KR20060022655A - 에리스로포이에틴 수용체에 결합하는 펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에리스로포이에틴 수용체 (EPO-R)의 작용제인 펩티드 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 펩티드 화합물을 불충분하거나 또는 불완전한 적혈구 생성과 관련된 질환을 치료하는 데에 사용하는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 화합물을 포함하는 의약 조성물 역시 제공된다.

Description

에리스로포이에틴 수용체에 결합하는 펩티드{PEPTIDES THAT BIND TO THE ERYTHROPOIETIN RECEPTOR}

관련 출원에 대한 참조

2003. 5. 12.에 출원된 미국 가출원 제60/470,245에 기하여 우선권을 주장한다. 이 우선 출원의 내용은 그 전체로서 본원에 참고 문헌으로서 병합된다.

본 발명은 에리스로포이에틴(erythropoietin) 수용체 (EPO-R)의 작용제인 펩티드 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 충분하지 않거나 또는 불완전한 적혈구 생산과 관련된 질환을 치료하는 데에 이들 화합물을 사용하는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 화합물을 포함하는 의약 조성물 역시 제공된다.

에리스로포이에틴 (EPO)은 165개의 아미노산으로 이루어진 당단백질 호르몬으로서, 약 34 킬로달톤 (kD)의 분자량을 가지며, 아미노산 위치 24,38, 83 및 126 상에 우선적으로 글리코실화된다. 이것은 초기에 23개의 아미노산으로 이루어진 신호(signal) 펩티드를 갖는 전구 단백질로서 생성된다. EPO는 α, β 및 아시알로(asialo)라는 3 가지 형태를 가질 수 있다. α 및 β형은 탄수화물 성분이 약간 다르지만, 동일한 효능, 생물학적 활성 및 분자량을 갖는다. 아시알로형은 말단 탄수화물 (시알산)이 제거된 α 또는 β형이다. EPO를 암호화하는 DNA 서열은 보고되어 있다 [Lin의 미국 특허 제4,703,008호]

EPO는 적혈구 전구 세포의 유사 분열(mitotic division) 및 분화를 자극함으로써, 적혈구의 생성을 보장한다. 이것은 저산소 상태가 우세한 경우에 신장에서 생성된다. 적혈구 전구 세포의 EPO 유도 분화 과정 중에 글로빈 합성이 유도되고, 헴 복합체(heme complex) 합성이 자극되며, 페리틴 수용체의 수가 증가한다. 이와 같은 변화는 세포가 더 많은 철분을 흡수하여 기능적인 헤모글로빈을 합성하도록 하는데, 상기 기능적인 헤모글로빈은 성숙한 적혈구 내에서 산소와 결합한다. 따라서, 적혈구 및 이들의 헤모글로빈은 신체에 산소를 공급하는 데에 있어서 중요한 역할을 한다. 이러한 변화는 EPO와 적혈구 전구 세포의 표면에 존재하는 적절한 수용체의 상호 작용에 의하여 개시된다[예를 들면, Graber 및 Krantz (1978), Ann. Rev. Med. 29.51-66 참조].

조직이 이미 존재하는 수의 적혈구로부터 산소를 충분히 공급받을 수 있을 정도로 신체가 건강한 상태에 있는 경우에, 혈장 내에 EPO는 매우 낮은 농도로 존재한다. 이러한 낮은 정상 농도는 노화를 통하여 정상적으로 손실되는 적혈구의 대체를 자극하는 데에 충분하다.

순환계 내에서 적혈구의 산소 운반이 감소하는 경우인 저산소증 상태 하에서는 순환계 내의 EPO의 양이 증가한다. 저산소증은 예를 들면, 출혈, 방사선에 과다 노출되는 것에 의한 적혈구의 파괴, 고도 또는 지속적인 무의식 상태에 기인하는 산소 흡수의 감소 또는 다양한 형태의 빈혈에 의하여 상당한 양의 혈액이 손실되는 것에 의하여 야기될 수 있다. 이와 같은 저산소성 스트레스에 응답하여 상승된 EPO 수준은 적혈구 선구 세포(progenitor cells)의 증식을 자극함으로써 적혈구 생성을 증가시킨다. 순환계 내의 적혈구의 수가 정상 조직의 산소 요구량에 비하여 높은 경우에 순환계 내의 EPO 수준은 감소한다.

EPO는 적혈구 생성 과정에 있어서 필수적이기 때문에 이 호르몬은 낮거나 또는 불완전한 적혈구 생성이 특징인 혈액 질환의 진단 및 치료 양쪽 모두에 유용하게 응용될 가능성이 있다. 최근의 연구는 베타-지중해 빈혈증 [Vedovato 외 (1984) Acta. Haematol. 71: 211-213 참조]; 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) [Vichinslcy 외 (1984) J. Pediatric 105: 15-21 참조]; 임신 및 월경 이상 [Cotes 외 (193) Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90: 304-311 참조]; 초기 미숙아 빈혈 [Haga 외 (1983) Acta Pediatr. Scand. 72; 827-831 참조]; 척수 손상 [Claus-Walker 외 (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65: 370-374 참조]; 우주 비행 [Dunn 외 (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52: 178-182 참조]; 급성 혈액 손실 [Miller 외 (1982) Brit. J. Haematol. 52: 545-590 참조]; 노화 [Udupa 외 (1984) J. Lab. Clin. Med. 103: 574-580 및 581-588 및 Lipschitz 외 (1983) Blood 63: 502-509 참조]; 비정상적인 적혈구 생성을 수반하는 각종 종양성 질환 상태 [Dainiak 외 (1983) Cancer 5: 1101-1106 및 Schwartz 외 (1983) Otolaryngol. 109: 269-272 참조]; 및 신장 기능 부전 [Eschbach. 외 (1987) N. Eng. J. Med. 316: 73-78 참조]를 비롯한 다양한 질환 상태, 장애 및 혈액 불규칙 상태에 대한 EPO 치료의 유효성을 예측하는 근거를 제공하였다.

정제된 균질 EPO는 특성이 분석되어 있다[Hewick의 미국 특허 제4,677,195]. EPO를 암호화하는 DNA 서열을 정제하고, 클로닝하고, 발현시켜, 천연 EPO와 동일한 생물학 및 면역학적 특성을 갖는 재조합 폴리 펩티드를 제조하였다. 천연 EPO 상에 있는 것과 동일한 올리고 당류를 갖는 재조합 EPO 분자 역시 제조된 적이 있다 [Sasaki 외 (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059-12076 참조].

EPO의 생물학적 효과는 부분적으로는 세포막 결합 수용체와의 상호 작용을 통하여 매개되는 것으로 보인다. 마우스의 비장으로부터 분리한 미숙 적혈구 세포를 이용한 초기 연구는 EPO 결합 세포 표면 단백질은 각각 약 85,000 달톤과 100,000 달톤의 분자량을 갖는 2종의 폴리펩티드를 포함한다고 제안하였다 [Sawyer 외 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3690-3694]. EPO-결합 부위의 수는 세포 표면당 평균 800 내지 1000개인 것으로 계산되었다. 이들 결합 부위 중의 약 300개는 약 90 pM (피코몰)의 Kd 값으로 EPO와 결합하고, 나머지는 약 570 pM의 감소된 친화력으로 EPO와 결합하였다 [Sawyer 외 (1987) J. Biol. Chem. 262: 5554-5562]. 다른 독립적인 연구는 프렌드(Friend) 백혈병 바이러스의 빈혈 균주 (FVA)를 주입한 마우스로부터 제조한 EPO-응답 비장 적혈 모구는 각각 약 100 pM과 800 pM의 Kd 값을 갖는 총 400개의 고 및 저 친화력 EPO 결합 부위를 갖는다는 것으로 제안하였다 [Landschulz 외 (1989) Blood 73: 1476-1486].

후속 연구는 2 가지 형태의 EPO 수용체 (EPO-R)가 단일한 유전자에 의하여 암호화되었다는 것을 나타내었다. 이 유전자는 클로닝되었다[예를 들면, Jones 외 (1990) Blood 76, 31-35; Noguchi 외 (1991) Blood 78: 2548-2556; Maouche 외 (1991) Blood 78: 2557-2563 참조]. 예를 들면, 생쥐 및 인간 EPO-R 단백질의 DNA 서열 및 암호화 펩티드 서열은 D'Andrea 외의 국제 공개 공보 제WO 90/08822호에 기술되어 있다. 현재의 모델은 EPO-R에 대한 EPO의 결합은 2개의 EPO-R 분자를 이량화 및 활성화하고, 이는 신호 전달이라는 후속 단계를 유발한다는 것을 제안한다 [예를 들면, Watowich 외 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2140-2144 참조].

EPO-R에 대하여 클로닝된 유전자의 유용성은 중요한 수용체의 작용제 및 길항제에 대한 탐색을 용이하게 한다는 점이다. 재조합 수용체 단백질의 유용성은 다양한 무작위 및 반무작위(semi-random) 펩티드 다양성 생성 시스템(peptide diversity generation systems) 내에서의 수용체-리간드 상호 작용 연구를 가능하게 한다는 점이다. 이들 시스템은 [미국 특허 제6,270,170에 기술되어 있는] "펩티드 온 플라스미드(peptides on plasmids)" 시스템, [미국 특허 제5,432,018 및 Cwirla 외 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382에 기술되어 있는] "펩티드 온 파지(peptides on phage)" 시스템, [1992. 9. 16.에 출원된 미국 특허 출원 제946,239호에 기술되어 있는] "암호화 합성 라이브러리(encoded synthetic library)" (ESL) 시스템 및 [미국 특허 제5,143,854호; 국제 출원 공개 공보 제90/15070호; Fodor 외 (1991) Science 251: 767-773; Dower 및 Fodor (1991), Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271-180; 및 미국 특허 제5,424,186호에 기술되어 있는] "대규모 고정화 중합체 합성(very large scale immobilized polymer synthesis)" 시스템을 포함한다.

적어도 약간 정도는 EPO-R과 상호 작용하는 펩티드가 확인되었는데, 이들은 예를 들면 Wrighton 외의 미국 특허 제5,773,569호; 제5,830,851호 및 제986,047호; Wrighton 외의 국제 공개 공보 제WO 96/40749호; Johnson 및 Zivir의 미국 특허 제5,767,078호 및 국제 출원 공개 공보 제96/40772호; Balu의 국제 공개 공보 제WO01/38342호; Smith-Swintosky 외의 WO 01/91780에 기술되어 있다. 특히, 펩티드 모티프를 갖는 일군의 펩티드가 확인되었는데, 이들의 구성원은 EPO-R에 결합하고, EPO-의존성 세포 증식을 자극한다. 상기 모티프를 갖는 것으로 역시 확인된 펩티드는 생체 외에서 약 20 나노몰 (nM) 내지 250nM의 EC₅₀ 값으로 EPO-의존성 세포 증식을 자극한다. 따라서, EPO에 의하여 자극되는 최대 세포 증식량의 50%가 자극되는 데에는 20nM 내지 250nM의 펩티드 농도가 요구된다.

EPO-R 작용제는 이 수용체에 의하여 매개되는 중요한 생물학적 활성의 연구 및 질환의 치료 양쪽 모두에 있어서 커다란 효능(potency)을 제시하고 있으나, 향상된 효능 및 활성을 갖는 펩티드 EPO-R 작용제를 확인할 필요성은 아직 남아 있다.

본 섹션 및 명세서 전반에서 인용된 참고 문헌의 인용 및 논의 사항들은 본 발명의 설명을 명료하게 하기 위한 것일 뿐, 이들 문헌을 본 발명의 선행 기술로서 인정하고자 하는 것은 아니다.

발명의 요약

본 발명은 극도로 향상된 효능 및 활성을 갖는 EPO-R 작용제 펩티드를 제공한다. 이들 작용제는 핵심(core) 아미노산 서열 LYACHX₀GPITX₁VCQPLR (SEQ ID NO: 1) (여기서, 각각의 아미노산은 단문자 약어로 표시되고, X₀은 메티오닌 (M) 또는 호모세린 메틸 에테르 (Hsm)이며, X₁ 은 트립토판 (W), 1-나프틸알라닌 (1-nal) 또는 2-나프틸알라닌 (2-nal)임)를 포함하는, 길이가 17 내지 약 40개의 아미노산으로 이루어진 단량체 펩티드 작용제는 물론, 각각의 펩티드 단량체는 길이가 17 내지 약 40개의 아미노산으로 이루어진 것으로서, 핵심 아미노산 서열 LYACHX₀GPITX₁VCQPLR (SEQ ID NO :1) (여기서, 각각의 아미노산은 단문자 약어로 표시되고, X₀은 메티오닌 (M) 또는 호모세린 메틸 에테르 (Hsm)이며, X₁ 은 트립토판 (W), 1-나프틸알라닌 (1-nal) 또는 2-나프틸알라닌 (2-nal)임)을 포함하는 것인 2개의 펩티드 단량체를 포함하는 이량체 펩티드 작용제를 포함한다. 이들 신규 펩티드 작용제의 효능은 아세틸화, 분자 내 디설파이드 결합 형성 및 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 부분의 공유 결합을 포함하는, 한 가지 이상의 변경에 의하여 더욱 향상될 수 있다. 본 발명은 추가로 이러한 펩티드 작용제를 포함하는 의약 조성물 및 이러한 펩티드 작용제를 사용하여 다양한 의료 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

발명의 상세한 설명

정의:

펩티드 내에 존재하는 아미노산 잔기는 다음과 같은 약어로 표시된다. 페닐알라닌은 Phe 또는 F; 류신은 Leu 또는 L; 이소류신은 Ile 또는 I; 메티오닌은 Met 또는 M; 발린은 Val 또는 V; 세린은 Ser 또는 S; 프롤린은 Pro 또는 P; 트레오닌은 Thr 또는 T; 알라닌은 Ala 또는 A; 티로신은 Tyr 또는 Y; 히스티딘은 His 또는 H; 글루타민은 Gln 또는 Q; 아스파라긴은 Asn 또는 N; 리신은 Lys 또는 K; 아스파르트산은 Asp 또는 D; 글루타민산은 Glu 또는 E; 시스테인은 Cys 또는 C; 트립토판은 Trp 또는 W; 아르기닌은 Arg 또는 R이고; 글리신은 Gly 또는 G이다. 펩티드 내에 존재하는 통상적인 것이 아닌 아미노산은 다음과 같은 약어로 표시된다. 1-나프틸알라닌은 1-nal 또는 Np; 2-나프틸알라닌은 2-nal; N-메틸글리신 (사르코신(sarcosine)으로도 알려져 있는)은 MeG 또는 Sc; 호모세린 메틸 에테르는 Hsm이고; 아세틸화 글리신 (N-아세틸글리신)은 AcG이다.

본 명세서에서 사용되는 "폴리펩티드" 또는 "단백질"라는 용어는 아미드 결합을 통하여 서로 연결된 알파 아미노산인 아미노산 단량체의 중합체를 지칭한다. 따라서 폴리펩티드는 길이에 있어서 적어도 2개의 아미노산 잔기를 가지며, 대개는 이보다 더 길다. 일반적으로, "펩티드"라는 용어는 길이에 있어서 단지 몇 개의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 따른 신규 EPO-R 작용제 펩티드는 바람직하게는 길이에 있어서 약 50개 이하의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들은 더욱 바람직하게는 길이에 있어서 약 17 내지 약 40 아미노산 잔기를 갖는다. 펩티드와는 달리, 폴리펩티드는 어떤 개수의 아미노산 잔기라도 포함할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드라는 용어는 펩티드는 물론, 더 긴 아미노산 서열 역시 포함하는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한"이라는 구절은 "일반적으로 안정한 것으로 여겨지는, 예를 들면, 생리학적으로 허용 가능하고, 인간에게 투여되었을 때, 알레르기 또는 위장 부조(gastric upset), 현기증 등과 같은 이와 유사한 나쁜 반응을 유발하지 않는 분자체(molecular entities) 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의하여 승인된 것 또는 미국 약전 또는 동물, 더욱 특별하게는 인간에게 사용함에 있어서 일반적으로 인정된 다른 약전에 실려 있는 것을 의미한다. "담체"라는 용어는 화합물이 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 운송 수단을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 물, 및 낙화생유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등과 같은, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 바람직하게는 물 또는 식염수 용액 및 덱스트로스 수용액 및 글리세롤 용액이 특히 주사용 용액을 위한 담체로서 사용된다. 적합한 제약 담체는 E. W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 "작용제"라는 용어는 이의 상보적인 생물학적 활성 수용체와 결합하여 상기 수용체를 활성화함으로써 상기 수용체에서의 생물학적 응답을 야기하거나 또는 이미 존재하는 수용체의 생물학적 활성을 향상시키는 생물학적 활성 리간드를 지칭한다.

EPO -R 작용제인 신규 펩티드

본 발명은 EPO-R의 작용제로서, 지극히 향상된 효능 및 활성을 나타내는 펩티드에 관한 것이다. 이들 펩티드 작용제는 바람직하게는 길이에 있어서 17 내지 약 40개의 아미노산으로 이루어진 것으로서, 핵심 아미노산 서열 LYACHX₀GPITX₁VCQPLR (SEQ ID NO: 1)를 포함하는 것인데, 여기서 각각의 아미노산은 표준 단문자 약어로 표시되며, X₀은 메티오닌 (M) 또는 호모세린 메틸 에테르 (Hsm)이고, X₁ 은 트립토판 (W), 1-나프틸알라닌 (1-nal) 또는 2-나프틸알라닌 (2-nal)이다.

본 발명의 펩티드는 단량체, 이량체 또는 기타의 다량체일 수 있다. 본 발명의 펩티드 다량체는 삼량체(trimers), 사량체(tetramers), 오량체(pentamers) 또는 그 이상의 구조일 수 있다. 나아가, 이러한 이량체 및 기타의 다량체는 이종 이량체 또는 이종 다량체일 수 있다. 본 발명의 펩티드 단량체는 분해 산물 (예를 들면, 메티오닌 또는 탈아미드화 글루타민의 산화 생성물, 아르가닌(arganine), 및 C-말단 아미드)일 수 있다. 이러한 분해 산물이 사용될 수 있고, 따라서 이들은 본 발명의 일부로서 고려된다. 바람직한 구체례에 있어서, 본 발명의 이종 다량체는 모든 EPO-R 작용제 펩티드인 다수의(multiple) 펩티드를 포함한다. 매우 바람직한 구체례에 있어서, 본 발명의 다량체는 동종 다량체인데, 다시 말하면, 이들은 동일한 아미노산 서열을 갖는 다수의 EPO-R 작용제 펩티드를 포함한다.

따라서, 본 발명은 또한 지극히 향상된 효능 및 활성을 나타내는 EPO-R의 이량체 펩티드 작용제에 관한 것이다. 바람직한 구체례에 있어서, 본 발명의 이량체는 양쪽 모두가 EPO-R 작용제 펩티드인 2개의 펩티드를 포함한다. 이들 바람직한 이량체 펩티드 작용제는 각각의 펩티드 단량체가 길이에 있어서 17 내지 약 40개의 아미노산으로 이루어진 것으로서, 각각의 아미노산은 표준 단문자 약어로 표시되며, X₀은 메티오닌 (M) 또는 호모세린 메틸 에테르 (Hsm)이고, X₁ 은 트립토판 (W), 1-나프틸알라닌 (1-nal) 또는 2-나프틸알라닌 (2-nal)인 핵심 아미노산 서열 LYACH X₀GPITX₁VCQPLR (SEQ ID NO: 1)을 포함하는 것인 2개의 펩티드 단량체를 포함한다. 특히 바람직한 구체례에 있어서, 본 발명의 이량체는 동일한 아미노산 서열을 갖는 2개의 EPO-R 작용제 펩티드를 포함한다.

본 발명의 몇 가지 구체례에 따르면, 유전적으로 암호화되는 20개의 L-아미노산 또는 입체 이성체성 D-아미노산 중 어떤 것으로부터 독립적으로 선택되는 2개 이상 및 바람직하게는 2 내지 6개의 아미노산 잔기가 전술한 핵심 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 커플링될 것이다. 예를 들면, 종종 서열 GG가 핵심 서열의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 부착될 것이다.

20개의 통상의 아미노산, a,a-디치환(disubstituted) 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 기타의 통상의 것이 아닌 아미노산과 같은 비천연 아미노산의 입체 이성질체 (예를 들면, D-아미노산) 역시 본 발명의 화합물의 적합한 성분이 될 수 있다. 통상의 것이 아닌 아미노산의 예는 β-알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-하이드록시프롤린, O-포스포세린, N-메틸글리신, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, 노르-류신 및 기타 이와 유사한 아미노산 및 이미노산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

기타의 변경 역시 가능한데, 이는 아미노 말단의 변경, 카복시 말단의 변경, 1개 이상의 천연 유전 암호화 아미노산의 비통상 아미노산으로의 교체, 1개 이상의 아미노산 잔기의 측쇄의 변경, 펩티드 인산화 등을 포함한다. 바람직한 아미노 말단 변경은 (예를 들면, 아세트산 또는 할로겐 치환 아세트산으로) 아세틸화하는 것이다. 바람직한 구체례에 있어서, N-말단 글리신은 N-아세틸글리신 (AcG)으로 아세틸화된 것이다. 바람직한 구체례에 있어서, C-말단 글리신은 N-메틸글리신 (MeG, 사르코신으로도 알려져 있음)이다.

본 발명의 바람직한 펩티드 단량체는 다음과 같은 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 구체례에 있어서, 본 발명의 펩티드 단량체는 상기 핵심 서열의 2개의 시스테인 잔기 사이에 분자 내 디설파이드 결합을 함유한다. 이러한 단량체는 다음과 같이 도식화될 수 있다.

또는

본 발명에서는 이들 펩티드 단량체의 접합체 역시 제공한다. 따라서, 한 가지 바람직한 구체례에 따르면, 본 발명의 단량체 펩티드는 이량화 또는 올리고머화되고, 이로써 EPO-R 작용제 활성이 향상된다.

