EA010099B1 - Пептиды, которые связываются с рецептором к эритропоэтину, и способы их применения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к пептидным соединениям, которые являются агонистами рецептора к эритропоэтину (ЭПО-рецептора). Данное изобретение также относится к терапевтическим способам, в которых такие пептидные соединения применяют для лечения нарушений, ассоциированных с недостаточной или дефицитной продукцией эритроцитов. Также предусмотрены фармацевтические составы, которые содержат пептидные соединения согласно данному изобретению.

Description

Настоящее изобретение относится к пептидным соединениям, которые являются агонистами рецептора к эритропоэтину (ЕРО-К, ЭПО-рецептора). Данное изобретение также относится к способам терапии, в которых такие пептидные соединения применяют для лечения нарушений, ассоциированных с недостаточной или дефицитной продукцией эритроцитов. Также предусмотрены фармацевтические составы, которые содержат пептидные соединения согласно данному изобретению.

Уровень техники

Эритропоэтин (ЭПО) представляет собой гормон гликопротеиновой природы, состоящий из 165 аминокислот, с молекулярной массой примерно 34 килодальтон (кДа) и предпочтительными сайтами гликозилирования в 24, 38, 83 и 126 положениях аминокислот. ЭПО первоначально синтезируется в виде белка-предшественника с сигнальным пептидом из 23 аминокислот. Эритропоэтин существует в трех формах: α-, β- и асиало-формах. Формы α- и β- слегка различны в своей углеводной части, но обладают одинаковой эффективностью, биологической активностью и молекулярной массой. Асиало-форма представляет собой α- или β-форму без концевого углевода (сиаловой кислоты). Последовательности ДНК, кодирующие эритропоэтин, были описаны ранее (патент США и.8. Ра1. Νο. 4703008, Ыи).

ЭПО стимулирует митотическое деление и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов, что обеспечивает продукцию эритроцитов. Продукция ЭПО происходит в почках в условиях гипоксии. В ходе индуцируемой эритропоэтином дифференцировки клеток-предшественников эритроцитов происходят индукция синтеза глобина, стимуляция синтеза гемсодержащего комплекса и увеличение числа рецепторов к ферритину. Эти изменения позволяют клетке поглощать больше железа и синтезировать функционально активный гемоглобин, который связывает кислород в зрелых эритроцитах. Таким образом, эритроциты и их гемоглобин играют ключевую роль в снабжении организма кислородом. Эти изменения инициированы взаимодействием эритропоэтина с соответствующим рецептором на поверхности клеток-предшественников эритроцитов (см., например., СтаЬет, ΚπιηΙζ (1978) Αηη. Рсу. Меб. 29: 51-66).

Если организм находится в здоровом состоянии, когда существующее число эритроцитов обеспечивает достаточную оксигенацию тканей, эритропоэтин присутствует в плазме в очень низких концентрациях. Эти нормальные низкие концентрации достаточны для стимуляции замещения эритроцитов, которые естественным образом погибают в результате старения.

Количество ЭПО в циркулирующей крови возрастает в условиях гипоксии, когда транспорт кислорода эритроцитами в циркулирующей крови снижен. Гипоксия может быть вызвана, например, значительной потерей крови вследствие кровотечения, разрушением эритроцитов при передозировке радиации, уменьшении количества вдыхаемого кислорода вследствие нахождения на большой высоте или продолжительного обморока либо различными формами анемии. В ответ на такой гипоксический стресс повышение уровня ЭПО увеличивает продукцию эритроцитов путем стимуляции пролиферации эритроидных предшественников. Когда количество эритроцитов превышает количество, необходимое для удовлетворения нормальной потребности тканей в кислороде, происходит снижение уровня ЭПО в циркулирующей крови.

Поскольку ЭПО необходим для образования эритроцитов, существуют потенциально полезные применения этого гормона как в диагностике, так и в лечении болезней крови, характеризующихся низкой либо дефицитной (недостаточной) продукцией эритроцитов. Недавние исследования обеспечили основу для планирования эффективного терапевтического применения ЭПО в лечении разнообразных болезненных состояний, нарушений и состояний с гематологическими расстройствами, включая бета-талассемию (см. УебосаЮ. е! а1. (1984) Ас1а. Наета1о1. 71: 211-213), кистозный фиброз (муковисцедоз) (см. УюЫпзку, е! а1. (1984) 1. Реб1а1пс. 105: 15-21), нарушения менструального цикла и беременности (см. Со!ез, е! а1. (193) Βτίΐ. 1. Оз!е!. Супеасо1. 90: 304-311), анемию недоношенных детей (см. Нада, е! а1. (1983) Ас!а Реб1а1т. 8сапб. 72: 827-831), повреждение спинного мозга (см. С1аи8-^а1кет, е! а1. (1984) Атсй. Р11уч Меб. К.ейаЫ1. 65: 370-374), космический полет (см. Оипи, е! а1. (1984) Еиг. 1. Арр1. РЬ.у8ю1. 52: 178-182), острую потерю крови (см., МШет, е! а1. (1982) Βη!. 1. Наета!о1. 52: 545-590), старение (см. Ибира, е! а1. (1984) 1. ЬаЬ. С1т. Меб. 103: 574-580 и 581-588, а также ЫрзсЫЕ, е! а1. (1983) В1ооб 63: 502-509), различные опухолевые заболевания, сопровождающиеся нарушенным эритропоэзом (см. Па1шак, е! а1. (1983) Сапсег 5: 1101-1106, а также 8сйтатй, е! а1. (1983) О!о1агупдо1. 109: 269-272), а также почечную недостаточность (см. ЕзсйЬасй. е! а1. (1987) Ν. Епд. 1. Меб. 316: 73-78).

Бал описан очищенный однородный ЭПО (патент США и.8. Ра!. №. 4677195, Не\\1ск). Последовательность ДНК, кодирующая ЭПО, была очищена, клонирована и экспрессирована, в результате чего были получены рекомбинантные полипептиды, обладающие биохимическими и иммунологическими свойствами природного ЭПО. Также была получена молекула рекомбинантного ЭПО с олигосахаридами, идентичными олигосахаридам природного ЭПО (см. 8а5ак1, е! а1. (1987) 1. Вю1. Сйет. 262: 12059-12076).

Оказалось, что биологическое действие ЭПО частично опосредовано взаимодействием с мембраносвязанным клеточным рецептором. Первоначальные исследования на незрелых эритроидных клетках,

- 1 010099 выделенных из селезенки мыши, позволили предположить, что связывающие ЭПО белки на поверхности клетки содержат два полипептида, имеющих молекулярные массы, равные приблизительно 85000 и 100000 Да соответственно (8а^уег, е! а1. (1987) Ргос. Иа!1. Асай. 8с1. И8А 84: 3690-3694). Расчетное число сайтов связывания ЭПО составило, в среднем, от 800 до 1000 на поверхности одной клетки. Из этих сайтов связывания приблизительно 300 связывало ЭПО с К_й, равной приблизительно 90 пМ (пикомоль), в то время как остальные связывали ЭПО с пониженной аффинностью, равной приблизительно 570 пМ (Задует, е! а1. (1987) 1. Вю1. Сйет. 262: 5554-5562). Независимое исследование позволило предположить, что ЭПО-чувствительные эритробласты селезенки, полученные от мышей, которым путем инъекции вводили ослабленный штамм (РУЛ) вируса лейкоза Фрейда, обладают высоко- и низкоаффинными сайтами связывания ЭПО общим числом приблизительно 400, причем значения Кй составляют 100 и 800 пМ для высоко- и низкоаффинных сайтов соответственно (Ьапйзсйик, е! а1. (1989) В1оой 73: 1476-1486).

Последующая работа показала, что единственный ген кодирует две формы рецептора к ЭПО (ЭПОрецептора). Этот ген был клонирован (см., например, 1опе§, е! а1. (1990) В1оой 76, 31-35, ИодисЫ, е! а1. (1991) В1оой 78: 2548-2556; Маоисйе, е! а1. (1991) В1оой 78: 2557-2563). Например, последовательности ДНК и кодируемые пептидные последовательности для белков ЭПО-рецептора мыши и человека описаны в публикации РСТ номер Χν0 90/08822 (О'Лпйгеа, е! а1.). Современные модели предполагают, что связывание ЭПО с ЭПО-рецептором приводит к димеризации и активации двух молекул ЭПО-рецептора, что приводит к ряду последовательных этапов передачи сигнала (см., например, \УаЮ\\'1с11. е! а1. (1992) Ргос. Иа!1. Асай. 8сЕ И8А 89: 2140-2144).

Доступность клонированных генов ЭПО-рецептора облегчает поиск агонистов и антагонистов этого важного рецептора. Доступность рекомбинантного белка рецептора позволяет изучать лиганд-рецепторные взаимодействия во множестве систем случайной и полупроизвольной генерации разнообразия белков. Эти системы включают систему пептиды на плазмидах (описана в патенте США 6270170), систему пептиды на фаге (описана в патенте США 5432018 и С^1г1а, е! а1. (1990) Ргос. Иа!1. Асай. 8сЕ И8А 87: 63786382), систему библиотека кодированных синтетических пептидов (описана в заявке на патент США Зег. Ио. 946239, поданной 16 сентября 1992) и систему синтез иммобилизованных полимеров в очень крупных масштабах (описана в патенте США 5143854, публикации XVО 90/15070; Рос1ог, е! а1. (1991) 8с1епсе 251: 767-773; Эо^ег, Ройог (1991) Апп. Вер. Мей. Сйет. 26: 271-180; и патенте США 5424186).

Были идентифицированы пептиды, которые, по меньшей мере, в некоторой степени взаимодействуют с ЭПО-рецептором. Эти белки описаны, например, в патентах США 5773569 и 5830851, а также 5986047 ^пдЫоп, е! а1.); публикации νθ 96/40749 ^пдЫоп, е! а1.); патенте США 5767078 и публикации νθ 96/40772 Дойщоп и Ζίνίιτ); публикации νθ 01/38342 (Ва1и) и νθ 01/91780 (8т1!й-8^ш!о5ку, е! а1.). В частности, была идентифицирована группа содержащих пептидный мотив пептидов, члены которой связываются с ЭПО-рецепторами и стимулируют ЭПО-зависимую пролиферацию клеток. Однако идентифицированные до сих пор пептиды, которые содержат данный мотив, стимулируют ЭПО-зависимую пролиферацию клеток ш уйго со значениями ЕС₅₀, равными от примерно 20 наномоль (нМ) до примерно 250 нМ. То есть для того, чтобы стимулировать 50% максимальной пролиферации клеток, стимулируемой ЭПО, требуются концентрации пептида от 20 до 250 нМ.

С учетом огромного потенциала агонистов ЭПО-рецепторов как для исследований важных биологических функций, опосредуемых этим рецептором, так и для лечения заболеваний остается потребность в идентификации пептидов-агонистов ЭПО-рецепторов с повышенной эффективностью и активностью. Настоящее изобретение предусматривает такие соединения.

Цитирование и/или обсуждение цитируемых источников в этом разделе и во всей спецификации приведены просто для разъяснения описания настоящего изобретения и не являются признанием того, что какая-либо из ссылок представляет собой прототип настоящего изобретения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предусматривает пептиды, которые являются агонистами ЭПО-рецепторов с существенно повышенными эффективностью и активностью. Эти агонисты включают мономерные пептидные агонисты длиной от 17 до примерно 40 аминокислот, которые содержат коровую последовательность аминокислот ЕУАСНХ₀СР1ТХ₁УССРЕР (8ЕЦ Ш N0: 1), где каждая аминокислота обозначена стандартной однобуквенной аббревиатурой, Х₀ обозначает метионин (М) или метиловый эфир гомосерина (Нзт), а Х₁ обозначает триптофан (V), 1-нафтилаланин (1-па1) или 2-нафтилаланин (2-па1), а также димерные пептидные агонисты, которые содержат два мономера пептидов, где длина каждого пептидного агониста составляет от 17 до примерно 40 аминокислот и содержит коровую последовательность аминокислот ЕУАС’НХ₀СР1ТХ|УС’ОРЕР (8ЕЦ Ш N0: 1), где каждая аминокислота обозначена стандартной однобуквенной аббревиатурой, Х₀ обозначает метионин (М) или метиловый эфир гомосерина (Нзт), а Х₁ обозначает триптофан (V), 1-нафтилаланин (1-па1), или 2-нафтилаланин (2-па1). Эффективность этих новых пептидных агонистов может быть дополнительно увеличена путем одной или более модификаций, включающих ацетилирование, образование внутримолекулярных дисульфидных связей, а также ковалентное присоединение одного или более фрагментов полиэтиленгликоля (ПЭГ, РЕС). Данное изобретение также предусматривает фармацевтические составы, содержащие такие пептидные агонисты и способы лечения разнообразных медицинских состояний с применением таких пептидных агонистов.

- 2 010099

Подробное описание изобретения

Определения

Названия остатков аминокислот в пептидах имеют следующие сокращения (аббревиатуры): фенилаланин - РЬе или Р, лейцин - Ьеи или Ь, изолейцин - 11е или I, метионин - Ме! или М, валин - Уа1 или V, серин - 8ег или 8, пролин - Рго или Р, треонин - ТЬг или Т, аланин - А1а или А, тирозин - Туг или Υ, гистидин - Н1к или Н, глутамин - О1и или О. аспарагин - Аки или Ν, лизин - Ьук или К, аспарагиновая кислота - Акр или Ό, глутаминовая кислота - О1и или Е, цистеин - Сук или С, триптофан -Тгр или V, аргинин Агд или К, глицин - О1у или О. Минорные аминокислоты в пептидах имеют следующие аббревиатуры: 1нафтилаланин - 1-па1 или Νρ, Ν-метилглицин (также известный как саркозин) - МеО или 8с, а ацетилированный глицин (Ν-ацетилглицин) - АсО.

Термин полипептид или белок обозначает здесь полимер, мономерами которого являются аминокислоты, которые представляют собой альфа-аминокислоты, соединенные между собой амидными связями. Длина полипептидов равна, следовательно, по меньшей мере двум остаткам аминокислот, но обычно полипептиды длиннее. Обычно термин пептид обозначает полипептид, длина которого составляет всего несколько остатков аминокислот. Длина новых пептидов - агонистов ЭПО-рецептора согласно настоящему изобретению составляет предпочтительно не больше, чем примерно 50 остатков аминокислот. Более предпочтительно их длина составляет примерно от 17 до 40 остатков аминокислот. Полипептид, в отличие от пептида, может содержать любое число остатков аминокислот. Следовательно, термин полипептид включает пептиды, а также более длинные последовательности аминокислот.

Фраза фармацевтически приемлемый обозначает здесь молекулы или составы, которые считают, в целом, безопасными, например те, которые являются физиологически приемлемыми и обычно не вызывают при введении человеку аллергических или аналогичных нежелательных реакций, таких как расстройство желудка, головокружение и т.п. Термин фармацевтически приемлемый предпочтительно употребляется здесь в понимании одобренного органом федерального или государственного регулирования либо перечисленного в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее как пригодного для применения у животных, а точнее у людей. Термин носитель обозначает дилюент, адъювант, наполнитель или разбавитель, с которым вводят соединение. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефти, масла растительного, животного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В качестве носителей, особенно для инъекционных растворов, используют предпочтительно воду или водные буферные растворы, а также водные растворы декстрозы и глицерина. Подходящие фармацевтические носители описаны в Кстшд!оп'к РЬагтасеи!1са1 8аепсек (автор Ε.ν. Маг!т).

Термин агонист обозначает здесь биологически активный лиганд, который связывается с комплементарным ему биологически активным рецептором и активирует последний, что либо вызывает биологический ответ рецептора, либо усиливает уже существующую биологическую активность рецептора.

Новые пептиды, которые являются агонистами ЭПО-рецептора

Настоящее изобретение описывает пептиды, которые являются агонистами ЭПО-рецептора и обладают существенно повышенными эффективностью и активностью. Эти пептидные агонисты предпочтительно имеют длину от 17 до примерно 40 аминокислот и содержат коровую последовательность аминокислот ΕΥΛί.ΉΧ_οΟΡΙΤΧ|νί.ΌΡΕΚ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1) где каждая аминокислота обозначена стандартной однобуквенной аббревиатурой, Χ_ο обозначает метионин (М) или метиловый эфир гомосерина (Нкт), а Χ₁ обозначает триптофан (V), 1-нафтилаланин (1-па1), или 2-нафтилаланин (2-па1).

Пептиды согласно данному изобретению могут представлять собой мономеры, димеры или другие мультимеры. Мультимеры пептидов согласно данному изобретению могут представлять собой тримеры, тетрамеры, пентамеры или другие структуры более высокого порядка. Кроме того, такие димеры и другие мультимеры могут представлять собой гетеродимеры или гетеромультимеры. Мономеры пептидов согласно настоящему изобретению могут представлять собой продукты деградации (например, продукты окисления метионина или деаминированного глутамина, С-концевого амида). Такие продукты деградации могут быть использованы в настоящем изобретении и, следовательно, рассматриваются как его часть. В предпочтительных способах реализации гетеромультимеры согласно данному изобретению содержат многочисленные пептиды, каждый из которых является пептидом-агонистом ЭПО-рецептора. В ососбенно предпочтительных способах реализации мультимеры согласно данному изобретению представляют собой гомомультимеры, т.е. они содержат многочисленные пептиды-агонисты ЭПО-рецептора с одной и той же последовательностью аминокислот.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к димерам пептидов-агонистов ЭПО-рецептора, которые демонстрируют значительно повышенную эффективность и активность. В предпочтительных способах реализации димеры согласно данному изобретению содержат два пептида, каждый из которых представляет собой пептид-агонист ЭПО-рецепотора. Эти предпочтительные агонисты-димеры пептидов содержат два пептидных мономера, причем каждый пептидный мономер имеет в длину от 17 до примерно 40 аминокислот и содержит коровую последовательность аминокислот ^ΥΛСΉX₀СРIΤX_|VС^Р^К (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1), где каждая аминокислота обозначена стандартной однобуквенной аббревиатурой, Χ_ο обозначает метионин (М) или метиловый эфир гомосерина (Нкт), а Χ₁ обозначает триптофан (V), 1-наф

- 3 010099 тилаланин (1-па1) или 2-нафтилаланин (2-па1). В особенно предпочтительных способах реализации димеры согласно данному изобретению содержат два пептида-агониста ЭПО-рецептора с одинаковой после довательностью аминокислот.

Согласно некоторым способам реализации данного изобретения два или более, а предпочтительно от двух до шести остатков аминокислот, независимо выбранных из 20 генетически кодируемых Ь-аминокислот или стереоизомерных Ό-аминокислот, будет связано с одним из концов основной последовательности или с обоими концами коровой последовательности, описанной выше. Например, часто к одному из концов или к обоим концам основной последовательности будет добавлена последовательность СС.

Стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) 20 основных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как а,а-дизамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие минорные аминокислоты, могут быть подходящими компонентами для соединений согласно настоящему изобретению. Примеры минорных аминокислот включают, без ограничения, β-аланин, 3-пиридилаланин, 4-гидроксипролин, О-фосфосерин, Ν-метилглицин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 5-гидроксилизин, нор-лейцин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты.

Возможны также другие модификации, включая модификацию Ν-конца, модификацию С-конца, замену одной или более встречающихся в природе, генетически кодируемых аминокислот минорными аминокислотами, модификацию боковых радикалов одного или более остатков аминокислот, фосфорилирование пептида и т.п. Одной из предпочтительных модификаций Ν-конца является ацетилирование (например, уксусной кислотой или ее галогензамещенной аминокислотой). В предпочтительных способах реализации Ν-концевой глицин подвергнут ацетилированию, в результате которого образуется Ν-метилглицин (МеС, также известный как саркозин).

Предпочтительные пептидные мономеры согласно настоящему изобретению включают, без ограничения ЕУАСНМОРГГЗМ УСфРЫЕ (8Еф ГО ΝΟ:2);

ЕУАСНМСР1Т(1-па1)УС9РЬК (8Еф ГО ΝΟ:3);

Б¥АС11М(дР1Т(2-па1)УСфРЕ1< (8Еф ГО ΝΟ:4);

ССБУАСЗЗМСРГГЗУ УСфРЕКС (8Еф ГО ΝΟ:5);

СОБУАСНМОРПЦ -па1)УСфРЕК6 (8ЕЦ ГО N0:6);

ОСЕ¥АСНМ6Р1Т(2-па1)УСфРЕКО (8Еф ГО N0:7);

(АсСОбЕУАСНМСРТТХАУСфРЕКО (8Еф ГО N0:8);

(АсО)ОЕ¥АСНМСР1Т(1 -па1)УСфРЕК6 (8Еф ГО ΝΟ:9);

(АсС)6Е¥АСНМСР1Т(2-па1)УСфРЕК.С (8ЕЦ ГО N0:10);

ССЕУАСНМбРГГХУУССРЬЩМеб) (8Еф ГО N0:11);

СОБ Υ АСНМ6Р1Т( I -па1)УСфРБК(МеО) О<ЗЕ¥АСНМСР1Т(2-па1)УСрРБК(МеО) (АсбЮБУЛСНМбРПАУУССРЕКСфМеЕт) (АсС)СЕ¥АСНМСР1Т(1-па1)УССРБК6(МеС) (АсС)6Е¥АСНМСР1Т(2-па1)УСрРЕКС(МеС) Е¥АСН(Н8ш)ОР1Т5УУСЦРЕК.

Е ¥АСН(Нзш)0Р1Т( 1 -па1)УСфРБК

Е¥АС11(115т)СР1Т(2-па1)УСфРЕК аСтБУАСЕКБЕпОСРПкУСрРЕКС 00Б¥АСН(Н8т)0Р1Т(1-па1)УСфРЕЯС

ООБ¥АСН(Нзт)СР1Т(2-па1)УСфРЕК6 (АсО)СЕ¥АСН(Нзт)СР1Т\УУСфРЕКО (АсО)СЕ УАСН(Н8т)ОР1Т( 1 -па1) УСрРБКО (АсО)СЕ¥АСН(Нзт)ОР1Т(2-па1)УСфРЕКа

ОСЕ¥АСН(Нзт)ОР1Т5УУСрРЕК(МеО)

6СЕ¥АСН(Н8т)0Р1Т(1-па1)УСфРЕК(МеС) ООЕ¥АСН(Н8т)ОР1Т(2-па1)УСфРЕК(МеО) (АсС)СЕ¥АСН(Нзт)ОР1Т\УУСфРЕКО(МеО) (8Εφ1ϋΝΟ: 12); (ΚΕφΙΟΝΟ: 13); (ЗЕрГОЫО: 14); (8Εφ ΙΌΝΟ: 15); (8Еф ГОРЮ: 16); (8ΕΌ ΙΏΝΟ; 17); (8Εφ№Ν0: 18); (8ЕС ГО ΝΟ: 19); (8ЕЦ ГО N0: 20); (8ΕφΙΟΝΟ: 21); (8Еф ГО ΝΟ: 22); (8Еф ГО N0: 23); (8Еф ГО N0: 24); (8Еф ГО ΝΟ: 25); (8Еф ГО N0: 26); (8Еф ГО N0: 27); (8Еф ГО N0: 28); (8Еф ГО N0: 29);

(АсО)аБ¥АСН(Н8т)ОР1Т(1-па1)УССРБКО(МеС) (8Е0 ГО N0: 30); и.

(АсО)ОБ¥АСН(Н8ш)ОР1Т(2-па1)УСфРБКО(МеО) (8Еф ГО N0: 31).

- 4 010099

В предпочтительных способах реализации мономеры пептидов согласно данному изобретению содержат внутримолекулярную дисульфидную связь между двумя остатками цистеина основной последовательности. Такие мономеры могут быть представлены следующим образом:

ЬУЛСНХ^НТХ.УСОРЬК _илн ЬУАСНХрОРПХ.УСОРЬК

Настоящее изобретение также предусматривает конъюгаты этих пептидных мономеров. Так, согласно одному из предпочтительных способов реализации мономеры пептидов согласно настоящему изобретению могут быть димеризованы или олигомеризованы, что приведет к повышению их активности как агонистов ЭПО-рецепторов.

В одном из способов реализации мономеры пептидов согласно данному изобретению могут быть олигомеризованы с использованием системы стрептавидин/биотин. Биотинилированные аналоги мономеров пептидов могут быть синтезированы по стандартным методикам. Например, биотин может быть присоединен к С-концу мономера пептида. Затем эти биотинилированные мономеры подвергают олигомеризации путем инкубации со стрептавидином (например, в молярном отношении 4:1 при комнатной температуре в фосфатном буферном растворе (РВ8) или и в среде Κ.ΡΜΙ (1иуйгодеи) в буфере НЕРЕ8 в течение 1 ч). В одном из вариантов этого способа реализации биотинилированные мономеры пептидов могут быть олигомеризованы путем инкубации с одним или несколькими коммерчески доступными антибиотиновыми антителами (например, антибиотиновые 1дС козы производства Кикедаагб & Репу ЬаЬогаЮпех. 1пс. (Вашингтон, округ Колумбия, США)).

В предпочтительных способах реализации мономеры пептидов согласно данному изобретению димеризуют путем ковалентного присоединения к линкерному фрагменту (соединяющему фрагменту). Линкерный (Ь_К) фрагмент предпочтительно, хотя и не обязательно, представляет С_1-12 линкерный фрагмент, факультативно заканчивающийся одной или двумя связями -ΝΗ- и факультативно содержащий замены в одном или двух доступных атомах углерода заместителем, который представляет собой низший алкил. Линкер Ь_К предпочтительно содержит -ΝΗ-Κ.-ΝΗ-, где Я обозначает низший (С_1-6) линейный углеводород, замещенный функциональной группой, такой как карбоксильная группа или аминогруппа, которая обеспечивает связывание с другим молекулярным фрагментом (который может, например, присутствовать на поверхности твердого носителя (подолжки)). Наиболее предпочтительно линкер представляет собой остаток лизина или амида лизина (остаток лизина, в котором карбоксильная группа была трансформирована в амидный фрагмент -ί.ΌΝΗ₂). В предпочтительных способах реализации линкер соединяет С-концы двух пептидных мономеров путем одновременного присоединения к С-концевой аминокислоте каждого мономера. Например, в случае, когда С-концевой линкер Ь_К представляет собой амид лизина структура димера может быть изображена, как показано в формуле Ι. Обобщенное изображение дано в формуле II:

Формула I

Формула II

Мономер 1 ^Κ-ΝΗί

Мономер 2

В формуле I и формуле II Ν² представляет атом азота ε-аминогруппы лизина, а Ν¹ представляет атом азота α-аминогруппы лизина. Структура димера может быть записана следующим образом: [пептид]₂Ьу5-амид, чтобы обозначить пептиды, связанные с α- и ε-аминогруппами лизина, или [Ас-пептид]₂Ьу8-амид, чтобы обозначить ацетилированные на Ν-конце пептиды, связанные α- и ε-аминогруппами лизина, или [Ас-пептид-дисульфид]₂Ьу8-спейсер-ПЭГ, чтобы обозначить ацетилированные на Ν-конце пептиды, связанные α- и ε-аминогруппами лизина, каждый из которых содержит внутримолекулярную дисульфидную петлю и спейсерную молекулу, образующую ковалентную связь между С-концом лизина и фрагментом ПЭГ, либо [Ас-пептид-Еу8*-МН₂]₂-иминодиуксусный-№(Вос-вА1а), чтобы обозна

- 5 010099 чить гомодимер ацетилированного на Ν-конце пептида, несущего С-концевой остаток амида лизина, где ε-амин лизина связан с двумя карбоксильными группами иминодиуксусной кислоты, где Вос-бетааланин ковалентно связан с атомом азота иминодиуксусной кислоты амидной связью.

