KR20090116494A - 폴리-락티드-코-글리콜라이드 미립구, 그 제조방법, 및그것을 포함하는 단백질 또는 펩티드 약물 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩티드 또는 단백질 약물, 및 PLGA(Poly(lactide-co-glycolide))를 포함하는 PLGA 미립구에 있어서, PLGA 미립구내에 황산기를 갖는 다당류가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구, 그 제조방법, 및 그 PLGA 미립구를 포함하는 펩티드 또는 단백질 약물 제제를 제공한다.

Description

폴리-락티드-코-글리콜라이드 미립구, 그 제조방법, 및 그것을 포함하는 단백질 또는 펩티드 약물 제제{Poly(lactide-co-glycolide) microsphere, a process for the preparatrion thereof, and a protein or peptide drug formulation comprising the same}
본 발명은 펩티드 또는 단백질 약물을 저장 또는 체내에 투여하는 동안 약효가 저하되지 않고 높은 활성으로 체내에 전달하기 위한 약물 전달 시스템에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 종래의 PLGA 미립구에 비해 보다 높은 효율로 펩티드 또는 단백질 약물을 전달할 수 있으면서 약물의 서방성을 더욱 안정적으로 확보할 수 있는 PLGA 미립구, 그 제조방법, 그 PLGA 미립구를 포함하는 의약 제제에 관한 것이다.
최근 다양한 질병에 펩티드 또는 단백질 약물 제제를 사용하고 있다. 또한, 유전공학의 발달로 인해 재조합 단백질 생산이 원활해짐에 따라서 다양한 펩티드 또는 단백질 약물 제제들이 생산되어 시판되고 있는 실정이다. 그러나, 이러한 성과에도 불구하고, 펩티드 또는 단백질 약물은 고가이며 생체 내 지속시간이 짧고 약물의 저장과 환자 투여 단계에서 단백 분해(proteolysis) 및 변성(denaturation) 에 의해서 약물의 약효가 떨어져서 실질적으로 치유가 필요한 환자에게 적용되지 못하고 있는 실정이다.
실제로 펩티드 또는 단백질 약물들의 약효가 현저하게 떨어지는 원인을 보면, 펩티드 또는 단백질 약물의 약효는 그들이 갖는 고유의 입체적 형상이 생체 내에서 다른 단백질들과 생화학적인 상호작용을 나타내어 발휘되는데, 약물이 투여되는 외부 환경 혹은 자체의 생화학적 특성에 의하여 약물들 간의 응집(aggregation), 탈아민화(deamination), 산화, 섬유화(fibrization), 가수분해, b-엘리미네이션, 및 라세미화(racemization)에 의해서 약물의 형태 변형이 일어나 본래의 형태보다 생화학적 작용성이 떨어지기 때문이다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 당해 기술 분야에서는 펩티드 또는 단백질 약물들을 저장 또는 체내 투여 동안에도 약효를 떨어뜨리지 않고, 높은 활성으로 체내에 전달하기 위한 방법이 연구되어 왔다. 이러한 방법 중 하나로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 단백질 또는 펩티드 약물에 공유 결합적으로 도입하는 PEG화를 통해 단백질 또는 펩티드의 친수성(親水性)을 높여 단백질 또는 펩티드의 변성 가능성을 줄이는 방법이 개발되었다.
그러나, 이러한 방법은 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 단백질 또는 펩티드 약물에 공유 결합적으로 도입하기 때문에 이에 의해서 약물의 생체 작용성이 변하게 되고, 그리하여 최소한의 생체 작용성의 변화를 주는 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 단백질 또는 펩티드 내 도입부위를 결정하기 위한 많은 연구를 수행해야 되는 어려움이 있다. 따라서, 이러한 PEG화 방법을 대체하기 위하여, 단백질과 공유 결합적인 방법 을 사용하지 않는 방법으로서, PLGA(Poly(lactide-co-glycolide)) 미립구에 의해서 단백질 또는 펩티드 약물을 제제화 하는 방법이 개발되었다.
PLGA는 체내에서 락트산(lactic acid)과 글리콜산(glycolic acid)으로 완전 분해되는 생분해성을 가지면서도 체내 신진대사에서 의해서 CO2 로 체외 배출되는 인체에 전혀 무해한 고분자로 FDA의 승인을 받은 물질이다. 또한, PLGA는 약물과 함께 미립구의 형태로 제제화가 가능하며, 이러한 제제화에 의해서 약물이 외부환경에 의해 변성 또는 응집되어 그의 활성이 변화하는 것을 막는 작용을 할 수 있다. 뿐만 아니라, PLGA는 담체로서 약물의 서방성(徐放性)을 부여할 수 있어, PLGA 미립구는 한 번의 투여로 약물이 오랜 기간동안 효과를 지속할 수 있도록 할 수 있다. 게다가, PLGA는 생분해 기간 및 약물의 방출조절이 가능하다. 즉, PLGA의 조성과 분자량을 달리하여, 미립구의 크기를 필요에 따라 조절할 수 있고, 약물의 전달기간도 몇 주부터 몇 달까지 다양하게 조절할 수 있다. 이러한 PLGA는 아주반트(adjuvant) 효과도 지니고 있어 면역학적으로도 그 응용범위가 넓다.
