JPH09512437A - 酵母中での哺乳類アデニリルシクラーゼの機能的発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳類アデニリルシクラーゼは酵母細胞中で機能的に発現する。酵母細胞は、アデニリルシクラーゼの阻害剤もしくは活性化剤、または酵母細胞中で機能的に共発現するアデニリルシクラーゼの調節体の阻害剤もしくは活性化剤を選別するのに使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母中での哺乳類アデニリルシクラーゼの機能的発現 本出願は現在係属中で１９９４年４月２６日出願の出願番号０８／２３３，７ ００の一部継続出願であり、引用することによって全開示内容が本明細書に取り 込まれている。本出願の出願日の利益は本明細書によってすべての関係法令およ び条約に基いて請求される。 発明の背景関連出願のクロス・リファレンス １９９４年１０月１３日出願で、引用することによって本明細書に取り込まれ ている、同一所有されている出願米国出願第０８／３２２，１３７号は、酵母フ ェロモン系タンパク質、例えば、酵母フェロモン受容体、Ｇタンパク質結合受容 体の哺乳類代用体の活性をモジュレートする物質をスクリーニングする際の遺伝 子操作された酵母の使用に関する。発明の技術分野 本発明は特に、酵母中での哺乳類アデニリルシクラーゼの発現、形質転換され た酵母細胞、並びに例えば哺乳類アデニリルシクラーゼ、または遺伝子操作され た酵母細胞中で哺乳類アデニリルシクラーゼに先天的もしくは人工的に結合して いる他のタンパク質の潜在的な阻害剤もしくは活性化剤を同定するのに使用する ことに関する。背景技術の説明 シグナル伝達 幾つかの例において、疾病を治療するかまたはその症状を軽減する薬 物の場合、その薬物は適切な細胞に送達され、そして正確な「スイッチ」を押さ なければならない。細胞スイッチは「受容体」として知られている。ホルモン、 成長因子、神経伝達物質および他の多くに生物分子は特異的細胞受容体との相互 作用によって正常に作用する。薬物は特定の受容体を活性化または遮断して、所 望の医薬的効果を達成する。細胞表面受容体は「体外」シグナル（リガンドの受 容体への結合）の「体内」シグナル（細胞の増殖、物質代謝または細胞消滅に関 与する細胞質または核中の経路のモジュレーション）中への導入を媒介する。 多くの場合、導入は以下のシグナリング・カスケードによって達成される。 ● アゴニスト（リガンド）は細胞表面上の特異的タンパク質（受容体）に結 合する。 ● リガンド結合の結果として、受容体は、細胞膜中の導入タンパク質を活性 化するアロステリック変化を受ける。 ● 導入タンパク質は、細胞内で、いわゆる「第二メッセンジャー分子」の産 生を活性化する。 ● 第二メッセンジャー分子は、特定遺伝子を「スイッチオン」もしくは「ス イッチオフ」するかまたはいくつかの代謝工程を変える潜在力を有する、細胞内 のある種の調節タンパク質を活性化する。 この一連の出来事は、各々の可能な細胞応答に特異的な様式で結びついている 。特定リガンドに対する応答は、細胞がどのような受容体を発現するかに依存す ることができる。例えば、α−アドレナリン受容体を発現している細胞中でのア ドレナリンに対する応答は、β−アドレナリン受容体を発現している細胞中での 応答の反対であることができる。 上記の「カスケード」は理想と考えられ、そしてこの主題についての変化が起 こる。例えば、受容体はそれ自体の導入タンパク質として作用することができる か、または導入タンパク質は、「第二メッセンジャー」による媒介なしで、細胞 内標的に直接に作用することができる。 Ｇタンパク質によるシグナル伝達 多種類の哺乳類ホルモンおよび神経伝達物質によって始められたシグナルは、 細胞の形質膜中の７つの膜内外ドメイン受容体によって受理され、そして異種三 量体Ｇタンパク質を経て細胞内エフェクターに導入される。多くの異なったＧタ ンパク質は受容体と相互作用することが知られている。Ｇタンパク質シグナリン グ系には３つの成分が含まれる。即ち、受容体自体、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇ タンパク質）、および細胞内標的、通常はタンパク質。 細胞膜はスイッチボードとして作用する。種々の受容体を経て到着する情報は は、受容体が同一の種類のＧタンパク質に作用する場合、単一の効果を生み出す ことができる。他方、単一受容体を活性化するシグナルは、受容体が異なった種 類のＧタンパク質に作用する場合、またはＧタンパク質が種々のエフェクターに 作用することができる場合、一つを超える効果を生み出すことができる。 異種三量体Ｇタンパク質は、βおよびγサブユニットのしっかりした複合体と 共に、グアニンヌクレオチド結合αサブユニットから構成される。それらの休止 状態では、アルファ（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）サブユニットから なるＧタンパク質は、ヌクレオチドグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）と複合して、 受容体と接触する。ホルモンまたは他の第一メッセンジャーが受容体と結合する 場合、受容体は配座を変化 させ、これがＧタンパク質との相互作用を変える。これがαサブユニットを刺激 して、ＧＤＰ、およびそれに代わってＧタンパク質を活性化するさらに豊富なヌ クレオチドグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を放出させる。次いで、Ｇタンパク質 は解離して、まだ複合されたベータおよびγサブユニットからαサブユニットを 分離する。遊離のＧαおよびＧβγサブユニットの両方は特異的エフェクター分 子（例えば、酵素アデニリルシクラーゼ、サイクリックＧＭＰホスホジエステラ ーゼ（ＰＤＥ）、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ₂、および選択されたイ オンチャンネル）の活性に影響することができる。エフェクター（しばしば酵素 である）は順に不活性な前駆体分子を活性な「第二メッセンジャー」に転化させ 、それは細胞質中に拡散し、代謝カスケードの引金を引く。数秒の後、Ｇタンパ ク質シグナリングは、Ｇαサブユニットの内因性ＧＴＰアーゼ活性によるＧＴＰ のＧＤＰへの加水分解、およびその後の不活性な異種三量体を形成するＧα−Ｇ ＤＰとＧβγとの再会合で終結する。この再会合はＧＤＰ結合ＧαのＧβγに対 する高いアフィニティーによって駆動される。 数千でなくとも、数百の受容体が異種三量体Ｇタンパク質によって情報を伝達 し、その中の少なくとも１７の異なった形態が単離された。最大の変動性はαサ ブユニット中に見出されるが、数種の異なったβおよびγ構造が報告されている 。追加的には、数種の異なったＧタンパク質依存性エフェクターがある。 微生物の研究から、Ｇタンパク質シグナル伝達経路の発生は真核細胞の進化の 初期に起こったことが示されている。Ｇタンパク質調節機能は酵母中の交配フェ ロモンに対する応答に対し内因性であり（Ｗｈｉｔｅ ｗａｙ等，１９８９）、細胞粘菌類タマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕ ｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の発生はｃＡＭＰに対するＧタンパク質媒介応答に よって制御される（Ｄｅｖｒｅｏｔｅｓ，１９８９）。Ｇタンパク質媒介性シグ ナル伝達におけるアデニリルシクラーゼの役割 アデニリルシクラーゼは、哺乳類細胞中で活性化Ｇタンパク質に応答して機能 するエフェクター分子について研究された最高のものの一つである。アデニリル シクラーゼの活性化は、シグナルが特定の細胞受容体から導入されると、ＧＴＰ 結合Ｇαｓが放出される場合に、起こる。Ｇαｓ（「ｓ」は刺激的を表す）は元 来、アデニリルシクラーゼ活性を欠いた変異体Ｓ４９細胞中のアデニリルシクラ ーゼ活性の調節体として同定された。Ｇαｓ−ＧＴＰはそれらのｃｙｃ^-細胞中 でのアデニリルシクラーゼ活性を刺激した［Ｎｏｒｔｈｕｐ等（１９８０）Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，６５１６−６５２０］。ｃＡ ＭＰの産生は純粋のＧＴＰ−γＳ−結合Ｇαｓ（ＧＴＰ−γＳはヌクレオチドの 非加水分解的形態である）によって刺激されることができる。シクラーゼのＧＴ Ｐ−結合Ｇαｓによる活性化は過剰のＧβγによって逆転する。阻害は不活性な Ｇタンパク質異種三量体が改編する場合、起こると考えられる。 Ｇタンパク質の他のクラス、Ｇαｉ（Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、およびＧαｉ３を 含む）と相互作用する受容体によってシグナルする分子はアデニリルシクラーゼ の阻害を媒介する。アゴニストがＧｉ−結合受容体に結合すると、活性化Ｇαｉ タンパク質および放出Ｇβγ複合体の両方はアデニリルシクラーゼの活性を阻害 することができるようである［Ｔａｕｓｓｉｇ等（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６１，２１８−２２１］。 Ｇβγ複合体は、異種三量体を遊離Ｇαｓで改編してその調節分子を隔離するこ とによって、酵素活性を阻害することができる［Ｇｉｌｍａｎ（１９８４）Ｃｅ ｌｌ，３６，５７７−５７９］。さらに、Ｇαｉサブユニットはアデニリルシク ラーゼ活性を直接に阻害することができる［Ｔａｕｓｓｉｇ等（１９９３）Ｓｃ ｉｅｎｃｅ，２６１，２１８−２２１］。アデニリルシクラーゼの負の調節のた めの第三の機構は、Ｇβγ複合体による直接阻害を含む。精製された１型アデニ リルシクラーゼはβγサブユニットによって直接に阻害されることが示された[ Ｔａｕｓｓｉｇ等(１９９３)Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，９−１２]。 サイクリックヌクレオチドは多数の細胞活性の調節で重要な役割を果たす。ア デノシン３′，５′−サイクリックリン酸（サイクリックアデノシン一リン酸ま たはｃＡＭＰ）の合成はアデニリルシクラーゼによって触媒され、酵素は哺乳類 細胞中では統合膜タンパク質である。サイクリックＡＭＰは、特異的プロティン キナーゼ（ｃＡＭＰ依存性プロティンキナーゼまたはプロティンキナーゼＡ）に よる細胞シグナルに応答して作用し、標的分子、例えば、他のプロティンキナー ゼまたは輸送もしくは細胞形態に関与するタンパク質をリン酸化する第二メッセ ンジャーである。キナーゼの刺激によって、細胞内ｃＡＭＰは、細胞物質代謝お よび細胞増殖の調節におけるホルモンの効果の多くを媒介する。サイクリックＡ ＭＰは数種のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によって加水分解され、そして多 分特定の輸送体によって幾つかの細胞型から活性的に分泌されるか、または細胞 内細胞小器官の膜中に存在する輸送体によって細胞質から隔離されることができ る。 脊椎動物細胞では、アデニリルシクラーゼは異種三量体Ｇタンパク質 によって調節され［Ｇｉｌｍａｎ（１９８４）Ｃｅｌｌ，３６，５７７−５７９ ］、他方酵母中では、ＲＡＳタンパク質がアデニリルシクラーゼを調節する［Ｔ ｏｄａ等（１９８５）Ｃｅｌｌ，４０，２７−３６；Ｂｒｏｅｋ等（１９８５） Ｃｅｌｌ，４１，７６３−７６９］。順に、異種三量体Ｇタンパク質およびＲＡ Ｓタンパク質の両方は、それらが結合しているグアニンヌクレオチドの形態によ って調節される。 多くのアデニリルシクラーゼは形質膜に随伴して見出だされるが、細菌中で発 現する酵素のある種の形態は、精巣中に見出だされる哺乳類酵素のように、細胞 質ゾル状である。周辺膜アデニリルシクラーゼはＥ．コリ（Ａｉｂａ等，１９８ ４）中およびＳ．セレビシエ（Ｋａｔａｏｋａ等、１９８５）中で発現する。タ マホコリカビ属のＡＧＧ遺伝子によってコードされたアデニリルシクラーゼは単 一の膜内外膜ドメインを有するようである（Ｐｉｔｔ等，１９９２）。タマホコ リカビ属からの第二のアデニリルシクラーゼ遺伝子（ＡＣＡ）（Ｐｉｔｔ等，１ ９９２）、ドロソフィラ・ルタバヤ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｒｕｔａｂａｙａ ）遺伝子（Ｌｅｖｉｎ等，１９９２）、および最近までにクローン化された、哺 乳類アデニリルシクラーゼをコードしている６つの全長のｃＤＮＡは、統合膜タ ンパク質をコードしてる。 酵母フェロモン系タンパク質およびそれらの代謝機能 一倍体酵母細胞は栄養増殖するのみならず、交配して二倍体細胞を形成するこ とができる。一倍体細胞の２種の交配型（「有性」）はａおよびαと呼称される 。ａ細胞はドデカペプチドａ因子を産生し、α細胞はトリデカペプチドα因子を 産生する。ａ因子およびα因子は、反対の「性」の酵母細胞中の交配反応を誘発 するから、それらはフェロモンと 呼ばれる。これらのフェロモン、並びにフェロモンの産生もしくは輸送またはフ ェロモンに対する反応に特異的に関与する他のタンパク質は「フェロモン系タン パク質」と考えられる。 α因子受容体遺伝子と同様に、ａ因子フェロモンをコードしている遺伝子はａ 細胞特異的遺伝子である。ａ細胞特異的遺伝子はａ細胞中でのみ発現する。α因 子フェロモンをコードしている遺伝子は、ａ因子受容体遺伝子と同様に、α細胞 特異的遺伝子である。α細胞特異的遺伝子はα細胞中でのみ発現する。他の酵母 遺伝子は一倍体特異的遺伝子セットに属し、そして一倍体細胞（ａ細胞またはα 細胞）中で発現するが、二倍体（ａ／α）細胞中ではしない。さらに、胞子形成 に関与するそれらの遺伝子を含めて、二倍体細胞特異的遺伝子セットが存在する 。真核細胞では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、転写因子ＴＦＩＩＤ （ＴＡＴＡ結合タンパク質またはＴＢＰ）が結合する特異的配列（ＴＡＴＡボッ クス）を含有する。活性な転写開始複合体には、ＴＦＩＩＤ、補助開始タンパク 質、およびＲＮＡＰｏｌ ＩＩが含まれる。より高級の真核細胞中のように、Ｔ ＡＴＡボックスは酵母プロモーター中では必須の制御配列である。酵母ＴＡＴＡ ボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）は、それが機能的に哺乳類ＴＦＩＩＤを代理 する能力によって同定された[Ｂｕｒａｔｏｗｓｋｉ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３４ ，３７(１９８８);Ｃａｖａｌｌｉｎｉ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，７７（１９ ８８）]。ほんの少数の明らかな例外を除いて［幾つかの解糖酵素遺伝子の転写 、Ｓｔｒｕｈｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，６，３８４７（１９８６）お よびＯｇｄｅｎ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６４３３５（１９８６）参 照］、酵母遺伝子の転写は、転写の開始のために、近接 のＴＡＴＡボックス要素およびＴＦＩＩＤを必要とする。また、効率的な転写に は、遺伝子特異的活性化剤タンパク質が必要である。これらの遺伝子特異的調節 タンパク質が転写に影響する正確な機構は完全には解明されていない。 ＭＣＭ１ｐ（ＭＣＭ１遺伝子中にコードされた）は酵母中の非細胞型特異的転 写因子である。ＭＣＭ１ｐは、単独でまたは、ａ−およびα−細胞特異的遺伝子 の発現を制御する他の調節タンパク質と協調して作用する。酵母交配型遺伝子座 は、細胞型特異的発現の制御に貢献する調節タンパク質をコードする。これらの タンパク質は、Ｍａｔａ１ｐ（ＭＡＴａ遺伝子によってコードされた）およびＭ ａｔα１ｐとＭａｔα２ｐ（ＭＡＴα遺伝子座によってコードされた）である。 ＭＣＭ１ｐは、ａ特異的遺伝子の制御領域中に位置する上流活性化配列（ＵＳＡ ）に結合することによって、ａ特異的遺伝子絵の転写を活性化する。Ｍａｔα１ ｐおよびＭＣＭ１ｐは相互作用して、特異的ＵＳＡ結合部位への相互の結合を増 強して、α細胞中のα細胞特異的遺伝子転写を活性化する。Ｍａｔα２ｐはＭＣ Ｍ１ｐと会合して、α細胞中のａ特異的遺伝子転写を抑制する。二倍体（ａ／α ）細胞では、Ｍａｔα１ｐおよびＭａｔα２ｐが会合して一倍体特異的遺伝子の 転写を抑制する。Ｍａｔα１ｐ／Ｍａｔα２ｐ調節性実体は二倍対細胞中にのみ 見出だされる。 酵母は、α因子フェロモン、ＭＦα１およびＭＦα２をコードしている２つの 遺伝子を含有する。これらの配列中に突然変異をもつ酵母の分析の結果から、Ｍ Ｆα１は、細胞によって産生された大多数のα因子を生成することが示される。 発現は、ＭＦα２からよりも、ＭＦα１からのほうが高い水準で起こる［Ｋｕｒ ｊａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ ｌ．，５，７８７（１９８５）］。酵母のＭＦα１遺伝子は、Ｎ末端に８５ａａ リーダー配列を含有する１６５ａａ前駆体タンパク質をコードする。リーダーに は、３つのオリゴ糖側鎖の添加のための部位を含有する１９ａａシグナル配列お よび６６ａａ配列が含まれる［Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， Ｃｅｌｌ，３９，９３３（１９８２）；Ｓｉｎｇｈ等，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒ ｅｓ．，１１，４０４９（１９８３）；Ｊｕｌｉｕｓ等，Ｃｅｌｌ，３６，３０ ９（１９８４）］。１３ａａα因子の４つの双頭コピーは前駆体のＣ末端部分中 に存在する。６−８ａａスペーサーペプチドはα因子配列の前に在る（図２を参 照）。 新生のα因子ポリペプチドのＥＲへのトランスロケーションの後、シグナル配 列は前駆体タンパク質から切断されて、プロ−α因子を与える（Ｗａｔｅｒｓ等 ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，６２０９（１９８８））。コアＮ結合炭 水化物は、プロα因子のＮ末端中の３つの部位に添加される［Ｅｍｔｅｒ等，Ｂ ｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１６，８２２（１ ９８３）；Ｊｕｌｉｕｓ等，Ｃｅｌｌ，３６，３０９（１９８４）；Ｊｕｌｉｕ ｓ等，Ｃｅｌｌ，３７，１０７５（１９８４）］。追加的のグリコシル化は、Ｋ ＥＸ２エンドペプチダーゼによるプロ−α因子の切断の前に、ゴリジ体中で起こ る。この酵素はスペース反復の各々の中を切断して、α因子ペプチドのＣ末端に 結合しているＬｙｓ−Ａｒｇ配列を残す［Ｊｕｌｉｕｓ等，Ｃｅｌｌ，３７，１ ０７５（１９８４）］。Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列はＫＥＸ−１プロテアーゼの作用に よって除去される［Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋａ等，Ｃｅｌｌ，５０，５７３（１９８ ７）］。α因子ペプチドのＮ末端に存在する追加のスペーサー残基は、ＳＴＥ１ ３によってコードされたジペプ チジルアミノペプチダーゼによって除去される［Ｊｕｌｉｕｓ等，Ｃｅｌｌ，３ ２，８３９（１９８３）］。４つのα因子ペプチドが、各前駆体タンパク質から 上記のタンパク質分解加工によって放出され、成熟α因子が細胞から分泌される 。 １２ａａ成熟ａ因子ペプチドの前駆体はＭＦａ１およびＭＦａ２遺伝子中にコ ードされ、そして夫々３６ａａおよび３８ａａ残基になる（ＭＦａ１遺伝子の図 式については、５を参照）。前駆体はａ因子の一つのコピーを含有し、そして２ つの遺伝子の生成物は１つのアミノ酸で配列が異なる。ａ因子の２つの形態はａ 細胞によって同量に産生される（Ｍａｎｎｅｙ等，真核微生物における性的相互 作用（ｉｎ Ｓｅｘｕａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔ ｉｃ ｍｉｃｒｏｂｅｓ），第２１頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８１））。 ａ因子の加工は、α因子の加工とはすべての詳細においては異なる工程を必要 とする。ａ因子の加工は細胞質ソル中で始まり、そしてファルネシルトランスフ ェラーゼによるカルボキシル末端近辺のＣ末端システイン残基（−ＣＶＩＡ）の ファルネシル化を含む［Ｓｃｈａｆｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，３７９（ １９８９）；Ｓｃｈａｆｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１１３３（１９９０ ）］。ファルネシルトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットは、それぞれ ＲＡＭ２およびＲＡＭ１によってコードされている［Ｈｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８，１１３７３（１９９１）］。ファルネシル化の 後に、修飾システィンに対してＣ末端である３個のアミノ酸の、膜結合エンドプ ロテアーゼによるタンパク質分解的除去が続く。次いで、カル ボキシ末端ファルネシル化システイン残基がさらに修飾される。カルボキシル基 はＳＴＥ１４遺伝子の生成物によってメチル化される。ＳＴＥ１４ｐは膜結合Ｓ −ファルネシルシステインカルボキシルメチルトランスフェラーゼである［Ｈｒ ｃｙｃｙｎａ等，ＥＭＢＯ．Ｊ．１０，１６９９（１９９１）］。ａ因子のＮ末 端加工の機構は解明されていない。前駆体の加工が完結した後、成熟ａ因子は、 ＳＴＥ６遺伝子［Ｋｕｃｈｌｅｒ等，ＥＭＢＯ．Ｊ．，８，３９７３（１９８９ ）］の生成物およびＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体によって細胞内腔に輸 送される。 正常なＳ．セレビシエ（出芽酵母）ａ細胞では、α因子はＧタンパク質結合膜 受容体ＳＴＥ２に結合する。Ｇタンパク質はＧ_αおよびＧ_βγサブユニットに解 離し、そしてＧ_βγは未同定エフェクターに結合し、それは順に多数の遺伝子を 活性化する。ＳＴＥ２０、キナーゼ、はＳＴＥ５、未知の機能のタンパク質を活 性化する。ＳＴＥ５はＳＴＥ１１キナーゼを活性化し、それがＳＴＥ７キナーゼ を刺激し、それがＫＳＳ１および／またはＦＵＳ３を誘発する。これらは転写因 子ＳＴＥ１２の発現のスイッチを入れる。ＳＴＥ１２は、ＦＵＳ１（細胞融合） 、ＦＡＲ１（細胞周期の阻止）、ＳＴＥ２（受容体）、ＭＦＡ１（フェロモン） 、ＳＳＴ２（修復）、ＫＡＲ３（核融合）、およびＳＴＥ６（フェロモン分泌） を含む、交配に関与する多種類の遺伝子の発現を刺激する。経路によって活性化 された他の遺伝子はＣＨＳ１、ＡＧα１、およびＫＡＲ３である。多重縦列配列 ＴＧＡＡＡＣＡは、この経路の遺伝子の多くの５′フランキング領域中に見出だ された「フェロモン反応要素」として認識された。 交配フェロモンに対する応答の一つは、細胞周期のＧ１相中の酵母細 胞の過渡休止である。これには、３つのＧ１サイクリン（ＣＬＮ１、ＣＬＮ２お よびＣＬＮ３）のすべてが不活性化されることが必要である。ＦＵＳ３はＣＬＮ ３を不活性化し、ＦＡＲ１はＣＬＮ２を阻害すると考えられる。（ＣＬＮ１を不 活性化する原因の生成物は未知である。） 増殖休止は多数の異なった機構によって停止される。第一に、フェロモン結合 の後、α因子受容体は内在化され、フェロモン結合部位の数が過渡的に減少する 。第二に、受容体のＣ末端尾部はリガンドの結合の結果リン酸化され、導入する Ｇタンパク質から受容体が脱離する。第三に、ＧＰＡ１ｐ（異種三量体Ｇタンパ ク質のＧαサブユニット）の発現のフェロモン誘発的増加は、Ｇ_βとＧ_γサブユ ニットに比してαサブユニットの水準を増加させ、遊離Ｇ_βγの水準の低下をも たらし、その結果フェロモン応答経路が不活性化する。追加の機構には、ＳＳＴ ２とＢＡＲ１の発現の誘発およびαサブユニットのリン酸化（多分ＳＶＧ１によ る）が含まれる。 シグナリングは、ＣＤＣ３６、ＣＤＣ３９、ＣＤＣ７２、ＣＤＣ７３、および ＳＲＭ１を含む、多数の遺伝子の発現によって阻害される。これらの遺伝子が不 活性化すると、シグナリング経路が活性化する。 同様のフェロモンシグナリング経路はα細胞中に認められるが、命名法は幾つ かの場合で異なる。（例えば、ＳＴＥ２の代わりにＳＴＥ３） 他の酵母もＧタンパク質媒介性交配因子応答経路を有する。例えば、融合酵母Ｓ．ポンベ （Ｓ．ｐｏｍｂｅ）では、Ｍ因子がＭＡＰ３受容体に結合するか、ま たはＰ因子がＭＡＭ２受容体に結合する。Ｇタンパク質の解離はキナーゼ・カス ケード（ＢＹＲ２、ＢＹＲ１、ＳＰＫ１）を活性化し、それは順に転写因子（Ｓ ＴＥ１１）を刺激する。しかし、Ｓ． ポンベ では、Ｇαサブユニットがシグナルを伝達し、勿論詳細においては他の相 違点がある。 酵母細胞中での外来タンパク質の発現 多種類の外来タンパク質がＳ．セレビシエ中で産生され、それらは酵母細胞質 中に残るか、または酵母分泌経路に導かれる（Ｋｉｎｇｓｍａｎ等，ＴＩＢＴＥ ＣＨ，５，５３（１９８７））。これらのタンパク質として、例えば、インスリ ン様増殖因子受容体（Ｓｔｅｕｂｅ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８ ，６５１（１９９１））、インフルエンザウイルス血球凝集素（Ｊａｂｂａｒ等 ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，２０１９（１９８５））、 ラット肝臓チトクロームＰ−４５０（Ｏｅｄａ等，ＤＮＡ，４，２０３（１９８ ５））および機能的哺乳類抗体（Ｗｏｏｄ等，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４４６（ １９８５））が挙げられる。酵母分泌経路の使用は、それが外来タンパク質の忠 実な折りたたみ、グリコシル化および安定化を達成する可能性を増加するから、 好適である。従って、酵母中での異種タンパク質の発現はしばしば、酵母分泌タ ンパク質の遺伝子（例えば、α因子フェロモンまたはＳＵＣ２［インベルターゼ ］遺伝子）中にコードされたシグナル配列と外来タンパク質遺伝子のコード領域 との融合を含む。 多数の酵母発現ベクターが、外来タンパク質の構成的または調節的発現を可能 にするように設計された。構成的プロモーターは、ホスホグリセリンキナーゼ（ ＰＧＫ１）またはアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）様の解糖酵素をコ ードするもののような高度に発現された遺伝子から誘導され、そして調節可能な プロモーターは、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）遺伝子を含む多数の遺伝子から 誘導された。さらに、超分 泌性の酵母変異株が誘導されることができる。これらの菌株はさらに効率的に哺 乳類タンパク質を分泌し、そして酵母中に大量の生物学的活性な哺乳類タンパク 質を生成する「産生」株として使用される（Ｍｏｉｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｗ ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，４９１（１９９１））。 異種Ｇタンパク質結合受容体は、Ｓ．セレビシエ中で機能的に発現したもので ある。ＭａｒｓｈとＨｅｒｓｈｋｏｗｉｔｚ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｓｙｍｐ．，Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５３：５５７−６５（１９８８ ））はＳ．セレビシエＳＴＥ２をＳ．クルイベン（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｎ）からの その相同体で置換すた。さらに劇的には、哺乳類ベーターアドレナリン受容体お よびＧαサブユニットが酵母中に発現し、酵母交配シグナル経路を制御すること が見出だされた。Ｋｉｎｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１２１−１２３（１９ ９０）。 Ｄｕｋｅ大学、国際特許第９２／０５２４４号明細書（１９９２年４月２日） には、酵母Ｇタンパク質αサブユニットを産生することができないが、哺乳類Ｇ タンパク質αサブユニットおよび上記の哺乳類Ｇタンパク質αサブユニット「と 結合する」（即ち、と相互作用する）哺乳類受容体の両方を産生するように遺伝 子操作された形質転換酵母が記載されている。具体的には、Ｄｕｋｅは、ヒト・ ベーター２アドレナリン受容体（ｈβＡＲ）、７つの膜内外受容体（ＳＴＲ）を 、酵母中、ＧＡＬ１プロモーターの制御下で、コード配列の最初の６３塩基対をＳＴＥ２ 遺伝子からの１１塩基対の非コード配列と４２塩基対をもつコート配列 で置換することによって改変されたｈβＡＲ遺伝子を用いて、発現させることを 報告している。（ＳＴＥ２は酵母α因子受容体をコードする）。 Ｄｕｋｅは、同族酵母タンパク質を欠く同一の細胞、酵母株８Ｃ中で、ラットＧ タンパク質αサブユニットを共発現させた。Ｄｕｋｅは、単離された膜がｈβＡ Ｒの種々の既知のアゴニストおよびアンタゴニストと適切に相互作用する能力の 研究によって示されるように、改変されたｈβＡＲは膜中に機能的に統合される ことを見出した。酵母発現ｈβＡＲに対するリガンド結合親和性は、天然産ｈβ ＡＲについて観察されたものと殆ど同一であると言われていた。リガンドが結合 すると、Ｇタンパク質媒介シグナルが導入される。Ｄｕｋｅはこれらの細胞中で は哺乳類アデニリルシクラーゼを共発現させられなかった。 酵母中での異種アデニリルシクラーゼの発現 アフリカトリパノソームは、宿主免疫防御を、それらの表面糖タンパク質を変 えることによって回避することができる原生動物寄生虫である。可変性の抗原性 は、コートタンパク質をコードしている遺伝子の逐次発現によって達成される。 可変性の表面糖タンパク質遺伝子（ＶＳＧ）は、不活動領域から活性な末端小粒 結合発現部位に転位する。発現部位関連遺伝子（ＥＳＡＧｓ）と呼称される追加 の転写解読枠（ＯＲＦｓ）はこれらの発現部位に見出される。トリパノソーマ・ ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）からクローン化されたＥＳ ＡＧ４は、Ｓ．セレビシエのアデニリルシクラーゼと相同性である配列を含有す ［Ｐａｙｓ等（１９８９）Ｃｅｌｌ，５７，８３５−８４５］。さらに、Ｔ．ブ ルセイのＥＳＡＧ４に相同性である、トリパノソーマ・エクイペルダム（Ｔｒｙ ｐａｎｏｓｏｍａ ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ）からのＥＳＡＧ（ｅＥＳＡＦ４ｃ） は、Ｓ．セレビシエのアデニリルシクラーゼ（ｃｙｒ−１）欠失変異株を補足す るアデニリルシクラーゼをコードすること が示された［Ｒｏｓｓ等（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，２０４７−２０５ ３］。 ｅＥＳＡＧ４ｃ ＯＲＦは、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベのアデニリルシ クラーゼの両方に相同性をもつ配列を含有する［Ｋａｔａｏｋａ等（１９８５） Ｃｅｌｌ，４３，４９３−５０５；Ｙａｍａｗａｋｉ−Ｋａｔａｏｋａ等（１９ ８９）ＰＮＡＳ，８６，５６９３−５６９７；Ｙｏｕｎｇ等（１９８９）ＰＮＡ Ｓ，８６，７９８９−７９９３］。トリパノソームと酵母との間に保存されてい る領域は酵母アデニリルシクラーゼ触媒的ドメイン内にあり、そして５０％の位 数で配列同一性を示す。ｅＥＳＡＧ４ｃ配列は、ウシ脳アデニリルシクラーゼ１ 型のそれと約４０％同一性である［Ｋｒｕｐｉｎｓｋｉ等（１９９０）Ｓｃｉｅ ｎｃｅ，２４４，１５５８−１５６２］。