ES2181691T5 - Sistema de distribucion de proteina eritropoyetina. - Google Patents
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Abstract
MICROSFERAS DE POLIMERO BIODEGRADABLE, PREFERIBLEMENTE FORMADAS DE ZEINA, SON USADAS PARA LA LIBERACION EN VIVO DE LA ERITROPOYETINA (EPO). LOS EJEMPLOS DEMUESTRAN LA ADMINISTRACION DE LA EPO EN ZEINA Y POLILACTIDOS Y MICROSFERAS DE POLIMERO A PERROS Y MONOS, CON EL INCREMENTO APROPIADO EN LOS NIVELES DE SANGRE Y UN INCREMENTO EN LAS CANTIDADES DE RETICULOCITOS.
Description
Sistema de distribución de proteína
eritropoyetina.
La eritropoyetina (EPO) es una glicoproteína que
pesa entre 34 y 38 Kda y tiene 165 aminoácidos, con aproximadamente
el 40% de su peso molecular de carbohidratos, originalmente aislada
de la orina, pero posteriormente producida por ingeniería genética
recombinante, que se usa para incrementar la cantidad de glóbulos
rojos. La producción normal de glóbulos rojos de un humano requiere
la secreción de la eritropoyetina por el riñón, según parece como
la glicoproteína madura. En el estado estacionario, esta hormona
circula en la sangre con una concentración desde 10 a 18
miliunidades (128-230 picogramos) por mililitro. La
hormona provoca la proliferación y diferenciación de una población
de células madre en la médula ósea, estimula la síntesis de la
hemoglobina en la maduración de las células eritrocitarias, y
acelera la liberación de los glóbulos rojos desde la médula a la
circulación, incrementando así la masa de glóbulos rojos y
mejorando las condiciones de hipoxia.
Pacientes con deficiencias de EPO a menudo
sufren anemia severa. La EPO es usada para tratar pacientes con
anemias asociadas a un fallo renal crónico, incluyendo pacientes en
diálisis (última etapa de la enfermedad renal) y pacientes que no
llevan a cabo diálisis, así como la anemia asociada al SIDA. LA EPO
es administrada como un bolo intravenoso tres veces por semana a
pacientes con diálisis y mediante una inyección subcutánea tres
veces a la semana en pacientes que no están en diálisis. Para
pacientes que están recibiendo EPO en bases crónicas
hipodérmicamente, las frecuentes inyecciones, dan como resultado
subidas y bajadas en los niveles de plasma y también problemas con
la incomodidad del paciente.
Es conveniente encontrar un método y medios para
la distribución oral o parenteral de la EPO que sea económico,
seguro y efectivo.
Una formula oral sería un avance significativo
en la administración del fármaco. Una fórmula oral requeriría una
protección intestinal frente a las vías degradativas en el tracto
gastrointestinal. La microencapsulación de la EPO en un sistema
polimérico adecuado podría proteger la proteína incorporada del
severo medio del tracto intestinal. Cualquier proceso de
microencapsulación requiere unas condiciones de formulación suaves
como bajas temperaturas, pH fisiológico y un sistema solvente
compatible para la preservación de la actividad biológica de la
EPO.
Es por lo tanto un propósito de la proteína
invención, dar un método para la liberación controlada, retrasada
de la EPO cuando es administrada por vía oral o parenteral.
Se utilizan microesferas de polímero
biodegradable, preferiblemente formadas por zeína, para liberar la
eritropoyetina (EPO) in vivo. Las microesferas son
preferiblemente administradas enteras, pero pueden ser administradas
por otros medios, para una liberación posterior. Seleccionando
rangos particulares de tamaño y el polímero específico a emplearse
para la formación de la microesfera, es posible dirigir las
microesferas a un tipo de célula tal como los macrófagos, o llevar
a cabo la absorción localizada de las microesferas a regiones como
las membranas mucosas de la boca, el tracto gastrointestinal o las
áreas urogenitales.
Los Ejemplos demuestran la administración de la
EPO en microesferas de zeína y polímeros a perros y monos, con
apropiados incrementos de los niveles sanguíneos y un aumento en el
conteo de reticulocitos.
La Figura 1 es un gráfico de los niveles de EPO
(mU/ml) en el suero sanguíneo en el tiempo (horas) en perros a los
que se les ha administrado subcutáneamente EPO en microesferas de
zeína.
La Figura 2 es un gráfico de los niveles de EPO
en suero (mU/ml) en el tiempo (días) en monos a los que se les ha
administrado EPO en microesferas de zeína por vía entérica.
La Figura 3 es un gráfico de conteos
normalizados de reticulocitos en el tiempo (días) en monos a los que
se les ha administrado EPO en microesferas de zeína o placebo en
microesferas de zeína por vía entérica.
La Figura 4 es un gráfico de los niveles de EPO
en el suero (mU/ml) en el tiempo (días) en ratas a las que se les
ha administrado subcutáneamente EPO en microesferas de PLGA
(cuadrados, rata U10 (5.8 mg), cuadrados oscuros, rata U11 (2.5
mg)).
Un método de distribución de la EPO es descrito
como aquel en el cual las microesferas poliméricas que contienen
EPO son administradas a un humano o a un animal de tal manera que la
EPO es liberada por difusión y/o degradación de las microesferas.
Las microesferas están formadas por polímeros biodegradables,
preferiblemente polímeros proteicos como la prolamina o
poliláctidos. Una proteína particularmente preferida es la zeína. En
este texto, con polímero se refiere tanto a los polímeros
sintéticos como a las proteínas. Las microesferas son administradas
por vía oral o por inyección, y se libera la EPO por difusión y
degradación de la microesfera.
Las microesferas de prolamina tienen importantes
ventajas. La matriz de prolamina es una sustancia natural y
biodegradable y se metaboliza en el organismo en péptidos y/o
aminoácidos. Las prolaminas pueden ser modificadas química o
enzimáticamente, para dotarlas con propiedades deseadas, como un
grado seleccionado de degradación. El proceso de creación de las
microesferas a partir de una solución de prolamina no requiere una
temperatura elevada de calentamiento o entrecruzamiento lo cual
podría degradar el material que va a ser incorporado. Por otra
parte, las microesferas pueden ser diseñadas para ser absorbidas a
través del epitelio intestinal a la corriente sanguínea y/o el
sistema linfático, o para tener por objetivo órganos específicos o
células fagocíticas. Las microesferas, por lo tanto tienen al menos
tres ventajas diferenciadas para controlar la distribución: la
protección de los agentes que podrían ser atacados y/o degradados
por las severas condiciones del tracto alimenticio o los enzimas de
la sangre; buscando un lugar para la liberación (como las células
fagocíticas, membranas mucosas o la sangre); y momento y velocidad
de la liberación controlados.
Las microesferas que contienen la EPO se crean
incorporando la EPO en una microesfera polimérica biocompatibe, en
donde la microesfera que contiene la EPO está caracterizada por una
liberación controlada sostenida de la EPO, preferentemente sobre un
periodo desde al menos 24 horas hasta un período de uno o dos meses.