В одном из дополнительных способах реализации полиэтиленгликоль (ПЭГ) может служить линкером Ь_к, который связывает два мономера в димер: например, единственный фрагмент ПЭГ может быть одновременно присоединен к Ν-концам обеих пептидных цепей пептидного димера.

Еще в одном дополнительном способе реализации линкерный (Ь_к) фрагмент представляет собой предпочтительно, но не обязательно, молекулу, содержащую две карбоксильные кислоты и факультативно содержащую замену по одному или более доступных атомов дополнительными функциональными группами, такими как аминогруппа, которые могут образовывать связи с одной или более молекул ПЭГ. Такую молекулу можно изобразить следующим образом:

-СО-(СН₂)„-Х-(СН₂)_га-СО-, где η является целым числом от 0 до 10, т является целым числом от 0 до 10, X выбирают из О, 8, Ν(ΟΗ₂)ρΝΚ.ι, ΝίΌ(ί.Ή_;)_|ΝΚ.| и ί.ΉΝΒ|. В₁ выбирают из Н, Вос, СЬх и т.д., а р является целым числом от 1 до 10.

В предпочтительных способах реализации одна аминогруппа каждого из пептидов образует амидную связь с линкером Ь_к. В особенно предпочтительных способах реализации аминогруппа пептида, связанная с линкером Ь_к, является эпсилон-аминогруппой остатка лизина, или альфа-аминогруппой Ν-концевого остатка, либо аминогруппой факультативной спейсерной молекулы. В особенно предпочтительных способах реализации и η, и т равны 1, X обозначает Ν^^Η^ρΝΚ,μ р равно 2, а В! обозначает Вос. Структура ЭПО-связывающих димеров пептидов, содержащих такой предпочтительный линкер, может быть изображена, как показано в формуле III.

По желанию (факультативно), группу Вос можно удалить, чтобы освободить химически активную аминогруппу, которая может образовывать ковалентную связь с активированными подходящим образом молекулами водорастворимого полимера, например молекулами ПЭГ, такими как мПЭГ-паранитрофенилкарбонат (тРЕб-ИРС), мПЭГ-сукцинимидил пропионат (тРЕС-8РА) и Ν-гидросукцинимид-ПЭГ (ΝΗ8-ΡΒΟ) (см., например, патент США И8 Ра1еп1 Νο. 5672662). Структура ЭПО-связывающего димерного пептида, содержащего такой предпочтительный линкер, может быть изображена, как показано в формуле IV.

Обычно, хотя и не обязательно, димеры пептидов будут также содержать одну и более внутримолекулярных дисульфидных связей между остатками цистеина пептидных мономеров. Предпочтительно два мономера содержат по меньшей мере одну внутримолекулярную дисульфидную связь. Наиболее предпочтительно оба мономера пептидного димера содержат внутримолекулярную дисульфидную связь и, таким образом, каждый мономер содержит циклическую группу.

Пептидный мономер или димер может также содержать один или более спейсерных (разделительных) фрагментов. Такие спейсерные фрагменты могут быть присоединены к пептидному мономеру или пептидному димеру. Предпочтительно такой спейсерный фрагмент может быть присоединен к линкерному Ь_к фрагменту, который связывает мономеры пептидного димера. Например, такой спейсерный фрагмент может быть присоединен к пептидному димеру через атом углерода карбонильной группы лизинового линкера или через атом азота линкера на основе иминодиуксусной кислоты. Например, такой спейсер может соединять линкер пептидного димера с фрагментом водорастворимого полимера или защитной группой. В другом примере такой спейсер может связывать пептидный мономер с присоединенным фрагментом водорастворимого полимера.

В одном способе реализации спейсерный фрагмент представляет собой С₁.₁₂ фрагмент, факульта

- 6 010099 тивно заканчивающийся -ΝΗ-связями или -С(ООН)-группами и факультативно содержащий замены у одного или нескольких доступных атомов углерода заместителями, которые представляют собой низшие алкилы. В одном способе реализации спейсер представляет собой В-СООН, где В представляет собой низший (С1_б) алкилен, замещенный функциональными группами, такими как карбоксильная группа или аминогруппа, которые обеспечивают связывание с другим молекулярным фрагментом. Например, спейсер может представлять собой остаток глицина (С) или аминогексановую кислоту. В предпочтительных способах реализации аминогексановая кислота представляет собой 6-аминогексановую кислоту (АНх). Например, в случаях, когда 6-аминогексановая кислота (АНх) связана с Ν-концом пептида, концевая аминогруппа пептида может быть связана с карбоксильной группой ЛНх стандартной амидной связью. В другом примере, в случае, когда ЛНх связана с С-концом пептида, амин ЛНх может быть связан с концевой карбоксильной группой концевой аминокислоты обычной амидной связью. Структура пептида может быть изображена, как показано в формуле V. Обобщенное изображение показано в формуле VI.

Формула V Формула VI

Мономер 1 Мономер 1

Мономер 2 ^и Мономер 2

В других способах реализации спейсер представляет собой -ΝΗ-Β-ΝΗ-, где В представляет собой низший (С_1-6) алкилен, замещенный функциональной группой, такой как карбоксильная группа или аминогруппа, которая обеспечивает связывание с другим молекулярным фрагментом. Например, спейсер может представлять собой остаток лизина (К) или амида лизина (Κ-ΝΗ₂, остаток лизина, в котором карбоксильная группа была трансформирована в амидный фрагмент -ί.ΌΝΗ₂).

В предпочтительных способах реализации спейсерный фрагмент имеет следующую структуру: -МН-(СН₂)_а-[О-(СН₂)_е]_у-О_£-(СН₂)_гУ где каждое из чисел α, β, γ, δ, и ε является целым, а их значения выбраны независимо. В предпочтительных способах реализации каждое из чисел α, β, и ε является целым, значение которого выбрано независимо из чисел от 1 до 6, δ равно 0 или 1, γ является целым числом, выбранным из чисел от 1 до примерно 10, за исключением тех случаев, когда γ больше 1, β равно 2, а Υ выбирают из ΝΗ и СО. В особенно предпочтительных способах реализации каждое из чисел α, β, и ε равно 2, оба числа γ и δ равны 1, а Υ представляет собой ΝΗ. Например, пептидный димер, содержащий такой спейсер, схематически изображен в формуле VII, где линкер представляет собой лизин, а спейсер соединяет линкер с защитной группой Вос.

Формула VII

Мономер 1 θ \—ΝΗ-γ_ _ζ—'

Мономер 2 θ

В другом особенно предпочтительном способе реализации γ и δ равны 0, α и ε вместе равны 5, а Υ обозначает СО.

В особенно предпочтительных способах реализации линкер и спейсерный фрагмент имеют структуру, показанную в формуле VIII и формуле IX.

- 7 010099

Мономеры, димеры или мультимеры пептидов согласно данному изобретению могут дополнительно содержать один или более фрагментов водорастворимых полимеров. Предпочтительно эти полимеры ковалентно присоединены к пептидным соединениям согласно данному изобретению. Предпочтительно для терапевтического применения препарата конечного продукта полимер будет представлять собой фармацевтически приемлемый полимер. Специалист в данной области сможет выбрать желаемый полимер, учитывая, будут ли конъюгат полимер-пептид применять в терапевтических целях, и если да, то учитывая такие параметры, как желаемая дозировка, время циркуляции, устойчивость к протеолизу и другие. Водорастворимый полимер может представлять собой, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ, РЕС), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинил пирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры), поли(п-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры оксида полипропилена и оксида этилена и полиоксиэтилированные высокомолекулярные спирты. Предпочтительным водорастворимым полимером является ПЭГ.

Полимеры могут иметь любую молекулярную массу, могут быть разветвленными или неразветвленными. Предпочтительные ПЭГ для использования в настоящем изобретении включают линейный, неразветвленный ПЭГ, имеющий молекулярную массу, превышающую 10 кДа, а более предпочтительно с молекулярной массой пределах примерно от 20 до 60 кДа, причем наиболее предпочтительная молекулярная масса - 20 кДа. Понятно, что обычно в отдельно взятом препарате ПЭГ молекулярные массы отдельных молекул будут различаться. Масса некоторых молекул будет больше, а некоторых меньше указанной молекулярной массы. Такие различия обычно отражают использованием слова примерно для описания молекулярных масс молекул ПЭГ.

Число присоединенных молекул полимера может быть различным, например к пептиду-агонисту ЭПО-рецептора согласно данному изобретению могут быть присоединены 1, 2, 3 или более молекул водорастворимых полимеров. Множественные присоединенные полимеры могут представлять собой один и тот же или разные химические компоненты (например, полиэтиленгликоли разной молекулярной массы). Так, в одном из предпочтительных способов реализации данного изобретения рассмотрены пептиды-агонисты ЭПО-рецептора с присоединенными к ним двумя или более фрагментами ПЭГ. Предпочтительно оба фрагмента ПЭГ представляют собой линейный, неразветвленный ПЭГ, каждый из которых предпочтительно имеет молекулярную массу в диапазоне примерно от 10 до 60 кДа. Более предпочтительно каждый линейный неразветвленный фрагмент ПЭГ имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 до 40 кДа, еще более предпочтительно в диапазоне между примерно 20 и 30 кДа, причем молекулярная масса 20 кДа для каждого неразветвленного полимера особенно предпочтительна. Однако другие молекулярные массы ПЭГ также предусмотрены в таких способах реализации. Например, данное изобретение предусматривает и включает пептиды-агонисты ЭПО-рецептора с двумя или более прикрепленными к ним фрагментами ПЭГ, по меньшей мере один из которых (или оба) имеет молекулярную массу примерно от 20 до 40 кДа или примерно от 20 до 30 кДа. В других способах реализации данное изобретение предусматривает и включает пептиды-агонисты ЭПО-рецептора с двумя или более прикрепленными к ним линейными неразветвленными фрагментами ПЭГ, по меньшей мере один из которых имеет молекулярную массу примерно от 20 до 60 кДа.

В одном способе реализации ПЭГ может служить линкером, который связывает два пептидных мономера в димер. В одном способе реализации ПЭГ присоединен по меньшей мере к одному концу (Νконцу или С-концу) пептидного мономера или димера. В другом способе реализации ПЭГ присоединен к спейсерному фрагменту пептидного мономера или димера. В особенно предпочтительном способе реализации ПЭГ присоединен к спейсерному фрагменту, причем указанный спейсерный фрагмент присоединен к линкерному фрагменту Ь_к, который соединяет мономеры пептидного димера. В предпочтительном способе реализации ПЭГ присоединен к линкерному фрагменту пептидного димера. В особенно предпочтительных способах реализации ПЭГ присоединен к спейсерному фрагменту, причем указанный спейсерный фрагмент соединяет мономеры пептидного димера. В особенно предпочтительных способах реализации ПЭГ присоединен к спейсерному фрагменту, а указанный спейсерный фрагмент присоединен к пептидному димеру через атом углерода карбонильной группы лизинового линкера или через атом азота амида лизин-амидного линкера (линкера на основе амида лизина).

Предпочтительные димеры пептидов согласно настоящему изобретению включают, без ограничения, следующие.

- 8 010099

Пептидный димер соединен

АР33065

АР34602

АР34395

АР34601 осьУАснмартти/ус¹:

АР32579

АГ33068

АР33131

АР34351

АР34350

АР34753

АР34757 (АсС)ОЕУАСНМОР1Т\¥УСОРЕКС

АЕ35062 (Ас(3)ОЕУАСНМОР1Т\УУСрРЬкСх

АЕ35218

АЕ35462

АЕ35464 (юьуА^нмбртуу^ (

ЮРЬКО\^ ‘ЦРЕКСк ιρίκοηκα (АсОКтЕУАСНМСРП^УСрРЕКСх.

(АсС)СЕУАСНМСР1Т\УУС9РЕВ.а\_ч

ЬУА^НМаРТТХУУ^ОРЕКСк

ЕУАСНМОРИУ/УСОРЕКС^

СЬУАСНМ<ЗР1Т^УСОРЬК / □ί у аснморгг^ус ι

ОЕУАСНМ6Р1Т\УУСОРЕЯСК (ЮЬУАСНМбРтУУСОРЬК '

06ЕУАСНМ0РГГ^УС(

60ЬУАСНМОР1Т\¥УСОРЕКС '

ВюИп-ССЕУАСНМСР1Т\УУ^0РЕК6'к

ВюПп-ООЬУАСНМОНТХУУСОРЕКС '

ЮРЕКСК

ООЕУАСНМаРПЗУУСОРЕКО '

РЕОйк-о-и-ССЬУАСНМСНТМЛ/^рРЕКСХ

РЕС_5К— О-^-СОЕУАСНМСРШУУСОРЕКО ' (АсСЮЕУАСНМОРПЛУУСр (АсС)СЕУАСНМ6Р1^гП¥УСрРЕКС\ (АсО)ОЕУАСНМОР1Т\¥УСрРЬКС (Аса)аЕ¥АСНМСР1Т\¥¥С01 (АсО)СЕУАСНМОРП \УУС9 (АсО)ОЕУАСНМСР1Т\¥УСЧ аСЕУАСНМСРЩЬпаПУ^ОРЕКС □ОЕУАСНМ'ЗР1Т(1-па1)\'СОРЕКС^//

- 9 010099

АЕ35525 [АсСЮЬУАСНМбМТ ЬпаПУСОРЕК МеС)—ην (АсС)6ЬУАСНМОР1Т(Ьпа1)УС0РЬК(МеС)--ΝΗ [ АсС)6Ь УАСНМСР1Т( 1 та1)УСОРЬк(Меа)-НМ (АсО)ОЕУАСНМОР1Т(2-па1)УСОРЕК(МеС)--МН (АсС)ОЬ¥АСНМОР1Т(2-па1)УСОРЬк(МеО)—ΗΝ (АсС)ОЕУАСНМ6Р1Т(2-па1)УС0РЕК(МеС)—Ηϊ\ (АсО)СЕУАСНМСР1Т\УУСОРЕКС6-НН

АБ3288

ООЕУАСН(Н5тХЗР1Т(1-па1)УСОРЕКб

АР35179

АР35180

ССЕУАСНМСР1Т(1-па1)УСОРЕК(Меаг

ООЬУА(

С6ЕУАСНМ6Р1Т(1-па1)у0?РЕК(МеОК

-0-*СС0ЬУАЬ1МОТ1Т(1-па1)у0<ЗР1.К(Ме0к ^рЕО20К—О-“_ааЕУАсНМСР|Т(1-па|)УСОРЕК(Ме6К (АсС)<ЗЕУАСНМС>Р1Т(1-па1)УС (АсОСЬУА^НМбНТХУУ^ОРЕКС (Ас6)6ЬУАСНМ6Р1Т\УУ00РЕЯ6--ΝΗ (АсО)ОЕУАСНМ6Р1Т(2-па1)У(!

(АсСКЗЕУАСНМСРГПУУСОРЕКбС

ССЕУАСН(Н8т)6Р1Т\УУС0РЕК6 ^Н(Н$т)СР1Т(1-па])У<^ (Ас6)6ЬУАСН(Н5т)0Р1Т( 1 .паПУ^ОРЬКС

САсС)СЕУАСН(Нзт)СР1Т( 1 -паПУСОРЕКО ' [Ас6)ОЕУА^Н(Нзп1)ОР1Т( 1 -па!)Ус!

(АсО)СЕУАСН(Н8ш)ОР1Т(1-па1)УСОРЕР6 ' (АсО)аЕУАс!н(Н8т)СР1Т(1-па1)Ус!оРЕК(МеО) (АсОК5ЕУАСНСН5т)СР1Т(1-па1)УСОРЕК(МеС)^

- 10 010099

АР35090	С1СЬУАСН(Н5т)СР1ТОТ09РЬЯ6{МеС) Χ-ΝΗ2 С6ЕУАСН(Н5т)6Р1П¥УС9РЕКС(МеО) '
АГ35148	ΡΕΘ2οκ—о—(АсС)СГУАСН(Н5т)СР1Т(1-па1)У<^РкК(МеОК /:κ-νη2 РЕО30к_о_(АсО)(и¥лснШ5т)аРЩ1-|1а1)УСОР1.1<<Ме6)/
АР35149	(АсС)6ЬУАСН(Н5т)СР1Т(1-па1)У^РЬК(Ме6)--ΝΗ У ΝΗ2 (АсО)ОГ¥АСН(Н5т)ОР1Т(Ьпа1)УСОРЕК(МеС)—ΗΝ ' 1______________________1 '—о
АР35168	(АЮ)аЬУАСН(Н5т)ар1Т(Ьпа1)Ус!оРЬК(МеС) ΝΗ и а<=г- \ .χχ .,νη уньи 1· 5? ‘ (Аса)СЬ¥АСН(Нзт)СР1Т(1-па1)УС0РЦ<(Меа)-НИ ΝΙΙ”\_0'^ /РЕ62гж X
АР35361	(АсС)6ЕУАСН(Нкт)СР1Т(2-па1)УСрРЕк(МеО). ^;κκ-νη2 (АсО)6ЕУАСН(Н5ш)6Р1Т(2-па1)УСрРЕК(МеОИ
АР35595	(АсС)СЕУАСН(Н5т)СР1Т(2-па1)УС9РЕК(МеС)__ин > ΝΗ/ΡΕ(320κ У у ° (АсО)аЬ¥АСН(Н5ш)ОР1Т(2-па1)УСОРЬК(МеО) —ΗΝ ΝΗ-, /—> 1_______________1 νο
АР35564	(АеО)ОЬ¥АСН(Н5П1)6Р1Т(2-па1)Ус!оРЬК(МеО)__мн ΝΗ /РЕСзок У у ° (АсС)<ЗЕУАСН(Нзт)ОР1Т(2-па1)УС<ЗРЕК(МеС)—ΗΝ ΝΗ·\ ,—( 1___________________1 ^-о

Другие пептиды согласно настоящему изобретению, включая пептидные мономеры, представляют собой следующие.

ЛКУГЧФМАЧК

0А<В«.

' с~Г~р с I к _р к г с~Т~Р О _5 о

х 1_С С I М_ н_ с“[ с 1 ^н~*

ОнС-ДуЛвФсй* »СУОфдн

М-|ОнЦв«Й аи*р

ьг
м
м
55
№
I- 57
’ 53
Μ
66
βί
62
ад-1
Μ
65
66 67
66
&ί та
' τΞ	--
Γ Ϊ4
Γ 7^
Γ 7®
1 77
|____ТЕ

[ Ц]Д*&ос ю’А*ем_ |ОА*Вйё~

ЮА'ВйС

- 11 010099

79

АС

К

N

н

ί

Υ

(3

С

К

м

с

Р

ί

τ

νν

V

С

8

8

к

6

т

0

к

νη2

80

Ас

Р

υ

1

А

Υ

8

с

к

м

о

Р

ь

τ

νν

V

С

А

Р

N

Η

к

νη2

мономер------

81

Ас

ί

с

в

н

Υ

8

с

н

Р

о

Р

ί

τ

νν

V

С

О

Р

А

Ε

к

0

к

νη2

-

82

Ас

1

ц

к

6

Υ

Ε

с

Υ

м

о

Р

ь

τ

νν

V

С

В

3

8

К

Р

в

к

νη2

-

83

Ас

м

в

1

н

Υ

Η

с

Υ

м

О

Р

ί

τ

νν

V

С

Е

с

8

Ε

ί

к

νη2

--------Е-------

84

Ас

н

ь

<3

к

Υ

Ο

с

8

Е

о

Р

о

τ

νν

V

С

К

Р

К

В

8

ί

к

νη2

“------

85

Ас

к

<3

к

Ν

Η

с

К

Г

6

Р

и

τ

νν

V

С

Р

ϋ

8

Υ

Е

Р

к

νη2

-------Е-------

86

Ас

к

Р

к

Р

Υ

8

с

1

м

6

Р

к

τ

νν

V

С

С

6

V

Η

А

с

νη2

-

87

Ас

V

ί

Р

1

Υ

Η

с

К

м

о

к

Е

τ

νν

Ε

С

м

В

А

А

С

V

т

к

νη2

88

Ас

Р

о

N

8

Υ

К

с

М

6

р

ί

Т

νν

V

С

в

к

β

К

Η

Е

к

νη2

-

89

40КЭа

1

Ас

в

<3

1

Υ

А

с

Н

М(х)

<3

Р

τ

1На1

V

С

о

Р

ί

В

баг

к

ΝΗ,

12

ΙΟΑ

МОНО-

90

40КОа

1

Ас

и

ί

Υ

А

с

Н

М{х)

с

Р

τ

1ΝβΙ

V

С

и

Р

Е

В

Заг

к

νη2

12

ГОА

91

1

Ас

6

(3

1

Υ

А

с

Н

М

с

Р

1

τ

1№Ι

V

С

о

Р

ί

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

СИД----

92

I

Ас

и

<3

ь

Υ

А

с

н

т

Р

1

τ

1Ыа1

ν

С

Р

ί

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

93

1

Ас

и

с

I-

А

с

н

м

в

Р

!

τ

1Ыа1

V

С

о

Р

Ε

В

оаГ

к

νη2

12

ЮА

~9 П гис---------

94

1

Ас

и

<3

ί

Υ

А

с

н

м

<7

Р

1

1

1ГЧа1

В

Заг

к

νη2

]2

ΙΟΑ

-

95

I

Ас

ь

О

ь

А

с

н

м

В

Р

ί

τ

1Ыа1

ν

С

О

р

ι.

к

ΝΗ-

12

ΙΟΑ

-

с

ь

А

с

н

м

О

Р

1

τ

1Ыа1

V

С

о

Р

Ε

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

-р ---------

97

1

Ас

ь

Υ

ί

с

в

м

(3

Р

1

τ

νν

V

С

Е

в

Υ

К

νη2

]2

ЮА+Вос

—Е------

98

|

Ас

1

Υ

8

с

н

Р

с;

Р

1

τ

νν

ν

С

Я

р

Ο

К

νη2

12

ЮА+Вос

99

1

Ас

и

Н

с

к

м

с

Р

ь

τ

νν

V

С

к

Р

I.

к

νη2

Р

100

|

Ас

ь

Υ

Е

с

к

м

О

р

м

τ

νν

ν

с

Р

6

к

νη2

р

ЮА+Вос

1

Ас

и

ь

с

к

м

(3

Р

V

τ

νν

Ε

С

О

Р

Ε

к

νη2

]2

ЮА+Вос

102

1

Ас

υ

Υ

N

с

к

Р

в

Р

ь

τ

νν

V

С

к

Р

8

к

νη2

V

ЮА+Вос

103

I

Ас

8

Υ

1

с

к

В

о

Р

т

τ

νν

Ε

С

т

А

Ο

к

ΝΗ-

]2

ЮА

104

1

Ас

Е

Υ

8

с

к

Μ

6

Р

м

τ

νν

V

С

8

Р

Τ

к

νη2

1?

ЮА

105

I

Ас

ί

Υ

ί

с

к

Р

р

τ

νν

Π

К

νη2

12

[

Ас

1

Υ

К

с

ί

М

с

Р

ί

τ

νν

V

С

т

Р

I)

к

ΓνηΓ

]2

ЮА

107

л

Ас

о

с

ί

Υ

А

с

н

м

с

Р

1

τ

1№|

V

С

о

Р

Ε

в

Заг

К

νη2

12

ЮА

-р, А|[-----------

108

40Κϋ3

1

АГх

и

(3

ί

Υ

А

с

н

м

с

Р

1

τ

1ΝβΙ

V

С

о

И

1

к

8аг

νη2

12

ЮА

Ν-концевой

109

40Кйа

1

<3

и

ί

Υ

А

с

н

м

в

Р

1

τ

1ΝβΙ

V

С

о

Р

Ε

в

Заг

νη2

]2

ЮА

параллельная дисульфидная

110

(

Ас

В

13

ι

Υ

А

с

н

м

о

Р

1

τ

1Ν3ί

ν

С

в

Заг

к

νη2

12

ЮА

р рго-----------

[

Ас

и

С

ь

Υ

А

с

ь

м

с

Р

1

τ

1№Ι

V

С

о

Р

1

в

Заг

к

ΝΗ.

12

ЮА

.......

112

1

Ас

о

<3

к

Υ

А

с

н

м

О

Р

1

τ

1Ν3ί

V

С

О

Р

1

в

Заг

к

νη2

12

ЮА

П АЬ

113

1

Ас

с

с

ί

Υ

А

Схх

н

м

6

Р

1

τ

1№Ι

V

Схх

а

Р

Ε

к

Заг

к

νη2

]2

ЮА

перекрестная дисульфидная

114

1

АС

о

(3

ί

Υ

А

С(Аст)

н

м

с

р

1

1Ыа1

С

и

н

ι

я

Заг

к

νη2

12

ЮА

параллельная дисульфидная

115

40КОа

1

и

и

ί

Υ

А

С

н

м

6

Р

1

τ

1Иа1

V

с

о

Р

Ε

в

Заг

ЮА

Ν-концевой

116

40Κϋ3

1

Ас

и

<3

ί

Υ

А

С

н

м

с

Р

1

τ

1№1

V

с

а

Р

Ε

в

Заг

к

νη2

]2

ЮА

перекрестная дисульфидная

117

1

Ас

<3

с

ί

Υ

А

С8Н

н

м

6

Р

1

τ

1Ыа1

V

СЗН

о

Р

Ε

баг

к

νη2

12

ЮА

ВебисеО

118

[

Ас

13

<3

ί

Υ

А

С(Асе)

н

м

6

р

1

τ

1ΝθΙ

V

С(Асе)

о

Р

Ε

в

баг

к

νη2

]2

ЮА

Саррео

119

I

Ас

К

1

В

Ε

Υ

8

С

υ

м

6

Р

ί

τ

νν

τ

С

V

Р

К

8

К

ын2

]2

ЮА+Вос

120

I

Ас

5

в

А

Η

Υ

М

С

н

м

с

Р

ί

τ

νν

V

с

к

Р

Ε

V

К

νη2 1

12

ЮА+Вос

121

|

Ас

О

в

В

Α

Υ

М

С

к

Е

с

Р

V

τ

νν

V

с

δ

Р

К

1

В

К

νη2

12

ЮА+Вос

122

|

Ас

т

1

А

υ

Υ

1

С

Υ

м

с

Р

Ε

τ

νν

Ε

с

я

Р

8

Р

в

А

к

νη2

]2

ЮА+Вос

123

I

Ас

N

и

К

τ

Υ

8

С

и

ί

с

Р

V

τ

νν

V

с

8

к

6

V

в

в

к

νη2

]2

ЮА+Вос

124

Д-

Ас

м

в

т

в

Υ

в

С

Υ

м

6

Р

Е

т

νν

V

с

Е

6

8

В

Ε

к

νη2

12

ЮА+Вос

125

Ас

8

в

т

в

Υ

в

С

Е

м

6

Р

ί

т

νν

V

с

Е

в

νν

К

νη2

12

126

АС

с

3

в

т

Υ

3

С

О

ί

6

Р

V

т

νν

V

с

6

в

В

В

|2.......

