KR100810141B1 - 폴리-락티드-코-글리콜라이드 미립구 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다당류 고분자, 특히 분자내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 고분자, 특히 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트를 함유하는 폴리-락티드-코-글리콜라이드 미립구 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

PLGA, 키토산 글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트, 단백질, 펩타이드

Description

폴리-락티드-코-글리콜라이드 미립구 및 그의 제조 방법{PLGA micro-sphere particle and the method for manufacturing thereof}

도 1은 키토산 글리콜라이드를 함유하는 본 발명에 따른 PLGA 미립구의 전자현미경사진이다.

도 2는 콘드로이친 설페이트를 함유하는 본 발명에 따른 PGLA 미립구의 전자현미경사진이다.

도 3은 키토산 글리콜라이드를 함유하는 본 발명에 따른 PLGA 미립구의 in vitro 방출특성을 보여주는 도면이다.

도 4는 콘드로이친 설페이트를 함유하는 본 발명에 따른 PLGA 미립구의 in vitro 방출특성을 보여주는 도면이다.

도 5는 키토산 글리콜라이드를 함유하는 본 발명에 따른 PLGA 미립구로부터 방출되는 시간별 라이소자임의 활성 변화추이를 보여주는 도면이다.

도 6은 콘드로이친 설페이트를 함유하는 본 발명에 따른 PLGA 미립구로부터 방출되는 시간별 라이소자임의 활성 변화추이를 보여주는 도면이다.

본 발명은 다당류 고분자 첨가제, 특히 분자내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 고분자 첨가제, 특히 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트를 함유하는 폴리-락티드-코-글리콜라이드 미립구 (이하, ‘PLGA 미립구’ 또는 ‘PLGA MS' 라고도 언급함) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명에 따른 PLGA 미립구를 이용하여 체내에 전달될 수 있는 약물은 펩타이드 또는 단백질 약물일 수 있다.

최근 유전공학의 발전으로 암과 같이 난치병 혹은 불치병으로 여겨졌던 많은 질병들이 펩타이드 또는 단백질 약물 제제에 의해서 치유될 수 있다는 것이 많은 유전공학자들에 의해서 증명되고 있고, 또한 수많은 펩타이드 또는 단백질 약물제제들이 개발되어 임상실험으로 그 가능성이 보여 지고 있다.

그러나 이러한 성과에도 불구하고, 펩타이드 또는 단백질 약물들은 약물 저장 및 환자 투여 단계에서 단백분해(proteolysis) 및 변성(denaturation)에 의해서 약물의 약효가 떨어져서 실질적으로 치유가 필요한 환자에게 적용되고 있지 못하고 있는 실정이다.

실제로 펩타이드 또는 단백질 약물들의 약효가 현저하게 떨어지는 원인을 보면, 펩타이드 또는 단백질 약물의 약효는 그들이 갖는 고유의 입체적 형상이 생체 내에서 다른 단백질들과 생화학적인 상호작용을 나타내어 발휘되는데, 약물이 투여되는 외부 환경 혹은 자체의 생화학적 특성에 의하여 약물들 간의 응집(aggregation), 탈아민화(deamidation), 산화, 가수분해, b-엘리미네이션 및 라세미화(racemization)에 의해서 약물의 형태 변형이 일어나 본래의 형태보다 생화 학적 작용성이 떨어지기 때문이다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 당업계에서는 펩타이드 또는 단백질 약물들이 저장 또는 체내 투여 동안에도 약효를 떨어뜨리지 않고, 높은 활성으로 체내에 전달하기 위한 방법을 연구하여 왔다.

이러한 방법 중 하나로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 단백질 또는 펩타이드 약물에 공유 결합적으로 도입하는 PEG화를 통해 단백질 또는 펩타이드의 친수성(親水性)을 높여 단백질 또는 펩타이드의 변성 가능성을 줄이는 방법이 개발되었다.

그러나, 이러한 방법은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 단백질 또는 펩타이드 약물을 공유 결합적으로 도입하기 때문에 이에 의해서 약물의 생체 작용성이 변하게 되고, 이로 인해 최소한의 생체 작용성의 변화를 주는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 단백질 또는 펩타이드내 도입부위를 결정하기 위하여 많은 연구를 수행해야 되는 어려움이 당업계에 존재하고 있다.

이러한 PEG화 방법을 대체하기 위하여, 공유 결합적인 방법을 사용하지 않는 방법으로서, PLGA 미립구에 의해서 단백질 또는 펩타이드 약물을 제형화하는 방법이 개발되었다.

PLGA 는 체내에서 락트산(lactic acid)과 글리콜산(glycolic acid)로 완전 분해되는 생분해성을 가지면서도 체내 신진대사에서 의해서 CO2 로 체외 배출되는 인체에 전혀 무해한 고분자로 FDA의 승인을 받은 물질이다. 또한, PLGA 는 약물과 함께 미립구의 형태로 제형화가 가능하며, 이러한 제형화에 의해서 약물이 외부환경에 의해서 변성 또는 응집되어 그의 활성이 변화되는 것을 막을 뿐만 아니라, PLGA 는 담체로서 서방성(徐放性)을 가지고 있어, 한 번의 투여로 약물이 오랜 기간 효과를 지속할 수 있도록 한다. 게다가, PLGA는 생분해기간 및 약물의 방출조절이 가능하다. 즉, 공중합체 조성과 분자량을 달리하여, 제형화 형태로서 미립구의 크기를 필요에 따라 조절할 수 있고, 약물의 전달기간도 몇 주부터 몇 달까지 다양하게 조절할 수 있다. 이러한 서방성 특성은, adjuvant 효과도 지니고 있어 면역학적으로도 그의 응용범위가 넓다.

