KR20060015472A - 약물전달 시스템 및 세포 치료법 - Google Patents

약물전달 시스템 및 세포 치료법 Download PDF

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KR20060015472A
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블레드미르 사베츠키
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더 테크놀로지 디벨로프먼트 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 포유류의 혈당 강하를 위해, 치료학적 유효량의 결정형 덱스트란 미세입자와 인슐린을 경구로, 주입으로 또는 흡입으로 투여하는 단계를 포함하는 포유류의 혈당 강하 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 인슐린 또는 그외 치료제의 조절 방출을 위한, 단일 상 또는 구조화된 다상 조성물일 수 있다.
미세입자, 세포 치료법, 전달 시스템

Description

약물전달 시스템 및 세포 치료법{DELIVERY SYSTEM FOR DRUG AND CELL THERAPY}
본 출원은 2003년 3월 4일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/451,245; 2003년 5월 5일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/467,601; 2003년 5월 9일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/469,017; 및 2003년 8월 15일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/495,097의 우선권 주장을 청구하는 것으로서, 상기 개시물들은 그 전체로서 본 발명에 참조문헌으로 통합된다.
본 발명은 체조직내 또는 체조직상에 치료제를 직접적으로 전신 전달 또는 국소 전달하기 위한 생물물질의 개발 및 조직 조작을 위한 생물물질의 개발에 관한 것이다. 특히 본 발명은 세포, 생물학적 활성의 물질 또는 이들의 조합형을 함유하는 생체친화적인 임플란트의 제조, 및 단백질, 펩타이드 및 핵산 전달을 위한 미세입자 매트릭스 물질에 관한 것이다.
용어, "생물물질"은 생물 기원으로부터 유래된 물질을 나타내거나 또는 인체의 치료에 사용되는 물질을 나타내는 것으로 이중적으로 사용된다. 본 발명은 후자에 관한 것이다. 용어 "생체친화적"은 본원에서 살아있는 세포를 포함한, 이질적인 신체 반응 또는 섬유증을 발생시키지 않는 물질 그 자체나 또는 치료제와 조 합 형태의 물질을 의미한다.
덱스트란은 미생물 또는 생화학적 방법에 의해 합성되는 고분자량의 폴리사카리드이다. 평균분자량 약 75 kDa의 덱스트란은 혈장과 유사한 콜로이드성 삼투압을 가져 이의 수용액은 임상적으로 혈장 증량제로 사용된다. 비드 형태의 가교 덱스트란은 미세담체 세포배양의 특별한 요구조건을 맞추기 위한 Pharmacia에 의해 개발된 "Cytodex
Figure 112005049604372-PCT00001
" 및 단백질의 GPC에 사용되는 "Sephadex
Figure 112005049604372-PCT00002
" 의 기본물질이다. 예를 들면 미국 특허 6,395,302 및 6,303,148(Hennink et al.)은 가교 덱스트란 입자에의 다양한 생물질의 부착에 관하여 개시한다. 그러나, 가교 덱스트란을 기본으로한 비드는 일반적으로 가교제의 사용에 기인하는 이들의 잠재적 독성 때문에 임플란트 제조용으로는 사용될 수 없다 (Blain J. F., Maghni K., Pelletier S. and Sirois P. Inflamm. Res. 48 (1999): 386-392).
미국 특허 4,713,249(Schroder)은 생물학적 활성 물질용 저장(depot) 매트릭스의 생산방법을 개시한다. 상기 특허에서 주장하는 바에 따르면, 상기 저장 매트릭스는 비공유결합의 사용을 암시하는 결정화에 의해 안정화된 탄수화물 미세입자로 구성된다. Schroder는 상기 주장된 결정화 탄수화물 미세입자를 생산하는 하기의 방법을 기술한다. 중합성 탄수화물 및 생물학적 활성 물질의 용액을 하나 이상의 친수성 용매에서 만든다. 이어서, 상기 탄수화물 및 생물학적 활성 물질의 혼합물을 소수성 액체 매질에서 유화하여 구형의 방울을 형성한다. 상기 유화제를 이어서 아세톤, 에탄올 또는 메탄올을 포함하는 결정화 매질에 넣어, 0.001-50 중량%의 상기 생물학적 활성 물질을 혼입한, 비공유 결합으로 가교된 결정형 중합성 탄수화물 매트릭스를 갖는 구를 형성한다. 따라서, 상기 생물학적 활성 물질은 상기 구형 방울을 결정화하기 전에 용액에 넣는다. Schroder는 상기 다단계 방법으로 만들어진 미세입자의 미세구조는 기술하지 않는다. Schroder의 다단계 방법은 복잡하며, 세포에 잠재적인 독성이 있는 유기 용매를 사용하며 이는 제거되어야 할 필요가 있다.
발명의 개요
포유류의 혈당 강하방법은, 치료학적 유효량의 결정형 덱스트란 미세입자 및 인슐린을 포유류의 혈당을 강하하기 위해 포유류에 경구로, 주입으로 또는 흡입으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 조성물은 인슐린 또는 그외 치료제의 조절 방법을 위한 단일 상 또는 구조화된 다상 조성물일 수 있다.
발명의 상세한 설명
A. 미세입자 형성
본 발명자들은 평균 직경 0.5 내지 3.5 ㎛의 결정형 덱스트란 미세입자가 20-90℃ 범위의 온도에서 1.0 내지 200.0 kDa 범위의 분자량을 갖는 농축된 덱스트란 수용액 (40-65 % W/W)에서 자연발생적으로 형성된다는 것을 실험적으로 발견하였다. 실온에서 미세입자를 형성하는 것이 적절한 경우, 2 내지 18 kDa의 덱스트란 용액을 사용할 수 있다. 물론, 상기 미세입자는 원한다면 실온을 초과하는 온도에서도 2 내지 18 kDa의 덱스트란 용액으로부터 형성될 수 있다. 상기 미세입자는 실온을 초과하는 고온, 예컨대 약 40 내지 약 70℃에서 고분자량의 덱스트란 용액, 예컨대 20 내지 75 kDa 용액으로부터 자연발생적으로 형성될 수 있다. 상기 미세입자는 임의의 적합한 형태 예컨대 규칙적 또는 비규칙적 형태를 가질 수 있지만, 바람직하게는 구형이고, 바람직하게는 직경이 10 ㎛ 이하, 예컨대 0.5 내지 5 ㎛이다.
투과전자현미경으로 결정형 덱스트란 미세입자의 미세다공성 구조를 밝혔다 (도 2A, 2B 참조). 바람직하게, 상기 미세입자의 공극률은 10 부피% 이상, 예컨대 약 10 내지 약 50%, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 약 40%이다. 따라서, 상기 구조는 미세입자 사이에 위치한 거대다공성 구역을 갖는 미세다공성 미세입자를 포함한다.
결정형 덱스트란 미세입자 수성 현탁액의 분무건조는 10.0 내지 150.0 ㎛ 직경 범위의 결정형 덱스트란 미세입자의 구형 응집체를 실질적으로 생산할 수 있다는 가능성을 보여주었다 (도 3 참조).
덱스트란 미세입자를 형성하는 방법의 비제한적 예는 다음과 같다. Amersham Biosciences의 50.0 g의 덱스트란 T40 (40 kDa 분자량)을 500 ㎖의 실험실용 비이커에 있는 50.0 g의 멸균 증류수에 층류(lamina flow)하에서 첨가하여 50% w/w 용액을 수득한다. 상기 혼합물을 60℃(수조)에서 자기 교반기 50 rpm에서 상기 덱스트란이 완전히 용해되어 투명한 용액을 수득할 때까지 교반한다. 이어서, 상기 용액에 진공을 걸어 용액에 포함된 모든 공기를 제거한다. 상기 투명한 용액에 Tyvek
Figure 112005049604372-PCT00003
리드를 덮고 이를 60℃의 실험실 오븐에 넣는다. 3.5시간 후에, 결정형 덱스트란 미세입자가 형성된 결과, 불투명한 점성 현탁액이 만들어진다.
비결정형 덱스트란을 제거하기 위해, 상기 미세입자를 예를 들면 3 X 250 ml의 증류수로 3,000g에서 30 분간 원심분리하여 세척하거나 또는 예를 들면 미세입자 1부 및 물 10부의 희석된 미세입자 현탁액을 여과(멸균 필터에 3 X 250 ml의 증류수를 통과시킴)하여 세척한다. 상기 원심분리/세척은 층류하에서 수행한다. 상기 미세입자를 500 ㎖의 실험실용 비이커에 넣고 Tyvek
Figure 112005049604372-PCT00004
리드를 덮어 60 ℃의 실험실용 오븐에서 8시간 동안 건조하여 수분함량이 약 5 %가 되게한다. 상기 수득한 건조 분말은 약 2 ㎛의 평균직경을 갖는 입자로 구성된다.
B. 결정형 덱스트란 미세입자를 기본으로 하는한 임플란트
결정형 덱스트린 미세입자과 그것의 응집체의 농축 현탁액은, 생체친화성을 테스트하기 위해 마우스 실험에서 임플란트로서 시도되었고, 이후 동물체내 주사하였다.
도 4 및 5는 실험 동물(마우스)에 피하(도 4) 및 근육내(도 5) 주입이후 조직 임플란트를 나타낸 것이다. 180일동안 동물 조직내 염증 반응이 검출되지 않았다.
도 6A, 6B 및 6C는 주입 후 1, 4 및 28일째 마우스의 근육 조직내 임플란트를 나타낸 것이다. 도 7A 및 7B 모두 주입 후 180일째 마우스의 근육 조직내 임플란트를 나타낸 것이다.
도 8A, 8B 및 8C는 피하 주입 후 4, 11 및 28일째 각각의 임플란트를 나타낸 것이다. 도 8D 및 8E는 피하 주입 후 180일째 임플란트를 나타낸 것이다. 도 8F 및 8G는 피하 주입 후 1년 경과시 임플란트를 나타낸 것이다. 도 8G에서, 입플란트 부위에 상처 조직이 아닌 정상 조직이 형성된다.
임플란트로부터의 거대분자의 느린 방출은 실험으로 증명되었으며, 상기 실험에서 거대분자는 주입전에 결정형 덱스트란 미세입자 또는 이들 응집체의 수성 현탁액 중에 용해되었다.
도 9 및 10은 형광 표지된 거대분자(FITC-덱스트란, MW 500 kDa) 및 근육내 주사 후 14일째에 임플란트로부터 마우스 근육조직으로의 상기 거대분자의 느린 방출(도 9)과, 임플란트로부터 플라스미드 DNA 방출로 인한 마우스 근육 조직에서의 리포터 유전자의 발현(도 10)을 보여준다. 따라서, 결정형 덱스트란 미세입자는 예컨대 형광 분자와 같은 표지물 단독 또는 치료제와의 조합형태로 시한적인 방출에 사용될 수 있다.
C. 2상( two phase ) 시스템
결정형 덱스트란 미세입자 및 그 응집체에 기초한 임플란트의 자가 조립(self assemble) 구조물은 2상 시스템을 기본으로 형성될 수 있다.
오일 방울, 리포솜, 미세입자 및 나노입자와 같은 콜로이드 시스템은, 결정형 덱스트란 미세입자의 현탁액에 분산되고, 주입되어 포유류 체내 투여 이후 치료제를 방출하는 임플란트를 형성할 수 있다.
예를 들어, 오일의 경우는, 오일 코어가 물 또는 폴리사카라이드(예를 들면, 덱스트란)와 같은 유기 중합체의 수용액에 분산된 결정형 덱스트란 미세입자 또는 그 응집체로 이루어진 쉘로 둘러싸인 경우 특별한 형태의 임플란트 구조가 형성될 수 있다. 이와 같은 구조는 캡슐로 고안될 수 있다. 이러한 쉘은, 캡슐이 조직으로 둘러싸일 경우 대략 둥근 형태의 쉘을 구성할 수도 있음을 주지해야만 한다. 그러나, 캡슐이 기질, 뼈 또는 장 벽과 같은 경계면 근처에 위치할 경우에는, 캡슐은 하나 이상의 미세입자 벽과 경계면의 사이에 위치하는 코어로 이루어질 수도 있다. 게다가, 오일이 예로써 사용되었지만, 코어는 다른 중합체, 쉘 등과 같은 기타 물질을 포함할 수도 있다.
캡슐 구조를 형성하기 위하여, 2-상 수성 시스템이 사용된다. 여러가지 중합체 수용액이 특정한 농도 이상으로 혼합되면, 이들은 종종 혼합할 수 없는 액상의 2-상 용액을 형성한다. 통상적으로 각 상은 90% 이상의 물로 이루어지며, 완충화되거나 등장액으로 제조될 수도 있다. 만약 세포 또는 입자 현탁액이 이러한 시스템에 첨가되면, 세포와 입자가 상 사이에서 불균등하게 분할되는 것을 종종 발견할 수 있다. 이러한 선호적인 분할 특성은 세포 집단 또는 입자를 구분하는 분리 과정의 토대로 사용될 수 있는데, 왜냐하면 이러한 시스템에서의 분할은 세포나 입자의 표면 특성에 의해서 직접적으로 결정되기 때문이다. 동일한 표면 특성을 가지지 않는 세포나 입자는 충분히 상이한 분할 특성을 보여준다.
2개의 중합체 상의 경쟁적인 흡착은 중합체의 화학적 특성에 의해 결정된다. 2-상 중합체 방법은 세포, 단백질, 핵산 및 미네랄을 분리 또는 분할시키는데 사용되어 왔다("Partitioning in Aqueous Two-Phasse Systems" 1985, eds., H. Walter, D. Brooks, and D. Fisher, publs. Academic Press).
예를 들면, 덱스트란/폴리에틸렌글리콜(PEG) 혼합물에서 유래된 상 시스템에서, 결정형 덱스트란 미세입자의 분할 실험에 의하면, PEG 상이 덱스트란에 분산되어 W/W 에멀션을 형성할 수 있지만, 바꾸어 말하면, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, PEG 상의 부피가 덱스트란 상의 부피보다 클 경우에는, 덱스트란 미세입자는 덱스트란 상내에 존재하는 것을 선호하는 것으로 나타났다.
도 11은, 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 덱스트란 수용액에서의 PEG 수용액의 에멀션 사진이다. 도 11의 구조에서, PEG 상의 부피는 덱스트란 상의 부피보다 적다. 덱스트란 상은 덱스트란과 결정형 덱스트란 미세입자를 함유한다. 그러므로, PEG 상은 덱스트란/덱스트란 미세입자 쉘(예를 들면, 막힌 세공 구조)에 둘러싸인 하나 이상의 구형의 코어를 형성한다.
도 12는, PEG 수용액에서의 결정형 덱스트란 미세입자를 함유하는 덱스트란 수용액의 에멀션 사진이며, 여기에서 PEG 상의 부피는 덱스트란 상의 부피보다 크다. 이 경우, 덱스트란 상은 PEG 상(예를 들면, PEG가 조직액에 살포될 때 생체내에서 형성되는 열린 세공 구조)에 둘러싸인 덱스트란 미세입자를 함유하는 하나 이상의 구형을 형성한다. 도 12에서 알 수 있듯이, 보다 작은 부피(방울)의 덱스트란 상은, 덱스트란/덱스트란 미세입자를 함유하는 보다 작은 구가 결합 및 융합된 보다 큰 구형의 덱스트란/덱스트란 미세입자 코어(도 12의 좌측 하단)를 형성한다.
