DE69637473T2

DE69637473T2 - An einem thrombopoietin rezeptor bindende peptide und zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69637473T2
Application number: DE69637473T
Authority: DE
Inventors: William J. Menlo Park Dower; Ronald W. Saratoga BARRET; Steven E. Menlo Park CWIRLA; David J. East Polo Alto DUFFIN; Christian M. Morgan Hill GATES; Sherril S. Santa Cruz HASELDEN; Larry C. Cupertino MATTHEAKIS; Peter J. Mountain View SCHATZ; Christopher R. Los Altos WAGSTROM; Nicholas C. Palo Alto WRIGHTON
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: NO331550B1; DK0885242T3; AU704215B2; PL323917A1; JPH10507776A; HUP9900921A3; US6083913A; PE7898A1; CA2636432C; CN1966520B; AR003431A1; HK1015380A1; ZA964814B; BR9608587A; US6465430B1; WO1996040750A1; CN1966520A; EA199700359A1; EP0885242B1; NO975705L

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide und Verbindungen bereit, die an den Thrombopoetin-Rezeptor binden und diesen aktivieren (c-mpI oder TPO-R) oder anderweitig als ein TPO-Agonist fungieren. Die Erfindung findet Anwendung auf den Gebieten der Biochemie und der medizinischen Chemie und stellt insbesondere TPO-Agonisten für die Verwendung bei der Behandlung menschlicher Krankheiten bereit.
Megakaryozyten sind aus dem Knochenmark abgeleitete Zellen, die dafür verantwortlich sind, zirkulierende Blutplättchen zu erzeugen. Obwohl sie in den meisten Spezies weniger als 0,25% der Knochenmark-Zellen umfassen, haben sie ein Volumen, das mehr als 10-fach größer ist als das typischer Markzellen. Siehe Kuter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 11104–11108 (1994). Megakaryozyten durchlaufen einen Prozess, der als Endomitose bekannt ist, wobei sie ihre Kerne replizieren, aber keine Zellteilung durchmachen und dadurch zur Entstehung polyploider Zellen führen. In Reaktion auf eine verminderte Zahl von Blutplättchen nimmt die Endomitoserate zu, es werden Megakaryozyten von höherer Ploidie gebildet und die Zahl von Megakaryozyten kann bis zum 3-Fachen zunehmen. Siehe Harker, J. Clin. Invest. 47: 458–465 (1968). Im Gegensatz dazu nimmt die Endomitoserate in Reaktion auf eine erhöhte Zahl von Blutplättchen ab, es werden Megakaryozyten von geringerer Ploidie erzeugt und die Zahl der Megakaryozyten kann um 50% abnehmen.
Der genaue physiologische Rückkopplungsmechanismus, durch den die Masse der zirkulierenden Blutplättchen die Endomitoserate und die Zahl der Knochenmark-Megakaryozyten reguliert, ist nicht bekannt. Man nimmt heute an, dass es sich bei dem zirkulierenden thrombopoetischen Faktor, der daran beteiligt ist, diesen Rückkopplungsmechanismus zu vermitteln, um Thrombopoetin (TPO) handelt. Genauer gesagt ist es gezeigt worden, dass TPO der wichtigste humorale Regulator in Situationen ist, die mit Thrombocytopenie in Zusammenhang stehen. Siehe z. B. Metcalf, Nature 369: 519–520 (1994). In mehreren Studien ist gezeigt worden, dass TPO die Zahl von Blutplättchen erhöht, die Größe von Blutplättchen steigert und den Isotopen-Einbau in Blutplättchen von Empfängertieren erhöht. Speziell nimmt man an, dass TPO die Bildung von Megakaryozytopoese auf mehrere Arten beeinflusst: (1) es führt zu einem Anstieg der Größe und der Zahl der Megakaryozyten; (2) es führt, in Form der Polyploidie, zu einem Anstieg des DNA-Gehalts in Megakaryozyten; (3) es steigert die Endomitose von Megakaryozyten; (4) es führt zu einer gesteigerten Reifung von Megakaryozyten und (5) es führt zu einem Anstieg des prozentualen Anteils von Vorläuferzellen in Form von kleinen Acetylcholinesterase-positiven Zellen im Knochenmark.
Da Blutplättchen (Thrombozyten) für die Blutgerinnung notwendig sind und da ein Patient ein erhebliches Todesrisiko infolge einer katastrophalen Hämorrhagie trägt, wenn deren Zahl sehr niedrig ist, hat TPO mögliche nützliche Anwendungen sowohl bei der Diagnose als auch der Behandlung verschiedener hämatologischer Funktionsstörungen, z. B. von Krankheiten, die in erster Linie auf Blutplättchen-Defekte zurückzuführen sind. Laufende klinische Studien mit TPO haben gezeigt, dass TPO Patienten sicher verabreicht werden kann. Darüber hinaus haben kürzlich durchgeführte Studien eine Grundlage für die Prognose der Wirksamkeit einer TPO-Therapie bei der Behandlung von Thrombocytopenie bereitgestellt und insbesondere der Thrombocytopenie, die eine Folge von Chemotherapie, Bestrahlungstherapie oder einer Knochenmarktransplantation als Behandlung von Krebs oder Lymphomen ist. Siehe z. B. McDonald (1992), Am. J. Ped. Hematology/Oncology 14: 8–21 (1992).
Das Gen, das TPO codiert, ist cloniert und charakterisiert worden. Siehe Kuter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 11104–11108 (1994); Barley et al., Cell 77: 1117–1124 (1994); Kaushansky et al., Nature 369: 568–571 (1994); Wendling et al., Nature 369: 571–574 (1994) und Sauvage et al., Nature 369: 533–538 (1994). Thrombopoetin ist ein Glycoprotein mit mindestens zwei Formen mit einer gemeinsamen N-terminalen Aminosäuresequenz mit scheinbaren molekularen Massen von 25 kDa und 31 kDa. Siehe Bartley et al., Cell 77: 1117–1124 (1994). Thrombopoetin scheint zwei unterschiedliche Regionen aufzuweisen, die durch eine potenzielle Arg-Arg-Spaltstelle getrennt sind. Die Amino-terminale Region ist in Mensch und Maus hoch konserviert und weist etwas Homologie mit Erythropoetin und Interferon-α und Interferon-β auf. Die Carboxy-terminale Region zeigt eine breite Divergenz zwischen den Spezies.
Die DNA-Sequenzen und die codierten Peptidsequenzen für der menschlichen TPO-R (auch als c-mpI bekannt) sind beschrieben worden. Siehe Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 5640–5644 (1992). TPO-R ist ein Mitglied der Familie der Hämatopoetin-Wachstumsfaktor-Rezeptoren, eine Familie, die durch ein gemeinsames strukturelles Design der extrazellulären Domäne gekennzeichnet ist, einschließlich vier konservierter C-Reste in dem N-terminalen Teil und einem WSXWS-Motiv nahe der Transmembranregion. Siehe Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 6934–6938 (1990). Hinweise darauf, dass dieser Rezeptor eine funktionelle Rolle bei der Hämatopoese spielt, umfassen Beobachtungen, dass seine Expression in Mäusen auf Milz, Knochenmark oder fötale Leber beschränkt ist (siehe Souyri et al., Cell 63: 1137–1147 (1990)) und bei Menschen auf Megakaryocyten, Blutplättchen und CD34⁺ Zellen (siehe Methia et al., Blood 82: 1395–1401 (1993)). Des Weiteren hemmt die Exposition von CD34⁺ Zellen gegenüber synthetischen Antisense-Oligonucleotiden gegen mpI-RNA das Auftreten von Megakaryozyten-Kolonien signifikant ohne die Bildung von erythroiden oder myeloiden Kolonien zu beeinträchtigen. Einige Arbeitsgruppen behaupten, dass der Rezeptor als ein Homodimer funktioniert, ähnlich der Situation bei den Rezeptoren für G-CSF und Erythropoetin.
Die Verfügbarkeit clonierter Gene für TPO-R erleichtert die Suche nach Agonisten dieses wichtigen Rezeptors. Die Verfügbarkeit des rekombinanten Rezeptor-Proteins ermöglicht das Studium der Rezeptor-Liganden-Interaktion in einer Vielzahl von zufallsbasierten und halb zufallsbasierten Systemen zur Erzeugung von Peptiddiversität. Zu diesen Systemen gehört das System „Peptide auf Plasmiden", das in den U.S. Patent Nr. 5,270,170 und 5,338,665 beschrieben ist; das System „Peptide auf Phagen", das in der U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/718,577, die am 20. Juni 1991 eingereicht worden ist, U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/514,108, die am 20. Juni 1990 eingereicht worden ist sowie in Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 6378–6382 (1990) beschrieben worden ist; das „Polysom"-System, das in der U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/300,262 beschrieben worden ist, die am 2. September 1994 eingereicht worden ist, bei der es sich um eine Continuation-in-Part-Anmeldung handelt, welche auf der U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/144,775, eingereicht am 29. Oktober 1993, und der PCT WO 95/11992 basiert; das System der „codierten synthetischen Bank", das in den U. S. Patentanmeldungen mit den Seriennummern 08/146,886, eingereicht am 12. November 1993, 07/946,239, eingereicht am 16. September 1992 und 07/762,522, eingereicht am 18. September 1991 beschrieben ist; und das System der „immobilisierten Polymersynthese in sehr großem Maßstab", das im U.S. Patent Nr. 5,143,854 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. 90/15070, die am 13. Dezember 1990 veröffentlicht worden ist; in der U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/624,120, die am 6. Dezember 1990 eingereicht worden ist; von Fodor et al., Science 251: 767–773 (2/1991); von Dower und Fodor, Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271-280 (1991) und in der U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/805,727, die am 6. Dezember 1991 eingereicht worden ist, beschrieben ist.
Die langsame Wiederherstellung der Blutplättchen-Spiegel bei Patienten, die an Thrombocytopenie leiden, stellt ein ernsthaftes Problem dar und hat die Suche nach einem Blut-Wachstumsfaktor-Agonisten dringlich gemacht, der in der Lage ist, die Regeneration von Blutplättchen zu beschleunigen. Die vorliegende Erfindung stellt einen solchen Agonisten bereit.
LU88573A (Genentech) offenbart bestimmte Thrombopoetin-Polypeptide, die Liganden für den mpI Cytokin-Rezeptor darstellen und von denen behauptet wird, dass sie für die Behandlung von Thrombocytopenie und verwandten Zuständen nützlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung bereit, welche an einen Thrombopoetin-Rezeptor bindet, wobei die Verbindung

(1) ein Molekulargewicht von weniger als etwa 8000 Dalton hat und
(2) eine Bindungsaffinität zu einem Thrombopoetin-Rezeptor ausgedrückt durch einen IC₅₀-Wert von nicht mehr als etwa 100 μM hat, wobei die Verbindung eine Aminosäuresequenz X₈GX₁X₂X₃X₄X₅WX₇ umfasst, wobei X₈ eine der 20 genetisch codierten L-Aminosäuren ist; X₁ P ist; X₂ T ist; X₃ L ist; X₄ R ist; X₅ E oder Q ist; X₇ I oder L ist.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung bereit, die an einen Thrombopoetin-Rezeptor bindet, wobei diese Verbindung

(1) ein Molekulargewicht von weniger als etwa 8000 Dalton hat und
(2) eine Bindungsaffinität zu einem Thrombopoetin-Rezeptor ausgedrückt durch einen IC₅₀-Wert von nicht mehr als etwa 100 μM hat, wobei die Verbindung eine Aminosäuresequenz GGCTLREWLHGGFCGG umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung bereit, die an einen Thrombopoetin-Rezeptor bindet, wobei diese Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus:
Diese Erfindung ist zum Teil auf die neue und unerwartete Entdeckung gerichtet, dass definierte niedermolekulare Peptide und Peptidmimetika die Eigen schaft besitzen, stark an den Thrombopoetin-Rezeptor zu binden und den TPO-R aktivieren können. Dementsprechend sind solche Peptide und Peptidmimetika nützlich für therapeutische Zwecke zur Behandlung von Zuständen, die durch TPO vermittelt werden (z. B. Thrombocytopenie, die von einer Chemotherapie, von einer Bestrahlungstherapie oder Knochenmarktransfusionen herrührt), ebenso wie für diagnostische Zwecke bei der Untersuchung des Mechanismus der Hämatopoese und für die in vitro – Expansion von Megakaryocyten und programmierten Vorläuferzellen.
Peptide und Peptidmimetika, die für therapeutische und/oder diagnostische Zwecke geeignet sind, haben einen IC₅₀-Wert von etwa 2 mM oder weniger, wie durch den Bindungsaffinitäts-Assay bestimmt, der in Beispiel 3 nachstehend ausgeführt ist, wobei ein niedrigerer IC₅₀-Wert mit einer stärkeren Bindungsaffinität an einen Thrombopoetin-Rezeptor korreliert. Für pharmazeutische Zwecke haben die Peptide und Peptidmimetika vorzugsweise einen IC₅₀-Wert von nicht mehr als etwa 100 μM, stärker bevorzugt nicht mehr als 500 nM. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Molekulargewicht des Peptids oder des Peptidmimetikums in einem Bereich von etwa 250 bis etwa 8000 Dalton.
Sofern sie für diagnostische Zwecke eingesetzt werden, werden die Peptide und Peptidmimetika vorzugsweise mit einer nachweisbaren Markierung markiert und dementsprechend dienen die Peptide und Peptidmimetika ohne eine solche Markierung als Zwischenstufen bei der Herstellung von markierten Peptiden und Peptidmimetika.
Peptide, welche die festgelegten Kriterien für das Molekulargewicht und die Bindungsaffinität für den TPO-R einhalten, umfassen 9 oder mehr Aminosäuren, wobei es sich bei den Aminosäuren um in der Natur vorkommende oder um synthetische (nicht in der Natur vorkommende) Aminosäuren handelt. Peptidmimetika umfassen Peptide, die eine oder mehrere der folgenden Modifikationen aufweisen:

Peptide, bei denen eine oder mehrere der Peptidyl [-C(O)NR-]-Verknüpfungen (Bindungen) durch eine Nicht-Peptidyl-Verknüpfung wie z. B. eine -CH₂-Carbamat-Verknüpfung [-CH₂-OC(O)NR-], eine Phosphonat-Verknüpfung, eine -CH₂-Sulfonamid-Verknüpfung [-CH₂-S(O)₂NR-], eine Harnstoff-Verknüpfung [-NHC(O) NH-], eine -CH₂-sekundäre Amin-Verknüpfung oder eine alkylierte Peptidyl-Verknüpfung [-C(O)NR⁶- ersetzt sind, wobei R⁶ ein niederer Alkylrest ist];
Peptide, bei denen der N-Terminus zu einer -NRR¹-Gruppe derivatisiert ist, zu einer -NRC(O)R-Gruppe, zu einer -NRC(O)OR-Gruppe zu einer -NRC(O)₂R-Gruppe, zu einer -NHC(O)NHR-Gruppe, wobei R und R¹ Wasserstoff oder ein niederer Alkylrest sind mit der Maßgabe, dass nicht beide Wasserstoff sind, zu einer Succinimid-Gruppe, zu einer Benzyloxycarbonyl-NH-(CBZ-NH)-Gruppe, oder zu einer Benzyloxycarbonyl-NH-Gruppe, die 1 bis 3 Substituenten an dem Phenylring hat, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus niederen Alkyl-, niederen Alkoxy-, Chlor- und Brom-Gruppen oder
Peptide, bei denen der C-Terminus zu -C(O)R² derivatisiert ist, wobei R² aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus niederen Alkoxyresten sowie -NR₃R₄, wobei R³ und R⁴ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus Wasserstoff und niederen Alkylresten.

Dementsprechend umfassen bevorzugte Peptide und Peptidmimetika eine Verbindung, die

(1) ein Molekulargewicht von weniger als etwa 5000 Dalton hat und
(2) eine Bindungsaffinität zu einem Thrombopoetin-Rezeptor ausgedrückt durch einen IC₅₀-Wert von nicht mehr als etwa 100 μM hat, wobei null bis alle -C(O)NH-Verknüpfungen des Peptids durch eine Verknüpfung ersetzt worden sind, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einer -CH₂OC(O)NR-Verknüpfung, einer Phosphonat-Verknüpfung, einer CH₂S(O)₂NR-Verknüpfung, einer -CH₂NR-Verknüpfung und einer -C(O)NR⁶-Verknüpfung sowie einer -NHC(O)NH-Verknüpfung, wobei R Wasserstoff oder ein niederer Alkylrest ist und R⁶ ein niederer Alkylrest ist, wobei ferner der N-Terminus des Peptids oder des Peptidmimetikums aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einer NRR¹-Gruppe, einer NRC(O)R-Gruppe, einer -NRC(O)OR-Gruppe, einer -NRS(O)₂R-Gruppe, einer -NHC(O)NHR-Gruppe, einer Succinimid-Gruppe, einer Benzyloxycarbonyl-NH-Gruppe, einer Benzyloxycarbonyl-NH-Gruppe, die 1 bis 3 Substituenten an dem Phenylring hat, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus niederen Alkyl-, niederen Alkoxy-, Chlor- und Brom-Resten, wobei R und R¹ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus Wasserstoff und niederen Alkylresten, und wobei noch ferner der C-Terminus des Peptids oder des Peptidmimetikums die Formel -C(O)R² hat, wobei R² aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Hydroxy-, niederen Alkoxy-Resten, sowie -NR³R⁴, wobei R³ und R⁴ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus Wasserstoff und niederen Alkylresten und wobei es sich bei den Stickstoffatomen der NR³R⁴-Gruppe wahlweise um die Aminogruppe des N-Terminus des Peptids handeln kann, um so ein zyklisches Peptid zu bilden, sowie physiologisch verträgliche Salze davon.

