ES2285118T5 - Un método para el desarrollo molecular in vitro de una función proteica. - Google Patents

Abstract

Un método para generar una secuencia de polinucleótidos o población de secuencias desde las secuencias de polinucleótido de filamento simple codificando una o más proteinas causales, el método comprende los pasos de: a) suministrar una primera población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple, la primera y segunda poblaciones juntas constituyen los filamentos positivos y negativos de la secuencia de polinucleótidos progenitores; b) realizar una reacción para la asimilación de las primera y segunda poblaciones de moléculas de polinucleótidos de filamento simple con una exonucleasa para generar las correspondientes poblaciones de fragmentos de polinucleótidos de filamento simple; c) contactar dichos fragmentos de polinucleótidos generados desde los filamentos positivos con fragmentos generados desde los filamentos negativos; y d) amplificar los fragmentos que templan a cada otro para generar al menos una secuencia de polinucleótidos codificando una o más proteínas causales que tienen características alteradas como se comparó con una o más proteinas causales codificadas por dichos polinucleótidos progenitores. en donde, en el paso (b), al menos un parámetro de la reacción usada para asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente del parámetro(s) equivalente(s) usado(s) en la reacción para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple.

Description

La presente invención describe un método para el desarrollo molecular in vitro de una función proteica, en particular barajando segmentos de flilamentos simples de ADN obtenidos por el uso de una nucleasa.

La función proteica puede ser modificada y perfeccionada in vitro por una variedad de métodos, que incluyen la clonación combinatoria de mutagénesis controlada en un sitio (Alber et al., Nature, 5; 330(6143):41-46, 1987) (Huse et al., Science, 246:1275-1281, 1989; Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992) y mutagénesis aleatoria combinada con sistemas apropiados de selección (Barbas et al., PNAS. USA, 89: 4457-4461, 1992).

El método de mutagénesis aleatoria junto con la selección ha sido usado en un número de casos para perfeccionar la función proteica y existen dos estrategias diferentes. Primeramente, la aleatorización de la secuencia genética completa en combinación con la selección de una variante proteica (mutante) con las características deseadas, seguida por un nuevo ciclo de mutagénesis aleatoria y selección. Este método puede entonces ser repetido hasta que una variante proteica es encontrada la cual es considerada óptima (Schier R. et al.,

J. Mol. Biol. 1996 263 (4): 551-567). Aquí, la ruta tradicional para introducir mutaciones es por medio de la tendencia al error PCR (Leung et al., Technique, 1: 11-15, 1989) con un índice de mutación de aproximadamente 0.7 %. En segundo lugar, las regiones definidas del gen puede ser mutagenizada con degradaciones de bases, que permiten índices de mutación de hasta el 100 % (Griffiths et al., EMBO. J, 13: 3245-3260, 1994; Yang et al., J. Mol.

Biol. 254: 392-403, 1995). A más alto índice de mutación usado, más limitada la región del gen que puede ser sometida a mutaciones.

La mutación aleatoria ha sido usada extensivamente en el campo de la ingeniería de anticuerpos. Los genes anticuerpos formados in vivo pueden ser clonados in v itro (Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 1250-1256, 1989) y las combinaciones aleatorias de los genes que codifican la variable de genes pesados y ligeros pueden ser sometidas a la selección (Marks et al ., Biotechnology, 10: 779-783, 1992). Los fragmentos de anticuerpos funcionales seleccionados pueden ser además perfeccionados por el uso de mutagénesis aleatoria y ciclos adicionales de selección (Schier R. et al., J. Mol. Biol. 1996 263 (4): 551-567).

La estrategia de la mutagénesis aleatoria es seguida por la selección. Las variantes con características interesantes pueden ser seleccionadas y las regiones de ADN mutadas de diferentes variantes, cada cual con características interesantes, son combinadas dentro de una secuencia de codificación (Yang et al., J. Mol. Biol. 254: 392-403, 1995). Este es un proceso secuencial de múltiples pasos, y los efectos sinergéticos potenciales de las diferentes mutaciones pueden perderse, ya que ellos no están sometidos a la selección en combinación. Así, estas dos estrategias no incluyen la mutagénesis simultánea de regiones definidas y la selección de una combinación de estas regiones.

Otro proceso implica el pareo combinatorio de genes los cuales pueden ser usados para perfeccionar, por ejemplo. la afinidad de anticuerpo (Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992). Aquí, las tres regiones CDR en cada gen variable están fijas y esta tecnología no permite barajar los segmentos del gen individual en el gen por el dominio variable, por ejemplo, incluyendo las regiones CDR, entre clones.

El concepto de barajar el ADN (Stemmer, Nature 370: 389-391, 1994) utiliza la fragmentación aleatoria del ADN y el ensamblaje de los fragmentos en una secuencia de codificación funcional. En este proceso, es posible introducir secuencias de ADN sintetizadas químicamente y de esta manera la variación objetivo para definir los lugares en el gen cuya secuencia ADN es conocida (Crameri et al., Biotechniques, 18: 194-196, 1995). Stemmer y colaboradores desarrollaron este método in vitro que se asemeja al proceso de evolución normal de la proteína en la naturaleza. El barajar el ADN genera diversidad por recombinación, combinando mutaciones útiles de genes individuales. Ha sido utilizado exitosamente para la evolución artificial de diferentes proteínas, por ejemplo, enzimas y citoquinas (Chang et al. Nature Biotech 17, 793-797, 1999; Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4504-4509,1997; Christians et al. Nature Biotech. 17, 259-264, 1999). Los genes son fragmentados aleatoriamente usando ADNasa I y entonces reensamblados por recombinación con cada otro. El material de partida puede ser o un gen simple (mutado primero aleatoriamente usando la tendencia al error (PCR) o secuencias homólogas que surgen naturalmente (también llamadas barajeo de familia). La ADNasa I hidroliza el ADN preferentemente en los sitios adyacentes a los nucleótidos pirimidina, por lo tanto es una selección adecuada para la fragmentación aleatoria del ADN. Sin embargo, la actividad es dependiente de los iones Mg o Mn, los iones Mg restringen el tamaño del fragmento a 50 bp, mientras que los iones Mn darán tamaños de fragmentos menores que 50 bp. Por lo tanto, para obtener todos los tamaños posibles para la recombinación el gen en cuestión necesita ser tratado al menos dos veces con ADNasa I en presencia de cualquiera de los dos iones diferentes, seguida por la remoción de esos mismos iones.

Un método adicional para generar una colección de ADN recombinante, usando fragmentos de ADN de cadena sencilla unidireccional, se describe en WO 02/38757.

En teoría, es posible barajar ADN entre cualquiera de los clones. Sin embargo, si el gen barajado resultante debe ser funcional con respecto a expresión y actividad, los clones a ser barajados tienen que ser preferiblemente relacionados o hasta idénticos, con la excepción de un bajo nivel de mutaciones aleatorias. Barajar el ADN entre clones genéticamente diferentes producirá generalmente genes no funcionales. Sin embargo, ha sido comprobado por la metodología ITCHY que las colecciones de fusión inter-especie pueden ser creadas entre fragmentos de la E. coli y los genes humanos transformilasa ribonucleótido glicinamida, los cuales tienen solamente el 50 % de identidad en el nivel de ADN (Ostermeier et al., Nat Biotechnol 17, 1205-9, 1999).

Una recombinación exitosa de dos genes diferentes requiere la formación de moléculas heterodobles. En algunos casos de familias barajadas casi solamente forman homo-dúplex como resultado de una recombinación de baja frecuencia. Este problema puede ser dirigido por el uso de ADN de cadena sencilla asimilado por ADNasa I (Kikuchi et al. Gene 243,133-137 2000).

El ADN de filamento simple puede ser obtenido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las bases biotinilatadas pueden ser usadas en las reacciones PCR en combinación con, por ejemplo, Dynabeads (Dynal, Norway) or AffiniTip Streptavidin Capture Micro-columns (Genosys Biotechnologies Inc., The Woodlands, USA). Alternativamente, el ADN de filamento simple puede ser obtenido por la utilización de bacteriófagos que son capaces de empacar el ADN de cadena sencilla (Viruses and Related Entities in Modem Microbiology, Principles and Applications pp.171-192, Ed. E.A. Birge, Wm. C. Brown Publishers1992; Sambrook et al. Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989). En adición, pueden ser usados los métodos asimétricos de PCR (ver Ejemplo 1).

La selección de enzimas con propiedades alteradas y perfeccionadas está a menudo basada en la función real de la enzima. Por ejemplo, el incremento de la termo estabilidad de una enzima puede ser seleccionada por medio de la incubación de colonias transformadas a temperaturas que causan inactivación de tipos de enzimas descontroladas. En adición, la actividad perfeccionada de -glucosidasa puede ser identificada por el uso de PNPG como el sustrato (Arrizubieta et al J Biol Chem Jun 27, 2000).

La selección de proteínas funcionales desde las colecciones moleculares ha sido revolucionada por el desarrollo de la tecnología de exposición de bacteriofagia (Parmley et al., Gene, 73: 305-391 1988; McCafferty et al., Nature, 348: 552-554, 1990; Barbas et al., PNAS. USA, 88: 7978-7982, 1991). Aquí, el fenotipo (proteína) está directamente vinculado a su correspondiente genotipo (DNA) y esto permite controlar la clonación del material genético, el cual puede entonces ser sometido a modificaciones adicionales para perfeccionar la función proteica. La bacterofagia ha sido usada para clonar bandas funcionales de una variedad de colecciones moleculares con hasta 1011 transformaciones en tamaño (Griffiths et al., EMBO. J. 13: 3245-3260, 1994). De esta forma, la bacterofagia puede ser usada para clonar directamente bandas funcionales de colecciones moleculares, y puede ser usada para perfeccionar además los clones originalmente seleccionados. Otro tipo de virus que han sido usados para la expresión de superficie de colecciones de proteínas y las selecciones de las mismas son baculovirus (Boublik et al Biotechnol 13:1079-1084. 1995; Mottershead et al Biochem Biophys Res Com 238:717-722, 1997; Grabherr et al Biotechniques 22:730-735, 1997) y retrovirus (Buchholz et al Nature Biotechnol 16:951-954, 1998).

La selección de proteínas funcionales de las colecciones moleculares puede también ser realizada por medio de la exposición de la superficie de la célula. También aquí, el fenotipo está directamente vinculado a su correspondiente genotipo. La exhibición de la superficie de la célula bacteriana ha sido usada para, por ejemplo, el filtrado de las variantes perfeccionadas de la celulasa carboximetil (CMCase) (Kim et al Appl Environ Microbiol 66:788-93, 2000). Otras células que pueden ser usadas para este propósito son las células de levadura (Boder and Wittrup Nat. Biotechnol 15:553-557, 1997), células COS (Higuchi et al J Immunol Meth 202:193-204, 1997) y células de insectos (Granzerio et al J Immunol Meth 203:131-139, 1997; Ernst et al Nucleic Acids Res 26:1718-1723, 1998).

La combinación aleatoria de ADN de diferentes clones mutados en combinación con la selección de la función deseada es una forma más eficiente para buscar a través de espacio de secuencia comparada a la selección secuencial y combinación de los clones seleccionados.

La presente invención busca facilitar métodos perfeccionados para el desarrollo in vitro de la proteína. En particular, la invención apunta a facilitar una más eficiente recombinación y métodos de barajar, los cuales darán lugar a más moléculas alteradas y por ello mejorar la probabilidad de encontrar moléculas con las propiedades deseables.

De acuerdo a un primer aspecto de la presente invención, se ha facilitado un método para la generación de una secuencia polinucleótida o una población de secuencias de secuencias progenitoras polinucleótidas de cadena sencilla (ss) codificando una o más motivos proteicos, que comprende los pasos de:

a) facilitar una primera población de moléculas polinucleótidas de cadena sencilla y una segunda población de moléculas polinucleótidas de cadena sencilla, la primera y la segunda poblaciones juntas constituyen filamentos positivos y negativos de las secuencias polinucleótidas progenitoras;

b) llevar a cabo una reacción para asimilar la primera y la segunda poblaciones de moléculas polinucleótidas de cadena sencilla con una exonucleasa para generar las correspondientes poblaciones de fragmentos de polinucleótidos de cadena sencilla;

c) conectar dichos fragmentos generados desde las cadenas positivas con los fragmentos generados desde las cadenas negativas y opcionalmente, adicionar las secuencias bases que se hibridan a los extremos 3’ y 5’ de al menos uno de los polinucleótidos progenitores bajo condiciones de hibridación;

d) amplificar los fragmentos que se hibridan uno a otro para generar al menos una secuencia polinucleótida codificando uno o más motivos proteicos que tienen características alteradas comparadas a uno o más motivos proteicos codificados por dicho polinucleótido progenitor,

en donde, en el paso (b), al menos un parámetro de la reacción usada para la asimilación de la primera población de moléculas polinucleótidas de cadena sencilla es diferente de los parámetros equivalentes usados en la reacción para la asimilación de la segunda población de moléculas polinucleótidas de cadena sencilla.