ｅＥＳＡＧ４ｃ配列によって予想され たタンパク質は、アデニリルシクラーゼ触媒性ドメインと相同性である配列をフ ランキングしている推定される膜内外ドメインをコードするＮ末端配列を有する 。 「ロイシンに富む反復」遺伝子系統群と相同性を有する配列は、トリパノソー マ・エクイペルダムのＥＳＡＧ内で同定されている［Ｔａｋａｈａｓｈｉ等（１ ９８５）ＰＮＡＳ，８２，１９０６−１９１０；Ｌｏｐｅｚ等（１９８８）ＰＮ ＡＳ，８５，２１３５−２１３９，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等（１９８８）Ｃｅｌｌ ，５２，２６９−２７９］。この系統群の成員によってコードされたタンパク質 は種々の機能に関与するが、しかしその反復配列は、膜会合およびタンパク質− タンパク質相互作用に関与すると考えられる。Ｓ．セレビシエでは、アデニリル シクラーゼの反復ドメインは、酵素のＲＡＳタンパク質による調節および酵素の 形 質膜との会合に必要である［Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ等（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，２５３９−２５４３；Ｆｉｅｌｄ等（１９９０）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ，２４７，４６４−４６７；Ｍｉｔｔｓ等（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，３８７３−３８８３］。ＥＳＡＧ内には、酵母中のＲａ ｓの調節機能と類似のトリパノソーメ中の調節機能を有すると仮定された、ヌク レオチド結合ドメイン［Ｆｌｏｒｅｎｔ等（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ ｏｌ．，１１，２１８０−２１８８］と限定された相同性をもつ配列がある。酵 母ｃｙｒ欠失変異株を補足する配列中には、ロイシンに富む反復領域もヌクレオ チド結合ドメインも含まれていない［Ｒｏｓｓ等（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．， １０，２０４７−２０５３］。Ｒｏｓｓ等（１９９１）は、これらの潜在的調節 配列の欠乏が、プラスミドからの内因性ＣＹＲ遺伝子を発現する酵母中で見られ るよりも、ｅＥＳＡＧｃを発現するｃｙｒ−１欠失変異株によって示される、よ り大きいアデニリルシクラーゼ活性の原因であると考えた。 トリパノソーマ・ブルセイのＶＳＧ領域からクローン化されたＥＳＡＧ４の外 に、Ｔ．ブルセイからクローン化された少なくとも３つの他の遺伝子、ＧＲＥＳ ＡＧ ４．１、４．２および４．３は、真核生物アデニル酸シクラーゼおよびグ アニル酸シクラーゼと配列相同性を持つ［Ａｌｅｘａｎｄｒｅ等（１９９０）Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，４３，２７９−２８８］。［「 ＧＲＥＳＡＧ」は発現部位関連遺伝子に関する遺伝子を示す。］ＥＳＡＧ ４お よびＧＲＥＳＡＧ４．１の両方はＳ．セレビシエのアデニリルシクラーゼ欠失変 異株、ｃｙｒ１Δ、を補足することができる。酵母膜フラクションに付随してい るトリパノソーム・シクラーゼはそれらのＣａ²⁺に対する反応が異なり、酵母中 で適切に調節されるようではない［Ｐａｉｎｄａｖｏｉｎｅ等（１９９２）Ｍｏ ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２，１２１８−１２２５］。 従って、酵母中で活性を表す（非調節であるが）ことがで示された異種アデニ リルシクラーゼは、トリパノソーム種から誘導される。トリパノソーム・シクラ ーゼ遺伝子は、酵母アデニリルシクラーゼの調節ドメインと相同性を持つ、ロイ シンに富むモチーフをコードしている配列の近辺の領域中に在る。このことは、 ２つの異なったトリパノソーム配列から誘導されたタンパク質が相互作用して、 調節性複合体を形成することを示唆している。これは、アデニリルシクラーゼの 活性が、酵素と調節性ＲＡＳタンパク質との相互作用によって制御される、サッ カロミセス・セレビシエ中の状態と類似していることができる。酵母酵素とトリ パノソーム酵素との間の配列および調節の相同性は、アデニリルシクラーゼを欠 失した酵母にトリパノソーム酵素をコードしている配列を補足することを助けた ようである。 酵母中で哺乳類アデニリルシクラーゼを発現させる試み 他の実験室による、酵母中で哺乳類アデニリルシクラーゼを発現させる以前の 試みは不成功であった。Ｔｅｘａｓ大学、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒのＡｌｆｒｅｄ Ｇｉｌｍａｎの研究室で研究しているＲｏｎａ ｌｄ Ｔａｕｓｓｉｇは、サッカロミセス・セレビシエ中で１型アデニリルシク ラーゼを発現させることを試みた（個人的連絡）。Ｔａｕｓｓｉｇによって使用 されたプロトコールは、哺乳類の１型アデニリルシクラーゼを用いた形質転換に よるｃｙｒ細胞 の救助を含んだ。シクラーゼ活性の測定基準はフォルスコリン含有培地中での試 験細胞の増殖であった。フォルスコリンは、哺乳類細胞中でアデニリルシクラー ゼ１−６型に直接に結合し、刺激することが知られている。Ｔａｕｓｓｉｇは、 哺乳類酵素で形質転換されたｃｙｒ細胞中には酵素活性を検出できなかった。即 ち、フォルスコリン含有培地中の形質転換細胞の増殖を検出することができなか った。 タマホコリカビ中での哺乳類アデニリルシクラーゼの発現 哺乳類２型アデニリルシクラーゼは、原始真核生物タマホコリカビ中で、公開 されていない方法によって、機能的に発現させられた。「Ｉｙｅｎｇａｒ（１９ ９３）に記載したＰ．Ｄｅｖｒｅｏｔｅｓからの個人的連絡」。タマホコリカビ から単離された２つのアデニリルシクラーゼ遺伝子、ＡＣＡ，の一つの構造は、 それが統合膜タンパク質である点において、哺乳類シクラーゼと構造的に類似し ていると予測される［Ｐｉｔｔ等、１９９２］。さらに、タマホコリカビ属は８ つのＧαサブユニットを発現することができ、その各々は哺乳類Ｇαタンパク質 と約４５％の配列相同性を有する［Ｈａｄｗｉｇｅｒ等，１９９１；Ｗｕ ａｎ ｄ Ｄｅｖｒｅｏｔｅｓ，１９９１］。酵母中で機能的哺乳類１型アデニリルシ クラーゼを発現させることが、Ｇｉｌｍａｎ研究室で成功せず、そしてタマホコ リカビ中で哺乳類酵素の発現が成功したことは、シグナルのこの酵素への導入に おける差異が、酵母とより高級な真核生物との間に存在することを示している。 さらに、これらの差異は、酵母中の哺乳類アデニリルシクラーゼによるシグナル 伝達経路を再現するいづれの試みにおいて考慮されなければならない。 ペプチドライブラリー ペプチドライブラリーは、多種類かつ多数のペプチド集合物を、標的との相互 作用を可能にする形態で、同時に提出するシステムである。これらのペプチドは 、溶液（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９１）、またはビーズ（Ｌａｍ，１９９１）、 チップ（Ｆｏｄｏｒ，１９９１）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ，ＵＳＰ ５，２２３， ４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ，ＵＳＰ，４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌ，１ ９９２）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ，Ｄｅｖｌｉｎ，Ｆｅｌｉｃｉ，Ｌａｄ ｎｅｒ，４０９）で提供されることができる。これらのペプチドの多くは、ペプ チドの最高の長さまたはペプチドの組成の点で、制限されている（例えば、Ｃｙ ｓは除外される）。支持体の近接のような立体因子は結合を妨害することができ る。通常、スクリーニングは、人工的に提供された標的に対する生体外での結合 についてであり、生活細胞中の細胞シグナル伝達経路の活性化または阻害につい てではない。細胞表面受容体は標的として使用されることができるが、スクリー ニングは、ペプチドの結合が受容体の配座のアロステリック変化を起こすかどう かを明らかにしない。 Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，０９６，８１５号明細書には、所望のＤＮＡ結 合活性によって新規のタンパク質またはペプチドを同定する方法が記載されてい る。多数の異なった潜在的結合タンパク質をコードしている半任意（「まだらな 」）ＤＮＡが、発現可能な形態で、適切な宿主細胞中に導入される。標的ＤＮＡ 配列は、タンパク質またはペプチドの結合が、選択的条件下で細胞に有害である 遺伝子生成物の発現を防止するように、遺伝子操作されたオペロン中に取り込ま れる。従って、選択的条件下で生残する細胞は、標的ＤＮＡに結合するタンパク 質を発現する細胞である。酵母細胞が試験に使用することができると教示されて いるが、細菌細胞が好適である。タンパク質と標的ＤＮＡとの間の相互作用は、 細胞中でのみ起こり、周辺質中では起こらず、そして標的は核酸であり、タンパ ク質ではない。 任意ペプチド配列による細胞タンパク質中の機能的ドメインの置換によって、 機能の達成のための特定配列の必要条件を幾らか決定することができる。細胞内 でのタンパク質の位置確認に作動する認識現象の詳細は未だ大部分未知であるが 、ミトコンドリア標的配列およびタンパク質分泌シグナル配列の配列変動上の制 約は、任意ペプチドを使用して解明された［それぞれ、Ｌｅｍｉｒｅ等，Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２０２０６（１９８９）およびＫａｉｓｅｒ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，３１２（１９８７）］。 酵母は、哺乳類受容体の潜在的アンタゴニストとして試験される外来ポリペプ チド変種を発現するように遺伝子操作された。変異グルカゴン分子をコードして いるライブラリーは、哺乳類グルカゴンのコード配列を含有するポリゴヌクレオ チドの合成中のヌクレオチドの任意的な取り込み間違いによって生じたものであ る。これらのライブラリーは酵母中で発現し、そして形質転換細胞からの培養液 は、ラット肝細胞膜中に存在するグルカゴン受容体に対するアンタゴニスト活性 を試験するのに使用された（Ｓｍｉｔｈ等，１９９３）。 本明細書中に引用されたすべての文献は引用することによって本明細書中に取 り込まれている。いずれの文献も先行技術を構成することは許可されない。 発明の要旨 本発明は酵母中での哺乳類アデニリルシクラーゼの機能的発現、およ び哺乳類アデニリルシクラーゼの潜在的阻害剤または活性化剤のみならず、遺伝 子操作された酵母際中で哺乳類アデニリルシクラーゼに天然でまたは人工的に「 結合」している他のタンパク質の潜在的阻害剤または活性化剤を同定するのに遺 伝子操作された酵母細胞を使用することに関する。本明細書中の用語「結合され た」は、結合タンパク質が阻害または不活性化されると、アデニリルシクラーゼ の阻害または不活性化（必ずしも夫々ではない）となることを意味する。ヒト・ アデニリルシクラーゼの機能的発現は特に望ましい。 サッカロミセス．セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）のアデニリルシクラーゼは、クローン化された哺乳類アデニリルシクラ ーゼの構造とは実質的に異なる構造を持つ周辺膜タンパク質である。最近までに クローン化された全部で６種の哺乳類アデニリルシクラーゼｃＤＮＡのすべては 、それらの全構造の顕著な部分を形成する複雑な膜内外構造を持つ統合膜タンパ ク質をコードしている。さらに、酵母は異種三量体Ｇタンパク質を含有するが、 これらのタンパク質はＳ．セレビシエのアデニリルシクラーゼの調節に関与しな いようであり、むしろ、酵母酵素はＧＴＰ結合タンパク質系統群の他の成員、Ｒ ａｓ１およびＲａｓ２によって調節される。従って、酵母アデニリルシクラーゼ は構造上および調節上で哺乳類酵素にあまり類似していないで、そして哺乳類酵 素がサッカロミセス中で機能させることができると考えることができなかった。 しかし、これらの不適合性は、哺乳類アデニリルシクラーゼおよび哺乳類Ｇタ ンパク質サブユニット、Ｇαｓ、の酵母中での共発現によって克服された。これ は、適切な酵母株を遺伝学的に操作することによって 達成された。本発明者等は野生型Ｇαｓ単独の存在が哺乳類アデニリルシクラー ゼを活性化するのに十分であると予想する先行理由を持っていなかった。本発明 者等は、哺乳類の７種のトランスメンブラン受容体を発現させ、その刺激が順番 にＧαｓおよび次いでシクラーゼを活性化することが必要であるという仮説の下 で研究してきた。それ故、本発明者らの結果は予想外の発見であった。 理論にしばられないならば、酵母細胞によって産生されたＧＴＰは哺乳類Ｇα ｓに結合し、それは順に哺乳類アデニリルシクラーゼを活性化すると現在考えら れる。この酵素はＡＴＰをサイクリックＡＭＰに転化し、それは酵母細胞の増殖 に必要である。それ故、酵母の生来のアデニリルシクラーゼが不活性である場合 、その増殖は哺乳類アデニリルシクラーゼの機能的発現に依存する。 好適には、酵母細胞は二倍体株、または酵母Ｇα、ＧβまたはＧγを発現しな い他の株である。 遺伝子操作された酵母細胞は、哺乳類アデニリルシクラーゼの阻害剤または活 性化剤を検出するのに使用することができる。所望に応じて、他の外因性タンパ ク質が哺乳類アデニリルシクラーゼに結合することができるので、他の外因性タ ンパク質の阻害剤または活性化剤が、アデニリルシクラーゼ活性に対するそれら の効果によって検出されることができる。好適な態様では、他の外因性タンパク 質は、以下に記載するように、フェロモン系タンパク質のための代理体である。 特に好適な態様では、他の外因性タンパク質は哺乳類Ｇタンパク質結合受容体で あり、それは酵母フェロモン受容体のための代理体である。 好適な態様では、選別された阻害剤および活性化剤は遺伝子操作され た酵母細胞中で共発現されたペプチドである。特に好適な態様では、培養された 酵母細胞はペプチドライブラリーを集合的に発現し、モジュレート的活性につい て選別される。 添付された請求の範囲は好適な態様の非制限的説明として取り扱われるべきで ある。 図面の簡単な説明図１．哺乳類アデニリルシクラーゼの構造的モデル この図は、Ｔａｎｇ等（１９９２年）Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５７，１３５−１４４に記載され た哺乳類アデニリルシクラーゼのモデルを採録したものである。Ｍ₁およびＭ₂は ２つのドメインを表し、各々は推定される６つの膜スパニング配列を含有する。 Ｎ₁およびＮ₂は共に短いアミノ末端尾部を含み、それは細胞内に存在すると考え られる。Ｎ₂配列は第一膜内外配列に近接している配列である。Ｃ_1aおよびＣ_1b は、２つの膜内外ドメインに結合する大きい細胞質ループを形成する。Ｃ_2aおよ びＣ_2b配列は、第二の大きい細胞質ループを形成する。Ｃ_2bで示されるＣ末端配 列は１型および３型アデニリルシクラーゼ中にのみ存在する。図２． 酵母自己分泌系の発生における逐次段階の略図 交配フェロモンの正常な合成および放出の略図を左上に図示する。２つの遺伝 子、ＭＦα１およびＭＦα２は、成熟α−因子を表すトリデカペプチドの各々４ つおよび２つの反復を含有する前駆体タンパク質（ＭＦα１ｐおよびＭＦα２ｐ ）をコードする。これらの前駆体は、小胞体中のシグナル配列の切断で始まりそ してリーダーペプチドのグリコシル 化およびプロテアーゼＫＥＸ２ｐ、ＳＴＥ１３ｐ、およびＫＥＸ１ｐによる切断 の両方を含む一連の酵素反応中でタンパク質分解的に加工される。結果は成熟α −因子の分泌であり、それは、通常ａ細胞の表面上に正常に発現したＳＴＥ２ｐ に結合すると、増殖停止を含むａ細胞中の多数の変化を誘発する。ａ細胞は、順 に、２つの遺伝子、ＭＦａ１およびＭＦａ２を発現させ、それらはａ−因子のた めの前駆体（ＭＦａ１ｐおよびＭＦａ２ｐ）をコードする。これらの前駆体はＲ ＡＭ１およびＲＡＭ２によるファルネシル化、Ｃ末端の３個のアミノ酸のタンパ ク質分解的切断（仮にＲＡＭ３ｐと同定されたタンパク質による）、新たに露呈 したＣ末端のシステインのＳＴＥ１４ｐによるカルボキシメチル化、および仮に ＳＴＥ１９ｐと同定された活性によるＮ末端リーダー配列のタンパク質分解的除 去を受ける。Ｓｔｅ５ｐによって細胞から成熟ａ−因子が輸出されると、それは α細胞の表面上に発現したＳＴＥ３ｐに結合し、それらの増殖を停止させる。 段階１は、ＳＳＴ２、ＦＡＲ１、およびＨＩＳ３が不活性化され、ｆｕｓ１： ：ＨＩＳ３にような適切なリポーター構築物がαおよびａ細胞の両方のゲノム中 に統合される酵母菌株の発生を含む。α細胞は、正常に発現したＳＴＥ３ｐのＳ ＴＥ２ｐによる置換によってさらに改造され、他方ａ細胞は、正常に発現したＳ ＴＥ２ｐのＳＴＥ３ｐによる置換によってさらに改変される。その結果得られた 菌株はヒスチジン欠乏培地中で、外因性フェロモンの不在下で増殖を示すべきで ある。 段階２は、最初に、細胞中のＭＦα１とＭＦα２の不活性化および段階１中で 発生したａ細胞中のＭＦａ１とＭＦａ２の不活性化を含む。これらの改変によっ て、ヒスチジン栄養要求性である菌株が生成する。次 に、適切な発現プラスミドが導入される。即ち、α−因子をコードしているオリ ゴヌクレオチドを含有する発現プラスミドｐＡＤＣ−ＭＦ（図４を参照）は、α 細胞に、ヒスチジン欠乏培地で増殖する能力を与えべきである。ａ−因子をコー ドしているオリゴヌクレオチドを含有する発現プラスミドｐＡＤＣ−ＭＦａ（図 ６を参照）は、ａ細胞が、ヒスチジン欠乏培地で増殖することを可能にするべき である。 段階３は、発現プラスミドの挿入のために、段階２で発生させた細胞を使用す る。しかし、真性フェロモンをコードするオリゴヌクレオチドを含有するプラス ミドを使用する代わりに、酵母は、任意または半任意オリゴヌクレオチドを含有 する発現プラスミドで形質転換される。ヒスチジン欠乏培地で増殖することがで きる形質転換体を増殖させ、そしてそれらのプラスミドは挿入されたオリゴヌク レオチドの配列決定のために単離される。 発明の好適な態様の詳細な説明１．一般的考察 １．１ 定義 本発明の目的のためには、「外因性」タンパク質とは、当酵母細胞によって天 然で産生されたタンパク質とアミノ酸配列が十分に異なり、それ故その最も近接 の同族物が酵母細胞以外の細胞によって産生されたタンパク質であるようなタン パク質である。この同族タンパク質を産生する細胞は、微生物細胞（酵母細胞以 外の）、植物細胞または動物細胞であることができる。動物細胞の場合、それは 無脊椎動物（例えば、昆虫または線虫）または脊椎動物（例えば、鳥類、魚類ま たは哺乳類、特にヒト）起源のものであることができる。それが、正常な人間の 染色体に よって、またはヒト細胞中に感染し複製するウイルスのゲノムによってコードさ れているかどうかに関係なく、タンパク質は、例えば、ヒト起源のものと考えら れる。 酵母フェロモンの翻訳後修飾、移送、認識またはシグナル形質導入に関与する 酵母タンパク質は、「フェロモン系タンパク質」（ＰＳＰ）と呼称され、そして 十分にＰＳＰの代理をすることができ、遺伝子操作された酵母細胞中で酵母タン パク質の役割を、少なくとも幾つかの環境下で、実行することができる同族の非 酵母タンパク質は、ＰＳＰ代理体と呼称される。 アデニリルシクラーゼの「活性化剤」とは、適切な酵母細胞中で、アデニリル シクラーゼをさらに活性にして、前記細胞中のｃＤＮＡシグナルを検出可能な程 度まで増強させる物質である。活性化剤の作用の様式は、直接的、例えば、シク ラーゼに結合することによるか、または間接的、例えば、シクラーゼと別の方法 で相互作用する他の分子に結合することによるものであることができる。 反対に、アデニリルシクラーゼの「阻害剤」とは、適切な酵母細胞中で、シク ラーゼを低活性にして、ｃＤＮＡシグナルを検出可能な程度まで低下させる物質 である。この低下は完全または部分的、および直接的または間接的効果によるも のとすることができる。 フェロモン系タンパク質代理体の「活性化剤」とは、適切な酵母細胞中で、フ ェロモン系タンパク質代理体をさらに活性にして、前記細胞の原生または改変フ ェロモンシグナル経路によって導入されたシグナルを検出可能な程度に増強させ る物質である。代理体は最初は非機能的であるが、活性化剤の作用の結果として 機能的にすることができるか、また はそれは機能的であることができ、そして活性化剤の効果は代理体の活性を向上 させることである。活性化剤の作用の様式は、直接的、例えば、代理体に結合す ることによるか、または間接的、例えば、代理体に別な方法によって相互作用す る他の分子に結合することによるものであることができる。ＰＡＰ代理体がフェ ロモン受容体の代理体体であり、そして活性化剤がフェロモンの代理をする場合 、活性化剤を受容体のアゴニストと呼称するのが習慣である。 反対に、フェロモン系タンパク質代理体の「阻害剤」とは、適切な酵母細胞中 で、ＰＳＰ代理体を低活性にして、導入されたシグナルを検出可能な程度に低下 させる物質である。低下は完全かまたは部分的であることができる。ＰＳＰ代理 体がフェロモン受容体の代理体であり、そして阻害剤が受容体に結合するために フェロモンと競合する場合、阻害剤を「アンタゴニスト」と呼称するのが習慣で ある。 用語「モジュレーター」には、「活性化剤」および「阻害剤」が含まれる。 「哺乳類アデニリルシクラーゼ」とは、哺乳類中に天然に存在するアデニリル シクラーゼと同一であるか、またはかかるアデニリルシクラーゼと実質的に相同 でありそして配列が酵母アデニリルシクラーゼよりもそれに類似している変異体 であるかいずれかのタンパク質である。「霊長類アデニリルシクラーゼ」または 「ヒト・アデニリルシクラーゼ」のような関連用語は相似的に定義される。哺乳 類アデニリルシクラーゼは、単独もしくは他の外因性タンパク質と提携した場合 、酵母タンパク質と「機能的に相同で」あるか、または薬物によって修飾された 後、それは遺伝子操作された酵母細胞内のアデニリルシクラーゼ活性を与えるこ と ができる。それは酵母タンパク質と同じほど効率的であることは必要ではないが 、しかしそれが同族酵母タンパク質の活性の少なくとも１０％を有することが望 まれる。 代理ＰＳＰタンパク質が、単独もしくは薬物によって修飾された後、遺伝子操 作された酵母細胞内で酵母ＰＳＰの機能または類似の機能を実行することができ る場合、代理ＰＳＰタンパク質は酵母タンパク質に「機能的に相同で」ある。そ れが酵母タンパク質と同じほど効率的であることは必要ではないが、しかしそれ が酵母タンパク質のフェロモン系関連活性の少なくとも一つの少なくとも１０％ を有することが望まれる。それが酵母タンパク質と同一の範囲の作用を有するこ とは必要ではなく、例えば、それが受容体である場合、それは外因性受容体の場 合と完全に異なるリガンド、または幾つかの共通のリガンドおよび幾つかの新規 のものに応答することができる。表２の受容体は、それらが酵母フェロモンに応 答せず、そしてそれらがＧ結合受容体であるが、それらが未修飾の外因性Ｇタン パク質に結合することができない場合でも、酵母フェロモン受容体と機能的に相 同であると考えられる。これは「相似的機能」と考えられる。 ＰＳＰ代理体は、機能的である薬物による幾つかの方法で修飾されなければな らないタンパク質であることができる。例えば、薬物はＰＳＰ代理体の立体配座 にアロステリック変化を起すことができるか、またはそれは代理体の一部を切断 して、次いでタンパク質の平衡を機能的分子とすることができる。 ＰＳＰ代理体はまた、他の改変が酵母細胞中に行われた場合のみ、例えば、外 因性Ｇタンパク質結合受容体と相互作用するキメラＧαサブユ ニットの発現、機能的であるものとすることができる。 用語「実質的に相同的」とは、アミノ酸配列との関連で使用された場合、立体 配座の相同性および従って類似の生物学的活性を与える、配列が実質的に同一か または類似である配列をいう。この用語は配列の通常の進化を含むことを意図さ れていない。 典型的には、「実質的に相同的」アミノ酸配列は、該技術分野で許容された方 法によって並べられた場合、所望の活性に関与すると知られている少なくともい ずれの領域に亙って、配列の少なくとも５０％、さらに好適には少なくとも８０ ％同一である。本発明者らが使用する配列アラインメントツールは、ＧＣＧ（Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄ ｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７１１）から入手した配 列分析ソフトウエアパッケージ、７．３版の一部である。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓ ｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ［Ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２，４８２−４８９（１９８１）］の相同性アルゴ リズムを使用して２つの配列の最良のアラインメントを同定する。最初は、パラ メーターを以下のように設定した。即ち、マッチ＝１．０ ギャップ・ウエイト ＝１．０ ミスマッチ＝−０．９ レングス・ウエイト＝０．０ 「ロウロード 」オプションも［ハイロード］オプションも選択していない。 最も好適には、末端以外で５個以下の残基が異なる。好適には、配列の、少な くとも上記の領域での、拡散性が、「保存的修飾」の形態にある。 「保存的修飾」は以下のように定義される。 （ａ）下記のアミノ酸の保存的置換；および （ｂ）末端での、インタードメイン境界での、ループ中、または比較的に高い移 動性をもつ他のセグメント中のアミノ酸の単一もしくは多重挿入または欠失。 好適には、末端を除く、約５個以下のアミノ酸が特定の遺伝子座に挿入または 除去され、そして修飾は、活性に重要な結合部位を含有すると知られている領域 の外にある。 保存的置換は、本明細書では、以下の５つの群の一つの中での交換と定義され る。 Ｉ． 小さい脂肪族、非極性または僅かに極性残基： Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ） ＩＩ． 極性、陰電荷残基、およびそれらのアミド： Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ ＩＩＩ．極性、陽電荷残基： Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ ＩＶ． 大きい、脂肪族、非極性残基： Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ） Ｖ． 大きい、芳香族残基： Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ 残基Ｐｒｏ、ＧｌｙおよびＣｙｓは特殊な立体配座的役割を有するから、括弧 書きしてある。Ｃｙｓはジスルフィド結合の形成に参加する。Ｇｌｙは鎖に柔軟 性を与える。Ｐｒｏは鎖に剛性を与え、αヘリックスを分断する。これらの残基 はポリペプチドのある種の領域において必須であり得るが、他のところでは置換 可能である。 「半保存的置換」とは、本明細書では、スーパー群Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ内または スーパー群ＩＶ／Ｖ内の置換であるが、群Ｉ−Ｖの単独の１群内の置換ではない と定義される。置換が保存的でない場合、それは好適には半保存的である。 ２つの調節性ＤＮＡ配列（例えば、プロモーター）は、それらがヌクレオチド 配列の実質的同一性の結果と実質的に同一の調節的効果を有する場合、「実質的 に相同的」である。典型的には、「実質的に相同的」配列は、少なくとも所望の 調節に関与していると知られている領域において、少なくとも５０％、さらに好 適には少なくとも８０％同一である。最も好適には、５個以下の塩基が異なる。 「不活性化」は、機能的遺伝子生成物が防止または抑制されることを意味する 。不活性化は、遺伝子の欠失、発現が起こらないようなプロモーターの突然変異 、遺伝子生成物が不活性であるようなコード配列の突然変異、または遺伝子生成 物の生物学的活性に必要な因子を与える欠損によって達成される。不活性化は部 分的または全体であることができる。「機能的発現」とは、その遺伝子生成物が 発現するだけではなく、発現細胞内で生物学的に活性であるような条件下での遺 伝子の発現をいう。 用語「自己分泌性細胞」とは、本明細書で使用される場合、その細胞のシグナ ル伝達経路を刺激することができる物質を産生する細胞をいう。野生型αおよび ａ細胞はフェロモン経路に関して自己分泌性ではない。しかし、α−因子とα− 因子受容体の両方、またはａ−因子とａ−因子受容体の両方を産生する酵母細胞 は、機能的形態において、極めて自己分泌性である。拡張すると、Ｇタンパク質 結合受容体、酵母フェロモン受容体の代理体を活性化する能力についてスクリー ニング されているペ プチドを産生する酵母細胞は、それは「推定される自己分泌性細胞」と呼ぶのが もっと正確であるが、「自己分泌性細胞」と呼ばれる。勿論、多数の種々のペプ チドが産生される、かかる細胞のライブラリー中では、細胞の一つまたはそれ以 上は、用語の厳密な意味において「自己分泌性」であるようである。１．２ キメラタンパク質の設計 未修飾の哺乳類または他の外因性タンパク質が、酵母細胞中で所望の程度まで 、機能的に発現されることができない場合、酵母細胞を、興味を起こさせる外因 性タンパク質のキメラおよび同族酵母タンパク質であるタンパク質を発現するよ うに遺伝子操作することができる。用語「キメラ」は、配列の一部が（例えば） 哺乳類タンパク質よりも酵母タンパク質に対して相同的であり、そして他の部分 は逆であることを包含する。可能な組合せとして、哺乳類／酵母、酵母／哺乳類 、哺乳類／酵母／哺乳類、および酵母／哺乳類／酵母が挙げられる。 機能的キメラは組織的な合成と試験の戦略によって同定することができる。理 論的考えられるすべてのキメラが直接に評価される必要はない。 １つの戦略を、以下に図式的に記載する。本発明者らは直線のタンパク質配列 を２つまたはそれ以上の試験可能な単位に分断した。これらの単位は等しい長さ または異なった長さとすることができる。好適には、単位は、機能的ドメインに 対応するか、或いは配列の特殊な特徴、例えば、異常に高い多様性もしくは類似 性をもつ領域、関連するタンパク質系統群中または配列モチーフの存在下の保存 的もしくは非保存的な領域、或いは異常な親水性もしくは疎水性の区域に対応す るように、分離される。「Ｙ」で酵母タンパク質の単位を表し、「Ｍ」で哺乳類 タンパク質 の対応する単位を表す。５個（２、３、４、６、１０等の代わりに５を選択する のは任意的である）の単位がある場合、以下のキメラのいずれかまたはすべてを 合成し試験することができ、これは重要な領域を迅速に位置を確認する助けとな る。 （ａ）酵母配列の代わりに哺乳類配列による漸進的Ｃ末端置換、例えば、 ＹＹＹＹＹ ＹＹＹＹＭ ＹＹＹＭＭ ＹＹＭＭＭ ＹＭＭＭＭ ＭＭＭＭＭ （ｂ）酵母配列の代わりに哺乳類配列による漸進的Ｎ末端置換、例えば、 ＹＹＹＹＹ ＭＹＹＹＹ ＭＭＹＹＹ ＭＭＭＹＹ ＭＭＭＭＹ ＭＭＭＭＭ （ｃ）二重末端置換、例えば、 ＭＭＭＭＭ ＹＭＭＭＹ ＹＹＭＹＹ ＹＹＹＹＹ および ＹＹＹＹＹ ＭＹＹＹＭ ＭＭＹＭＭ ＭＭＭＭＭ、 並びに （ｄ）単独置換「走査（Ｓｃａｎｓ）」、例えば、 ＭＹＹＹＹ ＹＭＹＹＹ ＹＹＭＹＹ ＹＹＹＭＹ ＹＹＹＹＭ および ＹＭＭＭＭ ＭＹＭＭＭ ＭＭＹＭＭ ＭＭＭＹＭ ＭＭＭＭＹ これらの試験で得たデータに基づけば、例えば、酵母膜上に現れる酵母配列と 哺乳類配列との間の基本的な差異は、第５単位中にあるようである。そこで、そ の単位をサブ単位に分断して、さらに試験することができる。