PLGA를 이용한 제형화 방법은 하기의 단계를 포함하여 PLGA 미립구의 형태로 제조하는 방법이 있다:

1) 단백질 또는 펩타이드 수용액과 PLGA 메틸렌 클로라이드(이하, ‘PLGA MC' 라고도 언급함) 수용액의 혼합물을 제공하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 얻어진 혼합물을 초음파 파쇄(ultra sonification) 혹은 격렬한 교반에 의하여 W/O (water-in-oil) 에멀젼을 제공하는 단계;

3) 상기 단계 2)에서 얻어진 파쇄 용액을 PVA 및 NaCl의 수용액에 서서히 넣고 교반하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 수득물로부터 용매를 증발시키고, 원심 분리하여 침전물을 얻어내는 단계;

5) 상기 단계 5)의 침전물을 세척하고 동결 건조하여 약물이 함유된 PLGA 미립구를 얻는 단계.

그러나 PLGA 자체가 락트산과 글리콜산의 공중합체여서 산성 환경에서 민감한 특성을 가지고 있으며, 이로 인해 PGLA 미립구는 산성 환경 하에서 제형화된 펩 타이드 또는 단백질 약물을 과도하게 방출하거나 약물의 변성이 촉진되는 문제점이 존재한다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 당업계에 다양한 시도들이 있어왔는데, 예를 들면 Schwendeman의 연구팀은 불용성인 수산화 마그네슘을 미립구의 제조과정 중에 첨가하여 PLGA의 분해시 나오는 수소를 중화시켜 미립구안의 산성화를 억제함으로써 봉입된 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있다고 보고하였고 [J. Wang, B. M. Wang, and S. P. Schwendeman. Characterization of the initial burst release of a model peptide from poly(D,L-lactide-co-glycolide) microspheres, J. Control. Release, 82, 289-307 (2002); G. Zhu, S. R. Mallery, and S. P. Schwendeman, Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly(lactide-co-glycolide), Nat. Biotechnol ., 18, 52-57 (2000); J. Kang and S. P. Schwendeman. Comparison of the effects of Mg(OH)2 and sucrose on the stability of bovine serum albumin encapsulated in injectable poly(D,L-lactide-co-glycolide) implants, Biomaterials , 23, 239-245 (2002)], Bae 그룹에서는 PEG/poly(L-histidine) 이중블록공중합체를 첨가하여 봉입된 단백질의 활성을 유지할 수 있다고 보고하였다 [J. H. Kim, A. Taluja, K. Knutson, Y.H. Bae . Stability of bovine serum albumin complexed with PEG-poly(L-histidine) diblock copolymer in PLGA microspheres. J Control Release, 109, 86-100 (2005)].

그러나, 이러한 연구결과로 생성된 미립구들은 생체적합성이 나쁘고 제조가 힘들다는 단점을 가지고 있어 실용화에는 문제가 있고, 또한 산업에 적용할 수 있을 정도의 서방성 약물전달 효과를 가지지 못하고, 펩타이드 또는 단백질 약물의 변성을 효과적으로 줄이지 못한다는 단점이 있다. 따라서, PLGA 미립구 제형화에 있어서 서방성 약물전달 효과와 펩타이드 또는 단백질 약물의 변성을 효과적으로 제어할 수 있는 PLGA 미립구 첨가제를 개발하고자 하는 연구가 당업계에서 진행되고 있다.

이에, 본 발명자 또한 PLGA 미립구 제형화에 있어서 서방성 약물전달 효과와 펩타이드 또는 단백질 약물의 변성을 효과적으로 제어할 수 있는 PLGA 미립구 첨가제를 개발하고자 많은 연구를 진행한 결과, 상기 첨가제로서 다당류 고분자들, 특히 분자내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 고분자, 더욱 구체적으로는 키토산 글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물을 사용하면 펩타이드 또는 단백질 약물의 변성 없이 서방성 약물전달에 이용될 수 있는 PLGA 미립구를 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 펩타이드 또는 단백질 약물의 체내 전달을 위한 PLGA 미립구의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 PLGA 미립구의 제조방법은, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

1) 펩타이드 또는 단백질 약물 수용액을 준비하는 단계;

2) 다당류 첨가제, 바람직하게는 분자내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 첨가제, 더욱 바람직하게는 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물의 수용액을 준비하는 단계;

3) 상기 단계 1)에서 얻어진 수용액과 상기 단계 2)에서 얻어진 수용액을 혼합하는 단계;

4) 상기 단계 3)에서 얻어진 수용액을 용매에 녹인 PLGA 용액을 첨가한 다음 교반하여 W/O 에멀젼을 제조하는 단계;

5) 상기 단계 4)에서 제조된 W/O 에멀젼을 분산용매에 분산시키는 단계;

6) 상기 단계 5)에서 제조된 용액으로부터 PLGA 미립구를 회수하는 단계.