그러므로, 제2 상(예를 들면, 덱스트란 상 및 덱스트란 미세입자와 같은 덱스트란 상의 함유물)에 대한 제1 상(예를 들면, PEG 상 및 치료제와 같은 PEG 상의 함유물)의 부피비가 1 미만이면, 캡슐은 자가 조립에 이해 제1 상 코어가 제2 상 쉘에 둘러싸인 형태를 형성한다. 만약 조성물이, PEG 상으로 분할되는 인슐린과 같은 치료제와 덱스트란 상으로 분할되는 덱스트란 미세입자를 포함한다면, 치료제는 PEG 코어로 선택적으로 분할되고 미세입자는 선택적으로 분할되어 자가 조립에 의해 PEG 코어 주위를 둘러싼 쉘을 형성한다.
각각 별도로 준비된 덱스트란과 PEG 상을 혼합함으로써 에멀션을 제조할 수 있으며, 덱스트란과 PEG 상은 모두 각각 PEG 상에 존재하는 것을 선호하거나 또는 덱스트란 상에 존재하는 것을 선호하는 다른 형태의 입자 현탁액이 될 수 있다. 이 원리는, 입자(예컨대, 거대분자, DNA, 플라스미드 등) 또는 입자 응집체(예컨대 미세입자, 세포, 리포좀, 단백질 등)의 여러가지 중합체 상으로의 분할은, 중합체 용액에서의 입자의 표면 구조 및 표면간 에너지에 달려있다는 것이다.
결정형 덱스트란 미세입자를 함유하는 수성 2-상 시스템을 실험 동물의 조직에 주입하여, 도 13 및 도 14에서 나타낸 바와 같은 캡슐 구조를 가지는 임플란트의 형성을 밝혀냈다. 2-상 시스템에서, 덱스트란 상의 부피는 PEG 상의 부피보다 크다. 도 113 및 도 14은, PEG 코어 및 덱스트란/덱스트란 미세입자 쉘을 가지는 캡슐이 생체내(예를 들면, 포유 동물의 조직에 주입한 후)에서 자가 조립되는 것을 보여준다. 쉘은, 미세입자 자체의 미세 기공 영역뿐만 아니라, 인접한 미세입자간의 거대기공 영역으로 이루어진다.
2-상 시스템으로부터 캡슐 구조를 형성하는 비제한적인 예시 방법은 하기와 같다. 10 g의 덱스트란 T40(분자량 40 kDa) 및 2 g의 PEG를 1,000 UI를 함유하는 88 ㎖의 (Actrapid®) 인슐린 용액에 용해시키고, 25g의 결정형 덱스트란 미세입자를 첨가한다. 이러한 단계는 층류(laminar flow) 조건에서 수행된다. 혼합물을 실온에서 100rpm의 속도의 자기 교반기로 30분 동안 교반하여 균질한 혼합물(즉, 현탁액)을 생성한다. 1.0 g의 현탁액은 8 UI의 인슐린을 함유한다.
덱스트란 미세입자는, 2-상 시스템으로 제공되는 덱스트란 용액과는 다른 분자량의 덱스트란 용액으로부터 제조될 수도 있음을 주지해야 한다. 그러므로, 결정형 덱스트란 미세입자는, 2-상 시스템으로 제공되는 40 내지 500 kDa의 덱스트란 용액, 예컨대 40 내지 75 kDa 용액인 덱스트란 용액이기 보다, 저분자량의 덱스트란 용액, 예컨대 2 내지 20kDa 용액이 될 수도 있다. 이는 40 내지 70kDa 용액과 같은 고분자량의 덱스트란 용액이, 폭넓은 조절 승인을 받고 있으며, 낮은 농도에서 캡슐의 쉘을 형성하는데 사용될 수 있으므로 유리하다. 저분자량의 용액은, 실질적으로 생체내에 제공되는 저분자량의 덱스트란 용액이 없어도, 결정화 시간을 단축시키는데 사용될 수 있다. 게다가, 저분자량의 미세입자는 생체내에서 더욱 용이하게 용해될 수도 있다.
2-상 시스템으로부터 형성되는 캡슐 구조는, 미세입자를 함유하는 단일 상으로 이루어진 조성물의 경우보다, 코어로부터 치료제를 더욱 균일하게 지속적으로 방출하므로, 유익하다. 게다가, 캡슐 구조를 이용함으로써, 단일 상 시스템을 사용하는 경우와 동일하거나 또는 그 이상의 치료제 방출 시간을 달성하는데에 보다 적은 양의 미세입자가 필요할 수 있는 것으로 여겨진다. 게다가, 2-상 시스템에서는 미세입자의 양을 조절함으로써, 미세입자 쉘의 두께를 조절할 수 있는 것으로 생각된다. 2-상 시스템에서는 미세입자의 사용량이 많으면 쉘이 두꺼워진다. 따라서, 캡슐 코어로부터의 치료제의 방출 양, 지속 시간 및/또는 시한은 쉘의 두께를 조절함으로써 조절될 수 있다. 그러므로, 각 환자나 환자 집단에 따라서 치료제의 방출 특성을 개별화할 수 있다.
PEG 및 덱스트란이 2 상에서의 물질의 예로 사용되지만, 아래의 분할 특성을 나타내는 그외 적합한 물질을 대신 사용할 수 있음을 주지해야 한다. 도 15는 수성 2-상 시스템에서의 여러가지 형태의 입자의 분할 특성을 개략적으로 나타낸다. 예를 들면, 바람직하게는 입자(10, 12 및 14)이고, 2개의 상(16 및 18)의 3가지 형태의 분자 또는 분자 응집체를 도 15에 나타내었다. 그러나 2개 또는 3개 이상의 입자가 존재할 수도 있다. 입자는 유기 및/또는 무기 물질, 리포솜, 살아있는 세포, 바이러스 및 거대분자로 제조된 미세구 또는 나노구와 같은 미세입자일 수 있다. 제1 형 입자(10)는 제1 상(16)으로 선호적으로 분리된다. 제2 형 입자(12)는 제1 상(16)과 제2 상(18)의 경계에 선호적으로 분리된다. 제3 형 입자(14)는 제2 상(18)으로 선호적으로 분리된다. 따라서, 전술한 비제한적인 예와 유사하게, 제1 입자(10)는 치료제를 포함할 수 있고, 제2 입자(12) 및/또는 제3 입자(14)는 결정형 덱스트란 미세입자를 포함할 수 있으며, 제1 상(16)은 PEG를 포함할 수 있고, 제2 상(18)은 덱스트란 상을 포함할 수 있다.
도 15A의 영역(20)에 나타낸 바와 같이, 소량의 제1 상(16)이 다량의 제2 상(18)에 제공되면, 제2 상(18)에 위치한, 제1 형 입자(10)의 농도를 함유하는 제1 상(16)의 구를 포함하는 캡슐 형 구조를 형성한다. 제2 형 입자(12)는 상(16, 18)의 계면에 위치해서 캡슐의 쉘로 작용할 수도 있다. 입자(14)는 제2 상(18)에 분산되거나 및/또는 캡슐의 쉘을 형성할 수 있다.
대조적으로, 도 15A의 영역(22)에 나타낸 바와 같이, 소량의 제2 상(18)이 다량의 제1 상(16)에 제공되면, 제1 상(16)에 위치한, 제2 형 입자(16)의 농도를 함유하는 제2 상(18)의 구를 포함하는 캡슐형을 형성한다. 제2 형 입자(12)는 상(16, 18)의 계면에 위치하고 캡슐의 쉘로 기능할 수도 있다. 입자(10)는 제1 상(16)에 분산되고 및/또는 캡슐의 쉘을 형성할 수 있다. 2-상 시스템(20 및 22)은, 동물 또는 인간과 같은 포유 동물에 주입에 의해, 외과적 이식으로 또는 경구 전달에 의한 임플란트로 사용될 수도 있다. 그러므로, 캡슐은 쉘을 통하여 치료제가 조절적으로 방출되는 용기 또는 저장소로 기능하는 코어를 가진, 구조적이고 삼차원적인 임플란트를 형성한다. 이와는 반대로, 미세입자가 균일하게 분포된 임플란트는 비구조적인 임플란트이다. 2상 시스템의 경구전달을 위해 형성된 구조는, 분산(dispered) PEG 상과 연속(continous) 덱스트란 상으로 이루어진 구조화된 현택액으로 일반적으로 설명될 수 있음을 주지하여야 한다.
게다가, 입자(즉, 분자 응집체)(10, 12 및 14)는 하나의 상으로 선택적으로 분할되는 액상 물질(예를 들면, 오일) 또는 거대분자로 대체될 수도 있다. 예를 들면, 인슐린과 같은 치료제는 PEG/덱스트란 2-상 시스템에서 PEG 상으로 분할될 수 있다. 인슐린이 PEG 상으로 선택적으로 분할되므로, PEG 상은 캡슐 구조의 인슐린을 함유하는 코어를 형성한다. 특정한 입자 및 치료제의 선택적인 분할시, 용어 "선택적으로 분할된다"는 입자 및 치료제가 100%로 하나의 상으로 분할된다는 것을 의미하지는 않음을 주지해야 한다. 그러나, 선택적으로 분할되는 종의 다수, 바람직하게는 80%의 분할 종이, 하나의 상으로 분할된다. 예를 들면, 인슐린의 다수는 PEG 상으로 분할되며, 인슐린의 일부는 덱스트란 상에 잔류할 수도 있다.
도 15B는, 도 15A에서 개략적으로 나타낸 2-상 시스템에 기초한 임플란트 구조 단면의 주사 전자 현미경 이미지이다. 제1 덱스트란 상, 제2 PEG 상 및 결정형 덱스트란 미세입자로 이루어진 2-상 수성 조성물이 세파로스 겔에 주입되었다. 이러한 겔 조성물은, 주입부로부터 결정형 덱스트란 미세입자의 확산을 중지시킴으로써 포유 동물의 조직과 유사하도록 한 것이다. 도 15B의 이미지는 코어-쉘 임플란트 구조 형성을 나타낸다. 코어는 쉘(34)에 둘러싸인 영역(30 및 32)로 이루어진다. 영역(30)은, 횡단면 SEM 이미지화를 위해, 겔을 절단하기 전에 PEG 상 영역으로 채운 보이드(void)이다. PEG 상 영역은 겔을 단면으로 절단하면, 겔 외부로 적하된다. 영역(32)은, 결정형 덱스트란 미세입자에 위치한 PEG 방울을 포함하는 코어의 외부 영역이다. 영역(34)은, PEG를 함유하는 코어를 둘러싸고 유지하는 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 쉘이다.
특별한 이론에 근거하지 않지만, 본 발명자는, 도 15B에 나타낸 코어-쉘 구조는 도 15C에 개략적으로 나타낸 자가 조립에 의해 형성되는 것으로 확신한다. 상이하고, 같이 사용될 수 없는 중합체 수용액과 같은 제1 상(16) 및 제2 상(18)은, 유리 비이커 또는 유리병과 같은 적절한 저장 용기(19)내에 있게되면, 하나의 상(16)이 다른 하나의 상(18) 위에 위치한다. 2-상 조성물이, 상(16 및 18)의 자유로운 흐름을 방해하는, 포유 동물 조직이나 조직을 모방한 겔과 같은 기질 물질 등에 주입될 경우, 이 조성물은 코어-쉘 구조로 자가 조립된다. 먼저 도 15C의 중단부에서 보여진 바와 같이, 작은 부피의 상은 대략적인 구형을 형성한다. 이후 도 15C의 하단에서 보여진 바와 같이, 이 구 형태가 결합하여 하나의 상이 다른 상의 쉘로 둘러싸인 대략적인 구형의 코어를 형성한다. 복수의 상 시스템에 있어서의 2-상 시스템을 예로 들었지만, 복수의 상 시스템은 필요에 따라서 2개의 상 이상을 가질 수도 있다.
D. 세포 치료법
포유류 세포로 수행된 실험들로, 결정형 덱스트란 미세입자 응집체(참조 도 3 및 12)의 표면에 의해 흡착되거나, 또는 거대-다공성 구조(참조 도 11) 또는 캡슐(도 13 및 14)의 내부와 동일한 표면에 의해 흡착된 세포를 체내로 전달하는 기법의 이용 가능성을 확인하였다.
일반적으로, 콜로이달 시스템에서 자발적인 조직화를 토대로한 치료법용 자가 조직화성 물질은 PLA, PLGA, PMMA, 알기네이트, 세포 등과 같은 결정형 덱스트란 미세입자 또는 그외 입자를 임플란트로 포함할 수 있다. 예컨대, 도 16A-16D는 덱스트란-PEG 2상 시스템에서 HeLa 세포와 결정형 덱스트란 미세입자의 분할을 나타낸다. 도 16A에서, 2상 시스템이 예시된다. 세포를 함유한 PEG 상으로 구성된 코어는 사진의 상단에 나타나 있고, 덱스트란/덱스트란 미세입자("CDM")은 하단에 나타나 있다. 쉘 바깥쪽 코어 내부로 격리되는 PEG 상 방울은, 코어와 쉘 부위의 경계면에서 보여진다. 도 16B는 PEG/덱스트란 2상 시스템에서 덱스트란 미세입자의 분할을 보인다. PEG 상(16)은 상층이고 덱스트란 미세입자를 함유하는 덱스트란 상(18)은 하층이다. 도 16C 및 16D는 결정형 덱스트란 미세입자 표면을 함유하는 덱스트란 상위의 HeLa 세포를 보이고 있다.
임플란트는 "저장기(reservoir)형 임플란트일 수 있으며, 세포 치환 요법에 사용될 수도 있다. "저장기"형 임플란트는 약물동력학을 향상시킬 수 있으며("파열(burst) 효과"가 없음), 생물학적 활성 물질의 지속적인 방출이 가능하다. "저장기"형 임플란트의 "코어"는 모든 형태의 활성 물질을 세포와 함께 "주입(loaded)"되는 임플란트 구조와 더불어 포함할 수 있다. 상기 코어는 치료성 펩타이드, 단백질, 핵산, 백신, 바이러스 및 세포를 포함할 수 있다.
도 17은 치료 원리에서 자가 조직화성 물질을 기초로 하는 세포 치환 요법의 예를 개략적으로 나타낸다. 예컨대, 결정형 덱스트란 미세입자를 기초로 하는 닫힌 구멍의 임플란트는 1형 당뇨병 치료법, 항암요법, 파킨슨병 치료법 및 그외 치료성 단백질 및 펩타이드 사용을 근간으로 하는 그외 적절한 치료법에 사용될 수 있다. 도 17에서, 임플란트(40)은 결정형 덱스트란 미세입자(12, 14) 캡슐 또는 이식된 세포(42)가 캡슐화된 쉘을 포함한다. 모든 적합한 세포, 예컨대 인슐린 생산 베타-세포, K 세포, 췌장 세포 또는 줄기 세포가 사용될 수 있다. 도 17에서 보여진 바와 같이, 상기 결정형 덱스트란 미세입자 캡슐은 혈당(44)(산소, 영양소 및 그외 자극원에도) 다공성이나, 캡슐에 들어가기에는 너무 커서 인슐린 생산 세포를 공격하지 못하는 면역세포는 투과하지 못한다. 혈당(44)는 결정형 덱스트란 미세입자 캡슐을 통과하여 침투하고, 인슐린 생산 세포로부터 인슐린(46) 생산을 자극한다. 상기 인슐린은 이후 결정형 덱스트란 미세입자 캡슐을 통과하여 혈액(48)으로 확산된다.
따라서, 인슐린 생산 세포가 캡슐화된 결정형 덱스트란 미세입자는 당뇨병을 치료하기 위해 인간과 같은 포유류에 이식될 수 있다. 결정형 덱스트란 미세입자 캡슐은 생체내에서 형성될 수 있으며, 외과 수술을 요하지 않을 수 있다. 이러한 기술은 "주입가능한 조직 기술"로서 당해분야에 공지되어 있다. 또한 상기 결정형 덱스트란 미세입자 캡슐은 가교된 독성 화합물 사용을 요하지 않는다. 상기 임플란트는 바람직하기로는 장시간 작용하는 인슐린 조제물을 제공하여 간의 당 생성을 억제하고, 공복상태에서 피크없이 시한적으로 작용하는 양상을 가진 거의 노르모글리세미아(normoglycemia)를 유지하는데 사용할 수 있다.
