ES2303338T3 - Peptidos y compuestos que se unen a un receptor de trombopoyetina. - Google Patents

Abstract

LOS RECEPTORES SON PEPTIDOS Y PEPTIDO MIMETICOS QUE SE UNEN AL RECEPTOR DE LA TROMBOPOYETINA Y LO ACTIVAN. DICHOS PEPTIDOS Y PEPTIDO MIMETICOS SON UTILES EN LOS METODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS HEMATOLOGICOS Y, ESPECIALMENTE, LA TROMBOCITOPENIA COMO CONSECUENCIA DE LA QUIMIOTERAPIA, RADIOTERAPIA, O TRANSFUSIONES DE LA MEDULA OSEA, ASI COMO EN METODOS DIAGNOSTICOS QUE UTILIZAN PEPTIDOS MARCADOS Y PEPTIDO MIMETICOS.

Description

Péptidos y compuestos que se unen a un receptor de trombopoyetina.

Antecedentes de la invención

La presente invención provee péptidos y compuestos que se unen y activan el receptor de trombopoyetina (c-mpl o TPO-R) o de otro modo actúan como agonistas de TPO. La invención tiene aplicación en los campos de bioquímica y química médica, y particularmente provee agonistas de TPO para uso en el tratamiento de enfermedades humanas.

Los megacariocitos son células derivadas de la médula ósea, responsables de producir las plaquetas de la sangre circulante. Si bien comprenden <0,25% de las células de médula ósea en la mayoría de las especies, tienen >10 veces el volumen de las células de médula ósea típicas. Véase Kuter et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:11104-11108 (1994). Los megacariocitos sufren un proceso conocido como endomitosis mediante el cual replican sus núcleos pero no pueden someterse a la división celular y, en consecuencia, dan lugar a células poliploides. En respuesta a un recuento de plaquetas disminuido, aumenta el índice endomitótico, se forman megacariocitos de ploidia superior, y la cantidad de megacariocitos puede aumentar al triple. Véase Harker J. Clin. Invest. 47:458-465 (1968). En contraste, en respuesta a un recuento de plaquetas elevado, el índice endomitótico disminuye, se forman megacariocitos de ploidia inferior y la cantidad de megacariocitos puede disminuir hasta un 50%.

Se desconoce el mecanismo de retroalimentación fisiológica exacto mediante el cual la masa de plaquetas circulantes regula el índice endomitótico y la cantidad de megacariocitos de médula ósea. Se cree ahora que el factor trombopoyético circulante implicado en la mediación de este circuito de retroalimentación es la trombopoyetina (TPO). Más específicamente, se ha demostrado que la TPO es el regulador humoral principal en situaciones que implican trombocitopenia. Véase, p. ej., Metcalf Nature 369:519-520 (1994). Se ha demostrado en diversos estudios que la TPO aumenta los recuentos de plaquetas, aumenta el tamaño de las plaquetas y aumenta la incorporación de isótopos a las plaquetas de animales receptores. Específicamente, se cree que la TPO afecta la megacariocicopoyesis en diversas formas: (1) produce aumentos en el tamaño y el número de megacariocitos; (2) produce un aumento en el contenido de ADN, en la forma de poliploidia, en megacariocitos; (3) aumenta la endomitosis de los megacariocitos; (4) produce mayor maduración de los megacariocitos; y (5) produce un aumento en el porcentaje de células precursoras, en la forma de pequeñas células acetilcolinesterasa positivas en la médula ósea.

Ya que las plaquetas (trombocitos) son necesarias para la coagulación de la sangre y cuando sus números son muy bajos el paciente está en grave riesgo de muerte por hemorragia catastrófica, la TPO tiene una aplicación potencial útil tanto en el diagnóstico como en el tratamiento de diversos trastornos hematológicos, por ejemplo, enfermedades principalmente debidas a defectos plaquetarios. Los ensayos clínicos en curso con TPO han indicado que la TPO puede administrarse de modo seguro a los pacientes. Además, estudios recientes han proporcionado una base para la proyección de la eficacia de la terapia con TPO en el tratamiento de la trombocitopenia y, particularmente, la trombocitopenia producida por la quimioterapia, radioterapia o trasplante de médula ósea como tratamiento para el cáncer o el linfoma. Véase, p. ej., McDonald (1992) Am. J. Ped. Hematology/Oncology 14:8-21 (1992).

El gen que codifica la TPO ha sido clonado y caracterizado. Véase Kuter et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE,UU. 91:11104-11108 (1994);. Barley et al. Cell 77:1117-1124 (1994); Kaushansky et al. Nature 369:568-571 (1994); Wendling et al. Nature 369:571-574 (1994); y Sauvage et al. Nature 369:533-538 (1994). La tromobopoyetina es una glucoproteína con por lo menos dos formas, con masas moleculares aparentes de 25 kDa y 31 kDa, con una secuencia de aminoácidos N-terminal común. Véase, Bartley et al. Cell 77:1117-1124 (1994). La trombopoyetina parece tener dos regiones distintas separadas por un sitio de escisión Arg-Arg potencial. La región amino-terminal está altamente conservada en el hombre y el ratón, y tiene cierta homología con la eritropoyetina y el interferón-a e interferón-b. La región carboxi-terminal muestra una amplia divergencia entre especies.

Se han descrito las secuencias de ADN y secuencias de péptidos codificados para el TPO-R humano (también conocido como c-mpl). Véase Vigon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:5640-5644 (1992). El TPO-R es un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento de la hematopoyetina, una familia caracterizada por un diseño estructural común del dominio extracelular, que incluye cuatro residuos C conservados en la porción N-terminal y un motivo WSXWS próximo a la región transmembranal. Véase Bazan Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:6934-6938 (1990). Las pruebas de que este receptor cumple un rol funcional en la hematopoyesis incluyen observaciones de que su expresión se restringe al bazo, la médula ósea o el hígado fetal en ratones (véase Souyri et al. Cell 63:1137-1147 (1990)) y a megacariocitos, plaquetas y células CD34^{+} en seres humanos (véase Methia et al. Blood 82:1395-1401 (1993)). Además, la exposición de células CD34^{+} a oligonucleótidos sintéticos antisentido a ARN de mpl inhibe el aspecto de las colonias de megacariocitos sin afectar la formación de colonias eritroides o mieloides. Algunos investigadores postulan que el receptor funciona como homodímero, similar a la situación con los receptores de G-CSF y eritropoyetina.

La disponibilidad de genes clonados para TPO-R facilita la búsqueda de agonistas de este importante receptor. La disponibilidad de la proteína del receptor recombinante permite el estudio de la interacción receptor-ligando en una diversidad de sistemas de generación de péptidos aleatorios y semialeatorios. Estos sistemas incluyen el sistema "péptidos en plásmidos" descrito en las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.270.170 y 5.338.665; el sistema "péptidos en fago" descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/718.577, presentada el 20 de Junio de 1991, la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/541.108, presentada el 20 de Junio de 1990, y en Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:6378-6382 (1990); el sistema "polisoma" descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/300.262, presentada el 2 de Septiembre de 1994, que es una solicitud de continuación en parte basada en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/144.775, presentada el 29 de Octubre de 1993, y PCT WO 95/11992; el sistema "colección sintética codificada" descrito en las Solicitudes de Patente de EE.UU. N^{os} de Serie 08/146,886, presentada el 12 de Noviembre de 1993, 07/946,239, presentada el 16 de Septiembre de 1992 y 07/762,522, presentada el 18 de Septiembre de 1991; y el sistema "síntesis de polímeros inmovilizados a muy gran escala" descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.143.854; Publicación de Patente PCT Nº 90/15070, publicada el 13 de Diciembre de 1990; Solicitud de Patente de EE.UU. Nº 07/624,120, presentada el 6 de Diciembre de 1990; Fodor et al. Science 251:767-773 (2/1991); Dower y Fodor Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-280 (1991); y Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/805.727, presentada el 6 de Diciembre de 1991.

La lenta recuperación de los niveles de plaquetas en pacientes que sufren de trombocitopenia es un problema grave, y tiene suma urgencia la búsqueda de un agonista del factor de crecimiento de la sangre capaz de acelerar la regeneración de las plaquetas. La presente invención provee dicho agonista.

El documento LUBB573A (Genentech) describe ciertos polipéptidos de trombopoyetina que son ligandos para el receptor de citocina mpl y se reivindican como útiles para tratar la trombocitopenia y afecciones relacionadas.

Compendio de la invención

La presente invención provee un compuesto que se une al receptor de trombopoyetina, teniendo dicho compuesto

(1) un peso molecular inferior a aproximadamente 8000 daltons, y

(2) una afinidad de unión al receptor de trombopoyetina según lo expresado por CI_{50} de no más de aproximadamente 100 \mum, en donde dicho compuesto comprende una secuencia de aminoácidos:

X_{8}GX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}X_{5}WX_{7}

en donde X_{8} es cualquiera de los 20 L-aminoácidos genéticamente codificados; X_{1} es P; X_{2} es T; X_{3} es L; X_{4} es R; X_{9} es E o Q; X_{7} es I o L.

En otro aspecto, la presente invención provee un compuesto que se une al receptor de trombopoyetina, teniendo dicho compuesto:

(1) un peso molecular inferior a aproximadamente 8000 daltons, y

(2) una afinidad de unión al receptor de trombopoyetina según lo expresado por CI_{50} de no más de aproximadamente 100 \mum, en donde dicho compuesto comprende una secuencia de aminoácidos:

GGCTLREWLHGGFCOG.

En otro aspecto, la presente invención provee un compuesto que se une al receptor de trombopoyetina, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en

1

La presente invención se refiere, en parte, al descubrimiento nuevo e inesperado de que los péptidos y miméticos de péptidos de bajo peso molecular tienen fuertes propiedades de unión al TPO-R y pueden activar el TPO-R. Por consiguiente, dichos péptidos y miméticos de péptidos son útiles para propósitos terapéuticos a fin de tratar afecciones mediadas por TPO (p. ej., trombocitopenia producida por quimioterapia, radioterapia o transfusiones de médula ósea) como también propósitos diagnósticos para estudiar el mecanismo de la hematopoyesis, y para la expansión in vitro de megacariocitos y células progenitoras comprometidas.

Los péptidos y miméticos de péptidos adecuados para propósitos terapéuticos y/o diagnósticos tienen un CI_{50} de aproximadamente 2 mM o menos, según lo determinado por el ensayo de afinidad de unión expuesto en el Ejemplo 3 a continuación, en donde un CI_{50} inferior se correlaciona con una afinidad de unión a TPO-R más fuerte. Para fines farmacéuticos, los péptidos y peptidomiméticos tienen un CI_{50} de no más de aproximadamente 100 \mum, más preferiblemente no más de 500 nM. En una realización preferida, el peso molecular del péptido o mimético de péptido es de aproximadamente 250 a aproximadamente 8000 daltons.

Cuando se usan para fines diagnósticos, los péptidos y miméticos de péptidos preferiblemente se marcan con un marcador detectable y, en consecuencia, los péptidos y los miméticos de péptidos sin dicho marcador sirven como intermedios en la preparación de péptidos marcados y miméticos de péptidos.

Los péptidos que satisfacen los criterios definidos para peso molecular y afinidad de unión hacia TPO-R comprenden 9 o más aminoácidos en donde los aminoácidos son aminoácidos naturales o sintéticos (no naturales). Los miméticos de péptidos incluyen péptidos que tienen una o más de las siguientes modificaciones:

péptidos en los que una o más de uno de los enlaces peptidilo [-C(O)NR-] (uniones) han sido reemplazados por enlaces no peptidilo, como enlace -CH_{2}-carbamato [-CH_{2}-OC(O)NR-]; un enlace fosfonato; un enlace -CH_{2}-sulfonamida [-CH_{2}-S(O)_{2}NR-]; un enlace urea [-NHC(O)NH-]; un enlace -CH_{2}-amina secundaria; o un enlace peptidilo alquilado [-C(O)NR^{6}- en donde R^{6} es alquilo inferior];

péptidos en los que el término N deriva a un grupo -NRR^{1}; a un grupo -NRC(O)R; a un grupo -NRC(O)OR; a un grupo -NRS (O)_{2}R; a un grupo -NHC(O)NHR, en donde R y R^{1} son hidrógeno o alquilo inferior, con la salvedad que R y R^{1} no son ambos hidrógeno; a un grupo succinimida; a un grupo benciloxicarbonil-NFi- (CH32-NH-); o a un grupo benciloxicarbonil-NH- que tiene entre 1 y 3 sustituyentes en el anillo fenilo seleccionados del grupo que consiste en alquilo inferior, alcoxi inferior, cloro y bromo; o

péptidos en los que el término C deriva a -C(O)R^{3}, en donde R^{3} se selecciona del grupo que consiste en alcoxi inferior, y -NR^{3}R^{4}, en donde R^{3} y R^{4} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior.

Por consiguiente, los péptidos y miméticos de péptidos preferidos comprenden un compuesto que tiene:

(1) un peso molecular inferior a aproximadamente 5000 daltons, y

(2) una afinidad de unión hacia TPO-R según lo expresado por CI_{50} de no más de aproximadamente 100 \mum,

en donde de cero a todos los enlaces -C(O)NH- del péptido han sido reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste en un enlace -CH_{2}OC(O)NR-; un enlace fosfonato; un enlace -CH_{2}S(O)_{2}NR-; un enlace -CH_{2}NR-; y un enlace -C(O)NR^{6}-; y un enlace -NHC(O)NH-, en donde R es hidrógeno o alquilo inferior, y R^{5} es alquilo inferior,

donde además el término N de dicho péptido o mimético de péptido se selecciona del grupo que consiste en un grupo -NRR^{1}; un grupo -NRC(O)R; un grupo -NRC(O)OR; un grupo -NRS(O)_{2}R; un grupo -NHC(O)NHR; un grupo succinimida; un grupo benciloxicarbonil-NH-; y un grupo benciloxicarbonil-NH- que tiene entre 1 y 3 sustituyentes en el anillo fenilo seleccionados del grupo que consiste en alquilo inferior, alcoxi, cloro y bromo, en donde R y R^{1} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior,

e incluso en donde el término C de dicho péptido o mimético de péptido tiene la fórmula -C(O)R^{2}, en donde R^{2} se selecciona del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi inferior y -NR^{3}R^{4}, en donde R^{3} y R^{4} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior y en donde el átomo de nitrógeno del grupo -NR^{3}R^{4} puede ser opcionalmente el grupo amina del término N del péptido, como para formar un péptido cíclico,

y sales fisiológicamente aceptables de los mismos.