PLGA를 이용한 제제화 방법으로서,
1) 단백질 또는 펩티드 수용액과 PLGA의 메틸렌 클로라이드 용액(이하, 'PLGA MC' 라고도 한다)의 혼합물을 제공하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 얻어진 혼합물을 초음파 파쇄(ultra sonification) 또는 격렬한 교반에 의하여 유중수(w/o) 에멀젼을 제공하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 얻어진 파쇄 용액을 폴리비닐알콜(PVA) 및 염화나트륨 의 수용액에 서서히 넣고 교반하여 분산시키는 단계;
4) 상기 단계 3)의 분산액으로부터 용매를 증발시키고, 원심 분리하여 침전물을 회수하는 단계; 및
5) 상기 단계 5)의 침전물을 세척하고 동결 건조하여 약물이 함유된 PLGA 미립구를 얻는 단계를 포함하는 PLGA 미립구를 제조하는 방법이 알려져 있다[Y.Y. Yang, H.H. Chia and T.S. Chung, Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method, J. Control. Release, 69, 81-96 (2000)].
그러나, PLGA 자체가 락트산과 글리콜산의 공중합체여서 산성 환경에서 민감한 특성을 가지고 있으며, 이로 인해 PGLA 미립구는 산성 환경 하에서 미립구 내에 함유된 펩티드 또는 단백질 약물을 과도하게 방출하거나 약물의 변성이 촉진되는 문제점이 존재한다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 당업계에 다양한 시도들이 있어 왔는데, 예를 들면 Schwendeman의 연구팀은 불수용성인 수산화마그네슘을 미립구의 제조과정 중에 첨가하여 PLGA의 분해 시 나오는 수소를 중화시켜 미립구안의 산성화를 억제함으로써 봉입된 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있다고 보고하였고[J. Wang, B. M. Wang, and S. P. Schwendeman.Characterization of the initial burst release of a model peptide from poly(D,L-lactide-co-glycolide) microspheres, J. Control. Release, 82, 289-307 (2002); G. Zhu, S. R. Mallery, and S. P. Schwendeman, Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly(lactide-co-glycolide), Nat. Biotechnol., 18, 52-57 (2000) J. Kang and S. P. Schwendeman. Comparison of the effects of Mg(OH)2 and sucrose on the stability of bovine serum albumin encapsulated in injectable poly(D,L-lactide-co-glycolide) implants, Biomaterials, 23, 239-245 (2002)], Bae 그룹에서는 PEG/poly(L-histidine) 이중블록공중합체를 첨가하여 봉입된 단백질의 활성을 유지할 수 있다고 보고하였다 [J. H. Kim, A. Taluja, K. Knutson, Y.H. Bae. Stability of bovine serum albumin complexed with PEG-poly(L-histidine) diblock copolymer in PLGA microspheres. J Control Release, 109, 86-100 (2005)].
그러나, 이러한 연구결과로 생성된 미립구들은 생체적합성이 나쁘고 제조가 힘들다는 단점을 가지고 있어 실용화에는 문제가 있고, 또한 산업에 적용할 수 있을 정도의 서방성 약물전달 효과를 가지지 못하고, 펩티드 또는 단백질 약물의 변성을 효과적으로 줄이지 못한다는 단점이 있다. 따라서, PLGA 미립구 제제화에 있어서 서방성 약물전달 효과와 펩티드 또는 단백질 약물의 변성을 효과적으로 제어할 수 있는 PLGA 미립구 첨가제를 개발하고자 하는 연구가 당업계에서 진행되고 있다.
이러한 미립구 첨가제로서 단백질 약물과 이온결합할 수 있는 카르복실기 함유 다당류(예: 히알루론산)를 단백질 약물과 복합체를 형성시킨 다음 PLGA 미립구 를 형성시키는 방법이 알려져 있다(E.S. Lee, M.J. Kwon, K. Na, J.H. Bae, Protein release behavior from porous microparticle with lysozyme/hyaluronate ionic complex Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 55(1), 15 March 2007, Pages 125-130 ). 이러한 경우 단백질 약물과 이온 결합에 의한 복합체를 형성시키기 위해서는 반응 용액의 pH를 단백질의 등전점 이하로 조정하여야 하나 pH를 4.5 이하로 너무 낮추면 다당류의 카르복실기가 음이온성을 상실하여 단백질과 이온 복합체를 형성할 수 없게 된다. 따라서, 등전점이 낮은 단백질 또는 펩티드 약물에 대해서는 적용할 수 없는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 단백질 또는 펩티드의 PLGA 미립구 제제화에 있어서 서방성 약물전달 효과와 펩티드 또는 단백질 약물의 변성을 효과적으로 제어할 수 있는 PLGA 미립구 첨가제로서, 단백질의 등전점에 상관없이 이용될 수 있는 PLGA 미립구 첨가제에 대해 연구한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 단백질의 등전점의 크기에 무관하게 PLGA 미립구의 제조 시 단백질 또는 펩티드 약물과 이온 결합성 복합체를 형성할 수 있는 PLGA 미립구 첨가제를 이용하여 제조되는 PLGA 미립구를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PLGA 미립구를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PLGA 미립구 포함하는 단백질 또는 펩티드 약물 제제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 펩티드 또는 단백질 약물, 및 PLGA(Poly(lactide-co-glycolide))를 포함하는 PLGA 미립구에 있어서, PLGA 미립구내에 황산기를 갖는 다당류가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구를 제공한다.