세포 치료법은 그외 질환을 치료하는데 사용될 수 있음을 주지해야한다. 예컨대, 도파민 생산 세포가 캡슐화된 결정형 덱스트란 미세입자는, 도 18에 개시한 바와 같인 파킨슨 병을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 도 18에서 보여진 바와 같이, 결정형 덱스트란 미세입자 캡슐의 구조는 가역적일 수 있으며, 세포(42)는 포유류 조직(50)에서 미세입자(12, 14)를 캡슐화하는 쉘을 형성한다. 예컨대, 환자 본인의 세포 또는 줄기세포가 미세입자 외부에 위치될 수 있다. 이와는 반대로, 환자 이외의 기원, 예컨대 공여체으로부터 유래한 세포는, 도 17에서 보여진 바와 같이 미세입자 쉘의 내부에 위치되어 환자의 자가면역 반응으로부터 세포를 보호할 수 있다. 이는 당뇨병과 그외 질환과 같은 상태를 치료하기 위한 생체내 조직 기술에 대한 가능성을 여는 것이다.
E. 골 이식 치환체
골 이식 공정에는 자가이식 조직의 사용이 관여되며, 조직은 환자 또는 공여체 또는 시체로부터 수득한 동종이식 조직으로부터 수득된다. 두가지 기본 기준은 성공적인 골-전도(osteoconduction) 및 골-유도(osteoinduction)를 판단하는데 사용된다.
자가이식 조직 수득에는, 염증, 감염 및 만성 통증과 같은 그 자체의 합병증을 발생시킬 수 있는 공여체 부위의 외과적 처지를 요한다. 수거될 수 있는 골 조직의 질은 또한 제한되지 않으나 공급 문제를 만들 수 있다.
동종이식은 공여체 부위의 질병률과 한정된 공급 문제를 제거함으로써 자가이식의 문제점 일부를 회피한다. 그러나, 동종이식에는 위험성이 존재한다. 많은 방법들이 질병 이완 위험성을 감소시킬 수 있지만, 조직을 멸균하기 위해 사용된 처치는 단백질과 인자들을 제거하고, 조직의 골유도를 감소 또는 소실시킨다.
또한 자가이식과 동종이식에 대한 몇 가지 대체안이 개발되었다. 이러한 다수의 대체안은 다양한 물질, 천연 및 합성 중합체, 세라믹 및 합성물을 포함한 어러가지 물질을 사용한다. 그외 대체 방법들은 단독으로 또는 그외 물질과 조합형태로 사용되는 인자계(factor-based) 전략 및 세포계(cell-based) 전략을 통합한다.
많은 골 이식 치환체는 천연 또는 합성 물질이며, 형질전환 성장 인자(TGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 및 골 형성 단백질(BMP)와 같은 재조합 성장 인자와 조합형태로 또는 단독으로 사용될 수 있다. 세포계 골 이식 치환체는 세포를 사용하여 새로운 조직을 단독으로 형성하거나 또는 지지 매트릭스(예, 중배엽 줄기 세포)상에 접종된다.
중합체계 골 이식 치환체와 함께, 골 분해성 및 비분해성 중합체 모두는 단독으로 또는 Orthovita, Inc.사의 Cortoss® 개방 다공성 폴리-락틱산 중합체(OPLA)와 같은 그외 물질과의 조합형태로 사용될 수 있다. 분해성 합성 중합체는 천연 중합체처럼 체내에 재흡수된다. 체내에 재흡수되는 임플란트가 가지는 이점은, 신체가 외부 신체를 잔류시키지 않고 스스로 완전히 치유할 수 있다는 것이다. 이러한 목적으로, 회사들은 폴리라틱산 및 폴리-라틱-코-글리콜릭산(PLGA)과 같은 분해성 중합체를 스탠드-단독 기기 및 자가이식 및 동종이식에 확장제로서 사용한다. 예컨대 Bone Tec, Inc.는 다공성을 유도하기 위해 미세입자 리칭 공정을 이용함으로써 다공성 PLGA 기포 매트릭스를 개발하였다. OsteoBiologics, Inc,는 이식 확장제로 사용된 미세입자 PLGA 산물인 Immix Extenders를 가지고 있다.
본 발명의 바람직한 예에 있어서, 전술한 다공성 결정형 덱스트란 미세입자는 골 이식 치환체로서 체내 특정 부위에서 골 형성을 제공하는 치료제와 조합형태로 사용된다. 골 형성을 위한 임의의 적합한 치료제는, 예컨대 이에 제한되지 않으나 전술한 중배엽 줄기 세포 TGF, PDGF, FGF 및 BMP를 포함하며, 펩타이드 줄기세포 또는 단백질이 사용될 수 있다. 치료제는 다공성 미세입자의 구멍내에 위치될 수 있다. 예컨대 상기 치료제는 결정화후 결정형 덱스트란 미세입자의 구멍내로 제공될 수 있다.
다른 바람직한 예에 있어서, 생체내 임플란트 형성 방법은 제1 액체 상에서 미세입자 현탁액을 제조하는 단계, 제1 액체상과 혼화되지 않는 제2 액체상에서 미세입자 현탁액을 제조하는 단계, 제1 액체상이 연속 상이고 제2 액체 상이 분산 상인 에멀젼을 제조하는 단계 및 상기 에멀젼을 포유류 체내에 주입하는 단계를 포함한다. 바람직하기로는, 상기 에멀젼은 골 이식 치환체로서 사용된다.
바람직하기로는, 상기 제1 액체상 및 상기 제2 액체상내 미세입자는 상이한 것이다. 예컨대, 제1 상의 미세입자는 다공성 세라믹 미세입자와 같은 비중합체 미세입자일 수 있으나, 반면에 제2 상의 미세입자는 전술한 다공성 결정형 덱스트란 미세입자와 같은 중합체 미세입자일 수 있다. 원하는 경우, 제2 액상은 체내 특정 부위에서 골 형성을 제공하는 치료제를 포함할 수 있다. 상기 치료제는 다공성 미세입자의 구멍에 위치될 수 있다.
F. 경구 인슐린 전달 비히클
본 발명의 다른 바람직한 예에 있어서, 본 발명자들은, 다공성(즉, 미세다공성: microporous) 미세입자의 조성물이 인슐린과 같은 단백질의 경구전달을 위한 비히클로서 사용될 수 있음을 확인하였다. 상기 다공성 미세입자는 혈당의 현저한 감소, 예를 들어, 경구 투여 후 60분 이내에 30%의 감소를 가져오는 인슐린의 경구투여를 가능하게 하는 모든 적절한 다공성 미세입자일 수 있다. 바람직하게, 상기 미세입자는 생체 결합성 입자로서, 예를 들면, 포유류의 장벽(intestine wall)에 적어도 임시적으로 결합되어, 상기 장벽을 통해 인슐린을 전달할 수 있는 입자이다. 가장 바람직하게, 상기 다공성 미세입자는 전술한 바와 같은 결정형 덱스트란 미세입자를 포함한다.
도 19에 나타낸 본 발명의 바람직한 예에서, 본 발명자들은, 토끼 등 포유류(53)에게 경구 투여되는, 결정형 덱스트란 미세입자(12, 14)와 인슐린(46)의 수성 현탁액이, 혈당 수준을 감소시킴에 있어, 인슐린을 단독으로 근육내 주사하는 것과 거의 동일하게 유효한 것을 확인하였다. 도 19는, 미세입자를 포함한 경구 투여된 조성물(54)로부터 포유류 (52)의 장(52)벽을 통해 침투하는 인슐린을 개략적으로 도시한 것이다. 토끼는 인간을 대상으로 한 약물시험의 일반적 모델이므로, 본 발명자들은 결정형 덱스트란 미세입자 및 인슐린을 포함한 액체 또는 고체 조성물(53), 예를 들어 수성 현탁액, 용액, 정제 또는 캅쉘이, 경구 투여된 경우, 인체에서도 혈당 수준을 감소시키는데 유효할 것으로 확신한다.
후술하는 실시예는, 결정형 덱스트란 미세입자를 사용한 경구 인슐린 전달을 도시한 것이다. 본 연구는, 친칠라 토끼 (2.3 ± 0.2 kg)에게, 본 명세서에서 개시된 방법에 따라 제조된 결정형 덱스트란 미세입자와 인간 재조합 인슐린으로 이루어진 수성 현탁액을 경구 투여하고, 이들의 반응을 관찰하는 것을 포함한다.
3.0 g의 Dextran T20 (Pharmacia, Uppsala, 스웨덴)을 2.0 g의 물에 용해시키고, 60 ℃의 온도에서 박스 안에 두었다. 3시간 후, 결정형 덱스트란 미세입자를 3 x 5.0 ㎖의 물로 3,000 g에서 원심분리에 의해 세정하였다. 이어서, 상기 결정형 덱스트란 미세입자를 2.0 ㎖의 물 속에서 현탁시키고, 실온에서 건조시켰다. 최종의 건조 분말은 경구 인슐린 전달 실험을 위한 인슐린 함유 현탁액의 제조에 사용되었다. 인슐린 함유 현탁액은, 상기 미세입자 250 mg; 인슐린 (NovoNordisk Actrapid HM Penfill, 40 UI/㎖) 0.3 ㎖ (12UI) 또는 0.6 ㎖ (24UI); 및 증류수를 부피 2.0㎖에 도달하도록 혼합함에 의해 제조하였다.
현탁액 샘플(2.0 ㎖)을 카테터로 토끼의 목에 주입하고, 이어서 10.0 ㎖의 물을 도입하였다. 실험 동물은 현탁액 주입 전 3시간 동안 사료를 먹이지 않았다. 토끼의 귀 정맥으로부터 혈액 샘플을 취하여 글루코오스 농도를 분석하였다. 혈당은, 적절히 보정된 "One-Touch System Glucose Analyzer" (Lifescan Johnson & Johnson, Milpitas, CA, USA) 상에서 포도당 산화효소법을 사용하여 측정하였다.
실시예 1 내지 8은 8마리의 토끼를 사용한 비교예이다. 실시예 9 내지 14는 5마리의 토끼를 사용한 본 발명에 따른 실시예이다.
(표 1에서 대조 실험군 #1로 요약된) 비교예 1과 2에서, 인간 재조합 인슐린의 수용액을 동물 당 12UI의 투여량으로 2마리의 토끼에게 근육내 주입하였다. (표 2에서 대조 실험군 #2로 요약된) 비교예 3과 4에서, 토끼은 원래의 상태 (즉, 상기 2마리의 토끼에는 인슐린 또는 다른 주사액을 제공하지 않은 상태)로 두었다. (표 3에서 대조 실험군 #3로 요약된) 비교예 5 와 6에서는, 인슐린 없이 결정형 덱스트란 미세입자의 현탁액을 2마리의 토끼에게 경구적으로 제공하였다. (표 4에서 대조 실험군 #4로 요약된) 비교예 7과 8에서는, 인슐린과 상업적으로 수득한 Sephadex® G-150 미세입자의 현탁액을 2마리의 토끼에게 경구적으로 제공하였다. Amersham Bioscience 웹 페이지에 따르면, Sephadex® G-150 미세입자는 비드화된 겔 미세입자로서 직경이 20 내지 150 미크론이며, 에피클로로히드린과 덱스트란을 가교시켜 제조한 것이다. (표 5에 정리된) 본 발명의 바람직한 예에 따른 실시예 9 내지 14에서는, 인슐린 (24UI)과 결정형 덱스트란 미세입자의 현탁액을 5마리의 토끼에게 경구적으로 제공하였다. 그 결과는 표 1 내지 5에 정리하였다.
토끼/실시예번호 인슐린투여량 0분, mg/dl 30분, mg/dl 60분, mg/dl 90분, mg/dl 120분, mg/dl
#1 12 UI i.m. 91 68 58 49 51
#2 12 UI i.m. 87 65 64 57 58
토끼/ 실시예번호 인슐린투여량 0분, mg/dl 30분, mg/dl 60분, mg/dl 90분, mg/dl 120분, mg/dl
#3 0.0 98 87 87 89 86
#4 0.0 88 90 91 94 87
토끼/ 실시예번호 인슐린투여량 0분, mg/dl 30분, mg/dl 60분, mg/dl 90분, mg/dl 120분, mg/dl
#5 0.0 92 99 94 95 92
#6 0.0 90 93 93 93 92
토끼/ 실시예번호 인슐린투여량 0분, mg/dl 30분, mg/dl 60분, mg/dl 90분, mg/dl 120분, mg/dl
#7 24 UI per os 85 82 86 81 83
#8 24 UI per os 84 75 86 76 77
토끼/ 실시예번호 인슐린투여량 0분, mg/dl 30분, mg/dl 60분, mg/dl 90분, mg/dl 120분, mg/dl
#9 24 UI per os 94 68 59 58 57
#10 24 UI per os 93 64 52 54 52
#11 24 UI per os 78 52 51 49 48
#12 24 UI per os 92 64 52 53 47
#13 24 UI per os 89 53 48 38 49
#14 24 UI per os 97 60 38 54 52
표 1 내지 5의 데이터로부터, 인슐린 12UI를 근육내 주사로 투여하였을 경우(실시예 1 내지 2)와, 인슐린 24UI를 결정형 덱스트란 미세입자와 함께 경구투여(per os)한 경우(실시예 9 내지 14)에 있어, 포유류의 혈액 내에서 당(즉, 글루코오스)의 평균 감소가 비교됨을 알 수 있다. 최대 글루코오스 감소는, 경구 투여 후 60분 경과 시 약 35 내지 60% 였다. 글루코오스의 상기 농도 프로파일은, 주입 모드와 경구 전달 모드에서 사실상 동일하였다. 인슐린 양을 달리하여 투여할 수도 있다. 예를 들어, 인슐린 30UI를 투여하는 것도 가능하다. 일반적으로, 주사된 인슐린양과 비교하여 2 내지 4 배 양의 인슐린을 경구투여하는 것은, 3 시간 까지 동안 유사한 혈당 강하를 형성한다.
인슐린은 그 자체로 장 효소에 의해 분해되어 위장관 점막층을 통해서는 미손상의 상태로는 흡수될 수 없음이 공지되어 있다 (참조: Amidon GL, Lee HJ, Absorption of peptide and peptidomimetic drugs, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1994; 34: 321-41). 그러나, 실시예 9 내지 14는, 수용된 저혈당증 효과(hypoglycemia effect)가 현저하므로, 덱스트란 미세입자가 인슐린과 같은 단백질의 경구전달용 비히클로서 사용될 수 있음을 보여준다. 특정 이론이나 작용 모드에 의해 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은, 상기 다공성의 결정형 덱스트란 미세입자를 수성 현탁액 내에서 인슐린 전달 매트릭스로서 사용하는 것은, 장 효소에 의한 유의한 분해로부터 인슐린을 보호하여, 상기 인슐린이 위장관 점막층을 통해 손상되지 않은 상태로 흡수될 수 있도록 한다고 생각한다. 인슐린은 미세다공성 미세입자 내의 미세구멍(micropore) 내에 위치하고/하거나 미세입자들 사이의 거대구멍(macropore)에 존재할 수 있다. 대조적으로, 가교된 Sephadex G-150 덱스트란 미세입자를 인슐린과 함께 사용한 경우 (실시예 7-8, 표 4), 혈당 농도에 있어 유의한 감소를 가져오지 못했다.