한 가지 구체례에 있어서, 본 발명의 펩티드 단량체를 비오틴/스트렙타비딘(streptavidin) 시스템을 이용하여 올리고머화할 수 있다. 펩티드 단량체의 비오틴화 유도체는 표준 기술로 합성될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 단량체는 C-말단 비오틴화될 수 있다. 그 다음, 이들 비오틴화 단량체를 스트렙타비딘과 함께 배양 [예를 들면, 실온에서 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 HEPES-완충 RPMI 배지 (Invitrogen) 내에서 4:1 몰비로 1 시간 동안]함으로써 올리고머화한다. 이 구체례의 한 가지 변형에 있어서, 비오틴화 펩티드 단량체를 상업적으로 구입 가능한 다양한 항 비오틴 항체 중의 어느 한 가지 [예를 들면, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Washington, DC)의 염소 항 비오틴 IgG]와 함께 배양함으로써 올리고머화할 수 있다.

바람직한 구체례에 있어서, 본 발명의 펩티드 단량체는 1개 이상의 연결자 부분(linker moiety)에 공유 결합시킴으로써 이량화된다. 상기 연결자(L_K) 부분은, 필수적인 것은 아니지만, 바람직하게는 임의로 1개 또는 2개의 -NH- 결합으로 종결되고, 임의로 1개 이상의 이용 가능한 탄소 원자가 저급 알킬 치환기로 치환되는 C_{1 -12} 연결 부분이다. 바람직하게는 상기 연결자 L_K는 R이 (예를 들면, 고체 지지체의 표면에 존재하는 것과 같은) 다른 분자 부분에 결합할 수 있는 카복실기 또는 아미노기와 같은 작용기로 치환된 저급 (C_{l -6}) 알킬렌인 -NH-R-NH-를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 연결자는 리신 잔기 또는 리신 아미드 (카복실기가 아미드 부분 -CONH₂로 전환된 리신 잔기)이다. 바람직한 구체례에 있어서, 상기 연결자는 각 단량체의 C-말단 아미노산에 동시에 부착됨으로써 2개의 펩티드 단량체의 C-말단을 연결시킨다.

예를 들면, C-말단 연결자 L_K가 리신 아미드인 경우, 상기 이량체는 다음 화학식 1에 제시된 것과 같은 구조로 설명될 수 있고, 화학식 2에 제시된 것과 같이 간략화될 수 있다.

화학식 1 및 2에 있어서, N²는 리신의 ε-아미노기의 질소 원자를 나타내는 것이고, N¹은 리신의 α-아미노기의 질소 원자를 나타내는 것이다. 상기 이량체 구조는 리신의 α 및 ε 아미노기 양쪽 모두에 결합되어 있는 펩티드를 표시하기 위하여 [펩티드]₂ Lys-아미드로, 또는 리신의 아미노기의 α 및 ε 아미노기 양쪽 모두에 결합되어 있는 N-말단 아세틸화 펩티드를 표시하기 위하여 [Ac-펩티드]₂ Lys-아미드로, 분자 내 디설파이드 루프를 갖는 각각의 펩티드가 리신의 α 및 ε 아미노기 양쪽 모두에 결합되어 있는 N-말단 아세틸화 펩티드를 표시하기 위하여 [Ac-펩티드, 디설파이드]₂ Lys-아미드로, 분자 내 디설파이드 루프 및 리신의 C-말단과 PEG 부분 사이에 공유 결합을 형성하는 간격자 분자를 갖는 각각의 펩티드가 리신의 α 및 ε 아미노기 양쪽 모두에 결합되어 있는 N-말단 아세틸화 펩티드를 표시하기 위하여 [Ac-펩티드, 디설파이드]₂ Lys-간격자-PEG로, 리신의 아민이 이미노디아세트산의 2개의 카복실기 각각에 결합되어 있고, Boc-베타-알라닌이 이미노디아세트산의 질소 원자에 아미드 결합을 통하여 공유 결합되어 있는 C-말단 리신 아미드 잔기를 갖는 N-말단 아세틸화 펩티드의 동종 이량체를 표시하기 위하여 [Ac-펩티드-Lys*-NH₂]₂-이미노디아세틱-N-(Boc-Ala)로 나타낼 수 있다.

추가의 구체례에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 2개의 펩티드 단량체를 이량화하는 연결자 L_K로서 작용할 수 있는데, 예를 들면, 1개의 PEG 부분이 펩티드 이량체의 양쪽 펩티드 사슬의 N-말단에 동시에 부착될 수 있다.

또 다른 추가의 구체례에 있어서, 상기 연결자 (L_K) 부분은 바람직하게는, 필수적인 것은 아니지만, 1개 이상의 이용 가능한 원자가 임의로 1개 이상의 PEG 분자에 결합할 수 있는 아민과 같은 추가의 작용기로 치환되어 있는 2개의 카복실산을 갖는 분자이다. 이러한 분자는 다음과 같이 표시될 수 있다.

식 중에서, n은 0 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 10의 정수이며, X는 O, S, N(CH₂)_pNR₁, NCO(CH₂)_pNR₁ 및 CHNR₁로부터 선택되는 것이고, R₁은 H, Boc, Cbz 등으로부터 선택되는 것이며, p는 1 내지 10의 정수이다.

바람직한 구체례에 있어서, 각 펩티드의 1개의 아미노기는 연결자 L_K와 아미드 결합을 형성한다. 특히 바람직한 구체례에 있어서, 연결자 L_K에 결합되어 있는 펩티드의 아미노기는 리신 잔기의 입실론(epsilon) 아민 또는 N-말단 잔기의 알파 아민이거나, 또는 임의적인 간격자 분자의 아미노기이다. 특히 바람직한 구체례에 있어서, n과 m은 양쪽 모두 1이고, X는 NCO(CH₂)_pNR₁이며, p는 2이고, R₁은 Boc이다. 이와 같은 바람직한 연결자를 갖는 이량체 EPO 펩티드는 다음 화학식 3에 제시된 구조로 표시될 수 있다.

필요에 따라, Boc기를 제거함으로써, 적절하게 활성화된 수용성 중합체 종, 예를 들면, mPEG-파라-니트로페닐카보네이트 (mPEG-NPC), mPEG-석신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) 및 N-하이드록시석신이미드-PEG(NHS-PEG)와 같은 PEG 종과 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 아민기를 유리시킬 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 제5,672,662호 참조). 이와 같은 바람직한 연결자를 갖는 이량체 EPO 펩티드는 다음 화학식 4에 제시된 구조로 표시될 수 있다.

필수적인 것은 아니지만, 일반적으로 펩티드 이량체는 또한 펩티드 단량체의 시스테인 잔기 사이에 1개 이상의 분자 내 디설파이드 결합을 가질 것이다. 바람직하게는, 2개의 단량체는 1개 이상의 분자 내 디설파이드 결합을 갖는다. 가장 바람직하게는, 펩티드 이량체의 단량체는 양쪽 모두 분자 내 디설파이드 결합을 가짐으로써, 각 단량체는 고리기를 갖는다.

펩티드 단량체 또는 이량체는 추가로 1개 이상의 간격자 부분을 포함할 수 있다. 이와 같은 간격자 부분은 펩티드 단량체 또는 펩티드 이량체에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 이와 같은 간격자 부분은 펩티드 이량체의 단량체를 연결하는 연결자 L_K 부분에 부착된다. 예를 들면, 이와 같은 간격자 부분은 리신 연결자의 카보닐 탄소를 통하여 또는 이미노디아세트산 연결자의 질소 원자를 통하여 펩티드 이량체에 부착될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 간격자는 펩티드 이량체의 연결자를 부착된 수용성 중합체 부분 또는 보호기에 연결할 수 있다. 다른 한 가지 예에 있어서, 이와 같은 간격자는 펩티드 단량체를 부착된 수용성 중합체 부분에 연결할 수 있다.

한 가지 구체례에 있어서, 상기 간격자 부분은 임의로 -NH- 결합 또는 카복실 (-COOH)기로 종결되고, 임의로 1개 이상의 이용 가능한 탄소 원자가 저급 알킬 치환기로 치환되는 C_{1 -12} 연결 부분이다. 한 가지 구체례에 있어서, 상기 간격자는 R이 다른 분자 부분과 결합할 수 있는 카복실기 또는 아미노기와 같은 작용기로 임의로 치환되는 저급 (C_{1 -6}) 알킬렌인 R-COOH이다. 예를 들면, 상기 간격자는 글리신 (G) 잔기 또는 아미노 헥산산일 수 있다. 바람직한 구체례에 있어서, 상기 아미노 헥산산은 6-아미노 헥산산 (Ahx)이다. 예를 들면, 상기 간격자 6-아미노 헥산산 (Ahx)이 펩티드의 N-말단에 결합되어 있는 경우에, 상기 펩티드 말단 아민기는 표준 아미드 커플링을 통하여 Ahx의 카복실기에 결합될 수 있다. 다른 한 가지 예에 있어서, Ahx가 펩티드의 C-말단에 결합되어 있는 경우에, 상기 Ahx의 아민은 표준 아미드 커플링을 통하여 말단 아미노산의 카복실기에 결합될 수 있다. 이와 같은 펩티드의 구조는 다음의 화학식 5에 제시된 것과 같이 도식화될 수 있으며, 화학식 6에 제시된 것과 같이 간략화될 수 있다.

다른 구체례에 있어서, 상기 간격자는 R이 다른 분자 부분과 결합할 수 있는 카복실기 또는 아미노기와 같은 작용기로 치환된 저급 (C_{1 -6}) 알킬렌인 -NH-R-NH-이다. 예를 들면, 상기 간격자는 리신 (K) 잔기 또는 리신 아미드 (K-NH₂, 카복실기가 아미드 부분 -CONH₂로 전환되어 있는 리신 잔기)일 수 있다.

바람직한 구체례에 있어서, 상기 간격자 부분은 다음과 같은 식을 갖는다.

식 중에서, α, β, γ, δ 및 ε는 각각 독립적으로 선택되는 정수이다. 바람직한 구체례에 있어서, γ가 1보다 큰 경우에 β는 2인 것을 제외하면, α, β 및 ε는 각각 1 내지 6으로부터 선택되는 정수이고, δ는 0 또는 1이고, γ는 0 내지 약 10으로부터 선택되는 정수이며, Y는 NH 또는 CO로부터 선택되는 것이다. 특 히 바람직한 구체례에 있어서, α, β 및 ε는 각각 2이고, γ 및 δ는 모두 1이며, Y는 NH이다. 예를 들면, 이와 같은 간격자를 갖는 펩티드 이량체가 다음의 화학식 7에 도시되어 있는데, 여기서 연결자는 리신이고, 상기 간격자는 연결자와 Boc 보호기를 연결한다.

특히 바람직한 다른 구체례에 있어서, γ와 δ는 0이고, α와 ε는 5이며, Y는 CO이다.

특히 바람직한 구체례에 있어서, 연결자 더하기 간격자 부분은 다음의 화학식 8 또는 9에 제시된 구조를 갖는다.

본 발명의 펩티드 단량체, 이량체 또는 다량체는 추가로 1개 이상의 수용성 중합체 부분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이들 중합체는 본 발명의 펩티드 화합물에 공유 결합된다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료적 사용을 위하여 상기 중합체는 약제학적으로 허용 가능한 것일 것이다. 본 발명 분야의 숙련자는 중합체-펩티드 접합체가 치료적으로 사용될 것인지 여부, 만약 그렇다면 바람직한 투여량, 순환 시간, 단백질 분해에 대한 내성 및 기타의 고려 사항과 같은 고려 사항에 기초하여 바람직한 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 수용성 중합체는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종 중합체 또는 무작위 공중합체), 폴리(n-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종 중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체 및 폴리옥시에틸화 폴리올일 수 있다. 바람직한 수용성 중합체는 PEG이다.

상기 중합체는 어떤 분자량을 갖는 것이어도 무방하며, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 PEG는 10 킬로달톤 (kD) 을 초과하는 분자량, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 60 kD의 분자량을 갖는 선형, 비분지형 PEG를 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, 상기 선형 비분지형 PEG 부분은 약 20 내지 40 kD의 분자량을 가져야 하며, 20 kD PEG인 것이 특히 바람직하다. 주어진 PEG 제품에 있어서, 분자량은 통상적으로 개개의 분자마다 다를 것이다. 몇몇 분자는 기술된 분자량에 비하여 더 크거나 더 작은 분자량을 가질 것으로 이해된 다. PEG 분자의 분자량을 기술하에 있어서 이와 같은 차이는 일반적으로 "약"이라는 용어를 사용하여 반영한다.

부착되는 중합체 분자의 수는 변할 수 있는데, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 수용성 중합체가 본 발명의 EPO-R 작용제 펩티드에 부착될 수 있다. 다수개의 부착 중합체는 서로 동일하거나 상이한 화학적 부분(예를 들면, 분자량이 서로 다른 PEG)일 수 있다. 따라서, 바람직한 구체례에 있어서, 본 발명은 EPO-R 작용제 펩티드에 부착되어 있는 2개 이상의 PEG 부분을 갖는 EPO-R 작용제 펩티드를 예상한다. 바람직하게는, 양쪽 모두의 PEG 부분은 각각 바람직하게는 약 10 내지 약 60 kD의 분자량을 갖는 선형, 비분지형 PEG이다. 더욱 바람직하게는, 각각의 선형 비분지형 PEG 부분은 약 20 내지 40 kD의 분자량을 가지며, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 30 kD의 분자량을 가지며, 각각의 선형 PEG 부분이 약 20 kD의 분자량을 갖는 것이 특히 바람직하다. 그러나, 이와 같은 구체례에 있어서 다른 분자량을 갖는 PEG 역시 고려된다. 예를 들면, 본 발명은 EPO-R 작용제 펩티드에 부착되어 있는 2개 이상의 선형 비분지형 PEG 부분을 갖는 EPO-R 작용제 펩티드를 예상 및 포괄하는데, 이들 중 적어도 1개 또는 양쪽 모두는 약 20 내지 40 kD의 분자량 또는 약 20 내지 30 kD의 분자량을 갖는다. 다른 구체례에 있어서, 본 발명은 EPO-R 작용제 펩티드에 부착되어 있는 2개 이상의 선형 비분지형 PEG 부분을 갖는 EPO-R 작용제 펩티드를 예상 및 포괄하는데, 이들 중 적어도 1개는 약 40 내지 60 kD의 분자량을 갖는다.

한 가지 구체례에 있어서, PEG는 2개의 펩티드 단량체를 이량화하는 연결자 로서 작용할 수 있다. 한 가지 구체례에 있어서, PEG는 펩티드 단량체 또는 이량체의 1개 이상의 말단 (N-말단 또는 C-말단)에 부착된다. 다른 한가지 구체례에 있어서, PEG를 펩티드 단량체 또는 이량체의 간격자 부분에 부착한다. 바람직한 구체례에 있어서, PEG를 펩티드 이량체의 연결자 부분에 부착한다. 매우 바람직한 구체례에 있어서, PEG를, 간격자 부분이 펩티드 이량체의 단량체를 연결하는 연결자 L_K 부분에 부착되어 있는 것인, 상기 간격자 부분에 부착한다. 특히 바람직한 구체례에 있어서, PEG를, 간격자 부분이 리신 연결자의 카보닐 탄소 또는 리신 아미드 연결자의 아미드 질소를 통하여 펩티드 이량체에 부착되어 있는 것인, 상기 간격자 부분에 부착한다.

본 발명의 바람직한 펩티드 이량체는 다음과 같은 것들을 포함하지만, 이에 하정되는 것은 아니다.

펩티드 단량체 및 이량체를 포함하는, 본 발명의 또 다른 펩티드는 다음과 같다.

본 발명의 상기 펩티드 서열은 단독으로 또는 펩티드 사슬의 N-말단 및/또는 C-말단 연장 부분과 연결된 상태로 제공될 수 있다. 이러한 연장 부분은 임의의 비천연 서열을 갖거나 또는 실질적으로 비천연 서열이 없는 천연 암호화 펩티드 서열 일 수 있는데, 상기 연장 부분은 본 발명 분야의 숙련자의 필요에 따라 어떤 첨가, 결손(deletions), 점 변이(point mutation) 또는 기타 서열 변형 또는 조합을 포함할 수 있다. 이에 한정되지 않은 예로서, 천연 서열은 완전한 길이 또는 부분 길이일 수 있으며, 이들은 측쇄 접합을 통하여 탄수화물, PEG 또는 기타 중합체 등의 부착 부위를 제공하는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 한 가지 변형에 있어서, 상기 아미노산 치환은 인간화(humanization)를 유도하여 인간 면역 체계와 양립되도록 한다.

비면역 글로불린 간격자 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 본 발명의 EPO-R 활성화 서열에 이웃하거나 또는 거의 근접한 면역 글로불린 서열을 포함하여, 모든 형태의 융합 단백질이 제공된다. 한 가지 유형의 구체례는 중 및/또는 경 사슬의 변경 가능한 (V) 영역 대신에 EPO-R 활성화 서열을 갖는 면역 글로불린 사슬이다.

본 발명의 펩티드 화합물의 제조:

펩티드 합성

본 발명의 펩티드는 본 발명 분야에서 알려져 있는 고전적인 방법으로 제조될 수 있다. 이들 표준적인 방법은 배타적(exclusive) 고상 합성, 부분 고상 합성법, 단편 축합, 고전적 용액 합성 및 재조합 DNA 기술을 포함한다 [예를 들면, Merrifield J. Am. Chem. Soc. 1963 85: 2149 참조]. 이들 표준적인 방법은 배타적인 것을 포함한다.

한 가지 구체례에 있어서, 펩티드 이량체의 펩티드 단량체를 개별적으로 합성하고, 합성에 이어 이량화한다. 바람직한 구체례에 있어서, 이량체의 펩티드 단 량체는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

특히 바람직한 구체례에 있어서, 이량체의 펩티드 단량체는 이들의 C-말단을 통하여 펩티드 합성의 개시 부위로 작용할 수 있는 2개의 작용기 및 (예를 들면, 고체 지지체의 표면에 존재할 수 있는) 다른 분자 부분과 결합할 수 있는 제3 작용기 (예를 들면, 카복실기 또는 아미노기)를 갖는 연결자 L_K 부분에 의하여 연결된다. 이 경우, 상기 2개의 펩티드 단량체는 고상 합성 기술에 따라 연결자 L_K 부분의 2개의 반응성 질고기 상에 직접 합성될 수 있다. 이와 같은 합성은 순차적으로 또는 동시에 이루어질 수 있다.

연결자 상에서의 이량체의 펩티드 사슬 합성을 순차적으로 수행하는 경우, 연결자 분자 상의 2개의 아민 작용기를 직각적으로(orthogonally) 제거될 수 있는 2개의 서로 다른 아민 보호기로 보호한다. 바람직한 구체례에 있어서, 상기 보호된 디아민은 보호된 리신이다. 보호된 연결자를 연결자의 제3 작용기를 통하여 고체 지지체에 커플링한다. 제1 아민 보호기를 제거하고, 이량체의 제1 펩티드를 제1 탈보호 아민 부분 상에 합성한다. 그 다음, 제2 아민 보호기를 제거하고, 이량체의 제2 펩티드를 제2 탈보호 아민 부분 상에 합성한다. 예를 들면, 연결자의 제1 아미노 부분을 Alloc로 보호하고, 제2 부분을 Fmoc로 보호할 수 있다. 이 경우, 상기 Fmoc 기 (Alloc 기는 아님)를 온화한 염기 [예를 들면, 20% 피페리딘 디메틸 포름아미드 (DMF) 용액]로 처리하여 제거하고, 제1 펩티드 사슬을 합성할 수 있다. 그 다음, 적합한 시약 [예를 들면, Pd(PPh₃)/4-메틸 모폴린 및 클로로포름]을 사용하여 상기 Alloc 기를 제거하고, 제2 펩티드 사슬을 합성할 수 있다. 이 기술은 2개의 펩티드 사슬의 서열이 동일하거나 상이한 이량체를 생성시키는 데에 이용될 수 있다. (이하에서 논의할) 디설파이드 결합 형성을 제어하기 위하여, 시스테인을 위한 상이한 티올-보호기를 이용하는 경우에, 이량체의 펩티드 사슬의 최종적인 아미노산 서열이 동일하게 되는 경우일지라도 이 기술이 이용되어야 한다는 점에 주목하라.

연결자 상에서 이량체의 펩티드 사슬을 동시에 합성하는 경우에는, 연결자 분자의 2개의 아민 작용기를 제거 가능한 동일한 아민 보호기로 보호한다. 바람직한 구체례에 있어서, 보호된 디아민은 보호된 리신이다. 보호된 연결자를 연결자의 제3 작용기를 통하여 고체 지지체에 커플링한다. 이 경우, 연결자 분자의 2개의 보호된 작용기를 동시에 탈보호하고, 탈보호 아민 상에 2개의 펩티드 사슬을 합성한다. 이 기술을 이용하는 경우, 이량체의 펩티드 사슬의 서열이 동일할 것이고, 시스테인 잔기를 위한 티올-보호기는 모두 동일할 것이다.

펩티드 합성을 위한 바람직한 방법은 고상 합성법이다. 고상 펩티드 합성 절차는 본 발명 분야에 잘 알려져 있다 [예를 들면, Stewart 고체 Phase Syntheses (Freeman and Co.: San Francisco) 1969; 2002/2003 General 카탈로그 from Novabiochem Corp, San Diego, USA; Goodman Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl, Stuttgart) 2002 참조]. 고상 합성법에 있어서, 합성은 통상적으로 α-아미노 보호 수지를 사용하여 펩티드의 C-말단으로부터 시작된다. 예를 들면, α-아미노산을 클로로메틸화 수지, 하이드록시메틸 수지, 폴리스 티렌 수지 또는 벤즈하이드릴아민 수지 등에 부착시킴으로써, 적합한 출발 물질을 제조할 수 있다. 이와 같은 클로로메틸화 수지의 한 가지는 Bio Rad Laboratories (Richmond, CA)에서 상품명 BIO-BEADS SX-1로 시판되는 것이다. 하이드록시메틸 수지의 제조 방법은 [Bodonszky 외 (1966) Chem. Ind. London 38: 1597]에 설명되어 있다. 벤즈하이드릴아민 (BHA) 수지는 [Pietta and Marshall (1970) Chem. Commun. 650]에 설명되어 있는데, 하이드로클로라이드형은 Beckman Instruments, Inc. (Palo Alto, CA)으로부터 구입 가능하다. 예를 들면, α-아미노 보호 아미노산을, Gisin (1973) Helv. Chim. Acta 56: 1467에 설명된 방법에 따라, 세슘 바이카보네이트 촉매의 도움으로 클로로메틸화 수지에 커플링할 수 있다.

