CN1965810A - Tα1缓释微球制剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胸腺肽alpha－1(Tα1)缓释微球制剂，其组成包括基质、胸腺肽alpha－1(Tα1)、保护剂和，其特征在于所述基质PLGA，分子量为3000～40000，为聚乳酸∶羟基乙酸＝25∶75－75∶25的聚乳酸－羟基乙酸共聚物；所述保护剂包括碳酸锌、海藻糖和甘露醇；胸腺肽alpha－1(Tα1)与聚乳酸—羟基乙酸共聚物的重量比例为0.5∶100至5∶100，微球粒径在室温时＜100μm。其制备采用下列方法：方法1：w/o/w溶剂挥发法，或方法2：s/o/o溶剂挥发法，制成缓释微球制剂，缓释效果达4周以上，释放符合近似零级模式，可用于各种肝炎和免疫力低下病人的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是胸腺肽alpha-1(Thymosin alpha-1，Tα1)的缓释微球制剂及其用途。
背景技术
胸腺肽alpha-1(Thymosin alpha-1，Tα1)是一个N端乙酰化的酸性多肽，由28个氨基酸残基组成，其相对分子质3108.3，等电点为4.2，其氨基酸序列是：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-G1u-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。
(Sjogren M.H.Thymalfasin：an immune system enhancer for the treatmentof liver disease[J].Journal of gastroenterology and hepatology，2004，19，S69-72)。胸腺肽αl促使致有丝分裂原激活后的外周血淋巴细胞的T细胞成熟作用，增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原激活后产生各种淋巴因子例如α、γ干扰素、白介素2(IL-2)和白介素3(IL-3)的分泌和增加T细胞上的淋巴因子受体的水平。(Sztein MB，Serrate SA.Characterization of theimmunoregulatory properties of thymosin alphal on interleukin-2production and interleukin-2 receptor expression in normal humanlymphocytes.[J].In tJ Im munopharmacol.1989，11(7)：789-800)它同时通过对T4辅助细胞的激活作用来增强异体和自体的人类混合的淋巴细胞反应。
为使Tα1在体内血药浓度平稳，减少病人的用药次数，提高Tα1的用药质量，本发明使用生物可降解聚合物作为基质制备成长效剂型以控制药物释放。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种Tα1缓释微球制剂及其制备方法，制成的Tα1缓释微球制剂缓释效果达4周以上，可用于各种肝炎和免疫力低下病人的治疗。
近年来生物可降解的高分子材料广泛应用于蛋白多肽类药物缓释微球的制备，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide)，PLGA]，由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美国FDA批准为药用高分子材料使用。以PLGA作为微球基质，体内外降解实验证明，在药物释放过程中，整个聚合物骨架呈均匀性降解，随着分子量的下降，骨架材料的亲水性增强，由于水分的不断渗入使蛋白多肽类药物持续释放出来(Wang YM，Sato H，Horikoshi.Invitro and in vivo evalution of taxol release from ploy(lactic-co-glycotic acid)microspheres containing isopropyl myristate anddegradation of the microspheres.J Control Rel，1997，49：157)。本发明就是使用PLGA作为基质制备Tα1缓释微球制剂的。制备供皮下注射的Tα1缓释微球制剂，可持续释药达4周以上。