En una realización relacionada, la invención se refiere a un péptido o mimético de péptido marcado que comprende un péptido o mimético de péptido como se describió anteriormente, que tiene un marcador covalentemente unido al mismo, capaz de detección.

Los péptidos particularmente preferidos incluyen: GGCADGPTLREWISFCGG; GNADGPTLRQWLEGRRPKN; GGCADGPTLREWISFCGGK; TIKGPTLRQWLKSREHTS; SIEGPTLREWLTSRTPHS; LAIEGPTLRQWLHGNGRDT; CADGPTLREWISFC; y IEGPTLRQWLAARA.

Los compuestos descritos en este documento son útiles para la prevención y el tratamiento de enfermedades mediadas por TPO, y particularmente para tratar trastornos hematológicos que incluyen, aunque sin limitarse a ello, trombocitopenia producida por quimioterapia, radioterapia o transfusiones de médula ósea. Por tanto, la presente invención es útil para tratar, en donde un paciente que tiene un trastorno susceptible al tratamiento con un agonista de TPO recibe, o se le administra, una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención.

La invención también provee composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos descritos en este documento y un vehículo fisiológicamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden tener una diversidad de formas que incluyen formas de administración oral, como también polvos y disoluciones inhalables, y disoluciones inyectables e infundibles.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-B ilustran los resultados de un ensayo funcional en presencia de diversos péptidos; el ensayo se describe en el Ejemplo 2. La Figura 1A es una representación gráfica de los resultados del ensayo de proliferación de células Ba/F3 transfectadas con TPO-R para péptidos seleccionados de la invención:

\blacksquare

designa los resultados para G G C A D G P T L R E W I S F C G G K (biotina);

X

designa los resultados para G G C A D G P T L R E W I S F C G G;

\ding{115}

designa los resultados para L A I E G P T L R Q W L H G N G R D T;

\medcirc

designa los resultados para G N A D G P T L R Q W L E G R R P K N; y

+

designa los resultados para T I K G P T L R Q W L K S R E H T S.

La Figura 1B es una representación gráfica de los resultados con los mismos péptidos y la línea celular parental.

La Figura 2A-C muestra los resultados de la oligomerización de péptidos usando el ensayo de proliferación de células Ba/F3 transfectadas con TPO-R. La Figura 2A muestra los resultados del ensayo del péptido biotinilado complejo (AF 12285 con estreptavidina (SA)) tanto para las líneas celulares transfectadas como parentales.

La Figura 2B muestra los resultados del ensayo del péptido biotinilado libre (AF 12295) tanto para las líneas celulares transfectadas como parentales. La Figura 2C muestra los resultados del ensayo para estreptavidina sola tanto para las líneas celulares transfectadas como parentales.

Las Figuras 3A-G muestran los resultados de una serie de experimentos de control que muestran la actividad de la TPO, los péptidos de la presente invención, EPO y péptidos de unión a EPO-R en un ensayo de proliferación celular que usa o bien la línea celular Ba/F3 transfectada con TPO-R y su línea parental correspondiente, o una línea celular dependiente de EPO. La Figura 3A representa los resultados para TPO en el ensayo de proliferación celular, usando la línea celular Ba/F3 transfectada con TPO-R y su línea parental correspondiente. La Figura 3B representa los resultados para EPO en el ensayo de proliferación celular, usando la línea celular Ba/F3 transfectada con TPO-R y su línea parental correspondiente. La Figura 3C representa los resultados del péptido biotinilado complejo (AF 12285 con estreptavidina (SA)) y una forma compleja de un péptido de unión a EPO-R biotinilado (AF 11505 con SA) en la línea celular Ba/F3 transfectada con TPO-R. Los resultados para la línea celular parental correspondiente se muestran en la Figura 3D. La Figura 3E representa los resultados para TPO en el ensayo de proliferación celular que usa la línea celular dependiente de EPO. La Figura 3G representa los resultados del péptido biotinilado que forma complejo (AF 12885 con estreptavidina (SA)) y una forma compleja de un péptido de unión a EPO-R biotinilado (AF 17.505 con SA) en la línea celular dependiente de EPO.

Las Figuras 4A-C ilustran la construcción de colecciones de péptidos en plásmidos en el vector pJS142. La Figura 4A muestra un mapa de restricción y posición de los genes. El plásmido de la colección incluye el finalizador transcripcional rrnB, el gen bla para permitir la selección en ampicilina, la región intragénica del fago M13 (M13 IG) para permitir el rescate de ADN monocatenario, origen de replicación de plásmidos (ori), dos secuencias lacO_{s}, y el gen araC para permitir la regulación positiva y negativa del promotor araB que impulsa la expresión del gen de fusión lac. La Figura 4B muestra la secuencia de la región de clonación en el extremo 3' del gen lac I, incluyendo los sitios SfiI y EagI utilizados durante la construcción de la colección. La Figura 4C muestra la ligadura de oligonucleótidos de colección renaturalizados, ON-229 y ON-830, a sitios SfiI de pJS142 para producir una colección. Los espacios sencillos en la secuencia indican sitios de ligadura.

Las Figuras 5A-B ilustran la clonación a los vectores pELM3 y pELM15 MBP. La Figura 5A muestra la secuencia en el extremo 3' del gen de fusión malE, incluyendo la secuencia codificante MBP, el enlazador poli asparagina, el sitio de escisión del factor Xa proteasa, y los sitios de clonación disponibles. Las porciones restantes de los vectores derivan de pMALc2 (pELM3) y pMALp2 (pELM15), comercializados por New England Biolabs. La Figura 5B muestra la secuencia de los vectores después de la transferencia del fragmento de la colección BspEII-ScaI hacia pELM3/pELM15 con digestión de AgeI-ScaI. La secuencia transferida incluye la secuencia que codifica el enlazador del péptido GGG de la colección pJS142.

La Figura 6A representa un mapa de restricción y posición de los genes para la construcción de colecciones diméricas de cabecera en el vector pCMG14. El plásmido de la colección incluye: el finalizador transcripcional rrnB, el gen bla para permitir la sección en ampicilina, la región intragénica del fago M13 (M13 IG) para permitir el rescate de ADN monocatenario, un origen de replicación de plásmidos (ori), una secuencia lacO_{s} y el gen araC para permitir la regulación positiva y negativa del promotor araB que conduce la expresión del gen de fusión de dímeros de cabecera. La Figura 6B representa la secuencia de la región de clonación en el extremo 3' del gen dimérico de cabecera, incluyendo los sitios SfiI y EagI utilizados durante la construcción de la colección. La Figura 6C muestra la ligadura de ON-1679, ON-829 y ON-830 renaturalizados a sitios SfiI de pCMG14 para producir una colección. Los espacios sencillos en la secuencia indican sitios de ligadura.

Las Figuras 7 a 9 muestran los resultados de otros ensayos que evalúan la actividad de los péptidos y miméticos de péptidos de la invención. En este ensayo, los ratones se tornan trombocitopénicos con carboplatino. La Figura 7 representa los resultados típicos cuando se tratan ratones Balb/C con carboplatino (125 mg/kg por vía intraperitoneal) en el Día 0. Las líneas punteadas representan los animales no tratados de tres experimentos. La línea continua representa grupos tratados con carboplatino en tres experimentos. Las líneas continuas resaltadas representan datos históricos. La Figura 8 representa el efecto de la valoración del carboplatino en los recuentos de plaquetas en ratones creados con las cantidades indicadas de carboplatino (en mg/kg, por vía intraperitoneal (ip) en el Día 0). La Figura 9 representa el alivio de la trombocitopenia inducida por carboplatino en el Día 10 mediante el péptido AF12513 (513). El carboplatino (CBP; 50-125 mg/kg, por vía intraperitoneal) se administró en el Día 0. Se administró AF12513 (1 mg/kg, ip) en los Días 1-9.

Descripción de las realizaciones específicas I. Definiciones y parámetros generales

Las siguientes definiciones se exponen para ilustrar y definir el significado y alcance de los diversos términos utilizados para describir la invención en este documento.

"Agonista" se refiere a un ligando biológicamente activo que se une a su receptor biológicamente activo complementario y activa este último o bien para causar una respuesta biológica en el receptor o para potenciar una actividad biológica pre-existente del receptor.

"Sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales no tóxicas de metal alcalino, metal alcalino térreo y de amonio, comúnmente utilizadas en la industria farmacéutica, que incluyen sales de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, bario, amonio y protamina zinc, preparadas por métodos conocidos en la técnica. La expresión también incluye sales de adición de ácido no tóxicas, que en general se preparan haciendo reaccionar los compuestos de la presente invención con un ácido orgánico o inorgánico adecuado. Las sales representativas incluyen hidrocloruro, sulfato de hidrobromuro, sulfato, bisulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, napsilato y similares.

"Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia biológica y las propiedades de las bases libres y que no son biológicamente o de algún otro modo indeseables, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido o-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares. Para una descripción de sales de adición de ácido o profármacos farmacéuticamente aceptables, véase Bundgaard, H., supra.

"Éster farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos ésteres que retienen, tras hidrólisis de la unión éster, la eficacia biológica y las propiedades del ácido carboxílico o alcohol y no son biológicamente o de algún otro modo indeseables. Para una descripción de ésteres farmacéuticamente aceptables como profármacos, véase Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estos ésteres típicamente se forman a partir del ácido carboxílico correspondiente y un alcohol. En general, la formación del éster se puede lograr por técnicas sintéticas convencionales. (Véase, p. ej., March Advanced Organic Chemistry, 3ª Ed., John Wiley &: Sons, New York (1985) p. 1157 y referencias allí citadas, y Mark et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). El componente alcohol del éster en general comprenderá (i) un alcohol alifático C_{2}-C_{12} que puede o no contener uno o más enlaces dobles y puede contener o no carbonos ramificados o (ii) alcoholes C_{7}-C_{12} aromáticos o heteroaromáticos. La presente invención también contempla el uso de aquellas composiciones que son los ésteres descritos en la presente memoria y al mismo tiempo son sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables.

"Amida farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas amidas que retienen, tras la hidrólisis de la unión amida, la eficacia biológica y las propiedades del ácido carboxílico o la amina y no son biológicamente ni de algún otro modo indeseables. Para una descripción de amidas farmacéuticamente aceptables como profármacos, véase Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estas amidas típicamente se forman a partir del ácido carboxílico correspondiente y una amina. En general, la formación de la amida se puede lograr por técnicas sintéticas convencionales. (Véase, p. ej., March Advanced Organic Chemistry, 3ª Ed., John Wiley & Sons, New York (1385) p. 1152 y Mark et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). La presente invención también contempla el uso de aquellas composiciones que son tanto las amidas descritas en la presente memoria como al mismo tiempo sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables.

"Vehículo farmacéutica o terapéuticamente aceptable" se refiere a un medio de vehículo que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos y que no es tóxico para el hospedante o el paciente.

"Estereoisómero" se refiere a un compuesto químico que tiene el mismo peso molecular, composición química y constitución que otro, pero con los átomos agrupados de modo diferente. Es decir, determinados restos químicos idénticos están en orientaciones diferentes en el espacio y, por tanto, cuando están puros, tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada. No obstante, algunos estereoisómeros puros pueden tener una rotación óptica tan leve que es casi indetectable con la presente instrumentación. Los compuestos de la presente invención pueden tener uno o más átomos de carbono asimétricos y, por tanto, incluir diversos estereoisómeros. Todos los estereoisómeros se incluyen dentro del alcance de la invención.

"Cantidad terapéutica o farmacéuticamente eficaz", como se aplica a las composiciones de la presente invención, se refiere a la cantidad de composición suficiente como para inducir un resultado biológico deseado. Ese resultado puede ser el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. En la presente invención, el resultado típicamente implicará una disminución en las respuestas inmunológicas y/o inflamatorias a la infección o lesión tisular.

Los residuos de aminoácidos en péptidos se abrevian de la siguiente manera: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es Ile o I; metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Ácido aspártico es Asp o D; Ácido glutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptófano es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G. Además, Bu es Butoxi, Bzl es bencilo, CHA es ciclohexilamina, Ac es acetilo, Me es metilo, Pen es penicilamina, Aib es ácido aminoisobutírico, Nva es norvalina, Abu es ácido aminobutírico, Thi es tienilamina, OBn es O-bencilo y hyp es hidroxiprolina.

Además de péptidos que consisten solamente en aminoácidos naturales, se proveen también miméticos de péptidos o análogos de péptidos. Los análogos de péptidos comúnmente se utilizan en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellos del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos" (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Se pueden utilizar miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente o potenciado. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica), tal como un polipéptido unido al receptor natural, pero que tiene uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados con un enlace seleccionado del grupo que consiste en: -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}-, y -CH_{2}SO-, por métodos conocidos en la técnica y también descritos en las siguientes referencias: Spatola, A.F. en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A.F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Edición 3, Peptide Backbone Modifications (revisión general); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468 (revisión general); Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (-CH_{2}NH-, CH_{2}CH_{2}-); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (-CH_{2}-S); Hann J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314 (1982) (-CH-CH-, cis y trans); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (-COCH_{2}-): Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (-COCH_{2}-); Szelke et al. European Appln. EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH_{2},-); Holladay et al. Tetrahedron Lett 24:4401-4404 (1983) (-C(OH)CH_{2}-); y Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (-CH,-S-). Un enlace no peptídico particularmente preferido es -CH_{2}NH-. Dichos miméticos de péptidos pueden tener ventajas significativas sobre las realizaciones de polipéptidos, incluyendo, por ejemplo: producción más económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas mejoradas (semivida, absorción, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (p. ej., un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida y otras. El marcado de peptidomiméticos usualmente implica la unión covalente de uno o más marcadores, directamente o a través de un espaciador (p. ej., un grupo amida), a una posición o posiciones no interfirientes en el peptidomimético que se predicen por datos de actividad de estructura cuantitativos y/o modelado molecular. Dichas posiciones no interfirientes en general son posiciones que no forman directamente contactos con la macromolé-
cula(s) (p. ej., moléculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas) a las que se une el peptidomimético para producir el efecto terapéutico. La derivatización (p. ej., marcado) de peptidomiméticos no debe interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del peptidomimético. En general, los peptidomiméticos de péptidos que se unen a receptores se unen al receptor con gran afinidad y poseen actividad biológica detectable (es decir, son agonistas o antagonistas a uno o más cambios fenotípicos mediados por los receptores).