초기 커플링 후, 예를 들면, 유기 용매 내에서 실온에서 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 염산 (HCl) 용액을 이용하여 α-아미노 보호기를 제거한다. 그 다음, α-아미노 보호 아미노산을 성장하는 지지체-결합 펩티드 사슬에 연속적으로 커플링한다. 아실형 보호기 (예를 들면, 포밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸), 방향족 우레탄형 보호기 [예를 들면, 벤질옥시카보닐 (Cbz) 및 치환된 Cbz], 지방족 우레탄 보호기 [예를 들면, t-부틸옥시카보닐 (Boc), 이소프로필옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐], 및 알킬형 보호기 (예를 들면, 벤질, 트리페닐메틸), 플루오레닐메틸 옥시카보닐 (Fmoc), 알릴옥시카보닐 (Alloc), 및 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde)를 포함하는 α-아미노 보호기는 본 발명 분야에서 펩티드의 단계적 합성이 유용한 것으로 알려진 것들이다.

측쇄 보호기 (통상적으로 에테르, 에스테르, 트리틸, PMC 등)는 커플링 중에 그대로 유지하며, 아미노-말단 보호기의 탈보호 또는 커플링 중에 분해되지 않는다. 측쇄 보호기는 최종 펩티드 합성의 완결 시 및 목적하는 펩티드를 변형시키지 않는 조건에서 제거될 수 있어야 한다. Tyr을 위한 측쇄 보호기는 테트라하이드로피라닐, tert-부틸, 트리틸, 벤질, Cbz, Z-Br-Cbz 및 2,5-디클로로벤질을 포함한다. Asp를 위한 측쇄 보호기는 벤질, 2,6-디클로로벤질, 메틸, 에틸 및 사이클로헥실을 포함한다. Thr 및 Ser을 위한 측쇄 보호기는 아세틸, 벤조일, 트리틸, 테트라하이드로피라닐, 벤질, 2,6-디클로로벤질, and Cbz를 포함한다. Arg을 위한 측쇄 보호기는 니트로, 토실 (Tos), Cbz, ㅇ아다만틸옥시카보닐 메시톨릴설포닐 (Mts), 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조퓨란-5-설포닐 (Pbf), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸-벤젠설포닐(Mtr) 또는 Boc를 포함한다. Lys을 위한 측쇄 보호기는 Cbz, 2-클로로벤질옥시카보닐 (2-Cl-Cbz), 2-브로모벤질옥시카보닐 (2-Br-Cbz), Tos 또는 Boc를 포함한다.

α-아미노 보호기의 제거 후에, 남아 있는 보호 아미노산을 원하는 순서에 따라 단계적으로 커플링한다. 각각의 보호 아미노산을 일반적으로, 예를 들면, 메틸렌 클로라이드 (CH₂Cl₂), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 포름아미드 (DMF) 또는 이들의 혼합물의 용액 내에서, 2-(1H-벤조트리아졸-l-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 또는 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC)와 같은 적합한 카복실기 활성화제(activator)를 3배 과량으로 사용하여 반응시킨다.

목적하는 아미노산 서열이 완성된 후에, 목적하는 펩티드를, 수지로부터 펩 티드를 절단할 뿐 아니라 남아 있는 모든 측쇄 보호기 역시 절단하는, 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 불화수소 (HF)와 같은 시약으로 처리하여 수지 지지체로부터 떼어낸다. 클로로메틸화 수지를 사용하는 경우, 불화수소 처리하면 유리 펩티드 산이 생성된다. 벤즈하이드릴아민 수지를 사용하는 경우, 불화수소 처리하면 유리 펩티드 아미드가 생성된다. 대안으로서, 클로로메틸화 수지를 사용하는 경우에, 측쇄 보호 펩티드를 떼어낼 수 있는데, 펩티드 수지를 암모니아로 처리함으로써 목적하는 측쇄 보호 아미드를 얻거나, 또는 알킬아민으로 처리함으로써 측쇄 보호 알킬아미드 또는 디알킬아미드를 얻을 수 있다. 그 다음, 측쇄 보호를 불화수소로 처리하는 보통의 방법으로 제거하여 유리 아미드, 알킬아미드, 또는 디알킬아미드를 얻는다. 본 발명의 에스테르를 제조함에 있어서는, 펩티드 산의 제조에 사용되는 수지를 사용하며, 측쇄 보호 펩티드를 염기 및 적절한 알코올 (예를 들면, 메탄올)로 절단한다. 그 다음, 측쇄 보호기를 불화수소로 처리하는 보통의 방법으로 제거하여 목적하는 에스테르를 얻는다.

이와 같은 절차는 20개의 천연 아미노산 이외의 아미노산, 유전적으로 암호화된 아미노산이 본 발명의 화합물의 1, 2 또는 그 이상의 위치에 치환되어 있는 펩티드를 합성하는 데에도 이용될 수 있다. 본 발명의 펩티드에 치환될 수 있는 합성 아미노산은 N-메틸, L-하이드록시프로필, L-3,4-디하이드록시페닐알라닐, L-δ-하이드록시리실 및 D-δ-메틸알라닐과 같은 δ-아미노산, L-α-메틸알라닐, (β 아미노산 및 이소퀴놀릴을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. D-아미노산 및 비천연 합성 아미노산이 본 발명의 펩티드에 병합될 수도 있다.

펩티드 변경

본 발명의 펩티드 화합물의 아미노 및/또는 카복시 말단을 변경시킴으로써 본 발명의 다른 화합물을 제조할 수 있다. 아미노 말단 변경은 메틸화 (예를 들면, --NHCH₃ 또는 --N(CH₃)₂), (예를 들면, 아세트산으로 또는 α-클로로아세트산, α-브로모아세트산 또는 α-요오도아세트산과 같은 이들의 할로겐화 유도체로의) 아세틸화, 벤질옥시카보닐 (Cbz) 기의 첨가, 또는 R이 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬 아릴 등 및 이와 유사한 기들로부터 선택되는 것인 RCOO--로 정의되는 카복실레이트 작용기 또는 R--SO2--로 정의되는 설포닐 작용기로 아미노 말단을 차단하는 것을 포함한다. 프로테아제에 대한 감수성을 감소시키기 위하여 또는 펩티드 화합물의 배열(conformation)을 제한하기 위하여 N-말단에 데스아미노산(desamino acid)을 도입할 수 있다 (이 경우, N-말단 아미노기가 존재하지 않는다). 바람직한 구체례에 있어서, N-말단을 아세틸화한다. 특히 바람직한 구체례에 있어서, N-말단 글리신을 아세틸화하여 N-아세틸글리신 (AcG)을 얻는다.

카복시 말단 변경은 유리산을 카복사미드기로 대체하거나 또는 카복시 말단에 고리형 락탐을 생성시켜 구조적 제한을 가하는 것을 포함한다. 본 발명의 펩티드를 고리화하거나 또는 펩티드의 말단에 데스아미노 또는 데스카복시(descarboxy) 잔기를 도입하여 말단 아미노 또는 카복실기가 존재하지 않도록 함으로써, 프로테아제에 대한 감수성을 감소시키거나 또는 펩티드의 배열을 제한한다. 본 발명의 화합물의 C-말단 작용기는 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 하이드록시 및 카복시, 및 이들의 저급 에스테르 유도체, 및 약제학적으로 허용 가능한 이들의 염을 포함한다.

유전적으로 암호화되는 20개의 천연 아미노산 (또는 입체 이성체성 D 아미노산)의 측쇄를 다른 측쇄, 예를 들면, 알킬, 저급 알킬, 고리형 4-, 5-, 6- 내지 7-원 알킬, 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 하이드록시, 카복시 및 이들의 저급 에스테르 유도체로, 및 with 4-, 5-, 6- 내지 7-원 헤테로 고리와 같은 기로 교체할 수 있다. 특히, 프롤린 잔기의 고리 크기가 5원 내지 4, 6, 또는 7원까지 변하는 프롤린 유사체가 사용될 수 있다. 고리기는 포화 또는 불포화될 수 있고, 불포화되는 경우 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 헤테로고리기는 바람직하게는 1개 이상의 질소, 산소, 및/또는 황 헤테로 원자를 갖는다. 이러한 기의 예는 퓨라자닐, 퓨릴, 이미다졸리디닐, 이미다졸릴, 이미다졸리닐, 이소티아졸릴, 이소옥사졸릴, 모폴리닐 (예를 들면 모폴리노), 옥사졸릴, 피페라지닐 (예를 들면, 1-피페라지닐), 피페리딜 (예를 들면,1-피페리딜, 피페리디노), 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐 (예를 들면, 1-피롤리디닐), 피롤리닐, 피롤릴, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 티오모폴리닐 (예를 들면, 티오모폴리노) 및 트리아졸릴을 포함한다. 이들 헤테로고리기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 이들 기가 치환되는 경우, 치환기는 알킬, 알콕시, 할로겐, 산소, 또는 치환되거나 또는 치환되지 않은 페닐일 수 있다.

펩티드는 인산화 및 [예를 들면, Hruby,외 (1990) Biochem J. 268: 249-262 에 기술되어 있는 것과 같은] 기타의 방법으로 용이하게 변경될 수 있다.

본 발명의 펩티드 화합물은 유사한 생물학적 활성을 갖는 비펩티드 화합물을 위한 구조적 모형으로 작용할 수도 있다. 본 발명 분야의 숙련자는 선도(lead) 펩티드 화합물과 동일하거나 또는 유사한 목적하는 생물학적 활성을 갖지만, 용해도, 안정성, 및 가수 분해 및 단백질 분해 반응에 있어서는 선도 물질에 비하여 더 좋은 활성을 갖는 화합물을 설계하는 데에 다양한 기술이 이용될 수 있다는 것을 인식한다 [Morgan and Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 참조]. 이들 기술은 펩티드 골격을 포스포네이트, 아미데이트, 카바메이트, 설폰아미드, 2차 아민 및 N-메틸아미노산으로 이루어진 골격으로 교체하는 것을 포함한다.

디설파이드 결합의 생성

본 발명의 화합물은 1개 이상의 분자 내 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 한 가지 구체례에 있어서, 펩티드 단량체 또는 이량체는 1개 이상의 분자 내 디설파이드 결합을 포함한다. 바람직한 구체례에 있어서, 펩티드 이량체는 2개의 분자 내 디설파이드 결합을 포함한다.

이러한 디설파이드 결합은 펩티드 핵심 서열의 시스테인 잔기의 산화에 의하여 형성될 수 있다. 한 가지 구체례에 있어서, 시스테인 결합 형성은 목적하는 이성질체의 생성을 최적화하는 데에 유효한 유형의 산화제 및 농도를 선택함으로써 제어된다. 예를 들면, 산화제가 DMSO인 경우, 펩티드 이량체를 산화하여 (분자간 디설파이드 결합을 형성시키는 것보다 우세하게), 2개의 분자 내 디설파이드 결합(각 펩티드 사슬에 1개씩)을 생성시킬 수 있다.

바람직한 구체례에 있어서, 시스테인 결합의 생성은 펩티드 합성 중에 티올-보호기를 선택적으로 사용함으로써 제어된다. 예를 들면, 2개의 분자 내 디설파이드 결합을 갖는 이량체가 필요한 경우, 제1 티올 보호기 [예를 들면, 트리틸 (Trt), 알릴옥시카보닐 (Alloc) 또는 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리덴) 에틸 (Dde) 등]로 보호된 상기 핵심 서열의 2개의 시스테인 잔기로 제1 단량체 펩티드 사슬을 합성한 다음, 제1 티올 보호기와는 다른 제2 티올 보호기 [예를 들면, 아세트아미도메틸 (Acm) 또는 t-부틸 (tBu) 등]으로 보호된 상기 핵심 서열의 2개의 시스테인 잔기로 제2 단량체 펩티드를 합성한다. 그 다음, 제1 티올 보호기를 제거하여 제1 단량체의 바이설파이드 고리화를 달성한 다음, 제2 티올 보호기를 제거하여 제2 단량체의 바이설파이드 고리화를 달성한다.

본 발명의 다른 구체례에서는 황 중의 1개가 CH₂ 기 또는 황의 다른 이소테어(isotere)로 교체되어 있는 것인 이들 디설파이드 유도체의 유사체를 제공한다. 이들 유사체는, 각각의 핵심 서열이 제2 C 잔기 대신에 1개 이상의 C 또는 호모시스테인 잔기 및 α-아미노-γ-부티르산을 갖는 것인 본 발명의 화합물로부터, 본 발명 분야에 알려져 있는 방법을 이용하여 [예를 들면, Barker 외 (1992) J. Med. Chem. 35: 2040-2048 and 또는 외 (1991) J. Org. Chem. 56: 3146-3149 참조], 분자 내 또는 분자간 치환 반응을 통하여 제조될 수 있다. α-아미노-γ-부티르산과 호모시스테인의 다른 동족체를 이용하여 이러한 치환 반응을 수행할 수도 있다는 것을 본 발명 분야의 숙련자는 용이하게 이해할 것이다.

전술한 것과 같은 고리화 전략 이외에, 다른 비 디설파이드 고리화 전략이 이용될 수도 있다. 그러한 대안적인 고리화 전략은, 예를 들면, 아미드 고리화 전략은 물론, 티오 에테르 결합의 생성 역시 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 분자 내 아미드 결합 또는 분자 내 티오 에테르 결합 중의 어느 한쪽을 갖는 고리화된 형태로 존재할 수 있다. 예를 들면, 상기 핵심 서열의 1개의 시스테인이 리신으로 교체되어 있고, 제2 시스테인이 글루타민산으로 교체되어 있는 펩티드를 합성할 수 있다. 그 다음, 이들 2개의 잔기의 측쇄 사이의 아미드 결합을 통하여 고리형 단량체를 생성시킬 수 있다. 대안으로서, 상기 핵심 서열의 1개의 시스테인이 리신으로 교체되어 있는 펩티드를 합성할 수 있다. 그 다음, 상기 핵심 서열의 리신 잔기의 측쇄들과 제2 시스테인 잔기 사이의 티오 에테르 결합을 통하여 고리형 단량체를 생성시킬 수 있다. 이와 같이, 디설파이드 고리화 전략 이외에, 본 발명의 화합물을 고리화하는 데에는 아미드-고리화 전략과 티오 에테르 고리화 전략 양쪽 모두를 용이하게 이용할 수 있다. 대안으로서, α-치환기가 α-할로아세트산, 예를 들면, α-클로로아세트산, α-브로모아세트산, 또는 α-요오도아세트산과 같은 이탈기인 α-치환된 아세트산으로 펩티드의 아미노-말단을 봉지(capped)할 수 있다.

연결자의 첨가

펩티드 이량체가 연결자 L_K 부분에 의하여 이량화되는 구체례에 있어서, 상기 연결자는 펩티드 합성 중에 펩티드에 도입될 수 있다. 예를 들면, 연결자 L_K 부 분이 펩티드 합성을 위한 개시 부위로 작용할 수 있는 2개의 작용기와 다른 분자 부분과 결합할 수 있는 제3 작용기 (예를 들면, 카복실기 또는 아미노기)를 갖는 경우에, 상기 연결자를 고체 지지체에 접합시킬 수 있다. 그 다음, 고상 합성 기술의 변형에 따라 연결자 L_K 부분의 2개의 반응성 질소기 상에서 2개의 펩티드 단량체를 직접 합성할 수 있다.

펩티드 이량체가 연결자 L_K 부분에 의하여 이량화되는 것인 대안적인 구체례에 있어서, 상기 연결자를 펩티드 합성 이후에 펩티드 이량체의 2개의 펩티드 단량체에 접합시킬 수 있다. 이러한 접합은 본 발명 분야에서 잘 정립되어 있는 방법에 의하여 달성될 수 있다. 한 가지 구체례에 있어서, 연결자는 합성되는 펩티드 단량체의 표적 작용기에 부착되기에 적합한 2개 이상의 작용기를 갖는다. 예를 들면, 2개의 유리 아민기를 갖는 연결자를 2개의 펩티드 단량체의 각각의 C-말단 카복실기와 반응시킬 수 있다. 다른 한 가지 예에 있어서, 사전에 활성화하거나 또는 적합한 커플링 시약 존재 하에 2개의 카복실기를 갖는 연결자를 2개의 펩티드 단량체의 각각의 N-말단 또는 측쇄 아민기, 또는 C-말단 리신 아미드와 반응시킬 수 있다.

간격자의 첨가

펩티드 화합물이 간격자 부분을 갖는 구체례에 있어서, 상기 간격자는 펩티드 합성 과정 중에 펩티드에 도입될 수 있다. 예를 들면, 간격자가 다른 분자 부분과 결합할 수 있는 유리 아미노기 및 제2 작용기 (예를 들면, 카복실기 또는 아미노기)를 갖는 경우, 상기 간격자를 고체 지지체에 접합시킬 수 있다. 그 다음, 펩 티드를 표준 고상 기술을 이용하여 상기 간격자의 유리 아미노기 상에서 직접 합성할 수 있다.

바람직한 구체례에 있어서, 2개의 작용기를 갖는 간격자를 먼저 제1 작용기를 통하여 고체 지지체에 커플링한다. 그 다음, 펩티드 합성을 위한 개시 부위로 작용할 수 있는 2개의 작용기와 다른 분자 부분과 결합할 수 있는 제3 작용기 (예를 들면, 카복실기 또는 아미노기)를 갖는 연결자 L_K 부분을 상기 간격자의 제2 작용기와 연결자의 제3 작용기를 통하여 상기 간격자에 접합시킨다. 그 다음, 2개의 펩티드 단량체를 고상 합성 기술의 변형에 따라 연결자 L_K 부분의 2개의 반응성 질소기 상에서 직접 합성할 수 있다. 예를 들면, 유리 아민기를 갖는 간격자와 커플링된 고체 지지체를 연결자의 유리 카복실기를 통하여 리신 연결자와 반응시킬 수 있다.

펩티드 화합물이 간격자 부분을 갖는 것인 대안적인 구체례에 있어서, 상기 간격자를 펩티드 합성 이후에 펩티드에 접합시킬 수 있다. 이러한 접합은 본 발명 분야에서 잘 정립되어 있는 방법에 의하여 달성될 수 있다. 한 가지 구체례에 있어서, 상기 연결자는 합성되는 펩티드 단량체의 표적 작용기에 부착되기에 적합한 1개 이상의 작용기를 갖는다. 예를 들면, 유리 아민기를 갖는 간격자를 펩티드의 C-말단 카복실기와 반응시킬 수 있다. 다른 한 가지 예에 있어서, 유리 카복실기를 갖는 연결자를 펩티드의 N-말단 또는 리신 잔기의 유리 아민기와 반응시킬 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 유리 설프하이드릴기를 갖는 간격자를 디설파이드 결합 을 형성시키는 산화 반응에 의하여 펩티드의 시스테인 잔기에 접합시킬 수 있다.

수용성 중합체의 부착

최근에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 수용성 중합체가 치료 및 진단학적으로 중요한 펩티드의 공유적 변경에 사용되고 있다. 이러한 중합체의 부착은 생물학적 활성을 향상시키고, 혈액 순환 시간을 지속시키며, 면역원성을 감소시키고, 수용성을 증가시키며, 프로테아제 소화에 대한 저항성을 향상시키는 것으로 생각된다. 예를 들면, 인터루킨 [Knauf 외 (1988) J. Biol. Chem. 263; 15064; Tsutsumi 외 (1995) J. 제어 방출 33: 447), 인터페론 (Kita 외 (1990) Drug Des. 전달 6: 157), 카탈라아제 (Abuchowsl i 외 (1977) J. Biol. Chem. 252: 582), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (Beauchamp 외 (1983) Anal. Biochem. 131: 25) 및 아데노신 디아미나아제 (Chen 외 (1981) Biochim. Biophy. Acta 660: 293)와 같은 치료 폴리펩티드에 대한 PEG의 공유적 부착은 이들의 생체 내 반감기를 연장시키거나, 및/또는 이들의 면역원성과 항원성을 감소시키는 것으로 보고되었다.

본 발명의 펩티드 화합물은 추가로 1개 이상의 수용성 중합체 부분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이들 중합체는 펩티드 화합물에 공유적으로 부착된다. 수용성 중합체는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종 중합체 또는 무작위 공중합체 중의 어느 한쪽), 폴리(n-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종 중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체 및 폴리옥시에틸화 폴리올일 수 있다. 바람직한 수용성 중합체는 PEG이다.

본 발명의 펩티드, 펩티드 이량체 및 기타의 펩티드 기재 분자를, 수용성 중합체를 분자 (예를 들면, 펩티드 + 간격자)의 수용체-결합 부분에 연결시키는 다양한 화학 중의 어떤 것을 이용하여 수용성 중합체 (예를 들면, PEG)에 부착시킬 수 있다. 통상의 구체례는 수용성 중합체를 수용체-결합 부분에 공유적으로 부착함에 있어서 1개의 부착 접합부(junction)을 이용하지만, 대안적인 구체례에 있어서는 다수개의 부착 접합부가 사용될 수 있고, 이 경우, 서로 상이한 종의 수용성 중합체를, 상기 간격자에 및/또는 펩티드 사슬의 한쪽 또는 양쪽 모두에 대한 공유적 부착을 포함할 수 있는 구별되는 부착 접합부에 있는 수용체-결합 부분에 부착시키는 것인 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 몇 가지 구체례에 있어서, 이량체 또는 그 이상의 다량체는 구별되는 종의 펩티드 사슬 (즉, 이종 이량체 또는 다른 이종 다량체)을 포함할 것이다. 이에 제한되지 않은 예로서, 이량체는 PEG 부착 접합부를 갖는 제1 펩티드 사슬을 포함할 수 있고, 제2 펩티드 사슬은 PEG 부착 접합부를 갖지 않거나 또는 제1 펩티드 사슬과는 상이한 결합 화학을 이용할 수 있으며, 몇 가지 변형에 있어서 상기 간격자는 PEG 부착 접합부를 갖거나 갖지 않을 수 있고, 페길화(PEGylated)되는 경우 상기 간격자는 제1 및/또는 제2 펩티드 사슬의 것과는 상이한 결합 화학을 이용할 수 있다. 대안적인 구체례는 수용체-결합 부분의 간격자 부분에 부착되어 있는 PEG 및 분자의 펩티드 부분의 아미노산 중 1개의 측쇄에 접합되어 있는 상이한 수용성 중합체 (예를 들면, 탄수화물)를 이용한다.