In einer verwandten Ausführungsform ist die Erfindung auf ein markiertes Peptid oder ein Peptidmimetikum gerichtet, umfassend ein Peptid oder Peptidmimetikum wie vorstehend beschrieben, welches daran kovalent gebunden einen Marker aufweist, der nachgewiesen werden kann.
Besonders bevorzugte Peptide umfassen:
Die hierin beschriebenen Verbindungen sind nützlich für die Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten, die durch TPO vermittelt werden, und speziell zur Behandlung von hämatologischen Funktionsstörungen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Thrombocytopenie, die in Folge von Chemotherapie, Bestrahlungstherapie oder Knochenmarktransfusionen auftritt. Daher ist die vorliegende Erfindung nützlich für eine Behandlung, wobei ein Patient, der eine Funktionsstörung aufweist, die einer Behandlung mit einem TPO-Agonisten zugänglich ist, eine therapeutisch wirksame Dosis oder Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung erhält oder diese ihm verabreicht wird.
Die Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, umfassend eine oder mehrere der hierin beschriebenen Verbindungen und einen physiologisch verträglichen Träger. Diese Arzneimittel können in einer Vielzahl von Formen vorliegen, einschließlich oraler Dosierungsformen ebenso wie als inhalierbare Pulver und Lösungen und als injizierbare und infundierbare Lösungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1A–B veranschaulichen Ergebnisse eines Funktions-Assays in Gegenwart von verschiedenen Peptiden; der Assay ist im Beispiel 2 beschrieben.
Die 1A ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse des Proliferations-Assays der mit dem TPO-R transfizierten Ba/F3-Zellen auf ausgewählte Peptide der Erfindung:

markiert die Ergebnisse für GGCADGPTLREWISFCGGK (Biotin);
X markiert die Ergebnisse für GGCADGPTLREWISFCGG;
markiert die Ergebnisse für LAIEGPTLRQWLHGNGRDT;
O markiert die Ergebnisse für GNADGPTLRQWLEGRRPKN; und
+ markiert die Ergebnisse für TIKGPTLRQWLKSREHTS.
1B ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse mit denselben Peptiden und der parentalen Zelllinie.