La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos limitados que comprenden una secuencia de consenso o una variación en la secuencia de consenso sustancialmente idéntica pueden generarse por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, añadiendo residuos cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

Aminoácidos sintéticos o no naturales se refiere a aminoácidos que no ocurren naturalmente in vivo pero que, no obstante, pueden incorporarse a las estructuras peptídicas descritas en el presente documento. Los aminoácidos sintéticos preferidos son los D-a-aminoácidos del L-a-aminoácido natural, como también D- y L-a-aminoácidos no naturales representados por la fórmula H_{2}NCHR^{5}COOH, en la que R^{5} es 1) un grupo alquilo inferior, 2) un grupo cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, 3) un heterociclo de 3 a 7 átomos de carbono y 1 a 2 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, azufre y nitrógeno, 4) un residuo aromático de 6 a 10 átomos de carbono que opcionalmente tiene entre 1 y 3 sustituyentes en el núcleo aromático seleccionados entre el grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi inferior, amino y carboxilo, 5) -alquilen-Y, donde alquileno es un grupo alquileno de 1 a 7 átomos de carbono y Y se selecciona entre el grupo que consiste en (a) hidroxi, (b) amino, (c) cicloalquilo y cicloalquenilo de 3 a 7 átomos de carbono, (d) arilo de 6 a 10 átomos de carbono que opcionalmente tiene entre 1 y 3 sustituyentes en el núcleo aromático seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi inferior, amino y carboxilo, (e) heterociclilo de 3 a 7 átomos de carbono y 1 a 2 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, azufre y nitrógeno, (f) -C(O)R^{2} en donde R^{2} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior y -NR^{3}R^{4} en donde R^{3} y R^{4} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior, (g) -S(O)_{n}R^{6} en donde n es un entero entre 1 y 2, y R^{6} es alquilo inferior, y con la salvedad que R^{5} no define una cadena lateral de un aminoácido natural.

Otros aminoácidos sintéticos preferidos incluyen aminoácidos en los que el grupo amino está separado del grupo carboxilo por más de un átomo de carbono como \beta-alanina, ácido \gamma-aminobutírico y similares.

Los aminoácidos sintéticos particularmente preferidos incluyen, a modo de ejemplo, D-aminoácidos de L-aminoácidos naturales, L-1-naftil-alanina, L-2-naftilalanina, L-ciclohexilalanina, L-2-aminoácido isobutírico, los derivados de sulfóxido y sulfona de metionina (es decir, HOOC-(H_{2}NCH)CH_{2}CH_{2}-S(O)_{n}R^{6}) en donde n y R_{6} son como se definió anteriormente, como también el derivado alcoxi inferior de metionina (es decir, HOOC-(H_{2}NCH)CH_{2}CH_{2}-OR^{6} donde R^{6} es como se definió anteriormente).

"Marcador detectable" se refiere a materiales, que cuando se unen covalentemente a los péptidos y miméticos de péptidos de la presente invención, permiten la detección del péptido y de los miméticos de péptidos in vivo en el paciente al que se ha administrado el péptido o el mimético de péptido. Los marcadores detectables adecuados se conocen en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo, radioisótopos, marcadores fluorescentes (p. ej., fluoresceína) y similares. El marcador detectable particular empleado no es crítico y se selecciona en relación con la cantidad de marcador que se ha de emplear como también en relación con la toxicidad del marcador y la cantidad de marcador empleada. La selección del marcador en relación con dichos factores se conoce en la técnica.

La unión covalente del marcador detectable al péptido o mimético de péptido se logra por métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, cuando se emplea el radioisótopo ^{125}I como el marcador detectable, la unión covalente de ^{125}I al péptido o mimético de péptido se puede lograr incorporando la tirosina de aminoácido al péptido o mimético de péptido y luego yodando el péptido. Si la tirosina no está presente en el péptido o mimético de péptido, la incorporación de tirosina al término N o C del péptido o mimético de péptido se puede lograr por química conocida. Asimismo, se puede incorporar ^{32}P al péptido o mimético de péptido como un resto fosfato, por ejemplo, a través de un grupo hidroxilo en el péptido o mimético de péptido, usando química convencional.

II. Panorama

La presente invención provee compuestos que se unen y activan el TPO-R o de otra forma se comportan como agonistas de TPO. Estos compuestos incluyen compuestos peptídicos "iniciales" y compuestos "derivados" construidos como para tener la misma o similar estructura molecular o forma que los compuestos iniciales pero diferir de los compuestos iniciales o bien con respecto a susceptibilidad a hidrólisis o proceólisis y/o con respecto a otras propiedades biológicas, como mayor afinidad hacia el receptor. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un agonista de TPO, y más particularmente un compuesto, que es útil para tratar trastornos hematológicos y, particularmente, trombocitopenia asociada con quimioterapia, radioterapia o transfusiones de médula ósea.

III. Identificación de agonistas de TPO

Los péptidos que tienen una afinidad hacia el TPO-R pueden identificarse fácilmente por sistemas que generan diversidad de péptidos aleatorios acoplados con un procedimiento de enriquecimiento de afinidad.

Específicamente, los sistemas que generan diversidad de péptidos aleatorios incluyen el sistema "péptidos en plásmidos" descrito en las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.270.170 y 5.338.665; el sistema "péptidos en fago" descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/718.577, presentada el 20 de Junio de 1991, que es una solicitud de continuación en parte de la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/541.108, presentada el 20 de Junio de 1990, y en Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:6378-6382 (1980); el sistema "polisoma" descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/300.262, presentada el 2 de Septiembre de 1994, que es una solicitud de continuación en parte basada en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/144.775, presentada el 29 de Octubre de 1993, y PCT WO 95/11992; el sistema de "colección sintética codificada (ESL)" descrito en la Solicitud de patente de EE.UU. Nº de Serie 08/146.886, presentada el 12 de Noviembre de 1993, que es una solicitud de continuación en parte de la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/946.239, presentada el 16 de Septiembre de 1992, que es una solicitud de continuación en parte de la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/762.522, presentada el 18 de Septiembre de 1991; y el sistema "síntesis de polímeros inmovilizados a muy gran escala" descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.143.854; Publicación de Patente PCT Nº 90/15070, publicada el 13 de Diciembre de 1990; Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/524.20, presentada el 6 de Diciembre de 1990; Fodor et al. Science 251:767-773 (2/1991); Dower y Fodor Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180 (1991); y Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/805.727, presentada el 6 de Diciembre de 1991.

Usando los procedimientos anteriormente descritos, se designaron en general péptidos aleatorios para tener un número definido de residuos de aminoácidos en longitud (p. ej., 12). Para generar la colección de oligonucleótidos que codifica los péptidos aleatorios, se usó el motivo del codón (NNK)x, en donde N es el nucleótido A, C, G o T (equimolar; dependiendo de la metodología empleada, se pueden emplear otros nucleótidos), K es G o T (equimolar), y x es un entero correspondiente al número de aminoácidos en el péptido (p. ej., 12), para especificar cualquiera de los 32 codones posibles resultantes del motivo NNK: 1 para cada uno de los 12 aminoácidos, 2 para cada uno de los 5 aminoácidos, 3 para cada uno de los 3 aminoácidos, y solamente uno de los tres codones de terminación. Por tanto, el motivo NNK codifica todos los aminoácidos, codifica solamente un codón de terminación y reduce el sesgo del codón.

En los sistemas empleados, los péptidos aleatorios fueron representados o bien en la superficie de la partícula del fago, como parte de una proteína de fusión que comprende la proteína de recubrimiento pIII o pVIII de un derivado del fago fd (péptidos en fago) o como una proteína de fusión con la proteína de fusión del péptido LacI unida a un plásmido (péptidos en plásmidos).

El fago o los plásmidos, incluyendo el ADN que codifica los péptidos, se identificaron y aislaron por un procedimiento de enriquecimiento por afinidad, usando el TPO-R inmovilizado. El procedimiento de enriquecimiento por afinidad, algunas veces denominado "panning", implica múltiples tandas de incubación del fago, los plásmidos o los polisomas con el receptor inmovilizado, recogiendo el fago, los plásmidos o los polisomas que se unen al receptor (junto con el ADN o el ARNm acompañante), y produciendo más del fago o los plásmidos (junto con la proteína de fusión del péptido LacI acompañante) recogidos. El dominio extracelular (ECD) del TPO-R típicamente se usó durante el procedimiento de selección por afinidad.

Después de varias tandas de enriquecimiento por afinidad, el fago o los plásmidos y los péptidos acompañantes se examinaron por ELISA para determinar si los péptidos se unen específicamente al TPO-R. Este ensayo se llevó a cabo de modo similar a los procedimientos utilizados en el procedimiento de enriquecimiento por afinidad, excepto que después de eliminar el fago no unido, los pocillos se trataron típicamente con anticuerpo de conejo anti-fago, luego con anticuerpo anticonejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (AP). La cantidad de fosfatasa alcalina en cada pocillo se determinó por métodos convencionales. Un procedimiento ELISA similar para uso en el sistema de péptidos y plásmidos se describe en detalle a continuación.

Comparando los pocillos de prueba con los pocillos de control (sin receptor), se puede determinar si las proteínas de fusión se unen al receptor específicamente. Los agrupamientos de fago que se unieron al TPO-R se detectaron en un formato de sonda con siembra por réplica, usando un receptor monovalente radiomarcado. Esta sonda puede producirse usando proteína cinasa A para fosforilar una secuencia de péptidos condensada al término C del receptor soluble. La forma "genéticamente modificada" del receptor de TPO se expresa entonces en células hospedantes, típicamente células CHO. Después de la cosecha PI-PLC de los receptores, se probó la unión del receptor a clones del fago específico de TPO o TPO-R. El receptor se marcó luego con alta actividad específica con ^{33}P para uso como sonda monovalente para identificar ligandos de gran afinidad usando siembras por réplica.

Los péptidos que se unieron específicamente al receptor se sintetizaron luego como el péptido libre (p. ej., sin fago) y se ensayaron en un ensayo en bloque. El ensayo en bloque se llevó a cabo en un modo similar al ELISA, excepto que se añadió el TPO o un péptido de referencia a los pocillos antes de la proteína de fusión (los pocillos de control eran de dos tipos: (1) sin receptor; y (2) sin TPO ni péptido de referencia). Las proteínas de fusión para las cuales se bloqueó la unión al receptor por la TPO o el péptido de referencia contienen péptido en la porción peptídica aleatoria que son compuestos preferidos de la invención.

El TPO-R, como también su dominio extracelular, se produjeron en células hospedantes recombinantes. Una forma útil de TPO-R se construye expresando la proteína como una proteína soluble en células hospedantes transformadas con baculovirus, usando métodos convencionales; otra forma útil se construye con un péptido de señal para secreción de proteínas y para unión de anclaje de membranas de glucofosfolípidos. Esta forma de unión de anclaje se denomina "PIG-tailing"- véanse Caras and Wendell Science 243:1196-1198 (1989) y Lin et al. Science 249:677-679
(1990).

Usando el sistema PIG-tailing, se puede escindir el receptor de la superficie de las células que expresan el receptor (p. ej., células CHO transformadas seleccionadas para expresión de alto nivel del receptor con un clasificador celular) con fosfolipasa C. El receptor escindido todavía comprende una secuencia carboxiterminal de aminoácidos, llamada "extremo HPAP", de la proteína de señal para la unión de membrana y puede inmovilizarse sin purificación adicional. La proteína del receptor recombinante puede inmovilizarse recubriendo los pocillos de las placas de microvaloración con un anticuerpo anti-extremo HPAP (Ab 179 o MAb 179), bloqueando la unión no específica con albúmina de suero bovino (BSA) en PBS, y luego uniendo el receptor recombinante escindido al anticuerpo. Usando este procedimiento, uno debería realizar la reacción de inmovilización en concentraciones variables del receptor para determinar la cantidad óptima para una preparación determinada, ya que diferentes preparaciones de proteína recombinante a menudo contienen diferentes cantidades de la proteína deseada. Además, se debe asegurar que el anticuerpo inmovilizante esté completamente bloqueado (con TPO o algún otro compuesto bloqueante) durante el procedimiento de enriquecimiento por afinidad. De lo contrario, el anticuerpo no bloqueado puede unirse a un fago no deseado durante el procedimiento de enriquecimiento por afinidad. Se pueden usar péptidos que se unen al anticuerpo inmovilizante para bloquear sitios no unidos que permanecen después de la inmovilización del receptor para evitar este problema, o se puede inmovilizar simplemente el receptor directamente a los pocillos de las placas de microvaloración, sin la ayuda de un anticuerpo inmovilizante. Véase la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/947.339, presentada el 18 de Septiembre de 1992.

Cuando se usan sistemas de generación de péptidos aleatorios que permiten la interacción multivalente ligando-receptor, se debe reconocer que la densidad del receptor inmovilizado es un factor importante para determinar la afinidad de los ligandos que pueden unirse al receptor inmovilizado. En densidades superiores del receptor (p. ej., cada pocillo recubierto con anticuerpo anti-receptor tratado con 0,25 a 0,5 mg de receptor), es más probable que ocurra la unión multivalente que en densidades inferiores del receptor (p. ej., cada pocillo recubierto con anticuerpo anti-receptor tratado con 0,5 a 1 ng del receptor). Si ocurre la unión multivalente, entonces será más posible aislar los ligandos con una afinidad relativamente inferior, a menos que se usen altas densidades de receptor inmovilizado para identificar compuestos iniciales y que se usen densidades inferiores del receptor para aislar compuestos derivados de afinidad superior.

Para discriminar entre péptidos de afinidad superior, frecuentemente se utiliza una sonda de receptores monovalentes. Esta sonda puede producirse usando proteína cinasa A para fosforilar una secuencia de péptidos condensada al término C del receptor soluble. La forma "modificada" del receptor de TPO se expresa entonces en células hospedantes, típicamente células CHO. Después de la cosecha PI-PLC de los receptores, se prueba la unión del receptor a clones del fago específico de TPO o TPO-R. El receptor luego se marca para actividad altamente específica con ^{33}P para uso como una sonda monovalente a fin de identificar ligandos de gran afinidad usando siembras por
réplica.

