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Hintergrund
der Erfindung
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Erythropoietin
(EPO) ist ein 34- bis 38-kDa-Glykoprotein mit 165 Aminosäuren, wobei
etwa 40% des Molekulargewichts durch Kohlehydrat geliefert werden,
das ursprünglich
aus Urin isoliert wurde, jedoch anschließend durch Gentechnologie hergestellt
wurde, das zur Erhöhung
der Zahl der roten Blutkörperchen
verwendet wird. Die normale Erzeugung von roten Blutkörperchen
erfordert die Ausschüttung
von Erythropoietin durch die Niere, anscheinend als reifes Glykoprotein.
Im Gleichgewichtszustand zirkuliert dieses Hormon im Körper mit
einer Konzentration von 10–18
Millieinheiten (128–230
Picogramm) pro Milliliter. Das Hormon triggert die Proliferation
und Differenzierung einer Population hierfür empfänglicher Stammzellen im Knochenmark,
es stimuliert die Hämoglobinsynthese
in reifenden Erythroidzellen und beschleunigt die Freisetzung von roten
Blutkörperchen
aus dem Mark in den Blutkreislauf, wodurch die Masse der roten Blutkörperchen
erhöht und
hypoxische Zustände
verbessert werden.
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Patienten
mit einem Mangel an EPO leiden häufig
an einer schweren Anämie.
EPO wird zur Behandlung von Patienten mit Anämie, die mit chronischer Niereninsuffizienz
in Verbindung steht, die Patienten mit Dialyse (Nierenerkrankung
im Endstadium) und Patienten ohne Dialyse umfassen, sowie Anämie, die
mit AIDS in Verbindung steht, verwendet. EPO wird als intravenöser Bolus
dreimal pro Woche an Patienten mit Dialyse und als subkutane Injektion
dreimal pro Woche an Patienten ohne Dialyse verabreicht. Für Patienten,
die EPO auf chronischer Basis subkutan erhalten, führen die
häufigen
Injektionen zu Spitzen- und Talplasmaspiegeln sowie Problemen mit
der Patientencompliance.
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Es
ist günstig,
ein Verfahren und Mittel zur oralen und parenteralen Abgabe von
EPO, die wirtschaftlich, sicher und wirksam sind, zu finden.
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Eine
orale Formulierung wäre
ein signifikanter Fortschritt bei der Verabreichung des Arzneimittels. Eine
orale Formulierung erfordert einen signifikanten enterischen Schutz
vor den Abbauwegen im Magen-Darm-Trakt. Eine Mikroverkapselung von
EPO in einem geeigneten Polymersystem könnte das eingebaute Protein
vor der scharfen Umgebung des Darmtrakts schützen. Ein Mikroverkapselungsverfahren
erfordert sanfte Formulierungsbedingungen, wie eine niedrige Temperatur,
einen physiologischen pH-Wert und ein kompatibles Lösemittelsystem
zur Bewahrung der biologischen Aktivität des EPO.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens
zur gesteuerten verzögerten
Freisetzung von EPO, wenn es oral oder parenteral verabreicht wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Biologisch
abbaubare Polymermikrokügelchen,
die vorzugsweise aus Zein gebildet sind, werden zur In-vivo-Freisetzung
von Erythropoietin (EPO) verwendet. Die Mikrokügelchen werden vorzugsweise
enterisch verabreicht, können
jedoch auf anderen Wegen zur anschließenden Freisetzung verabreicht
werden. Durch die Wahl spezieller Größenbereiche und eines spezifischen
Polymers, das zur Bildung der Mikrokügelchen verwendet wird, können die
Mikrokügelchen
auf eine Zellart, beispielsweise Makrophagen, zielgerichtet werden
oder eine ortsspezifische Absorption der Mikrokügelchen in Bereichen wie den
Schleimhautmembranen des Mundes, des Magen-Darm-Trakts oder der
Urogenitalbereiche bewirkt werden.
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Beispiele
belegen die Verabreichung von EPO in Zein- und Polymermikrokügelchen
an Hunde und Affen mit einer entsprechenden Zunahme der Blutspiegel
und einer Zunahme der Reticulocytenzahl.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Diagramm der Blutserumspiegel von EPO (mU/ml) über die
Zeit (Stunden) bei Hunden, die EPO in Zein-Mikrokügelchen
subkutan verabreicht erhielten.
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2 ist
ein Diagramm der Serumspiegel von EPO (mU/ml) über die Zeit (Tage) bei Affen,
die EPO in Zein-Mikrokügelchen
enterisch verabreicht erhielten.
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3 ist
ein Diagramm der relativen Reticulocytenzahlen über die Zeit (Tage) bei Affen,
die EPO in Zein-Mikrokügelchen
oder Placebo-Zein-Mikrokügelchen
enterisch verabreicht erhielten.
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4 ist
ein Diagramm der Serumspiegel von EPO (mU/ml) über die Zeit (Tage) bei Ratten,
die EPO in PLGA-Mikrokügelchen
subkutan verabreicht erhielten (Quadrate, Ratte U10 (5,8 mg), schwarze
Quadrate, Ratte U11 (2,5 mg)).
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Ein
Verfahren der Abgabe von EPO wird beschrieben, bei dem Polymermikrokügelchen,
die das EPO enthalten, an einen Menschen oder ein Tier verabreicht
werden, sodass das EPO durch Diffusion aus den Mikrokügelchen
und/oder Abbau derselben freigesetzt wird. Die Mikrokügelchen
sind aus biologisch abbaubaren Polymeren, vorzugsweise Proteinpolymeren,
Prolaminen oder Polylactiden, gebildet. Ein besonders be vorzugtes
Protein ist Zein. Hier und im folgenden bezeichnet Polymer sowohl
synthetische Polymere als auch Proteine. Die Mikrokügelchen
werden oral oder durch Injektion verabreicht und sie geben das EPO
durch Diffusion und Abbau des Mikrokügelchens frei.
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Die
Prolamin-Mikrokügelchen
besitzen mehrere Vorteile. Die Prolamin-Matrix ist eine natürlich vorkommende,
biologisch abbaubare Substanz, die im Körper zu Peptiden und/oder Aminosäuren verstoffwechselt
wird. Die Prolamine können
chemisch oder enzymatisch modifiziert werden, um ihnen günstige Eigenschaften,
beispielsweise eine gewählte
Abbaurate, zu verleihen. Das Verfahren zur Herstellung der Mikrokügelchen
aus einer Prolaminlösung
erfordert kein Erhitzen bei hoher Temperatur oder Vernetzen, was
ein einzuarbeitendes Material abbauen könnte. Darüber hinaus können die
Mikrokügelchen
so gestaltet werden, dass sie über
das Darmepithel in den Blutstrom und/oder das Lymphsystem absorbiert
werden oder auf spezifische Organe oder Phagocytenzellen zielgerichtet
sind. Die Mikrokügelchen
besitzen dadurch mindestens drei deutliche Vorteile für eine gesteuerte
Abgabe: einen Schutz vor Mitteln, die durch die scharfen Bedingungen
des Nahrungstrakts oder Enzyme im Blut angegriffen und/oder abgebaut
werden; Zielausrichtung auf eine Stelle für die Freisetzung (beispielsweise
Phagocytenzellen, Schleimhautmembranen oder Blut); und gesteuerte Freisetzungszeit
und -rate des Mittels.
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Einbau von
EPO in Mikroteilchen
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EPO
enthaltende Mikrokügelchen
werden durch Einbau des EPO in ein biologisch kompatibles Polymermikrokügelchen
hergestellt, wobei das das EPO enthaltende Mikrokügelchen
durch eine verzögerte
gesteuerte Freisetzung des EPO, vorzugsweise über einen Zeitraum von mindestens
24 h bis zu einem Zeitraum von einem bis zwei Monaten gekennzeichnet
ist. In der bevorzugten Ausführungsform
ist das Polymer biologisch abbaubar, und die Mikrokügelchen
weisen einen Durchmesser von weniger als 180 μm, vorzugsweise weniger als
70 μm auf
und sind zur Verabreichung durch subkutane oder intramuskuläre Injektion
geeignet (eine zur Injektion durch eine 23er Nadel geeignete Größe ist ein
Durchmesser von weniger als 180 μm),
und sie enthalten von 0,01 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-% EPO.
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Der
hier verwendete Ausdruck "mikro" bezeichnet ein Teilchen
mit einem Durchmesser von Nanometern bis Mikrometern. Mikrokügelchen
sind feste kugelförmige
Teilchen; Mikroteilchen sind Teilchen von unregelmäßiger oder
nichtkugelförmiger
Gestalt. Ein Mikrokügelchen
kann einen äußeren Überzug einer
gegenüber
dem ursprünglich
zur Bildung des Mikrokügelchens
verwendeten Material unterschiedlichen Zusammensetzung besitzen.
Falls nicht anders angegeben, kann der Ausdruck Mikrokügelchen
so verwendet werden, dass er Mikrokapseln umfasst, und der Ausdruck
Mikroteilchen so verwendet werden, dass er Mikroteilchen, Mikrokügelchen
und Mikrokapseln umfasst. Die Bezeichnung Mikroteilchengebilde wird
speziell verwendet, wenn unregelmäßig geformte Polymer- oder
Polymerarzneimittelteilchen beschrieben werden. Mikrokapseln sind
kugelförmige
Polymergebilde mit einem Nichtpolymerkern oder einem Kern aus einem
anderen Polymer als die äußere Hülle. Ein "Verbundmikrokügelchen" ist ein Mikrokügelchen,
das aus mindestens zwei unterschiedlichen Materialien, entweder
einem Protein und einem Polymer oder zwei Proteinen gebildet ist.
Ein "Verbundstoff" ist ein Aggregat
von wie hier beschriebenen Mikrokügelchen, das durch dem Fachmann
bekannte Materalien für
diesen Zweck gebunden ist.
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Die
hier verwendete "verzögerte" oder "verlängerte" Frei setzung des
EPO kann kontinuierlich oder diskontinuierlich, linear oder nichtlinear
sein. Dies kann unter Verwendung von einer oder mehrerer Arten von
Polymerzusammensetzungen, Arzneimittelbeladungen, einer Auswahl
von Streckmitteln oder Abbauverstärkungsmitteln oder anderen
Modifikationen durch eine alleinige Verabreichung, eine Verabreichung
in Kombination oder eine aufeinanderfolgende Verabreichung zur Erzeugung
der gewünschten
Wirkung erreicht werden.
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EPO
kann eingearbeitet werden in (1) die Polymermatrix, die die Mikrokügelchen
bildet, (2) Mikroteilchen, die von dem die Mikrokügelchen
bildenden Polymer umgeben sind, (3) einen Polymerkern in einem Proteinmikrokügelchen,
(4) einen Polymerüberzug
um ein Polymermikrokügelchen
oder (5) eingemischt werden in Mikrokügelchen, die zu einer größeren Form
aggregiert sind, oder eine Kombination derselben.
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EPO
kann als Teilchengebilde oder durch gleichzeitiges Auflösen des
EPO mit dem Polymer eingearbeitet werden. Freies EPO besitzt eine
spezifische Aktivität
von 120000 bis 180000 Einheiten/mg. Es wird in das Polymer zu einer
Konzentration zwischen 50 und 90000 Einheiten/mg Polymer eingearbeitet.
In der bevorzugten Ausführungsform
zur oralen Abgabe wird EPO mit Zein in einem wässrigen Gemisch mit Ethanol gelöst. Zein
wird in einer wässrigen
organischen Lösung
in einem Konzentrationsbereich von 3–15% (Gew/V) gelöst, wobei
eine Konzentration von 5–8%
bevorzugt ist. Stabilisierungsmittel können durch Zugabe der Stabilisierungsmittel
zur EPO-Lösung
vor der Lyophilisierung eingearbeitet werden.
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I. Arzneimittelabgabesysteme
mit synthetischem Polymer Verfahren zur Einarbeitung von EPO in
Mikrokügelchen
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Eine
Vielzahl von Techniken, durch die Wirkstoffe in syn thetische Polymermikrokügelchen
eingearbeitet werden können,
sind bekannt.
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Sprühtrocknung
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Bei
Sprühtrocknung
werden das Polymer und EPO zusammen in einem Lösemittel für das Polymer vermischt und
danach wird das Lösemittel
durch Versprühen
der Lösung
abgedampft, wobei den Wirkstoff enthaltende Polymertröpfchen zurückbleiben.
Sprühtrocknung
ist zusammenfassend detailliert bei K. Masters in "Spray Drying Handbook" (John Wiley & Sons, New York
1984); und Patrick B. Deasy in "Microencapsulation and
Related Drug Processes" (Marcel
Dekker, Inc., New York 1984) beschrieben. Sprühtrocknung ist nicht bevorzugt,
da es zu einem gewissen Aktivitätsverlust
aufgrund der in dem Verfahren erzeugten Wärme sowie zu einem Verlust
von beträchtlichen
Materialmengen aufgrund eines Klebens des Polymers an der großen Oberfläche an den
Seiten der Kammer führen
kann.
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Lösemittelverdampfung
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Lösemittelverdampfungstechniken
können
zur Bildung von Mikrokügelchen
verwendet werden. Diese Techniken umfassen ein Lösen des Polymers in einem organischen
Lösemittel,
das entweder gelösten
oder dispergierten Wirkstoff enthält. Die Polymer/Wirkstofflösung wird
dann zu einer gerührten
kontinuierlichen Phase, die üblicherweise
eine wässrige
ist, gegeben. Emulgatoren sind in der wässrigen Phase enthalten, um
die Öl-in-Wasser-Emulsion
zu stabilisieren. Das organische Lösemittel wird dann über einen
Zeitraum von mehreren Stunden oder mehr abgedampft, wodurch das
Polymer um das Kernmaterial abgelagert wird. Das Lösemittel
kann von den Mikrokügelchen
in einer einzigen Stufe gemäß der Beschreibung
in US-Patent Nr. 3 737 337 und US-Patent Nr. 3 523 906 oder US-Patent
Nr. 3 691 090 (unter vermindertem Druck) oder durch Anwendung von
Wärme,
wie in US-Patent Nr. 3 891 570 angegeben, entfernt werden. Ein zweistufiges
Verfahren ist in US-Patent Nr. 4 389 330 beschrieben. Gefriertrocknung
wurde ebenfalls zur Entfernung des Lösemittels aus Mikrokügelchen
verwendet, siehe der Bericht von Sato et al. in "Porous Biodegradable Microspheres for Controlled
Drug Delivery. I. Assessment of Processing Conditions and Solvent
Removal Techniques",
Pharmaceutical Research 5, 21–30
(1988).
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Eine
Lösemittelverdampfung
ist ziemlich gut durchzuführen,
sie ist jedoch nicht bevorzugt, da die Menge des eingearbeiteten
Materials üblicherweise
niedriger als die theoretischen Werte aufgrund eines Verlusts des
Arzneimittels an die wässrige
Phase ist, siehe der Bericht bei Benita et al. in "Characterization
of Drug Loaded Poly(d,l-lactide) Microspheres", J. Pharm. Sci. 73, 1721–1724 (1984).
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Phasentrennung
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Phasentrennungstechniken
können
ebenfalls zur Bildung von Mikrokügelchen
verwendet werden. Diese Techniken umfassen die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion
oder einer Öl-in-Wasser-Emulsion.
Das Polymer wird aus der kontinuierlichen Phase auf den Wirkstoff
durch eine Änderung
der Temperatur, des pH-Werts, der Ionenstärke oder die Zugabe von Fällungsmitteln
abgeschieden. Beispielsweise beschreibt das US-Patent Nr. 4 675 800 et al. die Bildung
von Poly(milch-co-glykol)säuremikrokügelchen,
die aktive Proteine enthalten. Das Protein wird zunächst in
der wässrigen
Phase einer Wasser-in-Öl-Emulsion
gelöst
oder als Feststoff in der Polymerphase dispergiert. Das Polymer
wird dann um die wässrigen
Tröpfchen
oder Arzneimittelteilchen durch Zugabe eines Nichtlösemittels
für das
Polymer, beispielsweise Siliconöl, abgeschieden. Das
Endprodukt besitzt, wie bei den meisten Phasentrennungstechniken,
die Form einer Mikrokapsel. Mikrokapseln enthalten ein von einer
Polymermembrankapsel umgebenes Kernmaterial. Mikrokapseln sind jedoch nicht
die bevorzugte Ausführungsform
für die
Abgabe von EPO, da die Freisetzungskinetiken von Wirkstoffen aus
diesen Vorrichtungen schwierig zu steuern sein können.
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Obwohl
diese Phasentrennungstechniken zur Bildung von Wirkstoff enthaltenden
Mikrokügelchen
führen,
geht Wirkstoff während
des Lösemittelsextraktionsprozesses
häufig
verloren. Außerdem
können
wie bei der Sprühtrocknung
biologisch aktive Proteine während
des Prozesses denaturiert werden.
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Schockfrosten-Lösemittelextraktion
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Ein
Verfahren zur Herstellung von EPO-Mikrokügelchen mit den gewünschten
Eigenschaften ist im US-Patent Nr. 5 019 400 von Gombotz et al.
beschrieben.
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Es
gibt zwei Hauptausführungsformen
des Systems zur Herstellung von Mikrokügelchen: ein System einer Kombination
von verflüssigtem
Gas und gefrorenem Nichtlösemittel
und ein System mit gefrorenem Nichtlösemittel.
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Das
Polymer und das einzukapselnde Mittel in einer Lösung werden unter Verwendung
einer Ultraschallvorrichtung in ein verflüssigtes Gas zerstäubt. Die
zerstäubten
Teilchen gefrieren, wenn sie mit dem verflüssigten Gas (flüssiger Stickstoff)
in Kontakt kommen, wobei gefrorene Kügelchen gebildet werden. Diese sinken
zur Oberfläche
des gefrorenen Nichtlösemittels
(Ethanol). Das Flüssiggas
wird abgedampft und die Kügelchen
beginnen beim Auftauen des Nichtlösemittels in das Nichtlösemittel
zu sinken. Das Lösemittel
in den Kügelchen
wird in das Nichtlösemittel
extrahiert, wobei Mikrokügelchen
gebildet werden, die das einzukapselnde Mittel enthalten. Andere
Nichtlösemittel,
beispielsweise Hexan, werden zu dem Nichtlösemittel (Ethanol) gegeben,
um ggf. die Rate der Lösemittelextraktion
aus bestimmten Polymeren, wenn beispielsweise Kügelchen aus Polylactid-co-glykolidpolymeren
gebildet werden, zu erhöhen.
Das verflüssigte
Gas kann flüssiges Argon
(–185,6°C), flüssiger Stickstoff
(–195,8°C), flüssiger Sauerstoff
(–182,9°C) oder ein
beliebiges anderes Gas sein, das zu einem sofortigen Gefrieren der
zerstäubten
Teilchen zu gefrorenen Kügelchen
führt.
Sauerstoff ist nicht bevorzugt, da er explosiv ist und eine Oxidation
des Proteins verursachen kann. Alternativ kann die Kombination von
verflüssigtem
Gas und gefrorenem Nichtlösemittel
durch ein kaltes Nichtlösemittel
für das Polymer
ersetzt werden, vorausgesetzt die Temperatur des Nichtlösemittels
liegt unter der Gefriertemperatur der Lösung von Polymer/Wirkstoff.
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In
beiden Ausführungsformen
ist es wichtig, dass Polymer/Wirkstoff bei Kontakt mit der kalten
Flüssigkeit
unmittelbar gefrieren und dann ein langsames Auftauen und eine Extraktion
des Polymerlösemittels
aus den Mikrokügelchen
erfolgt.
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Die
Auftaurate hängt
von der Wahl der Lösemittel
und Nichtlösemittel
ab. Es ist wichtig, ein Lösemittel für das Polymer
mit einem höheren
Schmelzpunkt als das Nichtlösemittel
für das
Polymer zu wählen,
so dass das Nichtlösemittel
zuerst schmilzt, was ein Einsinken der gefrorenen Mikrokügelchen
in die Flüssigkeit,
wo sie später
auftauen, ermöglicht.
Wenn ein Nichtlösemittelsystem
einer kalten Flüssigkeit
zur Herstellung der polymeren Mikrokügelchen verwendet wird, sinken
die Mikrokügelchen
unmittelbar in das Nichtlösemittel. Während des
Auftauens des Lösemittels
in den Mikrokügelchen
wird es in das Nichtlösemittel
extrahiert. Das Lösemittel
für das
Polymer und das Nichtlösemittel
für das
Polymer müssen
mischbar sein, um eine Extraktion des Lösemittels aus den Mikrokügelchen
zu ermöglichen.
Tabelle 1 zeigt einige Polymer/Lösemittel/Nichtlösemittel-Systeme,
die in diesem Verfahren verwendet werden können, zusammen mit deren Schmelzpunkten.
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Tabelle
1: Systeme von Polymeren und geeigneten Lösemitteln und Nichtlösemitteln
mit den Schmelzpunkten der Lösemittel
und Nichtlösemittel
(°C)
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Das
Gemisch Polymer/Wirkstoff/Lösemittel
kann in die kalte Flüssigkeit,
entweder das verflüssigte Gas
oder das kalte Nichtlösemittel,
unter Verwendung einer Vielzahl von Vorrichtungen, die zur Bildung
von kleinen Teilchen verwendet werden können, die Ultraschalldüsen, Druckdüsen, pneumati sche
Düsen und Rotationszerstäubungsvorrichtungen
umfassen, gesprüht
werden.
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Ein
weiter Bereich von Größen der
Mikrokügelchen
kann durch Variieren der Tropfengröße, beispielsweise durch Veränderung
des Düsendurchmessers,
gebildet werden. Wenn sehr große
Kügelchen
gewünscht sind,
können
die Kügelchen
durch eine Spritze direkt in die kalte Flüssigkeit extrudiert werden.
Eine Erhöhung der
Grenzviskosität
der Polymerlösung
kann ebenfalls zu einer erhöhten
Mikrokügelchengröße führen. Die Größe der durch
dieses Verfahren erzeugten Mikrokügelchen kann von einem Durchmesser
von mehr als 1000 μm
bis 5 μm
reichen. Ein bevorzugter Größenbereich
für injizierbare
Mikrokügelchen
ist ein Durchmesser von 30 bis 180 μm. Die durch diese Technik hergestellten
Mikrokügelchen
sind von kugelförmiger
Gestalt.
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Auswahl der
synthetischen Polymermatrix
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Fast
jeder Polymertyp kann verwendet werden, vorausgesetzt, es finden
sich das entsprechende Lösemittel
und Nichtlösemittel,
die die gewünschten
Schmelzpunkte aufweisen. Im allgemeinen wird eine Polymerlösung hergestellt,
die zwischen 1% und 30% Polymer, vorzugsweise 5–10% Polymer enthält.
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Die
hier verwendeten Ausdrücke "biologisch erodierbar" oder "biologisch abbaubar" bezeichnen Materialien,
die in vivo enzymatisch oder chemisch zu einfacheren chemischen
Spezies abgebaut werden.
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Polysaccharide
sind Beispiele für
natürlich
vorkommende Polymere. Synthetische Polymere, die zur Bildung der
Mikrokügelchen
verwendet werden können,
umfassen biologisch erodierbare Polymere, wie Poly(lactid), Poly(lactid-co-gly kolid),
Poly(caprolacton), Polycarbonate, Polyamide, Polyanhydride, Polyaminosäuren, Polyorthoester,
Polyacetale, Polycyanoacrylate und abbaubare Polyurethane, und nicht-erodierbare Polymere,
wie Polyacrylate, Ethylen-Vinylacetat-Polymere und andere acylsubstituierte
Celluloseacetate und Derivate derselben, nicht-erodierbare Polyurethane,
Polystyrole, Polyvinylchlorid, Polyvinylfluorid, Poly(vinylimidazol),
chlorsulfonierte Polyolefine und Polyethylenoxid.
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Die
Mikrokügelchen
können
aus Protein, Polymer oder Protein-Polymer-Gemischen gebildet sein. PLA,
PGA und PLA/PGA-Copolymere
sind zur Bildung von Prolamin-Verbundmikrokügelchen besonders geeignet.
PLA-Polymere werden üblicherweise
aus den cyclischen Estern von Milchsäuren hergestellt. Sowohl die
L(+)- als auch die D(–)-Formen
von Milchsäure
sowie das optisch inaktive DL-Milchsäuregemisch der D(–)- und
L(+)-Milchsäuren
können
zur Herstellung der PLA-Polymere verwendet werden. Verfahren zur
Herstellung von Polylactiden sind in der Patentliteratur gut dokumentiert.
Die folgenden US-Patente beschreiben detailliert geeignete Polylactide,
deren Eigenschaften und deren Herstellung: 1 995 970 von Dorough;
2 703 316 von Schneider; 2 758 987 von Salzberg; 2 951 828 von Zeile;
2 676 945 von Higgins; und 2 683 136, 3 531 561 von Trehu.
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PGA
ist das Homopolymer von Glykolsäure
(Hydroxyessigsäure).
Bei der Umwandlung von Glykolsäure
in Poly(glykolsäure)
wird Glykolsäure
zuerst mit sich selbst unter Bildung des cyclischen Esters Glykolid reagieren
gelassen, das in Gegenwart von Wärme
und einem Katalysator in ein linearkettiges Polymer mit hohem Molekulargewicht
umgewandelt wird. PGA-Polymere und deren Eigenschaften sind detaillierter
bei "Cyanamid Research
Develops World's
First Synthetic Absorbable Suture", Chemistry and Industry, 905 (1970) be schrieben.
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Sowohl
die Freisetzung der eingearbeiteten Verbindung als auch die biologische
Erosion der Matrix stehen in Verbindung mit den Molekulargewichten
von PLA, PGA oder PLA/PGA. Die höheren
Molekulargewichte, massegemittelte Molekulargewichte von 90000 oder
höher,
führen
zu Polymermatrizes, die ihre strukturelle Integrität über längere Zeiträume bewahren,
während
niedrigere Molekulargewichte, massegemittelte Molekulargewichte
von 30000 oder weniger, sowohl zu einer niedrigeren Freisetzung
als auch einer kürzeren Matrixlebensdauer
führen.
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Die
Freisetzung des EPO aus diesen Polymersystemen kann über zwei
unterschiedliche Mechanismen erfolgen. Das Arzneimittel kann durch
Diffusion durch mit Wasser gefüllte
Kanäle,
die in der Dosierungsform durch das Lösen des Arzneimittels erzeugt
wurden, oder durch Hohlräume
bzw. Poren, die durch die Entfernung des Polymerlösemittels
während
der ursprünglichen
Mikroverkapselung geschaffen wurden, freigesetzt werden. Der zweite
Mechanismus ist eine verstärkte
Freisetzung aufgrund des Abbaus des Polymers. Mit der Zeit beginnt
das Polymer zu erodieren und es erzeugt eine erhöhte Porosität und Mikrostruktur in der
Vorrichtung. Dies schafft zusätzliche
Wege zur Arzneimittelfreisetzung.
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Der
Abbau des Polymers erfolgt durch eine spontane Hydrolyse der Esterbindungen
im Gerüst.
Daher kann die Rate durch eine Veränderung von Polymereigenschaften,
die die Wasseraufnahme beeinflussen, gesteuert werden. Diese umfassen
das Monomerenverhältnis
(Lactid zu Glykolid), die Verwendung von L-Lactid im Gegensatz zu
D/L-Lactid und das Molekulargewicht des Polymers. Diese Faktoren
bestimmen die Hydrophilie und Kristallinität, die letztlich die Wassereindringungsrate
bestimmen. Hydrophile Streckmittel, wie Salze, Kohlehydrate und
Netzmittel, können
ebenfalls eingearbeitet werden, um das Eindringen von Wasser in
die Vorrichtungen zu erhöhen
und dadurch die Erosion des Polymers zu beschleunigen.
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Durch
Veränderung
der Eigenschaften des Polymers und der Eigenschaften der Dosierungsform
kann der Beitrag von jedem dieser Freisetzungsmechanismen gesteuert
und die Freisetzungsrate von EPO geändert werden. Langsam erodierende
Polymere, wie Poly-L-Lactid oder Poly(lactid-co-glykolid) von hohem
Molekulargewicht mit wenig Glykolidzusammensetzung bewirken, dass
die Freisetzung diffusionskontrolliert wird. Eine Zunahme der Glykolidzusammensetzung
und eine Verminderung des Molekulargewichts verstärkt sowohl
die Wasseraufnahme als auch die Hydrolyse des Polymers und verleiht
der Freisetzungskinetik zusätzlich eine
Erosionskomponente.
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Die
Freisetzungsrate kann auch durch Variieren der EPO-Beladung in den Mikrokügelchen
gesteuert werden. Eine Zunahme der Beladung erhöht das Netzwerk der Verbindungskanäle, die
beim Lösen
des Arzneimittels gebildet werden, und es verstärkt die Freisetzung des Arzneimittels
aus den Mikrokügelchen.
Ein bevorzugter Bereich der EPO-Beladungen liegt im Bereich von
40 bis 40000 Einheiten/mg, wobei der bevorzugte Bereich 50 bis 20000
Einheiten/mg beträgt.
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Die
Polymerhydrolyse wird bei sauren oder basischen pH-Werten beschleunigt
und daher kann der Einbau von sauren oder basischen Streckmitteln
zur Modulierung der Polymererosionsrate verwendet werden. Die Streckmittel
können
als Teilchengebilde zugegeben werden, mit dem eingearbeiteten EPO
gemischt werden oder im Polymer gelöst werden.
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Abbauverstärkungsmittel
beruhen auf dem Gewicht, bezogen auf das Polymergewicht. Sie können in Abhängigkeit
von der Verbindung der Proteinphase zugesetzt werden, als getrennte
Phase (d.h. als Teilchengebilde) zugesetzt werden oder in der Polymerphase
gemeinsam gelöst
werden. In allen Fällen
sollte die Menge zwischen 0,1 und 30 Prozent (Gew/Gew, Polymer)
betragen. Die Arten der Abbauverstärkungsmittel umfassen anorganische
Säuren,
beispielsweise Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, organische Säuren, beispielsweise
Citronensäure,
Benzoesäure,
Heparin und Ascorbinsäure,
anorganische Basen, beispielsweise Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat,
Calciumcarbonat, Zinkcarbonat und Zinkhydroxid, und organische Basen,
beispielsweise Protaminsulfat, Spermin, Cholin, Ethanolamin, Diethanolamin
und Triethanolamin, und Netzmittel, beispielsweise TweenTM und PluronicTM.
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Porenbildner
sollen den Matrizes eine Mikrostruktur zusätzlich verleihen (d.h. wasserlösliche Verbindungen,
beispielsweise anorganische Salze und Zucker). Sie werden als Teilchengebilde
zugegeben. Der Bereich sollte zwischen 1 und 30 Prozent (Gew/Gew,
Polymer) liegen.
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Zusatzstoffe zur Veränderung
der Freisetzungsrate, der Abbaurate, der Stabilität von EPO
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Streckmittel
können
EPO ebenfalls zugesetzt werden, um dessen Wirksamkeit in Abhängigkeit
von der Dauer der Freisetzung aufrechtzuerhalten. Stabilisierungsmittel
umfassen Kohlehydrate, Aminosäuren, Fettsäuren und
Netzmittel und sind einem Fachmann bekannt. Außerdem können Streckmittel, die die
Löslichkeit
von EPO modifizieren, beispielsweise Salze, Komplexierungsmittel
(Albumin, Protamin), zur Steuerung der Freisetzungsrate des Proteins
aus den Mikrokügelchen
verwendet werden.
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Stabilisierungsmittel
für EPO
werden auf das Verhältnis
zum Protein auf Gewichtsbasis bezogen. Beispiele umfassen ein Kohlehydrat,
wie Saccharose, Lactose, Mannit, Dextran und Heparin, Proteine,
wie Albumin und Protamin, Aminosäuren,
wie Arginin, Glycin und Threonin, Netzmittel, wie TweenTM und
PluronicTM, Salze, wie Calciumchlorid und
Natriumphosphat, und Lipide, wie Fettsäuren, Phospholipide und Gallensalze.
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Die
Verhältnisse
betragen im allgemeinen 1:10 bis 4:1 für Kohlehydrat zu Protein, Aminosäuren zu Protein,
Proteinstabilisierungsmittel zu Protein und Salze zu Protein; 1:1000
bis 1:20 für
Netzmittel zu Protein, und 1:20 bis 4:1 für Lipide zu Protein.
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II. Proteinabgabesysteme
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Verfahren
zur Herstellung von Proteinmikroteilchen
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Unter
Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens werden Mikrokügelchen
durch ein Phasentrennungs-Lösemittelentfernungsverfahren
hergestellt. Die Bildung der Mikrokügelchen hängt von der unterschiedlichen
Löslichkeit
von Proteinen in mit Wasser mischbaren organischen Lösemitteln,
Salzlösungen
oder sauren oder basischen Lösungen
im Vergleich zu deren Löslichkeit
in einer nicht-mischbaren Phase, beispielsweise einem unpolaren
organischen Lösemittel
oder einem Öl,
ab. Die meisten Proteine sind in Ölen nicht löslich. Daher wird Protein in
einem ersten Lösemittel,
das ein mit Wasser mischbares organisches, organisches/wässriges
oder binäres
organisches Lösemittel,
eine saure, basische oder Salzlösung
ist (der Einkapselungsphase), gelöst. Die einzuarbeitende Verbindung
wird in Form einer Suspension, Emulsion, Lösung oder von Teilchen zu der
Proteinlösung
gegeben. Dieses Gemisch wird dann mit einer zweiten flüssigen Phase (der
kontinuierlichen Phase), die die Proteine nicht löst und eine
begrenzte Mischbarkeit mit dem ersten Lösemittel besitzt, in Kontakt
gebracht. Die kontinuierliche Phase ist vorzugsweise ein Öl, beispielsweise
ein Pflanzenöl,
Siliconöl
oder Mineralöl.
Es wird kräftig
gerührt
und das erste Lösemittel
wird unter zur Bildung von Mikrokügelchen ausreichenden Bedingungen üblicherweise
durch Verdampfen oder Extraktion entfernt.
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Überzüge können ebenfalls
auf Mikroteilchen, die aus Protein oder Nichtproteinpolymeren bestehen, gebildet
werden. Zur Bildung der Überzüge werden
(1) Protein zunächst
in einem Lösemittel
gelöst,
(2) die aufzutragenden Teilchen oder Mikroteilchen zur Lösung gegeben,
(3) das Protein/Mikroteilchen-Gemisch zu einer zweiten flüssigen Phase,
die mit dem ersten Lösemittel
nicht mischbar und ein Nichtlösemittel
für den
Proteinüberzug
ist, gegeben, (4) das Gemisch gerührt, und (5) das erste Lösemittel
(üblicherweise
durch Verdampfen oder Extraktion) unter derart hinreichenden Bedingungen,
dass ein Beschichten der Teilchen oder Mikroteilchen mit einem Proteinüberzug bewirkt
wird, entfernt.
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Das
hier beschriebene Verfahren ergibt Proteinmikrokügelchen mit einem Durchmesser
zwischen Nanometern und Mikrometern, wobei ein mittlerer Durchmesser
zwischen 0,01 μm
und weniger als etwa 100 μm liegt,
in die eine Verbindung, die zu einer gewünschten Zeit und/oder an einer
gewünschten
Stelle abgegeben oder freigesetzt wird, eingearbeitet ist. Bei dem
bevorzugten Verfahren werden die Mikrokügelchen im gefrorenen Zustand
aufbewahrt, um die Stabilität
eingearbeiteter Verbindungen über
längere
Zeiträume
zu erhöhen.
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Proteine, die zur Bildung
der Mikrokügelchen
verwendbar sind
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In
der bevorzugten Ausführungsform
sind die Proteine hydrophobe Proteine, wie Prolamine, vorzugsweise
Zein. Die hier verwendeten Proteine können eine einzelne Proteinart,
eine Kombination von Proteinen oder eine Kombination eines Proteins
mit einem Polymer sein. Proteine werden zur Herstellung der Mikrokügelchen
verwendet, da sie natürlich
vorkommen, unterschiedlichste Eigenschaften bieten und in vivo zu
unschädlichen
Aminosäuren
oder kleinen Peptiden abgebaut werden. Hydrophobe Proteine besitzen
eine beschränkte
Löslichkeit
in Wasser und sind in organischen Lösemitteln, wässrigen
Gemischen organischer Lösemittel
und binären
Gemischen organischer Lösemittel
löslich.
Beispiele für
außer
Prolaminen verwendbare Proteine sind Collagen, Casein und Keratin.
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Prolamine
sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine große Zahl hydrophober Aminosäuren, wie Glutamin,
Aspergin und Prolgin, aufweisen. Prolamine sind wasserunlöslich, jedoch
in vielen organischen Lösemitteln,
insbesondere Alkoholen, die mindestens ein Prozent (1%) Wasser,
jedoch nicht mehr als sechzig Prozent Wasser enthalten, oder einem
polaren organischen Lösemittel
löslich.
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Prolamine
sind ohne weiteres erhältlich
und kostengünstig,
beispielsweise als Nebenprodukte der Getreideverarbeitung. Repräsentative
Prolamine umfassen Gliadin, Kafirin, Zein und Hordein. Ein bevorzugtes Prolamin
zur Verwendung bei der Herstellung von Mikrokügelchen ist Zein. Sowohl im
Handel erhältliche
Reinheitsgrade als auch gereinigte Formen von Zein können verwendet
werden. Die Eigenschaften von Zein sind detailliert bei L.C. Swallen
in "Zein – A New
Industrial Protein",
Ind. and Eng. Chem., 33: 393–398
(1941) beschrieben.
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Lösemittel für die Proteine, die zur Bildung
der Mikrokügelchen
verwendet werden
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Das
Protein wird in einem geeigneten Lösemittel gelöst. Das
Protein ist "löslich", wenn mehr als 0,5% (Gew./V)
des Proteins sich im Lösemittel
unter Bildung einer ersichtlich transparenten Lösung bei Raumtemperatur (etwa
20–25°C) lösen. Prolamine
sind beispielsweise in Alkoholen (Ethanol, einigen Ketonen (beispielsweise
Methylethylketon, Aceton) und Amidlösemitteln (beispielsweise Acetamid),
die zwischen 5% und 60% Wasser enthalten; in Lösungen eines extrem hohen (beispielsweise
ein pH-Wert von 10 oder größer) oder extrem
niedrigen (pH-Wert von 2 oder geringer) pH-Werts; und in wässrigen
Lösungen
von etwa 1,0 bis etwa 6 N anorganischen Salzen (beispielsweise NaCl,
KBr) löslich.
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Viele
binäre
Lösemittelsysteme
für Zein
sind bekannt, wobei die ersten Komponenten Polyole, insbesondere
niedere aliphatische Alkohole, Ketone oder Glykole sind und die
zweiten Komponenten Wasser, aromatische Kohlenwasserstoffe, Halogenkohlenwasserstoffe,
insbesondere Chlorkohlenwasserstoffe, Nitroparaffine, Aldehyde und
cyclische Ether sind. Spezielle Beispiele umfassen Gemische von
Alkoholen und Halogenkohlenwasserstoffen und Gemische von Alkoholen
und Propylenglykol mit Ethylenglykol. Binäre Lösemittelsysteme für Prolamine,
wie Zein, werden bei Manley und Evans, Industrial and Engineering
Chemistry 36, 661–665
(1943) angegeben.
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Geeignete
Materialien für
die kontinuierliche Phase
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Die
einzuarbeitende Verbindung wird zur Proteinlösung gegeben. Die Verbindung
kann in Form einer Suspension, einer Lösung (in Öl, einem organischen Lösemittel
oder Wasser), einer Emulsion oder von Teilchen sein. Das Verbindung/Protein-Gemisch
wird dann in eine zweite flüssige
Phase, die kontinuierliche Phase, eingeführt, die (1) nicht-mischbar
oder von begrenzter Mischbarkeit mit dem Proteinlösemittel ist
und (2) das Protein nicht löst.
Lösemittel
sind "nicht-mischbar", wenn sie sich bei
der Arbeitstemperatur ohne Vermischen nicht unter Bildung einer
stabilen homogenen Lösung
miteinander vermischen. Nicht-mischbare Phasen neigen unter diesen
Bedingungen zur Bildung getrennter Schichten. Öle, wie Mineralöl, Silikonöl oder Pflanzenöl, sind
verwendbare nicht-mischbare Phasen. Andere umfassen Hexan, Heptan,
Dodecan und Petrolether eines hohen Siedepunkts.
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Ein
oder mehrere Netzmittel können
dem Protein/erstes-Lösemittel-Gemisch
oder der kontinuierlichen Phase zugesetzt werden, um die Größe der Proteinmikrokügelchen
zu verringern. Geeignete Netzmittel und Verfahren zur Verwendung
derselben sind einem Fachmann bekannt.
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Verfahren
zur Bildung der Proteinmikrokügelchen
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Die
Proteinlösung
wurde zu der kontinuierlichen Phase gegeben und das erste Lösemittel
wurde beispielsweise vorzugsweise durch Verdampfen oder durch Lösemittelextraktion
unter Bedingungen, bei denen Mikrokügelchen gebildet werden, entfernt.
Ein effizientes Vermischen kann durch ein schnelles mechanisches Rühren unter
Verwendung eines Homogenisators und/oder unter Verwendung eines
Prallblechreaktors zur Verhinderung einer laminaren Strömung erreicht
werden. Bei Bedarf kann das Gemisch auf eine Temperatur zwischen
22°C und
etwa 45°C
während
eines Zeitraums zwischen etwa 15 Min. und 45 Min. erhitzt werden. Falls
es erhitzt wurde, wird das Gemisch zunächst auf Raumtemperatur abgekühlt und
danach werden die Mikrokügelchen,
in die die Verbindung eingearbeitet ist, gewaschen, vom Gemisch
abgetrennt und getrocknet. Wenn das eingearbeitete hydrophile Arzneimittel
in einem wässrigen
Medium instabil ist, können
die Mikrokügelchen
lyophilisiert werden.
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In
einer alternativen Ausführungsform,
die verwendet wird, wenn hydrophile Verbindungen in die Mikrokügelchen
im Gegensatz zu Teilchengebilden eingearbeitet werden sollen, wird
eine Doppelemulsionstechnik verwendet. Beispielsweise wird die einzuarbeitende
Verbindung zunächst
in einer wässrigen
Lösung
gelöst.
Das Zein wird in einem geeigneten binären organischen Gemisch mit
geringer Mischbarkeit mit Wasser gelöst. Viele binäre organische
Lösemittel
für Zein
sind bekannt, beispielsweise Gemische eines Alkohols, wie Methanol,
Ethanol oder Isopropanol, mit einem Halogenkohlenwasserstoff, mit
dem Halogenkohlenwasserstoff als erster Komponente. Die wässrige Lösung wird
zu der organischen Lösung
von Zein gegeben und eine Wasser-in-Öl-Emulsion wird erzeugt. Diese
Emulsion wird dann zu einer zweiten organischen flüssigen Phase,
der kontinuierlichen Phase, die nicht-mischbar oder von begrenzter
Mischbarkeit mit dem organischen Lösemittel für Zein ist, beispielsweise
einem Öl,
unter Bildung einer doppelten Wasser-in-Öl-Emulsion gegeben. Dieses Lösemittel
wird dann, wie im vorhergehenden beschrieben, unter Bildung von
Mikrokügelchen
entfernt.
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Modifizierung
der Mikrokügelchen
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Die
Eigenschaften der Mikrokügelchen
können
für eine
bestimmte Anwendung, beispielsweise durch chemische und/oder enzymatische Änderung
des Ausgangsproteins vor der Bildung der Mikrokügelchen, modifiziert werden.
Diese Modifizierungen können
ein Protein mit einer verstärkten
oder geänderten
thermischen Stabilität,
Oberflächenreaktivität, Lipophilie,
Molmasse, Ladung, Scherstabilität
und Beständigkeit
gegenüber Proteasen
ergeben.
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Enzymatische
Modifizierung des Proteins
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Die
Funktionalität,
Oberflächeneigenschaften
und Molmassen verteilung des Proteins können durch eine enzymatische
Behandlung modifiziert werden. Beispielsweise ergibt eine enzymatische
Hydrolyse von Zein mit einer Molmasse bzw. einem Molekulargewicht
des Dimers von etwa 30000 Dalton in 90%igem Ethanol unter Verwendung
einer Protease, wie Papain oder Chymotrypsin, Polypeptide mit einem
Molekulargewicht von etwa 1000 Dalton, die die Löslichkeitseigenschaften des
intakten Proteins beibehalten, d.h. die Polypeptide sind immer noch
in Wasser unlöslich,
jedoch in 90% Ethanol löslich.
Der Hydrolysegrad kann durch Variieren der verwendeten Enzymmenge
oder der Reaktionszeit, während
der das Enzym auf das Protein einwirkt, gesteuert werden.
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Die
Stabilität
des Proteins kann durch ein Vernetzen des Proteins vor der Verwendung
im Phasentrennungsverfahren durch die Zugabe eines Enzyms, das eine
intra- und/oder intermolekulare Vernetzung des Proteins katalysiert,
beispielsweise Transglutaminase oder Proteindisulfidisomerase, verstärkt werden.
Transglutaminase und Proteindisulfidisomerase bewirken eine inter-
und intramolekulare Vernetzung des Proteins über die Aminosäuren Glutamin
bzw. Cystein.
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Transglutaminase
katalysiert eine Acylübertragungsreaktion,
wobei die Amidgruppe der Aminosäure Glutamin
der Acyldonor ist. Andere enzymatische Verfahren, die die Eigenschaften
von Proteinen vor oder nach der Bildung der Mikrokügelchen
verändern,
sind bekannt.
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Chemische
Modifizierung des Proteins
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Die
Eigenschaften der Mikrokügelchen
können
auch durch eine chemische Modifizierung der verwendeten Proteine
bei deren Herstellung, entweder vor oder nach der Bildung der Mikrokügelchen,
geändert
werden. Diese Modifizierungen können
eine Behandlung der Proteine mit einer Säure, Base oder ei nem anderen Mittel,
das die Struktur von einer oder mehreren Aminosäurenseitenketten verändert, was
umgekehrt den Charakter des Proteins verändert, umfassen. Beispielsweise
bietet der hohe Glutamin- und Aspargingehalt von Prolaminen, insbesondere
Zein, ein Mittel zur Manipulation der Ladungseigenschaften des Proteins
und daher der Hydrophobie durch Desamidierung. Das bevorzugte Desamidierungsverfahren
umfasst eine sanfte säurekatalysierte
Desamidierung (bei einem pH-Wert von etwa 1) bei erhöhter Temperatur
(zwischen 25°C
und 65°C)
während
eines derart ausreichenden Zeitraums, dass der gewünschte Desamidierungsgrad
erreicht wird. Das Desamidierungsverfahren kann durch Ermitteln
der Freisetzung von Ammoniak mit einer Ammoniakelektrode verfolgt
werden. Die Desamidierung kann durch die Zugabe von Ammoniumcarbonat
oder einer anderen Base beendet werden.
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Andere
Beispiele für
eine chemische Modifizierung umfassen eine Veresterung des Proteins
mit Fettalkoholen oder eine Acylierung des Proteins mit Fettsäureanhydriden,
was die Säure
(oder Base) empfindlichkeit des Proteinprodukts ändern kann. Beispielsweise
können
Zein oder Zeinpeptide wie im vorhergehenden beschrieben desamidiert
werden und das desamidierte Zein danach mit einer Fettsäure umgesetzt
werden, wobei der Fettsäreester
des Proteins gebildet wird. Nicht-desamidierte oder desamidierte Zeinpeptide
können ebenfalls
mit Fettalkoholen umgesetzt werden, wobei Zein oder Zeinpeptide,
die fettacyliert sind, gebildet werden. Diese fettsäuremodifizierten
Proteine oder Peptide können
dann als Ausgangsmaterial zur Bildung der Mikrokügelchen verwendet werden.
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Die
Ladung an Protein kann ebenfalls durch Vernetzung von Aminosäuren oder
Polyaminosäuren
mit dem Protein unter Verwendung von Glutaraldehyd oder Carbodiimid
modifiziert werden.
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Proteine
können
vor oder nach der Bildung von Mikrokügelchen modifiziert werden.
Ein Vorteil des Phasentrennungsverfahrens besteht jedoch darin,
dass eine scharfe chemische oder Wärmebehandlung des Proteins
nach der Bildung der Mikrokügelchen
nicht erforderlich ist. Daher wird, wenn eine Modifizierung des Proteins
unter Verwendung von Mitteln, wie Glutaraldehyd, zur Vernetzung
des Proteins günstig
ist, das Protein vor dem Einarbeiten der abzugebenden Verbindung
und der Bildung der Mikrokügelchen
behandelt.
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Die
gleichen Abbauverstärkungsmittel
und Stabilisierungsmittel, die in Bezug auf die synthetischen Polymere
beschrieben wurden, können
den Polymeren zur Bildung der Protein-EPO-Mikrokügelchen zugesetzt werden.
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III. Bildung von Protein-Polymer-Mikrokügelchen
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Matrizes,
die entweder aus einem Proteingemisch oder einem Protein-Polymer-Gemisch,
wie Prolamin/PLA, Prolamin/PGA oder Prolamin/PLA-PGA, bestehen,
können
mit einer Vielzahl von Abbau- und Diffusionsraten gestaltet werden.
Im allgemeinen ist der Abbau eine Funktion der Protein- und Polymerzusammensetzung.
Die Diffusion ist eine Funktion der Matrixzusammensetzung, der Form
und der Natur des eingearbeiteten Materials. Matrizes können derart
synthetisiert werden, dass sie über
einen Zeitraum, der kürzer
als der Zeitraum der Freisetzung der eingearbeiteten Verbindung,
gleich diesem oder länger
als dieser ist, abgebaut werden. Die Verbindung kann durch Diffusion,
Abbau der Matrix oder eine Kombination von Diffusion durch die Matrix
und Freisetzung bei Abbau der Matrix freigesetzt werden.
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Diese
Verbundmatrizes können
eine von mehreren Formen aufweisen: Proteinmikrokügelchen
mit einem Polymerüberzug,
Po lymermikroteilchen oder Mikrokapseln, die von Protein eingekapselt
sind, biologisch aktive Verbindungen und Proteinmikrokügelchen,
die von Polymer eingekapselt sind, oder Proteinmikrokügelchen
mit oder eine eingearbeitete biologisch aktive Verbindung und eine
biologisch aktive Verbindung, die von Polymer eingekapselt ist.
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Größe der Mikrokügelchen
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Die
Mikrokügelchen
können
in einer Vielzahl von Größen im Bereich
von Mikrokügelchen
von Nanometergröße bis zu
einer durchschnittlichen Größe von 100 μm hergestellt
werden. Mikrokügelchen
mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von etwa 50 bis 100 nm bis
etwa 20 μm
sind zur enterischen Verabreichung oder Zielausrichtung auf Zellen
bevorzugt. Mikrokügelchen
mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von etwa 100 nm bis etwa
5 μm sind
zur Verwendung für
eine Arzneimittelabgabe besonders bevorzugt, da Mikrokügelchen
in diesem Größenbereich
in den Blutstrom und/oder in das Lymphsystem absorbiert werden können oder
phagocytisiert werden können.
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Die
Größe und andere
Eigenschaften der Mikrokügelchen
können
unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (REM), Lichtstreuung
und differentieller Abtastkalorimetrie (DSC) bestimmt werden.
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Herstellung
von Proteinüberzügen
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Proteinüberzüge werden
unter Verwendung einer Variation des Verfahrens zur Herstellung
von Mikrokügelchen
hergestellt. Die zu überziehenden
Teilchen (einschließlich
von Teilchen einer ungleichförmigen
Gestalt, Mikrokügelchen
und Mikrokapseln) können
aus einer beliebigen Polymersubstanz, üblicherweise Nichtproteinsubstanzen
oder modifizierten Protei nen oder einem abzugebenden Material hergestellt
werden. Zur Bildung des Überzugs
werden das Protein gelöst,
die zu überziehenden
Teilchen zur Proteinlösung
gegeben, das Protein/Mikroteilchen-Gemisch zur kontinuierlichen
Phase gegeben, das Gemisch gerührt
und das Lösemittel
vorzugsweise durch Verdampfen oder durch Lösemittelextraktion unter Bedingungen,
die bewirken, dass die Teilchen mit einem Proteinüberzug überzogen
werden, entfernt.
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IV.
Verfahren zur Verabreichung von Verbindungen, die in Mikrokügelchen
eingearbeitet sind, oder von Implantaten, die aus Mikrokügelchen
gebildet wurden.
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Mikrokügelchen
können
topisch, lokal oder systemisch durch parenterale Verabreichung oder
enterische Verabreichung verabreicht werden. Der bevorzugte Weg
für aus
Proteinpolymeren bestehende Mikrokügelchen ist oral.
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Enterische
Verabreichung
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Mikrokügelchen,
die EPO enthalten, werden vorzugsweise oral verabreicht. Diese Mikrokügelchen werden
in Abhängigkeit
von der chemischen Natur und Größe entweder
von der Epithelauskleidung des Magen-Darm-Trakts in den Blutstrom
oder das Lymphsystem absorbiert oder durch die Epithelauskleidung
des Magen-Darm-Trakts in den Blutstrom oder das Lymphsystem treten
gelassen. Das EPO wird aus den Mikrokügelchen durch Diffusion, Abbau
oder eine Kombination von Abbau und Diffusion in den Blutstrom,
das Lymphsystem, das Epithel oder an der Epitheloberfläche freigesetzt.
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Parenterale
Verabreichung
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Mikrokügelchen
von weniger als 180 μm
treten ohne weiteres durch eine Nadel zur intravenösen Verabreichung.
Geeignete pharmazeutische Träger,
beispielsweise eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung, sind bekannt und im Handel
erhältlich.
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Subkutane, intramuskuläre und intraperitoneale
Verabreichung
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Wie
im vorhergehenden beschrieben hergestellte Mikrokügelchen
sind klein genug, dass sie durch eine Nadel von Standardgröße unter
die Haut oder in das Peritoneum zur anschließenden Freisetzung eines eingearbeiteten
Arzneimittels injiziert werden können.
Das Haften der Mikrokügelchen
am Peritoneum unterstützt
eine ortsspezifische Freisetzung des eingearbeiteten Arzneimittels.
Mikrokügelchen
können
zur Immunisierung oder zu anderen Zwecken, bei denen eine langsamere
Freisetzung in den Blutstrom erwünscht
ist, auch implantiert oder intramuskulär injiziert werden. Träger, wie
phosphatgepufferte Kochsalzlösung,
oder ein Hilfsstoff, beispielsweise ein Öl, können als Träger für die Mikrokügelchen
verwendet werden. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind einem Fachmann bekannt.
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Die
Verfahren sind unter Bezug auf spezielle Ausführungsformen, die die Einarbeitung
und Freisetzung von biologisch aktivem EPO aufzeigen, weiter beschrieben.
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Beispiel 1: Herstellung
von EPO enthaltenden Prolaminmikrokügelchen
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Eine
Lösung
von EPO (1,0 mg/ml EPO in 400 mM Natriumchlorid, 8,0 mM Natriumphosphat
und 1,5 mM Kaliumphosphat) wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren
und 48 h lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver besaß eine spezifische
Aktivität
von 60000 Einheiten/mg der gesamten Feststoffe.
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Lyophilisiertes
EPO (2,0 mg) wurde in 200 μl
Wasser gelöst.
200 mg Zein (Typ F5000, Freeman Industries, Tucahoe, NY) wurden
in 3,8 ml eines wässrigen
Ethanolgemischs (200 μl
Wasser und 3,6 ml 100%iges Ethanol) gelöst. Die Zeinlösung wurde
dann zur EPO-Lösung
gegeben und sanft vermischt. Die Zein-EPO-Lösung wurde dann 20 s mit 120
ml Maisöl
unter Verwendung eines Virtishear-Homogenisators und eines Ultrafeingenerators
emulgiert. Diese Emulsion wurde dann zu 250 ml von auf 60°C vorgewärmtem Maisöl gegeben und
mit einem Overhead-Mischer mit 1800 U/min–1 gemischt.
Das entstandene Gemisch besaß eine
Temperatur von 50°C.
Die Temperatur wurde im Bereich von 45 bis 50°C mit einem Heizblock während 20
Min. gehalten und danach wurden die Mikrokügelchen auf Raumtemperatur
gekühlt.
Die entstandenen Mikrokügelchen
wurden mit Petrolether zur Entfernung des Maisöls gewaschen und filtriert.
Die Mikrokügelchen
wurden über
Nacht unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
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Beispiel 2: In-vivo-Freisetzung
von EPO aus Prolaminmikrokügelchen,
die subkutan an Hunde verabreicht wurden.
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Die
in Beispiel 1 gebildeten Zeinmikrokügelchen wurden in einem Modell
der subkutanen Verabreichung bei Beagle-Hunden getestet. Die Hunde
(N=2) erhielten subkutan eine Einzeldosis von Zeinmikrokügelchen
(30 mg) mit 1% EPO-Feststoffen injiziert. Blutproben zur EPO-Bestimmung
wurden 96 h nach der Injektion entnommen. Serum wurde hergestellt
und auf EPO durch einen Radioimmunoassay (Incstar, Stillwater, MN)
getestet.
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Die
Zunahme des Serum-EPO für
jedes der Tiere ist in 1 angegeben. Die Plasmaspiegel
erreichen bei 10 h einen Spitzenwert und kehren 120 h nach der Verabreichung
zur Grundlinie zurück.
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Beispiel 3: In-vivo-Freisetzung
von EPO aus Prolaminmikrokügelchen,
die oral an Affen verabreicht wurden.
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Die
in Beispiel 1 gebildeten Zein-EPO-Mikrokügelchen wurden in einem Modell
der enterischen Verabreichung bei Cynomolgus-Affen getestet. Die
Tiere (N=6) erhielten bei der Fütterung
eine Einzeldosis von 200 mg Zeinmikrokügelchen mit 1% EPO-Feststoffen
an den Tagen eins, zwei und drei der Untersuchung. 1 h vor der Dosisgabe
erhielt jeder Affe eine einzige intramuskuläre Injektion von 20 mg Cimetidin
zur Erhöhung des
pH-Werts des Magens. Die Mikrokügelchen
wurden in 8 ml eines phosphatgepufferten Resuspendiermediums resuspendiert.
Das Fütterungsröhrchen wurde
anschließend
mit 4 ml Resuspendiermedium gespült.
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An
jedem Tier wurde auch ein Kontrollexperiment, bei dem eine Einzeldosis
leerer Mikrokügelchen ohne
aktives Arzneimittel durch Fütterung
am Tag eins, zwei und drei der Untersuchung gegeben wurde, durchgeführt. 1 h
vor der Dosisgabe erhielt jeder Affe eine einzige intramuskuläre Injektion
von 20 mg Cimetidin zur Erhöhung
des pH-Werts des Magens. Jedes Tier wurde zwei Monate zwischen den
Experimenten mit Placebo und aktivem Mittel in Ruhe gelassen.
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Blutproben
zur EPO-Bestimmung wurden vor jeder Fütterung und dann 2, 4 und 6
h nach der Dosisgabe genommen. Blutproben wurden auch am Tag nach
der letzten Dosisgabe, am zehnten Tag nach der Dosisgabe und am
zweiundzwanzigsten Tag nach der Dosisgabe genommen. Blutproben wurden
für beide
Untersuchungen zu den gleichen Probenzeitpunkten genommen. Das Serum
wurde hergestellt und auf EPO unter Verwendung eines Radioimmunoassays
(INCSTAR, Stillwater, MN) getestet.
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Proben
für die
Reticulocytenzahlen wurden am Tag 1 vor der Mikrokügelchenverabreichung
und am Tag 5, 10 und 20 nach der Dosisgabe gewonnen.
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Die
Zunahme des mittleren Serum-EPO-Spiegels ist in 2 angegeben.
Der EPO-Spiegel steigt auf ein Maximum von 50 mU/ml nach dem Tag
5 und er kehrt nach 22 Tagen zur Grundlinie zurück. Die relativen Reticulocytenzahlen
sind in 3 angegeben. Die Zahl erreicht
am Tag 10 beim 3,5-fachen
der Grundlinienreticulocytenzahl einen Spitzenwert. Die Zunahme
der Reticulocytenzahlen belegt, dass das absorbierte EPO eine biologische
Aktivität
aufweist.
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Beispiel 4: Herstellung
von EPO enthaltenden Polymermikrokügelchen
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0,25
g Poly-D/L-Lactid (Boehringer Ingelheim, Resomer R104) und 0,25
g Poly-D/L-Lactid-co-glykolid (Birmingham Polymer Inc., Lactel 50:50)
wurden in 5,0 ml Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Polymerlösung wurden
15 mg eines entsalzten lyophilisierten EPO-Pulvers, das 1% (Gew./Gew.)
PluronicsTM F68 (BASF) enthielt, gegeben.
Das lyophilisierte EPO besaß Teilchengrößen im Bereich
von 1 bis 6 μm.
Die Suspension wurde in eine gasdichte 10-ml-Spritze gegeben. Eine
200-ml-Menge von
100%igem Ethanol wurde in einen runden Polypropylenbehälter (Durchmesser
17 cm, Tiefe 8 cm) gegeben. Diese Lösung wurde in flüssigem Stickstoff gefroren
und mit 500 ml flüssigem
Stickstoff bedeckt. Das Polymerproteingemisch wurde von der Spritze über eine
Spritzenpumpe mit 2 ml/min in eine Ultraschalldüse (Mode, Sonics and Material,
Danbury, CT), die über dem
Behälter
des flüssigen
Stickstoffs und des gefrorenen Ethanols platziert war, gepumpt.
Die Düse
zerstäubte
die Suspension zu Tröpfchen,
die bei Kontakt mit dem flüssigen
Stickstoff gefroren, und es wurden Mikrokügelchen gebildet, die auf das
gefrorene Ethanol sanken.
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Der
Behälter
wurde bei –80°C gelagert,
wobei dann im Laufe der Zeit der Flüssigstickstoff verdampfte und
das Ethanol schmolz. Beim Auftauen des Ethanols setzen sich die
Mikrokügelchen
in die Flüssigkeit
ab, wobei das Methylenchlorid extrahiert wird. Nach 24 h wurden
weitere 200 ml Hexan, das auf –80°C vorgekühlt war,
zu dem Behälter
gegeben. Nach drei Tagen wurde die Aufschlämmung von Mikrokügelchen
und Ethanol unter Verwendung einer 1-μm-DuraporeTM-Membran
(Millipore, Bedford, MA) filtriert. Die abfiltrierten Mikrokügelchen
wurden dann lyophilisiert.
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Die
in Beispiel 4 gebildeten Mikrokügelchen
wurden in einem Modell der subkutanen Verabreichung bei Sprague-Dawley-Ratten getestet.
Die Ratten (N=2) erhielten subkutan eine Einzeldosis Mikrokügelchen (2,5
mg oder 5,8 mg) injiziert. Blutproben zur EPO-Bestimmung wurden über mehrere
Wochen nach der Injektion entnommen. Serum wurde hergestellt und
durch einen Radioimmunoassay (Incstar, Stillwater, MN) auf EPO getestet.
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Die
Zunahme des Serum-EPO (mU/ml) für
jedes der Tiere ist in 4 angegeben. Das Plasmaprofil ist
zweiphasig, wobei die erste Phase drei Tage dauert und danach eine
Induktionsperiode von einer Woche folgt, nach der die Spiegel während mindestens
drei Wochen über
der Grundlinie bleiben.