Die 2A–C zeigen die Ergebnisse der Peptidoligomerisierung mit dem Proliferations-Assay der mit dem TPO-R transfizierten Ba/F3-Zellen. Die 2A zeigt die Ergebnisse des Assays für das komplexierte biotinylierte Peptid (AF 12285 mit Streptavidin (SA)) sowohl für die transfizierte als auch für die parentale Zelllinie.
Die 2B zeigt die Ergebnisse des Assays für das freie biotinylierte Peptid (AF 12285) sowohl für die transfizierte als auch für die parentale Zelllinie. Die 2C zeigt die Ergebnisse des Assays für Streptavidin alleine sowohl für die transfizierte als auch für die parentale Zelllinie.
Die 3A–G zeigen die Ergebnisse einer Serie von Kontrollexperimenten welche die Aktivität von TPO, den Peptiden der vorliegenden Erfindung, von EPO und EPO-R bindenden Peptiden in einem Zellproliferations-Assay zeigen, wobei entweder die mit dem TPO-R transfizierte Ba/F3-Zelllinie und deren korrespondierende parentale Linie oder eine EPO-abhängige Zelllinie eingesetzt wurden. Die 3A stellt die Ergebnisse für TPO in dem Zellproliferations-Assay mit der mit dem TPO-R transfizierten Ba/F3-Zelllinie und deren korrespondierenden parentalen Linie dar. Die 3B stellt die Ergebnisse für EPO in dem Zellproliferations-Assay mit der mit dem TPO-R transfizierten Ba/F3-Zelllinie und deren korrespondierenden parentalen Linie dar. Die 3C stellt die Ergebnisse für das komplexierte biotinylierte Peptid (AF 12285 mit Streptavidin (SA)) und einer komplexierten Form eines biotinylierten EPO-R bindenden Peptids (AF 11505 mit SA) in der mit dem TPO-R transfizierten Ba/F3-Zelllinie dar. Die Ergebnisse für die korrespondierende parentale Zelllinie sind in der 3D gezeigt. Die 3E zeigt die Ergebnisse für TPO in dem Zellproliferations-Assay mit der EPO-abhängigen Zelllinie. Die 3F stellt die Ergebnisse für das komplexierte biotinylierte Peptid (AF 12885 mit Streptavidin (SA)) und der komplexierten Form eines biotinylierten EPO-R bindenden Peptids (AF 11505 mit SA) in der EPO-abhängigen Zelllinie dar.
Die 4A–C veranschaulichen die Konstruktion der Peptide auf Plasmiden – Bänke im Vektor pJS142. 4A zeigt eine Restriktionskarte und die Position der Gene. Das Genbank-Plasmid umfasst den transkriptionellen Terminator rrnB, das bIa-Gen um eine Selektion auf Ampicillin zu ermöglichen, die intragene Region des Phagen M13 (M13IG) um die Gewinnung einzelsträngiger DNA zu ermöglichen, einen Plasmid-Replikationsursprung (ori), zwei IacO₅-Sequenzen und das araC-Gen um eine positive und eine negative Regulation des araB-Promotors zu ermöglichen, der die Expression des lac-Fusionsgens steuert. 4B zeigt die Sequenz der Clonierungsregion am 3'- Ende des lacI-Gens, einschließlich der SfiI- und EagI-Stellen, welche während der Konstruktion der Genbank benutzt wurden. 4C zeigt die Ligierung der aneinander gelagerten Genbank-Oligonucleotide, ON-829 und ON-830, in die SfiI-Stellen von pJS142 um eine Bank zu erzeugen. Einzelne Leerzeichen in der Sequenz geben die Ligierungsstellen an.
Die 5A–B veranschaulichen die Clonierung in die Vektoren pELM3 und pELM15 MBP. 5A zeigt die Sequenz am 3'-Ende des maIE-Fusionsgens, einschließlich der codierenden Sequenz für MBP, des Polyasparagin-Linkers, der Faktor Xa-Protease-Spaltstelle und der verfügbaren Clonierungsstellen. Die übrigen Teile der Vektoren sind von pMALc2 (pELM3) und pMALp2 (pELM15) abgeleitet, die von New England Biolabs erhältlich sind. 5B zeigt die Sequenz der Vektoren nach dem Transfer des BspEII-ScaI-Fragments der Genbank in die mit AgeI-ScaI verdauten pELM3/pELM15. Die transferierte Sequenz schließt die Sequenz ein, die das GGG-Linkerpeptid aus der pJS142-Bank codiert.
Die 6A stellt eine Restriktionskarte und die Position der Gene für die Konstruktion der Genbank des Kopfteil "headpiece"-Dimers im Vektor pCMG14 dar. Das Plasmid der Genbank umfasst: den transkriptionellen Terminator rrnB, das bIa-Gen um eine Selektion auf Ampicillin zu ermöglichen, die intragene Region des Phagen M13 (M13 IG) um die Gewinnung einzelsträngiger DNA zu ermöglichen, einen Plasmid-Replikationsursprung (ori), eine IacO₅-Sequenz und das araC-Gen um eine positive und eine negative Regulation des araB-Promotors zu ermöglichen, der die Expression des Kopfteil-Dimer-Fusionsgens steuert. Die 6B stellt die Sequenz der Clonierungsregion am 3'-Ende des Kopfteil-Dimer-Gens dar, einschließlich der SfiI- und EagI-Stellen, die im Verlauf der Konstruktion der Genbank verwendet wurden. Die 6C zeigt die Ligierung der aneinander angelagerten ON-1679, ON-829 und ON-830 an die SfiI-Stellen von pCMG14 um eine Genbank zu erzeugen. Einzelne Leerzeichen in der Sequenz geben die Ligierungsstellen an.
Die 7 bis 9 zeigen die Ergebnisse weiterer Assays, mit denen die Aktivität der Peptide und Peptidmimetika der Erfindung beurteilt wurde. In diesem Assay werden Mäuse mit Carboplatin thrombocytopenisch gemacht. 7 stellt typische Ergebnisse dar, wenn man BALB/c-Mäuse am Tag 0 mit Carboplatin (125 mg/kg intraperitoneal) behandelt. Die gestrichelten Linien stellen unbehandelte Tiere aus drei Experimenten dar. Die durchgezogene Linie repräsentiert mit Carboplatin behandelte Gruppen in drei Experimenten. Die dicken durchgezogenen Linien stellen historische Daten dar. 8 stellt die Wirkung der Titration von Carboplatin auf die Zahlen der Blutplättchen in Mäusen dar, die mit den angegebenen Mengen von Carboplatin behandelt worden sind (in mg/kg, intraperitoneal (ip) am Tag 0). 9 zeigt eine Verbesserung der Carboplatin-induzierten Thrombocytopenie am Tag 10 durch das Peptid AF 12513 (513). Carboplatin (CBP; 50–125 mg/kg, intraperitoneal) wurde am Tag 0 verabreicht. AF 12513 (1 mg/kg, ip) wurde an den Tagen 1–9 gegeben.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. BEGRIFFSKLÄRUNGEN UND ALLGEMEINE PARAMETER
Die folgenden Begriffsklärungen werden aufgeführt, um die Bedeutung und den Geltungsbereich der verschiedenen Begriffe zu erläutern und zu definieren, die verwendet werden um die Erfindung hierin zu beschreiben.
„Agonist" bezieht sich auf einen biologisch aktiven Liganden, der an seinen komplementären biologisch aktiven Rezeptor bindet und diesen aktiviert, entweder um eine biologische Reaktion in dem Rezeptor auszulösen oder um eine bereits vorliegende biologische Aktivität des Rezeptors zu verstärken.
„Pharmazeutisch verträgliche Salze" beziehen sich auf nicht-toxische Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze, die üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie eingesetzt werden, wozu die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium- Barium-, Ammonium- und Protamin-Zinksalze gehören, welche mit Hilfe von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Der Begriff umfasst auch nicht-toxische Säureadditions-Salze, die im Allgemeinen dadurch hergestellt werden, dass man die Verbindungen dieser Erfindung mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure reagieren lässt. Repräsentative Salze umfassen Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Eisulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Borat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Malest, Fumarat, Succinat, Tartrat, Napsylat und dergleichen.
„Pharmazeutisch verträgliche Säureadditions-Salz" bezieht sich auf solche Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen behalten und die nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht sind, die mit anorganischen Säuren wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dergleichen gebildet werden, und organische Säuren wie z. B. Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Brenztraubensäure, Oxasäure, Apfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und dergleichen. Für eine Beschreibung pharmazeutisch verträglicher Säureadditions-Salze als Arzneimittelvorstufen siehe Bundgaard, H., vorstehend).
„Pharmazeutisch verträglicher Ester" bezieht sich auf solche Ester, die auf die Hydrolyse der Esterbindung hin die biologische Wirksamkeit und die Eigenschaften der Carboxylsäure oder des Alkohols beibehalten und die nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht sind. Für eine Beschreibung pharmazeutisch verträglicher Ester als Arzneimittelvorstufen siehe Bundgaard, H., Hrsg., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Diese Ester werden üblicherweise aus der korrespondierenden Carbonsäure und einem Alkohol gebildet. Im Allgemeinen kann die Esterbildung über herkömmliche synthetische Methoden bewerkstelligt werden. (Siehe z. B. March, Advanced Organic Chemistry, 3. Ausg., John Wiley & Sons, New York (1985), S. 1157 und darin zitierte Referenzen, sowie Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). Der Alkohol-Bestandteil des Esters enthält im Allgemeinen (i) einen aliphatischen C₂-C₁₂ Alkohol, der eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten oder nicht enthalten kann und verzweigte Kohlenstoffreste enthalten oder nicht enthalten kann oder (ii) aromatische C₇-C₁₂ Alkohole oder heteroaromatische Alkohole. In dieser Erfindung wird auch die Verwendung solcher Zusammensetzungen in Betracht gezogen, die sowohl Ester sind wie hierin beschrieben und gleichzeitig die pharmazeutisch verträglichen Säureadditions-Salze davon.
„Pharmazeutisch verträgliches Amid" bezieht sich auf solche Amide, die auf die Hydrolyse der Amidbindung hin die biologische Wirksamkeit und die Eigenschaften der Carbonsäure oder des Amins beibehalten und die nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht sind. Für eine Beschreibung pharmazeutisch verträglicher Amide als Arzneimittelvorstufen siehe Bundgaard, H., Hrsg., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Diese Amide werden üblicherweise aus der korrespondierenden Carbonsäure und einem Amin gebildet. Im Allgemeinen kann die Amidbildung über herkömmliche synthetische Methoden bewerkstelligt werden. (Siehe z. B. March, Advanced Organic Chemistry, 3. Ausg., John Wiley & Sons, New York (1985), S. 1152 und Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). In dieser Erfindung wird auch die Verwendung solcher Zusammensetzungen in Betracht gezogen, die sowohl Amide sind wie hierin beschrieben und gleichzeitig die pharmazeutisch verträglichen Säureadditions-Salze davon.
„Pharmazeutisch oder therapeutisch verträglicher Träger" bezieht sich auf ein Trägermedium, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität der aktiven Inhaltsstoffe nicht stört und das für den Wirt oder den Patienten nicht toxisch ist.
„Stereoisomer" bezieht sich auf eine chemische Verbindung, welche dasselbe Molekulargewicht, chemische Zusammensetzung und Struktur aufweist, bei dem aber die Atome unterschiedlich angeordnet sind. Das bedeutet, dass bestimmte identische chemische Untereinheiten sich im Raum in verschiedenen Orientierungen befinden und daher, sofern sie rein sind, die Fähigkeit besitzen, die Ebene von polarisiertem Licht zu drehen. Einige reine Stereoisomere können jedoch eine optische Rotation aufweisen, die so schwach ist, dass sie mit derzeit verfügbaren Geräten nicht nachweisbar ist. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können eines oder mehrere asymmetrische Kohlenstoff-Atome besitzen und daher eine Reihe von Stereoisomeren umfassen. Alle Stereoisomere sind im Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen.
„Therapeutisch oder pharmazeutisch wirksame Menge" wie auf die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung angewandt bezieht sich auf die Menge einer Zusammensetzung, die ausreichend ist, um ein erwünschtes biologisches Ergebnis zu induzieren. Das Ergebnis kann in einer Linderung der Anzeichen, der Symptome oder der Ursachen einer Krankheit bestehen oder in jeder beliebigen sonstigen erwünschten Veränderung eines biologischen Systems. In der vorliegenden Erfindung wird das Ergebnis üblicherweise eine Abnahme der immunologischen und/oder inflammatorischen Reaktionen auf eine Infektion oder eine Gewebever letzung mit sich bringen.
Aminosäurereste in Peptiden werden wie folgt abgekürzt: Phenylalanin ist Phe oder F; Leucin ist Leu oder L; Isoleucin ist IIe oder I; Methionin ist Met oder M; Valin ist Val oder V; Serin ist Ser oder S; Prolin ist Pro oder P; Thrreonin ist Thr oder T; Alanin ist Ala oder A; Tyrosin ist Tyr oder Y; Histidine ist His oder H; Glutamin ist Gin oder Q; Asparagin ist Asn oder N; Lysin ist Lys oder K; Asparaginsäure ist Asp oder D; Glutaminsäure ist Glu oder E; Cystein ist Cys oder C; Tryptophan ist Trp oder W; Arginin ist Arg oder R; und Glycin ist Gly oder G. Außerdem ist Bu Butoxy, Bzl ist Benzyl, CHA ist Cyclohexylamin, Ac ist Acetyl, Me ist Methyl, Pen ist Penicillamin, Aib ist Aminoisobuttersäure, Nva ist Norvalin, Abu ist Aminobuttersäure, Thi ist Thienylalanin, OBn ist O-Benzyl und hyp ist Hydroxyprolin.
Zusätzlich zu den Peptiden, die nur aus natürlich vorkommenden Aminosäuren bestehen, werden auch Peptidmimetika oder Peptidanaloga bereitgestellt. Peptidanaloga werden in der pharmazeutischen Industrie gewöhnlich als nicht-peptidische Arzneimittel eingesetzt, die Eigenschaften aufweisen, die denen des Ausgangspeptids analog sind. Diese Arten von nicht-peptidischen Verbindungen nennt man „Peptidmimetika" oder „Peptidomimetika" (Fauchere, J., Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber und Freidinger, TINS, S. 392 (1985); und Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)). Peptidmimetika, die therapeutisch nützlichen Peptiden strukturell ähnlich sind können dazu verwendet werden, eine gleichwertige oder verstärkte therapeutische oder prophylaktische Wirkung zu erzeugen. Im Allgemeinen sind Peptidmimetika einem Modell-Polypeptid strukturell ähnlich (d. h. einem Polypeptid, das eine biologische oder pharmakologische Aktivität besitzt), wie z. B. ein natürlich vorkommendes Rezeptor bindendes Polypeptid, weisen aber eine oder mehrere Peptidbindungen auf, die wahlweise durch eine Bindung ersetzt sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus: -CH₂NH-, -CH₂S-, CH₂-CH₂-, CH=CH- (cis und trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und CH₂SO-, mit Hilfe von Methoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und die in den folgenden Referenzen beschrieben sind: Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, Hrsg., Marcel Dekker, New York, S. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (März 1983), Bd. 1, Heft 3, Peptide Backbone Modifications (allgemeiner Übersichtsartikel); Morley, Trends Pharm. Sci. (1980), S. 463–468 (allgemeiner Übersichtsartikel); Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177–185 (1979) (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola et al., Life Sci 38: 1243–1249 (1986) (-CH₂-S); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307–314 (1982) (-CH-CH-, cis und trans); Almquist et al., J. Med. Chem. 23: 1392–1398 (1980) (-COCH₂-); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett. 23: 2533 (1982) (-COCH₂-); Szelke et al., Europ. Anmeld. EP 45665 CA (1982): 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH₂-); Holladay et al., Tetrahedron Lett. 24: 4401–4404 (1983) (-C(OH)CH₂-) sowie Hruby, Life Sci 31: 189–199 (1982) (CH₂-S-). Eine besonders bevorzugte nicht-peptidische Verknüpfung ist -CH₂NH- Solche Peptidmimetika können erhebliche Vorteile gegenüber Polypeptid-Ausführungsformen aufweisen, einschließlich zum Beispiel: wirtschaftlichere Herstellung, höhere chemische Stabilität, verbesserte pharmakologische Eigenschaften (Halbwertszeit, Absorption, Stärke, Wirksamkeit etc.), veränderte Spezifität (z. B. ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten), verminderte Antigenität und andere. Das Markieren von Peptidmimetika beinhaltet üblicherweise eine kovalente Anlagerung von einem oder mehreren Markern, direkt oder über einen Spacer (z. B. eine Amidgruppe) an (einer) nicht störenden Position(en) auf dem Peptidmimetikum, die anhand von quantitativen Struktur-Aktivitäts-Daten und/oder molekularem Modelling vorhergesagt werden. Bei solchen nicht störenden Positionen handelt es sich im Allgemeinen um Positionen, die keine direkten Kontakte mit dem (den) Makromolekül(en) (z. B. Molekülen der Immunoglobulin-Überfamilie) bilden, an das (die) das Peptidmimetikum bindet, um die therapeutische Wirkung zu erzeugen. Eine Derivatisierung (z. B. eine Markierung) von Peptidmimetika sollte die erwünschte biologische oder pharmakologische Aktivität des Peptidmimetikums nicht wesentlich stören. Im Allgemeinen binden Peptidmimetika von Rezeptor bindenden Peptiden mit hoher Affinität an den Rezeptor und besitzen nachweisbare biologische Aktivität (d. h. sie sind agonistisch oder antagonistisch zu einer oder zu mehreren Rezeptorvermittelten phänotypischen Veränderungen).
Eine systematische Substitution von einer oder von mehreren Aminosäuren einer Konsensus-Sequenz mit einer D-Aminosäure desselben Typs (z. B. D-Lysin anstelle von L-Lysin) kann dazu verwendet werden um stabilere Peptide zu erzeugen. Außerdem können mit auf dem Fachgebiet bekannten Methoden (Rizo und Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)) beschränkte Peptide erzeugt werden, die eine Konsensus-Sequenz oder eine im Wesentlichen identische Variation einer Konsensus-Sequenz umfassen, zum Beispiel indem man interne Cysteinreste hinzufügt, die in der Lage sind, intramolekulare Disulfidbrücken auszubilden, welche das Peptid zyklisieren.
Synthetische oder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren beziehen sich auf Aminosäuren, die in vivo nicht natürlich vorkommen, aber die nichtsdestotrotz in die hierin beschriebenen Peptidstrukturen eingebaut werden können. Bevorzugte synthetische Aminosäuren sind die D-α-Aminosäuren natürlich vorkommender L-α-Aminosäuren, welche durch die Formel H₂NCHR⁵COOH dargestellt werden, wobei R⁵ 1) eine niedere Alkylgruppe ist, 2) eine Cycloalkylgruppe von 3 bis 7 Kohlenstoffatomen ist, 3) ein Heterozyklus aus 3 bis 7 Kohlenstoffatomen und 1 bis 2 Heteroatomen ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, 4) ein aromatischer Rest aus 6 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die gegebenenfalls 1 bis 3 Substituenten an dem aromatischen Kern aufweisen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, niederes Alkoxy, Amino und Carboxyl, 5) ein -Alkylen-Y ist, wobei Alkylen eine Alkylengruppe aus 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist und Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) Hydroxy, (b) Amino, (c) Cycloalkyl und Cycloalkenyl aus 3 bis 7 Kohlenstoffatomen, (d) Aryl aus 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls 1 bis 3 Substituenten an dem aromatischen Kern aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, niederes Alkoxy, Amino und Carboxyl, (e) Heterozyklus aus 3 bis 7 Kohlenstoffatomen und 1 bis 2 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, (f) -C(O)R², wobei R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, niederes Alkyl, niederes Alkoxy sowie -NR³R⁴, wobei R³ und R⁴ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und niederem Alkyl, (g) -S(O)_nR⁶, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 2 ist und R⁶ ein niederes Alkyl ist, mit der Maßgabe, dass R⁵ keine Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure definiert.
Andere bevorzugte synthetische Aminosäuren umfassen Aminosäuren, bei denen die Aminogruppe von der Carboxylgruppe durch mehr als ein Kohlenstoffatom getrennt ist wie β-Alanin, γ-Aminobuttersäure und ähnliche.
Besonders bevorzugte synthetische Aminosäuren umfassen zum Beispiel die D-Aminosäuren natürlich vorkommender L-Aminosäuren, L-1-Naphtylalanin, 1-2-Naphtylalanin, L-Cyclohexylalanin, L-2-Aminoisobuttersäure, die Sulfoxid- und Sulfon-Derivate von Methionin (d. h. HOOC-(H₂NCH)CH₂CH₂-S(O)_nR⁶), wobei n und R⁶ wie vorstehend definiert sind, ebenso wie das niedere Alkoxyderivat von Methionin (d. h. HOOC-(H₂NCH)CH₂CH₂-OR⁶, wobei R⁶ wie vorstehend definiert ist.
„Nachweisbarer Marker" bezieht sich auf Materialien, die, wenn sie kovalent an die Peptide und Peptidmimetika dieser Erfindung gekoppelt sind, den Nachweis des Peptids und des Peptidmimetikums in dem Patienten ermöglichen, dem das Peptid oder das Peptidmimetikum verabreicht worden ist. Geeignete nachweisbare Marker sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen zum Beispiel Radioisotope, fluoreszierende Marker (z. B. Fluorescein) und dergleichen. Der jeweilige nachweisbare Marker ist nicht entscheidend und wird in Abhängigkeit von der zu verwendenden Menge des Markers ebenso wie der Toxizität des Markers bei der Menge des verwendeten Markers gewählt. Eine Auswahl des Markers in Abhängigkeit von solchen Faktoren ist einem Fachmann ohne weiteres möglich.
Eine kovalente Bindung eines nachweisbaren Markers an das Peptid oder das Peptidmimetikum wird durch herkömmliche Methoden bewerkstelligt, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Wenn das Radioisotop ⁹²⁵I als nachweisbarer Marker eingesetzt wird, kann eine kovalente Bindung von ¹²⁵I an das Peptid oder das Peptidmimetikum zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass die Aminosäure Tyrosin in das Peptid oder das Peptidmimetikum eingebaut wird und dann das Peptid jodiert wird. Falls kein Tyrosin in dem Peptid oder dem Peptidmimetikum vorliegt, kann ein Einbau von Tyrosin am N- oder C-Terminus des Peptids oder des Peptidmimetikums durch wohlbekannte Chemie erreicht werden. Ebenso kann ³²P als eine Phosphatuntereinheit zum Beispiel über eine Hydroxylgruppe auf dem Peptid oder dem Peptidmimetikum in das Peptid oder Peptidmimetikum eingebaut werden, wobei herkömmliche Chemie verwendet wird.
II. ÜBERSICHT
Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen bereit, die an den TPO-R binden und diesen aktivieren oder sich auf andere Weise als TPO-Agonisten verhalten. Diese Verbindungen schließen peptidische „Leit"-Verbindungen und „derivatisierte" Verbindungen ein, die so konstruiert sind, dass sie dieselbe oder eine ähnliche molekulare Struktur oder Form wie die Leit-Verbindungen aufweisen, die sich aber von den Leit-Verbindungen entweder in Bezug auf die Anfälligkeit gegen über Hydrolyse oder Proteolyse unterscheiden und/oder in Bezug auf andere biologische Eigenschaften, wie z. B. eine erhöhte Affinität für den Rezeptor. Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, umfassend eine wirksame Menge eines TPO-Agonisten und insbesondere eine Verbindung, die nützlich ist um hämatologische Funktionsstörungen zu behandeln, und speziell eine Thrombocytopenie, die mit Chemotherapie, Bestrahlungstherapie oder Knochenmarktransfusionen assoziiert ist.
III. IDENTIFIZIERUNG VON TPO-AGONISTEN
Peptide, die eine Bindungsaffinität zu dem TPO-R aufweisen, lassen sich leicht mittels nach dem Zufallsprinzip arbeitenden Systemen zur Erzeugung von Peptiddiversität identifizieren, die mit einem Affinitätsanreichungsprozess gekoppelt sind.
Speziell umfassen nach dem Zufallsprinzip arbeitende Systeme zur Erzeugung von Peptiddiversität das System „Peptide auf Plasmiden", das in den U.S. Patenten Nr. 5,270,170 und 5,338,665 beschrieben ist; das System „Peptide auf Phagen", das in der am 20. Juni 1991 eingereichten U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/718,577 beschrieben ist, die eine Continuation-in-Part-Anmeldung der am 20. Juni 1990 eingereichten U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/541,108 ist, sowie in Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 6378–6382 (1980); das „Polysom-System", das in der am 2. September 1994 eingereichten U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/300,262 beschrieben ist, die eine Continuation-in-Part-Anmeldung ist, die auf der am 29. Oktober 1993 eingereichten U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/144,775 basiert, sowie PCT WO 95/11992 ; das System der „codierten synthetischen Genbank" (ESL), das in der am 12. November 1993 eingereichten U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/146,886 beschrieben ist, die eine Continuation-in-Part-Anmeldung der am 16. September 1992 eingereichten U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/946,239 ist, bei der es sich um eine Continuation-in-Part-Anmeldung der am 18. September 1991 eingereichten U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/762,522 handelt; und das System der „immobilisierten Polymersynthese in sehr großem Maßstab", das im U.S. Patent Nr. 5,143,854 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. 90/15070 , die am 13. Dezember 1990 veröffentlicht worden ist; in der U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/624,120, die am 6. Dezember 1990 eingereicht worden ist; von Fodor et al., Science 251: 767–773 (2/1991); von Dower und Fodor, Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271–280 (1991) und in der U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 805,727, die am 6. Dezember 1991 eingereicht worden ist, beschrieben ist.
Mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Prozeduren wurden Zufallspeptide im Allgemeinen so konstruiert, dass sie eine definierte Zahl von Aminosäureresten lang waren (z. B. 12). Um eine Kollektion von Oligonucleotiden zu erzeugen, welche die Zufallspeptide codieren, wurde das Codon-Motiv (NNK)_x verwendet, wobei N das Nucleotid A, C, G oder T ist (äquimolar; je nach der verwendeten Methodik können andere Nucleotide eingesetzt werden), K G oder T ist (äquimolar), und x eine ganze Zahl ist, die der Zahl der Aminosäuren in dem Peptid entspricht (z. B. 12), um einen beliebigen der 32 möglichen Codons zu bestimmen, die aus dem NNK-Motiv resultieren: 1 für jede von 12 Aminosäuren, 2 für jede von 5 Aminosäuren, 3 für jede von 3 Aminosäuren, und nur eines der drei Stop-Codons. Somit codiert das NNK-Motiv alle Aminosäuren, codiert nur ein Stop-Codon und vermindert die Bevorzugung von Codons.
In den verwendeten Systemen wurden die Zufallspeptide entweder auf der Oberfläche eines Phagenpartikels als Teil eines Fusionsproteins präsentiert, das entweder das pIII- oder das pVIII-Hüllprotein eines Abkömmlings des Phagen fd umfasst (Peptide auf Phagen), oder als ein Fusionsprotein mit dem LacI-Peptid-Fusionsprotein, das an ein Plasmid gebunden ist (Peptide auf Plasmiden).
Der Phage oder die Plasmide, einschließlich der DNA, welche die Peptide codiert, wurden durch einen Affinitätsanreicherungsprozess identifiziert und isoliert, wobei immobilisierter TPO-R eingesetzt wurde. Der Affinitätsanreicherungsprozess, manchmal „Panning" genannt, umfasst mehrere Runden des Inkubierens des Phagen, der Plasmide oder der Polysome mit dem immobilisierten Rezeptor, Auffangen des Phagen, der Plasmide oder der Polysome, die an den Rezeptor binden (zusammen mit der dazu gehörenden DNA oder mRNA), und Herstellen von mehr der aufgefangenen Phagen oder Plasmide (zusammen mit dem dazu gehörenden LacI-Peptid-Fusionsprotein). Üblicherweise wurde die extrazelluläre Domäne (ECD) des TPO-R während des Panning verwendet.
Nach mehreren Runden der Affinitätsanreicherung wurden der Phage oder die Plasmide und dazu gehörende Peptide mittels ELISA untersucht, um festzustellen, ob die Peptide spezifisch an den Rezeptor binden. Dieser Assay wurde auf ähnliche Weise durchgeführt wie die Prozeduren, die bei dem Affinitätsanreicherungsprozess eingesetzt wurden, außer dass die Vertiefungen nach dem Entfernen von ungebundenen Phagen üblicherweise mit Kaninchen-Anti-Phagen-Antikörper behandelt wurden, dann mit alkalischer Phosphatase (AP) – konjugiertem Ziege Anti-Kaninchen-Antikörper. Die Menge an alkalischer Phosphatase in jeder Vertiefung wurde mit Hilfe von Standardmethoden bestimmt. Eine ähnliche ELISA-Prozedur zur Verwendung in dem System „Peptide auf Plasmiden" ist nachstehend im Detail beschrieben.
Indem man die Test-Vertiefungen mit Kontroll-Vertiefungen vergleicht, kann man feststellen, ob die Fusionsproteine spezifisch an den Rezeptor binden. Die Phagen-Pools, von denen man festgestellt hat, dass sie an den TPO-R binden, wurden in einem Colony Lift – Sondenformat durchmustert, wobei ein radioaktiv markierter monovalenter Rezeptor verwendet wurde. Diese Sonde kann mit Hilfe von Proteinkinase A hergestellt werden, um eine Kemptide-Sequenz zu phosphorylieren, die an den C-Terminus des löslichen Rezeptors gebunden ist. Die „gentechnisch hergestellte" Form des Rezeptors wird dann in Wirtszellen exprimiert, üblicherweise in CHO-Zellen. Nach der Ernte der Rezeptoren mittels PI-PLC wird der Rezeptor auf Bindung an TPO- oder TPO-R-spezifische Phagenclone getestet. Der Rezeptor wird dann für den Einsatz als monovalente Sonde mit ³³P auf eine hohe spezifische Aktivität markiert, um mit Hilfe von Colony Lifts Liganden mit hoher Affinität zu identifizieren.
Peptide, von denen man feststellte, dass sie spezifisch an den Rezeptor binden, wurden dann als das freie Peptid synthetisiert (z. B. kein Phage) und in einem Blockierungs-Assay getestet. Der Blockierungs-Assay wurde auf eine ähnliche Weise durchgeführt wie der ELISA, außer dass TPO oder ein Referenz-Peptid vor dem Fusionsprotein zu den Vertiefungen hinzugefügt wurde (es gab zwei Arten von Kontroll-Vertiefungen: (1) kein Rezeptor, und (2) kein TPO oder Referenz-Peptid). Fusionsproteine, bei denen die Bindung an den Rezeptor durch TPO oder das Referenz-Peptid blockiert war, enthalten Peptide in dem Zufallspeptid-Teil, die bevorzugte Verbindungen der Erfindung darstellen.
TPO-R ebenso wie seine extrazelluläre Domäne wurden in rekombinanten Wirtszellen hergestellt. Eine nützliche Form von TPO-R wird konstruiert, indem man das Protein mit Hilfe von Standardmethoden als ein lösliches Protein in mit Baculovirus transformierten Wirtszellen exprimiert; eine andere nützliche Form wird mit einem Signalpeptid für die Proteinsekretion und die Bindung an einen Phospholipid-Membrananker konstruiert. Diese Form der Bindung an einen Anker wird „PIGtailing" genannt. Siehe Caras und Wendell, Science 243: 1196–1198 (1989) und Lin et al., Science 249: 677–679 (1990).
Mit Hilfe des PIG-tailing-Systems kann man den Rezeptor mit Phospholipase C von der Oberfläche der Zellen abspalten, die den Rezeptor exprimieren (z. B. transformierte CHO-Zellen, die mit einem Zellsorter auf hohe Expression des Rezeptors selektiert worden sind). Der abgespaltene Rezeptor umfasst immer noch eine Carboxy-terminale Sequenz von Aminosäuren aus dem Signalprotein für die Membranbindung, welche der „HPAP-Schwanz" genannt wird, und kann ohne weitere Aufreinigung immobilisiert werden. Das rekombinante Rezeptorprotein kann immobilisiert werden, indem man die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit einem Anti-HPAP-Schwanz-Antikörper (Ab 179 oder mAb 179) beschichtet, die nicht-spezifische Bindung mit Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockiert und dann den abgespaltenen Rezeptor an den Antikörper bindet. Mit Hilfe der Prozedur sollte man die Immobilisierungsreaktion mit unterschiedlichen Konzentrationen von Rezeptor durchführen, um die optimale Menge für eine gegebene Präparation zu bestimmen, da verschiedene Präparationen von rekombinantem Protein häufig unterschiedliche Mengen des gewünschten Proteins enthalten. Außerdem sollte man sicherstellen, dass der immobilisierende Antikörper während des Affinitätsanreicherungsprozesses vollständig blockiert ist (mit TPO oder irgendeiner anderen blockierenden Verbindung). Ansonsten kann unblockierter Antikörper während der Affinitätsanreicherungsprozedur unerwünschten Phagen binden. Um dieses Problem zu vermeiden kann man Peptide einsetzen, die an den immobilisierenden Antikörper binden um ungebundene Stellen zu blockieren, die nach der Rezeptorimmobilisierung übrig bleiben, oder man kann den Rezeptor einfach direkt an die Vertiefungen der Mikrotiterplatten immobilisieren, ohne die Hilfe eines immobilisierenden Antikörpers. Siehe U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/947,339, die am 18. September 1992 eingereicht worden ist.
Wenn man Systeme zur Erzeugung von Zufallspeptiden verwendet, die eine multivalente Liganden-Rezeptor-Interaktion ermöglichen, muss man berücksichtigen, dass die Dichte des immobilisierten Rezeptors ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Affinität der Liganden ist, die an den immobilisierten Rezeptor binden können. Bei höheren Rezeptordichten (wenn z. B. jede mit Anti-Rezeptor-Antikörper beschichtete Vertiefung mit 0,25 bis 0,5 mg des Rezeptors behandelt wird) ist es wahrscheinlicher, dass eine multivalente Bindung auftritt als bei niedrigeren Rezeptordichten (wenn z. B. jede mit Anti-Rezeptor-Antikörper beschichtete Vertiefung mit 0, 5 bis 1 ng des Rezeptors behandelt wird). Falls eine multivalente Bindung auftritt, dann ist es wahrscheinlicher, dass man Liganden mit relativ niedriger Affinität isoliert, sofern man nicht hohe Dichten des immobilisierten Rezeptors einsetzt, um Leit-Verbindungen zu identifizieren und geringere Rezeptordichten, um davon abgeleitete Verbindungen mit höherer Affinität zu isolieren.
Um zwischen Peptiden mit höherer Affinität zu unterscheiden, wird häufig eine monovalente Rezeptorsonde eingesetzt. Diese Sonde kann mit Hilfe von Proteinkinase A hergestellt werden, um eine Kemptide-Sequenz zu phosphorylieren, die an den C-Terminus des löslichen Rezeptors gebunden ist. Die „gentechnisch hergestellte" Form des TPO-Rezeptors wird dann in Wirtszellen exprimiert, üblicherweise in CHO-Zellen. Nach der Ernte der Rezeptoren mittels PI-PLC wird der Rezeptor auf Bindung an TPO- oder TPO-R-spezifische Phagenclone getestet. Der Rezeptor wird dann für den Einsatz als monovalente Sonde mit ³³P auf eine hohe spezifische Aktivität markiert, um mit Hilfe von Colony Lifts Liganden mit hoher Affinität zu identifizieren.
Bevorzugte Screeningmethoden um die Identifizierung von Peptiden zu erleichtern, die an den TPO-R binden, beinhalten zuerst das Identifizieren von Leit-Peptiden, die an die extrazelluläre Domäne des Rezeptors binden und dann das Herstellen von anderen Peptiden, welche den Leit-Peptiden ähneln. Speziell kann eine nach dem Zufallsprinzip erstellte Genbank mit einem pIII- oder pVIII-basierten „Peptide auf Phagen"-System durchmustert werden, um einen Phagen zu entdecken, der ein Peptid präsentiert, das an den TPO-R bindet. Die Phagen-DNAs werden sequenziert um die Sequenzen der auf der Oberfläche der Phagen zur Schau gestellten Peptide zu bestimmen.
Clone, die in der Lage sind, spezifisch an den TPO-R zu binden, wurden aus einer nach dem Zufallsprinzip erstellten Genbank von linearen pVIII-10-meren und aus nach dem Zufallsprinzip erstellten Genbanken von cyclischen pVIII-10-meren und 12-meren identifiziert. Die Sequenzen dieser Peptide dienen als Grundlage für die Konstruktion anderer Peptidbanken, die so konstruiert sind, dass sie eine hohe Häufigkeit von Derivaten der zuerst identifizierten Peptide enthalten. Diese Genbanken können so synthetisiert werden, dass sie die Produktion von Peptiden begünstigen, die sich von dem bindenden Peptid nur in einigen wenigen Resten unterscheiden. Dieser Ansatz beinhaltet die Synthese eines Oligonucleotids mit der codierenden Sequenz des bindenden Peptids, außer dass man, statt reine Präparationen von jedem der vier Nucleosidtriphosphate in der Synthese einzusetzen, Gemische der vier Nucleosidtriphosphate verwendet (d. h. 55% des „korrekten" Nucleotids und jeweils 15% der drei anderen Nucleotide ist ein bevorzugtes Gemisch für diesen Zweck, und 70% des „korrekten" Nucleotids und jeweils 10% der drei anderen Nucleotide ist ein anderes bevorzugtes Gemisch für diesen Zweck), um so Derivate der codierenden Sequenz des bindenden Peptids zu erzeugen.
Es wurde eine Vielzahl von Strategien eingesetzt, um die Leit-Peptide zu derivatisieren, indem man Genbanken durch „Mutagenese eines Grundthemas" herstellte. Diese umfassten eine pVIII-Phagemid-Mutagenese-Genbank, basierend auf der Konsensus-Sequenz, die mit einer Häufigkeit von 70:10:10:10 mutagenisiert und an jedem Ende mit nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Resten erweitert worden war, um Clone zu erzeugen, welche die Sequenz XXXX (C, S, P oder R) TLREWL XXXXXX (C oder S) codieren. Eine ähnliche erweiterte/mutagenisierte Genbank wurde mit Hilfe des Systems „Peptide auf Plasmiden" konstruiert, um Clone zu erzeugen, welche die Sequenz XXXXX (C, S, P oder R) TLREWL XXXXXXX (C oder S) codieren. Eine zusätzliche erweiterte/mutagenisierte Genbank, XXXX (C, S, P oder R) TLREWL XXXXXX (C oder S) wurde mit Hilfe des Polysom-Display-Systems konstruiert. Alle drei Genbanken wurden mit einer Peptidelution durchmustert und mit einem radioaktiv markierten monovalenten Rezeptor als Sonde getestet.
Die „Peptide auf Plasmiden" – Methode wurde auch für Peptid-Screening- und Mutagenese-Studien verwendet und ist im U.S. Patent Nr. 5,338,665 genauer beschrieben. Gemäß diesem Ansatz werden nach dem Zufallsprinzip gewonnene Peptide mittels Expression von einem Plasmidvektor, der das Fusionsgen trägt, an den C-Terminus von LacI fusioniert. Die Verknüpfung der LacI-Peptidfusion mit ihrer sie codierenden DNA geschieht über die IacO-Sequenzen auf dem Plasmid, welche einen stabilen Peptid-LacI-Plasmid-Komplex ausbilden, der mittels Affinitätsreinigung (Panning) auf einem immobilisierten Rezeptor durchmustert werden kann. Die auf diese Weise isolierten Plasmide können dann mittels Elektroporation zurück in E. coli eingeführt werden, um die ausgewählte Population für weitere Screeningrunden oder für die Untersuchung einzelner Clone zu amplifizieren.
Außerdem wurden Screening- und Mutagenese-Studien mit nach dem Zufallsprinzip gewonnenen Peptiden durchgeführt, wobei eine modifiziertes C-terminales Lac-I Display-System verwendet wurde, bei dem die Valenz des Displays reduziert war („Kopfteil-Dimer"-Display-System). Die Genbanken wurden durchmustert und die so erhaltenen DNA-Insertionen wurden als ein Pool in einen Maltose-Bindungsprotein (MBP) – Vektor cloniert, was deren Expression als C-terminale Fusionsproteine ermöglichte. Rohe Zelllysate aus den nach dem Zufallsprinzip gepickten einzelnen MBP-Fusions-Clonen wurden dann wie vorstehend diskutiert in einem ELISA-Format auf TPO-R-Bindung getestet.
Es wurden auch Peptid-Mutagenese-Studien mit dem Polysom-Display-System durchgeführt, wie in der gleichzeitig anhängigen, am 2. September 1994 eingereichten, U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/300,262, bei der es sich um eine Continuation-in-Part-Anmeldung handelt, die auf der am 29. Oktober 1993 eingereichten U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/144,775 basiert, und in PCT WO 95/11992 beschrieben. Es wurde eine Mutagenese-Bank konstruiert, basierend auf der Sequenz XXXX (C, P, R oder S) tIrefIXXXXXX (C oder S), in welcher X ein zufälliges NNK-Codon repräsentiert, und die Kleinbuchstaben Aminosäurecodons repräsentieren, die eine 70:10:10:10 – Mutagenese an den Positionen 1 und 2 enthalten und K (G oder T) an Position 3 des Codons. Die Genbank wurde für 5 Runden durch „Panning" gegen den TPO-Rezeptor selektiert, der auf magnetischen Kügelchen immobilisiert worden war. Nach der fünften Runde wurde der PCR-amplifizierte Pool in pAFF6 cloniert und die ELISA-positiven Clone wurden sequenziert. Die Sequenzen wurden in einen MBP-Vektor subcloniert und ihre Bindungsaffinitäten wurden mit Hilfe eines MBP-ELISA bestimmt.
Um den TPO-R für das Polysom-Screening zu immobilisieren, wurde Ab 179 zuerst wie vom Hersteller beschrieben chemisch an Tosyl-aktivierte magnetische Kügelchen konjugiert (erhältlich von Dynal Corporation). Die Kügelchen wurden in 0,5 M Boratpuffer (pH 9,5) über Nacht bei Raumtemperatur mit Antikörper inkubiert. Die Kügelchen wurden gewaschen und mit TPO-R kombiniert, der den „HPAP"-Schwanz enthielt. Die mit Antikörper beschichteten Kügelchen und Rezeptor wurden für 1 Stunde bei 4°C inkubiert, und die Kügelchen wurden nochmals gewaschen bevor man die Polysom-Bank dazugab.
Das Screening der verschiedenen vorstehend beschriebenen Genbanken ergab die Thrombopoetin-Rezeptor bindenden Peptide, die in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 gezeigt sind ebenso wie andere, die hierin nicht aufgeführt sind. TABELLE 1