En el recubrimiento preferente el polímero es biodegradable, las
microesferas tienen un diámetro de menos de ciento ochenta micras,
preferiblemente menos de setenta micras, y son adecuados para su
administración por inyección subcutánea o intramuscular (un tamaño
adecuado para la inyección a través de una aguja de medida 23
debería ser menor de 180 \mum de diámetro) y las microesferas
contienen desde un 0.01% del peso hasta aproximadamente el 20% del
peso de EPO.
Dentro de este texto, "micro" se refiere a
una partícula que tiene un diámetro desde nanómetros hasta
micrómetros. Las microesferas son partículas sólidas esféricas; las
micropartículas son partículas de forma irregular y no esférica.
Una microesfera puede tener un recubrimiento externo de distinta
composición que el material usado originalmente para formar la
microesfera. A menos que se especifique lo contrario, el término de
microesferas puede ser usado para abarcar microcápsulas y el
término micropartículas puede ser usado para abarcar
micropartículas, microesferas y microcápsulas. Las micropartículas
están específicamente referidas a cuando describimos polímeros de
forma irregular o partículas de medicamento polimérico. Las
microcápsulas son de forma esférica Las microcápsulas están
esféricamente formadas por mecanismos poliméricos, teniendo un
núcleo no polimérico o un núcleo de un polímero distinto del de la
corteza externa. Una "microesfera compuesta" es una microesfera
formada por, al menos, dos materiales diferentes, como proteína y
polímero o dos proteínas. Un "compuesto" es una agregación de
microesferas hechas como se describe aquí, confinado con materiales
conocidos por los entendidos en la materia de este propósito.
Como se usa en este texto liberación
"continuada" o "a largo plazo" de la EPO puede ser
continua o discontinua, lineal o no lineal. Esto puede ser llevado
a cabo usando uno o más tipos de composición polimérica, cargas de
fármacos, selecciones de excipientes o aumentos de degradación, u
otras modificaciones, administradas solas, combinadas o
secuencialmente para producir este efecto.
La EPO puede ser incorporada en (1) la matriz
polimérica formando microesferas, (2) micropartícula(s)
rodeadas por el polímero el cual forma las microesferas, (3) el
centro del polímero con una microesfera de proteína, (4) un
recubrimiento de polímero alrededor de la microesfera polimérica,
(5) mezclado con microesferas agregadas en una forma larga, o
combinación de las mismas.
La EPO puede ser incorporada como partículas o
disolviendo la EPO con el polímero. El volumen de EPO tiene una
actividad específica de 120.000 a 180.000 unidades/mg. Es
incorporado en el polímero en una concentración entre 50 y 40.000
unidades/mg de polímero. En el recubrimiento preferente para la
entrega por vía oral, la EPO es disuelta con zeína en una mezcla
acuosa de etanol. La zeína es disuelta en una solución orgánica
acuosa con un rango de concentración de 3-15% (w/v)
con una concentración preferente del 5-8%. Los
estabilizantes pueden ser incorporados por adición de los
estabilizantes a la solución anterior de EPO por liofilización.
Una variedad de técnicas son conocidas por las
cuales los agentes activos pueden ser incorporados a las
microesferas poliméricas sintéticas.
En el secado por atomización el polímero y la
EPO son mezclados juntos en un disolvente para el polímero, luego
el disolvente es evaporado por la atomización de la solución,
dejando gotitas poliméricas que contienen el agente activo. El
"spray drying" es repasado con detalle por K. Masters en
"Spray drying Handbook" (John Wiley & Sons, New York
1984); y Patrick B. Deasy en \Microencapsulation and Related Drug
Processess'' Marcel Dekker, INC. Mueva York 1984). El "spray
drying" no es el preferido dado que hubo resultados en los cuales
había bajado la actividad debido al calor generado en el proceso
así como una bajada de cantidades considerables del material debido
al pegado del polímero en gran parte del área exterior en los lados
de la cámara.
Las técnicas de evaporación del solvente pueden
ser usadas para formar microesferas. Estas técnicas incluyen
disolver el polímero en un disolvente orgánico que contenga disuelto
o disperso el agente activo.
La solución de polímero/agente activo es luego
añadida a una fase de agitación continua que suele ser acuosa. Los
emulsionantes son incluidos en la fase acuosa para estabilizar la
emulsión de agua en aceite. El solvente orgánico es entonces
evaporado en un periodo de varias horas o más, depositándose así el
polímero alrededor del material central. El solvente puede ser
quitado de las microesferas en un solo paso, como se describe en la
patente U.S. No. 3737337 y en la patente U.S. No. 3523906 o en la
patente U.S. No. 3691090 (bajo presión reducida), o por aplicación
de calor, como se muestra en la patente U.S. No. 3891570. Una
técnica de dos pasos es descrita en la patente U.S. No. 4389330. El
secado por congelación ha sido también empleado para quitar el
disolvente de las microesferas como se describe por Sato, et
al, en \Porous Biodegradable Microspheres For Controlled Drug
Delivery. I. Assement of proccesing conditions and solvent removal
techniques'', Pharmaceutical Research 5, 21-30
(1988).
La evaporación del disolvente trabaja
razonablemente bien pero no es la preferida desde que la cantidad de
material incorporado es normalmente más baja que las valoraciones
teóricas debido a la pérdida del medicamento en la fase acuosa,
como es presentado por Benita et al, en "Characterization
of drug loaded Poly(d,1-lactide)
Microspheres", J. Pharm. Sci. 73, 1721-1724
(1984).
Las técnicas de separación de fase pueden ser
usadas para formar microesferas. Estas técnicas incluyen la
formación de una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite
en agua. El polímero es precipitado desde la fase continua al
agente activo con un cambio de temperatura, pH, fuerza iónica o por
la adición de precipitados. Por ejemplo, en el estado de la técnica
No.4675800 et al, describe la formación de microesferas de
poli (lácticos-co-glicólicos)
ácidos que contiene proteínas activas. La proteína es primero
disuelta en la fase acuosa de emulsión de agua en aceite o
dispersada como un sólido en la fase polimérica. El polímero es
luego precipitado alrededor de las gotitas acuosas o partículas de
fármacos por adición de un no disolvente para el polímero como el
aceite de silicona. El producto final, como con la mayoría de las
técnicas de separación de fase, tiene la forma de una microcápsula.
Las microcápsulas contienen un material central rodeado por una
cápsula de membrana polimérica. Las microcápsulas no son el
recubrimiento preferido para la entrega de la EPO, sin embargo dada
la cinética de liberación de los agentes activos desde estos
dispositivos puede ser difícil de controlar.
Si bien estas técnicas de separación de fases
resultan en la formación de las microesferas que contienen los
agentes activos, el agente activo se pierde a menudo durante el
proceso de extracción del disolvente. Además, como con secado por
atomización, las proteínas biológicamente activas pueden ser
desnaturalizadas durante el proceso.