펩타이드 또는 단백질 약물 수용액과 PLGA 용액의 혼합물로부터 PLGA 미립구를 제조하는 방법은 당업계에 통상적으로 알려져 있다 [Y.Y. Yang, H.H. Chia and T.S. Chung, Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method, J. Control. Release, 69, 81-96 (2000)].

다시 말해서, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 단백질 약물을 함유하는 PLGA 미립구의 제조방법은 PLGA 미립구를 제조하기 위해 PLGA 용액에 펩타이드 또는 단백질 약물의 수용액을 혼합할 때, 다당류 첨가제, 바람직하게는 분자내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 첨가제, 더욱 바람직하게는 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물의 수용액을 더 혼합하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에 따른 PLGA 미립구의 제조방법에 대하여 각 단계별로 구체적으로 설명한다.

단계 1: 펩타이드 또는 단백질 약물 수용액을 준비하는 단계

본 발명에서 사용된 용어 ‘펩타이드’ 또는 ‘단백질’ 은 L-아미노산 또는 그의 유도체 또는 유사체, 또는 D-아미노산 또는 그의 유도체 또는 유사체들이 서로 간에 펩타이드 결합을 통해 연결되어 있는 형태의 화합물 또는 고분자를 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용된 용어 ‘펩타이드 약물’ 또는 ‘단백질 약물’은 생체내에 투입시 화학적 또는 생화학적 반응을 통하여 생체 질환의 일부 또는 전부를 경감 또는 치유할 수 있거나, 질병의 악화 방지를 시킬 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

펩타이드 또는 단백질 약물의 수용액을 준비함에 있어, PLGA 미립구의 제조동안에 이들 약물이 변성되는 것을 방지하기 위하여 완충제를 더 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질 약물을 인산 완충 식염수(PBS)에 넣어 펩타이드 또는 단백질 약물의 수용액을 준비할 수 있다.

한편, 당업자라면 수용액의 pH 등은 펩타이드 또는 단백질 약물이 변성되는 범위 내에서 적절하게 선택할 수 있고, 이러한 pH 조건에 따라 사용가능한 적절한 완충제를 선택할 수 있다.

펩타이드 또는 단백질 약물의 수용액 중 약물의 농도는 특별하게 한정되지는 않지만, PLGA 미립구 제형으로부터 방출되었을 때 생체내에서 효과를 발휘할 수 있 을 농도 이상인 것이 바람직하고, 용해 또는 PLGA 미립구 제형화 동안 과도한 펩타이드 간에 또는 단백질 간에 응집 혹은 불활성화가 발생하는 농도 이하인 것이 바람직하다. 예를 들면, 0.01 mg/ml 이상 1000 mg/ml 일 수 있다.

단계 2: 다당류 첨가제, 바람직하게는 분자내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 첨가제, 더욱 바람직하게는 키토산- 글리콜라이드 , 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물의 수용액을 준비하는 단계

본 발명에 따른 PLGA 미립구는 그의 내부에 다당류 첨가제, 바람직하게는 분자 내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 첨가제를 함유함으로써 펩타이드 또는 단백질 약물과 함께 이온결합에 의한 이온 복합체를 형성하여 완충화 (buffering effect) 혹은 중성화 (neutralization) 효과를 통해 펩타이드 또는 단백질 약물 간의 응집 또는 활성 감소를 효과적으로 막을 수 있을 뿐만 아니라, 다당류 특유의 증점 효과로 인해 PLGA 미립구 내부에서 더욱 안정적으로 약물의 활성을 유지할 수 있다. 여기에서 상기 분자내에 이온화 그룹을 갖는 다당류 첨가제에서 상기 이온화 그룹은 수성 환경하에서 염기성을 나타내도록 하는 것일 수 있다. 이러한 다당류 첨가제로는 글리콜 키토산 또는 콘드로이친 설페이트를 사용할 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 PLGA 미립구를 제조하기 위해 첨가되는 글리콜 키토산 (이하, ‘CS' 라고도 언급함)은 수용성 키토산 유도체로서 하기의 구조를 갖는다:

(식중, x 및 y는 각각 1 내지 100 사이의 정수이다)

상기 글리콜 키토산은 생체 적성합성이 높고, 생분해성이며 낮은 면역성을 갖는 키토산 부분 포함한다. 또한, 약물전달시스템에서는 글리콜 키토산은 항암제용 자기 응집체(self aggregate)를 형성하는 특성을 이용하여 많은 연구가 진행되고 있다.

본 발명에 따르면, 이러한 글리콜 키토산이 PLGA 미립구 내의 환경을 점도가 높은 환경으로 바꾸어서 펩타이드 또는 단백질의 순간적 방출 (burst release)을 막아 PLGA 제형에 약물 전달의 서방성 특성을 부여한다.

이러한 서방성 특성은 약물전달분야에서 매우 이롭게 이용될 수 있는데, 그 이유는 제형 내에서 약물의 빠른 방출이 일어날 경우 체내 펩타이드 또는 단백질의 농도는 급격히 올라가게 되고 이로 인해 체내 면역반응이 일어나 약물의 부작용이 일어날 가능성이 존재하기 때문이다.

