CN114099671A

CN114099671A - 利用抗cd40抗体的组合疗法

Info

Publication number: CN114099671A
Application number: CN202111420044.6A
Authority: CN
Inventors: P·埃尔马克; P·诺伦; N·韦通迈基
Original assignee: Alligator Bioscience AB
Current assignee: Alligator Bioscience AB
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2015-08-12
Publication date: 2022-03-01
Also published as: US20240132609A1; NZ729270A; CR20170096A; ES2725463T3; UA119783C2; EA201790339A1; US20240228643A9; JP2017524715A; EP3552665A2; AU2015303164B2; NI201700015A; EP3180087A1; US20210403589A1; BR112017002729A2; JP6654187B2; CL2017000335A1; ECSP17008984A; KR20170041790A; IL250512A0; MX2017001864A

Abstract

本发明涉及利用抗CD40抗体的组合疗法。所述组合疗法包含(a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和(b)具有癌症治疗功效的另一种免疫治疗剂，该免疫治疗剂不是抗CD40抗体或其抗原结合片段。本发明还涉及一种试剂盒和所述疗法的使用方法。

Description

利用抗CD40抗体的组合疗法

本申请是2015年08月12日提交的中国专利申请(申请号201580043161.1，题目为“利用抗CD40抗体的组合疗法”)的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于治疗受试者中的实体肿瘤的组合疗法，以及其使用方法。所述组合疗法包含(a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合片段，和(b)特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的另一种免疫治疗剂。本发明还涉及一种试剂盒和本发明的组合疗法的使用方法。

背景技术

癌症是发达国家中过早死亡的主要原因。免疫疗法在癌症中的目的是通过身体对抗肿瘤、特别是实体肿瘤产生有效的免疫应答。这可通过例如破坏对肿瘤抗原的耐受性、增强抗肿瘤免疫应答和刺激肿瘤部位的局部细胞因子应答来实现。长效抗肿瘤免疫应答的关键效应细胞是激活的肿瘤特异性效应T细胞。通过例如树突状细胞对效应T细胞的不完全活化可造成T细胞无反应性，其导致无效的抗肿瘤反应，而树突状细胞的充分诱导可以产生激活效应T细胞的有效扩增，从而将免疫应答重定向到肿瘤。

细胞表面CD40受体分子是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFR)的成员并且是先天性和适应性免疫应答的关键调节因子。其在人类抗原呈递细胞、特别是B细胞、树突状细胞和巨噬细胞上表达，以及在正常细胞如成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和上皮细胞上表达。此外，其在广泛的肿瘤细胞(包括所有B淋巴瘤、30％-70％的实体肿瘤、黑素瘤和癌瘤)上表达。

CD40的天然配体(称为CD154或CD40L)主要在成熟T淋巴细胞上表达。CD40L介导的信号传导触发若干生物事件，包括免疫细胞激活、增殖，以及细胞因子和趋化因子的产生。因此，通过CD40受体刺激增强了细胞和免疫功能。其在细胞介导的免疫应答中的作用是众所周知的。例如，通过CD40刺激激活树突状细胞可诱导效应T细胞的激活。因此，用CD40激动剂进行治疗可提供重定向免疫应答和扩增针对肿瘤的效应T细胞的手段。

已经报道了一些抗CD40抗体的抗肿瘤作用，其中已鉴定了几种机制。观测到对于CD40阴性肿瘤的间接作用，涉及抗原呈递细胞的激活，特别是肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的活性增加。对于CD40阳性肿瘤观测到间接和直接的抗肿瘤机制，其中结合于肿瘤细胞的CD40抗体诱导细胞凋亡。抗肿瘤活性的这些机制可通过抗体介导的细胞毒性(ADCC)来补充。然而，施用抗CD40抗体也产生不良副作用，例如细胞因子释放综合征。

因此，仍然需要改进的癌症疗法，特别是适用于治疗实体肿瘤的抗CD40抗体和其组合疗法。

发明内容

本发明的第一方面提供用于治疗受试者中的实体肿瘤的组合疗法，其包含(a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和(b)具有癌症治疗功效的另一种免疫治疗剂，该免疫治疗剂不是抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区的抗体竞争结合人类CD40，并且其中所述另外的免疫治疗剂特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子。

在一个实施方案中，所述实体肿瘤选自腺瘤、胚细胞瘤、癌瘤、硬纤维瘤、促纤维组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤、肉瘤、维尔姆斯瘤(Wilmstumour)、肺肿瘤、结肠肿瘤、淋巴肿瘤、乳腺肿瘤和黑素瘤。例如，所述实体肿瘤可为黑素瘤，例如转移性黑素瘤。

在一个实施方案中，所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含完整抗体或由完整抗体组成。

在一个替代实施方案中，所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含如下的抗原结合片段或由如下的抗原结合片段组成，所述抗原结合片段选自：Fv片段(例如单链Fv片段或二硫键键合的Fv片段)和Fab样片段(例如Fab片段；Fab'片段或F(ab)₂片段)。

在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是人类或人源化的。

在一个实施方案中，所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含选自SEQID NO 1、2、3、4、5和6的至少一个CDR，或其‘核心’CDR序列(关于序列细节，参见下文实施例1)。

因此，所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:1、2和3和/或SEQ ID NO:4、5和6的CDR序列，或其‘核心’CDR序列。

例如，所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和/或SEQ ID NO:8的重链可变区。

在一个实施方案中，所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ IDNO:11的轻链恒定区和/或SEQ ID NO:12的重链恒定区。

因此，所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含以下或由以下组成：SEQID NO:7加SEQ ID NO:11的轻链，和/或SEQ ID NO:8加SEQ ID NO:12的重链。

本发明的组合疗法另外包含可有效治疗癌症的另一种免疫治疗剂，其特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子。应理解，所述另外的免疫治疗剂的治疗益处可通过减弱抑制性免疫检查点分子的功能和/或通过激活刺激性免疫检查点分子的功能来介导。

在另一个实施方案中，所述另外的免疫治疗剂选自：

(a)结合PD-1的免疫治疗剂；

(b)结合CTLA-4的免疫治疗剂；

(c)结合OX40的免疫治疗剂；和

(d)结合CD137的免疫治疗剂。

因此，所述另外的免疫治疗剂可为PD1抑制剂，例如能够抑制PD1功能的抗PD1抗体或其抗原结合片段(例如，尼鲁单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、拉姆单抗(Lambrolizumab)、匹地单抗(Pidilzumab)和AMP-224)。可选地，所述PD1抑制剂可包含以下或由以下组成：能够抑制PD1功能的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段(例如，MEDI-4736和MPDL3280A)。

在另一个实施方案中，所述另外的免疫治疗剂是CTLA-4抑制剂，例如抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分。

在另一个实施方案中，所述另外的免疫治疗剂激活OX40，例如激动性抗OX40抗体或其抗原结合部分。

在另一个实施方案中，所述另外的免疫治疗剂激活CD137，例如激动性抗CD137抗体或其抗原结合部分。

本领域技术人员应理解，两种活性剂(如上所述)的存在可在治疗受试者的实体肿瘤中提供协同益处。“协同”包括两种药剂的组合治疗作用(例如通过参考生长速率或肿瘤大小所确定)大于单独施用的两种药剂的加和治疗作用。这种协同作用可通过在实体肿瘤的相关细胞系模型中单独和组合地测试活性剂来鉴定。

任选地，所述组合疗法还包括具有癌症治疗功效的第三免疫治疗剂。

例如，所述组合疗法可包含(a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，(b)特异性结合PD1或PD-L1的抗体或其抗原结合部分，和(c)特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分。

本发明的第二方面提供用于治疗实体肿瘤的方法中的特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区的抗体竞争结合人类CD40，并且其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与具有癌症治疗功效的另一种免疫治疗剂组合使用，所述免疫治疗剂不是抗CD40抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分如上文关于本发明的第一方面所讨论。

在一个实施方案中，所述具有癌症治疗功效的另外的免疫治疗剂如上文关于本发明的第一方面所讨论。

本发明的相关的第三方面提供特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗实体肿瘤的药物中的用途，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区的抗体竞争结合人类CD40，并且其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与具有癌症治疗功效的另一种免疫治疗剂组合使用，所述免疫治疗剂不是抗CD40抗体或其抗原结合片段。

本发明的第四方面提供一种药物组合物，其包含(a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和(b)具有癌症治疗功效的另一种免疫治疗剂，所述免疫治疗剂不是抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与包含SEQ IDNO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区的抗体竞争结合人类CD40。

本发明的第五方面提供一种治疗实体肿瘤的试剂盒，其包含(a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和(b)具有癌症治疗功效的另一种免疫治疗剂，所述免疫治疗剂不是抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区的抗体竞争结合人类CD40。

本发明的第六方面提供一种治疗受试者中的实体肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的以下：(a)向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和(b)向所述受试者施用治疗有效量的具有癌症治疗功效的另一种免疫治疗剂，所述免疫治疗剂不是抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区的抗体竞争结合人类CD40。

在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)是同时进行的或者其中步骤(b)是在步骤(a)之后24小时至两周、步骤(a)之后24小时至一周、步骤(a)之后24小时至72小时或步骤(a)之后24小时至48小时进行的。

在一个实施方案中，步骤(a)包括向肿瘤部位局部施用所述抗体。

在一个实施方案中，至少30％的在步骤(a)中施用的抗体量在施用后4小时保留在肿瘤部位，优选地其中至少40％的所述量在施用后4小时保留在肿瘤部位。

在一个实施方案中，步骤(b)的额外治疗剂与至少一种药学上可接受的稀释剂或载体被配制成适合全身施用的组合物。

在一个实施方案中，在多个分开的场合进行步骤(a)并且进行步骤(b)以使得所述受试者对额外治疗剂的暴露在所述方法的持续时间内是连续的。

在一个实施方案中，所述受试者是人类。

本发明人也已令人惊讶地证实，在施用至受试者后，某些抗CD40抗体保留在实体肿瘤部位。因此，仅一小部分的抗体从肿瘤部位逃逸到受试者的血管或淋巴循环中。

这导致非常有效的治疗，以及减少的副作用，使得能够使用较低剂量的抗体。当这种抗体局部施用于受试者中的肿瘤部位时，这些优点特别明显，但当所述抗体被全身施用时，这些优点也可能是显而易见的。

然而，本领域技术人员应理解，抗CD40抗体也可全身性(例如静脉内或皮下)施用至受试者。

本发明人还令人惊讶地证实，保留在肿瘤部位的抗CD40抗体与向受试者全身施用额外治疗剂的组合施用导致相对于仅施用抗CD40抗体的治疗作用改善。

因此，本发明提供一种治疗受试者中的实体肿瘤的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合CD40并在施用后保留在肿瘤部位的抗体，和任选地(b)向所述受试者全身施用治疗有效量的额外治疗剂。步骤(a)和(b)可同时进行。可选地，步骤(a)和(b)可依序进行，只要步骤(a)在步骤(b)之前即可。在步骤(a)中，抗CD40抗体优选局部施用至肿瘤。

本发明还提供一种用于治疗受试者中的实体肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含(a)治疗有效量的特异性结合CD40并在施用后保留在肿瘤部位的抗体，和任选地(b)治疗有效量的适合全身施用至受试者的额外治疗剂。所述特异性结合CD40的抗体优选以适合局部施用至肿瘤的形式提供。

序列表的简要描述

SEQ ID NO:1、2和3分别是抗体G12的轻链的CDR 1、2和3(根据IMGT编号来定义)。

SEQ ID NO:4、5和6分别是抗体G12的重链的CDR 1、2和3(根据IMGT编号来定义)。

SEQ ID NO:7和8分别是抗体G12的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9和10分别是抗体G12的轻链可变区和重链可变区的核酸序列。

SEQ ID NO:11是示例性轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12是示例性重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13是人类CD40的氨基酸序列。

附图说明

图1示出在以100μg的剂量经肿瘤内(IT)、经肿瘤周围(PT)或经静脉内(IV)施用抗体后在带有hCD40阴性膀胱癌细胞MB49的肿瘤的hCD40tg小鼠的血清中可检测到的抗体水平。

图2示出在经由皮下或静脉内途径以指定剂量施用抗体后在食蟹猴的血样中可检测到的抗体水平。

图3示出(A)B16.F10(hCD40+)克隆5.G12.46细胞和(B)模拟转染细胞的细胞表面人类CD40表达的流式细胞术分析的结果。

图4A示出带有皮下B16.F10(hCD40+)黑素瘤的hCD40tg小鼠在用对照、仅ADC-1013或者ADC-1013与抗PD-1抗体(“PD-1”)处理后的存活率。

图4B示出在第一只小鼠被处死当天每个治疗组的肿瘤体积。该图示出来自两个单独实验(n＝16)的汇集数据。使用ADC-1013治疗证明显著的抗肿瘤功效和增加的存活率。用抗PD-1联合治疗观测到改善的抗肿瘤功效和改善的存活率(*＝p<0.05，**＝<0.01，关于存活率的对数秩检验和关于肿瘤体积的Mann-Whitney检验)。

图5A示出在小鼠肿瘤模型中在抗CD40抗体的不同施用途径后在引流淋巴结中测定CD11c阳性细胞活化的结果。肿瘤内施用(IT)、腹膜内施用(IP)。活化由通过平均荧光强度(MFI)测量的CD86表达水平指示。

图5B示出在小鼠肿瘤模型中在抗CD40抗体的不同施用途径后在引流淋巴结中测定CD11b阳性细胞活化的结果。肿瘤内施用(IT)、腹膜内施用(IP)。活化由通过平均荧光强度(MFI)测量的CD86表达水平指示。