Un método para hacer microesferas de EPO,
teniendo las características convenientes es descrito en la patente
U.S. No. 5019400 por Gombotz, et al. Hay dos recubrimientos
principales en el sistema de hacer microesferas: una combinación de
sistemas no disolvente con gas líquido congelado y un sistema no
disolvente congelado.
Para que el polímero y el agente sean
encapsulados en la solución son atomizados usando un aparato
ultrasónico en un gas líquido. Las partículas atómicas se congelan
cuando contactan con gas líquido (nitrógeno líquido), formando
esferas congeladas. Estas se hunden hasta la superficie del no
solvente helado (etanol). El gas líquido es evaporado y las esferas
empiezan a hundirse en el no disolvente a medida que el
no-solvente se derrite. El disolvente de las
esferas es extraído al no disolvente para formar microesferas que
contienen el agente que va a ser encapsulado. Otras no disolventes
como el hexano son añadidas al no disolvente (etanol) para aumentar
el rango de extracción del disolvente de ciertos polímeros, donde
fuera apropiado, por ejemplo, cuando las esferas están formadas por
polímeros poli
láctidos-co-glicólicos. El gas
licuado puede ser argón líquido (-186ºC), nitrógeno líquido
(-195.8ºC), oxígeno líquido (-182.9ºC) u otro gas que de lugar a la
congelación inmediata de las partículas atomizadas en las esferas
heladas. El oxígeno no es preferido dado que es explosivo y puede
causar la oxidación de la proteína.
Alternativamente, el no solvente frío para el
polímero puede ser sustituido por la combinación del gas líquido
helado no solvente, siempre que la temperatura del no solvente esta
por debajo de la temperatura de congelación del polímero/solución
del agente activo.
En las dos realizaciones, es importante que el
polímero/agente activo se congelen en cuanto contacten con el
líquido frío, y luego sea lentamente derretido y el disolvente
polimérico sea extraído de las microesferas.
\newpage
El rango de deshielo depende de la elección de
solventes y no solventes. Es importante la selección de un solvente
para el polímero teniendo un punto de fusión mayor que el no
disolvente para el polímero para que el no disolvente se derrita
antes, permitiendo que las microesferas congeladas se hundan en el
líquido donde ellas más tarde se fundirán. Si un sistema no
disolvente frío líquido para crear las microesferas poliméricas es
usado, las microesferas se hundirán inmediatamente en el no
disolvente. Como el disolvente en la microesfera se deshiela, es
extraído en el no solvente. El solvente para el polímero y el no
solvente para el polímero deben ser miscibles para permitir la
extracción del solvente de las microesferas. La tabla 1 nos muestra
algunos sistemas polímero/solvente/no solvente que pueden ser
usados a lo largo de este proceso y sus puntos de fusión.
La mezcla polimérica/agente activo/disolvente
puede ser atomizada en el líquido frío, tanto el gas lípido como el
no solvente frío, usando una variedad de mecanismos los cuales
pueden ser usados para formar partícula pequeñas, incluyendo
boquillas sónicas, boquillas de presión, boquillas neumáticas, y
atomizadores rotatorios.
Se pueden fabricar microesferas de un amplio
rango de tamaño variando el tamaño de la gota, por ejemplo,
cambiando el diámetro de la boquilla. Si se desean esferas muy
grandes, las esferas pueden ser empujadas fuera a través de una
jeringuilla directamente al líquido frío. El incremento de la
viscosidad inherente de la solución polimérica puede también
resultar en un incremento del tamaño de las microesferas. El tamaño
de las esferas producidas por este polimérica puede variar desde
mayores de 1000 hasta 5 micras de diámetro. Un rango preferido de
tamaño para microesferas inyectables es desde 30 a 180 micras de
diámetro. Las microesferas creadas por esta técnica poseen forma
esférica.
Se puede emplear casi cualquier método de
polimérica siempre que se encuentre el solvente y no solvente
apropiados que tengan los puntos de fusión deseados. Generalmente,
se prepara una solución polimérica que contiene entre un 1% y un
30% de polimérica, preferiblemente entre 5-10%.
El termino "bioerosionable" o
"biodegradable" son usados aquí para referirse a los materiales
que son enzimáticamente o químicamente degradados en lípido en
especies químicas más sencillas.
Los polisacáridos son ejemplos de polimérica
naturales. Los polimérica sintéticos que pueden ser usados para
formar las microesferas incluyen polimérica, método
poli(láctidos), poli
(láctido-co-glicólico),
poli(co prolactano), policarbonatos, poliamidas,
polianhídridos, poliaminoácidos, poliortoesteres, poliacetatos,
policianoacrilatos y poliuretanos degradables, y polimérica no
degradables método los poliacrilatos, polimérica de
etileno-lípido acetano y otros acetatos de celulosa
acil sustituidos y derivados de ellos, poliuretanos no degradables,
poliestirenos, cloruro de polivinilo, fluoruro de polivinilo,
poli(lípido imidazole), poliolinas clorosulfonadas y método
de polietileno.
\newpage
Las microesferas pueden estar formadas por
proteína, o mezclas de polimérica con proteína. Los copolímeros
PLA, PGA y PLA/PGA son particularmente útiles para formar
microesferas compuestas de prolamina. Los polimérica PLA son
normalmente preparados a partícula de ésteres cíclicos de ácidos
lácticos. Las formas L(+) y D(-) del ácido láctico pueden ser
usadas para preparar los polimérica de PLA, así método la mezcla del
ácido DL láctico que es ópticamente inactivo a partícula de D(-) y
L(+) ácidos lácticos. Los métodos de preparación de los
poliláctidos están bien documentados en la literatura de patentes.
Las siguientes patentes US describen con detalle los poliláctidos
adecuados, sus propiedades y su preparación: 1995970 de Dorough;
2703316 de Scheneider; 2758987 de Salzberg; 2951828 de Zeile;
2676945 de Higgins; y 2683136; 3531561 de Trehu.
El PGA es el homopolímero de ácido glicólico
(ácido hidroxiacético). En la conversión de ácido glicólico a poli
(ácido glicólico), el ácido glicólico reacciona inicialmente consigo
mismo para formar el éster glicólico cíclico, el cual en proteína
de calor y de un catalizador se convierte en un polimérica de cadena
lineal de alto peso molecular. Los polimérica PGA y sus propiedades
se describen con más detalle en "Cynamid Research Develops
World's First Synthetic Absorbable Suture", Chemistry and
Industry 905 (1970).
Tanto la liberación del compuesto incorporado
mediante la bioerosión de la matriz están relacionadas con los
pesos moleculares del PLA, PGA, o PLA/PGA. Los pesos moleculares
altos, pesos moleculares polimérica de 90.000 o mayores dan método
resultado matrices polimérica las cuales retienen su integridad
estructural por método más largos de tiempo; mientras que pesos
moleculares más bajos, pesos moleculares polimérica de 30.000 o
método, dan método resultado tanto liberación más lentas método
vidas más cortas de las matrices.
