２８を含むものである、請求項７の単離 されたＤＮＡセグメント。 ｌ０．配列番号１、３、５、７、９または１１のいずれかのＤＮＡ配列、または そのいずれかの相補配列の少なくとも１４塩基配列を含み、それぞれ、配列番号 １、３、５、７、９または１１のいずれかのＤＮＡ配列またはその相補配列にハ イブリド化できる単離されたＤＮＡセグメント。 １１．配列が配列番号１、３、５、７、９または１１のＤＮＡ配列の少なくとも ２０塩基配列を含む請求項１０の単離されたＤＮＡセグメント。 １２．配列が配列番号１、３、５、７、９または１１のＤＮＡ配列の少なくとも ３０塩基配列を含む請求項１０の単離されたＤＮＡセグメント。 １３．配列が配列番号１、３、５、７、９または１１のＤＮＡ配列の少なくとも ４０塩基配列を含む請求項１０の単離されたＤＮＡセグメント。 １４．さらに、ソマトスクチン受容体ポリペプチドをコードするものとして定義 される請求項１０の単離されたＤＮＡセグメント。 １５．請求項７〜１２のいずれか一つで定義されるＤＮＡセグメントを含有する 組換えベクター。 １６．ソマトスタチン受容体ポリペプチド。 １７．配列番号２または４のどちらかのアミノ酸残基１から３９１を含むか、ま たはそのポリペプチドカ配列番号６または８のどちらかのアミノ酸残基１から３ ６９を含むか、またはそのポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸残基１から４ １８を含むか、またはそのポリペプチドが配列番号１２のアミノ酸残基１から４ ２８を含むものとしてさらに定義される請求項１４のソマトスタチン受容体ポリ ペプチド。 １８．組換えポリペプチドとしてさらに定義される請求項１４のソマトスタチン 受容体ポリペプチド。 １９．ソマトスタチン受容体ポリペプチドと反応性がある抗体の製法であって、 請求項２１〜２５のいずれかによる組換え宿主細胞であり、該ポリペプチドを発 現することができる細胞を生産すること、該ポリペプチドを発現するために適当 な条件下に該宿主細胞を培養すること、該ポリペプチドを回収すること、および 該ポリペプチドに対する抗体を製造することからなる方法。 ２０．モノクロナール抗体としてさらに定義される請求項１９の抗体。 ２１．請求項７または１０による単離されたＤＮＡセグメントを含有する組換え 宿主細胞。 ２２．真核宿主細胞としてさらに定義される請求項１９の組換え宿主細胞。 ２３．原核宿主細胞としてさらに定義される請求項２０の組換え宿主細胞。 ２４．酵母細胞としてさらに定義される請求項２０の組換え宿主細胞。 ２５．ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントが、組 換え宿主細胞内において機能する調製シグナルの転写制御の下にあり、その調節 シグナルは全ての必要な転写および転写後修飾がなされるようにソマトスタチン 受容体ポリペプチドの発現を適切に制御するものである請求項１９〜２１の組換 え宿主細胞。 ２６．ソマトスタチン受容体ポリペプチドの製法であって、請求項２１〜２５の いずれかによる組換え宿主細胞であり、該ポリペプチドを発現することができる 細胞を生産すること、該ポリペプチドを発現するために適当な条件下に宿主細胞 を培養すること、および該ポリペプチドを回収することを含む方法。 ２７．宿主細胞がさらに真核宿主細胞を包含する請求項２６の方法。 ２８．真核細胞がさらにＣＯＳ−１細胞を包含する請求項２６の方法。 ２９．宿主細胞がさらに原核細胞を包含する請求項２６の方法。 ３０．原核細胞がさらに大腸菌ＤＨ５α株の細菌細胞を包含する請求項２６の方 法。 ３１．ソマトスタチン受容体ポリペプチドと相互作用する能力のある候補物質を 検定するための方法であって、該ポリペプチドと該候補物質との相互作用を検定 しうる形のポリペプチドを生産することのできる宿主中でソマトスタチン受容体 ポリペプチドを発現すること、核ポリペプチドを該候補物質に暴露させること、 および該ポリペプチドと該候補物質との反応を評価することを含む方法。 ３２．この評価工程が、該ポリペプチドをＸ線結晶解析に適当な条件下で結晶化 すること、および該ポリペプチドをＸ線結晶解析することをさらに包含する請求 項２７の方法。 ３３．さらに、該評価段階が、望ましいソマトスタチン様相互作用を持つ候補物 質と、望ましくないソマトスタチン様相互作用を持たない候補物質とを判別でき る評価法をも含む、請求項２７の方法。 ３４．望ましくないソマトスタチン様相互作用がさらにインシュリン代謝の阻害 を含む請求項２７の方法。 ３５．望ましくないソマトスクチン様相互作用がさらにグルカゴン代謝の阻害を 含む請求項２７の方法。 ３６．該評価段階がさらに１またはそれ以上の単離された組換えソマトスタチン 受容体ポリペプチドと相互作用する選択的能力を持つ候補物質を特定できる評価 法を含む請求項２７の方法。