Los métodos de detección preferidos para facilitar la identificación de péptidos que se unen al TPO-R implican primero identificar los péptidos iniciales que se unen al dominio extracelular del receptor y luego hacer que otros péptidos se asemejen a los péptidos iniciales. Específicamente, usando una píldora o sistema de péptidos en fago basados en pVIII, puede detectarse una colección aleatoria para descubrir un fago que represente un péptido que se una a TPO-R. Los ADN de los fagos se secuencian para determinar las secuencia de los péptidos exhibidos en la superficie de los fagos.

Los clones capaces de unión específica al TPO-R se identificaron a partir de una colección 10-mer pVIII aleatoria, lineal y de colecciones cíclicas aleatorias 10-mer y 12-mer pVIII. Las secuencias de estos péptidos sirven como base para la construcción de otras colecciones de péptidos diseñadas para contener una alta frecuencia de derivados de los péptidos inicialmente identificados. Estas colecciones pueden sintetizarse como para favorecer la producción de péptidos que difieren del péptido de unión en solamente algunos residuos. Este planteamiento implica la síntesis de un oligonucleótido con la secuencia codificante del péptido de unión, excepto que en lugar de usar preparaciones puras de cada uno de los cuatro trifosfatos de nucleósido en la síntesis, se usan mezclas de los cuatro trifosfatos de nucleótidos (es decir, 55% del nucleótido "correcto", y 15% de cada uno de los otros tres nucleótidos consisten en una mezcla preferida para este propósito y 70% del nucleótido "correcto" y 10% de cada uno de los otros tres nucleótidos consisten en otra mezcla preferida para este propósito) como para generar derivados de la secuencia codificante del péptido de unión.

Se usó una diversidad de estrategias para derivar los péptidos iniciales realizando colecciones de "mutagénesis en un tema". Éstas incluyeron una colección de mutagénesis del fagémido pVIII basada en la secuencia de consenso mutagenizada a una frecuencia de 70:10:10:10 y extendida en cada término con residuos aleatorios para producir clones que codifican la secuencia XXXX (C, S, P o R) TLREWL XXXXXX (C o S). Se construyó una colección extendida/mutagenizada similar usando el sistema péptidos en plásmidos para producir clones que codifican la secuencia XXXXX (C, S, P, o R) TLREWL XXXXXXX. Se construyó una colección extendida/mutagenizada adicional, XXXX (C, S, P o R) TLREWL XXXXXX (C o S), usando el sistema de exhibición de polisomas. Las tres colecciones se detectaron con elución de péptidos y se sondearon con receptor monovalente radiomarcado.

Las técnicas de "péptidos en plásmidos" también se utilizaron para detección de péptidos y estudios de mutagénesis y se describen en más detalle en la Patente de EE.UU. Nº 5.338.665. Según este planteamiento, se condensan péptidos en el término C de LacI a través de la expresión de un vector de plásmidos que portan el gen de fusión. El enlace de la fusión del péptido LacI a su ADN codificante ocurre a través de las secuencias lacO en el plásmido, formando un complejo estable péptido LacI-plásmido que puede detectarse por purificación de afinidad en un receptor inmovilizado. Los plásmidos así aislados pueden reintroducirse en E. coli por electroporación para ampliar la población seleccionada para tandas adicionales de detección, o para la examinación de clones individuales.

Además, la detección de péptidos aleatorios y los estudios de mutagénesis se realizaron usando un sistema de exhibición de Lac-I C-terminal modificado en el que la valencia de exhibición se redujo (sistema de exhibición del "dímero de cabecera"). Se detectaron las colecciones, y las inserciones de ADN resultantes se clonaron como un grupo a un vector de proteína de unión de maltosa (MBP) permitiendo su expresión como proteína de fusión C-terminal. Los lisados celulares en bruto de clones de fusión MBP individuales aleatoriamente escogidos se ensayaron luego para unión TPO-R en un formato ELISA, como se analizó anteriormente.

Los estudios de mutagénesis de péptidos también se realizaron usando el sistema de exhibición de polisomas, como se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/300,262 en tramitación con la presente solicitud, presentada el 2 de Septiembre de 1994, que es una solicitud de continuación en parte basada en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/144,775, presentada el 29 de Octubre de 1993, y en el documento PCT WO 95/11992. Se construyó una colección de mutagénesis basada en la secuencia X X X X (C, P. R o S) t l r e f l X X X X X X (C o S), en la que X representa un codón NNK aleatorio, y las letras minúsculas representan codones de aminoácidos que contienen 70:10:10:10 de mutagénesis en las posiciones 1 y 2, y K (G o T) en la posición 3 del codón. La colección se seleccionó por afinidad durante 5 tandas contra el receptor de TPO que había sido inmovilizado en esferas magnéticas. Después de la quinta tanda, el grupo ampliado por PCR se clonó en pAFF6 y se secuenciaron clones ELISA positivos. Las secuencias se subclonaron en un vector MBP y sus afinidades de unión se determinaron por un ELISA
de MBP.

Para inmovilizar el TPO-R para detección de polisomas, se conjugó primero químicamente Ab 179 a esferas magnéticas activadas con tosilo (comercializadas por Dynal Corporation) como lo describe el fabricante. Las esferas se incubaron con anticuerpo en tampón de borato 0,5 M (pH 9,5) durante una noche a temperatura ambiente. Las esferas se lavaron y combinaron con TPO-R que contenía el extremo "HEAP". Las esferas recubiertas con anticuerpo y el receptor se incubaron durante 1 hora a 4ºC, y las esferas se lavaron nuevamente antes de añadir la colección de polisomas.

La detección de las diversas colecciones anteriormente descritas proporcionó los péptidos de unión al receptor de TPO que se muestran en las Tablas 1 y 2 a continuación, como también otros que no se mencionan en el presente documento.

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TABLA 1

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2

3

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TABLA 2

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5

6

7

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Los valores CI_{50} para algunos péptidos representativos adicionales se exponen en la Tabla a continuación. Se puede usar una diversidad de métodos para evaluar los valores CI_{50}. Por ejemplo, se usó un ensayo ELISA de unión de equilibrio, que usa o bien MBP-TPO o un trazador del péptido lacI para determinar si los péptidos inhiben la unión de TPO al dominio extracelular del receptor TPO. Típicamente, los valores CI_{50} se determinaron usando el péptido libre. El valor CI_{50} puede determinarse usando el péptido libre, que opcionalmente puede amidarse de modo C-terminal, o puede prepararse como un éster u otra carboxiamida.

Para recrear la secuencia exacta exhibida en el fago, los aminoácidos N-terminales y C-terminales de los péptidos sintéticos a menudo son precedidos por uno o dos residuos glicina. No se cree que estas glicinas sean necesarias para unión o actividad. Asimismo, para imitar la secuencia exacta de los péptidos exhibidos en los polisomas, los aminoácidos C-terminales de los péptidos sintéticos a menudos son precedidos por la secuencia M A S. De nuevo, no se cree que esta secuencia sea necesaria para unión o actividad.

Los valores CI_{50} se indican simbólicamente con los símbolos "-", "+" y "++". Por ejemplo, aquellos péptidos que mostraron valores CI_{0} superiores a 200 \muM se indican con un "-". Aquellos péptidos que dieron valores CI_{50} inferiores o iguales a 200 \muM se les da un "+", mientras que a aquellos que dieron valores CI_{50} de 500 nm o menos se indican con un "++". Aquellos péptidos que dieron valores CI_{50} próximos a o en el valor de corte para un símbolo en particular se indican con un designador híbrido, p. ej., "+/-". Aquellos péptidos para los cuales los valores CI_{50} no se determinaron se mencionan como "N.D.". El valor CI_{50} para péptidos que tienen la estructura: G G C T L R E W L H G G F C G G fue de 500 nm o menos. (Obsérvese que los aminoácidos N-terminales y C-terminales fueron precedidos por dos glicinas para recrear la secuencia exacta exhibida por el fago. No se cree que estas glicinas sean necesarias para unión o actividad).

TABLA 3

8

Los péptidos y peptidomiméticos que tienen un CI_{50} mayor que aproximadamente 100 mM carecen de unión suficiente como para permitir el uso en los aspectos diagnósticos o terapéuticos de la presente invención. Preferiblemente, para fines diagnósticos, los péptidos y peptidomiméticos tienen un CI_{50} de aproximadamente 2 mM o menos y, para fines farmacéuticos, los péptidos y peptidomiméticos tienen un CI_{50} de aproximadamente 100 \muM o menos.

La secuencia del péptido de unión también proporciona un medio para determinar el tamaño mínimo de un compuesto de unión al TPO-R de la invención. Usando el sistema de "colección sintética codificada" (ESL) o el sistema de "síntesis de polímeros inmovilizados a muy gran escala", se puede no solo determinar el tamaño mínimo de un péptido con dicha actividad, sino también elaborar todos los péptidos que forman el grupo de péptidos que difieren del motivo preferido (o el tamaño mínimo de ese motivo) en uno, dos o más residuos. Esta colección de péptidos puede luego detectarse para capacidad de unión al receptor de TPO. Estos sistemas de síntesis de polímeros inmovilizados u otros métodos de síntesis de péptidos pueden también utilizarse para sintetizar análogos de truncación, análogos de deleción, análogos de sustitución y sus combinaciones, de todos los compuestos peptídicos de la invención.

Los péptidos y miméticos de péptidos de la presente invención también se evaluaron en un ensayo de proliferación celular dependiente de trombopoyetina, como se describe en más detalle en el Ejemplo 2 a continuación. La proliferación celular se mide por técnicas conocidas en el campo, como un ensayo MTT que se correlaciona con la incorporación de ^{3}H-timidina como una indicación de la proliferación celular (véase Mossmann J. Immunol. Methods 65:55 (1983)). Los péptidos ensayados estimularon la proliferación de células Ba/F3 transfectadas con TPO-R en un modo dependiente de la dosis como se muestra en la Figura 1A. Estos péptidos no tienen ningún efecto en la línea celular parental, como se muestra en la Figura 1B.

Las Figuras 7 a 9 muestran los resultados de otro ensayo que evalúa la actividad de los péptidos y miméticos de péptidos de la invención. En este ensayo, los ratones se tornan trombocitopénicos con carboplatino. La Figura 7 representa los resultados típicos cuando se tratan ratones Balb/C con carboplatino (125 mg/kg por vía intraperitoneal) en el Día 0. Las líneas punteadas representan los animales no tratados de tres experimentos. La línea continua representa grupos tratados con carboplatino en tres experimentos. Las líneas continuas resaltadas representan datos históricos. La Figura 8 representa el efecto de la valoración del carboplatino en los recuentos de plaquetas en ratones tratados con las cantidades indicadas de carboplatino (en mg/kg, por vía intraperitoneal (ip) en el Día 0). La Figura 9 representa el alivio de la trombocitopenia inducida por carboplatino en el Día 10 mediante el péptido AF12513 (513). El carboplatino (CBP; 50-125 mg/kg, por vía intraperitoneal) se administró en el Día 0. Se administró AF12513 (1 mg/kg, ip) en los Días 1-9. Estos resultados demuestran que los péptidos de la invención pueden aliviar la trombocitopenia en un modelo de ratón.

Además, ciertos péptidos de la presente invención pueden dimerizarse u oligomerizarse, aumentando así la afinidad y/o actividad de los compuestos. Para investigar el efecto que tiene la dimerización/oligomerización de péptidos sobre la potencia mimética de la TPO en los ensayos de proliferación celular, se sintetizó un análogo biotinilado C-terminalmente del péptido G G C A D G P T L R E W I S F C G G (G G C A D G P T L R E W I S F C G G K (Biotina)). El péptido se preincubó con estreptavidina en RPMI tamponado con HEPES libre de suero a una relación molar 4:1. El complejo se ensayó para estimulación de la proliferación celular de células Ba/F3 transfectadas con TPO-R, como anteriormente, junto con el péptido biotinilado libre y el péptido parental no biotinilado. La Figura 2A muestra los resultados del ensayo del péptido biotinilado que forma complejo (AF 12885 con estreptavidina (SA)) tanto para las líneas celulares transfectadas como parentales. La Figura 2B muestra los resultados del ensayo del péptido biotinilado libre (AF 12285) tanto para las líneas celulares transfectadas como parentales. La Figura 2C muestra los resultados del ensayo para estreptavidina sola tanto para las líneas celulares transfectadas como parentales. Estas figuras ilustran que el complejo preformado fue aproximadamente 10 veces tan potente como el péptido libre.

La especificidad de la unión y actividad de los péptidos de la invención también se examinó estudiando la reactividad cruzada de los péptidos para el receptor de eritropoyetina (EPO-R). El EPO-R es también un miembro de la familia de los receptores del factor de crecimiento de hematopoyetina, como lo es el TPO-R. Los péptidos de la invención, como también la TPO, EPO y el péptido de unión a EPO conocido, se examinaron en un ensayo de proliferación celular, usando una línea celular dependiente de EPO. Este ensayo utilizó FDCP-1, una línea celular progenitora, hematopoyética, primitiva, multipotencial, murina dependiente del factor de crecimiento (véase, p. ej., Dexter et al. J. Exp. Med. 152:1036-1047 (1981)) como la línea celular parental. Esta línea celular puede proliferar, pero no diferenciarse cuando se enriquece con medio condicionado con WEHI-3 (un medio que contiene IL-3, ATCC número T1B68). La línea celular parental es transfectada con SPO-R humano o murino para producir la línea celular DCP-1-EPO-R. Estas líneas celulares transfectadas pueden proliferar, pero no diferenciarse en presencia de EPO humana o murina.

Las células se desarrollaron hasta la mitad de la densidad estacionaria en presencia de factores de crecimiento necesarios. Las células luego se lavaron en PBS y se dispusieron en un medio de completo sin factores de crecimiento durante 16-24 horas. Después de determinar la viabilidad de las células, se hace que las soluciones madre (en medio completo sin factores de crecimiento) proporcionen aproximadamente 10^{5} células por 50 microlitros. Las diluciones en serie de los compuestos (típicamente, el péptido en fase de disolución libre en oposición a un péptido unido a un fago u otro unido o inmovilizado) que se han de ensayar se disponen en placas de cultivo hístico de 96 pocillos para un volumen final de 50 microlitros por pocillo. Se añaden las células (50 microlitros) a cada pocillo y se incuban durante 24-48 horas, punto en el cual los controles negativos deberían morir o ser quiescentes. Se mide entonces la proliferación celular por técnicas conocidas en el campo, como un ensayo MTT.