La liberación de la EPO desde método sistemas
polimérica puede ocurrir por dos mecanismos diferentes. El fármaco
puede ser liberación por difusión a través de canales llenos de agua
generados en forma de dosis por disolución del fármaco o por
cavidades creadas al eliminar el solvente del polimérica durante la
microencapsulación original. El segundo mecanismo es un aumento de
la liberación debido a la degradación del polimérica. Con el tiempo,
el polímero comienza a degradarse y genera un incremento de la
porosidad y microestructura dentro del dispositivo. Esto crea
canales adicionales para la liberación del medicamento.
La degradación de los polímeros ocurre por una
hidrólisis espontánea de los enlaces de éster del esqueleto. Así,
puede controlarse la velocidad mediante la modificación de las
propiedades del polimérica que influyen en la captación del agua.
Estos incluyen la proporción de los monómeros (láctico a glicólico),
el uso del L-láctico en contraposición con el D/L
láctico, y el método molecular del polimérica. Estos factores
determinan la hidrofilicidad y cristalinidad las cuales definen en
última instancia el rango de penetración del agua. Los excipientes
hidrofílicos método las sales, carbohidratos y surfactantes pueden
también ser incorporados para aumentar la penetración del agua en
los dispositivos y así acelerar la erosión del polimérica.
Mediante la alteración de las propiedades del
polimérica y las propiedades de la forma de dosificación, se puede
controlar la contribución de cada uno de estos mecanismos de
liberación y alterar la velocidad de liberación de la EPO. El
desgaste lento de los polímeros como el
poli-L-láctico o los
poli(lácticos-co-glicólicos)
de alto peso molecular con bajas composiciones glicólicas puede
provocar que la liberación sea controlada por la difusión. Mediante
el incremento de la composición glicólica y la disminución se
estimula tanto la método de agua método la hidrólisis del
polimérica y se añade un componente de a la cinética de
liberación.
Se puede controlar también la velocidad de
liberación mediante la variación de la carga de EPO método de las
microesferas. Al incrementar la carga se incrementará la red de
canales interconectados formados a partícula de la disolución del
fármaco y aumentará la liberación del fármaco desde las
microesferas. El rango preferido de carga de EPO está entre 40 y
40.000 unidades/mg, siendo el rango con mayor preferencia entre 50 y
20.000 unidades/mg.
La hidrólisis del polimérica es acelerada en
pH's básicos o ácidos y así la inclusión de excipientes ácidos o
básicos puede usarse para modular la velocidad de erosión del
polimérica. Los excipientes pueden ser añadidos método partícula,
pueden ser mezclados con la EPO incorporada o pueden ser disueltos
método del polimérica.
Los estimulantes de la degradación están basados
en el método relativo al método del polimérica. Estos pueden ser
añadidos a la fase proteína método una fase separada (por ejemplo,
método partícula) o pueden ser codisueltos en la fase polimérica
dependiendo del compuesto. En método los casos la cantidad debe
estar entre 0.1 y treinta por ciento (w/w, polimérica). Los lípido
de estimulantes de la degradación incluyen ácidos inorgánicos método
el sulfato de amonio y el cloruro de amonio, ácidos orgánicos
método el ácido cítrico, el ácido benzoico, heparina y ácido
ascórbico, bases inorgánicas método el carbonato de método,
carbonato de potasio, carbonato de calcio, carbonato de zinc e
hidróxido de zinc, y bases orgánicas método el sulfato de proteína,
espermina, colina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina y
surfactantes método el TweenTM y PluronicTM.
Los agentes formadores de polímeros para añadir
microestructura a las matrices (por ejemplo, compuestos solubles en
agua método las sales inorgánicas y azúcares). Se añaden método
partícula. El rango suele estar entre uno y treinta por ciento
(w/w, polimérica).
\newpage
Los excipientes pueden ser también añadidos a la
EPO para mantener su proteína dependiendo de la duración de la
liberación. Los estabilizantes incluyen carbohidratos, aminoácidos,
ácidos grasos, y surfactantes y son conocidos por los entendidos en
la materia. Además, los excipientes que modifican la solubilidad de
la EPO método las sales, agentes acomplejantes (albúmina, proteína)
pueden ser usados para controlar la velocidad de liberación de las
proteína de las microesferas.
Los estabilizantes para la EPO están basados en
proporciones en método respecto a la proteína. Los ejemplos
incluyen carbohidratos método la sacarosa, lactosa, manitol dextrana
y heparina, proteína método la albúmina y proteína, aminoácidos
método la arginina, glicina y proteína, surfactantes método TweenTM
y PluronicTM sales método el cloruro de calcio y el fosfato de
método, y lípido método los ácidos grasos, fosfolípidos y las sales
biliares.
Las proporciones están generalmente entre 1:10 y
4:1, carbohidrato a proteína, aminoácido a proteína, estabilizante
proteína a proteína y sales a proteína; 1:1000 a 1:20, surfactantes
a proteína; y 1:20 a 4:1, lípido a proteína.
Usando el método descrito aquí, las microesferas
de proteína son preparadas mediante una separación de fase de
eliminación del disolvente. La formación de las microesferas depende
de la diferente solubilidad de las proteína en solventes orgánicos
miscibles en agua, soluciones salinas o soluciones ácidas o básicas,
comparados con su solubilidad en una fase inmiscible, tal como una
disolución orgánica no polimérica o un aceite. La mayoría de las
proteínas no son solubles en aceite. Siguiendo este principio, la
proteína es disuelta en un primer solvente que es un solvente
orgánico miscible en agua, un solvente orgánico/acuoso u orgánico
binario, o una solución ácida, básica o salina (la fase
encapsulada). El compuesto para ser incorporado, en forma de
suspensión, emulsión, solución o partícula es añadido a la solución
proteica. Esta mezcla es puesta en contacto con una segunda fase
líquida (la fase continua) que no disuelve las proteínas y tiene una
miscibilidad limitada en el primer solvente. La fase continua es
preferiblemente un aceite, tal como un aceite vegetal, aceite de
silicona o aceite mineral. Se le aplica una agitación vigorosa y el
primer solvente se elimina bajo condiciones suficiente para formar
microesferas, normalmente por evaporación o extracción.
Los recubrimientos pueden también estar hechos
de micrpartículas formadas por polímeros proteicos o no proteicos.
Para crear los recubrimientos, (1) la proteína se disuelve primero
en un solvente; (2) las partícula o micropartículas a recubrir son
añadidas a la disolución; (3) la mezcla proteína/micropartícula es
añadida a una segunda fase líquida la cual no es miscible en el
primer solvente y un no solvente para el recubrimiento de proteína;
(4) la mezcla es agitada; y (5) el primer disolvente es eliminado
(normalmente por evaporación o extracción) bajo condiciones
suficientes para causar que las partícula o micropartículas queden
recubiertas con el recubrimiento de proteína.