상기 PLGA 미립구는
a) 펩티드 또는 단백질 약물 수용액을 펩티드 또는 단백질 약물의 등전점 이 하의 pH를 갖도록 제조하는 단계;
b) 황산기를 갖는 다당류를 포함하는 수용액을 상기 등전점 이하의 pH를 갖도록 제조하는 단계;
c) 상기 단계 a)에서 제조된 수용액과 상기 단계 b)에서 제조된 수용액을 혼합하여 다당류-펩티드 또는 다당류-단백질 복합체를 형성시키는 단계;
d) 상기 단계 c)에서 얻어진 수용액을 PLGA 용액과 혼합한 다음 교반하여 w/o 에멀젼을 제조하는 단계;
e) 상기 w/o 에멀젼을 분산매 중에 분산시켜 PLGA 미립구를 형성시키는 단계; 및
f) 상기 형성된 PLGA 미립구를 분산액으로부터 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명에 따른 PLGA 미립구를 포함하는 펩티드 또는 단백질 약물 제제를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명이 제공하는 PLGA 미립구는 펩티드 또는 단백질 약물, 및 PLGA를 포함하는 미립구에 있어서, PLGA 미립구 내에 황산기를 갖는 다당류가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 한다. 이러한 본 발명에 따른 미립구에서 황산기를 갖는 다당류는 펩티드 또는 단백질 약물과 이온 결합성 복합체를 형성할 수 있다. 그러한 펩티드 또는 단백질 약물과 황산기를 갖는 다당류와의 이온 결합성 복합체는 PLGA 미립구 내에 봉입된 형태로서 존재할 수 있다.
상기 펩티드 또는 단백질 약물이 상기 황산기를 갖는 다당류와 이온 결합성 복합체를 형성하기 위해서는, 상기 펩티드 또는 단백질 약물이 양이온성을 나타내야 하며, 그러기 위해서는 제조 시 상기 펩티드 또는 단백질의 약물의 수용액의 pH를 약물의 등전점 이하로 낮춰서 펩티드 또는 단백질 약물이 양이온성을 나타내도록 하여야 한다. 또한, 상기 펩티드 또는 단백질 약물과 복합체를 형성하는 다당류는 음이온성을 나타내야 한다. 이러한 경우, 펩티드 또는 단백질 약물의 등전점이 4.5 이하로 낮아 pH를 4.5 이하로 할 경우 종래의 카르복실기를 갖는 다당류는 음이온성을 나타낼 수 없어 펩티드 또는 단백질 약물과 이온 결합성 복합체를 형성할 수 없었지만, 본 발명에서와 같이 황산기를 갖는 다당류를 이용할 경우에는 pH 4.5 이하에서도 충분히 음이온성을 나타내어 펩티드 또는 단백질 약물과 이온 결합성 복합체를 형성할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명에서와 같이 황산기를 갖는 다당류를 포함하는 PLGA 미립구는 펩티드 또는 단백질의 등전점에 관계없이 PLGA 미립구를 형성할 수 있는 장점이 있다.
상기 황산기를 갖는 다당류는 생체 적합성 다당류로서 하나 이상의 황산기를 가질 수 있으며, 이러한 조건을 만족시킨다면 임의의 다당류가 이용될 수 있다. 이러한 황산기를 갖는 다당류는 펩티드 또는 단백질 약물과 함께 이온 결합에 의한 복합체를 형성하여, PLGA 미립구가 산성 환경 하에서 PLGA의 분해시 발생되는 수소이온에 대해 PLGA 미립구 내부에서 완충화(buffering effect) 혹은 중성화(neutialization) 효과를 통해 산성 환경에서의 펩티드 또는 단백질 약물의 약물간 응집 또는 변성을 막아 약물의 활성 감소를 막을 수 있다. 또한, 상기 황산기 를 갖는 다당류는 PLGA 미립구의 붕괴 동안 PLGA 내부에 축적되는 산성물질을 중화시킴으로써 생성되는 산성 물질에 의한 PLGA의 산-가수분해 가속화를 막을 수 있다. 뿐만 아니라, 다당류 특유의 증점 효과로 인해 PLGA 미립구 내부에서 더욱 안정적으로 약물의 활성을 유지할 수 있다.
상기 황산기를 갖는 다당류로는 더마탄 설페이트, 헤파란 설페이트, 커들란 설페이트 등이 있으며, 특히 더마탄 설페이트가 바람직하다. 더마탄 설페이트는 콘드로이친 설페이트와 동일한 농도에서 낮은 pH(3.0)에서 콘드로이친 설페이트 보다 약 2배 정도로 단백질/다당류 이온 복합체 형성이 증가될 수 있다. 더마탄 설페이트(이하, CsB 라고도 한다)는 수용성 글리코스아미노글리칸(GAG) 유도체로서 하기 화학식 1의 구조를 갖는다:
Figure 112008032619902-PAT00001
상기 식에서, n은 1 내지 100의 정수이다.