ЮА+Вос

127

Ас

в

Р

в

Р

Υ

3

С

т

м

6

Р

в

т

νν

V

с

6

6

V

В

А

6

к

νη2

]2

ЮА+Вос

128

[

Ас

6

6

т

Υ

3

С

н

м

6

Р

Е

т

νν

V

с

К

Р

а

6

6

К

νη2

12

ЮА+Вос.

129

[

Ас

<3

в

ϋ

Υ

Η

С

в

м

6

Р

ί

т

νν

V

с

к

р

Е

6

6

К

νη2

]2

130

[

Ас

с

в

V

Υ

А

С

в

м

6

Р

1

т

νν

V

с

8

Ρ

ί

6

6

К

νη2

12

131

[

Ас

с

6

ί

Υ

А

С

н

м

6

Р

1

Υ

1Ν3Ι

V

с

Е

Р

ί

В

Заг

К

νη2

]2

ЮА

~пё—н г н---

132

[

Ас

6

6

Ε

Υ

А

С

н

м

в

Р

1

т

1Иа1

V

с

Е

Р

Ε

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

...... θ---г· —.....-—

133

[

Ас

с

6

Ε

Υ

А

С

н

м

6

Р

|

т

1Иа1

V

с

О

Р

Ε

В

8аг

к

νη2

]2

ЮА

—ή---------

134

I

Ас

с

6

Ε

Υ

А

С

н

м

с

р

В

Заг

К

νη2

12

ЮА

„Л5-----

[

Ас

6

с

ι

Υ

А

С

н

м

в

Р

1

т

1Ыа1

V

с

я

Р

К

νη2

12

ЮА

Ь (Э1п--

136

л

Ас

с

6

Ε

Υ

А

с

н

м

6

Р

1

т

1На1

V

с

а

Р

Ε

В

Заг

к

νη^

12

ЮА

.....р --------

137

л

Ас

6

6

Ε

Υ

А

с

н

м

6

Р

1

т

1Ыа1

V

с

о

Р

Ε

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

.....р /--------

138

[

Ас

3

6

Ε

Υ

А

с

н

м

6

Р

1

т

1На1

V

с

о

Р

Ε

В

Заг

к

νη2

Л2

ЮА

“□νϊϊ--------

139

[

Ас

с

6

Ε

Υ

А

с

н

м

в

Р

1

т

1Ыа1

V

с

о

Р

Ε

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

~ Ь 7Й а1---------

140

I

Ас

с

3

6

Ε

Υ

А

с

н

м

6

Р

1

т

1Иа1

V

с

Га

Р

Ε

В

Заг

к

νη2

]2

ЮА

- θ. ιΠ56Γίοη----

141

[

Ас

в

3

ί

Ε

Υ

А

с

н

м

в

Р

|

т

1Иа1

V

с

Г)

Р

Ε

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

~1еи каейюп--

Ас

с

и

1

Υ

Υ

А

с

н

м

6

Р

1

т

1Ыа1

V

т

а

Р

Ε

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

Туг 1п5еП1оп

143

Л

Ас

6

3

ί

Υ

А

А

с

н

м

6

Р

1

т

1№1

V

с

о

Р

Ε

В

Заг

к

νη2

)2

ЮА

А1а ΙπδβΓΐίοη

144

л

Ас

3

в

Ε

Υ

А

с

н

н

м

6

Р

I

т

1Ν3Ι

V

с

о

Ρ

Е

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

145

Д

Ас

3

6

Ε

Υ

А

с

н

м

м

6

Р

1

т

1ΝΘ1

V

с

о

Ρ

ί

В

Заг

к

νη2

12

ЮА

.....МеНп^егНоп---

146

[

Ас

Ν

Υ

Т

с

в

Р

6

Р

ί

т

νν

Ε

с

т

Р

а

К

ΝΗ2

12

ЮА+Вос

--

147

[

Ас

3

νν

О

с

в

1

6

Р

1

т

νν

V

с

в

νν

3

к

]2

ЮА+Вос

148

{

Ас

Ν

Υ

м

с

н

Е

η

Р

1

т

νν

3

к

νη2

12

ЮА+Вос

|

Ас

ι

Υ

1

с

в

м

6

Р

а

т

νν

Μ

с

о

Р

6

к

νη2

12

ЮА+Вос

—

150

ί

Ас

νν

Υ

8

с

ί

м

6

Р

м

т

νν

V

с

в

А

Η

к

ΝΗ,

]2

ЮА+Вос

151

[

Ас

Ε

Υ

Р

с

в

м

п

Р

1

т

νν

ν

с

и

Я

8

к

νη2

12

ЮА+Вос

152

д

Ас

о

В

Ε

Υ

А

с

н

м

6

6

Р

1

τ

Ша!

V

с

о

Ρ

Е

в

Заг

к

νη2

12

153

л

Ас

в

6

Ε

Υ

А

с

н

м

6

Р

|

1

τ

1Иа1

V

с

о

Ρ

ί

в

8аг

к

νη2

12

...... у.——-------

154

[

Ас

в

6

Ε

Υ

А

с

н

м

п

Р

I

т

τ

Ρ

ί

в

Заг

к

νη2

12

ЮА

———22---

л

Ас

и

С

ί

Υ

А

с

н

м

6

Р

1

т

1ΝβΙ

V

V

с

Е1

Ρ

Ε

в

Заг

к

νη2

]2

ЮА

~ Уа1 ΙΠ5βΓίί η-----

156

[

Ас

в

6

Ε

Υ

А

с

н

м

6

Р

1

т

1Ыа1

V

с

о

а

Ρ

Ε

в

Заг

к

νη2

12

ЮА

~ 6ίη ΙΠ5βΗίθΠ----

157

Л

Ас

в

6

Ε

Υ

А

с

н

м

6

Р

ί

т

1Иа1

V

с

о

р

Ρ

Ε

в

Заг

к

νη2

12

ЮА

~'р .---—-------

158

л

Ас

в

6

Ε

Υ

А

с

н

м

в

Р

1

т

1ΝβΙ

V

с

о

Р

Ε

Ε

в

Заг

к

νη2

12

ЮА

-.....;η56 н°П----

159

[

Ас

в

в

Ε

Υ

А

с

н

м

6

Р

1

т

1 На1

V

с

о

Р

Ε

В

в

8аг

к

νη2

12

ЮА

“Ага]п5еП1 η----

160

[

Ас

в

6

Ε

Υ

А

с

н

м

6

Р

1

т

1Иа1

V

с

о

Р

Ε

В

Заг

Заг

к

νη2

]2

ЮА

8аг ΙπδβΓίΐοπ

Разветвленная аминокислота выделена тенью

ЮА - имино-диуксусная кислота (конъюгат Ве(аА!а)

Последовательности пептидов согласно настоящему изобретению могут присутствовать отдельно или в соединении Ν-концевыми и/или С-концевыми дополнительными участками цепи пептида (удлиннениями). Такие удлиннения могут представлять собой природные кодируемые последовательности пептидов выборочно с не встречающимися в природе последовательностями или практически без них. Удлиннения могут содержать, по желанию специалиста в данной области, любые добавления, делеции, точечные мутации или другие модификации последовательности либо их комбинации. В качестве примера, но не ограничения, встречающиеся в природе последовательности могут представлять собой полноразмерные или укороченные последовательности, а также могут включать замены аминокислот, которые создают сайт присоединения углевода, ПЭГ, другого полимера и т.п. путем присоединения к боковым радикалам. В одном из вариантов замена аминокислоты приводит к гуманизации последовательности, что делает ее совместимой с иммунной системой человека. Предусмотрены все типы белков слияния, включая такие, в которых последовательности иммуноглобулина примыкают к последовательностям согласно настоящему изобретению, активирующим ЭПО-рецепторы, или расположены вблизи от них, с последовательностью неиммуноглобулинового спейсера или без нее. Один класс способов реализации представляет собой цепь иммуноглобулина, содержащую вместо вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи последовательность, активирующую ЭПО-рецептор.

Приготовление пептидных соединений согласно данному изобретению

Синтез пептидов

Пептиды согласно данному изобретению могут быть приготовлены классическими способами, из- 12 010099 вестными в данной области. Эти стандартные способы включают синтез полностью в твердой фазе (твердофазный синтез), способы синтеза частично в твердой фазе, конденсации фрагментов, классический синтез в растворе и технологию рекомбинантных ДНК (см., например, Меглйе1б 1. Ат. СНет. 8ос. 1963 85: 2149).

В одном из способов реализации мономеры пептидов пептидного димера синтезируют отдельно, после чего подвергают димеризации. В предпочтительных способах реализации мономеры пептидов в димере имеют одну и ту же последовательность аминокислот.

В особенно предпочтительных способах реализации мономеры пептидов в димере соединяют через С-концы с помощью линкерного фрагмента Ь_к, имеющего две функциональные группы, которые могут служить сайтами инициации для синтеза пептидов, и третью функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая обеспечивает связывание с другим молекулярным фрагментом (который может, например, присутствовать на поверхности твердого носителя (подложки)). В этом случае два мономера пептидов могут быть синтезированы непосредственно на двух химически активных азотных группах линкерного фрагмента Ь_к (вариант методики твердофазного синтеза). Такой синтез может быть последовательным или одновременным (параллельным).

В случае, когда предстоит провести последовательный синтез пептидных цепей димера на линкере, две функциональные аминогруппы защищают двумя разными ортогонально удаляемыми защитными группами для аминогрупп (аминзащищающими группами). В предпочтительных способах реализации защищенный диамин представляет собой защищенный лизин. Защищенный линкер связывают (сшивают) с твердым носителем через третью функциональную группу линкера. Удаляют первую аминзащищающую группу и на первом лишенном защиты аминофрагменте синтезируют первый пептид димера. Затем удаляют вторую аминзащищающую группу и на втором лишенном защиты аминофрагменте синтезируют второй пептид димера. Например, первый аминофрагмент линкера может быть защищен группой А11ос (аллилоксикрбонил), а второй - группой Етос (9-флуоренилметилкарбоксил). В этом случае группу Етос (но не группу А11ос) можно удалить обработкой слабым основанием (например, 20% пиперидина в диметилформамиде (ДМФ, ΌΜΕ)) и синтезировать первую пептидную цепь. После этого можно удалить группу А11ос подходящим реагентом (например, Р_б(РРН₃)/4-метилморфолином и хлороформом) и синтезировать вторую пептидную цепь. Эту методику можно использовать для получения димеров, в которых последовательности двух пептидных цепей являются идентичными или разными. Необходимо отметить, что в тех случаях, когда предстоит использовать тиолзащищающие группы для цистеина с целью контроля образования дисульфидных связей (как обсуждается ниже), необходимо применять эту методику, даже если последовательности аминокислот пептидных цепей димера идентичны.

В случае, когда предстоит провести одновременный синтез пептидных цепей димера на линкере, две функциональные аминогруппы линкерной молекулы защищают одной удаляемой аминзащищающей группой. В предпочтительных способах реализации защищенный диамин представляет собой защищенный лизин. Защищенный линкер связывают (сшивают) с твердым носителем через третью функциональную группу линкера. В этом случае две защищенные функциональные группы линкерной молекулы освобождают от защиты одновременно и на двух лишенных защиты аминах одновременно синтезируют две пептидные цепи. Необходимо отметить, что при использовании этой методики пептидные цепи будут идентичны, а все тиолзащищающие группы для остатков цистеина являются одинаковыми.

Предпочтительным способом синтеза пептидов является твердофазный синтез. Процедуры синтеза пептидов в твердой фазе хорошо известны в данной области (см., например, 81е\\'аг1 8о11б РНаке РерЕбе 8уп111екек (изд-во Егеетап апб Со.: 8ап Егапаксо) 1969; каталог 2002/2003 Сепега1 Са1а1од компании №уаЬюс11ет. Согр., 8ап П1едо, И8А (Сан-Диего, США); Сообтап 8уп(Ьек1к о£ Рерйбек апб Рерйботтейск (изд-во НоиЬеп-Аеу1, 81ийдай (Штедгарт)) 2002). В твердофазном синтезе синтез обычно начинают с Сконца пептида, используя α-аминозащищенную смолу. Подходящий исходный материал можно приготовить, например, путем присоединения требуемой α-аминокислоты к хлорометилированной смоле, карбоксиметиловой смоле, полистиреновой смоле, бензгидриламиновой смоле и т.п. Одну из таких хлорометилированных смол продает компания Вю Ваб БаЬогаЮпек (Ричмонд, Калифорния, США) под торговой маркой ВЮ-ВЕАО8 8Х-1. Препарат гидроксиметиловой смолы был описан Вобопк/ку, е1 а1. (1966) СНет. Шб. Ьопбоп 38: 1597. Бензгидриламиновая смола (ВНА) была описана Р1ейа, МагкНа11 (1970) СНет. Соттип. 650, а гидрохлоридная форма доступна коммерчески (Весктап ШкБитеШк, Шс, Пало Альто, Калифорния, США). Например, α-аминозащищенная аминокислота может быть связана с хлорометилированной смолой с помощью бикарбоната цезия (катализатор) согласно способу, описанному у С1кш (1973) Нек. СЫт. Ас1а 56: 1467.

После первоначального связывания α-аминозащищающую группу удаляют, например, используя растворы трифторуксусной кислоты (ТФА, ТРА) или соляной кислоты (НС1) в органических растворителях при комнатной температуре. После этого α-аминозащищенные аминокислоты успешно связываются с растущей пептидной цепью, связанной с носителем. α-Аминозащищающие группы представляют собой те группы, которые применяют в области поэтапного синтеза пептидов, включая защитные группы ацильного типа (например, формил, трифторацетил, ацетил), ароматические защитные группы уретано

- 13 010099 вого типа (например, бензилоксикарбоил (СЬх) и замещенный ΟΡζ), алифатические уретановые защитные группы (например, ΐ-бутилоксикарбонил (Вос), изопропилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил) и защитные группы алкильного типа (например, бензил, трифенилметил), флуоренилметилоксикарбонил (Ртос), аллилоксикарбонил (А11ос) и 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил (Эйс).

Группы, защищающие боковые радикалы (обычно эфиры, сложные эфиры, тритил, РМС и т.п.), остаются неповрежденными в ходе связывания и не отщепляются в ходе удаления защиты Ν-концевых групп или в ходе связывания. Удаление групп, защищающих боковые радикалы, должно становиться возможным после завершения синтеза конечного пептида и при таких условиях реакции, которые не приведут к изменению целевого пептида. Группы, защищающие боковой радикал тироксина, включают тетрагидропиранил, трет-бутил, тритил, бензил, ί','Ρζ. Ζ-ΒΓ-ί'Ρζ и 2,5-дихлоробензил. Группы, защищающие боковой радикал аспарагина, включают бензил, 2,6-дихлоробензил, метил, этил и циклогексил. Группы, защищающие боковой радикал треонина и серина, включают ацетил, бензоил, тритил, тетрагидропиранил, бензил, 2,6-дихлоробензил и ί'δζ. Группы, защищающие боковой радикал аргинина, включают нитрогруппу, тозил (Ток), СЩ, адамантилоксикарбонил, мезитоилсульфонил (М1к), 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфнонил (РЫ), 4-метокси-2,3,6-триметилбензенсульфонил (М1т) или Вос. Группы, защищающие боковой радикал лизина, включают СЩ, 2-хлоробензилоксикарбонил (2-С1-СЩ), 2-бромобензилоксикарбонил (2-Вт-СЩ), Тос или Вос.

После удаления α-аминозащищающих групп остающиеся защищенными аминокислоты поэтапно связывают в желаемом порядке. Обычно проводят реакцию каждой защищенной аминокислоты в примерно 3-кратном избытке, используя подходящий активатор карбоксильной группы, такой как 2-(1Нбензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафлуорофосфат (НВТИ) или дициклогексилкарбодимид (ΌΌΟ), растворенный, например, в хлориде метилена (СН₂С1₂), Ν-метилпирролидоне, диметилформамиде (ΌΜΡ) или их смесях.

После завершения синтеза желательной последовательности аминокислот желательные пептиды отсоединяют от носителя (смолы) путем обработки реагентом, таким как трифторуксусная кислота (ТРА) или фтороводород (НР), который не только отщепляет пептид от смолы, но и отщепляет все оставшиеся группы, защищающие боковые радикалы. В случае использования хлорметилированной смолы в результате обработки фтороводородом получают свободные кислоты пептида. В случае использования смолы, модифицированной бензгидриламином в результате обработки фтороводородом, получают непосредственно свободный амид пептида. В качестве альтернативы в случае применения хлорметилированной смолы пептид с защищенными боковыми радикалами может быть отсоединен путем обработки смолы, к которой присоединен пептид, аммиаком, что дает желаемый амид с защищенными боковыми радикалами, или алкиламином, что дает свободные алкиламид или диалкиламид с защищенными боковыми радикалами. Затем защиту боковых радикалов удаляют обычным способом путем обработки фтороводородом, что дает в результате амиды алкиламидов или диалкиламидов. При приготовлении сложных эфиров согласно данному изобретению применяют смолы, используемые для приготовления кислот пептидов, а пептиды с защищенными боковыми радикалами отщепляют основанием или соответствующим спиртом (например, метанолом). Затем группы, защищающие боковые радикалы, удаляют обычным способом путем обработки фтороводородом, в результате чего получают желаемый эфир.

Эти процедуры можно также применять для синтеза пептидов, в которых произведены замены 20 встречающихся в природе генетически кодируемых аминокислот на другие аминокислоты в одной, двух или более позициях соединения согласно данному изобретению. Синтетические аминокислоты, которые могут быть введены путем замены в пептиды согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, Ν-метил, Ь-гидроксипропил, Ь-3,4-дигидроксифенилаланин, δ-аминокислоты, такие как Τ-δ-гидроксилизил, Ό-δ-метилаланинил, Ь-а-метилаланил, β-аминокислоты и изоквинолил. Не встречающиеся в природе синтетические аминокислоты могут также быть введены в пептиды согласно настоящему изобретению.

Модификация пептидов

Также можно модифицировать амино- и/или карбоксильные концы пептидных соединений согласно настоящему изобретению для того, чтобы получить другие соединения согласно данному изобретению. Модификации аминоконца включают метилирование (например, -ЫНСН₃ или -Ν(ΟΗ₃)₂), ацетилирование (например, уксусной кислотой или ее галогенпроизводными, такими как а-хлоруксусная кислота, α-бромуксусная кислота или α-йодуксусная кислота), добавление бензилоксикарбонильной (ί'δζ) группы или блокирование Ν-конца блокирующей группой, содержащей карбоксилатную функциональную группу, обозначенную ВСОО-, или сульфонильную функциональную группу, обозначенную В-§0₂-, где В выбирают из алкильной, арильной, гетероарильной, алкил-арильной, а также подобных им и аналогичных групп. Также можно ввести дезаминокислоту в Ν-конец (таким образом на нем будет отсутствовать Ν-концевая аминогруппа), чтобы снизить чувствительность к протеазам или чтобы ограничить разнообразие конформаций пептидного соединения. В предпочтительных способах реализации Ν-конец подвергнут ацетилированию, в результате которого получают Ν-ацетилглицин (АсО).

Модификации С-конца включают замену свободных аминокислот карбоксамидной группой или об

- 14 010099 разование циклического лактама на С-конце с целью введения структурных ограничений. Можно также подвергать пептиды согласно данному изобретению циклизации или вводить деамино- или декарбоксиостаток на концах пептида таким образом, чтобы на концах отсутствовала концевая амино- или карбоксильная группа, с целью снизить чувствительность к действию протеаз или чтобы ограничить разнообразие конформаций пептида. С-Концевые функциональные группы соединения согласно настоящему изобретению включают амиды, амиды низших алкилов, ди(низший алкил)амиды, низшие алкокси-, гидрокси- и карбоксигруппы, а также их производные с низшими эфирами и их фармацевтически приемлемые соли.

Можно заменить встречающиеся в природе боковые радикалы 20 генетически кодируемых аминокислот (или стереоизомерических Ό-аминоксилот) другими боковыми радикалами, например такими группами, как алкильные группы, низшие алкилы, циклические 4-, 5- , 6- до 7-членные алкилы, амиды, низший алкил-амид-, низшие алкокси-, гидрокси-, карбоксигруппы и их производные с низшими эфирами, а также 4-, 5-, 6- до 7-членные гетероциклические группы. В частности, можно применять аналоги пролина, в которых размер кольца остатка пролина измененили с 5-членного на 4-, 6- или 7-членное. Циклические группы могут являться насыщенными или ненасыщенными, а ненасыщенные - ароматическими или неароматическими. Гетероциклические группы предпочтительно содержат следующие гетероатомы (один или более): азот, кислород и/или серу. Примеры таких групп включают фуразанил-, фуранил-, имидазолидил-, имидазолил-, имидазолил-, изотиазолил-, изоксазолил-, морфолинил- (например, морфолино-), оксазолил-, пиперазинил- (например, 1-пиперазниил-), пиперидил- (например, 1-пиперидил-, пиперидино-), пиранил-, пиразинил-, пиразолидил-, пиразонил-, пиразолинил-, пиридазинил-, пиридил-, пиримидинил-, пирролидинил- (например, 1-пирролидинил-), пирролинил-, пирролил-, тиадиазолил-, тиазолил-, тиенил-, тиоморфолинил- (например, тиоморфолино-) и триазолилгруппы. Эти гетероциклические группы могут являться замещенными или незамещенными. В случае замещенной группы заместитель может представлять собой алкил, алкоксигруппу, галоген, кислород либо замещенный или незамещенный фенил.

Можно также без труда модифицировать пептиды путем фосфорилирования и другими способами (например, как описано в НгиЬу е! а1. (1990) ВюсНет. I. 268: 249-262).

Пептидные соединения согласно данному изобретению могут также служить структурной моделью непептидных соединений со сходной биологической активностью. Специалисты в данной области осознают, что доступно множество методик, позволяющих конструировать соединения с биологической активностью, идентичной или аналогичной активности пептидного соединения-образца, но с более подходящей, чем у образца, активностью в отношении растворимости, стабильности и подверженности гидролизу и протеолизу (см. Могдап апб Сашог (1989) Апп. Вер. Меб. СНет. 24: 243-252). Эти методики включают замену пептидного остова остовом, составленным из фосфонатов, амидатов, карбаматов, сульфонамидов, вторичных аминов и Ν-метиламинокислот.

Образование дисульфидных связей

Соединения согласно настоящему изобретению могут содержать одну или более внутримолекулярных дисульфидных связей. В одном способе реализации пептидный мономер или димер содержит по меньшей мере одну внутримолекулярную дисульфидную связь. В предпочтительных способах реализации пептидный димер содержит две внутримолекулярные дисульфидные связи.

Такие дисульфидные связи могут быть образованы при окислении остатков цистеина коровой последовательности пептида. В одном из способов реализации образование связей между остатками цистеина контролируют, выбирая тип и концентрацию окисляющего вещества таким образом, чтобы эффективно оптимизировать образование желательного изомера. Например, окисления пептидного димера с преимущественным (по сравнению с образованием межмолекулярных дисульфидных связей) образованием двух внутримолекулярных дисульфидных связей (по одной в каждой пептидной цепи) достигают, когда окисляющее вещество представляет ДМСО (ЭМ8О).

В предпочтительных способах реализации образование связей между остатками цистеина контролируют путем выборочного применения тиолзащищающих групп в ходе синтеза пептидов. Например, если желательно получить димер с двумя внутримолекулярными дисульфидными связями, цепь первого мономера пептида синтезируют с двумя остатками цистеина коровой последовательности, защищенными первой тиолзащищающей группой (например, тритильной (Тй), аллилоксикарбонильной (А11ос), 1-(4,4диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этильной (Эбе) и т.п.), затем синтезируют второй мономер пептида с двумя остатками цистеина в основной последовательности, защищенными второй тиолзащищающей группой, отличной от первой тиолзащищающей группы (например, ацетамидометильной (Аст), Iбутильной (!Ви) и т.п.). После этого первую тиолзазищающую группу удаляют, что вызывает бисульфидную циклизацию первого мономера, а затем удаляют вторую тиолзащищающую группу, что вызывает бисульфидную циклизацию второго мономера.

В других способах реализации данного изобретения предусмотрены аналоги этих дисульфидных производных, в которых один из атомов серы был заменен на группу СН₂ или другой изотер серы. Эти аналоги могут быть приготовлены из соединений согласно настоящему изобретению, в которых каждая основная последовательность содержит по меньшей мере один остаток С или гомоцистемина и α-амино

- 15 010099 γ-масляную кислоту вместо второго остатка цистеина, путем внутримолекулярного или межмолекулярного замещения, которое производят известными в данной области способами (см., например, Вагкег, е! а1. (1992) 1. Меб. Сйет. 35: 2040-2048 и Ог, е! а1. (1991) 1. Огд. Сйет. 56: 3146-3149). Специалист в данной области легко поймет, что этого замещения может также добиться, используя другие гомологи αамино^-масляной кислоты и гомосерина.

В дополнение к описанным выше стратегиям циклизации, можно применять другие стратегии циклизации пептидов, не связанные с образованием дисульфидных связей. Такие альтернативные стратегии циклизации включают, например, стратегии амидной циклизации наравне со стратегиями, связанными с образованием тиоэфирных связей. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению могут существовать в циклической форме либо с внутримолекулярной амидной связью, либо с внутримолекулярной тиоэфирной связью. Например, может быть синтезирован пептид, в котором один цистеин основной последовательности заменен на лизин, а второй цистеин заменен на глютаминовую кислоту. После этого циклический мономер может быть образован посредством образования амидной связи между боковыми радикалами этих двух остатков. В качестве альтернативы может быть синтезирован пептид, в котором один цистеин основной последовательности заменен на лизин. Затем циклический мономер может быть образован посредством образования тиоэфирной связи между боковыми радикалами остатка лизина и второго остатка цистеина основной последовательности. По существу, в дополнение к стратегиям дисульфидной циклизации для циклизации пептидов согласно настоящему изобретению, можно без труда применять как стратегию амидной циклизации, так и стратегию тиоэфирной циклизации. В качестве альтернативы к Νконцу пептида может быть присоединена α-замещенная уксусная кислота (кэппирование конца пептида), где α-замещенной уксусная кислота представляет собой отделяемую группу, такую как α-галоуксусная кислота, например α-хлороуксусная кислота, α-бромоуксусная кислота или α-йодоуксусная кислота.