매우 다양한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 종이 수용체-결합 부분 (펩티드 + 간격자)의 페길화에 사용될 수 있다. 실질적으로 어떠한 적합한 반응성 PEG 시약이라도 사용될 수 있다. 바람직한 구체례에 있어서, 반응성 PEG 시약은 수용체-결합 부분에 접합되는 경우에 카바메이트 또는 아미드 결합의 생성을 가져올 것이다. 적합한 반응성 PEG 종은 NOF Corporation (Yebisu Garden Place Tower, 20-3 Ebisu 4-chome, Shibuya-ku, Tokyo 150-6019)의 Drug 전달 Systems 카탈로그 (2003) 및 Nektar 치료s (490 Discovery Drive, Huntsville, Alabama 35806)의 Molecular Engineering 카탈로그 (2003)에서 시판되고 있는 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이에 제한되지 않는 예로서, 다음과 같은 PEG 시약이 다양한 구체례에 있어서 바람직하다: mPEG2-NHS, mPEG2-ALD, multi-Arm PEG, mPEG(MAL)2, mPEG2(MAL), mPEG-NH2, mPEG-SPA, mPEG-SBA, mPEG-티오에스테르, mPEG-Double, 에스테르, mPEG-BTC, mPEG-ButyrALD, mPEG-ACET, 이종 작용성 PEG (NH2-PEG-COOH, Boc-PEG-NHS, Fmoc-PEG-NHS, NHS-PEG-VS, NHS-PEG-MAL), PEG acrylates (ACRL-PEG-NHS), PEG-인지질 (예를 들면, mPEG- DSPE), 본 발명 분야의 당업자가 선택한 화학에 의하여 활성화된 글리세린 기재 PEG의 GL 시리즈를 포함하는 SUNBRITE 시리즈의 다중 팔(multiarmed) PEG, (카복실-PEG, p-NP-PEG, 트레실-PEG, 알데히드 PEG, acetal-PEG, 아미노-PEG, 티올-PEG, 말레이미도-PEG, 하이드록실-PEG-아민, 아미노-PEG-COOH, 하이드록실-PEG-알데히드, 카복실산 무수물형-PEG, 작용기화 PEG-인지질, 및 특별한 응용 및 이용을 위하여 본 발명 분야의 숙련자에 의하여 선택되는 기타 유사하거나 및/또는 적합한 반응성 PEG를 포함하지만 이에 한정되지는 않는) SUNBRITE 활성화 PEG 중의 어떤 것.

중합체는 어떤 분자량의 것일 수도 있고, 분지형 또는 비분지형의 것일 수도 있다. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 PEG는 약 20 킬로달톤 (kD) 내지 약 40 kD의 분자량을 갖는 선형, 비분지형 PEG를 포함한다 ("약"이라는 용어는 PEG 제품에 있어서 기술된 분자량에 비하여 몇몇 분자는 더 큰 분자량을, 몇몇 분자는 더 작은 분자량을 갖는 것을 의미한다). 가장 바람직하게는, PEG는 약 30 kD 내지 약 40 kD의 분자량을 갖는다. 목적하는 치료학적 프로파일 (예를 들면, 필요한 지연 방출 기간, 필요한 경우 생물학적 활성에 대한 효과, 취급 용이성, 항원성의 정도 및 부존재, 및 치료 펩티드에 대한 PEG의 다른 알려진 효과)에 따라 다른 크기의 것이 사용될 수도 있다.

부착되는 중합체 분자의 수는 달라질 수 있는데, 예를 들면, 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 수용성 중합체가 본 발명의 EPO-R 작용제 펩티드에 부착될 수 있다. 부착된 다수개의 중합체는 서로 동일하거나 또는 상이한 화학적 부분 (예를 들면, 상이한 분자량의 PEG)일 수 있다. 몇 가지 경우에, 중합체 부착의 정도 (펩티드에 부착되는 중합체 부분의 개수 및/또는 중합체가 부착되는 펩티드의 총수)는 부착 반응에 있어서 중합체 분자 대 펩티드 분자의 비율은 물론, 반응 혼합물 내에 존재하는 각각의 총 농도에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, (과량의 미반응 펩티드 및/또는 중합체 부분이 없도록 하는 반응 효율의 면에서) 최적의 중합체 대 펩티드 비율은

목적하는 중합체 부착의 정도 (예를 들면, 모노, di-, 트리-, etc. ), 선택 되는 중합체의 분자량, 중합체가 분지형 또는 비분지형인가 여부, 및 특정 부착 방법을 위한 반응 조건과 같은 인자에 의하여 결정될 것이다.

바람직한 구체례에 있어서, 공유적으로 부착된 수용성 중합체는 PEG이다. 예시 목적을 위한, PEG (페길화)의 공유 부착 방법의 예가 이하에서 설명된다. 이들 예시적인 설명은 제한적인 것이 아니다. 본 발명 분야의 당업자는 광범위한 수용성 중합체를 공유적으로 부착하는 다양한 방법이 본 발명 분야에 알려져 있다는 것을 이해할 것이다. 이와 같이, 본 발명 분야에 알려져 있는 많은 수의 수용성 중합체 중의 어떤 것을 본 발명 분야에 알려져 있는 방법에 따라 펩티드 화합물에 부착하는 것은 본 발명의 범위 내이다.

한 가지 구체례에 있어서, PEG는 2개의 펩티드 단량체를 이량화하는 연결자로서 작용할 수 있다. 한 가지 구체례에 있어서, PEG를 펩티드 단량체 또는 이량체의 1개 이상의 말단 (N-말단 또는 C-말단)에 부착한다. 다른 한가지 구체례에 있어서, PEG를 펩티드 단량체 또는 이량체의 간격자 부분에 부착한다. 바람직한 구체례에 있어서, PEG를 펩티드 이량체의 연결자 부분에 부착한다. 매우 바람직한 구체례에 있어서, PEG를 상기 간격자 부분이 펩티드 이량체의 단량체를 연결시키는 연결자 L_K 부분에 부착되어 있는 것인 간격자 부분에 부착한다. 가장 바람직하게는, PEG를, 상기 간격자 부분이 리신 연결자의 카보닐 탄소 또는 리신 아미드 연결자의 아미드 질소를 통하여 펩티드 이량체에 부착되어 있는, 간격자 부분에 부착한다. 본 발명 분야의 당업자가 이용할 수 있는 수많은 PEG 부착 방법이 있다 [예를 들면, Goodson 외 (1990) Bio/Technology 8: 343 (부위 지정(부위-지향성) 돌연 변이 이후의 이의 글리코실화 부위의 인터루킨-2의 페길화); EP 0 401 384 (G-CSF에 대한 PEG 커플링); Malik,외, (1992) Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (트레실 클로라이드를 이용하는 GM-CSF의 페길화); 국제 공개 공보 제WO 90/12874 (시스테인-특이적 mPEG 유도체를 이용하여 재조합적으로 도입된 시스테인 잔기를 갖는 에리스로포이에틴의 페길화); 미국 특허 제5,757,078 (EPO 펩티드의 페길화 ); 및 미국 특허 제6,077,939 (펩티드의 N-말단 α-탄소의 페길화) 참조].

예를 들면, PEG를 반응성 기를 통하여 아미노산 잔기에 공유 결합시킬 수 있다. 반응성 기는 활성화 PEG 분자를 결합시키는 것들이다 (예를 들면, 유리 아미노 또는 카복실기). 예를 들면, N-말단 아미노산 잔기 및 리신 (K) 잔기는 유리 아미노기를 가지며, C-말단 아미노산 잔기는 유리 카복실기를 갖는다. (예를 들면, 시스테인 잔기에서 발견되는 것과 같은)설프하이드릴 기를 PEG를 부착하기 위한 반응성 기로 사용할 수도 있다. 그 외에, 활성화 기 (예를 들면, 하이드라지드, 알데히드, 및 방향족-아미노기)를 특이적으로 폴리펩티드의 C-말단에 도입하기 위한 효소-보조 방법은 [Schwarz 외 (1990) 방법 Enzymol. 184: 160; Rose 외 (1991) Bioconjugate Chem. 2: 154; Gaertner 외 (1994) J. Biol. Chem. 269: 7224]에 설명되어 있다.

예를 들면, PEG 분자를 상이한 반응성 부분을 갖는 메톡실화 PEG ("PEG")를 사용하여 펩티드 아미노기에 부착시킬 수 있다. 이와 같은 중합체는 mPEG-석신이미딜 석시네이트, mPEG-석신이미딜 카보네이트, mPEG-이미데이트, mPEG-4-니트로페닐 카보네이트, 및 mPEG-시아누릭 클로라이드를 포함한다. 유사하게, PEG 분자를 유리 아민기 (mPEG-NH₂)를 갖는 메톡실화 PEG를 사용하여 펩티드 카복실기에 부착시킬 수 있다.

PEG의 부착이 비특이적이고, 특이적 PEG 부착을 갖는 펩티드가 필요한 경우, 목적하는 페길화 화합물을 페길화 화합물의 혼합물로부터 정제할 수 있다. 예를 들면, N-말단 페길화 펩티드가 필요한 경우, N-말단 페길화 형을 무작위적으로 페길화된 펩티드의 집단으로부터 정제 (즉, 다른 모노페길화 부분으로부터 이 부분을 분리)할 수 있다.

바람직한 구체례에 있어서, PEG를 부위 특이적으로 펩티드에 부착시킨다. 성장 호르몬-방출 인자의 잠재적인 유사체의 N-말단, 측쇄 및 C-말단에서의 부위 특이적 페길화는 고상 합성법을 통하여 수행되어 왔다 [Felix 외 (1995) Int. J. Peptide Protein Res. 46: 253]. 다른 부위-특이적 방법은 N-말단 트레오닌이 과요오드산나트륨 에 의하여 산화되어 생성되는 N-말단에 있는 반응성 알데히드기를 통하여 부위-특이적 방법으로 리포솜 표면 그라프트 PEG 사슬의 극단(extremities)에 부착하는 것을 포함한다 [Zalipsky 외 (1995) Bioconj. Chem. 6: 705]. 그러나, 이 방법은 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기을 갖는 폴리펩티드에 한정된다. 하이드라존, 환원된 하이드라존, 옥심, 또는 환원된 옥심 결합을 통하여 펩티드의 N-말단을 페길화하는 또 다른 부위-특이적 방법은 Wei 외, 미국 특허 제6,077,939에 기술되어 있다.

한 가지 방법에 있어서, 선택적 N-말단 페길화를, 특정 단백질에서 유도체화하는 데에 이용할 수 있는 상이한 형태의 1차 아미노기 (리신 대 N-말단)의 구별되는 반응성을 이용하는 환원성 알킬화에 의하여 달성할 수 있다. 적절한 반응 조건 하에서, PEG를 갖는 카보닐 기를 선택적으로 펩티드의 N-말단에 부착한다. 예를 들면,

펩티드의 리신 잔기의 ε-아미노기와 N-말단 잔기의 α-아미노기 사이의 pKa 차이를 이용하는 pH에서 반응을 수행함으로써 단백질을 선택적으로 N-말단 페길화할 수 있다. 이와 같은 선택적 부착에 의하여, 다른 반응성 기 (예를 들면, 리신 측쇄 아미노기)의 중요한 변경이 없이, 단백질의 N-말단에서 페길화가 지배적으로 일어난다. 환원성 알킬화를 이용하는 경우, PEG는 단백질에 커플링하기 위한 1개의 반응성 알데히드를 가져야 한다 (예를 들면, PEG 프로프리온알데히드가 사용될 수 있다).

부위-특이적 돌연 변이가 부위-특이적 중합체 부착 펩티드 제조에 이용될 수 있는 추가의 접근법이다. 이 방법을 위해서는, 펩티드의 아미노산 서열이 적절한 반응성 기가 펩티드 내의 목적하는 위치에 도입되도록 고안된다. 예를 들면, WO 90/12874는

시스테인 잔기의 삽입 또는 시스테인 잔기를 다른 잔기로 치환하는 것에 의하여 변경된 단백질의 부위-지향성 페길화를 기술하고 있다. 이 공보는 또한 시스테인-특이적 mPEG 유도체를 재조합적으로 도입된 EPO 상의 시스테인 잔기와 반응시킴으로써 mPEG-에리스로포이에틴 ("mPEG-EPO")을 제조하는 방법을 설명하고 있다.

PEG를 간격자 또는 연결자 부분에 부착하는 경우에, 유사한 부착 방법이 이용될 수 있다. 이 경우에, 상기 연결자 또는 간격자는 반응성 기를 가지며, 적절한 상보적인 반응성 기를 갖는 활성화 PEG 분자가 공유적 부착이 일어나도록 하는 데에 이용된다. 바람직한 구체례에 있어서, 상기 연결자 또는 간격자 반응성 기는 적당하게 활성화된 PEG 분자와 반응함으로써 아미드 또는 카바메이트와 같은 안정한 공유 결합을 형성하는 말단 아미노기 (즉, 연결자 또는 간격자의 말단에 위치하는)를 갖는다. 적합한 활성화 PEG 종은 mPEG-파라-니트로페닐카보네이트 (mPEG-NPC), mPEG-석신이미딜 카보네이트 (mPEG-SC), 및 mPEG-석신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 바람직한 구체례에 있어서, 상기 연결자 또는 간격자 반응성 기는 적합한 반응 조건 하에서 아민-PEG를 갖는 분자와 공유 결합을 형성하는 활성화될 수 있는 카복실기를 갖는다. 적합한 PEG 분자는 mPEG-NHz를 포함하며, 적합한 반응 조건은 카보디이미드 매개 아미드 생성을 포함한다.

EPO -R 작용제 활성 분석

생체 외 기능 분석

생체 외 경쟁적 결합 분석은 EPO-R 결합에서 EPO와 경쟁하는 테스트 펩티드의 활성을 평가하는 것이다. 예를 들어 (미국 특허 5,773,569 참조), 인간 EPO-R의 세포 외 도메인 (EPO 결합 단백질, EBP)은 대장균 (E. coli)에서 재조합적으로 생산할 수 있으며, 재조합 단백질은 마이크로타이터 접시 또는 합성 비드 (예, 술포링크 비드, Pierce 화학적 Co. (Rockford, IL))와 같은 고정 상에 결합된다. 그 후 , 고정된 EBP는 표지된 재조합 EPO 또는 표지된 재조합 EPO 및 테스트 펩티드와 함께 배양된다. 이러한 실험을 위해서, 테스트 펩티드의 일련의 희석액이 필요하다. 추가된 테스트 펩티드가 없는 분석 수치는 EBP에 대한 총 EPO 결합을 의미한다. 테스트 펩티드를 함유하는 반응에 있어서, 결합된 EPO의 양을 정량하고, 대조군 (총=100%) 결합의 비율로서 표현한다. 이러한 수치를 펩티드 농도에 대하여 그래프화한다. IC50 수치는 EBP에 대한 EPO의 결합을 50%까지 감소시키는 테스트 펩티드 농도로 정의된다 (예, EPO 결합을 50% 억제).

다른 생체 외 경쟁적 결합 분석은 두 개의 비드의 근접 작용으로 유발되는 빛 신호의 분석을 이용한 것이다. EPO-결합 비드와 EPO-R-결합 비드이다. 비드 근접성은 EPO-R에 EPO가 결합함으로써 유발된다. EPO-R 결합에 있어서 EPO와 경쟁하는 테스트 펩티드는 이러한 결합을 억제하고, 빛 발산을 감소시킨다. 빛 발산을 50% 감소시키는 테스트 펩티드 농도를 IC50 수치로 정의한다.

본 발명의 펩티드는 EPO-R 결합에 있어서 EPO와 매우 효과적으로 경쟁한다. 이러한 증강된 기능은 실질적으로 저 농도의 펩티드에서 (예, IC50 수치보다 더 적은 농도) EPO의 결합을 억제하는 활성으로서 대표될 수 있다.

EPO-수용체에 특이적으로 결합하는, 본 발명의 단량체 및 이량체 펩티드 EPO-R 작용제의 생물학적 활성과 효능은 생체 외 세포를 기초로 한 활성 분석을 이용하여 측정될 수 있다.

한 가지 분석은 인간 EPO-R를 발현하고, 추가로 포스 프로모터-작동 루시페라제 리포터 유전자 구조체로 트랜스펙션된 설치 동물의 전 B 세포주 (pre-B Cell line)를 기초로 하고 있다. EPO 또는 다른 EPO-R 작용제에 노출될 때, 이러한 세포는 루시페라제를 합성함으로써 반응한다. 루시페라제는 기질 루시페린의 첨가에 따라 빛을 발산하게 된다. 따라서, 이러한 세포에서 EPO-R 활성 수준은 루시페라제 활성 측정으로 정량할 수 있다. 테스트 펩티드의 활성은 테스트 펩티드의 일련의 희석액을 세포 내로 첨가한 후, 이를 4시간 동안 배양함으로써 측정된다. 배양 후, 루시페린 기질을 세포에 첨가하고, 빛 발산을 측정한다. 빛 발산 최대치의 절반을 나타내는 테스트 펩티드 농도를 EC50으로 나타낸다.

이러한 분석에서, 본 발명의 펩티드는 EPO-R 신호 의존성 루시페라제 발현을 촉진하는 데 있어, 매우 증강된 활성을 나타낸다. 이렇게 증강된 기능은 실질적으로 저 농도의 펩티드에서 (예, EC50 수치보다 더 적은 농도), 루시페라제 활성 최대치의 절반을 유발하는 활성으로서 대표될 수 있다. 이러한 분석은 본 발명의 EPO-R 작용제 펩티드의 효능과 활성을 평가하는 유용한 방법이다.

또 다른 분석은 안정하게 트랜스펙션된 EPO-R 내로의 비형질전환 설치 동물 골수 유래 세포주, FDC-P1/ER 세포를 이용하여 수행할 수 있다 (Dexter, et al.(1980), J. Exp. Med.). 이러한 세포는 EPO 의존성 증식을 나타낸다.

이러한 분석에서, 세포는 필요 성장 인자 (예, 미국 특허 제5,773, 569호 참조)의 존재하에서 반 정지 밀도(half stationary density)까지 성장한다. 그 후, 세포를PBS로 세척하고, 성장 인자가 결핍된 전체 배지에서 16~24시간 동안 기아 상태로 한다. 세포가 생존하고 있는 것을 확인한 후 (예, 트리판 블루 염색에 의함), 원액 (성장 인자가 결핍된 전체 배지 내) 50㎕ 당 약 10⁵ 세포를 투입한다. 테스트되는 펩티드 EPO-R 작용제 화합물 (일반적으로 파지-결합 또는 다른 결합 또는 고정 펩티드에 반대되는 자유, 용액상 펩티드)을 각 웰 당 최종 부피가 50ml가 되도록 96 웰 조직 배양 플레이트에서 제조한다. 세포(50㎕)를 각 웰에 첨가하고, 세포는 24~48시간 배양한다. 이때, 음성 대조군은 죽거나 정지상태에 있어야 한다. 그 후, 세포 증식의 표시로서 H3-티미딘 유입을 측정하는 MTT 분석 (Mosmann,(1983), J. Immunol. Methods 65: 55-63 참조)과 같은, 본 기술분야에서 잘 알려진 방법에 따라 세포 증식을 측정한다. 펩티드를 EPO-R 발현 세포주와 모체 비발현 세포주 모두에서 측정한다. 세포 증식 최대치의 절반을 유발하는 테스트 펩티드 농도를 EC50으로 나타낸다.

본 분석에서, 본 발명의 펩티드는 EPO 의존성 세포 성장을 촉진하는데 있어서, 매우 증강된 활성을 나타낸다. 이렇게 증강된 기능은 실질적으로 저 농도의 펩티드에서 (예, EC50 수치보다 더 적은 농도) 세포 증식 자극 활성의 최대치의 절반을 유발하는 활성으로서 대표될 수 있다. 이러한 분석은 본 발명의 EPO-R 작용제 펩티드의 효능과 활성을 평가하는 유용한 방법이다.

또 다른 분석에서, 세포는 EPO-보충 배지에서 정지 상태까지 성장하고, 수집된 후, EPO 결핍 배지에서 추가로 18시간 동안 배양된다. 세포를 동일한 세포 밀도로 3 그룹으로 분리한다. 추가된 인자가 없는 그룹 (음성 대조군), EPO 함유 그룹 (양성 대조군) 및 테스트 펩티드 함유 실험군이다. 그 후, 배양된 세포를 여러 시 점에서 수집하고, 고정한 후, DNA 결합 형광 염색 (예, 프로피디움 아이오도 또는 훽스트 염색, 모두 Simga 로부터 입수 가능함)으로 염색한다. 그 후, 형광을 측정하는데, 예를 들어, 팍스 스캔 흐름 세포측정기 (FACS Scan Flow cytometer)를 이용하여 측정할 수 있다. 이어서, 세포 주기 각 단계에서의 세포의 비율을 측정하는데, 예를 들어, CelIFIT 소프트웨어 (Becton Dickinson)의 SOBR 모델을 이용하여 측정할 수 있다. EPO 또는 활성펩티드로 처리된 세포는 음성 대조군과 비교하여, S 단계의 세포 비율이 상대적으로 더 높다 (증가된 DNA 함량의 표지인 증가된 형광을 측정함).