본 발명에서 사용된 용어 '펩티드' 또는 '단백질' 은 L-아미노산 또는 그의 유도체 또는 유사체, 또는 D-아미노산 또는 그의 유도체 또는 유사체들이 서로 간에 펩티드 결합을 통해 연결되어 있는 형태의 화합물 또는 고분자를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어 '펩티드 약물' 또는 '단백질 약물'은 생체 내에 투여 시 화학적 또는 생화학적 반응을 통하여 생체 질환의 일부 또는 전부를 경감 또는 치유할 수 있거나, 질병의 악화를 방지할 수 있는 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 이러한 단백질 약물의 예를 하기 표 1에 그 용도, 등점점, 및 분자량과 함께 나타내었으며, 이는 단지 예시에 불과할 뿐이며 이에 한정되는 것인 아니다. 상기 단백질 또는 펩티드 약물은 현재 약효가 있는 것으로 공지되어 있는 펩티드 또는 단백질 약물뿐만 아니라, 앞으로 개발되는 임의의 펩티드 또는 단백질 약물이 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
Figure 112008032619902-PAT00002
PLGA 미립구를 형성하는 PLGA는 폴리(락티드-코-글리콜라이드)로서 락트산과 글리콜산이 80:20 내지 20:80의 몰비율, 바람직하게는 50:50 의 몰비율로 공중합되어 있는 생분해성 공중합체이다. 현재 산업적으로 이용되고 있는 PLGA는 8,000 내지 75,000 의 분자량을 가지며, 산성 환경 하에서 산-촉매 가수분해가 일어나는 성질을 갖는다. 본 발명에 따른 PLGA 미립구를 제조하기 위해서 사용될 수 있는 PLGA 는 상기 특성을 갖는 것이라면 임의의 PLGA가 이용될 수 있다. 예를 들면, Boehringer社(Germany)에서 제공되는 상품명 Resomer RG 계열의 PLGA, 더욱 바람직하게는 Resomer RG 504를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 PLGA 미립구는 황산기를 갖는 다당류를 펩티드 또는 단백질 약물과 함께 PLGA 입자 담체 내에 봉입시킴으로써, 펩티드 또는 단백질 약물의 순간적 방출을 막을 수 있으면서, PLGA 미립구만을 담체로 사용한 것과 비교하여 오랫동안 서서히 펩티드 또는 단백질 약물을 방출시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 이와 더불어, 본 발명에 따른 PLGA 미립구는 PLGA 미립구 내부의 펩티드 또는 단백질 약물의 변성을 황산기를 갖는 다당류에 의한 약물의 중성화 및 이온결합성 복합체의 형성에 의해서 효과적으로 막아 약물의 장기시간 방출시 단백질 약물을 더욱 오래 안정화 수 있다.
본 발명은 다른 측면에 있어서, 하기 단계를 포함하는 상기 PLGA 미립구를 제조하는 방법을 제공한다:
a) 펩티드 또는 단백질 약물 수용액을 펩티드 또는 단백질 약물의 등전점 이하의 pH를 갖도록 제조하는 단계;
b) 황산기를 갖는 다당류를 포함하는 수용액을 상기 등전점 이하의 pH를 갖도록 제조하는 단계;
c) 상기 단계 a)에서 제조된 수용액과 상기 단계 b)에서 제조된 수용액을 혼합하여 다당류-펩티드 또는 다당류-단백질 복합체를 형성시키는 단계;
d) 상기 단계 c)에서 얻어진 수용액을 PLGA 용액과 혼합한 다음 교반하여 w/o 에멀젼을 제조하는 단계;
e) 상기 w/o 에멀젼을 분산매 중에 분산시켜 PLGA 미립구를 형성시키는 단계; 및
f) 상기 형성된 PLGA 미립구를 분산액으로부터 회수하는 단계.
상기 PLGA 미립구를 제조하는 방법은 종래의 PLGA 미립구 제조방법에 있어서, 함유되는 펩티드 또는 단백질의 등전점 이하의 pH를 갖는 펩티드 또는 단백질의 수용액과, 그 펩티드 또는 단백질의 등전점 이하의 pH를 갖는 황산기를 갖는 다당류의 수용액을 혼합하여, 펩티드 또는 단백질과 황산기를 갖는 다당류의 이온결합성 복합체를 형성한 다음 PLGA 미립구를 제조하는 것을 특징으로 한다. 이하, 상기 제조방법을 단계별로 구체적으로 설명한다.
a) 펩티드 또는 단백질 약물 수용액을 펩티드 또는 단백질의 등전점 이하의 pH를 갖도록 제조하는 단계.
펩티드 또는 단백질 약물의 수용액은 이후에 황산기를 갖는 다당류와 이온결합성 복합체를 형성하기 위해, 펩티드 또는 단백질 약물이 양이온성을 갖도록 하여야 한다. 따라서, 펩티드 또는 단백질 약물의 수용액은 그 펩티드 또는 단백질 약물의 등전점 이하의 값을 갖도록 제조한다. 또한, 펩티드 또는 단백질 약물의 수용액의 pH를 너무 낮추게 되면 펩티드 또는 단백질이 변성될 수 있으므로 변성되지 않는 범위에서 적절히 선택하여야 한다. 당업자는 펩티드 또는 단백질의 약물의 등전점 이하로 하면서 변성되지 않는 범위로 pH 조정하는 것을 적절히 선택할 수 있다.