본 발명에 따른 PLGA 미립구의 제조에 첨가되는 콘드로이친 설페이트는 연골, 피부, 각막 및 태반에 존재하는 산성 무코폴리사카이드(mucopolysaccharide)로 서, 글리코사미노글리칸(GAG)의 일종이다. 특히, 본 발명에 따른 PLGA 미립구의 제조에 있어서 콘드로이친 설페이트의 형태는 어떠한 것이든 상관 없으며, 예를 들면 콘드로이친-4-설페이트 또는 콘드로이친-6-설페이트일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 콘드로이친 설페이트로는 D-글루쿠론산, N-아세틸갈락토사민 및 술페이트 잔기가 동등 몰량으로 존재하는 콘드로이친 설페이트 A (이하, ‘CSA’라고도 언급함)를 사용한다.

한편, 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물의 수용액을 준비함에 있어서, 이들이 가혹한 pH 환경 하에서도 가수분해되지 않도록 하기 위하여 수용액에 완충제를 첨가하는 것이 바람직하며, 예를 들면 인산 완충 식염수로 키토산-글리콜라이드, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물의 수용액을 준비할 수 있다.

펩타이드 또는 단백질 약물의 수용액 중 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도는 특별하게 한정되지는 않지만, PLGA 미립구 제형에서 펩타이드 또는 단백질 약물에 완충화 (buffering effect) 혹은 중성화 (neutralization)를 통한 안정화를 제공할 수 있는 농도로 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 0.01 mg/ml 이상 1000 mg/ml 일 수 있다.

키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도가 높을수록, PLGA 미립구 제형에서 펩타이드 또는 단백질 약물에 완충화 (buffering effect) 혹은 중성화 (neutralization)를 통한 약물 함유 PLGA 미립구에서 약물의 응집체 형성을 제어하면서도 제어된 서방성 형태로 약물을 방출시키는 효과가 높을 수 있다.

단계 3: 상기 단계 1)에서 얻어진 수용액과 상기 단계 2)에서 얻어진 수용액을 혼합하는 단계;

본 발명에 따르면, 펩타이드 또는 단백질 약물 및 키토산 글리콜 또는 콘드로이친 설페이트는 수용액 준비 과정 또는 이들의 혼합과정에서 응집체 (inclusion body)를 형성할 가능성이 있기 때문에 교반 없이 서서히 녹이는 것이 바람직하다.

또한, 두 수용액이 균일하게 혼합되도록 하기 위하여 혼합 후 일정시간, 예를 들면 약 10~20분, 바람직하게는 15분가량 방치해 두는 것이 바람직하다.

한편, 상기 단계 1)에서 얻어진 수용액 중의 단백질 또는 펩타이드 약물의 농도와 상기 단계 2)에서 얻어진 수용액 중의 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도의 혼합비는 특별히 한정되지는 않지만, 최종적으로 생성되는 PLGA 미립구 내부에서 약물의 불용성 응집체가 최소한으로 생성되도록 하기 위해서는 상기 단계 2)에서 얻어진 수용액 중의 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도가 높으면 높을수록 바람직하다.

이론에 의해서 본 발명이 특별히 한정되는 바는 아니지만, 수용액 중의 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 농도가 높을수록 좋은 이유는, 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 음전하와 펩타이드 또는 단백질 약물의 아민기의 양전하 간에 이온 복합체를 형성함과 동시에 고분자 사슬기의 존재로 비공유 결합에 의해서 약물과 키토산-글리콜라이드 또는 콘디로이친 설페이트 간의 결합인력이 형성되어 생체 내에서 활성을 나타내지 못하는 불용성 응집체를 형성하지 않기 때문이다.

또한 키토산-글리콜라이드 또는 콘디로이친 설페이트는 염기성의 물질로서 PLGA 미립구의 붕괴 동안 PLGA 내부에 축적되는 산성물질을 중화시킴으로써 생성되는 산성 물질에 의한 PLGA 의 산-가수분해 가속화를 막을 수 있다. 다시 설명하면, 키토산-글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트의 상기한 효과는 키토산-글리콜라이드 또는 콘디로이친 설페이트의 산에 대한 완충효과로 볼 수 있다.

단계 4: 상기 단계 3)에서 얻어진 수용액을 용매에 녹인 PLGA 용액을 첨가한 다음 교반하여 W/O 에멀젼을 제조하는 단계

PLGA는 폴리(락티드-코-글리콜라이드)를 일컫는 통상적인 약어로서 락트산과 글리콜산이 80:20 내지 20:80의 몰비율, 바람직하게는 50:50 의 몰비율로 공중합되어 있는 생분해성 공중합체이다. 현재 산업적으로 이용되고 있는 PLGA는 8,000 내지 75,000 의 분자량을 가지며, 산성 환경하에서 산-촉매된 가수분해가 일어나는 성질을 갖는다.

본 발명에 따른 PLGA 미립구를 제조하기 위해서 사용될 수 있는 PLGA 는 상기한 특성을 갖는 것이라면 어떤 것이든 사용될 수 있다. 예를들면, Boehringer社 (Germany)에서 제공되는 상품명 Resomer RG 계열의 PLGA, 더욱 바람직하게는 Resomer RG 502를 사용할 수 있다.

본 발명에 다른 PLGA 미립구를 제조하기 위해 사용되는 PLGA 미립구의 양은 펩타이드 또는 단백질 약물을 충분히 담지할 수 있는 정도의 양으로 사용하면 된다. 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면 펩타이드 또는 단백질 약물의 중량 대비 0.1 내지 1000 배의 중량으로 사용할 수 있다.