例えば、 ＭＭＭＭ （ｍｍ） ＭＭＭＭ （ｍｙ） ＭＭＭＭ （ｙｍ） ＭＭＭＭ （ｙｙ） 式中、丸括弧内は第５単位が分断された２つのサブ単位を表す。１．３ 機能的突然変異体の設計、全般的 タンパク質は以下の突然変異を耐容するようである。 （ａ）挿入または欠失よりむしろ、置換である； （ｂ）内部よりむしろ、末端の挿入または欠失； （ｃ）内部残基よりむしろ、表面残基に影響する； （ｄ）結合部位から遠位の分子の部分に影響する； （ｅ）一つのアミノ酸による、類似の大きさ、電荷、および／または疎水性を もつ他のアミノ酸の置換；および （ｆ）興味を起こさせるタンパク質が属する相同性タンパク質の系統群の中で の実質的な変異をうける部位である。 これらの考察は機能的変異体を設計するのに使用することができる。 表面残基対内部残基 荷電残基の殆ど常にタンパク質の表面上に在る。非荷電残基の場合、必然性は 少ないが、一般的に、親水性残基は表面に分配されているが、疎水性残基は内部 に分配されている。勿論、膜タンパク質の場合、膜スパニング・セグメントは疎 水性残基に富むようである。 表面残基は、種々の標識技術によって、またはＸ線回折およびＮＭＲのような ３−Ｄ構造マッピング技術によって、実験的に同定することができる。相同タン パク質の３−Ｄモデルは有用であることができる。 結合部位残基 結合部位を形成する残基は、（１）タンパク質をそる標的に複合させる前およ び後に、表面残基を標識する効果を比較すること、（２）結合部位を直接にアフ ニティーリガンドで標識すること、（３）タンパク質を断片にして、その断片を 結合活性について試験すること、および（４）どの変異体が結合を破壊するかを 決定する系統的突然変異誘発（例えば、アラニン走査突然変異誘発）によって、 同定することができる。相同タンパク質の結合部位が既知の場合、結合部位は類 似性によって仮定することができる。 タンパク質ライブラリーを構築しスクリーニングすることができるので、大き い系統群（例えば、１０⁸）の関連変異体を同時に評価することができる。２．哺乳類アデニリルシクラーゼ ２．１ 概観 哺乳類細胞中で異種三量体タンパク質によって導入されたシグナルは、エフェ クターと呼ばれる分子の作用を通して細胞内の出来事を影響する。これらのエフ ェクター分子を特徴とする最良のものの一つにホルモン感受性酵素、アデニリル シクラーゼがある。１９９４年初期の現在、アデニリルシクラーゼの６種の全長 および２種の部分的ａＤＮＡクローンが、多種類の哺乳類組織から得られている 。コードされているタンパク質の配列分析８種の酵素型が同定され、他方機能的 特性からそれらを５種の系統群（ＦＡＳＥＢ Ｊ．７，７６８−７７５）に分類 することが決定された。第一の系統群は１型アデニリルシクラーゼからなり、こ の酵素は、Ｇαｓを経るホルモン受容体によって、フォルスコリンによって、お よびＣａ⁺／カルモジュリンによって刺激される。１型をコードして いるｃＤＮＡはウシ脳ライブラリーから単離された［Ｋｒｕｐｉｎｓｋｉ等，（ １９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１５５８−１５６４］。１型酵素の活性は Ｇβγサブユニットの発現によって抑制される。細胞中で発現した他の各クロー ン化哺乳類シクラーゼはＧαｓによっておよびフォルスコリンによって刺激され る。しかし、Ｇβγに対するおよびＣａ⁺／カルモジュリンに対する反応はこれ らの他の酵素間で異なることが示された。 第二の系統群は２型および４型アデニリルシクラーゼからなる。これらの酵素 はＧβγによって刺激されるが、その刺激は活性化Ｇαｓの存在に依存する。こ の第二系統群に属する酵素は、ラット脳からクローン化され［Ｆｅｉｎｓｔｅｉ ｎ等，（１９９１）ＰＮＡＳ，８８，１０１７３−７７］、および試験された［ Ｇａｏ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ（１９９１）ＰＮＡＳ，８８，１０１７８−１０ １８２］。アデニリルシクラーゼのこの系統群はＣａ⁺／カルモジュリンに対し 非感受性である。２型および４型アデニリルシクラーゼは、配列相同性によって 関連しているが、分布および調節において異なる。２型メッセージは脳および肺 組織中に見出され、一方４型はさらに広く発現して、脳、肝臓、心臓、肺臓およ び精巣中に検出されている。２型酵素および４型を除いて最近までにクローン化 された他のすべての哺乳類アデニリルシクラーゼは、プロモーターキナーゼＡに よるリン酸化のための潜在的部位を含有する。さらに、２型酵素は活性化プロモ ーターキナーゼＣによって実質的に刺激されることが知られ、一方４型アデニリ ルシクラーゼはそのキナーゼによって影響されない。 ラット嗅覚組織からクローン化された３型アデニリルシクラーゼ［Ｂ ａｋａｌｙａｒ ａｎｄ Ｒｅｅｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，１４ ０３−１４０６］は、嗅覚神経上皮中で豊富に発現し、Ｃａ⁺／カルモジュリン による刺激に対して感受性であり、Ｇβγの存在によって直接には影響されない 。３型酵素は嗅覚シグナル形質導入の中心となることができる。 アデニリルシクラーゼの第４の系統群は、イヌ心臓［Ｉｓｈｉｋａｗａ等（１ ９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１３５５３−１３５５７］、ラット 肝臓および腎臓［Ｐｒｅｍｏｎｔ等（１９９２）ＰＮＡＳ，８９，９８０８−９ ８１３］、マウスのリンパ腫細胞［Ｐｒｅｍｏｎｔ等（１９９２）Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌｏｇｙ，１３１，２７７４−２７８３］を含む多種類の起源から、およ びマウス／ハムスターハイブリッド細胞株ＮＣＢ−２０［Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ（１９９２）ＰＮＡＳ，８９，６７１６−６７２０］から クローン化された。これらの酵素は配列に基づいて５型および６型と呼ばれ、活 性化Ｇαｓの存在または不在下で、Ｇβγによって影響されず、低濃度のＣａ⁺ によって阻害される。５型および６型のための多重メッセージが観察され、その ことは別にスプライスされた形態が存在することを示唆する。６型酵素は、Ｎ末 端の１４個のアミノ酸ストレッチの存在または不在によって異なる、長形態およ び短形態で存在することが示された（Ｉｙｅｎｇｅｒ（１９９３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，７，７６８−７７５）。５型および６型は、アデニリルシクラーゼ亜型の 間で最高度の配列拡散性が存在する推定される膜内外領域中で、５０％を超える 相同性を含む顕著な全配列の類似性を示す（Ｋａｔｓｕｓｈｉｋａ等（１９９２ ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，８７７４−８ ７７８）。５型と同様に、６型発現は心臓および脳で最高であり、５型と相違し て、６型のｍＲＮＡはまた多種類の他の組織中に検出される。 Ｓ４９マウスのリンパ腫細胞株から部分的ｃＤＮＡとしてクローン化された７ 型アデニリルシクラーゼは［Ｋｒｕｐｉｎｓｋｉ等（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６７，２４８５８−２５８６２］、２型酵素と関連しているようで ある。８型アデニリルシクラーゼを呼ばれる第二の部分的クローンは、ヒト脳ラ イブラリーから得られ、そして既に特性決定された酵素と異なるタンパク質をコ ードし［Ｐａｒｍａ等（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．１７９，４５５−４６２］、脳特異性であることができる［Ｋｒｕｐ ｉｎｓｋｉ等（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２４８５８−２ ５８６２］。 大多数の哺乳類アデニリルシクラーゼは統合膜タンパク質である。クローン化 された酵素の配列分析から、各々６個の疎水性配列を含有する２つのドメイン中 に存在する１２の膜スパニングの領域の存在が推測される。短Ｎ−および長Ｃ− 末端配列が細胞内に存在すると推定される。各種アデニリルシクラーゼ型間の全 配列類似性はは約５０％であり、幾つかの分離体の間により大きい相同性がある と、亜系統群に分類される。６つの膜内外配列（Ｃ１）の第一セットと第二セッ トとの間に、２つの大きい細胞質ドメイン、３５０個のアミノ酸ループが存在し 、そして伸長Ｃ−末端尾部（２５０−３００個のアミノ酸）が６つの膜内外配列 （Ｃ２）の第二セットに続く。これらの細胞質ドメインの一部は、クローン化さ れたグアニリルシクラーゼ［Ｃｈｉｎｋｅｒ ａｎｄ Ｇａｒｂｅｒｓ（１９９ １）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０，５５３−５ ７５］中に同定され、ある程度相互に相同性があり（Ｃ１とＣ２ドメインの間の ６０−８０％相同性）、そして最近までに配列決定された（５０−９２％）哺乳 類アデニリルシクラーゼ［Ｉｙｅｎｇａｒ（１９９３）ＦＡＳＥＢ，Ｊ．，７６ ８−７７５；Ｋｏｅｓｌｉｎｇ等（１９９１）］ＦＡＳＥＢ，Ｊ．，５，２７８ ５−２７９１；Ｔａｎｇ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ，７０， ８６９−８７２］中で高度に保存的である触媒性ドメインに対する配列類似性を 持っている。反対に、種々のアデニリルシクラーゼの膜内外領域は相互の配列相 同性を欠く。 グアニリルシクラーゼの触媒性ドメインに対する配列相同性とは別に、ウシＩ 型アデニリルシクラーゼのドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）相同体を分析 すると、哺乳類酵素のＣ−末端尾部は触媒作用に貢献するという追加の証明が得 られる。ドロソフィラ酵素のＣ末端細胞質ドメイン中の点突然変異（Ｇｌｙから Ａｒｇ）によって、アデニリルシクラーゼ活性が減少する。この突然変異は、す べての哺乳類アデニリルシクラーゼ分離体［Ｌｅｖｉｎ等（１９９２）Ｃｅｌｌ ，６８，４７９４８９］中で完全に保存されているグリシン残基を変える。Ｃ１ およびＣ２の保存的ドメイン中の点突然変異はよって、哺乳類酵素の触媒的活性 は減少する（Ｔａｎｇ等，１９９２年，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５７，１３５−１４４）。さらに、中央 細胞質ループまたはＣ末端尾部配列のいずれも欠くアデニリルシクラーゼの切断 された形態は、酵素活性を有しない。従って、分子のいずれかの半分の発現は不 活性な酵素を与え、一方両方の半分の共発現は部分的に触媒活性を回復する［Ｔ ａｎｇ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，８５９５−８６０３ ］。分子の２つの半分の 共発現は全部の活性を回復しないから、酵素の膜内外ドメインは、タンパク質の ２つの大きな細胞質領域の間の最適の相互作用を指示し、従って活性部位の安定 な形成を指示する［Ｉｙｅｎｇａｒ（１９９３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，７，７６８ −７７５］という仮説が設けられた。グアニリルシクラーゼの可溶性形態は、ア デニリルシクラーゼの高度に保存的なＣ１およびＣ２領域に対する相同性を持つ 配列を与える各サブユニットとの異種二量体として機能することが知られている ［Ｎａｋａｎｅ等（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，４７９−４ ８９］。 活性部位安定化の提案された役割とは別に、アデニリルシクラーゼ機能に対す る膜内外ドメインの貢献は不可解である。疎水性ドメインはフォルスコリン作用 のための部位であるようである。フォルスコリンは、Ｇタンパク質結合受容体ア ゴニストの不在下で、哺乳類細胞中のアデニリルシクラーゼに特異的に結合しそ して活性化する脂質可溶性ジテルペンである。フォルスコリンは、哺乳類の精巣 特異性シクラーゼに対しまたは細菌シクラーゼに対し効果を有しない；これらの タンパク質は細胞質ゾル状（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）である。しかし、タマホコリ カビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）のＡＣＡシクラーゼ、統合膜タンパク質、 はフォルスコリンに対して非感受性であり、他方哺乳類２型シクラーゼはタマホ コリカビ中で発現した場合、ジテルペンによる刺激に対して感受性である［Ｉｙ ｅｎｇａｒ（１９９３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，７，７６８−７７５に記載のＰ．Ｄ ｅｖｒｅｏｔｅｓからの個人的文通］。 好適には、酵母細胞は遺伝子操作されて、１、２、３、４、５、６、７または ８型哺乳類アデニリルシクラーゼを発現する。２型のシクラーゼは特に好適であ る。上記の型の内、以下のシクラーゼが特に興味を起 させる。 数種の種からの哺乳類アデニリルシクラーゼの１０種もの相違するアイソフォ ームがクローン化された。Ｉ〜ＶＩＩＩ型が配列決定され、文献に報告されてい る。ＩＸ型およびＸ型のクローニングおよび配列決定は出版されていないが、Ｘ 型の配列は１９９５年２月のＧｏｒｄｏｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで発表された 。配列が発表されているこれらのアイソフォームは以下の通りである。ウシＩ型 （Ｋｒｕｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１５５８−１５６４ ，１９８９）；ヒトＩＩ型（Ｓｔｅｎｇｅｌ，Ｄ．等，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，９ ０：１２６−１３０，１９９２）；ラットＩＩ型（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ，ＰＧ等 ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０１７３−１０１ ７７，１９９１）；ラットＩＩＩ型（Ｂａｋａｌｙａｒ，ＨＡ，ａｎｄ Ｒｅｅ ｄ，ＲＲ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１４０３−１４０ ６，１９９０）；ラットＩＶ型（Ｇａｏ，Ｂ．ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ． ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０１７８−１０１ ８２，１９９１）；イヌＶ型（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．，２６７：１３５５３−１３５５７，１９９３）；ウサギＶ型（Ｗａｌｌ ａｃｈ，Ｊ．等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，３３８：２５７−２６３，１９９４）； イヌＶＩ型（Ｋａｔｓｕｓｈｉｋａ，Ｓ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：８７７４−８７７８，１９９２）；マウスＶＩ型（Ｙｏ ｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６７１６−６７２０，１９９２）；ラット ＶＩ型（Ｐｒｅｍｏｎｔ，Ｒ．Ｔ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ，８９：９８０８−９８１３、１９９２）；マウスＶＩＩ型（Ｗａｔｓ ｏｎ，Ｐ．Ａ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２８８９３−２８８９８ ，１９９４）；ヒトＶＩＩＩ型（Ｄｅｆｅｒ，Ｎ．等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ３５１：１０９−１１３，１９９４）；ラットＶＩＩＩ型（Ｃａｌｉ，Ｊ．Ｊ． 等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１２１９０−５，１９９４） 種々のアイソフォームの数種の調節に関する詳細な情報は入手可能である。最 近までの出版されたアイソフォームは、Ｇαｓサブユニット、Ｇβγサブユニッ ト、カルシウム、およびプロティンキナーゼＣによる制御において異なるが、す べてのものはＧαｓによって活性化される（Ｔａｕｓｓｉｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６９：６０９３−６１００，１９９４；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１２２５３−１２ ２５６，１９９ ３；Ｃｏｏｐｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：４２１−４２４，１９９５）。本 発明は、酵母中の機能的および調節可能な活性体として、これらのアデニリルシ クラーゼを提供するのに使用することができる。 本発明は、現在既知の哺乳類アデニリルシクラーゼ、またはかかるシクラーゼ の現在既知の型の発現に限定されるものではない。 シクラーゼは好適には、霊長類、特にヒトのシクラーゼであるが、齧歯目（ネ ズミ、ラット、ウサギなど）、偶蹄目（ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシなど）もしく は食肉目（ネコ、イヌなど）または他の哺乳目の哺乳類に関連するシクラーゼで あることができる。 本発明の哺乳類アデニリルシクラーゼは天然に存在するタンパク質である必要 はなく、むしろ、その配列が、ＣＹＲ１によってコードされた天然に存在する酵 母アデニリルシクラーゼのそれよりも、天然に存在する哺乳類アデニリルシクラ ーゼのそれに類似しているならば、それは変異体であることができる。好適には 、変異体は、天然に存在する哺乳類アデニリルシクラーゼ、または機能的である と知られている変異体と実質的に相同である。 アデニリルシクラーゼ、ＣＹＲ１、をコードするＳ．セレビシエ遺伝子はＫａ ｔａｏｋａ等［（１９８５）Ｃｅｌｌ，４３，４９３−５０５］によってクロー ン化された。ＣＹＲ１は２０２６個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする ；タンパク質の４つのドメインは、同定され、Ｎ末端およびＣ末端ドメイン並び に中央、反復両親媒性配列および触媒性ドメインを含む。中央反復配列は、酵母 、哺乳類およびドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌ ａｎｏｇａｓｔｅｒ）中に同定された一系統群のタンパク質中に反復して見出さ れる２３個の アミノ酸のロイシンに富むモティーフと相同性を持つ［Ｆｉｅｌｄ等（１９９０ ）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，４６４−４６７］。それがＲａｓタンパク質と相互 作用するためには、酵素のロイシンに富む領域およびカルボキシル末端が必要で ある。酵母アデニリルシクラーゼの触媒性ドメインはＣ末端の４１７アミノ酸に 局在していた［Ｋａｔａｏｋａ等（１９８５）Ｃｅｌｌ，４３，４９３−５０５ ］。酵母アデニリルシクラーゼは周辺膜タンパク質であるようである。それは、 細胞の非洗浄剤抽出後の不溶性細胞中に見出される。配列の水治療（ｈｙｄｒｏ ｐａｈｉｃ）分析によっては、疎水性、膜スパニングのドメインが示されず、そ してコード配列は分泌または統合膜タンパク質中に通常見出されるシグナル配列 を欠く［Ｌｉａｏ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅｒ（１９８０）ＰＮＡＳ，７７，１８ ９８−１９０２；Ｋａｔａｏｋａ等，（１９８５）Ｃｅｌｌ，４３，４９３−５ ０５；Ｐｅｒｌｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１６７，３９１−４０９］。しかし、両親媒性配列を含有する反復 性ドメインによって、タンパク質の膜中への包埋が可能になることが仮定される 。この仮定を支持するものとして、中央両親媒性配列を含有する、切断された酵 母アデニリルシクラーゼ分子は、Ｅ．コリ（Ｅ，ｃｏｌｉ）中で発現した場合、 膜フラクションに局在する［Ｋａｔａｏｋａ等（１９８５）Ｃｅｌｌ，４３，４ ９３−５０５］。 Ｓ．セレビシエ中の２種のｒａｓ遺伝子は本来、哺乳類ｒａｓ遺伝子から誘導 されたプローブとの配列相同性によって同定された［Ｂｒｏａｃｈ ａｎｄ Ｄ ｅｓｃｈｅｎｎｅｓ（１９９０）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４，７９ −１３９］。Ｓ．セレビシエ中の２種のＲａ ｓ１およびＲａｓ２タンパク質は、アデニリルシクラーゼのＲａｓ依存性活性化 による単相細胞の栄養増殖およびｃＡＭＰの合成に必要である［Ｔｏｄａ等（１ ９８５）Ｃｅｌｌ，４０，２７−３６；Ｂｒｏｅｋ等（１９８５）Ｃｅｌｌ，４ １，７６３−７６９］。ＲＡＳが酵母中でいずれかの追加の必須機能を有するか どうかは分かっていないが、酵母中のアデニリルシクラーゼの過発現は、ｒａｓ １およびｒａｓ２分断変異株中のＲＡＳ機能の低下に由来する致死率を抑制する ことができる。それ故、ＲＡＳのいずれかの追加の必須機能は、ｃＡＭＰの産生 が増加することによって補償される［Ｋａｔａｏｋａ等（１９８５）Ｃｅｌｌ， ４３，４９３−５０５］。 天然に存在するアデニリルシクラーゼに「実質的に相同で」ある変異タンパク 質はまた貴重であることができる。ラットＩＩ型アデニリルシクラーゼでは、考 えられる「中立」突然変異として、第一膜内外ドメイン中の非保存的の第二の膜 スパニングの配列中の置換（Ｌｅｕ７８Ｉｌｅ；Ｌｅｕ７９Ｉｌｅ；Ｌｅｕ９３ ＩｌｅおよびＬｅｕ９４８Ｉｌｅ）があげられる。第一膜内外ドメイン中の非保 存的な第５の膜スパニング配列中の残基中で行われた置換は（Ｉｌｅ１６２Ｌｅ ｕ；Ｌｅｕ１６３Ｉｌｅ）、野生型の活性をもつ変異タンパク質を与える。本明 細書中に特に記載しなかった他の保存的アミノ酸置換が、野生型のタンパク質活 性の減少することなく、アデニリルシクラーゼ配列中で行うことができることが 可能である。２．２ スクリーニングにおけるアデニリルシクラーゼの使用 その天然の状態では、哺乳類アデニリルシクラーゼは不活性である。しかし、 それは、他の分子、特に遊離のＧαサブユニットまたはＧβγ 複合体によって、活性化することができる。 １つの態様では、遺伝子操作された細胞は、Ｇαおよびある場合にはＧβγの ように、アデニリルシクラーゼを直接に活性化するか、または部分的に活性化さ れたアデニリルシクラーゼの活性を増加させることができる薬物をすクリーニン グするのに使用される。 第二の態様では、遺伝操作された細胞は、哺乳類アデニリルシクラーゼを阻害 する薬物をスクリーニングするのに使用される。この場合には、アデニリルシク ラーゼは最初に活性化されなければならない。このことは、ＧαまたはＧβγを 過発現するように適切に遺伝子操作することによって、行うことができる。別法 として、細胞は、Ｇタンパク質およびＧタンパク質結合受容体の両方、或いはア デニリルシクラーゼの活性に影響する他のいずれのタンパク質、例えば、カルノ ジュリン、ＰＫＡもしくはＰＫＣまたはアデニリルシクラーゼと結合／相互作用 してその機能に影響する、今まで未知または未特性決定のタンパク質、および外 部から添加されたリガンドによっておよび共発現されたリガンドによって刺激さ れた受容体を共発現するように遺伝子操作することができる。この場合、受容体 は酵母フェロモン受容体とすることができ、リガンドは酵母α因子または因子と することができる。或いは、受容体は外来受容体とすることができ、リガンドは その受容体に適切なものとすることができる。いずれの場合も、リガンドは、ア デニリルシクラーゼの活性化を刺激するために単に使用された既知の活性化剤で あり、薬物はこのアデニリルシクラーゼの阻害のために選別される。 第三の態様では、遺伝子操作された細胞は、アデニリルシクラーゼを、間接に 例えば、Ｇタンパク質結合受容体に対するそれらの作用によって、 阻害または活性化する薬物を選別するのに使用される。受容体は、アデニリルシ クラーゼに対するＧタンパク質サブユニットの作用を活性化する。この場合、適 合Ｇタンパク質結合受容体および適合Ｇタンパク質は、同一の酵母細胞中の哺乳 類アデニリルシクラーゼが供給される。 第四の態様では、遺伝子操作された細胞は、フェロモン受容体の「上流」で作 用するフェロモン系タンパク質の代理体を阻害または活性化する薬物を選別する のに使用される。 アデニリルシクラーゼがＧαまたはＧβγによって活性化されることが望まれ るそれらの態様では、遺伝子操作された細胞は、この機能を実行することができ るＧαまたはＧβγの形態を発現することが必要である。酵母ＧαまたはＧβγ が哺乳類アデニリルシクラーゼを活性化しない場合、哺乳類またはキメラＧαま たはＧβγを、この目的のために発現させる。Ｇタンパク質については次節で説 明する。３．Ｇタンパク質 ３．１ 哺乳類Ｇタンパク質αサブユニット ３．１．１調節性（Ｇαｓ）サブユニット Ｓ４９マウスのリンパ腫細胞のｃｙｃ変異体の再構成分析によって、Ｇαｓタ ンパク質を、ホルモン受容体をアデニリルシクラーゼに結合させる調節性グアニ ンヌクレオチド結合タンパク質として同定した［Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｇｉｌｍａ ｎ（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，６９６６−６９６９］。哺 乳類ＧαｓｃＤＮＡクローンは、ヒト脳（Ｂｒａｙ等，１９８６，１９８７）、 ヒト肝臓（Ｍａｔｔｅｒａ等，１９８６）、ウシ脳（Ｈａｒｒｉｓ等，１９８５ ）、ウシ副腎（Ｒｏｂｉｓｈａ等，１９８６）、ウシ大脳皮質（Ｎｕｋａｄａ等 ，１９８ ６）、ハムスター肺繊維芽細胞（Ｍｅｒｃｋｅｎ等，１９９０）、ラット神経膠 腫細胞（Ｉｔｏｈ等，１９８６，１９８８）、ラット嗅覚神経上皮（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｅｄ，１９８７）、マウス・マクロファージ（Ｓｕｌｌｉｖａｎ 等，１９８６）、およびマウス・リンパ腫細胞（Ｓｕｌｌｉｖａｎ等，１９８７ ；Ｒａｌｌ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，１９８７）から得た。Ｂｒａｙ等（１９８ ６）はヒト脳から４種の異なったＧαｓ ｃＤＮＡ（Ｇαｓ１−４）を単離した 。これらの形態は一本鎖Ｇαｓ遺伝子から交互のスプライシングによって生じる ようである。Ｇαｓ遺伝子は、１３のエクソンを含有し（Ｋｏｚａｓａ等，１９ ８８）、それらはすべてＧαｓの長い形態中に存在する。分子の短い形態は、エ クソン３によってコードされた１５個のアミノ酸を欠く。さらに、種々のスプラ イス部位がエクソン４の５′末端で使用される場合、エクソン４の開始点でのセ リン・コドンの存在または不在で異なる２種の代替ｍＲＮＡが生成する。３．１．２ 阻害性（Ｇαｓ）サブユニット アデニリルシクラーゼの受容体媒介刺激の場合のように、ＧＴＰはその酵素の 受容体依存阻害に必要であることが見出された。このことは、この阻害における 、機能でＧαｓと異なる、Ｇタンパク質の役割を示している。このタンパク質の 同定は、Ｂ．ペルトゥシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素の作用の機構に関す る研究に由来している。この毒素は、（１）アデニリルシクラーゼのホルモン性 阻害を廃止する、および（２）４１−ｋｄ膜タンパク質をＡＤＰリボシル化する ことが見出された。この毒素基質を精製することによって、哺乳類Ｇタンパク質 Ｇαｓおよびトランスデューシンに関連するグアニンヌクレオチド結合タンパク 質と 同定することができた。そのタンパク質はＧαｉで示された（ｉ＝アデニリルシ クラーゼに阻害的）。 ３種の一本鎖コピー遺伝子はＧαｉ型のＧタンパク質サブユニットをコードし 、予想されたタンパク質（Ｇαｉ−１、Ｇαｉ−２およびＧαｉ−３）は８５％ の配列同一性を共有する。この酵素のシグナル抑制にアデニリルシクラーゼが結 合すると、Ｇαｉタンパク質は細胞ｃＡＭＰ水準を制御するＧαｓと協調して機 能する。 最近までに得られたＧαｉ−１ｃＤＮＡクローンは、ヒト（Ｂｒａｙ等，１９ ８７）、ウシ（Ｎｕｋａｄａ等，１９８６）およびラット（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ ｏ Ｒｅｅｄ，１９８７）である。ヒト（Ｉｔｏｈ等，１９８８；Ｗｅｉｎｓｔ ｅｉｎ等，１９８８；Ｂｅａｌｓ等，１９８７；Ｍｉｃｈｅｌ等，１９８６；Ｄ ｉｄｓｂｕｒｙ等，１９８７）、ラット（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｅｄ，１９ ８７；Ｉｔｏｈ，１９８６）、マウス（Ｓｕｌｌｉｖａｎ等，１９８６）および ウシ（Ｙａｔｏｍｉ等，１９９２）Ｇαｉ−２ｃＤＮＡクローンが単離された。 Ｇαｉ−３クローンには、ヒト（Ｉｔｏｈ等，１９８８；Ｂｅａｌｓ等，１９８ ８；Ｓｕｋｉ等，１９８７；Ｋｉｍ等，１９８８）およびラット（Ｉｔｏｈ等， １９８８；Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｅｄ，１９８７）が含まれる。 本発明中の好適なＧαｉクローンは亜型Ｇαｉ−２およびＧαｉ−３のヒトク ローンである。これらの亜型は炎症細胞中で発現することが見出されている。こ れらのクローンは酵母中で発現し、アデニリルシクラーゼ活性のそれらの抑制を 防止することができる化合物の同定のために、標的として使用される。Ｇαｉの 阻害剤は、炎症疾患の治療に非常に効能がある。即ち、好中球およびマクロファ ージ中で発現した多数の細胞 表面受容体はＧαｉを経てシグナルを媒介する。ヒトＧαｉ中で行われた可能な アミノ酸置換のサブセットは、十分に機能的な、アルベイト（ａｌｂｅｉｔ）変 異体、タンパク質を与えるようである。以下の突然変異はタンパク質の野生型活 性を変えないことは可能である。Ａｌａ５９Ａｓｐ、Ｇｌｕ６４Ａｓｐ、Ａｓｐ １６０Ｇｌｕ、Ａｌａ１６３Ｓｅｒ、Ｖａｌ３３２Ｉｌｅ。特に本明細書に記載 しない他のアミノ酸置換は、野生型Ｇαｉ活性のいかなる減少もなく、行うこと が可能である。３．１．３． キメラまたは他の変異Ｇタンパク質を設計する構造的モデルの使 用 Ｇαタンパク質構造のモデルは、活性に対して有害でないアミノ酸修飾を予想 するのに使用することができる。ＧαのｃＤＮＡの分析およびＧＴＰアーゼ超系 統群の成員中に存在する保存的配列との比較によって、「複合」Ｇα分子全体に 存在する５種の保存的ストレッチ、Ｇ１−Ｇ５、の同定が可能となった［Ｃｏｎ ｋｌｉｎ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ（１９９３）；Ｂｏｕｒｎｅ等，（１９９１） ］。さらに、推定されるα−ヘリックス、β鎖、ループドメインおよび挿入の位 置は、ｐ２１の既知の二次構造とのＧα配列の比較によって推論された。従って 、α−ヘリックス１−５、β鎖１−６、ループ１−１０および挿入１−４は、Ｒ ａｓタンパク質との比較に基づいて、一次Ｇα配列中の位置が与えられた。生化 学および遺伝学並びに配列分析によって、Ｇαタンパク質の概念的モデル描写さ れた（Ｃｏｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９３）。この概念的モデル は、Ｇαのグアニンヌクレオチド結合ポケットは、細胞質、受容体と相互作用す る残基、エフェクターの方に向けられ、そしてＧβγ複合体は原形質膜に面する と仮定している。