또한, 펩티드 또는 단백질 약물의 수용액을 제조 시 선택한 pH를 유지하기 위해 완충제를 이용할 수 있으며, 이러한 완충제는 선택한 pH 값에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 인산염 완충제가 이용될 수 있다. 펩티드 또는 단백질 약물의 수용액 중 약물의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니며, PLGA 미립구 제형으로부터 방출되었을 때 생체 내에서 효과를 발휘할 수 있는 농도 이상인 것이 바람직하고, 수용액 제조 시 또는 PLGA 미립구의 제조 동안 펩티드 또는 단백질 간의 과도한 응집 혹은 불활성화가 발생하는 농도 이하인 것이 바람직하다. 이러한 펩티드 또는 단백질 약물의 농도는 그 구체적인 종류에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 0.01 mg/ml 이상 1000 mg/ml 일 수 있다. 펩티드 또는 단백질 약물의 수용액을 제조 시 응집체를 형성할 가능성이 있기 때문에 교반 없이 서서히 용해시키는 것이 바람직하다.
b) 황산기를 갖는 다당류를 포함하는 수용액을 상기 등전점 이하의 pH를 갖도록 제조하는 단계.
상기 펩티드 또는 단백질 약물과 별도로 황산기를 갖는 다당류를 포함하는 수용액을 상기 등전점 이하의 pH를 갖도록 제조한다. 또한, 황산기를 갖는 다당류의 수용액을 제조 시 선택한 pH를 유지하기 위해 완충제를 이용할 수 있으며, 이러한 완충제는 선택한 pH 값에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 인산염 완충제가 이용될 수 있다.
상기 황산기를 갖는 다당류로는 더마탄 설페이트가 바람직하다. 상기 수용액 중 황산기를 갖는 다당류의 농도는 특별하게 한정되는 것은 아니지만, PLGA 미립구 제제에서 산성 환경에서 PLGA 미립구에서 생성될 수 있는 수소에 대한 펩티드 또는 단백질 약물에 완충화 (buffering effect) 혹은 중성화(neutralization)를 통한 안정화를 제공할 수 있는 농도로 적절하게 선택할 수 있으며, 예를 들면, 0.01 mg/ml 이상 1000 mg/ml 일 수 있다. 황산기를 갖는 다당류의 농도가 높을수록, PLGA 미립구 제제에서 펩티드 또는 단백질 약물에 완충화(buffering effect) 혹은 중성화(neutralization)를 통해 펩티드 또는 단백질 약물의 응집 형성을 제어하면서도 약물의 서방성 효과를 높일 수 있다.
c) 상기 단계 a)에서 제조된 수용액과 상기 단계 b)에서 제조된 수용액을 혼합하여 다당류-펩티드 또는 다당류-단백질 복합체를 형성시키는 단계.
상기 단계 a) 및 b) 각각에서 제조된 수용액을 혼합하여 다당류-펩티드 또는 다당류-단백질 복합체를 형성시키는 단계를 수행한다. 펩티드 또는 단백질 약물 및 더마탄 설페이트는 이러한 혼합 과정에서 응집체 (inclusion body)를 형성할 가능성이 있기 때문에 교반하지 않고 방치하는것이 바람직하다. 또한, 두 수용액이 균일하게 혼합되도록 하기 위하여 혼합 후 일정 시간, 예를 들면 약 10~20분, 바람직하게는 15분가량 방치해 두는 것이 바람직하다.
한편, 상기 단계 a)에서 얻어진 수용액 중의 단백질 또는 펩티드 약물의 농도와 상기 단계 b)에서 얻어진 수용액 중의 황산기를 가진 다당류의 농도의 비는 특별히 한정되지는 않지만, 최종적으로 생성되는 PLGA 미립구 내부에서 약물의 불용성 응집체가 최소한으로 생성되도록 하기 위해서는 상기 단계 b)에서 얻어진 수용액 중의 황산기를 가진 다당류의 농도가 높으면 높을수록 바람직하다.
이론에 의해서 본 발명이 특별히 한정되는 것은 아니지만, 수용액 중의 황산기를 가진 다당류의 농도가 높을수록 바람직한 이유는, 펩티드 또는 단백질 약물의 농도가 상대적으로 더 높게 되면, 황산기를 가진 다당류의 음전하와 펩티드 또는 단백질 약물의 아민기의 양전하 간에 이온 복합체를 형성함과 동시에 황산기를 가진 다당류 중의 고분자 사슬기의 존재로 비공유 결합에 의해서 약물과 다당류 간의 결합인력이 형성되어 생체 내에서 활성을 나타내지 못하는 불용성 응집체를 형성할 수 있기 때문이다.
d) 상기 단계 c)에서 얻어진 수용액을 PLGA 용액과 혼합한 다음 교반하여 w/o 에멀젼을 제조하는 단계.
상기 c) 단계에서 펩티드 또는 단백질 약물의 복합체가 형성된 수용액을 PLGA 용액과 혼합한 다음 교반하여 w/o 에멀젼을 제조하는 과정을 수행한다. 상기 PLGA의 양은 PLGA 미립구의 제조 시 펩티드 또는 단백질 약물을 충분히 담지할 수 있는 정도의 양으로 사용하면 된다. 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면 펩티드 또는 단백질 약물의 중량 대비 0.1 내지 1000 배의 중량으로 사용될 수 있다.