PLGA를 녹이기 위한 용매로는, 당업계에서 PLGA 미립구를 제조하기 위해 통상적으로 알려진 용매를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이러한 용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하는 것이 바람직하다.

W/O 에멀젼을 제조하는 방법은 특별히 한정되지는 않지만, 격렬하게 일정시간 교반하는 방법에 의해서 제조할 수 있다. PLGA내의 글리콜라이드 자체는 친수성기와 소수성기의 공존으로 인해 양친매성을 가지며, 이로 인해 물 또는 수용액과 함께 격렬히 교반할 경우 안정한 형태의 W/O 에멀젼이 형성될 수 있다.

이러한 에멀젼의 생성을 위해서 교반하는 시간은 용액의 양 등에 따라 다양할 수 있지만, 예를 들면 1초 내지 10분일 수 있으며, 바람직하게는 10초 내지 1분 동안 교반을 수행하여 PLGA 미립구 내부에 펩타이드 또는 단백질 약물 및 키토산-글리콜라이드 혹은 콘드로이친 설페이트의 혼합물의 수용액이 캡슐화되어 있는 형태의 W/O 에멀젼을 형성시킬 수 있다.

단계 5: 상기 단계 4)에서 제조된 W/O 에멀젼을 분산용매에 분산시키는 단계

단계 4)에서 제조된 W/O 에멀젼의 안정성을 향상시키기 위하여, 물에는 녹지만 유기용매에는 녹지 않는 고분자 분산용매에 분산시키는 것이 필요하다. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기한 고분자 분산용매의 예로는 폴리비닐알코올(PVA)를 사용할 수 있다.

예를 들면 상기 단계 4)에서 제조된 W/O 에멀젼을 폴비닐알코올 및 염화나트륨의 20중량%:0.9중량% 의 혼합 용액에 첨가하는 방식으로 W/O 에멀젼을 분산용매 중에 분산시킬 수 있다.

이 단계를 통해서, 제조된 용액중에서는 미세입자가 형성되며, 이러한 미세입자 제조 후에 10분~60분간 교반을 수행함으로써 미세입자를 함유한 용액에 대한 경화(hardening) 과정을 수행할 수 있다.

단계 6: 상기 단계 5)에서 제조된 용액으로부터 PLGA 미립구를 회수하는 단계

상기 단계 5)에서 제조된 용액으로부터 PLGA 미립구를 포함하는 입자는 원심분리를 통해 간단히 회수될 수 있다. 원심분리의 조건은 통상적인 반복실험을 통해서 알아낼 수 있지만, 예를 들어 약 2,500 rpm에서 약 1 내지 10분간 수행될 수 있다.

또한, PLGA 미립구로부터 불순물을 최소화하기 위하여 회수된 PLGA 미립구에 대해서 염화나트륨 용액으로 재분산시킨 후 추가 세척을 수행한 후 원심분리를 다시 반복수행하여 세척과정을 수행할 수 있다. 이러한 세척 과정은 복수회 행하는 것도 가능하다.

한편, 최종적으로 회수된 PLGA 미립구는 동결건조를 추가로 수행하여 입자 형태로 PLGA 미립구를 보관 또는 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명에 따른 PLGA 미립구는 펩타이드 또는 단백질 약물 및 PLGA를 포함하는 PLGA 미립구에 있어서, PLGA 미립구내에 글리콜 키토산, 콘드로이친 설페이트 또는 이의 조합물이 더 포함되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 PLGA 미립구는 키토산 글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트는 펩타이드 또는 단백질 약물과 함께 PLGA 입자담체내에 봉입시킴으로써, 펩타이드 또는 단백질 약물의 순간적 방출을 막을 수 있으면서도, PLGA 미립구만을 담체로 사용한 것과 비교하여 더 많은 양의 펩타이드 또는 단백질 약물을 방출시킬 수 있다. 이와 더불어, 본 발명에 따른 PLGA 미립구는 PLGA 미립구 내부의 펩타이드 또는 단백질 약물의 응집을 또한 약물의 중성화 및 이온적 복합체의 형성에 의해서 효과적으로 막아 장기방출시 약물의 효과를 더욱 오래 지속할 수 있다.

본 발명에 따른 PLGA 미립구는 당업계에서 PLGA 입자를 이용하고 있는 약물의 체내전달시스템 모두에 응용가능하다.

이하에서 본 발명에 따른 PLGA 미립구 제조방법의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 키토산 글리콜라이드 함유 PLGA 미립구의 제조

