CZ389797A3

CZ389797A3 - Peptidy a sloučeniny schopné vazby na receptor thrombopoetinu

Info

Publication number: CZ389797A3
Application number: CZ973897A
Authority: CZ
Inventors: William J. Dower; Ronald W. Barrett; Stevan E. Cwirla; David J. Duffin; Christian M. Gates; Sherril S. Haselden; Larry C. Mattheakis; Peter Schatz; Christopher R. Wagstrom; Nicholas C. Wrighton
Original assignee: Glaxo Group Limited
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1998-06-17
Also published as: CA2636432A1; NZ310778A; WO1996040750A1; AR003431A1; CA2636432C; NO20041296L; KR100436680B1; NO975705D0; TW518341B; EP0885242A4; DK0885242T3; PL323917A1; CN1192749A; CA2223449C; DE69637473T2; MX9709315A; NO317737B1; ZA964814B; CA2223449A1; EA199700359A1

Description

Peptidy a sloučeniny schopné vazby na receptor trombo poeti nu

Oblast techniky

Předkládaný vynález poskytuje peptidy a sloučeniny, které se s vážou na trombopoetinový receptor a aktivují jej (c-mpl nebo TPO-R) nebo jinak působí jako agonisté TPO. Vynález má použití v oblasti biochemie a lékařské chemie a poskytuje zvláště agonisty TPO pro použití při léčení onemocnění člověka.

Dosavadní stav techniky

Tato přihláška navazuje na US patentovou přihlášku No.

08/485,301 ze 7. června 1995 a US patentovou přihlášku No. 08/478,128 ze 7. června 1995, jejichž obsah se zde uvádí jako referenční.

Megakaryocyty jsou buňky odvozené z kostní dřeně, odpovědné is za produkci cirkulujících krevních destiček. Ačkoliv představují <0,25% kostní dřeně u většiny druhů, mají >10 x větší objem než typická buňka kostní dřeně (viz Kuter a další, Proč, Nati. Acad. Sci. USA. 91: 11104 - 11108 (1994). Megakaryocyty podléhají procesu známému jako endomitóza, při kterém se replikují jejich jádra, ale 2o neprobíhá buněčné dělení, čímž vznikají polyploidní buňky. Jako odpověď na snížený počet krevních destiček vzrůstá četnost endomitózy, vytvářejí se výšeploídní megakaryocyty a počet megakaryocytú může až trojnásobně stoupnout (viz Harker, J. Clin. Invest., 47: 458 - 465 (1968). Naopak když se počet krevních destiček as zvýší, četnost endomitózy klesá, vytvářejí se nížeploidní megakaryocyty a počet megakaryocytú může poklesnout o 50 %.

Přesný fyziologický zpětnovazebný mechanismus, kterým hmota cirkulujících destiček reguluje rychlost endomitózy a počet • * · · · · · · ·

V « · · ♦ * « « · * ·♦ _v ·* · · * · ♦ • · · · · · «· «· ·· · · 2 * ” megakaryocytů kostní dřeně není znám. Za cirkulující trombopoetický faktor, který má zprostředkující funkci v této zpětnovazební smyčce, je nyní pokládán trombopoetin (TPO). Ukázalo se zvláště, že TPO je hlavním humorálním regulátorem v situacích zahrnujících trombocytopenii (viz např. Metcalf, Nátuře, 369: 519 - 520 (1994). Ukázalo se, že v několika studiích zvyšoval TPO u pokusných zvířat počet krevních destiček, velikost krevních destiček a inkorporaci izotopu do destiček. Konkrétně se předpokládá, že TPO ovlivňuje megakaryocytopoézu několika způsoby: (1) zvyšuje velikost a počet megakaryocytů; (2) zvyšuje obsah DNA v megakaryocytech ve formě polyploidie; (3) zvyšuje endomitózu megakaryocytů; (4) zvyšuje maturaci (zralost) megakaryocytů; a (5) zvyšuje procento prekurzorových buněk ve formě malých buněk acetylcholinesteráza pozitivních v kostní dřeni.

Protože krevní destičky (trombocyty) jsou nezbytné pro srážení krve a pokud je jejich počet velmi nízký, pacient je ve vážném nebezpečí smrti způsobené masívním krvácením, TPO je potenciálně použitelný jak při diagnóze, tak i léčení různých hematologických poruch, například onemocnění způsobených primárně defekty krevních destiček. Začínající klinické pokusy s TPO ukázaly, že TPO je možno bezpečně podávat pacientům. Navíc poskytly poslední studie základ pro účinnou terapii TPO při léčení trombocytopenie, a zvláště trombocytopenie v důsledku chemoterapie, radiační terapie nebo transplantace kostní dřeně při léčbě nádoru nebo lymfomu. (Viz např. McDonald (1992), Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14: 8 - 21 (1992).

Gen kódující TPO byl klonován a charakterizován (viz Kuter a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA. 91: 11104 - 11108 (1994); Barley a další, Cell. 77: 1117 - 1124 (1994); Kaushansky a další, Nátuře, 369: 568 - 571 (1994); Wendling a další, Nátuře. 369: 571 - 574 (1994); a Sauvage a další, Nátuře. 369: 533 - 538 (1994). Trombopoetin je glykoprotein, který má alespoň dvě formy se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 25 kDa a 31 kDa se společnou sekvencí N-koncových aminokyselin (viz Bartley a další, Cell, 77: 1117 - 1124 (1994). Trombopoetin se zdá mít dvě rozdílné oblasti oddělené potenciálním štěpícím místem Arg-Arg. Aminokoncová oblast je u člověka a myši vysoce konzervována a má určitou homologii s erytropoetinem a interferonem-a a interferonem-b. Karboxylová koncová oblast vykazuje širokou mezidruhovou divergenci.

Byly popsány sekvence DNA a jimi kódované peptidové sekvence u lidského TPO-R (znám také jako c-mpl) (viz Vigon a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5640 - 5644 (1992). TPO-R je členem rodiny hematopoetinového receptoru růstového faktoru, která je charakterizována společným strukturním návrhem extracelulární domény včetně čtyř konzervovaných zbytků C v N-koncové oblasti a motivu WSXWS těsně u transmembránové oblasti (viz Bazan, Proč. Nati. Acad, Sci. USA, 87: 6934 - 6938 (1990). Důkazem skutečnosti, že tento receptor má funkční úlohu při hematopoéze, jsou pozorování, že jeho exprese se omezuje na slezinu, kostní dřeň nebo fetální játra u myši (viz Souyri a další, Cell, 63: 1137 - 1147 (1990) a na megakaryocyty, destičky a buňky CD34⁺ u člověka (viz Methia a další, Blood, 82: 1395 - 1401 (1993). Navíc expozice buněk CD34* syntetickým oligonukleotidům pozitivním vzhledem k mpl RNA výrazně inhibuje výskyt kolonií megakaryocytú bez ovlivnění tvorby erytroidních nebo myeloidních kolonií. Někteří pracovníci uvádějí, že receptor funguje jako homodymer podobně jako je tomu v situaci s receptory pro G-CSF a erytropoetin.

Dostupnost klonovaných genů pro TPO-R umožňuje hledání agonistů tohoto důležitého receptoru. Dostupnost rekombinantního receptorového proteinu umožňuje studium interakce receptor - ligand v řadě systémů pro vytváření náhodné a semináhodné rozdílnosti peptidů. Tyto systémy používají systém „peptidy na plazmidech“ • · · · ·· · «

(peptides on plasmides) popisovaný v US patentech No, 5,270,170 a 5,338,665, systém „peptidy na fágu“ (peptides on phage) popisovaný v US patentové přihlášce No. 07/718,577 z 20. 6. 1991, US patentové přihlášce No. 07/541,108 z 20, 6. 1990 a v Cwirla a další, Proč, Nati. Acad. Sci, USA, 87: 6378 - 6382 (1990); systém „polysom“ popisovaný v US patentové přihlášce No. 08/300,262 z 2. 9. 1994, který navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/144,775 z 29. 10, 1993 a PCT WO 95/11992; systém „kódované syntetické knihovny“ (encoded synthetic library) popisovaný v US patentových přihláškách No. 08/146,886 z 12. 11. 1993, 07/946,239 z 16. 9. 1992 a 07/762,522 z 18. 9. 1991; a systém „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ (very large scale immobilized polymer synthesis) popisovaný v US patentu No. 5,143,854; zveřejnění PCT patentu No, 90/15070, zveřejněn

13. 12. 1990; US patentové přihlášce No. 07/624,120 z 6. 12. 1990, Fodor a další, Science, 251: 767 - 773 (2/1991); Dower a Fodor, Ann Rep. Med. Chem.. 26: 271 - 180 (1991); a US patentové přihlášce No. 07/805,727 z 6. 12. 1991; přičemž uvedené patentové přihlášky a publikace se zde uvádějí jako referenční.

Vážným problémem u pacientů trpících trombocytopenií je pomalý návrat hladin krevních destiček, a proto se stalo urgentním hledání agonistů krevních růstových faktorů schopných urychlit regeneraci destiček. Předkládaný vynález takového agonistů popisuje.

Podstata vynálezu

Vynález je v jedné části zaměřen na nový a neočekávaný objev, že definované peptidy s nízkou molekulovou hmotností a látky napodobující peptidy, mají silné vazebné schopnosti vůči TPO-R a mohou TPO-R aktivovat. Tyto peptidy a látky napodobující peptidy jsou tedy použitelné pro terapeutické účely při léčení stavů podmíněných TPO (např. trombocytopenie v důsledku chemoterapie, « *

-5- .....

radiační terapie nebo transfuze kostní dřeně), stejně jako pro diagnostické účely při studiu mechanismu hematopoézy a pro expanzi megakaryocytů a ohrožených buněk předchůdců.

Peptidy a peptidy napodobující látky vhodné pro terapeutické a/nebo diagnostické účely mají IC₅₀ přibližně 2 mM nebo nižší při stanovení vazebné afinity testem uvedeným v příkladu 3 níže, kde nižší IC₅₀ koreluje se silnější vazebnou afinitou vůči TPO-R. Pro farmaceutické účely mají peptidy a peptidomimetické látky s výhodou IC50 ne větší než přibližně 100 μΜ, výhodněji ne více než 500 nM. Ve výhodném provedení je molekulová hmotnost peptidu nebo peptid napodobující látky od přibližně 250 do přibližně 8000 daltonů.

Při používání pro diagnostické účely se peptidy a peptidy napodobující látky s výhodou značí detekovatelným markérem a peptidy a peptidy napodobující látky bez takového označení tedy slouží jako meziprodukty při přípravě značených peptidú a peptidy napodobujících látek.

Peptidy splňující definovaná kritéria pro molekulovou hmotnost a vazebnou afinitu vůči TPO-R obsahují 9 nebo více aminokyselin, které se vyskytují v přírodě nebo jsou syntetické. Peptidy napodobující látky zahrnují peptidy s jednou nebo více následujícími modifikacemi:

peptidy, kde jedna nebo více peptidických vazeb (-C(O)NR-j byla nahrazena nepeptidickým spojením jako je spojení -CH₂-karbamát [-CH₂-OC(O)NR-]; fosfonátová vazba; vazba -CH₂-sulfonamid [-CH₂S(O)₂NR-j; močovinová vazba [-NHC(O)NH-]; vazba -CH₂-sekundární amin; nebo alkylovaná peptidylová vazba (-C(O)NR⁶-, kde R⁶ znamená nižší alkyl];

peptidy, u kterých N-konec je derivatizován na skupinu -NRR¹; skupinu -NRC(O)R; skupinu -NRC(O)OR; skupinu -NRS(O)₂R; skupinu -NHC(O)NHR, kde R a R¹ znamenají atom vodíku nebo nižší alkyl za podmínky, že R a R¹ nejsou oba atomy vodíku; sukcinimidovou skupinu; skupinu benzyloxykarbonyl-NH- (CBZ-NH-); nebo skupinu

-6 benzyloxykarbonyl-NH- s 1 až 3 substituenty na fenylovém kruhu zvolenými ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo; nebo peptidy, kde C-konec je derivatizován na skupinu -C(O)R², kde R² je zvolen ze skupiny nižší alkoxy, a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl.

Výhodné peptidy a peptidy napodobující látky tedy s výhodou zahrnují sloučeniny:

(1) s molekulovou hmotností méně než přibližně 5000 daltonů, a (2) s vazebnou afinitou vůči TPO-R vyjádřenou jako IC50 ne větší než 100 μΜ, kde žádná až všechny vazby -C(O)NH- peptidu byly nahrazeny vazbami zvolenými ze skupiny:

-CH₂OC(O)NR-; fosfonátová vazba; vazba -CH₂S(O)₂NR-; vazba -CH₂NR-; a vazba -C(0)NR⁸-; a vazba -NHC(O)NH-, kde R znamená atom vodíku nebo nižší alkyl a R⁶ je nižší alkyl, dále kde N-konec uvedeného peptidu nebo látky napodobující peptid je zvolen ze skupiny -NRR¹; skupiny -NRC(O)R; skupiny NRC(O)OR; skupiny -NRS(O)₂R; skupiny -NHC(O)NHR; sukcinimidové skupiny; skupiny benzyloxykarbonyl-NH-; a skupiny benzyloxykarbonyl-NH- s 1 až 3 substituenty na fenylovém kruhu, zvolenými ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo, kde R a R¹ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl, a ještě dále kde C-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky má vzorec -C(O)R², kde R² je zvolen ze skupiny hydroxy, nižší alkoxy, a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl a atom dusíku nebo skupina -NR R může být popřípadě aminová skupina N-konce peptidu, takže dojde k vytvoření cyklického peptidu, a jejich fyziologicky přijatelné soli.

• · *

V dalším provedení je vynález zaměřen na značený peptid nebo látku napodobující peptid obsahující peptid nebo látku napodobující peptid uvedené dříve, které mají na sebe kovalentně navázán markér schopný detekce. V některých provedeních vynálezu zahrnují výhodné peptidy strukturu jádra obsahující sekvenci aminokyselin:

X, X₂ X3 X₄ X5 Xe X?

kde Xi znamená C, L, Μ, P, Q, V; X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo'V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a X? znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V.

Ve výhodném provedení obsahuje jádro peptidů sekvenci aminokyselin:

X₈ G X1 X₂ X₃ X₄ X₅ W X₇ kde X1 znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X₂ znamená F, R, S nebo T; X₃ znamená F, L, V, nebo W; X₄ znamená A, K, L, M, R, S, V, nebo T; X₅ znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; X₇ znamená C, I, K, L, M nebo V; a každý ze zbytků X₈ je nezávisle na sobě zvolen z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin, jejich stereoizomerních Daminokyselin a nepřírodních aminokyselin. S výhodou je každý zbytek X_a nezávisle zvolen z jakýchkoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin a jejich stereoizomerních D-aminokyselin. Ve výhodném provedení X1 znamená P; X₂ znamená T; X₃ znamená L; X₄ znamená R; X₅ znamená E nebo Q; a X₇ znamená I nebo L.

Výhodněji obsahuje jádro peptidů sekvenci aminokyselin:

X₉ X_e G X1 X₂ X₃ X₄ X₅ W X₇ kde X₉ znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V; a X₈znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V. Výhodněji je skupina Xg A nebo I; a X₈ znamená D, E, nebo K.

« · • ·

- 8 Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCADGPTLREWISF CGG;GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTL REWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;SlEG PTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLHGNGRD T;CADGPTLREWISFC;alEGPTLRQWLAARA.

V dalším provedení vynálezu zahrnují výhodné peptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu peptidy se strukturou jádra obsahující- sekvenci aminokyselin:

C X₂ X₃ X₄ X_s X₆ Xz kde X₂ znamená K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S nebo V; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X5 znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X₆ znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V. Ve výhodnějším provedení znamená X₄ A, E, G, Η, K, L, Μ, P, Q, R, S, T nebo W. V dalším provedení X₂ je S nebo T; X₃ je L nebo R; X₄ je R; X_s je D, E, nebo G; X₆ je F, L, nebo W; a X₇ je I, K, L, R, nebo V. Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCTLREWLHGGFCGG.

V dalším provedení jsou výhodnými peptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu peptidy se strukturou obsahující sekvenci aminokyselin:

X₃ C X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ X₇ kde X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R. S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X₅ je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ je C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ je C, G, I, K, L, Μ, N, R, nebo V; a X_e je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin. V některých provedeních je X₈ s výhodou G, S, Y, nebo R.

Zde popisované sloučeniny jsou použitelné pro prevenci a léčení onemocnění podmíněných TPO a zvláště pro léčení hematologických poruch, včetně bez omezení trombocytopenie • · • © · ♦ · · · ♦· . «· · · · · · · ·· *©· · * · · ·· g „ ··* .. ·· *· v důsledku chemoterapie, radiační terapie nebo transfuzí kostní dřeně. Předkládaný vynález tedy poskytuje také způsob léčení, při kterém se pacientovi s poruchou, která je vnímavá léčení agonistou TPO, podává terapeuticky účinná dávka nebo množství sloučeniny podle 5 předkládaného vynálezu.

Vynález také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující jednu nebo více výše popsaných sloučenin a fyziologicky přijatelný nosič. Tyto farmaceutické prostředky mohou mít řadu forem včetně orálních dávkovačích forem stejně jako inhalovatelných prášků 10 a roztoků a roztoků pro injekce a infuze.

Popis konkrétních provedení

I. Definice a obecné parametry

Následující definice se uvádějí pro ilustraci a definují význam a 15 rámec různých termínů, které se zde používají při popisu vynálezu.

„Agonista“ označuje biologicky aktivní ligand, který se váže na svůj komplementární biologicky aktivní receptor a aktivuje jej za vyvolání biologické odpovědi receptoru nebo za zvýšení již existující biologické aktivity receptoru.

„Farmaceuticky přijatelné soli“ označují netoxický alkalický kov, kov alkalické zeminy a amonné soli běžně používané ve farmaceutickém průmyslu včetně sodíku, draslíku, lithia, vápníku, hořčíku, barya, amonia a protaminových zinkových solí, které se připravují v oboru známými způsoby. Termín také zahrnuje netoxické adiční soli s kyselinami, které se obvykle připravují reakcí sloučenin podle vynálezu s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou. Představiteli těchto solí jsou chlorid, bromid, sulfát, bisulfát, acetát, oxalát, valerát, oleát, laurát, borát, benzoát, laktát, fosfát, tosylát, citrát, maleát, fumarát, sukcinát, vínan, napsylát apod.

• ·

„Farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou“ označuje takové soli, které si zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti volných bází a které nejsou biologicky nebo jinak nežádoucí, vytvořené s anorganickými kyselinami, jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, dusičná, fosforečná apod. a organickými kyselinami, jako je kyselina octová, propionová, glykolová, pyrohroznová, oxalová, jablečná, malonová, jantarová, maleinová, fumarová, vinná, citrónová, benzoová, skořicová, mandlová, metansulfonová, ethansulfonová, p-toluensulfonová, salycilová apod. Pro popis farmaceuticky přijatelných adičních solí s kyselinami jako prekurzorů je možno nalézt informace v Bundgaard, H., výše.