상기 PLGA의 용액을 제조하기 위한 용매로는, 당업계에서 PLGA 미립구를 제조하기 위해 통상적으로 사용하는 것으로 알려진 용매를 사용할 수 있으며, 그중에서도 메틸렌 클로라이드를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 w/o 에멀젼을 제조하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니나, 격렬하게 일정시간 교반하는 방법에 의해서 제조할 수 있다. PLGA 내의 글리콜라이드 자체는 친수성기와 소수성기의 공존으로 인해 양친매성을 가지며, 이로 인해 물 또는 수용액과 함께 격렬히 교반할 경우 안정한 형태의 w/o 에멀젼이 형성될 수 있다. 이러한 에멀젼의 생성을 위해서 교반하는 시간은 용액의 양 등에 따라 다양할 수 있지만, 예를 들면 1초 내지 10분일 수 있으며, 바람직하게는 10초 내지 1분 동안 교반을 수행하여 PLGA 미립구 내부에 펩티드 또는 단백질 약물 및 황산기를 갖는 다당류의 혼합물의 수용액이 캡슐화되어 있는 형태의 w/o 에멀젼을 형성시킬 수 있다.
e) 상기 w/o 에멀젼을 분산매 중에 분산시켜 PLGA 미립구를 형성시키는 단계.
상기 단계 d)에 w/o 에멀젼이 형성되면, PLGA 미립구를 형성시키기 위해 분산매 중에 상기 에멀젼을 분산시킨다. 상기 제조된 w/o 에멀젼의 안정성을 향상시키기 위하여, 물에는 녹지만 유기용매에는 녹지 않는 고분자 분산매에 분산시킬 수 있다. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 고분자 분산매로는 폴리비닐알콜(PVA), 트윈80(tween80), 폴록사머188, 또는 폴록사머407 이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 폴리비닐알콜(PVA)이 이용될 수 있다. 상기 고분자 분산매에는 염화나트륨이 추가적으로 포함될 수 있다. 상기 염화나트륨은 제조과정에서 미립구로부터 단백질 약물의 방출을 막고 생리적인 조건을 유지하기 위한 것이다. 바람직하게는, 상기 분산매로서 폴리비닐알콜 및 염화나트륨의 혼합 수용액이 이용될 수 있으며, 폴리비닐알콜은 (1 ~ 7 중량%), 염화나트륨은 (0 ~ 3.6 중량%)로 사용될 수 있다. 이 단계를 통해서, 제조된 분산액 중에서는 미세입자가 형성되며, 이러한 미세입자 제조 후에 10분~60분간 교반을 수행함으로써 미세입자를 함유한 분산액에 대한 경화(hardening) 과정이 이루어져 PLGA 미립구가 생성될 수 있다.
f) 상기 형성된 PLGA 미립구를 분산액으로부터 회수하는 단계.
상기 단계 e)에서 제조된 분산액에서 형성된 PLGA 미립구를 회수하는 과정을 수행한다. PLGA 미립구는 원심분리를 통해 간단히 회수될 수 있다. 원심분리의 조건은 통상적인 반복실험을 통해서 알아낼 수 있지만, 예를 들어 약 2,500 rpm에서 약 1 내지 10 분간 수행하여, 회수할 수 있다.
또한, PLGA 미립구로부터 불순물을 최소화하기 위하여 회수된 PLGA 미립구에 대해서 염화나트륨 용액 중에 재분산시킨 다음 원심분리를 수행하여 회수함으로써, 미립구에 존재할 수 있는 불순물을 세척하는 과정을 추가로 수행할 수 있다. 이러한 세척 과정은 복수 회 수행할 수도 있다.
최종적으로 회수된 PLGA 미립구는 동결건조를 추가로 수행하여 입자 형태로 보관 또는 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 또한 상기 본 발명에 따른 PLGA 미립구를 포함하는 펩티드 또는 단백질 약물의 제제를 제공한다. 이러한 제제는 종래 PLGA 미립구가 이용될 수 있는 것으로 알려져 있는 임의의 제제일 수 있으며, 바람직하게는 주사제, 특히 피하주사제일 수 있다. 이러한 주사제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여 시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수도 있으며, 투여 시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 PLGA 미립구는 황산기를 갖는 다당류를 이용함으로써 펩티드 또는 단백질의 등전점의 크기에 상관없이 펩티드 또는 단백질 약물을 상기 다당류와 이온 결합성 복합체를 형성할 수 있으며, 그러한 복합체를 PLGA 미립구 내에 봉입시킴으로써 약물의 응집 또는 변성 없이 약물의 서방성 전달이 가능하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 더마탄 설페이트 함유 PLGA 미립구의 제조
0.1 ml의 인산완충용액(pH 3.0)에 단백질 약물로서 2 mg의 소혈청알부민 BSA (Sigma)을 서서히 녹여 제 1 용액을 준비하였다. 0.1ml의 인산완충용액 (pH 3.0)에 1mg 의 더마탄 설페이트를 녹여 제 2 용액을 준비하였다. 그 다음, 상기 제 1 용액과 상기 제 2 용액을 혼합하고 15 분가량 방치하여 제 3 용액을 준비하였다. 이어서, PLGA로서 150 mg의 RG 504H를 1 ml 의 메틸렌 클로라이드 (MC)에 녹여 제 4 용액을 제조하였다. 상기 제 4 용액에 제 3 용액을 넣고 1 분간 격렬하게 교반혼합(vortex)하여 w/o 에멀젼을 준비하였다. 상기 w/o 에멀젼을 분산용매로서 PVA(0.5wt%)/ NaCl(0.9wt%) 수용액 50 ml에 15초 이내에 주사기로 주입한 다음, 호모믹서내에서 2,300 rpm 및 10분간 교반하여 미세입자를 용액을 제조하였다. 미세입자 제조 후 1 시간동안 서서히 교반하여 경화(hardening) 과정을 수행한 다음, 2,500 rpm에서 5 분간 원심분리하여 미세입자를 회수하였다. 원심분리 후, 침전물에 0.9 wt% NaCl 용액을 넣어 재분산한 후 다시 원심분리하여 침전물을 얻고, 이 과정을 3 회 반복하여 세척과정을 수행하였다. 이어서, 생성물을 3 일간 동결건조하여 단백질 약물로서 소혈청알부민(BSA)이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다.