モデルは以下のこ とを主張する。 （１）ＧαのＮ末端はＧβγ複合体との相互作用のための主要な部位である。 （２）α２ヘリックスおよび挿入１領域はＧαのＧβγとの相互作用に貢献する 。 （３）少なくとも３つの領域が受容体と連結すると仮定される。アミノとカルボ キシル末端および保存的Ｇ５配列。概念的モデルでは、末端は原形質膜に面する Ｇαの部分上に位置し、一方Ｇ５配列は分子の「頂部」に位置する。 （４）Ｇαのエフェクターとの相互作用に関与すると意図された配列は、Ｇαの 原形質膜近接側面上に存在すると予想される。これらの配列には、α２ヘリック スの端部半分、挿入２−ループ７配列および挿入４−ループ９配列が含まれる。 この概念的モデル中の分子の配向は、タンパク質のＧＴＰアーゼ活性を抑制す ることによってＧαを構成的に活性化することが示された突然変異体に基づいて 、ＧＴＰ結合部位に特異的アミノ酸を割当てる実験的証拠によって部分的に支持 される。問題の突然変異体はｐ２１^rasのＧＴＰアーゼ抑制突然変異体の相同体 である。 Ｎ末端配列に対して生起したモノクローン性抗体はＧα_t1異種三量体の解離を 起こす。さらに、Ｎ末端でミリスチル化されたペプチドはＧα_t1のＧβγへの結 合を競合的に阻害する。化学的架橋実験はα２ヘリックスとＧβγとの密接な近 接を示し、そして特異的Ｇαｓ突然変異（Ｇ２２６Ａ）は２つの欠失を示す示す 。即ち、α２ヘリックス領域はＧＴＰ誘発配座変化を受けず、そしてＧＴＰはＧ βγとＧαｓの解離の 起こさない。α２ヘリックスとして記載された配列（ｐ２１^rasのα２ヘリック スに類似の）は、Ｇα中の他のいずれの配列よりも高度に保存的である。この厳 密な保存性は、異種三量体の形成が最近までに記載されたすべてのＧタンパク質 経路中のシグナリングの基礎をなす点で、Ｇβγとの相互作用でのヘリックスの 関与をさらに支持する。 追加のデータはＧαの概念的モデルの発展に貢献する。Ｇαのアミノおよびカ ルボキシル末端は、マストパランを使用して行った架橋研究に基づき、そしてＧ α_t1に対するモノクローン性抗体の特異性に基づいて、密接に近接しているよう である。実験的証拠はまた、Ｃ末端およびｐ２１^rasのα２ヘリックスと類似で ある領域の近接を示唆している。最後に、挿入１、ループ２内に位置する大きな 配列はＧＡＰ機能を有し、そしてＧＴＰアーゼドメインと異なるドメインとして 折たたまれているようである［Ｍａｒｋｂｙ等（１９９３）］。 実験的証拠は、Ｇαの３つの領域（ＮとＣ末端および保存的Ｇ５領域）は受容 体と接触する。さらに、Ｃｏｎｋｌｉｎ等（１９９３）は、Ｇαの極限Ｃ末端の アミノ酸残基は受容体−Ｇタンパク質の相互作用の特異性に貢献するというデー タを得た。Ｇαｑの極限Ｃ末端の４−９残基を、Ｇαｉの同一の領域から誘導さ れたアミノ酸で置換して構築されたキメラは、Ｄ₂ドパミンとＡ₁アデノシン受容 体からホスホリパーゼＣ、Ｇｑ特異性エフェクターにシグナルを変換することが できるＧαタンパク質となる。これらの受容体は通常はＧαｉに結合する。 Ｃ末端に関して−３位置にあるグリシン残基は、Ｇα分子のこの領域中でのβ 回転の形成の中核である。β回転は、受容体とＧαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｔ系統群の αサブユニットとの相互作用を特定する構造的シグナル であるようである［Ｄｒａｔｚ等（１９９３）］。受容体とＧαのＣ末端との相 互作用が、後者の分子の開放配座、即ちヌクレオチド交換が起こることができる 配置、をもたらす配座変化となることが仮定された。 Ｇαｓの突然変異誘発は、分子の３つの領域（α２ヘリックス、ｉ２−Ｌ７お よびｉ４−Ｌ９の部分）をアデニリルシクラーゼの活性化に関係づけた。第二系 列の実験では、Ｇα_t1から誘導されたペプチドを利用して、ホスホジエステラー ゼを活性化する分子の領域を推定した。ｉ４−＜９から誘導されたペプチドはα_t1 −ＧＴＰのｃＧＭＰホスホジエステラーゼを刺激する能力を模倣した。エフェ クター活性化で同定された領域は、原形質膜の方に向いていると考えられる分子 の表面上に存在する。さらに、関係配列の１つ（α２ヘリックス）は、ＧＴＰに よって誘発された配座変化を受けることが知られている。 初期の結晶構造に基づくモデルは、Ｅ．コリ ＥＦ−ＴｕｎｏのＧＴＰ結合ド メインの結晶構造（Ｊｕｒｎａｋ，１９８５；ＬａＣｏｕｒ等，１９８５）並び にＨａ−ｒａｓ−ｐ２１の結晶構造（Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｋｉｍ，１９ ８９）を考える。最近、ＧＴＰγＳと複合したトランスデューシン−α（Ｇｔα ）の結晶構造が、２．２オングストローム単位の解像度で得られた（Ｎｏｅｌ等 ，１９９３）。この結晶構造の分析は、上記の生化学的および遺伝学的データと 共に、すべてのＧα分子に利用可能な一般的構造／機能の相関関係を誘導するの に使用されている。 第三次元の構造において、２つのドメインが、Ｇｔα−ＧＴＰγＳ複合体中で 最も鮮明であり、その各々はグアニンヌクレオチド結合中裂に隣接する。これら は、異種三量体Ｇタンパク質に特有の（１）高度に保 存的なＧＴＰアーゼドメインおよび（２）高度にラセン状のドメインである。Ｇ ＴＰアーゼドメインは構造的にｐ２１のＧＴＰアーゼドメインおよびＥＦ−Ｔｕ に類似していて、そして６つの鎖状β−シートを囲む５つのα−ヘリックスから なる。他のドメインは、異種三量体Ｇタンパク質に特有の高度にラセン状であり 、そして２つのリンカー配列を介してＧＴＰアーゼドメインに結合している。ラ セン状でＧＴＰアーゼのドメインはＧＴＰγＳ分子および付随Ｍｇ²⁺イオンを囲 んでいるようである。この配置から、ヌクレオチド交換が起こるためには、Ｇα 分子の配座変化が必要であることが示唆される。リンカー配列中の配座変化はラ セン状ドメインの移動と分子の開放を起こすようである。 結晶構造は、ＧＴＰ分子の三リン酸エステル部分、必須Ｍｇ²イオン、および ヌクレオチドと相互作用するＧαの残基の描写を可能にする。Ｇｔαでは、ヌク レオチドおよびリン酸エステルと接触する残基はラセン状ドメインおよびリンカ ー２の一部を形成する。これらの領域は、受容体調節されたヌクレオチド交換に 関係する。Ｎｏｅｌ等（１９９３）は、Ｇα残基とグアノシンとの間の広範な相 互作用を記載している。これらのサブセットはＧタンパク質に特有であり、他方 他のものはＧＴＰアーゼ超系統群の成員中に保存されている。ヌクレオチド結合 部位と受容体と相互作用すると言われているＧαの表面との結合も記載されてい る。著者等は、「このシステムの機械論的に重要な特徴は、ヌクレオチドの一部 分との相互作用が他のものとの接触を支持する精密にして簡潔な様式であると力 説する。これらのしっかりと結合した相互作用は、ヌクレオチド結合中裂中にＧ ＤＰとＧＴＰを強く固定する要素の高度に協力的な受容体媒介性分解を強化する ようである」と力説する［Ｎｏｅｌ等 （１９９３）］。 特異的α−ヘリックスおよびβシート（α２／β４、α３／β５、α４／β６ ）をエフェクター結合および活性化に関係ずける実験データが存在する。これら の領域は、Ｇｔα−ＧＴＰγＳ結晶の分析から誘導された三次元モデル中に一連 の表面ループを形成することが見出された。Ｇｔαで行われた仕事から、これら のループとホスホジエステラーゼまたはその酵素の阻害性γ−サブユニットとの 相互作用が示唆される。Ｇｓα／Ｇｉαのキメラを使用して行われた研究から、 これらの表面ループはアデニリルシクラーゼの調節の役割を果たすことが示唆さ れる。さらに、Ｇｔα−ＧＴＰγＳの結晶構造から、ＧＴＰがどのようにしてこ れらのエフェクターループ中で配座変化を行うことができるかが示される。α／ γ２ヘリックス中のグリシン残基はＧＴＰのγ−リン酸エステルと相互作用し、 そしてＧＴＰの加水分解の際に起こる配座変化に必要な順応性の源と考えられる 。α２中のＧＤＰ／ＧＴＰ誘発変化は、結合した一連のヘリックス間接触を介し てα３およびα４に伝わり、γ−リン酸エステルのα２との相互作用中の変化を エフェクター結合表面ループに連結すると仮定される。 結晶構造から、ＧＴＰの加水分解で役割を果たすようである２つの残基に関心 が引かれる。保存的アルギニン残基（Ａｒｇ１７４）はγ−リン酸エステルに直 接に接触し、加水分解時にその放出を容易にすることができる。ＧｓαおよびＧ ｉα中の同族アルギニンの突然変異はＧＴＰアーゼ活性を大きく損なって、構成 的に活性なＧαとなる。構造から、γ−リン酸エステルに対する加水分解的攻撃 の開始剤として、位置２０３のグルタミンが示唆される。Ｇｌｕ２０３は、γ− リン酸エステルに 対する求核的攻撃のために良好に位置した水分子を活性化するのに適切に配向し ているようである。このグルタミン酸塩はα２ヘリックス中に存在し、そしてＧ αサブユニットの系統群中に保存される。 Ｇα構造の上記のモデルによって示されるように、分子の機能は受容体、βγ 複合体、ＧＴＰまたはＧＤＰ、およびエフェクター分子との相互作用に依存する 。実験的証拠または結晶構造誘導データが、これらの多数の相互作用に貢献して いるものとして示した残基の突然変異は、Ｇα機能を損なうことができる。以下 の配列、残基およびドメインは、Ｇα機能に特に重要であると示された。Ｎ−末 端残基、極限Ｃ−末端の残基（特に位置−３のグリシン）、高度に保存的なα２ ヘリックス、ＧαｔのＡｒｇ１７４の同族体、Ｇαｔのグルタミン２０３の同族 体、ＧＴＰアーゼドメイン並びにα２／β４、α３／β５およびα４／β６領域 。他の配列は、ＧＴＰアーゼ系統群の成員中でのそれらの保存性に基づいて、ま たはそれらが異種三量体的Ｇタンパク質αサブユニットに特有である点において 重要であるようである。これらには、保存性配列Ｇ１−Ｇ５およびＧαとＲａｓ タンパク質との間の比較によって挿入体として同定された領域が含まれる。研究 の激しい分野が残されているから、機能的に重要な領域の明確な記載を行うこと ができないことを述べなければならない。 将来の研究が、最も機能に貢献している大きいドメイン中の残基を同定し、そ してその特性がＧα機能の中核である追加の特定残基を同定することが期待され る。Ｇαの重要な領域中の保存的突然変異が分子の機能を無傷で残すけれども、 変化が激しい程、タンパク質機能に対する妨害の可能性が高くなる。上記のモデ ルはＧα分子の重要な特徴を強調し ている。配座の変化はヌクレオチドの交換に固有であり、その交換はＧα機能の 中核となる。配座の変化は、分子の一つのドメインから他のものへのシグナル伝 達の波として起こるようである。従って、モデルは、タンパク質の機能的ドメイ ンのいずれか一つの中の変化がシグナルの最後の変換に影響すること、即ち、分 子の機能は数個のドメインの良好な協調性に依存することを強調している。 しかし、実験系でＧαタンパク質の効用に貢献することができる突然変異を行 うことができることを述べなければならない。例として、ＧＴＰアーゼ機能を特 異的に損なう突然変異は、エフェクタータンパク質とのＧα相互作用に影響する ことなく、構成的に活性なタンパク質を与える。実験シナリオのサブセットでは 、構成的に活性なＧαは所望の分子試薬である。 ヒトＧαｓの配列中に以下の保存的アミノ酸置換を、タンパク質の野生型活性 を損なうことなく、行うことは可能であることができる。Ｉｌｅ１８３Ｌｅｕ、 、Ａｒｇ１８４Ｇｌｕ、Ｌｅｕ１９８Ｖａｌ、Ｖａｌ１２１Ｌｅｕ、およびＩｌ ｅ３７３Ｖａｌ。特に記載しない他の保存的アミノ酸置換を、Ｇαｓの配列中で 、野生型タンパク質の活性に顕著な変化を誘発することなく、行うことができる ようである。３．２ 哺乳類ＧβおよびＧγサブユニット １９９４年初期現在、少なくとも４種の哺乳類Ｇβサブユニットが知られて、 クローン化された。Ｇβ１のヒトおよびウシのクローンの両方（Ｃｏｄｉｎａ Ｊ．等，（１９８６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０７，１８７−１９２；Ｓｕｇ ｉｍｏｔｏ Ｋ．等，（１９８５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９１，２３５−２ ４０；Ｆｏｎｇ Ｈ．Ｋ．Ｗ．等，（１ ９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，２１６２−２ １６６）およびＧβ２（Ｆｏｎｇ Ｈ．Ｋ．Ｗ．等，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，３７９２−３７９６；Ｇａｏ Ｂ． 等，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，６１ ２２−６１２５）が単離された。ヒトＧβ３（Ｌｅｖｉｎｅ Ｍ．Ａ．等，（１ ９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２３２９−２ ３３３）およびマウスＧβ４（Ｖｏｎ Ｗｅｉｚｓａｃｋｅｒ Ｅ．等，（１９ ９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８３，３ ５０−３５６）もクローン化された。５種の完全な哺乳類Ｇγサブユニットはク ローン化された。ウシＧγ１（Ｈｕｒｌｅｙ Ｊ．Ｂ．（１９８５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６９４８−６９５２）、ウシＧγ ２（Ｒｏｂｉｓｈａｗ Ｊ．Ｄ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６ ７，２４０２３−２４０２７）、ウシおよびラットＧγ５（Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ． Ｊ．ａｎｄ Ａｒｏｎｓｏｎ Ｎ．Ｎ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ ｌ．，１２，１５８５−１５９１）およびウシＧγ７（Ｃａｌｉ Ｊ．Ｊ．等， （１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２４０２３−２４０２７）。 第６のＧγサブユニットの一部、Ｇγ４、は単離された（Ｇａｕｔａｍ Ｎ．等 ，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，７９７ ３−７９７７）。 ＧβおよびＧγの種々の組合せが試験管内で観察され、それ故、生理学的に活 性である潜在力を有する。例えば、Ｇβ１はＧγ１、Ｇγ２、Ｇγ３およびＧγ ５と二量体化することができ（Ｉｎｉｇｕｅｚ−Ｌｌ ｕｈｉ Ｊ．Ａ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２３４０９ −２３４１７）、そしてβ１γ１、β１γ２、およびβ１γ５は、ホスホリパー ゼＣ β２によるホスホイノシチド加水分解を刺激する（Ｋａｔｚ Ａ．等，（ １９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３６０，６８６−６８８）。他の組合せは観察されて いない。例えば、Ｇβ２はＧγ１と二量体化しない（Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｃ．Ｊ． 等，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１３８０７−１３８１０ ；Ｐｒｏｎｉｎ Ａ．Ｎ．ａｎｄ Ｇａｕｔａｍ Ｎ．（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，６２２０−６２２４）。βγ二量 体のアデニリルシクラーゼに対する効果は、アデニリルシクラーゼのアイソフォ ームおよび問題の特定のβγ二量体の両方に依存する。１型アデニリルシクラー ゼは種々のβγ二量体によって種々の程度に阻害されるが、同一の二量体は、Ｇ αｓの２型アデニリルシクラーゼに対する調節効果を増強する（Ｉｎｉｇｕｅｚ −Ｌｌｕｈｉ Ｊ．Ａ．（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６７，２３ ４０９−２３４１７）。両方の場合、β１γ２、β１γ３、β２γ２、およびβ ２γ３の効能はβ１γ１のそれと等しいかそれより大きい。 以下の追加の文献は貴重であることができる。 Ｇベータ５： 哺乳類Ｇタンパク質β−サブユニット系統群の第５成員。ホスホリパーゼＣの ベータ２アイソタイプの脳中での発現および活性化。Ｗａｔｓｏｎ ＡＪ，Ｋａ ｔｚ Ａ，Ｓｉｍｏｎ ＭＩ，１９９９４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６９： ２２１５０−６。 Ｇガンマ８： 新規のＧＴＰ結合タンパク質ガンマーサブユニット、Ｇガンマ１８、は嗅覚お よびじょう鼻神経上皮中の神経発生中に発現する。ＲｙｂａＮＪＰ，Ｔｉｒｉｎ ｄｅｌｌｉ Ｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７０：６７５７−６７６７，１９ ９５。 Ｇガンマ７： ｃＤＮＡクローン化によって同定されたガン・マサブユニットの新規形態を含 む、Ｇタンパク質ガンマサブユニットの選択的組織分布。Ｃａｌｉ ＪＪ，Ｂａ ｌｃｕｅｖａ ＥＡ，Ｒｙｂａｌｋｉｎ Ｉ，ａｎｄ Ｒｏｂｉｓｈａｗ ＪＤ ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６７：２４０２３−２４０２７，１９９２。 Ｇガンマ６： 脳中でのＧタンパク質の２種のガンマ・サブユニットの存在。Ｊ．Ｄ．Ｒｏｂ ｉｓｈａｗ，Ｖ．Ｋ．Ｋａｌｍａｎ，Ｃ．Ｒ．Ｍｏｏｍａｗ，Ｃ．Ａ，Ｓｌａｕ ｇｈｔｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４：１５７５８−１５７６１，１９ ８９。 変異ＧβおよびＧγサブユニットは、Ｇαサブユニットに関して記載したものと 類似の方法で設計することができる。４． 薬物スクリーニング 新規の分子の生物学的活性の同定は歴史的には、試験管内または全動物の使用 によって達成されてきた。無傷の生物学的実体、細胞または全生体のいずれか、 が、試験管内で抗微生物剤、抗カビ剤、抗寄生虫剤および抗ウイルス剤をスクリ ーニングするのに使用された。培養された哺乳類細胞も、潜在的な治療用化合物 を検出するように設計されたスクリーニングで使用された。哺乳類細胞のスクリ ーニングでは、細胞の増殖 または分化の刺激、細胞運動性の変化、特定代謝産物の産生、細胞内での特異的 タンパク質の発現、改造されたタンパク質機能、および改造された導電率特性を 含む多種類のバイオアッセイ終点が利用された。癌化学療法で使用された細胞毒 性化合物は、生体内または生体外で腫瘍細胞の増殖を抑制するそれらの能力によ って同定された。分散された細胞の培養物の外に、筋肉の収縮性に基づく場合の ように、全組織がバイオアッセイに役立った。 試験管内試験は、高速のスクリーニングの設計を可能にする、即ち多数の化合 物の少量を短時間で、低費用で試験することができる点で、好適な方法である。 最適には、動物は化合物評価の後者の段階にために保留され、発見フェーズでは 使用されない。全動物体の使用は労働集約的であり、極めて高価である。 微生物は、哺乳類細胞および組織よりもっと大きい程度で、迅速な薬物スクリ ーニングでの使用のために容易に利用することができる。酵母は特に魅力的な試 験システムを提供する。この微生物の広範な分析の結果、酵母およびより高級な 真核生物中の基礎的細胞工程で活性である多種類のタンパク質の構造と機能が明 らかになった。 酵母中の哺乳類アデニリルシクラーゼの機能的発現は、その活性が哺乳類細胞 中の中央シグナリング分子の生成に必要である、この酵素のモジュレーターの同 定に有用である安価なスクリーニングの設計を提供する。化学的実体または化学 的実体の組合せは、天然または合成品であれ、哺乳類アデニリルシクラーゼをモ ジュレートする能力についてスクリーニングされることができる。これらのモジ ュレーターはシクラーゼに直接に作用して、酵素の活性を変えるか、または以下 の分子：Ｇαｓ、Ｇ αｉまたはＧβγのアデニリルシクラーゼ活性化を変える能力に影響することが できる。４．１ 薬物、全般 その中からアデニリルシクラーゼのモジュレーターを同定することができる適 切な化学的実体には、ヌクレオチド類似体（特に、ＡＴＰの類似体、アデニリル シクラーゼの天然基質、およびＧＴＰの類似体、Ｇαｓの活性化剤）が含まれる 。フォルスコリン、ジテルペン、はアデニリルシクラーゼに直接に結合して、そ の分子の有効な刺激体となる。それ故、フォルスコリン様構造、フォルスコリン 誘導体、および全体としてのジテルペン類の化合物は、アデニリルシクラーゼ活 性に対する効果について試験する適切な化学的実体である。合成ペプチドは興味 を起こさせるものである。例によれば、カルモジュリン依存性アデニリルシクラ ーゼのカルモジュリン結合ドメインに基づくペプチドは、アデニリルシクラーゼ 活性のモジュレーターとして働くことができる。さらに、シクラーゼとアデニリ ルシクラーゼ活性の既知の内因性モジュレーターとの間の相互サブユニットを阻 害するいずれの構造をもつペプチドまたは分子は興味を起こさせる。既知の内因 性アデニリルシクラーゼもジュとして、Ｃａ²⁺、Ｃａ²⁺／カルモジュリン、プロ ティンキナーゼＣ、プロティンキナーゼＡ、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇβγ、およびア デノシンが挙げられる。 プロティンキナーゼＣの活性化はアデニリルシクラーゼ活性を刺激することが でき、そしてアデニリルシクラーゼは、プロティンキナーゼＣによるリン酸化の ための直接の標的であることがで示された［Ｙｏｓｈｉｍａｓａ等（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ，３２７，６７−７０］。Ｐ２ プリネルギック（ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ）およびＭ５ムスカリン様受容体、プロ ティンキナーゼＣ経路の刺激体はアデニリルシクラーゼを活性化する［Ｊｏｈｎ ｓｏｎ等（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３９，５ ３９−５４６］。最近までにクローン化されたアデニリルシクラーゼは、プロテ ィンキナーゼＣ活性化による調節に対する感受性について試験された。２型酵素 の基礎活性はプロティンキナーゼＣの活性化によって大きく増加し、他方１型お よび３型の活性は低い程度に影響される。反対に、アデニリルシクラーゼ４、５ および６型はプロティンキナーゼＣ活性化によって刺激されない［Ｊａｃｏｂｗ ｉｔｚ等（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，３８２９−３８３２ ；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．，２６８，４６０４−４６０７］。 研究の結果から、哺乳類細胞膜をプロティンキナーゼＡに露呈させた後、フォ ルスコリン刺激アデニリルシクラーゼ活性が増加することが示された［Ｐｒｅｍ ｏｎｔ等（１９９２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３１，２７７４−２７８ ３；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ（１９９２）ＰＮＡＳ，８９， ６７１６−６７２０］。一サブセットの同定された哺乳類アデニリルシクラーゼ は、プロティンキナーゼＡ依存性リン酸化による負の調節に感受性があるようで ある。推定されるプロティンキナーゼＡ依存性リン酸化部位は、４型アデニリル シクラーゼを除いて、各酵素の配列中に同定された。リン酸化の推定される部位 の位置は５型および６型では保存されるが、他のシクラーゼでは変化する[Ｉｙ ｅｎｇａｒ(１９９３)ＦＡＳＥＢ Ｊ．７，７６８−７７５]。４．２ ペプチド薬 １クラスの特に興味を起こさせる潜在的モジュレーターはペプチド・クラスで ある。用語「ペプチド」は、本明細書では、隣接するアミノ酸がペプチド（−Ｎ ＨＣＯ−）結合によって結合している、２つまたはそれ以上のアミノ酸の鎖を言 うのに使用される。従って、本発明のペプチドとして、オリゴペプチド、ポリペ プチド、およびタンパク質が挙げられる。現在、本発明のペプチドは、２−２０ ０個、さらに好適には５−５０個のアミノ酸の長さである。最小のペプチドの長 さは主として、活性化剤または阻害剤として十分な効力を得る必要によって指示 される。最大のペプチドの長さは、活性ペプチドが同定されると、合成上の便宜 性いかんによる。ペプチド薬が測定される場合、酵母細胞は、ペプチドに露呈さ れるよりむしろ、単にペプチドを培養培地に添加することによって、ペプチドを 発現するように遺伝子操作されることができる。４．３ 自己分泌性細胞 他の研究者は外因性薬物を受容体アゴニストおよびアンタゴニストとしてスク リーニングすくのを容易にするために酵母細胞を遺伝子操作したが、細胞はそれ 自体は薬物および受容体を産生しない。受容体を産生するように遺伝子操作され たが、薬物それ自体を産生しない酵母細胞は非効力である。それらを利用するた めに、薬物が作用を有するかどうかを検出するためには、十分な濃度の各薬物を 多数の細胞と接触させなければならない。それ故、各薬物のために、マイクロタ イター・プレート・ウエルまたは試験管を使用しなければならない。薬物は前も って合成して、そして酵母細胞に対するその作用を判定するのに十分に純粋でな ければならない。酵母細胞が薬物を産生することができる場合、有効濃度はより 高い。４．４ ペプチドライブラリー 一つの態様では、酵母細胞はペプチドライブラリーを発現するように遺伝子操 作される。「ペプチドライブラリー」とは、多くの異なった配列（典型的には１ ０００以上の異なった配列）のペプチドの集合物であり、それは実質的に同時に 、幾つかの活性について同時に試験される場合、「陽性」のペプチドを特性決定 することが可能であるように、製造される。本発明のペプチドライブラリーは酵 母細胞培養物の形態を取り、その中では、実質的に個々の細胞はライブラリーの 一つのペプチド、通常一つのみを発現する。各細胞が異なった配列のペプチドを 産生する場合、ライブラリーの多様性は最大になるが、幾らか余剰があるように ライブラリーを構築することが通常無難である。さらに、各配列は測定可能な濃 度で産生されねばならない。 ライブラリーのペプチドは異なった配列を持つＤＮＡ分子の混合物によってコ ードされている。各ペプチドコードＤＮＡ分子はベクターＤＮＡ分子に連結され 、得られた組換えＤＮＡ分子は酵母細胞中に導入される。どのペプチドコードＤ ＮＡ分子が特定の細胞中に導入されるかは偶然の問題であるから、その細胞がど のようなペプチドを産生するかは予測できない。しかし、混合物が製造される方 式の知識に基づいて、ペプチドライブラリー中のペプチドの混合物についてある 種の統計的予測を行うことができる。 ライブラリーのペプチドを、定常および変動残基から構成されるものとして、述 べることは便宜である。ライブラリーのすべてのペプチドについてｎ番目の残基 が同一である場合、定常であると言われる。問題のペプチドについて、ｎ番目の 残基が変わる場合、残基は変動残基である。 ライブラリーのペプチドは、一つの、通常は一つ以上の変動残基を有する。変動 残基は、全部で２０個の遺伝学的にコードされたアミノ酸のいずれかに対して２ 個のいづれかの間で変動することができる。可能性の範囲は、ペプチドの変動残 基の各々について、所望に応じて、異なることができる。さらに、特定の残基位 置での許容されるアミノ酸の発生の頻度は同一または相違することができる。ペ プチドはまた一つまたはそれ以上の定常残基を有することができる。 所要ＤＮＡ混合物を製造するには２つの主要な方法がある。１つの方法では、 ＤＮＡを一度に一塩基で合成する。変動が必要である場合、遺伝暗号によって指 示された塩基位置で、ヌクレオチドの適切な混合物を、慣用のポリヌクレオチド 合成の純粋なヌクレオチド試薬よりむしろ、発生期のＤＮＡと反応させる。 第二の方法は、アミノ酸変動に対するさらに厳密な制御を提供する。最初に、 各三ヌクレオチドが、ペプチドライブラリー中で特徴的である一つ（一つのみ） のアミノ酸のコドンである、三ヌクレオチド試薬を製造する。特定の変動残基が 合成されることになっている場合、適切な三ヌクレオチドの混合物を作成し、発 生期のＤＮＡと反応させる。必要な「変性」ＤＮＡが完成すると、それを、他の 所で詳細に記載したように、ペプチドの発現を確保するのに必要なＤＮＡ配列に 結合させなければならない、そして完全なＤＮＡ構築物を酵母細胞中に導入しな ければならない。４．５ 細胞周辺分泌 酵母細胞の細胞質は原形質膜と呼ばれる脂質二重層によって囲まれている。こ の原形質膜と細胞壁との間が細胞周辺空間である。酵母細胞に よって分泌されたペプチドは、多種類の機構によって原形質膜を通過し、細胞周 辺空間に入る。次いで、分泌されたペプチドは、細胞周辺中に存在するかまたは 原形質膜の外表面上に存在する他の分子と自由に相互作用する。次いで、ペプチ ドは細胞中への再摂取を受け、細胞壁を通って媒質中に拡散するか、または細胞 周辺空間内で分解する。 ペプチドライブラリーは、それらが連結している発現系の性質に依存する、２ つの異なった機構の１つによって、細胞周辺中に分泌されることができる。１つ のシステムでは、ペプチドは、小胞体およびゴルギ体によって分泌を指示する、 α因子前駆体中に存在するような、酵母シグナル配列に構造的に連結することが できる。これは、受容体タンパク質が原形質膜への移動中にたどる同一の道筋で あるから、特定のペプチドが、分泌経路を経て通過する間に受容体と相互作用す る機会が、受容体およびペプチドの両方を発現する細胞中存在する。これは、自 己分泌活性化を示す哺乳類細胞中で起こると仮定された。かかる相互作用は、通 過中の連結フェロモン応答経路の活性化を与えるようであり、それはペプチドア ゴニストを発現するそれらの細胞の同定を可能にする。外部から適用された受容 体アゴニストに対するペプチドアンタゴニストが求められる状況の場合、ペプチ ドアンタゴニストおよび受容体の両方が協力して細胞の外部に送達されるから、 このシステムはなお有効である。従って、アンタゴニストを産生するそれらの細 胞は、ペプチドアンタゴニストが、適切にかつ適時に位置して、常用体が外部か ら適用されたアゴニストによって刺激されるのを防止するから、選択可能である 。 ペプチドを細胞周辺空間に送達する別の機構は、ＳＴＥ６／ＭＤＲ１クラスの ＡＴＰ依存性輸送体を使用することである。この輸送体経路、 およびタンパク質またはペプチドをこの経路に指示するシグナル、小胞体に基づ く分泌経路ほどには、特性決定されていない。それにもかからわず、これらの輸 送体は明らかに、ペプチドがＥＲ／ゴリジ経路を通過する必要がなく、原形質膜 を通って直接に効率的に輸送することができる。本発明者等は、少なくとも１つ のサブセットペプチドが、この経路を経て、ａ−因子前配列および末端テトラペ プチドの文脈中のライブラリーを発現することによって、分泌されることを予想 している。このシステムの考えられる利点は、受容体およびペプチドが細胞の外 部表面に送達されるまで、両者が接触しないということである。従って、このシ ステムは、細胞の外部から通常送達されるアゴニストまたはアンタゴニストの状 態と模倣している。記載された経路のいずれを使用することも本発明の範囲内に ある。 本発明は、細胞周辺分泌、またはかかる分泌が提供される場合、いずれの特定 の分泌シグナルもしく輸送経路も必要としない。５． 哺乳類アデニリルシクラーゼ活性の阻害および活性化の検出 哺乳類アデニリルシクラーゼを阻害または活性化する能力について薬物をスク リーニングする際に有用である遺伝子操作された酵母細胞の場合、アデニリルシ クラーゼ活性に検出できる変化がなければならない。この変化（シグナル）は背 景（薬物の不在下でのアデニリルシクラーゼ活性の基礎水準）に対して検出可能 でなければならない。シグナルは細胞の増殖速度で変化するか、または色彩変化 もしくはルミネッセンスのような他の表現型変化で変化ことができる。 