0.25 ml의 인산완충식염수 (phosphate buffer saline) (pH 5.1)에 단백질 약물로서 50mg 의 라이소자임 (Sigma, hen egg lysozyme)을 서서히 녹여 제1 용액을 준비하였다. 이어서, 0.25 ml 의 인산완충식염수 (pH 5.1)에 10 mg 의 키토산-글리콜라이드를 녹여 제2 용액을 준비하였다. 그 다음, 상기 제1 용액과 상기 제2 용액을 혼합하고 15분가량 방치하여 제3 용액을 준비하였다. 이어서, PLGA 로서 500 mg의 RG 502H를 3 ml 의 메틸렌 클로라이드 (MC)에 녹여 제4 용액을 제조하였다. 상기 제4 용액에 제3 용액을 넣고 15초간 격렬하게 교반혼합(vortex)하여 W/O 에멀젼을 준비하였다. 상기 W/O 에멀젼을 분산용매로서 PVA(20wt%)/NaCl(0.9wt%) 용액 1L에 15초 이내에 주사기로 주입한 다음, 호모믹서내에서 4,000 rpm 및 4분간 교반하여 미세입자를 용액을 제조하였다. 미세입자 제조 후 40 분간 서서히 교반하여 경화(hardening) 과정을 수행한 다음, 2,500 rpm에서 3분간 원심분리하여 미세입자를 회수하였다. 원심분리 후, 침전물에 0.9 wt% NaCl 용액을 넣어 재분산 후 다시 원심분리하여 침전물을 얻고, 이 과정을 3회 반복하여 세척과정을 수행하였다. 이어서, 생성물을 3일간 동결건조하여 단백질 약물로서 라이소자임이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다 (수득율: > 90%).

제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 1a와 같다.

실시예 2: 키토산 글리콜라이드 함유 PLGA 미립구의 제조

20 mg 의 키토산-글리콜라이드를 이용하여 제2 용액을 제조한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 과정을 수행하여 단백질 약물로서 라이소자임이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다 (수득율: > 90%).

제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 1b와 같다.

실시예 3: 키토산 글리콜라이드 함유 PLGA 미립구의 제조

40 mg 의 키토산-글리콜라이드를 이용하여 제2 용액을 제조한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 과정을 수행하여 단백질 약물로서 라이소자임이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다 (수득율: > 90%).

제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 1c와 같고, 그의 절단면은 도 1d와 같다.

비교예 1: 키토산 글리콜라이드 미함유 PLGA 미립구의 제조

키토산-글리콜라이드를 함유하지 않은 제2 용액을 제조한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 과정을 수행하여 단백질 약물로서 라이소자임이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다 (수득율: > 90%).

제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 1e와 같다.

실시예 4: 콘드로이친 설페이트 함유 PLGA 미립구의 제조

0.25 ml의 인산완충식염수 (phosphate buffer saline) (pH 5.1)에 단백질 약물로서 50mg 의 라이소자임 (Sigma, hen egg lysozyme)을 서서히 녹여 제1 용액을 준비하였다. 이어서, 0.25 ml 의 인산완충식염수 (pH 5.1)에 12.5 mg 의 콘드로이친 설페이트를 녹여 제2 용액을 준비하였다. 그 다음, 상기 제1 용액과 상기 제2 용액을 혼합하고 15분가량 방치하여 제3 용액을 준비하였다. 이어서, PLGA 로서 500 mg의 RG 502H를 3 ml 의 메틸렌 클로라이드 (MC)에 녹여 제4 용액을 제조하였다. 상기 제4 용액에 제3 용액을 넣고 15초간 격렬하게 교반혼합(vortex)하여 W/O 에멀젼을 준비하였다. 상기 W/O 에멀젼을 분산용매로서 PVA(20wt%)/NaCl(0.9wt%) 용액 1L에 15초 이내에 주사기로 주입한 다음, 호모믹서내에서 4,000 rpm 및 4분간 교반하여 미세입자를 용액을 제조하였다. 미세입자 제조 후 40 분간 서서히 교반하여 경화(hardening) 과정을 수행한 다음, 2,500 rpm에서 3분간 원심분리하여 미 세입자를 회수하였다. 원심분리 후, 침전물에 0.9 wt% NaCl 용액을 넣어 재분산 후 다시 원심분리하여 침전물을 얻고, 이 과정을 3회 반복하여 세척과정을 수행하였다. 이어서, 생성물을 3일간 동결건조하여 단백질 약물로서 라이소자임이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다 (수득율: > 90%).

제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 2a와 같다.

실시예 5: 콘드로이친 설페이트 함유 PLGA 미립구의 제조

25 mg 의 콘드로이친 설페이트를 이용하여 제2 용액을 제조한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 과정을 수행하여 단백질 약물로서 라이소자임이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다 (수득율: > 90%).

제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 2b와 같다.

실시예 6: 콘드로이친 설페이트 함유 PLGA 미립구의 제조

50 mg 의 콘드로이친 설페이트를 이용하여 제2 용액을 제조한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 과정을 수행하여 단백질 약물로서 라이소자임이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다 (수득율: > 90%).

제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 2c와 같고, 그의 절단면은 도 2d와 같다.

실시예 7: 콘드로이친 설페이트 함유 PLGA 미립구의 제조

100 mg 의 콘드로이친 설페이트를 이용하여 제2 용액을 제조한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 과정을 수행하여 단백질 약물로서 라이소자임이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다 (수득율: > 90%).

제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 2e와 같고, 이중 PLGA 미립구 1개에 대한 확대사진은 도 2f와 같다.

비교예 2: 콘드로이친 설페이트 미함유 PLGA 미립구의 제조

콘드로이친 설페이트를 함유하지 않은 제2 용액을 제조한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 과정을 수행하여 단백질 약물로서 라이소자임이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다 (수득율: > 90%).

제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 2g와 같다.