그리하여 제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 1a와 같다.
비교예 1: 더마탄 설페이트 미함유 PLGA 미립구의 제조
더마탄 설페이트를 함유하지 않은 제 2 용액을 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 과정을 수행하여 단백질 약물로서 소혈청알부민(BSA)이 함유된 PLGA 미립구를 수득하였다.
제조된 PLGA 미립구의 전자현미경(SEM) 사진은 도 1b와 같다.
실험예 1: pH에 따른 단백질/더마탄 설페이트 복합체 형성
소혈청알부민/더마탄 설페이트 이온 복합체를 인산완충용액(pH4.0)에 1:1 비율(1ml/ml)로 형성시키고 UV-VIS 분광광도계(UV-2450, Shimadzu)를 이용하여 500 nm에서 투과율을 측정하였고, 0.01 N NaOH 수용액을 이용하여 pH를 체내와 같은 7.4까지 높여 주어 복합체의 형성 양상을 투과율을 통해서 알아보았다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 따르면, pH 3.0 에서는 투과율이 낮아 소혈청알부민/더마탄 설페이트 이온 복합체가 형성되었음을 확인할 수 있으나, pH 7.0에서는 투과율이 높아 이온 복합체가 거의 형성되지 않는다는 것을 확인할 수 있다. 이러한 사실로부터 소혈청 알부민이 더마탄설페이트와 이온 복합체를 형성하기 위해서는 용액의 pH를 등전점 이하로 해야 한다는 것을 알 수 있다.
실험예 2: PLGA 입자의 약물 봉입도 분석
실시예 1 내지 비교예 1 에서 제조된 PLGA 미립구에 대해서 소혈청알부민(BSA)의 입자 내에 봉입(encapsulation)되는 정도(이하, '봉입도'라 함)를 BCA 단백질 정량 분석을 이용하여 측정하였다.
측정방법에 대해서 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 PLGA 미립구 10 mg과 표준시료로서 소혈청알부민을 1mg/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml, 0.125mg/ml, 0.0625mg/ml 및 0.03125mg/ml의 농도로 인산완충용액에 녹이고 96 웰 플레이트에 20 ㎕씩 분주한 후 BCA 단백질 정량 방법을 이용하여 분석하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 획득한 미립구 10 mg을 아세토니트릴 1ml에 녹이고, 원심분리(14,000rpm, 10min)에 의해 상층액은 버리고 침전물을 인산완충식염수(10mM, pH 8.0) 1ml에 녹여서 96 웰 플레이트에 20 ㎕씩 분주하였다. 시료가 분주된 96 웰 플레이트에 BCA 용액 100 ㎕ 씩 처리하고 빛을 차단해준 다음 60℃에서 10 분간 반응시킨 후 마이크플레이트 흡광도 판독기로 λ=562 nm에서 분석을 수행 하였다. 그 결과는 하기의 표 2에 정리하였다.
Figure 112008032619902-PAT00003
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 PLGA 미립구는 더마탄 설페이트를 추가로 포함함으로써 약물의 봉입이 보다 효율적으로 이루어지는 것을 알 수 있다.
실험예 3: 단백질/더마탄 설페이트 복합체의 PLGA 미립구 제조 과정에서의 안정성 분석
소혈청알부민을 pH 3의 인산완충용액에 녹였다(1mg/ml). 더마탄 설페이트를 pH 3의 인산완충용액에 녹였다(2mg/ml). 상기 제조된 소혈청알부민 용액 1ml를 대조군으로 하고, 소혈청알부민 용액 및 더마탄 설페이트 용액 각각 500ul를 취해서 복합체를 형성시켰다. 이 두 용액을 각각 1:1 비율로 MC를 넣어주고 3000 rpm으로 10 분간 호모믹서를 이용하여 교반한 후 메틸렌클로라이드(MC)를 증발시켰다. 그리고, pH 8의 인산완충용액을 첨가하고 BCA 단백질 정량 분석법을 이용하여 가용성 단백질 약물을 정량하였다. 그 결과를 도 3에 그래프로 나타내었다. 도 3의 결과에 따르면, 소혈청알부민은 더마탄 설페이트와 복합체를 형성하는 경우가 소혈청알부민 단독에 비해 PLGA 미립구 형성 과정에서 더 안정한 것으로 나타났다.
실험예 4: PLGA 미립구로부터 단백질 약물의 방출 속도 분석
상기 실시예 1에서 제조된 소혈청 알부민이 봉입된 PLGA 미립구를 인산완충용액(10 mM, pH 7.4) 2 ml에 분산시킨 후 항온수조(37℃,50rpm)에서 교반하였다. 시간의 경과에 따라 1 ml를 취하여 BCA 단백질 정량 방법을 이용하여 방출된 단백질을 측정하였다. 비교예 1의 PLGA 미립구를 대조군으로 하여 동일하게 실험하고 비교하였다. 그 결과를 도 4에 그래프로서 나타내었다.