TABELLE 2
IC₅₀-Werte für einige zusätzliche repräsentative Peptide sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. Eine Vielzahl von Methoden kann dazu verwendet werden, IC₅₀-Werte zu bestimmen. Zum Beispiel wurde ein Äquilibriumbindungs-ELISA-Assay mit entweder MBP-TPO oder dem LacI-Peptid-Tracer eingesetzt, um zu bestimmen, ob die Peptide die Bindung von TPO an die extrazelluläre Domäne des TPO-Rezeptors hemmen. Üblicherweise wurden die IC₅₀-Werte mit dem freien Peptid bestimmt. Der IC₅₀-Wert kann typischerweise mit dem freien Peptid bestimmt werden, das gegebenenfalls C-terminal amidiert sein kann, oder als ein Ester oder ein anderes Carboxyamid zubereitet sein kann.
Um die genaue Sequenz wiederherzustellen, die auf dem Phagen zur Schau gestellt wird, gehen den N-terminalen und C-terminalen Aminosäuren häufig ein oder zwei Glycinreste voran. Man nimmt nicht an, dass diese Glycine für Bindung oder Aktivität notwendig sind. Ebenso geht, um die genaue Sequenz der auf den Polysomen zur Schau gestellten Peptide nachzuahmen, den C-terminalen Aminosäuren der synthetischen Peptide häufig die Sequenz MAS voran. Wiederum nimmt man nicht an, dass diese Sequenz für Bindung oder Aktivität notwendig ist.
IC₅₀-Werte sind durch die Symbole „–", „+" und „++" symbolisch angegeben. Um ein Beispiel zu geben sind diejenigen Peptide, die IC₅₀-Werte von mehr als 200 μM zeigten, mit einem „–" angegeben. Denjenigen Peptiden, die IC₅₀-Werte von weniger als oder gleich 200 μM ergaben, wird ein „+" gegeben, während diejenigen, die IC₅₀-Werte von 500 nM oder weniger ergaben, mit einem „++" angegeben sind. Diejenigen Peptide, die IC₅₀-Werte am oder in der Nähe des Cutoff-Punkts für ein bestimmtes Symbol ergaben, sind mit einer Misch-Bezeichnung angegeben, z. B. „+/–". Diejenigen Peptide, für die keine IC₅₀-Werte bestimmt wurden, sind als „N. D." aufgeführt. Der IC₅₀-Wert für Peptide, welche die Struktur: GGCTLREWLHGGFCGG aufweisen, lag bei 500 nM oder weniger. (Beachten Sie, dass den N-terminalen und C-terminalen Aminosäuren zwei Glycine vorangehen um die genaue Sequenz wiederherzustellen, die durch den Phagen entwickelt worden ist. Man nimmt nicht an, dass diese Glycine für Bindung oder Aktivität notwendig sind.) TABELLE 3
Peptide und Peptidmimetika, die einen IC₅₀-Wert von mehr als etwa 100 mM aufweisen, weisen keine ausreichende Bindung auf, um entweder als diagnostische oder therapeutische Ausführungsform dieser Erfindung verwendet zu werden. Für diagnostische Zwecke weisen die Peptide und Peptidmimetika einen IC₅₀-Wert von etwa 2 mM oder weniger auf, und für pharmazeutische Zwecke weisen die Peptide und Peptidmimetika einen IC₅₀-Wert von etwa 100 μM oder weniger auf.
Die Sequenz des bindenden Peptids stellt auch ein Instrument zur Verfügung die minimale Größe einer TPO-R bindenden Verbindung der Erfindung zu bestimmen. Unter Verwendung des Systems der „codierten synthetischen Bank" (ESL) oder des Systems der „Synthese immobilisierter Polymere in großem Maßstab" kann man nicht nur die minimale Größe eines Peptids mit einer solchen Aktivität bestimmen, sondern man kann auch alle der Peptide herstellen, die die Gruppe von Peptiden bilden, die sich von dem bevorzugten Motiv (oder der minimalen Größes dieses Motivs) in einem, zwei oder mehr Resten unterscheiden. Diese Sammlung von Peptiden kann dann auf die Fähigkeit durchmustert werden, an den TPO-Rezeptor zu binden. Diese Synthesesysteme für immobilisierte Polymere oder andere Peptidsynthesemethoden können auch dazu verwendet werden, verkürzte Analoga, Deletionsanaloga, Substitutionsanaloga und Kombinationen davon von allen Peptidverbindungen der Erfindung zu synthetisieren.
Die Peptide und Peptidmimetika der vorliegenden Erfindung wurden auch in einem Thrombopoetin-abhängigen Zellproliferations-Assay beurteilt, wie er genauer im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben ist. Die Zellproliferation wird durch auf dem Fachgebiet bekannte Methoden gemessen, wie z. B. einem MTT-Assay, der mit dem Einbau von [³H]-Thymidin als einem Anzeichen der Zellproliferation korreliert (siehe Mossmann, J. Immunol. Methods 65: 55 (1983)). Die getesteten Peptide stimulierten die Proliferation von mit TPO-R transfizierten Ba/F3-Zellen wie in 1A gezeigt in einer Dosis-abhängigen Weise. Diese Peptide haben wie in 1B gezeigt auf die parentale Zelllinie keine Wirkung.
Die 7 bis 9 zeigen die Ergebnisse eines weiteren Assays, mit dem die Aktivität der Peptide und Peptidmimetika der Erfindung beurteilt wird. In diesem Assay werden Mäuse mit Carboplatin thrombocytopenisch gemacht. 7 zeigt typische Ergebnisse, wenn BALB/c – Mäuse am Tag 0 mit Carboplatin (125 mg/kg intraperitoneal) behandelt werden. Die gestrichelten Linien stellen unbehandelte Tiere aus drei Experimenten dar. Die durchgezogenen Linien stellen mit Carboplatin behandelte Gruppen in drei Experimenten dar. Die dicken durchgezogenen Linien stellen historische Daten dar. 8 stellt die Wirkung der Carboplatin-Titration auf die Zahl der Blutplättchen in Mäusen dar, die mit den angegebenen Mengen von Carboplatin (in mg/kg, intraperitoneal (ip) am Tag 0) behandelt worden sind. 9 stellt eine Verbesserung der durch Carboplatin induzierten Thrombocytopenie durch das Peptid AF 12513 (513) am Tag 10 dar. Carboplatin (CBP; 50–125 mg/kg, intraperitoneal) wurde am Tag 0 verabreicht. AF 12513 (1 mg/kg, ip) wurde an den Tagen 1–9 gegeben. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Peptide der Erfindung Thrombocytopenie in einem Maus-Modell lindern können.
Außerdem können bestimmte Peptide der vorliegenden Erfindung dimerisiert oder oligomerisiert werden, wodurch die Affinität und/oder Aktivität der Verbindungen erhöht wird. Um den Effekt zu untersuchen, den die Dimerisierung/Oligomerisierung der Peptide auf die Stärke der TPO-Mimetika in Zellproliferations-Assays hat, wurde ein C-terminal biotinyliertes Analogon des Peptids GGCADGPTLREWISFCGG synthetisiert (GGCADGPTLREWISFCGGK (Biotin)). Das Peptid wurde mit Streptavidin in einem molaren Verhältnis von 4:1 in Serum-freiem HEPES-gepuffertem RPMI vorinkubiert. Der Komplex wurde wie vorstehend auf Stimulation der Zellproliferation von mit TPO-R transfizierten Ba/F3-Zellen getestet, nebeneinander mit freiem biotinyliertem Peptid und dem unbiotinylierten parentalen Peptid. Die 2A zeigt die Ergebnisse des Assays für das komplexierte biotinylierte Peptid (AF 12885 mit Streptavidin (SA)) für sowohl die transfizierte als auch die parentale Zelllinie. 2B zeigt die Ergebnisse des Assays für das freie biotinylierte Peptid (AF 12285) für sowohl die transfizierte als auch die parentale Zelllinie. 2C zeigt die Ergebnisse des Assays für Streptavidin alleine für sowohl die transfizierte als auch die parentale Zelllinie. Diese Figuren zeigen anschaulich, dass der vorab gebildete Komplex ungefähr 10 Mal so wirkungsvoll war wie das freie Peptid.
Die Spezifität der Bindung und die Aktivität der Peptide der Erfindung wurde auch untersucht, indem man die Kreuzreaktivität der Peptide für den Erythropoetin-Rezeptor (EPO-R) untersuchte. Beim EPO-R handelt es sich ebenfalls um ein Mitglied der Rezeptor-Familie der Hämatopoetin-Wachstumsfaktoren, wie es TPO-R ist. Die Peptide der Erfindung, ebenso wie TPO, EPO und ein bekanntes EPO bindendes Peptid wurden in einem Zellproliferations-Assay untersucht, wobei eine EPO-abhängige Zelllinie verwendet wurde. In diesem Assay wurde als parentale Zelllinie FDCP-1 verwendet, eine Wachstumsfaktor-abhängige multi-potenzielle primitive hämatopoetische Vorläufer-Zelllinie der Maus (siehe z. B. Dexter et al., J. Exp. Med. 152: 1036–1047 (1981)). Diese Zelllinie kann proliferieren, sich aber nicht differenzieren, wenn sie mit WEHT-3 konditioniertem Medium supplementiert wird (einem Medium, das IL-3 enthält, ATCC-Nr. T1868). Die parentale Zelllinie wird menschlichem EPO-R oder EPO-R der Maus transfiziert, um die Zelllinie FDCP-1-EPO-R zu erhalten. Diese transfizierten Zelllinien können proliferieren, sich aber in Gegenwart des menschlichen EPO-R oder des EPO-R der Maus nicht differenzieren.
Man ließ die Zellen in Gegenwart der notwendigen Wachstumsfaktoren bis zu halb-stationärer Dichte wachsen. Die Zellen werden dann in PBS gewaschen und für 16–24 Stunden in Komplettmedium ohne die Wachstumsfaktoren hungern gelassen. Nach Bestimmen der Lebensfähigkeit der Zellen werden Stammlösungen (in Komplettmedium ohne die Wachstumsfaktoren) hergestellt, um etwa 10⁵ Zellen pro 50 μl zu ergeben. Serielle Verdünnungen der Verbindungen (normalerweise das Peptid in der freien Lösungsphase im Gegensatz zu einem Phagen-gebundenen oder einem anderen gebundenen oder immobilisierten Peptid), die getestet werden sollen, werden in Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen in einem Endvolumen von 50 μl pro Vertiefung hergestellt. Man fügt Zellen (50 μl) zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiert die Zellen für 24–48 Stunden, zu welchem Zeitpunkt die Negativkontrollen sterben oder in den Ruhezustand gehen sollten. Die Zellproliferation wird dann mit Methoden gemessen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie z. B. mit einem MTT-Assay.
Die 3A–G zeigen die Ergebnisse einer Serie von Kontrollexperimenten, die die Aktivität von TPO, den Peptiden der vorliegenden Erfindung, EPO und EPO-R bindenden Peptiden in einem Zellproliferations-Assay zeigen, wobei entweder die mit TPO-R transfizierte Ba/F3-Zelllinie und deren korrespondierende parentale Linie oder eine EPO-abhängige Zelllinie und deren korrespondierende parentale Linie eingesetzt werden. Die 3A zeigt die Ergebnisse für TPO in dem Zellproliferations-Assay mit der mit TPO-R transfizierten Ba/F3-Zelllinie und deren korrespondierender parentalen Linie. 3B zeigt die Ergebnisse für EPO in dem Zellproliferations-Assay mit der mit TPO-R transfizierten Ba/F3-Zelllinie und deren korrespondierender parentalen Linie. 3C zeigt die Ergebnisse für das komplexierte biotinylierte Peptid (AF 12285 mit Streptavidin (SA)) und einer komplexierten Form eines biotinylierten, EPO-R bindenden Peptids (AF 11505 mit SA) in der mit TPO-R transfizierten Ba/F3-Zelllinie. Die Ergebnisse für die korrespondierende parentale Zelllinie sind in der 3D gezeigt. Die 3F zeigt die Ergebnisse für EPO in dem Zellproliferations-Assay mit der EPO-abhängigen Zelllinie. Die 3G zeigt die Ergebnisse für das komplexierte biotinylierte Peptid (AF 12285 mit Streptavidin (SA)) und der komplexierten Form eines biotinylierten, EPO-R bindenden Peptids (AF 11505 mit SA) in der EPO-abhängigen Zelllinie. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Peptide der Erfindung mit einem hohen Maß an Spezifität an den TPO-R binden und diesen aktivieren.
IV. HERSTELLUNG VON PEPTIDEN UND PEPTIDMIMETIKA
A. FESTPHASENSYNTHESE
Die Peptide der Erfindung können unter Verwendung klassischer, auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Festphasen-Standardverfahren. Die Standardmethoden umfassen ausschließliche Festphasen-Synthese, partielle Festphasen-Syntheseverfahren, Fragmentkondensation, die klassische Synthese in Lösung, und sogar mittels rekombinanter DNA-Technologie. Siehe z. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963). Auf einer Festphase wird die Synthese normalerweise von dem C-terminalen Ende des Peptids gestartet, wobei man ein Harz verwendet, das an der Alpha-Amino-Position geschützt ist. Ein geeignetes Startmaterial lässt sich beispielsweise herstellen, indem man die erforderliche Alpha-Aminosäure an ein chloromethyliertes Harz, ein Hydroxymethyl-Harz oder ein Benzhydrylamin-Harz koppelt. Ein solches chloromethyliertes Harz wird von Bio Rad Laborstories, Richmaond, CA unter dem Handelsnamen BIO-BEADS SX-1 vertrieben und die Herstellung des Hydroxymethyl-Harzes ist von Bodanszky et al., Chem. Ind. (London) 38: 1597 (1966) beschrieben. Das Benzhydrylamin (BHA) – Harz ist von Pietta und Marshall, Chem. Commn. 650 (1970) beschrieben worden und ist von Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA in der Hydrochloridform im Handel erhältlich.
Demnach können die Verbindungen der Erfindung hergestellt werden, indem man eine Alpha-Amino-geschützte Aminosäure mit Hilfe von zum Beispiel einem Cäsiumbicarbonat-Katalysator nach der von Gisin, Helv. Chim. Acta 56: 1467 (1973) beschriebenen Methode an das chloromethylierte Harz koppelt. Nach der anfänglichen Kopplung wird die Alpha-Amino-Schutzgruppe durch eine Auswahl von Reagenzien entfernt, wozu Lösungen von Trifluoressigsäure (TFA) oder Salzsäure (HCl) in organischen Lösungsmitteln bei Raumtemperatur gehören.
Bei den Alpha-Amino-Schutzgruppen handelt es sich um solche, die auf dem Fachgebiet der schrittweisen Peptidsynthese als nützlich bekannt sind. Dazu gehören Schutzgruppen vom Acyl-Typ (z. B. Formyl-, Trifluoracetyl-, Acetyl-), Schutzgruppen vom Typ der aromatischen Urethane (z. B. Benzyloxycarboyl- (Cbz) und substituiertes Cbz), aliphatische Urethan-Schutzgruppen (z. B. t-Butyloxycarbonyl(Boc), Isopropyloxycarbonyl-, Cyclohexyloxycarbonyl) sowie Schutzgruppen vom Alkyl-Typ (z. B. Benzyl-, Triphenylmethyl-). Boc und Fmoc sind bevorzugte Schutzgruppen. Diese Seitenketten-Schutzgruppe bleibt während der Kopplung intakt und wird nicht während der Entfernung der Schutzgruppe am Amino-Terminus oder während der Kopplung abgespalten. Die Seitenketten-Schutzgruppe muss nach dem Abschluss der Synthese des finalen Peptids entfernbar sein, und unter Reaktionsbedingungen, welche das Zielpeptid nicht verändern.
Die Seitenketten-Schutzgruppen für Tyr umfassen Tetrahydropyranyl-, tert-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, Cbz, Z-Br-Cbz und 2,5-Dichlorbenzyl-. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Asp umfassen Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl-, Methyl-, Ethyl- und Cyclohexyl-. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Thr und Ser umfassen Acetyl-, Benzoyl-, Trityl-, Tetrahydropyranyl-, Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl- und Cbz. Die Seitenketten-Schutzgruppe für Thr und Ser ist Benzyl-. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Arg umfassen Nitro-, Tosyl-(Tos), Cbz, Adamantyloxycarbonyl-, Mesitoylsulfonyl- (Mts) oder Boc-. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Lys umfassen Cbz, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl- (2-Cl-Cbz), 2-Brombenzyloxycarbonyl-(2-BrCbz), Tos oder Boc.
Nach dem Entfernen der Alpha-Amino-Schutzgruppe werden die übrigen geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt. Im Allgemeinen wird ein Oberschuss von jeder geschützten Aminosäure mit einem geeigneten Carboxylgruppen-Aktivator wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Lösung, zum Beispiel in Methylenchlorid- (CH₂-Cl₂), Dimethylformamid-(DMF) Gemischen eingesetzt.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vollständig aufgebaut worden ist, wird das gewünschte Peptid durch Behandlung mit einem Reagenz wie z. B. Trifluoressigsäure oder Fluorwasserstoff (HF) von dem Trägerharz entkoppelt, das nicht nur das Peptid von dem Harz abspaltet, sondern auch alle übrigen Seitenketten-Schutzgruppen. Wenn das chlormethylierte Harz verwendet wird, führt eine Behandlung mit Fluorwasserstoff zur Bildung der freien Peptidsäuren. Wenn das Benzhydrylamin-Harz verwendet wird, führt die Behandlung mit Fluorwasserstoff direkt zu dem freien Peptidamid. Wenn das chlormethylierte Harz eingesetzt wird, kann das Seitenketten-geschützte Peptid alternativ durch Behandlung des Peptidharzes mit Ammoniak entkoppelt werden, um das gewünschte Seitenkettengeschützte Amid zu ergeben oder mit einem Alkylamin, um ein Seitenkettengeschütztes Alkylamid oder Dialkylamid zu ergeben. Der Schutz der Seitenketten wird dann auf die übliche Weise mit durch Behandlung mit Fluorwasserstoff entfernt, um die freien Amide, Alkylamide oder Dialkylamide zu ergeben.
Diese Festphasen-Peptidsynthese-Prozeduren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und darüber hinaus in Stewart, Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman und Co., San Francisco, (1969) beschrieben.
Bei Verwendung des Systems der „codierten synthetischen Bank" oder der „Synthese immobilisierter Polymere in sehr großem Maßstab", die in den U. S. Patentanmeldungen mit der Seriennummern 07/492,462, eingereicht am 7. März 1990; 07/624,120, eingereicht am 6. Dezember 1990; sowie 07/805,727, eingereicht am 6. Dezember 1991 beschrieben sind, kann man nicht nur die minimale Größe eines Peptids mit einer solchen Aktivität bestimmen, man kann auch alle Peptide herstellen, die die Gruppe der Peptide bilden, die sich von dem bevorzugten Motiv (oder der minimalen Größe dieses Motivs) in einem, zwei oder mehr Resten unterscheiden. Diese Sammlung von Peptiden kann dann auf die Fähigkeit durchmustert werden, an den TPO-R zu binden. Dieses Synthesesystem für immobilisierte Polymere oder andere Peptidsynthesemethoden können auch dazu verwendet werden, verkürzte und Deletionsanaloga und Kombinationen von verkürzten und Deletionsanaloga von allen Peptidverbindungen der Erfindung zu synthetisieren.
B. SYNTHETISCHE AMINOSÄUREN
Diese Prozeduren können auch dazu verwendet werden, Peptide zu synthetisieren, in denen an einer, zwei oder mehr Positionen von einer beliebigen der Verbindungen der Erfindung andere Aminosäuren substituiert sind als die 20 natürlich vorkommenden genetisch codierten Aminosäuren. Zum Beispiel kann Naphtylalanin für Tryptophan substituiert werden, was die Synthese erleichtert. Andere synthetische Aminosäuren, die in die Peptide der vorliegenden Erfindung substituiert werden können, umfassen L-Hydroxypropyl-, L-3,4-Dihydroxyphenylalanyl-δ-Aminosäuren wie z. B. L-δ-Hydroxylysyl- und D-δ-Methylalanyl-, L-α-Methylalanyl-, β-Aminosäuren und Isochinolyl. D-Aminosäuren und nicht in der Natur vorkommende synthetische Aminosäuren können ebenfalls in die Peptide der vorliegenden Erfindung eingebaut werden.
Man kann die natürlich vorkommenden Seitenketten der 20 genetisch codierten Aminosäuren (oder der D-Aminosäuren) mit anderen Seitenketten ersetzen, zum Beispiel mit Gruppen wie etwa Alkyl-, niederen Alkyl-, zyklischen Alkyl- mit 4, 5, 6 bis 7 Ringatomen, Amid-, niederen Alkylamid-, niederen Alkyldiamid-, niederen Alkoxy-, Hydroxy-, Carboxy-Gruppen und den niederen Esterderivaten davon und mit Heterocyclen mit 4, 5, 6 bis 7 Ringatomen. Es können insbesondere Prolin-Analoga verwendet werden, bei denen die Ringgröße des Prolinrests von 5 Ringatomen auf 4, 6 oder 7 Ringatome geändert ist. Ringförmige Gruppen können gesättigt oder ungesättigt sein, und falls sie ungesättigt sind, können sie aromatisch oder nicht aromatisch sein.
Ringförmige Gruppen können gesättigt oder ungesättigt sein, und falls sie ungesättigt sind, können sie aromatisch oder nicht aromatisch sein. Heterocyclische Gruppen enthalten bevorzugt ein oder mehrere Stickstoff-, Sauerstoff- und/oder Schwefel-Heteroatome. Beispiele für solche Gruppen umfassen die Furazanyl-, Furyl-, Imidazolidinyl-, Imidazolyl-, Imidazolinyl-, Isothiazolyl-, Isoxazolyl-, Morpholinyl- (z. B. Morpholino-), Oxazolyl-, Piperazinyl- (z. B. 1-Piperazinyl-), Piperidyl- (z. B. 1-Piperidyl-, Piperidino-), Pyranyl-, Pyrazinyl-, Pyrazolidinyl-, Pyrazolinyl-, Pyrazolyl-, Pyridazinyl-, Pyridyl-, Pyrimidinyl-, Pyrrolidinyl- (z. B. 1-Pyrrolidinyl-), Pyrrolinyl-, Pyrrolyl-, Thiadiazolyl-, Thiazolyl-, Thienyl-, Thiomorpholinyl- (z. B. Thiomorpholino-) und Triazolyl-Gruppen. Diese heterocyclischen Gruppen können substituiert oder unsubstituiert sein. Sofern eine Gruppe substituiert ist, kann es sich bei dem Substituenten um ein Alkyl, ein Alkoxy, ein Halogen, Sauerstoff oder ein substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl handeln.
Man kann die Peptide der vorliegenden Erfindung auch leicht durch Phosphorylierung modifizieren, und andere Verfahren um Peptidderivate der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu erzeugen sind in Hruby et al.⁴² beschrieben. Demnach dienen die Verbindungen der Erfindung auch als eine Grundlage um Peptidmimetika mit ähnlicher biologischer Aktivität zu erzeugen.
Die Peptidverbindungen der Erfindung, einschließlich der Peptidmimetika, können mit einem oder mit mehreren einer Vielzahl von nicht Protein-haltigen Polymeren kovalent modifiziert werden, z. B. Polyethylenglycol, Polypropylenglycol oder Polyoxyalkenen, auf die Art und Weise, die in U.S. Patent Nr. 4,640,835 , U.S. Patent Nr. 4,496,689 , U.S. Patent Nr. 4,301,144 , U.S. Patent Nr. 4,670,417 , U.S. Patent Nr. 4,791,192 oder U.S. Patent Nr. 4,179,337 dargelegt ist.
C. ENDSTÄNDIGE MODIFIKATIONEN
Fachleute verstehen, dass eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung steht um Peptidmimetika mit derselben oder ähnlichen gewünschten biologischen Aktivität wie die korrespondierende Peptidverbindung zu konstruieren, aber mit einer günstigeren Aktivität als das Peptid in Bezug auf Löslichkeit, Stabilität und Empfindlichkeit gegenüber Hydrolyse und Proteolyse. Siehe zum Beispiel Morgan und Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243–252 (1989). Im Folgenden werden Verfahren zur Herstellung von Peptidmimetika beschrieben, die an der N-terminalen Aminogruppe, der c-terminalen Carboxylgruppe modifiziert sind, und/oder zum Verändern von einer oder von mehreren der Amidbindungen in dem Peptid zu einer Nicht-Amidbindung. Es ist ersichtlich, dass zwei oder mehrere solcher Modifikationen in der Struktur eines Peptidmimetikums gekoppelt werden können (z. B. Modifikation an der C-terminalen Carboxylgruppe und Einschluss einer -CH₂-Carbamat-Verknüpfung zwischen zwei Aminosäuren in dem Peptid).
1. N-TERMINALE MODIFIKATIONEN
Die Peptide werden normalerweise als freie Säure synthetisiert, könnten aber wie vorstehend erwähnt leicht als Amid oder Ester hergestellt werden. Man kann auch den Amino- und/oder Carboxy-Terminus der Peptidverbindungen der Erfindung modifizieren um andere Verbindungen der Erfindung zu erzeugen. Modifikationen am Amino-Terminus umfassen Methylieren (d. h. -NHCH₃ oder -NH(CH₃)₂), Acetylieren, Hinzufügen einer Carbobenzoyl-Gruppe oder Blockieren des Amino-Terminus mit einer beliebigen blockierenden Gruppe, die eine Carboxylat-Funktionalität enthält, die durch RCOO^– definiert ist, wobei R aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Naphtyl-, Acridinyl-, Steroidyl- und ähnlichen Gruppen. Modifikationen am Carboxy-Terminus umfassen den Austausch der freien Säure durch eine Carboxamid-Gruppe oder das Bilden eines zyklischen Lactams am Carboxy-Terminus um strukturelle Spannungen einzuführen.
Modifikationen am Amino-Terminus sind wie vorstehend aufgezählt und umfassen Alkylieren, Acetylieren, Hinzufügen einer Carbobenzoyl-Gruppe, Bilden einer Succinimid-Gruppe etc. Speziell kann dann die N-terminale Aminogruppe wie folgt umgesetzt werden:

(a) um eine Amidgruppe der Formel RC(O)NH- zu bilden, wobei R wie vorstehend definiert ist durch eine Reaktion mit einem Säurehalid [z. B. RC(O)Cl] oder einem Säureanhydrid. Üblicherweise kann die Reaktion durchgeführt werden, indem man etwa äquimolare oder überschüssige Mengen (z. B. etwa 5 Äquivalente) eines Säurehalids in einem inerten Verdünnungsmittel (z. B. Dichlormethan), das vorzugsweise einen Überschuss (z. B. etwa 10 Äquivalente) eines tertiären Amins wie z. B. Diisopropylethylamin enthält, mit dem Peptid in Kontakt bringt, um die Säure, die während der Reaktion erzeugt wird, abzufangen. Die Reaktionsbedingungen sind ansonsten herkömmlich (z. B. Raumtemperatur für 30 Minuten). Die Alkylierung der terminalen Aminogruppe um eine N-Substitution mit einem niederen Alkyl zu gewährleisten, gefolgt von einer Reaktion mit einem Säurehalid wie vorstehend beschrieben wird für eine N-Alkylamid-Gruppe der Formel RC(O)NR- sorgen;
(b) um eine Succinimid-Gruppe durch eine Reaktion mit Succinanhydrid zu bilden. Wie zuvor kann eine ungefähr äquimolare Menge oder ein Überschuss von Succinanhydrid (z. B. etwa 5 Äquivalente) eingesetzt werden, um die Aminogruppe durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Methoden in das Succinimid umzuwandeln, was die Verwendung eines Überschusses (z. B. zehn Äquivalente) eines tertiären Amins wie z. B. Diisopropylethylamin in einem geeigneten inerten Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) einschließt. Siehe zum Beispiel Wollenberg et al., U.S. Patent Nr. 4,612,132 . Es ist ersichtlich, dass die Succin-Gruppe substituiert werden kann, zum Beispiel mit C₂-C₆ Alkyl- oder -SR-Substituenten, die auf herkömmliche Weise erzeugt werden, um für ein substituiertes Succinimid am N-Terminus des Peptids zu sorgen. Solche Alkyl-Substituenten werden durch Reaktion eines niederen Olefins (C₂-C₆) mit Maleinanhydrid erzeugt, auf die Weise, die von Wollenberg et al., vorstehend, beschrieben worden ist, und -SR-Substituenten werden durch Reaktion von RSH mit Maleinanhydrid erzeugt, wobei R wie vorstehend definiert ist;
(c) um eine Benzyloxycarbonyl-NH- oder eine substituierte Benzyloxycarbonyl-NH-Gruppe durch Reaktion mit einer ungefähr äquivalenten Menge oder mit einem Überschuss von Cbz-Cl (d. h. Benzyloxycarbonylchlorid) oder einem substituierten Cbz-Cl in einem geeigneten inerten Verdünnungsmittel (z. B. Dichlormethan) zu bilden, das vorzugsweise ein tertiäres Amin enthält um die während der Reaktion erzeugte Säure abzufangen;
(d) um eine Sulfonamid-Gruppe durch Reaktion mit einer äquivalenten Menge oder einem Überschuss (z. B. 5 Äquivalenten) von R-S(O)₂Cl in einem geeigneten inerten Verdünnungsmittel (Dichlormethan) zu bilden, um das terminale Amin in ein Sulfonamid umzuwandeln, wobei R wie vorstehend definiert ist. Bevorzugt enthält das inerte Verdünnungsmittel überschüssiges tertiäres Amin (z. B. zehn Äquivalente) wie z. B. Diisopropylethylamin, um die während der Reaktion erzeugte Säure abzufangen. Die Reaktionsbedingungen sind ansonsten herkömmlich (z. B. Raumtemperatur für 30 Minuten);
(e) um eine Carbamat-Gruppe durch Reaktion mit einer äquivalenten Menge oder einem Überschuss (z. B. 5 Äquivalenten) von R-OC(O)Cl oder R-OC(O)OC₆H₄-p-NO₂ in einem geeigneten inerten Verdünnungsmittel (Dichlormethan) zu bilden, um das terminale Amin in ein Carbamat umzuwandeln, wobei R wie vorstehend definiert ist. Bevorzugt enthält das inerte Verdünnungsmittel einen Überschuss (z. B. etwa zehn Äquivalente) eines tertiären Amins wie z. B. Diisopropylethylamin, um jegliche während der Reaktion erzeugte Säure abzufangen. Die Reaktionsbedingungen sind ansonsten herkömmlich (z. B. Raumtemperatur für 30 Minuten); und
(f) um eine Harnstoff-Gruppe durch Reaktion mit einer äquivalenten Menge oder einem Überschuss (z. B. 5 Äquivalenten) von R-N=C=O in einem geeigneten inerten Verdünnungsmittel (Dichlormethan) zu bilden, um das terminale Amin in eine Harnstoffgruppe (d. h. RNHC(O)NH-) umzuwandeln, wobei R wie vorstehend definiert ist. Bevorzugt enthält das inerte Verdünnungsmittel einen Überschuss (z. B. etwa zehn Äquivalente) eines tertiären Amins wie z. B. Diisopropylethylamin. Die Reaktionsbedingungen sind ansonsten herkömmlich (z. B. Raumtemperatur für etwa 30 Minuten).