Добавление линкеров

В тех способах реализации, где пептиды димера димеризуют при помощи линкерного Ь_к фрагмента, указанный линкер может быть введен в пептид в ходе синтеза пептида. Например, если линкерный Ь_к фрагмент содержит две функциональные группы, которые могут служить сайтами инициации для синтеза пептида, и третью функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая обеспечивает связывание с другим молекулярным фрагментом, линкер может быть конъюгирован с твердым носителем. После этого можно синтезировать два пептидных мономера непосредственно на двух химически активных группах азота линкерного Ь_к фрагмента (вариант методики твердофазного синтеза).

В альтернативных способах реализации, в которых димер димеризован при помощи линкерного Ь_к фрагмента, указанный линкер может быть конъюгирован с двумя пептидными мономерами пептидного димера после синтеза пептидов. Такая конъюгация может быть достигнута способами, хорошо разработанными в данной области. В одном из способов реализации линкер содержит по меньшей мере две функциональные группы, подходящие для присоединения к функциональным группам-мишеням синтезированных пептидных мономеров. Например, может быть проведена реакция линкера с двумя свободными аминогруппами с С-концевыми карбоксильными группами каждого из двух пептидных мономеров. В другом примере может быть проведена реакция линкера, содержащего две карбоксильные группы, либо если эти группы предварительно активированы, либо в присутствии подходящего связывающего реагента, с аминогруппами Ν-конца или бокового радикала, либо С-концевыми амидами лизина каждого из двух пептидных мономеров.

Добавление спейсера

В тех способах реализации, где пептидные соединения содержат спейсерный фрагмент, указанный спейсер может быть введен в пептид в ходе синтеза пептида. Например, если спейсер содержит свободную аминогруппу и вторую функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая дает возможность связывания с другим молекулярным фрагментом, спейсер может быть конъюнгирован с твердым носителем. После этого пептид может быть синтезирован непосредственно на свободной аминогруппе спейсера по стандартным методикам твердофазного синтеза.

В предпочтительном способе реализации спейсер, содержащий две функциональные группы, вначале связывают с твердым носителем через первую функциональную группу. Затем лизиновый линкерный Ь_к фрагмент, имеющий две функциональные группы, которые могут служить сайтами инициации синтеза пептидов, и третью функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая обеспечивает связывание с другим молекулярным фрагментом, конъюгируют со спейсером через вторую функциональную группу спейсера и третью функциональную группу линкера. После этого можно синтезировать два пептидных мономера непосредственно на двух химически активных азотных группах лизинового линкерного Ь_к фрагмента (вариант методики твердофазного синтеза). Например, можно провести реакцию связанного с твердым носителем спейсера со свободной аминогруппой с лизиновым линкером через свободную карбоксильную группу линкера.

В альтернативных способах реализации, где пептидные соединения содержат спейсерный фрагмент, указанный спейсер может быть конъюгирован с пептидом после синтеза пептидов. Такая конъюгация может быть достигнута способами, хорошо разработанными в данной области. В одном из способов

- 16 010099 реализации спейсер содержит по меньшей мере одну функциональную группу, подходящую для присоединения к функциональной группе-мишени синтезированного пептида. Например, может быть проведена реакция спейсера со свободной аминогруппой с С-концевой карбоксильной группой пептида. В другом примере может быть проведена реакция спейсера со свободной карбоксильной группой со свободной аминогруппой Ν-конца пептида или остатка лизина. Еще в одном примере спейсер, содержащий свободную сульфгидрильную группу, может быть конъюгирован с остатком цистеина пептида путем окисления с целью образования дисульфидной связи.

Присоединение водорастворимых полимеров

В последние годы водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль, применяют для ковалентной модификации диагностически и терапевтически важных пептидов. Считается, что присоединение таких полимеров увеличивает биологическую активность, продлевает время циркуляции в крови, снижает иммуногенность, увеличивает растворимость в воде и повышает устойчивость к расщеплению протеазами. Например, сообщалось, что ковалентное присоединение ПЭГ к терапевтическим пептидам, таким как интерлейкины (КпаиГ, е! а1. (1988) I. Бю1. СЬет. 263; 15064; Тки!кит1, е! а1. (1995) I. Соп!го11еб Ке1еаке 33: 447), интерфероны (Кйа, е! а1. (1990) Эгид Эек. Ое1гуегу 6: 157), каталаза (АЬисЬо^кк1, е! а1. (1977) I. В1о1. СЬет. 252: 582), супероксид дисмутаза (ВеаисЬатр, е! а1. (1983) Апа1. ВюсЬет. 131: 25) и аденозин деаминаза (СЬеп, е! а1. (1981) Вюс1ит. ВюрЬу. Ас!а 660: 293), увеличивает время их полужизни 1п угуо и/или снижает их иммуногенность и антигенность.

Пептидные соединения согласно данному изобретению могут, кроме того, содержать один или более фрагментов водорастворимых полимеров. Предпочтительно эти полимеры ковалентно присоединены к пептидным соединениям. Водорастворимый полимер может представлять собой, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ, РЕО), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры), поли(п-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры оксида полипропилена и оксида этилена и полиоксиэтилированные высокомолекулярные спирты. Предпочтительным водорастворимым полимером является ПЭГ.

Пептиды, димеры пептидов и другие молекулы на основе пептидов согласно данному изобретению могут быть присоединены к водорастворимым полимерам (например, ПЭГ) при помощи разнообразных химических составов, которые связывают водорастворимый полимер(ы) с рецепторсвязывающей частью молекулы (например, пептид+спейсер). В обычном способе реализации для ковалентного присоединения водорастворимого полимера(ов) к рецепторсвязывающей части задействовано единственное место (сайт) присоединения. Однако в альтернативных способах реализации можно применять связывание во множественных сайтах присоединения, включая дальнейшие варианты, в которых разные виды водорастворимых полимеров присоединяют к рецепторсвязывающей части в разных сайтах присоединения, которые могут включать сайты ковалентного присоединения (присоединений) к спейсеру и/или одной или обеим пептидным цепям. В некоторых способах реализации димер или более крупный мультимер будет содержать различные виды пептидных цепей (т.е. будет представлять собой гетеродимер или другой гетеромультимер). В качестве примера, но не ограничения, димер может содержать одну пептидную цепь, имеющую сайт присоединения ПЭГ, а у второй пептидной цепи может либо отсутствовать сайт присоединения ПЭГ, либо для присоединения может быть использована связь не такого, как в первой цепи, химического состава. В некоторых вариантах спейсер может содержать или не содержать сайт присоединения ПЭГ, а если к указанному присоединен ПЭГ, для присоединения может быть использована связь не такого, как в первой и/или второй пептидной цепи, химического состава. В альтернативном способе реализации используют ПЭГ, присоединенный к спейсерной части рецепторсвязывающей части, а другой водорастворимый полимер (например, углеводород) конъюгирован с боковым радикалом одной из аминокислот пептидной части молекулы.

Для присоединения ПЭГ (ПЭГилирования) к рецепторсвязывающей части (пептиды+спейсер) может быть использовано множество разных видов полиэтиленгликоля (ПЭГ). Можно использовать практически любой подходящий химически активный реагент ПЭГ. В предпочтительных способах реализации применение химически активного реагента ПЭГ приведет к образованию карбаматной или амидной связи после конъюгирования с рецепторсвязывающей частью. Подходящие химически активные виды ПЭГ включают, без ограничения, коммерчески доступные реагенты, которые можно приобрести по каталогу Эгид Ое1гуегу 8ук1етк (2003) корпорации ΝΟΡ Согрогайоп ^еЫки Оагбеп Р1асе То^ег, 20-3 ЕЫки 4сЬоте, 8ЫЬиуа-ки, Токуо 150-6019) и каталогу Мо1еси1аг Епдшеппд 2003 компании №с!аг ТЬегареийск (490 О|ксоуегу Опус, Нип!куШе, А1аЬата 35806). В качестве примера, но не ограничения, здесь приводятся следующие часто предпочитаемые в разных способах реализации реагенты ПЭГ: т-РЕО2-НН8, тРЕО2-АЬП, тиШ-Агт РЕО, тРЕО(МАЬ)2, тРЕО(МАЬ), т-РЕО2-МН2, тРЕО-8РА, тРЕО-8ВА, тРЕО-!Ыоек!егк (тиоэфиры), тРЕО-ОоиЬ1е Ек!егк, тРЕО-ВТС, тРЕО-Вц^гАВП, тРЕО-АСЕТ, гетерофункциональные ПЭГ (НН2-РЕО-СООН, Вос-РЕО-МН8, Ртос-РЕО-Х! 18, ИН8-РЕО^8, МН8-РЕО-МАЬ), акрилаты ПЭГ (АСК^-РΕО-NΗ8), ПЕГ-фосфодилипиды (например, тРЕО-Э8РЕ), многолучевые ПЭГ серии 8υNВК1ΤΕ, включая серию ОЬ глицериновых ПЭГ, активированных химическим составом, вы

- 17 010099 бранным специалистом, любой из активированных ПЭГ серии 8υΝΒΚ1ΤΕ (включая, без ограничения, карбоксил-ПЭГи, р-ОТ-РЕСк, ТтекуйРЕСк, альдегид ПЭГи, ацеталь-ПЭГи, амино-ПЭГи, тиол-ПЭГи, имид-малеиновые ПЭГи, гидроксил-ПЭГ-амин, амино-ПЭГ-СООН, гидроксил-ПЭГ-альдегид, ПЭГ карбоксильно-ангидридного типа, функционализированные фосфолипид-ПЭГ и другие аналогичные и/или подходящие химически активные ПЭГ, выбираемые специалистами в данной области для конкретного применения и использования.

Полимер может иметь любую молекулярную массу, а также быть разветвленным или неразветвленным. Предпочтительный ПЭГ для использования в настоящем изобретении включает линейный неразветвленный ПЭГ, имеющий молекулярную массу от примерно 20 до примерно 40 кДа (примерно указывает на то, что в препаратах ПЭГ некоторые молекулы будут иметь массу больше, а некоторые меньше, чем указанные молекулярные массы). Наиболее предпочтительно ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 30 до 40 кДа. В зависимости от желаемого терапевтического профиля (например, желательная продолжительность отложенного высвобождения, воздействие, если оно есть, на биологическую активность, степень антигенности или ее отсутствие, а также другие известные воздействия ПЭГ на терапевтический пептид) могут быть использованы и другие размеры.

Число присоединенных молекул полимера может быть различным, например к пептиду-агонисту ЭПО-рецептора согласно данному изобретению могут быть присоединены 1, 2, 3 или больше молекул водорастворимых полимеров. Множественные присоединенные полимеры могут представлять собой один и тот же или разные химические компоненты (например, полиэтиленгликоли разной молекулярной массы). В некоторых случаях на степень присоединения полимера (число фрагментов полимера, присоединенных к пептиду, и/или общее число пептидов, к которым присоединен полимер) могут оказывать влияние соотношение количества молекул полимера относительно молекул пептида в реакции присоединения ПЭГ, а также общая концентрация каждого из этих компонентов в реакционной смеси. Обычно оптимальное отношение полимера к пептиду (в терминах эффективности реакции для того, чтобы избежать избытка непрореагировавших пептидов и/или фрагментов полимера) будет определяться такими факторами, как желаемая степень ПЭГилирования (например, моно-, ди-, три- и т.д.), молекулярная масса выбранного полимера, является ли полимер разветвленным или неразветвленным и условия реакции для конкретного способа присоединения.

В предпочтительных способах реализации ковалентно присоединяемый водорастворимый полимер представляет собой ПЭГ. В иллюстративных целях ниже описаны примеры способов ковалентного присоединения ПЭГ (ПЭГилирования). Эти иллюстративные описания не предназначены быть ограничивающими. Среднему специалисту в данной области будет понятно, что в данной области хорошо разработано множество различных способов присоединения разнообразных водорастворимых полимеров. По существу, настоящее изобретение охватывает пептидные соединения, к которым любым известным в данной области способом присоединения присоединено любое число водорастворимых полимеров.

В одном из способов реализации ПЭГ может служить линкером, который объединяет два мономера пептидов в димер. В одном из способов реализации ПЭГ присоединен по меньшей мере к одному из концов (Ν-концу или С-концу) пептидного мономера или димера. В другом способе реализации ПЭГ присоединен к спейсерному фрагменту пептидного мономера или димера. В предпочтительном способе реализации ПЭГ присоединен к линкерному фрагменту пептидного димера. В особенно предпочтительном способе реализации ПЭГ присоединен к спейсерному фрагменту, где указанный спейсерный фрагмент присоединен к линкерному Ь_к фрагменту, который соединяет мономеры пептидного димера. Наиболее предпочтительно ПЭГ присоединен к спейсерному фрагменту, где указанный спейсерный фрагмент присоединен к пептидному димеру через атом углерода карбонильной группы лизинового линкера или амидный атом азота линкера на основе амида лизина.

Существует ряд доступных специалисту в данной области способов присоединения ПЭГ (см., например, Сообкоп, е! а1. (1990) В1о/Тесйпо1оду 8: 343 (пегилирование интерлейкина-2 в сайте гликозилирования после сайт-направленного мутагенеза); ЕР 0401384 (присоединение ПЭГ к Г-КСФ); Майк, е! а1., (1992) Ехр. Нета!о1. 20: 1028-1035 (пегилирование ГМ-КСФ при помощи трезилхлорида); публикация РСТ РиЬ. №. \УО 90/12874 (пэгилирование эритропоэтина, содержащего введенный по рекомбинантной технологии остаток цистеина при помощи цистеин-специфической производной мПЭГ); патент США υ.8. Ра!. №. 5757078 (пэгилирование пептидов ЭПО) и патент США υ.8. Ра!. №. 6077939 (пэгилирование Ν-концевого α-углерода пептида)].

Например, ПЭГ может быть ковалентно связан с остатками аминокислот через химически активную группу. Химически активными являются те группы, с которыми может быть связана активированная молекула ПЭГ (например, свободная аминогруппа или карбоксильная группа). Например, Ν-концевые остатки аминокислот и остатки лизина (к) имеют свободную аминогруппу, а С-концевые остатки аминокислот имеют свободную карбоксильную группу. В качестве химически активных групп для присоединения ПЭГ могут также быть использованы сульфгидрильные группы (например, такие, как в остатках цистеина). В дополнение были описаны способы введения активированных групп при помощи ферментов (например, гидразидных, альдегидных и ароматических аминогрупп), в частности, в С-конец полипептида (8сйетата, е! а1. (1990) Ме!йобк Εηζутο1. 184: 160; Коке, е! а1. (1991) В1осоп)ида!е Сйет. 2: 154;

- 18 010099

Саейпет, е1 а1. (1994) I. Вю1. Сйет. 269: 7224).

Например, молекулы ПЭГ могут быть присоединены к аминогруппам пептида при помощи метоксилированного ПЭГ (мПЭГ, тРЕС), имеющего различные химически активные фрагменты. Такие полимеры включают мПЭГ-сукцинимидил сукцинат, мПЭГ-сукцинимидил карбонат, мПЭГ-имидат, мПЭГ-4нитрофенил и хлорид мПЭГ-цианмочевой кислоты. Аналогично, молекулы ПЭГ могут быть присоединены к карбоксильным группам пептида при помощи метоксилированного ПЭГ со свободной аминогруппой (мПЭГ-ΝΗ^ тРЕС-ΝΗ:).

В тех случаях, когда присоединение ПЭГ является неспецифическим, но желательно получить пептид, содержащий специфическое присоединение ПЭГ, желаемое ПЭГилированное соединение может быть выделено из смеси ПЭГилированных соединений путем очистки. Например, если желательным является пептид, ПЭГилированный на Ν-конце, ПЭГилированная на Ν-конце форма может быть выделена путем очистки из популяции случайным образом ПЭГилированных пептидов (например, разделением этого фрагмента и других моно-ПЭГилированных фрагментов).

В предпочтительных способах реализации присоединение ПЭГ к пептиду является сайт-специфическим. Было проведено сайт-специфическое пегилирование Ν-конца, бокового радикала и С-конца эффективного аналога релизинг-фактора гормона роста путем твердофазного синтеза (Рейх, е1 а1. (1995) ШЕ I. Рерййе Рто1ей1 Яек. 46: 253). Другой сайт-специфический метод включает сайт-специфическое присоединение пептида к концам выступающих с поверхности липосомы цепей ПЭГ через химически активную альдегидную группу на Ν-конце, полученную окислением периодатом натрия Ν-концевого треонина (2айр§ку, е1 а1. (1995) Вюсои). Сйет. 6: 705). Однако применение этого метода ограничено полипептидами с Ν-концевыми остатками треонина или серина. Другой сайт-специфический способ присоединения ПЭГ к Ν-концу пептида при помощи связи через гидразон, восстановленный гидразон, оксим или восстановленный оксим описан в патенте США И.8. Ра1. Νο. 6077939 (^е1, е1 а1.).

В одном из методов селективное Ν-концевое ПЭГилирование может быть выполнено путем восстановительного алкилирования, использующего различную химическую активность разных типов доступных для дериватизации первичных аминогрупп (лизина по сравнению с Ν-концевой) конкретного белка. В подходящих реакционных условиях содержащий карбонильную группу ПЭГ селективно присоединяется к Ν-концу пептида. Например, можно селективно ПЭГилировать пептид на Ν-конце путем проведения реакции при таком рН, который позволяет использовать разницу между рК_а ε-аминогрупп остатков лизина и α-аминогруппы Ν-концевого остатка пептида. Благодаря такому селективному присоединению ПЭГилирование происходит преимущественно на Ν-конце белка без существенного изменения других химически активных групп (например, аминогрупп бокового радикала лизина). При использовании восстановительного алкилирования нужно, чтобы ПЭГ содержал единственную химически активную альдегидную группу для связывания с белком (например, можно использовать ПЭГ пропиональдегид).

Следующим подходом, который может быть использован для приготовления пептидов для сайтспецифического присоединения полимеров, является сайт-специфический мутагенез. Согласно этому методу последовательность аминокислот пептида конструируют таким образом, чтобы в нее в желаемом положении пептида была введена подходящая химически активная группа. Например, в \УО 90/12874 описано сайт-специфическое ПЭГилирование белков, модифицированных путем вставки остатков цистеина или замены других остатков на остатки цистеина. В этой публикации также описано приготовление мПЭГ-эритропоэтина (мПЭГ-ЭПО, тРЕС-ЕРО) путем проведения реакции цистеин-специфической производной мПЭГ с введенными рекомбинантными методами остатками цистеина ЭПО.

В случае, когда фрагменты ПЭГ присоединяют к спейсерному фрагменту или линкерному фрагменту, могут быть использованы аналогичные способы присоединения. В этом случае линкер или спейсер содержит химически активную группу, а для того, чтобы вызвать ковалентное присоединение, используют активированную молекулу ПЭГ, содержащую подходящую комплементарную активную группу. В предпочтительных способах реализации химически активная группа линкера или спейсера содержит терминальную химически активную группу (т.е. расположенную на конце линкера или спейсера), которая реагирует с подходящим образом активированной молекулой ПЭГ, в результате чего образуется стабильная ковалентная связь, такая как амидная или карбаматная. Активированные подходящим образом виды ПЭГ включают, без ограничения, мПЭГ-паранитрофенилкарбонат (тРЕС-ЫРС), мПЭГсукцинимидилсукцинат (тРЕС-88), мПЭГ-сукцинимидилкарбонат (мПЭГ-СК, тРЕС-8С) и мПЭГсукцинимидилпропионат (тРЕС-8РА). В других предпочтительных способах реализации химически активная группа линкера или спейсера содержит карбоксильную группу, которая может быть активирована для образования ковалентной связи с аминсодержащей молекулой ПЭГ при подходящих условиях реакции. Подходящие молекулы ПЭГ включают тРЕС-ЫН₂, а подходящие реакционные условия включают карбодиимид-опосредованное образование амидов или ему подобные.

Способы анализа активности агонистов ЭПО-рецепторов Функциональные способы анализа ίη νίΐτο

В ходе анализов конкурентного связывания ίη νίΐτο количественно определяют способность тестируемого пептида конкурировать с ЭПО за связывание с ЭПО-рецептором. Например (см., например, опи

- 19 010099 сание в патенте США и.8. Ра1еп1 5733569), внеклеточный домен ЭПО-рецептора человека (ЭПО-связывающий белок, ЭСБ) может быть получен по технологии рекомбинантных ДНК в клетках Е. сой, а рекомбинантный белок связан с твердым носителем (подложкой), таким как микротитрационный планшет или синтетическая гранула (йеаб) (например, 8и1Го11пк йеабк от Р1егсе Сйет1са1 Со. (Рокфорд, Иллинойс, США)). Затем иммобилизованный ЭСБ инкубируют с меченым рекомбинантным ЭПО либо с меченым рекомбинантным ЭПО и тестируемым пептидом. В таких экспериментах применяют серийные разведения тестируемого пептида. По результатам анализа без добавления тестируемого пептида определяют полное связывание ЭРО с ЭСБ. Для реакций, в которых присутствует тестируемый пептид, определяют количество связанного ЭПО и выражают его в процентных долях от связывания контроля (полное связывание=100%). Строят график, на котором эти значения откладывают против концентрации пептида. Значение 1С₅о определяют как концентрацию тестируемого пептида, при которой связывание ЭПО с ЭСБ уменьшается на 50% (т.е. 50% ингибирование связывания ЭПО).

В другом способе анализа конкурентного связывания ίη νίίτο измеряют световой сигнал, генерируемый как функция близости двух гранул: ЭПО-конъюгированной гранулы и ЭПО-рецептор-конъюгированной гранулы. Близость гранул порождается связыванием ЭПО и ЭПО-рецептора. Тестируемый пептид, который конкурирует с ЭПО за связывание с ЭПО-рецептором, будет препятствовать этому связыванию, вызывая уменьшение свечения. Концентрацию тестируемого пептида, при которой происходит ослабление свечения на 50%, определяют как значение 1С₅₀.

Пептиды согласно настоящему изобретению очень эффективно конкурируют с ЭПО за связывание с ЭПО-рецепторами. Проявлением этой усиленной функции является их способность ингибировать связывание ЭПО в очень низких концентрациях (т.е. они обладают очень низкими значениями 1С₅₀).

Биологическую активность и эффективность мономерных и димерных пептидов-агонистов ЭПО-рецептора согласно данному изобретению можно измерить, используя способы функционального анализа в клеточных системах.

Один из способов анализа основан на применении линии предшественников В-клеток, экспрессирующих ЭПО-рецептор человека и трансфецированных конструкцией, содержащей репортерный ген люциферазы под контролем промотора Го5. На воздействие ЭПО или другого агониста ЭПО-рецептора такие клетки отвечают синтезом люциферазы. При добавлении к своему субстрату, люциферину, люцифераза вызывает свечение. Следовательно, уровень активации ЭПО-рецепторов в таких клетках можно количественно определить, измеряя активность люциферазы. Активность тестируемого пептида измеряют путем добавления серийных разведений тестируемого пептида к клеткам, которые затем инкубируют в течение 4 ч. После инкубации к клеткам добавляют субстрат - люциферин - и измеряют интенсивность свечения. Концентрацию тестируемого пептида, при которой интенсивность свечения равна половине максимального значения, заносят в протокол как ЕС₅₀.

Пептиды согласно настоящему изобретению демонстрируют в этом способе анализе существенно повышенную способность усиливать зависимую от передачи сигнала с ЭПО-рецептора экспрессию люциферазы. Проявлением этой усиленной функции является их способность давать интенсивность свечения, равную половине максимального значения, при существенно более низких концентрациях пептида (т.е. они обладают очень низкими значениями ЕС₅₀). Этот анализ является предпочтительным способом оценки эффективности и активности пептида-агониста ЭПО-рецептора согласно данному изобретению.

Можно провести другой анализ, используя клетки линии ЕИС-Р1-ЕВ (Иех!ег, е1 а1. (1980) 1. Ехр. Меб. 152: 1036-1047), хорошо описанной ^трансформированной клеточной линии, полученной из костного мозга мыши, в которую был стабильно трансфецирован ЭПО-рецептор. Эти клетки демонстрируют ЭПО-зависимую пролиферацию.

В одном из таких способов анализа клетки выращивают до получения половины стационарной плотности в присутствии необходимых факторов роста (см., например, описание в патенте США и.8. Ра1еп1 5773569). Затем клетки промывают ФБР и оставляют на 16-24 ч в полной среде без факторов роста (голодание). После определения жизнеспособности клеток (например, окрашиванием трипановым синим) готовят маточные (штоковые) растворы (в полной среде без факторов роста) с концентрацией примерно 10 клеток на 50 мкл. Готовят серийные разведения пептидных соединений-агонистов ЭПО-рецептора (обычно свободный пептид в фазе раствора, в отличие от фаг-связанного или иммобилизованного пептида), которые необходимо протестировать, в 96-луночном планшете для культур тканей; конечный объем разведений - 50 мкл в каждой лунке. В каждую лунку добавляют клетки (50 мкл), клетки инкубируют в течение 24-48 ч, после чего клетки в негативных контролях должны перейти в состояние покоя или прекратить деление. Затем измеряют клеточную пролиферацию, применяя хорошо известные в данной области методики, такие как тест с МТТ, в котором определяют включение Н³-тимидина в качестве индикатора клеточной пролиферации (см. Моктапп (1983) 1. 1ттипо1. Ме1йоб5 65: 33-63). Пептиды тестируют как на линии клеток, экспрессирующих ЭПО-рецептор, так и на родительской, неэкспрессирующей клеточной линии. Концентрацию тестируемого пептида, необходимую для того, чтобы получить половину максимальной клеточной пролиферации, вносят в протокол как ЕС₅₀.

Пептиды согласно настоящему изобретению демонстрируют существенно повышенную способность стимулировать клеточную пролиферацию. Проявлением этой усиленной функции является их спо

- 20 010099 собность давать половину максимальной пролиферации при существенно более низких концентрациях пептида (т.е. они обладают очень низкими значениями ЕС₅₀). Этот способ анализа является предпочтительным способом оценки эффективности и активности пептида-агониста ЭПО-рецептора согласно данному изобретению.

В другом способе анализа клетки выращивают до стационарной фазы в среде, дополненной ЭПО, собирают, а затем культивируют в течение дополнительных 18 ч в среде без ЭПО. Клетки делят на три группы с равной плотностью клеток: одна группа без добавления фактора (отрицательный контроль), группа с ЭПО (положительный контроль) и экспериментальная крупа с тестируемым пептидом. Затем в разные моменты времени культивируемые клетки собирают, фиксируют и красят ДНК-связывающим флуоресцентным красителем (например, коммерчески доступными (81дта) йодидом пропидия или красителем Ноес1151). Затем измеряют флуоресценцию, например, на поточном сканирующем цитометре РАС8. Процентное отношение клеток в каждой фазе клеточного цикла можно определить, например, используя модель 8ОВВ программного пакета Са11Р1! (Вес!оп Оюктзоп). Клетки, обработанные ЭПО или активным пептидом, демонстрируют увеличенную по сравнению с группой отрицательного контроля долю клеток в фазе 8 (что определяется по повышенной флуоресценции (индикатор повышенного содержания ДНК)).