图6.在一侧胁腹上接种B16.F10.hCD40+肿瘤。在第3、6和9天施用治疗。经肿瘤内施用ADC-1013(每剂100μg)。经腹膜内注射每剂250μg抗PD-1(克隆RPM1-14，BioXcell)和每剂100μg抗CTLA-4抗体(9D9，BioXcel)。示出第14天的肿瘤体积。

图7.在一侧胁腹上接种B16.F10肿瘤。在第3、6和9天施用治疗。经肿瘤内施用ADC-1013、抗CD137(Lob 12.3)和抗OX40(CD86)抗体和对照(每剂100μg)。跟踪肿瘤体积随时间的变化。

图8A和图8B.在用ADC-1013或对照(肿瘤内，100μg，第3、6和9天)治疗后，ADC-1013在B16.F10.hCD40+肿瘤中的抗肿瘤作用相比于在B16.F10(wt)肿瘤中的抗肿瘤作用。

图9A和图9B.在具有确定的淋巴瘤肿瘤(A20)的hCD40tg-BalbC(F1)小鼠中在第10、13、16天经肿瘤内施用ADC-1013(30μg)。肿瘤体积和存活率随时间的变化呈现于图中。

图10.在具有确定的肿瘤(LLC-1)的hCD40tg小鼠中在第4、7和10天经肿瘤内施用ADC-1013(100μg)。肿瘤体积随时间的变化呈现于图中。

图11.在B16.F10黑素瘤癌转移模型中的抗肿瘤作用。在肿瘤接种后第3、6和9天，在每侧胁腹上具有一个肿瘤的hCD40tg小鼠在右胁腹上的肿瘤中经肿瘤周围接受100μgADC-1013。注射(右侧肿瘤)和非注射(左侧)肿瘤的肿瘤体积随时间的变化显示在图中。

图12.第16天的肿瘤体积。在具有确定的黑素瘤肿瘤(B16.F10.hCD40+)的hCD40tg小鼠中在第3、6和9天经静脉内施用ADC-1013 100μg(n＝12)。

图13示出在BalbC小鼠中的皮下A20淋巴瘤肿瘤中的抗肿瘤作用(通过存活率随时间的变化测量)。在第5天和第8天经肿瘤周围用9D9(抗CTLA-4抗体，BioXcel)治疗小鼠并且在第5、8和11天经肿瘤内用TLR激动剂CpG(1668)治疗小鼠。

具体实施方式

应当理解，所公开的组合疗法和方法的不同应用可根据本领域中的具体需要定制。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述本发明的具体实施方案的目的，而不意在限制。

此外，除非内容另有明确指示，否则如在本说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，对“一种抗体”的提及包括“多种抗体”，对“一种抗原”的提及包括两种或更多种这样的抗原，对“一个受试者”的提及包括两个或更多个这样的受试者，等等。

“多肽”在本文中以其最广泛的含义使用，以指代两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物。因此，术语“多肽”包括短肽序列以及更长的多肽和蛋白质。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。

“保留在实体肿瘤部位”包括抗CD40抗体仅从肿瘤区域缓慢释放。抗体保留在肿瘤部位可通过监测施用后抗体的血清水平来评估(参见Mangsbo等,2014,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》,21(5):1115-1126，其公开内容以引用的方式并入本文中)。例如，在一个实施方案中，在肿瘤内注射30μg抗体(60μL)后4小时的抗CD40血清水平小于1μL/ml。

物质的“治疗有效量”是指给定物质以足以治愈、缓解或部分阻止病状或一种或多种其症状的量施用至罹患所述病状的受试者。这种治疗性处理可导致疾病症状的严重程度降低，或无症状期的频率或持续时间增加。给定目的和给定药剂的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状态。如本文所用，术语“受试者”包括任何哺乳动物，优选是人类。

本文(无论上文或下文)引用的所有出版物、专利和专利申请特此以全文引用的方式并入。

方法

本发明提供一种治疗受试者中的实体肿瘤的方法。所述肿瘤通常是恶性的并且可以是转移性的。

实体肿瘤在传统上由它们起源的组织限定，例如乳腺、结肠等。然而，由于免疫疗法作用于免疫系统，而不是作用于肿瘤本身，所以肿瘤的免疫状态可能比肿瘤的起源更能预测应答。在本文提出的支持研究中，更详细的两种不同模型，黑素瘤模型B16.F10(具有和不具有人类CD40)和MB49膀胱肿瘤模型。下文实施例中呈现的数据显示MB49比B16.F10更具免疫原性。然而，在两种模型中，在用如本文所述的抗CD40抗体治疗后，观测到显著的抗肿瘤作用。因此，本发明提供在免疫原性肿瘤(如MB49)和低免疫原性模型(如B16.F10)中的抗肿瘤作用。

因此，在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤是免疫原性的。这些肿瘤的特征在于免疫细胞例如T细胞和骨髓源细胞的浸润。已经证明，CD8 T细胞的浸润，即更具免疫原性的肿瘤谱，与治疗后的良好预后相关，例如在结肠癌中(Galon等,2014,《病理学杂志(J.Pathol.)》,232(2):199-209)。

在本发明的一个替代实施方案中，所述肿瘤是非免疫原性或低免疫原性的。低免疫原性肿瘤通常具有低MHCI表达或无MHCI表达，并且特征在于浸润性免疫细胞如T细胞和骨髓源细胞的数量较低(Lechner等,2013,《免疫疗法杂志(J Immunotherapy)》,36(9):477-89)。所述肿瘤可以是腺瘤、腺癌、胚细胞瘤、癌瘤、硬纤维瘤、促纤维组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤、肉瘤、维尔姆斯瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、淋巴肿瘤、乳腺肿瘤或黑素瘤。

胚细胞瘤的类型包括肝母细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤。癌瘤的类型包括结肠直肠癌或肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌和头颈癌和腺癌。肉瘤的类型包括尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、横纹肌肉瘤或任何其它软组织肉瘤。黑素瘤的类型包括恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、粘膜黑素瘤、结节性黑素瘤、息肉状黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、无黑色素性黑素瘤、软组织黑素瘤、具有小痣样细胞的黑素瘤、具有Spitz痣特征的黑素瘤和葡萄膜黑素瘤。淋巴瘤的类型包括前体T细胞白血病/淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、蕈样真菌病、外周T细胞淋巴瘤、结节性硬化形式的霍奇金淋巴瘤、混合细胞亚型的霍奇金淋巴瘤。肺肿瘤的类型包括非小细胞肺癌(腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌)和小细胞肺癌的肿瘤。

黑素瘤的发病率越来越高，并且每年在世界各地诊断出大约200,000个新病例。此外，黑素瘤非常适合在诊所局部施药，因为原发性肿瘤以及转移瘤通常易于接近。因此，对于本发明的方法，所述肿瘤优选是黑素瘤，并且最优选是转移性黑素瘤。由于高乳酸脱氢酶测试结果，所述肿瘤可被归类为转移性的。所述肿瘤可以被分类为以下阶段中的任何一个，但优选为III或IV期。

0期：原位黑素瘤(Clark I级)，99.9％存活率

I/II期：侵袭性黑素瘤，89-95％存活率

T1a：小于1.0mm原发肿瘤厚度，无溃疡，并且有丝分裂<1/mm²

T1b：小于1.0mm原发肿瘤厚度，有溃疡或有丝分裂≥1/mm²

T2a：1.01-2.0mm原发肿瘤厚度，无溃疡

II期：高风险黑素瘤，45-79％存活

T2b：1.01-2.0mm原发肿瘤厚度，有溃疡

T3a：2.01-4.0mm原发肿瘤厚度，无溃疡

T3b：2.01-4.0mm原发肿瘤厚度，有溃疡

T4a：大于4.0mm原发肿瘤厚度，无溃疡

T4b：大于4.0mm原发肿瘤厚度，有溃疡

III期：局部转移，24-70％存活率

N1：单个阳性淋巴结

N2：两到三个阳性淋巴结或局部皮肤/通路中转移

N3：四个阳性淋巴结或一个淋巴结和局部皮肤/通路中转移

IV期：远处转移，7-19％存活率

M1a：远处皮肤转移，正常LDH

M1b：肺转移，正常LDH

M1c：其它远处转移或具有升高的LDH的任何远处转移

本发明的方法包括：(a)向受试者施用治疗有效量的特异性结合CD40并在施用后保留在肿瘤部位的抗体，和任选地(b)向受试者全身施用治疗有效量的额外治疗剂。下文更详细地描述抗体在肿瘤部位的保留。步骤(a)和(b)可同时进行。可选地，步骤(a)和(b)可依序进行，只要步骤(a)在步骤(b)之前即可。在步骤(a)中，所述抗CD40抗体优选局部施用于肿瘤。

本发明的方法具有若干优点。首先，因为抗CD40抗体保留在肿瘤部位，所以其作为治疗是非常有效的。此外，对于抗CD40抗体的全身暴露减少，从而允许使用较低剂量的抗体并导致副作用较少。当进行步骤(b)时，治疗作用进一步改善。

本发明还提供：

-用于治疗受试者中的实体肿瘤的方法中的特异性结合CD40并在施用后保留在肿瘤部位的抗体，所述方法包括：(a)向所述受试者施用治疗有效量的所述特异性结合CD40的抗体，和任选地(b)向所述受试者全身施用治疗有效量的额外治疗剂。步骤(a)和(b)可同时进行。可选地，步骤(a)和(b)可依序进行，只要步骤(a)在步骤(b)之前即可。在步骤(a)中，所述抗CD40抗体优选局部施用于肿瘤。

-特异性结合CD40并在施用后保留在肿瘤部位的抗体在制造用于治疗受试者中的实体肿瘤的药物中的用途，其中所述治疗包括：(a)向所述肿瘤施用治疗有效量的所述特异性结合CD40的抗体，和任选地(b)向所述受试者全身施用治疗有效量的额外治疗剂。步骤(a)和(b)可同时进行。可选地，步骤(a)和(b)可依序进行，只要步骤(a)在步骤(b)之前即可。在步骤(a)中，所述抗CD40抗体优选局部施用于肿瘤。

-含有以下的产品：(1)特异性结合CD40并在施用后保留在肿瘤部位的抗体，和任选地(2)用于同时、分别或依序用于治疗受试者中的实体肿瘤的方法中的额外治疗剂，所述方法包括(a)向所述肿瘤局部施用治疗有效量的所述特异性结合CD40的抗体，和任选地(b)向所述受试者全身施用治疗有效量的额外治疗剂。步骤(a)和(b)可同时进行。可选地，步骤(a)和(b)可依序进行，只要步骤(a)在步骤(b)之前即可。在步骤(a)中，所述抗CD40抗体优选局部施用于肿瘤。

步骤(a)和(b)的时间选择和次序

步骤(a)和(b)优选依序(即在不同时间)进行，其中步骤(a)在步骤(b)之前进行。

步骤(a)和(b)优选间隔一段时间间隔以使得组合抗肿瘤作用被优化。这通常意味着在步骤(a)之后的足够长间隔时间进行步骤(b)，以使得步骤(a)的至少一种生理作用处于或接近其峰值水平。例如，所述抗CD40抗体通常会刺激树突状细胞，这又导致肿瘤特异性T细胞的激活。激活的T细胞在用抗CD40治疗约24小时内开始表达较高水平的免疫系统检查点分子(例如PD-1)。这些免疫系统检查点分子可负性调节抗肿瘤反应。步骤(b)中施用的药剂因此可优选为阻断或抑制所述免疫系统检查点的所述活性的药剂(例如抗PD1或抗PDL1抗体)。当步骤(b)中施用的药剂是这样的药剂时，步骤(b)优选在步骤(a)之后足够长的时间间隔进行，以使得受试者中的细胞中的免疫系统检查点分子的表达水平或表达所述免疫系统检查点分子的受试者中的细胞数量相对于在步骤(a)之前的受试者中的所述水平或数量或者相对于健康受试者中的所述水平或数量升高。在该上下文中，步骤(b)优选在步骤(a)之后24小时至两周、步骤(a)之后24小时至一周、步骤(a)之后24小时至72小时或步骤(a)之后24小时至48小时进行。

可选地，步骤(b)可在步骤(a)之后的时间点进行，其中受试者的细胞中的免疫系统检查点分子的表达水平或表达所述免疫系统检查点分子的受试者中的细胞数量经确定为相对于在步骤(a)之前的受试者中的所述水平或数量或者相对于健康受试者中的所述水平或数量升高。

受试者的细胞中的免疫系统检查点分子的表达水平或表达这种分子的受试者中的细胞数量可通过任何合适的方式，例如通过从受试者获取的样品的流式细胞术分析来确定。

可选地，可以优选同时地(即同时)或在彼此的24小时内进行步骤(a)和(b)，使得两个步骤可在同一天或在同一次访视治疗中心期间进行。这在对治疗中心的访问受限的情况下可能是特别有利的。在这种情况下，步骤(a)和(b)可同时进行，或者可间隔不到24小时、间隔不到12小时、间隔不到10小时、间隔不到6小时、间隔不到4小时、间隔不到3小时或间隔不到2小时进行。