2. C-TERMINALE MODIFIKATIONEN
Beim Herstellen der Peptidmimetika, bei denen die C-terminale Carboxylgruppe durch einen Ester ersetzt ist (d. h. -C(O)OR, wobei R wie vorstehend definiert ist), werden die Harze verwendet, die eingesetzt werden, um die Peptidsäuren zu erzeugen, und das Seitenketten-geschützte Peptid wird mit Base und dem geeigneten Alkohol, z. B. Methanol abgespalten. Die Seitenketten-Schutzgruppen werden dann auf die übliche Weise durch Behandlung mit Fluorwasserstoff entfernt, um den gewünschten Ester zu erhalten.
Beim Herstellen der Peptidmimetika, bei denen die C-terminale Carboxylgruppe durch das Amid -C(O)NR³R⁴ ersetzt ist, wird ein Benzhydrylamin-Harz als fester Träger für die Peptidsynthese verwendet. Nach der Beendigung der Synthese führt eine Behandlung mit Fluorwasserstoff um das Peptid von dem Träger freizusetzen, direkt zu dem freien Peptidamid (d. h. der C-Terminus ist -C(O)NH₂). Alternativ ergibt die Verwendung des chlormethylierten Harzes während der Peptidsynthese, gekoppelt mit der Reaktion mit Ammoniak um das Seitenketten-geschützte Peptid von dem Träger abzuspalten, das freie Peptidamid, und Reaktion mit einem Alkylamin oder einem Dialkylamin ein Seitenketten-geschütztes Alkylamid oder Dialkylamid (d. h. der C-Terminus ist -C(O)NRR¹, wobei R und R¹ wie vorstehend definiert sind). Der Schutz der Seitenketten wird dann auf die übliche Weise durch Behandlung mit Fluorwasserstoff entfernt um die freien Amide, Alkylamide oder Dialkylamide zu ergeben.
In einer anderen alternativen Ausführungsform kann die C-terminale Carboxylgruppe oder ein C-terminaler Ester durch eine interne Verdrängung des -OH bzw. des Esters (-OR) der Carboxylgruppe bzw. des Esters mit der N-terminalen Aminogruppe zu einem Ringschluss veranlasst werden um ein zyklisches Peptid zu bilden. Beispielsweise wird, nach der Synthese und der Abspaltung, um die Peptidsäure zu ergeben, die freie Säure durch einen geeigneten Carboxylgruppen-Aktivator wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Lösung in einen aktivierten Ester umgewandelt, z. B. in Methylenchlorid-(CH₂Cl₂), Dimethylformamid (DMF)-Gemischen. Das zyklische Peptid wird dann durch interne Verdrängung des aktivierten Esters mit dem N-terminalen Amin gebildet. Ein interner Ringschluss kann gegenüber einer Polymersierung durch die Verwendung von stark verdünnten Lösungen gefördert werden. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Man kann auch die Peptide der Erfindung zyklisieren oder einen Desamino- oder Descarboxy-Rest an den Enden des Peptids einführen, so dass es keine terminale Amino- oder Carboxylgruppe gibt, um die Anfälligkeit gegenüber Proteasen zu verringern oder um die Konformation des Peptids einzuschränken. C-terminale funktionelle Gruppen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen Amid-, niedere Alkylamid-, niedere Alkyldiamid-, niedere Alkoxy-, Hydroxy- und Carboxy-Gruppen und die niederen Esterderivate davon, sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
D. GERÜST – MODIFIKATIONEN
Andere Verfahren zur Herstellung von Peptidderivaten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in Hruby et al., Biochem. J. 268: 249–262 (1990) beschrieben. So dienen die Peptidverbindungen der Erfindung auch als Strukturmodelle für nicht-peptidische Verbindungen mit ähnlicher biologischer Aktivität. Fachleute verstehen, dass eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung stehen um Verbindungen mit derselben oder ähnlichen gewünschten biologischen Aktivität wie die Leit-Peptidverbindung zu konstruieren, aber mit einer günstigeren Aktivität als die Leitverbindung in Bezug auf Löslichkeit, Stabilität und Empfindlichkeit gegenüber Hydrolyse und Proteolyse. Siehe Morgan und Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243–252 (1989). Zu diesen Methoden gehört das Ersetzen des Peptidgerüsts mit einem Gerüst, das aus Phosphonaten, Amidaten, Carbamaten, Sulfonamiden, sekundären Aminen und N-Methylaminosäuren aufgebaut ist.
Peptidmimetika, bei denen eine oder mehrere der Peptidylverknüpfungen [-C(O)NH-]- durch solche Verknüpfungen wie z. B. eine -CH₂-Carbamat-Verknüpfung, eine Phosphonat-Verknüpfung, eine -CH₂-Sulfonamid-Verknüpfung, eine Harnstoff-Verknüpfung, eine sekundäre Amin-(CH₂NH)-Verknüpfung und eine alkylierte Peptidyl-Verknüpfung [-C(O)NR⁶- ersetzt worden sind, wobei R⁶ ein niederer Alkylrest ist], werden bei der herkömmlichen Peptidsynthese erzeugt, indem man lediglich an dem richtigen Zeitpunkt während der Synthese ein geeignetes geschütztes Aminosäureanalogon für das Aminosäurereagenz substituiert.
Geeignete Reagenzien umfassen zum Beispiel Aminosäureanaloga, bei denen die Carboxylgruppe der Aminosäure durch eine Einheit ersetzt worden ist, die dazu geeignet ist, eine der vorstehenden Verknüpfungen auszubilden. Wenn man zum Beispiel eine -C(O)NR-Verknüpfung in dem Peptid durch eine -CH₂-Carbamat-Verknüpfung (-CH₂OC(O)NR-) ersetzen möchte, dann reduziert man zuerst die Carboxyl (-COOH) – Gruppe einer auf geeignete Weise geschützten Aminosäure zu der -CH₂OH-Gruppe, die dann durch herkömmliche Verfahren zu einer -OC(O)Cl-Funktionalität oder einer para-Nitrocarbonat -OC(O)O-C₆H₄-p-NO₂-Funktionalität umgewandelt wird. Die Reaktion von jeder von solchen funktionellen Gruppen mit dem freien Amin oder einem alkylierten Amin am N-Terminus des partiell synthetisierten Peptids, das auf dem festen Träger vorliegt, führt zur Bildung einer -CH₂OC(O)NR-Verknüpfung. Für eine genauere Beschreibung der Bildung solcher -CH₂-Carbamat-Verknüpfungen siehe Cho et al., Science 261: 1303–1305 (1993)).
Auf ähnliche Weise kann ein Austausch einer Amidverknüpfung in dem Peptid mit einer Phosphonatverknüpfung auf die Weise erreicht werden, die in den U. S. Patentanmeldungen mit der Seriennummern 07/943,805, 08/081,977 und 08/119,700 dargelegt ist.
Der Austausch einer Amidverknüpfung in dem Peptid mit einer CH₃-Sulfonamid-Verknüpfung lässt sich durch Reduzieren der Carboxyl (-COOH)-Gruppe einer auf geeignete Weise geschützten Aminosäure zu der -CH₂OH-Gruppe erreichen, und die Hydroxylgruppe wird dann durch herkömmliche Verfahren zu einer geeigneten Abgangsgruppe wie z. B. einer Tosylgruppe umgewandelt. Die Reaktion des tosylierten Derivats mit zum Beispiel Thioessigsäure, gefolgt von Hydrolyse und oxidativer Chlorierung liefert die funktionelle Gruppe -CH₂-S(O)₂Cl, welche die Carboxylgruppe der ansonsten auf geeignete Weise geschützten Aminosäure ersetzt.
Eine Verwendung dieses auf geeignete Weise geschützten Aminosäureanalogs in der Peptidsynthese gewährleistet den Einschluss einer -CH₂-S(O)₂Cl-Verknüpfung, welche die Amidverknüpfung in dem Peptid ersetzt, wodurch ein Peptidmimetikum bereitgestellt wird. Für eine vollständigere Beschreibung der Umwandlung der Carboxylgruppe der Aminosäure zu einer -CH₂-S(O)₂Cl-Gruppe siehe z. B. Weinstein, Boris, Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Band 7, S. 267–357, Marcel Dekker, Inc., New York (1983).
Sekundäre Aminverknüpfungen, bei denen eine -CH₂NH-Verknüpfung die Amidverknüpfung in dem Peptid ersetzt, lassen sich herstellen indem man zum Beispiel ein auf eine geeignete Weise geschütztes Dipeptid-Analogon einsetzt, in dem die Carbonylbindung der Amidverknüpfung durch herkömmliche Verfahren zu einer CH₂-Gruppe reduziert worden ist. Im Fall von Diglycin liefert Reduktion des Amids zu dem Amin nach der Entschützung zum Beispiel H₂NCH₂CH₂NHCH₂COOH, das dann in der N-geschützten Form in der nächsten Kopplungsreaktion eingesetzt wird. Die Herstellung solcher Analoga durch Reduktion der Carbonylgruppe der Amidverknüpfung in dem Dipeptid ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Das auf eine geeignete Weise geschützte Aminosäuren-Analogon wird in der herkömmlichen Peptidsynthese auf dieselbe Weise verwendet wie man die korrespondierende Aminosäure verwenden würde. Zum Beispiel werden üblicherweise etwa 3 Äquivalente des geschützten Aminosäuren-Analogons in diese Reaktion eingesetzt. Man verwendet ein inertes organisches Verdünnungsmittel wie z. B. Methylenchlorid oder DMF und, falls eine Säure als Nebenprodukt der Reaktion erzeugt wird, enthält das Lösungsmittel der Reaktion üblicherweise ein tertiäres Amin um die während der Reaktion gebildete Säure abzufangen. Ein besonders bevorzugtes tertiäres Amin ist Diisopropylethylamin, das normalerweise in einem etwa 10-fachen Überschuss eingesetzt wird. Die Reaktion führt zu einem Einbau eines eine nicht-peptidische Verknüpfung aufweisenden Aminosäuren-Analogons in das Peptidmimetikum. Eine solche Substitution kann nach Wunsch wiederholt werden, so dass von null bis zu allen der Amidbindungen in dem Peptid durch Nicht-Amidbindungen ersetzt worden sind.
Man kann die Peptide der Erfindung auch zyklisieren oder einen Desamino- oder Descarboxy-Rest an den Enden des Peptids einbauen, so dass es keine terminale Amino- oder Carboxylgruppe gibt, um die Anfälligkeit gegenüber Proteasen zu vermindern oder um die Konformation des Peptids einzuschränken. C-terminale funktionelle Gruppen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen Amid-, niedere Alkylamid-, niedere Alkyldiamid-, niedere Alkoxy-, Hydroxy- und Carboxy-Gruppen und die niederen Esterderivate davon, sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon. Beispiele für zyklisierte Verbindungen sind in den Tabellen 4, 5, 6, 8 und 9 angegeben.
E. BILDUNG VON DISULFID-BINDUNGEN
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in einer zyklisierten Form vorliegen, mit einer intramolekularen Disulfid-Bindung zwischen den Thiol-Gruppen der Cysteine. Alternativ kann eine intramolekulare Disulfid-Bindung zwischen den Thiol-Gruppen der Cysteine erzeugt werden, um eine dimere (oder höher oligomere) Verbindung zu ergeben. Ein oder mehrere Cysteinreste können auch mit einem Homocystein substituiert werden. Diese intramolekularen oder intermolekularen Disulfid-Derivate können schematisch wie nachstehend gezeigt dargestellt werden:
wobei m und n unabhängig voneinander 1 oder 2 sind.
Andere Ausführungsformen dieser Erfindung stellen Analoga dieser Disulfid-Derivate bereit, in denen eines der Schwefelatome durch eine CH₂-Gruppe oder ein anderes Isoster für Schwefel ersetzt worden ist. Diese Analoga können wie nachstehend gezeigt über eine intramolekulare oder intermolekulare Verdrängung erzeugt werden, wobei auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren eingesetzt werden:
wobei p 1 oder 2 ist. Ein Fachmann wird unschwer erkennen, dass diese Verdrängung auch bei Verwendung anderer Homologe der vorstehend gezeigten α-Amino-γ-Buttersäure-Derivate und Homocystein erfolgen kann.
Alternativ kann der Amino-Terminus des Peptids mit einer alpha-substituierten Essigsäure mit einem Cap versehen werden, wobei der Alpha-Substituent eine Abgangsgruppe wie z. B. eine α-Halo-Essigsäure, zum Beispiel α-Chloressigsäure, α-Bromessigsäure oder α-Jodessigsäure ist. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können über Verdrängung der Abgangsgruppe durch den Schwefel des Cystein- oder des Homocysteinrests zyklisiert oder dimerisiert werden. Siehe z. B. Barker et al., J. Med. Chem. 35: 2040–2048 (1992) und Or et al., J. Org. Chem. 56: 3146–3149 (1991). Beispiele für dimerisierte Verbindungen sind in den Tabellen 7, 9 und 10 angegeben.
V. NUTZWERT
Die Verbindungen der Erfindung sind in vitro nützlich als einzigartige Werkzeuge um die biologische Rolle von TPO zu verstehen, einschließlich der Beurteilung der vielen Faktoren, von denen man annimmt, dass sie die Produktion von TPO und des Rezeptorbindungs-Prozesses beeinflussen und davon beeinflusst werden. Die vorliegenden Verbindungen sind auch nützlich bei der Entwicklung anderer Verbindungen, die an den TPO-R binden und diesen aktivieren, weil die vorliegenden Verbindungen wichtige Information über die Beziehung zwischen Struktur und Aktivität liefern, welche eine solche Entwicklung erleichtern sollte.
Die Verbindungen sind auch nützlich als kompetitive Bindungsmoleküle in Assays um nach neuen TPO-Rezeptor-Agonisten zu screenen. In solchen Assay-Ausführungsformen können die Verbindungen der Erfindung ohne Modifikation verwendet werden oder sie können auf eine Vielzahl von Arten modifiziert werden; zum Beispiel indem man sie markiert wie z. B. durch kovalente und nicht-kovalente Verknüpfung mit einer Einheit, die direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal liefert. In allen diesen Assays können die Materialien dafür entweder direkt oder indirekt markiert werden. Möglichkeiten für eine direkte Markierung umfassen Markergruppen wie z. B.: Radiomarker wie z. B. ¹²⁵I, Enzyme ( U. S. Patent Nr. 3,645,090 ) wie z. B. Peroxidase und alkalische Phosphatase und fluoreszierende Marker ( U. S. Patent Nr. 3,940,475 ), die in der Lage sind, die Veränderung in der Intensität der Fluoreszenz, der Verschiebung der Wellenlänge oder der Polarisierung der Fluoreszenz zu verfolgen. Möglichkeiten für indirekte Markierung umfassen Biotinylierung eines Bestandteils, gefolgt von Bindung an Avidin, das an eine der vorstehenden Markergruppen gekoppelt ist. Die Verbindungen können auch Spacer oder Linker umfassen, für den Fall, dass die Verbindungen an einen festen Träger gebunden werden sollen.
Darüber hinaus können die Peptide der vorliegenden Erfindung, basierend auf ihrer Fähigkeit, an den TPO-Rezeptor zu binden, als Reagenzien eingesetzt werden, um den TPO-Rezeptor auf lebenden Zellen, fixierten Zellen, in biologischen Flüssigkeiten, in Gewebehomogensten, in aufgereinigten natürlichen biologischen Materialien etc. nachzuweisen. Indem man solche Peptide markiert, kann man zum Beispiel Zellen identifizieren, die TPO-R auf ihrer Oberfläche haben. Außerdem können die Peptide der vorliegenden Erfindung, basierend auf ihrer Fähigkeit, an den TPO-Rezeptor zu binden, in in situ-Färbungen, FACS (Fluoreszenz-aktiviertes Sortieren von Zellen), Western Blotting, ELISA etc. eingesetzt werden. Außerdem können die Peptide der vorliegenden Erfindung, basierend auf ihrer Fähigkeit, an den TPO-Rezeptor zu binden, bei der Aufreinigung des Rezeptors oder beim Aufreinigen von Zellen eingesetzt werden, die TPO-Rezeptoren auf der Zelloberfläche (oder im Inneren von permeabilisierten Zellen) exprimieren.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch als im Handel erhältliche Reagenzien für verschiedene Zwecke der medizinischen Forschung und diagnostische Zwecke verwendet werden. Solche Verwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: (1) Verwendung als ein Kalibrierungs-Standard zur Quantifizierung der Aktivitäten von Kandidaten für TPO-Agonisten in einer Vielzahl von funktionellen Assays; (2) Verwendung um die Proliferation und das Wachstum von TPO-abhängigen Zelllinien aufrechtzuerhalten; (3) Verwendung bei der Strukturanalyse des TPO-Rezeptors mittels Co-Kristallisierung; (4) Verwendung um den Mechanismus der TPO-Signalübertragung/Rezeptoraktivierung zu untersuchen; und (5) andere Forschungs- und diagnostische Anwendungen, bei denen der TPO-Rezeptor bevorzugt aktiviert wird oder eine solche Aktivierung einfach gegen eine bekannte Menge eines TPO-Agonisten kalibriert wird und dergleichen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können für die in vitro-Expansion von Megakaryocyten und von deren programmierten Vorläufern verwendet werden, sowohl in Verbindung mit zusätzlichen Cytokinen als auch alleine. Siehe z. B. DiGiusto et al., PCT-Veröffentlichung Nr. 95/05843 . Chemotherapie und Bestrahlungstherapien verursachen Thrombocytopenie indem sie die sich schnell teilende, reifere Population von Megakaryocyten abtöten. Diese therapeutischen Behandlungen können jedoch auch die Zahl und die Lebensfähigkeit der unreifen, weniger mitotisch aktiven Vorläuferzellen der Megakaryocyten vermindern. Demnach kann eine Verbesserung der Thrombocytopenie durch TPO oder durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beschleunigt werden indem man Patienten nach der Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie eine Population seiner oder ihrer eigenen Zellen infundiert, die durch in vitro-Kultur für Megakaryocyten und unreife Vorläufer angereichert worden sind.
Die Verbindungen der Erfindung können auch an warmblütige Tiere, einschließlich Menschen. verabreicht werden, um den TPO-R in vivo zu aktivieren. Somit ist die vorliegende Erfindung nützlich für die therapeutische Behandlung von mit TPO zusammenhängenden Funktionsstörungen, welche das Verabreichen einer Verbindung der Erfindung in Mengen umfasst, die ausreichend sind, um die Wirkung von TPO auf den TPO-R in vivo nachzuahmen. Die Peptide und Verbindungen der Erfindung können zum Beispiel verabreicht werden, um eine Vielzahl von hämatologischen Funktionsstörungen zu behandeln, einschließlich aber nicht beschränkt auf Blutplättchen-Funktionsstörungen und Thrombozytopenie, insbesondere wenn diese Knochenmarktransfusionen, Bestrahlungstherapie und Chemotherapie assoziiert ist.
TPO-Antagonisten können zuerst Patienten verabreicht werden, die sich einer Chemotherapie oder einer Bestrahlungstherapie unterziehen, gefolgt von einer Verabreichung der TPO-Agonisten der Erfindung.
Die Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann entweder in vitro oder in vivo in einem der zahlreichen in McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology 14: 8–21 (1992) beschriebenen Modelle abgeschätzt werden.
Gemäß einer Ausführungsform sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich um Thrombozytopenie zu behandeln, die mit Knochenmarktransfusionen, Bestrahlungstherapie oder Chemotherapie assoziiert ist. Die Verbindungen werden normalerweise prophylaktisch vor der Chemotherapie, Bestrahlungstherapie oder Knochenmarktransplantation verabreicht oder nach einer solchen Exposition.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch Arzneimittel bereit, die als aktiven Bestandteil mindestens eines der Peptide oder Peptidmimetika der Erfindung in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel umfassen. Die Verbindungen dieser Erfindung können über orale, pulmonale, parenterale (intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse (IV) oder subkutane Injektion), Inhalation (über eine feinpulvrige Formulierung), transdermale, nasale, vaginale, rektale oder sublinguale Verabreichungswege verabreicht werden und können in Darreichungsformen formuliert werden, die für jeden Verabreichungsweg zweckdienlich sind. Siehe z. B. Bernstein et al., PCT Patent-Veröffentlichung Nr. WO 93/25221 ; Pitt et al., PCT Patent-Veröffentlichung Nr. 94/17784 und Pitt et al., Europäische Patentanmeldung 613,683 .
Feste Darreichungsformen zur oralen Verabreichung umfassen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granula. Bei solchen festen Darreichungsformen wird die aktive Verbindung mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie z. B. Sucrose, Lactose oder Stärke vermengt. Solche Darreichungsformen können auch, wie es die übliche Praxis ist, außer inerten Verdünnungsmitteln zusätzliche Stoffe enthalten, zum Beispiel Schmierstoffe wie z. B. Magnesiumstearat. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Darreichungsformen auch Pufferreagenzien umfassen. Tabletten und Pillen können außerdem mit Magensäure-resistenten Beschichtungen zubereitet werden.
Flüssige Darreichungsformen zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirup, wobei die Elixire inerte Verdünnungsmittel enthalten, die üblicherweise auf dem Fachgebiet eingesetzt werden, wie z. B. Wasser. Neben solchen inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen auch Adjuvantien beinhalten, wie z. B. Benetzungsmittel, Emulgatoren und Lösungsvermittler sowie Süßungsmittel, Geschmacks- und Duftstoffe.
Zubereitungen gemäß dieser Erfindung zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel oder Vehikel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöle, wie z. B. Olivenöl und Maisöl, Gelatine sowie injizierbare organische Ester wie z. B. Ethyloleat. Solche Darreichungsformen können auch Adjuvantien wie z. B. Konservierungsstoffe, Benetzungsmittel, Emulgatoren und Lösungsvermittler enthalten. Diese können sterilisiert werden, zum Beispiel durch Filtration durch ein Bakterien zurückhaltendes Filter, durch Einbringung von Sterilisierungsmitteln in die Zusammensetzungen, durch Bestrahlung der Zusammensetzungen oder durch Erhitzen der Zusammensetzungen. Sie können auch unmittelbar vor Verwendung mit sterilem Wasser oder irgendeinem anderen sterilen injizierbaren Medium hergestellt werden.
Bei Zusammensetzungen zur rektalen oder vaginalen Verabreichung handelt es sich bevorzugt um Zäpfchen, die außer der aktiven Substanz Excipienten wie z. B. Kakaobutter oder ein Zäpfchen-Wachs. Zusammensetzungen zur nasalen oder sublingualen Verabreichung werden ebenfalls mit Standard-Excipienten zubereitet, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind.