El proceso descrito aquí da lugar a microesferas
proteicas que tienen un diámetro entre nanómetros y micrómetros,
con un diámetro medio de entre 0.01 micras hasta menos de
aproximadamente 100 micras, teniendo incorporada en ese lugar un
compuesto para ser distribuido o liberado en un lugar y/o tiempo
deseado. En el método preferente, las microesferas se almacenan
congeladas para aumentar la estabilidad de los compuestos
incorporados sobre períodos de tiempo extensos.
En los recubrimientos preferentes, las proteínas
son proteínas hidrofóbicas, tales como las prolaminas,
preferentemente zeina. Tal como se usan aquí las proteínas pueden
ser de un único tipo, una combinación de proteínas, o una
combinación de proteína con polimérica. Las proteína son usadas para
crear microesferas dado que son naturales, ofrecen una diversas de
propiedades y son degradadas "in vivo" en aminoácidos o
péptidos pequeños inocuos. Las proteínas hidrofóbicas tienen una
solubilidad limitada en agua y son solubles en solventes orgánicos,
mezclas acuosas de solventes orgánicos, y mezclas binarias de
solventes orgánicos. Ejemplos de otras proteínas útiles junto a la
prolamina son el colágeno, caseína y keratina.
Las prolaminas se caracterizan por tener una
gran cantidad de aminoácidos hidrofóbicos, tales como glutamina,
asparagina y prolina. Las prolaminas son insolubles en agua pero son
solubles en muchos solventes orgánicos, particularmente alcoholes
que contienen al menos un uno por ciento de agua, pero no más de un
sesenta por ciento de agua o un solvente orgánico polar.
Las prolaminas son fácilmente obtenibles y
baratas, por ejemplo, como subproductos del procesamiento de los
granos. Las prolaminas representativas incluyen gliadina, kadina,
zeina y hordeina. La prolamina preferente para el uso en la
creación de microesferas es la zeina. Tanto los grados de
accesibilidad comercial como las formas puricadas de la zeina
pueden ser usadas. Las propiedades de la zeina son descritas con
detalle por L.C. Swallen en \Zein- A new Industrial protein'', Ind.
y Eng. Chem., 33:394-398 (1941).
La proteína es disuelta en un solvente
apropiado. La proteína es "soluble" si mas del 0.5% (w/v) de la
proteína se disuelve en el solvente para formar una solución que
sea transparente a la vista a temperatura ambiente (alrededor de
20-25 C). Las prolaminas son solubles, por ejemplo,
en alcoholes (etanol), algunas cetonas (ejemplo, metiletilcetona,
acetona) y solventes amida (ejemplo, acetamida), que contienen entre
5% y 60% de agua; en soluciones con pH extremadamente elevado
(ejemplo, pH 10 o mayor) o bajo (pH 2 o menor); y en soluciones
acuosas desde mas o menos 1.0 a 6N de sales inorgánicas (ejemplo,
NaCl, KBr).
Se conocen varios sistemas de solventes binarios
para la zeina, en los cuales los componentes primarios son los
polioles, especialmente los alcoholes alifáticos inferiores,
cetonas, o glicoles, y los componentes secundarios son agua,
hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos halogenados, especialmente
hidrocarburos clorados, nitroparafinas, aldehídos y éteres
cíclicos. Ejemplos específicos incluyen las mezclas de alcoholes e
hidrocarburos halogenados y mezclas de alcoholes y proilén glicol
con etilén glicol. Los sistemas de solventes binarios para
prolaminas tales como la zeina están recogidos en Manley y Evans,
Industrial and engineering chemistry 36, 661-665
(1943).
El compuesto que va a ser incorporado se añade a
la solución de proteína. El compuesto puede estar en forma de
suspensión, solución, (en aceite, solvente orgánico, o agua),
emulsión o partículas. La mezcla compuesto/proteína es entonces
introducida en una segunda fase líquida, la fase continua la cual es
(1) inmiscible o de miscibilidad limitada con el solvente de la
proteína y (2) no disuelve la proteína. Los disolventes son
"inmiscibles" si no se pueden mezclar unos con otros para
formar una solución estable homogénea a la temperatura operante sin
mezclar. Fases inmiscibles tienden a formar capas separadas bajo
estas condiciones. Aceites, tales como el aceite mineral, el aceite
de silicona, o el aceite vegetal son fases inmiscibles útiles. Otros
incluyen el hexano, el heptano, el dodecano, y el éter de petróleo
de elevado punto de ebullición.
Uno o mas surfactantes pueden ser añadidos a la
mezcla de proteína/primer solvente o a la fase continua para
reducir el tamaño de las microesferas proteicas. Los surfactantes
apropiados, y los métodos de uso de los mismos son conocidos por
los entendidos en la materia.
La solución de proteína fue añadida a la fase
continua y el primer solvente eliminado, preferiblemente por
evaporación o por extracción de solvente, bajo condiciones de
formación de microesferas. Una mezcla eficiente puede ser
conseguida por una rápida agitación mecánica usando un
homogeneizador y/o usando un reactor regulado para prevenir el
flujo laminar. Si es necesario la mezcla puede ser calentada a una
temperatura de entre 22 y 45ºC por un período de entre 15 y 45
minutos. Si es calentada, la mezcla es primero enfriada a
temperatura ambiente, y las microesferas que incorporan el
compuesto son lavadas, separadas de la mezcla y secadas. Si el
fármaco hidrofílico incorporado es inestable en el medio acuoso, las
microesferas pueden ser liofilizadas.
En una realización alternativa usada cuando
otros compuestos hidrofílicos tienen que ser incorporados a las
microesferas de manera diferente que como partículas, se emplea una
técnica de doble emulsión. Por ejemplo, el compuesto que va a ser
incorporado es primero disuelto en una solución acuosa. La zeina es
disuelta en una mezcla binaria orgánica adecuada con baja
miscibilidad acuosa. Algunos disolventes orgánicos binarios para la
zeina son conocidos, por ejemplo mezclas de un alcohol, tal como
metanol, etanol o isopropanol, con un hidrocarburo halogenado, con
el hidrocarburo halogenado como componente primario. La solución
acuosa es añadida a la solución orgánica de zeina y se crea una
emulsión de agua en aceite. Esta emulsión entonces es añadida a una
segunda fase liquida orgánica, la fase continua, que es inmiscible o
tiene miscibilidad limitada en el solvente orgánico para la zeina,
tal como un aceite, para formar una doble emulsión de agua en
aceite. Este disolvente es después eliminado, como se describe
previamente, para formar microesferas.
Las propiedades de las microesferas pueden ser
modificadas para una aplicación dada, por ejemplo, alterando
química y/o enzimáticamente la proteína de partida antes de formar
las microesferas. Tales modificaciones pueden producir una proteína
que posea una incrementada o alterada estabilidad termal,
reactividad externa, lipofilicidad, peso molecular, carga,
estabilidad de corte, y resistencia a las proteasas.