„Farmaceuticky přijatelný ester“ označuje takové estery, které po hydrolýze esterové vazby zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti karboxylové kyseliny nebo alkoholu a nejsou biologicky nebo jiným způsobem nežádoucí. Popis farmaceuticky přijatelných esterů jako prekurzorů se uvádí v Bundgaard, Hl, red., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Tyto estery se typicky tvoří z odpovídající karboaxylové kyseliny a alkoholu. Obecně je možno tvorbu esterů provádět běžnými způsoby syntézy (viz např. March, Advanced Organic Chemistry, 3. vyd., John Wiley & Sohs, New York (1985) str. 1157 a tam uvedené odkazy a Mark a další, Encvclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, New York (1980). Alkoholová složka esteru bude obvykle obsahovat (i) C₂- Ci₂ alifatický alkohol, který může nebo nemusí obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb a může nebo nemusí obsahovat rozvětvený uhlíkový řetězec nebo (ii) C₇ - C₁₂ aromatický nebo heteroaromatický alkohol. Tento vynález také předpokládá použití takových sloučenin, které jsou jak zde popisovanými estery, tak současně jejich farmaceuticky přijatelnými adičními solemi s kyselinami.

* * φ φ

-11 „Farmaceuticky přijatelný amid“ označuje amidy, které po hydrolýze amidové vazby zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti karboxylové kyseliny nebo aminu a nejsou biologicky nebo jiným způsobem nežádoucí. Popis farmaceuticky přijatelných amidů 5 jako prekurzorů léčiv je možno nalézt v Bundgaard, H., vyd. Design of Prodrugs. Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Tyto amidy se typicky vytvářejí z odpovídající amidové kyseliny a aminu. Amidy je možno obecně vytvářet běžnými způsoby syntéz (viz např. March Advanced Orqanic Chemistry, 3. vyd., John Wiley & Sons, New York io (1985) str. 1152 a Mark a další, Encvclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980).

Tento vynález také předpokládá použití takových sloučenin, které jsou jak amidy, jak se zde popisují, tak i současně jejich farmaceuticky přijatelnými adičními solemi s kyselinami.

„Farmaceuticky nebo terapeuticky přijatelný nosič“ označuje nosné médium, které neinterferuje s účinností biologické aktivity aktivních sloučenin, a které není toxické pro hostitele nebo pacienta.

„Stereoizomer“ označuje chemickou sloučeninu se stejnou molekulovou hmotností, chemickým složením a uspořádáním jako jiná 20 sloučenina, ale s odlišně seskupenými atomy. To znamená, že jsou stejné chemické skupiny rozdílně orientovány v prostoru a proto mají v čistém stavu . Některé čisté stereoizomery však mohou mít optickou rotaci tak malou, že je současnými přístroji nedetekovatelná. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou mít jeden nebo více 25 asymetrických atomů uhlíku, a proto zahrnují různé stereoizomery. Všechny stereoizomery se zahrnují do rámce předkládaného vynálezu.

„Terapeuticky nebo farmaceuticky účinné množství“ se používá pro sloučeniny podle předkládaného vynálezu a označuje množství sloučeniny dostatečné pro indukci požadované biologické odpovědi.

3o Tato odpověď může být zmírnění příznaků nebo příčin onemocnění nebo jakákoliv jiná požadovaná změna biologického systému.

• * ··

.. .......

- 12V předkládaném vynálezu bude výsledek typicky zahrnovat snížení imunologické a/nebo zánětlívé odezvy na infekci při poranění tkáně.

Zbytky aminokyselin v peptidech se zkracují následujícím způsobem: fenylalanin je Phe nebo F; leucin je Leu nebo L; izoleucin je Ile nebo I; methionin je Met nebo M; valin je Val nebo V; serin je Ser nebo S; prolin je Pro nebo P; threonin je Thr nebo T; alanin je Ala nebo A; tyrozin je Tyr nebo Y; histidin je His nebo H; glutamin je Gin nebo Q; asparagin je Asn nebo N; lyzin je Lys nebo K; kyselina asparagová je Asp nebo D; kyselina glutamová je Glu nebo E; cystein je Cys nebo C; tryptofan je Trp nebo W; arginin je Arg nebo R; glycin je Gly nebo G. Dále Bu znamená butoxy, Bzl je benzyl, CHA je cyklohexylamin, Ac je acetyl, Me je methyl, Pen je penicilamin, Aib je kyselina aminoizomáselná, Nva je norvalin, Abu je kyselina aminomáselná, Thi je thienylalanin, OBn je O-benzyl, a hyp je hydroxyprolín.

Navíc k peptidům obsahujícím pouze v přírodě se vyskytující aminokyseliny mohou být také poskytnuty analogy peptidů nebo peptidy napodobující látky (peptidomimetika). Analogy peptidů se obvykle používají ve farmaceutickém průmyslu jako nepeptidová léčiva s vlastnostmi analogickými k vlastnostem templátového peptidů. Tyto typy nepeptidových sloučenin se označují jako „peptidomimetika“ nebo „peptidy napodobující látky“ (Fauchere, J., Adv. Druo Res., 15: 29 (1986); Veber a Freidinger, TINS. str. 392 (1985); a Evans a další, J. Med. Chem., 30: 1229 (1987). Peptidy napodobující sloučeniny, které mají podobnou strukturu jako terapeuticky použitelné peptidy, mohou být použity pro získání stejného nebo zvýšeného terapeutického nebo profylaktického účinku. Obecně jsou peptidy napodobující sloučeniny podobné vzorovému polypeptidu (tj. polypeptidu, který má biologickou nebo farmakologickou účinnost), jako jsou v přírodě se vyskytující polypeptidy, vážící se na receptor, ale mají jednu nebo více • · · «» ··· ··

- 13 peptidových vazeb, popřípadě nahrazenu vazbou zvolenou ze skupiny: -CH₂OH₂-, CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (cis a trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- a -CH₂S0-, některým ze způsobů známých ze stavu techniky a dále popisovaných v následujících odkazech: Spatola, A.

F., Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and

Proteins, B. Weinstein, red., Marcel Dekker, New York, str. 267 (1983); Spatola, A. F., Veqa Data (březen 1983), díl 1, vyd. 3, Peptide Backbone Modifications (obecný přehled); Morley, Trends Pharm. Sci. (1980), str. 463 - 468 (obecný přehled); Hudson, D. a další, Int. J. w Pept. Prot. Res.. 14: 177 - 185 (1979) (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola a další, Life Sci.. 38: 1243 - 1249 (1986) (-CH₂-S); Hann, J. Chem. Soc.

Perkin Trans. I. 307 - 314 (1982) (-CH=CH-, cis a trans); Almquist a další, J. Med. Chem. (23: 1392 - 1398 (1980) (-COCH₂-); JenningsWhite a další, Tetrahedron Lett., 23: 2533 (1982) (-COCH₂-); Szelke a 15 další, evropská patentová přihláška EP 45665 CA (1982): 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH₂-); Holladay a další, Tetrahedron Lett., 24: 4401 4404 (1983) (-C(OH)CH₂); a Hrubý, Life Sci., 31: 189 - 199 (1982) (-CH₂-S-); které se zde všechny uvádějí jako referenční. Zvláště výhodnou nepeptidovou vazbou je -CH₂NH-. Tyto peptidy napodobující 20 látky mohou mít významné výhody proti provedením polypeptidů, například: ekonomičtější výroba, lepší chemická stabilita, zlepšené farmakologické vlastnosti (poločas, absorpce, schopnost působit, účinnost apod.), změněná specificita (např. šířka spektra biologického účinku), snížená antigenicita a další. Značení peptidy napodobujících 25 látek obvykle zahrnuje připojení jednoho nebo více markérů, přímo nebo prostřednictvím můstku (spacer) (např. amidové skupiny) na neinterferující polohu (polohy) peptid napodobující látky, která se předem určí pomocí kvantitativních dat struktura - účinnost a/nebo molekulárního modelování. Takovými neinterferujícími polohami jsou 30 polohy, které nevytvářejí přímé kontakty s makromolekulou (makromolekulami) (například molekuly širší rodiny imunoglobulinů), ke kterým se peptid napodobující sloučenina váže za dosažení • ••to • to ·· ··· ·· ··

- 14 terapeutického účinku. Derivatizace (například značení) peptidy napodobujících látek by v podstatě neměla interferovat s požadovanou biologickou nebo farmakologickou účinností peptid napodobující látky. Obvykle se peptid napodobující látky peptidů vážících se na receptoru 5 váží na receptor s vysokou afinitou a mají zjistitelnou biologickou účinnost (tj. agonistickou nebo antagonistickou k jedné nebo více receptorem podmíněných fenotypových změn.

Systematické nahrazování jedné nebo více aminokyselin obvyklé sekvence D-aminokyselinou stejného typu (například D-lyzin 10 namísto L-lyzinu) může být použito pro vytváření stabilnějších peptidů. Navíc mohou být v oboru známými metodami (Rizo a Gierasch, Ann. Rev. Biochem.. 61: 387 (1992) generovány uzavřené peptidy obsahující konvenční sekvenci nebo variaci v podstatě identickou s konvenční sekvencí; například přídavkem vnitřních cysteinových 15 zbytků schopných vytvářet intramolekulární disulfidické můstky, které peptid cyklizují.

Syntetické aminokyseliny nebo v přírodě se nevyskytující aminokyseliny označují aminokyseliny, které se nevyskytují v přírodě in vivo, ale které mohou být přesto začleněny do zde popisovaných 20 struktur peptidů. Výhodnými syntetickými aminokyselinami jsou D-aaminokyseliny v přírodě se vyskytujících L-a-aminokyselin stejně jako v přírodě se nevyskytující D- a L-a-aminokyseliny představované vzorcem H₂NCHR⁵COOH, kde R^s je 1) skupina nižšího alkylu, 2) cykloalkylové skupina složená ze 3 až 7 atomů uhlíku, 3) heterocykl ze 25 3 až 7 atomů uhlíku a 1 až 2 heteroatomů zvolených z atomů kyslíku, síry a dusíku, 4) aromatický zbytek tvořený 6 až 10 atomy uhlíku, popřípadě s 1 až 3 substituenty na aromatickém jádře, zvolenými ze skupiny hydroxyl, nižší alkoxylová, aminová a karboxylová skupina, 5) -alkylen-Y, kde alkylen je alkylenová skupina tvořená 1 až 7 atomy 30 uhlíku a Y je zvoleno ze skupiny (a) hydroxylové, (b) aminové, (c) cykloalkylové a cykloalkenylové složených ze 3 až 7 atomů uhlíku, • * · · · ·

(d) arylové složené ze 6 až 10 atomů uhlíku, popřípadě s 1 až 3 substituenty na aromatickém jádře, zvolenými ze skupiny hydroxyl, nižší alkoxy, amino a karboxyl, (e) heterocyklické složené z 3 až 7 atomů uhlíku a 1 až 2 heteroatomů zvolených ze skupiny kyslíku, síry a dusíku, (f) -C(0)R², kde R² je zvoleno ze skupiny atom vodíku, hydroxyl, nižší alkyl, nižší alkoxyl a skupina -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě zvoleny ze skupiny atom vodíku nebo nižší alkyl, (g) skupiny -S(O)_nR⁶, kde n je celé číslo od 1 do 2 a R^s je nižší alkyl a s podmínkou, že R⁵ nedefinuje postranní řetězec v přírodě se vyskytující aminokyseliny.

Další výhodné syntetické aminokyseliny zahrnují aminokyseliny, u kterých je aminoskupina oddělena od karboxylové skupiny více než jedním atomem uhlíku, jako je b-alanin, kyselina g-aminomáselná apod.

Zvláště výhodnými syntetickými aminokyselinami jsou například D-aminokyseliny, v přírodě se vyskytujících L-aminokyselin, L-1naftylalanin, L-2-naftylalanin, L-cyklohexylalanin, kyselina L-2aminoizomáselná, sulfoxidové a sulfonové deriváty methionínu (tj. HOOC-(H₂NCH)CH₂CK₂-S(O)_nR⁶), kde n a R⁶ jsou jak definováno výše, stejně jako nižší alkoxylový derivát methionínu (tj. HOOC(H₂NCH)CH₂CH₂-OR⁶, kde R⁶ je jak definováno výše).

„Detekovatelný markér“ označuje materiály, které při kovalentním navázání na peptidy a peptid napodobující látky podle vynálezu umožní detekci peptidu a peptid napodobující látky in vivo u pacienta, kterému byl peptid nebo peptid napodobující látka podán. Vhodnými detekovatelnými markéry jsou látky v oboru dobře známé, například radioizotopy, fluorescenční markéry (např. fluorescein) apod. Konkrétní použitý detekovatelný markér není kritický a volí se podle množství markéru, který má být použit, stejně jako jeho toxicity v použitém množství. Volba markéru vzhledem k těmto faktorům spadá do rámce znalostí v oboru.

Kovalentní připojení detekovatelného markéru k peptidu nebo peptid napodobující látce se provádí běžnými známými postupy. Když se například použije jako detekovatelný markér radioizotop ¹²⁵1, kovalentního připojení ¹²⁵1 k peptidu nebo peptid napodobující látce, může být provedeno zavedením aminokyseliny tyrozinu do peptidu nebo peptid napodobující látky a následnou jodací látky. Jestliže není tyrozin v peptidu nebo peptid napodobující látce přítomen, může být provedena v oboru známými způsoby inkorporace tyrozinu na N nebo C-konec peptidu nebo peptid napodobující látky. Podobně může být do peptidu nebo peptid napodobující látky ve formě fosfátové skupiny inkorporován ³²P, například prostřednictvím hydroxylové skupiny na peptidu nebo peptid napodobující látce, s použitím běžné chemické reakce.

II. Přehled

Předkládaný vynález poskytuje sloučeniny, které se vážou na TPO-R a aktivují jej, nebo se jinak chovají jako agonisté TPO. Tyto sloučeniny obsahují „vzorové“ peptidové sloučeniny a „odvozené sloučeniny“ konstruované tak, aby měly stejnou nebo podobnou molekulární strukturu nebo tvar jako vzorové sloučeniny, ale odlišné od vzorových sloučenin buď s ohledem na vnímavost k hydrolýze nebo proteolýze a/nebo na jiné biologické vlastnosti, jako je zvýšená afinita k receptoru. Předkládaný vynález také poskytuje prostředky obsahující účinné množství agonisty TPO a zvláště prostředek, který je použitelný hematologických poruch, zvláště trombocytopenie spojené s chemoterapií, radiační terapií nebo transfuzemi kostní dřeně.

• ··· • · « ·· *

III. Identifikace agonistů TPO

Peptidy s vazebnou afinitou k TPO-R mohou být snadno identifikovány vytvářením systémů s náhodnou různorodostí peptidů spojených s postupem afinitního obohacování.

Systémy pro vytváření náhodné různorodosti peptidů konkrétně zahrnují systém „peptidy na plazmidech“, popsaný v US patentech No. 5,270,170 a 5,338,665; systém „peptidy na fágu“, popsaný v US patentové'přihlášce No. 07/718,577 z 20. 6. 1991, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 07/541,108 z 20. 6. 1990 a v Cwirla a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 87: 6378 - 6382 (1980); „polyzomový systém“ popisovaný v US patentové přihlášce No. 08/300,262 z 2. 9. 1994, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/144,775 z 29. 10. 1993 a PCT WO 95/11992; systém „kódované syntetické knihovny“ (ESL) popisovaný v US patentové přihlášce No. 08/146,886 z 12. 11. 1993, navazující na US patentovou přihlášku No. 07/946,239 z 16. 9. 1992, navazující na US patentovou přihlášku No. 07/762,522 z 18. 9. 1991; a systém „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ (very large scale immobilized polymer synthesis) popisovaný v US patentu No. 5,143,854; zveřejnění PCT patentu No. 90/15070, zveřejněn 13. 12. 1990; US patentové přihlášce No. 07/624,120 z 6. 12. 1990, Fodor a další, Science, 251: 767 - 773 (2/1991); Dower a Fodor, Ann Rep. Med. Chem., 26: 271 - 180 (1991); a US patentové přihlášce No. 07/805,727 z 6. 12. 1991.

S použitím výše popsaných postupů byly obecně navrhovány náhodné peptidy tak, aby měly definovanou délku v počtu aminokyselinových zbytků (např. 12). Pro vytváření sbírky oligonukleotidú kódujících náhodné peptidy byl použit kodonový motiv (NNK)_X, kde N je nukleotid A, C, G nebo T (ekvimolárně; v závislosti na použité metodě, mohou být použity další nukleotidy), K je G nebo T (ekvimolárně) a x je celé číslo odpovídající počtu aminokyselin

- 18 v peptidu (např. 12) pro specifikaci jakéhokoliv z 32 možných kodonů vyplývajících z motivu NNK: 1 pro každou z 12 aminokyselin, 2 pro každou z 5 aminokyselin, 3 pro každou ze 3 aminokyselin a pouze 1 ze 3 stop kodonů. Motiv NNK tedy kóduje všechny aminokyseliny, 5 pouze jeden stop kodon a redukuje nerovnoměrnost kodonů.

V použitém systému byly náhodné peptidy předkládány buď na povrchu částice fágu, jako část fuzního proteinu obsahujícího buď plil nebo pVIM obalový protein derivátu fd fága (peptidy na fágu) nebo jako fuzní protein s fuzním proteinem Lad navázaným na plazmid io (peptidy na plazmidech).

Fág nebo plazmidy včetně DNA kódující peptidy byly identifikovány a izolovány afinitním obohacovacím postupem s použitím imobilizovaného TPO-R. Afinitní obohacovací proces, někdy nazývaný „panning“, se skládá z několika cyklů inkubace fága 15 piazmidů nebo polyzomů s imobilizovaným receptorem, izolace fága, plazmidů nebo polyzomů, které se vážou na receptor spolu s doprovázející DNA nebo mRNA a produkce většího množství fágů nebo plazmidů (spolu s doprovázejícím fuzním proteinem Lacl-peptid). V průběhu afinitního obohacovacího procesu byla typicky používána 20 extracelulární doména (ECD) TPO-R.

Po několika cyklech afinitního obohacování byl fág nebo plazmidy a doprovázející peptidy testovány metodou ELISA s cílem určit, jestli se peptidy specificky vážou na TPO-R. Tento test byl prováděn podobně jako postupy používané v afinitním obohacovacím 25 způsobu, s výjimkou toho, že po odstranění nenavázaného fága byly jamky typicky inkubovány s králičí anti-fágovou protilátkou, potom s alkalickou fosfatázou (AP) konjugovanou s kozí antikráličí protilátkou. Množství alkalické fosfatázy v každé jamce bylo stanoveno standardními způsoby. Podobný postup ELISA pro použití 3o pro systém peptidy na plazmidech se popisuje podrobněji níže.

• ·

Porovnáním testovacích jamek s kontrolními jamkami (bez receptoru) je možno určit, zda se fuzní proteiny specificky vážou na receptor. Vzorky fága, u kterých bylo zjištěno, že se vážou na TPO-R, byly testovány pomocí vzorkování s přenosem kolonií s použitím radioaktivně značeného monovalentního receptoru. Tuto sondu je možno vyrobit fosforylací kemptidové sekvence fúzované k C-konci rozpustného receptoru s použitím proteinkinázy A. „Uměle vytvořená“ forma receptoru TPO je potom exprimována v hostitelských buňkách, typicky buňkách CHO. Po sklizni PI-PLC receptoru byl receptor testován na vazbu k TPO nebo TPO-R specifickým fágovým klonům. Receptor se potom značí až do dosažení vysoké specifické aktivity ³³p a je ho potom možno použít jako monovalentní sondy pro identifikaci ligandů s vysokou afinitou s použitím přenosu kolonií.