Las Figuras 3A-G muestran los resultados de una serie de experimentos de control que muestran la actividad de la TPO, los péptidos de la presente invención, EPO y péptidos de unión a EPO-R en un ensayo de proliferación celular que usa o bien la línea celular Ba/F3 transfectada con TPO-R y su línea parental correspondiente, o una línea celular dependiente de EPO y su línea parental correspondiente. La Figura 3A representa los resultados para TPO en el ensayo de proliferación celular, usando la línea celular Ba/F3 transfectada con TPO-R y su línea parental correspondiente. La Figura 3B representa los resultados para EPO en el ensayo de proliferación celular, usando la línea celular Ba/F3 transfectada con TPO-R y su línea parental correspondiente. La Figura 3C representa los resultados del péptido biotinilado complejo (AF 12285 con estreptavidina (SA)) y una forma compleja de un péptido de unión a EPO-R biotinilado (AF 11505 con SA) en la línea celular Ba/F3 transfectada con TPO-R. Los resultados para la línea celular parental correspondiente se muestran en la Figura 3D. La Figura 3E representa los resultados para TPO en el ensayo de proliferación celular usando la línea celular dependiente de EPO. La Figura 3E representa los resultados para EPO en el ensayo de proliferación celular usando la línea celular dependiente de EPO. La Figura 3G representa los resultados del péptido biotinilado complejo (AF 12285 con estreptavidina (SA)) y la forma compleja de un péptido de unión a EPO-R biotinilado (AF 11505 con SA) en la línea celular dependiente de EPO. Estos resultados demuestran que los péptidos de la invención se unen y activan el TPO-R con un alto grado de especificidad.

IV. Preparación de péptidos y miméticos de péptidos A. Síntesis de fase sólida

Los péptidos de la invención pueden prepararse por métodos clásicos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando técnicas de fase sólida convencionales. Los métodos convencionales incluyen síntesis de fase sólida exclusiva, métodos de síntesis de fase sólida parcial, condensación de fragmentos, síntesis de disolución clásica e incluso tecnología de ADN recombinante. Véase, p. ej., Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963). En fase sólida, la síntesis típicamente comienza por el extremo C-terminal del péptido, usando una resina protegida por un alfaminoácido. Se puede preparar un material de partida adecuado, por ejemplo, uniendo el alfaminoácido requerido a una resina clorometilada, una resina de hidroximetilo o una resina de benzhidrilamina. Una de dichas resinas clorometiladas es comercializada con la marca BIO-BEADS SX-1 por Bio Rad Laboratories, Richmond, CA. y la preparación de la resina de hidroximetilo es descrita por Bodonszky et al. Chem. Ind. (Londres) 38:1597 (1966). La resina de benzhidrilamina (BHA) ha sido descrita por Pietta y Marshall Chem. Commun. 650 (1970), y es comercializada por Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, en la forma de hidrocloruro.

Por tanto, los compuestos de la invención pueden prepararse acoplando un aminoácido protegido con alfa-amino a la resina clorometilada con la ayuda, por ejemplo, de un catalizador de bicarbonato de cesio, según el método descrito por Gisin Helv. Chim. Acta. 56:1467 (1973). Después del acoplamiento inicial, el grupo protector de alfa-amino se elimina por una elección de reactivos que incluyen disoluciones de ácido trifluoroacético (TFA) o ácido clorhídrico (HCl) en disolventes orgánicos a temperatura ambiente.

Los grupos protectores de alfa-amino son aquellos conocidos como útiles en la técnica de síntesis gradual de péptidos. Se incluyen los grupos protectores de tipo acilo (p. ej. formilo, trifluoroacetilo, acetilo), los grupos protectores de tipo uretano aromático (p. ej. benciloxicarboílo (Cbz) y Cbz sustituido), grupos protectores de uretano alifáticos (p. ej. t-butiloxicarbonilo (Boc), isopropiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo) y grupos protectores de tipo alquilo (p. ej. bencilo, trifenilmetilo). Se prefieren los grupos protectores Boc y Fmoc. El grupo protector de cadena lateral permanece intacto durante el acoplamiento y no se separa durante la desprotección del grupo protector del término amino o durante el acoplamiento. El grupo protector de cadena lateral debe ser eliminable tras completar la síntesis del péptido final y bajo condiciones de reacción que no alterarán el péptido diana.

Los grupos protectores de cadena lateral para Tyr incluyen tetrahidropiranilo, terc-butilo, tritilo, bencilo, Cbz, Z-Br-Cbz y 2,5-diclorobencilo. Los grupos protectores de cadena lateral para Asp incluyen bencilo, 2,6-diclorobencilo, metilo, etilo y ciclohexilo. Los grupos protectores de cadena lateral para Thr y Ser incluyen acetilo, benzoílo, tritilo, tetrahidropiranilo, bencilo, 2,6-diclorobencilo y Cbz. El grupo protector de cadena lateral para Thr y Ser es bencilo. Los grupos protectores de cadena lateral para Arg incluyen nitro, Tosilo (Tos), Cbz, adamantiloxicarbonilmesitoilsulfonilo (Mts) o Boc. Los grupos protectores de cadena lateral para Lys incluyen Cbz, 2-clorobenciloxicarbonilo (2-Cl-Cbz), 2-bromobenciloxicarbonilo (2-BrCbz), Tos o Boc.

Después de la eliminación del grupo protector alfa-amino, los aminoácidos protegidos restantes se acoplan gradualmente en el orden deseado. Un exceso de cada aminoácido protegido en general se utiliza con un activador del grupo carboxilo apropiado tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) en disolución, por ejemplo, en mezclas de cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}), dimetilformamida (DMF).

Después de que se ha completado la secuencia de aminoácidos deseada, el péptido deseado se desacopla del soporte de resina por tratamiento con un reactivo tal como ácido trifluoroacético c= hidrógeno flúor (HF), que no solamente escinde el péptido de la resina, sino que también escinde todos los grupos protectores de cadena lateral restantes. Cuando se usa la resina clorometilada, el tratamiento con hidrógeno flúor produce la formación de los ácidos de péptido libres. Cuando se usa la resina benzhidrilamina, el tratamiento con hidrógeno flúor produce directamente la amida de péptido libre. Alternativamente, cuando se emplea la resina clorometilada, el péptido protegido de cadena lateral puede desacoplarse por tratamiento de la resina peptídica con amoníaco para dar la amida protegida con cadena lateral deseada, o con una alquilamina para dar una alquilamida o dialquilamida protegida con cadena lateral. La protección con cadena lateral luego se elimina en el modo usual por tratamiento con hidrógeno fluoruro para dar las amidas, alquilamidas o dialquilamidas libres.

Estos procedimientos de síntesis de péptidos de fase sólida se conocen en la técnica y se describen en más detalle en Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co., San Francisco, (1969)).

Usando el sistema de "colección sintética codificada" o de "síntesis de polímeros inmovilizados a muy gran escala" descritos en las Solicitudes de Patente de EE.UU. N^{os} de Serie 07/492.462, presentada el 7 de Marzo de 1990; 07/624.120, presentada el 6 de Diciembre de 1990; y 07/805.727, presentada el 6 de Diciembre de 1991; no solamente se puede determinar el tamaño mínimo de un péptido con dicha actividad, sino también elaborar todos los péptidos que forman el grupo de péptidos que difieren del motivo preferido (o el tamaño mínimo de ese motivo) en uno, dos o más residuos. Esta colección de péptidos puede luego detectarse para capacidad de unión al TPO-R. Este sistema de síntesis de polímeros inmovilizados u otros métodos de síntesis de péptidos también se pueden utilizar para sintetizar análogos de truncación y análogos de deleción, y combinaciones de análogos de truncación y deleción de todos los compuestos peptídicos de la invención.

B. Aminoácidos sintéticos

Estos procedimientos pueden utilizarse para sintetizar péptidos en los que los aminoácidos distintos a los 20 que ocurren naturalmente, aminoácidos genéticamente codificados, se sustituyen en una, dos o más posiciones de cualquiera de los compuestos de la invención. Por ejemplo, naftilalanina puede sustituirse con triptófano, facilitando la síntesis. Otros aminoácidos sintéticos que pueden sustituirse en los péptidos de la presente invención incluyen L-hidroxipropilo, L-3, 4-dihidroxifenilalanilo, d aminoácidos tales como L-d-hidroxilisilo y D-d-metilalanilo, L-a-metilalanilo, b aminoácidos e isoquinolilo. Pueden también incorporarse D aminoácidos y aminoácidos no naturales, sintéticos a los péptidos de la presente invención.

Se pueden reemplazar las cadenas laterales naturales de los 20 aminoácidos genéticamente codificados (o D aminoácidos) con otras cadenas laterales, por ejemplo con grupos tales como alquilo, alquilo inferior, alquilo cíclico de 4, 5, 6 a 7 miembros, amida, amida alquilo inferior, amida, amida di(alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi, carboxi y sus derivados de éster inferior, y con un grupo heterocíclico de 4, 5, 6 a 7 miembros. En particular, pueden emplearse análogos de prolina en los que el tamaño del anillo del residuo prolina cambia de 5 miembros a 4, 6 ó 7 miembros. Los grupos cíclicos pueden ser saturados o insaturados y, si son insaturados, pueden ser aromáticos o no
aromáticos.

Los grupos cíclicos pueden ser saturados o insaturados y, si son insaturados, pueden ser aromáticos o no aromáticos. Los grupos heterocíclicos preferiblemente contienen uno o más heteroátomos de nitrógeno, oxígeno y/o azufre. Los ejemplos de dichos grupos incluyen furazanilo, furilo, imidazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo (p. ej. morfolino), oxazolilo, piperazinilo (p. ej. 1-oiperazinilo), piperidilo (p. ej. 1-piperidilo, piperidino), piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo (p. ej. 1-pirrolidinilo), pirrolinilo, pirrolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, tiomorfolinilo (p. ej. tiomorfolino) y triazolilo. Estos grupos heterocíclicos pueden estar sustituidos o no sustituidos. Si un grupo está sustituido, el sustituyente puede ser alquilo, alcoxi, halógeno, oxígeno o fenilo sustituido o no sustituido.

Pueden modificarse fácilmente los péptidos de la presente invención por fosforilación, y se describen otros métodos para elaborar los derivados de péptidos de los compuestos de la presente invención en Hruby et al.^{42} Por tanto, los compuestos de péptidos de la invención también sirven como base para preparar miméticos con actividad biológica similar.

Los compuestos de péptidos de la invención, incluidos los peptidomiméticos, pueden modificarse covalentemente a uno o más de una diversidad de polímeros no proteináceos, p. ej., polietilenglicol, o polioxialquenos, en el modo expuesto en la Patente de EE.UU. Nº 4.640.835; Patente de EE.UU. Nº 4.496.689; Patente de EE.UU. Nº 4.301.144; Patente de EE.UU. Nº 4.670.417; Patente de EE.UU. Nº 4.791.192) o Patente de EE.UU. Nº 4.179.337.

C. Modificaciones terminales

Los expertos en la técnica reconocen que existe una diversidad de técnicas para construir miméticos de péptidos con la misma o similar actividad biológica deseada que el correspondiente compuesto peptídico pero con actividad más favorable que el péptido con respecto a solubilidad, estabilidad y susceptibilidad a hidrólisis y proteólisis. Véase, por ejemplo, Morgan and Gainor Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 (1989). A continuación se describen métodos para preparar miméticos de péptidos modificados en el grupo amino N-terminal, el grupo carboxilo C-terminal y/o para cambiar uno o más de los enlaces amido en el péptido a enlaces no amido. Se ha de entender que dos o más de dichas modificaciones pueden acoplarse en una estructura mimética de péptido (p. ej., modificación en el grupo carboxilo C-terminal e inclusión de un enlace -CH_{2}-carbamato entre dos aminoácidos en el
péptido).

1. Modificaciones N-terminales

Los péptidos típicamente se sintetizan como el ácido libre pero, como se observó anteriormente, podrían prepararse fácilmente como la amida o el éster. También puede modificarse el término amino y/o carboxi de los compuestos peptídicos de la invención para producir otros compuestos de la invención. Las modificaciones del término amino incluyen metilar (es decir, -NHCH_{3} o -NH(CH_{3})_{2}), acetilar, añadir un grupo carbobenzoílo, o bloquear el término amino con cualquier grupo bloqueante que contenga una funcionalidad carboxilato definida por RCOO-, en donde R se selecciona del grupo que consiste en naftilo, acridinilo, esteroidilo y grupos similares. Las modificaciones del término carboxi incluyen reemplazar el ácido libre con un grupo carboxamida o formar una lactama cíclica en el término carboxi para introducir restricciones estructurales.

Las modificaciones del término amino son como se describió anteriormente e incluyen alquilar, acetilar, añadir un grupo carbobenzoílo, formar un grupo succinimida, etc. Específicamente, el grupo amino N-terminal puede luego hacerse reaccionar de la siguiente manera:

(a) para formar un grupo amida de la fórmula RC(O)NH- en la que R es como se definió anteriormente por reacción con un haluro ácido [p. ej., RC(O)Cl] o anhídrido ácido. Típicamente, la reacción puede llevarse a cabo poniendo en contacto cantidades aproximadamente equimolares o en exceso (p. ej., aproximadamente 5 equivalentes) de un haluro ácido con el péptido en un diluyente inerte (p. ej., diclorometano) preferiblemente que contiene un exceso (p. ej., aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, como diisopropiletilamina, para depurar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son, por lo demás, convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). La alquilación del amino terminal para proveer una N-sustitución alquilo inferior seguida de reacción con un haluro ácido según se describió anteriormente proporcionará un grupo N-alquilo de la fórmula RC(O)NR-;

(b) para formar un grupo succinimida por reacción con anhídrido succínico. Como antes, puede emplearse una cantidad aproximadamente equimolar o un exceso de anhídrido succínico (p. ej., aproximadamente 5 equivalentes), y el grupo amino se convierte a la succinimida por métodos conocidos en la técnica que incluyen el uso de un exceso (p. ej., diez equivalentes) de una amina terciaria tal como diisopropiletilamina en un disolvente inerte adecuado (p. ej., diclorometano). Véase, por ejemplo, Wollenberg, et al., Patente de EE.UU. Nº 4.612.132. Se ha de entender que el grupo succínico puede sustituirse con, por ejemplo, alquilo C_{2}-C_{6} o sustituyentes -SR que se preparan en un modo convencional para proporcionar la succinimida sustituida en el término N del péptido. Dichos sustituyentes alquilo se preparan por reacción de una olefina inferior (C_{2}-C_{6}) con anhídrido maleico en el modo descrito por Wollenberg, et al., supra y los sustituyentes -SR se preparan por reacción de RSH con anhídrido maleico, en donde R es como se definió anteriormente;

(c) para formar un grupo benciloxicarbonil-NH- o un grupo benciloxicarbonil-NH- sustituido por reacción con aproximadamente una cantidad equivalente o un exceso de CBZ-Cl (es decir, cloruro de benciloxicarbonilo) o un CBZ-Cl sustituido en un diluyente inerte adecuado (p. ej., diclorometano) preferiblemente que contiene una amina terciaria para depurar el ácido generado durante la reacción;

(d) para formar un grupo sulfonamida por reacción con una cantidad equivalente o un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R-S(O)_{2}Cl en un diluyente inerte adecuado (diclorometano) para convertir la amina terminal a una sulfonamida en la que R es como se definió anteriormente. Preferiblemente, el diluyente inerte contiene exceso de amina terciaria (p. ej., diez equivalentes) como diisopropiletilamina, para depurar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son, por lo demás, convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos).