De esta forma, la invención facilita un método para generar una variante de polinucleótidos o una población de variantes de las secuencias de polinucleótidos de cadena sencilla progenitoras.

El uso de diferentes parámetros de la reacción usada para la asimilación de la primera y la segunda poblaciones de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla facilitan la ventaja de la variabilidad incrementada en la variante de polinucleótidos producida por el método de la invención.

Preferiblemente, las moléculas polinucleótidas del paso (a) son moléculas de ADN.

Por “correspondientes poblaciones de fragmentos de polinucleótidos de cadena sencilla” queremos decir la población de fragmentos producidas por la asimilación de la primera y segunda poblaciones de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla con una exonucleasa.

Por “parámetro equivalente” queremos decir el mismo parámetro usado en la reacción para asimilación de la otra población de moléculas polinucleótidas de cadena sencilla. Por ejemplo, la exonucleasa usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla puede diferir de la exonucleasa usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

Por “exonucleasa” queremos decir un polipéptido, por ejemplo, enzima o fragmento de ella, que tiene actividad exonucleótica. Preferiblemente, la actividad exonucleótica del polipéptido es mayor que la actividad endonucleótica del polipéptido. Más preferiblemente, el polipéptido tiene actividad exonucleótica pero es substancialmente libre de actividad endonucleótica.

Ventajosamente, el parámetro de la reacción de asimilación que difiere es seleccionado del tipo exonucleasa, de la concentración de exonucleasa, del volumen de reacción, de la duración de la reacción de asimilación, de la temperatura de la mezcla de reacción, del pH de la mezcla de reacción, de la longitud de las secuencias de los polinucleótidos de cadena sencilla progenitoras, de la cantidad de moléculas polinucleótidas de cadena sencilla y de la composición tampón de la mezcla de reacción.

En una realización preferida del método del primer aspecto de la invención, la exonucleasa usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la exonucleasa usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla. Preferiblemente, la exonucleasa usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es una exonucleasa 3’ (o sea el cual preferencialmente o exclusivamente remueve nucleótidos del terminal 3’ de polinucleótidos ss) y la exonucleasa usada para la asimilación de la segunda población de moléculas polinucleótidas de cadena sencilla es una exonucleasa 5’ (o sea la cual preferencialmente o exclusivamente remueve nucleótidos del terminal 5’ de los polinucleótidos ss) .

En una realización ulterior del método del primer aspecto de la invención, la concentración de exonucleasa usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la concentración de exonucleasa usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

En una realización ulterior del método del primer aspecto de la invención, el volumen de reacción usado para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente del volumen de reacción usado para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

En una realización ulterior del método del primer aspecto de la invención, la duración de la reacción de asimilación usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la duración de la reacción de asimilación usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

En una realización ulterior del método del primer aspecto de la invención, la temperatura de la mezcla de reacción usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la temperatura de la mezcla de reacción usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

En una realización ulterior del método del primer aspecto de la invención, el pH de la mezcla de reacción usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente del pH de la mezcla de reacción usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

En una realización ulterior del método del primer aspecto de la invención, la longitud de los polinucleótidos de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la longitud de la segunda población de polinucleótidos de cadena sencilla.

En una realización del método del primer aspecto de la invención, la composición tampón de la mezcla de reacción usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la composición tampón de la mezcla de reacción usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple.

En una realización ulterior del método del primer aspecto de la invención, la cantidad de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla en la primera población de moléculas de cadena sencilla es diferente de la cantidad de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla en la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

En una realización ulterior del método del primer aspecto de la invención, la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla constituye las cadenas positivas de la secuencia de polinucleótidos progenitores y la segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamentos simples constituye las cadenas negativas de la secuencia de polinucleótidos progenitores.

Convenientemente, el paso c) además comprende el engrosamiento de las primeras secuencias que se hibridan a las terminaciones 3’ y/o 5’ de al menos uno de los polinucleótidos progenitores bajo condiciones de hibridación.

De esa manera, la invención facilita un método para combinar fragmentos de polinucleótidos para generar una secuencia de polinucleótidos o poblaciones de secuencias de las características deseadas, cuyo método comprende los pasos de:

a) la asimilación lineal de un polinucleótido de cadena sencilla progenitor codificando uno o más motivos proteicos con una nucleasa distinta de la ADNasa I para generar una población de fragmentos de cadena sencilla de variadas longitudes;

b) el ensamblaje de una secuencia de polinucleótidos de las secuencias derivadas del paso (a).

Preferentemente el método además comprende el paso (c) que expresa la proteína codificada resultante de la secuencia de polinucleótidos ensamblada y d) filtrado de la proteína para las características deseadas.

Por el control de los parámetros de la reacción de asimilación de la exonucleasa, el tamaño de los fragmentos de polinucleótidos puede ser controlado. La determinación de las longitudes de los fragmentos de los polinucleótidos en esta forma evita la necesidad de tener que proporcionar un paso más tal como la purificación de fragmentos de la longitud deseada de un gel.

Con el propósito de generar una secuencia de polinucleótidos de características deseadas los polinucleótidos progenitores que codifican uno o más pmotivos proteicos pueden ser sometidas a mutagénesis para crear una pluralidad de diferentes derivados mutados de lo mismo. De igual modo, un polinucleótido progenitor puede ser ya obtenido codificando una plularidad de variantes de motivos proteicos de secuencia desconocida.

La mutación aleatoria puede ser realizada por cualquier método convencional como se describió con anterioridad, pero un método conveniente es el de con tendencia al error PCR.

Es preferible usar la tecnología PCR para ensamblar los fragmentos de polinucleótidos de cadena sencilla en una secuencia de polinucleótidos de filamentos dobles (ds).

La secuencia de polinucleótidos es preferiblemente de ADN aunque puede ser usada de RNA. Para simplificar el término polinucleótido será usado de ahora en adelante en el texto en relación con el ADN pero se apreciará que la presente invención es aplicable a ambos RNA y ADN.

Preferiblemente, cualquier exonucleasa que asimile polinucleótidos desde el terminal primario 5’ al terminal primario 3’, desde el terminal 3’ hasta el terminal 5’ o desde ambos terminales 3’ y 5’ pueden ser usados. Ejemplos de exonucleasas apropiadas que pueden ser usadas de acuerdo con la presente invención incluyen BAL 31, exonucleasa I, exonucleasa V, exonucleasa VII, exonucleasa T7 gen 6, bacteriófago lambda exonucleasa y exonucleasa Rec Jf.

El uso de la nucleasa BAL 31 en el proceso de barajar el ADN de la invención facilita un sistema rápido, fácil y controlable. Esta enzima puede dar todos los tamaños de fragmentos de gen y la actividad de la enzima puede ser fácilmente controlada deteniendo la asimilación en varios puntos temporales. BAL 31 es predominantemente una exonucleasa primaria 3’ que remueve mononucleótidos de ambos terminales 3’ de los dos filamentos de un ADN lineal. BAL 31 es también una endonucleasa; así el ADN de cadena sencilla generado por la actividad de la exonucleasa primaria 3’ es degradado por la endonucleasa. La actividad de la exonucleasa primaria 3’ de la enzima trabaja alrededor de 20 veces más eficientemente que la endonucleasa. Las concentraciones de enzimas son por eso importantes para los fragmentos de ADN obtenidos. La alta concentración de enzima favorece el ADN sin puntas ya que a bajas concentraciones los terminales de ADN de cadena sencilla pueden ser muy largos. BAL 31 consiste de dos formas de la enzima cinéticamente distintas, una forma rápida (F) y una forma lenta (S). La forma S es un producto de degradación proteolítica de la forma F. Además, BAL 31 trabaja asincrónicamente, generando una población de moléculas de ADN cuyos terminales han sido resecados a varias extensiones y cuyas colas de cadena sencilla varían en longitud. Ambas formas pueden actuar sobre el ssADN en forma exonucleolítica de una manera altamente progresiva. La dirección del ataque es desde el terminal 5’, en

contraste con el modo de asimilación del ADN doble. Ha sido sugerido que las moléculas de nucleasa son no productivamente separadas de los terminales 5’ y experimentan una difusión facilitada y para producir complejos de sustratos de enzimas (Lu T and Gray jr. HB Biochimica et Biophysica Acta 1995, vol. 1251, p125-138). La enzima usa Ca2+ como un cofactor que puede ser ligado en un compuesto con EGTA (Ethylene Glycol bis ( -amino ethyl Ether) N,N,N’,N’ - ácido tetra acético). Las secuencias de ADN lineal son asimiladas con BAL31 y la reacción detenida a diferentes puntos temporales por la adición de EGTA.

Los fragmentos individuales asimilados son purificados, mezclados y reensamblados con tecnología PCR. El gen ensamblado (reconstituido) puede ser entonces clonado en un vector de expresión para expresar la proteína. La proteína puede entonces ser analizada para mejorar las características.

El método de la presente invención facilita varias ventajas sobre las técnicas de barajar conocidas, incluyendo índices incrementados de recombinación, variablidad incrementada y control del tamaño del fragmento.

El método de la presente invención produce un conjunto de fragmentos de ADN progresivamente acortados para cada punto temporal en que una muestra de ADN es tomada del tratamiento BAL 31. Las muestras de ADN pueden ser recolectadas y combinadas u, opcionalmente, las muestras individuales pueden ser seleccionadas y usadas en el método. De esta forma la presente invención permite una selección de cuáles muestras serán usadas en el sistema de recombinación y por ello ofrece un adicional grado de control.

El método de la presente invención puede ser realizado sobre cualquier polinucleótido que codifique para un producto particular, por ejemplo cualquier proteína que tenga propiedades de enlace o catalíticas por ejemplo, anticuerpos o partes de anticuerpos, enzimas o receptores. Además, cualquier polinucleótido que tiene una función que puede ser alterada, tal como el ADN catalítico, puede ser barajado de acuerdo a la presente invención. Es preferible que el polinucleótido progenitor que codifica uno o más motivos proteicos sea de al menos 12 nucleótidos en longitud, más preferiblemente de más de 50 nucleótidos en longitud. Los polinucleótidos que sean de al menos de 100 nucleótidos en longitud o incluso de al menos 200 nucleótidos en longitud pueden ser usados. Donde los polinucleótidos progenitores son usados que codifiquen proteínas extensas tales como las enzimas o los anticuerpos, estos pueden ser muchos cientos o miles de bases en longitud. La presente invención puede ser realizada sobre cualquier tamaño de polinucleótido progenitor.

La presente invención también suministra secuencias de polinucleótidos generadas por el método descrito anteriormente que tienen las carácterísticas deseadas. Estas secuencias pueden ser usadas para la generación de vectores de terapia de gen y la replicación de constructores de gen defectuoso o vectores de vacunación para vacunaciones basadas en ADN. Además, las secuencias de polinucleótidos pueden ser usadas como herramientas de investigación.

La presente invención también suministra una colección de secuencias de polinucleótidos generadas por el método descrito anteriormente desde el cual un polinucleótido puede ser seleccionado el cual codifica una proteína que tiene las características deseadas. Es preferible que la colección de polinucleótidos sea una colección de ADN o cDNA.

La presente invención también suministra proteínas tales como enzimas, anticuerpos, y receptores que tienen características diferentes a aquéllas de tipo descontrolado producidas por el método descrito anteriormente. Estas proteínas pueden ser usadas individualmente o dentro de un portador farmacéuticamente aceptable como las vacunas o medicamentos para terapia, por ejemplo, como los inmunógenos, los antígenos o en caso contrario en la obtención de anticuerpos específicos. Ellos pueden ser usados también como herramientas de investigación.

Las características deseadas de un polinucleótido generado por la presente invención o una proteína codificada por un polinucleótido generado por la presente invención pueden ser cualquier variación o alteración en la actividad normal de un polinucleótido de tipo descontrolado (progenitor) o el polipéptido, la proteína,

o las motivos proteicos que codifica. Por ejemplo, puede ser deseable reducir o incrementar la actividad catalítica de una enzima, o mejorar o reducir la especificidad de enlace de un anticuerpo. Además, si la proteína o el polinucleótido es un inmunógeno, puede ser deseable reducir o incrementar su habilidad para obtener anticuerpos específicos contra él.

