CZ389797A3 - Peptidy a sloučeniny schopné vazby na receptor thrombopoetinu - Google Patents
Peptidy a sloučeniny schopné vazby na receptor thrombopoetinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ389797A3 CZ389797A3 CZ973897A CZ389797A CZ389797A3 CZ 389797 A3 CZ389797 A3 CZ 389797A3 CZ 973897 A CZ973897 A CZ 973897A CZ 389797 A CZ389797 A CZ 389797A CZ 389797 A3 CZ389797 A3 CZ 389797A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- peptide
- compound
- peptides
- group
- tpo
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 371
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 123
- 108010070774 Thrombopoietin Receptors Proteins 0.000 title claims description 4
- 102000005763 Thrombopoietin Receptors Human genes 0.000 title claims 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 168
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 85
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 64
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 52
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 51
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 46
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 36
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 32
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 32
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 26
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 23
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 claims description 21
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 16
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 14
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 13
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 12
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 11
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 11
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 claims description 11
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical group O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 9
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 claims description 4
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 claims description 4
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 4
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229940123936 Thrombopoietin agonist Drugs 0.000 claims 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 90
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 81
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 81
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 53
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 52
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 49
- 101710148535 Thrombopoietin receptor Proteins 0.000 description 45
- 102100034196 Thrombopoietin receptor Human genes 0.000 description 45
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 37
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 31
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 28
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- -1 hydrochloric Chemical class 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 24
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 24
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 20
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 20
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 19
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 18
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 18
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 18
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 18
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 17
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 14
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 14
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 14
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 11
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 8
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 101710102442 Erythropoietin receptor Proteins 0.000 description 7
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 7
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 5
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 5
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000034311 endomitotic cell cycle Effects 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 5
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N D-Cysteine Chemical compound SC[C@@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 101710193132 Pre-hexon-linking protein VIII Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical group NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 4
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BWKMGYQJPOAASG-VIFPVBQESA-N (3s)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2CN[C@H](C(=O)O)CC2=C1 BWKMGYQJPOAASG-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000799466 Homo sapiens Thrombopoietin receptor Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 3
- FXHCFPUEIDRTMR-UHFFFAOYSA-N hydron;1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid;chloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2CNC(C(=O)O)CC2=C1 FXHCFPUEIDRTMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 101710139410 1-phosphatidylinositol phosphodiesterase Proteins 0.000 description 2
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanoic acid Chemical compound CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000620880 Homo sapiens Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- 101000694103 Homo sapiens Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 2
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 2
- 101000730535 Morganella morganii Major phosphate-irrepressible acid phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037097 Protein disulfide-isomerase A3 Human genes 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100022919 Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 108700003859 araC Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150044616 araC gene Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N cyclohexylamine Chemical compound NC1CCCCC1 PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053400 human TPO Human genes 0.000 description 2
- TWXDDNPPQUTEOV-UHFFFAOYSA-N hydron;n-methyl-1-phenylpropan-2-amine;chloride Chemical compound Cl.CNC(C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 2
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 2
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(naphthalen-1-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=CC2=C1 IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004214 1-pyrrolidinyl group Chemical group [H]C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- DXQCCQKRNWMECV-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclopropylazaniumyl)acetate Chemical compound OC(=O)CNC1CC1 DXQCCQKRNWMECV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLFJIALFLSDAQ-UHFFFAOYSA-N 2-(pentylazaniumyl)acetate Chemical compound CCCCCNCC(O)=O AHLFJIALFLSDAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-thiophen-2-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CS1 WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 4-fluoro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(F)C=C1 XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ATYUCXIJDKHOPX-UHFFFAOYSA-N 5-[4-[(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)methyl]-3,5-dimethoxyphenoxy]pentanoic acid Chemical compound COC1=CC(OCCCCC(O)=O)=CC(OC)=C1CNC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ATYUCXIJDKHOPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003341 7 membered heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical class [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical class [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical group NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N D-Proline Chemical compound OC(=O)[C@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101000946191 Galerina sp Laccase-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010054017 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100039622 Granulocyte colony-stimulating factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000023661 Haematological disease Diseases 0.000 description 1
- 101000852145 Homo sapiens Erythropoietin receptor Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical class C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical class [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical class [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical class NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N Monoamide-Oxalic acid Natural products NC(=O)C(O)=O SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000852143 Mus musculus Erythropoietin receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical class [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000003354 benzotriazolyl group Chemical group N1N=NC2=C1C=CC=C2* 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N benzyl chloroformate Chemical compound ClC(=O)OCC1=CC=CC=C1 HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N bromoacetic acid Chemical compound OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 125000004106 butoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- ZMCUDHNSHCRDBT-UHFFFAOYSA-M caesium bicarbonate Chemical compound [Cs+].OC([O-])=O ZMCUDHNSHCRDBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Chemical class 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000005392 carboxamide group Chemical group NC(=O)* 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000002288 cocrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 230000009146 cooperative binding Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 125000005265 dialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006286 dichlorobenzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 101150012763 endA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 125000003838 furazanyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 125000002632 imidazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002636 imidazolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940030980 inova Drugs 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005956 isoquinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000842 isoxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Chemical class 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- OFYAYGJCPXRNBL-LBPRGKRZSA-N naphthalen-2-yl-3-alanine Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=CC2=C1 OFYAYGJCPXRNBL-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- GHLZUHZBBNDWHW-UHFFFAOYSA-N nonanamide Chemical compound CCCCCCCCC(N)=O GHLZUHZBBNDWHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940039748 oxalate Drugs 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000587 piperidin-1-yl group Chemical group [H]C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005936 piperidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108010052780 polyasparagine Proteins 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001850 polyploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Chemical class 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108010000947 protamine zinc Chemical class 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 125000004309 pyranyl group Chemical group O1C(C=CC=C1)* 0.000 description 1
- KOUKXHPPRFNWPP-UHFFFAOYSA-N pyrazine-2,5-dicarboxylic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C1=CN=C(C(O)=O)C=N1 KOUKXHPPRFNWPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003072 pyrazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002755 pyrazolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002098 pyridazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001422 pyrrolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical group OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000000565 sulfonamide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000001113 thiadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000005505 thiomorpholino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004568 thiomorpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003582 thrombocytopenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001361 thrombopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N β-(2-naphthyl)-alanine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=C21 JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- ORQXBVXKBGUSBA-QMMMGPOBSA-N β-cyclohexyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1CCCCC1 ORQXBVXKBGUSBA-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/02—Antidotes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Peptidy a sloučeniny schopné vazby na receptor trombo poeti nu
Oblast techniky
Předkládaný vynález poskytuje peptidy a sloučeniny, které se s vážou na trombopoetinový receptor a aktivují jej (c-mpl nebo TPO-R) nebo jinak působí jako agonisté TPO. Vynález má použití v oblasti biochemie a lékařské chemie a poskytuje zvláště agonisty TPO pro použití při léčení onemocnění člověka.
Dosavadní stav techniky
Tato přihláška navazuje na US patentovou přihlášku No.
08/485,301 ze 7. června 1995 a US patentovou přihlášku No. 08/478,128 ze 7. června 1995, jejichž obsah se zde uvádí jako referenční.
Megakaryocyty jsou buňky odvozené z kostní dřeně, odpovědné is za produkci cirkulujících krevních destiček. Ačkoliv představují <0,25% kostní dřeně u většiny druhů, mají >10 x větší objem než typická buňka kostní dřeně (viz Kuter a další, Proč, Nati. Acad. Sci. USA. 91: 11104 - 11108 (1994). Megakaryocyty podléhají procesu známému jako endomitóza, při kterém se replikují jejich jádra, ale 2o neprobíhá buněčné dělení, čímž vznikají polyploidní buňky. Jako odpověď na snížený počet krevních destiček vzrůstá četnost endomitózy, vytvářejí se výšeploídní megakaryocyty a počet megakaryocytú může až trojnásobně stoupnout (viz Harker, J. Clin. Invest., 47: 458 - 465 (1968). Naopak když se počet krevních destiček as zvýší, četnost endomitózy klesá, vytvářejí se nížeploidní megakaryocyty a počet megakaryocytú může poklesnout o 50 %.
Přesný fyziologický zpětnovazebný mechanismus, kterým hmota cirkulujících destiček reguluje rychlost endomitózy a počet • * · · · · · · ·
V « · · ♦ * « « · * ·♦ v ·* · · * · ♦ • · · · · · «· «· ·· · · 2 * ” megakaryocytů kostní dřeně není znám. Za cirkulující trombopoetický faktor, který má zprostředkující funkci v této zpětnovazební smyčce, je nyní pokládán trombopoetin (TPO). Ukázalo se zvláště, že TPO je hlavním humorálním regulátorem v situacích zahrnujících trombocytopenii (viz např. Metcalf, Nátuře, 369: 519 - 520 (1994). Ukázalo se, že v několika studiích zvyšoval TPO u pokusných zvířat počet krevních destiček, velikost krevních destiček a inkorporaci izotopu do destiček. Konkrétně se předpokládá, že TPO ovlivňuje megakaryocytopoézu několika způsoby: (1) zvyšuje velikost a počet megakaryocytů; (2) zvyšuje obsah DNA v megakaryocytech ve formě polyploidie; (3) zvyšuje endomitózu megakaryocytů; (4) zvyšuje maturaci (zralost) megakaryocytů; a (5) zvyšuje procento prekurzorových buněk ve formě malých buněk acetylcholinesteráza pozitivních v kostní dřeni.
Protože krevní destičky (trombocyty) jsou nezbytné pro srážení krve a pokud je jejich počet velmi nízký, pacient je ve vážném nebezpečí smrti způsobené masívním krvácením, TPO je potenciálně použitelný jak při diagnóze, tak i léčení různých hematologických poruch, například onemocnění způsobených primárně defekty krevních destiček. Začínající klinické pokusy s TPO ukázaly, že TPO je možno bezpečně podávat pacientům. Navíc poskytly poslední studie základ pro účinnou terapii TPO při léčení trombocytopenie, a zvláště trombocytopenie v důsledku chemoterapie, radiační terapie nebo transplantace kostní dřeně při léčbě nádoru nebo lymfomu. (Viz např. McDonald (1992), Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14: 8 - 21 (1992).
Gen kódující TPO byl klonován a charakterizován (viz Kuter a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA. 91: 11104 - 11108 (1994); Barley a další, Cell. 77: 1117 - 1124 (1994); Kaushansky a další, Nátuře, 369: 568 - 571 (1994); Wendling a další, Nátuře. 369: 571 - 574 (1994); a Sauvage a další, Nátuře. 369: 533 - 538 (1994). Trombopoetin je glykoprotein, který má alespoň dvě formy se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 25 kDa a 31 kDa se společnou sekvencí N-koncových aminokyselin (viz Bartley a další, Cell, 77: 1117 - 1124 (1994). Trombopoetin se zdá mít dvě rozdílné oblasti oddělené potenciálním štěpícím místem Arg-Arg. Aminokoncová oblast je u člověka a myši vysoce konzervována a má určitou homologii s erytropoetinem a interferonem-a a interferonem-b. Karboxylová koncová oblast vykazuje širokou mezidruhovou divergenci.
Byly popsány sekvence DNA a jimi kódované peptidové sekvence u lidského TPO-R (znám také jako c-mpl) (viz Vigon a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5640 - 5644 (1992). TPO-R je členem rodiny hematopoetinového receptoru růstového faktoru, která je charakterizována společným strukturním návrhem extracelulární domény včetně čtyř konzervovaných zbytků C v N-koncové oblasti a motivu WSXWS těsně u transmembránové oblasti (viz Bazan, Proč. Nati. Acad, Sci. USA, 87: 6934 - 6938 (1990). Důkazem skutečnosti, že tento receptor má funkční úlohu při hematopoéze, jsou pozorování, že jeho exprese se omezuje na slezinu, kostní dřeň nebo fetální játra u myši (viz Souyri a další, Cell, 63: 1137 - 1147 (1990) a na megakaryocyty, destičky a buňky CD34+ u člověka (viz Methia a další, Blood, 82: 1395 - 1401 (1993). Navíc expozice buněk CD34* syntetickým oligonukleotidům pozitivním vzhledem k mpl RNA výrazně inhibuje výskyt kolonií megakaryocytú bez ovlivnění tvorby erytroidních nebo myeloidních kolonií. Někteří pracovníci uvádějí, že receptor funguje jako homodymer podobně jako je tomu v situaci s receptory pro G-CSF a erytropoetin.
Dostupnost klonovaných genů pro TPO-R umožňuje hledání agonistů tohoto důležitého receptoru. Dostupnost rekombinantního receptorového proteinu umožňuje studium interakce receptor - ligand v řadě systémů pro vytváření náhodné a semináhodné rozdílnosti peptidů. Tyto systémy používají systém „peptidy na plazmidech“ • · · · ·· · «
(peptides on plasmides) popisovaný v US patentech No, 5,270,170 a 5,338,665, systém „peptidy na fágu“ (peptides on phage) popisovaný v US patentové přihlášce No. 07/718,577 z 20. 6. 1991, US patentové přihlášce No. 07/541,108 z 20, 6. 1990 a v Cwirla a další, Proč, Nati. Acad. Sci, USA, 87: 6378 - 6382 (1990); systém „polysom“ popisovaný v US patentové přihlášce No. 08/300,262 z 2. 9. 1994, který navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/144,775 z 29. 10, 1993 a PCT WO 95/11992; systém „kódované syntetické knihovny“ (encoded synthetic library) popisovaný v US patentových přihláškách No. 08/146,886 z 12. 11. 1993, 07/946,239 z 16. 9. 1992 a 07/762,522 z 18. 9. 1991; a systém „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ (very large scale immobilized polymer synthesis) popisovaný v US patentu No. 5,143,854; zveřejnění PCT patentu No, 90/15070, zveřejněn
13. 12. 1990; US patentové přihlášce No. 07/624,120 z 6. 12. 1990, Fodor a další, Science, 251: 767 - 773 (2/1991); Dower a Fodor, Ann Rep. Med. Chem.. 26: 271 - 180 (1991); a US patentové přihlášce No. 07/805,727 z 6. 12. 1991; přičemž uvedené patentové přihlášky a publikace se zde uvádějí jako referenční.
Vážným problémem u pacientů trpících trombocytopenií je pomalý návrat hladin krevních destiček, a proto se stalo urgentním hledání agonistů krevních růstových faktorů schopných urychlit regeneraci destiček. Předkládaný vynález takového agonistů popisuje.
Podstata vynálezu
Vynález je v jedné části zaměřen na nový a neočekávaný objev, že definované peptidy s nízkou molekulovou hmotností a látky napodobující peptidy, mají silné vazebné schopnosti vůči TPO-R a mohou TPO-R aktivovat. Tyto peptidy a látky napodobující peptidy jsou tedy použitelné pro terapeutické účely při léčení stavů podmíněných TPO (např. trombocytopenie v důsledku chemoterapie, « *
-5- .....
radiační terapie nebo transfuze kostní dřeně), stejně jako pro diagnostické účely při studiu mechanismu hematopoézy a pro expanzi megakaryocytů a ohrožených buněk předchůdců.
Peptidy a peptidy napodobující látky vhodné pro terapeutické a/nebo diagnostické účely mají IC50 přibližně 2 mM nebo nižší při stanovení vazebné afinity testem uvedeným v příkladu 3 níže, kde nižší IC50 koreluje se silnější vazebnou afinitou vůči TPO-R. Pro farmaceutické účely mají peptidy a peptidomimetické látky s výhodou IC50 ne větší než přibližně 100 μΜ, výhodněji ne více než 500 nM. Ve výhodném provedení je molekulová hmotnost peptidu nebo peptid napodobující látky od přibližně 250 do přibližně 8000 daltonů.
Při používání pro diagnostické účely se peptidy a peptidy napodobující látky s výhodou značí detekovatelným markérem a peptidy a peptidy napodobující látky bez takového označení tedy slouží jako meziprodukty při přípravě značených peptidú a peptidy napodobujících látek.
Peptidy splňující definovaná kritéria pro molekulovou hmotnost a vazebnou afinitu vůči TPO-R obsahují 9 nebo více aminokyselin, které se vyskytují v přírodě nebo jsou syntetické. Peptidy napodobující látky zahrnují peptidy s jednou nebo více následujícími modifikacemi:
peptidy, kde jedna nebo více peptidických vazeb (-C(O)NR-j byla nahrazena nepeptidickým spojením jako je spojení -CH2-karbamát [-CH2-OC(O)NR-]; fosfonátová vazba; vazba -CH2-sulfonamid [-CH2S(O)2NR-j; močovinová vazba [-NHC(O)NH-]; vazba -CH2-sekundární amin; nebo alkylovaná peptidylová vazba (-C(O)NR6-, kde R6 znamená nižší alkyl];
peptidy, u kterých N-konec je derivatizován na skupinu -NRR1; skupinu -NRC(O)R; skupinu -NRC(O)OR; skupinu -NRS(O)2R; skupinu -NHC(O)NHR, kde R a R1 znamenají atom vodíku nebo nižší alkyl za podmínky, že R a R1 nejsou oba atomy vodíku; sukcinimidovou skupinu; skupinu benzyloxykarbonyl-NH- (CBZ-NH-); nebo skupinu
-6 benzyloxykarbonyl-NH- s 1 až 3 substituenty na fenylovém kruhu zvolenými ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo; nebo peptidy, kde C-konec je derivatizován na skupinu -C(O)R2, kde R2 je zvolen ze skupiny nižší alkoxy, a -NR3R4, kde R3 a R4 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl.
Výhodné peptidy a peptidy napodobující látky tedy s výhodou zahrnují sloučeniny:
(1) s molekulovou hmotností méně než přibližně 5000 daltonů, a (2) s vazebnou afinitou vůči TPO-R vyjádřenou jako IC50 ne větší než 100 μΜ, kde žádná až všechny vazby -C(O)NH- peptidu byly nahrazeny vazbami zvolenými ze skupiny:
-CH2OC(O)NR-; fosfonátová vazba; vazba -CH2S(O)2NR-; vazba -CH2NR-; a vazba -C(0)NR8-; a vazba -NHC(O)NH-, kde R znamená atom vodíku nebo nižší alkyl a R6 je nižší alkyl, dále kde N-konec uvedeného peptidu nebo látky napodobující peptid je zvolen ze skupiny -NRR1; skupiny -NRC(O)R; skupiny NRC(O)OR; skupiny -NRS(O)2R; skupiny -NHC(O)NHR; sukcinimidové skupiny; skupiny benzyloxykarbonyl-NH-; a skupiny benzyloxykarbonyl-NH- s 1 až 3 substituenty na fenylovém kruhu, zvolenými ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo, kde R a R1 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl, a ještě dále kde C-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky má vzorec -C(O)R2, kde R2 je zvolen ze skupiny hydroxy, nižší alkoxy, a -NR3R4, kde R3 a R4 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl a atom dusíku nebo skupina -NR R může být popřípadě aminová skupina N-konce peptidu, takže dojde k vytvoření cyklického peptidu, a jejich fyziologicky přijatelné soli.
• · *
V dalším provedení je vynález zaměřen na značený peptid nebo látku napodobující peptid obsahující peptid nebo látku napodobující peptid uvedené dříve, které mají na sebe kovalentně navázán markér schopný detekce. V některých provedeních vynálezu zahrnují výhodné peptidy strukturu jádra obsahující sekvenci aminokyselin:
X, X2 X3 X4 X5 Xe X?
kde Xi znamená C, L, Μ, P, Q, V; X2 znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo'V; X3 znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X5 znamená A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X6 znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a X? znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V.
Ve výhodném provedení obsahuje jádro peptidů sekvenci aminokyselin:
X8 G X1 X2 X3 X4 X5 W X7 kde X1 znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X2 znamená F, R, S nebo T; X3 znamená F, L, V, nebo W; X4 znamená A, K, L, M, R, S, V, nebo T; X5 znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; X7 znamená C, I, K, L, M nebo V; a každý ze zbytků X8 je nezávisle na sobě zvolen z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin, jejich stereoizomerních Daminokyselin a nepřírodních aminokyselin. S výhodou je každý zbytek Xa nezávisle zvolen z jakýchkoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin a jejich stereoizomerních D-aminokyselin. Ve výhodném provedení X1 znamená P; X2 znamená T; X3 znamená L; X4 znamená R; X5 znamená E nebo Q; a X7 znamená I nebo L.
Výhodněji obsahuje jádro peptidů sekvenci aminokyselin:
X9 Xe G X1 X2 X3 X4 X5 W X7 kde X9 znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V; a X8 znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V. Výhodněji je skupina Xg A nebo I; a X8 znamená D, E, nebo K.
« · • ·
- 8 Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCADGPTLREWISF CGG;GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTL REWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;SlEG PTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLHGNGRD T;CADGPTLREWISFC;alEGPTLRQWLAARA.
V dalším provedení vynálezu zahrnují výhodné peptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu peptidy se strukturou jádra obsahující- sekvenci aminokyselin:
C X2 X3 X4 Xs X6 Xz kde X2 znamená K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X3 znamená C, F, I, L, M, R, S nebo V; X4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X5 znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X6 znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X7 znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V. Ve výhodnějším provedení znamená X4 A, E, G, Η, K, L, Μ, P, Q, R, S, T nebo W. V dalším provedení X2 je S nebo T; X3 je L nebo R; X4 je R; Xs je D, E, nebo G; X6 je F, L, nebo W; a X7 je I, K, L, R, nebo V. Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCTLREWLHGGFCGG.
V dalším provedení jsou výhodnými peptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu peptidy se strukturou obsahující sekvenci aminokyselin:
X3 C X2 X3 X4 X5 X6 X7 kde X2 znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X3 znamená C, F, I, L, M, R. S, V nebo W; X4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X5 je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X6 je C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X7 je C, G, I, K, L, Μ, N, R, nebo V; a Xe je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin. V některých provedeních je X8 s výhodou G, S, Y, nebo R.
Zde popisované sloučeniny jsou použitelné pro prevenci a léčení onemocnění podmíněných TPO a zvláště pro léčení hematologických poruch, včetně bez omezení trombocytopenie • · • © · ♦ · · · ♦· . «· · · · · · · ·· *©· · * · · ·· g „ ··* .. ·· *· v důsledku chemoterapie, radiační terapie nebo transfuzí kostní dřeně. Předkládaný vynález tedy poskytuje také způsob léčení, při kterém se pacientovi s poruchou, která je vnímavá léčení agonistou TPO, podává terapeuticky účinná dávka nebo množství sloučeniny podle 5 předkládaného vynálezu.
Vynález také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující jednu nebo více výše popsaných sloučenin a fyziologicky přijatelný nosič. Tyto farmaceutické prostředky mohou mít řadu forem včetně orálních dávkovačích forem stejně jako inhalovatelných prášků 10 a roztoků a roztoků pro injekce a infuze.