Peptidy, u kterých bylo zjištěno, že se specificky vážou na receptor, byly potom syntetizovány jako volné peptidy (například bez fága) a testovány blokovacím testem. Blokovací test byl prováděn podobným způsobem jako ELISA s tím rozdílem, že TPO nebo referenční peptid byly přidávány do jamek před fuzním proteinem (kontrolní jamky byly dvou typů: (1) bez receptoru; a (2) bez TPO nebo referenčního peptidu). Fuzní proteiny, pro které byla vazba na receptor blokována TPO nebo referenčním peptidem, obsahují v části náhodného peptidu peptidy, které jsou výhodnými sloučeninami podle vynálezu.

TPO-R, stejně jako jeho extracelulární doména, byly produkována v rekombinantních hostitelských buňkách. Jedna použitelná forma TPO-R se vytváří expresí proteinu jako rozpustného proteinu v bakulovirem transformovaných hostitelských buňkách s použitím standardních způsobů; další použitelná forma se vytvoří se signálním peptidem pro sekreci proteinu a pro připojení ukotvením na giykofosfolipidovou membránu. Tato forma ukotveni se nazývá „PIG• « · · tailing“, viz Caras a Wendell, Science, 243: 1196 - 1198 (1989) a Lin a další, Science, 249: 677 - 679 (1990).

S použitím systému PIG-tailing je možno odštěpit receptor z povrchu buněk, které jej exprimují (např. transformovaných buněk s CHO selektovaných na vysokou expresi receptoru pomocí třídiče buněk) fosfolipázou C. Odštěpený receptor stále ještě obsahuje karboxylovou terminální sekvenci aminokyselin, nazývanou „HPAP tail“ ze signálního proteinu pro připojení na membránu a může být imobilizován bez dalšího čištění. Rekombinantní receptorový protein io může být imobilizován potažením jamek mikrotitračních destiček protilátkou anti-HPAP tail (Ab 179 nebo MAb 179), blokováním nespecifické vazby bovinním sérovým albuminem (BSA) v PBS a potom vazbou odštěpeného rekombinantního receptoru na protilátku. S použitím tohoto postupu je možno provádět imobilizační 15 reakci při různých koncentracích receptoru pro určení optimálního množství pro daný preparát, protože různé preparáty rekombinantního proteinu často obsahují různá množství požadovaného proteinu. Navíc by se mělo zajistit, že imobilizovaná protilátka je (TPO nebo některou jinou blokovací sloučeninou) v průběhu postupu afinitního 2o obohacováni úplně blokována. Jinak muže neblokovaná protilátka vázat v průběhu postupu afinitního obohacování nežádoucího fága. Pro blokováni nenavázaných míst, která zůstala po imobilizaci receptoru pro zabránění tomuto problému je možno použít peptidy, které se vážou na imobilizující protilátku nebo je možno jednoduše 25 imobilizovat receptor přímo na jamky mikrotitračních destiček bez pomoci imobilizující protilátky. (Viz US patentová přihláška No. 07/947,339 z 18. 9. 1992, jejíž obsah se zde uvádí jako referenční.)

Při použití systémů vytváření náhodných peptidů, které dovolují multivalentní interakce ligand - receptor, je nutno připustit, že hustota

3o imobilizovaného receptoru je důležitým faktorem při zjišťování afinity ligandů, které se vážou na imobilizovaný receptor. Při vyšších

hustotách receptoru (například každá jamka potažená protilátkou antireceptor je inkubována s 0,25 až 0,5 mg receptoru) je multivalentní vazba pravděpodobnější než při nízkých hustotách receptoru (například každá jamka potažená protilátkou anti-receptor se inkubuje s 0,5 až 1 ng receptoru). Jestliže se vyskytuje multivalentní vazba, dojde s větší pravděpodobností k izolaci ligandu s relativně nižší afinitou, pokud se nepoužije vyšších hustot imobilizovaného receptoru pro identifikaci vzorových sloučenin a použije se nižších hustot receptoru pro izolaci odvozených sloučenin s vyšší afinitou.

Pro rozlišení mezi peptidy s vyšší afinitou se často používá monovalentní receptorová sonda. Tato sonda může být vytvořena s použitím proteinkinázy A pro fosforylaci kemptidové sekvence připojené k C-konci rozpustného receptoru. „Umělá forma“ receptoru TPO se potom exprimuje v hostitelských buňkách, typicky v buňkách CHO. Po sklizni PI-PLC receptorů byl receptor testován na vazbu k TPO nebo k TPO-R specifickým fágovým klonům. Receptor se potom značí až do vysoké specifické aktivity ³³P pro použití jako monovalentní sonda pro identifikaci ligandu s vysokou afinitou s použitím přenosu kolonií.

Výhodné metody screeningu pro umožnění identifikace peptidů, které se vážou na TPO-R zahrnují nejprve identifikaci vzorových peptidů, které se vážou na extracelulární doménu receptoru a potom přípravu dalších peptidů, které se vzorovým peptidům podobají. Konkrétně může být s použitím peptidů založených na plil nebo pVIII ve fágovém systému proveden screening náhodné knihovny pro odhalení fága nesoucího peptid, který se váže na TPO-R. Fágové DNA jsou sekvenovány pro stanovení sekvencí peptidů nesených na povrchu fágů.

Klony schopné specificky se vázat na TPO-R byly identifikovány z náhodného lineárního 10-meru knihovny pVIII a náhodného cyklického 10-meru a 12-meru knihoven pVIII. Sekvence těchto • φ

peptidů slouží jako základ pro konstrukci dalších peptidových knihoven navržených tak, aby obsahovaly deriváty na počátku identifikovaných peptidů s vysokou frekvencí. Tyto knihovny mohou být syntetizovány tak, aby byla zvýhodněna produkce peptidů, které se liší od vazebného peptidů pouze v několika zbytcích. Tento přístup zahrnuje syntézu oligonukleotidu s kódující sekvencí vazebného peptidů tak, že se při syntéze nepoužívá čistých preparátů každého ze čtyř nukleosidtrifosfátů, ale používá se směsí čtyř nukleosidtrifosfátú (tj. jednou z výhodných směsí pro tento účel je 55 % „správného“ nukleotidu a 15 % každého z ostatních tří nukleotidů a další výhodnou směsí pro tento účel je 70 % „správného“ nukleotidu a 10 % každého z ostatních tří nukleotidů), aby došlo k vytvoření derivátů kódující sekvence vazebného peptidů.

Pro derivatizaci vzorových peptidů byla použita řada strategií vytvořením knihoven „mutageneze na určité téma“. Ty zahrnovaly pVIII fágmidovou mutagenetickou knihovnu založenou na konvenční sekvenci mutagenizované s frekvencí 70 :10:10: 10a prodloužené na každém konci náhodnými zbytky za vytvoření klonů zahrnujících sekvenci XXXX (C, S, P nebo R) TLREWLXXXXXX (C nebo S). Podobná prodloužená/mutagenízovaná knihovna byla vytvořena s použitím systému peptidy na plazmidech za vytvoření klonů obsahujících sekvenci XXXXX (C, S, P nebo R) TLREWL XXXXXXX. S použitím polyzomového systému byla vytvořena další prodloužená/mutagenízovaná knihovna, XXXX (C, S, P, nebo R) TLREWL XXXXXX (C nebo S). U všech tří knihoven byl proveden screening s elucí peptidů a testováním sondou s radioaktivně značeným monovaientním receptorem.

Pro screening a studia mutageneze byl také použit postup „peptidy na plazmidech“, který se podrobněji popisuje v US patentu No. 5,338,665, který se zde uvádí jako referenční. Podle tohoto způsobu se náhodné peptidy expresí z plazmidového vektoru

B • · - 23 ·nesoucího fuzní gen fuzují na C-konec Lacl. Dojde k připojení peptidu Lad na jeho kódující DNA pomocí sekvencí lacO na plazmidu za vytvoření stabilního komplexu peptid - Lacl - plazmid, který múze být testován afinitním čištěním (panning) na imobilizovaném receptoru. Takto izolované plazmidy mohou být potom znovu zavedeny do E. coli pomocí elektroporace pro amplifikaci vybrané populace pro další cykly screeningu nebo pro testování jednotlivých klonů.

Navíc byly prováděny studie mutageneze a screening náhodného peptidu s použitím modifikovaného C-koncového Lac-I expresního systému, u kterého byla snížena expresní valence (systém typu „headpiece dimer“). Byl prováděn screening knihoven a výsledné inzerty DNA byly klonovány do vektoru maltózového vazebného proteinu (MBP), který dovolil jejich expresi jako C-koncového fuzního proteinu. Surové buněčné lyzáty z náhodně odpíchnutých jednotlivých fuzních klonů MBP byly potom testovány způsobem ELISA na vazbu k TPO-R jak bylo popsáno výše.

Studie mutageneze peptidů byly také prováděny s použitím polyzomového systému jak se popisuje v související US patentové přihlášce No. 08/300,262, 2. 9. 1994, navazující na US patentovou přihlášku No. 08/144,775 z 29. 10. 1993 a PCT WO 95/11992, které se zde uvádějí jako referenční. Byla vytvořena mutagenetická knihovna založená na sekvenci X X X X (C, P, R nebo S) t I r e f I X X X X X X (C nebo S), kde X označuje náhodný kodon NNK a malá písmena představují kodony aminokyselin obsahující mutagenezi 70 : 10 : 10 : 10 v polohách 1 a 2 a K (G nebo T) v poloze 3 kodonu. Byla provedena vazba technikou panning s pěti cykly na receptor TPO, který byl imobilizován na magnetických kuličkách. Po pátém cyklu bylo množství amplifikované PCR klonováno do pAFF6 a byly sekvenovány ELISA pozitivní klony. Sekvence byly subklonovány do vektoru MBP a pomocí MBP ELISA byly zjišťovány jejich vazebné afinity.

• « · ·

Pro imobilizaci TPO-R pro screening polyzomů byla nejprve konjugována Ab 179 k tosylem aktivovaným magnetickým kuličkám (výrobek firmy Dynal Corporation) podle návodu výrobce. Kuličky byly inkubovány s protilátkou v 0,5 M borátovém pufru (pH 9,5) přes noc 5 při pokojové teplotě. Potom byly kuličky promyty a spojeny s TPO-R obsahující konec „HPAP“. Kuličky potažené protilátkami a receptor byly inkubovány 1 hod při 4 °C a před přídavkem k polyzomové knihovně byly kuličky promyty znovu. Screening různých výše popsaných knihoven poskytl peptidy vážící se na receptor TPO io ukázané v tabulkách 1 a 2 níže i další peptidy, které nejsou uvedeny.

« * «

- 25’-*

Tabulka 1

Peptid

REGPTLRQWM

SRGMTLREWL

EGPTLRGWLA

REGQTLKEWL

ERGPFWAKAC

REGPRCVMWM

CSGLTLREWLVC

CLTGPFVTQWLYEC

CGEGLTLTQWLEHC

CRAGPTLLEWLTLC

CRQGPTLTAWLLEC

CADGPTLREWISFC

CELVGPSLMSWLTC

CGTEGPTLSTWLDC

CDQLGVTLSRWLEC

SGTGLTLREWLGSFSLLS

CPEGPTLLQWLKRGYSSC

RGDGPTLSQWLYSLMIMC

MVAGPTLREFIASLPIHC

SMQGPTFREWVSMMKVLC

*♦ • · it · *

- 26 v « · ♦ ·

SVQCGPTLRQWLAARNHLS

GNADGPTLRQWLEGRRPKN

SVRCGPTLRQWLAARTHLS

LAIEGPTLRQWLHGNGRDT

HGRVGPTLREWKTQVATKK

CADGPTLREWISFC

ISDGPTLKEWLSVTRGAS

SIEGPTLREWLTSRTPHS

TIKGPTLRQWLKSREHTS

GNADGPTLRQWLEGRRPKN

SIEGPTLREWLTSRTPHS

ISDGPTLKEWLSVTRGAS

···♦

·♦ ·*·· *♦ «« • · * · · · · • · 9 · · · ♦ • · · * · · · · · « » · · · · · «

Tabulka 2

Peptid

CSLEDLRKRC

CRRSELLERC

CTFKQFLDGC

CTRGEWLRCC

CTLRQWLQGC

CTLEELRACC

CTREELMRLC

CQRADLINFC

CNRNDLLLFC

CTRTEWLHGC

CTLEFMNGC

CSLGELRRLC

CNINQLRSIC

CTMRQFLVCC

CTRSEWLERC

CTLHEYLSGC

CTREELLRQC

CTFREFVNGC

CSRADFLAAC

CSCAQVVQCC

CTLRQWILLGMC

CTLREWLHGGFC

• · • · «

CTLRAWLMSETC

CTLRAWLMESCC

CTFQVWKLARNC

CLLREWLDXRTC

CVLREWLLXXSC

CLLSEFLAGQQC

CSLRQYLDFGLGSC

CTLQELKQSSLYEC

CDLSELKTHGYAYC

CKLSDWLMNGVAAC

CSLQEFLSHGGYVC

CSLKEFLHSGLMQC

CTFRQLLEYGVSSC

CTM R EF LVASGVAC

CTLAEFLASGVEQC

CTLKEWLVSHEVWC

CTLREFLSLGMNAC

CTLREFLDPTTAVC

CSLLEFLALGVALC

GGGRGCTLKQWKQGDCGRS

CNRSQLLAAC

CTLQQWLSGC

CTLREFKAGC

• · · Β

CTRAQFLKGC

CTLREFNRGC

CTLSDFKRGC

CTFRQWKEAC

CTLSEFRGGC

CTLQEFLEGC

CTLQQWKDGC

CTRSQWLEGC

CSLQEFKHGC

CTLGEWKRGC

CTLWGCGKRGC

CTLQEWRGGC

CTRLSGCWLC

CTRTQWLLDC

CTLAEFRRGC

CTSTQWLLAC

CSRSQFLRSC

CTLREWLEGC

CTLREFLLMGAC

CTLKEWLLWSSC

CTLLEWLRNPVC

CTLRQWLGDAWC

CTLGQWLQMGMC

CTLREWVFAGLC

• · ···· 4 4 Φ φ · 4 4 4 4 4

4 4 4 4444 4

Φ 4 4 4 4 4

CLLLEFLSGADC

CTLGEFLAGHLC

CRLREFLVDLTC

CSFRSWLVDQTC

CTLREWLEDLGC

CTLQDWLVSWTC

CTLSEWLSELSC

CTLMQWLGGWPC

CTLREWLSYGTC

CTLQEWLSGGLC

GSHGCTLREWLCMKIVPC

QWQGCTLRDCILRGVFWS

SVNSCTLREFLTGCRVFC

SYDGCTLRHWLMDIYGDC

QRSGCTLRDWVLLNCLAS

NYRGCTLSQWVSEQIVGC

GRSGCTLREYLGGMCYLS

ASWYCTVPELMEMQLPEC

GSTGCTLREXLHMLGLDC

ACEGCTLRQWLEYVRVGC

AQRGCTLQYFVSYGXDMC

GVCGCTLREFLAIPHTSC

SEGGCTLREWVASSLANC

SNSRCTLREWIIQGCDFS

CLGCTLSQWRKRTRCDTH

YRGCSRAQLLGGECRKK

GRGCTLKQWKQGDCGRS

VRGGCALRDWVAGECFDWT

LWRGCTLNGFKSRHCGSPE

CTLRSWKHRGCAP

GRGCTRAQWLAGCCTGH

RAGCTLREFRKGCLAL

KRGSTLAEMIRGCNRSN

GRGCTLKQWKQGDCGRS

RWRGCSLAKLKKGAACGRG

RGGCTLREWRRVRVIN

GRGCTLKQWKQGDCGRS

RYGCTRHQWLVGTCVRH

Hodnoty IC₅₀ pro některé další příklady peptidů se uvádějí v další tabulce. Pro zjištění hodnot IC_S0 je možno použít různých metod. Pro zjištění, jestli peptidy inhibují vazbu TPO na extracelulární 5 doménu receptoru TPO, byla použita například metoda ELISA s rovnovážnou vazbou s použitím stopovací látky buď MBP-TPO nebo lacl-peptid. Typicky byly hodnoty IC₅o určovány s použitím volného peptidu. Hodnota IC₅₀ může být stanovena s použitím volného peptidu, který může být popřípadě amidován na C-konci nebo může být 10 připraven jako ester nebo jiný karboxyamid.

• · · * « · · · ·

Pro obnovení přesné sekvence vytvořené na fágu se Nkoncovým a C-koncovým aminokyselinám syntetických peptidů často předřazují jeden nebo dva glycinové zbytky. Předpokládá se, že tyto glyciny nejsou nezbytné pro vazbu nebo aktivitu. Podobně se pro napodobení přesné sekvence peptidů vytvořených na polyzomech předřazuje C-koncovým aminokyselinám syntetických peptidů sekvence MAS. Opět se předpokládá, že sekvence není nutné pro vazbu nebo aktivitu.

Hodnoty IC_So se symbolicky označují symboly „+“ a Například peptidy s hodnotami IC₅o vyššími než 200 μΜ se označují jako Peptidy s hodnotami IC₅o menšími nebo rovnými 200 μΜ se označují jako „+“ a peptidy s hodnotami IC₅o menšími než 500 nM se označují jako _B++“. Peptidy s hodnotami IC₅o v blízkosti rozhraní těchto symbolů se označují hybridním označením, např. Peptidy, u kterých nebyly hodnoty IC₅o stanoveny, se označují jako „N. D.“. Hodnota IC₅₀ pro peptidy se strukturou: GGCTLREWLHGGFC G G byla 500 nM nebo méně. (Je třeba uvést, že N-koncovým a Ckoncovým aminokyselinám předcházely dva glyciny pro obnovené přesné sekvence vytvořené fágem. U těchto glycinú se předpokládá, že nejsou nutné pro vazbu nebo aktivitu.

Tabulka 3

Peptid	Afinita
GGCADGPTLREWISFCGG	++
GNADGPTLRQWLEGRRPKN	++
GGCADGPTLREWISFCGGK	++
TIKGPTLRQWLKSREHTS	++
GPTLRQWL	-
LAIEGPTLRQWLHGNGRDT	++
SIEGPTLREWLTSRTPHS	++

Tabulky výše, zejména tabulka 3 ukazuje, že výhodný peptid jádra obsahuje sekvenci aminokyselin:

s X, X₂ X₃ X₄ X₅ Χβ Xz kde Xt znamená C, L, Μ, P, Q, V; X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a iq X₇ znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V.