在任何上述实施方案中，步骤(a)可在第一次情况后的多个其它情况进行。也就是说，受试者可接受一系列剂量的抗CD40抗体。施用这些剂量以使得受试者仅间歇暴露于抗CD40抗体，优选地使得受试者的免疫细胞不会变得耗尽和/或受试者不遭受抗CD40抗体的快速耐受。在检测到这些症状中的任一种时，抗CD40抗体的下一次施用可能延迟或取消。如果施用多个剂量的抗CD40，则步骤(b)优选以如下方式进行：在步骤(b)开始之后，允许受试者在该方法的持续时间内(包括在步骤(a)的任何第二和另外的情况期间)连续暴露于额外治疗剂。当额外药剂是阻断或抑制免疫系统检查点的所述活性的药剂(例如抗PD1或抗PDL1抗体)时，这可能是特别适合的。对于这些药剂的治疗作用，连续受体阻断可能是特别重要的。

步骤(a)

所述方法的步骤(a)涉及向具有实体肿瘤的受试者局部或全身施用抗CD40抗体。对肿瘤部位的局部施药是优选的并且包括通过任何合适的手段(例如注射)进行的肿瘤周围、近肿瘤、肿瘤内、病灶内、病灶周围、颅内和囊内施用。局部施用还可包括腔内输注和吸入，这取决于肿瘤的部位。

在施用抗CD40抗体后的一段延长时期内，高比例的所述抗体将保留在体内肿瘤部位，即在肿瘤微环境内。也就是说，所述抗体表现出从肿瘤部位到血管或淋巴循环的渗漏减少，特别是当局部施用至肿瘤部位时。优选地至少30％的根据所述方法施用至肿瘤的抗体剂量在施用后四小时保留在肿瘤部位中，更优选地至少40％的剂量在施用后四小时得以保留并且最优选地至少50％的剂量在施用后四小时得以保留。

可以通过将抗体注射到鼠类模型中的肿瘤中并在施用后测量抗体的血清水平随时间的变化来研究肿瘤微环境中的抗体保留。可选地，可以使用注射到鼠类模型中的肿瘤中的放射性标记抗体来测量抗体的分布。合适的技术描述于实施例中。

体内肿瘤微环境中的pH相比于健康组织中的酸性显著更强。肿瘤的范围据报道为大约pH 6.5至7.2或6.6至7.0，而相比之下健康组织为7.2至7.4。这种酸性主要是由于因组织不良的脉管系统具有减少的混乱血流而造成的经受短期或长期缺氧的肿瘤区域中的厌氧糖酵解，和有氧糖酵解(Warburg效应)，这是其中即使在氧存在下也使用糖酵解代谢途径的常见癌症表型性质。鉴于此酸性，本发明的方法中使用的抗CD40抗体可优选具有高等电点，因为这将导致相对于具有较低等电点的类似抗体在肿瘤微环境中的保留改善。

可通过任何合适的方法来测定抗体的等电点。其可例如通过电泳方法在体外测定。可选地，可根据基本原理来计算等电点。在这种情况下，所得到的等电点通常被称为理论等电点。对于理论等电点的计算机计算，存在众多软件程序，例如GP-MAW(9.2版，来自Lighthouse Data)。本发明的方法中使用的抗CD40抗体优选具有9.0或以上、优选9.1或以上、更优选9.2或以上、或9.25或以上、最优选9.3或以上的理论等电点(pI)。

步骤(b)

所述方法的步骤(b)涉及额外治疗剂向受试者的全身施用。本文所述的任何药剂(包括步骤(a)的抗CD40抗体)的全身施用是指施用至受试者的循环系统(包括血管和/或淋巴系统)中。这种施用可通过任何合适的途径，但通常是肠胃外。

如本文所用的短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用模式，并且通常通过注射、输注或植入来实现。合适的途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓、脑内、鞘内、骨内或其它肠胃外施用途径。

抗体

概要

如本文所提及的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。抗体是指包含通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每个重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着更保守的被称为框架区(FR)的区域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。

重链可以是任何同种型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。

轻链包括κ链和λ链。

特别相关的是抗体和其抗原结合片段，其已被“分离”以便存在于与它在自然界中可能存在的环境不同的物理环境中，或者已经被修饰以与氨基酸序列中的天然存在的抗体不同。

抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。抗体可通过任何合适的方法产生。例如，适于产生单克隆抗体的方法公开于“《单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies；Amanual of techniques)》”,H Zola(CRC Press,1988)和“《单克隆杂交瘤抗体：技术和应用(Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Application)》”,SGR Hurrell(CRC Press,1982)中。也可使用重组技术。

术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原(例如CD40)的能力的抗体的一个或多个片段。已经证实抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括Fab片段、F(ab')₂片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段和分离的互补决定区(CDR)。单链抗体如scFv和重链抗体如VHH和骆驼抗体也旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段可使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且所述片段可被筛选以与完整抗体相同的方式利用。

用于本发明的方法中的抗体可为人类抗体。如本文所用的术语“人类抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架和CDR区都源自人类生殖系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则所述恒定区也源自人类生殖系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人类抗体”不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的生殖系的CDR序列已经被移植到人类框架序列上的抗体，所述抗体通常被称为嵌合或人源化的。

用于本发明的方法的人类抗体通常是人类单克隆抗体。这种人类单克隆抗体可通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从具有包含与永生化细胞融合的人类重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人类动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞。人类抗体也可通过人类淋巴细胞的体外免疫，接着用爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)转化淋巴细胞来制备。术语“人类抗体衍生物”是指人类抗体的任何修饰形式，例如，抗体与另一种药剂或抗体的结合物。

用于本发明的方法中的抗体可选地可为人源化抗体。

术语“人源化”是指通常使用重组技术制备的抗体分子，其具有源自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列的其余免疫球蛋白结构。所述抗原结合位点可包含与人类恒定结构域融合的完全非人类抗体可变结构域，或仅包含移植到人类可变结构域的适当人类框架区的这些可变结构域的互补决定区(CDR)。这些人源化分子的框架残基可为野生型(例如，完全人类)或者它们可被修饰以含有在其序列作为人源化基础的人类抗体中不存在的一个或多个氨基酸取代。人源化减少或消除了分子的恒定区将在人类个体中作为免疫原的可能性，但对于外来可变区的免疫应答的可能性仍然存在(LoBuglio,A.F.等,(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody InMan:Kinetics And Immune Response,”《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)(U.S.A.)》86:4220-4224)。另一种方法不仅集中于提供人源恒定区，而且还修改可变区以便将它们尽可能接近地重构成人类形式。已知重链和轻链的可变区含有三个互补决定区(CDR)，其响应于所讨论的抗原而变化并决定结合能力，侧接在给定物种中相对保守并且推定为CDR提供骨架的四个框架区(FR)。当针对特定抗原制备非人类抗体时，可以通过将源自非人类抗体的CDR移植在待修饰的人类抗体中存在的FR而将可变区“重构”或“人源化”。这种方法对于各种抗体的应用已由以下报道：Sato,K.等,(1993)《癌症研究(Cancer Res)》,53:851-856；Riechmann,L.等,(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”《自然(Nature)》,332:323-327；Verhoeyen,M.等,(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting An Antilysozyme Activity,”《科学(Science)》,239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等,(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody ByCDR-Grafting:The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,”《蛋白质工程(Protein Engineering)》,4:773-3783；Maeda,H.等,(1991)“Construction OfReshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”《人类抗体杂交瘤(Human Antibodies Hybridoma)》,2:124-134；Gorman,S.D.等,(1991)“Reshaping ATherapeutic CD4Antibody,”《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)(U.S.A.)》88:4181-4185；Tempest,P.R.等,(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody ToInhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,”《生物技术(Bio/Technology)》,9:266-271；Co,M.S.等,(1991)“Humanized Antibodies For AntiviralTherapy,”《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)(U.S.A.)》88:2869-2873；Carter,P.等,(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human CancerTherapy,”《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)(U.S.A.)》89:4285-4289；和Co,M.S.等,(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33Antigen,”《免疫学杂志(J.Immunol.)》,148:1149-1154。在一些实施方案中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施方案中，人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，其也被称为“源自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。人源化抗原的能力是众所周知的(参见例如美国专利No.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。

本文提及的任何抗体可以分离的形式提供或者可任选地提供与另一个部分连接(直接地或间接地)。所述另一个部分可为治疗分子，例如细胞毒性部分或药物。

治疗分子可例如通过化学结合直接连接到本发明的抗体。用于将分子与抗体结合的方法是本领域中已知的。例如，可使用碳化二亚胺结合(Bauminger和Wilchek(1980)《酶学方法(Methods Enzymol.)》,70,151-159)将多种药剂(包括多柔比星)与抗体或肽结合。水溶性碳化二亚胺1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)特别可用于将功能部分与结合部分结合。

还可以使用将部分结合到抗体的其它方法。例如，可以使用高碘酸钠氧化，接着是适当反应物的还原性烷基化，戊二醛交联也可以。然而，应认识到，无论选择产生本发明的结合物的哪种方法，都必须确定抗体保持其靶向能力并且功能部分保持其相关功能。

细胞毒性部分可以是直接和/或间接细胞毒性的。“直接细胞毒性”是指所述部分本身具细胞毒性者。“间接细胞毒性”是指所述部分尽管本身不具细胞毒性但可以例如通过其对另一个分子的作用或通过作用于其上的另一个分子来诱导细胞毒性者。细胞毒性部分可以仅在细胞内时具细胞毒性并且优选在细胞外时不具细胞毒性。

优选地，将抗体或抗原结合片段连接至作为直接细胞毒性化学治疗剂的细胞毒性部分。任选地，所述细胞毒性部分是直接细胞毒性多肽。细胞毒性化学治疗剂是本领域中众所周知的。

细胞毒性化学治疗剂(例如抗癌剂)包括：烷化剂，包括氮芥如二氯甲二乙胺(HN2)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，例如六甲蜜胺、塞替派；磺酸烷酯，例如白消安；亚硝基脲，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)和链脲佐菌素(链脲霉素)；和三氮烯，例如达卡巴嗪(DTIC；二甲基三氮烯咪唑-甲酰胺)；抗代谢物，包括叶酸类似物如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)；嘧啶类似物，例如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；和嘌呤类似物和相关抑制剂，例如巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他丁(2'-脱氧助间型霉素)。天然产物，包括长春花生物碱，例如长春碱(VLB)和长春新碱；表鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素，例如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素；红霉素)、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C)；酶，例如L-天冬酰胺酶；和生物反应调节剂，例如干扰素alphenome。各种药剂，包括铂配位络合物，例如顺铂(顺式DDP)和卡铂；蒽二酮，例如米托蒽醌和蒽环霉素；被取代的脲，例如羟基脲；甲基肼衍生物，例如丙卡巴肼(N-甲基肼；MIH)；和肾上腺皮质抑制剂，例如米托坦(o,p'-DDD)和氨鲁米特；紫杉醇和类似物/衍生物；以及激素激动剂/拮抗剂，例如氟他胺和他莫昔芬。

所述细胞毒性部分可以是导致细胞死亡的细胞毒性肽或多肽部分。细胞毒性肽和多肽部分是本领域中众所周知的并且包括例如蓖麻毒素、相思豆毒素、假单胞菌外毒素、组织因子等。将它们连接到靶向部分如抗体的方法也是本领域中已知的。其它核糖体失活蛋白在WO 96/06641中被描述为细胞毒性剂。假单胞菌外毒素也可用作细胞毒性多肽。某些细胞因子如TNFα和IL-2也可用作细胞毒性剂。

如果以足够剂量递送，则某些放射性原子也可能具细胞毒性。因此，细胞毒性部分可包含放射性原子，其在使用中将足够量的放射性递送至靶位点以便具细胞毒性。合适的放射性原子包括磷-32、碘-125、碘-131、铟-111、铼-186、铼-188或钇-90，或发射足够能量以破坏相邻细胞、细胞器或核酸的任何其它同位素。优选地，本发明的药剂中的放射性原子的同位素和密度使得超过4000cGy(优选至少6000、8000或10000cGy)的剂量被递送到靶位点，并且优选递送到靶位点的细胞和其细胞器，特别是细胞核。

放射性原子可以已知方式连接到抗体、其抗原结合片段、变体、融合物或衍生物。例如，EDTA或另一种螯合剂可连接到结合部分并用于连接111In或90Y。酪氨酸残基可直接用125I或131I标记。

所述细胞毒性部分可以是合适的间接细胞毒性多肽。所述间接细胞毒性多肽可以是具有酶促活性的多肽并且可以将无毒和/或相对无毒的前药转化为细胞毒性药物。关于抗体，这种类型的系统通常被称为ADEPT(抗体定向酶前药疗法)。该系统要求抗体将酶部分定位于患者体内的所需部位，并且在允许酶定位在所述部位的时间后，施用作为酶底物的前药，催化的最终产物是细胞毒性化合物。该方法的目的是使药物在所需部位的浓度最大化并使药物在正常组织中的浓度最小化。所述细胞毒性部分能够将非细胞毒性药物转化为细胞毒性药物。

使用如本文所述的靶向酶的系统的酶和前药可以是先前提出的任何酶。细胞毒性物质可以是任何现有的抗癌药物，例如烷化剂；插入DNA中的药剂；抑制任何关键酶如二氢叶酸还原酶、胸苷合成酶、核糖核苷酸还原酶、核苷激酶或拓扑异构酶的药剂；或通过与任何其它细胞成分相互作用而实现细胞死亡的药剂。依托泊苷是拓扑异构酶抑制剂的一个实例。