실험예 1: PLGA 입자의 약물 봉입도 분석

실시예 1 내지 7 및 비교예 1 내지 2에서 제조된 PLGA 미립구에 대해서 라이소자임의 입자내에 봉입(encapsulation)되는 정도(이하, ‘봉입도’라 함)를 TNBS법을 이용하여 측정하였다. TNBS법은 단백질을 가수분해하여 작은 절단편 (small fragments)으로 만들고, 이 절단편의 유리 아미노산(free amino acid)을 TNBS (Trinitrobenzene sulfonate)를 이용하여 정량하는 방법이다.

측정방법에 대해서 구체적으로 설명하면 다음과 같았다. 실시예 1 내지 7 및 비교예 1 내지 2에서 제조된 PLGA 미립구 20 mg 과 표준시료로서 라이소자임 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 및 0.15625 mg을 1 ml 의 6M HCl에 넣고 24시간 동안 37℃, 100 rpm으로 진탕교반(shaking)하였다. 이어서, 6 ml 의 1 M NaOH에 넣고 24시간 동안 37℃, 100 rpm으로 진탕교반하였다. 50 μl의 라이소자임 용액을 96웰 마이크로플레이트로 옮긴 뒤, 125 μl 의 4% (w/v) NaHCO3 (pH 9.0)과 50 μl 의 0.5% (w/v) TNBS 용액을 넣은 후 2시간 실온에서 배양한 후에 마이크로플레이트 흡 광도 판독기로 λ=450 nm에서 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1 및 2 에 나타내었다.

실험예 2: 불용성 약물 응집체 분석

실시예 1 내지 7 및 비교예 1 내지 2에서 제조된 PLGA 미립구 40 mg을 1 ml의 메틸렌 클로라이드에 녹인 후 30 분간 교반하였다. 이어서, 5000 rpm.에서 20분간 원심분리 후, 상청액을 제거하고, 라이소자임을 포함하는 침전물을 1 ml 의 10 mM 인산완충액 (pH 5.1)에 녹이고, 이때 녹지 않는 응집체를 원심분리한 후, 이를 6 M 우레아(urea)를 포함하는 1 ml의 10 mM 인산완충액 (pH 5.1)에 녹였다. 그런 다음, 생성된 용액을 1 ml 의 6M HCl에 넣고 24시간 동안 37℃, 100 rpm에서 진탕교반하였다. 그런 다음, 6 ml의 1 M NaOH에 넣고 24시간 동안 37℃, 100 rpm에서 진탕교반하였다. 50 μl의 라이소자임 용액을 96웰 마이크로플레이트로 옮긴 뒤, 125 μl의 4% (w/v) NaHCO3 (pH 9.0)과 50 μl의 0.5% (w/v) TNBS 용액을 넣은 후 2시간 실온에서 배양한 후 마이크플레이트 흡광도 판독기로 λ=450 nm에서 분석하였다. 표준시료로서 라이소자임 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 및 0.15625 mg에 대해서도 위 과정을 반복한 후, 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1 및 2에 나타내었다.

	키토산- 글리콜라이드 함량 (mg)	라이소자임 함량(%) (20mg 미립구 대비 함량)	봉입도 (%)	불용성 응집체 (%)
비교예 1	0	6.2310	60.7600	32.1500
실시예 1	10	6.0252	52.5300	23.6300
실시예 2	20	5.6782	63.2653	14.6993
실시예 3	40	5.5742	66.0234	7.9693

	콘드로이친 설페이트 함량 (mg)	라이소자임 함량(%) (40mg 미립구 대비 함량)	봉입도 (%)	불용성 응집체 (%)
비교예 2	0	6.2310	60.7600	32.1500
실시예 4	12.5	7.3125	72.6300	15.2910
실시예 5	25.0	8.0523	80.1500	10.8420
실시예 6	50.0	8.0163	82.5300	7.6923
실시예 7	100.0	8.3547	84.6610	4.1050

실험예 3: PLGA 미립구로부터 방출되는 속도 분석(1)

실시예 1 내지 3 및 비교예 1 의 PLGA 미립구로부터 라이소자임이 방출되는 속도에 대해서 분석하였다. 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 의 PLGA 미립구 20 mg을 3 ml 인산완충식염수 (pH 7.4, 8 g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 0.24 g의 KH2PO4, 1.81 g의 Na2HPO4? H2O, 0.5 g의 NaN3, 0.1 g의 Tween-20, 1000 ml의 증류수)에 현탁한 후, 투석 용기(dialysis bag) (MW cuf-off: 300,000)에 넣고, 37℃에서 교반혼합하면서 시간별로 2 ml을 회수하고 새로운 인산완충식염수 2 ml를 첨가하였다. 회수된 용액에 대해서 micro BCA reagent kit (Pierce社, Milwaukee, USA; 검출 민감도 20-2000 μg/ml)를 이용하여 분석하였다. 즉, 각 시약 주입 후 40℃에서 2시간 배양한 후 마이크로플레이트 흡광도 판독기로 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라이소자임 표준시료에 대한 결과는 도 3a와 같으며, 시간별에 따른 라이소자임의 누적 방출량에 대한 결과는 도 3b와 같다. 도 3b에서, -●- 은 비교예 1, -■- 은 실시예 1, -▲- 은 실시예 2, -▼- 은 실시예 3에 대한 결과 값이다.