Ve výhodném provedení obsahuje jádro peptidu sekvenci aminokyselin:

X₈ G Xi X₂ X₃ X₄ Xs W X₇ kde X1 znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X₂ znamená F, R, S nebo T;

X₃ znamená F, L, V, nebo W; X₄ znamená A, K, L, M, R, S, V, nebo T; X₅ znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; X₇ znamená C, I, K, L, M nebo V; a každý ze zbytků X₈ je nezávisle na sobě zvolen z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin, jejich stereoizomerních D-

	*	* · V ·	>9	99
•	• 0	• ·	t	9 V	•	4
•	•	• 9	•	• ♦		• 0
«		9 9 9	• ·			•
• ' ·	•	• ·	• ·	•	•	•

- 34 aminokyselin a nepřírodních aminokyselin. S výhodou je každý zbytek X₈ nezávisle zvolen z jakýchkoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin a jejich stereoizomerních D-aminokyselin. Ve výhodném provedeni Xi znamená P; X₂ znamená T; X₃ znamená L; X₄ znamená R; X₅ znamená E nebo Q; a X₇ znamená I nebo L.

Výhodněji obsahuje jádro peptidu sekvenci aminokyselin:

X₉ X_e G X, X₂ X₃ X₄ X₅ W X₇ kde Xg znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V; a X₈znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V. Výhodněji je skupina X₉A nebo I; a X₈ znamená D, E, nebo K.

Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCADGPTLREWISF CGG;GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTL REWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;SIEG PTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLHGNGRD T;CADGPTLREWISFC;alEGPTLRQWLAARA.

V dalším provedení vynálezu zahrnují výhodné peptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu peptidy se strukturou jádra obsahující sekvenci aminokyselin:

C X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ X₇ kde X₂ znamená K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S nebo V; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X₆ znamená C, F, G, L, M, S. V, W nebo Y; X₇ znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V. Ve výhodnějším provedení znamená X₄ A, E, G, Η, K, L, Μ, P, Q, R, S, T nebo W. V dalším provedení X₂ je S nebo T; X₃ je L nebo R; X₄ je R; X₅ je D, E, nebo G; X₆ je F, L, nebo W; a X₇ je I, K, L, R, nebo V. Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCTLREWLHGGFCGG.

····

- 35 X₈ C X₂ X₃ X< X₅ Xe Xz kde X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X₅ je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ je C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ je C, G, I, K, L, Μ, N, R, nebo V; a X₈ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin. V některých provedeních je X₈ s výhodou G, S, Y, nebo R.

Peptidy a peptidy napodobující látky s IC_So větší než přibližně 100 mM mají nedostatečnou vazbu pro umožnění buď při diagnostice nebo pro terapeutické účely podle vynálezu. Pro diagnostické účely mají s výhodou peptidy a peptidy napodobující látky IC50 přibližně 2 mM nebo menší a pro farmaceutické účely mají peptidy a peptidy napodobující látky IC₅o přibližně 100 μΜ nebo menší.

Sekvence vazebného peptidů také poskytuje způsob pro stanovení minimální velikosti vazebné sloučeniny TPO-R podle vynálezu. Použitím systému „kódované syntetické knihovny“ (ESL) nebo systém „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ je možno nejen stanovit minimální velikost peptidů s touto aktivitou, ale také vyrobit všechny peptidy tvořící skupinu peptidů odlišných od výhodného motivu (nebo minimální velikosti tohoto motivu) v jednom, dvou nebo více zbytcích. Potom může být proveden screening tohoto souboru peptidů na schopnost vazby na receptor TPO. Tyto systémy syntézy imobilizovaných polymerů nebo další způsoby syntézy peptidů mohou být také použity pro syntézu kmenových analogů, delečních analogů, substitučních analogů a jejich kombinací všech peptidových sloučenin podle vynálezu.

Peptidy a peptidy napodobující látky podle předkládaného vynálezu byly také testovány v testu trombopoetin dependentní buněčné proliferace, jak se podrobněji popisuje v příkladu 2 níže. Buněčná proliferace se měří v oboru známými způsoby, jako je stanovení MTT, které koreluje s inkorporací ³H-thymidinu jako • · • · · ♦

indikátoru buněčné proliferace (viz Mossmann, J. Immunol. Methods, 65: 55 (1983). Testované peptidy stimulovaly proliferaci TPO-R transfekovaných buněk Ba/F3 v závislosti na dávce, jak je ukázáno na obr. 1A. Tyto peptidy nemají žádný účinek na rodičovskou buněčnou 5 linii, jak je vidět v obr. 1B.

Obr. 7 až 9 ukazují výsledky dalšího testu vyhodnocujícího aktivitu peptidů a peptidy napodobujících látek podle vynálezu. V tomto testu se pomocí karboplatiny vytvoří trombocytopenické myši. Obr. 7 ukazuje typické výsledky při podání karboplatiny myši Balb/C io (125 mg/kg intraperitoneáině) v den 0. Čárkované přímky představují neošetřená zvířata ze tří experimentů. Plné čáry představují karboplatinou ošetřené skupiny ve třech experimentech. Silné plné čáry ukazují historické údaje. Obr. 8 zobrazuje účinek titrace karboplatiny na počty krevních destiček u myši, ošetřené uvedenými 15 dávkami karboplatiny (v mg/kg, intraperitoneáině (ip), v den 0). Obr. 9 ukazuje odstranění karboplatinou indukované trombocytopenie v den 10 peptidem AF12523 (513). Karboplatina (CBP; 50 - 125 mg/kg, intraperitoneáině) byla podána v den 0. Peptid AF 12513 (1 mg/kg, ip) byl podáván ve dnech 1 až 9. Tyto výsledky ukazují, že peptidy podle 2o vynálezu mohou v myším modelu zlepšovat trombocytopenii.

Určité peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být navíc dimenzovány nebo oligomerizovány a tím může být zvýšena jejich afinita a/nebo aktivita. Pro výzkum účinku, který má dimerizace/oligomerizace peptidů na TPO mimetickou schopnost 25 v testech buněčné proliferace byl syntetizován na C-konci biotinylovaný analog peptidu GGCADGPTLREWISFCGG (GGCADGPTLREWISFCGGK (Biotin)). Peptid byl předem inkubován se streptavidinem v bezsérovém HEPES - pufrovaném RPMI v molárním poměru 4:1. Komplex byl testován na stimulaci 30 buněčné proliferace TPO-R transfekovaných buněk Ba/F3, jak bylo uvedeno výše, spolu s volným biotinylovaným peptidem a • · • · · · · ·

·· .·· ·· ··

- 37 nebiotinylovaným rodičovským peptidem. Obr. 2A ukazuje výsledky testu pro komplexní biotinylovaný peptid (AF 12885 se streptavidinem (SA) jak pro transfekované, tak i rodičovské buněčné linie. Obr. 2B ukazuje výsledky testu pro volný biotinylovaný peptid (AF 12285) jak pro transfekované, tak i pro rodičovské buněčné linie. Obr. 2C ukazuje výsledky testu pro samotný streptavidin jak pro transfekované, tak i rodičovské buněčné linie. Tyto obrázky ukazují, že předem vytvořený komplex byl přibližně 10 x účinnější, než volný peptid.

Specificita vazby a aktivity peptidu podle vynálezu byla testována rovněž studiem křížové reaktivity peptidů pro erytropoetinový receptor (EPO-E). EPO-R je také člen rodiny hematopoetinového receptoru růstového faktoru, jako je TPO-R. Peptidy podle vynálezu stejně jako TPO, EPO a známý EPO-vazebný peptid byly testovány v testu buněčné proliferace s použitím EPOdependentní buněčné linie. Tento test používá FDCP-1, buněčné linie myších multipotenciálních primitivních hematopoetických prekurzorových buněk, dependentních na růstový faktor (viz např. Dexter a další, J. Exp. Med., 152: 1036 - 1047 (1981), jako rodičovské buněčné linie. Tato buněčná linie může proliferovat, ale není schopna diferenciace, pokud roste v WEHI-3-kondicionovaném médiu (médium obsahující IL-3, ATCC No. T1B68). Rodičovská buněčná linie je transfekována lidským nebo myším EPO-R za vytvoření buněčné linie FDCP-1-EPO-R. Transfekované buněčné linie mohou proliferovat, ale v přítomnosti lidského nebo myšího EPO se nemohou diferencovat.

Buňky rostly v přítomnosti nutných růstových faktorů do poloviční hustoty ve stacionární fázi. Buňky byly potom promyty v PBS a hladověly 16 až 24 hodin v úplném médiu bez růstových faktorů. Po stanovení počtu životaschopných buněk byly vytvořeny zásobní roztoky (v úplném médiu bez růstových faktorů) s koncentrací přibližně 10^s buněk na 50 μΙ. V 96-jamkových destičkách pro tkáňovou kultivaci se připraví sériová ředění testovaných sloučenin, typicky volný roztok • · · ·

peptidu proti na fág navázanému nebo jiným způsobem navázanému nebo imobilizovanému peptidu, na konečný objem 50 pl na jamku. Do každé jamky se přidají buňky (50 μΙ) a inkubují se 24 až 48 hodin, přičemž v tomto okamžiku by mely negativní kontroly zahynout nebo 5 být v klidovém stavu. V oboru známými způsoby, jako je test MTT, se pak měří buněčná proliferace.

Obr. 3A - G ukazují výsledky série kontrolních experimentů ukazujících aktivitu TPO, peptidu podle předkládaného vynálezu, EPO a EPO-R vazebných peptidu v testu buněčné proliferace s použitím io buď TPO-R transfekované buněčné linie Ba/F3 a jí odpovídající rodičovské linie nebo EPO-dependentní buněčné linie a jí odpovídající rodičovské linie. Obr. 3A zobrazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím TPO-R transfekované buněčné linie Ba/F3 a jí odpovídající rodičovské linie. Obr. 3B ukazuje výsledky pro EPO 15 v testu buněčné proliferace s použitím TPO-transfekované buněčné linie Ba/F3 a odpovídající rodičovské linie. Obr. 3C ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný peptid (AF 12285 se streptavidinem (SA) a komplexní formu biotinylovaného EPO-R vazebného peptidu (AF 11505 s SA) v TPO-R transfekované buněčné linii Ba/F3. Výsledky pro 2o odpovídající rodičovskou buněčnou linii jsou uvedeny v obr. 3D.

Obr. 3E ukazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3F ukazuje výsledky pro EPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3G ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný 25 peptid (AF 12285 se streptavidinem (SA) a komplexní formou biotinylovaného EPO-R vazebného peptidu (AF 11505 s SA) v EPOdependentní buněčné linii. Tyto výsledky ukazují, že peptidy podle vynálezu se váží a aktivují TPO-R s vysokým stupněm specificity.

· • ·· 9

IV. Příprava peptidů a peptid napodobujících látek

A. Syntéza na pevně fázi

Peptidy podle vynálezu mohou být připraveny klasickými v oboru známými postupy, například použití standardních metod s syntézy na pevné fázi. Standardní způsoby zahrnují syntézy prováděné výlučně na pevné fázi, způsoby syntézy prováděné částečně na pevné fázi, kondenzaci fragmentů, klasickou syntézu z roztoků a dokonce i rekombínantní technologii DNA (viz například Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963). Na pevné fázi se io syntéza typicky provádí od C-konce peptidu s použitím alfa-amino chráněné pryskyřice. Vhodné výchozí materiály mohou být například připraveny připojením požadované alfa-amino kyseliny na chloromethylovanou pryskyřici, hydroxymethylovou pryskyřici nebo benzhydrylaminovou pryskyřici. Jedna taková chloromethylovaná 15 pryskyřice se dodává pod obchodním názvem BIO-BEADS SX-1, firma Bio Rad Laboratories, Richmond, CA a příprava hydroxymethylové pryskyřice se popisuje v Bodonszky a další, Chem. Ind.. (Londýn) 38: 1597 (1966). Benzhydrylaminová (BHA) pryskyřice byla popsána v Pietta a Marshall, Chem. Commn, 650 (1970) a je komerčně 20 dostupná ve formě hydrochloridu u firmy Beckman Instruments, lne., Palo Alto, CA.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být tedy připraveny navázáním alfa-amino chráněné aminokyseliny na chloromethylovanou pryskyřici s pomocí například katalyzátoru 25 hydrogenuhličitanu česného způsobem popsaným v Gisin, Helv. Chim.

Acta.. 56: 1467 (1973). Po počáteční vazbě se alfa-amino ochranná skupina odstraní reagencií zvolenou z roztoků kyseliny trifluoroctové (TFA) nebo chlorovodíkové (HCI) v organických rozpouštědlech při pokojové teplotě.

Alfa-amino ochranné skupiny jsou skupiny známé jako použitelné při postupné syntéze peptidů. Patří sem ochranné skupiny • ·

...............

-40 acylového typu (například formyl, trifluoroacetyl, acetyl), aromatické ochranné skupiny urethanového typu (například benzyloxykarboyl (Cbz) a substituovaný Cbz), alifatické urethanové ochranné skupiny (například t-butyloxykarbonyl (Boc), izopropyloxykarbonyl, 5 cyklohexyloxykarbonyl) a ochranné skupiny alkylového typu (například benzyl, trifenylmethyl). Výhodnými ochrannými skupinami jsou Boc a Fmoc. Ochranná skupina postranního řetězce zůstává v průběhu vazby intaktní a neodštěpuje se během odstraňování ochranných skupin chránících koncové aminoskupiny nebo v průběhu vazby.

Ochranné skupiny postranního řetězce musí být odstranitelné po ukončení syntézy konečného peptidu a za takových reakčních podmínek, které nebudou měnit konečný peptid.

Ochranné skupiny postranního řetězce pro Tyr zahrnují tetrahydropyranyl, terc.-butyl, trityl, benzyl, Cbz, Z-Br-Cbz a 2,515 dichlorbenzyl. Ochranné skupiny postranního řetězce pro Asp zahrnují benzyl, 2,6-dichlorbenzyl, methyl, ethyl a cyklohexyl. Ochranné skupiny postranního řetězce pro Thr a Ser zahrnují acetyl, benzoyi, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-dichlorbenzyl a Cbz. Ochrannou skupinou postranního řetězce pro Thr a Ser je benzyl. Ochrannými 20 skupinami postranních řetězců pro Arg jsou nitro, tosyl (Tos), Cbz, adamantyloxykarbonyl, mezitoylsulfonyl (Mts) nebo Boc. Ochranné skupiny postranních řetězců pro Lys zahrnují Cbz, 2chlorobenzyloxykarbonyl (2-CI-Cbz), 2-bromobenzyloxykarbonyf (2BrCbz), Tos, nebo Boc.

Po odstranění alfa-aminové ochranné skupiny postupně reagují zbývající chráněné aminokyseliny v požadovaném pořadí. Obvykle se používá spolu s vhodným aktivátorem karboxylové skupiny, jako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC), přebytek každé chráněné aminokyseliny v roztoku například methylenchloridu (CH₂CI₂), 3o dimethylformamidu (DMF).

V « • ♦ · ·

- 41 Po ukončení syntézy požadované sekvence aminokyselin se požadovaný peptid odštěpí z pryskyřičného nosiče působením reagencie jako je kyselina trifluoroctové nebo fluorovodík (HF), které nejen odštěpí peptid z pryskyřice, ale odštěpí i zbývající ochranné skupiny postranního řetězce. Jestliže se použije chloromethylované pryskyřice, použitím fluorovodíku vzniknou volné kyseliny peptidu. Jestliže se použije benzhydrylaminové pryskyřice, působením fluorovodíkem přímo vznikne amid volného peptidu. Alternativně při použití chloromethylované pryskyřice může být peptid s chráněným postranním řetězcem odštěpen působením amoniaku na pryskyřici s navázaným peptidem za poskytnutí požadovaného amidu s chráněným postranním řetězcem nebo působením alkylaminu za vzniku alkylamidu nebo dialkylamidu s chráněným postranním řetězcem. Ochranné skupiny postranního řetězce se potom odstraňují obvyklým způsobem použitím fluorovodíku za vzniku volných amidů, alkylamidů nebo dialkylamidů.

Postupy syntézy peptidu na pevné fázi, které se uvádějí výše jsou v oboru známy a dále se popisují v Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co., San Francisco (1969).

Použitím „kódované syntetické knihovny“ nebo „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ popisovaných v US patentové přihlášce No. 07/492,462, 7. 3. 1990; 07/624,120, 6. 12. 1990; a

07/805,727, 6. 12. 1991, je možno nejen stanovit minimální velikost peptidu s danou aktivitou, ale je také možno připravit všechny peptidy vytvářející skupinu peptidú odlišných od výhodného motivu (nebo minimální velikosti tohoto motivu) v jednom, dvou nebo více zbytcích. Tento soubor peptidú je potom možno testovat na schopnost vazby k TPO-R. Tento systém syntézy imobilizovaného polymeru nebo jiné způsoby syntézy peptidú mohou být také použity pro syntézu zkrácených analogů a delečních analogů a kombinací zkrácených a delečních analogů všech peptidových sloučenin podle vynálezu.

.* ..· ·· ··

-42 B. Syntetické aminokyseliny

Tyto postupy mohou být také použity pro syntézu peptidů, u kterých jsou sloučeniny podle vynálezu substituovány v jedné, dvou nebo více polohách aminokyselinami jinými než je dvacet v přírodě se vyskytujících geneticky kódovaných aminokyselin. Například pro usnadnění syntézy může být tryptofan substituován za naftylalanin. Jiné syntetické aminokyseliny, které mohou být substituovány do peptidů podle předkládaného vynálezu, zahrnují L-hydroxypropyl, L-

3,4-dihydroxyfenylaianyl, d-aminokyseliny jako L-d-hydroxylyzyl a Dd-methylalanyl, L-a-methylalanyl, b-aminokyseliny, a izochinolyl. Do peptidů podle předkládaného vynálezu mohou být také zavedeny Daminokyseliny a syntetické aminokyseliny, které se nevyskytují v přírodě.

Je možno nahradit v přírodě se vyskytující postranní řetězce dvaceti geneticky kódovaných aminokyselin (nebo D-aminokyselin) jinými postranními řetězci, například skupinami, jako je alkyl, nižší alkyl, cyklický 4-, 5-m 6- až 7-členný alkyl, amid nižšího alkylu, dialkyiamid obsahující nižší alkyl, nižší alkoxy, hydroxy, karboxy a jejich nižší esterové deriváty, a 4-, 5-, 6- až 7- Člennými heterocyklickými skupinami. Použity mohou být zvláště analogy prolinu, ve kterých je 5- členný kruh prolinu změněn na 4-, 6- nebo 7členný kruh. Cyklické skupiny mohou být nasycené nebo nenasycené a jestliže jsou nenasycené, mohou být aromatické nebo nearomatické.

Cyklické skupiny mohou být nasycené nebo nenasycené, jestliže jsou nenasycené, mohou být aromatické nebo nearomatické. Heterocyklické skupiny s výhodou obsahují jeden nebo více heteroatomů dusíku, kyslíku a/nebo síry. Příklady takových skupin zahrnují furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, izothiazolyl, izoxazolyl, morfolinyl (např. morfolino), oxazolyl, piperazinyl (napr. 1-piperazinyl), piperidyl (napr. 1 -piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl, • · · · • ·

pyridazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolidinyl (např. 1-pyrrolidinyl), pyrrolinyl, pyrrolyl, thiadiazolyl, thiazolyl, thienyl, thiomorfolinyl (např. thiomorfolino) a triazolyl. Tyto heterocyklické skupiny mohou být substituované nebo nesubstituované. Kde je skupina substituovaná, může být substituentem alkyl, alkoxy, halogen, kyslík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl.