Аналогичные тесты могут быть проведены с использованием клеточных линий РЭСР-1 (см., например., Эех1ег е! а1. (1980) I. Ехр. Мей. 152: 1036-1047) или ТР-1 (Кйатцга, е! а1. (1989) В1оой 73: 375-380). РЭСР-1 представляет собой линию зависимых от фактора роста мультипотентных примитивных гематопоэтических клеток-предшественников, способных к пролиферации, но не к дифференцировке, в среде, кондиционированной добавлением νΕΗΙ-3 (среда, которая содержит интерлейкин 1Ь-3, коллекция АТСС номер Т1В-68). Для таких экспериментов клетки линии РЭСР-1 трансфецируют ЭПО-рецептором человека или мыши, в результате чего получают клеточные линии РОСР-1-11ЕРО-В или РПСР-1-тЕРО-В, соответственно, способные к пролиферации, но не к дифференцировке, в присутствии ЭПО. ТР-1-ЭПОзависимая клеточная линия может также быть использована для измерения воздействия пептидных агонистов ЭПО-рецептора на пролиферацию клеток.

Еще в одном способе анализа для выяснения способности соединений согласно настоящему изобретению служить агонистами ЭПО может быть использована процедура, изложенная в Кгу§!а1 (1983) Ехр. Нета!о1. 11: 649-660 для микроанализа, основанного на включении Н³-тимидина в клетки селезенки. Вкратце, мышам В6С3Р1 вводят ежедневно в течение 2 дней путем инъекции фенилгидразин (60 мг/кг). На третий день берут клетки селезенки и путем анализа с МТТ выясняют их способность пролиферировать в течение 24 ч.

Связывание ЭПО с ЭПО-рецептором в эритрорпоэтин-чувствительных клетках индуцирует фосфорилирование остатков тирозина как рецептора, так и многочисленных внутриклеточных белков, включая киназы 811е, уау и 1АК2. Соответственно, в другом способе анализа ш νίΙΐΌ измеряют способность пептидов согласно данному изобретению индуцировать фосфорилирование остатков тирозина ЭПО-рецептора и следующих за ним в цепочке передачи сигнала белков системы внутриклеточной сигнализации. Пептиды, идентифицированные как активные в ходе описанных выше тестов связывания и пролиферации, вызывают фосфорилирование остатков тирозина по схеме, практически идентичной схеме фосфорилирования остатков тирозина, вызываемого ЭПО в эритропоэтин-чувствительных клетках. Для этого анализа клетки ЕЭС-Р1/ЕР (Оех!ег, е! а1. (1980) I. Ехр. Мей. 152: 1036-47) выдерживают в среде, дополненной ЭПО, до тех пор, пока не будет достигнута стационарная фаза роста. Затем эти клетки культивируют в среде без ЭПО в течение 24 ч. Затем определенное число таких клеток инкубируют с тестируемым пептидом в течение приблизительно 10 мин при 37°С. В каждый анализ также включают контрольные пробы клеток с ЭПО. Затем обработанные клетки собирают путем центрифугирования, ресуспендируют в лизирующем буфере с 8Ό8 и подвергают электрофорезу в 8О8-полиакриламидном геле. После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу и визуализируют фосфортирозинсодержащие белки на блоте (фильтре) по стандартным иммунологическим методикам. Например, на блот можно нанести антитело против фосфотирозина (например, антифосфотирозиновый 1дС мыши, Ир8!а!е Вю!есйпо1оду, 1пс.), промыть, а затем нанести второе антитело (например, меченный пероксидазой 1дС козы против мышиных, Кпкедаагй & Репу ЬаЬога!опе8, 1пс. (Вашингтон, Колумбия, США)). После этого фосфотирозинсодержащие белки можно визуализировать по стандартным методикам, включающим колориметрический, хемилюминесцентный и флуоресцентный способы анализа. Например, можно провести хемилюминесцентный анализ, используя систему ЕСЬ Vе8!ет В1о!йпд 8у§!ет (Атегзкат).

Другим способом клеточного анализа т У1!го, который можно использовать для оценки активности пептидов, является анализ колоний, в котором используют клетки костного мозга мыши или клетки периферической крови человека. Костный мозг мыши может быть получен из бедренных костей мышей, а периферическую кровь человека можно получить у здорового донора. В случае, когда используют периферическую кровь, вначале из крови выделяют мононуклеары путем, например, центрифугирования в градиенте фиколла Е|со11-Нурас.|ие (8!ет Се11 Тесйпо1од1е8, 1пс. (Ванкувер, Канада)). В этом способе анализа для того, чтобы определить число и концентрацию ядерных клеток в первоначальной пробе, проводят подсчет клеток. Определенное число клеток наносят на метилцеллюлозу согласно инструкциям про

- 21 010099 изводителя (8!ет Се11 Тесйпо1од1е8, 1пс. (Ванкувер, Канада)). Экспериментальную группу клеток обрабатывают тестируемым пептидом, группу положительного контроля обрабатывают ЭПО, а группу отрицательного контроля не подвергают обработке. Затем после определенных периодов инкубации (обычно 10 и 18 дней) подсчитывают число растущих колоний для каждой группы. Активный пептид стимулирует образование колоний.

Другие способы биологического анализа ίη νίΐτο, которые можно использовать для демонстрации активности пептидов согласно настоящему изобретению, описаны в СгеепЬегдег, е! а1. (1983) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 80: 2931-2935 (линия ЭПО-зависимых клеток-предшественников гематопоэза), Оие11е апб \Уо]с1ю\У5к1 (1991) Г Вю1. Сйет. 266: 609-614 (фосфорилирование остатков тирозина белков в клетках В68И!.ЕР), ПикаШег-Гоип, е! а1. (1992) к Вю1. Сйет. 287: 10670-10678 (фосфорилирование остатков тирозина ЭПО-рецептора в ЭПО-чувствительных клетках человека), Оие11е. е! а1. (1992) к Вю1. Сйет. 267: 17055-17060 (фосфорилирование остатков тирозина цитоплазматического белка, рр100 в клетках ΡΌΟЕВ), ^оййшдХоп, е! а1. (1987) Ехр. Нета!о1. 15: 85-92 (колориметрический анализ для гемоглобина), Ка1йо апб Мшпо (1985) Апа1. Вюсйет. 149: 117-120 (определение гемоглобина при помощи 2,7-диаминофлуорена), Ра!е1, е! а1. (1992) к Вю1. Сйет. 267: 21300-21302 (экспрессия с-туЬ), ^йТйийп, е! а1. (1993) Се11 74: 227-236 (сборка и фосфорилирование остатков тирозина белка 1АК2), Ьеопагб, е! а1. (1993) В1ооб 82: 1071-1079 (Экспрессия факторов транскрипции САТА), Апбо, е! а1. (1993) Ргос. Νι!1. Асаб. 8ск И8А 90: 9571-9575 (регуляция перехода С1 путем циклизации Ό2 и Ό3).

Недавно появились сообщения о том, что прибор, разработанный Мо1еси1аг Ое\'1се5 Согр. и известный как микрофизиометр, успешно применяют для измерения воздействия агонистов и антагонистов на различные рецепторы. Основу действия этого аппарата составляет измерение изменений скорости закисления внеклеточной среды в ответ на активацию рецептора.

Функциональные анализы ш νί\Ό

Одним из способов функционального анализа ш νίνΌ, которые могут быть использованы для оценки эффективности тестируемого пептида, является биотест с использованием постгипоксийных полицетемических мышей. Для этого анализа мышей в течение нескольких дней подвергают циклу чередующихся тренировок. В этом цикле мыши попеременно проходят периоды гипобарических условий и условий с нормальным давлением окружающей среды. После этого мышей в течение 2-3 дней до введения тестируемых проб держат при нормальном давлении окружающей среды. Пробы тестируемых пептидов либо, в случае положительного контроля, стандарт ЭПО вводят кондиционированным (тренированным) мышам путем подкожной инъекции. Через 2 дня вводят радиомеченное железо (например, Ге⁵⁹), а через 2 дня после введения радиомеченного железа берут пробы крови. Затем для каждой пробы крови определяют гематокрит и радиоактивность по стандартным методикам. Пробы крови мышей, которым путем инъекции были введены активные тестируемые пептиды, демонстрируют более высокую радиоактивность (вследствие связывания Ге⁵⁹ гемоглобином эритроцитов), чем пробы крови мышей, не получавших тестируемые пептиды или ЭПО.

Другим способом функционального анализа ш νίνΌ, который можно использовать для оценки эффективности тестируемых пептидов, является анализ ретикулоцитов. Для проведения этого анализа нормальным, не получающим никаких веществ мышам, в течение 3 дней (последовательно) вводят путем подкожной инъекции либо ЭПО, либо тестируемый пептид. На третий день мышам также вводят путем внутрибрюшинной инъекции декстран железо (1гоп Эех!гап). На пятый день у мышей отбирают кровь. Определяют процент (%) ретикулоцитов в каждом образце крови путем окраски тиазоловым оранжевым и поточного цитометрического анализа (программа подсчета эритроцитов гебс-сопп!). Дополнительно, ручным способом определяют гематокрит. Уточненный процент ретикулоцитов определяют по следующей формуле:

%РЕ^ТИ^КУТОЧНЕННЫЙ⁼%РЕ^ТИ^КНАБЛЮДАЕМЫЙ^{х(гематок}р^итИНДИВИДУАЛЬНЫЙ/^{гематок}р^итНОРМАЛЬНЫЙ⁾

Применение пептидов-агонистов ЭПО-рецептора согласно данному изобретению

Пептидные соединения согласно данному изобретению полезны в качестве применяемых ш νί!ΐΌ инструментов для понимания биологической роли ЭПО, включая исследование многих факторов, которые, как считают, влияют на продуцирование ЭПО и связывание ЭПО с ЭПО-рецептором и на которые влияет продуцирование ЭПО и связывание ЭПО с ЭПО-рецептором (например, механизм передачи сигналов с ЭПО/ЭПО-Р/активации рецепторов). Настоящие пептиды также могут быть полезны в разработке других соединений, которые связываются с ЭПО-рецептором, поскольку настоящие пептиды дают важную информацию об отношении структура-активность, которая облегчает эти разработки.

Более того, благодаря своей способности связываться с ЭПО-рецептором пептиды согласно настоящему изобретению могут быть использованы в качестве реагентов для определения ЭПО-рецептора на живых клетках, фиксированных клетках, в биологических жидкостях, в гомогенатах тканей, в очищенных, природных биологических материалах и т. д. Например, снабжая такие пептиды меткой, можно идентифицировать клетки, имеющие на своих поверхностях ЭПО-рецептор. Дополнительно, благодаря их способности связывать ЭПО-рецептор пептиды согласно настоящему изобретению можно применять для окрашивания ш кйи, в методе ГАС8 (активированной флуоресценцией сортировки клеток), ХУеЧегп Ь1о!йпд, в твердофазном ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ) и т.д. Дополнительно, благо

- 22 010099 даря их способности связываться с ЭПО-рецептором пептиды согласно настоящему изобретению можно применять для очистки рецепторов или очистки клеток, экспрессирующих ЭПО-рецептор на свою поверхность (или внутри клеток с нарушенной мембраной).

Пептиды согласно данному изобретению можно также применять в качестве коммерческих реагентов для различных медицинских исследовательских и диагностических целей. Такие применения включают, без ограничения, (1) применение в качестве калибровочных стандартов для количественного определения активности предполагаемых агонистов ЭПО-рецепторов в различных функциональных анализах, (2) применение в качестве блокирующих реагентов в случайном скрининге пептидов (т.е. в поиске новых семейств пептидов-лигандов ЭПО-рецептора указанные пептиды можно применять для блокирования связывания пептидов согласно настоящему изобретению), (3) применение в сокристаллизации с ЭПО-рецептором, т.е. могут быть образованы кристаллы пептида согласно настоящему изобретению, связанного с ЭПО-рецептором, что делает возможным определение структуры рецептора/пептида путем рентгеноструктурного анализа, (4) применение для измерения способности клеток-предшественников эритроцитов индуцировать синтез глобина и синтез железосодержащих комплексов, а также увеличивать число рецепторов к ферритину путем инициации дифференцировки, (5) применение для поддержания пролиферации и роста ЭПО-зависимых клеточных линий, таких как ЕЭСР-1-тЕРО-Р и ТР-1, и (6) другие исследовательские и диагностические приложения, в которых ЭПО-рецептор предпочтительно является активированным, либо такая активация удобно откалибрована относительно известного количества агониста ЭПО-рецептора и т.п.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы лечения и изготовления лекарства. Пептидные соединения согласно данному изобретению можно вводить теплокровным животным, включая человека, с целью стимулировать связывание ЭПО с ЭПО-рецептором ίη νίνο. Следовательно, настоящее изобретение охватывает способы терапевтического лечения нарушений, связанных с недостаточностью (дефицитом) ЭПО, каковые методы включают введение пептида согласно данному изобретению в количествах, достаточных, чтобы стимулировать ЭПО-рецепторы и, следовательно, облегчить симптомы, связанные с недостаточностью ЭПО ίη νίνο. Например, пептиды согласно этому изобретению найдут применение в лечении почечной недостаточности и/или терминальной стадии нарушения функции почек/диализа, анемии на фоне СПИД, анемии, ассоциированной с хроническими воспалительными заболеваниями (например, ревматоидным артритом или хроническим воспалением кишечника) и аутоиммунным заболеванием, а также для стимуляции увеличения числа эритроцитов у пациента перед операцией. Другие болезненные состояния, нарушения и состояния гематологических нарушений включают бета-талассемию, кистозный фиброз (муковисцедоз), нарушения менструального цикла и беременности, анемии недоношенных детей, повреждения спинного мозга, космический полет, старение, разнообразные опухолевые заболевания, сопровождающиеся нарушенным эритропоэзом.

В других способах реализации пептидные соединения согласно данному изобретению можно применять для лечения расстройств, которые не характеризуются низким или недостаточным (дефицитным) содержанием эритроцитов, например подготовка к переливанию крови. Дополнительно, введение соединений согласно этому изобретению может привести к уменьшению продолжительности кровотечения и, следовательно, найдет применение для введения пациентам перед хирургическими операциями или в случаях, когда можно ожидать, что произойдет кровотечение. Дополнительно, соединения согласно этому изобретению найдут применение в активации мегакариоцитов.

Поскольку было показано, что ЭПО обладает митогенетическим и хемотаксическим воздействием на центральные холинэргические нейроны (см., например, Атадпок1ои, с1 а1. (1990) Ргос. №111. Лсай. 8с1. И8Л 87: 5978-5982 и КошкЫ, е! а1. (1993) Вгат Век. 609: 29-35), соединения согласно этому изобретению также найдут применение в лечении различных сосудистых нарушений, такое как стимуляция заживления ран, стимуляция роста коллатеральных кровеносных сосудов сердца (такое, как может иметь место после инфаркта миокарда), лечение травм и лечение после трансплантации сосудов. Соединения согласно этому изобретению также найдут применение в лечении различных неврологических расстройств, характеризующихся, в целом, низким абсолютным уровнем ацетилхолина или низкими относительными уровнями ацетилхолина по сравнению с другими нейроактивными веществами, например нейротрансмиттерами.

Фармацевтические составы

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрены фармацевтические составы вышеупомянутых соединений пептидов-агонистов ЭПО-рецепторов. Состояния, которые облегчает или корректирует введение таких составов, включают указанные выше. Такие фармацевтические составы могут предназначаться для перорального, парентерального (внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного или подкожного), чрескожного (пассивного либо с применением ионофореза или электропорации) путей введения, введения через слизистые оболочки (назально, ректально, вагинально или сублингвально) либо с использованием биоразрушаемых вставок и могут быть приготовлены в виде лекарственных форм, подходящих для каждого из путей введения. В целом, данное изобретение охватывает фармацевтические составы, содержащие терапевтически эффективные количества пептида-агониста ЭПО-рецептора или производных продуктов согласно данному изобретению вместе с фармацевтически приемлемыми дилю

- 23 010099 ентами, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие составы включают дилюенты, содержащие различные буферные вещества (например, Трис-НС1, ацетат, фосфат), с различными значениями рН и ионной силы, добавки, такие как ПАВ и солюбилизирующие вещества (например, Ттеееп 20, Ттеееп 80, Ро1укогЬа!е 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфат натрия), консерванты (например, ТЫтег§о1, бензиловый спирт) и наполнители (например, лактоза, маннитол); продукты слияния данного материала с конкретными препаратами полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т. д., или с липосомами. Также может быть использована гиалуроновая кислота. Такие составы могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ш νίνο и скорость клиренса ΐπ νίνο настоящих белков и производных. См., например, ВетюдЮп'к РкагтасеиДса1 8с1епсек, 18(Н Еб. (1990, Маск РиЬНкЫпд Со., ЕакЮп, РА 18042) р. 1435-1712, которая включена сюда путем ссылки. Составы могут быть приготовлены в жидкой форме или в форме высушенного порошка (например, лиофилизированного).

Пероральная доставка

Предусмотрено применение твердых лекарственных форм для перорального применения, которые описаны в Главе 89 Ветшд!оп'к РкагтасеиДса1 8с1епсек, 18111 Еб. 1990 (Маск РиЬНкЫпд Со. Еак!оп РА 18042), которая включена сюда путем ссылки. Твердые лекарственные формы включают таблетки, капсулы, пилюли, троше или пастилки, саше, болюсы, порошки или гранулы. Также для приготовления лекарственных форм составов согласно данному изобретению может быть применено заключение в липосомальную или белковую капсулы (как, например, белковые микросферы, описанные в патенте США и.8. Ра!еп! №. 4925637). Может быть применено заключение в липосому, а липосомы могут быть модифицированы разнообразными полимерами (например, патент США И.8. Ра!еп! №. 5013556). Описание возможных твердых лекарственных форм для терапевтических веществ дано в Магкка11, К.В. Мобет РкагтасеиДск, изданной С.8. Вапкег апб С.Т. Вкобек, Глава 10, 1979, и включено в данное описание путем ссылки. В целом, рецептура будет включать пептиды-агонисты ЭПО-рецептора (или их химически модифицированные формы) и инертные ингредиенты, которые обеспечивают защиту от среды желудка и высвобождение биологически активного материала в кишечнике.

Также предусмотрено применение жидких лекарственных форм для перорального введения, включая фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии и сиропы, которые могут содержать другие компоненты, включая инертные дилюенты, адъюванты, такие как смачивающие вещества, эмульгирующие и суспендирующие вещества, подслащивающие вкусовые и ароматизирующие вещества.

Пептиды могут быть химически модифицированы таким образом, что пероральная доставка производных становится эффективной. Обычно рассмотренная химическая модификация заключается в присоединении по крайней мере одного фрагмента молекулы самого компонента, где указанный компонент обеспечивает: (а) ингибирование протеолиза и (Ь) всасывание в кровоток из желудка или кишечника. Также желательно увеличить общую стабильность компонента или компонентов, а также увеличить время циркуляции в организме. Как обсуждалось выше, присоединение ПЭГ является предпочтительной химической модификацией для фармацевтического применения. Другие фрагменты, которые могут быть использованы, включают пропиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, спирт поливинилпирролидона, поливинилпирролидон, полипролин, поли-1,3диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан (см., например, АЬискотекк1 апб Эттк (1981) 8о1иЬ1е Ро1утег-Епхуте Аббис!к, в Епхутек ак Эгидк. НосепЬегд апб ВоЬейк, ебк. (ЛУПеу-кИегкаепсе: №\ν Уогк, ΝΥ) рр. 367-383; апб №тетагк, е! а1. (1982) I. Арр1. Вюскет. 4: 185-189).

В случае лекарственных форм для перорального введения местом высвобождения может быть желудок, тонкий кишечник (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка и подвздошная кишка) или толстый кишечник. Специалистам в данной области доступны лекарственные формы, которые не растворяются в желудке, но высвободят материал в двенадцатиперстной кишке или каком-либо другом участке кишечника. Предпочтительно избегать отрицательного воздействия среды желудка на высвобождение либо путем защиты пептида (или производной), либо путем высвобождения пептида (или производной) вне среды желудка, например в тонком кишечнике.

Для того, чтобы обеспечить устойчивость к среде желудка, необходима оболочка, не проницаемая для рН, равного по меньшей мере 5,0. Примерами наиболее обычных инертных ингредиентов, которые применяют в качестве растворяющихся в кишечнике оболочек, являются ацетат тримеллитат целлюлозы (САТ), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, поливинилацетата фталат (РVЛР), Еибгадк Ε30Ό, Адиа!епс, ацетат фталат целлюлозы (САР), Еибгадк Ь, Еибгадк 8 и 8ке11ас. Эти оболочки можно применять в виде смешанных пленок.

Для таблеток можно также применять покрытие или смесь покрытий, которые не предназначены для защиты от среды желудка. Эти покрытия могут включать сахарные оболочки или оболочки, которые облегчают проглатывание таблеток. Капсулы могут состоять из твердой оболочки (такой, как желатиновая), предназначенной для доставки сухих терапевтических веществ (т.е. порошка), для жидких форм можно применять мягкий желатин. Материал оболочки каше может представлять собой густой крахмал или другой съедобный материал (например, усваиваимый полимер глюкозы). Для пилюлей, пастилок, формовых таблеток или таблетированных порошков можно применять методики обработки влажной массы.

- 24 010099

Пептид (или производная) может быть включен в лекарственную форму в виде отдельных мелких частиц в форме гранул или шариков с размером частиц примерно 1 мм. Лекарственная форма материала для введения в капсуле может также представлять собой порошок, прессованную пластинку или даже таблетки. Эти терапевтические вещества могут быть приготовлены путем прессования.

Также могут быть включены красители и/или вкусовые добавки. Например, можно изготовить (таким способом, как инкапсулирование в липосому или микросферу) лекарственную форму, содержащую пептид (или производную) и затем ввести ее в съедобный продукт, такой как охлажденный напиток, содержащий краситель и вкусовую добавку.

Пептид (или производную) можно разбавить или увеличить его объем инертным материалом. Эти дилюенты (разбавители) могут включать углеводы, в особенности маннитол, α-лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Также в качестве наполнителей можно использовать некоторые неорганические соли, такие как трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Некоторые коммерчески доступные дилюенты: Еак1-По, Етбех, 8ТА-Кх 1500, Етсотргекк и Ау1се11.

В рецептуру терапевтического вещества в твердой лекарственной форме могут также быть включены дезинтегрирующие вещества. Материалы, используемые в качестве дезинтегрирующих веществ, включают, без ограничения, крахмал, включая коммерческое дезинтегрирующее вещество на основе крахмала, Ехр1о!аЬ. Можно использовать крахмал глколят натрия, АтЬетШс, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин, желатин, кожуру апельсина, кислую карбоксиметилцеллюлозу, природную губку и бентонит. Дезинтегрирующие вещества могут также представлять собой нерастворимые катионообменные смолы. В качестве дезинтегрирующих веществ можно также применять порошковые камеди, которые могут включать такие порошковые камеди, как агар, камедь карайи или трагакантовую камедь. Альгеновая кислота и ее натриевая соль также пригодны в качестве дезинтегрирующих веществ.

Для того, чтобы связать пептидное (или производное) вещество для формирования прочной таблетки, можно применять связывающие вещества, которые включают натуральные материалы, такие как акация, трагакант, крахмал и желатин. Другие включают метилцеллюлозу (МЦ, МС), этилцеллюлозу (ЭЦ, ЕС) и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ, СМС). Для гранулирования пептида (или производной) можно применять поливинилпирролидон (ПВП, РУР) и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ, СМС) в спиртовых растворах.

Для того, чтобы предотвратить слипание в ходе приготовления, в рецептуру пептида (или производной) могут быть включены антифрикционные вещества. Смазывающие вещества можно применять в виде прослойки между пептидом (или производной) и стенкой формы. Эти смазывающие вещества могут включать, без ограничения, стеариновую кислоту, включая ее магниевые и кальциевые соли, политетрафлюороэтилен (ПТФЕ), вазелиновое масло, масла и воска растительного происхождения. Можно также использовать растворимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль разных молекулярных масс, СатЬо^ах 4000 и 6000.

Скользящие вещества могут улучшить реологические (пластические) свойства лекарственного вещества в ходе приготовления, и их можно добавлять для того, чтобы облегчить преобразования в ходе прессования. Скользящие вещества могут включать крахмал, тальк, пирогенный кварц и гидратный силикоалюминат.

Чтобы облегчить растворение пептида (или производной) в водной среде, можно добавить поверхностно-активное вещество в качестве смачивающего вещества. Поверхностно-активные вещества могут включать анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, сульфосукцинат диоктила натрия и сульфонат диоктила натрия. Можно использовать катионные детергенты, которые могут включать хлорид бензалкония или хлорид бензетомия. Список потенциальных неионных детергентов, которые могут быть включены в рецептуру в качестве поверхностно-активных веществ, составляют 1аитотастодо1 400, ро1уоху1 40 к!еага!е (полиоксил стеарат), ро1уохуе!йу1епе сак!ог ой 10, 50 и 60 (полиоксиэтиленовое касторовое масло), д1усего1 топок!еага!е (моностеарат глицерина), ро1укогЬа!е 20, 40, 60, 65 и 80, сложный эфир сахарозы и жирной кислоты, метилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Эти поверхностноактивные вещества могут присутствовать в рецептуре белка или производной либо самостоятельно, либо в разных соотношениях в составе смесей.

Добавки, которые потенциально повышают всасывание пептида (или производной), представляют собой, например, жирные кислоты, олеиновую кислоту, линолевую кислоту и линоленовую кислоту.

Может быть желательно получить лекарственные формы для перорального введения с отложенным высвобождением. Пептид (или производная) может быть связан с инертным матриксом (основой), который делает возможным высвобождение по механизму диффузии или выщелачивания. Такой матрикс может представлять собой, например, камедь. Также в лекарственную форму могут быть введены медленно разрушающиеся матриксы. Некоторые растворяющиеся в кишечнике оболочки обладают эффектом отложенного высвобождения. Другая форма контролируемого высвобождения представлена способом, основанным на терапевтической системе Огок (Ака Согр.), т.е. лекарственное вещество заключено в полупроницаемую мембрану, которая позволяет воде проникать внутрь и выталкивать лекарственное

- 25 010099 вещество наружу через единственное маленькое отверстие благодаря осмотическим эффектам.

Для приготовления лекарственной формы могут быть использованы другие оболочки. Эти оболочки включают разнообразные сахара, которые могут быть нанесены на форму для изготовления оболочки. Пептид (или производную) также можно давать в виде покрытой пленкой таблетки, использованные в этом примере материалы разделены на две группы. К первой группе относятся некишечные материалы (т.е. материалы, которые растворяются не в кишечнике). Эта группа включает метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, метилгидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, повидон и полиэтиленгликоли. Вторая группа состоит из растворяющихся в кишечнике материалов, которые обычно представляют собой сложные эфиры фталевой кислоты.

Для получения оптимального пленочного покрытия можно использовать смесь материалов. Нанесение пленочного покрытия может быть произведено в формовочном устройстве для нанесения покрытий либо в псевдоожиженном слое, либо путем напрессовывания покрытия.