内在性（酵母）アデニリルシクラーゼは背景に貢献する。この貢献は、内在性 アデニリルシクラーゼとして酵母アデニリルシクラーゼの変異対 立遺伝子、ｃｄｃ３５−１、を持つ酵母細胞を使用することによって減少させる ことができる。 この対立遺伝子は、細胞が室温で増殖する場合に活性である温度感受性酵素を コードする。３０℃またはそれ以上では、そのアデニリルシクラーゼは不活性で あり、酵母細胞は増殖することができない。この菌株は好適にはＣａｍ表現型を 示し、このことは内因性ｃＡＭＰの添加によって高温での増殖を救出する能力を 反映する（Ｃａｍ表現型を示す酵母はｃＡＭＰを摂取し、利用することができる 。）［Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等（１９８２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．，１５０，２ ７７−２８５］。 従って、好適な態様では、試験菌株の背景は、タンパク質が発現プラスミドを 介してこれらの細胞中に導入される場合、哺乳類シクラーゼの機能の簡単な測定 基準を提供する。哺乳類アデニリルシクラーゼが活性である場合、酵母は３０℃ を超える温度で増殖し、その範囲内では酵母シクラーゼは非機能的である。試験 酵母細胞の増殖が、哺乳類酵素の活性の簡単にして手際のよい指標である。 別法として、内因性アデニリルシクラーゼをコードする遺伝子（ＣＹＲ１）が 、例えば、欠失によって、完全に無条件に不活性化される宿主菌株を使用するこ とができる。かかる酵母は、Ｃａｍ表現型を示し、そして内因性ｃＡＭＰが与え らるならば、グルコースの存在下で増殖することができる。別法として、これら の細胞はまた、ラットアデニリルシクラーゼおよびＧαｓを発現するならば、増 殖することができる。従って、本明細書に記載の本発明で使用されたｃｄｃ３５ −１変異株以外の宿主はある種の利点を有することができる。例えば、ｃｄｃ３ ５−１対立遺伝子中の自然逆突然変異によって、野生型活性をもつアデニリルシ クラーゼが生成する。かかる逆突然変異は、内因性アデニリルシクラーゼの欠失 変異体を使用して事実上回避することができる。 シグナル発生について、細胞の内因性成分に対するアデニリルシクラーゼの効 果に頼るよりのむしろ、酵母細胞中に遺伝子操作されたマーカー遺伝子によって 、アデニリルシクラーゼ活性を選択またはスクリーニングすることも可能である 。マーカー遺伝子は、その発現がスクリーニング可能または選択可能である表現 型変化を起こす遺伝子である。変化が選択可能である場合、表現型変化は、マー カー遺伝子を発現する細胞としない細胞との間の増殖または生残率に差異を生み 出す。変化があスクリーニング可能である場合、表現型変化は、マーカーを発現 する細胞を発現しないものから区別することができる、細胞の幾つかの検出でき る特性に差異を生み出す。選択は好適にはにはスクリーニングすることである。 シクラーゼ活性の測定として増殖以外の読出しを使用することが有利である状 態が起こることができる。増殖速度は測定するのに少なくとも１日を要するが、 転写活性の直接の読出しはさらに迅速な測定法の可能性を与える。例えば、ｌａ ｃＺをコードしている細菌遺伝子をＦＵＳ１プロモーターの制御下に置くことに よって、酵母フェロモン応答経路の活性化は、浸透性化された酵母が色素産生基 質から色素を生成する能力を監視することによって、１時間以下で検出すること ができる。かかる読出しの迅速性はそれ自体有利である。かかる読出しは、酵母 が増殖しない条件下でシクラーゼ活性を監視することが必要である。 哺乳類細胞では、ｃＡＭＰは、転写因子ＣＲＥＢをリン酸化しそれによって活 性化する、プロティンキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化すること によって、一パネルの遺伝子からの転写に影響する［Ｂｒｉｎｄｌｅ，ＰＫ ａ ｎｄ Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，ＭＲ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｇｅｎ ．Ｄｅｖ．，２：１９９−２０４に概説］。しかし、酵母中には、数種の遺伝子 しかＰＫＡによって影響されることが知られていない。即ち、ＡＤＨ２［Ｄｅｎ ｉｓ，ＣＬ等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２：１５０７−１ ５１４］、ＵＢ１４［Ｔａｎａｋａ，Ｋ等（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７：４９ ５−５０２］、ＣＴＴ１［Ｍａｒｃｈｌｅｒ，Ｇ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１ ２：１９９７−２００３］、およびＲＰＳ１３様の種々のリボソームタンパク質 遺伝子［Ｓｕｓｓｅｌ，Ｌ ａｎｄ Ｓｈｏｒｅ，Ｄ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７７４９−７７５３］。リボソーム 遺伝子のｃＡＭＰ依存性活性化は、広範な多種類の酵母プロモーター中のＤＮＡ 配列ＲＭＡＣＣＡＮＮＣＡＹＹに結合している酵母ＲＡＰ１転写因子によって媒 介される［Ｋｌｅｉｎ，Ｃ ａｎｄ Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃ ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４：１９２０−１９２８］。事実、ＲＡＰ１結合部位は 異種ＨＩＳ３プロモーターから転写を増加させることができ［Ｋｌｅｉｎ，Ｃ ａｎｄ Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４： １９２０−１９２８］、ＲＡＰ１結合部位を含有する上流調節配列が構築され、 そしてｌａｃＺのようなリポート遺伝子に結合していることを示唆する。かかる 構築物は、酵母中の哺乳類アデニリルシクラーゼの活性の迅速な比色法の読出し を提供をする。他の有用なリポーターとして、アルカリホスファターゼ、クロラ ンフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよび蛍光グリー ンタンパク質（ＦＧＰ） が挙げられ、それは比色法の発光、蛍光または放射性同位元素的の読出しを発生 させるのに使用することができる（後者は放射性同位元素の基質を要する）。 このように、マーカー遺伝子は、マーカー遺伝子の発現がアデニリルシクラー ゼの活性に依存性であるように、哺乳類アデニリルシクラーゼに結合することが できる。この結合は、マーカー遺伝子をサイクリックＡＭＰ応答プロモーターに 作用結合させることによって達成することができる。用語「サイクリックＡＭＰ 応答プロモーター」は、サイリックＡＭＰまたはサイクリックＡＭＰ産生の結果 として産生される代謝産物のいずれかによって、調節されるプロモーターを示す 。例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡプロモーターは、Ｓ．セ レビシエ中のｃＡＭＰによって調節されるようである［Ｒｕｔｈ等（１９９２） Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．２３５，３６５−３７２］。プロモーターは、サイ リクリックＡＭＰに元来応答性であるものか、または適切なオペレーターの取込 みによって応答性であるように遺伝子操作されたものであることができる。 一つの態様では、プロモーターは、シクラーゼの活性化の際、活性化され、そ の場合、選択のためには、マーカー遺伝子の発現が細胞の利益になるべきである 。好適なマーカー遺伝子はイミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ遺伝 子（ＨＩＳ３）である。サイクリックＡＭＰ応答性プロモーターが有利な遺伝子 に作用結合してる場合、細胞はアデニリルシクラーゼ活性をスクリーニングまた は選択するのに有用である。それが有害な遺伝子に結合している場合、細胞は阻 害剤をスクリーニングまたは選択するのに有用である。 別法として、プロモーターは、サイクリックＡＭＰによって抑制され、細胞に 有害である生成物の発現を防止するものであることができる。サイクリックＡＭ Ｐ抑制プロモーターを用いて、アゴニストを、プロモーターを有害な遺伝子に結 合させることによって、そしてアンタゴニストを、それを有益な遺伝子に結合さ せることによって、スクリーニングする。 抑制は、サイクリックＡＭＰ誘発プロモーターを、マーカー遺伝子によってコ ードされたｍＲＮＡの少なくとも一部（コーディング領域中かまたはフランキン グ領域中かいずれにせよ）に対するアンチセンスであるｍＲＮＡをコードしてい る遺伝子に、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害するように、作用結合させることによっ て達成することができる。抑制はまた、サイクリックＡＭＰ誘発プロモーターを ＤＮＡ結合抑制タンパク質をコードしている遺伝子に結合させることによって、 そして適切なオペレーター部位をマーカー遺伝子のプロモーターまたは他の適切 な領域中に取り込ませることによって、得ることができる。 適切な正の選択性（有益な）遺伝子として、以下のものが挙げられる。ＵＲＡ ３、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＹＲＰ１、ＡＤＥ１、２、３、４、５、７ 、８；ＡＲＧ１、３、４、５、６、８；ＨＩＳ２、４、５；ＩＬＶ１、２、５； ＴＨＲ１、４；ＴＲＰ２、３、４、５；ＬＥＵ１、４；ＭＥＴ２、３、４、８、 ９、１４、１６、１９；ＵＲＡ１、２、４、５、１０；ＨＯＭ３、６；ＡＳＰ３ ；ＣＨＯ１；ＡＲＯ２、７；ＣＹＳ３；ＯＬＥ１；ＩＮＯ１、２、４；ＰＲＯ１ 、３。他の無数の遺伝子が潜在的選択性マーカーである。上記のものは良く特性 決定された生合成経路に関与している。 イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ（ＩＧＰデヒドラターゼ）遺 伝子（ＨＩＳ３）は、感受性があり、かつ広範囲の発現水準に亙って選択される ことができるから、好適である。最も簡単な場合、細胞は活性化の不在下でヒス チジン栄養要求性（増殖にヒスチジンを要求する）である。活性化によって酵素 が合成され、そして細胞はヒスチジンについて原栄養性（ヒスチジンを要求しな い）になる。従って、選択は、ヒスチジンの不在下での増殖についてである。Ｉ ＧＰデヒドラターゼの細胞当たりほんのわずかの分子しかヒスチジン原栄養性に は必要でないので、測定は極めて高感度である。測定法のさらに複合的な改造法 では、細胞を、アミノトリアゾール（ＡＴ）、ＩＧＰデヒドラターゼの活性を阻 害する薬物、に対する抵抗性について選択することができる。低い固定水準のＨ ＩＳ３発現をもつ細胞は薬物に感受性があり、他方高い水準をもつ細胞は抵抗性 である。ＡＴ量はＨＩＳ３発現の基礎水準をもつ細胞を阻害するように選択する ことができるが、発現の誘発水準を持つ細胞の増殖を可能にする。この場合には 、選択は、ヒスチジンの不在下で、かつＡｔの適切な水準の存在下での増殖につ いてである。 適切な測定法では、いわゆる対抗選択可能なまたは負に選択可能な遺伝子を使 用することができる。適切な遺伝子として、ＵＲＡ３（オロチンジン−５′−リ ン酸デカルボキシラーゼ；５′−フクオロオロチン酸上での増殖を阻害する）、 ＬＹＳ２（２−アミノアジピン酸レダクターゼ；全窒素源としてα−アミノアジ ピン酸上での増殖を阻害する）、ＧＡＬ１（ガラクトキナーゼをコードする；Ｇ ＡＬ１の発現は、ＧＡＬ７（ガラクトトランスフェラーゼをコードする）または ＧＡＬ１０（エピメラーゼをコードする）中に突然変異を含有する菌株中のガラ クトース の存在下で毒性である）；ＣＹＨ２（リボソームタンパク質Ｌ２９をコードする ；シクロヘキシミド感受性対立遺伝子は耐性対立遺伝子に対して優性である）、 ＣＡＮ１（アルギニン透過酵素；ヌル対立遺伝子はアルギニン類似カナバニンに 耐性を与える）、および他の劣性薬剤耐性マーカーが挙げられる。 マーカー遺伝子はまたスクリーニング可能遺伝子であることができる。スクリ ーニングされた特徴は、細胞形態学、物質代謝または他のスクリーニング可能な 特徴の変化であることができる。適切なマーカーとして、ベーターガラクトシダ ーゼ（Ｘｇａｌ、Ｃ₁₂ＦＤＦ、Ｓａｌｍｏｎ−ｇａｌ、Ｍａｇｅｎｔａ−Ｇａｌ （後者はＢｉｏｓｙｎｔｈ Ａｇから入手））、酸またはアルカリホスファター ゼ、ワサビダイコンペルオキシダーゼ、エキソ−グルカナーゼ（酵母ｅｘｂ１遺 伝子の生成物；非必須、分泌性）；ルシフェラーゼ；およびクロランフェニコー ルトランスフェラーゼが挙げられる。上記の幾つかは、それらが分泌されるよう に（β−ガラクトシダーゼによらないで）遺伝子操作することができる。好適な スクリーニング可能マーカー遺伝子はベーターガラクトシダーゼである。酵素を 発現する個々細胞は無色の基質Ｘｇａｌを青色の色素に転化する。再度、プロモ ーターはサイクリックＡＭＰ誘発性またはサイクリックＡＭＰ阻害性であること ができる。 アデニリルシクラーゼの阻害剤を同定するためには、１つの態様では、ＭＡＴ α２ｐをコードしている遺伝子を、ＲＡＰ１結合部位を含有するプロモーターの 制御下に置き、その結果ＭＡＴα２の転写はｃＡＭＰ依存性になる。次いで、ｌ ａｃＺ遺伝子構築物をいずれかの一倍体特異性プロモーターの制御下に置く。こ れらの２種の構築物で形質転換された 酵母細胞中では、ｌａｃＺ−−の発現およびそれ故青色−−の発生はＭＡＴα２ Ｐの制御下になり、それは順にｃＡＭＰ水準によって制御される。具体的には、 活性アデニリルシクラーゼの存在下、酵母はＭＡＴα２ｐの発現およびその後の ｌａｃＺ発現の阻害によって白色である。シクラーゼが阻害される場合、ＭＡＴ α２ｐは減少し、その結果一倍体特異性プロモーターからのｌａｃＺ発現は増加 する。一倍体特異性プロモーターとして、これらに限定されないが、ＧＰＡ１、 ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８遺伝子のためのプロモーターが挙げられる。 アデニリルシクラーゼの阻害剤を発見する他の戦略は、ｃＡＭＰによって抑制 されるプロモーターを使用することである。ｃＡＭＰ抑制性要素はＳＳＡ３のプ ロモーター中に見出だされ（Ｂｏｏｒｓｔｅｉｎ，ＷＲ ａｎｄ ｒａｉｇ，Ｅ Ａ，１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：２５４３−２５５３）およびＣＴＴ１（Ｍ ａｒｃｈｌｅｒ，ＧＣ等、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：１９９７−２００ ３）、そしてＵＢ１４プロモーター（Ｔａｎａｋａ，ＫＫ等、１９８９，ＥＭＢ Ｏ Ｊ．，７：４９５−５０２）中に存在することができる。これらのプロモー ターは、ｌａｃＺのようなスクリーニング可能なマーカーの転写を指示するよう に遺伝子操作された場合、アデニリルシクラーゼ活性の阻害の読出しを提供する ことができる。具体的には、アデニリルシクラーゼの阻害の結果は、ｃＡＭＰ水 準が低下して、ｌａｃＺ発現の抑制を解除し、その結果阻害剤に露呈された酵母 の培養物中に数時間内に青色が発生する。かかる読出しは、アゴニストまたはア ンタゴニストによって起こされるｃＡＭＰの水準の小さい変化に鋭敏であり、そ して上記の増殖読出しの潜在的な欠点の幾つかを有しない。６．アデニリルシクラーゼ以外のタンパク質の阻害または活性化の検出 酵母細胞がアデニリルシクラーゼに直接にまたは間接に機能的「結合」するよ うにな方式で、興味を起こさせるタンパク質を発現するか、または発現するよう に遺伝子操作されるならば、アデニリルシクラーゼ以外のタンパク質の阻害剤ま たは活性化剤を検出することは可能である。 例えば、細胞を使用して、シクラーゼ関連タンパク質（ＣＡＰ）の阻害剤また は活性化剤についてスクリーニングすることができる。酵母細胞骨格（Ｋａｗｍ ｕｋａｉ等、１９９２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，３：１６７−１８０）と 相互作用し、そして酵母アデニリルシクラーゼ活性の調節体であることができる ＣＡＰが酵母中で同定された。 同様に、酵母ＣＡＰ遺伝子のヒト相同体が同定されて、そしてこれはヒトアデ ニリルシクラーゼの調節体として機能することができる。かかる調節体は潜在的 に、他のシグナル伝達経路からのシグナル中に入り込むことができる。アデニリ ルシクラーゼと相互作用しそしてそれらの活性を改変する、これらのおよび他の 未だ未同定の調節体を、本発明のさらなる態様において、クローン化された哺乳 類アデニリルシクラーゼに結合しているシグナル伝達経路のいずれの工程にも影 響するアゴニストまたはアンタゴニストを発見するために、使用することができ る。 アデニリルシクラーゼの最も特性決定された調節体はＧタンパク質、またはさ らに正確には、Ｇタンパク質の解離から生じるＧαサブユニットおよび／または Ｇβγ複合体である。その結果、本発明の酵母細胞を使用して、外因性（または キメラ）Ｇタンパク質結合受容体または他のＰＳＰ代理体と相互作用する能力に ついて、薬物を試験することができる。酵母細胞は、外因性Ｇタンパク質結合受 容体（またはたのＰＳＰ代 理体）、および相補性（通常は外因性またはキメラ的）Ｇタンパク質（または薬 物による活性化の後に必要である場合、フェロモン系中で作用するＰＳＰ代理体 に必要な他のＰＳＰ）の両方を発現しなければならず、そしてこれらの分子は、 アデニリルシクラーゼが影響されるような方式で提供されなければならない。 酵母細胞がＧタンパク質結合受容体を発現し、そしてこの受容体の刺激によっ て酵母細胞によって発現したＧタンパク質の解離が起こり、次いでＧαサブユニ ットまたはＧβγ複合体が哺乳類アデニリルシクラーゼと相互作用して、その活 性水準を増加または低下させる場合、Ｇタンパク質結合受容体（およびＧタンパ ク質）はアデニリルシクラーゼに結合するということができる。即ち、受容体の 阻害剤または活性化剤はアデニリルシクラーゼ活性に影響する。従って、酵母細 胞は、それが外因性（通常は哺乳類）Ｇタンパク質結合受容体の阻害剤または活 性化剤を、結合アデニリルシクラーゼの活性に対するそれらの効果によって、検 出するのに使用することができるように、遺伝子操作されることができる。この 結合は、対応する外因性（キメラ的）Ｇα、Ｇβおよび／またはＧγサブユニッ トの使用によって促進され、そしてシグナル対ノイズ率が、外因性遺伝子（また はそれらの生成物）の部分的または全不活性化によって改善されることができる 。 外因性Ｇタンパク質結合受容体はＰＳＰ代理体の一例であり、対応する酵母タ ンパク質はα−またはａ因子受容体である。しかし、他のＰＳＰの代理体の阻害 剤または活性化剤は、それらが内因性または外因性Ｇタンパク質結合受容体、お よびＧタンパク質結合アデニリルシクラーゼの刺激に直接的にまたは間接的に影 響するならば、スクリーニングする ことが可能である。 これらの「上流」ＰＳＰの例として、ファルネシルトランスフェラーゼおよび カルボキシメチルトランスフェラーゼが挙げられる。発現の後、ａ因子はＲＡＭ １ｐおよびＲＡＭ２ｐによってファルネシル化され、そしてＳＴＥ１４ｐによっ てカルボキシメチル化される。 ＲＡＭ１ｐおよびＲＡＭ２ｐは、異種二量体哺乳類ファルネシルトランスフェ ラーゼのサブユニットに相同であり、それ自体は哺乳類Ｒａｓタンパク質の膜会 合に必要である。酵母細胞が哺乳類ファルネシルトランスフェラーゼを発現する ように遺伝子操作される場合、それは、その酵素と相互作用する薬物を、機能的 ａ因子が産生するかどうかを決定することによって、同定するのに使用すること ができる。同様に、Ｓｔｅ１４ｐは哺乳類カルボキシメチルトランスフェラーゼ に相同であり、それは、低分子量のＧタンパク質（Ｒａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ）の 機能を制御する調節的役割を果たす。 プロテアーゼ。ＰＳＰは、ＫＥＸ２、ＳＴＥ１３またはＫＥＸ１のような酵母プ ロテアーゼであることができる。酵母α−因子フェロモンが、これらのプロテテ アーゼによる前駆体タンパク質の制御されかつ制限されたタンパク質分解によっ て生成する。酵母細胞は、代理体非酵母プロテアーゼの切断部位に対応する、ペ プチドリンカーが、切断によって成熟α−因子（またはその機能的相同体）が遊 離するように、取り込まれる酵母α−因子の不活性な前駆体を発現するように遺 伝子操作することができる。例えば、ＰＳＰ代理体はＨＩＶプロテアーゼとする ことができ、ＨＩＶプロテアーゼの切断部位はα−因子前駆体中の酵母プロテア ーゼ切断部位の代わりに置換される。前駆体およびＨＩＶプロテアーゼ は酵母細胞中で共発現する。ＨＩＶプロテアーゼによるタンパク質分解によって 、成熟α−因子が産生され、そしてシグナル形質導入が開始される。このシステ ムはＨＩＶプロテアーゼの阻害剤を同定するのに使用することができる。 好適には、天然に存在する酵母細胞とは異なって、酵母細胞は、α−因子前駆 体のみならず、α−因子受容体も発現するように遺伝子操作されるので、酵母の 単独一倍体型が測定を行うのに要するすべてである。ＡＢＣ輸送体。Ｓｔｅ６は 、α−因子の輸出に必要な酵母ＡＢＣ輸送体である。酵母細胞はα−因子および 外来ＡＢＣ輸送体の両方を発現するように遺伝子操作される。この輸送体は、そ れ自体はα−因子を輸送することができないものであるが、興味を起こさせる薬 物の存在下では、そうすることができるものであり得るか、またはそれは既に機 能的であるものであることができる。好適には、酵母細胞は、α−因子のみなら ず、α−因子受容体も発現するように遺伝子操作される。 内因性フェロモン受容体（または同族ＰＳＰ）が酵母細胞によって産生される 場合、測定は、フェロモン受容体（または同族ＰＳＰ）と相互作用するペプチド と外因性受容体（またはＰＳＰ代理体）と相互作用するものとの間を容易に区別 することができる。それ故、内因性遺伝子は欠失するかまたはそうではなく非機 能的になることが望まれる。 本発明を使用して、これらに限定されないが、受容体チロシンキナーゼとサイ トカイン受容体（ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＥＰＯ などのためのもののような）、Ｇタンパク質結合ケモカイン受容体（ＲＡＮＴＥ Ｓ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−１αおよびＩＬ−８受容体のような）、 増殖因子受容体（ＥＧＦＲおよびＰ ＤＧＥＲなどのような）、ＭＩＲＲｓとして知られている多重サブユニット免疫 認識受容体（ＦｃεＲＩ、およびＦｃγＲＩＩなど）を含む、多くの哺乳類受容 体の阻害剤または活性化剤を同定することができる。本発明で有用なさらなる受 容体として、Ｇタンパク質結合Ｃ５ａペプチド受容体、トロンビンペプチド受容 体（ＰＡＲ１）とその相同体ＰＡＲ２、ホルミルペプチドとブラジキニン受容体 、ムスカリン様受容体、アドレナリン作用性受容体、メラトニン、ガラニン、グ ルカゴンおよびオーファン受容体および多薬剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）輸送体 タンパク質が挙げられる。６．１ 哺乳類Ｇタンパク質−結合レセプター 本発明の酵母細胞は、哺乳類Ｇタンパク質−結合レセプターの活性をモジュレ ートする薬剤を同定するために使用できる。この態様では、哺乳類Ｇタンパク質 −結合レセプターを発現するように酵素細胞を操作する。ほとんどのＧタンパク 質−結合−レセプターは、形質膜を７回貫通する一本鎖から成る。そのようなレ セプターはしばしば、セブン−トランスメンブランレセプター（seven-transmem brane receptor:STR）と呼ばれる。100種以上ものＳＴＲが見いだされ、同じリ ガントに結合する多数の異なるレセプターを含み、そしてさらに多くのＳＴＲが 発見されるようである。 さらに、天然のリガンドが未知なＳＴＲが同定された：これらのレセプターは “みなし児”Ｇタンパク質−結合レセプターと呼ばれている。例にはNeoteら、C ell 72,415(1993):Koubaら、FEBS Lett.321,173(1993);Birkenbachら、J.Virol. 67,2209(1993)によりクローン化されたものがある。 本発明の“外因性Ｇタンパク質−結合レセプター”は、本発明の目的のために 特別に遺伝子操作された、野生−型酵母細胞に対して外因性である任意のＧタン パク質−結合レセプターでよい。このレセプターは植物または動物細胞レセプタ ーでよい。植物細胞レセプターに対する結合のスクリーニングは、例えば除草剤 のような開発に有用である。動物レセプターの場合は、無脊椎または脊椎動物起 源でよい。もし無脊椎動物レセプターであれば、昆虫レセプターが好ましく、そ して殺虫剤の開発に利用できる。このレセプターは脊椎動物、より好ましくは哺 乳類、さらに一層好ましくはヒトのレセプターでもよい。外因性のレセプターも 好ましくは、セブントランスメンブランセグメントレセプターである。 適当なレセプターには、制限するわけではないが、ドーパミン作用性の、ムス カリン作用性のコリン作用性の、α-アドレナリン作用の、β-アドレナリン作用 性、オピオイド（デルタおよびミューを含む）の、カンナビノイド、セロトニン 作用性の、そしてＧＡＢＡ作用性のレセプターを含む。他の適当なレセプターは 国際公開第94/23025号明細書の表２に掲げられている。本明細書で使用する用語 “レセプター”は、天然に存在する、または突然変異体レセプターの両方を包含 する。 これらの多くのＧタンパク質−結合レセプターは、酵母ａ-およびα-因子レセ プターのように、形質膜内にあると予想される７つの疎水性アミノ酸リッチ領域 を含む。遺伝子がすでに単離され、そしてその発現ベクターを構築できる特別な ヒトＧタンパク質−結合ＳＴＲには、国際公開第94/23025号明細書の表２に掲げ たものを含む。すなわち遺伝子を、酵母中で機能するプロモーターおよび酵母中 で機能するシグナル配列に操作可能に連結する。適当なプロモーターはSte2、St e3 およびga110を 含む。適当なシグナル配列にはこれらのSte2、Ste3および酵母細胞により分泌さ れるタンパク質をコードする他の遺伝子を含む。好ましくは遺伝子のコドンは、 酵母中での発現について至適化されている。Hoekemaら、Mol.Cell.Biol.,7:2914 -24(1987);Sharpら、14:5125-43(1986)を参照にされたい。 ＳＴＲの相同性は、Dohlmanら、Ann.Rev.Biochem.,60:653-88(1991)で考察さ れている。ＳＴＲを比較すると、場所的な相同性のパターンを認識できる。トラ ンスメンブラン ドメインはしばしば、最も類似しており、一方Ｎ−およびＣ− 末端領域、ならびにトランスメンブランセグメントＶおよびVIを連結する細胞質 ループはより変化している。 異なるＳＴＲ領域の機能的な重要性は、点突然変異（置換および欠失の両方） を導入し、そして異なるが関連するＳＴＲのキメラを構築することにより研究さ れた。個々のセグメントに対応する合成ペプチドも、活性を試験した。アフィニ ティー標識もリガンド結合部位を確認するために使用された。 酵母中で発現する外来性のレセプターが、機能的に酵母膜に組み込まれ、そし てそこで内因性の酵母Ｇタンパク質と相互作用することが考えられる。さらにレ セプターが修飾されるか(例えば、そのＶ−VIループを酵母STE2またはSTE3レセ プターと置き換えることによる)、あるいは匹敵するＧタンパク質が提供される ことが必要になるだろう。 野生型外因性Ｇタンパク質−結合レセプターが酵母中で機能的にできなければ 、この目的のためにこれを突然変異させてもよい。外因性レセプターと酵母レセ プターとの間のアミノ酸配列の比較を行い、高および低相同性領域を同定した。 膜内への機能的組み込みの必要性から、試験 的な突然変異を、リガンドまたはＧタンパク質結合に関与する領域を区別するた めに行なった。外因性レセプターを次に、酵母レセプターにさらに似せるために 、機能的組み込みが達成されるまで、後者の領域で突然変異させた。これが機能 性を得るために不十分ならば、Ｇタンパク質結合が関与する領域で次の突然変異 を行う。リガンド結合に関与する領域での突然変異は最後の手段として行い、そ して次に可能であればいつでも保存的置換を行うことにより、リガンド結合性を 保存するための努力をする。 好ましくは酵母ゲノムは、内因性の機能的な状態のａ-およびα-因子レセプタ ーを作成できないように修飾する。あるいは陽性のアッセイ評価は、問題のレセ プターではなく内因性のＧタンパク質−結合レセプターを活性化するペプチドの 能力を反映する。 ＰＳＰの代理が外因性のＧタンパク質−結合レセプターであるとき、酵母細胞 は外因性レセプターにより活性化され、そして次に哺乳類アデニルシクラーゼを 活性化できるＧタンパク質を生成できなければならない。内因性の酵母Ｇαサブ ユニット（例えばＧＰＡ）は十分に、“コンジネート(congnate)”Ｇαサブユニ ット(これはカップリングが起こるように外因性のレセプターと天然に結合して いる)と相同的である。さらに、外因性レセプターと正しく相互反応できる外来 のＧαサブユニットを生成する酵母細胞を遺伝的に操作する必要もあるだろう。 例えば、酵母Ｇタンパク質のＧαサブユニットは、自然に外因性レセプターと会 合したＧαサブユニットに置き換えることもできる。 DietzelおよびKurjan,Cell,50:1001(1987)は、機能的に酵母Ｇβγ複合体にカ ップルしたラットＧαｓを示した。しかしラットＧαｉ２は実 質的に過剰発現時のみ相補し、一方Ｇα０は全く相補しなかった。Kangら、Mol. Cell.Biol.,10:2582(1990)。結局、酵母Ｇαを幾つかの外来のＧαサブユニット に単純に置き換えることはできない。 したがって、別の方法として、酵母ＧαサブユニットをキメラＧαサブユニッ ト（その中の部分、実質的に酵母Ｇαのアミノ末端の対応する残基と相同的であ る、例えば少なくとも約２０、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸が、哺 乳類（または他の外因性の）のＧα骨格と実質的に相同的な配列と融合されてい る）に置き換える。４０アミノ酸が開始点として提案され、酵母Ｇβγとカップ リングするために必要とされる最小長、ならびに外因性レセプターに対するカッ プリング保持に匹敵する最大長を決定するために、より短い、またはより長い部 分を試験できる。現在、Ｇαサブユニットのカルボキン末端の最終のアミノ酸１ ０または２０個のみが、レセプターとの相互反応に必要であると考えられている 。 もし酵母細胞が哺乳類の、またはキメラＧαｉを発現するように操作されるな らば、そのＧαｉの阻害活性の特異的モジュレーターを予備選択できる。以下の レセプターはＧαｓにシグナル伝達してアデニリルシクラーゼを活性化すること が示された： β₁−アドレナリン作用性 ヒスタミンＨ２ β₂−アドレナリン作用性 グルカゴン Ｄ₁ドーパミン カルシトニン Ｄ₅ドーパミン グルカゴン-様ペプチド１ バソアクティブ インテスティナル ペプチド アデノコルチコトロピン作用性 ろ胞刺激ホルモン メラニン細胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン/ コリオゴナドトロピン セクレチン バソップレッシン Ｖ２ アデノシンＡ２ 甲状腺刺激ホルモン 以下のレセプターはアデニリルシクラーゼの阻害に関与することが示された： この阻害はＧｉ／Ｇｏ族のＧタンパク質員に対するシグナル伝達を介して起こる と考えられる： アデノシンＡ１ アンギオテンシンII、１型 アデノシンＡ３ カンナビノイド α-アドレナリン作用性 ブラジキニン ムスカリン作用性アセチルコリン レセプター２型 ＧＡＢＡ ムスカリン作用性アセチルコリン レセプター４型 ガラニン Ｄ２ドーパミン メタボトロピックグルタメート２型 Ｄ４ドーパミン メタボトロピックグルタメート３型 ５ＨＴ１ａ メタボトロピックグルタメート４型 ５ＨＴ１ｂ メラトニン ５ＨＴ１ｄ ＮＰＹ１ ５ＨＴ１ｅ ＮＰＹ２ ５ＨＴ１ｆ ソマトスタチン２ ホルミルMet-Leu-Phe ソマトスタチン３ デルタ オピオイド ソマトスタチン４ 酵母細胞を、哺乳類またはキメラＧβおよび／またはＧγサブユニット、なら びに哺乳類またはキメラＧαｓを発現するように操作できる。