Je možno také snadno modifikovat peptidy podle předkládaného vynálezu fosforylací a dalšími způsoby přípravy peptidových derivátů sloučenin podle předkládaného vynálezu, jak se popisuje v Hrubý a další⁴². Peptidové sloučeniny podle vynálezu tedy slouží také jako základ pro přípravu peptidy napodobujících látek s podobnou biologickou účinností.

Peptidové sloučeniny podle vynálezu včetně peptidy napodobujících sloučenin mohou být kovalentně modifikovány na jeden nebo více z řady neproteinových polymerů, například polyethylenglykol, polypropylenglykol nebo polyoxyalkeny, způsobem uvedeným v US patentu No. 4,640,835; US patentu No. 4,496,689; US patentu No. 4,301,144; US patentu No. 4,670,417; US patentu No. 4,791,192 nebo US patentu No. 4,179,337.

C. Koncové modifikace

Odborníkům v oboru je známo, že je dostupná řada způsobů pro vytváření peptid napodobujících látek se stejnými nebo podobnými požadovanými biologickými účinky jako je odpovídající peptidová sloučenina, ale s výhodnější aktivitou než má peptid s ohledem na rozpustnost, stabilitu a vnímavost k hydrolýze a proteoiýze (viz například Morgan a Gainor, Ann. Rep. Med. Chem.. 24: 243 - 252 (1989). V následující Části se popisují způsoby výroby peptidy napodobujících látek modifikovaných na N-koncové aminoskupině, Ckoncové karboxylové skupině a/nebo změnou jedné nebo více amidových vazeb v peptidů na vazby neamidové. Je jasné, že v jedné ·· · ♦

•> * φ •· · · • ·· * Φ V φ ·· • · ·· peptid napodobující struktuře může být spojeno více takových modifikací (např. modifikace C-koncové karboxylové skupiny a zahrnutí -CH₂-karbamátové vazby mezi dvě aminokyseliny v peptidu).

1. Modifikace na N-konci

Peptidy se typicky syntetizují jako volné kyseliny, ale jak je uvedeno výše, mohou být snadno připraveny jako amid nebo ester. Je také možno modifikovat aminový a/nebo karboxylový konec peptidových sloučenin podle vynálezu za vytvoření jiných sloučenin podle vynálezu. Modifikace aminového konce zahrnují methylaci (tj. -NHCH₃ nebo -NH(CH₃)₂), acetylaci, navázání karbobenzoylové skupiny nebo blokování aminového konce jakoukoliv blokovací skupinou obsahující karboxylátovou funkční skupinu definovanou vzorcem RCOO-, kde R je zvoleno ze skupiny naftyi, akridinyl, steroidyl a podobných skupin. Modifikace karboxylového konce zahrnují náhradu volné kyseliny karboxamidovou skupinou nebo vytvoření cyklického laktamu na karboxylovém konci pro zavedení spojených struktur molekul.

Modifikace aminového konce jsou jak se uvádí výše a zahrnují alkylaci, acetylaci, přídavek karbobenzoylové skupiny, vytvořeni sukcinimídové skupiny apod. Konkrétně může reagovat N-koncová aminoskupina následujícím způsobem:

(a) za vytvoření amidové skupiny vzorce RC(O)NH-, kde R je jak definováno výše, reakcí s halogenidem kyseliny (například RC(O)CI) nebo anhydridem kyseliny. Typicky je možno reakci provádět uvedením do styku přibližně ekvimolárních množství nebo nadbytku (například přibližně 5 ekvivalentů) halogenidu kyseliny s peptidem v inertním rozpouštědle (například dichlormethanu), s výhodou obsahujícího přebytek (například 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethylamin, pro vychytávání kyseliny vytvořené v průběhu reakce. Reakční podmínky jsou jinak obvyklé (například

-45 pokojová teplota po dobu 30 minut). Aikyiace terminální aminoskupiny za vytvoření substituce aminové skupiny nižším alkylem následovaná reakcí s halogenidem kyseliny jak je popsáno výše bude poskytovat Nalkylamidovou skupinu vzorce RC(0)NR-;

(b) za vytvoření sukcinimidové skupiny reakcí s anhydridem kyseliny jantarové. Jak bylo uvedeno dříve, přibližně ekvimolární množství nebo přebytek (např. přibližně 5 ekvivalentů) anhydridu kyseliny jantarové je možno použít a přeměnit aminovou skupinu na sukcinimid v oboru známými způsoby včetně použití přebytku (např. 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethylamin ve vhodném inertním rozpouštědle (např. dichlormethan). Odkazy je možno nalézt například v Wollenberg a další, US patent No. 4,612,132. Je třeba rozumět, že sukcinátová skupina může být substituována například C₂-C₆ alkylovými nebo -SR substituenty, které se připravují běžným způsobem, za poskytnutí substituovaného sukcinimidu na N-konci peptidu. Takové alkylové substituenty se připravují reakcí nižšího olefinu (C₂-C₆) s anhydridem kyseliny maleinové způsobem popisovaným v publikaci Wollenberg a další, výše a substituenty -SR se připravují reakcí RSH s anhydridem kyseliny maleinové, kde R je skupina jak byla definována výše;

(c) za vytvoření skupiny benzyloxykarbonyl-NH- nebo substituované skupiny benzyloxykarbonyl-NH- reakcí s přibližně ekvivalentním množstvím nebo s přebytkem sloučeniny CBZ-CI (tj. benzyloxykarbonylchlorid) nebo substituovanou sloučeninou CBZ-CI ve vhodném inertním rozpouštědle (např. dichlormethan) s výhodou obsahujícím terciární amin pro zachycení kyseliny vytvořené v průběhu reakce;

(d) za vytvoření sulfonamidové skupiny reakcí s ekvivalentním množstvím nebo přebytkem (například 5 ekvivalentů) sloučeniny R-S(O)₂CI ve vhodném inertním rozpouštědle (dichlormethan) pro převedení koncového aminu na sulfonamid, kde skupina R je jak

·« ···» • · · • · ·

• · « « · <· definována výše. S výhodou obsahuje inertní rozpouštědlo přebytek terciárního aminu (například 10 ekvivalentů) jako například diizopropylethylamin pro zachycení vytvořené kyseliny. Reakční podmínky jsou jinak obvyklé (pokojová teplota, 30 min);

(e) za vytvoření karbamátové skupiny reakcí s ekvivalentním množstvím nebo nadbytkem (např. 5 ekvivalentů) sloučeniny R-OC(O)CI nebo R-OC(O)OCeH₄-p-NO₂ ve vhodném inertním rozpouštědle (např. dichlormethan) pro přeměnu koncového aminu na karbamát, kde skupina R je jak definována výše. Inertní rozpouštědlo obsahuje s výhodou přebytek (přibližně 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethylamin, pro zachycení kyseliny vytvořené při reakci. Reakční podmínky jsou jinak obvyklé (například pokojová teplota, 30 minut); a (f) za vytvoření močovinové skupiny reakcí s ekvivalentním množstvím nebo přebytkem (například 5 ekvivalentů) sloučeniny R-N=C=O ve vhodném inertním rozpouštědle (například dichlormethan) pro přeměnu koncového aminu na mocovinovou (tj. skupinu RNHC(O)NH-), kde R je jak definováno výše. Inertní rozpouštědlo obsahuje s výhodou přebytek (například přibližně 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethylamin. Reakční podmínky jsou jinak normální (například pokojová teplota po dobu přibližně 30 minut).

2. Modifikace C-konce

Při přípravě peptidy napodobujících látek, u kterých je Ckoncová karboxylové skupina nahrazena esterem (tj. -C(O)OR, kde R je jak definováno výše) se používá pryskyřic používaných pro přípravu peptídových kyselin, přičemž postranní řetězec chráněného peptidů se štěpí bází a vhodným alkoholem (například methanolem). Ochranné skupiny postranního řetězce se potom odstraní obvyklým způsobem působením fluorovodíku za získání požadovaného esteru.

β 0 0

- 47*Při přípravě peptid napodobujících látek, kde C-koncová karboxylová skupina je nahrazena amidem -C(O)NR³R⁴ se jako pevný nosič pro syntézu peptidu použije benzhydrylaminová pryskyřice. Po ukončení syntézy vede působení fluorovodíku pro uvolnění peptidu s z nosiče přímo k volnému amidu peptidu (tj. na C-konci je skupina -C(O)NH₂). Alternativně vzniká při použití chloromethylované pryskyřice při syntéze peptidu ve spojení s reakcí s amoniakem pro odštěpení peptidu s chráněným postranním řetězcem z nosiče volný amid peptidu a reakcí s alkylaminem nebo dialkylaminem vzniká 10 alkylamid nebo diaikylamid (tj. na C-konci je skupina -C(O)NRR¹, kde R a R¹ jsou jak definováno výše) s chráněným postranním řetězcem. Ochranné skupiny z postranního řetězce se potom odstraní obvyklým způsobem použitím fluorovodíku za poskytnutí volných amidů, alkylamidů nebo dialkylamidů.

V dalším alternativním provedení může být indukována cyklizace C-koncové karboxylové skupiny nebo C-koncového esteru vnitřním odštěpením skupiny -OH nebo esteru (-OR) karboxylové skupiny nebo esteru s N-koncovou aminoskupinou za vytvoření cyklického peptidu. Například po syntéze a štěpení za poskytnutí 2o kyselé formy peptidu se volná kyselina přemění na aktivovaný ester vhodným aktivátorem karboxylové skupiny, jako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC) v roztoku například methylenchloridu (CH₂CI₂), ve směsi s dimethylformamidem (DMF). Cyklický peptid potom vzniká vnitřní reakcí aktivovaného esteru s N-koncovým 25 aminem. Vnitřní cyklizace narozdíl od polymerizace může být zesílena použitím velmi zředěných roztoků. Tyto způsoby jsou v oboru dobře známy.

Je možno provádět cyklizaci peptidů podle vynálezu nebo zavedení desaminového nebo deskarboxylového zbytku na konec χ peptidu takže se již nevyskytuje žádná koncová aminová nebo karboxylová skupina, a tak se sníží vnímavost k proteázám nebo se

I • · • ·« · • * » · ···· • φ 9 9 · · · · · · ·· « « · · · · · ·· _ 48'1......*’* “ omezí konformační změny peptidu. C-koncovými funkčními skupinami sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou amid, nižší alkylamid, nižší dialkylamid, nižší alkoxy, hydroxy a karboxy a jejich nižší esterové deriváty a farmaceuticky přijatelné soli.

D. Modifikace kostry

Další způsoby výroby derivátů peptidu sloučenin podle předkládaného vynálezu se popisují v Hrubý a další, Biochem. J., 268 (2): 249 - 262 (1990). Peptidové sloučeniny podle vynálezu slouží také jako strukturní modely pro nepeptidové sloučeniny s podobnou biologickou aktivitou. Odborníkům v oboru je známo, že pro vytváření sloučenin se stejnou nebo podobnou požadovanou biologickou aktivitou jako původní peptidová sloučenina, ale s výhodnější účinností než původní sloučenina co se týče rozpustnosti, stability a vnímavosti k hydrolýze a proteolýze, je možno použít řadu způsobů (viz Morgan a Gainor, Ann. Rep. Med. Chem., 24: 243 - 252 (1989). Mezi tyto způsoby patří náhrada peptidové kostry kostrou složenou z fosfonátů, amidátů, karbamátů, sulfonamidů, sekundárních aminů a N-methylaminových kyselin.

Peptidy napodobující látky, kde jedna nebo více z peptidylových vazeb (-C(O)NH-) byla nahrazena vazbami jako -CH₂-karbamátová vazba, fosfonátová vazba, -CH₂-sulfonamÍdová vazba, močovinová vazba, vazba sekundárního aminu (-CH₂NH-) a alkylovaná peptidylová vazba (-C(O)NR⁶-, kde R⁶ je nižší alkyl) se připravují běžnými způsoby syntézy peptidů pouhou substitucí vhodně chráněného analogu kyseliny za reagencii pro příslušnou aminokyselinu ve vhodném místě v průběhu syntézy.

Vhodnými reagenciemi jsou například analogy aminokyselin, ve kterých byla karboxylové skupina aminokyseliny nahrazena skupinou vhodnou pro vytvoření jedné z výše uvedených vazeb. Například pokud je třeba nahradit vazbu -C(0)NR- v peptidu vazbou

-CH₂-karbamát (-CH₂0C(0)NR-), karboxylové skupina (-COOH) vhodně chráněné aminokyseliny se nejprve redukuje na skupinu -CH₂OH, která se potom přeměňuje běžnými způsoby na skupinu -OC(O)CI nebo skupinu para-nitrokarbonátovou -OC(O)O-C₆H4-p-NO₂. Reakce každé takové funkční skupiny s volným aminem nebo alkylovaným aminem na N-konci částečně vytvořeného peptidů navázaném na pevném nosiči, vede k vytvoření vazby -CH₂0C(0)NR-. Podrobnější popis vytváření takových vazeb -CH₂-karbamát je možno nalézt v Cho a další, Science. 261: 1303 - 1305 (1993).

Podobně náhrady amidové vazby v peptidů vazbou fosfonátovou může být dosaženo způsobem uváděným v US patentových přihláškách No. 07/943,805, 08/081,577 a 08/119,700.

Náhrady amidové vazby v peptidů vazbou -CH₂-sulfonamidovou může být dosaženo redukcí karboxylové skupiny (-COOH) vhodně chráněné aminokyseliny na skupinu -CH₂OH a přeměnou hydroxylové skupiny na vhodnou odstěpitelnou skupinu jako je skupina tosylová, běžnými způsoby. Reakce tosylovaného derivátu například s kyselinou thiooctovou následovaná hydrolýzou a oxidační chlorací poskytne funkční skupinu -CH₂-S(O)₂CI, která nahradí karboxylovou skupinu jinak vhodně chráněné aminokyseliny. Použití tohoto vhodně chráněného analogu aminokyseliny při syntéze peptidů poskytne zavedení vazby -CH₂S(O)₂NR-, která nahradí amidovou vazbu v peptidů a tím vznikne peptid napodobující látka. Úplnější popis přeměny karboxylové skupiny aminokyseliny na skupinu -CH₂S(O)₂CI je možno najít v Weinstein, Boris, Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, díl 7, str. 267 - 367, Marcel Dekker, lne., New York (1983).

Náhrady amidové vazby v peptidů močovinovou vazbou je možno dosáhnout způsobem uvedeným v US patentové přihlášce No. 08/147,805.

- 50 Vazby sekundárního aminu, ve kterých vazba -CH₂NHnahrazuje amidovou vazbu v peptidů, mohou být připraveny použitím například vhodně chráněného dipeptidového analogu, ve kterém byla karbonylová vazba amidové vazby redukována na skupinu CH₂5 běžnými způsoby. Například v případě diglycinu dojde redukcí amidu na amin po odstranění ochranných skupin ke vzniku sloučeniny H₂NCH₂CH2NHCH₂COOH, která se pak pro další reakce používá v Nchráněné .formě. Příprava takových analogů redukcí karbonylové skupiny amidové vazby v dipeptidu je v oboru dobře známa.

Vhodně chráněné analogy aminokyselin se používají při běžné syntéze peptidů stejným způsobem jako odpovídající aminokyseliny. Například se při této reakci používají typicky přibližně tři ekvivalenty chráněného analogu aminokyseliny. Použije se inertního organického rozpouštědla jako je methylenchlorid nebo DMF a jestliže se jako 15 vedlejší produkt reakce vytváří kyselina, reakční rozpouštědlo obsahuje typicky přebytek terciárního aminu pro zachycení při reakci vytvořené kyseliny. Zvláště výhodným terciárním aminem je diizopropylethylamin, který se typicky používá přibližně v desetinásobném přebytku. Výsledkem reakce je zavedení analogu 2o aminokyseliny s nepeptidovou vazbou do peptid napodobující látky.

Tato substituce může být opakována podle potřeby, takže neamidovými vazbami se nahradí od 0 až po veškeré amidové vazby.

Je také možno peptidy podle vynálezu cyklizovat nebo na konce peptidů zavádět desaminové nebo deskarboxylové zbytky, takže není 25 přítomna žádná koncová aminová nebo karboxylová skupina, čímž se sníží vnímavost k proteázám nebo se omezí konformační změny peptidů. C-koncové funkční skupiny sloučenin podle předkládaného vynálezu zahrnují amid, nižší alkylamid, nižší dialkylamid, nižší alkoxy, hydroxy a karboxy a jejich nižší esterové deriváty a jejich 3o farmaceuticky přijatelné soli. Příklady cyklizovaných sloučenin se uvádějí v tabulkách 4, 5, 6, 8 a 9.

1'*

E. Vytváření disulfidovych vazeb

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou existovat v cyklizované formě s intramolekulární disulfidovou vazbou mezi thiolovými skupinami cysteinů. Alternativně může být vytvářena intermolekulární disulfidová vazba mezi thiolovými skupinami cysteinů za vytvoření dimerní (nebo výše oiigomerní) sloučeniny. Jeden nebo více cysteinových zbytků může být také substituován homocysteinem. Tyto intramolekulární nebo intermolekulární disulfidové deriváty mohou být schematicky znázorněny jak je uvedeno níže:

kde man jsou nezávisle na sobě 1 nebo 2.

Další provedení tohoto vynálezu poskytuje analogy těchto disulfidových derivátů, ve kterých jeden z atomů siry byl nahrazen skupinou CH₂ nebo jinými izostery síry. Tyto analogy mohou být připraveny intramolekulární nebo intermolekulární reakcí s použitím

• · · ·

kde p je jedna nebo 2. Odborníku v oboru bude jasné, že tato reakce muže probíhat také s použitím jiných homologú výše uvedeného derivátu kyseliny a-amino-g-máselné ukázaného výše a homocysteinu.

Alternativně může být amino konec peptidu zakončen alfasubstituovanou kyselinou octovou, přičemž alfa-substituentem je odštěpitelná skupina, jako je kyselina a-halogenoctová, například kyselina a-chloroctová, a-bromoctová nebo a-jodoctová. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být cyklizovány nebo dimenzovány reakcí odštěpitelné skupiny se sírou nebo cysteinovým nebo homocysteinovým zbytkem (viz například Barker a další, J. Med. Chem., 35: 2040 - 2048 (1992) a Or a další, J. Org. Chem., 56: 3146 3149 (1991). Příklady dimenzovaných sloučenin se uvádějí v tabulkách 7, 9 a 10.

V. Použitelnost

Sloučeniny podle vynálezu jsou použitelné in vitro jako jedinečné nástroje pro porozumění biologické úloze TPO, včetně vyhodnocení mnoha faktorů týkajících se vlivu na produkci a ovlivňování produkcí TPO a postupů vazeb na receptory. Předkládané sloučeniny jsou také použitelné při vývoji jiných sloučenin, které se váží na TPO-R a aktivují jej, protože předkládané sloučeniny poskytují důležité informace o vztahu mezi strukturou a aktivitou, které by mohly tento vývoj umožnit.

• ·· to

Sloučeniny jsou také použitelné jako kompetitivní vazné látky v testech určených ke screeningu nových agonistů receptoru TPO.