실시예 9 내지 14에 나타낸 바와 같이, 결정형 덱스트란 미세입자와 인슐린을 함유한 조성물을 포유류에 투여한 후 60분 경과 시, 포유류의 혈당농도는 5% 이상, 바람직하게는 30% 이상 감소한다. (즉, 본 발명의 현탁액의 투여 후 60분 경과시 포유류 내의 혈당치는, 현탁액 투여 직전의 측정된 값보다 5% 이상, 바람직하게는 30% 이상 낮아진다). 바람직하게는, 포유류 내 혈당농도는, 조성물을 포유류에 투여한 후 30분 경과시, 5% 이상, 예를 들어, 30% 이상, 바람직하게는 약 35 내지 40% 저하된다. 바람직하게는, 포유류 내 혈당농도는, 조성물을 포유류에 투여한 후 60분 경과시, 약 35 내지 60%, 예를 들어, 35 내지 45% 저하된다. 보다 바람직하게는, 포유류 내에서의 혈당 농도는, 투여 직전의 혈당 농도와 비교하여, 포유류에 상기 조성물을 투여한 후 30 내지 240분, 예를 들어, 30 내지 120분의 범위의 전체 기간 동안 저하된다. 예를 들어, 포유류 내 혈당 농도는, 포유류에 조성물을 투여한 후, 30 내지 240분, 바람직하게는 30 내지 120분의 기간 동안, 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 35% 이상, 예를 들어 35 내지 45% 저하된다.
따라서, 본 발명의 한 바람직한 예는, 결정형 덱스트란 미세입자와 인슐린을 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 경구 투여함에 의해 포유류의 혈당을 저하시키는 방법을 제공한다. 조성물의 "치료학적 유효량"은 치료 중인 질환, 상해 또는 장애의 유해 상태 또는 징후의 예방(prevention) 또는 개선(amelioration)에 의해 정해질 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은, 약 0.5 내지 약 5 ㎛의 평균 직경을 가진 결정형 덱스트란 미세입자와 인슐린의 수성 현탁액을 포함한다. 나아가, 상기 미세입자는, 바람직하게는 현탁액에 인슐린을 부가하기 전에 결정화된 다공성의 미세입자이므로, 인슐린은 미세입자의 표면과 접촉하고/하거나 미세입자의 구멍 내에 존재한다.
바람직하게는, 상기 결정화된 미세입자는, 복수개의 수소결합, 반데르 발스힘 및/또는 이온결합에 의해 함께 유지되는 덱스트란 분자 (즉, 중합체 분자)를 포함하며, 상기 덱스트란 분자들 사이에는 공유결합은 실질적으로 존재하지 않는다. 따라서, 상기 미세입자 내의 분자는 바람직하게는 의도적으로는 가교되지 않으며 (즉, 가교 단계가 수행되지 않으며), 상기 미세입자는 분자 간에 공유결합을 포함하고 있지 않거나, 분자 사이에 10% 미만의 공유결합을 포함한다.
인슐린과 미세입자를 포함하는 단일상 조성물(54)을 도 19에 도시하였으나, 앞서 기술하고, 도 13, 14, 15A, 15B, 15C 및 16B에 도시한 2상 조성물도 사용될 수 있다. 예를 들어, 덱스트란 상, PEG 상, 결정형 덱스트란 미세입자 및 인슐린을 포함한 2상 조성물이 사용될 수 있다. 생체 내에서, 상기 조성물은, 결정형 덱스트란 미세입자 포함 벽 (또는 쉘) 및, PEG와 인슐린 포함 코어를 포함하는 자가 조립 캅쉘 구조(self assembled capsule structure)를 가진다.
바람직하게는, 인슐린의 경구투여를 받는 포유류는, 혈당 감소가 필요한 인간, 예를 들어 당뇨병을 앓고 있는 인간이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 하나의 예는, 전술한 바와 같이, 인슐린과 결정형 덱스트란 미세입자의 현탁액을 경구투여함에 의해 치료가 요구되는 사람의 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
인슐린의 임의의 치료학적 유효량이 포유류에게 투여될 수 있다. 인슐린의 양은, 포유류의 종류 (즉, 인간 또는 토끼), 포유류의 체중, 현탁액 조성물, 소망하는 혈당 감소량 및 다른 인자에 기초하여 변화할 수 있다. 현탁액 내 인슐린 함량의 비제한적 예는, 현탁액 1그램 당 인간 재조합 인슐린이 약 10UI 내지 약 2,500UI, 예를 들어, 약 12 UI 내지 30UI, 예를 들어 24UI이다. 그러나, 상기 양은 소망하는 바에 따라 변화할 수 있다.
본 발명은, 전술한 바와 같이, 바람직한 예에 한정되는 것이 아니다. 유기 또는 무기 미세다공성 입자와 같이, 다른 매트릭스 재료가 인슐린 경구투여를 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 입자는 위장관 점막벽을 통한 인슐린 침투를 강화하고/하거나 상기 조성물을 안정화시키는 미세입자이다. 나아가, 상기 현탁액은 바람직하게는 물 용매; 매트릭스; 및 인슐린 용액 또는 현탁액 만을 포함하나; 상기 전달 시스템은 추가의 재료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은, 2상 시스템의 PEG 상과 같이 제2의 상을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 바람직한 측면은, 포유류의 혈당을, 포유류에 현탁액을 투여한 후 60분 경과 시, 30% 이상 저하시키기 위해, 치료학적 유효량의 인슐린과 매트릭스 재료를 포함한 조성물을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류의 혈당 강하 방법을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 포유류에 대한 현탁액 투여 방법은 결정형 덱스트란 미세입자와 치료학적 유효량의 인슐린의 수성 현탁액을 포유류에게 경구투여하는 단계를 포함한다.
전술한 바와 같이, 인슐린 또는 다른 단백질계 약물의 경구투여를 위해 매트릭스 재료로서 사용된 결정형 덱스트란 미세입자는, 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다. (참조: 예를 들어, 도 1) 바람직하게는, 상기 미세입자는 본 명세서에서 기술된 바람직한 예에 의해 제조된다. 바람직하게는, 상기 미세입자는 유기용매를 사용하지 않고 수용액 내에서 형성되지만, 상기가 반드시 필요한 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 측면에서, 치료학적 유효량의 인슐린과 결정형 덱스트란 미세입자는, 미세입자가 결정화된 후, 물속에서 혼합되어 인슐린 및 결정형 덱스트란 미세입자의 수성 현탁액을 형성한다. 상기 미세입자는 인슐린을 물에 부가하기 전, 부가함과 동시에 및/또는 부가한 후, 물에 첨가될 수 있다. 나아가, 상기 미세입자는, 그들이 형성된 용매 내에서, 포유류에게 경구 투여된다. 대안적으로, 이들은 그들이 형성된 용매로부터 제거되어 나와, 경구투여를 위한 물 또는 다른 수용액 내에 위치되거나 또는 예를 들어, 정제, 캅쉘 등, 경구투여를 위한 고체 형태로 건조되어 제공된다.
결정형 덱스트란 미세입자와 치료학적 유효량의 인슐린의 수성 현탁액 (또는, 인슐린과 매트릭스 재료의 다른 적절한 현탁액, 예를 들면 인슐린과 미세공성 미세입자의 현탁액)은, 바람직하게는 인체에 경구투여를 위하여 투약화된(dosed) 약리학적 조성물로서 제공된다. 본 발명의 한 바람직한 측면에서, 상기 조성물은 인체에 단독의 경구투여를 위해 투약화된 양으로 용기(vessel) 내에 위치한다. 상기 용기는 현탁액을 담을 수 있는 임의의 컨테이너, 예를 들어, 플라스틱 또는 유리병, 튜브, 점적기구(dropper), 스프레이 노즐, 파우치(pouch) 및/또는 기타 적절한 용기를 포함할 수 있다. 상기 용기는 조성물의 단독 경구 투여량을 위해 충분한 양의 현탁액을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 측면에서, 상기 조성물은 다중 경구 투여 투약량을 위해 적절한 양으로 임의의 적절한 용기 내에 위치할 수 있다. 상기 용기는 인체에 경구 투여량 투여를 위한 지침을 포함한다. 상기 지침은, 상기 용기상에 직접 인쇄된 것이거나 상기 용기에 부착된 라벨(label)과 같이, 용기 상에 인쇄될 수 있고, 혹은, 카드보드지 박스 내에 또는 약방 포장재(pharmacy envelope) 내에 용기와 함께 동봉된 종이 상에 인쇄된 것과 같이, 용기와 함께 동봉될 수 있다. 상기 지침은 각 투여량으로 취해야 하는 조성물의 양, 투여량이 취해져야 하는 빈도, 경구 투여를 위해 조성물의 투여량을 측정하는 방법 및/또는, 의료 관리 전문가 및/또는 약이 필요한 환자를 위한 기타 다른 적절한 경구 약물 지침을 기술할 수 있다. 대안적으로, 상기 지침은 전자화적으로 또는 음성적으로 투약 및 투여 지침에 접근하기 위한 방법, 예를 들어, 지침을 포함한 웹사이트에의 링크 또는, 상기 지침을 음성으로 들을 수 있는 전화번호 또는 녹음물(recordign)을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 측면에서, 용기 내에 위치한, 결정형 덱스트란 미세입자와 치료학적 유효량의 인슐린의 수성 현탁액은 상기를 필요로 하는 사람에게 조성물의 경구투여를 위한 지침과 함께 약학적 조성물 키트로서 제공된다. 상기 키트는 상기 용기 또는 상기 용기에 부착된 라벨에 인쇈된 지침서 또는, 병(즉, 용기)을 포함하는 카드보드지 상자 또는 약방 포장재 내에 상기 용기와 함께 동봉된 종이 및 지침지를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물은 수성 현탁액의 형태일 수 있으나, 포유류에서 혈당을 강하시키기 위하여 다른 전달 형태도 사용될 수 있다. 예를 들어, 다공성의 결정형 덱스트란 미세입자와 인슐린은 정제 또는 캅쉘의 형태로 투여될 수 있다.
상기 조성물을 고체 형태로 인간과 같은 포유류에 경구투여하기 위해서는, 결정형 덱스트란 미세입자와 인슐린의 용액을, 우선, 건조, 예를 들어 동결건조하여 분말을 형성한다. 상기 분말은 이어서, 선택적인 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께, 정제로 압축되거나 혹은 약학적으로 허용가능한 캅쉘 내에 놓여진다.
본 발명의 다른 바람직한 예에 있어서, 결정형 덱스트란 미세입자 및 치료학적 유효량의 인슐린을 포함하는 조성물은 인간과 같은 포유류에서 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이 경우, 상기 조성물은 흡입에 의해 포유류에 약학적 조성물을 투여하기 위해 개조된 용기내, 예컨대 짜거나 눌러서 조성물의 일정 함량이 나오는 흡입기내에 위치될 수 있다. 바람직하기로는, 상기 조성물은 흡입기로부터 용액 또는 현탁액 형태의 조성물을 분사함으로써 입을 통하여 포유류에 제공된다. 바람직하기로는, 상기 조성물은 포유류의 폐에 전달된다(즉, 폐 전달).
G. 주입가능한 인슐린 전달 비히클
본 발명자들은, 랫 및 토끼와 같은 포유류에게 결정형 덱스트란 미세입자 및 인슐린을 포함하는 조성물을 주사한 경우, 동량의 동일한 인슐린만을 단독으로 주사한 경우에 비해 인슐린의 효능 지속 시간이 기대 이상으로 연장된다는 것을 발견하였다. 도 20에는 주사기 56를 이용하여, 미세입자 12, 14 및 인슐린 46을 포함하는 1상 조성물(one phase composition)을 포유류 53에게 주사함으로써, 임플란트 40를 형성하는 과정이 개략적으로 도시되어 있다. 또한, 도 21에는 선택적으로 분할하여 결정화한 덱스트란 미세입자 12, 14를 포함하는 덱스트란상 18, 및 선택적으로 분할된 것으로서 인슐린을 함유하는 치료제 10을 포함하는 PEG상 16의 2상을 포함하는 2상 조성물을 포유류 53에게 주사함으로써, 포유류 53에 구조화된 임플란트 40을 형성하는 과정이 개략적으로 도시되어 있다. 덱스트란상 18은 PEG상 16 코어 주위에 쉘을 형성한다. 랫과 토끼는 인간을 대신하여 약물 테스트에 이용되는 인간과 공통된 모델이기 때문에, 결정형 덱스트란 미세입자 및 인슐린을 포함하는 본 발명의 조성물을 성인과 어린이에게 주사하는 경우에도 인슐린 효능의 지속 시간 연장 효과를 얻을 수 있을 것이라 생각된다.
실시예 15-22는 인슐린만을 단독 주사한 경우와 비교하여, 주사 가능한 인슐린 전달용 비히클로서, 결정형 덱스트란 미세입자를 이용한 경우의 이점에 대해 나타낸다. 본 실험에는 마우스가 이용되었으며, 결정형 덱스트란 미세입자 및 인간의 재조합 인슐린(NovoNordisk Actrapid HM Penfill®, 40 UI/ml)으로 구성된 수계 현탁액을 피하 주사한 다음, 그 반응에 대해 관찰하였다.
상기 현탁액을 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 5.0 g의 덱스트란 T10(Pharmacia, 웁쌀라, 스웨덴)을 20.0 g의 물에 용해시켰다. 그 용액을 0.22 ㎛의 필터(Millipore, Bedford, MA)에 통과시켜 여과한 후, 냉동 건조시켰다. 얻어진 분말 3.0 g을 멸균수 3.0 g에 용해한 다음, 60 ℃의 온도에서 박스 내에 두었다. 그로부터 6시간 후에, 결정형 덱스트란 미세입자를 3×5.0 ml의 멸균수를 이용하여 3,000 g에서 원심분리함으로써 세척하였다. 이렇게 얻어진 결정형 덱스트란 미세입자 현탁액을 인슐린 수용액과 혼합하여, 마우스를 이용한 실험에 사용하였다. 상기 현탁액 샘플을 마우스의 다리에 주사한 다음, 각각의 마우스 꼬리에서 혈액을 채취하여, 혈당 농도를 분석하였다. 원 터치 시스템 혈당 분석기(Lifescan, Johnson & Johnson, Milpitas, CA, USA)를 이용하여, 상기 분석기를 적절히 보정한 다음, 글루코오스 산화효소법에 따라 혈당을 측정하였다.
비교예 15는 마우스에게 인슐린을 주사하지 않은 경우이다. 비교예 16, 비교예 17, 및 비교예 21은 세 마리의 마우스에게 인슐린(0.5 UI)만을 단독으로 주사한 경우이다. 실시예 18-20 및 22는 네 마리의 마우스에게 인슐린(0.5 UI) 및 결정형 덱스트란 미세입자 임플란트를 주사한 경우이다. 각각의 결과는 표 6에 나타낸 바와 같다.