Popis konkrétních provedení
I. Definice a obecné parametry
Následující definice se uvádějí pro ilustraci a definují význam a 15 rámec různých termínů, které se zde používají při popisu vynálezu.
„Agonista“ označuje biologicky aktivní ligand, který se váže na svůj komplementární biologicky aktivní receptor a aktivuje jej za vyvolání biologické odpovědi receptoru nebo za zvýšení již existující biologické aktivity receptoru.
„Farmaceuticky přijatelné soli“ označují netoxický alkalický kov, kov alkalické zeminy a amonné soli běžně používané ve farmaceutickém průmyslu včetně sodíku, draslíku, lithia, vápníku, hořčíku, barya, amonia a protaminových zinkových solí, které se připravují v oboru známými způsoby. Termín také zahrnuje netoxické adiční soli s kyselinami, které se obvykle připravují reakcí sloučenin podle vynálezu s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou. Představiteli těchto solí jsou chlorid, bromid, sulfát, bisulfát, acetát, oxalát, valerát, oleát, laurát, borát, benzoát, laktát, fosfát, tosylát, citrát, maleát, fumarát, sukcinát, vínan, napsylát apod.
• ·
„Farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou“ označuje takové soli, které si zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti volných bází a které nejsou biologicky nebo jinak nežádoucí, vytvořené s anorganickými kyselinami, jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, dusičná, fosforečná apod. a organickými kyselinami, jako je kyselina octová, propionová, glykolová, pyrohroznová, oxalová, jablečná, malonová, jantarová, maleinová, fumarová, vinná, citrónová, benzoová, skořicová, mandlová, metansulfonová, ethansulfonová, p-toluensulfonová, salycilová apod. Pro popis farmaceuticky přijatelných adičních solí s kyselinami jako prekurzorů je možno nalézt informace v Bundgaard, H., výše.
„Farmaceuticky přijatelný ester“ označuje takové estery, které po hydrolýze esterové vazby zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti karboxylové kyseliny nebo alkoholu a nejsou biologicky nebo jiným způsobem nežádoucí. Popis farmaceuticky přijatelných esterů jako prekurzorů se uvádí v Bundgaard, Hl, red., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Tyto estery se typicky tvoří z odpovídající karboaxylové kyseliny a alkoholu. Obecně je možno tvorbu esterů provádět běžnými způsoby syntézy (viz např. March, Advanced Organic Chemistry, 3. vyd., John Wiley & Sohs, New York (1985) str. 1157 a tam uvedené odkazy a Mark a další, Encvclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, New York (1980). Alkoholová složka esteru bude obvykle obsahovat (i) C2 - Ci2 alifatický alkohol, který může nebo nemusí obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb a může nebo nemusí obsahovat rozvětvený uhlíkový řetězec nebo (ii) C7 - C12 aromatický nebo heteroaromatický alkohol. Tento vynález také předpokládá použití takových sloučenin, které jsou jak zde popisovanými estery, tak současně jejich farmaceuticky přijatelnými adičními solemi s kyselinami.
* * φ φ
-11 „Farmaceuticky přijatelný amid“ označuje amidy, které po hydrolýze amidové vazby zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti karboxylové kyseliny nebo aminu a nejsou biologicky nebo jiným způsobem nežádoucí. Popis farmaceuticky přijatelných amidů 5 jako prekurzorů léčiv je možno nalézt v Bundgaard, H., vyd. Design of Prodrugs. Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Tyto amidy se typicky vytvářejí z odpovídající amidové kyseliny a aminu. Amidy je možno obecně vytvářet běžnými způsoby syntéz (viz např. March Advanced Orqanic Chemistry, 3. vyd., John Wiley & Sons, New York io (1985) str. 1152 a Mark a další, Encvclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980).
Tento vynález také předpokládá použití takových sloučenin, které jsou jak amidy, jak se zde popisují, tak i současně jejich farmaceuticky přijatelnými adičními solemi s kyselinami.
„Farmaceuticky nebo terapeuticky přijatelný nosič“ označuje nosné médium, které neinterferuje s účinností biologické aktivity aktivních sloučenin, a které není toxické pro hostitele nebo pacienta.
„Stereoizomer“ označuje chemickou sloučeninu se stejnou molekulovou hmotností, chemickým složením a uspořádáním jako jiná 20 sloučenina, ale s odlišně seskupenými atomy. To znamená, že jsou stejné chemické skupiny rozdílně orientovány v prostoru a proto mají v čistém stavu . Některé čisté stereoizomery však mohou mít optickou rotaci tak malou, že je současnými přístroji nedetekovatelná. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou mít jeden nebo více 25 asymetrických atomů uhlíku, a proto zahrnují různé stereoizomery. Všechny stereoizomery se zahrnují do rámce předkládaného vynálezu.
„Terapeuticky nebo farmaceuticky účinné množství“ se používá pro sloučeniny podle předkládaného vynálezu a označuje množství sloučeniny dostatečné pro indukci požadované biologické odpovědi.
3o Tato odpověď může být zmírnění příznaků nebo příčin onemocnění nebo jakákoliv jiná požadovaná změna biologického systému.
• * ··
.. .......
- 12V předkládaném vynálezu bude výsledek typicky zahrnovat snížení imunologické a/nebo zánětlívé odezvy na infekci při poranění tkáně.
Zbytky aminokyselin v peptidech se zkracují následujícím způsobem: fenylalanin je Phe nebo F; leucin je Leu nebo L; izoleucin je Ile nebo I; methionin je Met nebo M; valin je Val nebo V; serin je Ser nebo S; prolin je Pro nebo P; threonin je Thr nebo T; alanin je Ala nebo A; tyrozin je Tyr nebo Y; histidin je His nebo H; glutamin je Gin nebo Q; asparagin je Asn nebo N; lyzin je Lys nebo K; kyselina asparagová je Asp nebo D; kyselina glutamová je Glu nebo E; cystein je Cys nebo C; tryptofan je Trp nebo W; arginin je Arg nebo R; glycin je Gly nebo G. Dále Bu znamená butoxy, Bzl je benzyl, CHA je cyklohexylamin, Ac je acetyl, Me je methyl, Pen je penicilamin, Aib je kyselina aminoizomáselná, Nva je norvalin, Abu je kyselina aminomáselná, Thi je thienylalanin, OBn je O-benzyl, a hyp je hydroxyprolín.
Navíc k peptidům obsahujícím pouze v přírodě se vyskytující aminokyseliny mohou být také poskytnuty analogy peptidů nebo peptidy napodobující látky (peptidomimetika). Analogy peptidů se obvykle používají ve farmaceutickém průmyslu jako nepeptidová léčiva s vlastnostmi analogickými k vlastnostem templátového peptidů. Tyto typy nepeptidových sloučenin se označují jako „peptidomimetika“ nebo „peptidy napodobující látky“ (Fauchere, J., Adv. Druo Res., 15: 29 (1986); Veber a Freidinger, TINS. str. 392 (1985); a Evans a další, J. Med. Chem., 30: 1229 (1987). Peptidy napodobující sloučeniny, které mají podobnou strukturu jako terapeuticky použitelné peptidy, mohou být použity pro získání stejného nebo zvýšeného terapeutického nebo profylaktického účinku. Obecně jsou peptidy napodobující sloučeniny podobné vzorovému polypeptidu (tj. polypeptidu, který má biologickou nebo farmakologickou účinnost), jako jsou v přírodě se vyskytující polypeptidy, vážící se na receptor, ale mají jednu nebo více • · · «» ··· ··
- 13 peptidových vazeb, popřípadě nahrazenu vazbou zvolenou ze skupiny: -CH2OH2-, CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis a trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- a -CH2S0-, některým ze způsobů známých ze stavu techniky a dále popisovaných v následujících odkazech: Spatola, A.
F., Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and
Proteins, B. Weinstein, red., Marcel Dekker, New York, str. 267 (1983); Spatola, A. F., Veqa Data (březen 1983), díl 1, vyd. 3, Peptide Backbone Modifications (obecný přehled); Morley, Trends Pharm. Sci. (1980), str. 463 - 468 (obecný přehled); Hudson, D. a další, Int. J. w Pept. Prot. Res.. 14: 177 - 185 (1979) (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola a další, Life Sci.. 38: 1243 - 1249 (1986) (-CH2-S); Hann, J. Chem. Soc.
Perkin Trans. I. 307 - 314 (1982) (-CH=CH-, cis a trans); Almquist a další, J. Med. Chem. (23: 1392 - 1398 (1980) (-COCH2-); JenningsWhite a další, Tetrahedron Lett., 23: 2533 (1982) (-COCH2-); Szelke a 15 další, evropská patentová přihláška EP 45665 CA (1982): 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay a další, Tetrahedron Lett., 24: 4401 4404 (1983) (-C(OH)CH2); a Hrubý, Life Sci., 31: 189 - 199 (1982) (-CH2-S-); které se zde všechny uvádějí jako referenční. Zvláště výhodnou nepeptidovou vazbou je -CH2NH-. Tyto peptidy napodobující 20 látky mohou mít významné výhody proti provedením polypeptidů, například: ekonomičtější výroba, lepší chemická stabilita, zlepšené farmakologické vlastnosti (poločas, absorpce, schopnost působit, účinnost apod.), změněná specificita (např. šířka spektra biologického účinku), snížená antigenicita a další. Značení peptidy napodobujících 25 látek obvykle zahrnuje připojení jednoho nebo více markérů, přímo nebo prostřednictvím můstku (spacer) (např. amidové skupiny) na neinterferující polohu (polohy) peptid napodobující látky, která se předem určí pomocí kvantitativních dat struktura - účinnost a/nebo molekulárního modelování. Takovými neinterferujícími polohami jsou 30 polohy, které nevytvářejí přímé kontakty s makromolekulou (makromolekulami) (například molekuly širší rodiny imunoglobulinů), ke kterým se peptid napodobující sloučenina váže za dosažení • ••to • to ·· ··· ·· ··
- 14 terapeutického účinku. Derivatizace (například značení) peptidy napodobujících látek by v podstatě neměla interferovat s požadovanou biologickou nebo farmakologickou účinností peptid napodobující látky. Obvykle se peptid napodobující látky peptidů vážících se na receptoru 5 váží na receptor s vysokou afinitou a mají zjistitelnou biologickou účinnost (tj. agonistickou nebo antagonistickou k jedné nebo více receptorem podmíněných fenotypových změn.
Systematické nahrazování jedné nebo více aminokyselin obvyklé sekvence D-aminokyselinou stejného typu (například D-lyzin 10 namísto L-lyzinu) může být použito pro vytváření stabilnějších peptidů. Navíc mohou být v oboru známými metodami (Rizo a Gierasch, Ann. Rev. Biochem.. 61: 387 (1992) generovány uzavřené peptidy obsahující konvenční sekvenci nebo variaci v podstatě identickou s konvenční sekvencí; například přídavkem vnitřních cysteinových 15 zbytků schopných vytvářet intramolekulární disulfidické můstky, které peptid cyklizují.
Syntetické aminokyseliny nebo v přírodě se nevyskytující aminokyseliny označují aminokyseliny, které se nevyskytují v přírodě in vivo, ale které mohou být přesto začleněny do zde popisovaných 20 struktur peptidů. Výhodnými syntetickými aminokyselinami jsou D-aaminokyseliny v přírodě se vyskytujících L-a-aminokyselin stejně jako v přírodě se nevyskytující D- a L-a-aminokyseliny představované vzorcem H2NCHR5COOH, kde Rs je 1) skupina nižšího alkylu, 2) cykloalkylové skupina složená ze 3 až 7 atomů uhlíku, 3) heterocykl ze 25 3 až 7 atomů uhlíku a 1 až 2 heteroatomů zvolených z atomů kyslíku, síry a dusíku, 4) aromatický zbytek tvořený 6 až 10 atomy uhlíku, popřípadě s 1 až 3 substituenty na aromatickém jádře, zvolenými ze skupiny hydroxyl, nižší alkoxylová, aminová a karboxylová skupina, 5) -alkylen-Y, kde alkylen je alkylenová skupina tvořená 1 až 7 atomy 30 uhlíku a Y je zvoleno ze skupiny (a) hydroxylové, (b) aminové, (c) cykloalkylové a cykloalkenylové složených ze 3 až 7 atomů uhlíku, • * · · · ·
(d) arylové složené ze 6 až 10 atomů uhlíku, popřípadě s 1 až 3 substituenty na aromatickém jádře, zvolenými ze skupiny hydroxyl, nižší alkoxy, amino a karboxyl, (e) heterocyklické složené z 3 až 7 atomů uhlíku a 1 až 2 heteroatomů zvolených ze skupiny kyslíku, síry a dusíku, (f) -C(0)R2, kde R2 je zvoleno ze skupiny atom vodíku, hydroxyl, nižší alkyl, nižší alkoxyl a skupina -NR3R4, kde R3 a R4 jsou nezávisle na sobě zvoleny ze skupiny atom vodíku nebo nižší alkyl, (g) skupiny -S(O)nR6, kde n je celé číslo od 1 do 2 a Rs je nižší alkyl a s podmínkou, že R5 nedefinuje postranní řetězec v přírodě se vyskytující aminokyseliny.
Další výhodné syntetické aminokyseliny zahrnují aminokyseliny, u kterých je aminoskupina oddělena od karboxylové skupiny více než jedním atomem uhlíku, jako je b-alanin, kyselina g-aminomáselná apod.
Zvláště výhodnými syntetickými aminokyselinami jsou například D-aminokyseliny, v přírodě se vyskytujících L-aminokyselin, L-1naftylalanin, L-2-naftylalanin, L-cyklohexylalanin, kyselina L-2aminoizomáselná, sulfoxidové a sulfonové deriváty methionínu (tj. HOOC-(H2NCH)CH2CK2-S(O)nR6), kde n a R6 jsou jak definováno výše, stejně jako nižší alkoxylový derivát methionínu (tj. HOOC(H2NCH)CH2CH2-OR6, kde R6 je jak definováno výše).
„Detekovatelný markér“ označuje materiály, které při kovalentním navázání na peptidy a peptid napodobující látky podle vynálezu umožní detekci peptidu a peptid napodobující látky in vivo u pacienta, kterému byl peptid nebo peptid napodobující látka podán. Vhodnými detekovatelnými markéry jsou látky v oboru dobře známé, například radioizotopy, fluorescenční markéry (např. fluorescein) apod. Konkrétní použitý detekovatelný markér není kritický a volí se podle množství markéru, který má být použit, stejně jako jeho toxicity v použitém množství. Volba markéru vzhledem k těmto faktorům spadá do rámce znalostí v oboru.
Kovalentní připojení detekovatelného markéru k peptidu nebo peptid napodobující látce se provádí běžnými známými postupy. Když se například použije jako detekovatelný markér radioizotop 1251, kovalentního připojení 1251 k peptidu nebo peptid napodobující látce, může být provedeno zavedením aminokyseliny tyrozinu do peptidu nebo peptid napodobující látky a následnou jodací látky. Jestliže není tyrozin v peptidu nebo peptid napodobující látce přítomen, může být provedena v oboru známými způsoby inkorporace tyrozinu na N nebo C-konec peptidu nebo peptid napodobující látky. Podobně může být do peptidu nebo peptid napodobující látky ve formě fosfátové skupiny inkorporován 32P, například prostřednictvím hydroxylové skupiny na peptidu nebo peptid napodobující látce, s použitím běžné chemické reakce.
II. Přehled
Předkládaný vynález poskytuje sloučeniny, které se vážou na TPO-R a aktivují jej, nebo se jinak chovají jako agonisté TPO. Tyto sloučeniny obsahují „vzorové“ peptidové sloučeniny a „odvozené sloučeniny“ konstruované tak, aby měly stejnou nebo podobnou molekulární strukturu nebo tvar jako vzorové sloučeniny, ale odlišné od vzorových sloučenin buď s ohledem na vnímavost k hydrolýze nebo proteolýze a/nebo na jiné biologické vlastnosti, jako je zvýšená afinita k receptoru. Předkládaný vynález také poskytuje prostředky obsahující účinné množství agonisty TPO a zvláště prostředek, který je použitelný hematologických poruch, zvláště trombocytopenie spojené s chemoterapií, radiační terapií nebo transfuzemi kostní dřeně.
• ··· • · « ·· *
III. Identifikace agonistů TPO
Peptidy s vazebnou afinitou k TPO-R mohou být snadno identifikovány vytvářením systémů s náhodnou různorodostí peptidů spojených s postupem afinitního obohacování.
Systémy pro vytváření náhodné různorodosti peptidů konkrétně zahrnují systém „peptidy na plazmidech“, popsaný v US patentech No. 5,270,170 a 5,338,665; systém „peptidy na fágu“, popsaný v US patentové'přihlášce No. 07/718,577 z 20. 6. 1991, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 07/541,108 z 20. 6. 1990 a v Cwirla a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 87: 6378 - 6382 (1980); „polyzomový systém“ popisovaný v US patentové přihlášce No. 08/300,262 z 2. 9. 1994, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/144,775 z 29. 10. 1993 a PCT WO 95/11992; systém „kódované syntetické knihovny“ (ESL) popisovaný v US patentové přihlášce No. 08/146,886 z 12. 11. 1993, navazující na US patentovou přihlášku No. 07/946,239 z 16. 9. 1992, navazující na US patentovou přihlášku No. 07/762,522 z 18. 9. 1991; a systém „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ (very large scale immobilized polymer synthesis) popisovaný v US patentu No. 5,143,854; zveřejnění PCT patentu No. 90/15070, zveřejněn 13. 12. 1990; US patentové přihlášce No. 07/624,120 z 6. 12. 1990, Fodor a další, Science, 251: 767 - 773 (2/1991); Dower a Fodor, Ann Rep. Med. Chem., 26: 271 - 180 (1991); a US patentové přihlášce No. 07/805,727 z 6. 12. 1991.
S použitím výše popsaných postupů byly obecně navrhovány náhodné peptidy tak, aby měly definovanou délku v počtu aminokyselinových zbytků (např. 12). Pro vytváření sbírky oligonukleotidú kódujících náhodné peptidy byl použit kodonový motiv (NNK)X, kde N je nukleotid A, C, G nebo T (ekvimolárně; v závislosti na použité metodě, mohou být použity další nukleotidy), K je G nebo T (ekvimolárně) a x je celé číslo odpovídající počtu aminokyselin
- 18 v peptidu (např. 12) pro specifikaci jakéhokoliv z 32 možných kodonů vyplývajících z motivu NNK: 1 pro každou z 12 aminokyselin, 2 pro každou z 5 aminokyselin, 3 pro každou ze 3 aminokyselin a pouze 1 ze 3 stop kodonů. Motiv NNK tedy kóduje všechny aminokyseliny, 5 pouze jeden stop kodon a redukuje nerovnoměrnost kodonů.
V použitém systému byly náhodné peptidy předkládány buď na povrchu částice fágu, jako část fuzního proteinu obsahujícího buď plil nebo pVIM obalový protein derivátu fd fága (peptidy na fágu) nebo jako fuzní protein s fuzním proteinem Lad navázaným na plazmid io (peptidy na plazmidech).
Fág nebo plazmidy včetně DNA kódující peptidy byly identifikovány a izolovány afinitním obohacovacím postupem s použitím imobilizovaného TPO-R. Afinitní obohacovací proces, někdy nazývaný „panning“, se skládá z několika cyklů inkubace fága 15 piazmidů nebo polyzomů s imobilizovaným receptorem, izolace fága, plazmidů nebo polyzomů, které se vážou na receptor spolu s doprovázející DNA nebo mRNA a produkce většího množství fágů nebo plazmidů (spolu s doprovázejícím fuzním proteinem Lacl-peptid). V průběhu afinitního obohacovacího procesu byla typicky používána 20 extracelulární doména (ECD) TPO-R.
Po několika cyklech afinitního obohacování byl fág nebo plazmidy a doprovázející peptidy testovány metodou ELISA s cílem určit, jestli se peptidy specificky vážou na TPO-R. Tento test byl prováděn podobně jako postupy používané v afinitním obohacovacím 25 způsobu, s výjimkou toho, že po odstranění nenavázaného fága byly jamky typicky inkubovány s králičí anti-fágovou protilátkou, potom s alkalickou fosfatázou (AP) konjugovanou s kozí antikráličí protilátkou. Množství alkalické fosfatázy v každé jamce bylo stanoveno standardními způsoby. Podobný postup ELISA pro použití 3o pro systém peptidy na plazmidech se popisuje podrobněji níže.
• ·
Porovnáním testovacích jamek s kontrolními jamkami (bez receptoru) je možno určit, zda se fuzní proteiny specificky vážou na receptor. Vzorky fága, u kterých bylo zjištěno, že se vážou na TPO-R, byly testovány pomocí vzorkování s přenosem kolonií s použitím radioaktivně značeného monovalentního receptoru. Tuto sondu je možno vyrobit fosforylací kemptidové sekvence fúzované k C-konci rozpustného receptoru s použitím proteinkinázy A. „Uměle vytvořená“ forma receptoru TPO je potom exprimována v hostitelských buňkách, typicky buňkách CHO. Po sklizni PI-PLC receptoru byl receptor testován na vazbu k TPO nebo TPO-R specifickým fágovým klonům. Receptor se potom značí až do dosažení vysoké specifické aktivity 33p a je ho potom možno použít jako monovalentní sondy pro identifikaci ligandů s vysokou afinitou s použitím přenosu kolonií.
Peptidy, u kterých bylo zjištěno, že se specificky vážou na receptor, byly potom syntetizovány jako volné peptidy (například bez fága) a testovány blokovacím testem. Blokovací test byl prováděn podobným způsobem jako ELISA s tím rozdílem, že TPO nebo referenční peptid byly přidávány do jamek před fuzním proteinem (kontrolní jamky byly dvou typů: (1) bez receptoru; a (2) bez TPO nebo referenčního peptidu). Fuzní proteiny, pro které byla vazba na receptor blokována TPO nebo referenčním peptidem, obsahují v části náhodného peptidu peptidy, které jsou výhodnými sloučeninami podle vynálezu.
TPO-R, stejně jako jeho extracelulární doména, byly produkována v rekombinantních hostitelských buňkách. Jedna použitelná forma TPO-R se vytváří expresí proteinu jako rozpustného proteinu v bakulovirem transformovaných hostitelských buňkách s použitím standardních způsobů; další použitelná forma se vytvoří se signálním peptidem pro sekreci proteinu a pro připojení ukotvením na giykofosfolipidovou membránu. Tato forma ukotveni se nazývá „PIG• « · · tailing“, viz Caras a Wendell, Science, 243: 1196 - 1198 (1989) a Lin a další, Science, 249: 677 - 679 (1990).