La funcionalidad, propiedades superficiales y
distribución del peso molecular de la proteína pueden ser
modificadas mediante tratamiento enzimático. Por ejemplo, la
hidrólisis enzimática de la zeina, que posee un peso molecular del
dímero de unos 38.000 daltons, en 90% de etanol usando una proteína
tal como la papaína o la quimiotripsina, produce polipéptidos con
un peso molecular de unos 1.000 daltons, los cuales retienen las
características de solubilidad de la proteína intacta, es decir,
los polipéptidos son todavía insolubles en agua pero solubles en
90% de etanol. El grado de hidrólisis puede ser controlado variando
la cantidad de enzima usado o el tiempo de reacción que la proteína
está expuesta a la enzima.
La estabilidad de la proteína puede ser
aumentada por entrecruzamiento de la proteína antes de su uso en el
proceso de separación de fase, mediante la adición de una enzima que
cataliza el entrecruzamiento intra y/o intermolecular de la
proteína, tal como la transglutaminasa, o la proteína disulfuro
isomerasa. La transglutaminasa y la proteína disulfuro isomerasa
causan entrecruzamiento inter- e intramolecular de la proteína
mediante los aminoácidos glutamina y cisteína, respectivamente. La
transglutaminasa cataliza la reacción de transferencia del acilo,
en la cual el grupo amida del aminoácido glutamina es el donante del
acilo. Se conocen otros procesos enzimáticos que alteran las
propiedades de las proteínas, antes o después de la formación de las
microesferas.
Las propiedades de las microesferas pueden ser
también alteradas por medicación química de las proteínas usadas en
su preparación, tanto antes como después de la formación de las
microesferas. Tales modificaciones pueden incluir el tratamiento de
las proteínas con un ácido, base u otro agente que altere la
estructura de una o más cadenas laterales de aminoácidos lo cual, a
su vez, altera el carácter de la proteína. Por ejemplo, el elevado
contenido de glutamina y asparagina de las prolaminas,
particularmente la zeina, proporciona un medio para la manipulación
de las características de carga de la proteína, y además la
hidrofobicidad, por deamidación. El método de deamidación
preferente incluye una suave deamidación catalizada por un ácido (a
un pH de mas o método 1) a temperaturas elevadas(entre 25 y
65 C) por un método de tiempo suficiente para lograr el nivel
deseado de deamidacion. El polimérica de deamidacion proteína ser
seguido por una medición de la liberación de amonio mediante un
electrodo de amonio. La deamidación puede ser terminada con la
adición de carbonato de amonio u otra base.
Otros ejemplos de modificación química incluyen
la esterificación de la proteína con alcoholes grasos, o la
ciclación de las proteínas con anhídridos grasos, los cuales pueden
alterar la sensibilidad ácida o básica del producto proteico. Por
ejemplo, zeina o péptidos de zeina pueden ser deamidados como se
describió anteriormente, entonces la zeina deamidada reacciona con
un ácido graso para formar un éster de ácido graso de la proteína.
Péptidos deamidados o no deamidados de la zeina pueden también
hacerse reaccionar con alcoholes grasos para formar zeina grasa
acilada o péptidos de zeina. Estas proteínas o péptidos modificados
por la adición de ácidos grasos pueden entonces ser usadas como
material de partida para formar las microesferas.
La carga de la proteína puede ser también
modificada por entrecruzamiento de aminoácidos o ácidos poliamino a
la proteína, usando glutaraldehído o carbodiimida.
Las proteínas pueden ser modificadas antes o
después de la formación de las microesferas. Sin embargo, una
ventaja del proceso de separación de fases es que el severo
tratamiento químico o calórico de la proteína después de la
formación de las microesferas no es requerido. De acuerdo al método,
cuando la modificación de la proteína usando agentes como el
glutaraldehído para el entrecruzamiento con la proteína es deseable,
la proteína es tratada previamente a la incorporación del compuesto
que va a ser entregado y a la formación de las microesferas.
Se pueden añadir a los polímeros los mismos
estimuladores de la degradación y estabilizantes descritos con
respecto a los polímeros sintéticos para la formación de las
microesferas de proteína-EPO.
Las matrices hechas ya fuese a partir de una
mezcla proteica o a partir de una mezcla de
proteína-polímero, como prolamina/PLA,
prolamina/PGA o prolamina/PLA PGA, pueden ser diseñadas con una
variedad de velocidades de degradación y difusión. En general, la
degradación es una función de la composición de la proteína y el
polímero. La difusión es una función de la composición y la forma de
la matriz, y de la naturaleza del material incorporado. Las
matrices pueden ser sintetizadas para degradarse en períodos de
tiempo más cortos, iguales, o más largos que el período de
liberación del compuesto incorporado. El compuesto puede ser
liberado por difusión, degradación de la matriz o una combinación
de la difusión a través de la matriz y la liberación a medida que
la matriz se degrada.
Estas matrices compuestas pueden tener una o
varias formas: microesferas proteicas con un revestimiento
polimérico; micropartículas o microcápsulas poliméricas
encapsuladas por proteína; compuestos bioactivos y microesferas
proteicas encapsuladas por polímeros, o microesferas proteicas con o
sin compuesto bioactivo incorporado y compuestos bioactivos
encapsulados por polímeros.
Las microesferas pueden ser producidas en una
variedad de tamaños, desde las microesferas de tamaño manométrico
hasta un tamaño medio de unas cien micras. Las microesferas que
tienen un tamaño medio entre aproximadamente 50 a 100 nm y 20
micras son más preferidas para la administración intestinal o para
dirigir a las células. Las microesferas con un tamaño medio de
partícula de unos 100 nm hasta 5 micras son particularmente
preferentes para usar en la entrega de fármacos porque las
microesferas dentro de este rango de tamaño pueden ser absorbidas
en el torrente sanguíneo y/o sistema linfático o fagocitadas.
El tamaño y otras características de las
microesferas pueden ser determinadas usando la microscopía
electrónica de barrido (SEM), dispersión de luz y calorimetría
diferencial de barrido (DSC).
Los revestimientos proteicos son hechos usando
una variación del método para producir las microesferas, Las
partículas (incluyendo las partículas de forma no uniforme,
microesferas y microcápsulas) que van a ser recubiertas, pueden ser
producidas a partícula de cualquier sustancia, normalmente
sustancias no proteicas o proteína modificadas, o material que va a
ser liberado. Para formar el revestimiento, la proteína es disuelta,
las partículas que van a ser recubiertas se añaden a la solución de
proteína, la mezcla proteína/micropartículas se añade a la fase
continua, se agita la mezcla y se elimina el solvente,
preferentemente por evaporación o por extracción del solvente bajo
condiciones que provocan que las partículas queden recubiertas con
el recubrimiento de proteína.
Las microesferas pueden ser administradas por
vía tópica, localmente o sistémicamente por administración
parenteral o administración intestinal. La ruta preferente es la
oral para las microesferas hechas de polímeros proteicos.
Las microesferas que contienen EPO son
preferentemente administradas oralmente. Estas microesferas,
dependiendo de la naturaleza química y tamaño, pueden ser
absorbidas o pasar a través del epitelio que recubre el tracto
gastrointestinal hacia el torrente sanguíneo o el sistema linfático.