所报道的前药系统包括表1中列出的那些。

表1

适于形成酶部分的一部分的酶包括：外肽酶，例如羧肽酶G、G1和G2(对于谷氨酰化的芥前药)、羧肽酶A和B(对于基于MTX的前药)和氨肽酶(对于2-α-氨基酰基MTC前药)；内肽酶，例如溶栓素(对于凝血酶前药)；水解酶，例如磷酸酶(例如碱性磷酸酶)或硫酸酯酶(例如芳基硫酸酯酶)(对于磷酸化或硫酸化前药)；酰胺酶，例如青霉素酰胺酶和芳基酰基酰胺酶；内酰胺酶，例如β-内酰胺酶；糖苷酶，例如β-葡糖醛酸酶(对于β-葡萄糖醛酸蒽环)、α-半乳糖苷酶(对于杏仁苷)和β-半乳糖苷酶(对于β-半乳糖蒽环)；脱氨酶，例如胞嘧啶脱氨酶(对于5FC)；激酶，例如尿激酶和胸苷激酶(对于更昔洛韦)；还原酶，例如硝基还原酶(对于CB1954和类似物)、偶氮还原酶(对于偶氮苯芥)和DT-心肌黄酶(对于CB1954)；氧化酶，例如葡萄糖氧化酶(对于葡萄糖)、黄嘌呤氧化酶(对于黄嘌呤)和乳过氧化物酶；DL-消旋酶、催化抗体和环糊精。

优选地，所述前药与细胞毒性药物相比是相对无毒的。通常，如在合适的体外细胞毒性测试中所测量，其具有小于10％的毒性、优选地小于1％的毒性。

可能的是，能够将前药转化为细胞毒性药物的部分将与本发明药剂的其余部分分离而具活性，但必要的是仅当(a)它与本发明药剂的其余部分组合和(b)本发明药剂连接、邻接或内化在靶细胞中时才具活性。

当每个部分是多肽时，这两个部分可通过交联多肽的任何常规方式连接在一起。例如，抗体或抗原结合片段可能富集硫醇基团和与能够与那些硫醇基团反应的双官能试剂(例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP))反应的另一个部分。例如用间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯实现的酰胺和硫醚键在体内通常比二硫键更稳定。

所述细胞毒性部分可能是放射敏化剂。放射敏化剂包括氟嘧啶、胸苷类似物、羟基脲、吉西他滨、氟达拉滨、烟酰胺、卤化嘧啶、3-氨基苯甲酰胺、3-氨基苯甲二酰胺、依他硝唑、哌莫硝唑和米索硝唑。此外，将基因递送到细胞中可以将它们放射敏化，例如p53基因或细胞周期蛋白D的递送。所述另外的部分可为在照射时变得具细胞毒性或释放细胞毒性部分者。例如，当适当照射时，硼-10同位素释放出具有细胞毒性的α粒子。类似地，所述细胞毒性部分可为可用于光动力学疗法中的一种，例如光敏素。

对CD40具特异性的抗体

本发明的组合疗法和方法利用免疫特异性结合CD40的抗体，即“抗CD40抗体”。在一个实施方案中，所述抗体在施用于受试者后保留在肿瘤部位(参见上文步骤(a)下的讨论)。所述抗体优选特异性结合CD40，也就是说它结合于CD40但不结合或者以较低亲和力(例如低10倍的亲和力)结合于其它分子。除非另有说明，否则如本文所用的术语CD40是指人类CD40。人类CD40的序列以SEQ ID NO:13示出。本发明的抗CD40抗体可对于来自其它哺乳动物的CD40(例如灵长类动物或鼠类CD40)具有一些结合亲和力。所述抗体当定位在细胞表面上时优选结合于人类CD40。

特别地，在本发明的组合疗法中使用的抗CD40抗体与包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区(任选地以及分别为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的轻链和重链恒定区)的‘参考抗体’竞争结合人类CD40。这种竞争性结合抑制可以使用本领域中熟知的测定法和方法，例如使用具有固定化人类CD40的BIAcore芯片并在参考抗体存在下在具有和不具有待测试的抗体多肽的情况下温育来确定。可选地，可以使用成对定位方法，其中参考抗体固定在BIAcore芯片的表面，人类CD40结合到固定化抗体，然后对第二抗体测试与人类CD40的同时结合能力(参见'BIAcore Assay Handbook',GE HealthcareLife Sciences,29-0194-00AA 05/2012；其公开内容以引用的方式并入本文中)。

示例性抗CD40抗体公开于Alligator Bioscience AB的WO 2013/034904中(其公开内容以引用的方式并入本文中)。

所述抗体优选能够以其天然状态结合于CD40并且特别是结合于位于细胞表面上的CD40。优选地，抗体将特异性结合于CD40。也就是说，在本发明方法中使用的抗体将优选以相比于其结合另一个分子的更大的结合亲和力结合于CD40。

“位于细胞表面上”是指CD40与细胞缔合以使得CD40的一个或多个区域存在于细胞表面的外表面上。例如，CD40可插入具有存在于细胞外表面上的一个或多个区域的细胞质膜中(即，定向为跨膜蛋白)。这可能发生在细胞表达CD40的过程中。因此，在一个实施方案中，“位于细胞表面上”可能是指“在细胞表面上表达”。可选地，CD40可能在具有共价和/或离子相互作用的细胞外部，将其定位到细胞表面的一个或多个特定区域。

在本发明的组合疗法和方法中使用的抗CD40抗体可诱导和/或增强表达CD40的细胞的ADCC介导的裂解和/或增强表达CD40的细胞的凋亡。所述细胞通常是肿瘤细胞。“增强”是指相对于在适当的对照物质存在下裂解或凋亡的细胞数量，在本发明的抗体存在下裂解或凋亡的细胞数量增加。用于测定细胞样品中的ADCC介导的裂解或凋亡水平的方法是本领域中众所周知的。例如，可使用铬-51释放测定法、铕释放测定法或硫-35释放测定法。在这些测定法中，将表达抗原(在这种情况下为CD40)的先前标记的靶细胞系与待测试的抗体一起温育。在洗涤后，效应细胞(通常表达Fc受体CD16)与抗体标记的靶细胞共温育。随后利用闪烁计数器或分光光度计通过细胞内标记的释放来测量靶细胞裂解。

优选地，所述抗体、抗原结合片段包含抗体Fc区。技术人员应理解，Fc部分可能来自IgG抗体，或来自不同类别的抗体(例如IgM、IgA、IgD或IgE)。例如，Fc区可能来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。然而，有利的是，Fc区来自IgG1抗体。

所述Fc区可能是天然存在的(例如内源性产生的抗体的一部分)或者可能是人工的(例如相对于天然存在的Fc区包含一个或多个点突变)。例如通过改变血清半衰期或改善与ADCC和CDC中所涉及的Fcγ受体(FcγR)的结合，具有提高其结合FcR的能力的点突变的Fc区可能是有利的。特别是，增强与FcγRIIB的结合的突变，例如S267E(Strohl等,2009,《生物技术新见(Curr Opin Biotechnol)》,20:685-691)对于本发明可能是有利的，提供FcγRIIB结合与CD40抗体的功能活性之间的关联(Li等,2011,《科学(Science)》,333:1030-1034)。

作为在这些测定法中所需的放射性同位素标记的替代方法，可使用其中通过测量天然存在于靶细胞中的酶的释放来检测裂解的方法。这可通过检测(例如生物发光检测)酶催化反应的产物来实现。在这样的测定法中不需要细胞的先前标记。用这种测定法检测的典型细胞酶是GAPDH。

在本发明的组合疗法和方法中使用的抗CD40抗体可调节表达CD40的细胞的活性，其中所述调节是所述细胞的活性的增加或降低。所述细胞通常是树突状细胞或B细胞。

当通过CD40发生信号传导时，专用APC(例如树突状细胞)被激活，其触发若干生物事件，包括免疫细胞激活、增殖，以及细胞因子和趋化因子的产生。用于测定与CD40相关的树突状细胞激活的方法是本领域中已知的(例如讨论于Schonbeck等,2001,《细胞与分子生命科学(Cell Mol Life Sci.)》,58:40-43；van Kooten等,2000,白细胞生物学杂志(J.Leuk.,Biol.),67:2-17中)并在下文进一步描述。

用重组CD40L或抗CD40抗体刺激人类B细胞诱导表面标志物如CD23、CD30、CD80、CD86、Fas和MHC II的上调，可溶性细胞因子例如IL-6、TNF-γ和TNF-α的分泌，和同型聚集。用于测定CD40相关B细胞活化的方法是本领域中已知的(例如讨论于Schonbeck等,2001,同上)并在下文进一步描述。

用于测定抗体调节树突状细胞和B细胞的活性的能力的方法和测定法是本领域中众所周知的。例如，可通过测量细胞表面标志物如CD86和CD80的水平和/或通过测量抗CD40抗体诱导的来自T细胞的IFNγ分泌来评估树突状细胞的激活，其中这些参数中的任一个的增加表示激活增加并且降低表示激活降低。类似地，可通过测量细胞表面标志物(例如CD86)的水平和/或通过测量抗CD40抗体诱导的B细胞增殖来评估抗体调节B细胞活性的能力(参见下文实施例3)，其中这些参数中的任一个的增加表示激活增加并且降低表示激活降低。

优选地，在本发明的组合疗法和方法中使用的抗CD40抗体(其增加树突状细胞或B细胞的激活)具有对树突状细胞或B细胞激活的效能。细胞激活通常可在测定法中以EC50水平测量，所述测定法包括用测试刺激物温育分离的树突状或B细胞，然后检测细胞增殖作为激活的量度。

术语“结合活性”和“结合亲和力”意在指抗体分子结合或不结合靶标的趋势。结合亲和力可通过测定抗体和其靶标的解离常数(Kd)来定量。类似地，抗体与其靶标的结合特异性可根据抗体对其靶标相比于抗体和另一种非靶标分子的解离常数的比较解离常数(Kd)来定义。

通常，抗体对于靶标的Kd相比于抗体对于其它非靶标分子如不相关物质或环境中伴随的物质的Kd将小2倍，优选5倍，更优选10倍。Kd更优选将小50倍，甚至更优选小100倍，并且还更优选小200倍。

该解离常数值可以通过众所周知的方法直接确定，并且甚至可以通过例如Caceci等(Byte 9:340-362,1984)中阐述的那些方法对于复杂混合物进行计算。例如，可使用诸如Wong和Lohman(《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》90,5428-5432,1993)所公开的双过滤硝酸纤维素过滤器结合测定法来建立Kd。评价配体如抗体对靶标的结合能力的其它标准测定法是本领域中已知的，包括例如ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域中已知的标准测定法，例如通过Biacore^TM系统分析来评估。

可以进行竞争性结合测定法，其中将抗体与靶标的结合和靶标与所述靶标的另一种已知配体如另一种抗体的结合进行比较。发生50％抑制时的浓度被称为Ki。在理想条件下，Ki等于Kd。Ki值永远不会小于Kd，因此可以方便地替换Ki的测量以提供Kd的上限。

在本发明的组合疗法和方法中使用的抗CD40抗体优选能够在亲和力相比于其结合于另一个非靶标分子的亲和力为至少两倍、10倍、50倍、100倍或更大的情况下结合于其靶标。

在本发明的组合疗法和方法中使用的抗体通常将展现以下能力：

(i)当定位于细胞表面上时特异性结合人类CD40；和/或

(ii)增强表达CD40的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解；和/或

(iii)增强表达CD40的细胞的凋亡；和/或

(iv)调节表达CD40的细胞的活性，其中所述调节是所述细胞的活性增加或降低。

所述抗体可为或可包含本文公开的特异性抗CD40抗体之一的变体或片段，只要所述变体或片段保留对CD40的特异性和功能特性(i)至(iv)中的至少一种即可。

片段优选是所述抗体的抗原结合部分。片段可通过截短，例如通过从多肽的N和/或C末端除去一个或多个氨基酸来制备。以此方式，可从N和/或C末端除去多达10个、多达20个、多达30个、多达40个或更多个氨基酸。也可通过一个或多个内部缺失来产生片段。

变体可包含关于本文公开的特异性抗CD40抗体的序列的一个或多个取代、缺失或添加。变体可包含来自本文公开的特定序列的1个、2个、3个、4个、5个、多达10个、多达20个、多达30个或更多个氨基酸取代和/或缺失。“缺失”变体可包括单个氨基酸的缺失、氨基酸小群组如2、3、4或5个氨基酸的缺失、或较大氨基酸区域的缺失，例如特定氨基酸结构域或其它特征的缺失。“取代”变体优选涉及用相同数目的氨基酸替代一个或多个氨基酸，并且制备保守性氨基酸取代。例如，氨基酸可被具有相似性质的替代氨基酸取代，例如，另一种碱性氨基酸、另一种酸性氨基酸、另一种中性氨基酸、另一种带电氨基酸、另一种亲水性氨基酸、另一种疏水性氨基酸、另一种极性氨基酸、另一种芳族氨基酸或另一种脂族氨基酸。

可用于选择合适取代基的20种主要氨基酸的一些性质如下：

优选的“变体”包括其中代替天然存在的氨基酸的出现在序列中的氨基酸是其结构类似物的那些。在序列中使用的氨基酸也可以是衍生的或修饰的(例如被标记的)，只要抗体的功能不会显著受到不利影响即可。

变体可在抗体合成期间或通过产生后修饰来制备，或者当抗体是重组形式时使用定点诱变、随机诱变或酶促裂解和/或核酸连接的已知技术来制备。

优选地变体抗体具有与本文公开的抗体的VL或VH结构域具有大于60％、或大于70％、例如75％或80％、优选地大于85％、例如大于90％或95％氨基酸同一性的氨基酸序列。这种氨基酸同一性水平可见于相关SEQ ID NO序列的全长上或序列的一部分上，例如20个、30个、50个、75个、100个、150个、200个或更多个氨基酸上，这取决于全长多肽的大小。