실험예 4: PLGA 미립구로부터 방출되는 속도 분석(2)

실시예 4 내지 7 및 비교예 2 의 PLGA 미립구로부터 라이소자임이 방출되는 속도에 대한 분석을 위 실험예 3과 동일한 방법으로 수행하였다. 라이소자임 표준시료에 대한 결과는 도 4a와 같으며, 시간별에 따른 라이소자임의 누적 방출량에 대한 결과는 도 4b와 같다. 도 4b에서, -●- 은 비교예 1, -■- 은 실시예 1, -▲- 은 실시예 2, -▼- 은 실시예 3, -◆- 은 실시예 7에 대한 결과 값이다.

실험예 5: PLGA 미립구로부터 방출되는 약물 활성 분석(1)

PLGA 미립구로부터 방출되는 라이소자임에 대해서 시간경과에 따른 활성을 분석하였다. 실험에 사용된 PLGA 미립구는 실시예 3의 것을 사용하였다.

라이소자임의 활성측정은 실험예 3과 동일한 방법을 약물 방출 실험을 수행하여 시간별로 얻어지는 1ml 의 시료에 대해서 수행하였다. 즉, 하루 전에 외부 상을 갈아준 후 다음날 외부상 1 ml을 수거하여 라이소자임의 활성을 측정하였고, 활성 측정 전에 TNBS법에 의해 1 ml 중 라이소자임의 농도를 확인하였다. 라이소자임의 활성은 문헌 [Perez and Griebenow, J. Pharm. Pharmacol., 53, 1217-1226, 2001] 과 유사한 방법으로 수행하였다. 구체적으로는 다음과 같았다.

2.3 mg/ml의 Micrococcus lysodeikticus (ATCC 4698) 세포 현탁액 (66 mM phosphate buffer pH 6.2) 중 100 μl을 측정시료 1 ml 중 150 μl 와 섞은 후 450 nm에서 15초 간격으로 4분간 시간에 따른 흡광도 감소를 모니터링하였다. 대조군으로는 라이소자임 표준시료용액 0 내지 1 mg/ml의 것으로 하였다. 얻어진 곡선의 선형 부분의 기울기는 표준시료의 기울기와 관계를 분석하였다. 즉, 측정 결과값은 초기 약물동역학적 속도 (kinetic rate)로 표시하였다 (흡광도의 기울기와 t50의 시간). 여기서, 활성도는 각 샘플의 초기 기울기와 관계가 있다. 표준시료의 라이소자임 농도별 초기속도에 대한 표준값을 정한 후, 각 표준시료 라이소자임의 초기속도를 활성도 100%로 하였다. 각 측정 시료의 초기속도를 계산후 표준시료 초기속도와 비교하여 상대적 활성도를 계산하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

실험예 6: PLGA 미립구로부터 방출되는 약물 활성 분석(2)

실험에 사용된 PLGA 미립구를 실시예 5의 것을 사용한 것을 제외하고는 실험예 5와 동일한 방법으로 PLGA 미립구로부터 방출되는 라이소자임에 대해서 시간경과에 따른 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 PLGA 미립구는 키토산 글리콜라이드 또는 콘드로이친 설페이트는 펩타이드 또는 단백질 약물과 함께 PLGA 입자담체내에 봉입시킴으로써, 펩타이드 또는 단백질 약물의 순간적 방출을 막을 수 있으면서도, PLGA 미립구만을 담체로 사용한 것과 비교하여 더 많은 양의 펩타이드 또는 단백질 약물을 방출시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 이와 더불어, 본 발명에 따른 PLGA 미립구는 PLGA 미립구 내부의 펩타이드 또는 단백질 약물의 응집을 또한 약물의 중성화 및 이온적 복합체의 형성에 의해서 효과적으로 막아 장기방출시 약 물의 효과를 더욱 오래 지속할 수 있는 것으로 확인되었다.

Claims (9)

1. 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구의 제조방법:

   1) 펩타이드 또는 단백질 약물 수용액을 준비하는 단계;

   2) 다당류 고분자 첨가제로서 콘드로이친 설페이트의 수용액을 준비하는 단계;

   3) 상기 단계 1)에서 얻어진 수용액과 상기 단계 2)에서 얻어진 수용액을 혼합하는 단계;

   4) 상기 단계 3)에서 얻어진 수용액을 용매에 녹인 PLGA 용액에 첨가한 다음 교반하여 W/O 에멀젼을 제조하는 단계;

   5) 상기 단계 4)에서 제조된 W/O 에멀젼을 분산용매에 분산시키는 단계;

   6) 상기 단계 5)에서 제조된 용액으로부터 PLGA 미립구를 회수하는 단계.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 1)의 수용액 및 상기 단계 2)의 수용액이 인산완충식염수를 함유하는 수용액임을 특징으로 하는 PLGA 미립구의 제조방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 4) 의 용매가 메틸렌 클로라이드임을 특징으로 하는 PLGA 미립구의 제조방법.
5. 제 1 항에 있에서, 상기 단계 5)에서 분산용매가 폴리비닐알코올(PVA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구의 제조방법.
6. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 PLGA 미립구.
7. 펩타이드 또는 단백질 약물 및 PLGA를 포함하는 PLGA 미립구에 있어서, PLGA 미립구내에 콘드로이친 설페이트가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구.
8. 제 6 항에 기재된 PLGA 미립구를 이용한 펩타이드 또는 단백질 약물의 체내전달시스템.
9. 제 7 항에 기재된 PLGA 미립구를 이용한 펩타이드 또는 단백질 약물의 체내전달시스템.

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