V provedení těchto testů mohou být sloučeniny podle vynálezu použity bez modifikace nebo mohou být řadou způsobů modifikovány; například značením, jako je kovalentní nebo nekovalentní připojení části, která přímo nebo nepřímo poskytuje detekovatelný signál.

V jakémkoliv z těchto testů mohou být materiály značeny buď přímo nebo nepřímo. Možnosti pro přímé značení zahrnují skupiny markérů, jako jsou: radioaktivní markéry jako je ¹²⁵l, enzymy (US patent 3,645,090), jako je peroxídáza a alkalická fosfatáza a fluorescenční markéry (US patent No. 3,940,475), schopné monitorování změny v intenzitě fluorescence, posunu vlnových délek nebo polarizace fluorescence. Možnosti nepřímého značení zahrnují biotinylaci jedné ze složek následovanou vazbou na avidin připojený na jednu z výše uvedených markerových skupin. Sloučeniny mohou také obsahovat spacery (mezerníky) nebo linkery v případech, kdy mají být připojeny na pevný nosič.

Navíc mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity pro svou schopnost vázat se na receptor TPO pro detekování receptorů TPO u živých buněk, fixovaných buněk, v biologických tekutinách, ve tkáňovách homogenátech, u čištěných přírodních biologických materiálů apod. Například značením těchto peptidů je možno identifikovat buňky s receptory TPO-R na povrchu. Navíc mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity pro svou schopnost vázat se na receptor TPO při in šitu barveni, FACS (fluorescencí aktivované třídění buněk), westernové blotování, ELISA apod. Navíc mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity pro svou schopnost vázat se na receptor TPO při čištění receptorů nebo při čištění buněk exprimujících receptory TPO na povrchu buněk (nebo uvnitř permeabilizovaných buněk).

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také použity jako komerční činidla pro různá použití v medicíně a pro diagnostická použití. Tato použití zahrnují bez omezení: (1) použití jako kalibračního standardu pro kvantifikaci aktivit kandidátů na antagonisty TPO v celé řadě funkčních testů; (2) použití pro udržování proliferace růstu TPO-dependentních buněčných linií; (3) použití při strukturní analýze receptoru TPO pomocí kokrystalizace; (4) použití pří výzkumu mechanismu přenos signálu TPO/aktivace receptoru; a (5) jiné výzkumy a diagnostická použití, kde dochází s výhodou k aktivaci receptoru TPO nebo se tato aktivace pohodlně kalibruje proti známému množství agonisty TPO apod.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro expanzi megakaryocytů in vitro a jejich předchůdců, jak ve spojení s dalšími cytokiny nebo samy o sobě (viz například DiGiusto a další, publikovaná PCT přihláška No. 95/05843). Chemoterapie a radiační terapie způsobují trombocytopenii usmrcováním rychle se dělící zralejší populace megakaryocytů. Toto terapeutické působení může také snížit počet a životaschopnost nezralých, méně mítoticky aktivních prekurzorových buněk megakaryocytů. Léčení trombocytopenie pomocí TPO nebo sloučeninami podle předkládaného vynálezu může být uspíšeno podáváním infuzí pacientům po chemoterapii nebo radiační terapii s jejich vlastními buňkami obohacenými o megakaryocyty a nezralé prekurzory v kultuře in vitro.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podávány teplokrevným živočichům včetně Člověka pro aktivaci TPO-R in vivo. Předkládaný vynález tedy zahrnuje způsoby terapeutického působení na poruchy spojené s TPO, které zahrnují podávání sloučeniny podle vynálezu v dostatečném množství pro napodobení účinku TPO na TPO-R in vivo. Například peptidy a sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány pro léčení celé řady hematologických poruch, včetně

- 55bez omezení poruch krevních destiček a trombocytopenie, zvláště při spojení s transfuzemi kostní dřeně, radiační terapií a chemoterapií.

V některých provedeních vynálezu se s výhodou nejprve podávají pacientům s chemoterapií nebo radiační terapií antagonisté s TPO a potom se jim podávají agonisté TPO podle vynálezu.

Účinnost sloučenin podle předkládaného vynálezu může být vyhodnocována buď in vitro nebo in vivo některým z četných modelů popsaných v McDonald, Am. J. of Pediatrie Hematoloov/Oncology, 14: 8 - 21 (1992).

w Podle jednoho provedení jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu použitelné pro léčení trombocytopenie spojené s transfuzemi kostní dřeně, radiační terapií nebo chemoterapií. Sloučeniny se typicky budou podávat preventivně před chemoterapií, radiační terapií nebo transplantací kostní dřeně nebo po takovém zákroku.

Předkládaný vynález tedy také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující jako aktivní složku alespoň jeden z peptidů nebo peptidy napodobujících látek podle vynálezu ve spojení s farmaceutickým nosičem nebo diluentem. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány orálně, pulmonárně, parenterálně (intramuskulárně, intraperitoneálně, intravenózně (IV) nebo subkutánně), inhalačně (prostřednictvím prostředku ve formě jemného prášku), transdermálně, nazálně, vaginálně, rektálně nebo sublingválními cestami podávání a mohou být ve formě dávkovačích forem vhodných pro každou z těchto cest podávání (viz např.

Bernstein a další, publikovaná PCT přihláška No. WO 93/25221; Pitt a další, publikovaná PCT přihláška No. WO 94/17784; a Pitt a další, evropská patentová přihláška 613,683).

Pevnými dávkovacími formami pro orální podávání jsou kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V těchto pevných dávkovačích

3o formách je aktivní sloučenina smísena spolu s alespoň jedním inertním farmaceuticky přijatelným nosičem jako je sacharóza, laktóza ··* · • · · ·

nebo škrob. Tyto dávkovači formy mohou, jak je tomu v normální praxi, obsahovat další látky jiné než inertní rediva, například kluzné látky, jako je stearan hořečnatý. V případě kapslí, tablet a pilulek, mohou dávkovači formy obsahovat také pufrovací prostředky. Tablety a pilulky mohou být navíc připraveny s enterosolventními povlaky.

Kapalné dávkovači formy pro orální podávání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy spolu s elixíry, které obsahují běžně v oboru používaná řediva, jako je voda. Vedle těchto inertních řediv mohou prostředky také obsahovat adjuvantní látky, jako jsou smáčedla, emulgační a suspendující prostředky a sladidla, ochucovací látky a parfémy.

Prostředky podle vynálezu pro parenterální podávání obsahují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze nebo emulze. Příklady nevodných rozpouštědel nebo vehikul jsou propylenglykoi, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako je olivový olej a obilný olej, želatina, a injikovatelné organické estery jako je ethyloleát.

Tyto dávkovači formy mohou také obsahovat adjuvantní látky jako jsou ochranné látky, smáčedla, emulgátory a dispergující látky. Mohou být sterilizovány například filtrem zahdržujícím bakterie, přidáním sterilízačních prostředků do farmaceutického prostředku, ozářením nebo zahřátím prostředku. Mohou být také vyrobeny bezprostředně před použitím pomocí sterilní vody nebo některého jiného sterilního injikovatelného média.

Sloučeniny pro rektální nebo vaginální podávání jsou s výhodou čípky, které mohou obsahovat navíc k aktivní látce vehikula, jako je kakaové máslo nebo Čípkový vosk. Prostředky pro nazální nebo sublingvální podávání se rovněž připravují pomocí vhodných standardních, v oboru známých vehikul.

Prostředky obsahující sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány pro preventivní a/nebo léčebné účely. Při terapeutických použitích se prostředky podávají pacientům trpícím onemocněním, jak

fy · Φ · Φ «φ · ♦ φ Φ · Φ · 0 « · 0 · 0 ·· φφ φ «0 · Φ · · · φ « 0 · 0 *

Φ «Φ 0· ·· · * bylo popsáno výše, v množství dostatečném pro vyléčení nebo alespoň částečné zastavení příznaků onemocnění a jeho komplikací. Množství odpovídající dosažení tohoto cíle se definuje jako „terapeuticky účinná dávka“. Množství dostatečně účinné pro toto použití bude záviset na vážnosti onemocnění a hmotnosti a celkovém stavu pacienta.

Prostředky podle vynálezu mohou být také zapouzdřeny do mikropouzder, například metodou: Tice and Bibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, vyd. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N. Y. (1992), str. 315 - 339.

Při preventivním použití se prostředky obsahující sloučeniny podle vynálezu podávají pacientům vnímavým nebo pacientům s jiným rizikem konkrétního onemocnění. Takové množství se definuje jako „profylakticky účinná dávka“. Při tomto použití závisí opět přesné množství na stavu pacienta a jeho hmotnosti.

Množství antagonisty TPO nezbytného pro účinné léčení bude záviset na mnoha různých faktorech, včetně způsobu podávání, cílového místa, fyziologického stavu pacienta a jiných podávaných lécích. Léčebné dávky by měly být titrovány pro optimalizaci bezpečnosti a účinností. Užitečné vodítko pro množství pro podávání in šitu těchto reagencií mohou poskytnout dávky používané in vitro. Dalším vodítkem pro dávkování u člověka může být testování na zvířatech účinných dávek pro léčení konkrétních onemocnění. Různé předpoklady se popisují například v Gilman a další, (vydavatelé), Goodman and Gilmanů: The Pharmacoloqical Basis of Therapeutics, 8. vydání, Pergamon Press (1990); a Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 7. vydání, Mack Publishíng Co., Easton, Penn. (1985).

Peptidy a peptidy napodobující látky podle vynálezu jsou účinné při léčení stavů podmíněných TPO při podávání v rozmezí dávek od přibližně 0,001 mg až přibližně 10 mg/kg tělesné hmotnosti za den. Konkrétní použitá dávka se řídí léčeným onemocněním, cestou podávání a úsudkem ošetřujícího lékaře v závislosti na faktorech, jako je vážnost stavu, věk a celkový stav pacienta apod.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1A-B ilustrují výsledky funkčního testu v přítomnosti různých peptidů; test se popisuje v příkladu 2. Obr. 1A je grafické znázornění výsledků proliferačního testu buněk Ba/F3 transfekovaných TPO-R pro zvolené peptidy podle vynálezu:

označuje výsledky pro GGCADGPTLREWISFCGK (biotin);

x označuje výsledky pro GGCADGPTLREWISFCG;

▲ označuje výsledky pro LAIEGPTLRQWLHGNGRD T;

• označuje výsledky pro GNADGPTLRQWLEGRRPK

N ; a + označuje výsledky pro TIKGPTLRQWLKSREHTS.

Obr. 1B je grafické znázornění výsledků se stejnými peptidy a rodičovskou buněčnou linií.

Obr. 2A-C ukazují výsledky oligomerizace peptidu s použitím testu proliferace buněk Ba/F3 transfekovaných TPO-R. Obr. 2A ukazuje výsledky testu pro komplexní biotinylovaný peptid (AF12285 se streptavidinem (SA) jak pro transfekovanou, tak i rodičovskou buněčnou linii. Obr. 2B ukazuje výsledky pro test volného biotinylovaného peptidu (AF12285) jak pro transfekovanou, tak i rodičovskou buněčnou linii.

Obr. 3A-G ukazují výsledky řady kontrolních experimentů ukazujících aktivitu TPO, peptidů podle předkládaného vynálezu, EPO a vazebných peptidů EPO-R v testu buněčné proliferace s použitím

-59*« · · « te b ♦♦ • » * * * 9 9 9 · · ♦ · • a · · » · « · · *it «v ♦ * · · ♦ · buď buněčné linie Ba/F3 transfekované TPO-R a její odpovídající rodičovské linie nebo EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3A zobrazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím buněčné linie Ba/F3 transfekované TPO-R a její odpovídající rodičovské linie. Obr. 3B ukazuje výsledky pro EPO v testu buněčné proliferace s použitím buněčné linie Ba/F3 transfekované TPO-R a její odpovídající rodičovské linie. Obr. 3C ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný peptid (AF12285 se streptavidinem (SA) a komplexní formu EPO-R vazebného peptidu (AF 11505 s SA) v buněčné linii Ba/F3 transfekované TPO-R. Výsledky pro odpovídající rodičovskou linii jsou ukázány na obr. 3D. Obr. 3E ukazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3F ukazuje výsledky pro EPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3G ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný peptid (AF12885 se streptavidinem (SA) a komplexní formu biotinylovaného EPO-R vazebného peptidu (AF11505 s SA) v EPO-dependentní buněčné linii.

Obr. 4A-C ilustrují konstrukci knihoven typu peptidy na plazmidech ve vektoru pJS142. Obr. 4A ukazuje restrikční mapu a pozice genů. Plazmid knihovny obsahuje terminátor transkripce rrnb, gen bia pro umožnění selekce ampicilinem, intragenovou oblast fága M13 (M13 IG) pro umožnění zpětného získání jednořetězcové DNA, počátek replikace plazmidu (on), dvě sekvence lacO_s a gen araC pro umožnění pozitivní a negativní regulace exprese fuzního genu lac řízené promotorem araB. Obr. 4B ukazuje sekvenci klonovací oblasti na 3’ konci genu lac I včetně restrikčních míst Sfil a Eagl použitých při konstrukci knihovny. Obr. 4C ukazuje ligaci teplotně hybridizovaných oligonukleotidů knihovny ON-829 a ON-830 k místům Sfil plazmidu pJS142 za vytvoření knihovny. Jednoduché mezery v sekvenci označuji místa ligace.

- 60 Obr. 5A-B ilustruje klonování do vektorů pELM3 a pELM15 MBP. Obr. 5A ukazuje sekvenci na 3’ konci fuzního genu malE včetně kódující sekvence MBP, polyasparagínového linkeru, štěpícího místa proteázy faktoru Xa a dostupných klonovacích míst. Zbývající části vektorů se odvozují z pMALc2 (pELN3) a pMALp2 (pELM15) dostupných od formy New Engiand Biolabs. Obr. 5B ukazuje sekvenci vektorů po přenosu fragmentu knihovny BspEII-Scal do pELM3/pELM15 štěpených Agel-Scal. Přenesená sekvence obsahuje sekvenci kódující GGG peptidový linkerz knihovny pJS142.

Obr. 6A znázorňuje restrikční mapu a polohy genů při konstrukci knihoven přilbového (headpiece) dimeru ve vektoru pCMG14. Plazmid z knihovny zahrnuje: terminátor transkripce rrnB, gen bla pro umožnění selekce ampicilinem, intragenovou oblast fága M13 (M13 IG) pro umožnění znovuobnovení jednořetězcové DNA, počátek replikace plazmidu (oři), jednu sekvenci lacO_s a gen araC pro umožnění pozitivní a negativní regulace exprese fuzního genu přilbového dimeru řízeného promotorem araB. Obr. 6B znázorňuje sekvenci klonovací oblasti na 3’konci přilbového dimerního genu včetně míst Sfil a Eagl používaných při konstrukci knihovny. Obr. 6C ukazuje ligaci teplotně hybridizovaného ON-1679, ON-829 a ON-830 na místa Sfil plazmidu pCMG14 pro vytvoření knihovny. Jednoduché mezery v sekvenci označují místa ligace.

Obr 7 až 9 ukazují výsledky dalších testů vyhodnocujících účinnost peptidů a peptidy napodobujících látek podle vynálezu. U myší používaných v tomto testu se karboplatinou vyvolá trombocytopenie. Obr. 7 ukazuje typické výsledky, jestliže se myším Balb/C v den 0 podá karboplatina (125 mg/kg intraperitoneálně). Čárkované přímky představují neošetřená zvířata ze tří experimentů. Plné čáry představují skupiny, kterým byla podána karboplatina ve třech experimentech. Silné plné čáry představují historická data. Obr. 8 znázorňuje účinek titrace karboplatiny na počty krevních destiček

-61 • · · · ·· « · * ···· * ♦ ♦ · « · w «« ·· ·· u myší ošetřených uvedenými množstvími karboplatiny (v mg/kg, intraperitoneálně (ip) v den 0). Obr. 9 ukazuje zmírnění karboplatinou indukované trombocytopenie v den 10 pomocí peptidu AF12513 (513). Karboplatina (CBP; 50 - 125 mg/kg, intraperitoneálně) byla podána v den 0. AF12513 (1 mg/kg, ip) byl podáván ve dnech 1-9.

Ačkoliv v následujících příkladech se konkrétně popisují pouze výhodná provedení vynálezu, je zřejmé, že do rámce vynálezu spadají také jejiclrmodifikace a variace.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Syntéza peptidu na pevné fázi

Různé peptidy podle vynálezu byly syntetizovány s použitím techniky syntézy na pevné fázi podle Merrifielda (viz Steward a Young, Solid Phase Peptide Svnthesis, 2. vyd., Pierce Chemical, Rockford, IL (1984) a Merrifield, J. Am. Chem. Soc„ 85: 2149 (1963) na automatickém přístroji Milligen/Biosearch 9600 nebo na syntezátoru peptidů Applied Biosystems lne. Model 431 A. Peptidy byly sestavovány s použitím standardních protokolů systému Applied Biosystems lne., Software version 1.01.Každá vazebná reakce byla prováděna po dobu 1 až 2 hodin se sloučeninou BOP (benzotriazolyl N-oxtrisdimethylaminofosfoniumhexafluorofosfát) a HOBt (1-hydroxybenzotriazol).

Bylo použito pryskyřice HMP nebo PAL (Milligen/Biosearch), která je zesítěnou polystyrénovou pryskyřicí s kyselinou 5-(4'-Fmocaminomethyl-3,5’-dimethoxyfenoxy)valerovou jako linkerem. Použití pryskyřice PAL vede po odštěpení peptidu z pryskyřice k vytvoření amidové funkční skupiny na karboxylovém konci. Po odštěpeni poskytne pryskyřice HMP skupinu karboxylové kyseliny na C-konci

- 62 finálního produktu. Většina reagencií, pryskyřic a chráněných aminokyselin (volných nebo navázaných na pryskyřici) byla zakoupena u firmy Milipore nebo Applied Biosystems lne.

Pro ochranu aminových skupin v průběhu vazby byla použita skupina Fmoc. Ochrana primárního aminu na aminokyselinách byla dosažena pomocí Fmoc a ochranné skupiny postranních řetězců byly t-butyl pro serin, tyrozin, asparagin, kyselinu glutamovou a threonin; trityl pro -glutamin; Pmc (2,2,5,7,8-pentamethylchromasulfonát) pro arginin; N-t-butyloxykarbonyi pro tryptofan; N-trityl pro histidin a glutamin; a S-trityl pro cystein.

Odštěpení peptidů z pryskyřice a současné odstranění ochranných skupin z funkčních skupin postranních řetězců bylo provedeno činidlem K nebo jeho mírnou modifikací. Alternativně při syntéze takových peptidů, které měly amidovaný karboxyiový konec, byl zcela uspořádaný peptid odštěpen směsí 90 % kyseliny trifluoroctové, 5 % ethandithiolu a 5 % vody zpočátku při teplotě 4 °C, která se postupně zvyšovala na pokojovou teplotu. Peptidy s odstraněnými ochrannými skupinami byly sráženy diethyletherem. Ve všech případech se prováděla purifikace pomocí preparativní HPLC s reverzní fází na koloně s navázaným Cis v gradientu acetinitril/voda v 0,1 % kyselině trifluoroctové. Homogenní peptidy byly charakterizovány hmotnostní spektrometrií s bombardováním rychlými atomy nebo hmotnostní spektrometrií s elektrorozprašováním a analýzou aminokyselin tam, kde to bylo použitelné.