关于氨基酸序列，“序列同一性”是指当使用具有以下参数的ClustalW(Thompson等,1994,同上)评估时具有所述值的序列：

成对比对参数-方法：精确，矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，空位延伸罚分：0.10；

多重比对参数-矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，延迟同一性％：30，罚分末端空位：开，空位间隔距离：0，阴性矩阵：无，空位延伸罚分：0.20，残基特异性空位罚分：开，亲水性空位罚分：开，亲水性残基：GPSNDQEKR。在特定残基处的序列同一性旨在包括已经简单地衍生化的相同残基。

用于本发明的组合疗法和方法中的抗CD40抗体可结合与如本文所公开的特异性抗体相同的表位，因为这种抗体可能模拟所公开抗体的作用。可通过常规方法来确定抗体是否结合于与另一种抗体相同的表位。例如，每种抗体与靶标的结合可使用竞争性结合测定法。进行竞争性结合测定法的方法是本领域中众所周知的。例如，它们可包括使抗体和靶标分子在抗体可以结合于靶标分子的条件下一起接触。然后可使抗体/靶标复合物与第二(测试)抗体接触并且可评估测试抗体能够从抗体/靶标复合物置换第一抗体的程度。这种评估可使用任何合适的技术，包括例如表面等离子体共振、ELISA或流式细胞术。测试抗体抑制第一抗体与靶标的结合的能力证明所述测试抗体可以与所述第一抗体竞争结合所述靶标，并且因此所述测试抗体结合于靶标上与所述第一抗体相同的表位或区域并且因此可模拟第一抗体的作用。

在本发明的组合疗法和方法中使用的抗CD40抗体可为包含SEQ ID NO:1至3的CDR序列的一个、两个或全部三个和/或SEQ ID NO:4至6的CDR序列的一个、两个或全部三个的抗体。所述抗体可包含SEQ ID NO:1至6的全部六个CDR序列。

所述抗体可包含SEQ ID NO:7的轻链可变区序列和/或SEQ ID NO:8的重链可变区序列。

所述抗体可为包含SEQ ID NO:7的轻链可变区序列和SEQ ID NO:8的重链可变区序列的抗体，或者可结合于与包含SEQ ID NO:7的轻链可变区序列和SEQ ID NO:8的重链可变区序列的抗体相同的表位。此外，所述抗体可包含SEQ ID NO:11的轻链恒定区序列和/或SEQ ID NO:12的重链恒定区序列。

在本发明的组合疗法和方法中使用的所述抗CD40抗体或其任何变体或片段优选具有9.0或以上、优选9.1或以上、更优选9.2或以上或者9.25或以上、最优选9.3或以上的理论等电点(pI)。

组合疗法

本发明提供一种用于治疗受试者中的实体肿瘤的组合疗法，其包括：(a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和(b)具有癌症治疗功效的另一种免疫治疗剂，所述免疫治疗剂不是抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区的抗体竞争结合人类CD40，并且其中所述另外的免疫治疗剂特异性结合免疫检查点分子。

如本文所用的术语“组合疗法”或“组合治疗”或“组合”表示任何形式的利用至少两种不同治疗剂的同时或并行治疗。

根据某些实施方案，抗CD40抗体或其抗原结合片段和特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂是以同一组合物或以单独的组合物同时施用的。根据其它实施方案，抗CD40抗体或其抗原结合片段和特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂是依序施用的，即抗CD40抗体或其抗原结合片段是在施用特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂之前或之后施用的。在一些实施方案中，抗CD40抗体或其抗原结合片段和特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂的施用是同时的，即抗CD40抗体或其抗原结合片段的施用时期和特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂的施用时期彼此重叠。在一些实施方案中，抗CD40抗体或其抗原结合片段和特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂的施用是不同时的。例如，在一些实施方案中，在施用特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂之前终止抗CD40抗体或其抗原结合片段的施用。在一些实施方案中，在施用抗CD40抗体或其抗原结合片段之前终止特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂的施用。

根据某些典型的实施方案，抗CD40抗体或其抗原结合片段和特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂是在单一治疗组合物内施用的。根据一些实施方案，所述治疗组合物还包含治疗上可接受的稀释剂或载体。

本发明的组合疗法的其它组分是具有癌症治疗功效的免疫治疗剂，所述免疫治疗剂不是抗CD40抗体或其抗原结合片段。

术语“免疫治疗剂”旨在包括可以刺激宿主免疫系统对受试者中的肿瘤或癌症产生免疫应答的任何分子、肽、抗体或其它药剂。各种免疫治疗剂可用于本文所述的组合物和方法中。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是抗体或其抗原结合片段。

术语“免疫应答”包括T细胞介导和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如，细胞因子产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括由T细胞活化间接实现的免疫应答，例如，抗体产生(体液应答)和细胞因子反应性细胞(例如巨噬细胞)的激活。

术语“免疫检查点分子”旨在包括免疫细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞)的细胞表面上以及某些肿瘤细胞上的一组蛋白质，其调节免疫应答。本领域技术人员应理解，免疫检查点蛋白可以是抑制性的，例如CTLA-4和PD-1，或刺激性的，例如OX40和CD137。示例性免疫检查点分子包括(但不限于)PD-1、CTLA-4、OX40(CD134)、CD137、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L 1、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT和A2aR。在一个优选实施方案中，所述免疫检查点分子是PD-1、CTLA-4、OX40(CD134)或CD137。

一种或多种抑制性免疫检查点分子的阻断或中和可以阻断或以其它方式中和抑制性信号传导，从而上调免疫应答以更有效地治疗癌症。可用于阻断抑制性免疫检查点的示例性药剂包括可以结合和/或灭活或抑制抑制性免疫检查点蛋白的抗体、小分子、肽、肽模拟物、天然配体和天然配体的衍生物，或其片段；以及可以下调抑制性免疫检查点核酸的表达和/或活性的RNA干扰、反义、核酸适体等，或其片段。用于上调免疫应答的示例性药剂包括针对阻断蛋白质与其天然受体之间的相互作用的一种或多种抑制性免疫检查点蛋白的抗体；一种或多种免疫检查点抑制剂蛋白(例如显性负多肽)的非激活形式；阻断一种或多种抑制性免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用的小分子或肽；结合其天然受体的融合蛋白(例如与抗体或免疫球蛋白的Fc区融合的免疫检查点抑制蛋白的细胞外部分)；阻断抑制性免疫检查点核酸转录或翻译的核酸分子；等等。这些药剂可以直接阻断一种或多种抑制性免疫检查点与其天然受体(例如抗体)之间的相互作用以防止抑制性信号传导并上调免疫应答。可选地，药剂可以间接阻断一种或多种抑制性免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用以防止抑制性信号传导并上调免疫应答。例如，免疫检查点蛋白配体如稳定化细胞外结构域的可溶形式可以结合其受体以间接降低结合于适当配体的受体的有效浓度。在一个实施方案中，单独或组合使用抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体来抑制免疫检查点抑制剂。

因此，在一个实施方案中，特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂是结合抑制性免疫检查点分子并抑制抑制性免疫检查点分子的功能的抗体或其抗原结合片段。

一种或多种刺激性免疫检查点分子的激活可以上调免疫应答以更有效地治疗癌症。可用于激活刺激性免疫检查点的示例性药剂包括可以激活刺激性免疫检查点蛋白的抗体、小分子、肽、肽模拟物、天然配体和天然配体的衍生物，或其片段；以及可以增强免疫检查点核酸的RNA干扰、反义、核酸适体等，或其片段。用于上调免疫应答的示例性药剂包括刺激性免疫检查点蛋白配体的可溶形式，或与Fc或促进配体多聚化的结构域融合的所述配体。在一个实施方案中，单独或组合使用抗CD137和抗OX40抗体来激活刺激性免疫检查点抑制剂。

因此，在一个替代实施方案中，特异性结合除CD40以外的免疫检查点分子的免疫治疗剂是结合于刺激性免疫检查点分子并激活刺激性免疫检查点分子的功能的抗体或其抗原结合片段。

检查点分子的优选实例包括PD1，其在与其配体PD-L1或PD-L2接合时充当T细胞活化的负调节剂。PD-L1特别是由许多实体肿瘤(包括黑素瘤)表达。这些肿瘤因此可通过激活T细胞上的抑制性PD-1受体来下调免疫介导的抗肿瘤作用。通过阻断PD1与PD-L1之间的相互作用，可除去免疫应答的检查点，从而导致增强的抗肿瘤T细胞应答。这种相互作用可被对PD1或PD-L1具特异性的抗体或任何其它合适药剂阻断。这些抗体和药剂通常可被称为PD1抑制剂。PD1抑制剂特别优选作为本发明方法的步骤(b)中的额外治疗剂。

抗PD1抗体包括尼鲁单抗、派姆单抗、拉姆单抗、匹地单抗和AMP-224。抗PD-L1抗体包括MEDI-4736和MPDL3280A。

由于肿瘤表达PD-L1，全身PD1抑制剂和局部抗CD40抗体的组合不是仅具吸引力。这种组合也可通过影响调节性T细胞和骨髓衍生抑制细胞(MSDC)而有益于调节一般免疫抑制环境。例如，在本发明的方法中使用的CD40激动剂如抗CD40抗体将调节CD40阳性肿瘤相关M2巨噬细胞和MSDC，而PD1抑制剂将调节调节性T细胞和MSDC。此外，如上文所解释(关于步骤(a)和(b)的时间选择，参见讨论)，据报道抗体对CD40的连接可激活并熟化树突状细胞，其在成熟时将上调PD-L 1和2，从而为组合两种治疗提供进一步的基本原理。此外，在本发明的方法中使用的CD40激动剂如抗CD40抗体将间接上调T细胞上的PD-1以及肿瘤和肿瘤浸润细胞上的PD-L1。因此，用系统性PD1抑制剂和保留在肿瘤部位的抗CD40抗体的组合治疗实体肿瘤(例如黑素瘤)将通过激活免疫系统和通过抑制反调节信号而具有多效作用。

检查点分子的另一个实例是T细胞受体CTLA-4，其充当T细胞活化的负调节剂。通常其在初始活化后在T细胞表面上上调。CTLA-4受体的配体是B7蛋白(B7-1和B7-2)，其由抗原呈递细胞表达。负责T细胞活化上调的相应受体是CD28，其与CTLA-4竞争结合B7蛋白。因此，通过阻断CTLA-4与B7蛋白的相互作用，而非CD28与B7蛋白的相互作用，可除去免疫应答的正常检查点之一，从而导致增强的抗肿瘤T细胞应答。阻断CTLA-4与B7蛋白的相互作用可用抗CTLA-4抗体或其它合适药剂实现。抗CTLA-4抗体包括伊匹单抗(ipilumumab)、曲美木单抗(tremelimumab)或PCT/EP2014/063442中公开的任何抗体。其它分子包括多肽，或可溶性突变CD86多肽。

因此，额外治疗剂可优选为特异性结合PD1、PD-L1或CTLA-4中的至少一种的抗体或其它药剂。

额外治疗剂最优选为PD1抑制剂，例如抗PD1或抗PD-L1抗体，其选自尼鲁单抗、派姆单抗、拉姆单抗(Lamborlizumab)、匹地单抗(Pdilizumab)、MEDI-4736和MPDL3280A。

当额外治疗剂是抗体或包含抗体的双特异性分子时，应理解，上文关于抗体、抗体的抗原结合片段、与其它治疗部分的任选结合等的定义阐述的所有一般考虑也适用于作为额外治疗剂的抗体。类似地，应理解，上文针对抗CD40抗体阐述的靶标特异性/亲和力的定义和用于确定特异性/亲和力的方法同样将适用于作为额外治疗剂的抗体，除非药剂的特异性靶标将代替CD40理解。作为额外治疗剂的抗体的变体和片段也可以与抗CD40抗体的变体和片段相同的方式定义。

试剂盒和药物组合物

本发明还提供用于治疗受试者中的实体肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含如上文所定义的组合疗法。例如，所述试剂盒可包含(a)治疗有效量的特异性结合CD40并在施用后保留在肿瘤部位的抗体，和任选地(b)治疗有效量的额外治疗剂，其适于全身施用至受试者。所述特异性结合CD40的抗体优选以适合局部施用至肿瘤部位的形式提供。

本发明的试剂盒可另外包含一种或多种其它试剂或仪器，其能够实施上述任何实施方案。这些试剂或仪器包括以下中的一种或多种：合适的缓冲液(水溶液)和施用抗CD40抗体和/或额外治疗剂(例如血管或包含针的仪器)的装置。

在本发明的方法中使用或以本发明的试剂盒提供的抗CD40抗体和额外治疗剂可各自以与药学上可接受的载体一起配制的独立药物组合物形式提供。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，它们是生理上相容的并且还与所需的施用途径相容。

因此，用于抗CD40抗体和额外治疗剂的载体可能适于全身施用，其如上文所定义是指施用到受试者的循环系统(包括血管和/或淋巴系统)中。这样的施用可通过任何合适的途径，但通常是肠胃外。如本文所用的短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用之外的施用模式，并且通常通过注射、输注或植入来实现。合适的途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外施用途径。

然而，用于抗CD40抗体的载体优选适合局部施用，其如上文所定义包括通过任何合适的手段(例如注射)进行的肿瘤周围、近肿瘤、肿瘤内、病灶内、病灶周围、颅内和囊内施用。局部施用还可包括腔内输注和吸入，这取决于肿瘤的部位。