El polinucleótido progenitor preferiblemente codifica uno o más motivos proteicos. Éstas son definidas como regiones o elementos de secuencia polinucleótida que codifican una secuencia polipéptida (o sea, amino ácido) la cual tiene, o potencialmente tiene, función proteica característica. Por ejemplo, una pmotivo proteico puede definir una porción de una proteína completa, tales como un epitope, un sitio de hendidura o un sitio catalítico, etc. Sin embargo, dentro del alcance de la presente invención, una pmotivo proteico expresada no tiene que mostrar actividad, o ser “correctamente” duplicada.

Varias bases de datos explorables de motivos proteicos y potenciales motivos proteicos están disponibles, tales como MOTIF, PROSITE, SMART y BLOCKS (www.blocks.fhcrc.org).

Puede ser deseable modificar una proteína así como alterar la conformación de ciertos epitopes, de ese modo mejorando su antigenicidad y/o reduciendo su reactividad cruzada. Por ejemplo, debería tal proteína ser usada como un antígeno, la modificación puede reducir cualquier reacción cruzada de anticuertpos surgidos con proteínas similares.

Aunque el término “enzima” es usado, este debe ser interpretado como también incluyendo cualquier polipéptido que tenga actividad como enzima, o sea, una función catalítica. Por ejemplo, los polipéptidos que forman parte de una enzima pueden todavía poseer función catalítica. Además, las proteínas tales como el interferón y las citoquinas están incluidas. De igual modo, el término “anticuerpo” debe ser interpretado como cubriendo cualquier sustancia aglutinante que tiene un dominio aglutinante con la especificidad requerida. Esto incluye fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuyas formas semejan esas de anticuerpo habilitándolas para enlazar un antígeno

o epitope. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo, capaces de enlazar un antígeno u otra pareja de enlace son los fragmentos Fab que consisten de los dominios VL, VH, Cl y CH1, el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo simple de un anticuerpo; el fragmento dAb el cual consiste del dominio VH; las regiones aisladas CDR y fragmentos F(ab’)2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfida en la región de vínculo. Fragmentos Fv de cadena simple están también incluidos.

Con el objeto de obtener expresiones de la secuencia polinucleótida generada, la secuencia puede ser incorporada en un vector que tiene secuencias de control operablemente enlazadas a la secuencia polinucleótida para controlar su expresión. Los vectores pueden incluir otras secuencias tales como promotoras o aceleradores para conducir la expresión de la secuencia polinucleótida insertada, ulteriores secuencias polinucleótidas de tal forma que la proteína codificada por el polinucleótido es producida como una fusión y/o señales de secreción codificadora de ácido nucleico de tal forma que la proteína producida en la célula hospedera es secretada desde la célula. La proteína codificada por la secuencia polinucleótida puede ser entonces obtenida por la transformación de los vectores dentro de las células hospederas en las cuales el vector es funcional, cultivando las células hospederas de modo que la proteína es producida y recuperando la proteína de las células hospederas o del medio circundante. Las células procarióticas y eucarióticas son usadas para este propósito en la técnica, incluyendo cadenas de E. coli, levadura, y células eucarióticas tales como las células COS o CHO. La selección de la célula hospedera puede ser usada para controlar las propiedades de la proteína expresada en esas células, por ejemplo, controlando donde la proteína es depositada en las células hospederas o afectando propiedades tales como su gicosilación.

La proteína codificada por la secuencia de polinucleótidos puede ser expresada por métodos bien conocidos en la técnica. Convenientemente, la expresión puede ser obtenida por el crecimiento de una célula hospedera en cultivo, que conteniene tal vector, bajo condiciones apropiadas la cual causa o permite la expresión de la proteína.

Los sistemas para clonación y expresión de una proteína en una variedad de diferentes células hospederas son bien conocidos. Las células hospederas adecuadas incluyen bacterias, células eucarióticas tales como las mamíferas y levaduras, y sistemas de baculovirus. También, la utilización del sistema de retrovirus para la clonación y expresión es una buena alternativa, ya que este virus puede ser usado junto con un número de tipos de células. Las líneas de células de mamíferos disponibles en la técnica para expresión de un polipéptido heterólogo incluye células de ovarios de hamsters chinos, células HeLa , células de riñón de crías de hamster, células COS y muchas otras. Un común, preferido hospedero bacterial es E. coli.

Los vectores adecuados pueden ser escogidos o construidos, conteniendo las apropiadas secuencias regulatorias, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos exterminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias aceleradoras, genes marcadores y otras secuencias apropiadas. Para más detalles ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de secuencias polinucleótidas, por ejemplo, en la preparación de construcciones polinucleótidas, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN dentro de las células y expresión de gen, y el análisis de proteínas, son descritos en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

El sistema puede ser usado para la creación de colecciones de ADN que abarcan secuencias variables las cuales pueden ser filtradas para la función proteica deseada en un número de maneras. La función enzima puede ser filtrada para con métodos específicos para la función enzima real por ejemplo, actividad CMCase, actividad -glucosidasa, y también termoestabilidad. Además, la exhibición de bacteriófago y la exhibición de la superficie de la célula pueden ser usadas para filtrar por la función enzima (Crameri A. et al., Nature 1998 15; 391 (6664): 288-291; Zhang J. H. et al., PNAS. USA 1997 94 (9): 4504-4509; Warren M.S. et al., Biochemistry 1996, 9; 35(27): 8855-8862; Kim et al ., Appl Environ Microbiol 66:788-93, 2000) así como por las propiedades de enlace alteradas de, por ejemplo, de anticuerpos (Griffith et al., EMBO J. 113: 3245-3260, 1994).

Una proteína suministrada por la presente invención puede ser usada en el filtrado de moléculas que afectan o modulan su actividad o función. Tales moléculas pueden ser útiles en un contexto (posiblemente incluyendo profiláctico) terapéutico.

La presente invención también suministra vectores que abarcan secuencias polinucleótidas generadas por el método descrito anteriormente.

La presente invención también suministra composiciones que abarcan cualesquiera secuencias polinucleótidas, vectores que abarcan secuencias polinucleótidas o proteínas generadas por el método descrito anteriormente y un portador aceptable farmacéuticamente o un portador adecuado para propósitos de investigación.

La presente invención además suministra un método que abarca, siguiendo la identificación del polinucleótido o polipéptido que tiene las características deseadas por el método descrito anteriormente, la

fabricación de ese polipéptido o polinucleótido completo o en parte, opcionalmente en conjunto con polipéptidos o polinucleótidos adicionales.

De esta manera, un aspecto adicional de la invención suministra un método de creación de un polipéptido que tiene las propiedades deseadas, el método abarca los siguientes pasos:

(a)

la generación de formas variantes de un polinucleótido progenitor usando un

método de acuerdo al primer aspecto de la invención;

(b)

la expresión de los polinucleótidos variantes producidos en el paso (a) para

producir polipéptidos variantes;

(c)

el filtrado de polipéptidos variantes para las propiedades deseadas y

(d)

la selección de un polipéptido que tiene las propiedades deseadas de polipéptidos

variantes.

La invención además suministra un polipéptido obtenido por el método anterior.

Siguiendo la identificación de un polinucleótido o polipéptido que tiene las características deseadas, éstos pueden ser creados para suministrar mayores números por las bien conocidas técnicas tales como PCR, clonación y expresión dentro de una célula hospedera.

Los polipéptidos o polinucleótidos resultantes pueden ser usados en la preparación de enzimas industriales, por ejemplo, enzimas detergentes de lavandería donde una actividad incrementada es preferible a bajas temperaturas. Alternativamente, el polinucleótido o polipéptido creado puede ser usado como una herramienta de investigación, o sea, los anticuerpos pueden ser usados en inmunoensayos, y los polinucleótidos pueden ser usados como sensores de hibridización o bases. Alternativamente, los polipéptidos o polinucleótidos resultantes pueden ser usados en la preparación de medicamentos para uso diagnóstico, el uso farmacéutico, la terapia, etc., como es abordado como sigue.

Los polipéptidos o polinucleótidos generados por los métodos de la invención e identificados como que tienen las características deseables pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden abarcar, además de una de las sustancias anteriores, un excipiente aceptable farmacéuticamente, un portador, un tampón, un estabilizador u otros materiales bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Tales materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material puede depender de la ruta de administración, por ejemplo, las rutas oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular e intraperitoneal.

Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden ser en tableta, cápsula, forma de polvo o líquida. Una tableta puede incluir un portador sólido tal como la gelatina o un ayudante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un portador líquido tal como el agua, el petróleo, los aceites animales o vegetales, el aceite mineral o el aceite sintético. La solución salina fisiológica, la dextrosa u otra solución sacárida o los glicoles tales como el etilen glicol, el propilen glicol o el polietilen glicol pueden ser incluidos.

Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o la inyección en el sitio de la afección, el ingrediente activo será en forma de una solución acuosa aceptable parenteralmente la cual está libre de pirógeno y tiene pH, isotonicidad y estabilidad aceptables. Aquellos relevantes expertos en la técnica están bien capacitados para preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como la Inyección de Cloruro de Sodio, la Inyección Ringer, la Inyección Lactato de Ringer. Los preservativos, los estabilizadores, los tampones, los antioxidantes y/o otros aditivos pueden ser incluidos como se requieran.

De esta forma, la invención además suministra un polipéptido producido por los métodos de la invención para uso en medicina y el uso suministra un polipéptido producido por los métodos de la invención en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento, la terapia y/o el diagnóstico de una enfermedad.

Si es un polipéptido, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo, una enzima, un polinucleótido, o una molécula de ácido nucleico, identificado siguiendo la generación por la presente invención que es para ser dado a un individuo, la administración es preferiblemente en una “cantidad efectiva profilácticamente” o en una “cantidad efectiva terapéuticamente” (como el caso puede ser, aunque la profilaxis puede ser considerada terapia), siendo esto suficiente para evidenciar beneficio al individuo. La cantidad real administrada, y el índice y el tiempo de curso de la administración, dependerán de la naturaleza y la severidad de lo que está siendo tratado. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones de la dosificación, etc., están dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros doctores en medicina, y típicamente toman en cuenta la enfermedad a ser tratada, la condición del paciente individual, el sitio de entrega, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. Ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden ser encontrados en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980.

Alternativamente, las terapias de objetivo pueden ser usadas para entregar el agente activo más específicamente a ciertos tipos de células, por el uso de sistemas destinados tales como el anticuerpo o las

coordinaciones específicas celulares. El objetivo puede ser deseable por una variedad de razones, por ejemplo, si el agente es inaceptablemente tóxico, o si de otra forma requeriría una dosificación demasiado alta, o si de otra forma no sería capaz de entrar en las células objetivo.

En vez de administrar estos agentes directamente, ellos podrían ser producidos en las células objetivo por expresión desde un gen codificado introducido en las células, por ejemplo, en un vector viral (una variante de la técnica VDEPT, o sea, el agente activante, por ejemplo, una enzima, es producida en un vector por expresión desde una codificación de ADN en un vector viral). El vector puede ser destinado a las células específicas para ser tratadas, o podría contener elementos regulatorios los cuales son intercambiados con más o menos selectividad por las células objetivo.

Alternativamente, el agente podría ser administrado en una forma precursora, para la conversión a la forma activa por un agente activante producido en, o destinado a, las células a ser tratadas. Este tipo de aproximación es a veces conocido como ADEPT o VDEPT; la antigua implica destinar el agente activante a las células por la conjugación a un anticuerpo celular específico, mientras que la más reciente implica la producción del agente activante, por ejemplo, una enzima, en un vector por expresión desde la codificación de ADN en un vector viral (ver por ejemplo, EP-A-415731 y WO 90/07936).

Una composición puede ser administrada sola o en combinación con otros tratamientos, ambos simultáneamente o secuencialmente en dependencia de la condición a ser tratada.

Como una alternativa adicional, el polinucleótido identificado como que tiene las características deseables siguiendo la generación por el método de la presente invención podría ser usado en un método de terapia de gen, para tratar a un paciente que no es capaz de sintetizar el polipéptido activo codificado por el polinucleótido o no es capaz de sintetizarlo a un nivel normal, por esa razón causando el efecto deparado por la proteína de tipo descontrolado.

Vectores tales como vectores virales han sido usados en la técnica anterior para introducir polinucleótidos dentro una amplia variedad de diferentes células objetivo. Típicamente los vectores son expuestos a las células objetivo de modo tal que la transfección puede tomar lugar en una proporción de células para suministrar una terapéutica útil o efecto profiláctico desde la expresión del polipéptido deseado. El ácido nucleico transfectado puede ser permanentemente incorporado dentro del genoma de cada célula tumoral objetivo, causando un efecto duradero, o alternativamente el tratamiento puede tener que ser repetido periódicamente.