ＧαｓおよびＧβ γサブユニットは会合してレセプターがカップルするヘテロ三量体Ｇタンパク質 を形成する。レセプターの刺激により、Ｇαｓの活性化速度が大きく増加し、Ｇ αｓおよびＧβγの解離を引き起こす；Ｇαｓは引き続き哺乳類アデニリルシク ラーゼを活性化する。６．２ ファルネシルトランスフェラーゼ 酵母ａ-因子の活性には、そのファルネシル化（Ram1pおよびRam2Pにより成る 、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼにより媒介される）、１次翻訳産 物のＣ−末端の３アミノ酸のタンパク質溶解開裂（未だに同定されていない酵素 により媒介される）、およびＣ−末端システインのカルボキシメチル化(Ste14p により媒介される)が必要である。酵母および哺乳類のファルネシルトランスフ ェラーゼは、構造的および機能的に類似している(Gomez Rら、Biochem.J.289:25 -31,1933:Kohl NEら、J.Biol.Chem.266:18884-8,1991)。酵母のファルネシルト ランスフェラーゼのαおよびβサブユニットをコードする遺伝子(それぞれRAM2 およびRAM1)、ならびに哺乳類のファルネシルトランスフェラーゼのαおよびβ サブユニットをコードする遺伝子(Kohl NEら、J.Biol.Chem.266:18884-8,1991； Chen WJら、Cell 66:327-34,1991)の間には配列相同性が存在する。哺乳類のフ ァルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットおよびRam1pは、アミノ酸配列 に7％の同一性が観察された(Chen WJら、Cell 66:327-34,1991)。 ファルネシルトランスフェラーゼのインヒビターを予備選択することの重要性 は、哺乳類のp21ras(種々の癌に関与する哺乳類細胞の成長お よび分化の抜群のレギュレーターである)が、ファルネシルトランスフェラーゼ の基質であり、そしてp21rasのファルネシル化がその活性に必要であるという事 実により示唆される。事実、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼの合成 の有機インヒビターは、ras-依存的な細胞の形質転換を選択的に阻害する(Kohl ら、Science 260,1934(1993)。ファルネシルトランスフェラーゼの２つのサブユ ニットのうち、βサブユニットは明らかに専らファルネシル化を行うので、イン ヒビターのより魅力的な標的である。対照的にαサブユニットは、ゲラニル−ゲ ラニルトランスフェラーゼＩ(ヘテロ三量体Ｇタンパク質およびRho/Rac族の小分 子量Ｇタンパク質のＧγサブユニットの修飾に関与する酵素)を共有する。βサ ブユニットがファルネシル化に専念する一方、哺乳類のファルネシルトランスフ ェラーゼは、p21rasに加えて様々な基質を有する。これらの他の基質（例えばラ ミンタンパク質、トランスデューシン-γおよびロドプシンキナーゼ）のファル ネシル化に対するβサブユニットインヒビターの効果は、有力なファルネシルト ランスフェラーゼインヒビターの設計および使用に考慮されるであろう。 相同的な哺乳類の遺伝子が酵母のRam1Pと機能的に置き換わるであろうことは まだ実証されていないが、これはram1突然変異体およびファルネシルトランスフ ェラーゼのβサブユニットをコードする哺乳類遺伝子を発現するベクターを使用 して、正式に試験することができる。もし哺乳類のβサブユニットがRam1Pの代 わりに機能できれば、試験細胞は両方とも生存でき（Rasのファルネシル化の結 果として）、そして交配可能である（ａ-因子のファルネシル化の結果）。 もしファルネシルトランスフェラーゼのβ-サブユニットをコードす る哺乳類の遺伝子が、ram1を相補すれば、酵母は哺乳類のファルネシルトランス フェラーゼの有力なインヒビターを発見するための試験系を提供するだろう。特 にMATa酵母テスター細胞は；１．RAM1の代わりに哺乳類ファルネシルトランスフ ェラーゼのβサブユニットの遺伝子を持つ；２．cAMPの存在下で、Ras機能の損 失に対して株を耐性にするcam突然変異を持つ；３．Ste3pの異質発現により運ば れるａ-因子に反応する；４．自己分泌ａ-因子に反応するのでガラクトースを含 有する培地では成長できないように開発できた。後者の特性は、フェロモン−反 応性プロモーターおよび突然変異したGAL7またはGAL10遺伝子を含むように操作 した細胞の制御下で、GAL1の発現に必要である。GAL1の発現は、GAL7またはGAL1 0遺伝子のいずれかに突然変異を含む株では、ガラクトースの存在下で毒性であ る。フェロモン反応経路を通るシグナル伝達は、そのように操作した細胞をガラ クトース感受性にする。そのような株を、ファルネシルトランスフェラーゼのβ サブユニットを阻害する化合物に暴露すると、これらの細胞にガラクトースおよ びcAMPを含む培地中で成長できる能力を付与する。 ファルネシルトランスフェラーゼのβ-サブユニットをコードする哺乳類の遺 伝子（および遺伝子のすべての修飾された変異体がram1を相補できなければ、哺 乳類のファルネシルトランスフェラーゼの有力なエフェクターのための代理標的 として、野生型のRam1pを使用できる。特にテスター細胞として：１．cAMPの存 在下で、Ras機能の損失に対して株を耐性にするcam突然変異を持つ；２．Ste3p の異質発現により運ばれるａ-因子に反応する；３．自己分泌ａ-因子に反応する ので、ガラクトースを含有する培地では成長できない、MATa酵母株を使用する。 そのような 株を、ファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットを阻害する化合物に暴 露すると、これらの細胞にガラクトースおよびcAMPを含む培地中で成長できる能 力を付与する。 上記に概説した方法で、ファルネシルトランスフェラーゼのインヒビターを、 ａ-因子に対する陰性反応を直接的に遮断する化合物(例えば、Ste4-Ste18複合体 とそのエフェクターとの相互作用妨害することによる)、あるいはファルネシル トランスフェラーゼに関与しないメカニズムによりａ-因子の生成を遮断する化 合物、のいずれかから区別できることが望ましい。対照はそのような疑陽性を同 定する。候補薬剤は、α-因子を分泌し、そして誤って分泌したａ-因子に反応し てガラクトース含有培地成長するように操作したMATa株で、上記に概説したよう な陰性選択スキームのように試験する。株は野生型Ram1Pを発現するだろう。こ れらの細胞がガラクトースおよびcAMPを含有する培地で成長できるようにする任 意の薬剤は、ファルネシルトランスフェラーゼのインヒビターとして作用しない だろう。 前述の試験に通過した候補薬剤は、Ste14p、Ste6pまたはファルネシルトラン スフェラーゼというよりはむしろａ-因子の成熟および輸送に関与する他のタン パク質を標的にすることにより作用できる。(注意。しかし、細胞の生存に必須 な能力を阻害する化合物は、疑陽性を生じないだろう。例えば、ａ-因子前駆体 のＣ−末端トリペプチドのエンドプロテオリティックな除去の原因のプロテアー ゼは、Ｇｇおよびタンパク質のRho/Rac族の員のプロセッシングに参加するよう なので、この酵素のインヒビターはテスター細胞の成長を可能にすることができ ない)。ａ-因子の生成に関与するタンパク質の中で、ファルネシルトランスフェ ラーゼだけがRAS機能の主要な決定基でもある、このような結果から、Ram1突然 変異体は30℃での成長を欠き、そして完全に37で成長できない(He Bら、Proc.Na tl.Acad.Sci.88:11373-7,1991)。テスター細胞（上記）は、候補インヒビターの 存在下、ガラクトース含有培地±cAMPで成長できる。もし試験化合物がファルネ シルトランスフェラーゼを阻害すれば、細胞はガラクトース±cAMPで成長できる が、cAMPの不在中のガラクトースでは成長できない。この違いは37℃で最も顕著 である。一方もし、試験化合物がａ-因子生成に関与する他のタンパク質を阻害 すれば、細胞はcAMPの有無にかかわらずガラクトース含有培地中で成長するだろ う。 上記の試験を通過した化合物は、ファルネシルトランスフェラーゼのインヒビ ターであろう。これは確認され、そしてそれらの能力を直接的なインビトロ酵素 アッセイで決定できる。概説した方法は、Ram1Pに影響を及ぼすファルネシルト ランスフェラーゼインヒビターを同定するだろう。Ram2Pを遮断する薬剤は、す べての条件下で成長できないようである。実際、ram2ヌル突然変異は致命的であ り(He Bら、Proc.Natl.Acad.Sci.88:11373-7,1991)、おそらくRam2Pもゲラニル ゲラニルトランスフェラーゼＩの成分として機能しているという事実によるもの であろう。６．３ カボキシメチルトランスフェラーゼ 酵母では、ａ−因子、Rasタンパク質および、おそらくRho/Racタンパク質のＣ −末端アミノ酸のメチル化は、Ste14pにより触媒される。MATa ste14突然変異体 は交配できないが、ａ-因子活性のカルボキシメチル化の必要性に影響し、ste14 破壊が致死的ではなく、そして細胞増殖速度に影響しない。カルボキシメチル化 は、Rasタンパク質およびSte18p(Ｇγサブユニットの酵母の相同体)の機能に重 要ではないようである。 酵母中のRas機能は明らかにカルボキシメチル修飾の不在に耐性であることがで きるが、これにもかかわらず哺乳類のメチルトランスフェラーゼのインヒビター は哺乳類のp21rasの活性を変化させることができる。 酵母のste14突然変異がホモロガスな哺乳類の遺伝子またはその修飾変異体に より相補できれば、これを決定できる。遺伝子型がste14である酵母中で、メチ ルトランスフェラーゼをコードする哺乳類の遺伝子を発現するために、エピソー ムベクターを使用できる。この株は、正常なａ-因子レセプターの代わりにａ-因 子レセプターを発現し、そして細胞に分泌されたａ-因子がヒスチジン−欠失培 地でオートクリン増殖を付与するように組み込まれたfus1-HIS3構築物を含む、 修飾されたMATa株である。もし哺乳類のメチルトランスフェラーゼがSte14pの代 わりに機能できれば、テスター細胞は交配できる。すなわち、哺乳類のメチルト ランスフェラーゼは活性なａ-因子をste14突然変異体中で合成することを可能に する。 もしメチルトランスフェラーゼをコードする哺乳類の遺伝子が、ste14を相補 するならば、テスター株は哺乳類のメチルトランスフェラーゼの有力なインヒビ ターを試験するために構築できる。１つの態様では、テスターMATa酵母株は：１ ．STE14の代わりに哺乳類のカルボキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子をもつ ；２．Ste3pによるヘテロロガスな発現により運ばれるa-因子に応答する；３． 自己分泌ａ-因子に反応するので、上記に概説した陰性GAL1選択スキームのよう にガラクトースを含有する培地で成長できないだろう。そのような株を、メチル トランスフェラーゼを阻害する化合物に暴露すると、これらの細胞にガラクトー ス含有培地中で成長できる能力を付与するだろう。 カルボキシメチルトランスフェラーゼ活性のインヒビターを、ａ-因子に対す る陰性反応を直接的に遮断する化合物(例えば、Ste4-Ste18複合体とそのエフェ クターとの相互作用を妨害することによる)、あるいはメチルトランスフェラー ゼに関与しないメカニズムにより、ａ-因子の生成を遮断する化合物のいずれか から区別できることが望ましい。以下の対照実験は、そのような疑陽性を同定す る。候補インヒビターは、ａ-因子を分泌し、そして誤って分泌したａ-因子に反 応してガラクトース含有培地成長するように操作したMATa株で試験する。このよ うな細胞がガラクトースを含有する培地で成長できるようにする任意の薬剤は、 カルボキシメチルトランスフェラーゼのインヒビターとして作用しないだろう。 前述の試験に通過した候補化合物は、カルボキシメチルトランスフェラーゼ、フ ァルネシルトランスフェラーゼ、Ste6pまたはａ-因子の成熟および輸送に関与す る他のタンパク質を標的にすることができる。化合物の標的を識別するために、 インビトロの生化学的、およびインビボの遺伝学的アッセイの組み合わせを応用 できる：候補薬剤の効果を試験するためにカルボキシメチルトランスフェラーゼ およびファルネシルトランスフェラーゼの両方が、インビトロでアッセイされる 。さらに、もし標的がSte14pならば、高コピープラスミドでのその過剰発現は、 化合物のインビボでの効果に対する耐性を付与するはずである。６．４ プロテアーゼ 成熟酵母α-因子は、成熟哺乳類メラノサイト−刺激ホルモン（MSH）またはカ ルシトニンが前駆体ポリタンパク質から誘導されるのとほぼ同様ナ様式で、ポリ タンパク質前駆体から誘導される13個のアミノ酸ペプチドである。酵母ゲノム中 の2つの遺伝子は、プレプロ-α-因子、MFα1 およびMFα2をコードする。MFα1は以下の構造のポリペプチド中に埋め込まれた 、成熟α-因子の4つのコピーを含有する前駆体ポリペプチドをコードする：疎水 性プレ-配列／親水性プロ−配列／α-因子／α-因子／α-因子／α-因子／。MF α2は、成熟α-因子の２コピーのみを含有する同様な構造のポリタンパク質前駆 体をコードする。 プレ-プロ-α-因子は細胞質で合成され、そして次に古典的なエス.セルビシエ (S.Cerevisiae)の分泌経路に沿って細胞質から小胞体に、そして次にゴルジに輸 送される。プレプロ-α-因子のシグナル配列は、ER中への移送中にシグナルペプ チダーゼにより開裂され、そしてアスパラギン結合オリゴサッカライドが付加さ れ(ER中で)、そして分泌経路を移動する時に前駆体のプロ−セグメント上で修飾 される（ゴルジ中で）。いったんゴルジに入ると、３つの異なるタンパク質溶解 プロセッシング工程が起こる。第一に、Kex2プロテアーゼが各α-因子反復のア ミノ末端付近の二塩基性残基(-KR-)で開裂する。Kex2は、哺乳類細胞のプロホル モンプロセッシングに関与するズブチリシン-様エンドプロテアーゼPC2およびPC 1/PC3に相同的である(SmeekensおよびSteiner 1990:ナカヤマら、1991)。さらに 哺乳類のKex2-様プロセッシングエンドプロテアーゼには、ヒト肝腫瘍から単離 されたPACE、精巣性生殖細胞で発現するPC4、およびガストロインテスチィナル ペプチドのプロセッシングのための候補プロテアーゼPC6を含む(Barrら、1991; ナカヤマら、1992;ナカガワら、1993)。Kex2-様タンパク質は、哺乳類細胞中の 組織−特異的エンドプロテアーゼの大きな族を含んで成るようである。 いったんKex2が未成熟なα-因子ペプチドを放出すると、２つのさらなるプロ テアーゼがプロセッシングを完了するように作用する。Kex1は、 Kex2による開裂後に残るカルボキシ−末端−KRを除く特異的なカルボキシペプチ ダーゼである。その哺乳類の対のカルボキシペプチダーゼＢおよびＥのように、 Kex1はカルボキシ-末端の塩基性残基を持つペプチド基質に高度に特異的である 。生じる最終的なタンパク質溶解的プロセッシングは、各プロ-α-因子ペプチド のアミノ末端でスペーサージペプチドを除去することである。これはSTE13遺伝 子産物、ジペプチジル アミノペプチダーゼＡにより達成される。この酵素はジ ペプチジル アミノペプチダーゼIV型である：これは-ｘ-Ａ-または-ｘ-Ｐ-部位 のいずれかのカルボキシル側で、インビトロで開裂できる。 他の種類のIV型ジペプチジル アミノペプチダーゼは、動物細胞中の様々なプ レ−ペプチドのプロセッシングにおいて活性であると考えられている(Kreil 199 0)。さらに、酵母Kex1およびKex2との間に機能的類似性が証明され、そしてその 両方の酵母酵素の哺乳類の対は、天然の酵素が欠失している哺乳類細胞中で発現 した時に、タンパク質溶解的に内因性の前駆体を開裂する(Thomasら、1988,1990 )。次に酵母プロテアーゼKex1、Kex2およびSte13pの哺乳類の相同体は、酵母中 で発現した時に、適切な開裂部位を持つ合成のα-因子フェロモン前駆体をプロ セスするように機能すると思われる。酵母中でそのように機能するヒトプロテア ーゼには、PC2およびPC1/PC3(または他のKex2相同体)、カルボキシペプチダーゼ ＢおよびＥ(Kex1相同体)、ならびにIV型ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Ste1 3p相同体）を含む。 酵母は、合成α-因子をプロセスできるプロテアーゼのインヒビターを発見す るために、容易なアッセイ系を提供するだろう。酵母は有力なインヒビターおよ び外因性プロテアーゼの両方を発現するように操作で き、そして好ましくは後者の酵母コンジネートではない。 さらに、プロテアーゼインヒビターを同定するための酵母フェロモンプロセッ シングを活用する手段は、適当な開裂認識部位が合成のα-因子前駆体に含まれ るかぎり、酵母中で機能を発現することができる任意のプロテアーゼを包含する ように広げることができる。後者の方法では、新規なタンパク質溶解活性を酵母 に加えるようになる；これらの酵素は、α-因子成熟経路中のプロテアーゼに代 わるであろうが、Kex1、Kex2またはSte13pの“触媒的相同体”にはならないだろ う。成熟α-因子の生産は、合成のMFα遺伝子から選択された酵母酵素について の認識部位（１つ、または複数）の除去、および新規なプロテアーゼ（１つ、ま たは複数）の認識配列の挿入を通して、新規なプロテアーゼ活性に依存するよう になるだろう。６．５ 外因性 ＡＢＣ輸送体 細胞質中の翻訳開始を含む分泌経路を通って進行する、細胞外の環境に輸送さ れるよう定められたタンパク質の多くは、小胞体の管腔への輸送、ゴルジを通っ て分泌小胞の通過、そして続いて細胞から出る。他のタンパク質は、“ＡＢＣ輸 送体”による仲介が関与する別のメカニズムにより細胞から出る。このＡＢＣ輸 送体は進化的に保存されたタンパク質の一族を形成し、全体的に類似する構造を 共有し、そして細胞膜をわたって大きな、および小さな分子の輸送で機能する(H iggins、1992)。このタンパク質一族の特徴的な成分は、ＡＴＰに結合する高度 に保存された配列である(Higginsら、1986;Hydeら、1990)；これら固有な膜タン パク質はATPaseであり、そのヌクレオチドの加水分解からエネルギーを取り出し 、分子の輸送を行う。この一族は50種より多くの原核および 真核細胞タンパク質を含む：アミノ酸、糖、オリゴサッカライド、イオン、重金 属、ペプチドまたは他のタンパク質の輸送体は、この超族に属する。代表的なト ランスメンブラン輸送体は、国際公開第94/23025号明細書の表１に含まれる。典 型的にはＡＢＣ輸送体は、物質を濃度勾配に対して細胞膜を通過させて汲み上げ るために、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを使用する。幾つかは物質を輸入し、そ して他は輸出する。Higgins，Ann.Rev.Cell.Biol.,8:67-113(1992)を参照にされ たい。 ＡＢＣ輸送体の原型構造は、４つの膜会合ドメインを含む：２つの疎水性の、 推定上の膜−スパンニング配列は、各々膜を６回横断し、そしてＡＴＰ加水分解 とカップルする２つのヌクレオチド結合ドメインが、輸送されると推定される。 原核生物では、ＡＢＣ輸送体のドメインは、しばしば別個のポリペプチド中に存 在する。ドメイン融合の様々なパーミューテーション(permutation)が記載され た：大腸菌のヒドロキサム酸鉄輸送体は、２つの膜スパンニングドメインを一本 のポリペプチド中に含み、そして幾つかの生物のリボース輸送体は１つの分子上 に２つのヌクレオチド−結合ドメインを持つ。主要組織適合性遺伝子複合体（Ｍ ＨＣ）ペプチド輸送体は、２つのポリペプチド、Tap1およびTap2から成る。各タ ンパク質のN-末端は、疎水性の膜-スパンニングドメインを含むが、一方C-末端 はＡＴＰ−結合配列を含む。Tap1およびTap2は一緒に、機能的複合体を形成する 。分裂酵母シゾサッカロミセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)中で発現す る重金耐性タンパク質HMT1は、１本の疎水性ドメインおよびC-末端のATP-結合配 列を含むポリペプチドから成る(Ortizら、1992)。これはMHT1輸送体がホモ二量 体として機能するのかもしれない。サッカロミセス セルビシエ(Saccharomyces cerevis iae) のSte6 ａ-因子輸送体は、２つの膜−スパンニングドメインおよび２つのヌ クレオチド−結合ドメインを含む一本のポリペプチドとして発現する。Ste6が２ つの半分子として発現される時、明らかに形成するタンパク質複合体は、野生型 の一本のポリペプチドの50％よりも高いレベルで機能を保持している(Berkower およびMichaels 1991)。Mdr1、CFTRおよびMRPを含む他の真核生物のＡＢＣ輸送 体において、４つのドメインは一本のポリペプチド内に含まれる。したがって、 ＡＢＣ輸送体は一本のマルチドメインポリペプチド、または２つ以上のポリペプ チドで、各々が１つ以上のドメインを含んでなることができる。 一般的に、輸送体は各疎水性ドメインあたり６つのトランスメンブランセグメ ント、全部で１２のセグメントを含む。輸送複合体の形成に必要なトランスメン ブランセグメントの最小数は、１０のようである。したがって、エス．チフィム リウム(S.typhimurium)のヒスチジン輸送体は、その各疎水性ドメインに由来す るN-末端トランスメンブランセグメントを欠き、したがってドメインあたり５つ のトランスメンブランセグメントを含む(Higginsら、Nature 298,723-727(1982) 。大腸菌マルトース輸送体のMalFタンパク質は、2つのさらなるトランスメンブ ランセグメントを持つ、疎水性配列のN-末端の伸長を含み、疎水性ドメインにつ いての総数を８にする(Overduinら、1988)。しかしN-末端の伸長は、この輸送体 の機能を損失することなく削除することができる(Ehrmannら、1990)。機能的輸 送体の形成に必要なセグメントの数は、これらの研究から示唆されるが、トラン スメンブラン自体の正しい構造に関するデータは存在しない。これらの配列はα -ヘリックス構造を有すると予想されるが、これは証明されておらず、そして形 質膜中の輸送複合体の 全構造は不明なままである。 脂質二重層に広がるためには、最少20個のアミノ酸が必要であり、そしてトラ ンスメンブランセグメントを形成すると考えられる配列が、疎水性の割合を使用 して同定された。疎水性の割合は、個々のアミノ酸残基に値を与え、各分子の疎 水性の程度を示す(KyteおよびDoolittle 1982;Englemanら、1986)。これらの値 は実験データ(種々の溶媒中でのアミノ酸の溶解度の測定、可溶性タンパク質中 の側鎖の分析)および理論的考察に基づき、そして合理的な精密度で新規配列の ２次構造の予想を可能にする。疎水性測定を使用する分析で、疎水的な性質を持 つタンパク質配列のこのような広がりは、トランスメンブランヘリックスと一致 する。 ２−３の例外では、２つの異なる輸送体のトランスメンブランドメインの間に 、わずかに重要なアミノ酸配列の類似性があるか、または無い。この配列類似性 の欠失は、これら疎水性ドメインの外観上の機能と一致する。これらの残基は、 形質膜を横断すると思われる疎水性のα-ヘリックス構造を形成できる一方、多 くのアミノ酸残基は疎水性であり、そしてα-ヘリックスの形成に貢献できる。 酵母STE6、ヒトMDRおよび大腸菌HlyBヘモリシン輸送体のトランスメンブラン ドメインの比較で、かなりの、未だに解明されていない配列類似性が検出された [Grosら、Cell 47,371(1986);McGrathおよびVarchavsky，Nature 340、400(1989 );Kuchlerら、EMBO J.8,3973(1989)]。他の配列類似性は、齧歯類p-グリコプロ テインのトランスメンブランドメインの場合のように、遺伝子重複により説明で きる(Endicottら、1991)。エス．ティフィムリウム(S.typhimurium)のヒスチジ ン輸送体のトラン スメンブランドメインは、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacteri um tumefaciens)のオクトピン取り込み系のトランスメンブランドメインと相同 性を有し、この後者の２つの輸送体は化学的に同様な基質21を輸送する(Valdiva ら、1991)。 突然変異体の輸送体タンパク質の研究は、基質の認識におけるトランスメンブ ラン配列の役割を指摘した。すなわち、p-ニトロフェニル-α-マルトシドを輸送 する能力を獲得した、大腸菌のマルトース輸送体はトランスメンブランドメイン に突然変異を有する(Reyesら、1986)。MDRのトランスメンブランセグメント11中 の突然変異は、その輸送体の基質特異性を変えることが示され(Grosら、1991)、 そしてCFTRのトランスメンブランドメイン中の残基の変化の突然変異は、そのイ オン選択性を変化させる(Andersonら、1991)。 輸送機能におけるエクストラメンブランループの配列が関与する、いくつかの 解釈が明らかになっている。多数の細菌の輸送体で、短い保存モチーフがトラン スメンブランセグメント４および５を連結する細胞質ループ上に存在する[(Dass aおよびHofnung(1985)]。この配列がこれら輸送体タンパク質のATP-結合ドメイ ンと相互作用するという仮説が立てられた；この保存配列の突然変異が、輸送機 能を破壊するのだろう(Dassa 1990)。細胞質ループも基質認識に関与することが できる。したがって酵母ａ-因子輸送体のトランスメンブランセグメント7および 12に続く配列は、ａ-因子レセプター(Ste3p)中の配列に似ており、そしてフェロ モン基質と相互作用できる(Kuchlerら 1989)。事実、細胞質ループ内の突然変異 は、上記輸送体の基質特異性を変化させることが知られている。ヒトMDRのG185V 突然変異は、トランスメンブランセグメント２お よび３の間のループに位置しているが、その輸送体とビンブラスチンおよびコル ヒチンとの相互作用を変化させる(Choiら 1988)。 ATP-結合ドメインは約200アミノ酸長であり、そして種々の輸送体のドメイン は典型的には30−50％の配列同一性を有する。保存された配列は、多くのヌクレ オチド結合タンパク質と会合する“ウォーカーモチーフ(Walke rmotifs)"を含む 。Walkerら、EMBO J.1:945-951(1982)。配列保存性はATP-結合ドメイン長をわた って伸び、ウォーカーモチーフに限定されない。さらに、１つの輸送体のATP-結 合ドメインは、別の１つよりよりも、２つの異なる輸送体からのドメインにより 大きな配列同一性を表す。しかし、保存されたATP-結合ドメインに含まれるすべ てのタンパク質が輸送に関与するわけではない。細胞質酵素UvrAはDNA修復で機 能し、そして酵母のEF-3タンパク質は延長因子である。さらに両タンパク質は、 配列比較により同定可能なATP-結合カセットを含む。 ATP-結合ドメインは高度に親水性であり、そして輸送体の場合は、膜の細胞質 側に位置し、そこでこれらタンパク質の膜−スパンニングドメインとの会合を通 して固定されるようである。トランスメンブランとATP-結合ドメインとの間の相 互作用点は、実験的に決定されていない。ヌクレオチド結合ドメインの構造モデ ルは、ループ配列が構造の芯から膜を横断する親水性配列との接触面に伸びるこ とができることを示している(Hydeら、1990;Mimuraら、1991)。２つの構造モデ ルは、１つがアデニル酸シクラーゼに基づき、そしてもう１つがras p21構造に 基づき、ヌクレオチド結合の芯の折りたたみが、加水分解中にATPと反応するよ うに配置されたウォーカーＡモチーフ（グリシン−リッチ−ループ）の５つのβ -シートから成ることを予想している。さらに、ループ構造（１ つのモデル中に２つのループ、１つの大きいループがもう１つの中にある）は、 ATP-結合ドメインとカップルするために、芯から輸送体の他のドメインに伸びる ことを予想している。カップリング配列は、ほとんどが構造的変化を通して、Ａ ＴＰ加水分解のエネルギーを、輸送に関与する分子のこれらの部分に運ぶようで ある。 Ste6機能は交配に必要であるが、タンパク質は酵母の生存に必要ではない(Wil sonおよびHerskowiz 1984;Kuchlerら、1989:McGrathおよびVarshavsky 1989)。S te6は構造的に哺乳類のMDRsに相同的である。さらに２つの哺乳類MDRタンパク質 、ネズミMdr3およびヒトMdr1が、STE6を欠失している細胞中で、酵母輸送体を機 能的に置換することが実証された(Raymondら、1992;KuchlerおよびThorner 1992 )。STE6が欠失した酵母株は、外因性のＡＢＣ輸送体の機能をモジュレートする 化合物を発見するための予備選択を設計する出発点として役立つ。 ２つの異なる酵母の予備選択を、ＡＢＣ輸送体機能のモジュレーターを同定す るために使用できる。第１の場合は、ａ-因子を輸送する哺乳類タンパク質が輸 送体機能の有力なインヒビターの標的として役立つだろう。したがって酵母株を 機能的輸送体である、例えば哺乳類MDR1(これはａ-因子の輸送において、酵母St e6タンパク質に代わる)を発現するように操作する。さらに、この株はオートク リン様式でａ-因子に反応するように操作される:例えば、細胞がガラクトースを 含有する培地中では成長できないように。この陰性選択は、GAL7およびGAL10遺 伝子の突然変異体を含むバックグラウンドの株の中で、フェロモン反応性プロモ ーターの制御下で、GAL1遺伝子の発現に依存するだろう。そのようなバックグラ ウンドの株において、ガラクトースの存在下でのGAL1の発現は、 細胞にとって毒性である。ａ-因子輸送の不在で、フェロモン反応経路へのシグ ナル伝達は毒性遺伝子が発現した時に止まる。試験化合物の存在下での、または 特別なランダムペプチドの発現時の細胞増殖は、輸送機能の信号阻害であり、そ して可能性のある治療剤の同定である。 MDRのインヒビターに加えて、ａ-因子とa-因子レセプターとの相互作用を妨害 する化合物を同定してもよい。そのような化合物は、野生型Matα株でのａ-因子 -誘導成長阻止のそれらの阻害により識別できる。化合物はまた、フェロモン反 応経路に沿った他の点に影響を及ぼし、シグナル伝達を阻害し、そしてこれらの 化合物は野生型Matα株中のシグナル伝達を妨害するだろう。 第二の予備選択では、最初にａ-因子またはａ-因子-様ペプチドを輸送できな い、突然変異体のヘテロロガスな輸送体(例えば突然変異体CFTR)を、内因性Ste6 が欠失しているオートクリン酵母中で発現できる。細胞はこれらの細胞が生産し たａ-因子に対してオートクリン反応することができるだろう。したがって、フ ェロモン-反応性プロモーターは、選択培地中で成長する能力を与える遺伝子の 発現を制御するだろう。そのような細胞は輸送体における欠失を正す化合物の同 定を可能とし、そして細胞外の場所にフェロモン類似体を輸送するように機能す ることを可能とする。このように、突然変異体タンパク質を安定化し、そして正 常なプロセッシング、輸送、形質膜への局在化および機能を可能にする、治療的 ペプチドまたは他の種類の化学的化合物を同定できた。