CN101001872A - FcγRIIB－特异性抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异性结合FcγRIIB、特别是人FcγRIIB的抗体及其片段，所述抗体或其片段结合FcγRIIB的亲和性高于结合FcγRIIA、特别是人FcγRIIA的亲和性。本发明还包括抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段的用途，其作为单一试剂疗法来治疗、预防、控制或改善癌症如B细胞恶性肿瘤，特别是B细胞慢性淋巴性白血病或非何杰金氏淋巴瘤；自体免疫性疾病；炎性疾病；IgE介导的过敏性疾病或上述疾病的一种或多种症状。本发明还提供了通过给予本发明的抗体来增强所述治疗性抗体的效应因子功能从而增强该治疗性抗体的治疗效果的方法。本发明还提供了通过给予本发明的抗体来提高疫苗组合物效果的方法。

Description

FcγRIIB-特异性抗体及其使用方法

本发明要求分别于2004年4月16日、2004年6月21日、2004年6月21日和2005年2月18提交的美国临时申请60/562,804、60/582,044、60/582,045和60/654,713的优先权，本文将这些临时申请全部引入作为参考。

1.发明领域

本发明涉及特异性结合FcγRIIB，特别是人FeγRIIB的抗体或其片段，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA、特别是人FcγRIIA亲和性。本发明还包括抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段的用途，其作为单一试剂疗法来治疗、预防、控制或改善癌症如B细胞恶性肿瘤，特别是B细胞慢性淋巴性白血病或非何杰金氏淋巴瘤；自体免疫性疾病；炎性疾病；IgE介导的过敏性疾病或上述疾病的一种或多种症状。本发明还包括将抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段与其它癌症治疗联合使用。本发明提供了药物组合物，其包含预防、治疗、控制或改善癌症如B细胞恶性肿瘤、自体免疫性疾病、炎性疾病、IgE介导的过敏性疾病或上述疾病的一种或多种症状有效量的抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了增强治疗性抗体的治疗效果的方法，该方法通过给予本发明的抗体来增强所述治疗性抗体的效应因子功能来实现。本发明还提供了提高疫苗组合物的效果的方法，该方法通过将本发明的化合物与疫苗组合物一起给药来实现。

2.本发明背景

2.1 Fc受体及其在免疫系统中的作用

免疫系统细胞与抗体-抗原复合物的相互作用产生广泛的反应，其范围遍及效应因子功能到免疫调节信号，前者如抗体依赖的细胞毒性反应、肥大细胞脱颗粒和吞噬作用，后者如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用都是通过抗体或免疫复合物的Fc结构域与造血细胞上的特定细胞表面受体结合来启动的。Fc受体的异源性导致由抗体和免疫复合物引发的细胞反应具有多样性。Fc受体共享可能介导细胞间信号转导的结构相关的配体结合区。

Fc受体，作为免疫球蛋白基因蛋白超家族的成员，是能够结合免疫球蛋白分子的Fc部分的表面糖蛋白。通过Fc受体链上的识别结构域，该家族的每一成员识别一种或多种同种型免疫球蛋白。通过其对免疫球蛋白亚型的特异性来定义Fc受体。IgG的Fc受体称为FcγR，IgE的称为FcεR，IgA的称为FcαR。不同的辅助细胞具有对于不同同种型的抗体的Fc受体，而且这些抗体的同种型决定何种辅助细胞将参与指定的反应(综述参见Ravetch J.V.等1991，Annu.Rev.Immunol.9：457-92；Gerber J.S.等，2001，Microbes and Infection，3：131-139；Billadeau D.D.等，2002，The Journal ofClinical Investigation，2(109)：161-1681；Ravetch J.V.等，2000，Science，290：84-89；Ravetch J.V.等，2001，Annu.Rev.Immunol.19：275-90；RavetchJ.V.1994，Cell，78(4)：553-60)。不同的Fc受体，表达其的细胞以及其同种型的特异性列在表1中(编自Immunobiology：The Immune System inHealth and Disease，第4版.1999；Elsevier Science Ltd/Garland Publishing，New York)。

Fcγ受体

此家族的每一成员为完整的细胞膜糖蛋白，具有不同长度的与免疫球蛋白相关结构域的C2组合有关的细胞外结构域、单一的跨膜结构域和细胞内胞浆结构域。已知有三种FcγR，称为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。这三种受体由不同的基因编码，但是这三种家族成员间的广泛同源性表明它们可能通过基因复制而来源于共同的起源。本发明特别关注FcγRII(CD32)。

FcγRII(CD32)

FcγRII蛋白为40KDa的完整的膜糖蛋白，因为对单体Ig的低亲和性(10⁶M^-1)，其只结合复合IgG。此受体是最广泛表达的FcγR，存在于所有造血细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞、肥大细胞以及血小板。FcγRII在其免疫球蛋白结合链中仅有两个免疫球蛋白样区域，并因此对IgG的亲和性比FcγRI要低得多。有三种FcγRII(FcγRII-A，FcγRII-B，FcγRII-C)基因，所有这些以聚集体或免疫复合物的形式结合IgG。