S použitím systému PIG-tailing je možno odštěpit receptor z povrchu buněk, které jej exprimují (např. transformovaných buněk s CHO selektovaných na vysokou expresi receptoru pomocí třídiče buněk) fosfolipázou C. Odštěpený receptor stále ještě obsahuje karboxylovou terminální sekvenci aminokyselin, nazývanou „HPAP tail“ ze signálního proteinu pro připojení na membránu a může být imobilizován bez dalšího čištění. Rekombinantní receptorový protein io může být imobilizován potažením jamek mikrotitračních destiček protilátkou anti-HPAP tail (Ab 179 nebo MAb 179), blokováním nespecifické vazby bovinním sérovým albuminem (BSA) v PBS a potom vazbou odštěpeného rekombinantního receptoru na protilátku. S použitím tohoto postupu je možno provádět imobilizační 15 reakci při různých koncentracích receptoru pro určení optimálního množství pro daný preparát, protože různé preparáty rekombinantního proteinu často obsahují různá množství požadovaného proteinu. Navíc by se mělo zajistit, že imobilizovaná protilátka je (TPO nebo některou jinou blokovací sloučeninou) v průběhu postupu afinitního 2o obohacováni úplně blokována. Jinak muže neblokovaná protilátka vázat v průběhu postupu afinitního obohacování nežádoucího fága. Pro blokováni nenavázaných míst, která zůstala po imobilizaci receptoru pro zabránění tomuto problému je možno použít peptidy, které se vážou na imobilizující protilátku nebo je možno jednoduše 25 imobilizovat receptor přímo na jamky mikrotitračních destiček bez pomoci imobilizující protilátky. (Viz US patentová přihláška No. 07/947,339 z 18. 9. 1992, jejíž obsah se zde uvádí jako referenční.)
Při použití systémů vytváření náhodných peptidů, které dovolují multivalentní interakce ligand - receptor, je nutno připustit, že hustota
3o imobilizovaného receptoru je důležitým faktorem při zjišťování afinity ligandů, které se vážou na imobilizovaný receptor. Při vyšších
hustotách receptoru (například každá jamka potažená protilátkou antireceptor je inkubována s 0,25 až 0,5 mg receptoru) je multivalentní vazba pravděpodobnější než při nízkých hustotách receptoru (například každá jamka potažená protilátkou anti-receptor se inkubuje s 0,5 až 1 ng receptoru). Jestliže se vyskytuje multivalentní vazba, dojde s větší pravděpodobností k izolaci ligandu s relativně nižší afinitou, pokud se nepoužije vyšších hustot imobilizovaného receptoru pro identifikaci vzorových sloučenin a použije se nižších hustot receptoru pro izolaci odvozených sloučenin s vyšší afinitou.
Pro rozlišení mezi peptidy s vyšší afinitou se často používá monovalentní receptorová sonda. Tato sonda může být vytvořena s použitím proteinkinázy A pro fosforylaci kemptidové sekvence připojené k C-konci rozpustného receptoru. „Umělá forma“ receptoru TPO se potom exprimuje v hostitelských buňkách, typicky v buňkách CHO. Po sklizni PI-PLC receptorů byl receptor testován na vazbu k TPO nebo k TPO-R specifickým fágovým klonům. Receptor se potom značí až do vysoké specifické aktivity 33P pro použití jako monovalentní sonda pro identifikaci ligandu s vysokou afinitou s použitím přenosu kolonií.
Výhodné metody screeningu pro umožnění identifikace peptidů, které se vážou na TPO-R zahrnují nejprve identifikaci vzorových peptidů, které se vážou na extracelulární doménu receptoru a potom přípravu dalších peptidů, které se vzorovým peptidům podobají. Konkrétně může být s použitím peptidů založených na plil nebo pVIII ve fágovém systému proveden screening náhodné knihovny pro odhalení fága nesoucího peptid, který se váže na TPO-R. Fágové DNA jsou sekvenovány pro stanovení sekvencí peptidů nesených na povrchu fágů.
Klony schopné specificky se vázat na TPO-R byly identifikovány z náhodného lineárního 10-meru knihovny pVIII a náhodného cyklického 10-meru a 12-meru knihoven pVIII. Sekvence těchto • φ
peptidů slouží jako základ pro konstrukci dalších peptidových knihoven navržených tak, aby obsahovaly deriváty na počátku identifikovaných peptidů s vysokou frekvencí. Tyto knihovny mohou být syntetizovány tak, aby byla zvýhodněna produkce peptidů, které se liší od vazebného peptidů pouze v několika zbytcích. Tento přístup zahrnuje syntézu oligonukleotidu s kódující sekvencí vazebného peptidů tak, že se při syntéze nepoužívá čistých preparátů každého ze čtyř nukleosidtrifosfátů, ale používá se směsí čtyř nukleosidtrifosfátú (tj. jednou z výhodných směsí pro tento účel je 55 % „správného“ nukleotidu a 15 % každého z ostatních tří nukleotidů a další výhodnou směsí pro tento účel je 70 % „správného“ nukleotidu a 10 % každého z ostatních tří nukleotidů), aby došlo k vytvoření derivátů kódující sekvence vazebného peptidů.
Pro derivatizaci vzorových peptidů byla použita řada strategií vytvořením knihoven „mutageneze na určité téma“. Ty zahrnovaly pVIII fágmidovou mutagenetickou knihovnu založenou na konvenční sekvenci mutagenizované s frekvencí 70 :10:10: 10a prodloužené na každém konci náhodnými zbytky za vytvoření klonů zahrnujících sekvenci XXXX (C, S, P nebo R) TLREWLXXXXXX (C nebo S). Podobná prodloužená/mutagenízovaná knihovna byla vytvořena s použitím systému peptidy na plazmidech za vytvoření klonů obsahujících sekvenci XXXXX (C, S, P nebo R) TLREWL XXXXXXX. S použitím polyzomového systému byla vytvořena další prodloužená/mutagenízovaná knihovna, XXXX (C, S, P, nebo R) TLREWL XXXXXX (C nebo S). U všech tří knihoven byl proveden screening s elucí peptidů a testováním sondou s radioaktivně značeným monovaientním receptorem.
Pro screening a studia mutageneze byl také použit postup „peptidy na plazmidech“, který se podrobněji popisuje v US patentu No. 5,338,665, který se zde uvádí jako referenční. Podle tohoto způsobu se náhodné peptidy expresí z plazmidového vektoru
B • · - 23 ·nesoucího fuzní gen fuzují na C-konec Lacl. Dojde k připojení peptidu Lad na jeho kódující DNA pomocí sekvencí lacO na plazmidu za vytvoření stabilního komplexu peptid - Lacl - plazmid, který múze být testován afinitním čištěním (panning) na imobilizovaném receptoru. Takto izolované plazmidy mohou být potom znovu zavedeny do E. coli pomocí elektroporace pro amplifikaci vybrané populace pro další cykly screeningu nebo pro testování jednotlivých klonů.
Navíc byly prováděny studie mutageneze a screening náhodného peptidu s použitím modifikovaného C-koncového Lac-I expresního systému, u kterého byla snížena expresní valence (systém typu „headpiece dimer“). Byl prováděn screening knihoven a výsledné inzerty DNA byly klonovány do vektoru maltózového vazebného proteinu (MBP), který dovolil jejich expresi jako C-koncového fuzního proteinu. Surové buněčné lyzáty z náhodně odpíchnutých jednotlivých fuzních klonů MBP byly potom testovány způsobem ELISA na vazbu k TPO-R jak bylo popsáno výše.
Studie mutageneze peptidů byly také prováděny s použitím polyzomového systému jak se popisuje v související US patentové přihlášce No. 08/300,262, 2. 9. 1994, navazující na US patentovou přihlášku No. 08/144,775 z 29. 10. 1993 a PCT WO 95/11992, které se zde uvádějí jako referenční. Byla vytvořena mutagenetická knihovna založená na sekvenci X X X X (C, P, R nebo S) t I r e f I X X X X X X (C nebo S), kde X označuje náhodný kodon NNK a malá písmena představují kodony aminokyselin obsahující mutagenezi 70 : 10 : 10 : 10 v polohách 1 a 2 a K (G nebo T) v poloze 3 kodonu. Byla provedena vazba technikou panning s pěti cykly na receptor TPO, který byl imobilizován na magnetických kuličkách. Po pátém cyklu bylo množství amplifikované PCR klonováno do pAFF6 a byly sekvenovány ELISA pozitivní klony. Sekvence byly subklonovány do vektoru MBP a pomocí MBP ELISA byly zjišťovány jejich vazebné afinity.
• « · ·
Pro imobilizaci TPO-R pro screening polyzomů byla nejprve konjugována Ab 179 k tosylem aktivovaným magnetickým kuličkám (výrobek firmy Dynal Corporation) podle návodu výrobce. Kuličky byly inkubovány s protilátkou v 0,5 M borátovém pufru (pH 9,5) přes noc 5 při pokojové teplotě. Potom byly kuličky promyty a spojeny s TPO-R obsahující konec „HPAP“. Kuličky potažené protilátkami a receptor byly inkubovány 1 hod při 4 °C a před přídavkem k polyzomové knihovně byly kuličky promyty znovu. Screening různých výše popsaných knihoven poskytl peptidy vážící se na receptor TPO io ukázané v tabulkách 1 a 2 níže i další peptidy, které nejsou uvedeny.
« * «
- 25’-*
Tabulka 1
Peptid |
REGPTLRQWM |
REGPTLRQWM |
SRGMTLREWL |
EGPTLRGWLA |
REGQTLKEWL |
ERGPFWAKAC |
REGPRCVMWM |
CSGLTLREWLVC |
CLTGPFVTQWLYEC |
CGEGLTLTQWLEHC |
CRAGPTLLEWLTLC |
CRAGPTLLEWLTLC |
CRQGPTLTAWLLEC |
CADGPTLREWISFC |
CELVGPSLMSWLTC |
CGTEGPTLSTWLDC |
CDQLGVTLSRWLEC |
SGTGLTLREWLGSFSLLS |
CPEGPTLLQWLKRGYSSC |
RGDGPTLSQWLYSLMIMC |
MVAGPTLREFIASLPIHC |
SMQGPTFREWVSMMKVLC |
*♦ • · it · *
- 26 v « · ♦ ·
SVQCGPTLRQWLAARNHLS |
GNADGPTLRQWLEGRRPKN |
SVRCGPTLRQWLAARTHLS |
LAIEGPTLRQWLHGNGRDT |
HGRVGPTLREWKTQVATKK |
CADGPTLREWISFC |
ISDGPTLKEWLSVTRGAS |
SIEGPTLREWLTSRTPHS |
TIKGPTLRQWLKSREHTS |
GNADGPTLRQWLEGRRPKN |
SIEGPTLREWLTSRTPHS |
ISDGPTLKEWLSVTRGAS |
···♦
·♦ ·*·· *♦ «« • · * · · · · • · 9 · · · ♦ • · · * · · · · · « » · · · · · «
Tabulka 2
Peptid |
CSLEDLRKRC |
CRRSELLERC |
CTFKQFLDGC |
CTRGEWLRCC |
CTLRQWLQGC |
CTLEELRACC |
CTREELMRLC |
CQRADLINFC |
CNRNDLLLFC |
CTRTEWLHGC |
CTLEFMNGC |
CSLGELRRLC |
CNINQLRSIC |
CTMRQFLVCC |
CTRSEWLERC |
CTLHEYLSGC |
CTREELLRQC |
CTFREFVNGC |
CSRADFLAAC |
CSCAQVVQCC |
CTLRQWILLGMC |
CTLREWLHGGFC |
• · • · «
CTLRAWLMSETC |
CTLRAWLMESCC |
CTFQVWKLARNC |
CLLREWLDXRTC |
CVLREWLLXXSC |
CLLSEFLAGQQC |
CSLRQYLDFGLGSC |
CTLQELKQSSLYEC |
CDLSELKTHGYAYC |
CKLSDWLMNGVAAC |
CSLQEFLSHGGYVC |
CSLKEFLHSGLMQC |
CTFRQLLEYGVSSC |
CTM R EF LVASGVAC |
CTLAEFLASGVEQC |
CTLAEFLASGVEQC |
CTLKEWLVSHEVWC |
CTLREFLSLGMNAC |
CTLREFLDPTTAVC |
CSLLEFLALGVALC |
GGGRGCTLKQWKQGDCGRS |
CNRSQLLAAC |
CTLQQWLSGC |
CTLREFKAGC |
• · · Β
CTRAQFLKGC |
CTLREFNRGC |
CTLSDFKRGC |
CTFRQWKEAC |
CTLSEFRGGC |
CTLQEFLEGC |
CTLQQWKDGC |
CTRSQWLEGC |
CSLQEFKHGC |
CTLGEWKRGC |
CTLWGCGKRGC |
CTLQEWRGGC |
CTRLSGCWLC |
CTRTQWLLDC |
CTLAEFRRGC |
CTSTQWLLAC |
CSRSQFLRSC |
CTLREWLEGC |
CTLREFLLMGAC |
CTLKEWLLWSSC |
CTLLEWLRNPVC |
CTLRQWLGDAWC |
CTLGQWLQMGMC |
CTLREWVFAGLC |
• · ···· 4 4 Φ φ · 4 4 4 4 4
4 4 4 4444 4
Φ 4 4 4 4 4
CLLLEFLSGADC |
CTLGEFLAGHLC |
CRLREFLVDLTC |
CSFRSWLVDQTC |
CTLREWLEDLGC |
CTLQDWLVSWTC |
CTLSEWLSELSC |
CTLMQWLGGWPC |
CTLREWLSYGTC |
CTLQEWLSGGLC |
GSHGCTLREWLCMKIVPC |
QWQGCTLRDCILRGVFWS |
SVNSCTLREFLTGCRVFC |
SYDGCTLRHWLMDIYGDC |
QRSGCTLRDWVLLNCLAS |
NYRGCTLSQWVSEQIVGC |
GRSGCTLREYLGGMCYLS |
ASWYCTVPELMEMQLPEC |
GSTGCTLREXLHMLGLDC |
ACEGCTLRQWLEYVRVGC |
AQRGCTLQYFVSYGXDMC |
GVCGCTLREFLAIPHTSC |
SEGGCTLREWVASSLANC |
SNSRCTLREWIIQGCDFS |
SNSRCTLREWIIQGCDFS |
CLGCTLSQWRKRTRCDTH |
YRGCSRAQLLGGECRKK |
GRGCTLKQWKQGDCGRS |
VRGGCALRDWVAGECFDWT |
LWRGCTLNGFKSRHCGSPE |
CTLRSWKHRGCAP |
GRGCTRAQWLAGCCTGH |
RAGCTLREFRKGCLAL |
KRGSTLAEMIRGCNRSN |
GRGCTLKQWKQGDCGRS |
RWRGCSLAKLKKGAACGRG |
RGGCTLREWRRVRVIN |
GRGCTLKQWKQGDCGRS |
RYGCTRHQWLVGTCVRH |
Hodnoty IC50 pro některé další příklady peptidů se uvádějí v další tabulce. Pro zjištění hodnot ICS0 je možno použít různých metod. Pro zjištění, jestli peptidy inhibují vazbu TPO na extracelulární 5 doménu receptoru TPO, byla použita například metoda ELISA s rovnovážnou vazbou s použitím stopovací látky buď MBP-TPO nebo lacl-peptid. Typicky byly hodnoty IC5o určovány s použitím volného peptidu. Hodnota IC50 může být stanovena s použitím volného peptidu, který může být popřípadě amidován na C-konci nebo může být 10 připraven jako ester nebo jiný karboxyamid.
• · · * « · · · ·
Pro obnovení přesné sekvence vytvořené na fágu se Nkoncovým a C-koncovým aminokyselinám syntetických peptidů často předřazují jeden nebo dva glycinové zbytky. Předpokládá se, že tyto glyciny nejsou nezbytné pro vazbu nebo aktivitu. Podobně se pro napodobení přesné sekvence peptidů vytvořených na polyzomech předřazuje C-koncovým aminokyselinám syntetických peptidů sekvence MAS. Opět se předpokládá, že sekvence není nutné pro vazbu nebo aktivitu.
Hodnoty ICSo se symbolicky označují symboly „+“ a Například peptidy s hodnotami IC5o vyššími než 200 μΜ se označují jako Peptidy s hodnotami IC5o menšími nebo rovnými 200 μΜ se označují jako „+“ a peptidy s hodnotami IC5o menšími než 500 nM se označují jako B++“. Peptidy s hodnotami IC5o v blízkosti rozhraní těchto symbolů se označují hybridním označením, např. Peptidy, u kterých nebyly hodnoty IC5o stanoveny, se označují jako „N. D.“. Hodnota IC50 pro peptidy se strukturou: GGCTLREWLHGGFC G G byla 500 nM nebo méně. (Je třeba uvést, že N-koncovým a Ckoncovým aminokyselinám předcházely dva glyciny pro obnovené přesné sekvence vytvořené fágem. U těchto glycinú se předpokládá, že nejsou nutné pro vazbu nebo aktivitu.
Tabulka 3
Peptid | Afinita |
GGCADGPTLREWISFCGG | ++ |
GNADGPTLRQWLEGRRPKN | ++ |
GGCADGPTLREWISFCGGK | ++ |
TIKGPTLRQWLKSREHTS | ++ |
GPTLRQWL | - |
LAIEGPTLRQWLHGNGRDT | ++ |
SIEGPTLREWLTSRTPHS | ++ |
Tabulky výše, zejména tabulka 3 ukazuje, že výhodný peptid jádra obsahuje sekvenci aminokyselin:
s X, X2 X3 X4 X5 Χβ Xz kde Xt znamená C, L, Μ, P, Q, V; X2 znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X3 znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X5 znamená A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X6 znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a iq X7 znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V.
Ve výhodném provedení obsahuje jádro peptidu sekvenci aminokyselin:
X8 G Xi X2 X3 X4 Xs W X7 kde X1 znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X2 znamená F, R, S nebo T;
X3 znamená F, L, V, nebo W; X4 znamená A, K, L, M, R, S, V, nebo T; X5 znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; X7 znamená C, I, K, L, M nebo V; a každý ze zbytků X8 je nezávisle na sobě zvolen z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin, jejich stereoizomerních D-
* | * · V · | >9 | 99 | |||
• | • 0 | • · | t | 9 V | • | 4 |
• | • | • 9 | • | • ♦ | • 0 | |
« | 9 9 9 | • · | • | |||
• ' · | • | • · | • · | • | • | • |
- 34 aminokyselin a nepřírodních aminokyselin. S výhodou je každý zbytek X8 nezávisle zvolen z jakýchkoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin a jejich stereoizomerních D-aminokyselin. Ve výhodném provedeni Xi znamená P; X2 znamená T; X3 znamená L; X4 znamená R; X5 znamená E nebo Q; a X7 znamená I nebo L.
Výhodněji obsahuje jádro peptidu sekvenci aminokyselin:
X9 Xe G X, X2 X3 X4 X5 W X7 kde Xg znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V; a X8 znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V. Výhodněji je skupina X9 A nebo I; a X8 znamená D, E, nebo K.
Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCADGPTLREWISF CGG;GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTL REWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;SIEG PTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLHGNGRD T;CADGPTLREWISFC;alEGPTLRQWLAARA.
V dalším provedení vynálezu zahrnují výhodné peptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu peptidy se strukturou jádra obsahující sekvenci aminokyselin:
C X2 X3 X4 X5 X6 X7 kde X2 znamená K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X3 znamená C, F, I, L, M, R, S nebo V; X4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X5 znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X6 znamená C, F, G, L, M, S. V, W nebo Y; X7 znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V. Ve výhodnějším provedení znamená X4 A, E, G, Η, K, L, Μ, P, Q, R, S, T nebo W. V dalším provedení X2 je S nebo T; X3 je L nebo R; X4 je R; X5 je D, E, nebo G; X6 je F, L, nebo W; a X7 je I, K, L, R, nebo V. Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCTLREWLHGGFCGG.
V dalším provedení jsou výhodnými peptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu peptidy se strukturou obsahující sekvenci aminokyselin:
····
- 35 X8 C X2 X3 X< X5 Xe Xz kde X2 znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X3 znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X5 je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X6 je C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X7 je C, G, I, K, L, Μ, N, R, nebo V; a X8 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin. V některých provedeních je X8 s výhodou G, S, Y, nebo R.
Peptidy a peptidy napodobující látky s ICSo větší než přibližně 100 mM mají nedostatečnou vazbu pro umožnění buď při diagnostice nebo pro terapeutické účely podle vynálezu. Pro diagnostické účely mají s výhodou peptidy a peptidy napodobující látky IC50 přibližně 2 mM nebo menší a pro farmaceutické účely mají peptidy a peptidy napodobující látky IC5o přibližně 100 μΜ nebo menší.
Sekvence vazebného peptidů také poskytuje způsob pro stanovení minimální velikosti vazebné sloučeniny TPO-R podle vynálezu. Použitím systému „kódované syntetické knihovny“ (ESL) nebo systém „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ je možno nejen stanovit minimální velikost peptidů s touto aktivitou, ale také vyrobit všechny peptidy tvořící skupinu peptidů odlišných od výhodného motivu (nebo minimální velikosti tohoto motivu) v jednom, dvou nebo více zbytcích. Potom může být proveden screening tohoto souboru peptidů na schopnost vazby na receptor TPO. Tyto systémy syntézy imobilizovaných polymerů nebo další způsoby syntézy peptidů mohou být také použity pro syntézu kmenových analogů, delečních analogů, substitučních analogů a jejich kombinací všech peptidových sloučenin podle vynálezu.
Peptidy a peptidy napodobující látky podle předkládaného vynálezu byly také testovány v testu trombopoetin dependentní buněčné proliferace, jak se podrobněji popisuje v příkladu 2 níže. Buněčná proliferace se měří v oboru známými způsoby, jako je stanovení MTT, které koreluje s inkorporací 3H-thymidinu jako • · • · · ♦
indikátoru buněčné proliferace (viz Mossmann, J. Immunol. Methods, 65: 55 (1983). Testované peptidy stimulovaly proliferaci TPO-R transfekovaných buněk Ba/F3 v závislosti na dávce, jak je ukázáno na obr. 1A. Tyto peptidy nemají žádný účinek na rodičovskou buněčnou 5 linii, jak je vidět v obr. 1B.
Obr. 7 až 9 ukazují výsledky dalšího testu vyhodnocujícího aktivitu peptidů a peptidy napodobujících látek podle vynálezu. V tomto testu se pomocí karboplatiny vytvoří trombocytopenické myši. Obr. 7 ukazuje typické výsledky při podání karboplatiny myši Balb/C io (125 mg/kg intraperitoneáině) v den 0. Čárkované přímky představují neošetřená zvířata ze tří experimentů. Plné čáry představují karboplatinou ošetřené skupiny ve třech experimentech. Silné plné čáry ukazují historické údaje. Obr. 8 zobrazuje účinek titrace karboplatiny na počty krevních destiček u myši, ošetřené uvedenými 15 dávkami karboplatiny (v mg/kg, intraperitoneáině (ip), v den 0). Obr. 9 ukazuje odstranění karboplatinou indukované trombocytopenie v den 10 peptidem AF12523 (513). Karboplatina (CBP; 50 - 125 mg/kg, intraperitoneáině) byla podána v den 0. Peptid AF 12513 (1 mg/kg, ip) byl podáván ve dnech 1 až 9. Tyto výsledky ukazují, že peptidy podle 2o vynálezu mohou v myším modelu zlepšovat trombocytopenii.