도 4에 따르면, 본 발명에 따른 PLGA 미립구가 비교예 1의 PLGA 미립구에 비해 초기 약물방출이 보다 서서히 이루어지는 것으로 나타났다.
실험예 5: 불용성 약물 응집체 분석
실시예 1 및 비교예 1 에서 제조된 PLGA 미립구 10 mg을 1 ml의 아세토니트릴에 녹인 후 20 분간 항온수조(37℃, 50rpm)에서 교반하였다. 이어서, 14,000 rpm에서 10 분간 원심분리 후, 상층액을 제거하고, 소혈청알부민을 포함하는 침전물을 1 ml의 10 mM 인산완충액(pH 8.0)에 녹이고, 이 때 녹지 않는 응집체를 원심분리한 후, 이를 6 M 우레아(urea)를 포함하는 1 ml의 10 mM 인산완충액(pH 8.0)에 녹였다. 그런 다음, 생성된 용액을 2 시간 실온에서 배양한 후 BCA 단백질 정량 방법을 이용하여 마이크플레이트 흡광도 판독기로 λ=562 nm에서 분석하였다. 표준시료로서 소혈청알부민 1mg/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml, 0.125mg/ml, 0.0625mg/ml및 0.03125mg/ml을 이용하였다. 그 결과를 하기 도 5 에 나타내었다. 이러한 결과로부터, 본원발명에 따른 PLGA 미립구는 미립구 제조 과정에서 단백질의 응집이 비교예 1의 경우에 비해 현저히 적게 일어난다는 것을 알 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 더마탄 설페이트 함유 소혈청알부민의 PLGA 미립구의 전자현미경 사진이다.
도 1b는 다당류를 추가로 포함하지 않는 종래의 소혈청알부민의 PLGA 미립구의 전자현미경 사진이다.
도 2 은 pH의 크기에 따른 단백질 및 더마탄 설페이트 간의 이온결합성 복합체의 형성 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 소혈청알부민이 더마탄 설페이트과 이온 결합성 복합체를 형성한 것과 소혈청알부민 단독이 각각 유기상/수상 계면층에서의 소혈청알부민에서 어느 정도의 안정성을 갖는지를 비교 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 더마탄 설페이트 함유 소혈청알부민의 PLGA 미립구로부터의 소혈청 알부민의 in vitro 방출 양상을 측정한 결과를 종래의 PLGA 미립구와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 더마탄 설페이트 함유 소혈청알부민의 PLGA 미립구에서의 단백질 응집체의 양을 측정한 결과를 종래의 PLGA 미립구와 비교하여 나타낸 그래프이다.

Claims (12)

  1. 펩티드 또는 단백질 약물, 및 PLGA(Poly(lactide-co-glycolide))를 포함하는 PLGA 미립구에 있어서, PLGA 미립구내에 황산기를 갖는 다당류가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 황산기를 갖는 다당류는 펩티드 또는 단백질약물과 이온 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 황산기를 갖는 다당류는 더마탄 설페이트, 헤파란 설페이트, 커들란 설페이트, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구.
  4. a) 펩티드 또는 단백질 약물 수용액을 펩티드 또는 단백질 약물의 등전점 이하의 pH를 갖도록 제조하는 단계;
    b) 황산기를 갖는 다당류를 포함하는 수용액을 상기 등전점 이하의 pH를 갖도록 제조하는 단계;
    c) 상기 단계 a)에서 제조된 수용액과 상기 단계 b)에서 제조된 수용액을 혼합하여 다당류-펩티드 또는 다당류-단백질 복합체를 형성시키는 단계;
    d) 상기 단계 c)에서 얻어진 수용액을 PLGA 용액과 혼합한 다음 교반하여 w/o 에멀젼을 제조하는 단계;
    e) 상기 w/o 에멀젼을 분산매 중에 분산시켜 PLGA 미립구를 형성시키는 단계; 및
    f) 상기 형성된 PLGA 미립구를 분산액으로부터 회수하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 PLGA 미립구의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 단계 f)에서 회수된 미립구를 염화나트륨 수용액 중에 재분산 시킨 후 다시 회수하는 단계를 1 회 이상 더 반복하는 PLGA 미립구의 세척 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 회수된 PLGA 미립구를 동결 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 단계 a)의 수용액 및 상기 단계 b)의 수용액이 상기 펩티드 또는 단백질의 등전점 보다 낮은 pH를 갖는 수용액인 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구의 제조방법.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 단계 a)의 수용액 또는 상기 단계 b)의 수용액이 인산염 완충액을 함유하는 것임을 특징으로 하는 PLGA 미립구의 제조방법.
  9. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 단계 d)의 PLGA 용액은 메틸렌클로라이드를용매로 하는 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구의 제조방법.
  10. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 단계 e)에서 분산매가 폴리비닐알콜(PVA), 트윈80(tween80), 폴록사머188, 폴록사머407, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 PLGA 미립구의 제조방법.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 PLGA 미립구를 포함하는 펩티드 또는 단백질 약물 제제.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 제제는 주사제인 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 단백질 약물 제제.
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