La EPO es liberada de las microesferas mediante difusión,
degradación, o una combinación de degradación y difusión, en el
torrente sanguíneo, el sistema linfático, el epitelio, o la
superficie del epitelio.
Las microesferas de menos de 180 micras pasan
fácilmente a través de una aguja para la administración intravenosa.
Transportadores farmacéuticos adecuados, por ejemplo, tampón
fosfato salino, son conocidos y asequibles comercialmente.
Las microesferas producidas como se describió
anteriormente son suficientemente pequeñas para ser inyectadas a
través de una aguja de medida estándar bajo la piel o en el
peritoneo para la subsiguiente liberación del fármaco incorporado.
La adhesión de la microesfera al peritoneo contribuye a la
liberación localizada del fármaco incorporado. Las microesferas
pueden también ser implantadas o inyectadas intramuscularmente para
inmunización u otros propósitos donde la lenta liberación en el
torrente sanguíneo es deseada. Los transportadores tales como el
tampón salino fosfato o un adyuvante tal como un aceite, pueden ser
usados como transportadores para las microesferas. Transportadores
farmacéuticamente aceptables son conocidos por aquellos entendidos
en la materia.
Los métodos están descritos con más detalles con
referencia a realizaciones específicas que demuestran la
incorporación y la liberación de la EPO biológicamente activa.
Ejemplo
1
Una solución de EPO (1.0 mg/ml EPO en 400 mM de
cloruro de sodio, 8.0 mM de fosfato de sodio y 1.5 mM de fosfato de
potasio) fue rápidamente congelada en nitrógeno líquido y
liofilizada durante 48 horas. El polímero liofilizado tiene una
actividad específica de 60.000 unidades/mg sólidos totales.
La EPO liofilizada (2.0 mg) fue disuelta en 200
\mul de agua. 200 mg de zeina (método F5000, Industrias Freeman,
Tucahoe; NY) fueron disueltos en 3.8 ml de una mezcla acuosa de
etanol (200 \mul de agua y 3.6 ml de etanol 100%). La solución de
zeina fue entonces añadida a la solución de EPO y mezclada
lentamente. La solución de EPO y zeina fue entonces emulsionada
durante 20 segundos con 120 ml de aceite de maíz usando un
homogeneizador Virtishear y un generador ultrafino. Esta emulsión
fue entonces añadida a 250 ml de aceite de maíz precalentado a 60ºC
y mezclada con un mezclador de cuchillas superiores a 1800 rpm. La
mezcla resultante tenía una temperatura de 50ºC. La temperatura fue
mantenida en el rango de 45-50ºC con una incubadora
durante veinte minutos, después de lo cual, las microesferas fueron
enfriadas a temperatura ambiente. Las microesferas resultantes
fueron lavadas con éter de petróleo para eliminar el aceite de maíz
y filtradas. Las microesferas fueron secadas durante la noche al
vacío a temperatura ambiente.
Ejemplo
2
Las microesferas de zeina formadas en el ejemplo
1 fueron probadas en un modelo de administración subcutánea en
perros beagle. Los perros (N=2) fueron inyectados subcutáneamente
con una sola dosis de microesferas de zeína (30 mg) con 1% de
sólidos de EPO. Muestras de sangre para la medición de EPO fueron
tomadas 96 horas después de la inyección. El suero fue preparado y
probado para la EPO por radioinmunoanálisis (Incstar, Stillwater,
MN).
El incremento en suero de EPO para uno de los
animales se muestra en la Figura 1. Los niveles de plasma llegan a
un pico a las diez horas y retornan a niveles basales 120 horas
después de la administración.
Ejemplo
3
Las microesferas de EPO de zeína formadas en el
Ejemplo 1 fueron probadas en un modelo de administración intestinal
en monos cynomolgus. Los animales (N=6) fueron alimentados mediante
sonda con una sola dosis de 200 mg de microesferas de zeina, con 1%
de lípido de EPO en los días uno, dos y tres del estudio. Una hora
antes de la dosis, cada mono recibió una sola inyección
intramuscular de 20 mg de cimetidina para elevar el pH gástrico.
Las microesferas fueron resuspendidas en 8 ml de un medio de
resuspensión de tampón salino fosfato. El tubo de la sonda fue
posteriormente lavado con 4 ml de método de resuspensión.
Cada animal también sufrió un experimento de
control en el cual una sola dosis de microesferas vacías sin ningún
fármaco activo fue suministrada por sonda en los días uno, dos y
tres del estudio. Una hora antes de suministrarle la dosis cada
mono recibió una inyección intramuscular de 20 mg de cimetidina para
elevar el pH gástrico. Cada animal descansó durante dos meses entre
el placebo y los experimentos activos.
Las muestras de sangre para las mediciones de la
EPO fueron tomadas antes de cada sonda y luego dos, cuatro y seis
horas después de la administración de la dosis. Las muestras de
sangre fueron también tomadas al día siguiente de la última dosis.
Las muestras de sangre fueron tomadas en los mismos tiempos de
muestreo para ambos estudios. El suero fue preparado y probado para
la EPO por radioinmunoanálisis (Incstar, Stillwater, MN).
Las muestras para el recuento de reticulocitos
fueron recogidas el día 1 del estudio, antes de la administración
de la microesfera, y en los das 5, 10 20 después de la dosis.
El incremento de los niveles medios de EPO
sérica se muestra en la Figura 2. El nivel de EPO se incrementa
hasta un máximo de 50 mU/ml después del día 5, y vuelve a los
niveles basales después de 22 días. Los conteos de reticulocitos
normalizados se muestran en la Figura 3. El recuento tiene un pico
el día 10 hasta 3.5 veces la cantidad de reticulocitos del nivel
basal. El incremento de los conteos de reticulocitos demuestra que
la EPO absorbida tiene actividad biológica.
Ejemplo
4
0.25 gramos de poli D/L láctido (Boehringer
Ingelheim, Resomer R104) y 0.25 gramos de poli D/L láctico
coglicólido (Birmingham polimérica Inc., Lactel 50:50)) fueron
disueltos en 5.0 ml de cloruro de metileno. A esta solución
polimérica fueron añadidos 15 mg de polímero de EPO desalada y
liofilizada conteniendo 1% w/w de PluronicsTMF68 (BASF). La EPO
liofilizada tenía tamaños de partícula en el rango de una a seis
micras. La suspensión fue puesta en una jeringa estanca al gas de
diez ml. Una cantidad de 200 ml de 100% de etanol fue añadida a un
contenedor redondo de polipropileno (17 cm de diámetro, 8 cm de
profundidad). Esta solución fue congelada en nitrógeno líquido y
cubierta con 500 ml de nitrógeno líquido. La mezcla de proteína y
polímero fue bombeada desde la jeringa por medio de una bomba de
jeringa a 2 ml/min, mediante una boquilla ultrasónica (Mode, Sonics,
and Material, Danbury, CT) que fue puesta encima del contenedor de
nitrógeno líquido y etanol congelado. La boquilla atomizó la
suspensión en gotitas que se congelaron en cuanto se pusieron en
contacto con el nitrógeno líquido y formaron microesferas que se
hundieron en el etanol helado.