(e) para formar un grupo carbamato por reacción con una cantidad equivalente o un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R-OC(O)Cl o R-OC(O)OC_{5}H_{4}-p-NO_{2} en un diluyente inerte adecuado (p. ej., diclorometano) para convertir la amina terminal en un carbamato, en donde R es como se definió anteriormente. Preferiblemente, el diluyente inerte contiene un exceso (p. ej., aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria como diisopropiletilamina, para depurar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son, por lo demás, convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). y

(f) para formar un grupo urea por reacción con una cantidad equivalente o un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R-N=C=O en un diluyente inerte adecuado (p. ej., diclorometano) para convertir la amina terminal en una urea (es decir, RNHC(O)NH-), en donde R es como se definió anteriormente. Preferiblemente, el diluyente inerte contiene un exceso (p. ej., aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, como diisopropiletilamina. Las condiciones de reacción son, por lo demás, convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos).

2. Modificaciones C-terminales

Para preparar los miméticos de péptidos en los que el grupo carboxilo C-terminal se reemplaza con un éster (es decir, -C(O)OR en donde R es como se definió anteriormente), se emplean resinas utilizadas para preparar ácidos de péptidos, y el péptido protegido por cadena lateral se escinde con la base y el alcohol apropiado, p. ej., metanol. Los grupos protectores de cadena lateral se eliminan luego en el modo usual por tratamiento con fluoruro de hidrógeno para obtener el éster deseado.

Para preparar los miméticos de péptido en los que el grupo carboxilo C-terminal se reemplaza con la amida -C(O)NR^{3}R^{4}, se usa una resina benzhidrilamina como el soporte sólido para la síntesis del péptido. Tras completar la síntesis, el tratamiento con hidrógeno fluoruro para liberar el péptido del soporte produce directamente la amida del péptido libre (es decir, el término C es -C(O)NH_{2}). Alternativamente, el uso de la resina clorometilada durante la síntesis de péptidos acoplada con reacción con amoníaco para escindir el péptido protegido por cadena lateral del soporte proporciona la amida de péptido libre, y la reacción con una alquilamina o dialquilamina proporciona una alquilamida o dialquilamida protegida por cadena lateral (es decir, el término C es -C(O)NRR^{1}, en donde R y R^{1} son como se definió anteriormente). La protección con cadena lateral luego se elimina en el modo usual por tratamiento con hidrógeno fluoruro para dar las amidas, alquilamidas o dialquilamidas libres.

En otra realización alternativa, el grupo carboxilo C-terminal o un éster C-terminal pueden inducirse para ciclarse por desplazamiento interno del -OH o el éster (-OR) del grupo o éster carboxilo respectivamente con el grupo amino N-terminal para formar un péptido cíclico. Por ejemplo, después de la síntesis y escisión para dar el ácido de péptido, el ácido libre se convierte a un éster activado por un activador de grupo carboxilo apropiado tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) en disolución, por ejemplo, en mezclas de cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}), dimetil formamida (DMF). El péptido cíclico se forma luego por desplazamiento interno del éster activado con la amina N-terminal. La ciclización interna, en oposición a la polimerización, puede potenciarse mediante el uso de disoluciones muy diluidas. Tales métodos son bien conocidos en la técnica.

Pueden también ciclarse los péptidos de la invención, o puede incorporarse un residuo desamino o descarboxi en los términos del péptido, de modo que no haya grupo amino o carboxilo, para disminuir la susceptibilidad a proteasas o para restringir la conformación del péptido. Los grupos funcionales C-terminales de los compuestos de la presente invención incluyen amida, amida alquilo inferior, amida di(alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi y carboxi, y sus derivados de éster inferior, y sus sales farmacéuticamente aceptables.

D. Modificaciones de la cadena principal

Otros métodos para elaborar derivados de péptidos de los compuestos de la presente invención se describen en Hruby et al. Biochem J. 268(2):299-262 (1990). Por tanto, los compuestos de péptidos de la invención también sirven como modelos estructurales para compuestos no peptídicos con actividad biológica similar. Los expertos en la técnica reconocen que existe una diversidad de técnicas para construir compuestos con la misma o similar actividad biológica deseada que el compuesto peptídico inicial pero con actividad más favorable que el inicial con respecto a solubilidad, estabilidad y susceptibilidad a hidrólisis y proteólisis. Véase Morgan and Gainor Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 (1989). Estas técnicas incluyen reemplazar la cadena principal del péptido con una cadena principal compuesta por fosfonatos, amidatos, carbamatos, sulfonamidas, aminas secundarias y ácidos de N-metil-
amino.

Los miméticos de péptidos en los que uno o más enlaces peptidilo [-C(O)NH-] han sido reemplazados con dichos enlaces como un enlace -CH_{2}-carbamato, un enlace fosfonato, un enlace -CH_{2}-sulfonamida, un enlace urea, un enlace amina secundaria (-CH_{2}NH-) y un enlace peptidilo alquilado [-C(O)NR^{6}-, en el que R^{6} es alquilo inferior], se preparan durante la síntesis de péptidos convencional simplemente sustituyente el reactivo de aminoácido con un análogo de aminoácido adecuadamente protegido en el punto apropiado durante la síntesis.

Los reactivos adecuados incluyen, por ejemplo, análogos de aminoácidos en los que el grupo carboxilo del aminoácido ha sido reemplazado con un resto adecuado para formar uno de los enlaces anteriormente mencionados. Por ejemplo, si uno desea reemplazar un enlace -C(O)NR- en el péptido con un enlace -CH_{2}-carbamato (-CH_{2}OC(O)NR-), entonces el grupo carboxilo (-COOH) de un aminoácido adecuadamente protegido se reduce primero al grupo -CH_{2}OH que luego se convierte por métodos convencionales a una funcionalidad -OC(O)Cl o una funcionalidad para-nitrocarbonato -OC(O)O-C_{6}H_{4}-p-NO_{2}. La reacción de cualquiera de dichos grupos funcionales con la amina libre o una amina alquilada en el término N del péptido parcialmente fabricado hallado en el soporte sólido conduce a la formación de un enlace -CH_{2}OC(O)NR-. Para una descripción más detallada de la formación de dichos enlaces -CH_{2}-carbamato, véase Cho et al Science, 261:1303-1305 (1993).

De modo similar, el reemplazo de un enlace amido en el péptido con un enlace fosfonato puede lograrse en el modo expuesto en las Solicitudes de Patente de EE.UU. N^{os} 07/943.805, 08/081.577 y 08/119.700.

El reemplazo de un enlace amido en el péptido con un enlace -CH_{2}-sulfonamida puede lograrse reduciendo el grupo carboxilo (-COOH) de un aminoácido adecuadamente protegido al grupo -CH_{2}OH, y el grupo hidroxilo se convierte entonces a un grupo saliente adecuado tal como un grupo tosilo por métodos convencionales. La reacción del derivado tosilado con, por ejemplo, ácido tioacético seguido de hidrólisis y cloración oxidativa proveerá el grupo funcional -CH_{2}-S(O)_{2}Cl que reemplaza el grupo carboxilo del aminoácido por lo demás adecuadamente protegido. El uso de este análogo de aminoácido adecuadamente protegido en la síntesis de péptidos proporciona la inclusión de un enlace -CH_{2}S(O)_{2}NR- que reemplaza el enlace amido en el péptido, proporcionando así un mimético de péptido. Para una descripción más completa sobre la conversión del grupo carboxilo del aminoácido a un grupo -CH_{2}S(O)_{2}Cl, véase, por ejemplo, Weinstein, Boris Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins Vol. 7, pág. 267-357, Marcel Dekker, Inc., New York (1983).

Los enlaces amina secundaria en los que un enlace -CH_{2}NH- reemplaza el enlace amido en el péptido pueden prepararse empleando, por ejemplo, un análogo de dipéptido adecuadamente protegido en el que la unión amido del enlace amido ha sido reducida a un grupo CH_{2} por métodos convencionales. Por ejemplo, en el caso de diglicina, la reducción de la amida a la amina producirá, después de la desprotección, H_{2}NCH_{2}CH_{2}NHCH_{2}COOH que luego se usa en la forma N-protegida en la siguiente reacción de acoplamiento. La preparación de dichos análogos por reducción del grupo carbonilo del enlace amido en el dipéptido se conoce en la técnica.

El análogo de aminoácido adecuadamente protegido se emplea en la síntesis de péptidos convencional en el mismo modo que se emplearía el aminoácido correspondiente. Por ejemplo, se emplean típicamente aproximadamente 3 equivalentes del análogo de aminoácido protegido en esta reacción. Se emplea un diluyente orgánico inerte tal como cloruro de metileno o DMF y, cuando se genera un ácido como producto secundario de reacción, el disolvente de reacción típicamente contendrá una cantidad en exceso de una amina terciaria para depurar el ácido generado durante la reacción. Una amina terciaria particularmente preferida es diisopropiletilamina que típicamente se emplea en un exceso de aproximadamente 10 veces. La reacción produce la incorporación del mimético de péptido de un análogo de aminoácido que tiene un enlace no peptidilo. Dicha sustitución puede repetirse como se desee de modo que de cero a todas las uniones amido en el péptido hayan sido reemplazadas con uniones no
amido.

Pueden también ciclarse los péptidos de la invención, o puede incorporarse un residuo desamino o descarboxi en los términos del péptido, de modo que no haya ningún grupo amino o carboxilo terminal, para disminuir la susceptibilidad a proteasas o para restringir la conformación del péptido. Los grupos funcionales C-terminales de los compuestos de la presente invención incluyen amida, amida alquilo inferior, amida di(alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi y carboxi, y sus derivados de éster inferior, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de compuestos ciclados se proveen en las Tablas 4, 5, 6, 8 y 9.

E. Formación de la unión disulfuro

Los compuestos de la presente invención pueden existir en forma ciclada con una unión disulfuro intramolecular entre los grupos tiol de las cisteínas. Alternativamente, puede producirse una unión disulfuro intermolecular entre los grupos tiol de las cisteínas para proporcionar un compuesto dimérico (u oligomérico superior). Uno o más de los residuos cisteína pueden también sustituirse con una homocisteína. Estos derivados disulfuro intramoleculares o intermoleculares pueden representarse esquemáticamente como se muestra a continuación:

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en donde m y n son independientemente 1 ó 2.

Otras realizaciones de la presente invención proveen análogos de estos derivados disulfuro en los que uno de los azufres ha sido reemplazado con un grupo CH_{2} u otro isóstero para azufre. Estos análogos pueden elaborarse vía un desplazamiento intramolecular o intermolecular, usando métodos conocidos en la técnica como se muestra a continuación:

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en donde p es 1 ó 2. La persona con experiencia en la técnica apreciará fácilmente que este desplazamiento puede también ocurrir usando otros homólogos del derivado ácido a-amino-g-butírico mostrado anteriormente y homocisteína.

Alternativamente, al término amino del péptido se le puede añadir un ácido acético alfa-sustituido, en donde el sustituyente alfa es un grupo saliente, como un ácido \alpha-haloacético, por ejemplo, ácido \alpha-cloroacético, ácido \alpha-bromoacético o ácido \alpha-yodoacético. Los compuestos de la presente invención pueden ciclarse o dimerizarse vía el desplazamiento del grupo saliente por el azufre del residuo cisteína u homocisteína. Véanse, p. ej., Barker et al. J. Med. Chem. 35:2040-2048 (1992) y Or et al. J. Org. Chem. 56:3146-3149 (1991. Los ejemplos de compuestos dimerizados se proveen en las Tablas 7, 9 y 10.

V. Utilidad

Los compuestos de la invención son útiles in vitro como herramientas únicas para entender la función biológica de la TPO, incluyendo la evaluación de muchos factores que se cree influencian, y son influenciados por, la producción de TPO y el proceso de unión al receptor. Los presentes compuestos son también útiles en el desarrollo de otros compuestos que se unen y activan el TPO-R, ya que los presentes compuestos proveen información importante sobre la relación entre estructura y actividad que debería facilitar dicho desarrollo.

Los compuestos son también útiles como fijadores competitivos en ensayos para detectar nuevos agonistas del receptor de TPO. En las realizaciones de dicho ensayo, los compuestos de la invención pueden utilizarse sin modificación o pueden modificarse en una diversidad de formas; por ejemplo, marcando, como uniendo covalentemente o no covalentemente un resto que provee directa o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, esos materiales pueden marcarse o bien directa o indirectamente. Las posibilidades de marcado directo incluyen grupos de marcadores tales como: radiomarcadores tales como ^{125}I, enzimas (Patente de EE.UU. 3.645.090) como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (Patente de EE.UU. Nº 3.940.475) capaces de vigilar el cambio en intensidad de fluorescencia, desplazamiento de longitud de onda o polarización de fluorescencia. Las posibilidades de marcado indirecto incluyen biotinilación de un constituyente seguida de unión a avidina acoplada a uno de los grupos de marcadores anteriormente mencionados. Los compuestos pueden también incluir espaciadores o enlazadores en casos en los que los compuestos se unirán a un soporte sólido.