유사한 분석이 FDCP-1 (예, Dexter et al. (1980), J. Exp. Med., 152:1036-1047 참조) 또는 TF-1 (Kitamura, et al. (1989), Blood, 73: 375-380]) 세포주를 이용하여 수행될 수 있다. FDCP-1은 성장 인자 의존성 설치 동물 다 기능성 초기 조혈성 전구 세포주 (growth factor dependent murine multi-potential primitive hematopoietic progenitor cell line)이며, WEHI-3-조절 배지(IL-3를 함유하는 배지, ATCC 번호 TIB-68)로 보충될 때, 이 세포는 증식할 수 있으나 분화할 수 없다. 이러한 실험을 위해서, FDCP-1 세포주는 인간 또는 설치 동물 EPO-R로 트랜스펙션되어, FDCP-1-hEPO-R 또는FDCP-1-mEPO-R를 각각 생산한다. 이들 세포는 EPO 존재하에서, 증식할 수 있으나, 분화할 수 없다. TF-1, EPO-의존성 세포주는 세포성 증식에서 펩티드 EPO-R 작용제의 효능을 평가하는데 또한 사용될 수 있다.

또 다른 분석에서, 비장 세포로의 H³-티미딘 유입을 기초로 한 마이크로분석 을 위한 크리스탈 (Krystal, (1983), Exp. Hematol, 11:649-660)에 의한 과정을 EPO 작용제로서 작용하는 본 발명의 화합물의 활성을 확인하기 위해 이용할 수 있다. 간단하게는, B6C3F₁ 마우스에 페닐히드라진(60mg/kg)을 이틀 동안 매일 주사한다. 3일째 날, 비장 세포를 제거하고, 24시간에 걸쳐, 증식하는 이들의 활성을 MTT 분석을 이용하여 측정한다.

에리스로포이에틴 반응 세포주에서 EPO-R에 대한 EPO 결합은 수용체와 Shc, vav및 JAK2 키나제와 같은 수많은 세포 내 단백질 모두의 티로신 인산화를 유도한다. 따라서, 다른 생체 외 분석은 EPO-R와 하류 세포 내 신호 변환자 단백질의 티로신 인산화를 유발하는, 본 발명 펩티드의 활성을 측정한다. 상기 기재된 결합 및 증식 분석에 의해 확인되는 것처럼, 활성 펩티드는 에리스로포이에틴 반응 세포에서의 EPO와 거의 동일한 인산화 패턴을 나타낸다. 이러한 분석에는, FDC-P1/ER 세포 (Dexter, et al. (1980), J Exp. Med., 152:1036-47)는 EPO-보충 배지에 유지시키고, 이들은 고정 상태까지 성장한다. 그 후, 이들 세포를 EPO가 없는 배지에서 24시간 배양한다. 이어서, 정해진 수의 이들 세포를 약 10분간 37℃에서 테스트 펩티드와 배양한다. EPO를 함유한 세포의 대조 시료 또한, 각 분석에서 이용된다. 그 후, 처리된 세포를 원심분리로 회수하고, SDS 용해 완충제 내에서 재현탁시킨 후, SDS 폴라아크릴아미드 겔 전기 영동한다. 겔 상에서 전기영동된 단백질을 니트로셀룰로스로 이동하고, 블롯 위의 단백질 함유 인티로신(phosphotyrosine)을 표준 면역학적 기술로 시각화한다. 예를 들어, 블롯을 항-인티로신 항체 (예, 마우스 항- 인티로신 IgG, Upstate Biotechnology, Inc.)로 검출하고, 세척한 후, 2차 항체 (예, 퍼옥시다제 표지된 고트 항-마우스 IgG, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Washington, DC))로 검출한다. 그 후에, 단백질 함유 인티로신은 비색계, 화학발광 또는 형광 분석을 포함하는 표준 기술로서 시각화된다. 예를 들어, 화학발광 분석은 아머샴의 ECL 웨스턴 블롯팅 시스템을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 펩티드의 활성을 분석하는 데 이용되는, 또 다른 세포 기초 생체 외 분석으로는 설치 동물 골수 또는 인간 말초 혈액 세포를 이용하는 콜로니 분석이 있다. 설치 동물 골수는 마우스의 대퇴골로부터 얻을 수 있으며, 인간 말초 혈액 시료은 건강한 기증자로부터 얻을 수 있다. 말초 혈액의 경우, 단핵구 세포는 혈액으로부터 처음으로 분리되는 것이며, 예를 들어, Ficoll-Hypaque gradient (Stem Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canada))로 원심분리하여 얻을 수 있다. 이 분석에서, 유핵 세포 계산은 원 시료에서 유핵 세포의 수와 농도를 확인하기 위해 수행한다. 정해진 수의 세포를 제조사의 지침에 따라 (Stem Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canada)), 메틸셀룰로오스에서 평판 배양한다. 실험군은 테스트 펩티드로 처리하고, 양성 대조군은 EPO로 처리하며, 음성 대조군은 어떠한 처리도 하지 않는다. 그 후, 각 그룹에 대하여 성장 콜로니의 수를 일반적으로 10일 및 18일 정도의 정해진 배양기간 후에 측정한다. 활성 펩티드는 콜로니 형성을 촉진할 것이다.

본 발명의 화합물의 활성을 확인하는데 사용될 수 있는 다른 생체 외 생물학적 분석은 다음에 기재되어 있다. Greenberger, et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2935 (EPO-dependent hematopoietic progenitor cell line); Quelle 및 Wojchowski, (1991), J. Biol. Chem. 266:609-614 (protein tyrosine phosphorylation in B6SUt.EP cells); Dusanter-Fourt, et al., (1992), J. Biol. Chem., 287:10670-10678 (tyrosine phosphorylation of EPO-receptor in human EPO-responsive cells); Quelle, et al., (1992), J. Biol. Chem., 267:17055-17060 (tyrosine phosphorylation of a cytosolic protein, pp 100, in FDC-ER cells); Worthington, et al., (1987), Exp. Hematol., 15:85-92 (colorimetric assay for hemoglobin); Kaiho 및 Miuno, (1985), Anal. Biochem., 149:117-120 (detection of hemoglobin with 2,7- diaminofluorene); Patel, et al., (1992), J. Biol. Chem., 267:21300-21302 (expression of c-myb); Witthuhn, et al., (1993), Cell, 74:227-236 (association and tyrosine phosphorylation of JAK2); Leonard, et al., (1993), Blood 82:1071-1079 (expression of GATA transcription factors); 및 Ando, et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9571-9575 (regulationof G1 kansition by cycling D2 and D3).

마이크로피지오미터(마이크로physiometer)로 알려진 Molecular 장치s Corp.에 의해 고안된 장치는 다양한 수용체에 대한 작용제와 길항제의 효과 측정시 유용하게 사용될 수 있다고 알려져 있다. 이러한 기구의 원리는 수용체 활성화에 반응하는 세포 외 매질의 산성화 변화를 측정하는 것이다.

생체 내 활성 분석

테스트 펩티드의 효능을 분석하는 생체 내 활성 분석에는 적혈구 증가 탈저 산소성 마우스 생물학적 분석(폴리cythemic exhypoxic mouse bioassay)이 있다. 이 분석을 위하여, 마우스는 수일간에 걸쳐 교차 컨디션 조절 주기에 노출시킨다. 이 주기에서, 마우스는 저 비중 상태와 대기압 상태 주기 사이에 번갈아 노출된다. 그 후, 마우스를 테스트 시료 투여 2~3일 전 대기압 하에 둔다. 테스트 펩티드 시료 또는 양성 대조군 마우스에서는 EPO 표준체를 컨디션 조절된 마우스 내로 피하 주사한다. 방사성 표지된 철 (예, Fe⁵⁹)을 2일 후에 투여하고, 혈액 시료는 방사성 표지된 철 투여 2일 후에 채취한다. 적혈구 용적률과 방사능 수치는 표준 기술을 이용하여 각 혈액 시료로부터 측정된다. 활성 테스트 펩티드가 주입된 마우스로부터 채취한 혈액 시료는 테스트 펩티드 또는 EPO가 주입되지 않은 마우스보다 더 큰 방사능을 나타내었다 (이는 적혈구 헤모글로빈에 의한 Fe⁵⁹의 결합에 의한 것이다).

테스트 펩티드의 효능을 분석하는 생체 내 활성 분석에는 망상 적혈구 분석이 있다. 이 분석을 위하여, 정상 비처리된 마우스에게 연속 3일간 EPO 또는 테스트 펩티드를 피하 주사한다. 3일째, 마우스에 철 덱스트란을 복강 주사한다. 5일째, 마우스로부터 혈액을 채취한다. 각 혈액에서 망상 적혈구의 비율(%)은 티아졸 오렌지 염색과 흐름 세포 측정기 (retic-count program)로 확인한다. 추가로, 적혈구 용적률을 계산한다. 망상 적혈구의 정확한 비율은 아래의 식을 이용하여 측정할 수 있다.

활성 테스트 화합물은 테스트 펩티드 또는 EPO가 주입되지 않은 마우스와 비 교하여 증가된 % RETIC_CORRECTED 수치를 나타낼 것이다.

본 발명의 EPO -R 작용제 펩티드의 용도

본 발명의 펩티드 화합물은, 영향을 주거나 영향을 받는 많은 인자들의 평가를 포함하는 EPO의 생물학적 기능, EPO의 생성 및 EPO-R에 대한 EPO의 결합을 이해하기 위한 수단으로서 생체 외에서 유용하다. 또한, 본 발명은 EPO-R에 결합하는 다른 화합물의 개발에 있어서도 유용하며, 이는 본 발명의 화합물이 개발을 촉진하는 중요한 구조 활성 관련성을 제공하기 때문이다.

더욱이, EPO-R에 결합하는 이들의 활성에 근거하여, 본 발명의 펩티드는 살아있는 세포; 고정 세포; 생물학적 액체; 조직균질액; 정제, 천연의 생물학적 제제 등에서 EPO-R를 검출하는 제제로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 펩티드를 표지화함으로써, 세포 표면에 EPO-R를 갖는 세포를 확인할 수 있다. 게다가, EPO-R에 결합하는 이들의 활성에 근거하여, 본 발명의 펩티드는 정위치(in situ) 염색, FACS (fluorescence-activated cell sorting) 분석, 웨스턴 블롯팅, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 등에 사용될 수 있다. 또한, EPO-R에 결합하는 이들의 활성에 근거하여, 본 발명의 펩티드는 수용체 정제에 이용되거나, 세포 표면에서 EPO-R을 발현하는 세포 (또는 내부 침투된 세포) 정제에도 이용할 수 있다.

또한 본 발명의 펩티드는 다양한 의학적 연구나 진단을 위한 상업적 제제로서 이용될 수 있다. 이러한 이용은 다음을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니 다. (1) 다양한 작용 분석에 있어서, 후보 EPO-R 작용제의 활성을 정량하는 측정 표준체로서의 이용; (2) EPO-R 펩티드 리간드의 새로운 물질을 찾는 것과 같은, 무작위 펩티드 스크리닝에서 저지제 (blocking agents)로서 이용, 이러한 펩티드는 본 발명의 EPO 펩티드의 회수를 저지하는데 사용됨; (3) EPO-R와 공결정화에서 이용, 예를 들어 EPO-R에 결합된 본 발명의 펩티드 결정이 형성되고, X선 결정학에 의해서 수용체/펩티드의 구조가 확인됨; (4) 글로빈 합성과 헴 복합체 합성을 유도하고, 분화가 개시됨으로써 페리틴 수용체의 수를 증가시키는 적혈구 전구체 활성 측정을 위한 이용; (5) FDCP-1-mEPO-R 및 TF-1 세포주와 같은 EPO 의존성 세포주의 증식과 성장을 유지하기 위한 이용; 및 (6) EPO-R이 유리하게 활성화되거나, 이러한 활성화를 EPO-R 작용제의 알려진 양에 대하여 간편하게 측정하는 다른 연구나 진단용 등이 있다.

본 발명의 또 다른 실시 형태로서, 치료 방법과 약물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 펩티드 화합물은 인간을 포함한 온혈 동물에 투여되어, 생체 내에서 EPO-R에 대한 EPO 결합을 자극한다. 따라서, 본 발명은 EPO 결핍과 관련되는 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 EPO-R을 자극하기에 충분한 양의 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하며, 따라서 생체 내에서 EPO 결핍과 관련된 증상을 완화한다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 신장 기능 부전 및/또는 말기 신장 기능 부전/투석; AIDS와 관련된 빈혈; 만성 염증성 질환 (예, 류마티스성 관절염 및 만성 장 염증성 질환)과 관련된 빈혈 및 자가 면역 질환의 치료에 이용될 수 있으며, 수술 전 환자의 적혈구 수치를 올리는데 이용할 수 있다. 본 발명의 펩 티드 투여로서 치료될 수 있는 다른 질환, 질병 및 적혈구 비정상 상태는 다음을 포함한다. 베타-지중해성빈혈; 낭성 섬유증; 임신 및 월경 장애; 조숙성 초기 빈혈; 척수 손상; 우주 비행; 급성 혈액 손실; 노화 및 비정상적 적혈구 생성에 의해 나타나는 다양한 종양성 질환 상태이다.

다른 실시 상태로서, 본 발명의 펩티드 화합물은 적혈구의 부족 또는 결핍을 특징으로 하지 않는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 수혈 전 전 처치에 이용될 수 있다. 게다가, 본 발명의 화합물의 투여는 출혈 시간을 감소시키므로, 출혈이 일어날 수 있는 수술 또는 조치 전에 환자에게 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 거대핵세포의 활성화에 사용될 수 있다.

EPO가 중추 콜린성 신경뿐 아니라, 혈관 상피 세포에 대해서도 분열 촉진 및 주화능이 있기 때문에 (예, Amagnostou, et al., (1990), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:5978-5982 및 Konishi, et al., (1993), Brain Res., 609:29-35 참조), 본 발명의 화합물은 다양한 혈관 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 상처 치유 촉진; 측부 심장 혈관 증식 촉진 (이는 심근 경색증 후에 발생할 수 있다); 외상 치료; 및 혈관 이식 후 치료 등에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 다양한 신경성 질환을 치료하는데 이용될 수 있으며, 일반적으로 이러한 신경성 질환은 신경 전달 물질과 같은 다른 신경 자극성 물질과 비교할 때, 아세틸콜린의 절대적인 수치의 저하 또는 상대적인 수치의 저하를 특징으로 한다.

의약 조성물

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 EPO-R 작용제 펩티드 화합물의 의약 조성물이 제공된다. 이러한 조성물의 투여에 의하여 완화 또는 조절되는 상태는 앞에 나타낸 것들을 포함한다. 이러한 의약 조성물은 경구, 비경구 (근육내, 복막내, 정맥내 (IV) 또는 피하 주사), 경피 (수동적으로 또는 이온 삼투 요법 또는 전기 천공법을 이용하는), 경점막(transmucosal) (코, 질, 직장, 또는 설하) 투여 경로로 또는 생물학적 침식이 가능한 삽입물을 이용하여 투여되며, 각각의 투여 경로에 적합한 투여 제형으로 제제화될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 의하여 파악되는 것은 유효량의 본 발명의 EPO-R 작용제 펩티드, 또는 유도체 생성물을 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 포함하는 의약 조성물이다. 이러한 조성물은 다양한 완충 내용물 (예를 들면, 트리s-HCI, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 세기로 이루어진 희석제; 세정제 및 가용화제 (예를 들면, Tween 20, Tween 80, 폴리소르베이트 80), 산화 방지제 (예를 들면, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트), 보존제 (예를 들면, Thimersol, 벤질 알코올) 및 장확장성(bulking) 물질 (예를 들면, 락토오스, 마니톨)과 같은 첨가제; 물질의 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체형 화합물의 미립자 제제에 또는 리포솜에 합일화(incorporation)하는 것을 포함한다. 하이알루론산 역시 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 본 발명 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도 및 생체 내 청소(clearance) 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로서 병합되어 있는 Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed. (1990, mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712를 참조하라. 상기 조성물은 액체형으로 제조될 수 있고, 건조 분말 (예를 들면, 동결 건조된) 형으로 제조될 수도 있다.

경구 전달

본 발명에서 사용되는 것으로 예상되는 것은 본 명세서에 참고 문헌으로서 병합되어 있는 Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042)의 89장에 일반적으로 설명되어 있는 경구 고체 투여 제형이다. 고체 투여 제형은 정제, 캡슐, 환약, 알약(troches) 또는 마름모꼴 정제(lozenges), 교갑(cachets), 펠렛, 분말, 또는 과립을 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물을 제제화하는 데에 리포솜 또는 프로테노이드 캡슐화를 이용할 수도 있다 (예를 들면, 미국 특허 제4,925,673호에 보고된 것과 같은 프로테노이드 미소 구체). 리포솜 캡슐화를 이용할 수 있는데, 리포솜을 다양한 중합체 (예를 들면, 미국 특허 제5,013, 556호)로 유도체화할 수 있다. 치료제를 위하여 가능한 고체 투여 제형에 대한 설명은 본 명세서에 참고 문헌으로서 병합되어 있는 Marshall, K. In: Modern Phar7naceutics Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes Chapter 10,1979에 제시되어 있다. 일반적으로, 제형은 EPO-R 작용제 펩티드 (또는 이들의 화학적 변형)와, 위장 환경에서의 보호를 허용하고, 장내에서 생물학적 활성 물질을 방출하게 하는 불활성 성분들을 포함할 것이다.

또한, 본 발명에서 사용될 것으로 예상되는 것은, 불활성 희석제; 습윤제, 유화제 및 현탁제와 같은 보조제; 및 감미제, 향료, 및 방향제(perfuming agents)를 비롯한 기타 성분들을 포함할 수 있는, 약제학적으로 허용 가능한 에멀전, 용액, 현탁액 및 시럽을 포함하는 경구 투여용 액체 투여 제형이다.

펩티드를 화학적으로 변경시켜 유도체의 경구 전달을 유효하게 할 수 있다. 일반적으로, 예상되는 화학적 변경은 성분 분자 그 자체에 1개 이상의 부분을 부착하는 것인데, 상기 부분은 (a) 단백질 분해의 억제; 및 (b) 위장 또는 장으로부터 혈류 내로의 흡수를 가능하게 한다. 또한 바람직한 것은 성분 또는 성분들의 전체적인 안정성 향상 및 체내 순환 시간의 증가이다. 앞에서 논의한 바와 같이, 페길화가 제약학적 사용을 위한 바람직한 화학적 변경이다. 이용될 수 있는 기타 부분은 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리프롤린, 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸(tioxocane)을 포함한다 [예를 들면, Abuchowski and Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Adducts," in Enzymes as Drugs. Hocenberg 및 Roberts 편집 (Wiley-Interscience: New York, NY) pp. 367-383; 및 Newmark 외 (1982) J. Appl. Biochem. 4: 185-189 참조].

경구 제형의 경우, 방출 위치는 위장, 소장 (샘창자, 지주넴(jejunem) 또는 회장), 또는 대장일 수 있다. 본 발명 분야의 당업자는 위장에서는 용해되지 않지만, 샘창자 또는 장 내의 어떤 부분에서 물질을 방출하는 이용 가능한 제형을 가지고 있다. 바람직하게는, 상기 방출은 펩티드 (또는 유도체)를 보호함으로써, 또는 펩티드 (또는 유도체)를 위장 환경을 넘어서, 장과 같은 곳에서 방출하게 함으로써 위장 환경에 유해한 효과를 피할 것이다.

완전한 위장 저항성을 보장하기 위하여 pH 5.0 이상까지 비투과성인 피복이 필수적이다. 장용 피복으로 사용되는 보다 일반적인 불활성 성분의 예는 셀룰로오 스 아세테이트 트리멜리테이트 (CAT), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트 (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), Eudragit L, Eudragit S, 및 Shellac이다. 이들 피복은 혼합된 필름으로서 사용될 수도 있다.

피복 또는 피복의 혼합물은 위장에 대하여 보호하고자 하는 것이 아닌 정제에도 사용될 수 있다. 이것은 당류 피복, 또는 정제를 씹기 쉽게 하는 피복을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조 치료제 (즉 분말) 전달용으로서 경질 껍질 (젤라틴과 같은)로 이루어질 수 있고, 액체 제형용으로서 연질 젤라틴 껍질이 이용될 수 있다. 알약의 껍질 물질은 두꺼운 전분 또는 기타의 식용 가능한 종이(paper)일 수 있다. 환약, 마름모꼴 정제, 성형 정제 또는 정제 가루약(triturates)의 경우, 습기 집적(massing) 기술이 사용될 수 있다.

펩티드 (또는 유도체)를 입자 크기 약 1mm의 과립 또는 펠렛 형태의 미세 다중 미립자로 제형에 포함시킬 수 있다. 캡슐 투여용 물질 제형 역시 분말, 가볍게 압착된 플러그(plugs), 또는 정제로 제공될 수 있다. 이들 치료제는 압착에 의하여 제조될 수 있었다.

착색제 및/또는 향료 역시 포함될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 (또는 유도체)를 (리포솜 또는 미소 구체 캡슐화에 의한 것과 같이) 제제화한 다음, 착색제 및 향료를 함유하는 냉장 음료와 같은 식용 제품 내에 추가로 함유시킬 수 있다.

불활성 물질로 희석하거나 또는 펩티드 (또는 유도체)의 부피를 증가시킬 수 있다. 이들 희석제는 탄수화물, 특히 마니톨, α-락토오스, 무수 락토오스, 셀룰로 오스, 수크로오스, 개질 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 칼슘 트리포스페이트, 마그네슘 카보네이트 및 염화나트륨을 비롯한 특정 무기 염 역시 충전제로서 사용될 수 있다. 몇 가지 상업적으로 구입 가능한 희석제는 Fast-Flo, Emdex,STA-Rx 1500, Emcompressand Avicell이다.

붕해제를 고체 투여 제형의 치료제 제형에 포함시킬 수 있다. 붕해제로 사용되는 물질은 전분에 기초한 시판 붕해제 Explotab를 비롯한 전분을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 소듐 전분 글리콜레이트, Amberlite, 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 울트라 아밀로펙틴(ultramylopectin), 소듐 알기네이트, 젤라틴, 오렌지 껍질, 산(acid) 카복시메틸 셀룰로오스, 천연 스폰지 및 벤토나이트가 사용될 수 있다. 붕해제는 불용성 양이온 교환 수지일 수도 있다. 분말화된 고무가 붕해제로서 및 결합제로서 사용될 수 있는데, 이것은 아가, 카라야(Karaya) 또는 트라가칸스(tragacanth)와 같은 분말화된 고무를 포함할 수 있다. 알긴산(alginic acid) 및 그 나트륨염 역시 붕해제로서 유용하다.