실시예 0분 글루코오스 mmol/l 15분 글루코오스 mmol/l 30분 글루코오스 mmol/l 45분 글루코오스 mmol/l 120분 글루코오스 mmol/l 210분 글루코오스 mmol/l 270분 글루코오스 mmol/l 390분 글루코오스 mmol/l
15 무손상 마우스 7.9 8.1 8.2 8.4 - - - -
16 인슐린 0.5 UI 5.9 3.3 2.7 1.8 0.9 3.5 3.0 3.2
17 인슐린 0.5 UI 8.1 3.8 2.8 1.9 0.9 3.7 3.4 3.5
18 인슐린 0.5 UI 및 결정형 덱스트란 미세입자 6.0 4.3 3.2 2.5 0.8 0.8 0.9 0.7
19 인슐린 0.5 UI 및 결정형 덱스트란 미세입자 6.9 5.6 4.1 3.4 - 1.2 - 1.6
20 인슐린 0.5 UI 및 결정형 덱스트란 미세입자 5.9 3.5 2.9 1.9 1.2 1.0 1.0 0.7
21 인슐린 0.5 UI (평균) 7 3.6 2.8 1.9 0.9 3.6 3.2 3.4
22 인슐린 0.5 UI 및 결정형 덱스트란 미세입자 (평균) 6.3 4.5 3.4 2.6 1.0 1.0 1.0 1.0
0.5 UI의 인슐린을 근육 내 주사(i.m.)하되, 결정형 덱스트란 미세입자를 이용하지 않은 경우에 있어서, 동물 혈액 중의 당(즉, 혈당)의 평균적인 감소는 매우 달랐다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 주사 후 45분 동안 비교예 16, 17 및 비교예 21의 마우스들의 글루코오스 수준은 실시예 18-20 및 22의 마우스들의 글루코오스 수준과 거의 동등하거나, 아니면 그보다 낮았다. 또한, 주사 후 120분 동안 비교예 16, 17 및 비교예 21의 마우스들과 실시예 18-20 및 22의 마우스들의 글루코오스 수준은 거의 동등하였다. 그러나, 주사 후 210분 내지 390분의 시간 동안 비교예 16, 17 및 비교예 21의 마우스들의 글루코오스 수준은 실시예 18-20 및 22의 마우스들에 비해 3배 가량 높았다. 실제로는 주사 후 120분 내지 390분의 시간 동안 실시예 18-20 및 22의 마우스들의 혈당 수준은 실질적으로 증가하지 않았다 (다시 말하면, 10%보다 높은 수준으로 증가하지 않고, 변화하지 않은 채로 유지되거나 또는 감소하였음). 이와는 대조적으로, 동량의 인슐린을 주사한 비교예 16, 17 및 비교예 21의 마우스들의 혈당 수준은 주사 후 120분 내지 390분의 시간 동안 실지적으로 증가하지 않았다. 결정형 덱스트란 미세입자/인슐린을 주사한 경우는 동량의 인슐린만을 단독 주사한 경우에 비해 더 오랜 시간 동안 혈당 수준이 감소되었다. 이것으로 보아, 결정형 덱스트란 미세입자와 인슐린을 포함하는 조성물을 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하의 토끼를 대상으로 한 실험은, 결정형 덱스트란 미세입자/인슐린을 주사함으로써, 동량의 인슐린만을 단독으로 주사한 경우에 비해 더 오랜 시간 동안 혈당을 감소시키는 방법, 및 더 오랜 시간 동안 기저 수준의 혈액 인슐린이 유지되도록 하는 방법을 나타낸 것이다. 속효성 인슐린인 Actrapid HM® 및 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 조성물을 피하 주사한 경우, 지속성 인슐린인 Monotard HM®을 피하 주사한 경우보다도 상기 속효성 인슐린의 효능 지속 시간이 연장된다는 것이 확인되었다.
여기서, 효능 지속 시간(duration of efficacy)이란, 식사 시와 같이, 혈당을 급상승시키는 대외적 조건에 좌우되지 않는 바람직한 수준으로, 혈당 농도를 저하시키는 시간 및/또는 혈액 내에 기저 수준의 인슐린 농도를 유지시키는 시간을 의미한다. 따라서, 효능 지속이란 용어는 인슐린 및 미세입자를 포함하는 조성물의 효능과 상기 조성물에 포함된 것과 동일한 동량의 인슐린만의 효능을 비교하기 위한 용어이다. 다시 말하면, 효능 지속 시간이란, 작용 지속 시간, 또는 약리학적 효과의 지속 시간을 의미하는 것으로서, 상기 인슐린 및 미세입자를 포함하는 조성물의 효능과 이와 동종 동량의 인슐린 단독의 효능을 비교하기 위해 환자가 공복 상태일 때 측정할 수 있다.
도 22A 및 22B에 도시된 바와 같이, Actrapid HM® 인슐린만을 단독으로 이용한 경우(도 22B)에는 인슐린의 흡수 시간 및 고혈당 강하 효과(hypoglycemic effect) 지속 시간이 약 2시간 내지 약 8시간 연장되었고, 지속성 인슐린인 "Monotard HM®"만을 단독으로 이용한 경우에는 약 17시간 내지 약 24시간 연장되었는데 반해, 속효성 인슐린인 Actrapid HM® 및 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 조성물을 이용한 경우에는 24시간 이상, 예를 들면, 약 28시간 내지 약 31시간으로 연장되었다. Actrapid HM® 인슐린 및 Monotard HM® 인슐린은 모두 Novo Nordisk의 제품으로서, 제조사의 설명서에 따르면 인체 내에서 이들 인슐린의 효능 지속 시간은 각각 8시간 및 20시간인 것으로 알려져 있다.
도 22A 및 도 22B에서 상부의 선은 인슐린이 투여되지 않은 무손상 토끼 대조군을 도시한 것이다. 또한, 도 22A 및 도 22B에서 y축은 인슐린 투여량이 8 UI로 한 경우의 혈당 농도와 관련하여 표준화한 스케일이다. 이들 도면에 도시된 데이터는 각각의 도에서 하나의 플롯으로 나타나도록 조정되었으며, 동물에 인슐린을 주사한 이후의 혈당 수준을 나타낸다.
도 22A 및 도 22B에 도시된 데이터를 다음과 같이 하여 얻었다. 친칠라 토끼(2.3±0.3 kg)에게, 결정형 덱스트란 미세입자 및 속효성 인슐린 Actrapid HM®으로 이루어진 조성물을 주사한 다음, 그에 따른 반응을 모니터링하였다. 각각의 조성물 샘플을 상기 토끼들에게 피하 주사하였다. 아울러, 상기 미세입자를 이용하지 않고서 각각의 토끼에게 지속성 인슐린 Monotard HM®(40 UI/ml) 및 속효형 인슐린 Actrapid HM®을 피하 주사하고, 이를 대조군으로 하였다. 토끼의 귀정맥에서 채혈한 다음, 얻어진 혈액 샘플을 이용하여 글루코오스 농도를 분석하였다. 글루코오스 분석기(One-Touch® Lifescan, Johnson & Johnson, Milpitas, CA, USA)를 이용하여, 상기 분석기를 적절히 보정한 다음, 혈당 농도를 측정하였다.
각각의 비교예 23 및 비교예 24에서는 두 마리의 무손상 토끼에게 인슐린을 주사하지 않았다. 각각의 비교예 25 및 비교예 25에서는 두 마리의 토끼에게 지속성 인슐린 Monotard HM® 수용액을 8 UI의 투여량으로 피하 주사하였다. 한편, 각각의 실시예 27-29에서는 세 마리의 토끼에게 결정형 덱스트란 미세입자와 속효성 인슐린 Actrapid HM®의 현탁액을 8 UI의 투여량으로 피하 주사하였다. 각각에 대한 실험 결과는 표 7에 나타낸 바와 같다.
실험# 인슐린투여량 0시간 글루코스 mmol/L 0.5시간 글루코스 mmol/L 1시간 글루코스 mmol/L 1.5시간 글루코스 mmol/L 2시간 글루코스 mmol/L 2.5시간 글루코스 mmol/L 16시간 글루코스 mmol/L 24시간 글루코스 mmol/L 31시간 글루코스 mmol/L
23 0.0 5.4 5.0 5.2 5.2 5.2 5.4 4.7 5.4 5.4
24 0.0 6.0 6.3 6.3 6.3 6.3 6.4 5.7 5.6 5.8
25 8UI 5.4 5.8 3.8 3.2 2.4 2.6 3.9 5.6 N.A
26 8UI 5.4 5.0 4.2 2.9 2.5 2.4 4.0 5.1 N.A
27 8UI 5.8 3.7 1.9 1.9 1.9 2.8 4.1 4.3 4.1
28 8UI 6.6 5.7 4.3 3.9 3.7 3.9 4.6 4.1 3.9
29 8UI 6.2 5.1 3.6 3.2 3.1 2.9 4.2 4.4 4.7
실시예 27-29는 결정형 덱스트란 미세입자와 속효성 인슐린 Actrapid HM®로 이루어진 조성물을 투여함으로써, 지속성 인슐린 Monotard HM®를 투여한 경우에 얻어지는 효과보다 우수한 효과를 얻을 수 있으며, Aventis로부터 입수 가능한 것으로서 (하루 1회 투여되는) 지속성 인슐린인 glargine Lantus®(www. aventis-us.com/Pls/lantus_TXT.html 사이트를 참조)를 투여한 경우에 얻는 효과와 거의 대등하였다. 또한, Lantus® 인슐린은 기타 인슐린 또는 용액에 희석되거나, 또는 이들과 혼합되어서는 안 된다. Lantus® 인슐린을 희석시키거나, 또는 혼합시키는 경우에는 Lantus® 및/또는 혼합된 인슐린의 약동학/약역학적 프로파일(예를 들면, 작용 개시점, 최대 효과를 나타낼 때의 시간)이 예측 불가능하게 변화될 수 있다. 이에 반해, 상기 결정화된 미세입자와 인슐린을 포함하는 조성물은 인간의 인슐린과 같은 임의의 적절한 인슐린을 이용할 수 있기 때문에, 전술한 바와 같은 제한 조건이 없다. 상기 결정화된 미세입자 및 인슐린을 포함하는 조성물에서 인슐린과 미세입자의 비율은 원하는 바에 따라 다양하게 할 수 있다. 또한, 임의의 적절한 인슐린을 이용하여, 인슐린 요법을 개개인의 환자에게 적합하도록 할 수 있다. 따라서, 상기 조성물에는 통상의 인슐린을 대표하는 일례로서 Actrapid HM®을 이용한 것일 뿐, 상기 브랜드의 인슐린으로 한정되지 않는다.
실시예 23-29의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 결정형 덱스트란 미세입자 및 인슐린을 포함하는 조성물은 상기 미세입자를 이용하지 않은 동종 동량의 인슐린을 이용한 경우에 비해, 인슐린의 효능 지속 시간을 30% 이상, 예를 들면, 100% 이상, 바람직하게는 100 내지 400% 이상 연장된 시간 동안 유지시키는 데 효과적이다. 또한, 상기 미세입자를 함유하는 인슐린 조성물은 상기 미세입자를 이용하지 않은 동종 동량의 인슐린을 이용한 경우에 비해, 혈중 바람직한 기저 수준의 인슐린 및 혈당 농도를 30% 이상, 예를 들면, 100% 이상, 바람직하게는 100 내지 400% 이상 연장된 시간 동안 유지시키는 데 효과적이다. 따라서, 상기 미세입자를 포함하는 조성물의 효능 지속 시간은 24시간 이상이며, 상기 조성물은 상기 조성물을 투여해야 할 필요가 있는 인간과 같은 포유류에게 하루에 1회만 주사된다.
상기 지속성 인슐린 및 결정화된 미세입자를 포함하는 조성물은 종래의 조성물에서와 같은, 다량의 인슐린을 이용하지 않은 경우에도 장기간 동안 효과 지속성을 얻을 수 있기 때문에, 종래의 지속성 인슐린 조성물에 비해 안전하다. 예를 들면, 과량 투여 시에 별다른 위험이 없는 환자에게 8 UI의 투여량으로 속효성 인슐린을 투여해도 의학적으로 안전하다면, 이와 동일한 속효성 인슐린 및 상기 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 조성물을 이와 동량의 속효성 인슐린 8 UI의 투여량으로 이용함으로써, 과량 투여 시에도 별다른 위험 없이, 심지어는 모든 인슐린이 한 번에 환자에게 방출되는 경우에도, 더 오랜 작용 지속 효과를 얻을 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 조성물을 이용함으로써, 인슐린의 양을 증가시키지 않고도 효능을 지속시킬 수 있기 때문에, 종래의 조성물에 비해서 비용 절감 효과를 얻을 수 있다. 종래의 지속적인 당뇨병 치료법에 따르면, Lantus® 인슐린(Aventis로부터 입수 가능함)과 같은 인슐린 유사체를 이용한다. 그러나, 상기 결정형 덱스트란 미세 결정을 포함하는 조성물은 안전성 프로파일이 확립된 인간의 재조합 인슐린을 포함한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 부작용(들) 및 당뇨병 환자들에 투여하는 각종 주사제의 위험성을 저하시킴으로써, 당뇨병 환자들의 삶의 질을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 주사 가능한 조성물로서는 인슐린 및 미세입자를 포함하는 1상 시스템; 또는 보다 오랜 효능 지속 시간을 얻기 위해, PEG와 인슐린 코어, 및 텍스트란과 덱스트란 미세입자 쉘을 형성하는 2상 시스템이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유류에게 비교적 주사하기 쉬운 유동성의 1상 또는 다상 콜로이드 시스템(즉, 현탁액 또는 에멀전)을 포함한다.
이하의 실시예는 덱스트란상, PEG상, 인슐린, 및 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는, 주사 가능한 2상 조성물의 용도를 나타낸다. 상기 조성물을 포유류에게 주사하면, 상기 조성물은 3차원의 캡슐 구조로서 구조화된 저장형 임플란트(structured reservoir type implant)를 형성하는 것으로 여겨진다. 상기 캡슐 구조에서, 상기 미세입자는 덱스트란상 내에 선택적으로 분할되고, 상기 인슐린은 상기 PEG상 내에 선택적으로 분할된다. 상기 미세입자를 포함하는 덱스트란상은 상기 인슐린을 포함하는 PEG상을 함유하는 코어 주위에 쉘을 형성한다. 상기 구조화된 임플란트에 의해, 상기 코어로부터 상기 쉘을 통한 방출이 조절된다.
비교예 30에서는 0.5 UI의 Actrapid HM® 인슐린(100 UI/ml)을 마우스에게 피하 주사하였다. 실시예 31에서는 0.4 g의 결정형 덱스트란 미세입자를, 몰중량이 70 kDa인 20%(W/W)의 덱스트란(Pharmacia, 스웨덴)의 수용액 0.6 ml 중에 분산시켜, 현탁액을 형성하였다. 또한, 분자량 6 kDa인 PEG(Fluka) 10 mg을 Actrapid HM® 인슐린(100 UI/ml) 0.1 ml에 용해시켜, 용액을 형성하였다. 상기 PEG와 인슐린의 용액 0.05 ml를 상기 미세입자와 덱스트란의 현탁액 0.15 ml와 혼합하여, 2상 조성물 또는 혼합물을 형성하였다. 이렇게 하여 얻어진, 0.5 UI의 인슐린을 포함하는 2상 혼합물 0.02 ml를 마우스에게 피하 주사하였다. 표 8은 각각의 경우에 따른 마우스의 혈당 농도를 나타낸다.
실시예 # 0분 글루코스 mmol/L 15분 글루코스 mmol/L 30분 글루코스 mmol/L 45분 글루코스 mmol/L 60분 글루코스 mmol/L 120분 글루코스 mmol/L
30 7.8 3.7 2.3 1.7 2.9 6.7
31 7.9 5.9 4.3 4.1 4.3 4.0
표 8으로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 2상 조성물을 투여한 경우에는 인슐린만을 단독 투여한 경우에 비해 효능 지속 시간이 길었다. 또한, 상기 2상 조성물을 투여한 경우에는 인슐린만을 단독 투여한 경우에 비해 혈당 농도이 보다 더 점진적으로 감소하였다. 특정 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 전술한 바와 같은 효과는 캡슐 구조의 코어로부터의 인슐린 방출이 조절되기 때문인 것이라 여겨진다.
아울러, 환자 개개인에 따라서 적합하도록 인슐린 및/또는 미세입자의 양을 조정하여, 환자에게 상기 미세입자를 포함하는 조성물을 매일 동일한 시간에(즉, 24시간 당 1회, 48시간 당 1회 등) 주사할 수 있다. 따라서, 상기 조성물의 효능 지속 시간을 환자 개개인에 따라서 조정할 수 있다. 2상 시스템에서는 상기 미세입자의 양을 조정하여, 상기 캡슐의 쉘 두께를 제어함으로써, 상기 캡슐의 코어로부터의 인슐린 방출 프로파일을 제어할 수 있다.