Парентеральная доставка

Препараты согласно этому изобретению для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии или эмульсии. Примерами неводных растворителей или разбавителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и сложные органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Такие лекарственные формы могут также содержать адъюванты, такие как консервирующие, смачивающие, эмульгирующие и диспергирующие вещества. Препараты могут быть стерилизованы, например, путем фильтрации через бактериальный фильтр, путем введения в состав стерилизующих средств, путем облучения составов или путем нагревания составов. Они также могут быть изготовлены с применением стерильной воды или какой-либо другой стерильной среды для инъекций непосредственно перед использованием.

Ректальная или вагинальная доставка

Составы для ректального или вагинального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые могут содержать, в дополнение к активному веществу, наполнители, такие как масло какао или воск для суппозиториев. Составы для назального или сублингвального введения также готовят со стандартными наполнителями, хорошо известными в данной области.

Пульмональное введение (через легкие)

Здесь также рассмотрена пульмональная доставка пептидов-агонистов ЭПО-рецептора (или их производных). Пептид (или производная) доставляется в легкие млекопитающих при вдыхании и переходит через эпителиальную выстилку легкого в кровеносное русло (см., например Ай)е1, е! а1. (1990) РРагтасеиРса1 ВекеагсР 7: 565-569; Афер е! а1. (1990) Ιηΐ. I. РРагтасеийск 63: 135-144 (ацетат лейпролида), Вгадие!, е! а1. (1989) I. Сагйюуакси1аг РРагтасо1оду 13 (кир.5): 143-146 (эндотелин-1), НиЬЬагй, е! а1. (1989) Аппа1к о£ 1п!егпа1 МеЛсте, Уо1. III, рр. 206-212 (а1-антитрипсин), 8тйР, е! а1. (1989) I. С1т. 1пуек1. 84: 1145-1146 (α-1-протеиназа); Окует, е! а1. (1990) Аегоко№11юп о£ Рго!етк, Ргосеейтдк о£ 8утрокшт оп Векриа!огу Эгид ОеРуегу II Кеук!опе, Со1огайо (рекомбинантный гормон роста человека); ЭеЬк е! а1., (1988) I. 1ттипо1. 140: 3482-3488 (интерферон-γ и фактор некроза опухолей а), патент США И.8. Ра!. №. 5284656 (Р1аЩ е! а1.) (гранулоцит-колониестимулирующий фактор). Способ и состав для пульмональной доставки лекарственного вещества для системного действия описан в патенте США И.8. Ра!. №. 5451659, \Уопд е! а1.

Для применения в реализации этого изобретения предусмотрен широкий ряд механических приспособлений, сконструированных для пульмональной доставки терапевтических продуктов, включающий, без ограничения, небулайзеры, дозирующие ингаляторы и порошковые ингаляторы, каждый из которых хорошо известен специалистам в данной области. Некоторые конкретные примеры коммерчески доступных приспособлений, подходящих для реализации этого изобретения: небулайзер И1!гауеп! (МаШпскгой! Шс., Сент-Луис, Колорадо, США), небулайзер АсогпП (Мащиек! Мей1са1 Ргойис!к, Инглевуд, Колорадо, США), дозирующий ингалятор Уеп!оРп и порошковый ингалаятор 8р1пНа1ег (Р1копк Согр., Бедфорд, Массачусетс, США).

Все подобные приспособления требуют применения лекарственных форм, подходящих для дозирования пептида (или производной). Обычно каждая лекарственная форма специфична по отношению к типу используемого приспособления и может включать применение соответствующего пропеллента в дополнение к обычным дилюентам, адъювантам и/или носителям, применяемым в терапии. Также рассмотрено применение липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включений или других типов носителей. Химически модифицированные пептиды также можно приготовить в виде разных лекарственных форм, в зависимости от типа химической модификации или типа используемого приспособления. Также модифицированный пептид может быть приготовлен в разных лекарственных формах, в зависимости от типа химической модификации и применяемого устройства.

Лекарственные формы, подходящие для применения с небулайзерами, струевыми или ультразвуковыми, обычно содержат пептид (или производную), растворенный в воде до концентрации примерно от 0,1 до 25 мг биологически активного белка на мл раствора. Лекарственная форма может также включать

- 26 010099 буфер и обычный сахар (например, для стабилизации белка и регуляции осмотического давления). Лекарственная форма для небулайзера может также содержать поверхностно-активное вещество для предотвращения агрегации пептида (или производной) на поверхности, вызванное атомизацией раствора при образовании аэрозоля.

Лекарственная форма для применения в дозирующем ингаляторе будет, в общем случае, содержать тонкоизмельченный порошок, содержащий пептид (или производную), суспендированный в пропелленте при помощи поверхностно-активного вещества. Пропеллент может представлять любой обыкновенный материал, употребляемый обычно для этой цели, такой как хлорофлуороуглерод, гидрохлорофлуороуглерод, гидрофлуороуглерод или углеводород, включая трихлорфлуорометан, дихлорфлуорометан, дихлортетрафлуорометанол и 1,1,1,2-тетрафлюороэтан либо их комбинации. Подходящие поверхностно-активные вещества включают триолеат сорбита и лецитин сои. Также в качестве поверхностно-активного вещества можно применять олеиновую кислоту.

Лекарственные формы для дозирования из порошкового ингалятора будут содержать тонкоизмельченный сухой порошок, содержащий пептид (или производную), и также могут включать наполнитель, такой как лактоза, сорбит, сахароза, маннитол, в количествах, которые облегчают распыление порошка из приспособления, например от 50 до 90% массы лекарственной формы. Наиболее предпочтительно приготовление пептида (или производной) в форме частиц со средним размером, меньшим, чем 10 мкм (или микрон), наиболее предпочтительно от 0,5 до 5 мкм, для наиболее эффективной доставки в нижние отделы легкого.

Назальная доставка

Также рассмотрена назальная доставка пептидов-агонистов ЭПО-рецептора (или их производных). Назальная доставка делает возможным переход пептида в кровеносное русло непосредственно после введения терапевтического продукта в нос без необходимости накопления этого продукта в легких. Лекарственные формы для назальной доставки включают формы, содержащие декстран или циклодекстран. Дозировки

По мере проведения дальнейших исследований будет появляться информация относительно подходящих уровней дозировки для лечения различных состояний у различных пациентов, и работник обычной квалификации сможет, принимая во внимание терапевтический контекст, возраст и общее состояние здоровья пациента, определить подходящую дозу. Выбранные дозировки зависят от желаемого терапевтического эффекта, пути введения и желаемой продолжительности лечения. Обычно млекопитающим ежедневно вводят дозировки от 0,001 до 10 мг/кг массы тела. Обычно дозировки для внутривенных инъекций могут быть ниже. Режим дозирования можно варьировать в зависимости от полужизни циркуляции и используемой лекарственной формы.

Пептиды согласно настоящему изобретению (или их производные) можно вводить совместно с одним или более дополнительных активных ингредиентов или фармацевтических составов.

Примеры

Далее настоящее изобретение описано посредством следующих примеров. Однако эти и другие примеры, встречающиеся в данной спецификации, приведены исключительно в иллюстративных целях и ни в коем случае не ограничивают объем и значение изобретения или какой-либо иллюстративной формы. Аналогично, данное изобретение не ограничивается каким-либо из описанных здесь конкретных предпочтительных способов реализации. Действительно, после прочтения данной спецификации для специалиста в данной области станут очевидны многочисленные модификации и варианты данного изобретения, которые могут быть сделаны без отступления от идеи и объема изобретения. Следовательно, данное изобретение ограничено только приложенной формулой вместе с полным объемом эквивалентов, на которые данная формула предоставляет право.

Пример 1. Синтез пептидных димеров-агонистов ЭПО-рецептора.

1. Синтез мономерного пептида.

Разнообразные пептидные мономеры согласно данному изобретению были синтезированы с использованием методики твердофазного синтеза Мерифилда (Меглйе1б) (см. 81е\\'аг1 Уоипд. 8о11б РНаке РерНбе 8уп1Нек1к, 2^пб ебШоп (Р1егсе СНеписак ВоскГогб, В) 1984) на автоматическом приборе Арркеб Вюкуккетк 433А. Использовали смолу РАЬ (М1Шдеп/Вюкеагсй), которая представляет собой поперечносшитый полистерен с 5-(4'-Ртос-аминометил-3,5'-диметоксифенокси)валериановой кислотой. При использовании РАЬ после отщепления пептида от смолы получают функциональную амидную группу на карбоксильном конце. Первичную защиту амина на аминокислотах производили группой Ртос, а защитными группами для боковых радикалов были ΐ-бутильная для гидроксилов серина, треонина и тирозина, тритильная для амидов аспарагина и глутамина, Тг1 и Аст для цистеина и Рст (2,3,5,7,8-пентаметилхромансульфонат) для гуанидиногруппы аргинина. Каждое связывание проводили в течение 1 или 2 ч в ВОР присутствии (гексафлюорофосфат бензотриазолил Ν-окстрисдиметиламинофосфония) и НОВ1 (1-гидроксибензтриазол).

Для синтеза пептидов с амидированным карбоксильным концом полностью собранный пептид отщепляли смесью 90% трифторуксусной кислоты, 5% этандитиола и 5% воды первоначально при 4°С, постепенно повышая температуру до комнатной в течение 1,5 ч. Лишенный защиты продукт отфильтро

- 27 010099 вывали от смолы и осаждали диэтилэфиром. После тщательного высушивания продукт очищали путем обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке С18 с градиентом смеси ацетонитрил/вода в 0,1% трифтроуксусной кислоты (трфторацетата, ТЕА).

2. Синтез пептидного димера.

Разнообразные пептидные димеры согласно данному изобретению синтезировали непосредственно на лизиновом линкере (вариант твердофазного синтеза).

Для одновременного синтеза двух пептидных цепей Етос-Ьук-Етос связывали со смолой РАЬ (М1Шдеп/В1О8еагсй), обеспечивая тем самым исходный остаток лизина, который послужит линкером между двумя синтезированными цепями. Защитные группы Ртос удаляли мягким основанием (20% пиперидин в диметилформамиде (ΌΜΡ)), а пептидные цепи синтезировали, используя освободившиеся в результате аминогруппы в качестве исходных точек синтеза. Синтез пептидных цепей проводили, используя описанную выше методику твердофазного синтеза. Для защиты всех остатков цистеина использовали группу Тг1. После снятия защиты с димера отщепления от смолы и очистки проводили окисление остатков цистеина путем инкубирования лишенного защиты димера в 100% ДМСО в течение 2-3 дней при температуре от 5 до 25°С. Эта реакция окисления давала преимущественно (>75%) димеры с двумя внутримолекулярными дисульфидными связями.

Для опоследовательного синтеза двух пептидных цепей Етос-Ьу8-А11ос связывали со смолой РАЬ (М1Шдеп/В1о8еагсй), обеспечивая тем самым исходный остаток лизина, который послужит линкером между двумя синтезированными цепями. Защитную группу Ртос удаляли мягким основанием (20% пиперидин в диметилформамиде). Первую пептидную цепь синтезировали, используя в качестве исходной точки образовавшуюся в результате свободную аминогруппу. Синтез пептида осуществляли, используя описанную выше методику твердофазного синтеза. Два остатка цистеина первой цепи защищали группой Тг1. За синтезом первой пептидной цепи следовало удаление группы А11ос со связанного с носителем лизинового линкера Рб[Р(С₆Н₅)₃]₄ 4-метилморфолином и хлороформом. Затем синтезировали вторую пептидную цепь на второй свободной аминогруппе. Два остатка цистеина второй цепи защищали группой Аст. Внутримолекулярную дисульфидную связь в первой пептидной цепи образовывали путем удаления защитной группы Тг1 трифторуксусной кислотой с последующим окислением путем перемешивания в 20% ДМСО в течение ночи. Затем образовывали внутримолекулярную дисульфидную связь во второй пептидной цепи путем одновременного удаления защитных групп Аст и окисления лишенных защиты остатков цистеина с использованием йода, метанола и трифторацетата талия.

3. Присоединение спейсеров.

В случае, когда спейсер представлял собой аминокислоту (например, глицин или лизин, как в соединениях АР35462 и АР35464, соответственно), спейсер вводили в пептид в ходе твердофазного синтеза пептида. В этом случае спейсерную аминокислоту связывали со смолой РАЬ, а ее свободная аминогруппа служила основой для присоединения другой спейсерной аминокислоты или лизинового линкера. За присоединением лизинового линкера следовал синтез димерных пептидов (как описано выше).

4. Синтез образцов пептидных димеров.

Схема примеров способов реализации этого синтеза описана ниже. В одном примере описан синтез пептидного димера, связанного через С-концевой амид лизина. В другом примере описан синтез пептидного димера, связанного через С-концевой лизин и содержащего спейсерную молекулу, присоединенную к связывающему лизину.

Синтез пептидного димера, связанного через остаток амида лизина на С-конце

Этап 1. Образование ТеЩаСе1-Итк-Ьу5.

Смолу Теп1аСе1-Ыпк (0,18 ммоль/г (Яарр Ро1утеге, Германия)) обрабатывали активированным раствором Ртос-Ьу§(Ртос)-ОН (приготовленном из 5 экв. аминокислоты и 5 экв. НАТИ (реагент для связывания белков), растворенного в концентрации 0,5М в ΌΜΡ, с последующим добавлением 10 экв. ОША) и оставляли при слабом встряхивании на 14 ч. Смолу промывали (ОМЕ, ТНЕ, ЬСМ, МеОН) и высушивали. В результате получали защищенную смолу. Остаточные аминогруппы кэппировали путем обработки смолы раствором 10% уксусного ангидрида, 20% пиридина в ЬСМ в течение 20 мин с последующей промывкой (как описано выше). Группы Етос удаляли путем мягкого встряхивания смолы в 30% пиперидине в ΌΜΕ в течение 20 мин, за которым следовали промывка (ΌΜΓ, ТНЕ, ЬСМ, МеОН) и высушивание.

Этап 2. Образование ТеШаСеЬИтк-Ьу (пептид)₂.

Смолу, полученную на этапе 1, подвергали повторяющимся циклам присоединения Ртос-амино- 28 010099 кислоты с активацией ΗΒΤϋ/ΗΘΒΐ и удаления групп Етос пиперидином для одновременного построения обеих пептидных цепей. Эту процедуру с легкостью выполняли на автоматическом синтезаторе пептидов ΑΒΙ 433 (Лррйеб Вюкуйетк, 1пс). После последнего удаления групп Етос терминальные аминогруппы ацетилировали уксусным ангидридом (10 экв.) и ΌΙΕΑ (20 экв.) в ΌΜΕ в течение 20 мин, после чего следовала промывка (как описано выше).

Этап 3. Отщепление от смолы.

Смолу, полученную, как описано выше, суспендировали в растворе ТЕЛ (82,5%), фенола (5%), этандитиола (2,5%) и тиоанизола (5%) в течение 3 ч при комнатной температуре. Можно также использовать альтернативные отщепляющие смеси, такие как ТЕЛ (95%), вода (2,5%) и триизопропилсилан (2,5%). Раствор ТЕЛ охлаждали до 5°С и вливали в ЕьО для того, чтобы осадить пептид. После фильтрации и высушивания при пониженном давлении получали желаемый пептид. Очистка путем препаратив-

Синтез пептидного димера, связанного через остаток амида лизина на С-конце и содержащего спейсерную молекулу

Этап 1. Синтез Сйх-ТЛР.

Раствор, содержащий коммерчески доступный диамин (ТАР, Л1бисй Сйетка1 Со.) (10 г, 67,47 ммоль) в безводном дихлорметане (ЭСМ, 100 мл), охлаждали до 0°С. Раствор бензилхлороформата (4,82 мл, 33,7 ммоль) в безводном дихлорметане (ИСМ) (50 мл) медленно добавляли при помощи капельной воронки в течение 6-7 ч, поддерживая температуру реакционной смеси 0°С на протяжении всего времени, а затем давали нагреться до комнатной температуры (~25°С). После еще 16 ч ИСМ удаляли под вакуумом, а остаток разделялся между 3-нормальной НС1 и эфиром. Водные фазы собирали и нейтрализовали 50% вод. ΝπϋΗ до значения рН 8-9 и экстрагировали этил ацетатом. Фазу этил ацетата высушивали над безводной Ν₂8Ο₄, а затем концентрировали под вакуумом, в результате чего получали неочищенный моно-СйхТЛР (5 г, выход примерно 50%). Это соединение использовали в следующей реакции без какой-либо дальнейшей очистки.

Этап 2. Синтез Сйх-ТЛР-Вос.

К тщательно перемешанной суспензии Сйх-ТЛР (5 г, 17,7 ммоль) в гексане (25 мл) добавляли Вос₂О (3,86 г, 17,7 ммоль) и продолжали перемешивание при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли ИСМ (25 мл) и промывали 10% вод. лимонной кислоты (2Х), водой (2Х) и концентрированным раствором №С1. Органический слой высушивали над безводной №-ь8О₄ и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт (выход 5 г) непосредственно использовали в следующей реакции.

- 29 010099

Этап 3. Синтез Вос-ТАР.

Неочищенный продукт предыдущей реакции растворяли в метаноле (25 мл) и гидрогенизировали в присутствии 5 мас.% катализатора палладий на угле под баллонным давлением в течение 16 ч. Смесь фильтровали, промывали метанолом и концентрировали фильтрат ίη νасиο, в результате чего получали продукт Н-ТАР-Вос (выход 3,7 г). Общий выход Вос-ТАР после этапов 1-3 составил приблизительно 44% (в расчете относительно использованного количества СЬх-С1).

Этап 4. Синтез Теп1аСе1-линкера.

Гранулированный твердый носитель (подложку) Теп1аСе1 Ьготйе (2,5 г, 0,48 ммоль/г, Варр Ро1утеге, Германия), фенольный линкер (5 экв.) и К₂СО₃ (5 экв.) нагревали в 20 мл ΌΜΡ (диметилформамид) до 70°С в течение 14 ч. После охлаждения до комнатной температуры смолу промывали (0,1-нормальная НС1, вода, АСЫ (ацетонитрил), ΌΜΡ, МеОН) и высушивали, в результате чего получали смолу цвета янтаря.

Этап 5. Синтез Теп1аСе1-линкер-ТАР(Вос).

Брали 2,5 г смолы, полученной, как описано выше, Н-ТАР-Вос (1,5 г, 5 экв.) и кристаллической уксусной кислоты (34 мкл, 5 экв.) в смеси 1:1 с МеОН-ТНР и встряхивали в течение 7 ч. К этой смеси добавляли 1М раствор цианоборогидрида натрия (5 экв.) в ТНР (тетрагидрофуран) и встряхивали в течение еще 7 ч. Смолу фильтровали, промывали (ΌΜΡ, ТНР, 0,1-нормальная НС1, вода, МеОН) и высушивали. Небольшое количество смолы бензоилировали хлоридом бензола (В/-С1) и диизопропилэтиламином (ΌΙΕΑ) в дихлорметане (ЭСМ), и расщепляли 70% ТРА-ЭСМ (трифтароуксусная кислота-дихлорметан), и проверяли путем жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ЬСМ8) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, НРЬС).

Этап 6. Синтез Теп1аСе1-линкер-ТАР-Еук.

Смолу, полученную, как описано выше, обрабатывали активированным раствором РтосЬук(Ртос)-ОН (приготовленного из 5 экв. аминокислоты и 5 экв. НАТИ (реагент для связывания белков), растворенного в концентрации 0,5М в ΌΜΡ, с последующим добавлением 10 экв. ЭГЕА) и оставляли при слабом встряхивании на 14 ч. Смолу промывали (ΌΜΡ, ТНР, ^СΜ, МеОН) и высушивали. В результате получали защищенную смолу. Остаточные аминогруппы кэппировали путем обработки смолы раствором 10% уксусного ангидрида, 20% пиридина в Ωί'Μ в течение 20 мин с последующей промывкой (как описано выше). Группы Ртос удаляли путем мягкого встряхивания смолы в 30% пиперидина в ΌΜΡ в течение 20 мин, за которым следовали промывка (ΌΜΡ, ТНР, ^СΜ, МеОН) и высушивание.

Этап 7. Синтез Теп1аСе1-линкер-ТАР-Еук(пептид)₂.

Смолу, полученную, как описано выше, подвергали повторяющимся циклам присоединения Ртосаминокислоты с активацией НВТШНОВ1 и удаления групп Ртос пиперидином для одновременного построения обеих пептидных цепей. Эту процедуру с легкостью выполняли на автоматическом синтезаторе пептидов АВ1 433 (Аррйей ВюкуЧетк. 1пс.). После последнего удаления групп Ртос терминальные аминогруппы ацетилировали уксусным ангидридом (10 экв.) и ЭГЕА (20 экв.) в ΩΜΕ в течение 20 мин, после

- 30 010099 чего следовала промывка (как описано выше).

Этап 8. Отщепление от смолы.

Смолу, полученную, как описано выше, суспендировали в растворе ТРА (82,5%), фенола (5%), этандитиола (2,5%) и тиоанизола (5%) в течение 3 ч при комнатной температуре. Можно также использовать альтернативные отщепляющие смеси, такие как ТРА (95%), вода (2,5%) и триизопропилсилан (2,5%). Раствор ТРА охлаждали до 5°С и вливали в ЕьО для того, чтобы осадить пептид. После фильтрации и высушивания при пониженном давлении получали желаемый пептид. Очистка путем препаратив-

5. Окисление пептидов с целью образования внутримолекулярных дисульфидных связей.

Пептидный димер растворяли в 20% ЭМ8О (ДМСО, диметилсульфоксид)/вода (1 мг сухой массы пептида/мл) и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 36 ч. Пептид очищали, загружая реакционную смесь на колонку С18 для ВЭЖХ (\Уа1егк ЭеНа-Рас С18, размер частиц 15 мкм, размер пор 300 А, длина 40 мм х 200 мм), с последующим нанесением на линейный градиент АСN/вода/0,01% ТРА от 5 до95% АСN в течение 40 мин. Лиофилизация фракций, содержащих целевой пептид, дает продукт в виде твердых хлопьев белого цвета. Например, в случае АР35525 схема этой реакции может быть изображена следующим образом:

АоХ-С-У-С-г— ΝΗ

ϋΜ3Ο/Η₂Ο

------------->.

Ытепс рерМе (ΧΥΖ) соп!аттд Отеле ρβρίιάβ (ΧΥΖ) соп1а1гнпд гебисеб сумете гезИиез οχΐάίζβά άΐευίίΐάβ Ьопбз

6. Присоединение ПЭГ к пептидам (ПЭГилирование).

ПЭГилирование пептидом согласно данному изобретению проводили согласно нескольким разным методикам.

Присоединение ПЭГ к концевой-Ν^ группе.

Пептидный димер смешивали с 1,5 экв. (в молях) активированных молекул ПЭГ (тРЕО-ОТС, NΟР Согр., Япония) в сухом ОМР, в результате чего получали прозрачный раствор. Через 5 мин к этому раствору добавляли 4 экв. Э1ЕА. Смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 14 ч, после чего следовала очистка обращенно-фазной ВЭЖХ на колонке С18. Структуру пептида с присоединенным ПЭГ подтверждали путем масс-спектрометрии (МАЬП1). Очищенный пептид также подвергали очистке путем катионообменной хроматографии, схема которой описана ниже. Например, в случае пептидного соединения АР35593 моно-ПЭГилированние концевой КН₂-группы спейсерного фрагмента можно схематично изобразить следующим образом:

- 31 010099

ДиПЭГилирование Ν-концов пептидного димера.

Пептидный димер смешивали с 2,5 экв. (в молях) активированных молекул ПЭГ (тРЕС-ИРС, ИОР Согр., Япония) в сухом ЭМЕ, в результате чего получали прозрачный раствор. Через 5 мин к этому раствору добавляли 4 экв. Э1ЕА. Смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 14 ч, после чего следовала очистка обращенно-фазной ВЭЖХ на колонке С18. Очищенный пептид также подвергали очистке путем катионообменной хроматографии, схема которой описана ниже. Например, в случае пептидного соединения АЕ35593 моно-ПЭГилированние концевой ИН₂-группы спейсерного фрагмента можно схематично изобразить следующим образом:

Η₂Ν~ ООЬУАСНМСРЩ1 -паЦУ^ОРЕЖМеОк

Η₂Ν- ССБУ АСНМ6Р1Т( I -па1)УСдРЬК(МеОК тРЕС-ΝΡΟ ΡΙΕΑ, РМЕ ^РЕ<520К_о_11-нМ-СОЕУАбнМОР1Т(1-па1)У^РЕЙ(МеСк

РСП ° >Н₂

ΡΕθίΟΚ—0-11—НЫ-ССЕУАСНМС;Р1Т(1-па])УСрРЕк(МеОГ

Димеризация пептидов посредстовм ПЭГилирования Ν-концов.

Пептид (2,5 экв) и ПЭГ (РЕС-(8РА-ИН8)₂, 1 экв.) 811еаг\\Щег Согр, США растворяли в концентрации 0,25М в сухом ЭМЕ (диметилформамиде), получая в результате прозрачный раствор. Через 5 мин к этому раствору добавляли 10 экв. Э1ЕА. Смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 2 ч, после чего следует очистка обращенно-фазной ВЭЖХ на колонке С18. Очищенный пептид также подвергают очистке путем катионообменной хроматографии, схема которой описана ниже.

Например, в случае пептидного соединения АЕ33131 эту реакцию можно схематически изобразить следующим образом:

— --------3 о

ΗίΝ-ο-α-ι-γ-Α-ά-Η-Μ-ο-ρ-ι-τ-νν-ν-ό-α-ρ-ί-κ-ο-^Ν^ ί'

Н ?------5 О

Ν-ο-ο-ί-у-а-с-η-μ-θ-ρ-ι-τ-νν-ν-ο-β-ρ-ι-ΐΐ-β-^ΝΗ^

Димеризация пептидов посредством ПЭГилирования по С-концам.

Пептид (2,5 экв) и ПЭГ (РЕС-(8РА-ИН8)₂, 1 экв., 811еаг\\Щег Согр, США) растворяли в концентрации 0,25М в сухом ОМЕ (диметилформамиде), получая в результате прозрачный раствор. Через 5 мин к этому раствору добавляют 10 экв. Э1ЕА. Смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 2 ч, после чего следует очистка обращенно-фазной ВЭЖХ на колонке С18. Очищенный пептид также подвергают очистке путем катионообменной хроматографии, схема которой описана ниже. На

- 32 010099 пример, эту реакцию можно в общем виде изобразить следующим образом:

ΝΗ2

О

7. Ионообменная очистка пептидов.