Určité peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být navíc dimenzovány nebo oligomerizovány a tím může být zvýšena jejich afinita a/nebo aktivita. Pro výzkum účinku, který má dimerizace/oligomerizace peptidů na TPO mimetickou schopnost 25 v testech buněčné proliferace byl syntetizován na C-konci biotinylovaný analog peptidu GGCADGPTLREWISFCGG (GGCADGPTLREWISFCGGK (Biotin)). Peptid byl předem inkubován se streptavidinem v bezsérovém HEPES - pufrovaném RPMI v molárním poměru 4:1. Komplex byl testován na stimulaci 30 buněčné proliferace TPO-R transfekovaných buněk Ba/F3, jak bylo uvedeno výše, spolu s volným biotinylovaným peptidem a • · • · · · · ·
·· .·· ·· ··
- 37 nebiotinylovaným rodičovským peptidem. Obr. 2A ukazuje výsledky testu pro komplexní biotinylovaný peptid (AF 12885 se streptavidinem (SA) jak pro transfekované, tak i rodičovské buněčné linie. Obr. 2B ukazuje výsledky testu pro volný biotinylovaný peptid (AF 12285) jak pro transfekované, tak i pro rodičovské buněčné linie. Obr. 2C ukazuje výsledky testu pro samotný streptavidin jak pro transfekované, tak i rodičovské buněčné linie. Tyto obrázky ukazují, že předem vytvořený komplex byl přibližně 10 x účinnější, než volný peptid.
Specificita vazby a aktivity peptidu podle vynálezu byla testována rovněž studiem křížové reaktivity peptidů pro erytropoetinový receptor (EPO-E). EPO-R je také člen rodiny hematopoetinového receptoru růstového faktoru, jako je TPO-R. Peptidy podle vynálezu stejně jako TPO, EPO a známý EPO-vazebný peptid byly testovány v testu buněčné proliferace s použitím EPOdependentní buněčné linie. Tento test používá FDCP-1, buněčné linie myších multipotenciálních primitivních hematopoetických prekurzorových buněk, dependentních na růstový faktor (viz např. Dexter a další, J. Exp. Med., 152: 1036 - 1047 (1981), jako rodičovské buněčné linie. Tato buněčná linie může proliferovat, ale není schopna diferenciace, pokud roste v WEHI-3-kondicionovaném médiu (médium obsahující IL-3, ATCC No. T1B68). Rodičovská buněčná linie je transfekována lidským nebo myším EPO-R za vytvoření buněčné linie FDCP-1-EPO-R. Transfekované buněčné linie mohou proliferovat, ale v přítomnosti lidského nebo myšího EPO se nemohou diferencovat.
Buňky rostly v přítomnosti nutných růstových faktorů do poloviční hustoty ve stacionární fázi. Buňky byly potom promyty v PBS a hladověly 16 až 24 hodin v úplném médiu bez růstových faktorů. Po stanovení počtu životaschopných buněk byly vytvořeny zásobní roztoky (v úplném médiu bez růstových faktorů) s koncentrací přibližně 10s buněk na 50 μΙ. V 96-jamkových destičkách pro tkáňovou kultivaci se připraví sériová ředění testovaných sloučenin, typicky volný roztok • · · ·
peptidu proti na fág navázanému nebo jiným způsobem navázanému nebo imobilizovanému peptidu, na konečný objem 50 pl na jamku. Do každé jamky se přidají buňky (50 μΙ) a inkubují se 24 až 48 hodin, přičemž v tomto okamžiku by mely negativní kontroly zahynout nebo 5 být v klidovém stavu. V oboru známými způsoby, jako je test MTT, se pak měří buněčná proliferace.
Obr. 3A - G ukazují výsledky série kontrolních experimentů ukazujících aktivitu TPO, peptidu podle předkládaného vynálezu, EPO a EPO-R vazebných peptidu v testu buněčné proliferace s použitím io buď TPO-R transfekované buněčné linie Ba/F3 a jí odpovídající rodičovské linie nebo EPO-dependentní buněčné linie a jí odpovídající rodičovské linie. Obr. 3A zobrazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím TPO-R transfekované buněčné linie Ba/F3 a jí odpovídající rodičovské linie. Obr. 3B ukazuje výsledky pro EPO 15 v testu buněčné proliferace s použitím TPO-transfekované buněčné linie Ba/F3 a odpovídající rodičovské linie. Obr. 3C ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný peptid (AF 12285 se streptavidinem (SA) a komplexní formu biotinylovaného EPO-R vazebného peptidu (AF 11505 s SA) v TPO-R transfekované buněčné linii Ba/F3. Výsledky pro 2o odpovídající rodičovskou buněčnou linii jsou uvedeny v obr. 3D.
Obr. 3E ukazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3F ukazuje výsledky pro EPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3G ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný 25 peptid (AF 12285 se streptavidinem (SA) a komplexní formou biotinylovaného EPO-R vazebného peptidu (AF 11505 s SA) v EPOdependentní buněčné linii. Tyto výsledky ukazují, že peptidy podle vynálezu se váží a aktivují TPO-R s vysokým stupněm specificity.
· • ·· 9
IV. Příprava peptidů a peptid napodobujících látek
A. Syntéza na pevně fázi
Peptidy podle vynálezu mohou být připraveny klasickými v oboru známými postupy, například použití standardních metod s syntézy na pevné fázi. Standardní způsoby zahrnují syntézy prováděné výlučně na pevné fázi, způsoby syntézy prováděné částečně na pevné fázi, kondenzaci fragmentů, klasickou syntézu z roztoků a dokonce i rekombínantní technologii DNA (viz například Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963). Na pevné fázi se io syntéza typicky provádí od C-konce peptidu s použitím alfa-amino chráněné pryskyřice. Vhodné výchozí materiály mohou být například připraveny připojením požadované alfa-amino kyseliny na chloromethylovanou pryskyřici, hydroxymethylovou pryskyřici nebo benzhydrylaminovou pryskyřici. Jedna taková chloromethylovaná 15 pryskyřice se dodává pod obchodním názvem BIO-BEADS SX-1, firma Bio Rad Laboratories, Richmond, CA a příprava hydroxymethylové pryskyřice se popisuje v Bodonszky a další, Chem. Ind.. (Londýn) 38: 1597 (1966). Benzhydrylaminová (BHA) pryskyřice byla popsána v Pietta a Marshall, Chem. Commn, 650 (1970) a je komerčně 20 dostupná ve formě hydrochloridu u firmy Beckman Instruments, lne., Palo Alto, CA.
Sloučeniny podle vynálezu mohou být tedy připraveny navázáním alfa-amino chráněné aminokyseliny na chloromethylovanou pryskyřici s pomocí například katalyzátoru 25 hydrogenuhličitanu česného způsobem popsaným v Gisin, Helv. Chim.
Acta.. 56: 1467 (1973). Po počáteční vazbě se alfa-amino ochranná skupina odstraní reagencií zvolenou z roztoků kyseliny trifluoroctové (TFA) nebo chlorovodíkové (HCI) v organických rozpouštědlech při pokojové teplotě.
Alfa-amino ochranné skupiny jsou skupiny známé jako použitelné při postupné syntéze peptidů. Patří sem ochranné skupiny • ·
...............
-40 acylového typu (například formyl, trifluoroacetyl, acetyl), aromatické ochranné skupiny urethanového typu (například benzyloxykarboyl (Cbz) a substituovaný Cbz), alifatické urethanové ochranné skupiny (například t-butyloxykarbonyl (Boc), izopropyloxykarbonyl, 5 cyklohexyloxykarbonyl) a ochranné skupiny alkylového typu (například benzyl, trifenylmethyl). Výhodnými ochrannými skupinami jsou Boc a Fmoc. Ochranná skupina postranního řetězce zůstává v průběhu vazby intaktní a neodštěpuje se během odstraňování ochranných skupin chránících koncové aminoskupiny nebo v průběhu vazby.
Ochranné skupiny postranního řetězce musí být odstranitelné po ukončení syntézy konečného peptidu a za takových reakčních podmínek, které nebudou měnit konečný peptid.
Ochranné skupiny postranního řetězce pro Tyr zahrnují tetrahydropyranyl, terc.-butyl, trityl, benzyl, Cbz, Z-Br-Cbz a 2,515 dichlorbenzyl. Ochranné skupiny postranního řetězce pro Asp zahrnují benzyl, 2,6-dichlorbenzyl, methyl, ethyl a cyklohexyl. Ochranné skupiny postranního řetězce pro Thr a Ser zahrnují acetyl, benzoyi, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-dichlorbenzyl a Cbz. Ochrannou skupinou postranního řetězce pro Thr a Ser je benzyl. Ochrannými 20 skupinami postranních řetězců pro Arg jsou nitro, tosyl (Tos), Cbz, adamantyloxykarbonyl, mezitoylsulfonyl (Mts) nebo Boc. Ochranné skupiny postranních řetězců pro Lys zahrnují Cbz, 2chlorobenzyloxykarbonyl (2-CI-Cbz), 2-bromobenzyloxykarbonyf (2BrCbz), Tos, nebo Boc.
Po odstranění alfa-aminové ochranné skupiny postupně reagují zbývající chráněné aminokyseliny v požadovaném pořadí. Obvykle se používá spolu s vhodným aktivátorem karboxylové skupiny, jako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC), přebytek každé chráněné aminokyseliny v roztoku například methylenchloridu (CH2CI2), 3o dimethylformamidu (DMF).
V « • ♦ · ·
- 41 Po ukončení syntézy požadované sekvence aminokyselin se požadovaný peptid odštěpí z pryskyřičného nosiče působením reagencie jako je kyselina trifluoroctové nebo fluorovodík (HF), které nejen odštěpí peptid z pryskyřice, ale odštěpí i zbývající ochranné skupiny postranního řetězce. Jestliže se použije chloromethylované pryskyřice, použitím fluorovodíku vzniknou volné kyseliny peptidu. Jestliže se použije benzhydrylaminové pryskyřice, působením fluorovodíkem přímo vznikne amid volného peptidu. Alternativně při použití chloromethylované pryskyřice může být peptid s chráněným postranním řetězcem odštěpen působením amoniaku na pryskyřici s navázaným peptidem za poskytnutí požadovaného amidu s chráněným postranním řetězcem nebo působením alkylaminu za vzniku alkylamidu nebo dialkylamidu s chráněným postranním řetězcem. Ochranné skupiny postranního řetězce se potom odstraňují obvyklým způsobem použitím fluorovodíku za vzniku volných amidů, alkylamidů nebo dialkylamidů.
Postupy syntézy peptidu na pevné fázi, které se uvádějí výše jsou v oboru známy a dále se popisují v Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co., San Francisco (1969).
Použitím „kódované syntetické knihovny“ nebo „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ popisovaných v US patentové přihlášce No. 07/492,462, 7. 3. 1990; 07/624,120, 6. 12. 1990; a
07/805,727, 6. 12. 1991, je možno nejen stanovit minimální velikost peptidu s danou aktivitou, ale je také možno připravit všechny peptidy vytvářející skupinu peptidú odlišných od výhodného motivu (nebo minimální velikosti tohoto motivu) v jednom, dvou nebo více zbytcích. Tento soubor peptidú je potom možno testovat na schopnost vazby k TPO-R. Tento systém syntézy imobilizovaného polymeru nebo jiné způsoby syntézy peptidú mohou být také použity pro syntézu zkrácených analogů a delečních analogů a kombinací zkrácených a delečních analogů všech peptidových sloučenin podle vynálezu.
.* ..· ·· ··
-42 B. Syntetické aminokyseliny
Tyto postupy mohou být také použity pro syntézu peptidů, u kterých jsou sloučeniny podle vynálezu substituovány v jedné, dvou nebo více polohách aminokyselinami jinými než je dvacet v přírodě se vyskytujících geneticky kódovaných aminokyselin. Například pro usnadnění syntézy může být tryptofan substituován za naftylalanin. Jiné syntetické aminokyseliny, které mohou být substituovány do peptidů podle předkládaného vynálezu, zahrnují L-hydroxypropyl, L-
3,4-dihydroxyfenylaianyl, d-aminokyseliny jako L-d-hydroxylyzyl a Dd-methylalanyl, L-a-methylalanyl, b-aminokyseliny, a izochinolyl. Do peptidů podle předkládaného vynálezu mohou být také zavedeny Daminokyseliny a syntetické aminokyseliny, které se nevyskytují v přírodě.
Je možno nahradit v přírodě se vyskytující postranní řetězce dvaceti geneticky kódovaných aminokyselin (nebo D-aminokyselin) jinými postranními řetězci, například skupinami, jako je alkyl, nižší alkyl, cyklický 4-, 5-m 6- až 7-členný alkyl, amid nižšího alkylu, dialkyiamid obsahující nižší alkyl, nižší alkoxy, hydroxy, karboxy a jejich nižší esterové deriváty, a 4-, 5-, 6- až 7- Člennými heterocyklickými skupinami. Použity mohou být zvláště analogy prolinu, ve kterých je 5- členný kruh prolinu změněn na 4-, 6- nebo 7členný kruh. Cyklické skupiny mohou být nasycené nebo nenasycené a jestliže jsou nenasycené, mohou být aromatické nebo nearomatické.
Cyklické skupiny mohou být nasycené nebo nenasycené, jestliže jsou nenasycené, mohou být aromatické nebo nearomatické. Heterocyklické skupiny s výhodou obsahují jeden nebo více heteroatomů dusíku, kyslíku a/nebo síry. Příklady takových skupin zahrnují furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, izothiazolyl, izoxazolyl, morfolinyl (např. morfolino), oxazolyl, piperazinyl (napr. 1-piperazinyl), piperidyl (napr. 1 -piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl, • · · · • ·
pyridazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolidinyl (např. 1-pyrrolidinyl), pyrrolinyl, pyrrolyl, thiadiazolyl, thiazolyl, thienyl, thiomorfolinyl (např. thiomorfolino) a triazolyl. Tyto heterocyklické skupiny mohou být substituované nebo nesubstituované. Kde je skupina substituovaná, může být substituentem alkyl, alkoxy, halogen, kyslík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl.
Je možno také snadno modifikovat peptidy podle předkládaného vynálezu fosforylací a dalšími způsoby přípravy peptidových derivátů sloučenin podle předkládaného vynálezu, jak se popisuje v Hrubý a další42. Peptidové sloučeniny podle vynálezu tedy slouží také jako základ pro přípravu peptidy napodobujících látek s podobnou biologickou účinností.
Peptidové sloučeniny podle vynálezu včetně peptidy napodobujících sloučenin mohou být kovalentně modifikovány na jeden nebo více z řady neproteinových polymerů, například polyethylenglykol, polypropylenglykol nebo polyoxyalkeny, způsobem uvedeným v US patentu No. 4,640,835; US patentu No. 4,496,689; US patentu No. 4,301,144; US patentu No. 4,670,417; US patentu No. 4,791,192 nebo US patentu No. 4,179,337.
C. Koncové modifikace
Odborníkům v oboru je známo, že je dostupná řada způsobů pro vytváření peptid napodobujících látek se stejnými nebo podobnými požadovanými biologickými účinky jako je odpovídající peptidová sloučenina, ale s výhodnější aktivitou než má peptid s ohledem na rozpustnost, stabilitu a vnímavost k hydrolýze a proteoiýze (viz například Morgan a Gainor, Ann. Rep. Med. Chem.. 24: 243 - 252 (1989). V následující Části se popisují způsoby výroby peptidy napodobujících látek modifikovaných na N-koncové aminoskupině, Ckoncové karboxylové skupině a/nebo změnou jedné nebo více amidových vazeb v peptidů na vazby neamidové. Je jasné, že v jedné ·· · ♦
•> * φ •· · · • ·· * Φ V φ ·· • · ·· peptid napodobující struktuře může být spojeno více takových modifikací (např. modifikace C-koncové karboxylové skupiny a zahrnutí -CH2-karbamátové vazby mezi dvě aminokyseliny v peptidu).
1. Modifikace na N-konci
Peptidy se typicky syntetizují jako volné kyseliny, ale jak je uvedeno výše, mohou být snadno připraveny jako amid nebo ester. Je také možno modifikovat aminový a/nebo karboxylový konec peptidových sloučenin podle vynálezu za vytvoření jiných sloučenin podle vynálezu. Modifikace aminového konce zahrnují methylaci (tj. -NHCH3 nebo -NH(CH3)2), acetylaci, navázání karbobenzoylové skupiny nebo blokování aminového konce jakoukoliv blokovací skupinou obsahující karboxylátovou funkční skupinu definovanou vzorcem RCOO-, kde R je zvoleno ze skupiny naftyi, akridinyl, steroidyl a podobných skupin. Modifikace karboxylového konce zahrnují náhradu volné kyseliny karboxamidovou skupinou nebo vytvoření cyklického laktamu na karboxylovém konci pro zavedení spojených struktur molekul.
Modifikace aminového konce jsou jak se uvádí výše a zahrnují alkylaci, acetylaci, přídavek karbobenzoylové skupiny, vytvořeni sukcinimídové skupiny apod. Konkrétně může reagovat N-koncová aminoskupina následujícím způsobem:
(a) za vytvoření amidové skupiny vzorce RC(O)NH-, kde R je jak definováno výše, reakcí s halogenidem kyseliny (například RC(O)CI) nebo anhydridem kyseliny. Typicky je možno reakci provádět uvedením do styku přibližně ekvimolárních množství nebo nadbytku (například přibližně 5 ekvivalentů) halogenidu kyseliny s peptidem v inertním rozpouštědle (například dichlormethanu), s výhodou obsahujícího přebytek (například 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethylamin, pro vychytávání kyseliny vytvořené v průběhu reakce. Reakční podmínky jsou jinak obvyklé (například
-45 pokojová teplota po dobu 30 minut). Aikyiace terminální aminoskupiny za vytvoření substituce aminové skupiny nižším alkylem následovaná reakcí s halogenidem kyseliny jak je popsáno výše bude poskytovat Nalkylamidovou skupinu vzorce RC(0)NR-;
(b) za vytvoření sukcinimidové skupiny reakcí s anhydridem kyseliny jantarové. Jak bylo uvedeno dříve, přibližně ekvimolární množství nebo přebytek (např. přibližně 5 ekvivalentů) anhydridu kyseliny jantarové je možno použít a přeměnit aminovou skupinu na sukcinimid v oboru známými způsoby včetně použití přebytku (např. 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethylamin ve vhodném inertním rozpouštědle (např. dichlormethan). Odkazy je možno nalézt například v Wollenberg a další, US patent No. 4,612,132. Je třeba rozumět, že sukcinátová skupina může být substituována například C2-C6 alkylovými nebo -SR substituenty, které se připravují běžným způsobem, za poskytnutí substituovaného sukcinimidu na N-konci peptidu. Takové alkylové substituenty se připravují reakcí nižšího olefinu (C2-C6) s anhydridem kyseliny maleinové způsobem popisovaným v publikaci Wollenberg a další, výše a substituenty -SR se připravují reakcí RSH s anhydridem kyseliny maleinové, kde R je skupina jak byla definována výše;
(c) za vytvoření skupiny benzyloxykarbonyl-NH- nebo substituované skupiny benzyloxykarbonyl-NH- reakcí s přibližně ekvivalentním množstvím nebo s přebytkem sloučeniny CBZ-CI (tj. benzyloxykarbonylchlorid) nebo substituovanou sloučeninou CBZ-CI ve vhodném inertním rozpouštědle (např. dichlormethan) s výhodou obsahujícím terciární amin pro zachycení kyseliny vytvořené v průběhu reakce;
(d) za vytvoření sulfonamidové skupiny reakcí s ekvivalentním množstvím nebo přebytkem (například 5 ekvivalentů) sloučeniny R-S(O)2CI ve vhodném inertním rozpouštědle (dichlormethan) pro převedení koncového aminu na sulfonamid, kde skupina R je jak
·« ···» • · · • · ·
• · « « · <· definována výše. S výhodou obsahuje inertní rozpouštědlo přebytek terciárního aminu (například 10 ekvivalentů) jako například diizopropylethylamin pro zachycení vytvořené kyseliny. Reakční podmínky jsou jinak obvyklé (pokojová teplota, 30 min);
(e) za vytvoření karbamátové skupiny reakcí s ekvivalentním množstvím nebo nadbytkem (např. 5 ekvivalentů) sloučeniny R-OC(O)CI nebo R-OC(O)OCeH4-p-NO2 ve vhodném inertním rozpouštědle (např. dichlormethan) pro přeměnu koncového aminu na karbamát, kde skupina R je jak definována výše. Inertní rozpouštědlo obsahuje s výhodou přebytek (přibližně 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethylamin, pro zachycení kyseliny vytvořené při reakci. Reakční podmínky jsou jinak obvyklé (například pokojová teplota, 30 minut); a (f) za vytvoření močovinové skupiny reakcí s ekvivalentním množstvím nebo přebytkem (například 5 ekvivalentů) sloučeniny R-N=C=O ve vhodném inertním rozpouštědle (například dichlormethan) pro přeměnu koncového aminu na mocovinovou (tj. skupinu RNHC(O)NH-), kde R je jak definováno výše. Inertní rozpouštědlo obsahuje s výhodou přebytek (například přibližně 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethylamin. Reakční podmínky jsou jinak normální (například pokojová teplota po dobu přibližně 30 minut).
2. Modifikace C-konce
Při přípravě peptidy napodobujících látek, u kterých je Ckoncová karboxylové skupina nahrazena esterem (tj. -C(O)OR, kde R je jak definováno výše) se používá pryskyřic používaných pro přípravu peptídových kyselin, přičemž postranní řetězec chráněného peptidů se štěpí bází a vhodným alkoholem (například methanolem). Ochranné skupiny postranního řetězce se potom odstraní obvyklým způsobem působením fluorovodíku za získání požadovaného esteru.