Příklad 2

Biologické testy

Biologickou aktivitu peptidů je možno měřit s použitím testu proliferace buněk dependentních na trombopoetinu. Myší IL-3 dependentní Ba/F3 buňky byly transfekovány s lidským TPO-R • · · ·♦ · · · · * · o·· · ·· • » *» * ·· ··· ·· • * · φ··· · ·· ·· «« »· · *· ··

- 63 s úplnou délkou. V nepřítomnosti 1L-3 (kondicionované médium WEHI-3) jsou tyto buňky dependentní pro proliferaci na TPO. Rodičovská netransfekovaná buněčná linie neodpovídá na lidský TPO, ale zůstává IL-3 dependentní.

Biologické testy byly prováděny na obou těchto buněčných liniích s použitím syntetických peptidů odvozených ze screeningu knihovny. Buňky rostly v kompletním médiu RPMI-10 obsahujícím 10 % WEHI-3 kondicionovaného média, potom byly dvakrát promyty v PBS, resuspendovány v médiu neobsahujícím WEHI-3 io kondicionované médium a přidány do jamek obsahujících zředění peptidu nebo TPO v koncentraci 2 χ 10⁴ buněk/jamku. Buňky byly inkubovány 48 hodin při 37 ’C ve zvlhčené atmosféře 5 % CO2 a metabolická aktivita byla testována redukcí MTT na formazan, přičemž absorbance byla měřena při 570 nm na čtecím zařízení pro 15 destičky ELISA. Testované peptidy stimulovaly proliferaci TPO-R transfekovaných buněk Ba/F3 v závislosti na dávce, jak je ukázáno na obr. 1. Tyto peptidy nemají žádný vliv na rodičovskou buněčnou linii.

Příklad 3

Vazebná afinita

Vazebné afinity chemicky syntetizovaných peptidů vůči TPO-R byly měřeny v kompetitivním vazebném testu. Jamky mikrotitrační destičky byly potaženy 1 mg streptavidinu, blokovány PBS/1 % BSA a potom inkubovány s 50 ng biotinylované antireceptorové 25 imobilizační protilátky (Ab179). Jamky byly potom inkubovány se sklizní rozpustného TPO-R v ředění 1:10. Různé koncentrace peptidu nebo peptid napodobující látky byly smíseny s konstantním množstvím zkrácené formy TPO obsahující zbytky 1-156 fúzované k C-konci maltózového vazebného proteinu (MBP-TPOise). Směsi peptidu MBP30 TPO₁₅₆ byly přidány do jamek potažených TPO-R, inkubovány dvě hodiny při 4 ’C a potom promyty PBS. Množství MBP-TPO₁₅₆, které

- 64 bylo v rovnováze navázáno, bylo měřeno přídavkem králičího antiséra proti MBP, po kterém následovalo působení kozího protikráličího IgG konjugovaného s alkalickou fosfatázou. Množství alkalické fosfatázy v každé jamce bylo potom určováno s použitím standardních metod.

Test se provádí v širokém rozmezí koncentrací peptidu a výsledky jsou vyneseny do grafu tak, že osa y představuje množství navázaného MBP-TPOi₅₆ a osa x představuje koncentraci peptidu nebo peptid napodobující látky. Je tak možno určit koncentraci, při které peptid nebo peptid napodobující látka sníží množství MBPTPOi56 navázané na imobilizovaný TPO-R o 50 % (IC_S0). Disociační konstanta (Kd) pro peptid by měla být podobná při použití výše uvedených reakčních podmínek změřené hodnotě IC₅₀.

Příklad 4 „Peptidy na plazmidech

Vektor pJS142 se používá pro konstrukci knihovny a je ukázán na obr. 4. Pro konstrukci knihovny jsou nutné tři sekvence oligonukleotidů: ON-829 (5’ ACC ACC TCO GG); ON-830 (5’ TTA CTT AGT TA) a oligonukleotid specifický pro knihovnu, o který se zajímáme (5’ GA GGT GGT {ΝΝΚ}_Π TAA STA AGT AAA GC), kde {NNK}_n označuje náhodnou oblast požadované délky a sekvence. Oligonukleotidy mohou být v průběhu syntézy fosforylovány chemicky na 5’ konci nebo po purifikaci pomocí polynukleotidkinázy. Potom se teplotně hybridizují v molárním poměru 1:1:1a navážou na vektor.

Kmen E. coii, který se s výhodou používá pro techniku panningu, má genotyp: A(srl-recA) endAí nupG lon-11 sulA1 hsdR17 A(ompT-fepC)266 AclpA319::kan Alacl lac ZU118, který může být připraven z kmene E. coii získaného z Genetic Stock Center at Yale University (E. coii b/r, označení v centru CGSC:6573) s genotypem lon-11 sulA1. Výše popsaný kmen E. coii se pro použití připravuje

- 65 elektroporací, jak se popisuje v Dower a další, Nucleic Acids Res.. 16: 6127 (1988), kromě toho, že ve všech promývacích krocích se používá 10 % glycerol. Buňky jsou testovány na účinnost s použitím 1 pg plazmidu Bluescript (Stratagene). Tyto buňky se používají pro 5 pěstování původní knihovny a pro zesílení obohacené populace po každém cyklu panningu.

Peptidy na plazmidech se z buněk uvolňují pro panning mírným enzymatickým štěpením buněčné stěny s použitím lysozymu. Po zcentrifugování částí buněk lze pro většinu receptorů přímo použít io surový lyzát. Jestliže je zapotřebí nějakého dalšího čištění plazmidových komplexů, je možno použít pro odstranění mnoha z nízkomolekulárních kontaminantů surového lyzátu gelové filtrační kolony.

Panning se provádí v pufru (HEKL) s nižší koncentrací soli než is většina fyziologických pufrů. Panning je možno provádět v mikrotitračních destičkách s receptorem (mobilizovaným na neblokující monoklonální protilátce (MAb) nebo na kuličkách nebo kolonách. Konkrétně je možno použít v prvním cyklu panningu 24 jamek, přičemž každá jamka je pokrytá receptorem. Pro druhý cyklus 20 se typicky používá 6 jamek pokrytých receptorem (vzorek PAN) a 6 jamek bez receptorů (vzorem NC). Srovnávání počtu plazmidů v těchto dvou vzorcích může poskytnout informaci, zda jsou klony specifické vůči receptorů pomocí panningu obohaceny. „Obohacení“ se definuje jako poměr transformantú PAN ke transformantúm 25 získaným ze vzorku NC. Desetinásobné obohacení obvykle naznačuje to, že jsou přítomny klony specifické k receptorů.

V dalších cyklech panningu je užitečné snížit vstup lyzátu do jamek na nižší nespecifickou vazbu pozadí plazmidových komplexů.

V cyklu 2 se obvykle používá 100 μΙ lyzátu na jamku. V cyklu 3 se používá 100 μΙ lyzátu na jamku, zředěných v poměru 1/10 HEKL/BSA.

-66*Pro další cykly panningu je vstup plazmid transformujících jednotek alespoň 1000 x větší než odhadované zbývající různorodosti.

Vazebné vlastnosti peptidů kódované jednotlivými klony se typicky vyšetřují po třech, čtyřech nebo pěti cyklech panningu, v závislosti na hodnotách obohacení. Typicky se používá metody ELISA, která detekuje specifickou vazbu na receptor fuzními proteiny Lacl-peptid. Lad je normálně tetramer a minimální funkční jednotka vázající se na DNA je dimer. Peptidy se tedy ukazují na fuzním proteinu vícenásobně. Za předpokladu, že v jamkách může být imobilizována dostatečná hustota receptoru, se budou peptidy fúzované k Lad vázat na povrch kooperativním vícenásobným způsobem. Tato kooperativní vazba dovolí detekci výskytu vazby s malou vnitřní afinitou. Citlivost tohoto testu je výhodná v tom, že mohou být identifikovány počáteční úspěšné pokusy s nízkou afinitou, ale je nevýhodná v tom, že signál při ELISA nekoreluje s vnitřní afinitou peptidů. Fuze peptidů k maltózovému vazebnému proteinu (MBP) jak je popsáno níže, dovolí testování ve formátu ELISA, kde síla signálu lepší koreluje s afinitou (viz obr. 5A-B).

DNA ze zajímavých klonů může být připravena ve dvouretězcové formě s použitím jakékoliv standardní metody miniprepu. Kódující sekvence zajímavých jednotlivých klonů nebo populací klonů mohou být převedeny do vektorů, kde jsou tyto sekvence fúzovány ve čtecím rámci s genem kódujícím MBP, proteinem, který se obvykle vyskytuje v roztoku jako monomer. Klonování knihovny do pJS142 vytvoří restrikční místo BspEI v blízkosti počátku náhodné kódovací oblasti knihovny. Štěpením BspEI a Scal umožní čištění fragmentu DNA o velikosti přibližně 900 bp, který může být subklonován do jednoho ze dvou vektorů, pELM3 (cytoplazmatický) nebo pELM15 (periplazmatický), které jsou jednoduché modifikace vektorů pMALc2 a pMALp2, dostupných komerčně od firmy New England Biolabs (viz obr. 5A-B). Štěpení «φ«4 4 4« 4444 «444 «44 4« · *44« « 4 4 · *444 φ 4·«4 4* «4*4 4 • 4 4 4 4 · ·44«

- 67pELM3 a pELM15 Agel a Scal umožní účinné klonování fragmentu BspEI-Scal z knihovny pJS142. Konce BspEI a Agel jsou kompatibilní pro lígaci. Navíc je správná ligace míst Scal nezbytná pro znovuvytvoření funkčního genu bia (rezistence na ampicilin) a tím pro snížení množství klonů v pozadí z nežádoucích provedení ligace. Exprese fúzí peptidů MBP řízeného promotorem tac může potom být indukována pomocí IPTG.

Lyzáty pro ELISA Lad nebo MBP se připravují z jednotlivých klonů lyží buněk pomocí lysozymu a odstraněním nerozpustných částí buněk centrifugách Lyzáty jsou potom přidány do jamek obsahujících imobilizovaný receptor a do kontrolních jamek bez receptoru. Vazba fúzí peptidů MBP nebo Lad se detekuje inkubací s králičím polyklonálním antisérem buď proti Lad nebo MBP, následovanou inkubací s kozí antikráličí sekundární protilátkou značenou alkalickou fosfatázou. Navázaná alkalická fosfatáza se detekuje chromogenním substrátem p-nitrofenylfosfátem.

Příklad 5

Systém „přilbového dimeru“

Varianta techniky Lad peptidů na plazmidech používá vazebného proteinu DNA nazývaného přilbový dimer („headpiece dimer“). Vazba DNA lac represorem E. coii je zprostředkována přibližně 60 aminokyselinami „přilbové“ domény. Dimer přilbové domény, který se váže na lac operátor se normálně vytváří asociací mnohem delší C-koncové domény o délce přibližně 300 aminokyselin. Systém „přilbového dimeru“ využívá přilbového dimeru molekul obsahujících dva přilbové úseky spojené krátkým peptidovým linkerem. Tyto proteiny se na DNA vážou dostatečně stabilně, aby dovolily aasociaci peptidového epitopu na C-konci přilbového dimeru s plazmidem kódujícím tento peptid.

-68 Náhodné peptidy fuzují s C-koncem přilbového dimeru, který se váže na plazmid, který jej kóduje za vytvoření komplexu peptid přilbový dimer - plazmid, jehož screening je možno provést pomocí panningu. Přilbový dimer systému peptidy na plazmidech dovoluje větší selektivitu pro ligandy s vysokou afinitou než systém Lacl. Systém přilbového dimeru je tedy použitelný pro přípravu mutagenetických knihoven založených na počátečních úspěšných sekvencích s nízkou afinitou a selekci variant těchto počátečních sekvencí s vyšší afinitou.

Knihovny se konstruují jako v případě peptidů na plazmidech s použitím přilbového dimerního vektoru pCMG14 (viz obr. 6A-C). Přítomnost lac operátoru se pro vazbu plazmidu proteinem přilbového dimeru nevyžaduje. Knihovny byly zavedeny do bakteriálního kmene obsahujícího E. coli (lon-11 sulA1 hsdR17 (ompT-fepC) AcipA319::kan Alacl lac ZU118 A(srl-recA) 306::Tn10 a amplifikovány za podmínek bazální (A) indukce promotoru. Panning knihoven přilbového dimeru se provádí podobnými postupy jako u knihoven Lacl kromě toho, že na místo pufru HEKL se používá pufr HEK a eluce plazmidú z jamek se provádí vodným fenolem namísto IPTG. Sekvence z panningu přilbového dimeru jsou často charakterizovány po převodu do vektoru MBP tak, že mohou být testovány afinitně citlivou metodou ELISA MBP a také tak, že populace klonů mohou být testovány přenosem kolonií se značeným receptorem.

Příklad 6

V tomto příkladu byly cyklizované sloučeniny testovány třemi způsoby. Zaprvé byly získány hodnoty IC₅₀, jak bylo popsáno výše. Navíc byl proveden test proliferace MTT buněk jak bylo popsáno výše pro výpočet hodnot EC_S0. Nakonec byl proveden mikrofyziometrický test (Molecular Devices Corp.). V tomto testu se v podstatě měří rychlost okyselování extracelulárního média jako odezva na stimulaci

X

-69 receptoru TPO sloučeninami podle vynálezu. Rozsahy pro EC₅₀ jsou symbolicky označeny jako pro ICso popsané výše, výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Struktura EC50 (nM) IC50 prolifer. mikrofyz. (nM)

[H]-(Pen)ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂] “Η 1 s------------------s	++	++
[0=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂] \| I	++	++	++
1 ch₂------------------s
[H]-(Homocys)ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂] S 1	++	++	ND
S----------------S
[0-C-N]-ADGPTLREWISF-(Cys)-[NH₂]	+	+	+
c h₂-------------S---------1
0
[H]-(D-Cys)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH₂]	+	+	ND
s---------------------s
[H]-(Cys)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH₂] I I	+	+	++
1 1 S-------------------S
[H]-(D-Pen)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH₂]	+	+	++
S--------------------S
[H]-(Homocys)ADGPTLREWISF(Homocys)-[NH₂]	+	+	++

S-----------------------S

[O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Homocys)-[NH₂]	+	+	++
	CH₂-----------		—s
[O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Pe	n)-[NH₂]	+	+	+
	r' u _		*
	^“2	v
[O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂]	++	+	++
Ph r*Lj	1 ť*
rn-un	o
[H]-KADGPTLREWISFE-[HN₂]		+	+	ND
1	1 , κι li

[H]-EADGPTLREWISFl· 1	<-[NH₂]		+	+	ND
0=	n MU
L· N Π
[0=C	:-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂] 1	++	+	ND
/v [0=C I
>NH]-ADGPTLREWISF(Cy	> s)-[NH₂]	++	+	ND
			S

[HN]-ADGPTLREWISFE-[NH₂]		+	+	+
		u=u
[H]-(Pen)ADGPTLREWISF(Pen)-[NH₂]	+	+	ND
	S-------------	-----S

Příklad 7

V tomto příkladu byly testovány náhrady aminokyselin v polohách D, E, I, S, nebo F v cyklizované sloučenině

•	*«	··	**	*«
41*	* *	•	* · ·	*
•	• ·	•	* ·	• ·
•	• · ·	•	• ··* «	•
*	• *	• *	* *	•
	*·	··		• ·

CADGPTLREWISFC na hodnoty EC_So a IC_S0 jak bylo popsáno výše.

Mikrofyziometrické výsledky se udávají v závorkách. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 5 níže.

Tabulka 5

CADGPTLREWISFC

Substituce	ECSO (nM) Buněč.prolifer.	IC50 (nM)
E - Q	++(+)	++
D - A	+ (+)	++
1 - A	+ (+)	+
S - A	₊₊ (₊₊)	++
S - D-Ala	+	+
S - Sar	+	++
S - Aib	₊₊ (+)	++
S - D-Ser	++	++
S - Nva	₊₊ (₊₊)	++
S - Abu	++	++
S - (N-Me-Ala)	+	+
S - (N-Me-Val)	+	+
S - (N-Me-Ala)*	+	+
S - (nor-Leu)	++	++
S - (t-Bu-Gly)	+	++
S - (N-Me-Ser(Bzl)]		+
S - (homoser)	ND	ND
S - (N-Me-Leu)	+	ND
F - A	+ (+)	++

« · · ·

··♦·

Substituce	EC50 (nM) Buněč.prolifer.	IC50 (nM)
F - D-Ala	+	++
F - F-Phe	+	++
F - Homo-Phe	₊₊ (₊₊)	++
F - CHA	++ (++)	++
F - Thi	++	++
F - (Ser(Bzl))	++	++
F - (N-Me-Aia)	+	+
F - (fenygly)	₊₊ (++)	++
F - (pyridylala)	++	++
F - (p-nitrofe)	++ (++)	++
F - (3,4-di-CI-Phe)	₊₊ (+)	++
F - (p-CI-Phe)	++	++
F - (2-Nal)	₊₊ (₊₊)	++
F - (1-Nal)	++	++
F - (Diph-Ala)	++	++
F - (N-Me-Phe)	++	ND
S,F - Ava (thioether)	+	++
S,F - Ava(cys-cys)	+	++
S,F - Ava	+	++
AD - delece	+ (+)	ND
ADG - delece	(+)	+

Ava = HsN/V/VCOOH

Přiklad 8

V tomto příkladu byly vyhodnoceny substituce aminokyselin ve sloučenině (O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)

Lh₂_________________ [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)

I ch₂------------------s v polohách D, S, nebo F jak je uvedeno v tabulce 6 níže. Hodnoty EC₅o a IC_So byly vypočteny jak bylo popsáno výše.

Mikrofyziometrické výsledky jsou v závorkách.

Tabulka 6 [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys) I I

CH?------------------S

Substituce	ECSO (nM) Buněč.prolif.	IC50 (nM)
D - E	(+)	ND
Forma volné kyseliny	++ (+)	ND
Přidán Gly na aC-konci	++	++
S - Abu	++ (++)	ND
F - DiPh-Ala	(++)	+4-
S,F - Abu, DiPh-Ala	+ (+)	++

Příklad 9

V tomto příkladu byly vypočteny hodnoty EC_So a IC₅o jak se popisuje výše pro dimerní sloučeniny uvedené v tabulce 7 níže. Pro porovnání je zahrnut cyklizovaný monomer

CADGPTLREWISFC

Sloučeniny z tabulky 8 byly při maximální koncentraci 10 μΜ neaktivní.

V tab. 9 byly určovány a porovnávány hodnoty ECso a IC₅o jak bylo popsáno výše pro cyklizované a dimerizované varianty l E G P T

LRQWLAARA.

V tab. 10 se porovnávají zkrácené formy dimeru (H)-l EG PTLRQ WLAARA (H)-lEGPTLRQWLAAEA(p-Ala)K-(NH₂)

Hodnoty EC_So a IC_So byly vypočteny jak se popisuje výše. io Mikrofyziometrické výsledky se udávají v závorkách.

Tabulka 7

EC50(nM) IC50(nM)

Mikrofyz. Prolif.

O li

[BrH-C-NH]-ADGPTLREWISFC-[NH₂] 0 II [Br+C-NH]-ADGPTLREWISFC-[NH₂]		++	++
[Hl-IEGPTLRQWLAARA [H]-IEGPTLRQWI_AARA(3-Ala)lL[NH₂]	++	++	++
[H]-CIEGPTLRQWLAARA-[NH₂] [H]-CIEGPTLRQWLAAEA-[NH₂]	++	++	++
[H]-CADGPTLREWISF-[NH₂] [H]-CADGPTLREWISF-[NH₂]	++	++	++

[H]-SVQCGPTLRQWLAARNHLS-[NH₂] [H1-SVQCGPTLRQWLAARNHLS-[NH₂]	++	++	++
[H]-MVGPTLRSGC-[NH₂] [H1-MVGPTLRSgA-[NH₂]	ND	+	+
CADGPTLRWISFC l 1	++	+4·	++
[Ac]-ADGPTLREWISFC [Ac]-ADGPTLREWISFC	ND	++	++
ADGPTLREWlSFCj;	++	++	++
ADGPTLREWISFC
[Acj-DGPTLREWISFC [Ac]-DGPTLREWISFC	++	++	++
[Ac]-GPTLREWISF(^ [Acj-GPTLREWISFC	ND	++	++
GPTLREWISFÍ^	++	++	+
GPTLREWISFC
[Ac]-PTLREWISFC [Ac]-PTLREWISFC	ND	++	++
PTLREWlSFCj)	++	++	+
PTLREWISFC

- 76 [Ac]-TLREWISFC [Ac]-TLREWISFC

TLREWISF(f	++	+	+
TLREWISFC

	Tabulka 8 [Hl-CTRAQFLKGC-[NH₂]
5	[H]-CNINQLRSIC-[NH₂l (_________________________________________I [H]-CNRSQLLAAC-[NH₂] [H1-CTSTQWLLAC-[NH₂] ! j [H]-CQRADLINFC-[NH₂] [H]-CLLSEFLAGQQC-[NH₂]
10	[H]-CTFQVWKLARNC-[NH₂] [H]-CTLGQWLQMGMÍf-[NH₂] [H]-CLTGPFVTQWLYEC-[NH₂] [H1-CTLREFLDPTTAVC-[NH₂] i i [H]-CGTEGPTLSTWLDC-[NH₂]
15	[H]-CELVGPSLMSWLTC-[NH₂] [H]-<pSLKEFLHSGLMQC-[NH₂] [H]-CTLAEFLASGVEQ<p-[NH₂] [H]-CTLKEWLVSHEVWC-ENH₂]

MM [H]-C1EGPTLRQWLAARAC-[NH₂] [H]-REGPTLRQWM-[NH₂] [H]-REGPTLRQWLMSRS-[NH₂]

Tabulka 9

EC50(nM) IC50(nM)

*	Mikrofyz.	Prolif.
[H ]-1 EG PTLRQ WLAARA-[N H₂]	ND	++	++
[H]-CIEGPTLRQWLAARAC-[NH₂]	ND	++	++
[HJ-I EG PTLRQ WLAARA \ [H]-IEGPTLRQWLAAEA(p-Ala)K-[NH₂]	++	++	++

IEGPTLRQWLAAEA-[NH₂] ++ [H]-CIEGPTLRQWLAAEA-[NH₂] ++ ++

Tabulka 10 (H)-IEGPTLRQWLAAR^ (H)-IEGPTLRQWLAAEA(p-Ala)K-(NH₂)

Sekvence	EC50(nM) Buněč.prolif.	IC50(nM)
(Ac)-IEGPTLRQWLAARA (Ac)- IEGPTLRQWLAARA-3A-l!(NH₂)	++	ND
(Η)- 1 EG PTLRQ WLAAR (H)- IEGPTLRQWLAAR-3A-K(NH₂)	++	ND

(H)- lEGPTLRQWLA^ (H)- IEGPTLRQWLAA-pA-K(NH₂)	++(++)	ND
(Ac)-EGPTLRQWLAARA (Ac)-EG PTLRQ WLAARA-pA-K(N H₂)	ND	ND
(H)-EGPTLRQWLAARÝ (H)-EGPTLRQWLAARA-pA-K(NH₂)	++	ND
(H)-EGPTLRQWLAAR (H)-EGPTLRQWLAAR^A-K(NH₂)	++(++)	ND
(Ac)-EGPTLRQWLAÝ (Ac)-EGPTLRQWLAA^A-K(NH₂)	++	ND
(H)-EGPTLRQWLAÝ (H)-EGPTLRQWLAA-3A-K(NH₂)	++	ND

Příklad 10

V tomto příkladu byly zaváděny různé substituce v polohách G,

P a W v cyklizované sloučenině [HJ-CADGPTLREWISFC - [NH₂]

Tabulka 11 ukazuje příklady substituovaných sloučenin, které io vykazují aktivitu agonistů TPO. Substituenty uvedené v tabulce zkratkami jsou následující:

Tabulka 11

[HJ-CADGPTLREWISFC - [NH₂]
G	P	W
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gly	Pro	Trp
Gly	Pro	Trp
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gaba	Pro	Trp
Cpr-Gly	Pro	Trp
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gly	Pro	Trp
Gly	Pro	Nal
Sar	Pro	Trp
Cpr-Gly	L-Tic	Nal
Gly	D-Tic	D-Trp
Cpr-Gly	D-Tic	Trp
Gaba	Hyp(OBn)	Trp

Náhrady prolinu

D-Pro

L-Pro

|_-4-Hyp(OBn)

Kyselina L-pipekolinová

inova

Kyselina L-azetidin karboxylová

COQH

L-Tic

D-Tic

L-Oic

L-Tiq

Náhrady tryptofanu

L-(benzathienyl)-alanin DL-5-Me-Trp

DL-5-F-Trp

DL-5-Br-Trp

L-Tic

Náhrady qlycinu

Glycin • · · ·

Sarkosin

COOH

COOH β-alanin

Kyselina γ-aminomáselná

N-pentylglycin

N-cyklopropy|g|ycin

Příklad 11

Pro testování vhodnosti myši jako běžného testovacího druhu bylo provedeno několik experimentů in vitro, navržených pro měření aktivity testovaných sloučenin na myším receptoru. Nejprve byly 5 inkubovány buňky kostní dřeně, sklizené z femorú 8 až 9 týdnů starých myší Balb/C, inkubovány 7 dnů v kapalné kultuře vždy s rhuTPO nebo různými koncentracemi testovaných peptidů. Na konci inkubačníperiody byly kultury koncentrovány odstředěním centrifugou Cytospin, barveny na acetyicholinesterázu (AChE, diagnostika myších io megakaryocytú) a počítány pod mikroskopem. 1 nM rhuTPO bylo dosaženo růstu velmi velkých ( > 40 pm) neadherentních buněk barvících se na AChE. Zdá se, že tyto buňky jsou zralé megakaryocyty. Z počátečního zaočkování 10^s celkových buněk kostní dřeně/ml (v 50 ml kulturách) se vyvinulo očekávaných is 1 až 2 x 10⁶ megakaryocytú. Tato odezva na TPO byla označena jako „maximální“. Kontrolní kultury neobsahující přidané růstové faktory produkovaly velmi málo AChE pozitivních buněk. Několik peptidových sloučenin bylo testováno tímto testem při vyšších koncentracích a výsledky jsou uvedeny v tabulce 12. Peptid A v koncentraci 10 μΜ 20 produkoval maximální odpověď u buněk myší kostní dřeně. Toto zjištění bylo prvním důkazem, že tato rodina peptidů je na myším receptoru aktivní. V druhém experimentu byly sklizeny buňky kostní dřeně a kultivovány v polotuhém médiu (methylcelulóza) obsahujícím buď žádné faktory, 1 nM rhuTPO nebo 10 μΜ Peptidů A. Po sedmi 25 dnech kultivace byly kolonie velkých buněk (u kterých se očekávalo, že jde o megakaryocyty) počítány a seskupeny do malých kolonií (3-5 buněk) nebo velkých kolonií (větší než 6 buněk). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13. TPO a testované peptidy oba produkovaly podstatně více kolonií obou velikostí než tomu bylo v kulturách 3o negativní kontroly. To ukazuje, že peptidy napodobují TPO ve své schopnosti stimulovat expanzi populace Mk prekurzorových buněk.

Pro získání kvantitativnějšího srovnání účinnosti testovaných sloučenin na myší a lidské receptory byl klonován receptor muTPO a transfekován do buněk BaF3. Byla izolována TPO dependentní populace buněk.

• · · *

Tabulka 12

Peptid	Testovaná koncentrace	(nM) Odezva

D	100 000	žádná
C	40 000	maximální**
C + S. A. *	1000	maximální
S. A. samotný	1000	žádná
B	100 000	minimální
A	10 000	maximální
TPO (R & D)	1	„maximální“

* Streptavidin v komplexu s biotinylovaným peptidem - koncentrace zdánlivého komplexu 1 : 4.

io ** Porovnání s rekombinantním lidským TPO ** 25 až 30 % ACE barvících buněk na cytopspinu

Kultury bez růstových faktorů - přibližně 5 % AChE barvících buněk (nižší počet buněk) • · · ·

Tabulka 13

Sloučenina	3-5 velkých buněk	6-12 velkých buněk
Bez faktorů 1	2	1
Bez faktorů 2	1	1
1 nM TPO # 1-1	15	6
1 nM TPO_ # 1-2	12	1
1 nM TPO # 2-1	16	8
1 nM TPO # 2-2	13	3
10 μΜ Peptidu #1-1	25	10
10 μΜ Peptidu # 1-2	22	8
10 μΜ Peptidu # 2-1	22	7
10 μΜ Peptidu # 2-2	21	10

Zastupuje:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina schopná vazby na tromb o poeti nový receptor, vyznačující se tím, že má:

(1) molekulovou hmotnost menší než přibližně 8000 daltonů, a (2) vazebnou afinitu ke trombopoetinovému receptoru vyjádřeno hodnotou IC50 ne větší než přibližně 100 μΜ.
2, Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e uvedenou sloučeninou je peptid a kde žádná až všechny vazby -C(O)NH- peptidu byly nahrazeny vazbou zvolenou ze skupiny vazba -CH₂OC(O)NR-; fosfonátová vazba; vazba -CH₂S(O)₂NR-; vazba -CH₂NR- a vazba -C(O)NR⁶-; a vazba -NHC(O)NH-, kde R znamená atom vodíku nebo nižší alkyl a R⁶znamená nižší alkyl, dále kde N-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky je zvolen ze skupiny -NRR¹; skupiny -NRC(O)R; skupiny -NRC(0)OR; skupiny -NRS(O)₂R; skupiny -NHC(O)NHR; sukcinimidové skupiny; skupiny benzyloxykarbonyl-NH-; a skupiny benzyloxykarbonyl-NH-, která má na fenylovém kruhu od 1 do 3 substitentú zvolených ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo, kde R a R¹ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl, a ještě dále kde C-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky má vzorec -C(O)R², kde R² je zvolen ze skupiny hydroxy, nižší alkoxy a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl a kde dusíkový atom skupiny -NR³R⁴ může být popřípadě aminovou ♦ to ···· o · · toto «♦ to · ·

-87 • to to· to to • to to • to to to · • to to toto toto skupinou N-konce peptidu, takže dojde k vytvoření cyklického peptidu, a její fyziologicky přijatelné soli.
3. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, ž e obsahuje sloučeninu podle nároku 1 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
4. Způsob léčení pacienta trpícího poruchou, vnímavou k léčení agonistou trombopoetinu, který zahrnuje podávání terapeuticky účinné dávky nebo množství sloučeniny podle nároku 1 pacientovi.
5. Způsob podle nároku 4, kde sloučeninou podávanou pacientovi je peptid, a kde žádná až všechny vazby -C(O)NH- peptidu byly nahrazeny vazbou zvolenou ze skupiny vazba -CH₂OC(O)NR-; fosfonátová vazba; vazba -CH₂S(O)₂NR-; vazba -CH₂NR- a vazba -C(O)NR^{5 6}-; a vazba -NHC(O)NH-, kde R znamená atom vodíku nebo nižší alkyl a R⁶znamená nižší alkyl, dále kde N-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky je zvolen ze skupiny -NRR¹; skupiny -NRC(O)R; skupiny -NRC(O)OR; skupiny -NRS(O)₂R; skupiny -NHC(O)NHR; sukcinimidové skupiny; skupiny benzyloxykarbonyl-NH-; a skupiny benzyloxykarbonyl-ΝΗ-, která má na fenylovém kruhu od 1 do 3 substitentů zvolených ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo, kde R a R¹ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl, ·«· ·· * · ♦· · * > ··« ·»·· • · · ♦ · ·· ··♦· * • * · * · · · · · · * * «· » · · · · · · · · -88 a ještě dále kde C-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky má vzorec -C(O)R², kde R² je zvolen ze skupiny hydroxy, nižší alkoxy a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl a kde dusíkový atom skupiny -NR³R⁴ může být popřípadě aminovou skupinou N-konce peptidu, takže dojde k vytvoření cyklického peptidu, a jeho fyziologicky přijatelné solí.
6. Sloučenina podle nároku 2, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:

Xi X₂ X₃ X4 X5 Χβ X7 kde Χ_η znamená C, L, Μ, P, Q, V; X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₅znamená A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a X₇ znamená C, G, I, K, L, M, N, R nebo V.
7. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedená sekvence aminokyselin má cyklizovanou strukturu.
8. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedená sekvence aminokyselin má dimenzovanou strukturu.
9. Sloučenina podle nároku 6, kde sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin

C X₂ X₃ X< Xs Xe X?

• ··· · · · · · · · » ·· · · · · · • · « «««· · · · , , * · Β « t * * ·* · ·

- 89 kde Χ₂ znamená Κ, L, Ν, Q, R, S, Τ nebo V; Χ₃ znamená C, F,

I, L, Μ, R, S nebo V; Χ₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných

L-aminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X₈ znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a X₇ znamená C, G, I,

K, L, Μ, N, R nebo V.
10. Sloučenina podle nároku 8, kde X₄ je A, E, G, Η, K, L, Μ, P, Q, R,’S, T nebo W.
11. Sloučenina podle nároku 10, kde X₂ znamená S nebo T; X₃znamená L nebo R; X₆ znamená R; X₅ znamená D, E nebo G; X₆ znamená F, L nebo W; a X₇ znamená I, K, L, R nebo V.
12. Sloučenina podle nároku 9, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:

X_e C X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ X₇ kde X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₅ je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ je C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ je C, G, I, K, L, Μ, N, R, nebo V; a X₈ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin.
13. Sloučenina podle nároku 12, kde X₈ znamená G, S, Y nebo R.
14. Sloučenina podle nároku 12, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin: GGCTLREWLHGGFCGG.
15. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:

X₈ G Xi X₂ X₃ X₄ X₅ W X₇ kde X, znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X₂ znamená F, R, S nebo T; X₃ znamená F, L, V, nebo W; X₄ znamená A, K, L, M, R, S, V, nebo T; X₅ znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; X₇znamená C, I, K, L, M nebo V; a X₈ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin
16. Sloučenina podle nároku 15, kde Xi znamená P; X₂ znamená T; X₃ znamená L; X₄ znamená R; X₅ znamená E nebo Q; X₇znamená I nebo L.
17. Sloučenina podle nároku 16, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:

Xg X₈ G Xi X₂ X₃ X₄ X₅ W X₇ kde X₈ znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V; a X₉znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V;.
18. Sloučenina podle nároku 17, kde X₈ znamená D, E nebo K; a Xg znamená A nebo I.
19. Sloučenina podle nároku 18, kde uvedená sloučenina je zvolena ze skupiny GGCADGPTLREWISFCGG;G NADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTLR EWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;SI EGPTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLH GNGRDT;CADGPTLREWISFC;alEGPTLRQ W L A A R A.
20. Způsob podle nároku 4, kde uvedená sloučenina podávaná pacientovi obsahuje sekvenci aminokyselin

C X₂ X₃ X₄ Xs X₆ Xz kde X₂ znamená K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M_T R, S nebo V; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X_s znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X₆znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V.
21. Způsob podle nároku 20, kde X₄ znamená A, E, G, Η, K, L, M, P, Q, R, S, T nebo W.
22. Způsob podle nároku 21, kde X₂ je S nebo T; X₃ je L nebo R; X₄ je R; X₅ je D, E, nebo G; X₆ je F, L, nebo W; a X₇ je I, K, L, R, nebo V.
23. Způsob podle nároku 22, kde uvedená sloučenina podávaná pacientovi obsahuje sekvenci aminokyselin: GGCTLREW LHGGFCGG.
24. Způsob podle nároku 4, kde porucha ovlivnitelná léčením agonistou trombopoetinu je zvolena ze skupiny: hematologické poruchy a trombocytopenie v důsledku chemoterapie, radiační terapie nebo transfuzí kostní dřeně.
25. Způsob podle nároku 4, kde uvedená sloučenina podávaná pacientovi obsahuje sekvenci aminokyselin • · ♦ · • · v • ·

- 92 Xa G Xi X₂ X₃ X₄ Xs W X₇ kde X: znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X₂ znamená F, R, S nebo

T; X₃ znamená F, L, V, nebo W; X₄ znamená A, K, L, M, R, S,

V, nebo T; X₅ znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; X₇5 znamená C, I, K, L, M nebo V; a X₈ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin.
26. Způsob podle nároku 25, kde Xi znamená P; X₂ znamená T; X₃znamená L; X₄ znamená R; X_s znamená E nebo Q; X₇ znamená ίο I nebo L.
27. Způsob podle nároku 26, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:

X₉ X₈ G Xt X₂ X₃ X₄ X₅ W X₇

15 kde X₈ znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V a X₉ znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V;.
28. Způsob podle nároku 27, kde X_a znamená D, E nebo K; a X₉znamená A nebo I.
29. Způsob podle nároku 28, kde sloučenina podávaná pacientovi je zvolena ze skupiny GGCADGPTLREWISFCGG; GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTL REWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;S

25 IEGPTLREWLTSRTPHSjLAIEGPTLRQWLH

GNGRDT;CADGPTLREWISFC;alEGPTLRQ W L A A R A.
30. Sloučenina, která se váže na trombopoetinový receptor, kde uvedená sloučenina je zvolena ze skupiny

CADGPTLREWISFC;

5 [Ac]- CADGPTLREWISFC- [amid] ;

O = C A D G P T L R E W I S F C - NH₂ ; a

I I ch₂-------------------s

IEGPTLRQWLAARA

I io IEGPTLRQWLAARA (pala)-K [NH₂]
31. Způsob léčení pacienta trpícího poruchou vnímavou k léčení agonistou trombopoetinu, který zahrnuje podávání sloučeniny zvolené ze skupiny

15 CADGPTLREWISFC;

[Ac] - CADGPTLREWISFC - [amid] ;

O = CADGPTLREWISFC-NH₂ ; a

I I ch₂-------------------s

IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA (pala)-K [NH₂] pacientovi.