FcγRII-A(CD32A)和FcγRII-B(CD32B)胞浆结构域中的明显差异产生受体结合的两种异源功能性应答。该基本原理的区别在于A同种型引发导致细胞活化如吞噬作用和呼吸暴发的细胞内信号，而B同种型引发抑制性信号，例如抑制B细胞活化。

通过FcγR的信号事件

结合后，活化和抑制信号均由FcγR转导。不同受体同种型间的结构差异导致这些截然不同的相反功能。所述受体的胞浆内的信号发生结构域的两种不同结构域称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，它们引起不同反应。招募这些结构的不同胞浆酶使FcγR介导的细胞反应发生。含ITAM的FcγR复合物包括FcγRI、FcγRIIA、和FcγRIIIA，而含ITIM的复合物仅包括FcγRIIB。

人中性粒细胞表达FcγRIIA基因。通过免疫复合物或特异性抗体交联聚集的FcγRIIA使ITAM与受体相关激酶聚集在一起，这促进ITAM磷酸化。ITAM磷酸化作为Syk激酶的锚定位点，该Syk激酶的活化使下游底物(例如PI₃K)活化。细胞的活化使前炎性介质释放。

FcγRIIB基因在B淋巴细胞上表达，其细胞外结构域与FcγRIIA有96％相同，且以不能区别的方式结合IgG复合物。根据FcγRIIB细胞浆结构域中的ITIM的存在来确定FcγR的这种抑制性亚族。最近，建立了此抑制的分子基础。当与活化的FcγR结合时，FcγRIIB中的ITIM出现磷酸化并吸引肌醇多磷酸5’-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，其水解磷酸肌醇信使，该信使是由于含ITAM的FcγR介导的酪氨酸激酶活化而释放的，从而防止了细胞内Ca⁺⁺的内流。因此FcγRIIB的交联阻断了对FcγR连接的活化反应并抑制了细胞反应性。由此破坏了B细胞活化、B细胞增殖和抗体分泌。

表1.免疫球蛋白同种型Fc区的受体

受体	FcγRI(CD64)	FcγRII-A(CD32)	FcγRII-B2(CD32)	FcγRII-BI(CD32)	FcγRIII(CD16)	FcεR	FcαRI(CD89)
								结合	IgG1108M-1	IgG12×106M-1	IgG12×106M-1	IgG12×106M-1	IgG15×105M-1	IgG11010M-1	IgG1，IgA2107M-1
细胞类型	巨噬细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞树突状细	巨噬细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞树突状细	巨噬细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞	B细胞肥大细胞	NK细胞嗜酸性粒细胞巨噬细胞中性粒细胞	肥大细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞	巨噬细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞

	胞	胞血小板朗格罕斯细胞			肥大细胞
								结合作用	摄取刺激呼吸爆发活化杀伤诱导	摄取颗粒释放	摄取刺激抑制	无摄取刺激抑制	杀伤诱导	颗粒分泌	摄取，杀伤诱导

2.2 相关疾病

2.2.1 癌症

瘤或肿瘤是由异常的不受控的细胞生长产生的瘤性组织，其可以是良性的或是恶性的。良性肿瘤通常位于局部。恶性肿瘤统称为癌症。术语“恶性”通常指该肿瘤可侵袭和破坏邻近的机体结构并扩散至远处而引起死亡(综述参见Robbins和Angell，1976，Basic Pathology，第2版，W.B.SaundersCo.，Philadelphia，pp.68-122)。癌症可在机体的许多位置产生，并根据其起源而表现不同。癌细胞破坏机体部分，它们从该部分起源并随后扩散到机体的其它部分，在该其它部分开始新的生长并引起更严重的破坏。

每年有超过120万的美国人发展成为癌症。在美国癌症是第二大致死因，并且如果目前的趋势继续发展，癌症可能在2010年前成为死亡的主要原因。肺癌和前列腺癌是美国男性的头号癌杀手。肺癌和乳腺癌是美国女性的头号癌杀手。两个美国男性中有一个在其有生之年的某个时刻会被诊断患有癌症。三个美国女性中有一个在其有生之年的某个时刻会被诊断患有癌症。仍没有治愈癌症的方法。目前的治疗策略诸如手术、化疗和放疗时常没有效果或表现出严重的副作用。