β 0 0
- 47*Při přípravě peptid napodobujících látek, kde C-koncová karboxylová skupina je nahrazena amidem -C(O)NR3R4 se jako pevný nosič pro syntézu peptidu použije benzhydrylaminová pryskyřice. Po ukončení syntézy vede působení fluorovodíku pro uvolnění peptidu s z nosiče přímo k volnému amidu peptidu (tj. na C-konci je skupina -C(O)NH2). Alternativně vzniká při použití chloromethylované pryskyřice při syntéze peptidu ve spojení s reakcí s amoniakem pro odštěpení peptidu s chráněným postranním řetězcem z nosiče volný amid peptidu a reakcí s alkylaminem nebo dialkylaminem vzniká 10 alkylamid nebo diaikylamid (tj. na C-konci je skupina -C(O)NRR1, kde R a R1 jsou jak definováno výše) s chráněným postranním řetězcem. Ochranné skupiny z postranního řetězce se potom odstraní obvyklým způsobem použitím fluorovodíku za poskytnutí volných amidů, alkylamidů nebo dialkylamidů.
V dalším alternativním provedení může být indukována cyklizace C-koncové karboxylové skupiny nebo C-koncového esteru vnitřním odštěpením skupiny -OH nebo esteru (-OR) karboxylové skupiny nebo esteru s N-koncovou aminoskupinou za vytvoření cyklického peptidu. Například po syntéze a štěpení za poskytnutí 2o kyselé formy peptidu se volná kyselina přemění na aktivovaný ester vhodným aktivátorem karboxylové skupiny, jako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC) v roztoku například methylenchloridu (CH2CI2), ve směsi s dimethylformamidem (DMF). Cyklický peptid potom vzniká vnitřní reakcí aktivovaného esteru s N-koncovým 25 aminem. Vnitřní cyklizace narozdíl od polymerizace může být zesílena použitím velmi zředěných roztoků. Tyto způsoby jsou v oboru dobře známy.
Je možno provádět cyklizaci peptidů podle vynálezu nebo zavedení desaminového nebo deskarboxylového zbytku na konec χ peptidu takže se již nevyskytuje žádná koncová aminová nebo karboxylová skupina, a tak se sníží vnímavost k proteázám nebo se
I • · • ·« · • * » · ···· • φ 9 9 · · · · · · ·· « « · · · · · ·· _ 48'1......*’* “ omezí konformační změny peptidu. C-koncovými funkčními skupinami sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou amid, nižší alkylamid, nižší dialkylamid, nižší alkoxy, hydroxy a karboxy a jejich nižší esterové deriváty a farmaceuticky přijatelné soli.
D. Modifikace kostry
Další způsoby výroby derivátů peptidu sloučenin podle předkládaného vynálezu se popisují v Hrubý a další, Biochem. J., 268 (2): 249 - 262 (1990). Peptidové sloučeniny podle vynálezu slouží také jako strukturní modely pro nepeptidové sloučeniny s podobnou biologickou aktivitou. Odborníkům v oboru je známo, že pro vytváření sloučenin se stejnou nebo podobnou požadovanou biologickou aktivitou jako původní peptidová sloučenina, ale s výhodnější účinností než původní sloučenina co se týče rozpustnosti, stability a vnímavosti k hydrolýze a proteolýze, je možno použít řadu způsobů (viz Morgan a Gainor, Ann. Rep. Med. Chem., 24: 243 - 252 (1989). Mezi tyto způsoby patří náhrada peptidové kostry kostrou složenou z fosfonátů, amidátů, karbamátů, sulfonamidů, sekundárních aminů a N-methylaminových kyselin.
Peptidy napodobující látky, kde jedna nebo více z peptidylových vazeb (-C(O)NH-) byla nahrazena vazbami jako -CH2-karbamátová vazba, fosfonátová vazba, -CH2-sulfonamÍdová vazba, močovinová vazba, vazba sekundárního aminu (-CH2NH-) a alkylovaná peptidylová vazba (-C(O)NR6-, kde R6 je nižší alkyl) se připravují běžnými způsoby syntézy peptidů pouhou substitucí vhodně chráněného analogu kyseliny za reagencii pro příslušnou aminokyselinu ve vhodném místě v průběhu syntézy.
Vhodnými reagenciemi jsou například analogy aminokyselin, ve kterých byla karboxylové skupina aminokyseliny nahrazena skupinou vhodnou pro vytvoření jedné z výše uvedených vazeb. Například pokud je třeba nahradit vazbu -C(0)NR- v peptidu vazbou
-CH2-karbamát (-CH20C(0)NR-), karboxylové skupina (-COOH) vhodně chráněné aminokyseliny se nejprve redukuje na skupinu -CH2OH, která se potom přeměňuje běžnými způsoby na skupinu -OC(O)CI nebo skupinu para-nitrokarbonátovou -OC(O)O-C6H4-p-NO2. Reakce každé takové funkční skupiny s volným aminem nebo alkylovaným aminem na N-konci částečně vytvořeného peptidů navázaném na pevném nosiči, vede k vytvoření vazby -CH20C(0)NR-. Podrobnější popis vytváření takových vazeb -CH2-karbamát je možno nalézt v Cho a další, Science. 261: 1303 - 1305 (1993).
Podobně náhrady amidové vazby v peptidů vazbou fosfonátovou může být dosaženo způsobem uváděným v US patentových přihláškách No. 07/943,805, 08/081,577 a 08/119,700.
Náhrady amidové vazby v peptidů vazbou -CH2-sulfonamidovou může být dosaženo redukcí karboxylové skupiny (-COOH) vhodně chráněné aminokyseliny na skupinu -CH2OH a přeměnou hydroxylové skupiny na vhodnou odstěpitelnou skupinu jako je skupina tosylová, běžnými způsoby. Reakce tosylovaného derivátu například s kyselinou thiooctovou následovaná hydrolýzou a oxidační chlorací poskytne funkční skupinu -CH2-S(O)2CI, která nahradí karboxylovou skupinu jinak vhodně chráněné aminokyseliny. Použití tohoto vhodně chráněného analogu aminokyseliny při syntéze peptidů poskytne zavedení vazby -CH2S(O)2NR-, která nahradí amidovou vazbu v peptidů a tím vznikne peptid napodobující látka. Úplnější popis přeměny karboxylové skupiny aminokyseliny na skupinu -CH2S(O)2CI je možno najít v Weinstein, Boris, Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, díl 7, str. 267 - 367, Marcel Dekker, lne., New York (1983).
Náhrady amidové vazby v peptidů močovinovou vazbou je možno dosáhnout způsobem uvedeným v US patentové přihlášce No. 08/147,805.
- 50 Vazby sekundárního aminu, ve kterých vazba -CH2NHnahrazuje amidovou vazbu v peptidů, mohou být připraveny použitím například vhodně chráněného dipeptidového analogu, ve kterém byla karbonylová vazba amidové vazby redukována na skupinu CH2 5 běžnými způsoby. Například v případě diglycinu dojde redukcí amidu na amin po odstranění ochranných skupin ke vzniku sloučeniny H2NCH2CH2NHCH2COOH, která se pak pro další reakce používá v Nchráněné .formě. Příprava takových analogů redukcí karbonylové skupiny amidové vazby v dipeptidu je v oboru dobře známa.
Vhodně chráněné analogy aminokyselin se používají při běžné syntéze peptidů stejným způsobem jako odpovídající aminokyseliny. Například se při této reakci používají typicky přibližně tři ekvivalenty chráněného analogu aminokyseliny. Použije se inertního organického rozpouštědla jako je methylenchlorid nebo DMF a jestliže se jako 15 vedlejší produkt reakce vytváří kyselina, reakční rozpouštědlo obsahuje typicky přebytek terciárního aminu pro zachycení při reakci vytvořené kyseliny. Zvláště výhodným terciárním aminem je diizopropylethylamin, který se typicky používá přibližně v desetinásobném přebytku. Výsledkem reakce je zavedení analogu 2o aminokyseliny s nepeptidovou vazbou do peptid napodobující látky.
Tato substituce může být opakována podle potřeby, takže neamidovými vazbami se nahradí od 0 až po veškeré amidové vazby.
Je také možno peptidy podle vynálezu cyklizovat nebo na konce peptidů zavádět desaminové nebo deskarboxylové zbytky, takže není 25 přítomna žádná koncová aminová nebo karboxylová skupina, čímž se sníží vnímavost k proteázám nebo se omezí konformační změny peptidů. C-koncové funkční skupiny sloučenin podle předkládaného vynálezu zahrnují amid, nižší alkylamid, nižší dialkylamid, nižší alkoxy, hydroxy a karboxy a jejich nižší esterové deriváty a jejich 3o farmaceuticky přijatelné soli. Příklady cyklizovaných sloučenin se uvádějí v tabulkách 4, 5, 6, 8 a 9.
1'*
E. Vytváření disulfidovych vazeb
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou existovat v cyklizované formě s intramolekulární disulfidovou vazbou mezi thiolovými skupinami cysteinů. Alternativně může být vytvářena intermolekulární disulfidová vazba mezi thiolovými skupinami cysteinů za vytvoření dimerní (nebo výše oiigomerní) sloučeniny. Jeden nebo více cysteinových zbytků může být také substituován homocysteinem. Tyto intramolekulární nebo intermolekulární disulfidové deriváty mohou být schematicky znázorněny jak je uvedeno níže:
kde man jsou nezávisle na sobě 1 nebo 2.
Další provedení tohoto vynálezu poskytuje analogy těchto disulfidových derivátů, ve kterých jeden z atomů siry byl nahrazen skupinou CH2 nebo jinými izostery síry. Tyto analogy mohou být připraveny intramolekulární nebo intermolekulární reakcí s použitím
• · · ·
kde p je jedna nebo 2. Odborníku v oboru bude jasné, že tato reakce muže probíhat také s použitím jiných homologú výše uvedeného derivátu kyseliny a-amino-g-máselné ukázaného výše a homocysteinu.
Alternativně může být amino konec peptidu zakončen alfasubstituovanou kyselinou octovou, přičemž alfa-substituentem je odštěpitelná skupina, jako je kyselina a-halogenoctová, například kyselina a-chloroctová, a-bromoctová nebo a-jodoctová. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být cyklizovány nebo dimenzovány reakcí odštěpitelné skupiny se sírou nebo cysteinovým nebo homocysteinovým zbytkem (viz například Barker a další, J. Med. Chem., 35: 2040 - 2048 (1992) a Or a další, J. Org. Chem., 56: 3146 3149 (1991). Příklady dimenzovaných sloučenin se uvádějí v tabulkách 7, 9 a 10.
V. Použitelnost
Sloučeniny podle vynálezu jsou použitelné in vitro jako jedinečné nástroje pro porozumění biologické úloze TPO, včetně vyhodnocení mnoha faktorů týkajících se vlivu na produkci a ovlivňování produkcí TPO a postupů vazeb na receptory. Předkládané sloučeniny jsou také použitelné při vývoji jiných sloučenin, které se váží na TPO-R a aktivují jej, protože předkládané sloučeniny poskytují důležité informace o vztahu mezi strukturou a aktivitou, které by mohly tento vývoj umožnit.
• ·· to
Sloučeniny jsou také použitelné jako kompetitivní vazné látky v testech určených ke screeningu nových agonistů receptoru TPO.
V provedení těchto testů mohou být sloučeniny podle vynálezu použity bez modifikace nebo mohou být řadou způsobů modifikovány; například značením, jako je kovalentní nebo nekovalentní připojení části, která přímo nebo nepřímo poskytuje detekovatelný signál.
V jakémkoliv z těchto testů mohou být materiály značeny buď přímo nebo nepřímo. Možnosti pro přímé značení zahrnují skupiny markérů, jako jsou: radioaktivní markéry jako je 125l, enzymy (US patent 3,645,090), jako je peroxídáza a alkalická fosfatáza a fluorescenční markéry (US patent No. 3,940,475), schopné monitorování změny v intenzitě fluorescence, posunu vlnových délek nebo polarizace fluorescence. Možnosti nepřímého značení zahrnují biotinylaci jedné ze složek následovanou vazbou na avidin připojený na jednu z výše uvedených markerových skupin. Sloučeniny mohou také obsahovat spacery (mezerníky) nebo linkery v případech, kdy mají být připojeny na pevný nosič.
Navíc mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity pro svou schopnost vázat se na receptor TPO pro detekování receptorů TPO u živých buněk, fixovaných buněk, v biologických tekutinách, ve tkáňovách homogenátech, u čištěných přírodních biologických materiálů apod. Například značením těchto peptidů je možno identifikovat buňky s receptory TPO-R na povrchu. Navíc mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity pro svou schopnost vázat se na receptor TPO při in šitu barveni, FACS (fluorescencí aktivované třídění buněk), westernové blotování, ELISA apod. Navíc mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity pro svou schopnost vázat se na receptor TPO při čištění receptorů nebo při čištění buněk exprimujících receptory TPO na povrchu buněk (nebo uvnitř permeabilizovaných buněk).
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také použity jako komerční činidla pro různá použití v medicíně a pro diagnostická použití. Tato použití zahrnují bez omezení: (1) použití jako kalibračního standardu pro kvantifikaci aktivit kandidátů na antagonisty TPO v celé řadě funkčních testů; (2) použití pro udržování proliferace růstu TPO-dependentních buněčných linií; (3) použití při strukturní analýze receptoru TPO pomocí kokrystalizace; (4) použití pří výzkumu mechanismu přenos signálu TPO/aktivace receptoru; a (5) jiné výzkumy a diagnostická použití, kde dochází s výhodou k aktivaci receptoru TPO nebo se tato aktivace pohodlně kalibruje proti známému množství agonisty TPO apod.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro expanzi megakaryocytů in vitro a jejich předchůdců, jak ve spojení s dalšími cytokiny nebo samy o sobě (viz například DiGiusto a další, publikovaná PCT přihláška No. 95/05843). Chemoterapie a radiační terapie způsobují trombocytopenii usmrcováním rychle se dělící zralejší populace megakaryocytů. Toto terapeutické působení může také snížit počet a životaschopnost nezralých, méně mítoticky aktivních prekurzorových buněk megakaryocytů. Léčení trombocytopenie pomocí TPO nebo sloučeninami podle předkládaného vynálezu může být uspíšeno podáváním infuzí pacientům po chemoterapii nebo radiační terapii s jejich vlastními buňkami obohacenými o megakaryocyty a nezralé prekurzory v kultuře in vitro.
Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podávány teplokrevným živočichům včetně Člověka pro aktivaci TPO-R in vivo. Předkládaný vynález tedy zahrnuje způsoby terapeutického působení na poruchy spojené s TPO, které zahrnují podávání sloučeniny podle vynálezu v dostatečném množství pro napodobení účinku TPO na TPO-R in vivo. Například peptidy a sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány pro léčení celé řady hematologických poruch, včetně
- 55bez omezení poruch krevních destiček a trombocytopenie, zvláště při spojení s transfuzemi kostní dřeně, radiační terapií a chemoterapií.
V některých provedeních vynálezu se s výhodou nejprve podávají pacientům s chemoterapií nebo radiační terapií antagonisté s TPO a potom se jim podávají agonisté TPO podle vynálezu.
Účinnost sloučenin podle předkládaného vynálezu může být vyhodnocována buď in vitro nebo in vivo některým z četných modelů popsaných v McDonald, Am. J. of Pediatrie Hematoloov/Oncology, 14: 8 - 21 (1992).
w Podle jednoho provedení jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu použitelné pro léčení trombocytopenie spojené s transfuzemi kostní dřeně, radiační terapií nebo chemoterapií. Sloučeniny se typicky budou podávat preventivně před chemoterapií, radiační terapií nebo transplantací kostní dřeně nebo po takovém zákroku.
Předkládaný vynález tedy také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující jako aktivní složku alespoň jeden z peptidů nebo peptidy napodobujících látek podle vynálezu ve spojení s farmaceutickým nosičem nebo diluentem. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány orálně, pulmonárně, parenterálně (intramuskulárně, intraperitoneálně, intravenózně (IV) nebo subkutánně), inhalačně (prostřednictvím prostředku ve formě jemného prášku), transdermálně, nazálně, vaginálně, rektálně nebo sublingválními cestami podávání a mohou být ve formě dávkovačích forem vhodných pro každou z těchto cest podávání (viz např.
Bernstein a další, publikovaná PCT přihláška No. WO 93/25221; Pitt a další, publikovaná PCT přihláška No. WO 94/17784; a Pitt a další, evropská patentová přihláška 613,683).
Pevnými dávkovacími formami pro orální podávání jsou kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V těchto pevných dávkovačích
3o formách je aktivní sloučenina smísena spolu s alespoň jedním inertním farmaceuticky přijatelným nosičem jako je sacharóza, laktóza ··* · • · · ·
nebo škrob. Tyto dávkovači formy mohou, jak je tomu v normální praxi, obsahovat další látky jiné než inertní rediva, například kluzné látky, jako je stearan hořečnatý. V případě kapslí, tablet a pilulek, mohou dávkovači formy obsahovat také pufrovací prostředky. Tablety a pilulky mohou být navíc připraveny s enterosolventními povlaky.
Kapalné dávkovači formy pro orální podávání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy spolu s elixíry, které obsahují běžně v oboru používaná řediva, jako je voda. Vedle těchto inertních řediv mohou prostředky také obsahovat adjuvantní látky, jako jsou smáčedla, emulgační a suspendující prostředky a sladidla, ochucovací látky a parfémy.
Prostředky podle vynálezu pro parenterální podávání obsahují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze nebo emulze. Příklady nevodných rozpouštědel nebo vehikul jsou propylenglykoi, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako je olivový olej a obilný olej, želatina, a injikovatelné organické estery jako je ethyloleát.
Tyto dávkovači formy mohou také obsahovat adjuvantní látky jako jsou ochranné látky, smáčedla, emulgátory a dispergující látky. Mohou být sterilizovány například filtrem zahdržujícím bakterie, přidáním sterilízačních prostředků do farmaceutického prostředku, ozářením nebo zahřátím prostředku. Mohou být také vyrobeny bezprostředně před použitím pomocí sterilní vody nebo některého jiného sterilního injikovatelného média.
Sloučeniny pro rektální nebo vaginální podávání jsou s výhodou čípky, které mohou obsahovat navíc k aktivní látce vehikula, jako je kakaové máslo nebo Čípkový vosk. Prostředky pro nazální nebo sublingvální podávání se rovněž připravují pomocí vhodných standardních, v oboru známých vehikul.
Prostředky obsahující sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány pro preventivní a/nebo léčebné účely. Při terapeutických použitích se prostředky podávají pacientům trpícím onemocněním, jak
fy · Φ · Φ «φ · ♦ φ Φ · Φ · 0 « · 0 · 0 ·· φφ φ «0 · Φ · · · φ « 0 · 0 *
Φ «Φ 0· ·· · * bylo popsáno výše, v množství dostatečném pro vyléčení nebo alespoň částečné zastavení příznaků onemocnění a jeho komplikací. Množství odpovídající dosažení tohoto cíle se definuje jako „terapeuticky účinná dávka“. Množství dostatečně účinné pro toto použití bude záviset na vážnosti onemocnění a hmotnosti a celkovém stavu pacienta.
Prostředky podle vynálezu mohou být také zapouzdřeny do mikropouzder, například metodou: Tice and Bibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, vyd. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N. Y. (1992), str. 315 - 339.
Při preventivním použití se prostředky obsahující sloučeniny podle vynálezu podávají pacientům vnímavým nebo pacientům s jiným rizikem konkrétního onemocnění. Takové množství se definuje jako „profylakticky účinná dávka“. Při tomto použití závisí opět přesné množství na stavu pacienta a jeho hmotnosti.
Množství antagonisty TPO nezbytného pro účinné léčení bude záviset na mnoha různých faktorech, včetně způsobu podávání, cílového místa, fyziologického stavu pacienta a jiných podávaných lécích. Léčebné dávky by měly být titrovány pro optimalizaci bezpečnosti a účinností. Užitečné vodítko pro množství pro podávání in šitu těchto reagencií mohou poskytnout dávky používané in vitro. Dalším vodítkem pro dávkování u člověka může být testování na zvířatech účinných dávek pro léčení konkrétních onemocnění. Různé předpoklady se popisují například v Gilman a další, (vydavatelé), Goodman and Gilmanů: The Pharmacoloqical Basis of Therapeutics, 8. vydání, Pergamon Press (1990); a Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 7. vydání, Mack Publishíng Co., Easton, Penn. (1985).
Peptidy a peptidy napodobující látky podle vynálezu jsou účinné při léčení stavů podmíněných TPO při podávání v rozmezí dávek od přibližně 0,001 mg až přibližně 10 mg/kg tělesné hmotnosti za den. Konkrétní použitá dávka se řídí léčeným onemocněním, cestou podávání a úsudkem ošetřujícího lékaře v závislosti na faktorech, jako je vážnost stavu, věk a celkový stav pacienta apod.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1A-B ilustrují výsledky funkčního testu v přítomnosti různých peptidů; test se popisuje v příkladu 2. Obr. 1A je grafické znázornění výsledků proliferačního testu buněk Ba/F3 transfekovaných TPO-R pro zvolené peptidy podle vynálezu:
označuje výsledky pro GGCADGPTLREWISFCGK (biotin);
x označuje výsledky pro GGCADGPTLREWISFCG;
▲ označuje výsledky pro LAIEGPTLRQWLHGNGRD T;
• označuje výsledky pro GNADGPTLRQWLEGRRPK
N ; a + označuje výsledky pro TIKGPTLRQWLKSREHTS.
Obr. 1B je grafické znázornění výsledků se stejnými peptidy a rodičovskou buněčnou linií.
Obr. 2A-C ukazují výsledky oligomerizace peptidu s použitím testu proliferace buněk Ba/F3 transfekovaných TPO-R. Obr. 2A ukazuje výsledky testu pro komplexní biotinylovaný peptid (AF12285 se streptavidinem (SA) jak pro transfekovanou, tak i rodičovskou buněčnou linii. Obr. 2B ukazuje výsledky pro test volného biotinylovaného peptidu (AF12285) jak pro transfekovanou, tak i rodičovskou buněčnou linii.
Obr. 3A-G ukazují výsledky řady kontrolních experimentů ukazujících aktivitu TPO, peptidů podle předkládaného vynálezu, EPO a vazebných peptidů EPO-R v testu buněčné proliferace s použitím
-59*« · · « te b ♦♦ • » * * * 9 9 9 · · ♦ · • a · · » · « · · *it «v ♦ * · · ♦ · buď buněčné linie Ba/F3 transfekované TPO-R a její odpovídající rodičovské linie nebo EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3A zobrazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím buněčné linie Ba/F3 transfekované TPO-R a její odpovídající rodičovské linie. Obr. 3B ukazuje výsledky pro EPO v testu buněčné proliferace s použitím buněčné linie Ba/F3 transfekované TPO-R a její odpovídající rodičovské linie. Obr. 3C ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný peptid (AF12285 se streptavidinem (SA) a komplexní formu EPO-R vazebného peptidu (AF 11505 s SA) v buněčné linii Ba/F3 transfekované TPO-R. Výsledky pro odpovídající rodičovskou linii jsou ukázány na obr. 3D. Obr. 3E ukazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3F ukazuje výsledky pro EPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3G ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný peptid (AF12885 se streptavidinem (SA) a komplexní formu biotinylovaného EPO-R vazebného peptidu (AF11505 s SA) v EPO-dependentní buněčné linii.