Была исследована способность нескольких обменных носителей отделять полученный, как описано выше, конъюгат пептид-ПЭГ от непрореагировавшего (или гидролизованного) ПЭГ, в дополнение к их способности удерживать исходные димерные пептиды. Ионообменную смолу (2-3 г) загружали в 1 см колонку, после чего колонку переводили в натриевую форму (0,2-нормальную №1ОН загружали в колонку до достижения значения рН элюанта 14, приблизительно 5 объемов колонки), а затем в водородную форму (элюировали либо 0,1-нормальной НС1, либо 0,1 НОАс, до тех пор, пока рН элюанта не совпадал с рН загрузки, приблизительно 5 объемов колонки), за этим следовали три промывки в 25% водном растворе АС^ до достижения значения рН 6. Либо пептид до конъюгирования с ПЭГ, либо конъюгат пептид-ПЭГ растворяли в 25% водном растворе ΑСN и доводили значение рН до <3 при помощи ТЕА, после чего загружали в колонку. После промывки 2-3 объемами 25% водного раствора ΑСN и сбора 5 мл фракций пептид высвобождали из колонки путем элюции 0,1М раствором ИН₄ОАс в 25% водном растворе АС№, снова собирали 5 мл фракции. Исследование путем ВЭЖХ выявляло фракции, содержащие желаемый пептид.

Анализ на испарительном детекторе светорассеяния (ЕЬ8И) показал, что, когда пептид удерживался на колонке и его элюировали раствором ИН₄ОАс (обычно между фракциям 4 и 10), загрязнения неконъюгированным ПЭГ выявлено не было. Когда пептид элюировали исходным промывочным буфером (обычно первые две фракции), не было выявлено разделения желательного конъюгата ПЭГ и избыточного ПЭГ.

Следующие колонки успешно удерживали как пептид, так и конъюгат пептид-ПЭГ, а также успешно очищали конъюгат пептид-ПЭГ от неконъюгированного пептида.

Таблица1 Ионообменные смолы

Носитель	П роизводител ь
Мопо 8 НК. 5/5 сильная катионообменная загруженная колонка	Ашегзйат Вюзсхепсез
8Е53Са11и1ове, микрогранулярный сильный катионообменный носитель	АУЬайпап
8Р 8ерЬаго5е Газ! Γ!ο\ν сильный катионообменный носитель	Атегвйат Вю5С1епсез

- 33 010099

Пример 2. Способы анализа активности ш тйго.

В этом примере описаны различные способы анализа (тестирования) ш νιΙΐΌ, которые подходят для оценки активности и эффективности пептидов-агонистов ЭПО-рецептора согласно данному изобретению. Результаты этих тестов демонстрируют, что новые пептиды согласно этому изобретению связываются с ЭПО-рецептором и активируют опосредуемую ЭПО-рецептором передачу сигналов. Более того, результаты этих тестов показывают, что составы, содержащие новые пептиды, неожиданным образом демонстрируют повышеную аффинность связывания ЭПО-рецептора и биологическую активность по сравнению с описанными ранее пептидами-миметиками ЭПО.

Мономеры и димеры пептидов-агонистов ЭПО-рецептора готовят согласно способам, приведенным в примере 1. Эффективность этих пептидных мономеров и димеров оценивают путем последовательных тестов активности ш ν 11го для определения активности, включая анализ активации репортерного гена, анализ пролиферации, анализ конкурентного связывания и анализ К/ВОЕ-Э. Более подробно эти четыре способа анализа описаны ниже.

Результаты этих тестов активности ш νίΙΐΌ собраны в табл. 2 (для мономеров пептидов) и табл. 3 (для димеров пептидов). В этих таблицах приведены обозначения соединений и структура каждого протестированного пептида, а также экспериментальные результаты для каждого из этих четырех способов анализа. Эти результаты демонстрируют существенно повышенную эффективность новых пептидов согласно данному изобретению.

1. Анализ активации репортерного гена.

Этот способ анализа основан на применении клетки, несущей репортерный ген (репортерная клетка), полученной из линии В-клеток-предшественников мыши, ВаГ3/ЕроВ/СС8ЕВГок/1их. Эта линия репортерных клеток экспрессирует химерный рецептор, состоящий из внеклеточной части ЭПО-рецептора человека и внутриклеточной части Г-КСФ-рецептора человека. Далее, эту клеточную линию трансфецируют конструкцией, содержащей репортерный ген люциферазы, контролируемой промотором Гок. Активация этого химерного рецептора добавлением вещества, стимулирующего эритропоэз, вызывает экспрессию репортерного гена люциферазы и, следовательно, возникновение свечения при добавлении субстрата люциферазы - люциферина. Следовательно, уровень активации ЭПО-рецептора в таких клетках можно количественно определить, измерив активность люциферазы.

Клетки ВаГ3/ЕроВ/СС8ЕВГок/1их культивируют в среде ИМЕМ/Р12 (С1йсо), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (ЕВ8, Нус1опе), 10% супернатанта ХУЕН1-3 (супернатант культуры клеток ХУЕН1-3 коллекции АТСС #Т1В-68) и пенициллином/стрептомицином. Приблизительно за 18 ч до проведения анализа клетки переводят на среду ИМЕМ/Е12, дополненную 10% фетальной сыворотки (ЕВ8, Нус1опе) и 0,1% супернатанта ХУЕН1-3 (условия голодания). В день проведения анализа клетки 1 раз промывают средой ИМЕМ/Р12, дополненной 10% ЕВ8 (без супернатанта ^ЕН1-3), затем 1х10⁶ клеток культивируют в присутствии известных концентраций тестируемого пептида либо с ЭПО (Β&Ό 8ук1етк, Миннеаполис, Миннесота, США). В этом анализе одновременно тестируют серийные разведения тестируемого пептида. Планшеты для анализа инкубируют в течение 4 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО2, после чего в каждую лунку добавляют люциферин (81еабу-С1о, Рготеда, Мэдисон, Висконсин, США). После 5-минутной инкубации измеряют свечение на люминометре Раскагб Торсоип! Ьитшоте1ег (Раскагб 1пк1гите1к Со. Даунерс Гроув, Иллинойс, США). При помощи программного обеспечения Сгарй Раб строят график зависимости количества свечения от концентрации тестируемого пептида. Концентрацию тестируемого пептида, которая дает свечение, равное половине максимального значения, заносят в протокол как ЕС₅₀ (см. табл. 2 и 3: репортер ЕС₅₀).

2. Анализ пролиферации.

Этот способ анализа основан на применении линии В-клеток-предшественников мыши, ВаГ3, которые в результате трансфекции экспрессируют ЭПО-рецептор человека. Пролиферация полученной в результате клеточной линии, ВаЕ3/Са14/Е1к/ЕРОВ, зависит от активации ЭПО-рецептора. Степень пролиферации клеток количественно определяют при помощи тиазолила синего (МТТ), сигнал в анализе с МТТ пропорционален числу жизнеспособных клеток.

Клетки ВаЕ3/Са14/Е1к/ЕРОВ культивируют в центрифужных пробирках в среде ИМЕМ/Р12 (С1йсо), дополненной 10% фетальной сыворотки (ЕВ8, Нус1опе) и 2% супернатанта ХУЕН1-3 (коллекция АТСС #Т1В-68). Культивируемые клетки выдерживают в течение ночи в центрифужных пробирках при плотности 1х10⁶ клеток/мл в среде ИМЕМ/Р12, дополненной 10% ЕВ8 и 0,1% супернатанта ХУЕН1-3 (условия голодания). Затем выдержанные без супернатанта клетки дважды промывают фосфатным буферным раствором Дульбекко (С1йсо) и ресуспендируют до плотности 1 х 10⁶ клеток/мл в среде ИМЕМ/Е12, дополненной 10% ЕВ8 (без супернатанта \УЕН1-3). Затем аликвоты суспензии клеток объемом 50 мкл (~50000 клеток) вносят в трипликатах в 96-луночные планшеты для анализа. В эти 96-луночные планшеты добавляют аликвоты объемом 50 мкл (конечный объем в ячейке 100 мкл) серий разведений тестируемых пептидов-миметиков ЭПО либо 50 мкл ЭПО (Κ&Ό 8ук1етк 1пс., Минеаполис, Миннесота, США), либо Лгапекр™ (дарбепоэтин альфа, коммерчески доступный агонист ЭПО-рецептора, Лтдеп) в среде ИМЕМ/Р12, дополненной 10% ЕВ8 (без супернатанта ХУЕН1-3). Например, можно тестировать 12 разных

- 34 010099 разведений, конечная концентрация тестируемого пептида (или контрольного пептида ЭПО) в которых варьируется от 810 до 0,0045 пМ. Затем клетки в планшете инкубируют в течение 48 ч при 37°С. Затем в каждую лунку культурального планшета добавляют по 10 мкл МТТ (Воске П1адпокДск) и оставляют для инкубации на 4 ч. Затем реакцию останавливают добавлением 10% 8Ό8 (додецилсульфат натрия)+0,01нормальная НС1. Затем планшеты инкубируют в течение ночи при 37°С. Затем проводят спектрофотометрическое измерение поглощения в каждой лунке при длине волны 595 нм. При помощи ПО Сгарк Раб строят график зависимости поглощения от концентрации тестируемого пептида и рассчитывают ЕС₅₀ (см. табл. 3: пролиферация ЕС₅₀).

3. Анализ конкурентного связывания.

Расчеты конкурентного связывания проводят, используя способ анализа, в котором световой сигнал генерируется как функция близости двух гранул: стрептавидиновой гранулы-донора, покрытой биотинилированной пептидной меткой, связывающей ЭПО-рецептор, и гранулы-акцептора, к которой присоединен ЭПО-рецептор. Свет порождается в результате неизлучающего переноса энергии, в ходе которого первая гранула вследствие освещения высвобождает синглетный кислород, контакт с которым вызывает испускание света второй гранулой. Эти наборы гранул коммерчески доступны (Раскагб). Близость гранул порождается связыванием пептидной метки, связывающей ЭПО-рецептор, с ЭПО-рецептором. Тестируемый пептид, конкурирующий с пептидной меткой, связывающей ЭПО-рецептор, за связывание с ЭПО-рецептором, препятствует этому связыванию, что вызывает снижение свечения.

Более подробно данный метод представляет собой следующее. Добавляют 4 мкл серийных разведений пептида-агониста ЭПО-рецептора, либо положительного или отрицательного контроля, в лунки 384луночного планшета. После этого в каждую лунку добавляют 2 мкл смеси рецептора с гранулами. Смесь рецептора с гранулами состоит из 15 мкл стрептавидиновых (5 мг/мл) гранул-доноров (Раскагб), 15 мкл моноклонального антитела аЬ179 (5 мг/мл, это антитело распознает часть плацентарной щелочной фосфатазы, содержащуюся в рекомбинантном ЭПО-рецепторе), гранул-акцепторов, покрытых белком А (белок А будет связывать антитело аЬ179, Раскагб), 112,5 мкл разведения 1:6,6 рекомбинантного ЭПО-рецептора (продуцируемого клетками яичника китайского хомячка в виде белка, слитого с частью плацентарной щелочной фосфатазы, которая содержит целевой эпитоп для антитела аЬ179) и 607,5 мкл буфера А1ркадиек! (40 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 1 мМ МдС1₂, 0,1% БСА, 0,05% Ттеееп 20). Перемешивают постукиванием. В каждую лунку добавляют по 2 мкл биотинилированной пептидной метки, связывающей ЭПО-рецептор, АЕ33068 (конечная концентрация 30 нМ). АЕ33068, связывающий ЭПО-рецептор пептид (см. табл. 3 Репортер ЕС₅₀ (пМ)), готовят согласно способам, описанным в примере 1.

АРЗЗО68

Βίο!)η-ΟΩΕΥΑ(?ΗΜαΡΙΤ\ν^Γνί'9ΡΕΕΟ\_ ^Κ-ΝΗ₂ В1о!)п-аСкУАСНМСР1Т\УУСОРИ<С /

Перемешивают центрифугированием в течение 1 мин. Планшет закрывают пленкой Раскагб Тор 8еа1 и оборачивают фольгой. Инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. После 18 ч измеряют свечение на считывающем устройстве А1рка Оиек1 (Раскагб). Строят график зависимости свечения от концентрации пептида и анализируют при помощи Сгарк Раб или Ехсе1.

Концентрация тестируемого пептида, которая дает 50% снижение свечения по сравнению с наблюдаемым без тестируемого пептида, заносят в протокол как Κ.'₅₀ (см. табл. 2 и 3: Л^IС₅₀).

4. Анализ К/ВОЕ-Э.

Передача сигнала с ЭПО-рецептора стимулирует дифференцировку стволовых клеток костного мозга в пролиферирующие клетки-предшественники эритроцитов. В этом способе анализа измеряют способность тестируемых пептидов стимулировать пролиферацию и дифференцировку клетокпредшественников эритроцитов из плюрипотентных стволовых клеток костного мозга человека.

Для этого анализа делают серийные разведения тестируемого пептида в среде ШИМ (С1Ьсо), дополненной 10% РВ8 (Нус1опе). Затем эти серийные разведения либо положительный контроль (пептид ЭПО) добавляют к метилцеллюлозе до получения конечного объема, равного 1,5 мл. Затем смесь метилцеллюлозы и пептида тщательно перемешивают на вихревом смесителе. Размораживают аликвоты (100000 клеток/мл) СИ34+ клеток, полученных из костного мозга человека (Ро1е!юк/СатЬгех). Размороженные клетки осторожно добавляют к 0,1 мл 1 мг/мл ДНКазы (8!ет Се11к) в пробирке объемом 50 мл. Затем к клеткам осторожно добавляют 40-50 мл среды ГМЭМ: среду добавляют отдельными каплями по стенке пробирки объемом 50 мл до объема 10 мл, а затем медленно доливают оставшийся объем по стенке пробирки. Затем клетки центрифугируют при 900 об./мин в течение 20 мин и осторожно удаляют среду путем аспирации. Клетки ресуспендируют в 1 мл среды РМЭМ и подсчитывают плотность клеток на мл среды на предметном стекле гемоцитометра (аликвоту объемом 10 мкл помещают на предметное стекло, а плотность клеток считают как среднее число X 10000 клеток/мл). Затем клетки разбавляют в среде

- 35 010099

ΓΜΌΜ до плотности 15000 клеток/мл. Добавляют по 100 мкл разбавленных клеток на каждые 1,5 мл метилцеллюлозы вместе с пробой пептида (конечная концентрация клеток в анализируемой среде равна 1000 клеток/мл) и смесь перемешивают на вихревом смесителе. Ждут, пока исчезнут пузыри в смеси, а затем отбирают путем аспирации 1 мл, используя иглу с тупым концом. Добавляют по 0,25 мл отобранной смеси из каждой пробы в каждую из 4 лунок 24-луночного планшета (марки Ра1соп). Помещенные в планшет смеси инкубируют при 37°С во влажном инкубаторе с 5% содержанием СО₂ в атмосфере в течение 14 дней. Подсчет эритроидных колоний проводят, используя фазово-контрастный микроскоп (объектив 5Х-10Х, конечное увеличение 100Х). Концентрацию тестируемого пептида, при которой число образованных колоний составляет 90% максимального относительно наблюдаемого в положительном контроле с ЭПО, вносят в протокол как ЕС90 (см. табл. 2 К/ВОЕ-Э ЕС90).

5. Анализ конкурентного связывания радиолигандов.

Для измерения значений Κ'₅₀ пептидов согласно этому изобретению можно также использовать анализ конкурентного связывания альтернативных радиолигандов. В этом способе анализа измеряют связывание конъюгата ¹²Д-ЭПО с ЭПО-рецептором. Анализ предпочтительно проводить согласно со следующим иллюстративным протоколом.

А. Материалы.

Рекомбинантный химерный ЧЭПО-р/Ес	• Обозначение: КесошЬтап! Нишап ЕРО В/Рс СЫтега • Поставщик: В&О 8уз!етз (Миннеаполис, Миннесота, США) • Номер по каталогу: 963-ЕВ • Номер партии (Ьо! МитЬег): ЕОК033071 • Хранение: 4°С
Иодированный рекомбинантный эритропоэтин человека	• Обозначение: (3[!251]юдо!угозу1)Еп!Ьгорое!т, Питал гесотЬтаги, ЫдЬ арес1Г1с асйуйу, 370кВц, 10 μθΐ ((3[1251]йодотирозил)Эритропоэтин, рекомбинантный человеческий, высокая специфическая активность 370 кБеккерелй, 10 мкКи) • Поставщик: АшегзЬат Вюзаелсез (Пискатавей, Нью-Йорк, США) • Номер по каталогу: ΙΜ219-10μΟί • Номер партии: • Хранение: 4'С
Сефароза с белком С	• Обозначение: Ргокт-С ЗерЬагозе 4 Газ! Ρίον/ • Поставщик: Ашегзйат Вюзиепсез (Пискатавей, Нью-Йорк, США) • Номер по каталогу: 17-0681-01 • Номер партии: • Хранение: 4*С
Аналитический буфер	• Фосфатный буферный раствор (ФБР, РВ8), рН 7.4, содержащий 0.1% бычьего сывороточного альбумина и 0.91 азида натрия • Хранение: 4С

В. Определение подходящей концентрации рецептора.

Одну ампулу 50 мкг лиофилизированного рекомбинантного внеклеточного домена ЭПО-рецептора в виде белка слияния с Ес-фрагментом !дС1 человека восстанавливают в 1 мл аналитического буфера. Для определения соответствующего количества рецептора для использования в анализе смешивают 100 мкг серийных разведений этого препарата рецептора с йодированным рекомбинантным эритропоэтином человека (¹²⁵ЬЭПО, приблизительно 20000 импульсов в минуту в 200 мкл) в 12x75 мм полипропиленовых пробирках. Пробирки закрывают крышками и помещают для осторожного перемешивания в шейкер ЬаЬОнаке с вращающейся платформой при 4°С.

На следующий день в каждую пробирку добавляют 50 мкл 50% суспензии сефарозы с белком С. Затем пробирки инкубируют в течение 2 ч при 4°С при осторожном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют в течение 15 мин при 4000 об./мин (3297С) для осаждения сефарозы с белком С. Супернатанты осторожно отделяют и удаляют. После трехкратной промывки 1 мл аналитического буфера при 4°С измеряют радиоактивность осадка счетчиком гамма-квантов Ае11ас Αί/агб. Затем анализируют результаты и рассчитывают разведение, необходимое для того, чтобы достичь 50% максимального значения связывания.

- 36 010099

С. Определение Κ\₀ пептида.

Для определения Κ.'₅₀ пептида согласно настоящему изобретению 100 мкл серийных разведений пептида смешивают со 100 мкл рекомбинантного рецептора к эритропоэтину (100 пг на пробирку) в 12x75 мм полипропиленовых пробирках. Затем в каждую пробирку добавляют по 100 мкг йодированного эритропоэтина человека (¹²⁵ЬЭПО), пробирки закрывают крышками и осторожно перемешивают в течение ночи при 4°С.

На следующий день определяют количество связанного ¹²⁵ЬЭПО, как описано выше. Анализируют результаты и рассчитывают значение Κ₅₀, используя ПО Сгарйраб Ргып уегЧон 4.0, Сгарй 8оГ1теаге, Ечс. (Сан-Диего, Калифорния, США). Анализ предпочтительно повторяют 2 или более раз для каждого тестируемого пептида для того, чтобы в итоге получить 3 или более определенных в трипликатах воспроизводимых значений ГС50.

6. Обсуждение.

Результаты анализа активации репортерного гена ίη νίΐΐΌ для мономеров пептидов согласно настоящему непосредственно сравнивали с результатами того же анализа для родственных пептидных последовательностей, раскрытых ранее (см. АЕ31552 и АЕ31748 в табл. 2), а именно

ОСЕУАСНМОРМТУСрРЬКО 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 32 и

СОЬУАСНМСРМТ(1 -па1)УСОРЕКО 8ЕО ГО ΝΟ: 33.

Эти результаты демонстрируют существенно улучшенную эффективность мономеров новых пептидов согласно данному изобретению, поскольку эффективность димеров новых пептидов превышала эффективность мономеров описанных ранее пептидов в 3-7,5 раз. Затем эти мономеры новых пептидов использовали для приготовления димеров новых пептидов еще большей эффективности и активности.

Таблица 2

Анализ активации репортерного гена ίη νίΙΐΌ для пептидных мономеров

Обозначение соединения	Мономер пептида	Репортер ЕС50 (пМ)
АР31552	1 1 ССЬУАСНМСРМТтеУСОРЬКС-МН-,	100
АР31748	1 1 С6ЬУАСНМСРМТ(1-па1)УС9РЬЯС-НН2	40
АР33128	6ϋΕΥΑάΗΜϋΡ1Τνν6,)ΡίΚα-ΝΗ2	13
АР36729	1 1 (Ас6)01 .Υ АСНМОРГП1 -па!) УСрРЬКК-МНЗ	13.3

Таблица 3

Анализ активации репортерного гена ίη νίΙΐΌ для пептидных димеров

Обозначение соединения	Пептидный димер	’епорте Р ЕС50 (рМ)	Пролиферация ЕС50 (РМ)	а<2 1С50 (пМ)	с/вги-е ЕС90 (пМ)
АЕ33065	ГУАСНМСРПУ/УСОРЬКСх. ^κ-νη2 ГУАСПМОРИТЛ/СОРГкСХ	300
АЕ34602	СЬУАСНМОР1Т\УУ^ОРЬК< Χ-νη2 ОЬ УАСНМСРПТУУСОРЬК.'	727
АЕ34395	ОЬУАСНМСИТУ/У^ОРЬКСк ^κ-νη2 ΟΕΥΑΟΗΜΟΡΙΤν/νσρΡίΚίΧ	100
АГ34601	ССЬУАОТМСРПУЛ'/оРЬГТх, Ν·νιι2 СОЬУАСНМбРтУУСОРЬК '	100
АЕ32579	«'.(,ΕΥΑόΗΜΟΡίιν,'ν/ορι.ΚΓίχ. χκ-νη2 осьуаснмсрпхуусорькс/ *	47	142	1.7	3

- 37 010099

АЕ33068	ВюНщСОЕУАСНМОР1ТХУУС^РЬКСК ^Κ-ΝΗ2 ВюПп-СОЬУАСНМСРПЭУУСрРЬКб <	170
АР33131	(^ΟίΥΑάίΜΟΡΙΤ^ίίοΡίΚΌ-ΝΗ, РЕО з 4К 60Ι.ΥΑ<ρΗΜαΡΙΤ\ννψΡΙ.Γ<6-ΝΗ;	158		18
АЕ34351	бСЬУАСНМбРПХУУ^рРЬКОк ^К-АЬх-АЬх аОЬУАСНМСР1Т\¥УС9РЬКС '	50
АР34350	РЕС5К_о-Д-ООЬУЛСНМОРП^'у/оРЬРСк о >.νη2 ΡΕΘ6κ—0-и-СОЬУАСНМСР1ТУ.’УСГ>Р1К<3-/	267		16
АГ34753	(АсО)6ЕУАСНМСРГ™УСОРЬК6\ К-АЬх-Акх (Ас6)СЬУА(рНМСР[Т\УУ^0РЕКО	73			1.2
АЕ34757	1.........Ί (АсС)6ЬУАСНМбР1Т\¥УСрРЬКО\ К-АЬх-АЬх-РЕСзк (АсО)СЬУА^НМСР1Т\УУ<^9РЬКб '	но			2.7
АЕЧ5062	(АсС)СЕУАСНМ6Р1Т\УУСрРЬКС\ Κ-Λ1ιχ-ΑΗχ-ΡΕ<ϊ2οκ (АсС)СЕУА^НМОР1Т^¥У^рРЬкС	91			1.6
АР35218	(АсахзьУАСНмоит^усорькаака^ κ-νη2 (АсС)ОЬУА1рНМОРГ1У.'У^ОРЬКССКО Х	27
АГ35462	(АсОХЗЬУАСНМОР1Т1УУСрРЬКС\ ^каа (АсО)СЬУА^НМОР1Т\¥У^ОРЬКС	194
АЕ35464	(АсС)СЬУ АСНМ6Р1ТОУСрРЕк6\ κκ-νη2 (АсО)ОЬУА^НМОР1ТУА^9Р1_К<}'	181
АЕ33197	ССЬУА^НМОРЩРпаОУСОРЬКОх Χ-ΝΙ1, ООЬУАСНМСРЩЬпаОУСрРЬКС/	80
АР34994	С0ЬУАСНМ6Р1Т( 1ч1а1)У<^РЬН(Ме6к ^Κ-ΝΗ2 СОЬУАСНМСРЩ! -па1)УСрРЕК(Ме<ЗГ	27	170		3.7
АР35О83	РЕС2г|К_о-и-СС1Л’АСНМОРГ1Т1-па1)УСОР(,к(МеОк о %-ын2 РЕС2ок— 0-“-ОаЬУАСНМОР1Т(1-па1)УСОРЬК(Ме6К	92
АЕ35525	(АсС)СЬУА(?НМСР1Т(1 -па1)у00РЬК(МеО>—ΝΗ / ΝΗ2 ь (АсСК}ЬУАСНМ6Р1Т(1-па1)УСрРЫ<(МеО)—ΗΝ ΝΗ-ч /—' 1__________________1 '—О	57	57		3

- 38 010099

АР35526	(АсС)СЬ¥ЛСНМ<1Р1Т(|-па|)\'С<?РЬД(МсС)--ΝΗ ί к,и осе > ΝΗΑ^ν °К Ь (АсС)ОЬУАСНМОР1Т(1-па1)УС0РЬК(Меа)-ΗΝ ΝΗ-\_ ,—' РЕС20к Ίί^ 0	900	800		13
АР35563	(АсС!)<ЗЕУАСНМаРГ1(2-па1)УС0Ри<(МеС)--ΝΗ > ΝΗ /РЕбзок (АсС)6Ь¥АСНМ6Р1Т(2-па1)УСС}Р1Ж(Ме6>- ΗΝ ΝΗ^^-'	135	47		3
АЕ35575	(Αο6)ΟΣΥΑ€ΗΜΟΡΙΤ\ννές>ΡΕΚ6--ΝΗ > ΝΗ^ΡΕΟ20Κ Ъ’ 5 θ (Аса)аЕУАСНМСР11А¥УС<ЭРЬКС-™ ΝΗ-\	127	57,000		1.1
АЕ35592	(АсЩОЬУАСНМОРПТУУ^ОРЬКа--ΝΙΙ / NN ζΡΕ<330κ (АсО)ОЬ¥АСНМОР1Т\¥УСОРЬКО-НМ N11 д. '	67	40		1.3
АГ35593	(Αία)θίΥΑ0ΗΜθΡΐτ\ννόθΡίΐ«5—νη > ΝΗ О < (Аса^ЬУАСНМбИТХУУСЦРЬКС-НЫ'гЩд ,—' 1-------------1 '—О	76	32		1.5
АР35594	1 1 (АсО)аЬУАСНМОР1Т(2-па1)УСОРЬК(Ме<;)--ΝΗ / ΝΗ А < о Г <ЕО»К (АсО)ОР¥АСНМСР1Т(2-па1)УСС?РЕ1<(МеС)-нц^МНл 1-----------------1 '—О	54	40		2.2
АЕ35219	ζΝΗ^ζΡΕΘ2οκ / θ (Асо^ъУАснмопт'Л'УсоРЬКСС-ин^у-с О ΝΗ $4° ΜοΓι)6ίΥΑ0ΗΜΓιρ1Τψν€0ΡΕΚΟ6-ΗΝ ΝΗ2	403
АР32876	ООЬУА0н(Н5ш)Ор1Т1УУС0рЫ<О \ κ-νϊι, <ЗаЬУАСН<Нзт)ар1Т’Л'УСррЬКС ' 1____________________________________________________1	100
АЕ32881	СЮЬУА(!:Н(Н5т)бР1Т(1-па1)У^9РЬКС . ^κ-νη2 ССЬ¥АСН(Нбт)6Р1Т(1-11а1)УСрРкК6	100			11

- 39 010099

АР35179	(АсО)ОЕ¥АСН(Няп)СР1Т( 1 -паЦубоРЬКО . К-Акх-АЬх (Ас6)СЬУАСН(Н5т)СР1Т(1-па1)УСрРЕК6	57			3.7
АР35180	(Ас6)0ЬУАСН(Нз1пК}Р1Т( 1-па1)УС0РЬЙС К-АЬх-АЬх-РЕСзок (АсС)СЬ¥АСН(Н5тКЗРГТ(1-па1)УС0РЕК6 '	303
АР35463	(АсС)СЬ¥АСН(Н5ш)ОРЩ1-па1)У<!дРЫЦМеО). ^КСО (АсО)С.Ь¥АСН(Л8т)аР1Т(1-па1)УСОРЬК(МеС)-/	125
АЕ35О9О	С1бЬ¥АСН(Н5т)СР1Т^Л/0ОРЕК6(МеС) ^κ-νη2 6СЬ¥АСН(Нзт)6Р1Т\УУС0РЕКС(Ме6) '	35	190		3.7
АЕ35148	РЕС20к_о—(Аса)СЪУАСН(№тК;Р1Т(1-па1)УС0РЬК(МеСК к-хп, РЕСгок—О—(АсС,)С1.УАСН(Н<.т)С:Р1Т(1-11а1)УСОР1.К(Мс<,)<	3600
АГ35149	(Ас6)СЬ¥АСН(Н5П1КдР1Т(1-па1)У^0РЬК(Ме6) —ΝΗ / ΝΗ2 (АсС)СЬ¥АСН(Нзт)ОР1Т(1-па1)УС0РЬК(Ме6)—ΗΝ ΝΗ-Α /—' I__________________1 —о	43	57		2
АГ35168	1 1 О (Ас<3)ОЕУАСН(Н£т)ОР1Т(1-па1)¥С0РЕВ.(Ме6)—ΝΗ II „„ Ή V “ (АсО)ОЬ¥АСН(Нзт)ОР1Т(1-па1)УСОРЕК(МеО) -ΗΝ ΝΗ-^ /--1 ρΕθ О	1800
АР35361	{АсО)ОЬ¥АСН(Нзт)СР[Т(2-па1)¥С0РЬК(МеС). ^κκ-νη2 (АсО)СЕ¥АСН(Н5т)ОР1Т(2-па1)¥С0РЬК(МеО}^	77
АР35595	(АсО)аЬ¥А^Н(Н5т)ОР[Т(2-па1)У^ОРЕК(МеО)__мн > РМу/РЕбгок /о Го >4 9 (АсО)СЬ¥АСН(Н5т)<ЗР1Т(2-па1)УСОРкК(МеО) —ΗΝ N11д ,—> 1_____________________1 '-о	65	42		1.5
АЕ35564	1 1 (АсС)СЬ¥АСН(Няп)ОР1Т(2.па1}УСОРЕР(МеО)__мн > НН.ЕЗзок /о Го >4 о (АсО)аЪ¥АСН(Н5ш)ОР1Т(2-па1)УСОРЕК(МеО) -ΗΝ N11 д 1_____________________1 '-о	887	270		4.5

Пример 3. Способы анализа активности ш у1уо.