펩티드 (또는 유도체) 약제를 서로 붙잡아서 단단한 정제를 형성시키기 위하여 결합제가 사용될 수 있는데, 여기에는 아카시아, 트라가칸스, 전분 및 젤라틴과 같은 천연물로부터 얻어지는 물질이 포함된다. 기타의 것은 메틸 셀룰로오스 (MC), 에틸 셀룰로오스 (EC) 및 카복시메틸 셀룰로오스 (CMC)을 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 (HPMC) 양쪽 모두는 펩티드 (또는 유도체)를 과립화하는 알코올성 용액에 사용될 수 있다.

제제화 공정 중에 들러붙는 것을 방지하기 위하여 윤활제(antifrictional agent)를 펩티드 (또는 유도체)의 제제에 포함시킬 수 있다. 윤활제는 펩티드 (또는 유도체)와 다이(die) 벽 사이에 층으로서 사용될 수 있는데, 이들은 그 마그네슘 및 칼슘염을 포함하는 스테아르산, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 액체 파라핀, 식물성 오일 및 왁스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 소듐 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 다양한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 Carbowax 4000 및 6000과 같은 용해성 윤활제를 사용할 수도 있다.

제제화 과정 중에 약물의 유동성을 향상시키고, 압착 중에 재배열을 도울 수 있는 글리던트(glidants)를 첨가할 수 있다. 글리던트는 전분, 탈크, 화성 실리카(pyrogenic silica) 및 수화 실리코알루미네이트를 포함할 수 있다.

펩티드 (또는 유도체)가 수계 환경에 용해되는 것을 돕기 위하여, 습윤제로서 계면 활성제가 첨가될 수 있다. 계면 활성제는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐설포석시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트와 같은 음이온성 세정제를 포함할 수 있다. 양이온성 세정제를 사용할 수 있는데, 이것은 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 계면 활성제로서 제제에 포함시킬 수 있는 잠재적인 비이온성 세정제의 목록은 라우로매크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤모노스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65 및 80, 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카복시메틸 셀룰로오스이다. 이들 계면 활성제는 단백질 또는 유도체의 제제 내에 단독으로 또는 혼합물로서 상이한 비율로 존재할 수 있다.

잠재적으로 펩티드 (또는 유도체)의 흡수(uptake)를 향상시키는 첨가제는 예 를 들면 지방산 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이다.

제어 방출 경구 제형이 필요할 수 있다. 펩티드 (또는 유도체)를, 확산 또는 침출 메커니즘 중의 어느 하나에 의한 방출을 허용하는 불활성 매트릭스, 예를 들면, 고무에 혼합할 수 있다. 서서히 분해하는(degenerating) 매트릭스 역시 제제에 혼합될 수 있다. 몇 가지 장용 피복 역시 지연된 방출 효과를 갖는다. 제어 방출의 또 다른 형태는 Oros 치료 체계 (Alza Corp.)에 기초한 방법, 즉, 삼투 효과에 기인하여 물의 유입을 허용하고, 약물을 1개의 작은 구멍을 통하여 밀어내는 반투과막으로 약물을 감싸는 방법에 의한 것이다.

다른 피복을 제제용으로 사용할 수 있다. 이들은 피복 팬(pan)에 응용될 수 있는 다양한 당류를 포함한다. 펩티드 (또는 유도체)는 필름 피복 정제로 제공될 수도 있는데, 이 경우, 사용되는 물질은 2개의 기로 나누어진다. 첫 번째 것은 비장용(nonenteric) 물질로서, 이는 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸하이드록시-에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필-메틸 셀룰로오스, 소듐 카복시-메틸 셀룰로오스, 프로비돈 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 두 번째 기는 보통 프탈산의 에스테르인 장용 물질로 이루어진다.

물질의 혼합이 최적의 필름 피복을 제공하기 위하여 이용될 수 있다. 필름 피복은 팬 피복기에서 또는 유동화 베드에서, 또는 압착 피복에 의하여 수행될 수 있다.

비경구 전달

본 발명에 따른 비경구 투여용 제제는 멸균 수용액 또는 비수용액, 현탁액, 또는 에멀전을 포함한다. 비수계 용매 또는 운송 수단의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유 및 옥수수유와 같은 식물성 오일, 젤라틴, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 이러한 투여 제형은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수도 있다. 이들은 , 예를 들면, 박테리아 보전 여과기를 통하여 여과시킴으로써, 조성물에 살균제(sterilizing agents)를 혼합시킴으로써, 또는 조성물을 가열함으로써 멸균될 수 있다. 이들은 사용 직전에 멸균수 또는 기타의 멸균 주사 가능 매질을 사용하여 제조될 수도 있다.

직장 또는 질내 전달

직장 또는 질내 투여용 조성물은 활성 물질 이외에도 코코아 버터 또는 좌약 왁스와 같은 부형제를 함유하는 좌약이다. 코 또는 설하 투여용 조성물 역시 본 발명 분야에 잘 알려져 있는 표준 부형제와 함께 제조된다.

폐 전달

또한, 본 발명에서 예상되는 것은 EPO-R 작용제 펩티드 (또는 이들의 유도체)의 폐 전달이다. 펩티드 (또는 유도체)는 흡입 중에 포유 동물의 폐로 전달되어, 폐 상피 내층을 통과하여 혈류로 전달된다 [예를 들면, Adjei 외 (1990) Pharmaceutical Research 7: 565-569; Adjei 외 (1990) Int. J. Pharmaceutics 63: 135-144 (류프롤리드(leuprolide) 아세테이트); Braquet 외 (1989) J. Cardiovascular Pharmacology 13 (sup5): 143-146 (엔도텔린-1); Hubbard 외 (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206-212 (α1-안티트립신); Smith 외 (1989) J. Clin. Invest. 84: 1145-1146(α-1-단백 분해 효소); Oswein 외 (1990) "에어로졸ization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delievery II Keystone, Colorado (재조합 인간 성장 호르몬); Debs 외 (1988) J. Immunol. 140: 3482-3488 (인터페론-γ 및 종양 괴사 인자 α); 및 Platz 외, 미국 특허 제5,284,656호 (과립 백혈구 집락 자극 인자) 참조]. 전신 효과용 약물의 폐 전달을 위한 방법 및 조성물은 Wong 외의 미국 특허 제5,451, 569호에 기술되어 있다.

치료제 제품의 폐 전달을 위하여 고안된 매우 다양한 기계 장치가 본 발명의 실시에 사용될 것으로 예상되는데, 이는 분무기, 계량화 투여 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 이들은 모두 본 발명 분야의 당업자에게 친숙한 것들이다. 본 발명의 실시에 적합한 상업적으로 구입 가능한 장치의 몇 가지 구체적인 예는 Ultravent 분무기 (Mallinclcrodt Inc., St. Louis, MO); Acorn II 분무기 (Marquest Medical Products, Englewood, CO); Ventolin 계량화 투여 흡입기 (Glaxo Inc., Research 트리angle Park, NC); 및 Spinhaler 분말 흡입기 (Fisons Corp. , Bedford, MA)이다.

이러한 모든 장치는 펩티드 (또는 유도체)의 투여(dispensing)에 적합한 제형의 사용을 필요로 한다. 통상적으로, 각각의 제형은 이용되는 장치의 유형에 대하여 특유하며, 치료에 유용한 통상의 희석제, 보조제 및/또는 담체 이외에도 적절한 분사제 물질의 사용을 포함할 수 있다. 리포솜, 마이크로캡슐 또는 미소 구체, 포함물(inclusion) 복합체, 또는 다른 유형의 담체의 사용 역시 고려된다. 화학적 변경의 유형 또는 이용되는 장치의 유형에 따라, 화학적으로 변경된 펩티드를 상이한 제형으로 제조할 수도 있다.

분사기 또는 초음파 중 어느 한쪽인 분무기와 함께 사용하는 데에 적합한 제형은 통상적으로 용액 1mL 당 생물학적 활성 단백질을 약 0.1 내지 25 mg의 농도로 물에 용해시킨 펩티드 (또는 유도체)를 포함할 것이다. 상기 제형은 (예를 들면, 단백질 안정화 및 삼투압 조절을 위한) 완충제 및 간단한 당류를 포함할 수도 있다. 분무기 제형은 에어로졸 형성 시에 용액의 원자화(atomization)에 기인하는 펩티드 (또는 유도체)의 표면 유도 응집을 감소시키거나 또는 방지하기 위한 계면 활성제를 함유할 수도 있다.

계량화-투여 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 제형은 일반적으로 계면 활성제의 도움으로 분사제 내에 현탁된 펩티드 (또는 유도체)를 함유하는 미분화된 분말을 포함할 것이다. 상기 분사제는 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 하이드로탄소, including 트리클로로플루오로메탄,디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 또는 이들의 조합과 같이, 이러한 목적에 사용되는 통상의 물질 중의 어떤 것일 수 있다. 적합한 계면 활성제는 소르비탄 트리올리에이트 및 대두(soya) 레시틴을 포함한다. 올레산 역시 계면 활성제로서 사용될 수 있다.

분말 흡입기 장치로부터 투여하기 위한 제형은 펩티드 (또는 유도체)를 함유하는 미분화된 건조 분말을 포함할 것이며, 이것은 락토오스, 소르비톨, 수크로오 스, 또는 마니톨과 같은 장확장성 약물(abullcing agent)을, 장치로부터의 분말 살포(dispersal)를 용이하게 하는 양으로, 예를 들면, 제형에 대하여 50 내지 90 중량%의 양으로 포함할 수도 있다. 펩티드 (또는 유도체)는 가장 유리하게는, 먼 쪽(distal) 폐까지 가장 효과적으로 전달하기 위하여, 평균 입자 크기가 10 mm (또는 마이크론) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5mm인 미립자형으로 제조되어야 한다.

코(nasal) 전달

EPO-R 작용제 펩티드 (또는 유도체)의 코 전달 역시 고려된다. 코 전달은 치료제를 코에 투여한 후에, 치료제가 폐에 침착(deposition)될 필요 없이, 펩티드가 직접 혈류까지 통과할 수 있게 한다. 코 전달용 제형은 덱스트란 또는 사이클로덱스트란을 함께 포함한다.

투여량

모든 펩티드 화합물에 대하여 추가적인 연구를 실시함으로써, 다양한 환자의 다양한 상태를 치료하는 데에 적절한 투여량 수준과 관련된 정보가 얻어질 것이며, 통상의 숙련자는 치료 상황, 연령, 수용자의 일반적인 건강을 고려하여 적합한 투여량을 확인할 수 있을 것이다. 선택되는 투여량은 목적하는 치료 효과, 투여 경로 및 필요한 치료 기간에 의존한다. 일반적으로, 하루에 0.001 내지 10 mg/kg 체중의 투여량 수준으로 포유류에게 투여한다. 일반적으로, 정맥 주사 또는 주입의 경우에 투여량은 낮을 수 있다. 투여 계획은 순환 반감기 및 사용되는 제형에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 펩티드 (또는 이들의 유도체)는 1개 이상의 추가 활성 성분 또는 의약 조성물과 함께 투여될 수 있다.

다음으로는 본 발명을 이하의 실시예를 통하여 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 본 명세서의 다른 실시예는 예시를 위한 것일 뿐, 본 발명 또는 어떤 예시 형태의 범위 및 의미를 제한하고자 하는 것이 아니다. 유사하게, 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정의 바람직한 구체례에 한정되는 것이 아니다. 사실상 본 발명의 다양한 변형 및 변경은 본 명세서를 이해하는 당업자에게 분명하고, 그 정신 및 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 청구 범위에 기재된 것과 동등한 완전한 범위와 함께, 첨부된 청구 범위 및 에 의해서만 제한될 것이다.

실시예 1: EPO-R 작용제 펩티드의 합성

1. 펩티드 단량체 합성

본 발명의 다양한 펩티드 단량체를 Applied Biosystems 433A 자동화 장치 상에서 Merrifield 고상 합성 기술 [Stewart 및 Young. 고상 펩티드 합성, 2판 (Pierce 화학적, Rockford, IL) 1984 참조]을 이용하여 합성하였다. 사용된 수지는 5-(4'-Fmoc-아미노 메틸-3,5'-디메톡시페녹시)발레르산으로 가교된 폴리스티렌인 PAL (Milligen/Biosearch)이었다. PAL 수지를 사용함으로써 수지로부터 펩티드가 절단될 때 카복실 말단 아미드 기능성을 유도한다. Fmoc로 아미노산 상의 1차 아민을 보호하였고, 측쇄 보호기로는 세린, 트레오닌 및 티로신 하이드록실에 대해서는 t-부틸을, 글루타민 및 아스파라긴 아미드에 대해서는 트리틸을, 시스테인에 대해서는 Trt 또는 Acm을, 아르기닌 구아니디노기에 대해서는 Pmc (2,2,5,7,8-펜타메틸크로만 설포네이트)를 사용하였다. 각각의 커플링은 BOP (벤조트리아졸릴 N-옥스트리스디메틸아미노포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 및 HOBt (1-하이드록시벤즈트리아졸)로 1시간 또는 2시간 동안 수행하였다.

아미드화 카복시 말단을 갖는 펩티드의 합성의 합성에 있어서는 완전히 조립된 펩티드를 90% 트리플루오로아세트산, 5% 에탄디티올 및 5% 물로 이루어진 혼합물을 이용하여 초기에는 4℃에서, 1.5시간에 걸쳐 점차로 온도를 실온까지 상승시켜 절단하였다. 탈보호 생성물을 수지로부터 여과하고, 디에틸 에테르로 침전시켰다. 생성물을 완전히 건조시킨 다음, 0.1% 트리플루오로아세트산 농도로 아세토니트릴/물 구배로 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피하여 정제하였다.

2. 펩티드 이량체 합성

본 발명의 다양한 펩티드 이량체를 고상 기술을 변형시켜 리신 연결자 상에서 직접 합성하였다.

2개의 펩티드 사슬을 동시에 합성하기 위하여, Fmoc-Lys-Fmoc를 PAL 수지 (Milligen/Biosearch)에 커플링함으로써 합성되는 2개의 사슬 사이에서 연결자로 작용하는 초기 리신 잔기를 제공하였다. 상기 Fmoc 보호기를 온화한 염기(20% 피페리딘 DMF 용액)로 제거하고, 얻어지는 유리 아미노기를 출발 지점으로 사용하여 상기 펩티드 사슬을 합성하였다. 전술한 고상 합성 기술을 이용하여 펩티드 사슬을 합성하였다. 모든 시스테인 잔기를 보호하기 위하여 Trt를 사용하였다. 이량체 탈 보호, 수지로부터의 절단 및 정제 후에, 탈보호 이량체를 100% DMSO 내에서 5 내지 25℃에서 2-3일 동안 배양하여 시스테인 잔기를 산화하였다. 이 산화 반응으로 2개의 분자 내 디설파이드 결합을 갖는 이량체를 지배적으로 (> 75%) 얻었다.

2개의 펩티드 사슬을 순차적으로 합성하기 위하여, Fmoc-Lys-Alloc을 PAL 수지 (Milligen/Biosearch)에 커플링하여 합성되는 2개의 사슬 사이에서 연결자로 작용하는 초기 리신 잔기를 제공하였다. 상기 Fmoc 보호기를 온화한 염기(20% 피페리딘 DMF 용액)로 제거하였다. 그 다음, 얻어지는 유리 아미노기를 출발 지점으로 사용하여 제1 펩티드 사슬을 합성하였다. 전술한 고상 합성 기술을 이용하여 펩티드 사슬을 합성하였다. 제1 사슬의 2개의 시스테인 잔기를 Trt로 보호하였다. 제1 펩티드 사슬의 합성 후에, Pd[P(C₆H₅)₃]₄, 4-메틸 모폴린 및 클로로포름을 사용하여 Alloc 기를 지지체-결합 리신 연결자로부터 제거하였다. 그 다음, 이 제2 유리 아미노기에서 제2 펩티드 사슬을 합성하였다. 제2 사슬의 2개의 시스테인 잔기를 Acm으로 보호하였다. 트리플루오로아세트산을 사용하여 Trt 보호기를 제거함으로써 제1 펩티드 사슬에 분자 내 디설파이드 결합을 형성시킨 다음, 20% DMSO 내에서 밤새도록 교반하여 산화시켰다. 그 다음, 요오드, 메탄올 및 탈륨 트리플루오로아세테이트를 사용하여 Acm 보호기의 제거와 탈보호 시스테인 잔기의 산화를 동시에 수행하여 제2 펩티드 사슬에 분자 내 디설파이드 결합을 형성시켰다.

3. 간격자의 부착

상기 간격자가 아미노산 (예를 들면, 각각 AF35462 및 AF35464로서의 글리신 또는 리신)인 경우, 상기 간격자를 고상 펩티드 합성 중에 펩티드에 도입하였다. 이 경우, 상기 간격자 아미노산을 PAL 수지에 커플링하였는데, 이의 유리 아미노기가 다른 간격자 아미노산의 부착 또는 리신 연결자의 부착을 위한 기재(basis)로서 작용하였다. 리신 연결자의 부착 후에, 전술한 바와 같이 이량체 펩티드를 합성하였다.

4. 예시적인 펩티드 이량체의 합성

이 합성 기술의 예시적인 구체례가 이하에서 설명된다. 한 가지 예에서는, C-말단 리신 아미드를 통하여 연결된 펩티드 이량체의 합성법이 설명된다. 다른 한 가지 예에서는, C-말단 리신에 연결되어 있고, 연결하는 리신에 부착된 간격자 분자를 갖는 펩티드 이량체의 합성의 합성법이 설명된다.

C-말단 리신 아미드를 통하여 연결된 펩티드 이량체의 합성:

단계 1-TentaGel-Rink-Lys의 생성: TentaGel-Rink 수지 (0.18mml/g Rapp 중합체e 제품, 독일)를 (5 당량의 아미노산 및 5 당량의 HATU를 DMF에 0.5 M로 용해시키고, 10 당량의 DIEA를 첨가하는 것으로부터 제조된) 활성화된 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 용액으로 처리하고, 14시간 동안 온화하게 흔들어 주었다. 상기 수지를 세정(DMF, THF, DCM, MeOH)하고, 건조하여 보호된 수지를 얻었다. 수지를 10% 아세트산 무수물, 20% 피리딘의 DCM 용액으로 20분 동안 처리하여 잔류 아민기를 봉지(capped)한 다음, 전술한 바와 같이 세정하였다. 수지를 30% 피페리데인의 DMF 용액 내에서 20분 동안 온화하게 흔들어서 Fmoc 기를 제거하고, 세정(DMF, THF, DCM, MeOH) 및 건조하였다.

단계 2-TentaGel-Rink-Lys(펩티드)₂의 생성: 단계 1로부터의 수지를 HBTU/HOBt 활성화하고, 피페리딘으로 Fmoc를 제거하여 2개의 펩티드 사슬을 동시에 건조하는 Fmoc-아미노산 커플링 사이클을 반복 실시하였다. 이 과정은 Applied Biosystems, Inc에서 시판되는 ABI 433 자동화 펩티드 합성기 상에서 편리하게 수행되었다. 최종적인 Fmoc 제거 후에, 말단 아민기를 DMF 내에서 아세트산 무수물 (10 당량) 및 DIEA (20 당량)로 아실화한 다음, 전술한 바와 같이 세정하였다.

단계 3-수지로부터의 절단: 전술한 수지를 실온에서 TFA (82.5%), 페놀 (5%), 에탄디티올 (2.5%), 물 (5%) 및 티오아니솔 (5%)로 이루어진 용액 내에 3시간 동안 현탁시킨다. TFA (95%), 물 (2.5%) 및 트리이소프로필실란 (2.5%)과 같은 대체 절단 칵테일(cocktail)이 사용될 수도 있다. TFA 용액을 5℃까지 냉각시키고, Et₂O에 부어서 펩티드를 침전시킨다. 여과 및 감압 건조하여 원하는 펩티드를 얻었다. C18 칼럼을 이용하는 제조용 HPLC로 순수한 펩티드를 얻는다.

C-말단 리신 아미드를 통하여 연결되어 있고 간격자 분자를 갖는 펩티드 이량체의 합성:

단계 1-Cbz-TAP의 합성: 시판되는 디아민 ("TAP" Aldrich 화학적사 제품) (10g, 67.47mmol)을 함유하는 무수 DCM (100 ml) 용액을 0℃로 냉각시켰다. 반응 혼합물의 온도를 0℃로 유지하면서, 벤질클로로포메이트 (4.82ml, 33.7mmol)의 무수 DCM(50mI) 용액을 첨가 깔때기를 통하여 6-7시간에 걸쳐 서서히 첨가한 다음, 온도를 실온(~25℃)까지 올라가게 하였다. 추가로 16시간 경과 후에, 진공 하에서 DCM을 제거하고, 잔류물을 3N HCl과 에테르 사이에 분배시켰다. 수층을 모아서 50% NaOH 수용액으로 pH 8-9까지 중화한 다음, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 진공 농축하여 조질 모노-Cbz-TAP (5g, 약 50% 수율)을 얻었다. 이 화합물을 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.

단계 2-Cbz-TAP-Boc의 합성: 격렬하게 교반되는 Cbz-TAP (5g, 17.7mmol)의 헥산 (25ml) 현탁액에 Boc₂O (3.86g, 17.7mmol)를 첨가하고, 실온에서 밤새도록 교 반을 계속하였다. 반응 혼합물을 DCM (25ml)으로 희석하고, 10% 시트르산 수용액 (2X), 물 (2X) 및 브라인(brine)으로 세정하였다. 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 진공 농축하였다. 조질 생성물 (수율 5g)을 다음 반응에 직접 사용하였다.

단계 3 - Boc-TAP의 합성: 이전 반응의 조질 생성물을 메탄올 (25ml)에 용해시키고, 5% 탄소상 Pd(5중량%) 존재 하에 풍선압 하에서 16시간 동안 수소화하였다. 혼합물을 여과하고, 메탄올로 세정한 다음 여액을 진공 농축하여 조질 H-TAP-Boc 생성물 (수율 3.7g)을 얻었다. 단계 1-3을 마친 후의 Boc-TAP의 대략적인 총 수율은 44% (사용된 Cbz-Cl의 양을 기준으로 계산)이었다.