Una variedad de vectores, tanto vectores virales como vectores plásmidos, son conocidos en la técnica, ver US Patent No. 5,252,479 y WO93/07282. En particular, un número de virus han sido usados como vectores de transferencia de gen, incluyendo papovavirus, tales como el SV40, el vaccinia virus, el herpes virus, incluyendo HSV y EBV, y el retrovirus. Muchos protocolos de terapia de genes en la técnica anterior han usado los retrovirus murina deshabilitados.

Como una alternativa para el uso de vectores virales los métodos conocidos de introducción de ácido nucleico dentro de las células incluyen la electroporación, la co-precipitación de fosfato de calcio, las técnicas mecánicas tales como la microinyección, la trasferencia mediada por liposomas y la incorporación directa de ADN y la transferencia de ADN receptor-mediado.

Como se mencionó anteriormente, el propósito de la terapia de gen usando ácido nucleico que codifica a un polipéptido, o una porción activa del mismo, es incrementar la cantidad de la expresión producto del ácido nucleico en las células en las cuales el nivel de polipéptido del tipo descontrolado está ausente o presente solamente en niveles reducidos. Tal tratamiento puede ser terapéutico en el tratamiento de células las cuales son ya cancerosas o profiláctico en el tratamiento de individuos conocidos a través del filtrado que tienen una susceptibilidad alela y por lo tanto una predisposición a, por ejemplo, el cáncer.

La presente invención también proporciona un equipo para generar una secuencia polinucleótida o una población de secuencias de características deseadas que abarcan reactivos para la preparación de ssADN, una exonucleasa y componentes para realizar una técnica PCR, por ejemplo, ADN termoestable (nucleótidos) y dispositivo de detención, por ejemplo, EGTA.

Como se esbozó anteriormente la presente invención convenientemente facilita para la creación de secuencias de gen enzima mutado y sus combinaciones aleatorias a enzimas funcionales que tienen características deseables. Como un ejemplo de este aspecto de la invención, los genes enzimas son mutados por tendencia al error PCR la cual resulta en un índice de mutación de aproximadamente el 0.7 %. El conjunto resultante de genes enzima mutados son entonces asimilados con una exonucleasa, por ejemplo, BAL 31, y la reacción inhibida por la adición de EGTA o por inactivación por calor a diferentes puntos de tiempo, resultando en un conjunto de fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Estos pueden ser entonces ser sometidos a reagrupación basade en PCR como se describió anteriormente. Los fragmentos de ADN reagrupados resultantes son entonces clonados y una colección de genes se construye. Los clones pueden entonces ser seleccionados de esta colección y secuenciados.

Una aplicación adicional de esta tecnología es la generación de una población de secuencias de ADN variables la cual pueden ser usadas para selecciones y análisis adicionales. Por otra parte la codificación de proteínas más grandes, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos y enzimas, el ADN puede codificar péptidos donde las carácterísticas funcionales pueden ser usadas para el diseño de diferentes sistemas de selección. La selección de secuencias ADN recombinado que codifican péptidos ha sido previamente descrita (Fisch et al., PNAS. USA 1996

Jul 23; 93 (15): 7761-7766). Además, la población variable de ADN puede ser usada para producir una población de moléculas RNA con, por ejemplo, actividades catalíticas. Vaish et al., (PNAS. USA 1998 Mar 3; 95 (5): 2158-2162) demostraron el diseño de sistemas funcionales para la selección de RNA catalítico y Eckstein F (Ciba Found. Symp. 1997; 209; 207-212) ha esbozado las aplicaciones del RNA catalítico en las células. El sistema puede ser usado para la investigación adicional a través de espacio de secuencia en la selección de péptidos/moléculas con actividades catalíticas basadas en las secuencias de ADN recombinado.

Los aspectos y realizaciones de la presente invención serán ahora ilustrados, por medio del ejemplo, con referencia a las figuras acompañantes. Los aspectos y las realizaciones adicionales serán apreciables para los expertos en la técnica.

La Figura 1 muestra el principio del método desde la molécula plantilla a la molécula perfeccionada.

La Figura 2 muestra los principales pasos en la preparación de ADN de cadena sencilla usando biotina.

La Figura 3 muestra los principales pasos en la preparación de ADN de cadena sencilla usando bacteriófago.

La Figura 4 muestra los principales pasos para la generación de fragmentos de ADN de cadena sencilla usando tratamiento con exonucleasa.

La Figura 5 muestra los principales pasos para el ensamblaje de fragmentos de ADN de cadena sencilla usando PCR.

La Figura 6 muestra el % de recombinantes formados que tienen una subsiguiente asimilación cruzada de dsADN con 20 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.

La Figura 7 muestra el % de recombinantes formados que tienen dos subsiguientes asimilaciones cruzadas de dsADN con 20 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.

La Figura 8 muestra el % de recombinanes formados que tienen una subsiguiente asimilación cruzada de ssADN con 1.25 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.

La Figura 9 muestra el % de recombinantes formados que tienen dos subsiguientes asimilaciones cruzadas de ssADN con 1.25 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.

La Figura 10 muestra el % de recombinantes formados que tienen una subsiguiente asimilación cruzada de ssADN con 11 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.

La Figura 11 muestra el % de recombinantes formados que tienen dos subsiguientes asimilaciones cruzadas de ssADN con 11 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.

La Figura 12 muestra una imagen de electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la subsiguiente asimilación de 300 ng de ssADN con BAL 31 para 50 minutos (carril 1), 30 minutos (carril 2) y 10 minutos (carril 3). El ssADN no tratado se muestra en el carril 4. Los marcadores del peso molecular son mostrados en el carril 5.

La Figura 13 muestra los cromatogramas de gel correspondientes para el carril 4 en la Figura 12.

La Figura 14 muestra los cromatogramas de gel correspondientes para el carril 3 en la Figura 12.

La Figura 15 muestra los cromatogramas de gel correspondientes para el carril 2 en la Figura 12.

La Figura 16 muestra una imagen de electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con exonucleasa VII para 10 minutos (carril 3), 20 minutos (carril 4) y 30 minutos (carril 5). ). El ssADN no tratado se muestra en el carril 2. Los marcadores del peso molecular son mostrados en el carril 1.

La Figura 17 muestra una imagen de electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con exonucleasa Rec Jf (9 U/mg de ssADN) para 10 minutos (carril 2), 20 minutos (carril 3) y 30 minutos (carril 4). ). El ssADN no tratado se muestra en el carril 1. Los marcadores del peso molecular son mostrados en el carril 5.

La Figura 18 muestra una imagen de electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con exonucleasa Rec Jf (36 U/mg de ssADN) para 10 minutos (carril 3), 20 minutos (carril 4) y 30 minutos (carril 5). El ssADN no tratado se muestra en el carril 2. Los marcadores del peso molecular son mostrados en los carriles 1 y 6.

La Figura 19 muestra una imagen de electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con ADNasa I (0.15 U enzima/mg de ADN). Los carriles de muestreo fueron como sigue:

Carril 1: Marcadores de peso molecular

Carril 2: ssADN no tratado en tampón de Mg Carril 3: ssADN fragmentado con ADNasa I en tampón de Mg Carril 4: ssADN no tratado en tampón Mn Carril 5: ssADN fragmentado con ADNasa I en tampón de Mn Carril 6: (vacío) Carril 7: (vacío) La Figura 20 muestra una imagen de electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la

subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con ADNasa I. Los carriles de muestreo fueron como sigue:

Carril 1: Marcadores de peso molecular

Carril 2: dsDNA no tratado en tampón de Mg

Carril 3: dsDNA no tratado en tampón de Mg

Carril 4: ssADN no tratado (filamento anterior) en tampón de Mg

Carril 5: ssADN no tratado (filamento anterior) en tampón de Mg

Carril 6: ssADN no tratado (filamento posterior) en tampón de Mg

Carril 7: ssADN no tratado (filamento posterior) en tampón de Mg

Carril 8: dsDNA fragmentado con ADNasa I (0.24 U enzima/mg de ADN) en tampón de Mg

Carril 9: dsDNA fragmentado con ADNasa I (1.3 U enzima/mg de ADN) en tampón de Mg

Carril 10: ssADN no tratado (filamento anterior) con ADNasa I (0.24 U enzima/mg de ADN) en tampón de

Mg

Carril 11: ssADN no tratado (filamento anterior) con ADNasa I (1.3 U enzima/mg de ADN) en tampón de Mg

Carril 12: ssADN no tratado (filamento posterior) con ADNasa I (0.24 U enzima/mg de ADN) en tampón de

Mg Carril 13: : ssADN no tratado (filamento posterior) con ADNasa I (1.3 U enzima/mg de ADN) en tampón de

Mg

La Figura 21 muestra los cromatogramas de gel correspondientes para el carril 6 en la Figura 20.

La Figura 22 muestra los cromatogramas de gel correspondientes para el carril 12 en la Figura 20.

La Figura 23 muestra los cromatogramas de gel correspondientes para el carril 13 en la Figura 20.

La Figura 24 muestra una imagen de electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la

subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con nucleasa de frijol Mung.

Los carriles de muestreo fueron como sigue:

Carril 1: ssADN no tratado en tampón de Mg

Carril 2: ssADN fragmentado con nuclease de frijol Mung por 10 minutos

Carril 3: Marcadores de peso molecular

La Figura 25 muestra el efecto de la duración de la fragmentación sobre la frecuencia de recombinación de

genes tet-resistentes siguiendo la fragmentación de ADN de cadena sencilla con (a) BAL 31, (b) Exo I, (c) T7gene6 y

(d) Exo V combinado con Exo I.

La Figura 26 muestra el porcentaje de múltiples cruzamientos generados después del tratamiento con diferentes exonucleasas. La frecuencia de recombinación fue evaluada para a) Exo I tratado ssADN, b) Exo I (10 min tratado ssADN combinado con Exo VII tratado ADN, c) Exo I (10 min tratado ssADN combinado con Exo VII tratado ssADN, y d) Exo I (10 min) tratado ssADN combinado con Exo V y Exo VII tratado ssADN.

La Figura 27 muestra una comparación de los números de recombinaciones observadas subsiguientes a las fragmentaciones de ssADN con una exonucleasa y la fragmentación de dsDNA con una endonucleasa.

EJEMPLOS

El procedimiento de barajar el ADN puede ser ilustrado mediante los pasos mostrados en las Figuras 1 a 5. El gen que codifica la proteína de interés (X) en el plasmídeo pFab5chis es usado en este ejemplo. Las mutaciones aleatorias son introducidas por tendencia al error PCR. El ADN de cadena sencilla es preparado. Esto puede ser realizado por cualesquiera de las bases biotiniladas o por el uso de un bacteriófago capaz de empaquetar ADN de cadena sencilla, como se discutió arriba. La codificación y la decodificación de filamentos ssADN son preparadas en diferentes reacciones (A y B). Los filamentos de ssADN de cualesquiera reacciones son sometidas a tratamientos enzimáticos diferentes usando, por ejemplo, BAL 31. Por la mezcla de dos conjuntos de fragmentos de ADN de cadena sencilla en cantidades equimolares el gen puede ser reensamblado en una naturaleza barajada y en muchas versiones por el uso de dos reacciones PCR subsecuentes, donde la primera reacción no contiene bases. Después de clonar esta colección de genes reensamblados en pY, las selecciones pueden realizarse para lograr la molécula de interés perfeccionada.

Una más detallada descripción de ejemplos de la presente invención está dada debajo.

EJEMPLO 1

Reactivos

La polimerasa AmpliTaq® fue adquirida de Perkin-Elmer Corp., el dNTPs de Boehringer Mannheim Biochemica (Mannheim, Germany), y la nucleasa BAL 31 de New England Biolabs Inc. (Beverly, USA). Todas las enzimas de restricción fueron adquiridas de New England Biolabs Inc. (Beverly, USA). El bromuro de etidio fue adquirido de Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). La ligasa T4 ADN fue adquirida de New England Biolabs Inc. (Beverly, USA). EDTA y EGTA fueron adquiridas de Kebo Lab (Sweden).

Todas las bases fueron diseñadas en el lboratorio y obtenidas de Life Technologies (Täby, Sweden) y SGSDNA (Köping, Sweden).

PCR

Todas las Reacciones en Cadena de Polimerasa (PCR) fueron realizadas en un termociclador automático (Perkin-Elmer Cetus 480, Norwalk, CT, USA). Las técnicas PCR para la amplificación de ácido nucleico están descritas en US Patent No. 4,683,195. Las referencias para el uso general de las técnicas PCR incluyen Mullis et al ., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987), Ehrlich (ed), PCR technology, Stockton Press, NY, 1989, Ehrlich et al., Science, 252:1643-1650, (1991), "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis et al., Academic Press, New York, (1990).