本发明的胸腺肽alpha-1(Tα1)缓释注射微球制剂，其组成包括基质、胸腺肽alpha-1(Tα1)、保护剂和，其特征在于所述基质PLGA，分子量为3000～40000，为聚乳酸∶羟基乙酸＝25∶75-75∶25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述保护剂包括碳酸锌、海藻糖和甘露醇；胸腺肽alpha-1(Tα1)与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比例为0.5∶100至5∶100，微球粒径在室温时＜100μm。
本发明缓释微球制剂制备方法有二种：
1.w/o/w溶剂挥发法：
(1)制备油相
将基质材料PLGA溶于有机溶剂二氯甲烷制成油相，浓度为100mg～500mg/ml；
(2)制备内水相
取适量Tα1溶于磷酸盐缓冲液(离子浓度为5～80Mm)中形成内水相，Tα1浓度为1mg～10mg/ml。制备微球时将内水相加入上述油相超声乳化形成初乳，将初乳迅速滴加在1～6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中(还含有0～25％NaCl，或0～25％葡萄糖)，机械搅拌充分匀化(搅拌速度为800～2000rpm)，室温下继续低速搅拌4～6小时(搅拌速度为200～600rpm)，洗涤，收集，冷冻干燥即可。
2.s/o/o溶剂挥发法：
(1)制备油相
将基质材料PLGA溶于有机溶剂乙腈制成油相，浓度为50mg～300mg/ml；
(2)制备Tα1微粉
将适量的聚乙二醇(PEG)和Tα1及保护剂(其比例为10∶1∶2)分散于水溶液中，冷冻干燥后用乙腈洗涤、离心，除去PEG，得到Tα1微粉，保护剂选自碳酸锌、海藻糖和甘露醇等，Tα1浓度为1mg～10mg/ml。
(3)制备微球
将Tα1微粉加入油相，超声分散，然后逐滴加在大豆油中，机械搅拌充分匀化(搅拌速度为500～800rpm)，室温下搅拌1～1.5小时，再加入适量的石油醚继续搅拌2～3小时(搅拌速度为200～500rpm)，可得Tα1微球，洗涤，收集，冷冻干燥即可。
本发明所用的基质材料PLGA，分子量为3000～40000，聚乳酸(PLA)∶羟基乙酸(PGA)为25∶75～75∶25，浓度为50mg～300mg/ml。超声乳化10次，超声条件为：输出功率：450w；工作时间：40ms/次。
本发明缓释微球经体外释放实验，缓释达4周以上，释放符合近似零级模式，可用于各种肝炎和免疫力低下病人的治疗。
附图说明
图1为实施例1制备的Tα1微球体外累积释放～时间曲线图，
图2为实施例2制备的Tα1微球体外累积释放～时间曲线图，
图3为实施例3制备的Tα1微球体外累积释放～时间曲线图，
图4为本发明Tα1的缓释微球制剂给药后30天内CD4+/CD8+值～时间曲线图。
图中含▲的曲线代表免疫功能低下的大鼠注射w/o/w(葡萄糖)法制备的Tα1缓释微球后30天内CD4+/CD8+变化值、含●的曲线代表注射剂组、含■的曲线代表空白微球组。
具体实施方式
实施例1：w/o/w(NaCl)溶剂挥发法制备Tα1缓释微球制剂
将PLGA(RG502H，PLA∶PGA＝50∶50，Mw＝14000)100mg溶于1.0ml二氯甲烷制成油相，Tα11mg溶于0.1ml的磷酸盐缓冲液中形成内水相，将其加入上述油相，超声乳化10次，超声条件为：输出功率：450w；工作时间：40ms/次。形成w/o的初乳，将含3％PVA溶液30ml(含NaCl 5％)置于搅拌容器中，将初乳在高速搅拌(1200rpm)下快速加入外水相中充分匀化，二分钟后，将转速下调至400rpm同时外水相加入100ml蒸馏水，室温下搅拌4小时，微球硬化后离心分离并洗涤，冷冻干燥。密封分装后辐照消毒即可。Tα1微球的包封率为87.8％，粒径＜100μm。
实施例2：w/o/w(葡萄糖)溶剂挥发法制备Tα1缓释微球制剂
将PLGA(RG502H，PLA∶PGA＝50∶50，Mw＝14000)100mg溶于1.0ml二氯甲烷制成油相，Tα11mg溶于0.1ml的磷酸盐缓冲液中形成内水相，将其加入上述油相，超声乳化10次，超声条件为：450w；工作时间：40ms/次。形成w/o的初乳，将含3％PVA溶液30ml(含Glucose 10％)置于搅拌容器中，将初乳在高速搅拌(1200rpm)下快速加入外水相中充分匀化，2分钟后，将转速下调至400rpm同时外水相加入100ml蒸馏水，室温下搅拌4小时，微球硬化后离心分离并洗涤，冷冻干燥。密封分装后辐照消毒即可。Tα1微球的包封率为90.2％，粒径＜100μm。
实施例3：s/o/o溶剂挥发法制备Tα1缓释微球制剂
将PEG(PEG6000)19.3mg和Tα11mg及保护剂(碳酸锌0.22mg)分散于1ml重蒸溜水中，旋涡混合3分钟左右，冷冻干燥后，用二氯甲烷洗涤，离心，除去PEG，得到Tα1微粉。将PLGA(RG502H，PLA∶PGA＝50∶50，Mw＝14000)120mg溶于乙腈1.0ml制成油相，将微粉加入上述油相，超声分散，将其逐滴加入大豆油中充分匀化，搅拌(500rpm)1小时，再加入适量的石油醚继续搅拌(200rpm)2小时，可得Tα1微球，离心，用石油醚洗涤，收集，冷冻干燥，密封分装后辐照消毒即可。Tα1微球的包封率为91％，粒径＜100μm。