단계 4-TentaGel-연결자의 합성: TentaGel 브로마이드 (2.5 g, 0.48mmol/g, Rapp 중합체e 제품, 독일), 페놀형 연결자 (5 당량 및 K₂CO₃ (5 당량)를 20 mL의 DMF 내에서 70℃로 14시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 다음, 수지를 세정 (0.1 N HCl, 물, ACN, DMF, MeOH)하고, 건조시켜 호박색 수지를 얻었다.

단계 5 - TentaGel-연결자-TAP(Boc)의 합성: 앞에서 얻은 2.5 g의 수지와 H-TAP-Boc (1.5 g, 5 당량) 및 빙초산 (34 ㎕, 5 당량 )을 1:1 MeOH-THF의 혼합물에 용해시키고, 밤새도록 흔들어 주었다. 여기에 1M 소듐 시아노보로하이드라이드 (5 당량) THF 용액을 가하고, 추가로 7시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 세정(DMF, THF, 0.1 N HCl, 물, MeOH)하고, 건조하였다. 소량의 수지를 DCM 내에서 Bz-Cl 및 DIEA로 벤질화하고, 70% TFA-DCM로 절단한 다음, LCMS 및 HPLC로 확인하였다.

단계 6-TentaGel-연결자-TAP-Lys의 합성: 앞에서 얻은 수지를 (5 당량의 아미노산 및 5 당량의 HATU를 DMF에 0.5 M로 용해시킨 다음, 10 당량의 DEA를 첨가하여 제조한) Fmoc-Lys (Fmoc)-OH의 활성화 용액으로 처리하고, 14시간 동안 온화하게 흔들어 주었다.

수지를 (DMF, THF, DCM, MeOH로) 세척하고, 건조시켜, 보호된 수지를 획득하였다. 잔여 아민기는 레진을 10% 무수 아세트산과 20% 피리딘의 DMC 용액으로 20분간 처리하여 봉지(cap)한 후, 상기와 같이 세척하였다. 에프목기는 20분간 30% 피페리딘 DMF 내에서 수지를 서서히 교반시켜 제거하고, (DMF, THF, DCM, MeOH로) 세척한 후, 건조시켰다.

단계 7 - 텐타겔-연결자-TAP-Lys(펩티드)₂의 합성

상기의 수지를 HBTU/HOBt 활성화로 에프목 아미노산 커플링과 피페리딘으로 에프목 제거를 반복하여, 양쪽 펩티드 쇄를 동시에 형성시켰다. 이러한 과정은 바이오시스템 사(Biosystems, Inc.)로부터 이용가능한 ABI 433 자동화 펩티드 합성기를 이용하여 편리하게 수행할 수 있다. 최종 에프목 제거 후, 말단 아민기를 DMF 내에서 무수 아세트산(10 eq.)과 DIEA(20eq.)로 20분간 아실화한 후, 상기와 같이 세척하였다.

단계 8 - 수지로부터의 분리

상기의 수지를 TFA(82.5%), 페놀(5%), 에탄디티올(2.5%), 물(5%) 및 티오아니솔 (5%) 용액에 실온에서 3시간 현탁시켰다. 다르게는 TFA(95%), 물(2.5%) 및 트리이소프로필시레인(2.5%)과 같은 분리 혼합물을 사용할 수도 있다. TFA 용액은 5℃로 냉각시킨 후, Et₂O 내로 부어 펩타이드를 침전시켰다. 감압하에서 여과 건조하여, 원하는 펩티드를 획득하였다. C18 컬럼을 이용한 예비 HPLC로 정제하여 순수한 펩티드를 얻었다.

5. 펩티드 산화로 분자 내 디설파이드 결합의 형성

펩티드 다이머는 20% DMSO/물 (1mg 건조 중량 펩티드/ml)에 용해시키고, 36시간 실온에 방치시켰다. C18 HPLC 컬럼 (Waters Delta-Pak C18, 15 마이크론 입자 크기, 300 옹스트롬 세공 크기, 40mm x 200mm 길이)에 반응 혼합물을 적재시키고, 40 분간 5%부터 95%까지 ACN 선형 농도 구배의 ACN/물/0.01% TFA로 용리하여 정제하였다. 원하는 펩티드를 함유하는 분획을 냉동 건조(Lyopholization)시켜, 생성물을 가벼운 흰색 고체로 만들었다. 예를 들어, AF35525의 경우, 이 반응을 아래와 같이 도식화하여 설명할 수 있다.

6. 펩티드의 페길화

본 발명의 펩티드 페길화는 몇 가지 다른 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

말단 -NH2기의 페길화

펩티드 이량체를 활성화된 PEG 제제 (mPEG-NPC, NOF Corp., Japan) 1.5eq ( 몰 기준)와 함께 건조 DMF에서 혼합하여 깨끗한 용액을 수득하였다. 5분 후에, 상기 용액에 DIEA 4eq.를 첨가하였다. 혼합물을 14시간 동안 상온에서 교반하고, C18 역상 HPLC로 정제하였다. 페길화된 펩티드의 구조를 MALDI 매스로 확인하였다. 또한, 정제한 펩티드는 아래에 기재된 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피로 정제시켰다. 예를 들어, AF35593의 경우, 간격자 부분의 말단 -NH2기의 단일 페길화를 아래와 같이 도식화하여 설명할 수 있다.

펩티드 이량체 N-말단의 이중페길화

펩티드 이량체를 활성화된 PEG 제제 (mPEG-NPC, NOF Corp., Japan) 2.5eq (몰 기준)와 함께 건조 DMF에서 혼합하여 깨끗한 용액을 수득하였다. 5분 후에, 상기 용액에 DIEA 4eq.를 첨가하였다. 혼합물을 14시간 동안 상온에서 교반하고, C18 역상 HPLC로 정제하였다. 또한, 정제한 펩티드는 아래에 기재된 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피로 정제시켰다. 예를 들어, AF35083의 경우, 이러한 반응을 아래와 같이 도식화하여 설명될 수 있다.

N-말단 페길화를 거치는 펩티드 이량체화

펩티드 (2.5eq.)와 PEG-(SPA-NHS)₂ (1eq. Shearwater Corp, USA.)를 0.25M 건조 DMF에 용해시켜, 깨끗한 용액을 수득하였다. 5분 후에, 상기 용액에 DIEA 10eq.를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 상온에서 교반하고, C18 역상 HPLC로 정제하였다. 또한, 정제한 펩티드는 아래에 기재된 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피로 정제시켰다. 예를 들어, AF33131의 경우, 이러한 반응을 아래와 같이 도식화하여 설명할 수 있다.

C-말단 페길화를 거치는 펩티드 이량체화

펩티드(2.5eq.)와 PEG-(SPA-NHS)₂ (1eq. Shearwater Corp, USA.)를 0.25M 건조 DMF에 용해시켜, 깨끗한 용액을 수득하였다. 5분 후에, 상기 용액에 DIEA 10eq.를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 상온에서 교반하고, C18 역상 HPLC로 정제하였다. 또한, 정제한 펩티드는 아래에 기재된 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피로 정제시켰다. 예를 들어, 이러한 반응을 아래와 같이 요약할 수 있다.

7. 펩티드의 이온 교환 정제

몇 가지의 교환 고정상은 상기 펩티드-PEG 접합체를 미반응 (또는 가수분해된) PEG로부터 분리하는 능력에 따라, 추가로, 출발 이량체 펩티드를 보유하는 능력에 따라 평가되었다. 이온 교환 수지(2-3g)를 1cm 컬럼에 적재한 후, 나트륨 형 (용리액이 pH14에 도달할 때까지 컬럼에 0.2N NaOH를 적재함, ca.5 컬럼 부피)으 로, 이어서, 수소 형 (용리액이 적재 pH에 도달할 때까지 0.1N HC1 또는 0.1M HOAc로 용리함, ca.5 컬럼 부피)으로 전환시켰다. 그 후, pH가 6에 도달할 때까지, 25% ACN/물로 세척하였다. 접합체 이전의 펩티드 또는 펩티드-PEG 접합체를 25% ACN/물 (10mg/ml)에 용해시키고, TFA로 pH를 3 미만으로 조정한 후, 컬럼에 적재시켰다. 25% ACN/물 2~3 컬럼 부피로 세척하고, 분획 5ml를 수집한 후, 펩티드를 25% ACN/물에서 0.1M NH₄0Ac로 용리하여 컬럼으로부터 분리시켰다. 그 후, 다시 분획 5ml를 수집하였다. HPLC 분석으로 원하는 펩티드를 함유하고 있는 분획을 확인하였다. 증발 빛 산란 검출기 (ELSD)를 이용한 분석으로, 펩티드가 컬럼에 머물러 있을 때와 NH₄0Ac 용액으로 용리될 때 (일반적으로 분획 4 및 10 사이임), 불순물로서 비접합된 PEG가 관찰되지 않는 것을 알 수 있었다. 펩티드가 초기 세척 완충제에서 용리될 때 (일반적으로 처음 2 분획), 원하는 PEG-접합체와 과량의 PEG의 어떠한 분리도 관찰되지 않았다.

아래의 컬럼은 펩티드와 펩티드-PEG 접합체 모두를 성공적으로 보유하고, 비접합체 펩티드로부터 펩티드-PEG 복합체를 성공적으로 정제하였다.

이온 교환 수지
고정상	공급사
모노 S HR 5/5 강력 양이온 교환 사전 적재 컬럼	아머샴 바이오사이언스
SE53 셀룰로스, 미세과립 강력 양이온 교환 고정상	와트만
SP 세파로스 고속 강력 양이온 교환 고정상	아머샴 바이오사이언스

실시예 2: 생체 외 (in vitro) 활성 분석

이 실시예는 본 발명의 EPO-R 작용제 펩티드의 활성과 효능을 평가하는데 유용한 다양한 생체 외 분석을 설명한다. 이러한 분석의 결과는 본 발명의 새로운 펩티드가 EPO-R에 결합하고 EPO-R 신호를 활성화하는 것을 뒷받침한다. 더욱이, 이러한 분석의 결과는 본 발명의 새로운 펩티드 조성물이 EPO-R 결합 친화력과 생물학적 활성에 있어서, 앞서 설명한 EPO 모사 펩티드에 비해 놀랄만한 증가를 나타내는 것을 보여준다.

EPO-R 작용제 펩티드 단량체 및 이량체는 실시예 1의 방법에 따라 제조된다. 이러한 펩티드 단량체 및 이량체의 효능은 일련의 생체 외 활성 분석으로 평가되며, 이러한 분석으로는 리포터 분석, 증식 분석, 경쟁적 결합 분석 및 C/BFU-e 분석이 있다. 이러한 4가지 분석은 아래에서 더욱 자세하게 설명한다.

이러한 생체 외 활성 분석의 결과는 표 2 (펩티드 단량체)와 표 3 (펩티드 이량체)에 요약되어 있다. 이러한 표는 화합물 명과 각 테스트된 펩티드의 구조를 나타내고, 이러한 4 가지 분석의 실험 결과를 보여준다. 이러한 결과는 본 발명의 새로운 펩티드가 극적으로 증가된 효능이 있음을 증명한다.

1. 리포터 분석

이 분석은 설치 동물의 전 B 세포주 (pre-B Cell line) 유래 리포터 세포, Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux를 기초로 하고 있다. 이 리포터 세포주는 인간 GCSF 수용체의 세포 내 부분에 인간 EPO 수용체 세포 외 부분을 포함하는 키메릭 수용체이다. 추가로 이러한 세포주는 포스 프로모터-작동 루시페라제 리포터 유전자 구조체로 트랜스펙션 된다. 적혈구 생성 제제의 첨가로 인한, 이러한 키메릭 수용체의 활성은 루시페라제 리포터 유전자의 발현을 초래하고, 루시페라제 기질 루시페린의 첨가에 따라 빛을 발산하게 된다. 따라서, 이러한 세포에서 EPO-R 활성 수준은 루시페라제 활성 측정으로 정량할 수 있다.

Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS; Hyclone), 10% WEHI-3 상청액 (WEHI-3 세포 배양물로부터의 상청액, ATCC #TIB-68) 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 배지(Gibco)에서 배양한다. 분석 약 18시간 전에, 세포를 10% FBS와 0.1% WEHI-3 상청액을 보충한 DMEM/F12 배지로 옮겨 기아 생태(starvation)로 한다. 분석 당일 날, 세포를 10% FBS (WEHI-3 상청액 비 함유)를 보충한 DMEM/F12 배지로 한번 세척하고, 1ml 당 1X10⁶ 세포를 펩티드의 알려진 농도 하에서, 또는, 양성 대조군으로서 EPO(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)를 이용하여 10% FBS (WEHI-3 상청액 비 함유)를 보충한 DMEM/F12 배지에서 배양한다. 이 분석에서 테스트 펩티드의 일련의 희석액을 동시에 테스트한다. 루시페린 (Steady-Glo; Promega, Madison, Wi)을 각 웰에 첨가한 후에, 분석 플레이트를 37℃, 5% C0₂ 기압 하에서, 4시간 배양하였다. 5분간의 배양 후에, 팩커드 톱카운트 루미노미터 (Packard Instrument Co., Downers Grove,Ⅱ1.)로 빛 발산을 측정한다. 빛 수치를 테스트 펩티드 농도에 비례하여 그래프화하고, 그래프 패트 소프트웨어로 분석한다. 빛의 최대 발산치 절반을 유발하는 펩티드의 농도를 EC50으로 나타낸다 (표 2 및 3 참조: 리포터 EC50).

2. 증식 분석

이 분석은 인간 EPO-R를 발현하기 위해 트랜스펙션된 설치 동물의 전 B 세포주, Baf3를 기초로 하고 있다. 그 결과 나타나는 세포주, BaF3/Gal4/Elk/EPOR의 증식은 EPO-R 활성에 좌우된다. 세포 증식의 정도는 MTT를 이용하여 정량할 수 있으며, MTT 분석에서의 신호는 살아있는 세포 수에 비례한다.

BaF3/Gal4/Elk/EPOR 세포를 10% FBS (Hyclone) 및 2% WEHI-3 상청액 (ATCC # TIB-68)이 보충된 DMEM/F12 배지(Gibco)에서, 스피너 플라스크 내에서 배앙한다. 배양된 세포를 10% FBS 및 0.1% WEHI-3 상청액이 보충된 DMEM/F12 배지에서 1ml 당 10⁶ 세포의 밀도로 스피너 플라스크 내에서 밤새 기아 상태로 한다. 그 후, 기아 상태가 된 세포를 두벨코의 PBS (Dulbecco's PBS (Gibco))로 2번 세척하고, 10% FBS (WEHI-3 상청액 미함유)가 보충된 DMEM/F12 배지에서 1ml 당 10⁶ 세포 밀도로 재현탁시킨다. 그 후, 세포 현탁액 50㎕ (~50,000 세포)를 96 웰 분석 플레이트에서 3배로 평판 배양한다. 테스트 EPO 모사 펩티드, 50㎕ EPO (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) 또는 Aranesp^TM (darbepoeitin α, 암젠사로부터 입수가능한 ERO-R 작용제)의 10% FBS (WEHI-3 상청액 미함유)가 보충된 DMEM/F12 배지 내에서의 일련의 희석액 50㎕을 96 웰 분석 플레이트 (최종 웰 부피 100㎕)에 첨가한다. 예를 들어, 테스트 펩티드 (또는 대조 EPO 펩티드)의 최종 농도 범위가 810pM 내지 0.0045pM일 때, 12개의 다른 희석액을 테스트한다. 그 후, 평판화된 세포는 37℃에서 48시간 배양한다. 이어서, MTT (Roche Diagnostics) 10㎕를 각 배양 접시 웰에 첨가하고, 4시간 동안 배양한다. 그 후, 반응은 10% SDS와 0.01N HC1을 첨가하여 종료시킨다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 밤새 배양한다. 595nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 분광광도계로 측정한다. 테스트 펩티드의 농도에 대한 흡광도 수치 그래프를 작성하고, 그래프 패드 소프트웨어를 이용하여 EC50을 측정한다. 최대 흡광도의 절반을 유발하는 테스트 펩티드의 농도를 EC50으로 나타낸다 (표 3 참조: 증식 EC50).

3. 경쟁적 결합 분석

경쟁적 결합 결과는 두 개의 비드의 근접 작용으로 유발되는 빛 신호의 분석을 이용하는 것이며, 상기 두 개의 비드는 비오틴 부착된 EPO-R-결합 펩티드 트레이서를 함유하는 스트렙트아비딘 도너(donor) 비드와 EPO-R에 결합하는 어셉터(acceptor) 비드이다. 빛은 단일항(singlet) 산소가 조명에 의해서 첫 번째 비드로부터 방출되고, 방출된 단일항 산소가 두 번째 비드에서 빛을 방출시키는 동안, 비방사성 에너지 전이에 의해 발생한다. 이러한 비드들은 상업적으로 이용가능 하다 (Packard). 비드의 근접성은 EPO-R-결합 펩티드 트레이서가 EPO-R에 결합함으로써 발생한다. EPO-R 결합에 있어서 EPO-R-결합 펩티드 트레이서와 경쟁하는 테스트 펩티드는 이러한 결합을 억제하고, 빛 발산을 감소시킨다.

이 방법을 더욱 자세하게 설명하면 아래와 같다.

테스트 EPO-R 작용제 펩티드, 또는 양성 또는 음성 대조군의 일련의 희석액 4㎕를 384 웰 플레이트의 웰에 첨가한다. 이어서, 웰 당 수용체/비드 혼합물 2㎕를 첨가한다. 수용체 비드 혼합물은 다음으로 구성된다. 5mg/ml 스트렙트아비딘 도너 비드 (Packard) 15㎕, 5mg/ml 단클론 항체 abl79 (이 항체는 재조합 EPO-R에 포함되어 있는 인간 태반 알칼리성 포스파타제 단백질의 부위를 인식한다) 15㎕, 단백질 A-코팅된 어셉터 비드 (단백질 A는 ab179 항체에 결합한다, Packard), 재조합 EPO-R (ab179 표적 에피토프를 함유하는 인간 태반 알칼리성 포스파타제 단백질의 일부에 대한 융합 단백질로서, 중국산 햄스터 난소 세포에서 생산함)의 1:6.6 희석액 112.5㎕ 및 알파퀘스트 완충제 (40mM HEPES, pH7.4; 1mM MgCl₂; 0.1% BSA, 0.05% 트윈 20)이다. 가볍게 두드리면서 혼합한다. 비오틴 부착된 EPO-R-결합 펩티드 트레이서, AF33068 (최종 농도 30nM)를 웰 당 2㎕ 첨가한다. AF33068는, EPO-R 결합 펩티드 (표 3 "리포터 EC50 (pM)") 참조), 실시예 1에서 기재한 방법에 따라 제조할 수 있다.

1분간 원심기를 이용하여 혼합한다. 패커드 톱 봉인으로 플레이트를 봉하고, 호일로 감싼다. 실온에서 밤새 배양한다. 18시간 후, 알파퀘스트 판독기 (Packard)를 이용하여 빛 발산을 판독한다. 펩티드 농도에 대한 빛 발산 그래프를 작성하고, 그래프 패드 또는 엑셀로 분석한다.

빛 발산에 있어서 테스트 펩티드가 없는 상태에서 관찰된 것과 비교하여 50% 감소를 유발하는 테스트 펩티드의 농도를 IC50으로 나타낸다 (표 2 및 3 참조: AQ IC50).

4. C/BFU-e 분석

EPO-R 신호는 골수 줄기 세포의 적혈구 세포 전구체로의 분화를 촉진시킨다. 이러한 분석은 초기 인간 골수 다성능 줄기 세포로부터 적혈구 세포 전구체의 증식과 분화를 촉진하는 테스트 펩티드의 활성을 측정한다.

이러한 분석을 위해서, 일련의 테스트 펩티드 희석액을 10% FBS(Hyclone)가 보충된 IMDM 배지(Gibco)에서 만든다. 그 후, 이러한 일련의 희석액 또는 양성 대조군 EPO 펩티드를 메틸셀룰로스에 첨가하고, 최종 부피가 1.5ml가 되게 한다. 메틸셀룰로스와 펩티드 혼합물을 완벽하게 와류한다. 인간 골수 유래 CD34+ 세포 (Poietics/Cambrex)의 분량 (100,000 세포/ml)을 해동한다. 해동한 세포를 50ml 튜브 내의 lmg/ml DNAse (줄기 세포) 0.1ml에 서서히 첨가한다. 그 후, IMDM 배지 40-50ml를 세포에 천천히 첨가한다. 이 배지의 처음 10ml를 50ml 튜브의 측면을 따라 적가하고, 나머지 남은 용량은 튜브의 측면을 따라 천천히 가한다. 이어서, 세포를 20분간 900rpm에서 회전시키고, 배지는 서서히 흡인하여 조심스럽게 제거한다. 세포를 IMDM 배지 1ml에 재현탁시키고, ml 당 세포의 밀도를 혈구 계산기 슬라이드 상에서 측정한다 (슬라이드 상 세포 현탁액 10ml 분량, 세포 밀도는 평균 총수 X 10,000 세포/ml이다). 그 후, 세포 밀도가 15,000 세포/ml가 되도록 세포를 IMDM 배지에 희석한다. 희석된 세포 100㎕를 펩티드 시료이 추가된 각각의 메틸셀룰로스 1.5ml에 첨가하고 (분석 배지에서의 최종 세포 농도는 1000세포/ml이다), 이 혼합물을 와류시킨다. 혼합물 내에서 거품이 사라지게 한 후, 굵은 바늘을 이용하여 1ml를 흡인시킨다. 각 시료로부터 흡인된 혼합액 0.25ml를 24 웰 플레이트 (Falcon brand)의 4 웰에 첨가한다. 평판화된 혼합액을 37℃, 5% C0₂, 습기 배양기에서 14일간 배양한다. 상 현미경 (5X-1OX 대물렌즈, 100X의 최종 배율)을 이용하여 적혈구 콜로니의 존재를 계산한다. EPO 양성 대조군으로 관찰한 것과 비교하여, 형성된 콜로니의 수가 최대치의 90%인 테스트 펩티드 농도를 EC90으로 나타낸다 (표 3 참조: C/BFU-e EC90).