この方法は成功するので あれば、プロセッシングおよび／または局在化の欠陥の矯正を通して、突然変異 体タンパク質の機能を回復することにより、遺伝子治療により実施されているよ うな、幾つかの突然変異体遺伝子を正 常な配列と“置き変える”必要を排除する。 突然変異体の輸送体の“アクチベーター”に加えて、内因的に発現したフェロ モンによる輸送の不在において、ａ-因子レセプターからのシグナル伝達を開始 できる化合物も同定できる。これらの化合物は、野生型Matα株中での増殖阻止 を引き起こすその能力により識別できる。また化合物は、フェロモン経路に沿っ た他の点でも影響を与えることができ、そしてａ-因子の不在において野生型Mat α株中のシグナル伝達を開始する能力を通して識別できる。 好適な態様では、酵母細胞により生産された外因性タンパク質は、国際公開第 94/23025号明細書の表Ｉに掲げられた外因性ＡＢＣ輸送体の１つである。７．酵母中での遺伝子発現 ７．１ 調節配列 ペプチド−コーディング遺伝子の酵母細胞中での発現には、酵母中で機能する プロモーターが必要である。適当なプロモーターは、メタルチオネイン、3-ホス ホグリセレートキナーゼ(Hitzemanら、J.Biol.Chem.255,2073(1980))、またはエ ノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、 ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン 酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオ ースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ のような他の解糖系酵素(Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.7,149(1968);およびHollan dら、Biochemistry 17,4900(1978))のプロモーターを含む。酵母の発現に適当な ベクターおよびプロモーターは、さらにR.Hitzmanら、欧州 特許出願公開第73,657号明細書に記載されている。成長条件により制御される転 写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２ 、イソシトクロームＣ、CUP1(銅により誘導される)、酸ホスファターゼ、窒素代 謝に関連する分解酵素、および前述のメタルチオネインおよびグリセルアルデヒ ド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用の 原因の酵素に関するプロモーター領域である。最終的に、２つの半数体交配型の １つだけで活性なプロモーターが、特定の状況で適当であるらしい。このような 半数体−特異的プロモーターの中で、フェロモンプロモーターMFa1およびMFα1 ならびにGPA1プロモーターが、特に興味深い。 適当な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子または酵母で効率的に 発現する他の遺伝子に関連する末端配列を、発現ベクター中のヘテロロガスなコ ーディング配列の３’に連結して、ｍＲＮＡのポリアデニレーションおよびター ミネーション配列を提供できる。７．２ 構造配列 アデニリルシクラーゼをコードする構造遺伝子は、野生型の哺乳類の遺伝子、 または修飾した遺伝子でよい。“サイレント”修飾は、例えば（１）対応するｍ ＲＮＡ中の２次構造を排除する、または（２）例えば制限部位を導入、削除また は修飾することにより、それほど好ましくない、またはクローニングに利用でき ないコドンを酵母に好ましいコドンと置換することにより、発現を改善するため に作成できる。この遺伝子はまた、突然変異体アデニリルシクラーゼをコードす るように修飾できる。 酵母のコドン使用法の分析では、酵母に存在する最も豊富なイソ受容 ｔＲＮＡから成る好適なコドン組が存在することを示し、そしてこの好適な組(6 1の可能なコーディングトリプレットの中の25)が、すべての酵母タンパク質につ いて同じであることを示している(BennetzenおよびHall(1981)J.Biol.Chem.257, 3026-3031)。豊富なタンパク質に要求される迅速な翻訳速度は、好適なコドンの 組が存在するための選択圧を提供すると考えられる。特別な遺伝子において偏向 したコドンの利用度は、遺伝子発現レベルと直接的に相関するので(Hoekmaら、( 1987)Mol.Cell.Biol.7,2914-2924)、酵母中でヘテロロガスな遺伝子発現を目的 とする実験法は、その微生物についてすでに記載されたコドン偏向を利用する(S harpら、(1986)Nucl Acids Res.14,5125-5143)。 哺乳類アデニリルシクラーゼをサッカロミセス セルビシエ(Saccharomyces c erevisiae )中で発現するために用いる配列の操作では、キメラコーディング配列 を構築した。ラット２型アデニリルシクラーゼの最初の27コドンは、発現ベクタ ー中に挿入されたオリゴヌクレオチドにより与えられ、一方コドン28から始まる コーディング配列の残りはラット脳から得たｃＤＮＡクローンに由来した。オリ ゴヌクレオチドを用いて、酵素のN-末端でのコドン使用法は、酵母中の配列の翻 訳を至適化するために変更した。７．３．ベクター ベクターは酵母細胞中で複製できなければならい。ベクターは宿主ゲノムに組 み込まれ、その後、染色体ＤＮＡの一部として複製されるＤＮＡであることがで き、あるいはプラスミドの場合のように自律的に複製するＤＮＡでよい。後者の 場合は、ベクターは宿主で機能する自律的複製の起源を含まなければならない。 通常使用される２つ種類の複製起源 がある：プラスミドを酵母細胞あたり40−50コピー複製できる酵母２ミクロンサ ークルに由来するもの；およびゲノムCEN ARS配列に由来するもの、これは低コ ピー数、典型的には酵母細胞あたり１または２個のプラスミドだけが維持される 。組み込みベクターの場合には、組み込みを容易にする配列、例えば宿主配列に 相同的な配列、またはインテグラーゼをコードする配列を含んでよい。 酵母細胞中で複製できる上に、ベクターが細菌細胞中でも複製できれば、そこ で多くの遺伝子操作をより都合よく行えるので好都合である。酵母および細菌の 両細胞中で複製できるシャトルベクターには、YEps、YIpsおよびpRS系がある。７．４．宿主細胞 酵母はサイクリックＡＭＰを成長に必要とし、そして培養できる任意の種でよ い。適当な種は、クルイベレイ ラクチィス(Kluyverei lactis)、シゾサッカロ ミセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)およびウスティラゴ マイディス(Ustilago maydis)；サッカロミセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が 好ましい。本明細書で使用する“酵母”という用語は、分類学的意味で厳しく含 まれるものだけではなく（すなわち単細胞生物）、酵母−様多細胞真菌も含む。 宿主細胞は二倍体ａ／αまたは半数体細胞でよい。好ましくは第一に、酵母Ｇ タンパク質の哺乳類シクラーゼに対する効果の可能性を排除するために、二倍体 株を使用する。半数体細胞と比較して二倍体酵母細胞はGPA1を発現しないが、こ れはＧαの相同体をコードし、STE4またはSTE18も発現しないが、これはそれぞ れ酵母ＧβおよびＧγをコードする。 さらに、交配は好ましくは、内因性シクラーゼとして、酵母アデニリ ルシクラーゼcdc-35-1の突然変異体対立遺伝子を持つ、二倍体株を派生するよう に行われる。 この酵母細胞は好ましくは、cam1、cam2、cam3株のようなｃＡＭＰ依存性株で ある。 実施例 酵母は、酵素アデニリルシクラーゼの触媒活性を成長のために必要とする。突 然変異体の対立遺伝子cdc35-1によりコードされるサッカロミセスセルビシエ(Sa ccharomyces cerevisiae)のアデニリルシクラーゼの突然変異体形が存在する。c dc35-1の突然変異は、温度感受性細胞分裂周期突然変異体と記載されている(Cas personら、（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,5060-5063)。この突然変異は、 酵母アデニレートシクラーゼに変化を持つ温度感受性cyr1-1突然変異体に似た表 現型を生じる。cdc35-1を持つ半数体は、30℃より高い温度で非分裂細胞として Ｇ１で成長が止まる。cdc35-1について二倍体のホモ接合体は、リッチ培地中、 野生型酵母細胞の胞子形成を妨げる栄養条件で、胞子を形成する(Shiloら、（197 8）Exp.Cell.Res.112,241-248)。cdc35-1突然変異は、酵母CYR1をコードする配 列により相補できるか、あるいは細胞は外因性のｃＡＭＰを添加することにより 成長阻止から救われることができ、cam表現型を表す細胞も提供する。cdc35-1はcyr1-1 と同じ座にマップされる(BouteletおよびHilger 1980)。制限的温度で成 長が阻止したcdc35-1細胞の抽出物は、室温でインキューベーションされた野生 型細胞とおよそ等量のインビトロ アデニリルシクラーゼ活性を表す。これらの データは、cdc35-1突然変異が触媒部位の外側のアデニリルシクラーゼ分子の部 分、おそらくシクラーゼとコーファクターまたは調節分子との間の相互作用 に関与する配列に影響を及ぼすことを示唆している。 この突然変異体対立遺伝子を持つ二倍体株(CY1106)(遺伝型:MATa/MATα cdc35 -1 /cdc35-1 cam/(cam?)ura3-52/ura3-52 leu2-3,112/leu2 trp1/trp1 his7/+)を 、ラットアデニリルシクラーゼ２型およびラットＧαｓをコードする配列を含む プラスミドで形質転換した。ラットアデニリルシクラーゼの発現は、構成的であ り、そしてＧαｓの発現は銅により誘導された。この株は34℃で銅の存在により 成長し、そして不在では成長しなかった。ラット アデニリルシクラーゼ−コー ディングプラスミドのみ、またはラットＧαｓ−コーディングプラスミドのみの 同様な株が存在し、そして34℃未満の温度では発現できなかった。この実験は、 哺乳類のＧαｓの存在中でラットアデニリルシクラーゼ２型が、cdc35-1により コードされる突然変異体アデニリルシクラーゼを持つ酵母を、34℃未満の温度で 成長できるようにすることを実証した。 この実験を以下により詳細に記載する。 １．アデニリルシクラーゼ発現プラスミドの構築 ラットII型アデニリルシクラーゼを発現するプラスミドを得るために、以前構 築し、そしてYEp51に基づく酵母発現プラスミドを使用した(Broachら、(1983)、 “遺伝子発現の実験操作(Experimental Manipulation of Gene Expression)"(エ ム．イノウエ編集)、第83-117頁、アカデミック出版(Academic Press)、ＮＹ、1 983)。このベクター(Cadus 1284)の目立った特徴は次の通りである：第一に、酵 母２μ環状プラスミドの複製決定基を含む；これにより酵母中で高コピー数を複 製することが可能になる(典型的には細胞あたり10-40コピー)。またこのベクタ ーは、同遺伝子の機能的なゲノム性コピーを欠く酵母中で、プラスミドの存在 について選択できる酵母遺伝子を含む；詳細には、アミノ酸ロイシンの不在で、 ベクターを保持するleu2酵母は成長するが、ベクターを欠くこの細胞は成長しな いだろう。最終的に、親のYep51に存在するGAL10プロモーター配列の代わりに、 Cadus 1284は酵母ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)遺伝子のプロモーター配列 を含む。プラスミドから、発現すべき遺伝子の挿入を可能にするNcoIおよびBamH Ｉ制限酵素部位は、この構成的に活性なプロモーターの下流に存在する。 約100塩基対のオリゴヌクレオチドを、NcoI−およびBamHＩ−制限ベクター、C adus 1284に挿入した。このオリゴヌクレオチドは、酵母中での翻訳を優先する コドン使用法で、ラット シクラーゼの最初の27アミノ酸をコードする。このオ リゴヌクレオチドを、以下の一本鎖オリゴヌクレオチドを使用して構築した： オリゴ０６６をリン酸化オリゴ０６９とアニールした；オリゴ０７１をリン酸化 オリゴ０７０とアニールした。２つの２本鎖オリゴヌクレオチドを混合し、連結 し、EspIで消化し、そして生成した約92塩基対のオリゴヌクレオチドをゲル精製 し、そしてNcoI-およびBamHＩ-消化Cadus 1284に連結した。生成した修飾ベクタ ー、Cadus 1464はBamHＩ部位が重複し、そしてオリゴヌクレオチドにより与えら れた独特なXmaI部位を含む。 ラット脳に由来するアデニリルシクラーゼ２型をコードする遺伝子を、Randal l R.Reedから(ジョンズ ホプキンス 医学校)、XmaI部位を開始コ ドンの80塩基下流に、そしてシクラーゼ停止コドンの約220塩基対下流に含む6.4 キロベースのプラスミドクローンとして得た(Feinsteinら、(1991)Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 88,10173-10177)。これらの制限酵素部位を、シクラーゼのほぼ全コ ーディング領域（コドン28から始まり、そして停止コドンまで続く）を含む3.4 キロベース断片を単離するために使用した。この断片を上記の修飾ベクターのXm aI部位に連結し、キメラシクラーゼ遺伝子を作成し、ここで最初の27コドンはベ クターに存在するオリゴヌクレオチドにより与えられ、そして残りのコドンは本 来のラットアデニリルシクラーゼ２型遺伝子配列により与えられた。シクラーゼ 発現プラスミド構築のためのこの手法の結果、以下を含む：１．キメラシクラー ゼ遺伝子によりコードされるN-末端の27アミノ酸は、天然のラット遺伝子により コードされるアミノ酸と同一であるが、これらのアミノ酸をコードするトリプレ ットは、酵母で効率的に翻訳されるものである；２．キメラシクラーゼ遺伝子は 、高い、構成的に活性なＰＧＫプロモーターの制御下で発現する；３．シクラー ゼ遺伝子は酵母細胞中で高コピー数となるだろう。 ２．Ｇαｓ発現プラスミドの構築 Ｇαｓを発現するために使用するプラスミドは、銅−誘導性酵母プロモーター 、CUP1の制御下に、完全長のラットＧαｓ ｃＤＮＡを含む(プラスミドはKang ら、Mol.Cell.Biol.10:2582-2590,1990に記載されている)。Ｇαｓの発現は、こ のプラスミドを保持する酵母を、100μMの硫酸銅を含有する固体培地にプレーテ ィングすることにより誘導した。 ３．酵母株の誘導 酵母中で哺乳類のアデニリルシクラーゼの活性を試験するために使用 する株は、遺伝型 MATa cdc35-1 cam leu2 trp1 ura3 his7(Y1777)の半数体株か ら生成した二倍体株であった。突然変異体cdc35-1対立遺伝子を持つY1777を、プ リンストン大学のJ.R.Broach研究室から得た。Y1777をCY5(遺伝型 MATα ura3 l ys2 ade2 his3 leu2)と交配し、生成した二倍体を胞子形成させ、そして遺伝型 MATα cdc35-1（cam?）ura3 trp1 leu2の半数体子孫を、Y1777との交配のために 選択し、二倍体株CY1106(遺伝型 cdc35-1/cdc35-1 cam/（cam?） ura3-52/ura3- 52 leu2-3 112/leu/2 trp1/trp1 his7/+)を生成した。CY1106は、これを生成し た半数体のように、室温で成長することができるが、cdc35-1突然変異体の対立 遺伝子によりコードされる、内因性の酵母アデニリルシクラーゼの温度感受性の ために、30℃以上の温度では成長できない。 二倍体株CY1106を、以下のプラスミド対で形質転換した：（１）PGKプロモー ター駆動-ラットアデニリルシクラーゼ発現プラスミド(Cadus1470)およびCUP1プ ロモーター−駆動ラットＧαｓ発現プラスミド(Cadus 1284)およびCUP1プロモー ター−駆動ラットＧαｓ発現プラスミド(Cadus 1046)で、CY1251株を生成した; （２）アデニリルシクラーゼ配列を欠くPGKプロモーター駆動発現プラスミド(Ca dus 1046)でCY1248を生成した;（３）PGKプロモーター駆動-アデニリルシクラー ゼ発現プラスミド(Cadus 1470)およびＧαｓを欠くCUP1−駆動発現プラスミド(C adus 1136)で、CY1249を生成した；（４）アデニリルシクラーゼ配列を欠くPGK プロモーター駆動発現プラスミド(Cadus 1284)およびＧαｓ配列を欠くCUP1−駆 動発現プラスミド(Cadus 1136)で、CY1246を生成した。４つの種類の二重形質転 換体、CY1251、CY1248、CY1248、CY1249およびCY1246、(遺伝型 MATa/MATα cdc 35-1/cdc35-1 cam/（cam?） ura3-52/ ura3-52 leu2-3，112/leu2 trp1/trp1 his7/+)、それぞれPGKプロモーターを含 む高−コピーLEU2-マークプラスミド、およびCUP1プロモーターを含む高−コピ ーTRP1-マークプラスミドを、ロイシンおよびトリプトファンを欠き、±100μMC uSO₄の合成固体培地にプレーティングした。プレートをＲＴ、30℃、34℃および 37℃で３日間インキューベーションした。 ＲＴおよび30℃で、４つの株は銅の存在および不在下の両方で、ほぼ同じ濃度 速度で成長し、cdc35-1対立遺伝子によりコードされる内因性の酵母アデニリル シクラーゼの活性を反映していた。 銅の不在中、34℃で、すべての４つの株は成長できなかった。しかし、34℃で 、硫酸銅の存在中、CY1251(哺乳類のアデニリルシクラーゼおよび銅−誘導性の 哺乳類Ｇαｓの構成的発現を含む)は、急速に増殖したが、他の株は成長できな かった。したがって、34℃で哺乳類のアデニリルシクラーゼは、不活性な突然変 異体酵母アデニリルシクラーゼを相補できた、ただし哺乳類Ｇαｓも発現した。 37℃ですべての４つの株は、銅の存在下で成長を示さず、これはこの温度での 酵母の悪い生存能力のためらしい。 ４．半数体酵母細胞での哺乳類アデニリルシクラーゼの発現 酵母中での哺乳類のアデニリルシクラーゼの機能的発現の最初の結果は、二倍 体細胞（遺伝型 MATa/MATα cdc35-1/cdc35-1 cam/（cam?） ura3-52/ura3-52 l eu2-3 ，112/leu2 trp1/trp1 his7/+）を使用して得られた。同様な結果が半数体 酵母で得られるかどうかを決定するために、遺伝型がMATa cdc35-1 cam ura3-52 ，leu2-3,112 trp1 his7 およびMAtα cdc35-1 cam ura3-52，leu2-3,112 trp1 his7の半数体細胞を、二 倍体細胞を形質転換するために使用した同一のプラスミドで形質転換した：１つ は銅−誘導性ラットＧαｓ遺伝子を含み、そして第二は構成的に発現したラット アデニリルシクラーゼ２型を含む。Ｇαｓが発現されるならば、ラットアデニリ ルシクラーゼは、34℃で各半数体株の成長を救うことができる。しかし得られた 結果には、わずかな差異が二倍体細胞と半数体細胞に観察された。アデニリルシ クラーゼを発現している二倍体細胞では、34℃でのＧαｓ−刺激成長はわずかに 高く、そして34℃、Ｇαｓ不在での成長はわずかに低かった（すなわち、細胞の 低いバックグラウンド成長があった）。 ５．低コピープラスミドから哺乳類のアデニリルシクラーゼの発現 最初の結果は、典型的に細胞あたり10-40コピーで存在する高コピープラスミ ドから、ラットアデニリルシクラーゼ２型の発現で得た。もしラットアデニリル シクラーゼをコードする遺伝子が、酵母細胞あたり１または２コピーだけで存在 するならば、同じ表現型が観察されるのかどうかを決定するために、ラットシク ラーゼを発現する低コピープラスミドを使用した。cdc35-1対立遺伝子を持つ酵 母を、アデニリルシクラーゼ２型をコードする低コピープラスミドで形質転換し た。詳細には、ラットアデニリルシクラーゼ２型を構成的PGKプロモーターの制 御下にコードする配列を、LEU-2−含有高コピー−プラスミドから、同等な低− コピープラスミドに移した。ラットＧαｓ遺伝子を銅−誘導性CUP1プロモーター の制御下に含む、半数体およびホモ接合体二倍体cdc35-1酵母の両方中に、低− コピープラスミドおよび適当な陰性対照を形質転換した。Ｇαｓおよびラットア デニリルシクラーゼの両方がこれらの細胞中で発現される時、細胞は34℃で成長 する能力を獲得する。これらの結果は、 細胞の成長に十分なシクラーゼ活性は、アデニリルシクラーゼ遺伝子が細胞あた り１または２コピーで複製するプラスミドの上に存在する時に得られることを示 している。この結果は、半数体および二倍体酵母の両方で得られた。 ６．組み込み配列からラットアデニリルシクラーゼの発現 低−コピープラスミドを使用して得られた結果は、ラットアデニリルシクラー ゼは、シクラーゼ遺伝子が酵母ゲノム中に組み込まれたcdc35-1酵母中での34℃ での成長を救うことを示唆している。染色体外プラスミドからよりも、遺伝子の 組み込みコピーから発現されたシクラーゼを有するほうが好ましい：遺伝子は組 み込まれた時により安定であり、そして組み込みは続く実験で導入することを望 む別のプラスミドを使用するために、選択できるLEU2マーカーを自由にする。UR A3 でマークされ、そしてLYS2遺伝子中にラットアデニリルシクラーゼ遺伝子を挿 入された組み込みプラスミドを使用して、ラット２型シクラーゼをコードする遺 伝子を、CY732(遺伝型 MATa cdc35-1 cam lys2 leu2 trp1 ura3)のlys2座中に向 ける。CY732はこのプラスミドで形質転換され、そしてURA⁺形質転換体を選択し 、そして5-フルオロオロティックアシッド(FOA)の存在下で成長させてURA3の損 失を選択する。FOAで成長するコロニーを取り出し、Ｇαｓをコードするプラス ミドで形質転換し、そして34℃で生育する能力について試験する。34℃でのＧα ｓ−依存的成長を表すこれらの酵母は、LYS2座に組み込まれたラットアデニリル シクラーゼ遺伝子を持つはずである。それらの遺伝型をMATa cdc35-1 cam Lys2: Ac2 leu2 trp1 ura3と命名する。 ７．２型アデニリルシクラーゼのアクチベーターおよびインヒビターの 予備選択 cdc35-1を持ち、そして２型ラットアデニリルシクラーゼを発現する酵母は、 後者のタンパク質のアクチベーターが34℃で酵母の成長を促進するので、哺乳類 シクラーゼを刺激する薬剤を予備選択するために使用できる。（したがってラッ トＧαｓはアデニリルシクラーゼのアクチベーターの１例である。）詳細には、cdc35-1 およびラット２型アデニリルシクラーゼの組み込みコピーを持つ半数体 酵母(遺伝型 MATa cdc35-1 cam lys2::ACII leu2 trp1 ura3)を、哺乳類のアデ ニリルシクラーゼの候補アクチベーターを同定するために、天然または合成化合 物のライブラリーを予備選択するために使用できる。候補アクチベーターは、34 ℃で試験株の成長を刺激することができるが、ラットアデニリルシクラーゼ遺伝 子を欠く親株(遺伝型 MATa cdc35-1 cam lys2 leu2 trp1 ura3)の成長を刺激す ることはできない。この方法をひろげて、試験株を、ランダム配列のペプチドを コードするURA3-含有プラスミドのライブラリーで形質転換する。形質転換体を ウラシル−欠失培地にプレーティングし、そして34℃でインキューベーションす る。哺乳類のアデニリルシクラーゼを活性化するペプチドを発現する細胞は、そ の酵素の“オートクリン”刺激のためにコロニーを形成する。これらのペプチド は、ペプチド−コーディングプラスミドを単離し、そしてランダムペプチドをコ ードする領域をシークエンシングすることにより同定できる。哺乳類アデニリル シクラーゼの候補アクチベーターは、シクラーゼの直接的な刺激を確認するため に、精製した酵素を用いてインビトロの生化学的予備選択でさらに試験する。 ２型ラットアデニリルシクラーゼの組み込みコピー、およびＧαｓを コードするプラスミドを持つ半数体cdc35-1酵母を、哺乳類シクラーゼのインヒ ビターを最初に予備選択するために使用できる。34℃でＧαｓ-依存的成長を減 少させる薬剤は、シクラーゼの候補インヒビターと考えられ、そして精製した酵 素を用いて第二の生化学的予備選択で試験する。この第二予備選択は、２型アデ ニリルシクラーゼを直接的に阻害する薬剤と、間接的に作用する薬剤（例えばＧ αｓが哺乳類シクラーゼを刺激する能力を妨害する）とを識別する。Ｇαｓとア デニリルシクラーゼの相互作用を遮断することにより作用する化合物は、それ自 体興味深く、そして独立して特性決定する。 ８．酵母中での哺乳類Ｇαｉの発現 Ｇαｓがすべての既知のアデニリルシクラーゼの形態を刺激できる一方、１型 、５型および６型アデニリルシクラーゼはＧαｉ-1により直接阻害されることが 示された［Taussigら、(1994)］。cdc35-1、５型アデニリルシクラーゼの組み込 みコピーおよびＧαｓをコードするプラスミドを持つ半数体酵母を、例えばＧα ｉ−１をコードする高コピープラスミドで形質転換する。Ｇα１遺伝子を発現す る酵母は、Ｇαｉ−１サブユニットの阻害効果のために、Ｇαｉ−１を欠く親株 よりも34℃での成長が遅いと予想される。これが証明されれば、哺乳類アデニリ ルシクラーゼ、ＧαｓおよびＧαｉ-1を発現するこの株を、Ｇαｉ-1によるシク ラーゼ阻害を妨害する化合物を予備選択するための試験株として使用する。 34℃での試験株の成長を刺激する化合物は、Ｇαｉ−１およびアデニリルシク ラーゼの相互作用を遮断することにより、この効果を発揮できる。しかし、同じ 成長−刺激効果が、アデニリルシクラーゼを直接活性 化する化合物によっても現され、Ｇαｓのアデニリルシクラーゼに対する刺激効 果を増大し、活性がｃＡＭＰ生産等に依存する下流の成分を活性化する。アデニ リルシクラーゼに対するＧαｉ−１の阻害効果に直接影響する成長−刺激化合物 と、どこでも作用する化合物とを識別するために、すべての候補化合物を一群の 同質遺伝子対照株で試験する。１つの対照株は、Ｇαｉ−１を欠き（しかしアデ ニリルシクラーゼ５型およびＧαｓを含む）；この株の成長を促進する、または 成長をより広い温度範囲で可能にする化合物は、Ｇαｉ−１以外の標的に作用す ると考える。他の対照株は、アデニリルシクラーゼ５型が無い、またはＧαｓが 無い、またはアデニリルシクラーゼおよびＧαｓの両方が無いものである。これ ら任意の対照株の成長を刺激する化合物は、Ｇαｉ−１とアデニリルシクラーゼ 間の相互作用のインヒビターとして除外する。これらの対照試験で、アデニリル シクラーゼを直接刺激する、またはアデニリルシクラーゼに対するＧαｓの刺激 効果を促進する化合物の同定を導くことができる。 ９．酵母中での活性化哺乳類Ｇαｓの発現 Ｇαｓサブユニットは、Ｇαｓ−ＧＴＰおよびＧαｓ−ＧＤＰと呼ばれる２つ のいずれかの形態で存在する。本発明の実験条件下で、酵母中で優勢な哺乳類Ｇ αｓの形態はＧαｓ−ＧＤＰであると予想される。Ｇαｓがラット２型アデニリ ルシクラーゼを酵母中で刺激する能力は、比較的少量のＧＴＰ-結合形態のプー ルが原因である。多くのプール活性化種がアデニリルシクラーゼ活性を刺激でき ることが望ましい実験状況であるかもしれないので、構成的に活性なＧαｓの突 然変異形態を活用する。遺伝型がそれぞれ MATa cdc35-1 cam lys2 leu2 trp1 u ra3 およ び MATa/MATα cdc35-1/cdc35-1 cam/(cam?) ura3-52/ura3-52 leu2-3,112/leu2 trp1/trp1 his7/+ である半数体および二倍体酵母を、以下の２つのプラスミド で形質転換する：PGKプロモーターにより駆動されるラットアデニリルシクラー ゼ２型をコードする、低−コピーのLEU-2含有プラスミド、および優勢な突然変 異体Ｇαｓの直接発現を支配する(もし排他的でないならば、Gαs-GTP形態で)、 CUP1プロモーターを使用するTRP1-含有高コピープラスミド。従来の野生型Ｇα ｓ対立遺伝子のオリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発法で生成された、この Ｇαｓの活性化形態（Ｇαｓ_Q227L）は、Ｇαｓの構成的活性化および下垂体腺 腫においてアデニリルシクラーゼの持続的刺激の結果生じるGTPase−阻害突然変 異と同定された(Landisら、（1989）Nature 340,692-696)。この突然変異はGTPas e活性を95％減少させ、したがって突然変異体ＧαｓはGTP-結合体で優勢的に存 在する。ラットアデニリルシクラーゼおよび突然変異体Ｇαｓを同時発現する株 では、34℃でのより急速な成長により現わされる、より大きなアデニリルシクラ ーゼ活性、より広い成長温度範囲、または銅の誘導効果に対するより大きな感受 性が観察されることを期待する。 １０．酵母中での哺乳類Ｇβγサブユニットの発現 哺乳類のＧαサブユニットの発現に加えて、酵母を哺乳類の特別なＧβγの組 み合わせを発現するように操作する。酵母中で、哺乳類のＧαｓまたはＧαｉ、 Ｇβ、およびＧγサブユニットの同時発現は、酵母中に哺乳類のヘテロ三量体Ｇ タンパク質の再構成を生じるだろう。哺乳類細胞において、これらのヘテロ三量 体Ｇタンパク質は、アデニリルシクラーゼに対するセブン−トランスメンブラン レセプターのサブセットと カップルし、この酵素を刺激または阻害する。したがって、適当なＧタンパク質 −結合レセプターおよびアデニリルシクラーゼの酵母中での発現は、ヘテロ三量 体Ｇタンパク質の成分と一緒に、その生物中で完全な哺乳類のシグナル伝達経路 を２重にする。適当な株の中にこの経路の再構成をした時、セブン−トランスメ ンブランレセプターを活性化、または阻害する薬剤は、34℃でｃＡＭＰ−依存性 成長に影響するだろう。さらに酵母中で発現するアデニリルシクラーゼの特定の イソ型、ＧβおよびＧγの適当な選択を通して、様々なＧβγ二量体の機能に影 響する薬剤は34℃でのｃＡＭＰ−依存性に影響するだろう。 酵母中で発現するＧβおよびＧγサブタイプの賢明な選択は、哺乳類アデニリ ルシクラーゼを発現する株の利用性に影響する。Ｇβ1およびＧγ1はＧαｓに結 合する機能的複合体を形成できるが、β1γ1二量体はＧαｓの存在中ではアデニ リルシクラーゼ２型を活性化する能力を現さない(J Biol Chem 267:23407、1992 )。したがって、哺乳類のＧαｓおよび２型アデニリルシクラーゼの両方を同時 発現する酵母中でのβ1およびγ1の発現は、Ｇαｓとの複合体を形成することに より、Ｇαｓによるシクラーゼの刺激を妨害することにより、シクラーゼによる ｃＡＭＰの生成を下げる。次にこれは、Ｇαｓおよびシクラーゼだけを発現する 時に起こる成長と比べて、酵母のより遅い成長に反映されるべきである。したが って、３つの哺乳類Ｇタンパク質サブユニットおよび２型アデニリルシクラーゼ を同時発現する酵母のゆっくりとした成長は、哺乳類Ｇタンパク質が酵母中でヘ テロ三量体を形成することを示す。この結果、機能的な哺乳類のヘテロ三量体Ｇ タンパク質が研究できる酵母株を提供する。 Ｇβ1およびＧγ1を、カリフォルニア工科大学のMel Simon博士から得た鋳型 プラスミドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。これらのプラス ミドはＧβ１(Fongら、（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,2162-2166)およびＧ γ１(Hurleyら、（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6948-6952)をコードするウ シ遺伝子を含む。