取决于施用途径，抗体和/或药剂可包覆在材料中以保护抗体免于酸和其它可能使抗体和/或药剂失活或变性的自然条件的作用。优选的药学上可接受的载体包含水性载体或稀释剂。可用于本发明的药物组合物中的合适的水性载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其它载体的实例包括乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适的混合物；植物油，例如橄榄油；和可注射有机酯，例如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)，通过在分散体的情况下维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠。

本领域技术人员应理解，本发明的组合疗法的抗体组分通常以一种或多种药物组合物的形式提供，每种药物组合物含有治疗有效量的抗体组分以及药学上可接受的缓冲剂、赋形剂、稀释剂或载体。

如本文所用的‘治疗有效量’或‘有效量’或‘治疗有效的’是指对于给定病状和施用方案提供治疗作用的量。这是计算以与所需添加剂和稀释剂(即载体或施用媒介物)一起产生所需治疗作用的活性抗体的预定量。此外，其意指足以减少或预防宿主的活性、功能和应答中的临床显著缺陷的量。可选地，治疗有效量足以引起宿主中的临床显著病状的改善。如本领域技术人员所理解的，化合物的量可根据其比活性而改变。合适的剂量可含有经计算以产生所需治疗作用的预定量的活性组合物以及所需的稀释剂。

治疗有效量可由具有普通技术的医学或兽医工作者基于如本领域所熟知的患者特征如年龄、体重、性别、病状、并发症、其它疾病等来确定。

药物组合物可包括药学上可接受的抗氧化剂。这些组合物也可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上文的灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。

药物组合物通常必须在制造和储存条件下是无菌和稳定的。所述组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。可以通过将所需量的活性剂(例如抗体)并入到根据需要具有上述列举的一种成分或成分组合的适当溶剂中，接着灭菌微过滤，来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性剂并入含有碱性分散介质和来自上文列举那些的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性剂的粉末加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何额外的所需成分。药物组合物可包含另外的活性成分以及上述那些。

合适的药学上可接受的缓冲剂、稀释剂、载体和赋形剂是本领域中众所周知的(参见《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第18版,A.RGennaro编,Mack Publishing Company(1990)和《药物赋形剂手册(handbook of PharmaceuticalExcipients)》,第3版,A.Kibbe编,Pharmaceutical Press(2000)，其公开内容以引用的方式并入本文中)。

术语“缓冲剂”旨在包括含有用于稳定pH的酸-碱混合物的水溶液。缓冲剂的实例是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲胂酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。

术语“稀释剂”旨在包括为稀释药物制剂中的药剂的水性或非水性溶液。稀释剂可以是盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)中的一种或多种。

术语“佐剂”旨在包括添加到制剂中以增加本发明的药剂的生物作用的任何化合物。佐剂可以是具有不同阴离子的锌、铜或银盐中的一种或多种，例如(但不限于)不同酰基组合物的氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐和乙酸盐。佐剂还可以是阳离子聚合物，例如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰化透明质酸、壳聚糖、阳离子树枝状大分子、阳离子合成聚合物如聚(乙烯基咪唑)，和阳离子多肽如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸和含有这些氨基酸的肽。

赋形剂可以是碳水化合物、聚合物、脂质和矿物质中的一种或多种。碳水化合物的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇和环糊精，其被添加到组合物中，例如用于促进冻干。聚合物的实例是淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/氧化丙烯共聚物、具有不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯，和聚乙烯吡咯烷酮(都具有不同分子量)，其被添加到组合物中，例如用于粘度控制，用于实现生物粘附，或用于保护脂质免于化学和蛋白水解降解。脂质的实例是脂肪酸、磷脂、单糖、单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(都具有不同的酰基链长度和饱和度)、卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化卵和大豆卵磷脂，其出于与聚合物类似的原因被添加到组合物中。矿物质的实例是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其被添加到组合物以获得诸如减少液体积聚或有利的颜料性质的益处。

本发明的基于活性抗体的药剂可被配制成本领域中已知适合其递送的任何类型的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以是脂质体的形式，其中除了其它药学上可接受的载体之外，所述药剂与两亲性试剂如脂质组合，所述两亲性试剂以胶束、不溶性单层和液晶的聚集形式存在。用于脂质体制剂的合适的脂质包括(但不限于)单酸甘油酯、二酸甘油酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。合适的脂质还包括在极性头部基团中被聚(乙二醇)修饰以延长血流循环时间的上述脂质。这种脂质体制剂的制备可见于例如US 4,235,871中，所述文件的公开内容以引用的方式并入本文中。

本发明的药物组合物也可以是可生物降解的微球的形式。脂族聚酯如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯)(PCL)和聚酸酐已经在微球生产中广泛用作可生物降解的聚合物。这种微球的制备可见于US 5,851,451和EP 0 213303中，所述文件的公开内容以引用的方式并入本文中。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物以例如基于聚γ谷氨酸的纳米颗粒形式提供。这种纳米颗粒的制备和使用的细节可见于WO 2011/128642中，所述文件的公开内容以引用的方式并入本文中。本领域技术人员应理解，本发明的组合疗法的一种或多种活性组分可配制在单独的纳米颗粒中，或者两种活性组分可配制在相同的纳米颗粒中。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物以聚合物凝胶形式提供，其中聚合物如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯咪唑、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/氧化丙烯共聚物、具有不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯，和聚乙烯吡咯烷酮，被用于增稠含有药剂的溶液。所述聚合物还可包含明胶或胶原蛋白。

可选地，所述药剂可简单地溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。

应理解，本发明的药物组合物可包括离子和用于增强活性剂作用的限定pH。另外，所述组合物可进行常规的医药操作如灭菌，和/或可含有常规佐剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等。

根据本发明的药物组合物可通过本领域技术人员已知的任何合适途径施用。因此，可能的施用途径包括肠胃外(静脉内、皮下和肌内)、局部、经眼、经鼻、经肺、经颊、口服、肠胃外、经阴道和经直肠。也可从植入物施用。

有利地，所述药物组合物适于在肿瘤部位处或附近施用，例如肿瘤内或肿瘤周围。

所述药物组合物优选适合于肠胃外施用。用于将抗体配制成药物组合物的方法将是医学和药学领域的技术人员众所周知的、优选的组合物描述于随附实施例中。

本发明的组合疗法可使用可注射的持续释放药物递送系统来递送。这些经专门设计以降低注射频率。这种系统的实例是Nutropin Depot，其将重组人类生长激素(rhGH)包封在可生物降解的微球中，一旦注射，就在持续时期内缓慢释放rhGH。优选地，经肌内(i.m.)和/或皮下(s.c.)和/或静脉内(i.v.)进行递送。

本发明的组合疗法可以通过将药物直接释放到所需部位的手术植入装置来施用。例如，Vitrasert直接将更昔洛韦释放到眼中以治疗CMV视网膜炎。将该毒性剂直接应用于疾病部位实现了有效的治疗，而没有药物的显著全身副作用。

也可以使用电穿孔疗法(EPT)系统来施用本发明的组合疗法。向细胞递送脉冲电场的装置增加了细胞膜对药物的渗透性，从而导致细胞内药物递送的显著增强。

本发明的组合疗法也可以通过电结合(EI)来递送。当在皮肤表面上直径达30微米的小颗粒经历与电穿孔中使用的电脉冲相同或相似的电脉冲时，发生EI。在EI中，这些颗粒被驱动通过角质层并进入皮肤的更深层。所述颗粒可以负载或涂布有药物或基因，或者可以简单地充当在药物可以进入的皮肤中产生孔的“子弹”。

本发明的替代组合疗法是热敏感性ReGel注射系统。低于体温时，ReGel是可注射的液体，而在体温下，其立即形成缓慢侵蚀并溶解成已知的安全的可生物降解聚合物的凝胶储槽。活性物质随着生物聚合物溶解而随时间递送。

本发明的组合疗法也可以经口递送。该方法采用了用于体内口服摄取维生素B₁₂和/或维生素D以共同递送蛋白质和肽的自然过程。通过搭载维生素B₁₂和/或维生素D吸收系统，本发明的药剂、药物和药物组合物可以移动通过肠壁。合成维生素B₁₂类似物和/或维生素D类似物与药物之间的复合物，其在复合物的维生素B₁₂部分/维生素D部分中保留了对内在因子(IF)的显著亲和力并在复合物的活性物质中保留了显著生物活性。

本发明的组合疗法可以通过“Trojan肽”引入细胞。这些是一类被称为穿透素的多肽，其具有转运特性并且能够携带亲水性化合物穿过质膜。该系统允许将寡肽直接靶向细胞质和细胞核，并且可以是非细胞类型特异性和高效的。参见Derossi等,(1998),《细胞生物学趋势(Trends Cell Biol.)》,8,84-87。

优选地，本发明的组合疗法是含有每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的活性成分的单位剂量。

本发明的组合疗法通常将以药学上可接受的剂型，以包含任选地呈无毒有机或无机酸或碱加成盐形式的活性成分的药物组合物形式，经口或通过任何肠胃外途径施用。取决于待治疗的病症和患者，以及施用途径，所述组合物可以不同剂量施用。

在人类治疗中，本发明的组合疗法可以单独施用，但通常将与关于预期施用途径和标准药学实践选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体混合施用。

例如，本发明的组合疗法可以可含有调味剂或着色剂的片剂、胶囊、胚珠、酏剂、溶液或悬浮液形式经口、经颊或经舌下施用，用于立即释放、延迟释放或控制释放应用。本发明的药剂、药物和药物组合物还可通过海绵体内注射来施用。

这些片剂可含有赋形剂如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸，崩解剂如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲纤维素钠和某些复合硅酸盐，和制粒粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，可包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。

相似类似的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。在这方面优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮液和/或酏剂，本发明的药剂、药物和药物组合物可与以下组合：各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料，乳化和/或悬浮剂以及稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油，和其组合。

本发明的组合疗法可以经肠胃外，例如静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下施用，或者它们可通过输注技术施用。它们最好以无菌水溶液形式使用，所述无菌水溶液可含有其它物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。如果需要，水溶液应当适当缓冲(优选缓冲到3至9的pH)。通过本领域技术人员熟知的标准制药技术容易实现合适的肠胃外制剂在无菌条件下的制备。

适合于肠胃外施用的药物和药物组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。药物和药物组合物可呈现于单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)中，并且可储存在仅在即将使用前需要添加无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下。可从前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。

本发明的组合疗法也可以经鼻内或通过吸入施用并且方便地以干粉吸入器或来自使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其它合适的气体的加压容器、泵、喷雾器或雾化器的气雾剂喷雾形式递送。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀以递送计量量来确定剂量单位。所述加压容器、泵、喷雾器或雾化器可含有活性剂的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可配制以含有本发明药剂和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

可选地，本发明的组合疗法可以栓剂或阴道栓形式施用，或者它们可以洗剂、溶液、乳膏剂、凝胶剂、软膏剂或撒粉剂形式局部应用。本发明的药剂、药物和药物组合物也可例如通过使用皮肤贴剂经皮施用。它们也可通过眼部途径施用，特别是用于治疗眼睛疾病。

对于眼科用途，本发明的组合疗法可以配制成于等渗的pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选配制成于等渗的pH调节的无菌盐水中任选地与防腐剂如苯扎氯铵组合的溶液。可选地，它们可配制在软膏剂如凡士林中。

对于局部施用于皮肤，本发明的组合疗法可以配制为含有悬浮或溶解在例如具有以下中的一种或多种的混合物中的活性剂的合适的软膏剂：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯剂、乳化蜡和水。可选地，它们可以配制成悬浮或溶解在例如以下中的一种或多种的混合物中的合适的洗剂或乳膏剂：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

适合在口中局部施用的制剂包括：在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性成分的口含锭；在惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分的锭剂；和在合适的液体载体中包含活性成分的漱口剂。

通常，在人类中，本发明的组合疗法在肿瘤部位处或附近的局部施用是优选的途径，特别是肿瘤内或肿瘤周围施用。

对于兽医用途，本发明的组合疗法根据正常兽医实践以适当可接受的制剂形式施用，并且兽医将确定对于特定动物将是最适当的给药方案和施用途径。

本发明的实施方案包括(但不限于)以下：

A.一种治疗受试者中的实体肿瘤的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合CD40并在施用后保留在所述肿瘤部位的抗体或其抗原结合部分，和任选地(b)向所述受试者全身施用治疗有效量的额外治疗剂。

B.根据实施方案A所述的方法，其中步骤(b)的所述额外治疗剂是用于治疗癌症的免疫治疗剂，其不是抗CD40抗体。

C.根据实施方案b所述的方法，其中所述免疫治疗剂是PD1抑制剂，任选地其中所述PD1抑制剂是抗PD1或抗PD-L1抗体。

D.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中所述实体肿瘤是腺瘤、胚细胞瘤、癌瘤、硬纤维瘤、促纤维组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤、肉瘤、维尔姆斯瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、淋巴肿瘤、乳腺肿瘤或黑素瘤。

E.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中所述实体肿瘤是黑素瘤，优选地转移性黑素瘤。

F.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述抗体包含选自SEQ ID NO 1、2、3、4、5和6的至少一个CDR。

G.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述抗体包含SEQID NO:1、2和3和/或SEQ ID NO:4、5和6的CDR序列。

H.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述抗体包含SEQID NO:7的轻链可变区和/或SEQ ID NO:8的重链可变区。

I.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述抗体包含SEQID NO:11的轻链恒定区和/或SEQ ID NO:12的重链恒定区。

J.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述抗体与包含SEQID NO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区的抗体竞争结合人类CD40。

K.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)是同时进行的或者其中步骤(b)是在步骤(a)之后24小时至两周、步骤(a)之后24小时至一周、步骤(a)之后24小时至72小时、或步骤(a)之后24小时至48小时进行的。