实施例4.微球的体外释放试验：
精密称取Tα1微球10mg各8支分别置于10ml玻璃离心管中，加入适量10mMpH 7.4磷酸缓冲液(含0.02％叠氮钠作为抑菌剂，0.01％Tween-80作为润湿剂)为释放介质，置于恒温水浴摇床中，在100rpm振荡速度、37℃±0.5℃温度条件下进行微球的体外释放度测定。分别在2h、1d、6d、11d、16d、21d、27d取出离心管，于12000rpm离心10min，吸出上清液后将残余微球冷冻干燥24h。以后每隔4-5天同以上操作方法取样一次，并用HPLC法测定Tα1的含量。
以取样天数为横坐标，以相应的Tα1累积释放百分比为纵坐标制作药物释放曲线，上述三个实施例制备的微球制剂释放曲线分别见图1～3。由图可见所制备的Tα1缓释微球制剂可在体外释药4周左右。
实施例5.动物试验：
选取成年SD雄鼠30只，体重200g左右，随机分为3组，每10只为一组。A组为Tα1注射剂组，B组作为对照组(空白微球组)，C组为Tα1注射微球组。每组大鼠分别腹腔给予免疫抑制剂环磷酰胺(CTX)50mg/kg·d-1，给药体积500μl/100g，每组10只。每五天给药一次，使所有大鼠产生免疫抑制反应。从第10个实验日起，A组大鼠皮下给与Tα1注射剂不同的处理(按体表面积换算表中的折算比计算每只大鼠应给予的剂量给药)，每周给药2次：B组皮下注射空白微球；C组皮下注射Tα1微球。Tα1的给与剂量143μg/kg，皮下给药体积为500μl/100g。在给药过后的第1d、2d、7d、12d、22d、27d，眼眶静脉窦取血100μl。加入荧光素标记的CD4、CD8抗体，经流式细胞仪检测得到CD4+/CD8+值。CD4+/CD8+值和时间的曲线图见图4。
由图4可见，Tα1微球具有与静脉注射原料药相同的使免疫抑制大鼠CD4+/CD8+值增高的作用，而且微球组的效果明显优于注射机组。说明Tα1微球在体内有明显的缓释作用，持续刺激大鼠的免疫调节功能，所以本发明可作为Tα1的缓释剂型用于可用于各种肝炎和免疫力低下病人的治疗。
Claims (3)
1.一种胸腺肽alpha-1(Tα1)缓释微球制剂，其组成包括基质、胸腺肽alpha-1(Tα1)、保护剂，其特征在于所述基质PLGA，分子量为3000～40000，为聚乳酸∶羟基乙酸＝25∶75-75∶25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述保护剂包括碳酸锌、海藻糖和甘露醇；胸腺肽alpha-1(Tα1)与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比例为0.5∶100至5∶100，微球粒径在室温时＜100μm。
2.根据权利要求1所述的一种胸腺肽alpha-1(Tα1)缓释微球制剂，其特征在于其制备采用下列方法：
方法1：w/o/w溶剂挥发法，或
方法2：s/o/o溶剂挥发法：
具体步骤如下：
方法1：将基质溶于有机溶剂制成油相，浓度为100mg～500mg/ml；取Tα1溶于磷酸盐缓冲液(离子浓度为5～80Mm)中形成内水相，Tα1浓度为1mg～10mg/ml；外水相采用1～6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中(还含有0～25％NaCl，或0～25％葡萄糖)；内水相加入上述油相超声乳化形成初乳，在机械充分搅拌下(搅拌速度为800～2000rpm)将初乳迅速滴加到外水相中形成复乳，室温下继续低速搅拌4～6小时(搅拌速度为200～600rpm)，洗涤、收集微球，冷冻干燥即得Tα1微球。
方法2：将基质PLGA溶于有机溶剂乙腈制成油相，浓度为50mg～300mg/ml；将聚乙二醇(PEG)和Tα1及保护剂(其比例为10∶1∶2)，分散于水溶液中，Tα1浓度为1mg～10mg/ml，冷冻干燥后用乙腈洗涤、离心，除去PEG，得到Tα1微粉；将Tα1微粉加入油相，超声分散，然后逐滴加在大豆油中，机械搅拌(搅拌速度为500～800rpm)充分匀化，室温下搅拌1～1.5小时，再加入适量的石油醚继续搅拌2～3小时(搅拌速度为200～500rpm)，可得Tα1微球，洗涤，收集，冷冻干燥即得Tα1微球。
3.根据权利要求1或2所述的一种胸腺肽alpha-1(Tα1)缓释微球制剂在各种肝炎，肿瘤病人和免疫力低下病人的治疗中的应用。
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