各々の２つの増幅した生成物を、URA3およびLEU2でマークした 高コピー数プラスミド中にクローン化する。これらのプラスミド発現は、銅−誘 導性CUP1プロモーターにより制御される。LYS2座に組み込まれたラット２型アデ ニリルシクラーゼ遺伝子を持ち、そして哺乳類のＧαｓを、TRP1-マーク高-コピ ープラスミドに由来するGPA1プロモーター（これは半数体細胞中で構成的に活性 である）の制御下に発現する半数体cdc35-1酵母は、URA3およびLEU2でそれぞれ マークしたＧβおよびＧγを含む高-コピープラスミドで形質転換する。したが って酵母は3つのプラスミドを持ち、それぞれが独特な選択性マーカーおよび哺 乳類Ｇタンパク質サブユニットを発現する。これらの酵母は、Ｇαｓによるラッ ト２型アデニリルシクラーゼの刺激のため、銅の誘導が無くても34℃で成長する はずである。成長培地に銅を加えると、ＧβおよびＧγの発現が高まり、そして これによりＧβγ二量体がＧαｓと複合化した時に成長を阻害し、そしアルファ サブユニットによるシクラーゼの刺激を妨げる。 哺乳類のＧα、ＧβおよびＧγがヘテロ三量体を酵母中で形成できるという証 明に基づき、成長が、βγ二量体とＧαｓとの会合の程度に極端に感受性の酵母 を構築する。インビトロで、Ｇβ１およびＧγ２がＧαｓに結合する機能的複合 体を形成することはすでに示された。しかし、β１γ１複合体とは対照的に、β １γ２はＧαｓと相乗的に作用し、２ 型アデニリルシクラーゼを活性化する(Iniguez-Lluhiら（1992）J.Biol.Chem.26 7,23407-23417)。すなわち、遊離のＧαｓが２型シクラーゼを刺激する能力は、 遊離のβ１γ２二量体により増強される。２型アテニリルシクラーゼも発現する 酵母中で、哺乳類のＧαｓ、Ｇβ１およびＧγ２の等しい発現レベルは、ヘテロ 三量体Ｇタンパク質の形成によりシクラーゼ活性を生じないはずである。しかし これらの酵母は、ＧαｓおよびＧβγを解離させる介入に反応して、アデニリル シクラーゼ活性を大いに増大させて発現し、したがって34℃で成長するよに平衡 化されている。例えば、これらの酵母はＧαｓおよびβγの会合を妨害する化合 物に極端に感受性であろう。 遺伝型 MATa cdc35-1 cam lys2::ACII leu2 trp1 ura3の酵母を、以下の３つ の高−コピー数プラスミドで形質転換する： １．CUP1プロモーターの制御下に哺乳類Ｇαｓを持つTRP1-マークプラスミド； ２．GPA1プロモーターの制御下に哺乳類Ｇβ１を持つLEU2-マークプラスミド； ３．GPA1プロモーターの制御下に哺乳類Ｇγ２を持つURA3-マークプラスミド； CuSO₄を用いたＧαｓ発現の誘導は、ＧβγによるＧαｓの結合のために、34℃ では細胞を成長させることができないはずである。しかしもし、34℃での成長が 銅により刺激されるなら、Ｇβγに比べて過剰なＧαｓサブユニットがあると予 想される。したがって、成長が観察されなくなるまで培地中の銅の濃度を低くす ることにより、Ｇαｓの発現を下げる。(Ｇβ１およびＧγ２を欠く対照株のCuS O₄を用いたパラレルなタイト レーションは、このCuSO₄濃度が、Ｇβ１およびＧγ２の不在中、34℃での成長 を誘導するに十分なＧαｓの発現を誘導できることを確認するために行う。)こ の銅濃度で、３つの哺乳類Ｇタンパク質サブユニットがおよそ等モルの細胞内濃 度になるはずである。一方、この株はこの臨界的銅濃度の存在下では34℃で成長 できず、成長はβγからαを解離する薬剤に極めて感受性である。したがって、 臨界的銅濃度でこれらレセプターの活性化がこの株の34℃での成長を導くように 、この株をさらに操作して哺乳類のセブントランスメンブランレセプターを発現 させる。低コピーおよび組み込みACIIはcdc35-1株の成長を助ける 。 上述の理由から、ラットAC2(アデニリルシクラーゼ２)を酵母ゲノムに組み込 んだ。AC2の組み込みを支配するプラスミドは、PGK-プロモーター-駆動AC2を、 ベクター(Cadus 1294;遺伝型 CmR 'lys2 lys2')(これはCY1789株(遺伝型 MATa t bt1-1 cdc35-1 ura3 his3 trp1 leu2(cam?)のLYS2座にPGKp-AC2の組み込みを支 配した)にクローニングすることにより構築した。詳細には、PGKp-AC2をCadusプ ラスミド1512から4.4kbのEcoRI−BglII断片として切り出し、このBglII部位を平 滑末端とし、そして断片をCadusプラスミド 1294のポリリンカー中のEcoRIおよ びSmaI部位にクローン化した。生成した構築物(Cadusプラスミド 1633)を、独特 なBglII部位で直線化し、そしてCY1789株をこの直線化ＤＮＡで形質転換した。 このAC2の標的化組み込みは野生型LYS2を破壊し、組み込み体は、α-アミノアジ ピン酸塩(2g/l)(完全に機能的なLYS2を欠く酵母に成長の要因を付与する化合物) を含有するプレートで選択した(Chatooら、Genetics 93:51,1979)。そのような 組み込み体の１つであるCY1936(遺伝型 MATa lys2::PGKp-ACII tbt1-1 cdc35-1 ura3 his3 trp1 le u2(cam?) を、発現が銅−誘導性CUP1プロモーターの制御下にあるラットＧαｓを コードするプラスミドで形質転換した。生成した株は、100μMCuSO₄の存在中、3 4℃で成長を現し、組み込んだAC2が温度感受性cdc35-1対立遺伝子を相補する能 力を反映し、ただしＧαｓも発現される。同質な二倍体株をCY1936から作成し、 そしてＧαｓが同時発現される限り、この制限的温度で成長できるその能力によ り示されるように、この株も機能的なラットAC2を発現することを示した。ＡＣＩＶは、cdc35-1株に温度耐性をＧαｓ-依存的様式で、エピソーム的および 組み込みの両方で付与する ４型ラットアデニリルシクラーゼをコードするｃＤＮＡは、テキサス大学のサ ウスウエスタンメディカルセンターのAl.Gilman博士から提供された。出願人は 酵母中でAC4を発現するプラスミドを、AC4の読み取り枠の14N-末端アミノ酸の除 くすべてを含む3.2kbのSpeI−BglII断片を、LEU-マークした２μベクター(Cadus プラスミド 1849、これはPGKプロモーター、続いてAC4のN-末端14アミノ酸をコ ードする合成オリゴヌクレオチドを含む)中にサブクローン化することにより構 築した。SpeI−BglII断片の挿入により、Cadusプラスミド1856を生成し、その中 のPGKプロモーターは、酵母中での発現が至適化された14N-末端コドンを中に含 むAC4変異体の全読み取り枠の転写を支配する。温度感受性酵母アデニリルシク ラーゼをコードするcdc35-1対立遺伝子についてホモ接合性であり、そしてCUP1 プロモーター−駆動野生型ラットＧαｓをコードするプラスミドを含む二倍体酵 母を、Cadus プラスミド1856で形質転換した。形質転換体を、銅の存在下で制限 的温度（34℃）で成長能力を試験した。CY2128およびCY2129株(これらの形質転 換体の代表)は銅-依存的温度-耐 性成長を示し、AC4がこれら酵母中で哺乳類のＧαｓの存在中で機能することを 示す。AC2で観察されるように、LYS2座へのPGKプロモーター−駆動AC4の組み込 みは、Ｇαｓが同時発現される時、34℃で成長する能力を保持する株を生じた。ＧαｓＱ２２７Ｌは、より大きなバックグラウンド成長、より急速な成長、そし てより大きな温度耐性を反映して、野生型Ｇαｓよりも大きな成長を表す。Ｇα ｓＧ２２６Ａを用いた実験でＧαｓ．ＧＴＰが活性化種であることを確認する 。 半数体−特異的GPA1プロモーター、銅-誘導性CUP1プロモーター、および構成 的PGKプロモーターから野生型ラットＧαｓ形を発現する、高コピーおよび低コ ピーの両プラスミドを構築した。各々の場合で、AC2またはAC4と一緒のＧαｓの 発現は、cdc35-1酵母の温度−耐性成長を生じた。上記のように、Ｇαｓは、そ れに結合したグアニンヌクレオチド：Ｇαｓ・ＧＴＰおよびＧαｓ・ＧＤＰにより 識別される２つの形態で存在できる。２種のどちらがアデニリルシクラーゼを刺 激するのかを、野生型Ｇαｓを発現する株の温度-耐性成長と、Ｇαｓの２つの 突然変異体形、Ｇαｓ_Q277LおよびＧαｓ_G226Aのいずれかを発現する同質遺伝子 株とを比較することにより決定した。Ｇαｓ_Q277L突然変異体は野生型GTPase活 性の５％を有するだけなので、Ｇαｓ・ＧＴＰ形で優勢に存在する。対照的に、 Ｇαｓ_G226Aはかなり妥協したＧＴＰのＧＤＰへの変化が表されるので、主にＧ αｓ・ＧＤＰ形で存在する。もしＧαｓ・ＧＴＰ形が活性種であれば、哺乳類のア デニリルシクラーゼを発現する株は、同時発現したＧαｓ_Q277Lで最大の温度耐 性成長を表し、そして同時発現したＧαｓ_G226Aで最小の温度耐性成長を表すだ ろう。 Cadusプラスミド1536は、野生型Ｇαｓの代わりに構成的に活性なＧαｓ（Ｇ αｓ_Q277L）を含むことを除いて、Cadusプラスミド1046の類似体である（上記を 参照にされたい）。Cadusプラスミド 1843も、野生型Ｇαｓの代わりにＧαｓ_{G2 26A} を含むことを除いて、Cadusプラスミド1046の類似体である。LEU2-マーク高 コピープラスミド(Cadusプラスミド1512)上にPGKプロモーター−駆動AC2を持つ 二倍体温度−感受性酵母株を、これらのプラスミドで形質転換してCY1429および CY1430株(遺伝型cdc35-1/cdc35-1 cam/(cam?) Ura3-52/Ura3-52 leu2-3,112/leu 2 trp1/trp1 his7/+[TRP1 CUP1P-ratGαs REP3 2mu-ori AmpR/LEU2 2mu-ori REP 3 AmpR PGKp-ratACII])；CY1773およびCY1774株(遺伝型 cdc35-1/cdc35-1 cam/( cam?) ura3-52/ura3-52 leu2-3,112/leu2 trp1/trp1 his7/+[TRP1 CUP1P-ratGα s_Q227L REP3 2mu-ori AmpR/LEU2 2mu-ori REP3 AmpR PGKp-ratACII])；ならびに CY2052およびCY2053株(遺伝型 cdc35-1/cdc35-1 cam/(cam?) ura3-52/ura3-52 l eu2-3,112/leu2 trp1/trp1 his7/+[TRP1 CUP1P-ratGαs_G226A REP3 2mu-ori Amp R/LEU2 2mu-ori REP3 AmpR PGKp-ratACII])。これらの各々の株を、100μMのCuS O₄を含む、または含まない合成培地にプレーティングし、そして34℃でインキュ ーベーションした。野生型Ｇαsを発現する株は、銅の存在下で成長し、存在し ないと成長しないが、Ｇαｓ_G226Aを発現する株は銅の存在または不在で34℃に て成長を表さなかった。 Ｇαｓ_Q227Lを発現する株は銅の存在または不在で成長し、Ｇαｓ_Q227Lの特異的 活性がCUP1プロモーターの基本的活性から生じるレベルであっても、34℃で成長 できるほど十分に高いことを示している。野生型Ｇαｓに比べて高いＧαｓ_{Q227 L} 活性は、CY1429およびCY1430株に比べて、 温度耐性株CY1773およびCY1774の広範な温度耐性によっても反映されている：Ｇ αｓ_Q227Lを含むAC2-発現株は、もし発現が銅の添加で誘導されるならば、37℃ もの高い温度でも成長するだろうが、野生型Ｇαｓを含む株はどのような条件で もそのような温度耐性を表すことができない。 これらの実験は、Ｇαｓ・ＧＴＰが酵母中でAC2を活性化する種であることを 示している。同様な結果はAC2の代わりにAC4を用いて得られる。この結果は、Ｇ αｓ・ＧＴＰがＧαｓの刺激形であることを示唆するインビトロ研究と一致する 。したがってこの結果は、酵母中で発現される哺乳類のアデニリルシクラーゼお よび哺乳類Ｇタンパク質が、正常な生理的挙動であることを示している。ヒトおよびラットＧαｓタンパク質は、ラットＡＣIIの活性化において等しく効 果的である。しかし、ヒトＧαｓ ｍＲＮＡのコーディング配列の３’の１／３ の低い翻訳能のために、これらのタンパク質をコードする遺伝子は異なるレベル で発現される。 ヒトおよびラットＧαｓサブユニットタンパク質は、１つのアミノ酸が異なる ：ラットタンパク質は６位にアスパラギンを含むが、ヒトタンパク質ではこの残 基はトレオニンである。ヒトおよびラットＧαｓが、アデニリルシクラーゼ２型 （AC2）に対して異なる活性を有するのかどうかを決定するために、ラットおよ びヒトコーディング配列を、LEU-2マーク、高コピープラスミド(Cadusプラスミ ド 1512)上のプロモーターからAC2を発現する半数体cdc35-1酵母中で、CUP1プロ モーターを含む高コピープラスミドから発現させた。生成した株は制限温度で異 なる成長速度を示した：ラットＧαｓを発現する株(CY1635およびCY1636)は、ヒ トタンパク質を発現する株(CY1703およびCY1704)よりも早く成長し た。同様な結果はホモ接合性二倍体cdc35-1酵母で、２つのＧαｓの発現を駆動 するプロモーター(すなわち、PGKおよびGPAプロモーター)を用い、ならびに高お よび低−コピープラスミドの両方から発現されたＧαｓを用いて観察された。こ れらの結果はラットとヒトタンパク質との間の１つのアミノ酸の差異がこの差異 の原因であることを示唆したが、さらなる実験では、実際、このような状況でな かった：キメラ遺伝子(これはヒトＧαｓコーディング配列の５’の約30％（開 始コドンからEcoRI部位まで）が、ラットＧαｓをコードする類似領域と置き換 えられている)からヒトＧαｓを発現する酵母は、ラット遺伝子を発現する酵母 と等しい速度で成長した。ヒトＧαｓの低活性は、ヒトＧαｓコーディング領域 の３’の１／３にマップされ(BglII部位から停止コドンまで)、これはこの領域 のラット遺伝子によりコードされるアミノ酸と同一のアミノ酸をコードする。発 現されたラットおよびヒトのＧαｓの活性(すなわちその比活性)はアデニリルシ クラーゼの刺激に関して区別できないので、ヒトコーディング配列の５’末端は ラット遺伝子の均等な領域よりも効率が低く発現されると結論する。マウスアデニリルシクラーゼ６型およびラットアデニリルシクラーゼ３型用の酵 母発現ベクターの構築 マウスアデニリルシクラーゼ６型を、Gary Johnsonから、Cadusプラスミド 17 57と命名されたプラスミド中に５kb cDNAとして得た。これを３段階で、PGKプロ モーターを含むLEU2-マーク高コピー酵母発現ベクター中にサブクローン化した( Cadusプラスミド 1284)。第一段階は：１）オリゴ110(5'CAGACATGTCTTGGTTTCGTG GCCTCCTG 3')およびオリゴ111(5'GCGGATCCAAGGTCATGACCAGTTCCTGTGCAGTGC 3')を 使用して、Cadus 1757か ら、AC6の読み取りのN-末端1.2kbを含む断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）により増幅し、２）ＰＣＲ生成物をAf1IIIおよびBamHＩで切断し、そして３） 増幅した生成物をNcoI-およびBamHＩ-消化Cadusプラスミド 1284(LEU2 PGKp 2mu -ori REP3 AmpR)にクローニングする、ことから成った。これでCadusプラスミド 1918を生成した。1.2kbのPCR-増幅生成物は、AC6に由来する３’末端の付近にS phI部位を含むことに注意されたい。この内因性のSphI部位は、第２段階で使用 し、それは：１）AC6読み取り枠の３’の574ヌクレオチドを、Cadus 1757から、 2.1kbのSphI-BamHＩ断片の部分として切り出し、そして２）この断片をSphIおよ びBamHＩ消化Cadus 19１８中にクローニングすることから成った。この生成物は Cadusプラスミド 1919であった。最終段階は：１）AC6読み取り枠の中ほどの2kb をSphI断片として切り出し、２）SphI−消化Cadus 1919中にクローニングし、そ して３）再構築されたAC6読み取り枠を含むプラスミドを含むクローンについて 組換え体をスクリーニングすることを含んだ。生成したプラスミドをCadusプラ スミド 1950と命名した。 ラットアデニリルシクラーゼ３型(ラットAC3)を、Gary Johnsonから、Cadusプ ラスミド 1756と命名されたプラスミド中に4.5kb cDNAとして得た。AC3を酵母中 に発現するための発現プラスミドを以下のように構築した。 オリゴ112(5'CATGACTGAAGATCAAGGTTTCTCG 3')およびオリゴ113(5'GATCCGAGAAACC TTGATCTTCAGT 3')をアニールし、そしてAC3のN-末端の9アミノ酸をコードする二 本鎖オリゴヌクレオチドを、NcoI-およびBamHＩ-消化Cadusプラスミド 1284(LEU 2 PGKp 2mu-ori REP3 AmpR)にクローン化し、Cadusプラスミド 1894を生成した 。AC3読み取り枠の残りを、次にCadus 1756からの3.5kbのBamHＩ-HindIII断片を、BamHＩ-およびHindIII-消化Cadus 18 94中にクローニングすることにより挿入した。生成したプラスミドCadus 1916は 、AC3-コーディング遺伝子を含み、そのN-末端の8アミノ酸は酵母中での発現に 至適化され、そしてその転写はPGKプロモーターにより支配されている。Ｇαｓおよび様々なシクラーゼイソ型を発現するcam 1、2、3株において：ACＩ は室温(RT)で最適温度、30℃で幾らかの成長を表し；ACIVおよびACVIは広い温度 範囲で成長を表し；ACIVの最適温度はRTであり、ACVIは30℃である。ACIIIはい かなる温度でも成長を表さない。 cdc35-1温度−感受性対立遺伝子を含む酵母株は、30℃以下の温度で成長でき 、これらの温度での突然変異体酵母アデニリルシクラーゼの活性を反映している 。これらの株を、哺乳類のアデニリルシクラーゼがcdc35-1突然変異を相補する 能力について評価するために使用した時、相補試験は30℃より高い温度でのみ行 うことができる。実際、そのような試験に利用できる温度は、約30℃-37℃であ る。もしある理由のために、哺乳類の酵素がこの比較的狭い温度範囲で機能しな ければ、この酵母のバックグラウンドにおいて、成功裏の相補は観察されないだ ろう。したがって30℃より低い温度で、機能的なシクラーゼ活性の測定を可能に するバックグラウンドの株を有することは有利である。 ウィスコンシン大学でWarren Hiedemanにより構築された株(TC41)に由来する 酵母株を、テキサス大学サザンウエスタンメディカルセンターのAl.Gilman博士 から得た。TC41株はCYR1の欠失の結果、酵母シクラーゼをコードせず、そしてcA MPを含む培地中で成長できるようにする３つの特性が決定されていない突然変異 （cam1、cam2およびcam3）を持つ。 Gilman博士のグループは、ラットのＧαｓ_Q277LをTRP1座のCUP1プロモーターの 制御下に組み込むことにより、この株を修飾した。生成した株(CY2828；遺伝型 MATa cyr1::ura3 trp1-1:CUP1p-GαsQ227L cam1 cam2 cam3 leu2-3 leu2-112 hi s3-532 his4)は、成長するためにcAMP添加が必要である。 様々な哺乳類のアデニリルシクラーゼが、CY2828の成長をcAMPの添加無しで可 能にできる能力を調査するために、CY2828を次のプラスミドで形質転換した：１ ）Cadusプラスミド 1856(上記)、これはAC4をコードし、姉妹株CY2906およびCY2 907を生成した(遺伝型 MATa cyr1::ura3 trp1-1:CUP1p-G@sQ227L cam1 cam2 cam 3 leu2-3 leu2-112 his3-532 his4［LEU2 2mu-ori REP3 AmpR PGKp-ACIV］；２ ）Cadusプラスミド 1916（上記）これはAC3をコードし、姉妹株CY2908およびCY2 909を生成した(遺伝型 MATa cyr1::ura3 trp1-1:CUP1p-G@sQ227L cam1 cam2 cam 3 leu2-3 leu2-112 his3-532 his4［LEU2 2mu-ori REP3 AmpR PGKp-ACIII］；３ ）Cadusプラスミド 1950（上記）これはAC6をコードし、姉妹株CY2910およびCY2 911を生成した(遺伝型 MATa cyr1::ura3 trp1-1:CUP1p-G@sQ227Lcam1 cam2 cam3 leu2-3 leu2-112 his3-532 his4［LEU2 2mu-ori REP3AmpR PGKp-ACVI］；およ び４）Cadusプラスミド 2129（Giman博士の研究室で構築した）これはAC1をコー ドし、姉妹株CY2906およびCY2907を生成した(遺伝型 MAta cyr1::ura3 trp1-1:C UP1p-G@sQ227L cam1 cam2 cam3 leu2-3 leu2-112 his3-532 his4［AmpR LEU2 CE N ARS CUP1p-ste6-ACI］。各株の成長は外因性のcAMPの不在で、室温、30℃、34 ℃および37℃で測定した。AC4およびAC6の両方は、30℃および34℃でcyr1欠失の 効果的相補を示した；AC1は室温で欠失を最も相補した；そしてAC3は試 験したどのような温度でも欠失を相補できなかった。βγが機能的ヘテロ三量体を形成でき、Ｇαによるシクラーゼの刺激の減少の証 明 同じプラスミド上に様々なＧβおよびＧγの対を含む、URA3-マークCEN ARS プラスミドを構築した。例えば、Ｇβ１およびＧγ２の両方を発現するプラスミ ドを以下のように構築した。ウシＧγ２の読み取り枠を、Cadusプラスミド 1319 (Melvin Simon博士から提供され、そしてＧγ２ ｃＤＮＡを含む)から、プライ マーA14652(5'GGGCGTCTCCCATGGCCAGCAACAACACCGC 3')およびA14653(5'GGGGTCGAC CGAGGCTCCTCAGGTTCCTC 3')を使用してＰＣＲ−増幅した。増幅生成物をEsp3Iお よびSalIで消化し、そしてCadusプラスミド 1449のNcoIおよびSalI消化部位にク ローン化した。生成したプラスミド、Cadus 1705は、Ｇγ２の発現を支配するPG Kプロモーターを使用する。PGKプロモーター−Ｇγ２単位を、次にCadus 1705か ら1kbのNcoI−XhoI断片として切り出し、そしてNcoI−XhoI-消化Cadusプラスミ ド 1460にクローン化した。生成したプラスミド、Cadus 1781は次にADH1プロモ ーターを含む422bpの断片を受容した。詳細には、ADH1プロモーターをCadus 162 5から、NheIを用いて切断することにより取り出し、突出部を埋め、SpeIで切断 し、そして422bp断片を単離した。この断片を、XbaIですでに切断したCadus 178 1に連結し、5'突出部を埋め、そしてSpeIで消化した。ADH1プロモーターとPGKプ ロモーター-駆動Ｇγ２を一緒に含む組換え体(Cadusプラスミド 2209)を選択し 、そしてＧβ１読み取り枠の受容体として使用した。特にウシＧβ１の読み取り 枠をCadus 1315(Mel Simon博士から提供され、そしてＧβ１ ｃＤＮＡを含む)か ら、プライマー123(5'CGGCTAGCATCTATATACAATGAGTGAA CTTGACCAGTTACGGC 3')およびプライマー127(5'CGAGCGGCCGCTCAGTTCCAGATTTTGAGG AAGCTGTCC 3')を使用してＰＣＲ増幅した。増幅生成物をNotIおよびNheIで消化 し、そしてNotIおよびNheI消化Cadus2209にクローン化し、Cadusプラスミド2254 を生成した。このようにCadusプラスミド 2254は、PGKプロモーターからＧγ２ の、そしてADH1プロモーターからＧβ１の発現を支配する、URA3-マーク低コピ ープラスミドである。同様な構築法で、Ｇβ１およびＧγ１をコードする(Cadus プラスミド 2255)、Ｇβ２およびＧγ１をコードする(Cadusプラスミド 2257)、 Ｇβ２およびＧγ２をコードする(Cadusプラスミド 2256)、Ｇβ３およびＧγ１ をコードする(Cadusプラスミド 2259)、Ｇβ３およびＧγ２をコードする(Cadus プラスミド 2258)、Ｇβ４およびＧγ1をコードする(Cadusプラスミド 2363)、 およびＧβ４およびＧγ２をコードする(Cadusプラスミド 2361)、類似プラスミ ドを得た。 Ｇβ１およびＧγ２(Cadus 2254によりコードされる)ならびにＧβ１およびＧ γ１(Cadus 2255にコードされる)が、Ｇαｓと複合体を形成する能力を、Ｇαｓ によるAC2の刺激に対するＧβおよびＧγの同時発現の効果を評価することによ り試験した。もしＧαβγ複合体が３つのＧタンパク質サブユニットの同時発現 で形成できるならば、遊離のＧαレベルはＧαサブユニットのみを発現する酵母 に比べて、３つのすべてのサブユニットを発現する酵母の方が低くなるだろうと 予想した。これは３つのＧタンパク質サブユニットと一緒に哺乳類のアデニリル シクラーゼを発現するcdc35-1株の成長が、Ｇαとのみ哺乳類のアデニリルシク ラーゼを発現する同等な株に比べて低いことにより反映される。 酵母CY2065株(遺伝型 MATa/α lys2::PGKp-ACII/lys2::PGKp-ACII tbt 1-1/tbt1-1 cdc35-1/cdc35-1 cam/(cam?) ura3/ura3 leu2/leu2 trp1/trp1)を、 Cadusプラスミド2081(TRP1 CEN6 ARSH4 AmpR CUP1p-ratGαs)およびCadusプラス ミド2254(URA3 PGKp-Gγ2 CEN6 ARSH4 AmpR ADH1p-Gβ1)で形質転換し、姉妹株C Y3845およびCY3846を得た。これらの株は哺乳類タンパク質Ｇβ１、Ｇγ２およ びＡＣ２を構成的に、そしてＧαｓを銅の添加により発現するだろう。哺乳類タ ンパク質Ｇαｓ、Ｇβ１、Ｇγ１およびＡＣ２(CY3847およびCY3848)またはＧα ｓおよびＡＣ２のみ(CY3861およびCY3862)を発現する同等な株を構築した。これ ら６つの株を、プラスミドの保持を選択する固体培地上に1000個細胞をスポッテ ィングすることにより、34℃の温度−耐性成長について試験した。Cadusプラス ミド2254(Ｇβ１およびＧγ２をコードする)またはCadusプラスミド2255((Ｇβ １およびＧγ１をコードする)を含む株は、Ｇβγを発現する株よりもゆっくり と成長した。３つのＧタンパク質サブユニットの同時発現は、Ｇタンパク質ヘテ ロ三量体の形成を生じると結論する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マンフレデイ，ジヨン・ピー アメリカ合衆国ニユーヨーク州10014ニユ ーヨーク・グリニツジストリート666・ア パートメント556 (72)発明者 トウルーハート， ジヨシユア アメリカ合衆国ニユーヨーク州10960サウ スニアク・サウスブロードウエイ212

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類アデニリルシクラーゼを発現するように遺伝子操作された酵母細胞 であって、前記哺乳類アデニリルシクラーゼが前記細胞中で機能的でありかつ調 節可能である酵母細胞。 ２．哺乳類アデニリルシクラーゼおよび哺乳類もしくはキメラＧαタンパク質 サブユニットを共発現するように遺伝子操作されている請求の範囲１に記載の酵 母細胞であって、前記哺乳類アデニリルシクラーゼが前記Ｇαタンパク質サブユ ニットによって活性化可能であるかまたは阻害可能である酵母細胞。 ３．哺乳類アデニリルシクラーゼおよび哺乳類もしくはキメラＧβγ複合体を 共発現するように遺伝子操作されている請求の範囲１に記載の酵母細胞であって 、前記哺乳類アデニリルシクラーゼが前記Ｇβγ複合体によって活性化可能であ るかまたは阻害剤である酵母細胞。 ４．内因性酵母アデニリルシクラーゼの発現が機能的でない、請求の範囲１、 ２または３のいずれかに記載の酵母細胞。 ５．内因性酵母アデニリルシクラーゼが温度感受性である、請求の範囲４に記 載の酵母細胞。 ６．細胞が変異体対立遺伝子ｃｄｃ３５−１を含んでなる、請求の範囲５に記 載の酵母細胞。 ７．内因性酵母アデニリルシクラーゼが不活性化される、請求の範囲１に記載 の酵母細胞。 ８．哺乳類アデニリルシクラーゼが１型、２型、３型、４型、５型、６型、７ 型および８型アデニリルシクラーゼからなる群から選ばれる、 請求の範囲１−７のいずれかに記載の酵母細胞。 ９．哺乳類Ｇタンパク質サブユニットがアデニリルシクラーゼと同一の哺乳類 種から誘導される、請求の範囲２または請求の範囲３に記載の酵母細胞。 １０．哺乳類アデニリルシクラーゼが酵母染色体中に統合された遺伝子から発 現する、請求の範囲１−９のいずれかに記載の酵母細胞。 １１．酵母細胞が、サイクリックＡＭＰ応答性プロモーターを含みそして選択 可能または選別可能な遺伝子生成物をコードしている標識遺伝子をさらに含んで なる、請求の範囲１−１０のいずれかに記載の酵母細胞。 １２．前記酵母細胞が、会合してＧβγ複合体を生成することができるＧβサ ブユニットおよびＧγサブユニットをさらに発現し、前記Ｇαサブユニット、Ｇ βサブユニットおよびＧγサブユニットが、会合して異種三量体哺乳類または異 種三量体キメラＧタンパク質を生成することができる、前記請求の範囲２に記載 の酵母細胞。 １３．前記細胞が、前記哺乳類またはキメラＧタンパク質と相互反応してＧβ γ複合体からのＧαｓサブユニットの解離を起させることができる哺乳類Ｇタン パク質結合受容体をさらに発現する、請求の範囲１１に記載の酵母細胞。 １４．内因性Ｇタンパク質サブユニットが機能的形態で発現されないような、 酵母Ｇタンパク質サブユニット遺伝子中の変異をさらに含んでなる、請求の範囲 １２に記載の酵母細胞。 １５．Ｃａｍ表現型を示す、請求の範囲１または請求の範囲２に記載の酵母細 胞。 １６．ｃａｍ１、ｃａｍ２、ｃａｍ３突然変異を含んでなる、請求の範囲１５ に記載の酵母細胞。 １７．細胞が二倍体である、請求の範囲１−１６のいずれかに記載の酵母細胞 。 １８．哺乳類Ｇタンパク質サブユニットがＧαｓサブユニットである、請求の 範囲２に記載の酵母細胞。 １９．前記哺乳類アデニリルシクラーゼを阻害する哺乳類Ｇαｉをさらに共発 現する、請求の範囲２に記載の酵母細胞。 ２０．請求の範囲１−１９のいずれかに記載の酵母細胞を前記哺乳類アデニリ ルシクラーゼの活性の潜在的モジュレーターに露呈すること、および前記活性が 前記細胞中でモジュレートされるかどうかを決定することを含んでなる、 哺乳類アデニリルシクラーゼ活性のモジュレーターを同定する方法。 ２１．モジュレーターが活性化剤である、請求の範囲２０に記載の方法。 ２２．モジュレーターが阻害剤である、請求の範囲２０に記載の方法。 ２３．前記モジュレーションが、所定の選択的条件下で、細胞増殖、またはレ ポーター遺伝子の活性と関連可能である、請求の範囲２０に記載の方法。 ２４．哺乳類アデニリルシクラーゼの活性に対する哺乳類Ｇタンパク質サブユ ニットのモジュレート的効果を拮抗または増強する物質を同定する方法であって 、請求の範囲２および請求の範囲３のいずれかに記載の酵母細胞を潜在的アンタ ゴニストまたはアンタゴニストに露呈すること、およびアデニリルシクラーゼ活 性の水準が変えられるかどうかを決 定すること、を含んでなる同定方法。 ２５．哺乳類Ｇタンパク質サブユニットがＧαｉサブユニットであり、そして Ｇαｉサブユニットのモジュレート的効果がアデニリルシクラーゼ活性の阻害で ある、請求の範囲２４に記載の方法。