L.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中步骤(a)包括向所述肿瘤部位局部施用所述抗体，任选地其中所述抗体与至少一种药学上可接受的稀释剂或载体被配制成适合局部施用的组合物，和/或所述抗体结合至额外的治疗部分。

M.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中至少30％的在步骤(a)中施用的抗体量在施用后四小时保留在所述肿瘤部位，优选地其中至少40％的所述量在施用后四小时保留在所述肿瘤部位。

N.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述额外治疗剂与至少一种药学上可接受的稀释剂或载体被配制成适合全身施用的组合物。

O.根据前述实施方案中的一项所述的方法，其中在多个分开的场合进行步骤(a)并且进行步骤(b)以使得所述受试者对于所述额外治疗剂的暴露在所述方法的持续时间内是连续的。

P.根据前述实施方案中的任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

Q.一种治疗受试者中的实体肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含(a)治疗有效量的特异性结合CD40并在施用后保留在所述肿瘤部位的抗体，和任选地(b)治疗有效量的额外治疗剂，其适合全身施用至受试者。

R.一种抗体或其抗原结合部分，其特异性结合CD40并且能够在施用后保留在肿瘤部位，其用于治疗受试者中的实体肿瘤。

S.根据实施方案R所述的抗体或其抗原结合部分，其与一种或多种额外治疗剂组合使用，其中所述额外治疗剂不是抗CD40抗体。

T.根据实施方案S所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述额外治疗剂是选自以下的癌症治疗：常规放射治疗剂、通路抑制剂(例如酪氨酸激酶抑制剂或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂)、细胞因子(例如IL-2、IL-12、IL-15或IL-21)、化学治疗剂和免疫治疗剂。

U.根据实施方案S或T所述的抗体或其抗原结合部分，其与以下额外治疗剂中的一种或多种组合使用：

(i)抗PD1免疫治疗剂；

(ii)抗CTLA-4免疫治疗剂；

(iii)抗OX40免疫治疗剂；和/或

(iv)抗CD137免疫治疗剂。

V.根据实施方案T或U所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述免疫治疗剂是PD1抑制剂，任选地其中所述PD1抑制剂是抗PD1或抗PD-L1抗体。

W.根据实施方案R至V中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述实体肿瘤是腺瘤、胚细胞瘤、癌瘤、硬纤维瘤、促纤维组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤、肉瘤、维尔姆斯瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、淋巴肿瘤、乳腺肿瘤或黑素瘤。

X.根据实施方案R至W中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述实体肿瘤是黑素瘤，优选地转移性黑素瘤。

Y.根据权利要求实施方案R至X中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其包含选自SEQ ID NO 1、2、3、4、5和6的至少一个CDR。

Z.根据实施方案R至Y中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ IDNO:1、2和3和/或SEQ ID NO:4、5和6的CDR序列。

AA.根据实施方案R至Z中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ IDNO:7的轻链可变区和/或SEQ ID NO:8的重链可变区。

BB.根据实施方案R至AA中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ IDNO:11的轻链恒定区和/或SEQ ID NO:12的重链恒定区。

CC.根据实施方案R至BB中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和SEQ ID NO:8的重链可变区的抗体竞争结合人类CD40。

DD.根据实施方案R至CC中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与至少一种药学上可接受的稀释剂或载体被配制成适合局部施用的组合物，和/或所述抗体结合至额外的治疗部分。

EE.一种组合疗法组合物，其包含根据实施方案R至DD中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分和一种或多种额外治疗剂，其中所述额外治疗剂不是抗CD40抗体。

FF.根据实施方案EE所述的组合疗法组合物，其中所述额外治疗剂是选自以下的癌症治疗：常规放射治疗剂、通路抑制剂(例如酪氨酸激酶抑制剂或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂)、细胞因子(例如IL-2、IL-12、IL-15或IL-21)、化学治疗剂和免疫治疗剂。

GG.根据实施方案EE或FF所述的组合疗法组合物，其包含：

(i)抗PD1免疫治疗剂；

(ii)抗CTLA-4免疫治疗剂；

(iii)抗OX40免疫治疗剂；和/或

(iv)抗CD137免疫治疗剂。

HH.根据实施方案EE或GG中的任一项所述的组合疗法组合物，其中所述免疫治疗剂是PD1抑制剂，任选地其中所述PD1抑制剂是抗PD1或抗PD-L1抗体。

II.根据实施方案R至DD中的任一项所述的抗体或其抗原结合部分的用途，其用于制备供治疗受试者中的实体肿瘤的药物。

本发明通过以下实施例进一步说明，所述实施例不应理解为进一步限制。在本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以引用的方式明确地并入本文中。

实施例

实施例1-序列信息

抗CD40抗体克隆G12(抗体ADC-1013)

(a)CDR序列(根据IMGT编号定义，其中核心CDR序列在其中加下划线)

(b)可变区序列

可变轻链(V_L)氨基酸序列-SEQ ID NO:7

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDKSISGLVFGGGTKLTVLG

可变重链(V_H)氨基酸序列-SEQ ID NO:8

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWGQGTLVTVSS

可变轻链(V_L)核苷酸序列-SEQ ID NO:9

CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCGGGTTACAATGTATACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATAAGAGCATTTCTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT

可变重链(V_H)核苷酸序列-SEQ ID NO:10

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGGTGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA

(c)示例性恒定区氨基酸序列

人类Igλ轻链C2区(NCBIAAA59107.1)-SEQ ID NO:11

QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

人类Igγ-1重链恒定区(Uniprot P01857.1)-SEQ ID NO:12

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；

人类CD40序列-SEQ ID NO:13

>gi|117606560|gb|ABK41937.1|CD40分子，TNF受体超家族成员5[智人]MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ。

实施例2-局部或全身施用后的生物利用度

在食蟹猴和小鼠中进行临床前研究，以研究在肿瘤周围、肿瘤内或静脉内施用后ADC-1013的生物利用度。

材料和方法

在接种有人类CD40阴性膀胱癌细胞MB49的人类CD40阳性转基因小鼠模型中评估ADC-1013的药代动力学。以100μg的剂量经肿瘤内(IT)、肿瘤周围(PT)或静脉内(IV)注射ADC-1013，并且在治疗前以及治疗后4小时和24小时收集血清。药代动力学概况(图1)表明，与IV相比，在IT或PT施用后，ADC-1013在施用后4小时的全身暴露降低100至1000倍。

食蟹猴通过皮下或静脉内途径暴露于ADC-1013。此处的皮下施用类似于向黑素瘤的局部施用。

结果和结论

在以下时间点从所有动物采集血样用于毒代动力学分析：给药前以及给药后15分钟和2、6、24、48、72、96和168小时，并且测量ADC1013水平(图2)。基于曲线下平均面积(AUC-96)计算ADC1013在皮下施用后的生物利用度。皮下相对于静脉内施用的AUC-96的范围为28-42％，表明28％-42％的全身生物利用度。

将这些观测结果用于确定在如实施例3中公开的B16.F10小鼠模型中施用免疫治疗性抗体组合的剂量水平。

实施例3-体内鼠类黑素瘤模型

B16.F10是最常用作临床前小鼠模型中的黑素瘤模型的肿瘤细胞系(Grosso2013Cancer Immunity Review)。将小鼠B16.F10黑素瘤细胞系与人类黑素瘤充分比较，因为它以低水平表达MHC并且被认为是低免疫原性的(Lechner Jimmunother 2013)。低MHC水平可能例如与T细胞活化不足有关，这可能使得这些肿瘤更难以用免疫疗法治疗。为了增加B16.F10的翻译相关性，用人类CD40转染细胞系。将转染的细胞系(称为B16.F10(hCD40+)用于这些实验。

材料和方法

黑素瘤细胞系B16.F10获自American Type Cell Collection(ATCC)。通过用含有人类CD40的线性化载体并通过使用Lipofectamine(Invitrogen)来转染B16.F10，获得hCD40表达系B16.F10(hCD40+)。所述载体含有赋予新霉素抗性的元件。将转染细胞在DMEM(含有4.5g/L葡萄糖、Ultraglutamine I和丙酮酸钠)、10％FCS、Hepes和1mg/ml G418中培养以选择稳定转染株。使用CD40生物素和磁珠(Miltenyi)选择CD40阳性克隆。选择通过流式细胞术测量的具有验证的hCD40表达的单克隆(克隆5.G12.46)。

将在对数期生长的B16.F10(hCD40+)以100μL体积在第0天(D0)皮下注射到hCD40转基因小鼠(hCD40Tg)的右胁腹中。细胞的平均接种数量为每只小鼠0.1×10⁶个。利用数显卡尺在宽度、长度和高度上测量肿瘤生长，计算肿瘤体积(w/2x l/2xh/2x pi x(4/3))。在第3、6和9天施用治疗。经肿瘤内施用ADC-1013(20μL，每剂100μg)并且经腹膜内施用抗PD-1(克隆RPM1-14，BioXcell)(100μL，每剂250μg)。

结果和结论

如图3的A中所示，转染的B16.F10(hCD40+)黑素瘤细胞系显示人类CD40的大量表达。通过存活率(图4A)和在处死第一只小鼠当天的肿瘤体积(图4B)在带有皮下B16.F10(hCD40+)黑素瘤的hCD40tg小鼠中确定ADC-1013的抗肿瘤作用。ADC-1013显示通过存活时间增加和肿瘤体积减小所测量的肿瘤生长显著降低。通过用ADC-1013和抗PD-1抗体的组合治疗动物来增加抗肿瘤功效。

实施例4-体内鼠类膀胱癌模型

材料和方法

将MB49膀胱癌细胞用于在8周龄雌性hCD40Tg小鼠上引发肿瘤。在第0天，将0.25×10⁶个肿瘤细胞皮下接种到小鼠的右胁腹中。在第14天，向小鼠肿瘤内或腹膜内注射测试抗CD40抗体(每只小鼠总共1μg和30μg抗体，或PBS；每组4只小鼠)。在第16天，通过颈椎脱位处死40只小鼠。将肿瘤引流淋巴结收集到完全培养基中，并且将来自每个实验组的两个肿瘤或淋巴结汇集在一起。使用Liberase TL(Roche)和尼龙网过滤器(100μm；FischerScientific)将收集的组织进行酶促和机械均质化。用含有3-10mM EDTA和0.1％胎牛血清的RPMI培养基充分洗涤膜以制备单细胞悬浮液。在含有0.5％牛血清白蛋白的PBS中洗涤分离的细胞，并且通过用小鼠抗CD16/32(BD Bioscience)处理细胞来阻断非特异性Fc结合。

通过流式细胞术分别对CD11c阳性细胞和CD11b阳性细胞分析CD86表达水平(作为激活的标志物)。CD11c是树突状细胞的标志物。CD11b在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞亚群上表达。用活/死可定影染色剂FVS450(BD Bioscience)和以1:100稀释的对CD11c-PE、CD11b-PECy7和CD86-APC(BD Bioscience)具特异性的抗体将细胞染色。在染色后，使用Cellfix(BD Bioscience)对所有细胞进行多聚甲醛固定。测量每个样品的染色并以CD86(样品)-FMO(样品)计算并且表示为阳性细胞％减去PBS对照。使用FACS Verse(BectonDickinson)和FlowJo vX分析软件来分析染色的细胞。结果显示在图5A(CD11c细胞)和图5B(CD11b细胞)中。

结果和结论

图5A中的数据显示，用抗CD40抗体治疗增加了通过CD86在肿瘤中的表达所测量的树突状细胞激活。图5B中的数据显示，用抗CD40抗体治疗增加了通过CD86在肿瘤中的表达所测量的CD11b阳性细胞激活。总之，与腹膜内(IP)治疗相比，在肿瘤内(IT)治疗后获得更强的激活。用肿瘤内(IT)给予的1μg低剂量进行治疗产生出乎意料高的树突状细胞激活。

实施例5-组合疗法I的体内作用

材料和方法

将在对数期生长的B16.F10(hCD40+)肿瘤细胞系以100μL体积在第0天(D0)皮下注射到hCD40转基因小鼠(hCD40Tg)的右胁腹中。接种细胞数量为每只小鼠0.1×10⁶个。利用数显卡尺在宽度、长度和高度上测量肿瘤生长，计算肿瘤体积(w/2x l/2xh/2x pi x(4/3))。在第3、6和9天施用治疗。经肿瘤内施用ADC-1013(每剂100μg)。经腹膜内注射抗PD-1(每剂250μg)(克隆RPM1-14，BioXcell)和抗CTLA-4抗体(每剂100μg)(9D9，BioXcel)。第14天的肿瘤体积示于图6中。

结果和结论

已经显示，用靶向PD-1的抗体与靶向CTLA-4的抗体组合治疗可在临床试验中赋予加和效应(Wolchok等,《新英格兰医学杂志(New Eng J Med)》,2013)。在该实施例中，我们公开了临床前数据，表明向CTLA-4/PD-1组合中增添ADC-1013治疗可进一步增加黑素瘤患者的治疗效果。与单独的CTLA-4和PD-1相比，对于CTLA-4、PD-1和ADC-1013来说，通常在第14天的肿瘤体积降低所测量的抗肿瘤作用显著更好(图6)。

在临床环境中，CTLA-4抗体可为伊匹单抗、曲美木单抗或其它CTLA-4靶向抗体中的任一种。所述PD-1靶向抗体可为结合人类PD-1的抗体，例如尼鲁单抗或派姆单抗或其它。它还可以是结合PD-1的配体的抗体，例如靶向PD-L1和PD-L2的抗体，例如度伐单抗(durvalumab)和阿维单抗(avelumab)。