2.2.1.1 B细胞恶性肿瘤

B细胞恶性肿瘤包括但不限于B细胞淋巴瘤和白血病，其在美国是有显著发病率的瘤性疾病。在美国每年有大约55,000新淋巴瘤病例(1998年资料)，每年约有25,000人死亡。这表明在美国人群中，癌症发病率为4％，全部癌症相关死亡率为4％。再版的欧洲-美国淋巴肿瘤分类(1994，REALclassification，1999年修订)依据其来源将淋巴瘤分为B细胞系淋巴瘤、T细胞系淋巴瘤或何杰金氏淋巴瘤。B细胞系淋巴瘤是在美国诊断出的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的最常见类型(Williams，Hematology，第6版.(Beutler等编)，McGraw Hill 2001)。慢性淋巴细胞性白血病(CLL)是一种肿瘤性疾病，以血液、骨髓和淋巴样组织中小的、成熟样淋巴细胞的积累为特征。在美国CLL的发病率为每100,000人2.7例。随年龄在增长，特别是在男性中，这种风险呈进行性增加。其占所有癌症的0.8％，且是最常见的成人白血病，占所有白血病的30％。在几乎所有的病例中(＞98％)，患病细胞均属于B淋巴细胞系。非白血病变体，即小淋巴细胞淋巴瘤占所有淋巴瘤的5-10％，其具有与B-CLL患者中的有关淋巴结不可区分的组织学、形态学和免疫学特征(Williams，2001)。

慢性淋巴细胞白血病的发生史分为几个阶段。在早期，慢性淋巴细胞白血病是一种无痛疾病，以小的、成熟的、无功能性的存活期延长的恶性B淋巴细胞为特征。最后，恶性B细胞的复制期减少，患者症状加重。化疗试剂治疗可缓解症状，但患者的总存活仅有最低程度的延长。在慢性淋巴细胞白血病的晚期，以显著的贫血和/或血小板减少为特征。此时，存活的中位值低于两年(Foon等，1990，Annals Int.Medicine，113：525)。由于细胞的增殖速率非常低，因此慢性淋巴细胞白血病对化疗剂治疗有抗性。

最近，基因表达研究鉴定出了在淋巴细胞增殖性疾病中可能上调表达的一些基因。一种被认为在B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)患者中和大部分非何杰金氏淋巴瘤患者中过表达的分子是CD32B(Alizadeh等，2000，Nature，403：503-511；Rosenwald等，2001，J.Exp.Med.184：1639-1647)。然而，在B-CLL中CD32B的作用并不清楚，因为有一报道证明CD32B在低百分比的B-CLL细胞上以低的密度表达(Damle等，2002，Blood，99：4087-4093)。CD32B为B细胞系表面抗原，其在B细胞瘤中过表达使其成为治疗性抗体的适合靶点。此外，CD32B属于抑制性受体类别，其结合传递负性信号。因此抗CD32B的抗体应该具有消除肿瘤细胞的功能，其机制包括补体依赖的细胞毒性作用(CDC)、抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)以及启动细胞凋亡信号。因此，CD32B与其副本CD32A(活化的Fcγ受体)的高度同源性能够进一步阻断选择性识别该分子的一种而非另一种形式的抗体产生。

2.2.1.2 癌症治疗

目前，癌症的治疗包括根除患者中肿瘤细胞的手术、化疗、激素治疗和/或放疗(参见例如，Stockdale，1998，″Principles of Cancer PatientManagement″，in Scientific American：Medicine，vol.3，Rubenstein和Federman编，第12章，第IV部分)。近来，癌症的治疗还包含了生物治疗和免疫治疗。所有这些治疗对患者都有显著的缺点。例如手术治疗，由于患者的健康状态可能对于患者来说是不适当的，或者是不可接受的。此外，手术也可不可能完全去除肿瘤组织。只有当肿瘤组织表现出比正常组织更加敏感时，放疗才是有效的，但放疗通常也会引起严重的副作用。激素治疗很少作为单一试剂施用，并且尽管有效，但通常是在其它治疗已经去除了大部分癌细胞后用于防止或延迟癌症的复发。生物治疗/免疫治疗数量有限并可能会产生副作用，如皮疹或肿胀、流感样症状，包括发热、寒战和疲乏、消化道问题或过敏反应。

对于化疗，有各种化疗剂可用于癌症治疗。大部分癌症化疗是通过抑制DNA合成、直接或间接抑制脱氧核糖核酸三磷酸前体的生物合成来阻断DNA复制和伴随的细胞分化起作用(参见例如，Gilman等，Goodman andGilman′s：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版(Pergamom Press，New York，1990))。这些试剂，包括诸如亚硝基脲的烷基化试剂、诸如氨甲喋呤和羟基脲的抗-代谢物以及其它试剂，例如etoposides、喜树碱、争光霉素、阿霉素、柔红霉素等等，尽管不必需对细胞周期具有特异性，但因其作用于DNA复制，因而在S期杀伤细胞。其它是试剂，特别是秋水仙碱和长春花生物碱，诸如长春碱和长春新碱，干扰微观的装配导致有丝分裂停滞。化疗方案通常包括联合给予化疗剂来增加治疗效果。