В этом примере описаны различные способы анализа ш у1уо, которые подходят для оценки активности и эффективности пептидов-агонистов ЭПО-рецептора согласно данному изобретению. Димеры пептидов-агонистов ЭПО-рецептора готовят согласно способам, приведенным в примере 1. Активность этих пептидных димеров ш у1уо оценивают в последовательных тестах, включающих метод с использованием послегипоксийных (постгипоксийных) полицетемических мышей и анализ ретикулоцитов. Ниже эти два анализа описаны более подробно.

1. Способ анализа (биотест) с использованием постгипоксийных полицетемических мышей.

Активность тестируемых пептидов ш у1уо измеряют в способе биологического анализа, разработанном на основе метода постгипоксийных полицетемических мышей, описанного в Со!ек & ВапдРат (1961), №11иге 191: 1065-1067. В этом способе анализа исследуют способность тестируемого пептида функционировать в качестве миметика ЭПО, т.е. активировать ЭПО-рецептор и индуцировать образование новых эритроцитов. Образование эритроцитов количественно оценивают по включению радиомеченного железа в гемоглобин образуемых эритроцитов.

Мышам линии ВЭР1 позволяют акклиматизироваться к условиям окружающей среды в течение 710 дней. Определяют массу тела всех животных и животных с низкой массой (<15 г) не используют.

- 40 010099

Мышей подвергают последовательным тренировочным циклам в камере с низким давлением общей продолжительностью 14 дней. Каждый 24-часовой цикл состоит из 18 ч при давлении, равном 0,40±0,02% атмосферного, и 6 ч при нормальном давлении окружающей среды. После тренировки мышей держат при нормальном давлении окружающей среды в течение дополнительных 72 ч перед началом дозирования.

Тестируемые пептиды или стандарты рекомбинантного ЭПО человека разводят в разбавителе ФБР+0,1% БСА (ФБР/БСА, РВ8/В8А). Маточные растворы мономера пептида вначале солюбилизируют в диметилсульфоксиде (ДМСО, ЭМ8О). Группы отрицательного контроля включают одну группу мышей, которым путем инъекции вводят только ФБР/БСА, и одну группу мышей, которым путем инъекции вводят 1% ДМСО. В каждую группу дозирования входят 10 мышей. Инъекции мышам делают подкожно (в заднюю часть шеи), вводя по 0,5 мл соответствующей пробы.

Через 48 ч после инъекции пробы мышам вводят путем внутрибрюшинных инъекций 0,2 мл Ре⁵⁹ (Иироп!, NΕN) для получения дозы, приблизительно равной 0,75 мкКи/мышь. Массу тела мыши определяют через 24 ч после введения Ре⁵⁹, а через 48 ч после введения Ре⁵⁹ мышей забивают. У каждого животного путем пункции сердца отбирают кровь и определяют гематокрит (в качестве антикоагулянта применяли гепарин). Каждую пробу крови (0,2 мл) исследуют на включение Ре⁵⁹ при помощи счетчика гамма-квантов Раскагб. Нереактивных мышей (т.е. мышей с включением радиоактивного вещества меньшим, чем в группе отрицательного контроля) исключают из соответствующего набора данных. Мышей со значениям гематокрита ниже чем 53% гематокрита группы отрицательного контроля также исключают.

Результаты получены из наборов по 10 животных для каждой экспериментальной дозы. Рассчитывают среднее количество включенной радиоактивности (импульсов в минуту) в пробах крови от каждой группы.

2. Анализ ретикулоцитов.

Нормальным мышам линии ВИР1 в течение 3 дней (последовательно) вводят (0,5 мл путем подкожной инъекции) либо контрольный ЭПО, либо тестируемый пептид. На третий день мышам также вводят дозу (0,1 мл путем внутрибрюшинной инъекции) комплекса декстран железо (препарат 1гоп бех!гап, 100 мг/мл). На пятый день мышей анестезируют углекислым газом (СО₂) и отбирают кровь путем пункции сердца. Определяют процент (%) ретикулоцитов в каждой пробе крови путем окраски тиазоловым оранжевым и поточного цитометрического анализа (программа гебс-соип!). Гематокрит определяют вручную. Уточненный процент ретикулоцитов определяют по следующей формуле:

%^РЕТИКУ_ТОЧНЕННЫЙ⁼%^РЕТИКНАБЛЮДАЕМЫЙ^{х(гематок}р^итИНДИВИДУАЛЬНЫЙ^{/гематок}р^итНОРМАЛЬНЫЙ⁾

3. Гематологический анализ.

Нормальным мышам линии СИ1 4 раза в неделю вводят путем болюсной внутривенной инъекции либо положительный контроль ЭПО, либо тестируемый пептид, либо разбавитель. Диапазон доз, выраженных в мг/кг, положительного контроля и тестируемого пептида исследуют путем варьирования концентрации соединения в лекарственной форме. Вводимые путем инъекции объемы равны 5 мг/кг. Контрольная группа, получающая разбавитель, состоит из 12 животных, в то время как в каждую из оставшихся групп дозирования входит по 8 животных. Регистрируют жизнеспособность (ежедневно) и массу тела (еженедельно).

Получающих дозы пептидов мышей лишают питания, а затем анестезируют вдыхаемым изофлюраном и отбирают пробы крови (перед смертью мышей) путем пункции сердца или брюшной аорты в день 1 (для мышей контрольной группы, получающих разбавитель) и в дни 15 и 29 (4 мыши/группа/день). Кровь переносят в пробирки марки Vасиΐа^ηе^®. Предпочтительным антикоагулянтом является этилендиаминтетраацетат (ЭДТА, ЕИТА).

Образцы крови исследуют с целью измерения образования эритроцитов в конечных точках и определения таких физиологических показателей, как гематокрит, гемоглобин и общее число эритроцитов, с применением автоматизированных клинических анализаторов, хорошо известных в данной области (например, производства СоиНег, 1пс.).

Данные для типичных пептидов-агонистов даны в табл. 4. Результаты даны в форме повышения гематокрита (Н!) в процентах (%) по отношению к контрольной группе получающих инъекции разбавителя мышей на 15 день и на 29 день. Указанные пептидные соединения вводили тестируемым мышам в дозе 1 мг/кг.

- 41 010099

Таблица 4

Гематологический анализ ίη угуо для пептидных димеров

Обозначение соединения

Пептидный димер

Зовышение

Ηΐ (%) в день 15

Повышение

Ηΐ (%) в день 29

АР35526

АГ35594 (АсО )Οί ΥΑ СН МО ΡΙΤ( I - па!) УСОРСК(МеО)- ΗΝ (АсС)С!УАСНМСР1Т(1-паПУСрР1Й|МсС:>-НЫ (АсС)6Ь¥А(!мМСР1Т(2-па1)У<!:0РЬК(МеС)— (АсО)СЬУАСНМ<ЗР1Т(2-паПУСОРЬК(МеС)-№Ч (АсС)СЬУАСНМОР1Т(2-па1)УСОРЬК(МеО)—ΗΝ (АсО)ОТУА^НМОР1Т(2-па1)У(!оРкК(Меа (АсС)6Е¥АСНМСР1Т( 1 -па1)уЦрЬШМсС’|-(Ас0)0кУАСНМ0Р1Т(Ьпз1)УС0Р1.К<Ме0

Объем настоящего изобретения не ограничен описанными здесь конкретными способами реализации. Действительно, из предшествующего описания и сопутствующих рисунков специалисту в данной области очевидны разнообразные модификации данного изобретения, дополняющие описанные здесь. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы.

Описание изобретения содержит цитаты и обсуждение многочисленных источников, включая патенты, патентные заявки и различные публикации. Цитирование и/или обсуждение таких источников приведено просто для того, чтобы сделать более ясным описание настоящего изобретения, но не является признанием того, что какая-либо из этих ссылок является прототипом по отношению к настоящему изобретению. Все источники, цитируемые и обсуждаемые в данном описании, включены в него в полном объеме путем ссылки, и в такой же степени включен путем ссылки каждый источник отдельно.

Claims (33)

1. Пептид, содержащий примерно от 17 до 40 остатков аминокислот и содержащий последовательность аминокислот

1Л'ЛСНХоСР1ТХ₁ УСЦРЬВ (ЗЕЦ ГО N0: 1), где Х₀ обозначает остаток, выбранный из метионина (М) и метилового эфира гомосерина (Нкт), а Х₁ обозначает остаток, выбранный из триптофана (^), 1-нафтилаланина (1-пз1) и 2-нафтилаланина (2-па1), где указанный пептид связывается с рецептором к эритропоэтину (ЭПО-рецептором) и активирует его.

2. Пептид согласно п.1, отличающийся тем, что Ν-конец указанного пептида ацетилирован.

3. Пептид согласно п.1, отличающийся тем, что указанный пептид содержит последовательность аминокислот, выбранную из

- 42 010099

ЕУАСНМСР1Т\¥УСфРЕК

ЬУ АСНМ6Р1Т( 1 -па1) УСфРЬК

ЕУАСНМ0Р1Т(2-па1)УСфРЬР

ООЕУАСНМОРПУУУСфРЕКО

ООЕУАСНМ6Р1Т(1-па1)УСфРЕКО

6ОЕУАСНМ(ЗР1Т(2-па1)УСфРЕКО (АсО)СЕУАСНМСР1™УСфРЕК6 (АсО/СБУ АСНМСРГЦ1 -па1) УСфРЕКО (АсО)ОЕУАСНМ6Р1Т(2-па1)УСфРЕКС

ООЕУАСНМ(ЗР1Т^,Л’УСфРЕК.(МеСг) 6ОЕУАСНМСР1Т(1 -паЦУСфРЕЩМеС)

С36ЕУАСНМОР1Т(2-паГ)УСфРЕЕ(МеО) (АсО)ОЕУАСНМ6Р1ТХ¥УСфРЕКО(МеО) (АсО)ОЕ У АСНМОР1Т( 1 -па1)УСфР1 .ΕΟ(ΜβΟ) (АсС)ОЕУАСНМОР1Т(2-па1)УСфРЕК6(МеС)

ЕУАСН(Н5т)СР1Т\УУСфРЕК ЕУАСН(Н81П)ОР1Т( 1 -паПУСрРЬК ЕУАСН(Н5т)ОР1Т(2-па1)УСфРЕК 00ЕУАСН(Н5т)0Р1Т\¥УСфРЕР0

О6ЕУАСН(Н5т)ОР1Т(1-па1)УСфРЬКО

ООЕУАСН(Н5т)ОР1Т(2-па1)УСфРЕКО (АсО)СЕУАСН(Н5т)ОР1Т\¥УСфРЕКО (АсО)ОЕУАСН(Нзт)ОР1Т(1-паГ)УС0РЕКО (АсО)СЕУАСН(Нзт)ОР1Т(2-па1)УСфРЕКО

00ЕУАСН(Н5т)6РГТ\¥УСфРЕК(Ме0)

ОСЕУАСН(Н5ш)ОР1Т(1-па1)УСфРЕР(МеО)

ОСЕУАСН(Н5т)СР1Т(2-па1)УСфРЕК(МеО) (АсС)0ЕУАСН(Н5П1)6Р1Т1¥УСфРЕК0(МеС) (АсС)ОЕУАСН(Нзт)ОР1Т(1-па1)УСфРЕК.О(МеО) (АсО)СЕУАСН(Н5т)СР1Т(2-па1)УСфРЕКО(МеО) (8Еф ГО N0: 2); (8Еф ГО ΝΟ: 3);

(8Е<3 ГО ΝΟ: 4); (8Еф ГО ΝΟ: 5);

(ЗЕф ГО N0: 6);

(8Еф ГО N0: 7); (8Еф ГО ΝΟ: 8); (8ЕфГОГЮ:9); (8ΕφΙϋΝ0: 10); (ЗЕфГОИО: 11); (8ΕφΠ3ΝΟ: 12); (8ΕφΙϋΝ0: 13); (8Еф ΙΌΝΟ: 14);

(8Еф ΙΠΝΟ: 15);

(ЗЕф ΙΟΝΟ: 16);

(8Еф ΙΟΝΟ: 17); (8Ε0ΙΟΝΟ: 18); (δΕφΙϋΝΟ: 19); (ΒΕφΙϋΝΟ: 20); (8ΕφΙΌΝΟ: 21); (5Еф Π3ΝΟ: 22); (ΚΕφΙΟΝΟ: 23); (δΕφΙϋΝΟ: 24); (8Εφ Ιϋ ΝΟ: 25); (ЗЕф ГО ΝΟ; 26); (8Ε0ΙΟΝΟ: 27); (ЗЕф ГО ΝΟ: 28); (8Εφ ГО ΝΟ: 29);

(8Εφ Ιϋ ΝΟ: 30); и (δΕφΙϋΝΟ: 31).

4. Пептид согласно п.1, отличающийся тем, что указанный пептид представляет собой мономер, димер или гомодимер.

5. Пептид согласно п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит один или более водорастворимых полимеров, ковалентно связанных с указанным пептидом.

6. Пептид согласно п.5, отличающийся тем, что указанный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ).

7. Пептид согласно п.6, отличающийся тем, что указанный ПЭГ содержит линейную неразветвленную молекулу, имеющую молекулярную массу примерно от 500 до 60000 Да.

8. Пептид согласно п.7, отличающийся тем, что указанный ПЭГ имеет молекулярную массу меньше чем примерно 20000 Да.

9. Пептид согласно п.7, отличающийся тем, что указанный ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 20000 до 60000 Да, предпочтительно примерно от 20000 до 40000 Да.

10. Пептид согласно п.7, отличающийся тем, что два фрагмента ПЭГ ковалентно связаны с указанным пептидом, причем каждый из указанных ПЭГ содержит линейную неразветвленную молекулу.

11. Пептид согласно п.10, отличающийся тем, что указанный ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 20000 до 30000 Да.

12. Пептидный димер, содержащий:

(a) первую пептидную цепь, (b) вторую пептидную цепь и (c) линкерный фрагмент, соединяющий указанные первую и вторую пептидные цепи, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из указанных первой пептидной цепи и второй пептидной цепи имеет примерно от 17 до 40 остатков аминокислот в длину и содержит последовательность аминокислот

1.УАСНХ(|С1Р1ТХ_]УСфРЕК (ЗЕф Ιϋ ΝΟ: 1),

- 43 010099 где Х₀ обозначает остаток, выбранный из метионина (М) метилового эфира гомосерина (Нкт), а Х₁ обозначает остаток, выбранный из триптофана (^), 1-нафтилаланина (1-па1) и 2-нафтилаланина (2-па1), где указанный пептид связывается с рецептором к эритропоэтину (ЭПО-рецептором) и активирует его.

13. Пептидный димер согласно п.12, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из указанной первой пептидной цепи и указанной второй пептидной цепи содержит последовательность аминокислот, выбранную из

ЬУАСНМСРГПУУСрРЕК

Б УАСНМСР1Т(1 -па1)УСрР1 .К

ЕУАСНМ6РГГ(2-па1)УСрРЕК

ОбЕУАСНМОРПУ/УСрРЕКО

0СЬУАСНМ6Р1Т(Ьпа1)УС(?Р[Ж6

6ОЬУАСНМОР1Т(2-па1)УС0РЕкО (АсС)ОЬУАСНМСР1Т)УУС9РЬВО (Лс<1)С;ЬУАС11М<1Р1Т(1-па1)УСС)РГ.кС (Ас6)0ЕУАСНМ6Р1Т(2-па1)УСрРЕКС

СОЕУАСНМСР1ТтеУСС)РЕЕ(МеС)

СбБУАСНМОРЩ 1-па1)УСрРЕК(МеС)

ООЕУАСНМОР1Т(2-па1)УСрРЕЕ(МеО) (АсО)СЕУАСНМОР1Т1УУСрРЕКО(МеО) (АсО)СЕУАСНМОР1Т( 1 -па1)УСрРЕКС(Меб) (АсС)СЕУАСНМОР1Т(2-па1)УС<ЗРЕКО(МеО)

ЕУАСН(Н5т)СР1ТУ/УСрРЕК

ЕУАСН(Нзт)6Р1Т(1 -па1)УС0РЕЯ

ЕУАСН(Нзт)<ЗР1Т(2-па1)УС<2РЕВ.

6СЕУАСН(Нзт)6Р1Т1УУСрРЕКС

С<ЗЕУАСН(Н5т)6Р1Т(1-паДУСфРЕКО

О6ЕУАСН(Н5т)ОР1Т(2-па1)УС0РЕКО (ΑοΟ)<3ΕΥΑΕ:Η(Η5ιπ)ΟΡΠΆ'УСрРЬЕО (АсО)ОБ УАСН(Н5т)ОР1Т( 1 -па1)УСрРЕК6 (АсО)ОЕУЛСН(Нзт)ОР1Т(2-па[)УСрРЕКС

ООЕУАСН(Нзт)ОРГГ\УУСфРЕК(МеО)

ОСг1.¥АСН(Н5т)СР1Т( 1 -паДУСрРЕЩМеС·)

ООЕУАСН(Н8т)ОР1Т(2-па1)УСфРЕК(МеО) (АсО)ОЕУАСН(Н8т)ОР1Т1¥УСрРЕКО(МеО) (АсС)СЕ¥АСН(Нзт)ОР1Т(1-па1)УСрРЕКС(МеО) (АсС)ОЕУАСН(Н8т)ОР1Т(2-па1)УСЦРЕКС(МеО)

14. Пептидный димер согласно п.12, отличающийся тем, что указанный линкерный фрагмент имеет формулу (ЗЕр ГО N0: 2); (ΞΕζΗβΝΟ: 3); (8ΕφΙϋΝ0: 4); (ЗЕр ГО ΝΟ: 5); (ЗЕР ГО ΝΟ: 6); (ЗЕр ΙϋΝΟ: 7); (ЗЕР ΙϋΝΟ: 8); (ЗЕр ГО ΝΟ: 9); (ЗЕр ΙΟΝΟ: 10); (ЗЕ(? ΙϋΝΟ: 11); (ЗЕр ΙϋΝΟ: 12); (ЗЕР ГО N0: 13); (ЗЕр ГО N0: 14); {ЗЕр Ιϋ ΝΟ: 15); (ЗЕр ГО N0: 16); (8Ε01ΟΝΟ: 17); (5Ер ΙϋΝΟ: 18); (ЗЕР ГО ΝΟ: 19); (ЗЕр ГО ΝΟ: 20); (ЗЕр ГО N0:21); (ЗЕр ГО ΝΟ: 22); (8Е<2 ГО ΝΟ: 23); (ЗЕр ГО N0: 24); (ЗЕр ГО N0: 25); (8ΕΡΙΟΝΟ: 26); (ЗЕр IΟΝΟ: 27); (8ΕρΐϋΝΟ: 28); (8Ε<3 ГО ΝΟ: 29); (8ΕρΐϋΝΟ: 30); и (8ЕС) ΙΩΝΟ: 31).

ΝΗ-Κ₃-ΝΗ-, где В3 обозначает низший (С1-6)алкен.

15. Пептидный димер согласно п.14, отличающийся тем, что указанный линкерный фрагмент представляет собой остаток лизина.

16. Пептидный димер согласно п.12, отличающийся тем, что указанный линкерный фрагмент имеет формулу

-СО-(СН₂)„-Х-(СН₂)_т-СОгде п является целым числом от 0 до 10, т является целым числом от 1 до 10, X выбирают из О, 8, ^СН₂)^В_Ь N^(0^)^^! и СΗNΒ₁, В! выбирают из Н, Вос и СЬх, а р является целым числом от 1 до 10.

17. Пептидный димер согласно п.16, отличающийся тем, что каждое из чисел п и т равно 1, X обозначает NСО(СΗ₂)_рNΒ1, р равно 2, а В, обозначает Н.

18. Пептидный димер согласно п.12, отличающийся тем, что дополнительно содержит водорастворимый полимер.

19. Пептидный димер согласно п.18, отличающийся тем, что указанный водорастворимый полимер

- 44 010099 ковалентно связан с линкерным фрагментом.

20. Пептидный димер согласно п.12, отличающийся тем, что дополнительно содержит спейсерный фрагмент.

21. Пептидный димер согласно п.20, отличающийся тем, что указанный спейсерный фрагмент имеет формулу

-ΝΗ^Ηζία-Ιο^σΗ^ι^ΟΗ^-γ-, где каждое из чисел α, β и ε является целым, значение которого независимо выбрано из чисел от 1 до 6, δ равно 0 или 1, γ является целым числом, выбранным из чисел от 0 до 10, а Υ выбирают из ИН или СО, при условии, что β равно 2, при γ большем чем 1.

22. Пептидный димер согласно п.21, отличающийся тем, что каждое из чисел α, β и ε равно 2, каждое из чисел γ и δ равно 1, а Υ обозначает ΝΠ

23. Пептидный димер согласно п.20, отличающийся тем, что дополнительно содержит один или более водорастворимых полимеров.

24. Пептидный димер согласно п.23, отличающийся тем, что указанный водорастворимый полимер ковалентно связан со спейсерным фрагментом.

25. Пептидный димер согласно п.18 или 23, отличающийся тем, что указанный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ, РЕО).

26. Пептидный димер согласно п.25, отличающийся тем, что указанный ПЭГ представляет собой линейный неразветвленный ПЭГ, имеющий молекулярную массу примерно от 500 до 60000 Да.

27. Пептидный димер согласно п.26, отличающийся тем, что указанный ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 500 до менее 20000 Да.

28. Пептидный димер согласно п.26, отличающийся тем, что указанный ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 20000 до 60000 Да, предпочтительно примерно от 20000 до 40000 Да.

29. Пептидный димер согласно п.25, отличающийся тем, что два фрагмента ПЭГ ковалентно связаны с пептидом, причем каждый ПЭГ содержит линейную неразветвленную молекулу.

30. Пептидный димер согласно п.29, отличающийся тем, что каждый из указанных ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 20000 до 30000 Да.

31. Способ лечения пациента, включающий введение пациенту, который имеет нарушение, характеризующееся дефицитом (недостаточностью) эритропоэтина либо низкой или дефицитной (недостаточной) популяцией эритроцитов, терапевтически эффективного количества пептида согласно любому из пп.1-11, имеющего примерно от 17 до 40 остатков аминокислот в длину и содержащего последовательность аминокислот

ЬУАСЖоОРГГХУСфРЕК (8Ер Ю ΝΟ: 1), где Х₀ обозначает остаток, выбранный из метионина (М) и метилового эфира гомосерина (Нкт), а Χ₁ обозначает остаток, выбранный из триптофана (V), 1-нафтилаланина (1-па1) и 2-нафтилаланина (2-па1).

32. Способ согласно п.31, отличающийся тем, что указанное нарушение выбирают из терминальной стадии почечной недостаточности или диализа, анемии на фоне СПИДа, аутоиммунного заболевания или злокачественного заболевания, бета-талассемии, кистозного фиброза, анемии недоношенных детей, анемии, ассоциированной с хроническим воспалением, повреждения спинного мозга, острой потери крови, старения, а также состояний опухолевого заболевания, сопровождающихся нарушенным эриропоэзом.

33. Фармацевтический состав, содержащий:

(ί) пептид по любому из пп.1-11, имеющий длину от примерно 17 до примерно 40 остатков аминокислот и содержащий последовательность аминокислот

ЬУАСНХобИТХ^СфРЕК (ЗЕр Ю ΝΟ: 1), где Х₀ обозначает остаток, выбранный из метионина (М) и метилового эфира гомосерина (Нкт), а Χ₁ обозначает остаток, выбранный из триптофана (V), 1-нафтилаланина (1-па1) и 2-нафтилаланина (2-па1), и (ίί) фармацевтически приемлемый носитель.