Die Zusammensetzungen, welche die Verbindungen enthalten, können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen wie vorstehend beschrieben einem Patienten, der bereits an einer Krankheit leidet, in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist um die Symptome der Krankheit und ihrer Komplikationen zu heilen oder wenigstens teilweise aufzuhalten. Eine Menge, die ausreichend ist, dies zu bewerkstelligen, wird als „therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Die Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen von dem Schweregrad der Krankheit und dem Gewicht und dem Allgemeinzustand des Patienten ab.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch in Mikrokapseln verpackt werden, zum Beispiel mit Hilfe des Verfahrens von Tice und Bibi (in Treatise an Controlled Drug Delivery, Hrsg. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N. Y. (1992), S. 315–339.
Bei prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, die die Verbindungen enthalten, einem Patienten verabreicht, der für eine bestimmte Krankheit anfällig ist oder sonstwie ein Risiko dafür aufweist. Eine solche Menge wird als „prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Bei dieser Verwendung hängen die genauen Mengen wiederum von dem Gesundheitszustand des Patienten und dessen Gewicht ab.
Die Mengen des TPO-Agonisten, die für eine wirksame Therapie notwendig sind, hängen von vielen verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Art der Verabreichung, der Zielstelle, dem physiologischen Zustand des Patienten, sowie anderen verabreichten Medikamenten. Daher sollten Behandlungsdosierungen titriert werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Üblicherweise können Dosierungen, die in vitro verwendet werden, nützliche Anhaltspunkte für die Mengen sein, die für eine in situ – Verabreichung dieser Reagenzien nützlich sind. Ein Test an Tieren der für die Behandlung bestimmter Funktionsstörungen wirksamen Dosen liefert eine weitere Prognose für die Dosierung beim Menschen. Verschiedene Gesichtspunkte sind z. B. in Gilman et al. (Hrsg.), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Ausg., Pergamon Press (1990); und Remington's Pharmaceutical Sciences, 7. Ausg., Mack Publishing Co., Esston, Penn. (1985) beschrieben.
Die Peptide und Peptidmimetika dieser Erfindung sind wirksam bei der Behandlung von TPO-vermittelten Zuständen, wenn sie in einem Dosierungsbereich von etwa 0,001 mg bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Die spezifische verwendete Dosis wird von dem jeweiligen behandelten Zustand, dem Verabreichungsweg ebenso wie von der Beurteilung des behandelnden Arztes bestimmt werden, abhängig von Faktoren wie z. B. dem Schweregrad des Zustands, dem Alter und Allgemeinzustand des Patienten und dergleichen.
BEISPIEL 1
FESTPHASEN-PEPTIDSYNTHESE
Verschiedene Peptide der Erfindung wurden mit Hilfe der Festphasen-Syntheseverfahren von Merrifield auf einem automatisierten Milligen/Biosearch 9600 Gerät oder einem Applied Biosystems Inc. Modell 431A Peptidsynthesegerät synthetisiert (siehe Steward und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausg., Pierce Chemical, Rockford, IL (1984) und Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963)). Die Peptide wurden unter Verwendung von Standardprotokollen der Applied Biosystems Inc. System-Software, Version 1.01 zusammengesetzt. Jede Kopplung wurde für 1–2 Stunden mit BOP (Benzotriazolyl-N-oxtrisdimethylaminophosphoniumhexafluorphosphat) und HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) durchgeführt.
Bei dem verwendeten Harz handelte es sich um HMP-Harz oder PAL (Milligen/Biosearch), das ein vernetztes Polystyrol-Harz mit 5-(4'-Fmoc-Aminomethyl-3,5'-dimethoxyphenoxy)valeriansäure als Linker ist. Die Verwendung von PAL-Harz führt nach Spaltung des Peptids von dem Harz zu einer Carboxyl-terminalen Amidfunktionalität. Das HMP-Harz erzeugt nach der Spaltung einen Carboxylsäurerest am C-Terminus des Endprodukts. Die meisten Reagenzien, Harze und geschützten Aminosäuren wurden von Millipore oder von Applied Biosystems Inc. bezogen.
Die Fmoc-Gruppe wurde für den Schutz der Aminogruppe während der Kopplungsprozedur verwendet. Der Schutz primärer Amine auf Aminosäuren wurde mit Fmoc erreicht, und die Seitenketten-Schutzgruppen waren t-Butyl für Serin, Tyrosin, Asparagin, Glutaminsäure und Threonin; Trityl für Glutamin; Pmc (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-sulfonat) für Arginin; N-t-Butyloxycarbonyl für Tryptophan; N-Trityl für Histidin und Glutamin; und S-Trityl für Cystein.
Das Entfernen der Peptide von dem Harz und die gleichzeitige Entschützung der Seitenkettenfunktionen wurde durch Behandlung mit Reagenz K oder leichten Modifikationen davon erreicht. Alternativ wurde das vollständig zusammengesetzte Peptid bei der Synthese von jenen Peptiden mit einem amidierten Carboxyl-Terminus mit einem Gemisch aus 90% Trifluoressigsäure, 5% Ethandithiol und 5% Wasser abgespalten, zunächst bei 4°C und mit allmählicher Steigerung auf Raumtemperatur. Die entschützten Peptide wurden mit Diethylether gefällt. In allen Fällen erfolgte die Aufreinigung durch präparative Umkehrphasen-Hochleistungsflüssig chromatographie auf einer Säule mit gebundenem C₁₈-Silica-Gel mit einem Gradienten aus Acetonitril/Wasser in 0,1% Trifluoressigsäure. Die homogenen Peptide wurden mittels "Fast Atom Bombardment"-Massenspektroskopie oder "Elektrospray"-Massenspektroskopie und gegebenenfalls Aminosäurenanalyse charakterisiert.
BEISPIEL 2
BIOASSAYS
Die biologische Aktivität der Peptide lässt sich mit einem Thrombopoetinabhängigen Zellproliferations-Assay messen. Die IL-3-abhängigen Maus-Ba/F3-Zellen wurden mit der Volllänge-Version des menschlichen TPO-R transfiziert. In Abwesenheit von IL-3 (WEHT-3 konditionierte Medien) ist die Proliferation dieser Zellen von TPO abhängig. Die parentale untransfizierte Zelllinie reagiert nicht auf menschliches TPO, sondern bleibt IL-3-abhängig.
Bioassays sind mit beiden der vorstehenden Zelllinien mit synthetischen Peptiden durchgeführt worden, die aus dem Screening einer Bank stammen. Man ließ die Zellen in komplettem RPMI-10 – Medium wachsen, das 10% WEHI-3-konditioniertes Medium enthielt, wusch sie dann zwei Mal in PBS, resuspendierte sie in Medium, das kein WEHT-3-konditioniertes Medium enthielt und fügte sie in einer Konzentration von 2 × 10⁴ Zellen/ml zu den Vertiefungen hinzu, die Verdünnungen der Peptide oder TPO enthielten. Die Zellen wurden für 48 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ inkubiert und die metabolische Aktivität wurde anhand der Reduktion von MTT zu Formazan getestet, indem die Extinktion bei 570 nm auf einem ELISA-Platten-Lesegerät gemessen wurde. Wie in 1 gezeigt ist, stimulierten die getesteten Peptide die Proliferation von mit TPO-R transfizierten Ba/F3-Zellen in einer Dosis-abhängigen Weise. Diese Peptide haben keine Wirkung auf die parentale Zelllinie.
BEISPIEL 3
BINDUNGSAFFINITÄT
Bindungsaffinitäten von chemisch synthetisierten Peptiden für TPO-R wurden in einem Kompetitions-Bindungsassay gemessen. Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit 1 mg Streptavidin beschichtet, mit PBS/1% BSA blockiert, gefolgt von 50 ng eines immobilisierenden biotinylierten Anti-Rezeptor-Antikörpers (Ab 179). Die Vertiefungen wurden dann mit einer 1:10-Verdünnung von geerntetem löslichem TPO-R behandelt. Verschiedene Konzentrationen von Peptiden und Peptidmimetika wurden mit einer konstanten Menge einer verkürzten Form von TPO gemischt, die aus den Resten 1–156 bestand, die an den C-Terminus des Maltose-Bindungsproteins fusioniert waren (MBP-TPO₁₅₆). Die Gemische aus Peptid und MBP-TPO₁₅₆ wurden zu den mit TPO-R beschichteten Vertiefungen gegeben, für 2 Stunden bei 4°C inkubiert und dann mit PBS gewaschen. Die Menge an MBP-TPO₁₅₆, die im Gleichgewicht gebunden war, wurde gemessen indem man ein gegen MBP gerichtetes Kaninchen-Antiserum hinzufügte, gefolgt von einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-IgG. Die Menge an alkalischer Phosphatase in jeder Vertiefung wurde dann mit Standardmethoden bestimmt.
Der Assay wird über einen Bereich von Peptid-Konzentrationen durchgeführt und die Ergebnisse werden graphisch aufgetragen, so dass y-Achse die Menge an gebundenem MBP-TPO₁₅₆ darstellt und die x-Achse die Konzentration des Peptids oder des Peptidmimetikums. Man kann dann die Konzentration bestimmen, bei der das Peptid oder das Peptidmimetikum die Menge des an den immobilisierten TPO-R gebundenen MBP-TPO₁₅₆ um 50% vermindert (IC₅₀). Die Dissoziationskonstante (Kd) für das Peptid sollte dem gemessenen IC₅₀-Wert ähnlich sein, wenn man die vorstehend beschriebenen Assaybedingungen verwendet.
BEISPIEL 4
„PEPTIDE AUF PLASMIDEN"
Der Vektor pJS142 wird für die Konstruktion der Genbank verwendet und ist in 4 gezeigt. Für die Konstruktion der Genbank werden drei Oligonucleotidsequenzen benötigt: ON-829 (5' ACC ACC TCC GG); ON-830 (5' TTA CTT AGT TA) und ein Genbank-spezifisches Oligonucleotid von Interesse (5' GA GGT GGT {NNK}_n TAA CTA AGT AAA GC), wobei {NNK}_n eine nach dem Zufallsprinzip bestimmte Region der gewünschten Länge und Sequenz bezeichnet. Die Oligonucleotide können während der Synthese oder nach der Aufreinigung mit Polynucleotidkinase chemisch 5' phosphoryliert werden. Sie werden dann in einem molaren Verhältnis von 1:1:1 aneinander angelagert und an den Vektor ligiert.
Der E. coli-Stamm, der bevorzugt für das Panning verwendet wird, besitzt den Genotyp: Δ(srI-recA) endA1 nupG Ion-11 sulA1 hsdR17 Δ(ompT-fepC)266 dc1pA319::kan ΔlacI lac ZU118, der aus einem E. coli-Stamm des E. coli Genetic Stock Center an der Yale University mit dem Genotyp Ion-11 sulA1 (E. coli b/r, Bezeichnung des Stock Centers CGSC:6573) hergestellt werden kann. Der vorstehende E. coli-Stamm wird wie von Dower et al., Nucl. Acids Res. 16: 6127 (1988) beschrieben für die Verwendung in der Elektroporation vorbereitet, außer dass 10% Glycerin bei allen Waschschritten eingesetzt wird. Die Zellen werden mit 1 pg eines Bluescript-Plasmids (Stratagene) auf Effizienz getestet. Diese Zellen werden für die Expansion der Original-Bank und für die Amplifikation der angereicherten Population nach jeder Panning-Runde verwendet.
Peptide auf Plasmiden werden für das Panning von den Zellen durch sanfte enzymatische Verdauung der Zellwand mit Lysozym freigesetzt. Nach der Pelletierung der Zelltrümmer kann das Rohlysat auf den meisten Rezeptoren direkt eingesetzt werden. Falls irgendeine zusätzliche Aufreinigung der Plasmid-Komplexe erforderlich ist, kann eine Gelfiltrationssäule verwendet werden, um viele der niedermolekularen Verunreinigungen in dem Rohlysat zu entfernen.
Das Panning wird in einem Puffer (HEKL) mit einer niederigeren Salzkonzentration als die der meisten physiologischen Puffer durchgeführt. Das Panning kann in Mikrotiterplatten durchgeführt werden, in denen ein Rezeptor auf einem nicht blockierenden monoclonalen Antikörper (mAb) immobilisiert ist, oder durch Panning auf Kügelchen oder auf Säulen. Genauer gesagt können in der ersten Panning-Runde 24 Vertiefungen eingesetzt werden, von denen jede mit Rezeptor beschichtet ist. Für die zweite Runde werden üblicherweise sechs Vertiefungen verwendet, die mit dem Rezeptor beschichtet sind (PAN-Probe) und sechs Vertiefungen ohne Rezeptor (NC-Probe). Ein Vergleich der Zahl der Plasmide in diesen zwei Proben kann einen Hinweis darauf geben, ob Rezeptor-spezifische Clone durch das Panning angereichert werden. „Anreicherung" ist als das Verhältnis von PAN-Transformanten zu denjenigen definiert, die aus der NC-Probe wiedergewonnen werden. Eine 10-fache Anreicherung ist gewöhnlich ein Hinweis darauf, dass Rezeptor-spezifische Clone vorliegen.
In späteren Panning-Runden ist es nützlich, den Einsatz von Lysat in die Vertiefungen zu verringern um nicht-spezifische Hintergrund-Bindung der Plasmid-Komplexe zu erniedrigen. In der Runde 2 werden gewöhnlich 100 μl des Lysats pro Vertiefung eingesetzt. In der Runde 3 werden 100 μl des 1:10 in HEKL/ESA verdünnten Lysats pro Vertiefung eingesetzt. Für weitere Panning-Runden wird üblicherweise ein Einsatz an transformierenden Plasmid-Einheiten verwendet, der mindestens 1000-fach über der geschätzten verbliebenen Diversität liegt.
Die Bindungseigenschaften der Peptide, die von den einzelnen Clonen codiert werden, werden üblicherweise nach 3, 4 oder 5 Panning-Runden untersucht, je nach den beobachteten Anreicherungszahlen. Üblicherweise wird ein ELISA eingesetzt, der Rezeptor-spezifische Bindung durch LacI-Peptid-Fusionsproteine nachweist. LacI ist normalerweise ein Tetramer und die minimale funktionelle DNA-Eindungs-Spezies ist ein Dimer. Die Peptide werden somit auf dem Fusionsprotein multivalent zur Schau gestellt. Angenommen dass eine ausreichende Rezeptordichte in den Vertiefungen immobilisiert werden kann, werden die mit lacI fusionierten Peptide an die Oberfläche in einer kooperativen, multivalenten Art und Weise binden. Diese kooperative Bindung ermöglicht den Nachweis von Bindungsereignissen mit niedriger intrinsischer Affinität. Die Sensitivität dieses Assays ist insofern ein Vorteil, als dass anfängliche Hits mit niedriger Affinität leicht identifiziert werden können, ist aber insofern ein Nachteil, als dass das Signal in dem ELISA nicht mit der intrinsischen Affinität der Peptide korreliert. Eine Fusion der Peptide an das Maltose-Bindungsprotein (MBP) wie nachstehend beschrieben ermöglicht das Testen in einem ELISA-Format, in dem die Stärke des Signals besser mit der Affinität korreliert. Siehe 5A–B.
DNA aus Clonen von Interesse kann unter Verwendung beliebiger Standard-Miniprep-Prozeduren in doppelsträngiger Form präpariert werden. Die codierenden Sequenzen von interessierenden einzelnen Clonen oder von Populationen von Clonen können auf Vektoren transferiert werden, in denen diese Sequenzen im selben Leseraster mit dem Gen fusioniert werden, das MBP codiert, ein Protein, das im Allgemeinen in Lösung als ein Monomer vorkommt. Das Clonieren einer Bank in pJS142 erzeugt eine BspEI – Restriktionsstelle in der Nähe des Anfangs der nach dem Zufallsprinzip aufgebauten codierenden Region der Genbank. Eine Verdauung mit BspEI und ScaI ermöglicht die Aufreinigung eines ~ 900 bp großen DNA-Fragments, das in einen von zwei Vektoren, pELM3 (cytoplasmatisch) oder pELM15 (periplasmatisch) subcloniert werden kann, bei denen es sich um einfache Modifikationen der Vektoren pMALc2 bzw. pMALp2 handelt, die von New England Biolabs im Handel erhältlich sind. Siehe 5A–B. Eine Verdauung von pELM3 und pELM15 mit AgeI und ScaI ermöglicht eine effiziente Clonierung des BspEI-ScaI-Fragments aus der pJS142-Bank. Die BspEI- und AgeI-Enden sind für eine Ligierung kompatibel. Darüber hinaus ist die korrekte Ligierung der ScaI-Stellen entscheidend, um ein funktionelles bIa(Amp-Resistenz)-Gen wiederherzustellen, wodurch der Spiegel von Hintergrunds-Clonen aus unerwünschten Ligierungsereignissen gesenkt wird. Die Expression der vom tac-Promotor gesteuerten MBP-Peptid-Fusionen kann dann mit IPTG induziert werden.
Lysate für den LacI- oder für den MBP-ELISA werden dann aus Einzelclonen präpariert indem man die Zellen mit Lysozym lysiert und unlösliche Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt. Die Lysate werden dann zu Vertiefungen hinzugefügt, die immobilisierten Rezeptor enthalten, und zu Kontroll-Vertiefungen ohne Rezeptor. Bindung durch die LacI- oder die MBP-Peptidfusionen wird mittels Inkubation mit einem polyclonalen Kaninchen-Antiserum nachgewiesen, das entweder gegen LacI oder MBP gerichtet ist, gefolgt von einer Inkubation mit einem sekundären Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase markiert ist. Die gebundene alkalische Phosphatase wird mit dem chromogenen Substrat p-Nitrophenylphosphat nachgewiesen.
BEISPIEL 5
„KOPFTEIL-DIMER"-SYSTEM
Eine Variante der Technik der LacI-Peptide auf Plasmiden macht sich ein DNA-Bindungsprotein zunutze, das „Kopfteil-Dimer" genannt wird. DNA-Bindung durch den lac-Repressor von E. coli wird durch die ungefähr 60 Aminosäuren große „Kopfteil"-Domäne vermittelt. Das Dimer der Kopfteil-Domänen, das an den lac- Operator bindet, wird normalerweise durch eine Verbindung der viel größeren, ungefähr 300 Aminosäuren umfassenden, sauren C-terminalen Domäne gebildet: Das „Kopfteil-Dimer" – System nutzt Kopfteildimer-Moleküle, die zwei Kopfteile enthalten, die über einen kurzen Peptid-Linker verbunden sind. Diese Proteine binden DNA mit ausreichender Stabilität um die Verbindung eines am C-Terminus des Kopfteildimers zur Schau gestellten Peptidepitops mit dem Plasmid zu ermöglichen, das jenes Peptid codiert.
Die Zufallspeptide werden an den C-Terminus des Kopfteildimers fusioniert, welches an das Plasmid bindet, das es codierte, um einen Peptid-Kopfteildimer-Plasmid-Komplex zu erzeugen, der mittels Panning durchmustert werden kann. Das Kopfteildimer-Peptide auf Plasmide – System ermöglicht eine größere Selektivität für Liganden mit hoher Affinität als das LacI-System. Demnach ist das Kopfteildimer-System nützlich um Mutagenese-Banken herzustellen, die auf anfänglichen Hits mit niedriger Affinität basieren, und um durch Selektion Varianten jener anfänglichen Sequenzen mit höherer Affinität zu gewinnen.
Die Genbanken werden wie mit Peptiden auf Plasmiden konstruiert, wobei man den Kopfteildimer-Vektor pCMG14 verwendet (siehe 6A–C). Die Anwesenheit des lac-Operators ist für die Bindung des Plasmids durch das Kopfteildimer-Protein nicht notwendig. Die Genbanken wurden in den bakteriellen Stamm eingeführt, der E. coli (Ion-11 suIA1 hsdR17 (ompT-fepC) ΔcIpA319::kan ΔlacI lac ZU118 Δ(srI-recA) 306::Tn10 umfasste, und unter Bedingungen einer basalen (A) Promotorinduktion amplifiziert. Das Panning der Kopfteildimer-Genbanken wird mit Hilfe ähnlicher Prozeduren durchgeführt wie jene, die für die LacI-Genbanken verwendet worden sind, außer dass der HEK-Puffer an Stelle des HEKL-Puffers verwendet wird und die Elution der Plasmide von den Vertiefungen mit wässrigem Phenol anstatt mit IPTG durchgeführt wird. Sequenzen aus dem Kopfteildimer-Panning werden häufig nach dem Transfer in den MBP-Vektor charakterisiert, damit sie in dem Affinitäts-sensitiven MBP-ELISA getestet werden können und auch damit Populationen von Clonen durch Colony Lifts mit markiertem Rezeptor durchmustert werden können.
BEISPIEL 6
In diesem Beispiel wurden zyklisierte Verbindungen drei Assays unterzogen. Zuerst wurden IC₅₀-Werte wie vorstehend beschrieben erhalten. Außerdem wurde ein MTT-Zellproliferations-Assay wie vorstehend beschrieben durchgeführt, um EC₅₀ ^- Werte zu berechnen. Zuletzt wurde ein Mikrophysiometer (Molecular Devices Corp.)-Assay durchgeführt. Im Wesentlichen wird in diesem Assay die Geschwindigkeit der Ansäuerung des extrazellulären Mediums in Reaktion auf eine Stimulierung des TPO-Rezeptors durch die Verbindungen der Erfindung bestimmt. Die Bereiche für EC₅₀ sind wie für die vorstehend beschriebenen IC₅₀-Werte symbolisch angegeben. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4
BEISPIEL 7
In diesem Beispiel wurden Aminosäuresubstituenten an den Positionen D, E, I, S oder F in der zyklisierten Verbindung
wie vorstehend beschrieben auf die EC₅₀- und IC₅₀-Werte getestet. Mikrophysiometer-Ergebnisse sind in Klammern angegeben. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 5 zusammengefasst. TABELLE 5
BEISPIEL 8
In diesem Beispiel wurden Aminosäuresubstitutionen in der Verbindung
wie in der nachstehenden Tabelle 6 angegeben an den Positionen D, S oder F untersucht. EC₅₀- und IC₅₀-Werte wurden wie vorstehend beschrieben berechnet. Mikrophysiometer-Ergebnisse sind in Klammern angegeben.
TABELLE 6
BEISPIEL 9
In diesem Beispiel wurden EC₅₀- und IC₅₀-Werte wie vorstehend für die in der nachstehenden Tabelle 7 aufgeführten Dimerverbindungen beschrieben berechnet.
Das zyklisierte Monomer
ist als Vergleich mit aufgeführt.
Die Verbindungen von Tabelle 8 waren bei der maximalen getesteten Konzentration von 10 μM inaktiv.
In der Tabelle 9 werden die EC₅₀- und IC₅₀-Werte, die, wie vorstehend für die zyklisierten und dimerisierten Varianten von IEGPTLRQWLAARA beschrieben, bestimmt wurden, verglichen.
In der Tabelle 10 werden verkürzte Versionen des Dimers
verglichen. EC₅₀- und IC₅₀-Werte wurden wie vorstehend beschrieben berechnet. Mikrophysiometer-Ergebnisse sind in Klammern angegeben. TABELLE 7
TABELLE 8
TABELLE 8 Forts.
TABELLE 9
TABELLE 10
BEISPIEL 10
In diesem Beispiel wurden verschiedene Substitutionen an den Positionen G, P und W in der zyklisierten Verbindung
eingeführt.