SECUENCIACIÓN

Todas las construcciones han sido secuenciadas por el uso del equipo BigDye Terminator Cycle Sequencing (Perkin-Elmer, US Patent No. 4,683,195 Elmervill, CA, USA). La secuenciación ha sido realizada en un Secuenciador ABI Prism 377 ADN.

ELECTROFORESIS DE AGAR

La electroforesis de agar de ADN fue realizada con el 2 % de geles de agar (AGAROSE (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)) con 0.25 μg/ml de bromuro de etidio en un tampón Tris-acetato (TAE-buffer 0.04M Tris-acetate, 0.001M EDTA). Las muestras para la electroforesis fueron mezcladas con un tampón que carga un antiséptico filtrado compuesto de 25 % de Ficoll y Bromfenólico azul y cargado dentro de pozos en un 2 % de gel de agar. La electroforesis fue activada a 90 V por 45 minutos a menos que de otro modo esté indicado en el tampón Tris-acetato con 0.25 μg/ml de bromuro de etidio. Las bandas de tamaño apropiado fueron purificadas con gel usando el Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) cuando fue necesario. Como marcador de peso molecular estandar, la escala de 1 kb (Gibco BRL) de marcador de peso molecular de ADN fue usada. La concentración de ADN de los productos extraidos de gel fueron estimados usando un espectrofotómetro.

CEPAS BACTERIANAS

La cepa TOP10F’ de Escherichia col i fue usada como hospedero bacteriano para las transformaciones. Las células químicamente competentes de esta cepa fueron producidas básicamente como está descrito en Hanahan, D. 1983; Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557580; Electrocompetent cells of this bacterial strain were produced (Dower, W.J., J. F. Miller and C.W. Ragsdale. 1988; High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16:6127).

PLÁSMIDOS

Todas las manipulaciones genéticas fueron realizadas en pFab5cbis de acuerdo a Molecular cloning; a laboratory manual (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Este vector es diseñado para albergar cualquier gen scFv insertado entre los sitios SfiI y NotI. El sitio Sfil está localizado en el peIB líder y el sitio NotI está localizado justo después de la región VL, tal que el VH-conectador-VL es insertado. En este caso, un anticuerpo tendente a CD40 fue usado.

BASES

Las dos bases biotiniladas que rodean el gen anticuerpo de pFab5chis fueron diseñadas con las secuencias siguientes incluyendo los sitios de restricción única designados: base anterior 1736 SfiI:

y 1735 NotI base posterior: 5’-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT Las dos bases biotiniladas que rodean el gen anticuerpo de pFab5chis fueron diseñadas con las secuencias siguientes incluyendo los sitios de restricción única designados: base anterior 1664 SfiI:

y la base posterior 1635 NotI: 5’-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT PCR ESTANDAR

Las reacciones PCR estandar fueron realizadas a 25 ciclos consistiendo en el perfil siguiente: desnaturalización (94° C, 1 minuto), hibridación de base (55 °C; 1 minuto) y extensión (72 °C, 3 minutos). Cada reacción PCR contenía 10 mM de Tris-HCl, pH 8.3, 50mM de KCl, 1.5mM de MgCl2, 200 μM de dNTP, 1μM de base anterior, 1μM de base posterior, 1.25 U de polimerasa ADN termoestable AmpliTaq® (Perkin-Elmer Corp.), y 50 ng como diseño básico en un volumen de 100 ml.

TENDENCA AL ERROR PCR Las reacciones con tendencia al error PCR fueron realizadas en un tampón 10 X que contiene 500 mM de NaCl, 100 mM de Tris-HCl, pH 8.8, 5mM de MgCl2 , 100 μg de gelatina (de acuerdo con con Kuipers et al., Nucleic Acids Res. 1991, Aug 25;19 (16):4558 pero con una concentración de MgCl2 incrementada de 2 mM a 5 mM.

Para cada 100 μl de reacción se mezcló lo siguiente: dATP 5 mM 5 μl dGTP 5 mM 5 μl dTTP 10 mM 10 μl dCTP 10 mM 10 μl 20 mM 3’ base 1.5 μl 20 mM 5’ base 1.5 μl lOx Kuipers tampón 10 μl antiséptico mp H20 46.3 μl

El diseño básico en el vector pFab5chis fue añadido a una cantidad de 50 ng. 10 ml de 10 mM de MnCl2 fueron añadidos y el tubo fue chequeado para que no ocurriera ninguna precipitación de MnO2. Al menos 5 Unidades de enzima Taq fueron añadidos. La tendencia al error PCR fue realizada a las siguientes temperaturas para 25 ciclos sin un arranque caliente: 94 °C 1’, 45 °C 1’, 7 °C 1’, 72° C para 7 minutos. El producto resultante fue una tendencia al error insertada sobre la proteína de aproximadamente 750 bp. Este inserto fue purificado con el equipo de purificación Gibco PCR, antes del tratamiento ulterior.

GENERACIÓN DE ADN DE CADENA SENCILLA POR BASES BIOTINILADAS El fragmento de interés fue amplificado por dos reacciones PCR separadas. Estas reacciones pueden ser PCR estándar como está descrito arriba o tendencia al error PCR también como se describe arriba. Las bases deben ser diseñadas tal que en una reacción la base anterior es biotinilada y en la otra reacción la base posterior es biotinilada. Por ejemplo, las reacciones PCR con A) bases 1736 y 1635 y B) las bases 1664 y 1735, con el perfil mencionado arriba fueron realizadas por 25 ciclos con anticuerpo pFab5chis como diseño básico. Estos

productos PCR producidos de aproximadamente 750 bp donde en A el filamento superior fue biotinilado y en B el filamento inferior fue biotinilado.

Los filamentos no biotinilados fueron recuperados por purificación usando una matriz solidamente revestida con estreptavidina, por ejemplo, Dynabeads. Las cuentas magnéticas son lavadas y equilibradas con PBS/1% BSA y tampón B&W conteniendo 5 mM Tris pH 7.5, 1 M de NaCl, y 0.5 mM de EGTA. 100 μl de cada producto de PCR es mezclado con 100 μl de cuentas disueltas en tampón de 2 x B&W e incubado con rotación a la temperatura ambiente, por 15 minutos. Los productos PCR desligados son removidos mediante un cuidadoso lavado doble con B&W. Los filamentos no biotinilados del ADN capturado es extraído por desnaturalización alcalina para dejar incubar el ADN con 25 μl 0.1 M de NaOH por 10 minutos a la temperatura ambiente. La solución es separada de las cuentas y neutralizadas con 7.5 μl 0.33 M de HCl y 2.5 μl 1 M Tris pH 8.

GENERACIÓN DE UN FILAMENTO SIMPLE DE ADN USANDO BACTERIÓFAGOS

El fragmento de interés fue clonado dentro de vectores bacteriófagos M 13, M13mp18 y M13mp19 usando enzimas de restricción PstI/HinIII. El bacteriófago fue propagado usando fila mento Escher ichia co li-strain TOP10F’ de acuerdo a los métodos convencionales. El filamento simple de ADN para el filamento superior fue preparado del vector bacteriófago M13mp18 y el filamento simple de ADN para el filamento inferior fue preparado del vector bacteriófago M13mp19. Brevemente, 1,5 ml de un cultivo bacteriano infectado fue centrifugado a 12 000 g durante 5 minutos a 4 °C. El flotante fue precipitado con 200 μl al 20% de PEG8000/2.5 M de NaCl. El bacteriófago granulado fue resuspendido en 100 μl de TE. 50 μl de fenol equilibrado con la adición de Tris-Cl (pH 8.0) y la muestra fue puesta a girar rápido. Después de la centrifugación a 12 000 g por 1 minuto a RT la fase superior, que contenía el ADN, fue transferido y precipitado con etanol. El gránulo de ADN fue disuelto en 50 μl de TE (pH 8.0) y almacenado a -20 °C. (Sambrook et al . Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989, chapter 4). El ADN de cadena sencilla preparado del bacterífago es circular y debe se abierto con anterioridad al tratamiento con BAL 31. Esto puede ser realizardo con una endonucleasa capaz de dividir el ADN de cadena sencilla.

GENERACIÓN DE CADENA SENCILLA DE ADN USANDO PCR ASIMÉTRICO

Los productos PCR son purificados usando una columna giratoria para remover el exceso de bases de los PCR previos. 150 ng de productos purificados son usados como diseño básico en una amplificación linear realizada en 100 μl de tampón 1xGeneAmp® 10 x PCR que contiene 1.5 nM de MgCl2 (Applied Biosystems), 200 nM de cada dNTP (New England BioLabs), y 10 nM de una base simple. Las condiciones de ciclo de PCR son: desnaturalización a 94° C por 1 minuto, 35 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 55 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto seguidos por la extensión a 72 °C por 7 minutos.

Los productos asimétricos PCR son separados por tamaño desde el diseño de base filamentado sobre gel de agar al 1 % y purificados usando el equipo Qiaquick Gel Extraction (Qiagen).

GENERACIÓN DE ADN FRAGMENTADO DE CADENA SENCILLA USANDO BAL 31

Los filamentos de ssADN (que contienen filamentos superiores e inferiores, respectivamente) fueron sometidos a tratamiento enzimático separado usando, por ejemplo, BAL 31. Cada reacción de asimilación contenía 0.02 μg/μl de ssADN, 600 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 12 mM de CaCl2, 12 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA pH 8.0 y BAL 31 a varias concentraciones de enzima en el rango de 0.1- 5 U/ml. Las reacciones fueron incubadas a 30° C y las fracciones del ssADN asimiladas fueron recolectadas secuencialmente a 10, 30, 60 y 120 segundos no más. Las reacciones fueron detenidas por adición de EDTA y tratamiento de calor a 65 °C por 10 minutos. Los fragmentos de ssADN fueron purificados por extracción de fenol/cloroformo y etanol precipitado. Los ssADN son resuspendidos en 10 mM de Tris pH 8.0.

Los patrones de asimilación fueron evaluados por electroforesis de gel de agar al 1 %.

PURIFICACIÓN DE LOS FRAGMENTOS PRODUCIDOS ASIMILADOS:

Los fragmentos de ADN asimilados fueron purificados por la extracción de fenol/cloroformo/isoamilo/alcohol. 50 μl de tampón de fenol fueron añadidos a cada tubo de 100 μl de la muestra junto con 50 μl de una mezcla de cloroformo e isoamiloalcohol (24:1). Los tubos fueron puestos a girar rápido por 30 segundos y entonces centrifugados por 1 minuto en una microcentrífuga a 14 000 r.p.m. La fase superior fue entonces recogida y mezclada con 2.5 volúmenes de etanol al 99.5 % (1/10 fue de 3M de Acetato de Sodio, pH 5.2). El ADN fue precipitado por una hora a -80 °C. El ADN fue entonces granulado por centrifugación durante 30 minutos en una microcentrífuga a 14.000 r.p.m. Los gránulos fueron lavados una vez con etanol al 70% y entonces vueltos a disolver en 10 μl de agua estéril.

ANÁLISIS DE LOS FRAGMENTOS ASIMILADOS PRODUCIDOS Y PURIFICADOS EN GEL DE AGAR

5 μl de los gránulos disueltos para cada punto de tiempo y del espacio vacío fueron mezcladas con

2.5 μl del tampón de carga (25 % Ficoll y Bromphenolic azul) y cargados dentro de pozos de gel de agar al 2 %. La electroforesis de los diferentes puntos de tiempo fueron realizados como fue citado anteriormente.

.

REAGRUPACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE MÁXIMA LONGITUD

La reagrupación de los fragmentos de ssADN es lograda por dos reacciones PCR consecutivas. La primera reacción PCR debe contener 10 mM de Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTP, 0.3 U de polimerasa rotulada y 2 μl de BAL31 de la muestra tratada, todo en un volumen final de 25 μl, y sometido a 5 ciclos con el perfil siguiente: 94 °C por 1 minuto, 50 °C por 1 minuto y 72 °C por 2 minutos + 72 °C por 5 minutos. La segunda reacción PCR debe contener 10 mM de Tris-HC1, pH 8.3, 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTP, 0.6 U de polimerasa rotulada, 1 μM de la base anterior, 1 μM de la base posterior y 5 μl de muestra de la primera reacción de PCR, todo en un volumen final de 50 μl, y sometido a 15 ciclos con el perfil siguiente: 94 °C por 1 minuto, 55 °C por 1 minuto y 72 °C por 2 minutes + 72 °C por 7 minutos. Los productos resultantes pueden ser evaluados por electroforesis de gel de agar.