Obr. 4A-C ilustrují konstrukci knihoven typu peptidy na plazmidech ve vektoru pJS142. Obr. 4A ukazuje restrikční mapu a pozice genů. Plazmid knihovny obsahuje terminátor transkripce rrnb, gen bia pro umožnění selekce ampicilinem, intragenovou oblast fága M13 (M13 IG) pro umožnění zpětného získání jednořetězcové DNA, počátek replikace plazmidu (on), dvě sekvence lacOs a gen araC pro umožnění pozitivní a negativní regulace exprese fuzního genu lac řízené promotorem araB. Obr. 4B ukazuje sekvenci klonovací oblasti na 3’ konci genu lac I včetně restrikčních míst Sfil a Eagl použitých při konstrukci knihovny. Obr. 4C ukazuje ligaci teplotně hybridizovaných oligonukleotidů knihovny ON-829 a ON-830 k místům Sfil plazmidu pJS142 za vytvoření knihovny. Jednoduché mezery v sekvenci označuji místa ligace.
- 60 Obr. 5A-B ilustruje klonování do vektorů pELM3 a pELM15 MBP. Obr. 5A ukazuje sekvenci na 3’ konci fuzního genu malE včetně kódující sekvence MBP, polyasparagínového linkeru, štěpícího místa proteázy faktoru Xa a dostupných klonovacích míst. Zbývající části vektorů se odvozují z pMALc2 (pELN3) a pMALp2 (pELM15) dostupných od formy New Engiand Biolabs. Obr. 5B ukazuje sekvenci vektorů po přenosu fragmentu knihovny BspEII-Scal do pELM3/pELM15 štěpených Agel-Scal. Přenesená sekvence obsahuje sekvenci kódující GGG peptidový linkerz knihovny pJS142.
Obr. 6A znázorňuje restrikční mapu a polohy genů při konstrukci knihoven přilbového (headpiece) dimeru ve vektoru pCMG14. Plazmid z knihovny zahrnuje: terminátor transkripce rrnB, gen bla pro umožnění selekce ampicilinem, intragenovou oblast fága M13 (M13 IG) pro umožnění znovuobnovení jednořetězcové DNA, počátek replikace plazmidu (oři), jednu sekvenci lacOs a gen araC pro umožnění pozitivní a negativní regulace exprese fuzního genu přilbového dimeru řízeného promotorem araB. Obr. 6B znázorňuje sekvenci klonovací oblasti na 3’konci přilbového dimerního genu včetně míst Sfil a Eagl používaných při konstrukci knihovny. Obr. 6C ukazuje ligaci teplotně hybridizovaného ON-1679, ON-829 a ON-830 na místa Sfil plazmidu pCMG14 pro vytvoření knihovny. Jednoduché mezery v sekvenci označují místa ligace.
Obr 7 až 9 ukazují výsledky dalších testů vyhodnocujících účinnost peptidů a peptidy napodobujících látek podle vynálezu. U myší používaných v tomto testu se karboplatinou vyvolá trombocytopenie. Obr. 7 ukazuje typické výsledky, jestliže se myším Balb/C v den 0 podá karboplatina (125 mg/kg intraperitoneálně). Čárkované přímky představují neošetřená zvířata ze tří experimentů. Plné čáry představují skupiny, kterým byla podána karboplatina ve třech experimentech. Silné plné čáry představují historická data. Obr. 8 znázorňuje účinek titrace karboplatiny na počty krevních destiček
-61 • · · · ·· « · * ···· * ♦ ♦ · « · w «« ·· ·· u myší ošetřených uvedenými množstvími karboplatiny (v mg/kg, intraperitoneálně (ip) v den 0). Obr. 9 ukazuje zmírnění karboplatinou indukované trombocytopenie v den 10 pomocí peptidu AF12513 (513). Karboplatina (CBP; 50 - 125 mg/kg, intraperitoneálně) byla podána v den 0. AF12513 (1 mg/kg, ip) byl podáván ve dnech 1-9.
Ačkoliv v následujících příkladech se konkrétně popisují pouze výhodná provedení vynálezu, je zřejmé, že do rámce vynálezu spadají také jejiclrmodifikace a variace.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Syntéza peptidu na pevné fázi
Různé peptidy podle vynálezu byly syntetizovány s použitím techniky syntézy na pevné fázi podle Merrifielda (viz Steward a Young, Solid Phase Peptide Svnthesis, 2. vyd., Pierce Chemical, Rockford, IL (1984) a Merrifield, J. Am. Chem. Soc„ 85: 2149 (1963) na automatickém přístroji Milligen/Biosearch 9600 nebo na syntezátoru peptidů Applied Biosystems lne. Model 431 A. Peptidy byly sestavovány s použitím standardních protokolů systému Applied Biosystems lne., Software version 1.01.Každá vazebná reakce byla prováděna po dobu 1 až 2 hodin se sloučeninou BOP (benzotriazolyl N-oxtrisdimethylaminofosfoniumhexafluorofosfát) a HOBt (1-hydroxybenzotriazol).
Bylo použito pryskyřice HMP nebo PAL (Milligen/Biosearch), která je zesítěnou polystyrénovou pryskyřicí s kyselinou 5-(4'-Fmocaminomethyl-3,5’-dimethoxyfenoxy)valerovou jako linkerem. Použití pryskyřice PAL vede po odštěpení peptidu z pryskyřice k vytvoření amidové funkční skupiny na karboxylovém konci. Po odštěpeni poskytne pryskyřice HMP skupinu karboxylové kyseliny na C-konci
- 62 finálního produktu. Většina reagencií, pryskyřic a chráněných aminokyselin (volných nebo navázaných na pryskyřici) byla zakoupena u firmy Milipore nebo Applied Biosystems lne.
Pro ochranu aminových skupin v průběhu vazby byla použita skupina Fmoc. Ochrana primárního aminu na aminokyselinách byla dosažena pomocí Fmoc a ochranné skupiny postranních řetězců byly t-butyl pro serin, tyrozin, asparagin, kyselinu glutamovou a threonin; trityl pro -glutamin; Pmc (2,2,5,7,8-pentamethylchromasulfonát) pro arginin; N-t-butyloxykarbonyi pro tryptofan; N-trityl pro histidin a glutamin; a S-trityl pro cystein.
Odštěpení peptidů z pryskyřice a současné odstranění ochranných skupin z funkčních skupin postranních řetězců bylo provedeno činidlem K nebo jeho mírnou modifikací. Alternativně při syntéze takových peptidů, které měly amidovaný karboxyiový konec, byl zcela uspořádaný peptid odštěpen směsí 90 % kyseliny trifluoroctové, 5 % ethandithiolu a 5 % vody zpočátku při teplotě 4 °C, která se postupně zvyšovala na pokojovou teplotu. Peptidy s odstraněnými ochrannými skupinami byly sráženy diethyletherem. Ve všech případech se prováděla purifikace pomocí preparativní HPLC s reverzní fází na koloně s navázaným Cis v gradientu acetinitril/voda v 0,1 % kyselině trifluoroctové. Homogenní peptidy byly charakterizovány hmotnostní spektrometrií s bombardováním rychlými atomy nebo hmotnostní spektrometrií s elektrorozprašováním a analýzou aminokyselin tam, kde to bylo použitelné.
Příklad 2
Biologické testy
Biologickou aktivitu peptidů je možno měřit s použitím testu proliferace buněk dependentních na trombopoetinu. Myší IL-3 dependentní Ba/F3 buňky byly transfekovány s lidským TPO-R • · · ·♦ · · · · * · o·· · ·· • » *» * ·· ··· ·· • * · φ··· · ·· ·· «« »· · *· ··
- 63 s úplnou délkou. V nepřítomnosti 1L-3 (kondicionované médium WEHI-3) jsou tyto buňky dependentní pro proliferaci na TPO. Rodičovská netransfekovaná buněčná linie neodpovídá na lidský TPO, ale zůstává IL-3 dependentní.
Biologické testy byly prováděny na obou těchto buněčných liniích s použitím syntetických peptidů odvozených ze screeningu knihovny. Buňky rostly v kompletním médiu RPMI-10 obsahujícím 10 % WEHI-3 kondicionovaného média, potom byly dvakrát promyty v PBS, resuspendovány v médiu neobsahujícím WEHI-3 io kondicionované médium a přidány do jamek obsahujících zředění peptidu nebo TPO v koncentraci 2 χ 104 buněk/jamku. Buňky byly inkubovány 48 hodin při 37 ’C ve zvlhčené atmosféře 5 % CO2 a metabolická aktivita byla testována redukcí MTT na formazan, přičemž absorbance byla měřena při 570 nm na čtecím zařízení pro 15 destičky ELISA. Testované peptidy stimulovaly proliferaci TPO-R transfekovaných buněk Ba/F3 v závislosti na dávce, jak je ukázáno na obr. 1. Tyto peptidy nemají žádný vliv na rodičovskou buněčnou linii.
Příklad 3
Vazebná afinita
Vazebné afinity chemicky syntetizovaných peptidů vůči TPO-R byly měřeny v kompetitivním vazebném testu. Jamky mikrotitrační destičky byly potaženy 1 mg streptavidinu, blokovány PBS/1 % BSA a potom inkubovány s 50 ng biotinylované antireceptorové 25 imobilizační protilátky (Ab179). Jamky byly potom inkubovány se sklizní rozpustného TPO-R v ředění 1:10. Různé koncentrace peptidu nebo peptid napodobující látky byly smíseny s konstantním množstvím zkrácené formy TPO obsahující zbytky 1-156 fúzované k C-konci maltózového vazebného proteinu (MBP-TPOise). Směsi peptidu MBP30 TPO156 byly přidány do jamek potažených TPO-R, inkubovány dvě hodiny při 4 ’C a potom promyty PBS. Množství MBP-TPO156, které
- 64 bylo v rovnováze navázáno, bylo měřeno přídavkem králičího antiséra proti MBP, po kterém následovalo působení kozího protikráličího IgG konjugovaného s alkalickou fosfatázou. Množství alkalické fosfatázy v každé jamce bylo potom určováno s použitím standardních metod.
Test se provádí v širokém rozmezí koncentrací peptidu a výsledky jsou vyneseny do grafu tak, že osa y představuje množství navázaného MBP-TPOi56 a osa x představuje koncentraci peptidu nebo peptid napodobující látky. Je tak možno určit koncentraci, při které peptid nebo peptid napodobující látka sníží množství MBPTPOi56 navázané na imobilizovaný TPO-R o 50 % (ICS0). Disociační konstanta (Kd) pro peptid by měla být podobná při použití výše uvedených reakčních podmínek změřené hodnotě IC50.
Příklad 4 „Peptidy na plazmidech
Vektor pJS142 se používá pro konstrukci knihovny a je ukázán na obr. 4. Pro konstrukci knihovny jsou nutné tři sekvence oligonukleotidů: ON-829 (5’ ACC ACC TCO GG); ON-830 (5’ TTA CTT AGT TA) a oligonukleotid specifický pro knihovnu, o který se zajímáme (5’ GA GGT GGT {ΝΝΚ}Π TAA STA AGT AAA GC), kde {NNK}n označuje náhodnou oblast požadované délky a sekvence. Oligonukleotidy mohou být v průběhu syntézy fosforylovány chemicky na 5’ konci nebo po purifikaci pomocí polynukleotidkinázy. Potom se teplotně hybridizují v molárním poměru 1:1:1a navážou na vektor.
Kmen E. coii, který se s výhodou používá pro techniku panningu, má genotyp: A(srl-recA) endAí nupG lon-11 sulA1 hsdR17 A(ompT-fepC)266 AclpA319::kan Alacl lac ZU118, který může být připraven z kmene E. coii získaného z Genetic Stock Center at Yale University (E. coii b/r, označení v centru CGSC:6573) s genotypem lon-11 sulA1. Výše popsaný kmen E. coii se pro použití připravuje
- 65 elektroporací, jak se popisuje v Dower a další, Nucleic Acids Res.. 16: 6127 (1988), kromě toho, že ve všech promývacích krocích se používá 10 % glycerol. Buňky jsou testovány na účinnost s použitím 1 pg plazmidu Bluescript (Stratagene). Tyto buňky se používají pro 5 pěstování původní knihovny a pro zesílení obohacené populace po každém cyklu panningu.
Peptidy na plazmidech se z buněk uvolňují pro panning mírným enzymatickým štěpením buněčné stěny s použitím lysozymu. Po zcentrifugování částí buněk lze pro většinu receptorů přímo použít io surový lyzát. Jestliže je zapotřebí nějakého dalšího čištění plazmidových komplexů, je možno použít pro odstranění mnoha z nízkomolekulárních kontaminantů surového lyzátu gelové filtrační kolony.
Panning se provádí v pufru (HEKL) s nižší koncentrací soli než is většina fyziologických pufrů. Panning je možno provádět v mikrotitračních destičkách s receptorem (mobilizovaným na neblokující monoklonální protilátce (MAb) nebo na kuličkách nebo kolonách. Konkrétně je možno použít v prvním cyklu panningu 24 jamek, přičemž každá jamka je pokrytá receptorem. Pro druhý cyklus 20 se typicky používá 6 jamek pokrytých receptorem (vzorek PAN) a 6 jamek bez receptorů (vzorem NC). Srovnávání počtu plazmidů v těchto dvou vzorcích může poskytnout informaci, zda jsou klony specifické vůči receptorů pomocí panningu obohaceny. „Obohacení“ se definuje jako poměr transformantú PAN ke transformantúm 25 získaným ze vzorku NC. Desetinásobné obohacení obvykle naznačuje to, že jsou přítomny klony specifické k receptorů.
V dalších cyklech panningu je užitečné snížit vstup lyzátu do jamek na nižší nespecifickou vazbu pozadí plazmidových komplexů.
V cyklu 2 se obvykle používá 100 μΙ lyzátu na jamku. V cyklu 3 se používá 100 μΙ lyzátu na jamku, zředěných v poměru 1/10 HEKL/BSA.
99·· · ·· ···· fafa ·· fa ·· · · · fa fa ·♦ * fa fa fa fa fafa·· • fa ©fa fa fafa ©♦fa fa· ©fafa fa fa fa ♦ fa fa·
-66*Pro další cykly panningu je vstup plazmid transformujících jednotek alespoň 1000 x větší než odhadované zbývající různorodosti.
Vazebné vlastnosti peptidů kódované jednotlivými klony se typicky vyšetřují po třech, čtyřech nebo pěti cyklech panningu, v závislosti na hodnotách obohacení. Typicky se používá metody ELISA, která detekuje specifickou vazbu na receptor fuzními proteiny Lacl-peptid. Lad je normálně tetramer a minimální funkční jednotka vázající se na DNA je dimer. Peptidy se tedy ukazují na fuzním proteinu vícenásobně. Za předpokladu, že v jamkách může být imobilizována dostatečná hustota receptoru, se budou peptidy fúzované k Lad vázat na povrch kooperativním vícenásobným způsobem. Tato kooperativní vazba dovolí detekci výskytu vazby s malou vnitřní afinitou. Citlivost tohoto testu je výhodná v tom, že mohou být identifikovány počáteční úspěšné pokusy s nízkou afinitou, ale je nevýhodná v tom, že signál při ELISA nekoreluje s vnitřní afinitou peptidů. Fuze peptidů k maltózovému vazebnému proteinu (MBP) jak je popsáno níže, dovolí testování ve formátu ELISA, kde síla signálu lepší koreluje s afinitou (viz obr. 5A-B).
DNA ze zajímavých klonů může být připravena ve dvouretězcové formě s použitím jakékoliv standardní metody miniprepu. Kódující sekvence zajímavých jednotlivých klonů nebo populací klonů mohou být převedeny do vektorů, kde jsou tyto sekvence fúzovány ve čtecím rámci s genem kódujícím MBP, proteinem, který se obvykle vyskytuje v roztoku jako monomer. Klonování knihovny do pJS142 vytvoří restrikční místo BspEI v blízkosti počátku náhodné kódovací oblasti knihovny. Štěpením BspEI a Scal umožní čištění fragmentu DNA o velikosti přibližně 900 bp, který může být subklonován do jednoho ze dvou vektorů, pELM3 (cytoplazmatický) nebo pELM15 (periplazmatický), které jsou jednoduché modifikace vektorů pMALc2 a pMALp2, dostupných komerčně od firmy New England Biolabs (viz obr. 5A-B). Štěpení «φ«4 4 4« 4444 «444 «44 4« · *44« « 4 4 · *444 φ 4·«4 4* «4*4 4 • 4 4 4 4 · ·44«
- 67pELM3 a pELM15 Agel a Scal umožní účinné klonování fragmentu BspEI-Scal z knihovny pJS142. Konce BspEI a Agel jsou kompatibilní pro lígaci. Navíc je správná ligace míst Scal nezbytná pro znovuvytvoření funkčního genu bia (rezistence na ampicilin) a tím pro snížení množství klonů v pozadí z nežádoucích provedení ligace. Exprese fúzí peptidů MBP řízeného promotorem tac může potom být indukována pomocí IPTG.
Lyzáty pro ELISA Lad nebo MBP se připravují z jednotlivých klonů lyží buněk pomocí lysozymu a odstraněním nerozpustných částí buněk centrifugách Lyzáty jsou potom přidány do jamek obsahujících imobilizovaný receptor a do kontrolních jamek bez receptoru. Vazba fúzí peptidů MBP nebo Lad se detekuje inkubací s králičím polyklonálním antisérem buď proti Lad nebo MBP, následovanou inkubací s kozí antikráličí sekundární protilátkou značenou alkalickou fosfatázou. Navázaná alkalická fosfatáza se detekuje chromogenním substrátem p-nitrofenylfosfátem.
Příklad 5
Systém „přilbového dimeru“
Varianta techniky Lad peptidů na plazmidech používá vazebného proteinu DNA nazývaného přilbový dimer („headpiece dimer“). Vazba DNA lac represorem E. coii je zprostředkována přibližně 60 aminokyselinami „přilbové“ domény. Dimer přilbové domény, který se váže na lac operátor se normálně vytváří asociací mnohem delší C-koncové domény o délce přibližně 300 aminokyselin. Systém „přilbového dimeru“ využívá přilbového dimeru molekul obsahujících dva přilbové úseky spojené krátkým peptidovým linkerem. Tyto proteiny se na DNA vážou dostatečně stabilně, aby dovolily aasociaci peptidového epitopu na C-konci přilbového dimeru s plazmidem kódujícím tento peptid.
-68 Náhodné peptidy fuzují s C-koncem přilbového dimeru, který se váže na plazmid, který jej kóduje za vytvoření komplexu peptid přilbový dimer - plazmid, jehož screening je možno provést pomocí panningu. Přilbový dimer systému peptidy na plazmidech dovoluje větší selektivitu pro ligandy s vysokou afinitou než systém Lacl. Systém přilbového dimeru je tedy použitelný pro přípravu mutagenetických knihoven založených na počátečních úspěšných sekvencích s nízkou afinitou a selekci variant těchto počátečních sekvencí s vyšší afinitou.
Knihovny se konstruují jako v případě peptidů na plazmidech s použitím přilbového dimerního vektoru pCMG14 (viz obr. 6A-C). Přítomnost lac operátoru se pro vazbu plazmidu proteinem přilbového dimeru nevyžaduje. Knihovny byly zavedeny do bakteriálního kmene obsahujícího E. coli (lon-11 sulA1 hsdR17 (ompT-fepC) AcipA319::kan Alacl lac ZU118 A(srl-recA) 306::Tn10 a amplifikovány za podmínek bazální (A) indukce promotoru. Panning knihoven přilbového dimeru se provádí podobnými postupy jako u knihoven Lacl kromě toho, že na místo pufru HEKL se používá pufr HEK a eluce plazmidú z jamek se provádí vodným fenolem namísto IPTG. Sekvence z panningu přilbového dimeru jsou často charakterizovány po převodu do vektoru MBP tak, že mohou být testovány afinitně citlivou metodou ELISA MBP a také tak, že populace klonů mohou být testovány přenosem kolonií se značeným receptorem.
Příklad 6
V tomto příkladu byly cyklizované sloučeniny testovány třemi způsoby. Zaprvé byly získány hodnoty IC50, jak bylo popsáno výše. Navíc byl proveden test proliferace MTT buněk jak bylo popsáno výše pro výpočet hodnot ECS0. Nakonec byl proveden mikrofyziometrický test (Molecular Devices Corp.). V tomto testu se v podstatě měří rychlost okyselování extracelulárního média jako odezva na stimulaci
X
-69 receptoru TPO sloučeninami podle vynálezu. Rozsahy pro EC50 jsou symbolicky označeny jako pro ICso popsané výše, výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4
Struktura EC50 (nM) IC50 prolifer. mikrofyz. (nM)
[H]-(Pen)ADGPTLREWISF(Cys)-[NH2] “Η 1 s------------------s | ++ | ++ | |
[0=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH2] | I | ++ | ++ | ++ |
1 ch2------------------s | |||
[H]-(Homocys)ADGPTLREWISF(Cys)-[NH2] S 1 | ++ | ++ | ND |
S----------------S | |||
[0-C-N]-ADGPTLREWISF-(Cys)-[NH2] | + | + | + |
c h2-------------S---------1 | |||
0 | |||
[H]-(D-Cys)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH2] | + | + | ND |
s---------------------s | |||
[H]-(Cys)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH2] I I | + | + | ++ |
1 1 S-------------------S | |||
[H]-(D-Pen)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH2] | + | + | ++ |
S--------------------S | |||
[H]-(Homocys)ADGPTLREWISF(Homocys)-[NH2] | + | + | ++ |
S-----------------------S
[O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Homocys)-[NH2] | + | + | ++ | |||
CH2----------- | —s | |||||
[O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Pe | n)-[NH2] | + | + | + | ||
r' u _ | * | |||||
^“2 | v | |||||
[O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH2] | ++ | + | ++ | |||
Ph r*Lj | 1 ť* | |||||
rn-un | o | |||||
[H]-KADGPTLREWISFE-[HN2] | + | + | ND | |||
1 | 1 , κι li | |||||
[H]-EADGPTLREWISFl· 1 | <-[NH2] | + | + | ND | ||
0= | n MU | |||||
L· N Π | ||||||
[0=C | :-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH2] 1 | ++ | + | ND | ||
/v [0=C I | ||||||
>NH]-ADGPTLREWISF(Cy | > s)-[NH2] | ++ | + | ND | ||
S | ||||||
[HN]-ADGPTLREWISFE-[NH2] | + | + | + | |||
u=u | ||||||
[H]-(Pen)ADGPTLREWISF(Pen)-[NH2] | + | + | ND | |||
S------------- | -----S |
Příklad 7
V tomto příkladu byly testovány náhrady aminokyselin v polohách D, E, I, S, nebo F v cyklizované sloučenině
• | *« | *·*· | ** | *« |
41* | * * | • | * · · | * |
• | • · | • | * · | • · |
• | • · · | • | • ··* « | • |
* | • * | • * | * * | • |
*· | ·· | • · |
CADGPTLREWISFC na hodnoty ECSo a ICS0 jak bylo popsáno výše.