虽然有多种化疗剂可供使用，但化疗具有许多缺点(参见例如，Stockdale，1998，″Principles Of Cancer Patient Management″in ScientificAmerican Medicine，vol.3，Rubenstein和Federman编，第12章，第10部分)。几乎所有的化疗剂都是有毒的，并且化疗可引起显著且常见的危险、副作用，包括严重的恶心、骨髓抑制、免疫抑制等。此外，即使进行化疗剂的联合给药，一些肿瘤细胞仍对所述化疗剂有抗性或发展为有抗性。事实上，对治疗方案中使用的具体化疗剂具有抗性的那些细胞通常证明对其它药物也有抗性，甚至对作用机制不同于在具体的治疗方案中使用的药物的作用机制的那些试剂。此现象称为多向性药物和多药物抗性。因此，由于药物抗性，许多癌症对标准化疗方案来说是难以治疗的。

B细胞恶性肿瘤通常用单一试剂化疗、化疗和/或放疗组合来治疗。这些治疗可减少发病率和/或改善存活，虽然它们具有显著的副作用。B细胞恶性肿瘤对不同形式治疗的反应是复杂的。例如，在非何杰金氏淋巴瘤的适当临床阶段，区域放疗可产生满意的治疗。然而一些患者却没有反应，疾病复发并且随时间延长而对治疗产生抗性，特别是所述疾病的最具侵袭性变体。约有一半的患者死于该疾病(Devesa等，1987，J.Nat′l Cancer Inst.79：701)。

用于治疗难治性B细胞瘤的探索性疗法包括自体同源和同种异源的骨髓或干细胞移植和基因治疗。最近，利用靶B细胞特异抗原的单克隆抗体的免疫治疗已引入到了B细胞瘤的治疗中。用于引导放射性核素、毒素或其它治疗性试剂的单克隆提供了向肿瘤位点选择性地释放这种试剂从而限制对正常组织的毒性成为可能。

对替代性癌症治疗有显著的需求，特别需要已证明对诸如手术、放疗、化疗和激素治疗的标准癌症治疗来说难以治疗的癌症的治疗。一种有前景的替代是免疫治疗，其中癌细胞被癌抗原特异性抗体特异性靶向。主要的努力已用于使免疫反应具有特异性，例如，杂交瘤技术使肿瘤选择性抗体的开发成为可能(参见Green M.C.等，2000，Cancer Treat Rev.，26：269-286；Weiner LM，1999，Semin Oncol.26(suppl.14)：43-51)，并且在过去的几年里，食品药品管理局已经批准了第一批用于癌症治疗的单克隆抗体(MAb)：用于非何杰金氏淋巴瘤的Rituxin(抗-CD20)，用于B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的Campath(抗-CD52)，以及用于转移性乳腺癌的赫赛汀(Herceptin)[抗-(c-erb-2/HER-2)](Suzanne A.Eccles，2001，Breast Cancer Res.，3：86-90)。NHL和B-CLL是B细胞肿瘤的两种最常见的类型。已经证实了这些抗体的临床效果，但其使用并不是没有副作用。抗体效应因子功能的潜能，例如介导抗体依赖的细胞毒性作用(“ADCC”)是这种治疗的障碍。此外，对于Rituxan和Campath，至少一半的患者对其没有反应，并且部分有反应者可能会对随后的治疗产生抗性。

因此，需要癌症，具体是B细胞恶性肿瘤的可选疗法，尤其对于用标准的癌症治疗和诸如Rituxan的新免疫治疗难以治疗的患者。

2.2.2 炎性疾病与自体免疫性疾病

炎症是机体的白细胞和化学物质保护我们的机体不受诸如细菌和病毒等外来物质感染的过程。通常其特征为受影响的区域疼痛、肿胀、发热和变红。称为细胞因子和前列腺素的化学物质控制此过程，并以有序和自我控制的级联释放入血或受影响的组织中。该化学物质的释放增加损伤或感染区域的血流，并可能导致变红和发热。一些化学物质引起体液漏入该组织导致肿胀。该保护性过程可刺激神经并引起疼痛。当这些改变仅在相关区域在有限的时间内发生时，这对机体是有益的。

在自体免疫性疾病和/或炎性疾病中，免疫系统引发炎性反应，此时并没有外来物质的攻击，机体正常的保护性免疫系统由于错误地自我攻击而而对其自身组织产生伤害。有许多种不同的自体免疫性疾病，其以不同方式影响机体。例如，多发性硬化症患者的脑受到影响，克罗恩氏病患者的肠道受到影响，和类风湿性关节炎患者的不同关节的滑膜、骨和软骨受到影响。因为自体免疫性疾病加剧一种和多种机体组织类型的破坏，因而会导致器官的异常生长和器官功能的变化。自体免疫性疾病可能仅影响一种器官和组织类型，也可影响多种器官和组织。自体免疫性疾病通常影响的器官和组织包括红细胞、血管、结缔组织、内分泌腺体(例如，甲状腺或胰腺)、肌肉、关节和皮肤。自体免疫性疾病的例子包括但不限于桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、恶性贫血、阿狄森氏病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、斯耶格伦综合征(Sjogren′s syndrome)、皮肌炎、红斑狼疮、多发性硬化症、自体免疫性内耳疾病、重症肌无力(myasthema gravis)、莱特尔氏综合征(Reiter′s syndrome)、格雷夫斯病(Gravesdisease)、自体免疫性肝炎、家族性腺瘤性息肉病和溃疡性结肠炎。