RESTRICCIÓN DE LA ASIMILACIÓN DE FRAGMENTOS REENSAMBLADOS Y PLASMIDOS CON SFIL Y NOTL

El fragmento reensamblado y el plasmido pFab5chis fueron primero divididos con Sfil por medio del uso del tampón NEB 2 que incluye BSA y 11 U de enzima/μg de ADN. La reacción fue realizada durante 4 horas a 50 °C. Después de esto el ADN fue dividido con Notl añadiéndole tampón de conversión y 6 U de enzima/μg de ADN. Esta reacción fue realizada a 37 °C durante toda la noche.

PURIFICACIÓN POR GEL DEL VECTOR ASIMILADO DE RESTRICCIÓN Y FRAGMENTO REENSAMBLADO ASIMILADO DE RESTRICCIÓN

Las reacciones divididas fueron analizadas sobre un gel de agar al 1%. La restricción inserción de la asimilación mostró un producto divido de aproximadamente 750bp. Esto se corresponde bien con el tamaño esperado. La banda de la inserción dividida y de plasmido fue cortada y extraida con el gel como se describió previamente. La inserción asimilada de restricción mostró un producto divido de alrededor de 750 bp. Esto corresponde bien con el tamaño esperado. La banda del inserto dividido y el plasmido fue cortada y se le extrajo el gel como se describió previamente.

LIGAZÓN DEL FRAGMENTO ASIMILADO DE LA RESTRICCIÓN REENSAMBLADA CON PFAB5CHIS ASIMILADO DE LA RESTRICCIÓN

La division purificada pFab5chis fue ligada con el fragmento asimilado de la restricción reensamblada en baño de Maria a 12 °C por 16 horas. 50 μl del vector fue mezclado con 50 μl de la inserción y 15 μl de tampón IOx (suministrado con la enzima), 7.5 μl de ligasa (5 U/μl) y agua estéril para un volumen final de 150 μl. Una ligadura de restricción asimilada pFab5chis sin ninguna inserción fue también realizada en la misma forma.

TRANSFORMACIÓN DE E COLI TOP10P QUÍMICAMENTE COMPETENTE CON LA INSERCIÓN REENSAMBLADA LIGADA

Las reacciones de ligaduras fueron purificadas por extracción de fenol/cloroformo como fue descrito anteriormente. La fase superior de la extracción fue recogida y mezclada con 2.5 volúmenes de etanol al

99.5 % (1/10 fue de 3 M de Acetato de Sodio, pH 5.2). El ADN fue precipitado por 1 hora a -80 °C. El ADN fue entonces granulado por centrifugación por 30 minutos en una microcentrífuga a 14.000 r.p.m. El granulado fue lavado una vez con etanol al 70 % y entonces redisuelto en 10 μl de agua esteril. 5 μl de cada ligadura fue separadamente mezclada con 95 μl químicamente competente de E coli TOP10F’ incubada en hielo durante 1 hora y entonces transformada (Sambrook et al. Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989). Después de una hora de crecimiento la bacteria procedente de las dos transformaciones fue esparcida en ampicillín que contiene láminas de agar (100 μg/ml). Las láminas fueron cultivadas boca abajo en una incubadora a 37 °C durante 14 horas.

EJEMPLO 2 - FRECUENCIAS DE RECOMBINACIÓN; COMPARACIÓN DEL DSDNA EL SSDNA

En ulteriores experimentos comparables, tres fragmentos de anticuerpo scFy fueron usados en experimentos de recombinación, tanto como dsDNA o como ssADN.

dsDNA

Los tres genes scFv fueron cada uno amplificados en PCR usando bases anteriores y posteriores y un procedimento PCR estandar. El tamaño de las bandas fueron confirmados con electroforesis de del de agar y el resto de los productos PCR amplificados fueron purificados usando el equipo de purificación Concert PCR (Gibco). El dsDNA de los tres scFy fue mezclado en cantidades equimolares y tratados con BAL 31. Cada reacción de dsDNA contenía una concentración de 0.02 μg/μl de volumen de reacción de 600 mM de NaCl, 20mM de Tris-HCl, 12mM de CaCl2, 12 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA pH 8.0 y BAL31 a varias concentraciones de enzimas (usando 4, 20 o 100 U enzima/ml de volumen de reacción). Las reacciones fueron incubadas a 30 °C y las fracciones del dsDNA fueron recogidas secuencialmente a 10, 30 y 50 minutos. Las reacciones fueron detenidas con EDTA y tratamiento de calor (alternativamente, un protocolo de inactivación sin calor de EDTA puede ser usado, ver más adelante) y purificadas usando extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol. Las muestras de dsDNA fueron resuspendidas en 10 mM Tris pH 8.0.

Manteniendo cada punto de tiempo separado, las muestras fueron sometidas a reagrupación de PCR (para esta reagrupación 60 ng de ADN fueron usados) y amplificación de PCR de acuerdo al protocolo, y

clonadas en pGEM (Product No A362A, Promega, Madison, USA). Dieciocho clones de cada punto de tiempo fueron secuenciados y el número y frecuencia de las recombinaciones fueron determinados.

INACTIVACIÓN POR CALOR DE ASIMILACIONES DE EXONUCLEASA

Un protocolo para detener la reacción de BAL 31 sin usar EDTA ha sido establecido. Este protocolo de inactivación por calor evita el uso de la extracción fenol/cloroformo, la cual es dañina a la salud y también causa pérdidas de material.

En resumen, la muestra es incubada por 10 minutos a 95 °C y entonces puesta directamente en hielo, para detener la reacción enzimática. Después de esto la muestra puede ser directamente precipitada usando etanol.

ssADN

Los tres genes scFv fueron cada uno amplificados en dos reacciones PCR usando pares de bases anterior/biotina posterior y biotina anterior/posterior usando el procedimiento PCR estandar. Los tamaños de las bandas fueron confirmados con electroforesis de agar y el resto de los productos PCR amplificados fueron purificados usando el equipo de purificación Concert PCR (Gibco). El ADN de cadena sencilla fue obtenido usando cuentas magnéticas de acuerdo con el protocolo, logrando tres filamentos sensitivos y tres filamentos antisensitivos. El filamento sensitivo y el filamento antisensitivo, respectivamente, de los tres scFy fueron mezclados en cantidades equimolares y tratados con BAL 31 de acuerdo con el protocolo (usando 1.25 o 11 U enzima/ml de volumen de reacción y sdDNA a una concentración de 0.015 mg/ml de volumen de reacción) y las muestras fueron retiradas a 0

(i.e. no asimilada), 10, 30 y 50 minutos. Las reacciones fueron detenidas con EDTA y tratamiento de calor y purificadas usando extracción fenol/cloroformo y precipitación de etanol. Manteniendo cada punto de tiempo separado, pero mezclando los filamentos sensitivos y antisensitivos, las muestras fueron sometidas a PCR reagrupado (para esta reagrupación 60 ng de ADN es usado) y amplificación PCR de acuerdo con el protocolo, y clonados en pGEM. Dieciocho clones de cada punto de tiempo fueron secuenciados y el número y la frecuencia de las recombinaciones fueron determinados.

RESULTADOS

La frecuencia más alta de combinación usando el dsDNA fue lograda usando de un volumen de reacción de 20 U de enzima/ml (que contiene 0.02 μg/μl de ADN y tratado durante 10 minutos. Esta dio el 39 % de los clones con un cruzamiento (Figura 6) y el 17 % de los clones con dos cruzamientos (Figura 7). Usando 4 U de enzima/ml dio ningún cruzamiento independiente del tiempo para la fragmentación y 100 U de enzima/ml resultaron en completa fragmentación de muy pequeños fragmentos, como fue indicado por el fracaso de recobrar el gen de longitud completa durante la reagrupación.

Los resultados de los experimentos usando ssADN son mostrados en las Figuras 8 a 10. La Figura 8 muestra 1.25 U/ml de BAL 31 y clones con un cruzamiento, la Figura 9 muestra 1.25 U/ml de BAL 31 y clones con dos cruzamientos. La Figura 10 muestra 11 U/ml y clones con un cruzamiento y la Figura 11 muestra 11 U/ml de BAL 31 y clones con dos cruzamientos.

La frecuencia de recombinación más alta dando un cruzamiento usando ssADN fue lograda usando 11 U de enzima/ml y tratando durante 10 minutos (Figura 10). El 59 % de los clones tuvieron un cruzamiento. La frecuencia de recombinación más alta dando dos cruzamientos usando ssADN fue lograda usando 1.25 U de enzima/ml y tratando durante 30 minutos (Figura 9). El 20 % de los clones tuvieron dos cruzamientos.

CONCLUSIONES Y COMENTARIOS

Estos datos claramente muestran que una mayor frecuencia de recombinación es lograda usando ssADN. Los tres scFv usados tienen las mismas secuencias de montaje, indicando que el número de cruzamientos reportados pueden ser superiores debido a los cruzamientos en regiones donde ninguna diferencia de frecuencias resultará. Estos experimentos usando ssADN fueron realizados de manera no óptima para mostrar máxima recombinación, ya que todos los filamentos de todas las tres moléculas fueron mezclados. La mezcla de filamento de un scFv con el filamento antisensitivo de otro scFv producirían frecuencias superiores de cruzamiento, ver el Ejemplo 3 más adelante. También, cada punto de tiempo fue aquí mantenido separado y sería lógico estimar la frecuencia de los cruzamientos para incrementar si puntos de tiempo diferentes, por ejemplo, diferentes tamaños de fragmentos son mezclados.

EJEMPLO 3 - FRECUENCIAS DE RECOMBINACIÓN; HOMOLOGÍA DE DEPENDENCIA USANDO ssDNA

Para investigar la homología requerida para lograr el cruzamiento establecemos experimentos para recombinar cuatro scFv (designados SMUC159, CT17, AE11 y MO152) hacemos tres pares con diferentes homologías, como sigue:

SMUC159-CT17 92%

SMUC159-AE11 70%

SMUC159-MO152 60%

Los cuatro genes scFv fueron cada uno amplificados en dos reacciones PCR usando pares de bases anterior/biotina posterior y biotina anterior/posterior usando el procedimiento PCR estandar. Los tamaños de las bandas fueron confirmados con electroforesis de agar y el resto de los productos PCR amplificados fueron purificados usando el equipo de purificación Concert PCR (Gibco). El ADN de cadena sencilla fue obtenido usando cuentas magnéticas de acuerdo con el protocolo, logrando cuatro filamentos sensitivos y cuatro filamentos antisensitivos. Cada filamento fue tratado con BAL 31 de acuerdo con el protocolo (usando 4.2 o 12.5 U de enzima/ml) y las muestras fueron retiradas a los 0, 10, 30 y 50 minutos, ó 0, 15, 30, 45 y 60 minutos. Las reacciones fueron detenidas con EDTA y tratamiento de calor y purificadas usando extracción fenol/cloroformo y precipitación de etanol. Manteniendo cada punto de tiempo separado, pero mezclando los filamentos sensitivos y antisensitivos para formar pares como se indica arriba, las muestras fueron sometidas al PCR reagrupado y a la amplificación de PCR de acuerdo con el protocolo y clonadas en pGEM. Quince clones de cada punto de tiempo fueron secuenciados y el número y la frecuencia de las recombinaciones fueron determinados.

RESULTADOS

Los cruzamientos fueron identificados en todas las combinaciones de scFv, indicando que una homología tan baja como el 60 % es suficiente para lograr la recombinación.

EJEMPLO 4 - CONTROL MEJORADO DEL TAMAÑO DEL FRAGMENTO USANDO EXONUCLEASIS

(A) Exonucleasas

Usamos las exonucleasas, por ejemplo, BAL31, exonucleasa I, exonucleasa V, exonucleasa VII, exonucleasa T7 gen 6, bacteriófago lambda exonucleasa, y exonucleasa y Rec Jf para la fragmentación en los métodos de la presente invención. Estas enzimas dividen un nucleótido por vez, lo mismo desde el terminal 5’ o desde el terminal 3’ o desde ambos terminales. La reacción puese ser detenida usando EDTA o inactivación por calor (ver arriba), en dependencia de la enzima usada. Esto significa que los fragmentos de todos los tamaños posibles, que difieren con sólo un nucleótido, pueden ser obtenidos.

Los siguientes ejemplos demuestran cómo la asimilación exonucleasa permite la creación de fragmentos de varios y controlables tamaños dependiendo de las condiciones usadas.

BAL 31

El ADN de cadena sencilla fue asimilado con BAL 31 de acuerdo con el protocolo en el Ejemplo 1, con una concentración de enzima de un volumen de reacción de 4.2 U/ml y una concentración de ssADN de volumen de reacción de 0.008 μg/μl.

En un experimento típico, alrededor de 300 ng de ADN son aislados en cada punto de tiempo del tratamiento de BAL 31. La Figura 12 muestra una imagen de electroforesis de gel de agar de un experimento con ssADN no tratado en el carril 4 y ssADN tratado durante 10 minutos en el carril 3, durante 30 minutos en el carril 2 y durante 50 minutos en el carril 1. El carril 5 es el peso molecular estándar (MW).