특정 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 마우스 및 토끼에 주사된 동량의 인슐린과 결정형 덱스트란 미세입자의 지속적인 효과는, 상기 결정형 덱스트란 미세입자 기재의 임플란트로부터 상기 인슐린 분자가 확산됨으로써 얻어지는 것이라 여겨진다(즉, 인슐린 방출이 스스로 조절됨). 마우스와 토끼는 인간을 대신하여 약물 테스트에 이용되는 인간과 공통된 모델이기 때문에, 위의 표 6 내지 8에 나타낸 데이터로부터, 결정형 덱스트란 미세입자 기재의 임플란트를 이용함으로써, 향상된 약동학적 및 약역학적 특성을 가지며, 제어된 방출 전달 시스템을 개발할 수 있고, 인간과 같은 기저 수준의 인슐린을 필요로 하는 환자들에게 적절할 것이라 사료된다.
H. 재료
용어 "인슐린"은 인슐린 유사체, 인간으로부터 추출된 천연 인슐린, 인간 재조합 인슐린, 소 및 또는 돼지 기원으로부터 추출된 인슐린, 돼지 및 소의 재조합 인슐린 및 이들 인슐린 산물의 모든 혼합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 상기 용어는 실질적으로 정제된 형태로 당뇨병 치료에 정상적으로 사용되는 폴리펩타이드를 포함하는 것이며, 부가적인 부형제를 포함하는 상업적으로 구입가능한 약제 형태로의 사용을 포함한다. 상기 인슐린은 바람직하기로는 재조합으로 생산된 것이며, 탈수(완전히 건조됨) 또는 용액 형태일 수 있다.
용어 "인슐린 유사체", "단량성 인슐린(monomeric insulin)" 및 그 유사체는 호환적으로 사용되며, 전술한 모든 형태의 "인슐린"을 포함하는 의도이며, 상기 폴리펩타이드내의 하나 이상의 아미노산은 대체 아미노산으로 치환되고 및/또는 하나 이상의 아미노산은 결손되거나, 또는 하나 이상의 부가적인 아미노산이 상기 폴리펩타이드 체인 또는 아미노산 서열에 부가되어, 혈당치를 감소시키는 인슐린으로 작용한다. 일반적으로, 용어 "인슐린 유사체"에 대한 본 발명의 바람직한 예로는, 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 제 5,547,929호에 개시된 "인슐린 리스프로 유사체(insulin lispro analogs)"; LysPro 인슐린 및 휴말로그 인슐린(humalog insulin)을 포함하는 인슐린 유사체 및 그외 "슈퍼 인슐린 유사체"가 포함되며, 상기 인슐린 유사체의 혈당 수치에 작용하는 능력은 기존의 인슐린 뿐만 아니라 지방조직보다 간에서 보다 더 활성인 간 선택적 인슐린 유사체에 비해 실질적으로 증대된 것이다. 바람직한 유사체는, 인슐린으로 일반적으로 동일한 목적으로 사용되는 인슐린-유사 화합물인, 예컨대 인슐린 리스프로, 즉 혈당치를 감소시키기 위해 투여되는 화합물과 같은 단량성 인슐린 유사체이다.
용어 "유사체"는 비교가능한 것으로 간주되는 분자와 공통된 기능적 활성을 공유하고 전형적으로 공통된 구조 특성을 공유하는 분자를 의미한다.
용어 "재조합"은 원핵 세포에서 발현되는 클론된 모든 치료 유형 또는 유전학적으로 조작된 분자 또는 제2의 조합 라이브러리를 형성하기 위하여 다른 상태로 더 처리될 수 있는 조합 라이브러리 분자, 특히 치료제의 생리화학적, 약리학적 및 임상적 안정성을 강화하는 보호기를 함유하는 분자를 의미한다.
또한, 전술한 치료제는 인슐린으로 한정되지 않는다. 그외 적합한 모든 치료제가 경구 전달, 흡입 전달, 주입 전달 및 외과적 이식 전달을 위한 미세입자와 같이 사용될 수도 있다.
예컨대, 적합한 치료제는, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 0.5 kDa 내지 150kDa 분자크기의 단백질을 포함한다. 대개, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 치료제로는, 전술한 인슐린 및 인슐린 유사체와 같은 당뇨병 보조제; 아밀린(amylin); 글루카곤; 계면활성제; 사이토카인, 케모카인, 림포카인과 같은 면역조절성 펩타이드 및 단백질; 탁솔; 인터루킨-1, 인터루킨-2과 같은 인터루킨 및 인터페론; 에리트로포이에틴; 혈전용해제(Thombolytics) 및 헤파린제; 항-단백질 분해효소, 항트립신제 및 아밀로라이드(amiloride); rhDNase; 항생제 및 그외 항-감염제; 부갑상선 호르몬, LH-RH 및 GnRH 유사체와 같은 호르몬 및 성장 인자; 핵산; DDAVP; 칼시토닌(calcitonin);사이클로스포린; 리바비린(ribavirin); 효소; 헤파린; 조혈인자; 사이클로스포린; 백신; 면역글로불린; 혈관작용성 펩타이드(vasoactive peptide); 안티센스제; 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체가 포함된다. 그외 적합한 치료제로는, 바이러스, 세포, 유전자 및 그외 적합한 백신과 분자 치료제와 같이 치료 특성을 지닌 기타 약제가 포함된다.
용어 "아밀린"에는 인간의 천연 아밀린, 소 아밀린, 돼지 아밀린, 랫 아밀린, 토끼 아밀린 뿐만 아니라 프람린티드(prmlintide)와 그외 아밀린 작용제를 포함한 합성, 반합성 또는 재조합 아밀린 또는 아밀린 유사체가 포함된다.
용어 "면역조절성 단백질"은 사이토카인, 케모카인, 림포카인 보체(lymphokines complement) 성분, 성장 호르몬, 면역계 보조물, 및 부착 분자 및 인간 또는 인간을 제외한 동물에 특이성을 갖는 그것의 리셉터를 포함한다. 유용한 예로는, GM-CSF, G-CSF, IL-2, IL-12, OX40, OX40L(gp34), 림포탁틴(lymphotactin), CD40, CD40L이 포함된다. 유용한 예로는, 인터루킨, 예컨대 인터루킨1 내지 15; 인터페론 알파, 베타 또는 감마; 호중구 활성화 단백질(neutrophil activating protein)(NAP)과 같은 종양 괴사 인자, 과립구 대식세포 집락 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor)(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(macrophage colony stimulating factor)(M-CSF), 과립세포 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor)(G-CSF), 케모카인; 대식세포 주화성 및 활성화 인자(macrophage chemoattractant and activating factor)(MCAF), RANTES, 대식세포 염증성 펩타이드 MIP-1a와 MIP-1 b, 보체 성분과 이의 리셉터, 또는 보조 분자, 예컨대 B7.1, B7.2, ICAM-1, 2 또는 3 및 사이토카인 리셉터가 포함된다. OX40와 OX40-리간드(gp34)는 면역조절성 단백질의 더욱 유용한 예이다. 면역조절성 단백질은 여러가지 목적에 있어서 인간 또는 인간을 제외한 동물에 대한 특이성을 가질 것일 수 있으며, 본 목적에서는 경우에 따라, 용이성에 따라, 세포외 도메인과 천연 단백질과 이의 뮤테인에 결합성을 가진 그외 단편, 및 다른 폴리펩타이드 서열, 예컨대 면역글로불린 중쇄의 컨스턴트 도메인(constant domain)과 그것의 융합 단백질에 의해 표시될 수 있다. 하나 이상의 면역조절성 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 삽입되면, 이들은 예컨대 하나 이상의 사이토카인 또는 사이토카인과 보조/부착 분자 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 용어 "인터페론" 또는 "IFN"은 바이러스 복제와 세포 증식을 저해하고 면역 반응을 조절하는 매우 상동한 종-특이 단백질 패밀리를 의미한다. 인터페론은 이들의 세포 기원과 항원성에 의거하여 3가지 클래스, 즉 알파-일터페론(루코사이트), 베타-인터페론(섬유아세포) 및 감마-인터페론(면역보체 세포)로 그룹화된다. 각 그룹의 재조합 형태와 유사체가 개발되었으며 상업적으로 구입가능하다. 각 그룹에서 서브타입은 항원/구조 특징을 기초로 한다. 개별적인 아미노산 서열을 가지는 적어도 24개의 인터페론 알파(서브타입 A 에서 H)는 이러한 펩타이드를 코딩하는 DNA를 분리하고 분석함으로써 동정된다. 용어 "알파-인터페론", "알파 인터페론", "인터페론 알파", "인간의 루코사이트 인터페론" 및 "IFN"은 본원에서 호환적으로 사용되며, 상기 그룹의 일원을 지칭한다. 이러한 방식으로 제조된 인간의 루코사이트 인터페론은, 다른 아미노산 서열을 가지는 인간 루코사이트 인터페론들의 혼합을 포함한다.
용어 "에리트로포이에틴"은 합성, 반합성, 재조합, 천연, 인간, 원숭이 또는 천연 에리트로포리에틴의 일차 구조의 배위의 일부 또는 전체(즉, 아미노산 잔기의 연속 서열) 및 하나 이상의 생물학적 특징(예, 면역학적 특징 및 생체내 및 생체외 생물 활성)을 가지는, 동물 또는 미생물에서 분리된 폴리펩타이드 산물에 적용되며, 이들의 대립 변이체가 포함된다. 이러한 폴리펩타이드는 또한 게놈 또는 cDNA 클로닝 또는 유전자 합성으로 수득된 외인성 DNA 서열을 원핵 또는 진핵 숙주에서 발현시킨(예, 박테리아, 효모 및 포유류 세포에 의한 배양으로) 산물이 존재하는 것이 독특한 특징이다. 척추동물세포(예, 포유류 및 조류)에서 미생물 발현 산물은 또한, 혈장 또는 뇨와 같은 세포외 유액 또는 포유류 세포의 천연 조건에서 에리트로포리에틴과 조합되어질 수도 있는 인간의 단백질 또는 그외 오염물질과의 조합으로부터 자유로와지는 특징을 갖는다. 전형적인 효모(예, 사카로마이세스 세레비지아) 또는 원핵생물(예 E. coli) 숙주 세포의 산물은 모든 포유류 단백질과의 조합으로부터 자유롭다. 사용 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 포유류의 또는 그외 진핵생물의 탄수화물로 당화되거나 또는 당화되지 않을 수 있다. 폴리펩티드는 또한 시작 아미노산 잔기 메티오닌(위치 -1)을 포함할 수도 있다. 본 발명의 새로운 당단백질 산물은, 이의 한가지 이상의 생물학적 특성을 지니도록 하기 위하여, 천연 에리트로포이에틴(예 인간)의 그것과 충분히 중복가능한 일차 구조 배위를 가지고, 천연 에리트로포이에틴(예 인간)의 것과 상이한 평균 탄수화물 조성을 가지는 것을 포함한다.
용어 "헤파린제" 및 "혈전용해제"는 헤파린, 저분자량의 헤파린, 조직 플라스미노겐 활성자(TPA), 유로키나제(Abbokinase) 와 그외 응혈을 통제하기위해 사용되는 인자들과 같은 항-응고 인자를 포함한다.
용어 "항-단백질 분해효소" 및 "단백질 분해효소-저해제"는 호환적으로 사용되며, 합성, 반-합성, 재조합, 천연 또는 비천연, 가용성 또는 리셉터와 반응성이 있는 고정화된 약제로 사용되거나 또는 항체, 효소 또는 핵산으로서 작용한다. 이는 체액성 면역 반응을 조절하는 리셉터, 세포성 면역 반응을 조절하는 리셉터(예, T-세포 리셉터)와 신경 반응을 조절하는 리셉터(예, 글루타메이트 리셉터, 글리신 리셉터, 감마-아미노 부티릭산(GABA) 리셉터)를 포함한다. 이는, 사이토카인 리셉터(관절염, 패혈증성 쇼크, 이식 거부반응, 자가면역질환 및 염증성 질환과 관련됨), 세포독성 T-세포 리셉터와 및/또는 T-헬퍼 세포 리셉터(자가면역질환과 관련됨)에 존재하는 항원과 조합하는 주조직적합성(MHC) 클래스 I과 II 리셉터 및 트롬빈 리셉터(응집, 심혈관 질환과 관련됨)를 포함한다. 또한, 자가 항원을 인지하는 항체, 예컨대 자가면역 질환에 관련된 항체와 바이러스(예, HIV, 헤페스 심플렉스 바이러스) 및/또는 미생물 항원을 인지하는 항체를 포함한다.
용어 "호르몬"과 "성장 인자"는, 호르몬 방출성 호르몬으로, 예컨대 천연, 인간, 돼지, 소, 양, 합성, 반합성 또는 재조합 기원으로부터 기원한 성장 호르몬, 갑상선 호르몬, 타이로트로핀 방출성 호르몬(TRH), 고나도트로핀 방출성 호르몬(GnRH), 루테이닌화 호르몬(gonadotropin-releasing hormone), 루테이닌화 호르몬 방출성 호르몬(LHRH, 루프롤리드, 델트리렐릭, 고소렐린, 나파렐린, 다나졸 등과 같은 슈퍼작용제 및 길항제를 포함함)를 포함한다. 이들은 또한 옥트레오티드(Sandostatin)과 같은 소마토스타틴을 포함한다. 생물치료제의 분류에서, 그외 약제로는, 자궁 수축용 약제(예, 옥시토신), 이뇨(예, 바소프레신), 호중구감소증(neutropenia)(예, GCSF), 호흡기 질환용 약제(예, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제), RDS(예, 계면활성제, 선택적으로 아포프로테인을 포함함) 등을 포함한다.
용어 "효소"는 DNAse(Genentech), 단백질 분해효소(예, 트립신 및 트롬빈과 같은 세린 분해효소), 중합효소(예, RNA 중합효소, DNA 중합효소), 역전사효소 및 키나제와 같은 재조합 데옥시리보뉴클레이즈, 관절염, 골다공증, 염증성 질환, 당뇨병, 알레르기, 기관 이식 거부반응, 오코진 활성화(예, 디하이드로폴레이트 리덕테이즈), 신호 전이, 자가-주기 조절, 전사, DNA 복제 및 회복에 관여하는 효소를 포함한다.
용어 "핵산"은 천연적으로 또는 비천연적으로 발생되는 뉴클레오시드를 포함하는 DNA 또는 RNA 모든 단편, 또는 상보적인 수소 결합을 통하여 그외 핵산 또는 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있으며 또한 비핵산성 리간드에 결합할 수 있는 그외 프로테노이드 약제를 포함한다.