类风湿性关节炎(RA)和青少年类风湿性关节炎属于炎性关节炎类型。关节炎是描述关节炎症的常用术语。某些关节炎类型(但并非全部)是误导的炎症的结果。除类风湿性关节炎外，与炎症有关的其它类型的关节炎包括银屑病关节炎、莱特尔氏综合征、强直性脊椎炎关节炎和痛风性关节炎。类风湿性关节炎在机体两侧关节同时发生的慢性关节炎类型(诸如两侧的手、手腕和膝)。此对称性有助于区分类风湿性关节炎与其它类型的关节炎。除影响关节外，类风湿性关节炎有时会影响皮肤、眼、肺、心脏、血液或神经。

类风湿性关节炎影响约1％的世界人口并极可能致残。在美国每年大约有290万的类风湿性关节炎发病者。女性发病比男性高2至3倍。类风湿性关节炎的典型发病年龄在25岁至50之间。71,000年轻美国人患有青少年类风湿性关节炎(年龄为18岁及以下)，女孩患病是男孩的6倍。

类风湿性关节炎是自体免疫性疾病，其中机体的免疫系统将在关节中分泌滑膜液的滑膜不当地识别为异质物。炎症发生且关节中及关节周围的软骨和组织被损伤或破坏。在严重的病例中，该炎症扩散到其它的关节组织以及周围的软骨中，在这些地方其侵蚀和破坏骨和软骨并使关节畸形。机体用疤痕组织来代损伤的组织，引起关节内的正常空间变得狭窄并将骨融合在一起。类风湿性关节炎引起僵直、肿胀、疲劳、贫血、体重下降、发烧和常见的麻痛。类风湿性关节炎的一些常见症状包括持续一小时或更长时间的晨起关节僵直；特定手指或手腕关节肿胀；关节周围软组织肿胀；关节两侧肿胀。肿胀可伴随或不伴随疼痛，并可进行性破坏或在恶化之前保持数年不变。

类风湿性关节炎可基于多种因素的组合来诊断，这些因素包括：疼痛关节的具体区域和对称性，存在晨起关节僵直，皮肤下存在肿块和结节(风湿性结节)，表明类风湿性关节炎的X-线检测结果，和/或称为类风湿性因子的血液化验的阳性结果。许多(但不是全部)患有类风湿性关节炎的人群其血液中含有类风湿性因子抗体。类风湿性因子也可能出现在未患有类风湿性关节炎的人群中。其它的疾病也可引起血液中类风湿性因子产生。这就是为什么类风湿性关节炎的诊断需要基于几种因素在组合而不能仅仅依赖血液中类风湿性因子的存在的原因。

该疾病的典型过程是持久但波动的关节症状，并在约10年后，90％的患者会表现出骨和软骨的结构破坏。有很小百分比是完全消除的短暂疾病，有另一很小百分比会发生多关节畸形的严重疾病，并有时会有该疾病的其它表现。炎性进程导致关节的骨和软骨被侵蚀和破坏。在类风湿性关节炎中，存在持续的抗原呈递、T细胞刺激、细胞因子分泌、滑液细胞活化和关节破坏的自身免疫循环。该疾病对个人和社会均具有严重的影响，引起明显的疼痛、功能损伤和致残，需要花费数百万美元的健康护理费且有工资损失(参见例如，NIH网址和NIAID网址)。

目前对关节炎的治疗主要集中在用抗炎性或免疫抑制性药物来减轻关节的炎症。任何治疗关节炎的一线药物都通常为抗炎药，例如阿司匹林、布洛芬以及诸如塞来考昔(celecoxib)和罗非考昔(rofecoxib)的Cox-2抑制剂。“二线药物”包括金制剂、氨甲喋呤和类固醇。尽管这些都是关节炎的成熟治疗，但很少有患者通过这些线的单独治疗能够康复。最近，随着对类风湿性关节炎发病机理的了解的深入，联合使用了氨甲喋呤和细胞因子抗体或重组的可溶性受体。例如，肿瘤坏死因子(TNF)-α的重组可溶性受体已用于与氨甲喋呤联合来治疗关节炎。然而，利用氨甲喋呤与诸如重组可溶性受体的抗TNF-α试剂治疗的患者仅有约50％表现出显著的临床改善。尽管进行了治疗，但许多患者仍然难以治疗。对于类风湿性关节炎患者来说，难以治疗问题仍然存在。现行的治疗具有高发的副作用或不能完全防止疾病的进展。因此，还没有理想的治疗方法，并且不能方法能治愈。亟需要更有效的治疗类风湿性关节炎和其它自体免疫性疾病的新疗法。