Además, en base a su capacidad de unión al receptor de TPO, los péptidos de la presente invención pueden usarse como reactivos para detectar receptores de TPO en células vivas, células fijas, en fluidos biológicos, en homogeneizados de tejido, en materiales purificados, naturales, etc. Por ejemplo, marcando dichos péptidos, uno puede identificar células que tienen el TPO-R en sus superficies. Además, en base a su capacidad de unión al receptor de TPO, los péptidos de la presente invención pueden utilizarse en tinción in situ, FACS (clasificación celular activada por fluorescencia), inmunotransferencia, ELISA, etc. Además, en base a su capacidad de unión al receptor de TPO, los péptidos de la presente invención pueden utilizarse en la purificación del receptor, o en la purificación de células que expresan los receptores de TPO en la superficie celular (o dentro de células permeabilizadas).

Los compuestos de la presente invención pueden también utilizarse como reactivos comerciales para diversos usos de investigación y diagnóstico médico. Dichos usos incluyen, aunque sin limitarse a ello: (1) uso como un patrón de calibración para cuantificar las actividades de agonistas de TPO candidatos en una diversidad de ensayos funcionales; (2) uso para mantener la proliferación y el crecimiento de líneas celulares dependientes de TPO; (3) uso en el análisis estructural del receptor de TPO a través de la co-cristalización; (4) uso para investigar el mecanismo de la transducción de señal/activación del receptor de TPO; y (5) otras aplicaciones diagnósticas y de investigación en las que el receptor de TPO está preferiblemente activo o dicha activación es convenientemente calibrada contra una cantidad conocida de un agonista de TPO, y similares.

Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse para expansión in vitro de megacariocitos y sus progenitores comprometidos, junto con citocinas adicionales o en forma independiente. Véase, p. ej., DiGiusto et al. Publicación PCT Nº 95/05843. La quimioterapia y las radioterapias causan la trombocitopenia, lo que destruye la población más madura de megacariocitos que se dividen rápidamente. No obstante, estos tratamientos terapéuticos pueden también reducir el número y la viabilidad de las células precursoras de megacariocitos menos mitóticamente activos, inmaduros. Por tanto, el alivio de la trombocitopenia por TPO o los compuestos de la presente invención puede obstaculizarse infundiendo a los pacientes después de la quimioterapia o radioterapia con una población de su propias células enriquecidas para megacariocitos y precursores inmaduros por cultivo in vitro.

Los compuestos de la invención pueden también administrarse a animales de sangre caliente, incluyendo seres humanos, para activar el TPO-R in vivo. Por tanto, la presente invención es útil en métodos para tratamiento terapéutico de trastornos relacionados con la TPO que comprenden administrar un compuesto de la invención en cantidades suficientes para imitar el efecto de la TPO en el TPO-R in vivo. Por ejemplo, los péptidos y compuestos de la invención pueden administrarse para tratar una diversidad de trastornos hematológicos incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, trastornos plaquetarios y trombocitopenia, particularmente cuando se asocian con transfusiones de médula ósea, radioterapia y quimioterapia.

Los antagonistas de TPO pueden primero administrarse a pacientes que se someten a quimioterapia y radioterapia, con posterior administración de los agonistas de tpo de la invención.

La actividad de los compuestos de la presente invención puede evaluarse in vitro o in vivo en uno de los diversos modelos descritos en McDonald Am. J. of Pediatric Hematalogy/Oncology 14:8-21 (1992).

Según una realización, las composiciones de la presente invención son útiles para tratar la trombocitopenia asociada con transfusiones de la médula ósea, radioterapia o quimioterapia. Los compuestos típicamente se administrarán profilácticamente antes de la quimioterapia, radioterapia o trasplante de médula ósea, o después de dicha exposi-
ción.

Por consiguiente, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden, como un ingrediente activo, por lo menos uno de los péptidos o miméticos de péptidos de la invención en asociación con un vehículo o diluyente farmacéutico. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por las rutas oral, pulmonar, parental (inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), inhalación (vía una formulación en polvo fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal o sublingual y pueden formularse en formas de administración apropiadas para cada ruta de administración. Véanse, p. ej., Bernstein et al. Publicación de Patente PCT Nº WO 93/25221; Pitt et al. Publicación de Patente PCT Nº WO 94/17784; y Pitt et al. Solicitud de Patente Europea 613.683.

Las formas de administración sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas de administración sólidas, el compuesto activo se mezcla con por lo menos un vehículo inerte farmacéuticamente aceptable tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas de administración pueden también comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales que no sean diluyentes inertes, p. ej., agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de administración pueden también comprender agentes tampón. Los comprimidos y píldoras pueden adicionalmente prepararse con recubrimientos entéricos.

Las formas de administración líquidas para administración oral incluyen emulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes farmacéuticamente aceptables, con los elixires que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, como agua. Además de dichos diluyentes inertes, las composiciones pueden también incluir adyuvantes, como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, y agentes edulcorantes, saporíferos y perfumantes.

Las preparaciones según la presente invención para administración parental incluyen disoluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, estériles. Los ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Dichas formas de administración pueden también contener adyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes y dispersantes. Pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retiene una bacteria, incorporando agentes de esterilización a las composiciones, irradiando las composiciones, o calentando las composiciones. También pueden fabricarse usando agua estéril, o algún medio inyectable estéril, inmediatamente antes del uso.

Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden contener, además de la sustancia activa, excipientes tales como manteca de cacao o una cera de supositorio. Las composiciones para administración nasal o sublingual también se preparan con excipientes convencionales conocidos en la
técnica.

Las composiciones que contienen los compuestos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya padece una enfermedad, como se describió anteriormente, en una cantidad suficiente para curar o por lo menos aliviar parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del peso y estado general del paciente.

Las composiciones de la invención pueden también microencapsularse mediante, por ejemplo, el método de Tice y Bibi (en Treatise on Controlled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N.Y. (1992), pp. 315-339).

En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los compuestos de la invención se administran a un paciente susceptible o en riesgo de una enfermedad particular. Dicha cantidad se define como "dosis profilácticamente eficaz". En este uso, las cantidades precisas nuevamente dependen del estado de salud y el peso del pacien-
te.

Las cantidades del agonista de TPO necesarias para la terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, y otros medicamentos administrados. Por tanto, las administraciones del tratamiento deben ajustarse para optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente, las administraciones utilizadas in vitro pueden proveer una guía útil de las cantidades útiles para administración in situ de estos reactivos. Las pruebas en animales de dosis eficaces para trastornos particulares proveerán otra indicación predictiva de la administración a seres humanos. Se describen diversas consideraciones, p. ej., en Gilman et al. (eds), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8ª ed., Pergamon Press (1990); y en Remington's Pharmaceutical Sciences, 7ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1985).

Los péptidos y miméticos de péptidos de la presente invención son eficaces para tratar afecciones mediadas por TPO cuando se administran en un intervalo de administración de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día. La dosis específica empleada es regulada por la afección particular que se esté tratando, la ruta de administración, como así también el criterio del médico, que dependerá de factores tales como la gravedad de la afección, la edad y el estado general del paciente, y similares.

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Ejemplo 1

Síntesis de un péptido en fase sólida

Se sintetizaron diversos péptidos de la invención usando las técnicas de síntesis de fase sólida de Merrifield (véase Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª edición, Pierce Chemical, Rockford, IL (1984) y Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)) en un instrumento automatizado Milligen/Biosearch 9600 o en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems Inc. Modelo 431A. Los péptidos se ensamblaron usando protocolos convencionales de la versión del software 1.01 de Applied Biosystems Inc. Cada acoplamiento se realizó durante una o dos horas con BOP (hexafluorofosfato de benzotriazolil N-oxtrisdimetilaminofosfonio) y HOBt (1-hidroxibenzo-
triazol).

La resina utilizada fue la resina HMP o PAL (Millien/Biosearch), que es una resina de poliestireno entrecruzada con ácido 5-(4'-Flnoc-aminometil-3,5'-dimetoxifenoxi)valérico como enlazador. El uso de la resina PAL produce una funcionalidad amida carboxilo terminal tras la escisión del péptido de la resina. Tras la escisión, la resina HMP produce un resto ácido carboxílico en el término C del producto final. La mayoría de los reactivos, resinas y aminoácidos protegidos (libres o en la resina) se adquirieron de Millipore o Applied Biosystems Inc.

El grupo Fmoc se usó para protección amino durante el procedimiento de acoplamiento. La protección de la amina primaria se logró con Fmoc y los grupos de protección de cadena lateral fueron t-butilo para serina, tirosina, asparagina, ácido glutámico y treonina; tritilo para glutamina; Pmc (sulfonato de 2,2,5,7,8-pentametilcroma) para arginina; N-t-butoxicarbonilo para triptófano; N-tritilo para histidina y glutamina; y S-tritilo para cisteína.

La eliminación de los péptidos de la resina y la desprotección simultánea de las funciones de la cadena lateral se lograron por tratamiento con reactivo K o leves modificaciones de éste. Alternativamente, en la síntesis de péptidos elegidos, con un término carboxilo amidado, el péptido totalmente ensamblado se escindió con una mezcla de ácido trifluoroacético al 90%, etanoditiol al 5% y agua al 5%, inicialmente a 4ºC, y aumentando gradualmente hasta temperatura ambiente. Los péptidos desprotegidos se precipitaron con éter dietílico. En todos los casos, la purificación fue por cromatografía preparativa, de fase inversa, líquida de alto rendimiento en una columna de gel de sílice unida a C_{19} con un gradiente de acetonitrilo/agua en ácido trifluoroacético al 0,1%. Los péptidos homogéneos se caracterizaron por espectrometría de masas con bombardeo de átomos Fasc o espectrometría de masas con electropulverización y análisis de aminoácidos, si correspondía.

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Ejemplo 2

Bioensayos

La bioactividad de los péptidos se puede medir usando el ensayo de proliferación celular dependiente de trombopoyetina. Se transfectaron células murinas Ba/F3 dependientes de IL-3 con TPO-R humano de longitud total. En ausencia de IL-3 (medio condicionado WEHI-3), estas células dependen de la TPO para proliferación. La línea celular no transfectada, parental no responde a la TPO humana, pero permanece dependiente de IL-3.

Los bioensayos se han realizado en ambas líneas celulares anteriormente mencionadas usando péptidos sintéticos derivados de detección de colecciones. Las células se desarrollaron en medio RPMI-10 completo, que contenía medio condicionado con WSHI-3 al 10%, luego se lavaron dos veces en PBS, se resuspendieron en medio que carecía de medio condicionado con WEHT-3, y se añadieron a pocillos que contenían diluciones de péptido o TPO a 2 x 10^{4} células/pocillo. Las células se incubaron durante 48 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada y se ensayó la actividad metabólica por la reducción de MTT a formazan, con absorbancia a 570 nM medida en una lectora de placas ELISA. Los péptidos ensayados estimularon la proliferación de células Ba/F3 transfectadas con TPO-R en un modo dependiente de la dosis como se muestra en la Figura 1. Estos péptidos no tienen ningún efecto en la línea celular parental.

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Ejemplo 3

Afinidad de unión

Las afinidades de unión de péptidos químicamente sintetizados para TPO-R se midieron en un ensayo de unión de competición. Los pocillos de una placa de microvaloración se recubrieron con un 1 mg de estreptavidina, se bloquearon con PBS/1% BSA, seguido de 50 ng de anticuerpo inmovilizante de anti-receptor biotinilado (Ab179). Los pocillos se trataron luego con una dilución 1:10 de cosecha de TPO-R soluble. Las distintas concentraciones de péptido o mimético de péptido se mezclaron con una cantidad constante de una forma truncada de TPO que consistía en los residuos 1-156 condensados al término C de la proteína de unión a maltosa (MBP-TPO_{156}). Las mezclas de péptido MBP-TPO_{156} se añadieron a los pocillos recubiertos con TPO-R, se incubaron durante 2 horas a 4ºC y luego se lavaron con PBS. La cantidad de MBP-TPO_{156} que se unió en equilibrio se midió añadiendo IgG anticonejo de cabra conjugada con un antisuero de conejo de cabra conjugado contra MBP, seguido de IgG anticonejo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina. La cantidad de fosfatasa alcalina se determinó luego usando métodos
convencionales.

El ensayo se realizó en un intervalo de concentraciones de péptido y los resultados se grafican de modo tal que el eje y representa la cantidad de MBP-TPO_{156} unido y el eje x representa la concentración de péptido o mimético de péptido. Se puede entonces determinar la concentración en la que el péptido o mimético de péptido reducirá en un 50% (CI_{50}) la cantidad de MBP-TPO_{156} unido a TPO-R inmovilizado. La constante de disociación (Kd) para el péptido debería ser similar a la CI_{50} medida usando las condiciones de ensayo anteriormente descritas.

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Ejemplo 4

Péptidos en plásmidos

Se usa el vector pJS142 para la construcción de una colección y se muestra en la Figura 4. Se necesitan tres secuencias de oligonucleótidos para la construcción de la colección: ON-829 (5' ACC ACC TCC GG); ON-830 (5' TTA CTT AGT TA) y un oligonucleótido de interés específico de una colección (5' GA GGT GGT {NNK}_{n} TAA CTA AGT AAA GC), en donde {NNK}_{n} denota una región aleatoria de la longitud y la secuencia deseadas. Los oligonucleótidos pueden fosforilarse en 5' químicamente durante la síntesis o después de la purificación con cinasa de polinucleótidos. Luego se anelan en una relación molar 1:1:1 y se ligan al vector.

La cepa de E. coli que preferiblemente se usa para selección por afinidad tiene el genotipo: \Delta(srl-recA) endA1 nupG lon-11 sulA1 hsdR17 \Delta(ompT-fepC)266 \DeltaclpA319: : kan \DeltalacI lac ZU118 que puede prepararse a partir de cepa de E. coli del E. coli Genetic Stock Center de la Universidad de Yale (E. coli b/r, designación del centro de stock CGSC:6573) con genotipo lon-11 sulA1. La cepa de E. coli anteriormente mencionada se prepara para uso en electroporación como lo describen Dower et al. Nucleic Acids Res. 16:6127 (1988), excepto que se usa glicerol al 10% para todas las etapas de lavado. Las células se ensayan para eficacia usando 1 pg de un plásmido Bluescript (Stratagene). Estas células se usan para desarrollo de la colección original y para ampliación de la población enriquecida después de cada tanda de selección por afinidad.

Los péptidos en plásmidos se liberan de las células para selección por afinidad por digestión enzimática moderada de la pared celular, usando lisozima. Después de sedimentar los sedimentos celulares, el lisado bruto puede usarse directamente en la mayoría de los receptores. Si se necesita alguna purificación adicional de los complejos de plásmido, se puede utilizar una columna de filtración de gel para eliminar muchos de los contaminantes de bajo peso molecular en el lisado bruto.