Mikrofyziometrické výsledky se udávají v závorkách. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 5 níže.
Tabulka 5
CADGPTLREWISFC
Substituce | ECSO (nM) Buněč.prolifer. | IC50 (nM) |
E - Q | ++(+) | ++ |
D - A | + (+) | ++ |
1 - A | + (+) | + |
S - A | ++ (++) | ++ |
S - D-Ala | + | + |
S - Sar | + | ++ |
S - Aib | ++ (+) | ++ |
S - D-Ser | ++ | ++ |
S - Nva | ++ (++) | ++ |
S - Abu | ++ | ++ |
S - (N-Me-Ala) | + | + |
S - (N-Me-Val) | + | + |
S - (N-Me-Ala)* | + | + |
S - (nor-Leu) | ++ | ++ |
S - (t-Bu-Gly) | + | ++ |
S - (N-Me-Ser(Bzl)] | + | |
S - (homoser) | ND | ND |
S - (N-Me-Leu) | + | ND |
F - A | + (+) | ++ |
« · · ·
··♦·
Substituce | EC50 (nM) Buněč.prolifer. | IC50 (nM) |
F - D-Ala | + | ++ |
F - F-Phe | + | ++ |
F - Homo-Phe | ++ (++) | ++ |
F - CHA | ++ (++) | ++ |
F - Thi | ++ | ++ |
F - (Ser(Bzl)) | ++ | ++ |
F - (N-Me-Aia) | + | + |
F - (fenygly) | ++ (++) | ++ |
F - (pyridylala) | ++ | ++ |
F - (p-nitrofe) | ++ (++) | ++ |
F - (3,4-di-CI-Phe) | ++ (+) | ++ |
F - (p-CI-Phe) | ++ | ++ |
F - (2-Nal) | ++ (++) | ++ |
F - (1-Nal) | ++ | ++ |
F - (Diph-Ala) | ++ | ++ |
F - (N-Me-Phe) | ++ | ND |
S,F - Ava (thioether) | + | ++ |
S,F - Ava(cys-cys) | + | ++ |
S,F - Ava | + | ++ |
AD - delece | + (+) | ND |
ADG - delece | (+) | + |
Ava = HsN/V/VCOOH
Přiklad 8
V tomto příkladu byly vyhodnoceny substituce aminokyselin ve sloučenině (O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)
Lh2_________________ [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)
I ch2------------------s v polohách D, S, nebo F jak je uvedeno v tabulce 6 níže. Hodnoty EC5o a ICSo byly vypočteny jak bylo popsáno výše.
Mikrofyziometrické výsledky jsou v závorkách.
Tabulka 6 [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys) I I
CH?------------------S
Substituce | ECSO (nM) Buněč.prolif. | IC50 (nM) |
D - E | (+) | ND |
Forma volné kyseliny | ++ (+) | ND |
Přidán Gly na aC-konci | ++ | ++ |
S - Abu | ++ (++) | ND |
F - DiPh-Ala | (++) | +4- |
S,F - Abu, DiPh-Ala | + (+) | ++ |
Příklad 9
V tomto příkladu byly vypočteny hodnoty ECSo a IC5o jak se popisuje výše pro dimerní sloučeniny uvedené v tabulce 7 níže. Pro porovnání je zahrnut cyklizovaný monomer
CADGPTLREWISFC
Sloučeniny z tabulky 8 byly při maximální koncentraci 10 μΜ neaktivní.
V tab. 9 byly určovány a porovnávány hodnoty ECso a IC5o jak bylo popsáno výše pro cyklizované a dimerizované varianty l E G P T
LRQWLAARA.
V tab. 10 se porovnávají zkrácené formy dimeru (H)-l EG PTLRQ WLAARA (H)-lEGPTLRQWLAAEA(p-Ala)K-(NH2)
Hodnoty ECSo a ICSo byly vypočteny jak se popisuje výše. io Mikrofyziometrické výsledky se udávají v závorkách.
Tabulka 7
EC50(nM) IC50(nM)
Mikrofyz. Prolif.
O li
[BrH-C-NH]-ADGPTLREWISFC-[NH2] 0 II [Br+C-NH]-ADGPTLREWISFC-[NH2] | ++ | ++ | |
[Hl-IEGPTLRQWLAARA [H]-IEGPTLRQWI_AARA(3-Ala)lL[NH2] | ++ | ++ | ++ |
[H]-CIEGPTLRQWLAARA-[NH2] [H]-CIEGPTLRQWLAAEA-[NH2] | ++ | ++ | ++ |
[H]-CADGPTLREWISF-[NH2] [H]-CADGPTLREWISF-[NH2] | ++ | ++ | ++ |
[H]-SVQCGPTLRQWLAARNHLS-[NH2] [H1-SVQCGPTLRQWLAARNHLS-[NH2] | ++ | ++ | ++ |
[H]-MVGPTLRSGC-[NH2] [H1-MVGPTLRSgA-[NH2] | ND | + | + |
CADGPTLRWISFC l 1 | ++ | +4· | ++ |
[Ac]-ADGPTLREWISFC [Ac]-ADGPTLREWISFC | ND | ++ | ++ |
ADGPTLREWlSFCj; | ++ | ++ | ++ |
ADGPTLREWISFC | |||
[Acj-DGPTLREWISFC [Ac]-DGPTLREWISFC | ++ | ++ | ++ |
[Ac]-GPTLREWISF(^ [Acj-GPTLREWISFC | ND | ++ | ++ |
GPTLREWISFÍ^ | ++ | ++ | + |
GPTLREWISFC | |||
[Ac]-PTLREWISFC [Ac]-PTLREWISFC | ND | ++ | ++ |
PTLREWlSFCj) | ++ | ++ | + |
PTLREWISFC |
- 76 [Ac]-TLREWISFC [Ac]-TLREWISFC
TLREWISF(f | ++ | + | + |
TLREWISFC |
Tabulka 8 [Hl-CTRAQFLKGC-[NH2] | |
5 | [H]-CNINQLRSIC-[NH2l (_________________________________________I [H]-CNRSQLLAAC-[NH2] [H1-CTSTQWLLAC-[NH2] ! j [H]-CQRADLINFC-[NH2] [H]-CLLSEFLAGQQC-[NH2] |
10 | [H]-CTFQVWKLARNC-[NH2] [H]-CTLGQWLQMGMÍf-[NH2] [H]-CLTGPFVTQWLYEC-[NH2] [H1-CTLREFLDPTTAVC-[NH2] i i [H]-CGTEGPTLSTWLDC-[NH2] |
15 | [H]-CELVGPSLMSWLTC-[NH2] [H]-<pSLKEFLHSGLMQC-[NH2] [H]-CTLAEFLASGVEQ<p-[NH2] [H]-CTLKEWLVSHEVWC-ENH2] |
MM [H]-C1EGPTLRQWLAARAC-[NH2] [H]-REGPTLRQWM-[NH2] [H]-REGPTLRQWLMSRS-[NH2]
Tabulka 9
EC50(nM) IC50(nM)
* | Mikrofyz. | Prolif. | |
[H ]-1 EG PTLRQ WLAARA-[N H2] | ND | ++ | ++ |
[H]-CIEGPTLRQWLAARAC-[NH2] | ND | ++ | ++ |
[HJ-I EG PTLRQ WLAARA \ [H]-IEGPTLRQWLAAEA(p-Ala)K-[NH2] | ++ | ++ | ++ |
IEGPTLRQWLAAEA-[NH2] ++ [H]-CIEGPTLRQWLAAEA-[NH2] ++ ++
Tabulka 10 (H)-IEGPTLRQWLAAR^ (H)-IEGPTLRQWLAAEA(p-Ala)K-(NH2)
Sekvence | EC50(nM) Buněč.prolif. | IC50(nM) |
(Ac)-IEGPTLRQWLAARA (Ac)- IEGPTLRQWLAARA-3A-l!(NH2) | ++ | ND |
(Η)- 1 EG PTLRQ WLAAR (H)- IEGPTLRQWLAAR-3A-K(NH2) | ++ | ND |
(H)- lEGPTLRQWLA^ (H)- IEGPTLRQWLAA-pA-K(NH2) | ++(++) | ND |
(Ac)-EGPTLRQWLAARA (Ac)-EG PTLRQ WLAARA-pA-K(N H2) | ND | ND |
(H)-EGPTLRQWLAARÝ (H)-EGPTLRQWLAARA-pA-K(NH2) | ++ | ND |
(H)-EGPTLRQWLAAR (H)-EGPTLRQWLAAR^A-K(NH2) | ++(++) | ND |
(Ac)-EGPTLRQWLAÝ (Ac)-EGPTLRQWLAA^A-K(NH2) | ++ | ND |
(H)-EGPTLRQWLAÝ (H)-EGPTLRQWLAA-3A-K(NH2) | ++ | ND |
Příklad 10
V tomto příkladu byly zaváděny různé substituce v polohách G,
P a W v cyklizované sloučenině [HJ-CADGPTLREWISFC - [NH2]
Tabulka 11 ukazuje příklady substituovaných sloučenin, které io vykazují aktivitu agonistů TPO. Substituenty uvedené v tabulce zkratkami jsou následující:
Tabulka 11
[HJ-CADGPTLREWISFC - [NH2] | ||
G | P | W |
Sar | Hyp(OBn) | Nal |
Sar | Hyp(OBn) | Nal |
Gly | Pro | Trp |
Gly | Pro | Trp |
Sar | Hyp(OBn) | Nal |
Gaba | Pro | Trp |
Cpr-Gly | Pro | Trp |
Sar | Hyp(OBn) | Nal |
Gly | Pro | Trp |
Gly | Pro | Nal |
Sar | Pro | Trp |
Cpr-Gly | L-Tic | Nal |
Gly | D-Tic | D-Trp |
Cpr-Gly | D-Tic | Trp |
Gaba | Hyp(OBn) | Trp |
Náhrady prolinu
D-Pro
L-Pro
|_-4-Hyp(OBn)
Kyselina L-pipekolinová
inova
Kyselina L-azetidin karboxylová
COQH
L-Tic
D-Tic
L-Oic
L-Tiq
Náhrady tryptofanu
L-(benzathienyl)-alanin DL-5-Me-Trp
DL-5-F-Trp
DL-5-Br-Trp
L-Tic
Náhrady qlycinu
Glycin • · · ·
Sarkosin
COOH
COOH β-alanin
Kyselina γ-aminomáselná
N-pentylglycin
N-cyklopropy|g|ycin
Příklad 11
Pro testování vhodnosti myši jako běžného testovacího druhu bylo provedeno několik experimentů in vitro, navržených pro měření aktivity testovaných sloučenin na myším receptoru. Nejprve byly 5 inkubovány buňky kostní dřeně, sklizené z femorú 8 až 9 týdnů starých myší Balb/C, inkubovány 7 dnů v kapalné kultuře vždy s rhuTPO nebo různými koncentracemi testovaných peptidů. Na konci inkubačníperiody byly kultury koncentrovány odstředěním centrifugou Cytospin, barveny na acetyicholinesterázu (AChE, diagnostika myších io megakaryocytú) a počítány pod mikroskopem. 1 nM rhuTPO bylo dosaženo růstu velmi velkých ( > 40 pm) neadherentních buněk barvících se na AChE. Zdá se, že tyto buňky jsou zralé megakaryocyty. Z počátečního zaočkování 10s celkových buněk kostní dřeně/ml (v 50 ml kulturách) se vyvinulo očekávaných is 1 až 2 x 106 megakaryocytú. Tato odezva na TPO byla označena jako „maximální“. Kontrolní kultury neobsahující přidané růstové faktory produkovaly velmi málo AChE pozitivních buněk. Několik peptidových sloučenin bylo testováno tímto testem při vyšších koncentracích a výsledky jsou uvedeny v tabulce 12. Peptid A v koncentraci 10 μΜ 20 produkoval maximální odpověď u buněk myší kostní dřeně. Toto zjištění bylo prvním důkazem, že tato rodina peptidů je na myším receptoru aktivní. V druhém experimentu byly sklizeny buňky kostní dřeně a kultivovány v polotuhém médiu (methylcelulóza) obsahujícím buď žádné faktory, 1 nM rhuTPO nebo 10 μΜ Peptidů A. Po sedmi 25 dnech kultivace byly kolonie velkých buněk (u kterých se očekávalo, že jde o megakaryocyty) počítány a seskupeny do malých kolonií (3-5 buněk) nebo velkých kolonií (větší než 6 buněk). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13. TPO a testované peptidy oba produkovaly podstatně více kolonií obou velikostí než tomu bylo v kulturách 3o negativní kontroly. To ukazuje, že peptidy napodobují TPO ve své schopnosti stimulovat expanzi populace Mk prekurzorových buněk.
Pro získání kvantitativnějšího srovnání účinnosti testovaných sloučenin na myší a lidské receptory byl klonován receptor muTPO a transfekován do buněk BaF3. Byla izolována TPO dependentní populace buněk.
• · · *
Tabulka 12
Peptid | Testovaná koncentrace | (nM) Odezva |
D | 100 000 | žádná |
C | 40 000 | maximální** |
C + S. A. * | 1000 | maximální |
S. A. samotný | 1000 | žádná |
B | 100 000 | minimální |
A | 10 000 | maximální |
TPO (R & D) | 1 | „maximální“ |
* Streptavidin v komplexu s biotinylovaným peptidem - koncentrace zdánlivého komplexu 1 : 4.
io ** Porovnání s rekombinantním lidským TPO ** 25 až 30 % ACE barvících buněk na cytopspinu
Kultury bez růstových faktorů - přibližně 5 % AChE barvících buněk (nižší počet buněk) • · · ·
Tabulka 13
Sloučenina | 3-5 velkých buněk | 6-12 velkých buněk |
Bez faktorů 1 | 2 | 1 |
Bez faktorů 2 | 1 | 1 |
1 nM TPO # 1-1 | 15 | 6 |
1 nM TPO_ # 1-2 | 12 | 1 |
1 nM TPO # 2-1 | 16 | 8 |
1 nM TPO # 2-2 | 13 | 3 |
10 μΜ Peptidu #1-1 | 25 | 10 |
10 μΜ Peptidu # 1-2 | 22 | 8 |
10 μΜ Peptidu # 2-1 | 22 | 7 |
10 μΜ Peptidu # 2-2 | 21 | 10 |
Zastupuje:
Claims (31)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Sloučenina schopná vazby na tromb o poeti nový receptor, vyznačující se tím, že má:(1) molekulovou hmotnost menší než přibližně 8000 daltonů, a (2) vazebnou afinitu ke trombopoetinovému receptoru vyjádřeno hodnotou IC50 ne větší než přibližně 100 μΜ.
- 2, Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e uvedenou sloučeninou je peptid a kde žádná až všechny vazby -C(O)NH- peptidu byly nahrazeny vazbou zvolenou ze skupiny vazba -CH2OC(O)NR-; fosfonátová vazba; vazba -CH2S(O)2NR-; vazba -CH2NR- a vazba -C(O)NR6-; a vazba -NHC(O)NH-, kde R znamená atom vodíku nebo nižší alkyl a R6 znamená nižší alkyl, dále kde N-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky je zvolen ze skupiny -NRR1; skupiny -NRC(O)R; skupiny -NRC(0)OR; skupiny -NRS(O)2R; skupiny -NHC(O)NHR; sukcinimidové skupiny; skupiny benzyloxykarbonyl-NH-; a skupiny benzyloxykarbonyl-NH-, která má na fenylovém kruhu od 1 do 3 substitentú zvolených ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo, kde R a R1 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl, a ještě dále kde C-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky má vzorec -C(O)R2, kde R2 je zvolen ze skupiny hydroxy, nižší alkoxy a -NR3R4, kde R3 a R4 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl a kde dusíkový atom skupiny -NR3R4 může být popřípadě aminovou ♦ to ···· o · · toto «♦ to · ·-87 • to to· to to • to to • to to to · • to to toto toto skupinou N-konce peptidu, takže dojde k vytvoření cyklického peptidu, a její fyziologicky přijatelné soli.
- 3. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, ž e obsahuje sloučeninu podle nároku 1 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
- 4. Způsob léčení pacienta trpícího poruchou, vnímavou k léčení agonistou trombopoetinu, který zahrnuje podávání terapeuticky účinné dávky nebo množství sloučeniny podle nároku 1 pacientovi.
- 5. Způsob podle nároku 4, kde sloučeninou podávanou pacientovi je peptid, a kde žádná až všechny vazby -C(O)NH- peptidu byly nahrazeny vazbou zvolenou ze skupiny vazba -CH2OC(O)NR-; fosfonátová vazba; vazba -CH2S(O)2NR-; vazba -CH2NR- a vazba -C(O)NR5 6-; a vazba -NHC(O)NH-, kde R znamená atom vodíku nebo nižší alkyl a R6 znamená nižší alkyl, dále kde N-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky je zvolen ze skupiny -NRR1; skupiny -NRC(O)R; skupiny -NRC(O)OR; skupiny -NRS(O)2R; skupiny -NHC(O)NHR; sukcinimidové skupiny; skupiny benzyloxykarbonyl-NH-; a skupiny benzyloxykarbonyl-ΝΗ-, která má na fenylovém kruhu od 1 do 3 substitentů zvolených ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo, kde R a R1 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl, ·«· ·· * · ♦· · * > ··« ·»·· • · · ♦ · ·· ··♦· * • * · * · · · · · · * * «· » · · · · · · · · -88 a ještě dále kde C-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky má vzorec -C(O)R2, kde R2 je zvolen ze skupiny hydroxy, nižší alkoxy a -NR3R4, kde R3 a R4 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl a kde dusíkový atom skupiny -NR3R4 může být popřípadě aminovou skupinou N-konce peptidu, takže dojde k vytvoření cyklického peptidu, a jeho fyziologicky přijatelné solí.
- 6. Sloučenina podle nároku 2, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:Xi X2 X3 X4 X5 Χβ X7 kde Χη znamená C, L, Μ, P, Q, V; X2 znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X3 znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X5 znamená A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X6 znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a X7 znamená C, G, I, K, L, M, N, R nebo V.
- 7. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedená sekvence aminokyselin má cyklizovanou strukturu.
- 8. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedená sekvence aminokyselin má dimenzovanou strukturu.
- 9. Sloučenina podle nároku 6, kde sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselinC X2 X3 X< Xs Xe X?• ··· · · · · · · · » ·· · · · · · • · « «««· · · · , , * · Β « t * * ·* · ·- 89 kde Χ2 znamená Κ, L, Ν, Q, R, S, Τ nebo V; Χ3 znamená C, F,I, L, Μ, R, S nebo V; Χ4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovanýchL-aminokyselin; X5 znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X8 znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a X7 znamená C, G, I,K, L, Μ, N, R nebo V.
- 10. Sloučenina podle nároku 8, kde X4 je A, E, G, Η, K, L, Μ, P, Q, R,’S, T nebo W.
- 11. Sloučenina podle nároku 10, kde X2 znamená S nebo T; X3 znamená L nebo R; X6 znamená R; X5 znamená D, E nebo G; X6 znamená F, L nebo W; a X7 znamená I, K, L, R nebo V.
- 12. Sloučenina podle nároku 9, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:Xe C X2 X3 X4 X5 X6 X7 kde X2 znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X3 znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X5 je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X6 je C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X7 je C, G, I, K, L, Μ, N, R, nebo V; a X8 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin.
- 13. Sloučenina podle nároku 12, kde X8 znamená G, S, Y nebo R.
- 14. Sloučenina podle nároku 12, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin: GGCTLREWLHGGFCGG.
- 15. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:X8 G Xi X2 X3 X4 X5 W X7 kde X, znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X2 znamená F, R, S nebo T; X3 znamená F, L, V, nebo W; X4 znamená A, K, L, M, R, S, V, nebo T; X5 znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; X7 znamená C, I, K, L, M nebo V; a X8 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin
- 16. Sloučenina podle nároku 15, kde Xi znamená P; X2 znamená T; X3 znamená L; X4 znamená R; X5 znamená E nebo Q; X7 znamená I nebo L.
- 17. Sloučenina podle nároku 16, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:Xg X8 G Xi X2 X3 X4 X5 W X7 kde X8 znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V; a X9 znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V;.
- 18. Sloučenina podle nároku 17, kde X8 znamená D, E nebo K; a Xg znamená A nebo I.
- 19. Sloučenina podle nároku 18, kde uvedená sloučenina je zvolena ze skupiny GGCADGPTLREWISFCGG;G NADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTLR EWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;SI EGPTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLH GNGRDT;CADGPTLREWISFC;alEGPTLRQ W L A A R A.
- 20. Způsob podle nároku 4, kde uvedená sloučenina podávaná pacientovi obsahuje sekvenci aminokyselinC X2 X3 X4 Xs X6 Xz kde X2 znamená K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X3 znamená C, F, I, L, MT R, S nebo V; X4 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; Xs znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X6 znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X7 znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V.
- 21. Způsob podle nároku 20, kde X4 znamená A, E, G, Η, K, L, M, P, Q, R, S, T nebo W.
- 22. Způsob podle nároku 21, kde X2 je S nebo T; X3 je L nebo R; X4 je R; X5 je D, E, nebo G; X6 je F, L, nebo W; a X7 je I, K, L, R, nebo V.
- 23. Způsob podle nároku 22, kde uvedená sloučenina podávaná pacientovi obsahuje sekvenci aminokyselin: GGCTLREW LHGGFCGG.
- 24. Způsob podle nároku 4, kde porucha ovlivnitelná léčením agonistou trombopoetinu je zvolena ze skupiny: hematologické poruchy a trombocytopenie v důsledku chemoterapie, radiační terapie nebo transfuzí kostní dřeně.
- 25. Způsob podle nároku 4, kde uvedená sloučenina podávaná pacientovi obsahuje sekvenci aminokyselin • · ♦ · • · v • ·- 92 Xa G Xi X2 X3 X4 Xs W X7 kde X: znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X2 znamená F, R, S neboT; X3 znamená F, L, V, nebo W; X4 znamená A, K, L, M, R, S,V, nebo T; X5 znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; X7 5 znamená C, I, K, L, M nebo V; a X8 je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin.
- 26. Způsob podle nároku 25, kde Xi znamená P; X2 znamená T; X3 znamená L; X4 znamená R; Xs znamená E nebo Q; X7 znamená ίο I nebo L.
- 27. Způsob podle nároku 26, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:X9 X8 G Xt X2 X3 X4 X5 W X715 kde X8 znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V a X9 znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V;.