Las figuras 13 y 15 muestran los correspondientes cromatogramas de los carriles, respectivamente. La Figura 13 es el material no tratado y los picos múltiples se refieren a las diferentes conformaciones del ssADN. La Figura 14 corresponde al carril 3 y al materiale tratado durante 10 minutos. El material fue tratado con calor para detener la reacción enzimática, y de esa manera resolver las diferentes conformaciones, y un pico de distinto tamaño es mostrado. La Figura 15 corresponde al carril 2 y al material tratado durante 30 minutos.

Aquí está claro que el pico correspondiente a los fragmentos más grandes es decreciente y un pico de fragmentos más pequeños de ADN ha aparecido.

Exonucleasa VII

El ADN de cadena sencilla fue asimilado con exonucleasa VII usando una concentración de enzimas de un volumen de reacción de 7.7 U/ml y una concentración de volumen de reacción de 0.008 μg/μl. La reacción tampón abarca 67 mM de fosfato de potasio (pH 7.9), 10 mM de mercaptoetanol, 6.7 mM de MgCl2 y 8.3 mM de EDTA.

La reacción fue permitida para proceder a 37 °C for 10, 20 y 30 minutos, antes de ser detenida por inactivación de calor (95 °C por 5 minutos).

En la Figura 16 el patrón de fragmentación usando exonucleasa VII es mostrado. El carril 1 es estandar de MW, el carril 2 es ssADN no tratado, el carril 3 es ssADN fragmentado, el caril 2 es ssADN no tratado, el carril 3 es ssADN fragmentado con exonucleasa VII por 10 minutos, el carril 4 es ssADN fragmentado con exonucleasa VII por 20 minutos y el carril 5 es ssADN fragmentado con exonucleasa VII por 30 minutos. Esto muestra que los tamaños de los fragmentos son reducidos por el tiempo.

Exonuclease Rec Jf

El ADN de cadena sencilla fue asimilado con exonucleasa Rec Jf usando una concentración de enzima lo mismo de una reacción de volumen de 2.5 U/ml que una reacción de volumen de 10 U/ml y ssADN a una

concentración de 0.007 μg/μl, correspondiendo a 0.36 U/enzima/μg de ADN y 1.4 U/enzima/μg, respectivamente. La reacción tampón abarca 50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl2 y 1 mMde ditiotreitol, a pH 7.9

La reacción fue permitida para proceder a 37 °C for 10, 20 y 30 minutos, antes de ser detenida por inactivación de calor (95 °C por 5 minutos).

En la Figura 17 el patrón de fragmentación usando exonucleasa Rec Jf a 0.36 U/μg de ssADN es mostrado. El carril 1 es ssADN no tratado, el carril 2 es ssADN fragmentado con exonucleasa Rec Jf por 10 minutos, el carril 3 es ssADN fragmentado con exonucleasa Rec Jf por 20 minutos y el carril 4 es ssADN fragmentado con exonucleasa Rec Jf or 30 minutos. Esto muestra que los tamaños de los fragmentos son reducidos por el tiempo. En la Figura 18 la concentración de enzima es incrementada 4 veces (1.4 U/μg de ssADN) y el patrón de fragmentación es mostrado de 0 a 30 minutos, mostrando un grado mayor de fragmentación como es comparado con la Figura 17. Esto muestra que tanto el tiempo y la concentración de enzima pueden ser usados para controlar la fragmentación.

(B) Endonucleasas

Los métodos de barajar el ADN convencional típicamente usan ADNasa I para la fragmentación (por ejemplo, ver Stemmer, 1994, Nature 370:389-391). La ADNasa I corta el ADN en una forma endonucleolítica en sitios adyacentes a las pirimidinas. Consecuentemente, no todos los posibles tamaños de fragmentos pueden ser obtenidos.

Por otra parte, usando magnesio en la reacción tampón, una mezcla homóloga de mono- y oligómeros es obtenida. Por lo tanto, diferentes métodos tales como la purificación por electroforesis de gel de agar

o filtración de gel necesitan ser usados para aislar los fragmentos de diferentes tamaños. A menudo fragmentos de tamaño pequeño o una mezcla de pequeños y largos fragmentos son deseados para optimizar la recombinación. Sin embaro, estos métodos de purificación introducen muescas en los productos PCR de filamento doble. Los fragmentos de un particular tamaño purificados sobre un gel deberían así consistir de dsDNA con un gran número de muescas de cadena sencilla, que darían un aumento a demasiados pequeños fragmentos generados por encima de la desnaturalización. Esto significa que muchos de los fragmentos de cadena sencilla generados sobre al desnaturalización debían ser demasiado cortos para funcionar como bases durante el recocido, resultando en una gran pérdida de producto.

El uso de manganeso en la reacción tampón crea fragmentos de tamaños más pequeños que 50 bp y ningún gel de purificación es necesario. Sin embargo, aquí Ud. está restringido a usar sólo fragmentos pequeños y estos no pueden ser mezclados con fragmentos mayores, algo que probablemente incrementaría la frecuencia de recombinación.

Los problemas asociados con el uso de endonucleasas son demostrados en los siguientes experimentos:

ADNasa I

El ADN fue asimilado por 5 minutos con ADNasa I a una concentración de 0.15 U/μg de ADN.

Los tampones de magnesio y de manganeso fueron comparados cuando la fragmentación con ADNasa I y el resultado son mostrados en la Figura 19. El carril 1 es MW estandar, el carril 2 es ssADN no tratado en amortigador de Mg, el carril 3 es ssADN fragmentado con ADNasa I en tampón de Mg de acuerdo con Stemmer (1994) Nature 370:389-391, el carril 4 es ssADN no tratado en tampón de Mn de acuerdo con Kikuchi et al. (2000) Gene 243:133-137. Está claro de la Figura 19 que, cuando se usa el tampón de Mg y las condiciones de acuerdo con los artículos de Stemmer y Kikuchi, ninguna fragmentación ocurre. Por otra parte, cuando se usa el tampón de Mn y las condiciones de acuerdo con los artículos de Stemmer y Kikuchi, todo el material es totalmente fragmentado dentro de unos pocos minutos solamente.

En un intento de obtener fragmentos de diferentes tamaños decidimos usar el tampón de Mg e incrementar la concentración de enzimas. La Figura 20 muestra una imagen de electroforesis de gel de agar de un tal experimento usando ADNasa I. El carril 1 es MW estandar. El carril 6 es ssADN no tratado. El carril 12 es ssADN tratado de acuerdo con los artículos de Stemmer and Kikuchi, usando 0.15 U/enzima/μg de ADN y el carril 13 es el mismo material tratado con 1 U/enzima/μg de ADN (por ejemplo, seis veces más enzima).

Las figuras 21 a 23 muestran los correspondientes cromatogramas. El ssADN no tratado ha sido tratado con calor, por esto sólo un pico aparece en la Figura 21 (indicado por una flecha). El la Figura 22, es apreciable que el uso de una cantidad de ADNasa I de acuerdo con los artículos de Stemmer y Kikuchi el pico de ssADN no tratado es un tanto reducido (indicado por una flecha) pero ningún pico distinguible es visible para el ADN fragmentado, sólo una mancha. Usando 6 veces más enzima el ssADN no tratado es totalmente suprimido (Figura 23) y ni aquí hay un pico visible de los fragmentos.

Nucleasa de frijol de Mung

El ADN de cadena sencilla fue asimilado con nucleasa de frijol de Mung (Product No. MO250S, New England Biolabs) usando una concentración de enzima de ambos 0.375 U/ml de reacción de volumen y ADN a una concentración 0.007 μg/μl de reacción de volumen. La reacción tampón abarca 50 nM de acetato de sodio, 30 mM de ZnSO4, a pH 5.0.

La reacción fue permitida para proceder a 25 °C por 10 minutos, antes de ser detenida por inactivación de calor (95 °C por 5 minutos).

La Figura 24 muestra la fragmentación usando otra nucleasa, la nucleasa de frijol Mung. El carril 1 es el ssADN no tratado, el carril 2 es el mismo material tratado por 10 minutos. El carril 3 es el MW estandar.

Los resultados indican que todo el ADN fue totalmente fragmentado después de sólo 10 minutos de asimilación con la nucleasa de frijol de Mung (ver carril 2), a pesar de usar la enzima a una concentración inferior que aquélla recomendada por el fabricante.

CONCLUSIONES Y COMENTARIOS

Los ejemplos anteriores muestran como los tamaños de los fragmentos pueden ser controlados usando exonucleasas y alterando las condiciones de la reacción, por ejemplo, el tiempo, el volumen de reacción, la concentración de enzimas. Los diferentes picos son visualizados usando cromatogras de imagen de gel.

En contraste, usando endonucleasas, tal como la ADNasa I, da una reacción la cual es difícil de controlar. Usando condiciones como las referidas en la literatura, lo mismo usando tampones que contienen Mg o Mn típicamente da una situación cuando lo mismo todo o nada es fragmentado, ver especialmente la Figura 20. Un experimento usando otra endonucleasa (nucleasa de frijol de Mung) confirma estas observaciones.

Ejemplo 5 – La asimilación de sub-poblaciones de material de inicio de ADN de cadena sencilla con diferentes exonucleasas.

En experientos adicionales, el material de inicio de ADN de cadena sencilla fue dividido en dos poblaciones, las cuales fueron entonces asimiladas usando diferentes exonucleasas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Plásmidos

Una varante de tetraciclina suprimida de plámido pBR322 fue construída por división con tratamiento SalI and BamHI (Roche, Basel, Switzerland) Klenow (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) y ligazón de terminal romo (New England Biolabs, MA, USA). El plásmido resultante fue chequeado para la sensibilidad a la tetraciclina y es llamado pBR322dtet.

El PBR322stop1 y el pBR322stop3 fueron creados por amplifiación PCR del gen de tetraciclina pBR322 usando bases especiíficas (Tabal 1). Cada gen de tetraciclina fue clonado en pBR322.

Tabla 1

Secuencias base

Detención anterior Nhel pBR322:

Posterior Eagl pBR322: 5’-CGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATG-3’ Anterior HindIII pBR 322: 5’- CAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAT-3’ Detención posterior Sall pBR 322:

PCR

A menos que de otra forma las reacciones PCR notorias contenidas en 4 μM de cada base, 160 μM de dNTP (Roche, Basel, Switzerland), 1x AmpliTaq de reacción tampóna, 2.5 U de polimerasa de ADN termoestable AmpliTaq (Applied Biosystems, CA, USA).

FIND PCR 1: 5 o 25 ciclos de 94 °C por 30 seg, 50 °C por 45 seg, 72 °C por 1 minuto y entonces 72 °C por 7 minutos, ningunas bases externas fueron incluidas.

FIND PCR 2: 15, 25 o 50 ciclos de 94 °C por 30 seg, 55 °C por 45 seg, 72 °C por 1 minuto y entonces 72 °C por 7 minutos con bases externas incluidas.

Preparación de ADN de cadena sencilla

El gen de interés, o sea, tet-r, fue amplificado usando bases específicas, una de las bases fue biotinilada. El ssADN de los filamentos sensitivos y antisensitivos fue purificado usando cuentas magnéticas de estreptavidina (adquiridas de cualesquiera Dynal AS, Oslo, Norway o Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. El ssDA por este medio obtenido fue más adelante purificado lo mismo por precipitación de etanol o por el uso de recochip (TaKaRa, Shiga, Japan) de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes.

Experimentos FIND

Los experiemtos FIND fueron iniciados por la asimilación de ADN con una exonucleasa. El ADN era de cadena sencilla (preparado como lo anterior) y originado del gen resistente a la tetraciclina (pBR322stop1 o pBR322stop3, 945 bp). La exonucleasa era BAL 31 (0.08-1 U/μg ADN, New England Biolabs, MA, USA), exonucleasa I (100 U/μg ADN, New England Biolabs, MA, USA), T7 gen 6 exonucleasa (320 U/μg ADN, USB, Cleveland Ohio, USA) y exonucleasa V (12.5 U/μg ADN, USB, Cleveland Ohio, USA). El tiempo de asimilación estuvo en el rango de 2 - 9 minutos. Las reacciones de asimilación fueron detenidas porla adición de EDTA a una concentración final de 20 mM y/o inactivación de calor a 65 o 95 °C durante 10 minutos. Cuando la EDTA fue usada para detener la fragmentación de ADN, el ADN fue además purificado por la extracción de fenol/cloroformo y la precipitacón de etanol. Los fragmentos fueron recombinados en una reacción FIND PCR1 por 15, 25 o 50 ciclos. Finalmente los genes de longitud total fueron clonados dentro de pBR322dtet por el uso de HindIII y EagI (New England Biolabs, MA, USA) para la evaluación de la funcionabilidad o dentro de pGEM (Promega, Madison, WI, USA) para la secuenciación.

Evaluación de la funcionabilidad de los clones de tetraciclinas

Los clones introducidos dentro de pBR322dtet fueron transformados en competentes químicos E. coli TG y colocado en placas de agar LB conteniendo 1 μg/ml de ampicillina. De cien a doscientos clones fueron entonces trasladados a placas de agar LB conteniendo 50 μg/ml de tetraciclina y la frecuencia de clones resistentes a la tetraciclina podría ser calculada.

RESULTADOS

Como se mostró arriba, las recombinaciones de frecuencias superiores usando el prociedimiento FIND de la presente invención podrían ser logrados usando ssADN en la fragmentación. La exonucleasa BAL 31 es predominantemente exonucleasa 3’ que remueve los monocucleótidos de ambos terminales 3’ de dos filamentos de un ADN de doble filamento lineal. Sin embargo BAL 31 puede también degradar los terminales de ADN de cadena sencilla generados por la actividad de la exonucleasa 3’ sobre el ADN de filamento doble. La actividad de BAL 31 sobre el ssADN es removida de los mononucleótidos de los terminales 5’ solamente. El uso de BAL 31 para la fragmentación de ssADN y entonces el reagrupamiento de los genes de longitud total será resultado teóricamente en un cruzamiento por gen. Los experimentos fueron por consiguiente realizados para probar diferentes exonucleasas para la fragmentación de ssADN. La exonucleasa I tiene actividad 3’ solamente siempre que el BAL 31, el T7gene 6 y la exonucleasa RecJ tengan solamente actividad 5’. La exonucleasa V y la exonucleasa VII tienen actividad desde ambos terminales (5’ y 3’). Para mostrar que estas exonucleasas pueden ser usadas en el paso de fragmentación en un experimento FIND y produce genes funcionalmente recombinados un sistema modelo basado en los genes resistentes a la tetraciclina fue usado.

Fue encontrado que BAL 31 (Figura 25a) así como la exonucleasa I (Figura 25b) y la exonucleasa T7gene 6 (Figure 25c) todas trabajan bien en el procedimento FIND y una dependencia sobre el tiempo de fragmentación de la frecuencia de recombinación fue observada.

Si solamente una exonucleasa, la cual asimila ssADN desde sólo un terminal, es usado sólo un cruzamiento puede en teoría ser logrado. Sin embargo, fue encontrado que cruzamientos adicionales pueden ser obtenidos en fragmentos de ADN desde el tratamiento por diferentes exonucleasas fueron combinadas. El tratamiento de exonucleasa V y exonucleasa VII resultará en pequeños fragmentos sin los terminales 5’ y 3’. Estos terminales son necesarios para amplificar el material recombinado en la última reacción PCR. Estos fragmentos de ADN pueden por esto ser combinados con ADN asimilado desde los terminales 5’ o 3’. El resultado de tal combinación puede ser visto el la Figura 25d donde el ssADN tratado con exonucleasa I durante 10 minutos fue combinado con ssADN tratado con exonucleasa V durante 40 a 50 minutos. Los clones funcionales de hasta el 40 % fueron obtenidos, un resultado que debe ser comparado a un máximo del 25 % logrado en el mismo sistema usando sólo una enzima (Figura 25a-c). Los fragmentos son también combinados desde el tratamiento de exonucleasa I y exonucleasa VII, y los fragmentos de la exonucleasa T7gene 6, y los fragmentos del tratamiento de exonucleasa T7gene 6 y exonucleasa VII, en diferentes puntos de tiempo, y clones recombinados funcionalmente podría ser obtenidos (no se muestran datos).

Ejemplo 6 - La asimilación de sub-poblaciones de material de inicio de ADN de cadena sencilla con diferentes exonucleasas (experimentos adicionales)

En un conjuto de experimentos separados, múltiples cruzamientos fueron producidos por la combinación de fragmentos obtenidos por la asimilación de ADN de cadena sencilla con exonuclease I con fragmento obtenido por la asimilación de exonucleasa V ADN de cadena sencilla y/o exonucleasa VII.

La exonucleasa I (Exo I) tiene sólo actividad 3’ mientras que la exonucleasa V (Exo V) y la exonucleasa VII (Exo VII) tienen actividad desde ambos terminales (5’ y 3’). Por lo tanto, los tratamientos de la Exo V y de la Exo VII resutarán en pequeños fragmentos sin los terminales 5’ y 3’. Estos terminales son necesarios para amplificar el material recombinado en la última reacción PCR. Estos fragmentos de ADN pueden por tanto ser combinados con ADN asimilado desde los terminales 5’ y 3’ solamente.

Una mezcla equimolar de los tres genes scFv fue usada en la fragmentación con Exo I, Exo V y Exo

VII. Diferentes combinaciones de material fragmentado fue mezclado y reensamblado con PCR dentro de los genes de longitud completa y finalmente secuenciados (Figura 26a-d). Exo I se comportó similar a BAL 31 con hasta el 40 de clonescon una recombinación (Figure 26a). La combinación de Exo I con Exo V o Exo VII incrementó el número de cruzamientos hasta cinco recombinaciones (Figuras 26a y c, respectivamente). Exo VII parece ser más eficiente que Exo V, la combinación Exo I/ Exo VII generó recombinaciones en sobre el 75 % de los clones. Finalmente, una combinación de ADN fragmentado desde todas las tres enzimas fue mezclada la cual generó recombinaciones (1 a 4) en casi todos los clones, solamente el 7 % de ellos fueron del tipo descontrolado de genes. Más aún, los mayores tiempos de fragmentación fueron más eficientes (Figura 26d). En este caso particular los genes scFv consistieron de amplias áreas de homología completa (las regiones de montaje), significando que el numero de las recombinaciones identificadas (hasta 4) son las únicas que son posibles de identificar, o sea, el número real de recombinaciones podría ser mucho más alto.

Ejemplo 7 - Comparación de los efectos de la asimilación de ssADN con una exonucleasa con los efectos de asimilación de dsDNA con una endonucleasa.

Los experimentos en la Figura 27 fueron realizados por la recombinación de genes codificando para tres scFv’s diferentes usando cualquier tratamiento de ssADN y exonucleasa o dsDNA y endonucleasa.

La asimilación de dsDNA endonucleasa fue realizada usando ADNasa I, como se describió en Stemmer et al., 1994, Nature 370:389-91. La asimilación de la ssADN exonucleasa fue realizada usando Exo I, Exo V y Exo VII, con muestras equimolares de fragmentos de Exo I (10 minutos de tiempo de reacción), Exo V (30 minutos de tiempo de reacción) y Exo VII (30 minutos de tiempo de reacción) siendo usados en las reacciones de recombinación.

El número de recombinaciones fue evaluado por el uso de la secuenciación. El resultado muestra que la asimilación de ssADN/exonucleasa produce algunos clones de tipo descontrolado y más recombinaciones.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para generar una secuencia o población de secuencias de polinucleótidos a partir de secuencias progenitoras de polinucleótidos de cadena sencilla codificando uno o más motivos proteicos, el método comprendiendo los pasos de:

   a) suministrar una primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla y una segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla, la primera y segunda poblaciones juntas constituyendo cadenas positivas y negativas de la secuencia de polinucleótidos progenitores;

   5 b) realizar una reacción para la asimilación de las primera y segunda poblaciones de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla con una exonucleasa para generar las correspondientes poblaciones de fragmentos de polinucleótidos de cadena sencilla;

   c) contactar dichos fragmentos de polinucleótidos generados desde las cadenas positivas con fragmentos generados desde las cadenas negativas; y

   10 d) amplificar los fragmentos que se hibridan entre sí para generar al menos una secuencia de polinucleótidos codificando uno o más motivos proteicos que tienen características alteradas comparados con uno o más motivos proteicos codificados por dichos polinucleótidos progenitores.

   en donde, en el paso (b), al menos un parámetro de la reacción usada para asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente del parámetro(s) equivalente(s) usado(s) en la reacción para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.
2. 2. Un método de acuerdo a la reinvindicación 1, en el que el parámetro de la reacción es seleccionado de un tipo de exonucleasa, una concentración de exonucleasa, un volumen de reacción, duración de la reacción de asimilación, la temperatura de la mezcla de reacción, el pH de la mezcla de reacción, la longitud de las secuencias de polinucleótidos de cadena sencilla progenitoras, la cantidad de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla y la composición tampón de la mezcla de reacción.

   3 Un método de acuerdo a la reivindicación 1 o 2, en el que la exonucleasa usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la exonucleasa usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

   4 Un método de acuerdo a la reinvindicación 3, en el que la exonucleasa usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es una exonucleasa 3’ y la exonucleasa usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucléótidos de cadena sencilla es una exonucleasa 5’.

   5 Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que la concentración de exonucleasa usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la concentración de exonucleasa usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

   6 Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que el volumen de reacción usado para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente del volumen de reacción usado para la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

   7 Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que la duración de la reacción de asimilación usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la duración de la reacción de asimilación usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

   8 Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que la temperatura de la mezcla de la reacción usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la temperatura de la mezcla de la reacción usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

3. 9.

   Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que el pH de la mezcla de la reacción usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente del pH de la mezcla de la reacción usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

4. 10.

   Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que la longitud de los polinucleótidos en la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la longitud de los polinucleótidos en la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

5. 11.

   Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que la composición tampón de la mezcla de reacción usada para la asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos

   de cadena sencilla es diferente de la composición tampón de la mezcla de reacción usada para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

6. 12.

   Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que la cantidad de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla en la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es diferente de la cantidad de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla en la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla.

7. 13.

   Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que la primera población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla constituye las cadenas positivas de las secuencias de polinucleótidos progenitoras y la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla constituye las cadenas negativas de las secuencias de polinucleótidos progenitoras.

8. 14.

   Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que las moléculas de polinucleótido del paso (a) son moléculas de ADN.

9. 15.

   Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que el paso c) además comprende añadir secuencias iniciadoras que hibridan a los terminales 3’ y/o 5’ de al menos uno de los polinucleótidos progenitores bajo condiciones de hibridación.

10. 16.

    Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que la exonucleasa usada para asimilar la primera y/o la segunda población de moléculas de polinucleótidos de cadena sencilla es seleccionada del grupo que consiste de BAL 31, exonucleasa I, exonucleasa V, exonucleasa VII, exonucleasa T7gene 6, exonucleasa lambda bacterófaga y exonucleasa Rec Jf.

11. 17. Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que una secuencia

    o secuencias de polinucleótidos progenitores ha(n) sido sometida(s) a mutagénesis.

12. 18.

    Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que una o ambas poblaciones de fragmentos generados en el paso b) es(son) sometida(s) a mutagénesis.

13. 19. Un método de acuerdo a la reivindicación 17 o 18 donde la mutagénesis es PCR propensa a error.

14. 20.

    Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes, en el que el paso b) es realizado para generar poblaciones de fragmentos de cadena sencilla de diversas longitudes.

15. 21.

    Un método de acuerdo a la reinvindicación 20 donde el paso b) es controlado para generar fragmentos de cadena sencilla que tienen una longitud promedio de más que aproximadamente 50 nucleótidos.

16. 22.

    Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes que además comprende el paso de expresar in vitro al menos una secuencia de polinucleóticos generada en el paso d) para producir el polipéptido codificado.

17. 23.

    Un método de acuerdo a la reinvindicación 22 que además comprende el paso de prueba del polipéptido codificado para las carácterísticas deseadas.

18. 24.

    Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes en el que la secuencia de polinucleótidos progenitora codifica un anticuerpo o fragmento del mismo.

19. 25.

    Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes en el que la secuencia de polinucleótidos progenitora codifica una enzima.

20. 26.

    Un método de acuerdo a una cualquiera de las reinvindicaciones precedentes en el que la secuencia de polinucleótidos progenitora codifica un antígeno.

21. 27.

    Un método para hacer un polipéptido que tiene propiedades deseadas, el método comprendiendo los pasos siguientes:

    (a)

    generar formas variantes de un polinucleótido progenitor usando un método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26;

    (b)

    expresar los polinucleótidos variantes producidos en el paso (a) para producir polipéptidos variantes;

    (c)

    filtrar los polopéptidos variantes para las propiedades deseadas; y

    (d)

    seleccionar un polopéptido que tiene las propiedades deseadas de los polipéptidos variantes.

22. 28.

    Un método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 el cual comprende, después de la identificación de un polinucleótido y/o un polipéptido codificado con las carácterísticas deseadas, añadir dicho polinucleótido y/o polipéptido codificado a un portador aceptable farmacéuticamente.