El contenedor fue puesto a -80ºC punto en que el
nitrógeno lípido se evaporó y al cabo del tiempo el etanol se
fundió. A medida que el etanol se derrite, las microesferas se
colocan en el líquido donde el cloruro de metileno es extraído.
Después de 24 horas, 200 ml adicionales de hexano preenfriado a
-80ºC fueron añadidos al contenedor. Después de tres días, los
métodos de microesferas y etanol son filtrados usando una membrana
(Millipore, Bedford, MA). Las microesferas filtradas fueron luego
liofilizadas.
Las microesferas formadas en el ejemplo 4 fueron
probadas en un método de administración subcutánea en ratas
Sprague-Dawley. Las ratas (N=2) fueron inyectadas
subcutáneamente con una sola dosis de microesferas (2.5 mg o 5.8
mg). Las muestras de sangre para las mediciones de EPO fueron
tomadas durante varias semanas después de la inyección. El suero
fue preparado y probado para la EPO por radioinmunoanálisis
(Incstar, Stillwater, MN).
El incremento en suero de EPO (mU/ml) para cada
uno de los animales se muestra en la Figura 4. El perfil del plasma
es bifásico con una primera fase que dura tres días la cual es
seguida por un período de inducción de una semana después de la
cual los niveles permanecen por encima de los niveles basales
durante al menos tres semanas.
Claims (16)
1. Un método para fabricar una composición de
liberación mantenida para eritropoyetina biológicamente activa para
la administración a un paciente, que incluye la incorporación de la
eritropoyetina en una microesfera polimérica biodegradable de forma
que dicha eritropoyetina sea incorporada dentro del polímero de
dicha microesfera mencionada, cuya eritropoyetina está en una
concentración de entre 0.01 y 20% en peso, y en combinación con un
agente estabilizante seleccionado de un grupo que consiste en
aminoácidos, surfactantes, sales y lípido, en donde la liberación
del agente estabilizante con respecto a la proteína eritropoyetina
está entre 1:10 y 4:1 para aminoácidos a proteína y sal a proteína,
entre 1:1000 y 1:20 para surfactantes a proteína y entre 1:20 y 4:1
para lípido a proteína.
2. El método de la reivindicación 1 en donde la
microesfera es una microesfera proteica producida
a.) contactando la solución de proteína que
contiene al menos un tipo de proteína con un segundo líquido el
cual es de miscibibilidad limitada en el solvente de la proteína y
no disuelve la proteína, para formar una mezcla
proteína-no-solvente.
b.) agitando la mezcla
proteína-no-solvente para formar una
dispersión de la solución proteína en el segundo líquido; y
c.) eliminando el solvente de la proteína para
formar microesferas proteicas.
donde la microesfera de proteína tiene un
diámetro entre 50 nanómetros y 100 micras y la microesfera no está
formada por enlaces amidas ni está desnaturalizada por calor.
3. El método de la reivindicación 2 en donde la
proteína es una proteína hidrofóbica.
4. El método de la reivindicación 3 en donde la
proteína hidrofóbica es seleccionada del grupo que consiste en
prolamina, colágeno, caseína, y keratina.
5. El método de la reivindicación 1 en donde la
microesfera está formada por un polímero sintético seleccionado del
grupo que consiste en poli(láctido),
poli(láctido-co-glicólido),
poli(caprolactona), policarbonatos, poliamidas,
polianhídridos, poliaminoácidos, poliortoésteres, poliacetales,
policianoacrilatos, poliuretanos, poliacrilatos, polímeros de
etilén-vinilacetatos, poliestirenos, cloruros de
polivinilo, fluoruros de polivinilo, poli(imidazoles de
vinilo), poliolefinas clorosulfonadas, óxidos de polietileno,
polifosfaceno, polihidroxibutirato, mezclas y copolímeros de las
mismas.
6. El método de la reivindicación 1 en donde la
microesfera está formada por un polímero no proteico en combinación
con una proteína.
7. El método de la reivindicación 1 en donde las
microesferas están en un transportador farmacéutico para una
administración intestinal al paciente.
8. El método de la reivindicación 1 en donde las
microesferas están en un transportador farmacéutico para una
administración parenteral al paciente.
9. Una composición de liberación mantenida para
eritropoyetina biológicamente activa que contiene eritropoyetina
incorporada en el polímero de una microesfera polimérica
biodegradable, en donde la eritropoyetina esta en una concentración
de entre 0.01 y 20% en peso, conteniendo entre 50 y 40.000
unidades/mg, y en combinación con un agente estabilizante
seleccionado de un grupo que consiste en aminoácidos, surfactantes,
sales y lípidos, en donde la liberación del agente estabilizante a
la proteína eritropoyetina esta entre 1:10 y 4:1 de aminoácidos a
proteína y sales a proteína, entre 1:1000 y 1:20 de surfactantes a
proteína y entre 1:20 y 4:1 de lípido a proteína.
10. La composición de la reivindicación 9 en
donde la microesfera polimérica biodegradable es como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.
11. La composición de la reivindicaciones 9 o
10, en donde las microesferas están en un transportador
farmacéuticamente aceptable.
12. La composición de la reivindicación 9
comprendiendo adicionalmente excipientes que modulan la velocidad
de erosión del polímero, seleccionados del grupo que consiste en
ácidos inorgánicos, bases inorgánicas, bases orgánicas, ácidos
orgánicos, sales, agentes acomplejadores, carbohidratos y
surfactantes.
13. La composición de la reivindicación 12 en
donde el excipiente que modula la velocidad de erosión del polímero
es un agente formador de poros, tal como una sal o un azúcar, y es
añadido al polímero en una forma particulada en una concentración
de entre uno y treinta por ciento (w/w, polímero).
\newpage
14. La composición de la reivindicación 9
comprendiendo adicionalmente excipientes que modifican la
solubilidad de la EPO seleccionados de un grupo que consiste en
sales, ácidos inorgánicos, ácidos orgánicos, bases inorgánicas,
bases orgánicas y surfactantes, y estando en una concentración de
entre 0.1 y treinta por ciento (w,w polímero).
15. Una composición obtenible por el método de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
16. Una composición de liberación mantenida para
eritropoyetina biológicamente activa que contiene eritropoyetina
incorporada en el polímero de una microesfera polimérica
biodegradable, en donde la eritropoyetina está en una concentración
de entre 0.01 y 20% en peso, sulfato de amonio, un carbonato
metálico y un agente estabilizador seleccionado a partir del grupo
que comprende aminoácidos, surfactantes, sales, y lípidos, donde la
proporción del agente estabilizador con respecto a la proteína
eritropoyetina está entre 1:10 y 4:1 de aminoácidos a proteína y de
sal a proteína, entre 1:1000 y 1:20 de surfactante a proteína, y
entre 1:20 y 4:1 de lípidos a proteína.
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