- 28. Způsob podle nároku 27, kde Xa znamená D, E nebo K; a X9 znamená A nebo I.
- 29. Způsob podle nároku 28, kde sloučenina podávaná pacientovi je zvolena ze skupiny GGCADGPTLREWISFCGG; GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTL REWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;S25 IEGPTLREWLTSRTPHSjLAIEGPTLRQWLHGNGRDT;CADGPTLREWISFC;alEGPTLRQ W L A A R A.
- 30. Sloučenina, která se váže na trombopoetinový receptor, kde uvedená sloučenina je zvolena ze skupinyCADGPTLREWISFC;5 [Ac]- CADGPTLREWISFC- [amid] ;O = C A D G P T L R E W I S F C - NH2 ; aI I ch2-------------------sIEGPTLRQWLAARAI io IEGPTLRQWLAARA (pala)-K [NH2]
- 31. Způsob léčení pacienta trpícího poruchou vnímavou k léčení agonistou trombopoetinu, který zahrnuje podávání sloučeniny zvolené ze skupiny15 CADGPTLREWISFC;[Ac] - CADGPTLREWISFC - [amid] ;O = CADGPTLREWISFC-NH2 ; aI I ch2-------------------sIEGPTLRQWLAARAIEGPTLRQWLAARA (pala)-K [NH2] pacientovi.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48530195A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
US47812895A | 1995-06-07 | 1995-06-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ389797A3 true CZ389797A3 (cs) | 1998-06-17 |
CZ291749B6 CZ291749B6 (cs) | 2003-05-14 |
Family
ID=27045796
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19973897A CZ291749B6 (cs) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | Peptidová sloučenina, která se váže na thrombopoetinový receptor a aktivuje jej a farmaceutický prostředek |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6083913A (cs) |
EP (4) | EP1961760A3 (cs) |
JP (1) | JP3059218B2 (cs) |
KR (1) | KR100436680B1 (cs) |
CN (2) | CN1315870C (cs) |
AR (1) | AR003431A1 (cs) |
AT (1) | ATE390439T1 (cs) |
BR (1) | BR9608587A (cs) |
CA (2) | CA2223449C (cs) |
CZ (1) | CZ291749B6 (cs) |
DE (1) | DE69637473T2 (cs) |
DK (1) | DK0885242T3 (cs) |
EA (1) | EA001220B1 (cs) |
ES (1) | ES2303338T3 (cs) |
HU (1) | HU227678B1 (cs) |
IL (1) | IL122102A (cs) |
MX (1) | MX9709315A (cs) |
NO (2) | NO317737B1 (cs) |
NZ (1) | NZ310778A (cs) |
PE (1) | PE7898A1 (cs) |
PL (1) | PL188795B1 (cs) |
PT (1) | PT885242E (cs) |
TR (1) | TR199701526T1 (cs) |
TW (1) | TW518341B (cs) |
WO (1) | WO1996040750A1 (cs) |
ZA (1) | ZA964814B (cs) |
Families Citing this family (84)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5869451A (en) * | 1995-06-07 | 1999-02-09 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
US6251864B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-06-26 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
EA001220B1 (ru) * | 1995-06-07 | 2000-12-25 | Глаксо Груп Лимитед | Пептид или пептидомиметик, который связывается с рецептором тромбоэтина, фармацевтическая композиция и способ лечения |
US6172210B1 (en) * | 1996-04-02 | 2001-01-09 | Blood Center Research Foundation | DNA encoding phospholipid scramblase |
US7091311B2 (en) | 1996-06-07 | 2006-08-15 | Smithkline Beecham Corporation | Peptides and compounds that bind to a receptor |
US6593456B1 (en) * | 1996-11-06 | 2003-07-15 | The Regents Of The University Of California | Tumor necrosis factor receptor releasing enzyme |
US6930084B1 (en) | 1996-11-06 | 2005-08-16 | The Regents Of The University Of California | Treating arthritis with TNF receptor releasing enzyme |
US6121416A (en) | 1997-04-04 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
US6420518B1 (en) | 1997-04-04 | 2002-07-16 | Genetech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
CA2328252A1 (en) * | 1998-04-14 | 1999-10-21 | Katherine Louisa Widdowson | Receptor ligands |
US7153655B2 (en) | 1998-06-16 | 2006-12-26 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function involving the use of exonuclease enzyme and two populations of parent polynucleotide sequence |
US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
TWI250988B (en) * | 1998-10-23 | 2006-03-11 | Kirin Amgen Inc | Thrombopoietic compounds |
DK1141014T3 (da) | 1999-01-06 | 2005-04-11 | Genentech Inc | Insulinlignende vækstfaktor (IGF) i mutantvariant |
US6911314B2 (en) | 1999-05-14 | 2005-06-28 | The Regents Of The University Of California | Screening for drugs that affect TNF receptor releasing enzyme |
EP1216037A2 (en) | 1999-09-21 | 2002-06-26 | Emory University | Methods and compositions for treating platelet-related disorders using mpl pathway inhibitory agents |
TWI284639B (en) | 2000-01-24 | 2007-08-01 | Shionogi & Co | A compound having thrombopoietin receptor agonistic effect |
ATE389416T1 (de) | 2000-05-16 | 2008-04-15 | Genentech Inc | Behandlung von knorpelerkrankungen |
CY2010012I2 (el) | 2000-05-25 | 2020-05-29 | Novartis Ag | Μιμητικα θρομβοποιητινης |
WO2001092211A1 (fr) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composes possedant des activites analogues a celles de la thrombopoietine |
ATE320450T1 (de) | 2000-12-05 | 2006-04-15 | Alexion Pharma Inc | Rationell entworfene antikörper |
US7396917B2 (en) | 2000-12-05 | 2008-07-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
US6958213B2 (en) | 2000-12-12 | 2005-10-25 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function |
JP4145654B2 (ja) | 2001-01-26 | 2008-09-03 | 塩野義製薬株式会社 | トロンボポエチン受容体アゴニスト作用を有する環状化合物 |
AU2002307062A1 (en) * | 2001-04-02 | 2002-10-15 | Purdue Pharma L.P. | Thrombopoietin (tpo) synthebody for stimulation of platelet production |
US7332474B2 (en) * | 2001-10-11 | 2008-02-19 | Amgen Inc. | Peptides and related compounds having thrombopoietic activity |
WO2003040885A2 (en) * | 2001-11-06 | 2003-05-15 | Drug Design Methodologies, L.L.C. | System and method for improved computer drug design |
KR101010905B1 (ko) | 2002-01-18 | 2011-01-25 | 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 | 2-아실아미노티아졸 유도체 또는 그 염 |
US20040009944A1 (en) * | 2002-05-10 | 2004-01-15 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same |
WO2003097834A2 (en) | 2002-05-17 | 2003-11-27 | Alligator Bioscience Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
TWI280128B (en) | 2002-05-22 | 2007-05-01 | Smithkline Beecham Corp | 3'-[(2Z)-[1-(3,4- dimethylphenyl)-1,5-dihydro-3-methyl-5-oxo-4H-pyrazol-4-ylidene]hydrazino]-2'-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-carboxylic acid bis-(monoethanolamine) |
US20040028661A1 (en) * | 2002-08-07 | 2004-02-12 | Bartelmez Stephen H. | Expansion of cells using thrombopoietin and anti-transforming growth factor-beta |
JP4412173B2 (ja) | 2002-08-14 | 2010-02-10 | 日産化学工業株式会社 | トロンボポエチンレセプター活性化剤ならびにそれらの製造方法 |
EP1542714B1 (en) | 2002-09-18 | 2014-04-02 | Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. | Methods of increasing platelet and hematopoietic stem cell production |
FI20021762A0 (fi) * | 2002-10-03 | 2002-10-03 | Karyon Oy Ab Ltd | Uusia terapeuttisia aineita ja valmisteita |
TWI324593B (en) | 2002-10-09 | 2010-05-11 | Nissan Chemical Ind Ltd | Pyrazolone compounds and thrombopoietin receptor activator |
US7736909B2 (en) * | 2003-01-09 | 2010-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising capture agents |
DE602004028725D1 (de) * | 2003-05-12 | 2010-09-30 | Affymax Inc | Neue poly(ethylenglycol) modifizierte erythropoietinagonisten und deren verwendungen |
JP2007500218A (ja) | 2003-05-12 | 2007-01-11 | アフィーマックス・インコーポレイテッド | ポリ(エチレングリコール)修飾ペプチド系化合物の新規スペーサー部分 |
CN100441595C (zh) | 2003-05-12 | 2008-12-10 | 阿费麦克斯公司 | 结合红细胞生成素受体的新肽 |
BRPI0411172A (pt) * | 2003-05-12 | 2006-07-18 | Affymax Inc | peptìdeo, dìmero de peptìdeo, seu uso e composição farmacêutica |
WO2004108078A2 (en) * | 2003-06-02 | 2004-12-16 | Alexion Pharmaceuticals Inc. | Rationally designed antibodies |
CN1863783A (zh) | 2003-08-12 | 2006-11-15 | 盐野义制药株式会社 | 具有血小板生成素受体激动作用的化合物 |
US7723295B2 (en) | 2003-08-28 | 2010-05-25 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Peptides and compounds that bind to a receptor |
ES2626107T3 (es) * | 2003-08-28 | 2017-07-24 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Péptidos y compuestos que se unen al receptor de trombopoyetina |
TW200526638A (en) | 2003-10-22 | 2005-08-16 | Smithkline Beecham Corp | 2-(3,4-dimethylphenyl)-4-{[2-hydroxy-3'-(1H-tetrazol-5-yl)biphenyl-3-yl]-hydrazono}-5-methyl-2,4-dihydropyrazol-3-one choline |
US20060210542A1 (en) * | 2004-08-16 | 2006-09-21 | Yurkow Edward J | Use of TPO mimetic compounds and pharmaceutical compositions in the treatment of anemia |
CN100432102C (zh) * | 2004-09-30 | 2008-11-12 | 百瑞全球有限公司 | 血小板增进蛋白及其应用 |
WO2006060148A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-08 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
AU2005312585B2 (en) | 2004-12-08 | 2012-01-12 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | 3-ethylidenehydrazino substituted heterocyclic compounds as thrombopoietin receptor activators |
RU2401259C2 (ru) | 2004-12-14 | 2010-10-10 | Ниссан Кемикал Индастриз, ЛТД | Амидные соединения и активаторы рецептора тромбопоэтина |
CA2600749C (en) * | 2005-03-10 | 2014-04-15 | Nascacell Ip Gmbh | Dimeric or multimeric microproteins |
US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7550433B2 (en) * | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7919461B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
WO2006136450A2 (en) * | 2005-06-23 | 2006-12-28 | Aplagen Gmbh | Supravalent compounds |
TWI368617B (en) | 2005-07-15 | 2012-07-21 | Nissan Chemical Ind Ltd | Thiophene compounds and thrombopoietin receptor activators |
JP5104752B2 (ja) | 2005-07-20 | 2012-12-19 | 日産化学工業株式会社 | ピラゾール化合物及びトロンボポエチンレセプター活性化剤 |
EP1947101A4 (en) | 2005-11-07 | 2009-09-16 | Nissan Chemical Ind Ltd | HYDRAZIDE COMPOUND AND THROMBOPOIETIN RECEPTOR ACTIVATOR |
JP2009514941A (ja) * | 2005-11-08 | 2009-04-09 | アステラス製薬株式会社 | 血小板減少症を治療する化合物および方法 |
US7879318B2 (en) | 2006-01-23 | 2011-02-01 | Mcw Research Foundation, Inc. | Method of reducing the effects of ischemia by administration of a thrombopoietin receptor ligand |
JP5157900B2 (ja) | 2006-06-07 | 2013-03-06 | 日産化学工業株式会社 | 含窒素ヘテロ環化合物及びトロンボポエチンレセプター活性化剤 |
US20080039475A1 (en) * | 2006-08-08 | 2008-02-14 | Akarx, Inc. | Compositions and methods for increasing blood platelet levels in humans |
US8106154B2 (en) | 2007-01-31 | 2012-01-31 | Affymax, Inc. | Nitrogen-based linkers for attaching modifying groups to polypeptides and other macromolecules |
ECSP077628A (es) | 2007-05-03 | 2008-12-30 | Smithkline Beechman Corp | Nueva composición farmacéutica |
WO2008157824A2 (en) * | 2007-06-21 | 2008-12-24 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Thrombopoietin peptide conjugates |
AU2008283357B2 (en) | 2007-07-31 | 2011-08-11 | Shionogi & Co., Ltd. | Pharmaceutical composition containing optically active compound having thrombopoietin receptor agonist activity and intermediate thereof |
WO2009029682A1 (en) * | 2007-08-28 | 2009-03-05 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapy with syk kinase inhibitor |
US8278057B2 (en) * | 2007-09-14 | 2012-10-02 | Nestec S.A. | Addressable antibody arrays and methods of use |
US8637455B2 (en) * | 2007-10-22 | 2014-01-28 | Affinergy, Llc | Compositions and methods for delivery of glycopeptide antibiotics to medical device surfaces |
CN101481352A (zh) | 2008-01-10 | 2009-07-15 | 上海恒瑞医药有限公司 | 双环取代吡唑酮偶氮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用 |
NZ594638A (en) | 2009-02-24 | 2013-03-28 | Alexion Pharma Inc | Antibodies containing therapeutic tpo/epo mimetic peptides for treatment of thrombocytopenia type conditions |
CN102449481B (zh) * | 2009-05-29 | 2016-05-25 | 德克萨斯大学系统董事会 | 用于分离和处理自身免疫性t细胞的类肽配体 |
ES2782898T3 (es) | 2009-05-29 | 2020-09-16 | Novartis Ag | Métodos de administración de compuestos agonistas de la trombopoyetina |
RU2566064C2 (ru) * | 2009-06-02 | 2015-10-20 | Дзе Борд Оф Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Техас Систем | Идентификация низкомолекулярных соединений, распознаваемых антителами у индивидуумов с нейродегенеративными заболеваниями |
WO2011047257A1 (en) * | 2009-10-16 | 2011-04-21 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods for producing cyclic peptoid libraries |
JP5704073B2 (ja) | 2009-10-23 | 2015-04-22 | 日産化学工業株式会社 | 縮環へテロ環化合物及びトロンボポエチンレセプター活性化剤 |
WO2011098095A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Aplagen Gmbh | Peptides binding the tpo receptor |
CN104045715B (zh) * | 2013-03-15 | 2018-05-01 | 兰州大学 | 二聚体化融合蛋白的制备及应用 |
CA2960778C (en) * | 2014-09-11 | 2023-03-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions |
AU2018306329B8 (en) * | 2017-07-26 | 2025-02-20 | Janssen Pharmaceutica Nv | Methods of protecting vascular integrity induced by targeted radiation therapy |
WO2021112249A1 (ja) | 2019-12-06 | 2021-06-10 | 味の素株式会社 | 生理活性を有するペプチドの製造方法及び短鎖リンカーを含むペプチド |
MX2023010902A (es) | 2021-03-18 | 2023-09-27 | Seagen Inc | Liberacion selectiva de farmacos a partir de conjugados internalizados de compuestos biologicamente activos. |
Family Cites Families (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2046920B1 (cs) | 1969-06-19 | 1974-05-03 | Citizen Watch Co Ltd | |
US3940475A (en) | 1970-06-11 | 1976-02-24 | Biological Developments, Inc. | Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
JPS6023084B2 (ja) | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
NO812612L (no) | 1980-08-06 | 1982-02-08 | Ferring Pharma Ltd | Enzym-inhibitorer. |
US4640835A (en) | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
US4612132A (en) | 1984-07-20 | 1986-09-16 | Chevron Research Company | Modified succinimides |
DE3675588D1 (de) | 1985-06-19 | 1990-12-20 | Ajinomoto Kk | Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist. |
US4791192A (en) | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5326558A (en) | 1989-08-08 | 1994-07-05 | Genetics Institute, Inc. | Megakaryocytopoietic factor |
IL96477A0 (en) | 1989-12-01 | 1991-08-16 | Amgen Inc | Megakaryocyte production |
DK167813B1 (da) * | 1989-12-07 | 1993-12-20 | Carlbiotech Ltd As | Pentapeptidderivat, farmaceutisk acceptable salte heraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og farmaceutisk praeparat indeholdende et saadant derivat |
US5571508A (en) | 1989-12-18 | 1996-11-05 | Amrad Corporation Limited | Method for the treatment of thrombocytopenia and pharmaceutical compositions useful therefor |
US5141851A (en) * | 1990-04-18 | 1992-08-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Isolated farnesyl protein transferase enzyme |
US5723286A (en) | 1990-06-20 | 1998-03-03 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening systems |
US5250732A (en) | 1991-07-18 | 1993-10-05 | Genentech, Inc. | Ketamine analogues for treatment of thrombocytopenia |
US5639603A (en) | 1991-09-18 | 1997-06-17 | Affymax Technologies N.V. | Synthesizing and screening molecular diversity |
DE69217497T2 (de) | 1991-09-18 | 1997-06-12 | Affymax Tech Nv | Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren |
US5270170A (en) | 1991-10-16 | 1993-12-14 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
US5359115A (en) | 1992-03-26 | 1994-10-25 | Affymax Technologies, N.V. | Methods for the synthesis of phosphonate esters |
DE69332222T3 (de) | 1992-06-11 | 2007-05-10 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc., Cambridge | Enythropoietin enthaltendes arzneimittelabgabesystem |
US5420328A (en) | 1992-09-11 | 1995-05-30 | Affymax Technologies, N.V. | Methods for the synthesis of phosphonate esters |
EP0945504A3 (en) * | 1992-12-11 | 1999-12-08 | The University Of Florida | Materials and method for control of pests |
US5354934A (en) | 1993-02-04 | 1994-10-11 | Amgen Inc. | Pulmonary administration of erythropoietin |
AU685506B2 (en) | 1993-08-25 | 1998-01-22 | Systemix, Inc. | Method for producing a highly enriched population of hematopoietic stem cells |
WO1995011992A1 (en) | 1993-10-27 | 1995-05-04 | The Regents Of The University Of California | Antiviral compounds |
AU8124694A (en) | 1993-10-29 | 1995-05-22 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
SG47030A1 (en) | 1994-01-03 | 1998-03-20 | Genentech Inc | Thrombopoietin |
WO1995021919A2 (en) * | 1994-02-14 | 1995-08-17 | Kirin Brewery Company, Limited | Protein having tpo activity |
KR100289201B1 (ko) | 1994-02-14 | 2001-05-02 | 엘. 데이예를 카렌. | 조혈 단백질과 그것의 제조를 위한 재료 및 방법 |
CA2169173C (en) | 1994-02-14 | 2002-10-15 | Kenneth Kaushansky | Methods for stimulating erythropoiesis using thrombopoietin |
SG79882A1 (en) | 1994-02-14 | 2001-04-17 | Kirin Brewery | Protein having tpo activity |
US5766581A (en) | 1994-03-31 | 1998-06-16 | Amgen Inc. | Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation |
US5571686A (en) | 1994-04-14 | 1996-11-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of using megapoietin for prolonging the survival & viability of platlets |
US5641655A (en) | 1994-11-30 | 1997-06-24 | Zymogenetics, Inc. | Methods for producing thrombopoietin polypeptides using a mammalian tissue plasminogen activator secretory peptide |
AU4163196A (en) * | 1994-11-30 | 1996-06-19 | Zymogenetics Inc. | Low molecular weight thrombopoietin |
EA001220B1 (ru) * | 1995-06-07 | 2000-12-25 | Глаксо Груп Лимитед | Пептид или пептидомиметик, который связывается с рецептором тромбоэтина, фармацевтическая композиция и способ лечения |
US5869451A (en) * | 1995-06-07 | 1999-02-09 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
US5932546A (en) * | 1996-10-04 | 1999-08-03 | Glaxo Wellcome Inc. | Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor |
US8157793B2 (en) | 2006-10-25 | 2012-04-17 | Terumo Kabushiki Kaisha | Manipulator for medical use |
JP7605076B2 (ja) | 2021-09-29 | 2024-12-24 | トヨタ紡織株式会社 | 乗物用シート |
-
1996
- 1996-06-07 EA EA199700359A patent/EA001220B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 WO PCT/US1996/009623 patent/WO1996040750A1/en active IP Right Grant
- 1996-06-07 DE DE69637473T patent/DE69637473T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 US US08/973,225 patent/US6083913A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 ZA ZA9604814A patent/ZA964814B/xx unknown
- 1996-06-07 JP JP9501903A patent/JP3059218B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 NZ NZ310778A patent/NZ310778A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 CN CNB961961422A patent/CN1315870C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 EP EP07024601A patent/EP1961760A3/en not_active Withdrawn
- 1996-06-07 DK DK96919241T patent/DK0885242T3/da active
- 1996-06-07 CA CA002223449A patent/CA2223449C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 PT PT96919241T patent/PT885242E/pt unknown
- 1996-06-07 HU HU9900921A patent/HU227678B1/hu unknown
- 1996-06-07 KR KR1019970709057A patent/KR100436680B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 EP EP10184658A patent/EP2338897A1/en not_active Withdrawn
- 1996-06-07 AT AT96919241T patent/ATE390439T1/de active
- 1996-06-07 AR ARP960103057A patent/AR003431A1/es active IP Right Grant
- 1996-06-07 CZ CZ19973897A patent/CZ291749B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 EP EP96919241A patent/EP0885242B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 PL PL96323917A patent/PL188795B1/pl unknown
- 1996-06-07 CA CA2636432A patent/CA2636432C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 ES ES96919241T patent/ES2303338T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 PE PE1996000437A patent/PE7898A1/es not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 CN CN200610154077XA patent/CN1966520B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 BR BR9608587A patent/BR9608587A/pt active Search and Examination
- 1996-06-07 TR TR97/01526T patent/TR199701526T1/xx unknown
- 1996-06-07 IL IL12210296A patent/IL122102A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 EP EP08075859A patent/EP2055712A1/en not_active Withdrawn
- 1996-08-02 TW TW085109336A patent/TW518341B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-12-01 MX MX9709315A patent/MX9709315A/es unknown
- 1997-12-05 NO NO19975705A patent/NO317737B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-04-13 US US09/549,090 patent/US6465430B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-03-29 NO NO20041296A patent/NO331550B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ389797A3 (cs) | Peptidy a sloučeniny schopné vazby na receptor thrombopoetinu | |
CZ134099A3 (cs) | Inhibitory serinových proteáz, zejména proteázy viru hepatitidy C NS3 | |
US6251864B1 (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
US5932546A (en) | Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor | |
US8227422B2 (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
US5869451A (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
WO1996040189A1 (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
JP4848277B2 (ja) | 受容体に結合するペプチドおよび化合物 | |
AU704215C (en) | Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor | |
HK1015380B (en) | Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor | |
HK1124620A (en) | Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor | |
HK1163698A (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
HK1163698B (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20160607 |