용어 "백신"은 분리된 또는 항원이 존재하는 세포, 예컨대 T 세포를 활성화하여 선택적인 항원에 대하여 다가 세포성 면역 반응을 형성시킬 수 있는 활성화된 수지상 세포를 통하여 체액성 및 세포성 면역 반응을 자극하기 위한 치료 조성물이다. 강력한 항원 존재 세포는 세포가 폴리펩타이드 복합체에 생체외에서 노출됨으로써 자극된다. 상기 폴리펩타이드 복합체는 수지상 세포 결합 단백질과 폴리펩타이드 항체를 포함할 수 있으며, 바람직하기로는, 상기 폴리펩타이드 항원은 조직 특이적 종양 항원 또는 온코젠 유전자 산물중 어느 하나이다. 그러나, 바이러스 항원과 같은 그외 항원이 이러한 조합에 사용되어 면역자극성 반응을 형성할 수 있을 것으로 이해된다. 다른 바람직한 예에서, 면역자극성 폴리펩타이드 복합체 일부분을 형성하는 상기 수지상 세포-결합 단백질은 GM-CSF이다. 다른 바람직한 예에서, 상기 복합체의 일부를 형성하는 폴리펩타이드 항원은 종앙 특이적인 항원 PAP(prostatic acid phosphatase)이다. 또다른 바람직한 예에서, 상기 폴리펩타이드 항원은 온코젠 산물인 펩타이드 항원 중 하나 일 수 있다. 상기 폴리펩타이드 복합체는 또한 수지상 세포 결합성 단백질과 폴리펩타이드 항원 사이에 링커 펩타이드를 포함할 수도 있다. 상기 폴리펩타이드 복합체는 폴리펩타이드 항원에 공유결합으로 연결된 수지상 세포 결합성 단백질을 포함할 수 있으며, 이러한 폴리펩타이드 복합체는 바람직하기로는 수지상 세포 결합성 단백질, 바람직하기로는 GM-CSF와 폴리펩타이드 항원으로부터 형성된다. 상기 폴리펩타이드 항원은 바람직하기로는 PAP와 같은 조직 특이적 종양 항원, 또는 Her2, p21RAS 및 p53과 같은 온코젠 산물이며; 그러나 그외 예들에서 바이러스 항원 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
용어 "면역글로블린"은 하나 이상의 유전자 벡터에 의한 코딩 또는 인코딩되고, 숙주 방어 세포에서 핵산의 다양한 결합성 모이어티에 접합하거나 또는 인간 또는 동물 개체의 치료를 보조하기 위한 발현 벡터를 커플링하는 것과 같은, 숙주 방어 기작에 관여하는 폴리펩타이드 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 폴리펩타이드 클래스로 포함되는 의약제로는, IgG, IgE, IgM, IgD, 개별적인 또는 이들 서로간의 조합형이 포함된다.
그외 적합한 치료제로는, 부신피질자극포르몬(adrenocorticotropic hormone), 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 프롤랙틴(prolactin), 룰리베린(luliberin), 루테인화 호르몬 방출성 호르몬(luteinizing hormone releasing hormone)(LHRH) 작용제, LHRH 길항제, 가스트린, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 유로가스트론, 세크레틴, 엔케팔린, 엔도르핀, 안지오텐신, 종양 괴사 인자(TNF), 신경 성장 인자(NGF), 헤파린아제, 골형성 단백질(bone morphogenic protein)(BMP), hANP, 글루카곤계 펩타이드(GLP-1), 인터루킨-11(IL-11), VEG-F, 재조합 간염 B 표면 항원(rHBsAg), 레닌(renin), 브래디키닌(bradykinin), 백시트랙신(bacitracins), 폴리믹신(polymyxins), 콜리스틴(colistins), 티로시딘(tyrocidine), 그라미시딘(gramicidins), 및 합성 유사체, 변형제 및 이들의 약학적 활성의 절편, 효소, 사이토카인, 항체 및 백신이 포함된다.
용어 덱스트란 미세입자로는, 비치환된 덱스트란 미세입자와 치환된 덱스트란 미세입자를 포함한다. 예컨대, 치환된 덱스트란 미세입자는 적합한 기, 예컨대, 메틸 기로 덱스트란 미세입자의 결정화를 해치지 않는 정도로, 예컨대 3.5 이하의 브랜칭 %로 치환된 덱스트란을 포함한다. 미세입자의 평균 직경은 바람직하기로는 약 0.5 내지 약 5 ㎛이고, 더 바람직하기로는 약 1 내지 약 2 ㎛이다.
또한, 결정형 미세입자와 같은 가고되지 않은 다공성 덱스트란 미세입자는 바람직하기로는 치료제와 함께 사용되지만, 그외 적합한 유기 또는 무기 미세입자, 예컨대 폴리사카라이드, PLA, PLGA, PMMA, 폴리이미드, 폴리에스테르, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 비닐 아세테이트 또는 그외 중합체성 물질을 포함한 그외 중합체 미세입자, 알기네이트와 세포와 같은 생물물질 입자, 또는 실리카, 유리 또는 칼슘 포스페이트와 같은 무기 입자가 대신 사용될 수 있다. 바람직하기로는 상기 미세입자는 생분해성이다. 바람직하기로는, 다공성 미세입자가 사용된다. 가장 바람직하기로는, 상기 미세입자는 구멍에 치료제를 함유하고 상기 구멍으로부터 치료제를 시한적으로 방출하도록 충분한 다공성을 가진다. 즉, 상기 치료제는 구멍으로부터 시간에 따라 방출되며, 예컨대 5분이상, 바람직하기로는 30분이상, 더 바람직하기로는 1시간이상, 예컨대 한번에 전부가 아니라 수시간에서 수일에 거쳐 방출된다. 따라서, 상기 입자의 물질, 구멍 크기 및 구멍의 부피는 사용 치료제의 유형, 전달을 위한 치료제의 부피, 치료제 전달 지속 시간, 치료제가 전달되는 조건 및 그외 인자에 따라 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 측면에 있어서, 치료제는 다공성 미세입자의 구멍에 적어도 부분적으로 위치된다. 바람직하기로는, 상기 치료제는 미세입자내에 캡슐화되지 않으며(즉, 상기 미세입자는 쉘 내부의 치료제 코어를 가진 쉘로서 작용하지 않는다), 미세입자의 표면에 부착되지 않는다. 그러나, 적절하다면, 치료제 일부는 상기 미세입자의 구멍에 위치할 뿐만 아니라, 또한 미세입자 쉘내에 캡슐화될 수 있거나 및/또는 미세입자의 표면에 부착된다. 구멍내 치료제의 위치는 치료제의 최적 시한적인 방출을 제공한다. 이와는 반대로, 상기 미세입자의 표면에 부착되 치료제는 종종 너무 빨리 방출되지만, 미세입자에 캡슐화된 치료제는 충분히 곧 방출되지 않으며 미세입자 쉘이 분해되면서 한번에 방출된다. 2상 시스템에서 적어도 80% 이상의 치료제가 미세입자를 포함하는 벽 또는 쉘로 둘러싸인 코어에 위치하는 것이 바람직하다.
I. 제조 방법
상기 미세입자는 임의의 적합한 방법으로 형성할 수 있다. 상기 미세입자가 형성된 후에 상기 미세입자를 치료제와 조합하는 것이 바람직하다. 따라서, 결정형 덱스트란 미세입자와 같은 미세입자를 임의의 적합한 방법으로 형성한 다음 치료제와 미세입자를 임의의 적합한 방법으로 조합한다. 이와 대조적으로, 일부 종래의 방법에서는, 입자 전구체 물질과 치료제를 용액으로 만든 다음, 치료제 코어를 미세입자 쉘(shell)로 둘러싸도록, 모노머 또는 올리고머 물질과 같은 상기 전구체 물질을 결정화하거나 가교결합시킴으로써 치료제가 미세입자 쉘 내에 캡슐화된다.
치료제는 미세입자가 형성된 후에 다공성 미세입자의 구멍(pore) 내에 제공되는 것이 바람직하다. 따라서, 먼저 다공성 미세입자를 형성한 다음, 미세입자를 함유하는 용액에 치료제를 제공하여 미세입자의 구멍 내에 치료제가 침투하도록 한다. 이 공정에서 치료제의 일부는 미세입자의 표면에 부착될 수도 있음은 물론이다.
이와 같이, 가교결합되지 않은 다공성 결정형 덱스트란 미세입자를 제조하는 방법은, 덱스트란 수용액과 같은 덱스트란 용액을 제조하는 단계, 결정화 다공성 덱스트란 미세입자를 형성하도록 결정화 공정을 실행하는 단계, 및 필요할 경우, 상기 용액으로부터 결정화 다공성 덱스트란 미세입자를 분리하는 단계를 포함한다. 이어서, 미세입자를 함유하는 결정화 용액 내에 치료제를 제공하거나, 제2 수용액과 같은 제2 용액 내에 상기 분리된 미세입자와 치료제를 제공함으로써, 치료제를 미세입자의 구멍 내에 침투시킨다. 예를 들면, 결정형 덱스트란 미세입자는 2-20 kDa 덱스트란 용액과 같은 제1의 저분자량 덱스트란 수용액 중에 형성될 수 있다. 이어서 상기 제1 용액으로부터 미세입자를 제거한 다음, 40-500 kDa 용액, 예컨대 40-75 kDa 용액과 같은, 고분자량 덱스트란을 함유한 제2 덱스트란 수용액 내에 주입한다. 제2 용액은 2상(two phase) 시스템 중 제1 상을 포함할 수 있고, 이것은 다음으로, 치료제를 함유하는 PET 상과 같은 제2 상과 조합된다. 다른 다공성 미세입자에 있어서도 유사한 방법을 이용할 수 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 결정화를 포함하는 임의의 적합한 미세입자 형성 방법에 의해 다공성 미세입자를 형성한 후에 치료제가 미세입자의 기공 내에 삼투된다. 조성물의 성분들, 예컨대 인슐린, 마이크로입자 및 하나 이상의 수상은 임의의 적합한 순서로 또는 동시에 조합할 수 있다.
바람직하게는, 미세입자는, 유기 용매 및 미세입자에 유기물 잔사를 남기게 되는 유기 반응 촉진제를 함유하지 않는 용액으로부터 자가 조립에 의해 형성된다. 따라서, 예를 들면 덱스트란 미세입자를 덱스트란 수용액으로부터 자가 조립에 의해 형성하는 것이 바람직하다. 그러나, 필요한 경우에, 유기용매 및/또는 유기 반응 촉진제를 사용할 수도 있다. 이 경우, 유해한 유기물 잔사를 제거하기 위해 뒤이어 사용하기 전에 미세입자를 정제할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 제1 상 코어 및 제2 상 벽 또는 쉘을 가진 캡슐 구조가 2상 조성물로부터 생체 내 또는 생체외에서 형성될 수 있다. 상기 조성물은 냉동 건조와 같이 건조분말일 수 있으며, 분말 또는 다공성 케익으로 저장될 수있다. 조성물을 포유류에 투여할 준비가 되면, 조성물을 수화하여 경구 방식으로 또는 주사로 포유류에 투여한다.
바람직하게는, 미세입자와 치료제를 포함하는 상기 조성물은 주사용으로 투약되는 경우, 유동가능한 콜로이드 시스템(flowable colloidal system)이다. 유동가능한 콜로이드 시스템의 예로는 큰 어려움 없이 통상의 게이지 주사기 또는 바늘을 이용하여 포유류에 주사할 수 있는 에멀젼 및 현탁액이 포함된다. 대조적으로, 일부 종래의 조성물은 덱스트란 히드로겔 또는 가교결합 덱스트란 매트릭스 중의 치료제를 포함한다. 덱스트란 히드로겔 및 가교결합 덱스트란 매트릭스는 특수하게 제조하지 않는 한 유동가능한 조성물이 아니다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에 있어서, 미세입자는 포유류의 점막에 접착성이 있는 미세입자를 포함한다. 상기 접착성 미세입자는 앞에서 설명한 다공성 미세입자인 것이 바람직하다. 이것은 치료제의 유효한 전달을 더욱 향상시킨다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에 있어서, 미세입자는, 미세입자 표면에 대한 치료제의 접착성을 높이고 치료제의 전달을 최적화하기 위해 특별히 조절된 표면을 가진 미세입자를 포함한다. 상기 미세입자 표면에 대해 치료제의 접착성을 증가시키는 임의의 적합한 변형이 이루어질 수 있다.
이상과 같은 본 발명의 설명은 예시와 설명을 위해 제시되었다. 이상의 설명이 모든 것을 망라하거나 개시된 엄밀한 형태에 본 발명을 한정하려는 것이 아니며, 전술한 교시를 통해 변형 및 변경이 가능하고, 또는 본 발명의 실시를 통해 변형 및 변경을 이룰 수 있을 것이다. 도면 및 설명은 본 발명의 원리 및 본 발명의 실제적 응용을 설명하기 위해 선택된 것이다. 본 발명의 범위는 첨부하는 청구의 범위 및 그 등가물에 의해 정의되어야 할 것이다.
본원 명세서에 인용된 모든 출판물 및 특허출원 및 특허는 그 전체가 참고로서 본원에 포함된다.
도 1은 분자량 70.0 kDa의 덱스트란 수용액 55.0%(w/w)에서 자연적으로 형성된 결정형 덱스트란 미세입자 사진이다.
도 2A는 도 1에 개시된 결정형 덱스트란 미세입자의 횡단면 사진이다.
도 2B는 도 2A에 개시된 미세입자의 횡단면 사진이다. 상기 미세입자의 미세기공 구조를 볼 수 있다.
도 3은 결정형 덱스트란 미세입자의 응집 사진이다.
도 4는 도 3에 개시된 결정형 덱스트란 미세입자로 이루어진 피하 주사된 임 플란트 사진이다.
도 5는 도 3의 결정형 덱스트란 미세입자로 이루어진 근육내 주사된 임플란트 사진이다.
도 6A, 6B 및 6C는 결정형 덱스트란 미세입자로 이루어진 임플란트가 주사된 마우스 근육의 횡단면 사진이다(각각 주사 후 1일, 4일 및 28일).
도 7A 및 7B는 결정형 덱스트란 미세입자로 이루어진 임플란트가 주사된 마우스 근육의 횡단면 사진이다(주사 후 180일).
도 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F 및 8G는 결정형 덱스트란 미세입자로 이루어진 임플란트가 주사된 마우스 근육의 횡단면 사진이다(각각 주사 후 1일, 4일, 28일, 180일, 180일, 1년 및 1년).
도 9는 마우스 근육 조직에 근육내 주사한 후 14일째에 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 임플란트로부터 형광표지된 거대분자의 느린 방출성을 나타낸 사진이다.
도 10은 임플란트로부터 플라스미드 DNA의 방출 이후 마우스 근육조직에서의 리포터 유전자의 발현을 나타낸 사진이다.
도 11은 도 1의 결정형 덱스트란 미세입자를 함유하는 덱스트란 수용액(분자량 500 kDa)내 PEG 수용액의 에멀젼 사진이다.
도 12는 PEG 수용액에서의 도 1의 결정형 덱스트란 미세입자를 함유하는 덱스트란 수용액(분자량 500 kDa)의 에멀젼 사진이다.
도 13은 도 1의 결정형 덱스트란 미세입자를 함유하는 덱스트란 수용액(분자 량 500 kDa)내의 PEG 수용액 에멀젼의 근육내 주사 사진이다.
도 14는 도 1의 결정형 덱스트란 미세입자를 함유하는 덱스트란 수용액(분자량 500 kDa)의 PEG 수용액 에멀젼의 피하 주사 사진이다.
도 15A 및 15C는 수계 2상계에서 여러가지 형태의 입자와 상 분할(partition)을 개략적으로 도시한 것이다.
도 15B는 2상계를 기초로 한 임플란트 구조의 횡단면 사진이다.
도 16A, 16B, 16C 및 16D는 2상계에서 HeLa 세포와 결정형 덱스트란 미세입자의 분할 사진이다.
도 17 및 18은 본 발명의 실시예에 따른 세포 치료법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 19, 20 및 21은 본 발명의 실시예에 따른 치료제 전달 방법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 22A 및 22B는 시간 대비 다양한 인슐린을 함유한 조성물에 대한 혈당 상대 농도로 표준화한 그래프이다.

Claims (68)

  1. 포유류 체내 또는 신체에 제공되고 생분해성, 생체친화성 3차 구조의 물질을 형성하도록 순응되는 생분해성 및 생체친화성 성분을 포함하는 약학적 유동성 조성물로서, 상기 조성물은 상기 체내 또는 신체에 국부 또는 전신성 치료효과를 제공하기 위한 다상, 유동가능한 콜로이달 시스템 및 치료제를 포함하는, 약학적 유동성 조성물.