Tabelle 11 führt Beispiele für die substituierten Verbindungen auf, die eine TPO-agonistische Aktivität zeigen. Die in der Tabelle abgekürzten Substitutionen sind wie folgt: TABELLE 11

\|H\| – CADGPTLREWISFC – \|NH₃\|
G	P	W
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gly	Pro	Trp
Gly	Pro	Trp
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gaba	Pro	Trp
Cpr-Gly	Pro	Trp
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gly	Pro	Trp
Gly	Pro	Nal
Sar	Pro	Trp
Cpr-Gly	L-Tic	Nal
Gly	D-Tic	D-Trp
Cpr-Gly	D-Tic	Trp
Gaba	Hyp(OBn)	Trp

Prolin-Substitutionen

Tryptophan-Substitutionen

Glycin-Substitutionen

BEISPIEL 11
Um die Eignung von Mäusen als einer zweckdienlichen Test-Spezies zu beurteilen, sind mehrere in vitro – Experimente unternommen worden, die dafür konzipiert waren, die Aktivität der Testverbindungen auf dem Maus-Rezeptor zu messen. Zuerst wurden Markzellen, die aus den Oberschenkeln von 8 bis 9 Wochen alten BALB/c-Mäusen gewonnen wurden, für 7 Tage entweder mit rhuTPO oder mit verschiedenen Konzentrationen der Testpeptide in Flüssigkultur inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Kulturen mittels Cytospin aufkonzentriert, auf Acetylcholinesterase (AChE, ein diagnostisch Merkmal von Maus-Megakaryocyten) angefärbt und mittels mikroskopischer Analyse gezählt. Ein (1) nM rhuTPO führte zum Auswachsen sehr großer (> 40 μm) nicht adhärenter Zellen, die sich auf AChE anfärben lassen. Bei diesen Zellen scheint es sich um reife Megakaryocyten zu handeln. Aus einer anfänglichen Aussaat von 10⁶ Gesamtmarkzellen/ml (in 50 ml-Kulturen) entwickelten sich schätzungsweise 1 bis 2 × 10⁶ Megakaryocyten. Diese Reaktion auf TPO wurde als „maximal" bezeichnet. Kontrollkulturen, die keine hinzugefügten Wachstumsfaktoren enthielten, erzeugten sehr wenige AChE-positive Zellen. Mehrere Peptidverbindungen wurden in diesem Assay in hohen Konzentrationen getestet und die Ergebnisse sind in der Tabelle 12 zusammengefasst. Peptid A erzeugte eine maximale Reaktion des Mausmarks bei 10 μM. Dieser Befund war der erste Hinweis darauf, dass diese Familie auf dem Maus-Rezeptor aktiv ist. In einem zweiten Experiment wurden Markzellen geerntet und in einem halbfesten Medium (Methylcellulose) gezüchtet, das entweder keine Faktoren, 1 nM rhuTPO oder 10 μM Peptid A enthielt. Nach 7 Tagen in Kultur wurden Kolonien von großen Zellen (von denen man annahm, dass es sich um Megakaryocyten handelte) gezählt und in kleine Kolonien (3–5 Zellen) oder große Kolonien (mehr als 6 Zellen) eingeteilt. Die Ergebnisse sind der Tabelle 13 gezeigt. TPO und die Testpeptide erzeugten beide wesentlich mehr Kolonien von beiden Größen als die Negativkontrollkulturen. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Peptide bei ihrer Fähigkeit, die Expansion der Population von Mk-Vorläuferzellen zu stimulieren, TPO nachahmen.

Um einen quantitativeren Vergleich der Aktivitäten der Testverbindungen auf Maus-Rezeptoren und menschliche Rezeptoren zu erhalten, wurde der muTPO- Rezeptor cloniert und in Ba/F3-Zellen transfiziert. Eine TPO-abhängige Population von Zellen wurde isoliert. TABELLE 12

Peptid	Gestetete Konzentration (nM) Reaktion
D	100,000	79 eine
C	40,000	maximal**
C + S. A.*	1000	maximal**
S. A. allein	1000	keine
B	100,000	minimal
A	10,000	maximal**
TPO (R & D)	1	"maximal"

* Streptavidin mit biotinyliertem Peptid komplexiert – Konzentration eines mutmaßlichen 1:4 Komplexes.
** Verglichen mit rekombinantem menschlichem TPO
** 25–30% auf ACE angefärbte Zellen auf Cytospin Kulturen ohne Faktor – ca. 5% auf AChE angefärbte Zellen (geringere Zellularität)

Verbindung			3–5 große Zellen	6–12 große Zellen
Keine Faktoren	1	2	1
Keine Faktoren	2	1	1
1 nM TPO	#1-1	15	6
1 nM TPO	#1-2	12	1
1 nM TPO	#2-1	16	8
1 nM TPO	#2-2	13	3
10 μM Peptid	#1-1	25	10
10 μM Peptid	#1-2	22	8
10 μM Peptid	#2-1	22	7
10 μM Peptid	#2-2	21	10

Claims

Verbindung, welche an einen Thrombopoietin-Rezeptor bindet, wobei die Verbindung (a) ein Molekulargewicht von weniger als 8000 Dalton hat; und (b) eine Bindungsaffinität zu einem Thrombopoietin-Rezeptor ausgedrückt durch einen IC₅₀-Wert von nicht mehr als 100 μM hat; wobei die Verbindung eine Aminosäuresequenz X₈GX₁X₂X₃X₄X₅WX₇ umfasst, wobei X₈ eine der 20 genetisch codierten L-Aminosäuren ist; X₁ P ist; X₂ T ist; X₃ L ist; X₄ R ist; X₅ E oder Q ist; X₇ I oder L ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine Aminosäuresequenz X₉X₈GX₁X₂X₃X₄X₅WX₇ umfasst, wobei X₈ A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T oder V ist; und X₉ A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T oder V ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei X₈ D, E oder K ist; und X₉ A oder I ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GGCADGPTLREWISFCGG; GNADGPTLRQWLEGRRPKN; GGCADGPTLREWISFCGGK; TIKGPTLRQWLKSREHTS; SIEGPTLREWLTSRTPHS; LAIEGPTLRQWLHGNGRDT; CADGPTLREWISFC; und IEGPTLRQWLAARA.
Verbindung, welche an einen Thrombopoietin-Rezeptor bindet, wobei die Verbindung (1) ein Molekulargewicht von weniger als 8000 Dalton hat; und (2) eine Bindungsaffinität zu einem Thrombopoietin-Rezeptor ausgedrückt durch einen IC₅₀-Wert von nicht mehr als 100 μM hat; wobei die Verbindung eine Aminosäuresequenz GGCTLREWLHGGFCGG umfasst.
Verbindung, welche an einen Thrombopoietin-Rezeptor bindet, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Arzneimittel umfassend die Verbindung nach Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Aktivierung des Thrombopoietin-Rezeptors im Menschen.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer hämatologischen Störung.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Störung eine Blutplättchen-Störung oder eine Thrombozytopenie ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Störung Thrombozytopenie infolge von Chemotherapie, Strahlentherapie oder Knochenmarkstransfusionen ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verbindung kovalent an ein nicht-proteinöses Polymer gebunden ist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei das nicht-proteinöse Polymer ausgewählt ist von der Liste: Polyethylenglykol, Polypropylenglykol und Polyoxyalkene.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: