JPH07507806A - エリスロポエチン薬物送達システム - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 エリスロボエチン薬物送達システム 発明の背景 エリスｏボエチン（ＥＰＯ）は、３４ｋｄａから３８ｋｄａの１６５アミノ酸の 糖タンパク質であり、その分子量の約４０％は炭水化物であり、元来は尿から分 離されるが、実質的には組換え遺伝子工学により生成され、赤血球細胞数を増加 するために用いられる。ヒト赤血球細胞の正常な生成には、見かけは成熟した糖 タンパク質として腎臓によるエリスロポエチンの分泌が必要である。安定期では 、このホルモンは、］ミリリットルあたり１０ミリユニットから１８ミリユニツ ト（１２８ピコグラム〜２３０ピコグラム）の濃度で血中を循環している。この ホルモンは、骨髄中の受容幹細胞群の増殖および分化を引き起こし、赤血球細胞 の成熟においてはヘモグロビン合成を刺激し、そして循環系への骨髄からの赤血 球の放出を促進し、それにより赤血球の総量を増加し、そして低酸素症状態を改 善する。

ＥＰＯ欠損症の患者は、しばしば重篤な貧血症に冒される。ＥＰＯは、透析患者 （末期の腎疾患）および透析しない患者、ならびにＡＩＤＳ関連貧血症の患者を 含む慢性腎不全関連貧血症の患者を治療するために用いられる。ＥＰＯは、透析 患者に対しては週に３回静脈内持続投与として投与され、そして透析しない患者 に対しては週に３回皮下注射として投与される。持続性生薬（ｃｈｒｏｎｉｃ　 ｂａｓｉｓ）でＥＰＯを皮下に受けている患者について頻繁な注射の結果、ピー クと谷間の血漿レベル、および患者の不快さの問題が生じる。

経済的で、安全で、そして効果的なＥＰＯの経口送達または非経口送達の方法お よび手段を見出すことが望ましい。

経口処方物は薬物投与にかなり有利である。経口処方物は胃腸管での分解経路か らの顕著な腸の保護が必要である。適切なポリマー系中へのＥＰＯのマイクロカ プセル化により、腸管の過酷な環境から、取り込まれたタンパク質を保護し得た 。

いずれのマイクロカプセル化のプロセスでも、低温、生理学的ｐＨ１およびＥＰ ’０の生物学的活性の保存に適合する溶媒系のような穏和な処方条件が必要であ る。

従って、本発明の目的は、経口的にまたは非経口的に投与された場合に、ＥＰＯ の制御された遅延性の放出の方法を提供することである。

発明の要旨 生分解性ポリマーマイクロスフェア（好ましくはぜインで形成される）が、エリ スロポエチン（ＥＰＯ）のインビボでの放出に用いられる。マイクロスフェアは 、好ましくは腸内に投与されるが、あとに続く放出のために他の経路によっても 投与され得る。マイクロスフェアを形成するために用いるべき、特定のサイズの 範囲および特定のポリマーを選択することにより、マイクロスフェアをマクロフ ァージのような細胞型に標的化すること、またはマイクロスフェアの口内粘膜、 胃腸管、または泌尿生殖器のような領域への局所吸収を行うことが可能である。

実施例でゼインおよびポリマーマイクロスフェア中のＥＰｏヲイヌおよびサルへ 投与し、血液レベルの適切な増加および網赤血球数の増加を伴うことを示す。

図面の簡単な説明 図１は、ゼインマイクロスフェア中のＥＰＯを皮下投与しタイヌにおける、時間 （時間）に対するＥＰＯの血液血清レベル（＋ｎＵ／ｍｌ）のグラフである。

図２は、ゼインマイクロスフェア中のＥＰＯを腸内投与したサルにおける、時間 （日）に対するＥＰＯの血清レベル（ａ＋Ｕ／＋ｎｌ）のグラフである。

図３は、ゼインマイクロスフェア中のＥＰＯまたはプラセボのゼインマイクロス フェアを腸内投与したサルにおける、時間（日）に対する正常化した網赤血球数 のグラフである。

図４は、ＰＬＧＡマイクロスフェア中のＥＰＯを皮下投与したラットにおける、 時間（日）に対するＥＰＯの血清レベル（ｆｆｌ［Ｊ＃＋１）のグラフである（ 四角、　ラッｔ−０１０（５，８ａ＋ｇ）、Ｎ四角、ラットＵｌｌ（２，５ｆｆ １ｇ））。

発明の詳細な説明 ＥＰＯを含むポリマーマイクロスフェアが、マイクロスフェアからの拡散および ／またはマイクロスフェアの分解により、ＥＰＯが放出されるために、ヒトまた は動物に投与される、ＥＰＯの送達方法が記載される。マイクロスフェアは生分 解性ポリマー、最も好ましくはプロラミンまたはポリラクチドのようなタンパク 質ポリマーで形成される。特に好ましいタンパク質は、ゼインである。本明細書 で使用される場合、ポリマーは、合成ポリマーおよびタンパク質の両方をいう。

マイクロスフェアは経口または注射により投与され、マイク。スフェアの拡散お よび分解によりＥＰＯを放出する。

プロラミンマイクロ文フェアは、幾っがの利点を持っている。プロラミンマトリ ックスは、天然の生分解性の物質であり、生体中でペプチドおよび／またはアミ ノ酸に代謝される。

プロラミンは、化学的または酵素的に、選択した分解速度のような所望の特性を 付与するために修飾され得る。プロラミン溶液からマイクロスフェアを作製する プロセスは、高温加熱または取り込まれる材料を分解し得る架橋剤を必要としな い。さらに、マイクロスフェアは腸上皮を通じて血流中および／またはリンパ系 に吸収されるか、あるいは特定の器官もしくは貧食細胞に標的化されるように設 計され得る。マイクロスフェアはそれによって、制御された送達のために少なく とも三つの異なる利点を有する二消化管の苛酷な条件または血液中の酵素により 攻撃されるおよび／または分解される薬剤の保護；放出部位（例えば貧食細胞、 粘膜、または血液）の標的化：および薬剤放出の制御された時間および速度。

マイクロスフェアへのＥＰＯの取り込み。

ＥＰＯ含有マイクロスフェアを、生物適合性ポリマーマイクロスフェア中にＥＰ Ｏを取り込むことにより作製する。このＥＰＯ含有マイクロスフェアはＥＰＯの 制御された放出を、好ましくは少なくとも２４時間を超えて、１力月から２力月 間まで維持することを特徴とする。好ましい実施態様において、ポリマーは生分 解性であり、マイクロスフェアは１８０ミクロンより小さい直径を有し、最も好 ましくは、７０ミクロンより小さく、そして皮下注射または筋肉内注射による投 与に適しく２３ゲージ針を通す注射に適切なサイズは直径が１８０μｍより小さ い）、そしてマイクロスフェアは、０．０１重量％から約２０重量％までのＥＰ Ｏを含む。

本明細書の用語「マイクロ」は、ナノメーターからマイクロメーターの直径を有 する粒子のことをいう。マイクロスフェアは固体の球状の粒子である；マイクロ パーティクルは不規則なまたは非球状形の粒子である。マイクロスフェアは、マ イクロスフェアを形成するために使用した元の物質とは異なる組成の外側のコー ティングを有し得る。別に記載がなければ、用語マイクロスフェアは、マイクロ カプセルを包含するように用いられ得、そして用語マイクロパーティクルは、マ イクロパーティクル、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルを包含するよ うに用いられ得る。マイクロノマーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔ ｅ）は、詳細には不規則な形のポリマー、またはポリマー−薬物粒子を記載する 場合にいう。マイクロカプセルは、非ポリマー核または外殻とは異なるポリマー の核を有する球形のポリマーデバイスである。「コンポジットマイクロスフェア 」は、タンパク質およびポリマー、あるいは２種のタンパク質のいずれかの、少 なくとも２種の異なる材料で形成されたマイクロスフェアである。「コンポジッ ト」は、本明細書の記載のように、作製されたマイクロスフェアが、この目的の ために当業者に公知の材料と結合している集合体をいう。

本明細書のＥＰＯの放出を「維持する」または「継続する」ことは、持続的また は非持続的、直線的または非直線的であり得る。これは、１つまたはそれ以上の 型のポリマー組成物、薬物充填物、賦形剤または分解増強剤の選択、あるいは他 の改変を用いて、所望の効果を生じるために単独で、組合せて、または連続的に 投与して達成され得る。

ＥＰＯは、（１）マイクロスフェアを形成するポリマーマトリックス、（２）マ イクロスフェアを形成するポリマーによって取り囲まれたマイクロパーティクル 、（３）タンパク質マイクロスフェア中のポリマー核、（４）ポリマーマイクロ スフェアの周囲のポリマーコーティング、（５）マイクロスフェアと混合され、 凝集してより大きな形態になるか、またはそれらの組み合わせ中に取り込まれ得 る。

ＥＰＯはまた、微粒子として、またはポリマー中にＥＰＯを共溶解することによ り取り込まれ得る。バルクＥＰＯは１２０．０００ユニット／ｍｇから１８０． ０００ユニット／ｌｎｇの比活性を有する。それはポリフ−中に５０ユニット／ ＋ｎｇポリマーから４０．０００ユニット７１ｇポリマーの濃度になるように取 り込まれる。経口送達の好ましい実施態様では、ＥＰＯはエタノールの水系混合 物中にゼインとともに溶解される。ゼインは水系有機溶媒中に３％〜１５％（Ｗ ／ｖ）の範囲の濃度（好ましい濃度は５％〜８％）で溶解される。

安定化剤は、凍結乾燥の前にＥＰＯ溶液への安定化剤の添加により取り込まれ得 る。

■１合成ポリマー薬物送達システム。

マイクロスフェアへのＥＰＯの取り込みの方法。

活性薬剤が合成ポリマーマイクロスフェアへ取り込まれ得る、種々の技法が知ら れている。

スプレー乾燥 スプレー乾燥では、ポリマーおよびＥＰＯをポリマー用の溶媒中で共に混合して 、次いて溶液をスプレーして活性薬剤を含むポリマーの小滴を放置することによ り溶媒を蒸発させる。

スプレー乾燥はに、　Ｍａｓｔｅｒｓにより「スプレー乾燥ハンドブック（Ｓｐ ｒａｙ　ＤｒｙｉｎｇＩｌａｎｄｂｏｏｋ）Ｊ　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　 ５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ１９８４）中で：およびＰａｔｒｉｃｋ　Ｂ、　 Ｄｅａｓｙ＋：より「マイクｏ７’７ブセル化および関連薬剤プロセス（Ｍｉｃ ｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｐｒｏ ｃｅｓｓｅｓ）Ｊ　（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ　１９８４）中で詳細を論じており、ぞの教示は本明細書中に援用されてい る。スプレー乾燥は、好ましくない。なぜなら、プロセスにおいて生じる熱のた め活性の幾分かの喪失、およびチャンバー側の広い表面領域にポリマーが固着す るため、かなりの量の材料を喪失する結果になり得るからである。

溶媒蒸発 溶媒蒸発技法を、マイクロスフェアを形成するために用い得る。これらの技法は 、溶解されたまたは分散されたのいずれかの活性薬剤を含む有機溶媒中にポリマ ーを溶解することを包含する。次いで、ポリマー／活性薬剤溶液を通常水性であ る撹拌した連続相に加える。乳化剤が水相中に含まれて水中油エマルジョンを安 定化させる。次いで、有機溶媒を数時間かそれ以上にわたって蒸発させ、それに より核材料のまわりにポリマーを堆積させる。溶媒を、米国特許第３．７３７． ３３７号おヨヒ米国特許第３．５２３．９０６号、または米国特許第３．６９１ ．０９０号（減圧下）に記載されるように、１段階で、あるいは米国特許第３． ８９１．５７０号に示されるように、熱を適用することにより、マイクロスフェ アから除去し得る。２段階技法が米国特許第４、３８９．３３０号に記載されて いる。凍結乾燥もまた、マイクロスフェアから溶媒を除去するために用いられ、 ５ａｔｏらにより［薬物送達を制御する多孔性の生分解性マイクロスフェア。

■、処理条件および溶媒除去技法の評価Ｊ　、　Ｐｈａｒｎ＋ａｃｅｕｔｉ田Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　５．２ｌ−３０（１９８８）に報告されている。これらの方法 の教示は、本明細書に援用されている。

溶媒蒸発は合理的にうま（働くが、取り込まれる材料の量が水相への薬物の喪失 のために通常は理論値より少ないので、好ましくない。これは、Ｂｅｎ１ｔａら 、　［ポリ（ｄ、　Ｉ−ラクチド）マイクロスフェアに移入された薬物の特徴Ｊ 　、　Ｊ、　Ｐｈａｒｎ、　Ｓｃｉ。

７３、１７２１−１７２４（１９８４）において報告された。

相分離 相分離技法がまた、マイクロスフェアを形成するために用いられる。これらの技 法は、油中水エマルジョンまたは水中油エマルションの形成を含む。ポリマーを 連続相から活性薬剤のヒに、温度、ｐＨ、イオン強度、または沈殿化剤の添加に より沈殿させる３つ例えば、米国特許第４．６７５．８００号は活性タンパク質 を含むポリ（乳酸−コーグリコール酸）マイクロスフェアの形成を記載している 。タンパク質は、まず油中水工マルショノの水相に溶解するかまたはポリマー用 に固体として分散させる。次いて、ポリマーを水系の小滴または薬物粒子のまわ りに、シリコーンオイルのようなポリマー用の非溶媒を加えることにより沈殿さ せる。最終生成物は、はとんどの相分離技法で、マイクロカプセルの形である。

マイクロカプセルはポリマー膜カプセルにより周囲を取り囲まれた核材料を含む 。しかし、活性薬剤のこれらのデバイスからの放出キネティクスは制御が困難で あり得るので、マイクロカプセルはＥＰＯの送達には好ましい実施態様ではない 。

これらの相分離技法の結果、活性薬剤を含むマイクロスフェアの形成を生じるが 、活性薬剤はしばしば溶媒抽出プロセスの間に喪失される。さらに、スプレー乾 燥と同様に、生物学的に活性なタンパク質がプロセスの間に変性され得る。

迅速な凍結、溶媒抽出 所望の特徴を有するＥＰＯマイクロスフェアを作製する方法が、Ｇｏｎｂｏｔｚ らの米国特許第５．０１．９．４００号に記載されており、その教示は本明細書 に援用されている。

マイクロスフェアを作製するための系に２つの主要な実施態様がある：液化ガス ー凍結非溶媒の組合せの系および凍結非溶媒系。

溶液中でカプセル化されるべきポリマーおよび薬剤を、液化ガス中に超音波デバ イスを用いて霧化する。霧化した粒子は、液化ガス（液体窒素）と接触させた場 合に、凍結し、凍結スフェアを形成する。これらは、凍結非溶媒（エタノール） の表面に沈殿させる。液化ガスを蒸発させ、そしてスフェアは、非溶媒が融解す るにつれて非溶媒中に沈殿し始める。スフェア中の溶媒は、非溶媒に抽出され、 カプセル化される薬剤を含むマイクロスフェアを形成する。ヘキサンのような他 の非溶媒を非溶媒（エタノール）に加えて、適切な場合、例えばスフェアがポリ ラクチドーコーグリコリドポリマーで形成される場合に、特定のポリマーからの 溶媒抽出の速度を増大する。

液化ガスは、液体アルゴン（−１８５，６°Ｃ）、液体窒素（−１９５，８℃） 、液体酸素（−１８２，９°Ｃ）、または霧化した粒子を直ちに凍結して、凍結 スフェアを生じる他の任意のガスであり得る。酸素は、爆発性があり、そしてタ ンパク質の酸化を引き起こし得るので好ましくない。

あるいは、ポリマー用の冷非溶媒は、非溶媒の温度がポリマー／活性薬剤溶液の 凍結温度を下回る場合、液化ガス−凍結非溶媒の組合せに置換し得る。

両方の実施態様において、ポリマー／活性薬剤が冷液体を接触させるとすぐに凍 結し、次いでゆっくり融解し、モしてポリマー溶媒がマイクロスフェアから抽出 されることが重要である。

融解速度は溶媒および非溶媒の選択に依存している。非溶媒がまず融解して、凍 結マイクロスフェアが後から融解する液体中に沈殿し得るため、ポリマー用の非 溶媒よりも高い融点を有するポリマー用の溶媒の選択が重要である。ポリマーマ イクロスフェアを作製するための冷液体非溶媒系が用いられる場合、マイクロス フェアは、非溶媒中に直ちに沈殿する。

マイクロスフェア内の溶媒が融解するに従って、非溶媒中に抽出される。ポリマ ー用の溶媒およびポリマー用の非溶媒はマイクロスフェアからの溶媒の抽出を可 能にするために混和性でなければならない。表１は、このプロセスに用いられ得 るいくつかのポリマー／溶媒／非溶媒系をそれらの融点と共に示す。

（以下余白） ポリマー／活性薬剤／溶媒混合物は、冷液体（液化ガスまたは冷非溶媒）中に、 微粒子゛を形成するために用い得る、超音波ノズル、圧力ノズル、気圧ノズル、 および回転式の噴霧器を含む種々のデバイスを用いてスプレーし得る。

広範囲のマイクロスフェアのサイズを、例えばノズルの直径を変化させることに より小滴のサイズを変えて作製し得る。

非常に大きなスフェアを所望の場合、スフェアを冷液体中に直接シリンジを通し て押し出し得る。ポリマー溶液の本来の粘度の増大はまた、マイクロスフェアの サイズの増大を生じ得る。このプロセスにより生成されたスフェアのサイズは直 径で１０００ミクロンより大きいものから５ミクロンの範囲であり得る。注入可 能なマイクロスフェアの好ましいサイズ範囲は直径３０ミクロンから１８０ミク ロンである。この技法で作製されたマイクロスフェアは、球形である。

合成ポリマーマトリックスの選択 所望の融点を有する適切な溶媒および非溶媒を見出すならば、はとんどのいかな るタイプのポリマーも用い得る。一般的に、ポリマー溶液は、１％のポリマーと ３０％のポリマーとの間、好ましくは５％〜１０％のポリマーを含むように調製 される。

本明細書の用語「生侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）Ｊ、または「生分解性（ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂ］　ｅ）Ｊは、酵素的または化学的にインビボでより単 純な化学物質に分解される材料をいう。

多糖類は、天然ポリマーの例である。マイクロスフェアを形成するために用いら れ得る合成ポリマーは、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクチトーコーグリコリド） 、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリ アミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、お よび生分解性ポリウレタンなどの生侵食性ポリマー、ならびにポリアクリレート 、エチレン−ビニルアセテートポリマーならびに他のアシル置換セルロースアセ テートおよびそれらの誘導体、非侵食性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化 ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポ リオレフィン、およびポリエチレンオキシドなどの非侵食性ポリマーを包含する 。

マイクロスフェアは、タンパク質、ポリマー、またはタンパク質−ポリマー混合 物で形成され得る。ＰＬＡ、ＰＧＡ、およびＰＬΔ／ＰＧＡコポリマーはプロラ ミンコンポジットマイクロスフェアを形成するのに特に有用である。Ｐ　１．、 　Ａポリマーは、通常乳酸の環状エステルから調製される。Ｌ（＋）型およびＤ （−）型の乳酸の両方、ならびにＤ（−）およびＬ（＋）乳酸の混合物である光 学不活性ＤＬ−乳酸混合物が、ＰＬＡポリマーを調製するのに使用し得る。ポリ ラクチドを調製する方法は、特許文献に良く記載されている。以下の米国特許の 教示は、本明細書に参考として援用され、適切なポリラクチド、それらの特性お よび調製を詳細に記載している：　Ｄｏｒ。

ｕｇｈの第１．９９５．９７０号、５ｃｈｎｅｉｄｅｒの第２．７０３．３１６ 号、Ｓａｌｚｂｅｒｇの第２．７５８．９８７号、Ｚｅｉｌｅの第２．９５１． ８２８号、Ｈｉｇｇｉｎｓの第２．６７６、９４５号、およびＴｒｅｈｕの第２ ．６８３．１３６号；第３．５３１．５６１号。

ＰＧＡはグリコール酸（ヒドロキシ酢酸）のホモポリマーである。グリコール酸 のポリ（グリコール酸）への転換において、グリコール酸は最初はそれ自身で反 応し環状エステルグリコリドを生じ、加熱および触媒の存在下で、高分子量の直 鎖状のポリマーに転換される。ＰＧＡポリマーおよびその特性は、「サイアナミ ド研究所は世界初の合成吸収性縫合を開発する（Ｃｙａｎａｌｒｌｉｄ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｄｅｖｅｌｏｐｓ　Ｗｏｒｌｄ’ｓ　Ｆｉｒｓｔ　５ｙｎｔｈｅｔ ｉｃ　Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ　５ｕｔｕｒｅ）Ｊ　、Ｃｈｅｒｎｉｓｔｒ　ａｎ ｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒ　、９０５（１９７０）に、より詳細に記載されている。

取り込まれた化合物の放出およびマトリックスの生侵食の両方は、ＰＬＡ、ＰＧ Ａ、またはＰＬＡ／ＰＧＡの分子量に　。

関係する。分子量が大きいほど（重量平均分子量が９０．０００以上）、より長 い期間、構造の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を保持するポリマーマトリックス が得られる；一方、分子量が低いほど（重量平均分子量が３０．０００以下）、 より遅い放出およびより短いマトリ・ンクス寿命となる。

これらのポリマー系からのＥＰＯの放出は、２つの異なるメカニズムで起こり得 る。薬物は、薬物の溶解により投与剤型に生じた水を満たしたチャネルを通して 分散することにより、あるいは最初のマイクロカプセル化の間でのポリマー溶媒 の除去により作り出された空間により放出され得る。第２のメカニズムはポリマ ーを分解して放出を増強する。時間と共に、ポリマーは侵食し始め、そしてデバ イス内に多孔性および微小構造の増加を生じる。これは、薬物放出の追加経路を 作り出す。

ポリマーの分解は、骨格のエステル結合の自然発生的な加水分解により生じる。

従って、速度は、水の取り込みに影響ｒるポリマー特性を変化することにより制 御され得る。これらは、モノマー率（グリコリドに対するラクチド）、Ｄ／Ｌラ クヂドに対してＬ−ラクチドの使用、およびポリマーの分子量を含む。これらの 因子は、浸水性の割合を究極的には左右する親水性および結晶性を決定する。塩 類、炭水化物、および界面活性剤のような親水性賦形剤がまた、取り込まれてデ ノーイスへの浸水性を増加し、従ってポリマーの侵食を促進し得る。

ポリマーの特性および投与剤型の特性を変えることにより、個々のこれらの放出 メカニズムの寄与を制御し得、そしてＥＰＯの放出速度を変化させ得る。ポリＬ −ラクチドのようなゆつくりと侵食するポリマーまたは低いグリコリド組成を有 する高分子量のポリ（ラクチドーコーグリコリド）は、放出を引き起こして分散 を制御するようになる。グリコリド組成の増加および分子量の低下は、水の取り 込みおよびポリマーの加水分解の両方を増強し、そして放出キネティクスに侵食 成分を加える。

放出速度はまた、マイクロスフェア内へのＥＰＯの移入を変化させることにより 制御し得る。移入の増加は、薬剤の溶解において形成されたチャネルを結ぶネッ トワークを増加し、そしてマイクロスフェアからの薬剤の放出を増強する。好ま しいＥＰＯ移入の範囲は、４０ユニット／ｆｆ１ｇから４０．０００ユニット／ Ｉｎｇの範囲であり、最も好ましくは５０ユニツ）＃＋ｇから２０．０００ユニ ット／ｆｆ１ｇの範囲である。

ポリマーの加水分解は、酸性または塩基性のｐ＋＋で促進され、従って、酸性ま たは塩基性の賦形剤を含有することが、ポリマー侵食率を調筋するために用いら れ得る。賦形剤は、微粒子として添加され得、取り込まれたＥＰＯと混合され得 、またはポリマー内に溶解され得る。

分解増強剤はポリマー重量に比較した重量に基づく。それらはタンパク質相に添 加され得、分離相として（すなわち、粒子として）加えられ得、または化合物に 依存してポリマー相に共に溶解され得る。全ての場合において、その量は、０． １％と３０％（ｗ／ｗ、ポリマー）との間である。分解増強剤のタイプは、硫酸 アンモニウムおよび塩化アンモニウムのような無機酸、クエン酸、安息香酸、ヘ パリン、およびアスコルビン酸のような有機酸、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム 、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、および水酸化亜鉛のような無機塩基、ならびに硫 酸プロタミン、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ンエタノールアミン、 およびトリエタノールアミンのような有機塩基、ならびにＴｗｅｅｎ”およびＰ ｌｕｒｏｎｉｃＴＭのような界面活性剤を含む。

マトリックス・＼微小構造を加えるための孔形成剤（すなわち、無機塩および糖 のような水溶性化合物）。それらは粒子として加えられる。その範囲は、１％と ３０％との間である（ｖ／ｗ、ポリマー）。

放出速度、分解速度、ＥＰＯの安定性を変化させるための添加剤賦形剤もまた、 ＥＰＯに添加して放出の持続に依存する能力を維持（１，得る。安定化剤は、炭 水化物、アミノ酸、脂肪酸、および界面活性剤を含み、当業者に公知である。さ らに、塩類、複合化剤（アルブミン、プロタミン）のようなＥＰＯの溶解性を改 変する賦形剤を用いて、マイクロスフェアからのタンパク質の放出速度を制御し 得る。。

ＥＰＯの安定化剤は、重量基準でタンパク質に対する割合に基づく。例として、 スクロース、ラクトース、マンニトール、デギストラン、およびヘパリンのよう な炭水化物、アルブミンおよびプロタミンのようなタンパク質、アルギニン、グ リシン、およびトレオニンのようなアミノ酸、ＴｗｅｅｎＴ′およびＰｌｕｒｏ ｎｉｃ”のような界面活性剤、塩化カルシウムおよびリン酸ナトリウムのような 塩、ならびに脂肪酸、リン脂質、および胆汁酸塩のような脂質を含む。

割合は一般的に、タンパク質に対する炭水化物、タンパク質に対するアミノ酸、 タンパク質に対するタンパク質安定化剤、およびタンパク質に対する塩類は、■ ＝１０〜４：ｌ：タンパク質に対する界面活性剤は、１：］、０００〜１：２０ ；タンパク質に対する脂質は、ｌ：２０〜４：１である。

＋＋、タンパク質送達システム。

タンパク質マイクロパーティクルを作製する方法本明細書に述べられている方法 を用いて、タンパク質マイクロスフェアは相分離、溶媒除去プロセスにより調製 される。

マイクロスフェアの形成は、非極性有機溶媒あるいはオイルのような非混和相中 の溶解度と比べて、水と混和し得る有機溶媒、塩溶液、あるいは酸性溶液または 塩基性溶液中のタンパク質の異なる溶解度に依存する。大部分のタンパク質はオ イルに溶けない。従って、タンパク質を、水と混和し得る有機、有８！ｌ／水系 、または二元性有機溶媒、酸、塩基または塩溶液（カプセル比相）である第１の 溶媒に溶解する。懸濁液、エマルジョン、溶液、または粒子の形態で取り込まれ る化合物が、タンパク質溶液に添加される。次いでこの混合物は、タンパク質を 溶解せず、そして第１の溶媒との混和性が制限されている第２の液相（連続相） と接触させる。二の連続相は好ましくは、植物油、シリコーンオイル、または鉱 油のようなオイルである。激しく撹拌され、そして第１の溶媒は、マイクロスフ ェアを形成するのに十分な条件下で、通常蒸発あるいは抽出により除去される。

コーティングはまた、タンパク質または非タンパク質のポリマーから作られるマ イクロパーティクルの上に作製され得る。コーティングを作るために、（１）タ ンパク質をまず溶媒に溶解する；（２）コートされる粒子またはマイクロパーテ ィクルをその溶液に添加する。（３）タンパク質／マイクロパーティクル混合物 を、第１の溶媒と混和しないそしてタンパク質コーティングのための非溶媒であ る第２の液相に添加する；（４）混合物を撹拌する；そして（５）粒子またはマ イクロパーティクルをタンパク質コーティングでコートするのに十分な条件下で （通常、蒸発または抽出により）、第１の溶媒を除去する。

本明細書で述べるプロセスによって、ナノメーターとマイクロメーターとの間の 直径（平均直径が０．０１ミクロンから約１００ミクロンより小さい間）を有し 、その中に所望の時間でおよび／または部位に送達または放出される化合物を取 り込んでいるタンパク質マイクロスフェアが得られる。好ましい方法では、マイ クロスフェアは長期間にわたって、取り込まれた化合物の安定性を増強するため に凍結して保存される。

マイクロスフェアを形成するために有用なタンパク質。

好ましい実施態様において、タンパク質は、プロラミン、好ましくはゼインのよ うな、疎水性のタンパク質である。本明細書で用いられる場合、タンパク質は、 単一型のタンパク質、タンパク質の組合せ、またはタンパク質とポリマーの組合 せであり得る。タンパク質は天然のものであり、特性が多種多様であり、そして インビボで無害のアミノ酸または小ペプチドに分解されるので、マイクロスフェ アを作製するのに用いられる。疎水性タンパク質は水への溶解度が制限されてお り、有機溶媒、有機溶媒の水系混合物、および有機溶媒の二元性混合物に可溶性 モある。プロラミン以外の他の有用なタンパク質の例としては、コラーゲン、カ ゼイン、およびケラチンがある。

プロラミンは、グルタミン、アスパラギン、およびプロリンのような多くの疎水 性アミノ酸を有することを特徴とする。

プロラミンは水に不溶性であるが、多くの有機溶媒、特に、少なくとも１％の水 、しかし６０％を越えない水を含むアルコール類、または極性有機溶媒に可溶性 である。

プロラミンは、例えば穀類加工の副産物として、容易に入手でき、安価である。

代表的なプロラミンには、グリアジン、カフィリン、ゼイン、およびホルデイン が包含される。マイクロスフェアの製造に使用するのに好ましいプロラミンは、 ゼインである。市販の入手可能な等級および精製された形態のゼインの両方が使 用され得る。ゼインの特性は、Ｌ、　Ｃ，Ｓｗａｌｌｅｎの「ゼイン−新規の産 業用タンパク質」、Ｉｎｄ、　ａｎｄ　Ｅｎ　。

マイクロスフェアの作製に用いるタンノ寸り賞月の溶媒。

タンパク質を適切な溶媒に溶解する。タン、クク質は、０．５％（Ｗ／Ｖ）を超 えるタンパク質が溶媒に溶け、室温（約２０°Ｃ〜２５°Ｃ）で、可視的に透明 な溶液を形成すれば「可溶性」である。プロラミンは、例えば、５％と６０％と の間の水を含むアルコール（エタノール）、幾つかのケトン類（例えばメチルエ チルケトン、アセトン）、およびアミド溶媒（例えば、アセトアミド）；極端に 高いｐＨ溶液（例えばｐ）１１０以上）または極端に低いｐＨ溶液（ｐＨ２以下 ）；および約１．ＯＮから約６Ｎの無機塩（例えば、ＮａＣ１、ＫＢｒ）の水溶 液に可溶性である。

ゼイン用の多くの二元性溶媒系が公知であり、その中の主成分はポリオール、特 に低級脂肪族アルコール、ケトン、またはグリコールであり、副成分は、水、芳 香族炭化水素、／１０ゲン化炭化水素、特に塩素化炭化水素、ニトロノでラフイ ン、アルデヒド、および環状エーテルである。特定の例には、アルコールおよび ハロゲン化炭化水素の混合物、ならびにアルコールおよびプロピレングリコール とエチレンジ１ノコールとの混合物が含まれる。ゼインのようなプロラミンに対 する二元性溶媒系は、ＭａｎｌｅｙおよびＥｖａｎｓ、　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ 　ａｎｄ　Ｅｎ　１ｎｅｅ■邸−リに１ド上α３６．６６１−６６５（１９４３ ）に報告されている。

連続相に適切な物質。

取り込まれるべき化合物は、タンノクク質溶液に添加される。

化合物は、懸濁液、溶液（オイル、有機溶媒、または水中の）、エマルジョン、 または粒子の形態であり得る。次いで化合物／タンパク質混合物は、（１）タン パク質溶媒と混和しない、または混和しにくい、および（２）タンパク質を溶解 しない第２の液相である連続相に導入される。溶媒は、互いに混和しないで作用 温度で安定な均一溶液を混合せずに形成する場合、「非混和性」である。非混和 相は、これらの条件下では分離層を形成する傾向にある。鉱油、シリコーンオイ ル、または植物油のようなオイルは有用な非混和相である。他にヘキサン、ヘプ タン、ドデカン、および高沸点の石油エーテルが含まれる。

一種またはそれ以上の界面活性剤が、タンパク質／第１の溶媒混合物、または連 続相に加えられて、タンパク質マイクロスフェアのサイズを縮小させ得る。適切 な界面活性剤、およびその使用法は当業者に公知である。

マイクロスフェアを形成するプロセス。

タンパク質溶液を連続相に添加し、そして第１の溶媒は、例えば、好ましくは蒸 発により、または溶媒抽出によりマイクロスフェアを形成する条件下で除去され る。効果的な混合は、ホモジナイザーを用いた急速な機械的撹拌により、および ／または層流を妨げる隔壁反応器を用いることによって達成され得る。必要な場 合、混合物は約１５分から４５分の間の期間、２２°Ｃと約４５°Ｃとの間の温 度に加熱され得る。加熱した場合、混合物をまず室温まで冷却し、次に化合物を 取り込んだマイクロスフェアを洗浄し、混合物から分離し、そして乾燥する。取 り込まれた親水性薬剤が水系媒体で不安定な場合、マイクロスフェアを凍結乾燥 し得る。

親水性化合物が微粒子として以外にマイクロスフェア中に取り込まれる場合に用 いられる別の実施態様においては、二重エマルジョン技法が用いられる。例えば 、取り込まれる化合物を最初に水溶液に溶解する。ゼインは低い水混和性を有す る適切な二元性有機混合物に溶解される。ゼイン用の多くの二元性有機溶媒が公 知であり、例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパツールのような アルコールとハロゲン化炭化水素との混合物で、ハロゲン化炭化水素を主成分と する混合物がある。水溶液をゼインの有機溶液に添加し、油中水エマルシコンが 作製される。次いで、このエマルジョンを、オイルのようなぜイン用の有機溶媒 と非混和性または混和しにくい第２の有機液相（連続相）に添加し、二重の油中 水エマルジョンを形成する。次いで、この溶媒を上記のように除去し、マイクロ スフェアを形成する。

マイクロスフェアの改変。

マイクロスフェアの特性は、所定の用途のために、例えば、マイクロスフェアを 形成する前に化学的におよび／または酵素的に出発タンパク質を変えることによ り、改変し得る。このような改変によって、熱安定性、表面反応性、脂溶性、分 子量、電荷、せん断安定性、およびプロテアーゼ耐性が増強されたり、または変 えられたタンパク質を生成し得る。

タンパク質の酵素的改変。

タンパク質の機能性、表面特性、および分子量の分布を、酵素処理によって改変 し得る。例えば、約３８．０００ダルトンの二量体の分子量を有するゼインの、 ９０％エタノール中でパパインまたはキモトリプシンなどのプロテアーゼを用い る酵素的加水分解で、約１．０００ダルトンの分子量を有するポリペプチドが得 られ、これは、未処理のタンパク質の溶解特性（すなわち、ポリペプチドは依然 水に不溶であるが、９０％エタノールに溶解性である）を維持している。加水分 解の程度は、使用した酵素の量、またはタンパク質が酵素に曝される反応時間を 変えることにより制御し得る。

タンパク質の安定性は、相分離プロセス中での使用に先立ってタンパク質を架橋 することにより増強され得る。これは、トランスグルタミナーゼ、またはタンパ ク質ジスルフィドイソメラーゼのような、タンパク質の分子内および／または分 子間の架橋を触媒する酵素の添加によりなされる。トランスグルタミナーゼおよ びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、アミノ酸、それぞれ、グルタミンお よびシスティン、を介してタンパク質の分子内および分子間架橋を引き起こす。

トランスグルタミナーゼは、アミノ酸のグルタミンのアミド基がアシル供与体で ある、アシル転移反応を触媒する。マイクロスフェアの形成の前後でタンパク質 の特性を変える、他の酵素的プロセスが知られている。

タンパク質の化学的改変。

マイクロスフェアの特性はまた、調製で用いられるタンパク質の化学的改変によ り、マイクロスフェアの形成の前後のいずれかで変えられ得る。このような改変 には、タンパク質を、１つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖の構造を変え、そのこ とによりタンパク質の特性を変える、酸、塩基、あるいは他の薬剤で処理するこ とが含まれ得る。例えば、プロラミン、特にゼインの高グルタミンおよびアスパ ラギン含量によって、アミド分解により、タンパク質の電荷特性、そしてそれに よる疎水性を操作する手段が提供される。好ましいアミド分解法には、上昇させ た温度（２５°Ｃと６５°Ｃとの間）で、所望のレベルのアミド分解が達成され るのに十分な時間、穏和な酸に触媒されたアミド分解（約ｐｉ１１で）が含まれ る。アミド分解プロセスは、アンモニア電極でアンモニアの放出を測定すること により追跡し得る。アミド分解は炭酸アンモニウムまたはその他の塩基の添加に より、停止し得る。

化学的改変の他の例には、タンパク質生成物の酸（または塩基）感受性を変え得 る、脂肪アルコールによるタンパク質のエステル化、または脂肪酸無水物による タンパク質のアシル化が含まれる。例えば、ゼインまたはゼインペプチドは上記 のようにアミド分解され得、次にアミド分解されたゼインは、脂肪酸と反応して 、タンパク質の脂肪酸エステルを形成し得る。アミド分解されないまたはアミド 分解されたゼインペプチドはまた、脂肪アルコールと反応して、脂肪アシル化（ ｆａｔｔｙ　ａｃｙｌａｔｅｄ）されたゼインまたはゼインペプチドを形成し得 る。次にこれらの脂肪酸で改変したタンパク質またはペプチドを、マイクロスフ ェアを形成する出発材料として用い得る。

タンパク質の電荷はまた、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドを用いてタ ンパク質にアミノ酸またはポリアミノ酸を架橋することにより改変され得る。

タンパク質は、マイクロスフェアの形成前または形成後で改変され得る。しかし 、相分離プロセスの有利な点は、マイクロスフェア形成後のタンパク質の苛酷な 化学処理または熱処理を必要としない点である。従って、グルタルアルデヒドの ようなタンパク質の架橋のための薬剤を用いてタンパク質を改変することが望ま しい場合、タンパク質は送達される化合物の取り込みおよびマイクロスフェアの 形成の前に処理される。

合成ポリマーに関して記載された同様の分解増強剤および安定化剤を、タンパク 質−ＥＰＯマイクロスフェアの形成用のポリマーに添加し得る。

ＩＩｌ、タンパク質−ポリマーマイクロスフェアの形成タンパク質混合物、ある いはプロラミン／ＰＬＡ、プロラミン／ＰＧＡ、またはプロラミン／ＰＬＡ−Ｐ ＧＡのようなタンパク質−ポリマー混合物のいずれかから作られるマトリックス は、種々の分解速度および拡散速度を有するように設計され得る。一般的に、分 解はタンパク質およびポリマー組成物の機能である。拡散は、マトリックス組成 物、形態、および取り込まれる物質の性質の機能である。マトリックスは、取り 込まれる化合物の放出期間より短い期間、等しい期間、またはより長い期間にわ たって分解されるように合成され得る。化合物は、拡散により、マトリックスの 分解により、またはマトリックスを介する拡散とマトリックス分解としての放出 との組み合わせにより放出され得る。

これらのコンポジットマトリックスはいくつかの形態のうちの１つをとり得る。

ポリマーコーティングを有するタンパク質マイクロスフェア：タンパク質により カプセル化されたポリマーマイクロパーティクルまたはマイクロカプセル；ポリ マーによりカプセル化された生物活性化合物およびタンパク質マイクロスフェア ：または、取り込まれた生物活性化合物およびポリマーでカプセル化された生物 活性化合物を有するまたは有しないタンパク質マイクロスフェア。

マイクロスフェアのサイズ。

マイクロスフェアは、ナノメーターのサイズのマイクロスフェアから約１００　 ミクロンの平均サイズまでの範囲の種々のサイズで生成され得る。約５０ｎｍ〜 ｌｏＯｎｍから約２０ミクロンの平均粒子サイズを有するマイクロスフェアが、 腸内投与、または細胞に標的化するのにより好ましい。約１００ｎｉ＋から約５ ミクロンの平均粒子サイズを有するマイクロスフェアが、薬物送達に用いるには 特に好適である。なぜなら、このサイズ範囲のマイクロスフェアは、血流および ／またはリンパ系に吸収され得る、または食作用を受け得るからである。

マイクロスフェアのサイズおよび他の特徴は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、光散 乱および示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて測定し得る。

タンパク質コーティングの調製。

タンパク質コーティングは、マイクロスフェアを作る方法の変法を用いて作られ る。コートされる粒子（定形を持たない粒子、マイクロスフェア、およびマイク ロカプセルを含む）は、任意のポリマー材料、通常、非タンパク質性物質または 改変タンパク質、あるいは放出される物質から作られ得る。

コーティングを形成するために、タンパク質を溶解し、コートされる粒子をタン パク質溶液に添加し、タンパク質／マイクロパーティクル混合物を連続相に添加 し、混合物を撹拌し、そして溶媒を、好ましくは蒸発によりまたは溶媒抽出によ り、粒子がタンパク質コーティングでコートされる条件下で除去する。

ＩＶ、マイクロスフェアに取り込まれる化合物またはマイクロスフェアから形成 される移植片の投与方法。

マイクロスフェアは、非経口投与または腸内投与により、局所的に、局部的に、 または全身的に、投与され得る。タンパク質ポリマーて作製されたマイクロスフ ェアについて、好ましい経路は経口である。

腸内投与。

ＥＰＯを含むマイクロスフェアは、好ましくは経口投与される。

これらのマイクロスフェアは、化学的性質およびサイズによって、胃腸管の上皮 組織の内層に吸収されるかまたは通過するかして、血流またはリンパ系中に入る 。ＥＰＯは、マイクロスフェアから、拡散、分解、または分解と拡散との組み合 わせにより、血流中に、リンパ系中に、上皮組織中に、あるいは上皮組織の表面 に放出される。

非経口投与。

１８０ミクロンより小さいマイクロスフェアは、静脈内投与のための針を容易に 通過する。適切な薬学的キャリアは、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水が知られ ており、そして市販されている。

皮下、筋肉内、および腹腔内投与。

上記のように生成されたマイクロスフェアは、皮下または腹腔中に標準ゲージ針 を通じて注入され、続いて取り込まれた薬物が放出されるのに十分な程小さい。

マイクロスフェアの腹腔膜への付着は、取り込まれた薬物の放出の局在化を目的 とする。マイクロスフェアはまた、免疫化または血流中への遅延放出が望ましい 他の目的のために、筋肉内に移植片または注射し得る。リン酸緩衝化生理食塩水 のようなキャリアまたはオイルのようなアジュバントが、マイクロスフェアのキ ャリアとして用いられ得る。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に公知であ る。

本方法は、生物学的に活性なＥＰＯの取り込みおよび放出を記載した特定の実施 態様を参考としてさらに記載される。

実施例１：ＥＰＯを含むプロラミンマイクロスフェアの調製。

ＥＰＯの溶液（４００＋ｎＭ塩化ナトリウム、８．　Ｏａ＋Ｍリン酸ナトリウム 、および１．５ｍＭリン酸カリウム中の１．Ｏｎ＋ｇ／ｎ＋ｌ　ＥＰＯ）を液体 窒素中で素早く凍結し、４８時間凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は、６０、０００ ユニット／ｆｆ１ｇ総固体の比活性を有した。

凍結乾燥ＥＰＯ（２，Ｏｎ＋ｇ）を２００μｌの水に溶解した。２００ａ＋ｇの ゼイン（Ｆ５０００型、Ｆｒｅｅａ′ｌａｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｔｕｃ ａｈｏｅ、ＮＹ）を３．８１ｎｌの水系エタノール混合物（２００μｌの水およ び３．６＋ｎｌの１００％エタノール）に溶解した。次いで、ゼインをＥＰＯ溶 液に添加し、緩やかに混合した。次いで、ゼインＥＰＯ溶液を１２０＋＋＋１の コーン油と２０秒間、ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒホモジナイザーおよび超微細発生機 （ｕｌｔｒａｆｉｎｅ　ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）を用いて乳化した。次いで、この エマルジョンを予め６０°Ｃに加熱した２５０＋ｎＬのコーン油に加え、そして １８００ｒｐｒｎでオーバーヘッドミキサー（ｏｖｅｒｈｅａｄ　ｍ１ｘｅｒ） で混合した。

得られた混合物は、５０℃であった。温度を、加熱プロ・ンクで２０分間４５℃ から５０℃の範囲で維持し、その後マイクロスフェアを室温まで冷却した。得ら れたマイクロスフェアを石油エーテルで洗浄し、コーン油を除去し、濾過した。

マイクロスフェアを室温で真空下−晩乾燥した１、実施例２：イヌに皮下投与し たプロラミンマイクロスフェアからのＥＰＯのインビボ放出。

実施例１で形成したゼインマイクロスフェアをピーグル犬における皮下投与モデ ルで試験した。イヌ（Ｎ・２）ｉこ、１９６ＥＰＯ固体と共にゼインマイクロス フェアの一回用量（３０＋ｎｇ）を皮下にｄＥ人した。ＥＰＯの測定用の血液サ ンプルを注入後９６時間の間採取した。血清を調製し、放射免疫ア・ソセイ（ｌ ｎｃｓｔａｒ、　５ｔｉｌ］、ｗａｔｅｒ、ＭＮ）によりＥＰＯをアッセイした 。

各動物に一ついての血清ＥＰＯの増加を図１に示す。血漿レベルは、１０時間で ピークを示し、投与後１２０時間でベースラインに戻る。

実施例３：サルに経口投与したプロラミンマイクロスフェアからのＥＰＯのイン ビボ放出。

実施例１で形成したゼインＥＰＯマイクロスフェアをカニクイサルにおける腸内 投与モデルで試験した。動物（Ｎ・６）を研究開始１日目、２日目、および３日 目（こ１％ＥＰＯを有する２００ｎｇのゼインマイクロスフェアの１回用量の栄 養投与（ｇａｖａｇｅ）　ｌこより摂取させた。投与前１時間、それぞれのサル は２ｈ＋ｇのシメチジンの一回筋肉内注入を受けて胃のｐＦｌを上昇させた。マ イクロスフェアを、８ｆｆｉ１のリン酸緩衝化再懸濁媒体中に再懸濁した。その 後、栄養投与チューブを４０１１の再懸濁媒体で洗い流した。

各動物はまた、対照実験も行った。いかなる活性薬剤も有さないブランクのマイ クロスフェアの１回用量を研究開始の１日目、２日目、および３日目１こ栄養投 与１こより摂取させた。

投与前１時間、各サルは２０ｍｇのシメチジンの１回の筋肉内注入を受け、胃の ｐｉ（を上昇させた。各動物はブラセボと活性薬剤実験との間の２カ月間休ませ た。

ＥＰＯの測定用血液サンプルは、各栄養投与前および投与後２時間、４時間、お よび６時間に採取した。血液サンプルはまた、最終投与の翌日、投与後１０日目 、および投与後２２日目に採取した。血液サンプルを両実験の同じサンプル採取 時間で採取した。血清を調製し、放射免疫アッセイ（ＩＮＣ３ＴＡＲ，Ｓｔｉ］ １ｗａｔｅｒ、　ＭＮ）を用いてＥＰＯについてアッセイした。

赤血球計数用のサンプルを、研究開始日１日目（マイクロスフェア投与前）およ び投与後５日目、１０日目、２０日目に収集した。

平均の血清ＥＰＯレベルにおける増加を図２に示す。ＥＰＯレベルは、５日後に ５０ｍＬｌ／ｍｌの最高値まで増加し、２２日後にベースラインに戻る。正常化 した赤血球数を図３に示す。赤血球数は、ベースラインの赤血球数の３．５倍で １０日目でピークを示す。

赤血球数の増加は、吸収したＥＰＯが生物学的活性を有することを示す。

実施例４：ＥＰＯを含むポリマーマイクロスフェアの調製。

０２５グラムのポリＤルラクチト（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｌｎｇｅｌｈｅｉｎ 、　Ｒｅ５ｏｎｅｒ　Ｒ１，０４）および０．２５グラムのポリＤルラクチドー コーグリコリド（ＢｉｒＩｌ′ｌｉｎｇｈａｌ！′ｌＰｏｌｙｍｅｒ　Ｉｎｃ、 、Ｌａｃｔｅｌ　５０：５０）を５．　ｈ＋１の塩化メチレン中に溶解した。こ のポリマー溶液に、１％Ｗ／ＷのＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭＦ６８（ＢＡＳＦ）を 含む、脱塩して凍結乾燥した１５ＩｎｇのＥｌ）０扮末を加えた。凍結乾燥した ＥＰＯは、１ミクロンから６ミクロンの範囲の粒子サイズを有した。懸濁液は、 Ｉｈ＋１のガス気密シリンジに入れた。２０ｈ＋ｌｉの１００％エタノールを、 丸いポリプロピレンコンテナ（１７ｃＱｌの直径、８Ｃ１ｎの深さ）に加えた。

この溶液を、液体窒素中で凍結し、５００ａ＋１の液体窒素でカバーした。ポリ マータンパク質混合物を、シリンジポンプを介してシリンジから、液体窒素およ び凍結エタノールのコンテナ上においた超音波ノズル（Ｍｏｄｅ、　５ｏｎｉｃ ｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌ、　Ｄａｎｂｕｒｙ、　ＣＴ）中へ、２　ｒｎｌ ／分て注入した。ノズルを、液体窒素に接触させて凍結させる小滴中に懸濁液を 霧化し、そして凍結エタノール上に沈澱したマイクロスフェアを形成した。

コンテナを、液体窒素が蒸発し、そしてエタノールが時間と共に融解する一８０ °Ｃ１，ｍ　ａいた。エタノールが融解するにつれて、マイクロスフェアを塩化 メチレンを抽出した液体中に置く。２４時間後、予め一８０°Ｃに冷却した追加 の２００ｍ１のヘキサンをコンテナに加えた。３日後、マイクロスフェアおよび エタノールのスラリーを、１ミクロンのＤｕｒａｐｏｒｅ”膜（Ｍｉｌｌｉｐｏ ｒｅ。

Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を用いて濾過した。次いで、濾過したマイクロスフェ アを凍結乾燥した。

実施例４で形成したマイクロスフェアをＳｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラットに おける皮下投与モデルで試験した。ラット（Ｎ・２）を１回用量のマイクロスフ ェア（２，５＋ｎｇまたは５．８ｆｆ１ｇ）で皮下に注入した。ＥＰＯの測定用 の血液サンプルを注入後数週間の間採取した。

血清を調製し、放射免疫アッセイ（Ｉｎｃｓｔａｒ、　Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ、 　Ｍｊｉ）によりＥＰＯをアッセイした。

各動物の血清ＥＰＯ（ｎ＋Ｕ／ｆｆ１ｌ　）の増加を図４に示す。血漿プロフィ ールは、１週間の導入期間に続く３日間持続する第１相を有する２相性であり、 その後レベルを少なくとも３週間ベースラインを越えて維持する。

時間 ＦＩＧ　Ｉ 時間（日） ＦＩＧ、２ 時間（日） ＦＩｏ、３ 時間（日） ＦＩＧ、４ 補正書の写しく翻訳文）提出書（ｆ９許法第１８４条の８）

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．マイクロスフェア中のエリスロポエチンを投与する工程を包含するエリスロ ポエチンの投与方法であって、該エリスロポエチンが５０から４０，０００の間 の有効量で患者に０．１重量％から２０重量％の間の濃度である、方法。
2. ２．請求項１に記載の方法であって、前記マイクロスフェアが以下の工程、 ａ）少なくとも１種類のタンパク質を含むタンパク質溶液を第２の液体と接触さ せる工程であって、該第２の液体がタンパク質溶媒との制限された混和性を有し 、そしてタンパク質を溶解せず、タンパク質−非溶媒混合物を形成する、工程； ｂ）該タンパク質−非溶媒混合物を撹拌して第２の液体中でタンパク質溶液の分 散を形成する工程；およびｃ）該タンパク質溶媒を除去して、タンパク質マイク ロスフェアを形成する工程、 により生産されるタンパク質マイクロスフェアであり、ここで、該タンパク質マ イクロスフェアが、５０ｎｍと１００ミクロンとの間の直径を有し、そして該マ イクロスフェアが、該タンパク質のアミド結合または熱変性により形成されない 、方法。
3. ３．前記タンパク質が、疎水性タンパク質である、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記疎水性タンパク質が、プロラミン、コラーゲン、カゼイン、およびケラ チンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. ５．前記マイクロスフェアが、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクチドーコーグリコ リド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーポネート、ポリアミド、ポリ無水物 、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレー ト、ポリウレタン、ポリアクリレート、エチレン−ビニルァセテートポリマー、 および他のアシル置換されたセルロースアセテートおよびそれらの誘導体、ポリ スチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、 クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ポリホスファゼン、 ポリヒドロキシブチレート、それらの混合物およびそれらのコポリマーからなる 群から選択される合成ポリマーで形成される、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記マイクロスフェアが、タンパク質と組合せて非タンパク質ポリマーで形 成される、請求項１に記載の方法。
7. ７．請求項１に記載の方法であって、前記マイクロスフェアが患者に投与するた めに薬学的に受容可能なキャリアと混合される、方法。
8. ８．請求項１に記載の方法であって、前記マイクロスフェアが受容可能な薬学的 キャリア中で患者に腸内投与される、方法。
9. ９．請求項１に記載の方法であって、前記マイクロスフェアが受容可能な薬学的 キャリア中で非経口的に患者に投与される、方法。
10. １０．マイクロスフェア中にエリスロポエチンを含むエリスロポエチン組成物で あって、該エリスロポエチンが０．０１％から２０％の間の濃度であり、５０ユ ニット／ｍｇと４０，０００ユニット／ｍｇの間で含む、組成物。
11. １１．請求項１０に記載の組成物であって、前記マイクロスフェアが以下の工程 、 ａ）少なくとも１種類のタンパク質を含むタンパク質溶液を第２の液体と接触さ せる工程であって、該第２の液体がタンパク質溶媒との制限された混和性を有し 、そしてタンパク質を溶解せず、タンパク質−非溶媒混合物を形成する、工程； ｂ）該タンパク質−非溶媒混合物を撹拌して第２の液体中でタンパク質溶液の分 散を形成する工程；およびｃ）該タンパク質溶媒を除去して、タンパク質マイク ロスフェアを形成する工程、 により生産されるタンパク質マイクロスフェアであり、ここで、該タンパク質マ イクロスフェアが、５０ｎｍと１００ミクロンとの間の直径を有し、そして該マ イクロスフェアが、該タンパク質のアミド結合または熱変性により形成されない 、組成物。
12. １２．前記タンパク質が疎水性タンパク質である、請求項１１に記載の組成物。
13. １３．請求項１２に記載の組成物であって、前記疎水性タンパク質が、プロラミ ン、コラーゲン、カゼイン、およびケラチンからなる群から選択される、組成物 。
14. １４．前記マイクロスフェアが、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクチドーコーグリ コリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーポネート、ポリアミド、ポリ無水 物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレ ート、ポリウレタン、ポリアクリレート、エチレン−ビニルアセテートポリマー 、および他のアシル置換されたセルロースアセテートおよびそれらの誘導体、ポ リスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール） 、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ポリホスファゼン 、ポリヒドロキシブチレート、それらの混合物およびそれらのコポリマーからな る群から選択される合成ポリマーで形成される、請求項１０に記載の組成物。
15. １５．請求項１０に記載の組成物であって、前記マイクロスフェアがタンパク質 と組合せて非タンパク質ポリマーで形成される、組成物。
16. １６．請求項１０に記載の組成物であって、前記マイクロスフェアが、薬学的に 受容可能なキャリアである、組成物。
17. １７．請求項１０に記載の組成物であって、ポリマー侵食速度を調節する賦形剤 、ＥＰＯ能力を安定化する賦形剤、およびＥＰＯの溶解度を改変する賦形剤から なる群から選択される賦形剤をさらに含む、組成物。
18. １８．請求項１７に記載のマイクロスフェアであって、前記侵食速度調節剤が１ ％と３０％（ｗ／ｗ，ポリマー）の間の濃度で、特定の形態でポリマーに添加さ れる孔形成剤である、マイクロスフェア。
19. １９．請求項１７に記載のマイクロスフェアであって、前記安定化剤が、炭水化 物、アミノ酸、タンパク質、脂質、塩類、脂肪酸、および界面活性剤からなる群 から選択される、マイクロスフェア。
20. ２０．請求項１７に記載のマイクロスフェアであって、ＥＰＯの溶解度を改変す る前記賦形剤が、０．１％と３０％（ｗ／ｗ，ポリマー）の間の濃度で存在し、 塩類、複合化剤、無機酸、有機酸、無機塩基、有機塩基、および界面活性剤から なる群から選択される、マイクロスフェア。