2 2.3 过敏反应

根据导致过敏症状的表现的基本机制，将免疫介导的过敏(超敏)反应分为四种类型(I-IV)。I型过敏反应以IgE介导的血管活性物质的释放为特征，如由肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺。在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，过敏原结合的IgE与其受体交联，这引起这些物质的释放和随后的过敏症状。在患有I型过敏反应的个体中，当第二次暴露于过敏原时，会引起高水平的该过敏原特异性的IgE抗体产生，这是因为记忆性B细胞和T细胞的参与了IgE产生所需要的三细胞相互反应。产生的高水平IgE抗体会通过过敏原结合的IgE而使肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的IgE受体的交联增加，这导致这些细胞活化并使病理性介质释放，该介质引起I型过敏反应疾病的临床表现。

已经鉴定并表征了对IgE有不同亲和性的两种受体。高亲和性受体(FcεRI)在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面表达。低亲和性受体(FcεRII/CD23)在包括B细胞、T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和Langerhan(朗格罕斯)细胞的多种细胞上表达。高亲和性IgE受体由三种亚单位(α，β和γ链)构成。一些研究表明，仅α链参与IgE的结合，而β和γ链(其是跨膜或是细胞浆蛋白)是信号转导事件所需的。鉴定IgE结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的FcεRI所需的IgE结构在设计治疗或预防IgE介导的过敏反应策略中是极其重要的。例如，IgE受体结合位点的阐明可用于鉴定在体内阻断IgE与受体接受细胞的结合的肽或小分子。

目前，利用诸如抗组胺和皮质类固醇的药物来治疗IgE-介导的过敏反应，其试图通过对抗由肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放的血管活性物质来减轻与过敏反应有关的症状。高剂量的抗组胺和皮质类固醇会引起有害的副作用(例如，中枢神经系统紊乱、便秘等等)。因此亟需治疗I型过敏反应的其它方法。

治疗I型过敏反应性疾病的一种方法是在血清中产生与可溶性(游离)IgE反应的单克隆抗体，阻断IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的其受体结合，且不结合受体结合的IgE(即，他们是非过敏原性的)。两种此类单克隆抗体正处于IgE介导的过敏反应治疗的临床开发的后期阶段(参见例如，Chang，T.W.，2000，Nature Biotechnology，18：157-62)。

IgE介导的过敏反应的一种最有前景的治疗是激活对抗内源性IgE的非过敏原性抗原表位的免疫。Stanworth等人(美国专利5,601,821)描述了衍生自人IgE的CεH4结构域的肽的应用策略，该肽与异源性载体蛋白结合而作为过敏反应性疫苗。然而，这种肽证明并不能够诱导与天然可溶性IgE反应的抗体产生。此外，Hellman(美国专利5,653,980)建议基于全长CεH2-CεH3结构域(大约220氨基酸长)与异质性载体蛋白的融合构建抗IgE疫苗组合物。然而，Hellman建议的由抗IgE疫苗组合物诱导的抗体极有可能导致过敏性反应，因为已证明IgE分子的CεH2和CεH结构域的一些部分的抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE受体交联并引起过敏性反应介质产生(参见例如，Stadler等，1993，Int.Arch.Allergy and Immunology，102：121-126)。因此，亟需不会诱导过敏性抗体的IgE介导的过敏反应的治疗方法。

对诱导过敏性反应的极大关注产生了I型过敏性疾病的另一种治疗法，该治疗包括模拟表位，其当给予动物时能够诱导抗IgE多克隆抗体产生(参见例如，Rudolf等，1998，Journal of Immunology，160：3315-3321)。Kricek等人(国际公开WO 97/31948)用单克隆抗体BSWI7筛查了噬菌体展示的肽文库以鉴定可模拟IgE受体结合构象的肽模拟表位。推测这些模拟表位可用于诱导多克隆抗体，该多克隆抗体与游离的天然IgE反应，但不与受体结合的IgE反应，并阻断IgE与其受体的结合。Kriek等人公开了与IgE分子的任何部分不同源的肽模拟表位，其因此与本发明所公开的肽不同。

现有技术调查证实，亟需增强治疗或预防如癌症、自体免疫性疾病、炎性疾病或过敏反应等疾病的现有方法的治疗效果。具体地，亟需增强效应因子功能，尤其是增强用于癌症治疗的治疗性抗体的细胞毒作用。本领域目前仍没有治疗或预防过敏性疾病的方法(例如，通过抗体治疗或疫苗治疗)。