5. 방사성 리간드 경쟁적 결합 분석

또한, 방사성 리간드 경쟁 결합 분석이 본 발명 펩티드의 IC50 수치를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 이 분석은 EPOr에 대한 ¹²⁵I-EPO의 결합을 측정하는 것이다. 분석은 하기의 예시되는 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.

A. 원료

재조합 인간 EPO R/Fc 키메라	·동정: 재조합 인간 EPO R/Fc 키메라 ·공급원: R&D systems (Minneapolis, MN, US) ·카탈로그 No.:963-ER ·로트 No.:EOK033071 ·보관: 4℃
요오드 처리된 재조합 인간 에리스로포이에틴	·동정: (3[125I]아이오도티로실)에리스로포이에틴, 인간 재조합, 고 특이적 활성, 370kBq, 10μCi ·공급원: Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, US) ·카탈로그 No.:IM219-10μCi ·로트 No.: ·보관: 4℃
단백질-G 세파로스	·동정: 단백질-G 세파로스 4 고속 ·공급원: Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, US) ·카탈로그 No.:17-0618-01 ·로트 No.: ·보관: 4℃
분석 완충제	·0.1% 소 태아 혈청 알부민과 10% 소디움 아자이드를 함유하는 PBS (Phosphate 완충제ed Saline), pH7.4 ·보관: 4℃

B. 적절한 수용체 농도의 측정

인간 IgGl의 Fc 부위에 융합된 동결 건조된 재조합 EPOr 세포 외 도메인의 50㎍ 바이얼을 분석 완충제 1ml 내에 복원시켰다. 분석에 사용하는 수용체의 적절한 양을 측정하기 위해, 본 수용체 제제의 일련의 희석액 100㎕를 요오드 처리한 재조합 인간 에리스로포이에틴 (¹²⁵I-EPO) 200㎕ 내에, 12 X 75mm 폴리프로필렌 테스트 튜브 내에서 약 20,000cpm으로 결합시켰다. 튜브는 뚜껑을 덮어, 4℃, 랩퀘이크 (LabQuake) 회전 진탕기에서 밤새 서서히 혼합시킨다.

다음날, 단백질-G 세파로스의 50% 슬러리 50㎕를 각 튜브에 첨가한다. 그 후, 튜브는 4℃에서 2시간 배양하고, 서서히 혼합한다. 이어서, 튜브를 4000RPM (3297 x G)에서 15분간 원심분리하고, 단백질-G 세파로스를 작은 알갱이로 만든다. 상청액을 조심스럽게 제거한 후, 폐기한다. 4℃ 분석 완충제 1ml로 3회 세척한 후, 상기 작은 알갱이를 왈락 위저드 감마 카운터(Wallac Wizard gamma counter)로 계산한다. 그 후, 결과를 분석하고 최대 결합 수치의 50%에 도달될 필요가 있는 희석액을 계산한다.

C.펩티드의 IC₅₀ 측정

본 발명 펩티드의 IC₅₀을 측정하기 위해서, 펩티드의 일련의 희석액 100㎕를 12 X 75mm 폴리프로필렌 테스트 튜브 내에서 재조합 에리스로포이에틴 수용체 (100pg/튜브) 100㎕와 결합시킨다. 그 후, 요오드 처리한 재조합 인간 에리스로포이에틴 (¹²⁵I-EPO) 100㎕를 각 튜브에 첨가하고, 각 튜브는 뚜껑을 덮고, 4℃에서 밤새 서서히 혼합한다.

다음날, 결합된 ¹²⁵I-EPO를 상기 설명한 바와 같이 정량한다. 결과를 분석하고, 그래프패드 프리즘 버젼 4.0(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 IC₅₀ 수치를 측정한다. 이 분석은 IC₅₀ 수치가 이러한 방법으로 측정되는 각 펩타이드에 대해_, 총 3배수의 IC₅₀ 측정을 위해 2번 이상 반복하는 것이 바람직하다.

6. 결론

본 발명의 펩티드 단량체에 대한 생체 외 리포터 분석 결과는 앞서 개시한 관련 펩티드 서열의 결과와 직접적으로 비교된다 (표 2의 AF31552 및 AF31748 참조). 즉,

GGLYACHMGPMTVCQPLRG SEQ ID NO: 32 및

GGLYACHMGPMT(1-nal)VCQPLRG SEQ ID NO: 33.

이러한 결과는 본 발명의 새로운 펩티드 단량체가 매우 향상된 효능을 가지는 것을 증명한다. 또한, 새로운 펩티드 이량체는 본 리포터 분석에서 앞서 기재한 펩티드 단량체 효능에 비해 3 내지 7.5배의 효능이 있다. 이러한 새로운 펩티드 단량체는 그 후, 효능과 활성이 훨씬 더 큰 새로운 펩티드 이량체를 제조하는데 사용된다. 표 2는 펩티드 단량체에 대한 생체 외 리포터 분석을 보여준다.

표 3은 펩티드 이량체에 대한 생체 외 리포터 분석을 보여준다.

실시예 3: 생체 내 활성 분석

이 실시예는 본 발명의 EPO-R 작용제 펩티드의 활성과 효능을 평가하는데 유용한 다양한 생체 내 분석을 설명한다. EPO-R 작용제 펩티드 단량체 및 이량체는 실시예 1의 방법에 따라 제조된다. 이러한 펩티드 단량체 및 이량체의 활성은 일련의 분석으로 평가되며, 이러한 분석은 적혈구 증가 탈저산소성 마우스 생물학적 분석과 망상적혈구 분석이 있다. 이러한 2가지 분석은 아래에서 더 자세하게 설명한다.

1. 적혈구 증가 탈저산소성 마우스 생물학적 분석

코츠와 뱅햄 (Cotes and Bangham (1961), Nature 191: 1065-1067)에 의해 기재된 방법으로부터 채택된 적혈구 증가 탈저산소성 마우스 생물학적 분석에서 테스트 펩티드의 생체 내 활성이 분석된다. 이 분석은 EPO 모사체로서 작용하는, 예를 들어 EPO-R을 활성화하고 새로운 적혈구 세포 합성을 유도하는, 테스트 펩티드의 활성을 분석한다. 적혈구 세포 합성은 방사성 표지된 철이 합성된 적혈구 세포의 헤모글로빈 내로의 혼입하는 것에 근거하여 정량된다.

BDF1 마우스는 상온에서 7~10일간 적응시킨다. 모든 동물에 대해서 체중을 측정한 후, 저체중의 동물 (<15g)을 제외한다. 마우스는 총 14일간 저비중실에서 연속적인 컨디션 조절 주기에 노출시킨다. 각 24시간 주기는 0.400±0.02% 기압에서 18시간 및 대기압에서 6시간으로 이루어진다. 컨디션 조절 후, 마우스는 주입 전에 추가로 72시간 동안 대기압하에 둔다.

테스트 펩티드, 또는 재조합 인간 EPO 표준체를 PBS+0.1% BSA 담체 (PBS/BSA)에 희석시킨다. 처음에 펩티드 단량체 원액을 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 용해시킨다. 음성 대조군은 PBS/BSA를 단독으로 주입한 마우스 그룹과 1% DMSO를 주입한 마우스 그룹을 포함한다. 각 그룹은 10 마리의 마우스로 구성된다. 마우스를 적절한 시료 0.5ml로 피하 주사한다 (목덜미 부위).

시료 주입 48시간 후, 마우스를 적절한 0.75μCuries/마우스 사용량을 위해, Fe⁵⁹ (Dupont, NEN) 0.2ml로 복막 주사한다. 마우스 체중을 Fe⁵⁹ 투여 24시간 후 측정하고, 마우스를 Fe⁵⁹ 투여 48시간 후 희생시킨다. 혈액을 각 동물로부터 심장 천자로 채취하고, 적혈구 용적률을 측정한다 (헤파린은 항응고제로서 사용되었다). 팩커드 감마 카운터를 사용하여 Fe⁵⁹ 혼입을 확인하기 위해, 각 혈액 시료(0.2ml)을 분석하였다. 비 반응 마우스 (예를 들어, 음성 대조군보다 더 적은 방사능 유입을 나타내는 마우스)는 적절한 데이터로부터 제거된다. 음성 대조군의 53% 미만의 적혈구 용적률을 가지는 마우스도 또한 제거된다.

각 실험 투여량에 대해 10 마리로부터 결과가 도출된다. 각 그룹으로부터, 혈액 시료로 유입된 방사능의 평균 양 (분당 계산, CPM)이 측정된다.

2. 망상 적혈구 분석

정상의 BDF1 마우스에 연속 3일간, EPO 대조군 또는 테스트 펩티드를 접종시킨다(0.5ml, 피하 주사). 3일째, 마우스에 철 덱스트란(100mg/ml)을 또한, 접종시킨다 (0.1ml, 복강 주사). 5일째, 마우스를 CO₂로 마취하고, 심장 천자로 혈액을 채취한다. 각 혈액 시료에서 망상 적혈구의 비율(%)은 티아졸 오렌지 염색과 흐름 세포 측정기 (retic-count program)로 확인한다. 적혈구 용적률이 계산된다. 망상 적혈구의 정확한비율은 아래의 식을 이용하여 측정할 수 있다.

3. 혈액학 분석

정상의 CD1 마우스를 EPO 양성 대조군, 테스트 펩티드 또는 담체를 4주일에 한번, 일시 정맥 주사한다. mg/kg으로 표현되는 양성 대조군과 테스트 펩티드의 투여량 범위는 제제 내 활성 화합물의 농도를 변화시킴으로써 테스트된다. 주사량은 5ml/kg이다. 담체 대조군은 12 마리로 구성되는 반면, 8마리는 잔존하는 사용량 그룹의 각각에 존재한다. 매일 생존 능력과 매주 체중을 측정한다.

투약된 마우스는 금식시킨 후, 이소플루란 흡입으로 마취시킨다. 최종 혈액 시료을 심장 또는 복강 대동맥 천자로 1일째 (담체 대조군 마우스), 15일째 및 29일째 (4마리/그룹/일) 채취한다. 혈액을 Vacutainer^® 브랜드 튜브로 옮긴다. 바람직한 항응고제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이다.

혈액 시료은 본 기술 분야에서 잘 알려진 자동 임상 분석기 (예, Coulter, Inc. 제조품)를 이용하여, 적혈구 합성과 적혈구 용적률 (Hct), 헤모글로빈 (Hgb) 및 적혈구 계산 (RBC)과 같은 생리 기능을 측정하는 종점으로 평가된다.

본 분석에서 대표적인 EPO-R 작용제 펩티드의 데이터가 표 4에 기록되어 있다. 결과는 담체가 주입된 대조군 마우스과 비교하여, 15일 및 29일째 적혈구 용적률 (Hct) 비율(%)에서의 증가량으로 나타낸다. 표시된 펩티드 화합물은 1mg/kg의 용량으로 테스트 마우스에 투여되었다. 표 4는 펩티드 이량체의 생체 내 혈액학 분석을 보여준다.

본 발명은 여기에서 기재된 구체적인 실시 형태에 의해 범위가 제한되는 것은 아니다. 실제로, 여기에 기재된 것 외에, 본 발명에 다양한 실시 형태는 선행하는 기재와 수반되는 도면으로부터 본 기술의 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 기재된 청구 범위에 포함되는 것이다.

추가로, 모든 수치는 적절한 것이고, 설명을 위해 제공한 것이다.

특허, 특허 출원 및 다양한 공개 문헌을 포함한 수많은 참조 문헌이 본 발명의 설명에서 인용되고 논의된다. 이러한 문헌의 인용 및/또는 논의는 단지 본 발명의 보다 정확하게 기술하기 위함이며, 이러한 문헌을 본 발명의 "종래 기술"로 인정하는 것은 아니다. 본 상세한 설명에서 인용되고 논의된 모든 문헌은, 각각의 인용문헌들이 개별적으로 문헌에 의해 병합된 것처럼, 여기에서 전적으로 같은 범위로 인용문헌으로 병합된다.

Claims (61)

1. 길이에 있어서 약 17 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함하고, X₀는 메티오닌 (M) 및 호모세린 메틸 에테르 (Hsm)로부터 선택되는 잔기이고, X₁은 트립토판 (W), 1-나프틸알라닌 (1-nal) 및 2-나프틸알라닌 (2-nal)로부터 선택되는 잔기인 아미노산 서열 LYACHX₀GPITX₁VCQPLR (SEQID NO: 1)을 포함하는 펩티드로서, 에리스로포이에틴 수용체 (EPO-R)에 결합하여 상기 에리스로포이에틴 수용체 (EPO-R)를 활성화하는 것인 펩티드.
2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드의 N-말단이 아세틸화된 것인 펩티드.
3. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 이하의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 펩티드.

   

   
4. 제1항에 있어서, 펩티드는 단량체인 것인 펩티드.
5. 제1항에 있어서, 펩티드는 이량체인 것인 펩티드.
6. 제5항에 있어서, 펩티드는 동종 이량체인 것인 펩티드.
7. 제1항에 있어서, 펩티드에 공유 결합되어 있는 1개 이상의 수용성 중합체를 추가로 포함하는 것인 펩티드.
8. 제7항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 것인 펩티드.
9. 제8항에 있어서, 상기 PEG는 분자량 약 500 내지 약 60,000 달톤의 선형 비분지형 분자를 포함하는 것인 펩티드.
10. 제9항에 있어서, 상기 PEG는 약 20,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것인 펩티드.
11. 제9항에 있어서, 상기 PEG는 약 20,000 내지 약 60,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 펩티드.
12. 제9항에 있어서, 상기 PEG는 약 20,000 내지 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 펩티드.
13. 제9항에 있어서, 2개의 PEG 부분이 펩티드에 공유 결합되어 있고, 상기 PEG는 각각 선형 비분지형 분자를 포함하는 것인 펩티드.
14. 제13항에 있어서, 상기 PEG는 각각 약 20,000 내지 약 30,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 펩티드.
15. (a) 제1 펩티드 사슬; (b) 제2 펩티드 사슬; 및 (c) 상기 제1 및 제2 펩티드 사슬을 연결시키는 연결 부분을 포함하는 펩티드 이량체로서,

    상기 제1 펩티드 사슬과 상기 제2 펩티드 사슬 중 1개 이상은 길이에 있어서 약 17 내지 약 40 아미노산 잔기를 포함하고, X₀는 메티오닌 (M) 및 호모세린 메틸 에테르 (Hsm)로부터 선택되는 잔기이고, X₁은 트립토판 (W), 1-나프틸알라닌 (1-nal) 및 2-나프틸알라닌 (2-nal)로부터 선택되는 잔기인 아미노산 서열 LYACHX₀GPITX₁VCQPLR (SEQID NO: 1)를 포함하는 것이며,

    에리스로포이에틴 수용체 (EPO-R)에 결합하여 상기 에리스로포이에틴 수용체 (EPO-R)를 활성화하는 것인 펩티드 이량체.
16. 제15항에 있어서, 상기 제1 펩티드 사슬과 상기 제2 펩티드 사슬 중 1개 이상이 이하의 것들로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 펩티드 이량체.

    
17. 제15항에 있어서, 상기 연결 부분은 R₃이 저급 (C_{1 -6}) 알킬렌인 식 -NH-R₃-NH-를 포함하는 것인 펩티드 이량체.
18. 제17항에 있어서, 상기 연결 부분은 리신 잔기인 것인 펩티드 이량체.
19. 제15항에 있어서, 상기 연결 부분은 다음의 식으로 표시되는 것인 펩티드 이량체:

    -CO-(CH₂)_n-X-(CH₂)_m-CO-

    식 중에서, n은 0 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 10의 정수이고, X는 O, S, N(CH₂)_pNR₁, NCO(CH₂)_pNR₁ 및 CHNR₁으로부터 선택되는 것이고, R₁은 H, Boc 및 Cbz로부터 선택되는 것이며, p는 1 내지 10의 정수이다.
20. 제19항에 있어서, n과 m은 각각 1이고, X는 NCO(CH₂)_pNR₁이며, p는 2이고, R₁은 H인 펩티드 이량체.
21. 제15항에 있어서, 수용성 중합체를 추가로 포함하는 것인 펩티드 이량체.
22. 제21항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 연결자 부분에 공유 결합되어 있는 것인 펩티드 이량체.
23. 제15항에 있어서, 간격자 부분을 추가로 포함하는 것인 펩티드 이량체.
24. 제23항에 있어서, 상기 간격자 부분은 다음 화학식으로 표시되는 것인 펩티드 이량체:

    -NH-(CH₂)_α[O-(CH₂)_β]_γ-O_δ-(CH₂)_ε-Y-

    식 중에서, α, β 및 ε는 각각 독립적으로 1 내지 6으로부터 선택되는 정수이고, δ는 0 또는 1이고, γ는 0 내지 약 10으로부터 선택되는 정수이며, Y는 NH 또는 CO로부터 선택되는 것인데, 단 γ가 1보다 큰 경우 β는 2이다.
25. 제24항에 있어서, α, β 및 ε는 각각 2이고, δ와 γ는 각각 1이며, Y는 NH인 펩티드 이량체.
26. 제23항에 있어서, 1개 이상의 수용성 중합체를 추가로 포함하는 것인 펩티드 이량체.
27. 제26항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 상기 간격자 부분에 공유 결합되어 있는 것인 펩티드 이량체.
28. 제21항 또는 제26항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 펩티드 이량체.
29. 제28항에 있어서, 상기 PEG는 약 500 내지 약 60,000 달톤의 분자량을 갖는 선형 비분지형 PEG인 것인 펩티드 이량체.
30. 제29항에 있어서, 상기 PEG는 약 500에서 약 20,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것인 펩티드 이량체.
31. 제29항에 있어서, 상기 PEG는 약 20,000 to 60,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 펩티드 이량체.
32. 제31항에 있어서, 상기 PEG는 약 20,000 내지 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 펩티드 이량체.
33. 제28항에 있어서, 2개의 PEG 부분이 펩티드에 공유 결합되어 있고, 상기 PEG 각각은 선형 비분지형 분자를 포함하는 것인 펩티드.
34. 제33항에 있어서, 상기 PEG 각각은 약 20,000 내지 약 30,000 달톤의 분자량 을 갖는 것인 펩티드.
35. 에리스로포이에틴의 결핍 또는 낮거나 불완전한 적혈구 집단을 특징으로 하는 질환을 갖는 환자에게, 길이에 있어서 약 17 내지 약 40 아미노산 잔기를 포함하고, X₀는 메티오닌 (M) 및 호모세린 메틸 에테르 (Hsm)로부터 선택되는 잔기이고, X₁은 트립토판 (W), 1-나프틸알라닌 (1-nal) 및 2-나프틸알라닌 (2-nal)로부터 선택되는 잔기인 아미노산 서열 LYACHX₀GPITX₁VCQPLR (SEQID NO: 1)를 포함하는 펩티드를, 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 환자의 치료 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 질환이 말기 신장 부전 또는 투석; AIDS, 자가 면역 ㅈ질환 또는 암과 관련된 빈혈; 베타-지중해 빈혈증; 낭포성 섬유증 ; 초기 미숙아 빈혈; 만성 염증성 질환과 관련된 빈혈; 척수 손상; 급성 혈액 손실; 노화; 및 비정상적인 적혈구 생성을 수반하는 종양 질환 상태로부터 선택되는 것인 방법.
37. 제35항에 있어서, 펩티드가 이하의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.

    
38. 제35항에 있어서, 펩티드는 단량체인 것인 방법.
39. 제35항에 있어서, 펩티드는 이량체인 것인 방법.
40. 제39항에 있어서, 펩티드는 동종 이량체인 것인 방법.
41. 제35항에 있어서, 1개 이상의 수용성 중합체가 펩티드에 공유 결합되어 있는 것인 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 것인 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 PEG는 약 500 내지 약 60,000 달톤의 분자량을 갖는 선형 비분지형 PEG인 것인 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 PEG는 약 500에서 약 20,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것인 방법.
45. 제43항에 있어서, 상기 PEG는 약 20,000 내지 60,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 펩티드 이량체.
46. 제45항에 있어서, 상기 PEG는 약 20,000 내지 약 40,000 달톤의 분자량을 갖 는 것인 방법.
47. 제42항에 있어서, 2개의 PEG 부분이 펩티드에 공유 결합되어 있고, 상기 PEG 각각은 선형 비분지형 분자를 포함하는 것인 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 PEG 각각은 약 20,000 내지 약 30,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 방법.
49. (i) 길이에 있어서 약 17 내지 약 40 아미노산 잔기로 이루어지고, X₀는 메티오닌 (M) 및 호모세린 메틸 에테르 (Hsm)로부터 선택되는 잔기이고, X₁은 트립토판 (W), 1-나프틸알라닌 (1-nal) 및 2-나프틸알라닌 (2-nal)로부터 선택되는 잔기인 아미노산 서열 LYACHX₀GPITX₁VCQPLR (SEQID NO: 1)를 포함하는 펩티드와,

    (ii) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
50. 제49항에 있어서, 펩티드는 다음과 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 의약 조성물.

    

    
51. 제49항에 있어서, 펩티드는 단량체인 의약 조성물.
52. 제49항에 있어서, 펩티드는 이량체인 의약 조성물.
53. 제52항에 있어서, 펩티드는 동종 이량체인 의약 조성물.
54. 제49항에 있어서, 1개 이상의 수용성 중합체는 펩티드에 공유 결합되어 있는 것인 의약 조성물.
55. 제54항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 의약 조성물.
56. 제55항에 있어서, 상기 PEG는 약 500 내지 약 60,000 달톤의 분자량을 갖는 선형 비분지형 PEG인 것인 의약 조성물.
57. 제56항에 있어서, 상기 PEG는 약 500에서 약 20,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것인 의약 조성물.
58. 제56항에 있어서, 상기 PEG는 약 20,000 내지 약 60,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 의약 조성물.
59. 제58항에 있어서, 상기 PEG는 약 20,000 내지 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 의약 조성물.
60. 제55항에 있어서, 2개의 PEG 부분이 펩티드에 공유 결합되어 있고, 상기 PEG 각각은 선형 비분지형 분자를 포함하는 것인 의약 조성물.
61. 제60항에 있어서, 상기 PEG 각각은 약 20,000 내지 30,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 의약 조성물.