  2. 제1상;
    제2상;
    제1상으로 우선적으로 분할되도록 순응된 제1 분자 또는 분자 응집체; 및
    제2상으로 우선적으로 분할되도록 순응된 제2 분자 또는 분자 응집체;
    를 포함하며,
    상기 제2 분자 또는 분자 응집체 그 자체는 상기 조성물이 상기 포유류의 신체에 제공되는 경우 상기 제1 분자 또는 분자 응집체에 인접한 벽을 자가 조립(self assemble)하는 것인, 포유류의 체내 또는 신체에 제공되기 위한 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 콜로이달 시스템은 미세입자를 포함하는 액상 현탁액 또는 에멀젼인 것을 특징으로 하는, 약학적 유동성 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 제1분자 또는 분자 응집체는 치료제를 포함하며;
    제2 분자 또는 분자 응집체는 미세입자를 포함하며;
    상기 벽은 치료제 함유성 코어 주위에 미세입자 쉘을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제 3항 또는 4항에 있어서, 상기 미세입자는 다공성 미세입자이고, 상기 조성물은 포유류의 신체에 주입에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 다공성 미세입자는 중합체 미세입자인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 다공성 미세입자는 평균 직경 0.5 내지 5.0 ㎛의 결정형 덱스트란 미세입자인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물은 미세입자 혼합물을 포함하는 2상 액체 시스템(two-phase system)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 2상 시스템은 생체내 제공시 제1상 코어와 상기 코어를 둘러싼 제2상 쉘을 포함하는 캡슐 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 치료제는 코어 액상으로 선택적으로 분할되고, 상기 미세입자는 쉘 액상으로 선택적으로 분할되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제 8항 내지 10항중 어느 한항에 있어서, 상기 치료제는 펩타이드, 단백질, 핵산, 바이러스, 세포 및 그것의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 제 9항 내지 11항중 어느 한항에 있어서, 상기 코어는 PEG 수성 상과 선택적으로 분할된 인슐린을 포함하고, 상기 쉘은 덱스트란 수성 상과 선택적으로 분할된 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 제 2항에 있어서,
    상기 조성물은 유동성 조성물 또는 수화에 의해 유동성이 인가될 수 있는 건조 조성물을 포함하고;
    상기 제1 분자 또는 분자 응집체는 미세입자, 거대분자, 세포, 리포좀, DNA, 플라스미드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및
    상기 제2 분자 또는 분자 응집체는 미세입자, 거대분자, 세포, 리포좀, DNA, 플라스미드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. 다상 콜로이달 시스템 및 치료제를 포함하는 약학적 유동성 조성물을 형성하는 단계;
    상기 약학적 유동성 조성물을 포유류 신체에 주입하는 단계; 및
    포유류 체내에서 자가 조립에 의해 생분해성 및 생체친화성 구조의 인플란트가 형성되는 단계를 포함하는;
    생체친화적 임플라트의 생체내 형성 방법.
  15. 제1상;
    제2상;
    제1상으로 우선적으로 분할되도록 순응된 제1 분자 또는 분자 응집체; 및
    제2상으로 우선적으로 분할되도록 순응된 제2 분자 또는 분자 응집체;
    를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 단계; 및
    상기 약학적 조성물을, 포유류의 체내 또는 신체에 제공하여 상기 조성물이 상기 포유류의 체내 또는 신체에 제공되는 경우, 상기 제2 분자 또는 분자 응집체 그 자체가 상기 제1 분자 또는 분자 응집체에 인접한 벽을 자가 조립하는 단계를 포함하는,
    포유류의 체내 또는 신체에 약학적 조성물을 제공하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 콜로이달 시스템은 미세입자를 포함하는 액상의 현탁액 또는 에멀젼인 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 제1분자 또는 분자 응집체는 치료제를 포함하며;
    제2 분자 또는 분자 응집체는 미세입자를 포함하며;
    상기 벽은 치료제 함유성 코어 주위에 미세입자 쉘을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제 16항 또는 17항에 있어서, 상기 미세입자는 중합체 미세입자이고, 상기 포유류의 신체는 인간 또는 동물의 신체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 중합체 미세입자는 다공성 미세입자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 다공성 미세입자는 평균 직경 0.5 내지 5.0 ㎛의 결정형 덱스트란 미세입자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제 14항 내지 20항중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물은 미세입자를 포함하는 2상 시스템인 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 2상 시스템은 생체내 제공시 제1상 코어와 상기 코어를 둘러싼 제2상 쉘을 포함하는 캡슐 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 치료제는 코어로 선택적으로 분할되고, 상기 미세입자는 쉘로 선택적으로 분할되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제 21항 내지 23항중 어느 한항에 있어서, 상기 치료제는 펩타이드, 단백질, 핵산, 바이러스 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제 22항 내지 24항중 어느 한항에 있어서, 상기 코어는 PEG와 선택적으로 분할되는 인슐린을 포함하며, 상기 쉘은 덱스트란 수상과 선택적으로 분할된 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제 15항에 있어서,
    상기 조성물은 유동성 조성물 또는 포유류에 제공되기 전에 수화에 의해 유동성이 인가되는 건조 조성물을 포함하며;
    상기 제1 분자 또는 분자 응집체는 미세입자, 거대분자, 세포, 리포좀, DNA, 플라스미드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및
    상기 제2 분자 또는 분자 응집체는 미세입자, 거대분자, 세포, 리포좀, DNA, 플라스미드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  27. 유체내 생분해성 및 생체친화성 미세입자와 표지의 콜로이달 현탁액 또는 에멀젼을 포함하는 유동성 조성물.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 미세입자는 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하며;
    상기 표지는 포유류 체내에 위치하는 경우 조성물로부터 조절가능하게 방출되는 형광 거대분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유동성 조성물.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 콜로이달 현탁액은 선택적으로 분할된 표지를 포함하는 제1상 쉘과 선택적으로 분할된 미세입자를 포함하는 제2상 코어를 가지는 캡슐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유동성 조성물.
  30. 유체내 생분해성 및 생체친화성 미세입자와 표지(label)의 콜로이달 현탁액 또는 에멀젼을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
    상기 약학적 조성물을 포유류의 체내에 도입하는 단계;
    를 포함하는 생체친화성 임플라트의 생체내 형성 방법.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 미세입자는 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하며;
    상기 결정형 덱스트란 미세입자는 포유류의 신체에 생체친화적이며, 포유류의 체내에서 생분해가능하며; 및
    상기 표지는 형광 거대분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체친화성 임플라트의 생체내 형성 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 상기 콜로이달 현탁액은 포유류의 체내로 도입되는 경우 선택적으로 분할된 표지를 포함하는 제1상 코어 및 선택적으로 분할된 미세입자를 포함하는 제2상 쉘을 가지는 캡슐로 자가 조립되는 것을 특징으로 하는, 생체친화성 임플라트의 생체내 형성 방법.
  33. 결정형 덱스트란 미세입자의 캡슐내 함유된 세포를 이를 필요로하는 포유류에 제공하는 단계 또는 결정형 덱스트란 미세입자의 캡슐 외표면을 이를 필요로하는 포유류에 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 치료법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 세포는 캡슐내에 함유되어 상기 세포는 캡슐의 코어를 구성하며, 상기 미세입자는 상기 코어를 둘러싼 쉘을 구성하며; 및
    상기 쉘은 산소와 영양분에 대해 다공성이나 면역계 세포에 대해선 불투과성인 것을 특징으로 하는, 세포 치료법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 세포는 캡슐내로의 혈당 침투에 대한 반응으로 캡슐을 통과하여 포유류의 혈액으로 인슐린을 생성 또는 방출하여 혈당을 강하하는, 인슐린 생성 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 치료법.
  36. 제 34항에 있어서, 상기 세포는 상기 조성물이 투여되는 포유류로부터 유래되지 않은 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 치료법.
  37. 제 33항에 있어서,
    상기 세포는 상기 캡슐의 외표면과 접촉하고;
    상기 세포는 상기 조성물이 투여되는 포유류로부터 유래된 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 치료법.
  38. 다공성 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 골 이식 치환체.
  39. 제 38항에 있어서, 신체 특정 부위에 골 형성을 제공하는 치료제를 미세입자 의 구멍 위치에 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 이식 치환체.
  40. 포유류 신체의 골 이식부에 다공성 결정형 덱스트란 미세입자를 제공하는 단계 및 상기 다고아성 결저아형 덱스트란 미세입자를 포함하는 골 이식 치환체를 형성하는 단계를 포함하는, 골 이식 치환체 형성 방법.
  41. 제 40항에 있어서,
    다공성 결저아형 덱스트란 미세입자 현탁액을 제1 수상으로 제조하는 단계;
    제2 미세입자 현탁액을 제1 수상과 혼화되지 않는 제2 수상으로 제조한는 단계;
    상기 제2 수상은 연속 수상이고 제1 수상은 분산상인 에멀젼을 제조하는 단계; 및
    상기 에멀젼을 포유류 체내에 주입하는 단계;
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 골 이식 치환체 형성 방법.
  42. 제 41항에 있어서,
    상기 제2 미세입자는 세라믹 미세입자를 포함하고; 및
    시네 특정부에 골 형성을 제공하는 치료제가 다공성 결정형 덱스트란 미세입자의 구멍에 위치하는 것을 특징으로 하는, 골 이식 치환체 형성 방법.
  43. 결정형 덱스트란 미세입자를 제공하는 단계; 및
    인슐린 및 결정형 덱스트란 미세입자의 현탁액을 형성하기 위해 상기 미세입자가 결정화된 후에 치료학적 유효량의 인슐린 및 결정형 덱스트란 미세입자를 용액내에서 조합하는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 현탁액을 포유류에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  45. 제 44항에 있어서,
    상기 결정형 덱스트란 미세입자는 평균직경 0.5 내지 5 ㎛의 미세입자를 포함하고;
    상기 미세입자를 제공하는 단계는 비유기성 용매에서 미세입자를 형성하는 것을 포함하고;
    상기 용액은 수용액을 포함하고; 및
    상기 포유류는 인간을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  46. 제 44항에 있어서, 상기 현탁액을 건조하여 결정형 덱스트란 미세입자 및 인슐린을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  47. (a) 유기용매가 결핍된 덱스트란 수용액을 제조하는 단계;
    (b) 실온보다 높은 온도에서 결정화 과정을 실시하여 덱스트란을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 용액으로부터 가교되지 않은 결정형 다공성 덱스트란 미세입자를 분리하는 단계;
    를 포함하는, 가교되지 않은 결정형의 다공성 덱스트란 미세입자를 제조하는 방법.
  48. 제 47항에 있어서,
    상기 덱스트란 용액은 분자량 2 내지 200 kDa의 덱스트란을 포함하며; 및
    상기 결정화 과정은 40 내지 99 ℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 가교되지 않은 결정형의 다공성 덱스트란 미세입자를 제조하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서,
    상기 미세입자는 자연발생적으로 상기 용액에서 형성되며;
    상기 덱스트란 용액은 분자량 20 내지 75 kDa의 덱스트란을 포함하며; 및
    상기 결정화 과정은 40 내지 70 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 가교되지 않은 결정형의 다공성 덱스트란 미세입자를 제조하는 방법.
  50. 제 47항에 있어서, 상기 미세입자는 인슐린과 조합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 가교되지 않은 결정형의 다공성 덱스트란 미세입자를 제조하는 방법.
  51. 형성된 다공성 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하는 현탁액을 제공하는 단계; 및
    치료제를 현탁액에 제공하여 상기 치료제가 상기 다공성 미세입자의 구멍으로 침투되는 단계
    를 포함하는, 미세입자의 구멍에 치료제를 포함하는 다공성 결정형 덱스트란 미세입자를 제조하는 방법.
  52. 제 51항에 있어서, 현탁액을 제공하는 단계는
    덱스트란 수용액을 제조하는 단계;
    결정화 과정을 수행하여 다공성 결정형 덱스트란 미세입자를 형성하는 단계;
    상기 용액에서 미세입자를 분리하는 단계; 및
    치료제를 포함하는 콜로이달 시스템에 미세입자를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세입자의 구멍에 치료제를 포함하는 다공성 결정형 덱스트란 미세입자를 제조하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 치료제는 인슐린이고 상기 콜로이달 시스템은 인슐린ㄹ 및 미세입자를 포함하는 현탁액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세입자의 구멍에 치료제를 포함하는 다공성 결정형 덱스트란 미세입자를 제조하는 방법.
  54. 인슐린 및 다공성 결정형 덱스트란 미세입자를 포함하며, 인슐린 및 미세입자를 조성물로 조합하기 전에 상기 미세입자가 형성된 것을 포함하는, 조성물.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 조성물은 유동성 콜로이달 조성물을 포함하며 상기 미세입자는 평균직경 0.5 내지 5 ㎛의 미세입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  56. 제 54항에 있어서, 상기 인슐린은 결정형 덱스트란 미세입자의 구명에 위치하나 각 미세입자 내부로 캡슐화되지 않은 것을 특징으로 하는, 조성물.
  57. 제 54항에 있어서, 상기 인슐린은 제1 중합체 상으로 선택적으로 분할되고 상기 미세입자는 제2 중합체 상으로 선택적으로 분할되어, 상기 조성물은 포유류의 체내 도입시 구조화된 임플란트를 형성하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  58. 인슐리, 제1 중합체, 제1 중합체와 혼화되지 않는 제2 중합체 및 미세입자를 포함하는, 조성물.
  59. 제 58항에 있어서, 상기 조성물은 유동성 콜로이달 조성물을 포함하고, 상기 미세입자는 평균직경 0.5 내지 5 ㎛의 미세입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  60. 제 59항에 있어서, 상기 제1 중합체는 덱스트란을 포함하고 제2 중합체는 PEG를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  61. 제 60항에 있어서, 상기 인슐린은 PEG 상으로 선택적으로 분할되고 상기 미세입자는 덱스트란 상으로 선택적으로 분할되어, 상기 조성물은 포유류 체내로 도입시 PEG 상 코어 및 덱스트란 상 쉘을 포함하는 구조화된 임플란트를 형성하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  62. 결정형 덱스트란 미세입자와 포유류를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 포유류에 제공하여 포유류의 혈당 강하 단계를 포함하며, 상기 미세입자는 인슐린과 미세입자를 조성물로 조합하기 이전에 형성하는 것인, 포유류의 혈당 강하 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 상기 조성물은 유동성 콜로이달 조성물을 포함하고, 상기 미세입자는 평균직경 0.5 내지 5 ㎛의 미세입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유류의 혈당 강하 방법.
  64. 제 63항에 있어서,
    상기 조성물은 덱스트란 상과 PEG 상으로 구성되는 2상 조성물을 포함하며;
    상기 인슐린을 PEG 상으로 선택적으로 분할되고 상기 미세입자는 덱스트란 상으로 선택적으로 분할되며; 및
    상기 조성물은 포유류 체내로 도입된 후 PEG 상 코어 및 덱스트란 상 쉘로 구성되는 구조화된 임플란트를 형성하는 것을 특징으로 하는, 포유류의 혈당 강하 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 상기 조성물을 투여받은 포유류의 신체를 토대로 쉘 두께를 조절함으로써 임플란트로부터 인슐린의 방출을 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유류의 혈당 강하 방법.
  66. 제 62항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨병이 있는 인간에게 제공하여 인간의 혈당을 강하하는 것을 특징으로 하는, 포유류의 혈당 강하 방법.
  67. 흡입에 의해 약학적 조성물의 투여량을 포유류에게 투여하기 위해 개조된 용기; 및
    상기 용기에 위치되는, 결정형 덱스트란 미세입자와 치료학적 유효량의 인슐린을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는, 흡입기.
  68. 포유류의 혈당을 강하하기 위하여, 결정형 덱스트란 미세입자 및 인슐린을 포함하는 치료학적 유효량의 조성물을 포유류에 흡입으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류의 혈당 강하 방법.
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