实施例6-组合疗法II的体内作用

材料和方法

将在对数期生长的B16.F10肿瘤细胞系以100μl体积在第0天(D0)皮下注射到hCD40转基因小鼠(hCD40Tg)的右胁腹中。接种细胞数量为每只小鼠0.1×10⁶个。利用数显卡尺在宽度、长度和高度上测量肿瘤生长，计算肿瘤体积(w/2x l/2xh/2x pi x(4/3))。在第3、6和9天施用治疗。经肿瘤内施用ADC-1013、抗CD137(克隆Lob 12.3)和抗OX40(CD86)抗体和对照(每剂100μg)。如图7中所示跟踪体积随时间的变化。

结果和结论

与对照相比，用ADC-1013治疗产生显著的抗肿瘤反应。所述抗肿瘤作用大于利用靶向CD137和OX40的抗体获得的抗肿瘤作用(图7)。ADC-1013和OX40的组合以及ADC-103与CD137的组合导致与单一疗法相比更强的抗肿瘤作用。这表明组合CD40和CD137或者组合CD40和OX40将具有临床益处。

实施例7-ADC-1013对小鼠中的野生型B16黑素瘤的作用

材料和方法

皮下接种B16.F10.hCD40+细胞或B16.F10(wt)细胞(1×10⁵)，并且在第3、6和9天利用ADC-1013经肿瘤内治疗小鼠(每剂100μg)。

用于该研究的小鼠是hCD40tg小鼠。

结果和结论

ADC-1013也在B16.F10肿瘤中产生显著的抗肿瘤作用。在B16.F10(wt)和B16.F10.hCD40+肿瘤中获得的抗肿瘤作用是相似的(图8A和图8B)。这并不排除ADCC的直接诱导在人类CD40阳性黑素瘤治疗中起作用。在hCD40阳性肿瘤中可能存在其它定性差异，例如较低的免疫细胞浸润。此外，B16肿瘤上的人类CD40水平较低，如在肿瘤样品上离体所测量。

实施例8-ADC-1013在淋巴瘤模型(A20)中的作用

材料和方法

将在对数期生长的A20淋巴瘤细胞系以100μL体积在第0天(D0)皮下注射到hCD40tg-BalbC(F1)小鼠的右胁腹中。通过使hCD40tg小鼠与BalbC小鼠杂交来产生hCD40tg-BalbC(F1)小鼠。接种细胞数量为每只小鼠5×10⁶个。利用数显卡尺在宽度、长度和高度上测量肿瘤生长，计算肿瘤体积(w/2x l/2xh/2x pi x(4/3))。在第10、13和16天在具有确定的淋巴瘤肿瘤(A20)的小鼠中经肿瘤周围施用ADC-1013(每剂30μg)。

结果和结论

用ADC-1013治疗在A20淋巴瘤模型中产生显著的抗肿瘤作用(图9A和图9B)。这种模型是hCD40阴性的并且因此此处显示的抗肿瘤作用仅由ADC-1013对免疫细胞的激活引起。

实施例9-ADC-1013在肺癌模型(LLC-1)中的作用

材料和方法

将在对数期生长的肺癌细胞系(LLC-1)以100μL体积在第0天(D0)皮下注射到hCD40tg小鼠的右胁腹中。接种细胞数量为每只小鼠0.25×10⁶个。利用数显卡尺在宽度、长度和高度上测量肿瘤生长，计算肿瘤体积(w/2x l/2xh/2x pi x(4/3))。在第4、7和10天在具有确定的肿瘤(LLC-1)的hCD40tg小鼠中经肿瘤周围施用ADC-1013(100μg)。

结果和结论

在肺癌模型中用ADC-1013治疗产生显著(p<0.05，单侧Mann Whitney t检验)抗肿瘤作用(图10)。该模型是hCD40阴性的并且此处显示的抗肿瘤作用仅由ADC-1013对免疫细胞的激活引起。

实施例10-局部施用ADC-1013的远端作用

材料和方法

将在对数期生长的B16.F10肿瘤细胞系以100μL体积在第0天(D0)皮下注射到hCD40转基因小鼠(hCD40Tg)的右胁腹和左胁腹中。接种细胞数量为每只小鼠0.1×10⁶个。利用数显卡尺在宽度、长度和高度上测量肿瘤生长，计算肿瘤体积(w/2x l/2xh/2x pi x(4/3))。在第3、6和9天施用治疗。将ADC-1013和对照经肿瘤内施用(每剂100μg)到右胁腹中的肿瘤中。如图11中所示跟踪注射和非注射肿瘤的肿瘤体积随时间的变化。

结果和结论

局部的肿瘤内治疗也在远端的非注射肿瘤中产生抗肿瘤作用。在100μg剂量治疗后的游离ADC-1013水平远低于体外测定法中的ADC-1013的EC50，这表明对于非注射肿瘤的抗肿瘤作用部分取决于在注射肿瘤区域中激活的免疫细胞向非注射肿瘤的迁移。

这表明注射到一个肿瘤中的ADC-1013可对其它非注射肿瘤(例如转移瘤)具有显著的抗肿瘤作用。

实施例11-全身(iv)施用ADC-1013的作用

材料和方法

将在对数期生长的B16.F10(hCD40+)肿瘤细胞系以100μL体积在第0天(D0)皮下注射到hCD40转基因小鼠(hCD40Tg)的右胁腹中。接种细胞数量为每只小鼠0.1×10⁶个。利用数显卡尺在宽度、长度和高度上测量肿瘤生长，计算肿瘤体积(w/2x l/2xh/2x pi x(4/3))。在第3、6和9天施用治疗。经静脉内施用ADC-1013(每剂100μg)。

结果和结论

ADC-1013的全身、静脉内施用导致对肿瘤生长的显著抑制作用(图12)。

实施例12-组合疗法III的体内作用

材料和方法

向雌性BalbC小鼠皮下接种5×10⁶个A20淋巴瘤细胞。在第5天和第8天经肿瘤周围用9D9(抗CTLA-4抗体，BioXcel)治疗小鼠并且在第5、8和11天经肿瘤内用TLR激动剂CpG(1668)治疗小鼠。跟踪存活率随时间的变化。

结果和结论

9D9抗体靶向检查点受体CTLA-4并且CpG结合于Toll样受体9。TLR是跨膜蛋白，在抗原呈递细胞如树突状细胞上表达。TLR9与CpG的连接诱导树突状细胞激活。结果示于图13中。

靶向TLR9和CTLA4的治疗的组合的抗肿瘤作用相比于仅用CpG治疗不会导致增加的抗肿瘤作用。因此数据表明，与检查点抑制剂组合激活树突状细胞的治疗组合并不总是导致增加的抗肿瘤作用。

因此，本发明的组合疗法的功效不能被预测或合理地预期。

序列表

<110> 鳄鱼生物科学公司

<120> 利用抗CD40抗体的组合疗法

<130> 611521CG-670131

<150> GB1414270.7

<151> 2014-08-12

<150> GB1422614.6

<151> 2014-12-18

<150> GB1507541.9

<151> 2015-05-01

<160> 13

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变轻链互补决定区1

<400> 1

Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asn Val Tyr

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变轻链互补决定区2

<400> 2

Gly Asn Ile Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变轻链互补决定区3

<400> 3

Cys Ala Ala Trp Asp Lys Ser Ile Ser Gly Leu Val

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变重链互补决定区1

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met His

1 5 10

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变重链互补决定区2

<400> 5

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ser Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Tyr

1 5 10 15

Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly Arg

20 25

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变重链互补决定区3

<400> 6

Cys Ala Arg Ile Leu Arg Gly Gly Ser Gly Met Asp Leu

1 5 10

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变轻链氨基酸序列

<400> 7

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asn Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Lys Ser

85 90 95

Ile Ser Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变重链氨基酸序列

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Leu Arg Gly Gly Ser Gly Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..336

<223> /mol_type="未指定DNA"

/note="可变轻链核苷酸序列"

/organism="人工序列"

<400> 9

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgcactg ggagcagctc caacatcggg gcgggttaca atgtatactg gtatcagcag 120

ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tatggtaaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240

cggtccgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg ataagagcat ttctggtctg 300

gttttcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggt 336

<210> 10

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..357

<223> /mol_type="未指定DNA"

/note="可变重链核苷酸序列"

/organism="人工序列"

<400> 10

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg gctttcatat attagtggtg gtagtagtta cattttctac 180

gcagactcag tgaggggccg attcaccatc tccagagaca actccgagaa cgcgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatatta 300

agaggcggga gcggtatgga cctctggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357

<210> 11

<211> 105

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 人类Igλ轻链C2区

<400> 11

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 12

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 人类Igγ-1重链恒定区

<400> 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 13

<211> 277

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 人类CD40序列

<400> 13

Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu

20 25 30

Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val

35 40 45

Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu

50 55 60

Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His

65 70 75 80

Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr

85 90 95

Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr

100 105 110

Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly

115 120 125

Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys

145 150 155 160

Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln

165 170 175

Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu

180 185 190

Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile

195 200 205

Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn

210 215 220

Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp

225 230 235 240

Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His

245 250 255

Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser

260 265 270

Val Gln Glu Arg Gln

275

Claims

1.特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与免疫治疗剂的组合在制备用于治疗实体肿瘤的药物中的用途，其中所述免疫治疗剂选自：

a)结合PD-1的免疫治疗剂；

b)结合CTLA-4的免疫治疗剂；

c)结合OX40的免疫治疗剂；和

d)结合CD137的免疫治疗剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:1、2和3的轻链CDR序列和SEQ ID NO:4、5和6的重链CDR序列。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分与所述免疫治疗剂在同一组合物中或在分开的组合物中。

4.根据权利要求1所述的用途，所述结合PD-1的免疫治疗剂是阻断PD1与PD-L1之间的相互作用的抗PD-1抗体。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述实体肿瘤是黑素瘤。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含完整抗体或由完整抗体组成。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含如下抗原结合片段或由如下抗原结合片段组成，所述抗原结合片段选自：Fv片段和Fab样片段。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分是人类或人源化的。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和/或SEQ ID NO:8的重链可变区。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:11的轻链恒定区和/或SEQ ID NO:12的重链恒定区。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:7加SEQ ID NO:11的轻链，和/或SEQ ID NO:8加SEQ IDNO:12的重链。

12.根据权利要求4所述的用途，其中所述抗PD-1抗体选自尼鲁单抗、派姆单抗、拉姆单抗、匹地单抗和AMP-224。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述结合CTLA-4的免疫治疗剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述结合OX40的免疫治疗剂是抗OX40抗体或其抗原结合部分。

15.根据权利要求1所述的用途，其中所述结合CD137的免疫治疗剂是抗CD137抗体或其抗原结合部分。

16.一种药物组合物，其用于治疗实体肿瘤，其包含：

a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和

b)阻断PD1与PD-L1之间的相互作用的抗PD-1抗体。

17.一种药物组合物，其用于治疗实体肿瘤，其包含：

a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和

b)抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分。

18.一种药物组合物，其用于治疗实体肿瘤，其包含：

a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和

b)抗OX40抗体或其抗原结合部分。

19.一种药物组合物，其用于治疗实体肿瘤，其包含：

a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和

b)抗CD137抗体或其抗原结合部分。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的药物组合物，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:1、2和3的轻链CDR序列和SEQ ID NO:4、5和6的重链CDR序列。

21.根据权利要求16至19中任一项所述的药物组合物，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含完整抗体或由完整抗体组成。

22.根据权利要求16至19中任一项所述的药物组合物，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含如下抗原结合片段或由如下抗原结合片段组成，所述抗原结合片段选自：Fv片段和Fab样片段。

23.根据权利要求16至19中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合部分是人类或人源化的。

24.根据权利要求16至19中任一项所述的药物组合物，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和/或SEQ ID NO:8的重链可变区。

25.根据权利要求16至19中任一项所述的药物组合物，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:11的轻链恒定区和/或SEQ ID NO:12的重链恒定区。

26.根据权利要求16至19中任一项所述的药物组合物，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:7加SEQ ID NO:11的轻链，和/或SEQ ID NO:8加SEQ ID NO:12的重链。

27.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述抗PD-1抗体选自尼鲁单抗、派姆单抗、拉姆单抗、匹地单抗和AMP-224。

28.一种试剂盒，其用于治疗实体肿瘤，其包含：

a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和

b)阻断PD1与PD-L1之间的相互作用的抗PD-1抗体。

29.一种试剂盒，其用于治疗实体肿瘤，其包含：

a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和

b)抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分。

30.一种试剂盒，其用于治疗实体肿瘤，其包含：

a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和

b)抗OX40抗体或其抗原结合部分。

31.一种试剂盒，其用于治疗实体肿瘤，其包含：

a)特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，和

b)抗CD137抗体或其抗原结合部分。

32.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:1、2和3的轻链CDR序列和SEQ ID NO:4、5和6的重链CDR序列。

33.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述实体肿瘤是黑素瘤。

34.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含完整抗体或由完整抗体组成。

35.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含如下抗原结合片段或由如下抗原结合片段组成，所述抗原结合片段选自：Fv片段和Fab样片段。

36.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体或其抗原结合部分是人类或人源化的。

37.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的轻链可变区和/或SEQ ID NO:8的重链可变区。

38.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:11的轻链恒定区和/或SEQ ID NO:12的重链恒定区。

39.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:7加SEQ ID NO:11的轻链，和/或SEQID NO:8加SEQ ID NO:12的重链。

40.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述抗PD-1抗体选自尼鲁单抗、派姆单抗、拉姆单抗、匹地单抗和AMP-224。