3.发明内容

FcγRIIA和FcγRIIB的细胞外结构域95％是相同的，因此它们有多个共同的抗原表位。然而，FcγRIIA和FcγRIIB表现出非常不同的活性。其最基本的不同是FcγRIIA起始细胞内信号发生而引起细胞活化如吞噬作用和呼吸爆发。在本发明之前，或据本发明人所知，能区分天然人FcγRIIA和天然人FcγRIIB的已知抗体还没有被鉴定出来。考虑到它们的不同活性和介导免疫反应的作用，需要识这种别天然人FcγRIIB和非天然人FcγRIIA的抗体。本发明部分地基于这种FcγRIIB特异性抗体的发现。

本发明涉及分离的抗体或其片段，该抗体或其片段特异性结合FcγRIIB，特别是人FcγRIIB，更特别地是天然人FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA，特别是人FcγRIIA，更特别是天然人FcγRIIA的亲和性。优选地，本发明的抗体结合天然人FcγRIIB的胞外结构域。在本发明的某些实施方案中，所述抗体或其片段结合FcγRIIB的亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性2倍。在本发明的其它实施方案中，所述抗体或其片段结合FcγRIIB的亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少10⁴、至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷或者至少10⁸倍。在优选的实施方案中，所述抗体或其片段结合FcγRIIB的亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性100倍、1000倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍或10⁸倍。优选地，这些结合亲和性由单体IgG，而不是聚集的IgG来测定的，且结合是通过可变区实现的(例如，抗体的Fab片段具有与全长免疫球蛋白分子相似的结合特性)。

在一个实施方案中，本发明的FcγRIIB特异性抗体不是如Pulford等，1986(Immunology，57：71-76)所述的命名为KB61的单克隆抗体，或者是Weinrich等，1996，(Hybridoma，15(2)：109-6)所述的命名为MAbII8D2的单克隆抗体。在特定的实施方案中，本发明的FcγRIIB特异性抗体不结合与单克隆抗体KB61或单克隆抗体MAbII8D2相同的抗原表位和/或不与单克隆抗体KB61或单克隆抗体MAbII8D2竞争结合。优选地，本发明的FcγRIIB-特异性抗体不结合与FcγRIIb2同种型的氨基酸位置135-141相应的氨基酸序列Ser-Asp-Pro-Asn-Phe-Ser-Ile。

本发明涉及特异性结合FcγRIIB的分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段的结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性，该亲和性通过本领域公知的评价特异性的标准方法来测定。本发明涉及特异性结合FcγRIIB的分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段的结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性，该亲和性以例如Western印记、BIAcore放射性免疫分析来测定。本发明涉及特异性结合FcγRIIB的分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段的结合亲和性在FcγRIIB结合的线性范围内高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性，该亲和性通过ELISA分析来测定。在本发明的一个实施方案中，本发明涉及由哺乳动物系统产生、特异性结合FcγRIIB的分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段的结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性，该亲和性通过ELISA分析来测定。

在特定的实施方案中，本发明涉及特异性结合FcγRIIB的分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段的结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性，且所述抗体的不变区还对至少一种或多种Fc活化受体具有增强的亲和性。在另一特定实施方案中，所述Fc活化受体为FcγRIII。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体或其片段阻断FcγRIIB的IgG结合位点并阻断聚集的标记IgG与FcγRIIB结合，例如，在阻断性ELISA分析中。在特定的实施方案中，所述抗体或其片段在ELISA阻断分析中阻断了聚集的标记IgG的结合的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％。在另一特定实施方案中，所述抗体或其片段在ELISA阻断分析中，完全阻断聚集的标记IgG的结合。

在本发明的另一实施方案中，所述抗体或其片段阻断FcγRIIB的IgG结合位点并阻断聚集的标记IgG与FcγRIIB结合，这可以通过双着色FACS分析来测定。

本发明包括调节(即激动或拮抗)FcγRIIB活性的抗体的用途。在本发明的一个实施方案中，本发明的所述抗体激动FcγRIIB的至少一种活性，即引发信号产生。尽管不倾向受任何作用机制的限制，本发明的激动性抗体可模拟FcγRIIB簇，该簇可阻碍对FcγR结合的活化应答并抑制细胞应答。

在本发明的另一实施方案中，本发明的所述抗体拮抗FcγRIIB的至少一种活性，即阻断信号发生。例如，本发明的抗体阻断聚集的IgG与FcγRIIB结合。

本发明提供了抑制FcεRI诱导的肥大细胞活化的抗体。本发明还提供了抑制FcγRIIA介导的巨噬细胞活化的抗FcγRIIB抗体。本发明还提供了抑制B细胞受体介导的信号发生的抗FcγRIIB抗体。