La selección por afinidad se lleva a cabo en un tampón (HEKL) de una concentración salina inferior que la mayoría de los tampones fisiológicos. La selección por afinidad puede realizarse en pocillos de microvaloración con un receptor inmovilizado en un anticuerpo monoclonal no bloqueante (MAb) o seleccionando por afinidad en esferas o en columnas. Más específicamente, en la primera tanda de selección por afinidad. Se pueden usar 24 pocillos, cada uno recubierto con receptor. Para la segunda tanda, típicamente se usan seis pocillos recubiertos con receptor (muestra PAN) y 6 pocillos sin receptor (muestra NC). La comparación del número de plásmidos en estas dos muestras puede dar una indicación de si los clones específicos del receptor están siendo enriquecidos por selección por afinidad. "Enriquecimiento" se define como la relación de transformantes PAN a aquellos recuperados de la muestra NC. El enriquecimiento de 10 veces usualmente es una indicación de que están presentes clones específicos del
receptor.

En tandas posteriores de selección por afinidad, es útil reducir la introducción de lisado a los pocillos para reducir la unión de fondo no específica de los complejos de plásmido. En la tanda 2, usualmente se usan 100 \mul de lisado por pocillo. En la tanda 3, se usan 100 \mul de lisado por pocillo diluidos con 1/10 en HEKL/BSA. Para tandas adicionales de selección por afinidad, típicamente se usa una introducción de unidades transformantes de plásmido de por lo menos 1000 veces encima de la diversidad restante estimada.

Las propiedades de unión de los péptidos codificados por clones individuales típicamente se examinan después de 3, 4 ó 5 tandas de selección por afinidad, dependiendo de los números de enriquecimiento observados. Típicamente, se usa un ELISA que detecta la unión específica al receptor por proteína de fusión LacI-péptido. LacI es normalmente un tetrámero y la especie de unión de ADN funcional mínima es un dímero. Los péptidos se exhiben, por tanto, en forma multivalente en la proteína de fusión. Suponiendo que una densidad suficiente de receptor puede inmovilizarse en los pocillos, los péptidos condensados a LacI se unirán a la superficie en un modo cooperativo y multivalente. Esta unión cooperativa permite la detección de eventos de unión de baja afinidad intrínseca. La sensibilidad de este ensayo es una ventaja en el sentido que se pueden identificar fácilmente impactos iniciales de baja afinidad, pero es una desventaja en el sentido de que la señal en el ELISA no se correlaciona con la afinidad intrínseca de los péptidos. La fusión de los péptidos a la proteína de unión a maltosa (MBP), como se describe a continuación, permite pruebas en un formato ELISA en el que la fuerza de la señal se correlaciona mejor con la afinidad. Véase la Figura 5A-B.

El ADN de clones de interés puede prepararse en forma bicatenaria usando cualquier procedimiento de miniprep convencional. Las secuencias codificantes de clones individuales o poblaciones de clones interesantes pueden transferirse a vectores que condensan esas secuencias en marco con el gen que codifica MBP, una proteína que en general ocurre como monómero en disolución. La clonación de una colección en pJS142 crea un sitio de restricción BspEI cerca del comienzo de la región codificante aleatoria de la colección. La digestión con BspEI y ScaI permite la purificación de un fragmento de ADN de 900 bp que puede subclonarse en uno de dos vectores, pELM3 (citoplásmico) o pELM15 (periplásmico), que son modificaciones simples de los vectores pMALc2 y pMALp2, respectivamente, comercializados por New England Biolabs. Véase la Figura 5A-B. La digestión de pELM3 y pELM15 con AgeI y ScaI permite la clonación eficiente del fragmento BspEI-ScaI de la colección pJS142. Los extremos BspEI y AgeI son compatibles para ligadura. Además, la ligadura correcta de los sitios ScaI es esencial para recrear un gen bla funcional (resistencia a Amp), reduciendo así el nivel de clones de fondo de los eventos de ligadura no deseados. La expresión de las fusiones de péptido MBP impulsadas por el promotor tac pueden entonces inducirse con IPTG.

Los lisados para ELISA de LacI o MBP se preparan a partir de clones individuales lisando células que usan lisozima y eliminando sedimentos celulares insolubles por centrifugación. Los lisados se añaden luego a pocillos que contienen el receptor inmovilizado y a pocillos de control sin receptor. La unión por las fusiones de péptido MBP o LacI se detecta por incubación con un antisuero policonal de conejo dirigido contra LacI o MBP seguido de incubación con anticuerpo secundario anticonejo de cabra marcado con fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina unida se detecta con sustrato cromagénico de fosfato de p-nicrofenilo.

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Ejemplo 5

Sistema de "dímeros de cabecera"

Una variante de la técnica péptidos LacI en plásmidos utiliza una proteína de unión a ADN llamada "dímero de cabecera". La unión de ADN por el represor lac de E. coli es mediada por el dominio "de cabecera" de aproximadamente 60 aminoácidos. El dímero de los dominios de cabecera que se une al operador lac normalmente se forma por asociación del dominio C-terminal de aproximadamente 300 aminoácidos que es mucho más largo: El sistema de "dímeros de cabecera" utiliza moléculas diméricas de cabecera que contienen dos cabeceras conectadas por un enlazador de péptidos corto. Estas proteínas se unen al ADN con suficiente estabilidad para permitir la asociación de un epítopo de péptido exhibido en el término C del dímero de cabecera con el plásmido que codifica ese péptido.

Los péptidos aleatorios se condensan al término C de del dímero de cabecera, que se une al plásmido que lo codificó para formar un complejo péptido-dímero de cabecera-plásmido que puede detectarse con selección por afinidad. El sistema dímero de cabecera-péptidos en plásmidos permite mayor selectividad para ligandos de gran afinidad que el sistema LacI. Por tanto, el dímero de cabecera es útil para elaborar colecciones de mutagénesis basadas en impactos de baja afinidad inicial, y para seleccionar variantes de afinidad superior de esas secuencias iniciales.

Las colecciones se construyen como con péptidos en plásmidos usando el vector dimérico de cabecera pCMG14 (véanse las Figuras 6A-C). No se requiere la presencia del operador lac para unión de plásmidos por la proteína dimérica de cabecera. Las colecciones se introdujeron en una cepa bacteriana que comprendía E. coli (lon-11 sulA1 hsdR17 (ompT-fepC) \DeltaclpA319::kan \DeltalacI lac ZU118 \Delta(srI-recA) 306::Tn10 y se ampliaron bajo condiciones de inducción del promotor (A) basal. La selección por afinidad de las colecciones de dímeros de cabecera se lleva a cabo por procedimientos similares a aquellos utilizados para colecciones de LacI, excepto que se usó el tampón HEK en lugar del tampón HEKL, y la elución de los plásmidos de los pocillos se realizó con fenol acuoso en lugar de IPTG. Las secuencias de selección por afinidad del dímero de cabecera con frecuencia se caracterizan después de la transferencia al vector MBP de modo de poder ensayarse en el ELISA de MBP sensible a afinidad y también de modo que puedan detectarse poblaciones de clones por siembras por réplica con receptor marcado.

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Ejemplo 6

En este Ejemplo, los compuestos ciclados se sometieron a tres ensayos. Primero, se obtuvieron los valores CI_{50} como se describió anteriormente. Además, se realizó un ensayo de proliferación celular MTT como se describió anteriormente, para calcular los valores CE_{50}. Finalmente, se realizó un ensayo microfisiómetro (Molecular Devices Corp.). Básicamente, en este ensayo se determinó el índice de acidificación del medio extracelular en respuesta a la estimulación del receptor de TPO por los compuestos de la invención. Los intervalos para CE_{50} se indican simbólicamente como para los valores CI_{50} anteriormente descritos. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

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Ejemplo 7

En este Ejemplo, los sustitutos de aminoácidos en las posiciones D, E, I, S o F en el compuesto ciclado

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se ensayaron para valores CE_{50} y CI_{50}, como se describió anteriormente. Los resultados del ensayo microfisiómetro se exponen entre paréntesis. Los resultados se resumen en la Tabla 5 a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5

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Ejemplo 8

En este Ejemplo, las sustituciones de aminoácidos en el compuesto

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se evaluaron en las posiciones D, S o F como se indica en la Tabla 6 a continuación. Se calcularon los valores CE_{50} y CI_{50}, como se describió anteriormente. Los resultados del ensayo microfisiómetro se exponen entre paréntesis.

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TABLA 6

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Ejemplo 9

En este Ejemplo, se calcularon los valores CE_{50} y CI_{50} como se describió anteriormente para los compuestos diméricos enumerados en la Tabla 7 a continuación. El monómero ciclado

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se incluye como comparación.

Los compuestos de la Tabla 8 estuvieron inactivos en la concentración máxima ensayada de 10 \mum.

En la Tabla 9, se comparan los valores CE_{50} y CI_{50} determinados como se describió anteriormente para variantes cicladas y dimerizadas de I E G P T L R Q W L A A R A.

En la Tabla 10, se comparan las truncaciones del dímero

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Se calcularon los valores CE_{50} y CI_{50}, como se describió anteriormente. Los resultados del ensayo microfisiómetro se exponen entre paréntesis.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7

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TABLA 8

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TABLA 9

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TABLA 10

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Ejemplo 10

En este ejemplo, se introdujeron diversas sustituciones en las posiciones G, P y W del compuesto ciclado

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La Tabla 11 enumera ejemplos de los compuestos sustituidos que muestran actividad agonista de TPO. Las sustituciones abreviadas en la tabla son las siguientes:

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TABLA 11

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Reemplazos de prolina

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Reemplazos de triptófano

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Reemplazos de glicina

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Ejemplo 11

Para evaluar la factibilidad de los ratones como especies de ensayo convenientes, se realizaron diversos experimentos in vitro, diseñados para medir la actividad de los compuestos de prueba en el receptor de ratón. Primero, se incubaron células de médula, obtenidas de los fémures de ratones Balb/C de 8 a 9 semanas de vida, durante 7 días en cultivo líquido con rhuTPO o distintas concentraciones de los péptidos de prueba. Al final del período de incubación, los cultivos se concentraron por Citospina, se tiñeron para acetilcolinesterasa (AChE, un diagnóstico de megacariocitos de ratón) y se contaron por análisis microscópico. Un (1) nM rhuTPO generó el crecimiento de células no adherentes muy grandes (>40 um) que tiñen para AChE. Estas células parecen ser megacariocitos maduros. A partir de una siembra inicial de 10^{6} células de médula totales/ml (en 50 ml de cultivos) se desarrolló un estimado de 1 a 2 x 10^{6} megacariocitos. Esta respuesta a la TPO se designó como "máxima". Los cultivos de control que no contenían factores de crecimiento añadidos produjeron muy pocas células AChE-positivas. Varios de los compuestos peptídicos se ensayaron en alta concentración en este ensayo y los resultados se resumen en la Tabla 12. El péptido A ac 10 uM produjo una respuesta máxima de la médula de ratón. Este hallazgo fue la primera prueba de que esta familia de péptidos es activa en el receptor murino. En un segundo experimento, se recolectaron células de médula y se cultivaron en medio semisólido (metilcelulosa) que no contenía ningún factor, rhuTPO 1 nM o péptido A 10 uM. Después de 7 días en cultivo, las colonias de células grandes (que se supone son megacariocitos) se contaron y agruparon en colonias pequeñas (3-5 células) o en colonias grandes (superiores a 6 células). Los resultados se muestran en la Tabla 13. La TPO y los péptidos de prueba produjeron ambos sustancialmente más colonias de ambos tamaños que los cultivos de control negativo. Esto indica que los péptidos imitan la capacidad de la TPO de estimular la expansión de la población de células precursoras Mk.

Para obtener una comparación más cuantitativa de la actividad de los compuestos de prueba en receptores murinos y humanos, se clonó el receptor de muTPO y se transfectó a células BaF3. Se aisló una población de células dependientes de TPO.

TABLA 12

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TABLA 13

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Claims (13)

1. Un compuesto que se une al receptor de trombopoyetina, teniendo dicho compuesto

(1) un peso molecular inferior a 8000 daltons, y

(2) una afinidad de unión hacia el receptor de trombopoyetina según lo expresado por CI_{50} de no más de 100 \mum

en donde dicho compuesto comprende una secuencia de aminoácidos:

X_{8}GX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}X_{5}WX_{7}

en la que X_{8} es cualquiera de los 20 L-aminoácidos genéticamente codificados; X_{1} es P; X_{2} es T; X_{3} es L; X_{4} es R; X_{5} es E o Q; X_{7} es I o L.

2. El compuesto según la reivindicación 1, en el que dicho compuesto comprende una secuencia de aminoácidos:

X_{9}X_{8}GX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}X_{5}WX_{7}

en la que X_{8} es A, C. D, E, K. L, Q, R, S, T o V; y X_{9} es A, C, E, G, 1, L, M, P, R, Q, S, T o V.

3. El compuesto según la reivindicación 2, en el que X_{8} es D, E o K; y X_{9} es A o I.

4. El compuesto según la reivindicación 3, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en GG
CADGPTLREWISFCGG; GNADGPTLRQWLEGRRPKN; GGCADGPTLREWISFCGGK; TIKGPTLRQWLKSR
EHTS; SIEGPTLREWLTSRTPHS; LAIEGPTLRQWLHGNGRDT; CADGPTLREWISFC; y IEGPTLROWLAARA.

5. Un compuesto que se une al receptor de trombopoyetina, teniendo dicho compuesto:

(1) un peso molecular inferior a 8000 daltons, y

(2) una afinidad de unión hacia el receptor de trombopoyetina según lo expresado por un CI_{50} no superior a 100 \muM, en donde dicho compuesto comprende una secuencia de aminoácidos: GGCTLREWLHGGFCGG.

6. Un compuesto que se une al receptor de trombopoyetina, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en

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7. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto según la reivindicación 1 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la preparación de un medicamento para activar el receptor de trombopoyetina en un ser humano.

9. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno hematológico.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que el trastorno es un trastorno plaquetario o trombocitopenia.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que el trastorno es la trombocitopenia provocada por la quimioterapia, radioterapia o transfusiones de médula ósea.

12. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el compuesto está covalentemente unido a un polímero no proteináceo.

13 Un compuesto según la reivindicación 12, en el que el polímero proteináceo se selecciona de la lista de: polietilenglicol, polipropilenglicol y polioxialquenos.

14. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que dicho compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en:

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