在特定的实施方案中，所述抗FcγRIIB抗体阻断FcγRIIB的配体结合位点。在更特定的实施方案中，所述阻断活性可阻断免疫复合物引发的活化的负调节，并从而增强免疫反应。在更特定的实施方案中，所述增强的免疫反应为抗体依赖性细胞反应增加。在另一特定的实施方案中，本法明的抗FcγRIIB抗体阻断FcγRIIB受体与B细胞和/或Fc受体交联，从而使B细胞、肥大细胞、树突状细胞和巨噬细胞活化。

本发明包括制备本发明的抗体或其片段的方法，特别是相对于FcγRIIA，对FcγRIIB具有特异性的新的单克隆抗体的制备方法。本发明的抗体或其片段可以由本领域任何已知的制备抗体的方法来制备，具体地，通过本领域公知的培养的杂交瘤分泌、化学合成或重组表达技术来制备。在一个特定的实施方案中，本发明涉及重组制备FcγRIIB特异性抗体的方法，所述方法包括：(i)在适于所述抗体表达的条件下在培养基中培养宿主细胞，该宿主细胞含有可操作地与异源启动子连接的第一核酸分子，和可操作地与相同或不同的异源启动子连接的第二核酸，所述第一核酸和第二核酸分别编码所述抗体或其片段的重链和轻链，该抗体或其片段特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性；及(ii)从所述培养基回收所述抗体。在另一实施方案中，本发明提供了制备FcγRIIB单克隆抗体的方法，该抗体特异性性结合FcγRIIB，特别是人FcγRIIB，其结合亲和性高于所述单克隆抗体结合FcγRIIA，特别是人FcγRIIA的亲和性，所述方法包括：(a)用纯的FcγRIIB或其免疫原片段免疫一个或多个FcγRIIA转基因小鼠；(b)从所述一个或多个小鼠的脾细胞中产生杂交瘤细胞株；(c)从所述杂交瘤细胞株筛选出一种或多种杂交瘤细胞株，该一种或多种杂交瘤细胞株产生特异性结合FcγRIIB的抗体，该抗体的结合亲和性高于该抗体结合FcγRIIA的亲和性。本发明包括所述方法产生的任何抗体。在一个特定的实施方案中，本发明提供制备FcγRIIB单克隆抗体的方法，该抗体特异性结合FcγRIIB，特别是人FcγRIIB，其结合亲和性高于所述单克隆抗体结合FcγRIIA，特别是人FcγRIIA的亲和性，所述方法包括：(a)用纯的FcγRIIB或其免疫原片段免疫一个或多个FcγRIIA转基因小鼠；(b)加强免疫所述小鼠足够的时间以引发免疫反应；(c)从所述一个或多个小鼠的脾细胞中产生杂交瘤细胞株；(d)从所述杂交瘤细胞株筛选出一种或多个种交瘤细胞株，该一种或多种杂交瘤细胞株产生特异性结合FcγRIIB的抗体，该抗体的结合亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性。在优选的实施方案中，所述小鼠在四个月的时间内被加强免疫至少四次。在本发明的一个实施方案中，所述小鼠被纯的FcγRIIB免疫，其与本领域公知的佐剂混合以增强在所述小鼠中的免疫反应。在本发明的一个具体的实施方案中，所述免疫原片段是FcγRIIB的可溶性胞外结构域。可利用本领域公知的标准技术(例如，ELISA)来筛选所述杂交瘤细胞株。

在本发明的某些实施方案中，所述抗FcγRIIB抗体为单克隆抗体、合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、人抗体，嵌合抗体、camelized抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体，Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、细胞内抗体或者上述任一种的抗原表位结合片段。

优选地，本发明的抗体为单克隆抗体，并更优选地，为人源化或人抗体。在一个特定的优选实施方案中，本发明的抗体结合人FcγRIIB、特别是天然人FcγRIIB的胞外结构域。在另一特定的实施方案中，本发明的抗体特异性地或选择性地识别一种或多种FcγRIIB的抗原表位，特别是天然人FcγRIIB的抗原表位。本发明的另一实施方案包括利用噬菌体展示技术来增加本发明的抗体对FcγRIIB的亲和性。可以使用本领域公知的任何筛选方法(例如，ELISA)来鉴定对FcγRIIB具有增强活性的抗体。在另一特定的实施方案中，利用本领域公知的筛选分析方法(例如，BIACORE分析)来筛选本发明的抗体，以鉴定具有K_off比率低于3 ×10³s^-1的抗体。

在优选的实施方案中，本发明提供由克隆2B6或3H7产生的单克隆抗体或者其嵌合、人源化或其它工程化的形式，所述克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591和PTA-4592。在另一优选的实施方案中，所述发明提供由克隆1D5、2E1、2H9、2D11和1F2产生的单克隆抗体或者其嵌合、人源化或其它工程化的形式，所述克隆的ATCC登记号分别为PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959。在另一实施方案中，本发明提供了分离的抗体或其片段，其与由克隆2B6或3H7产生的单克隆抗体竞争结合，并结合FcγRIIB，优选天然人FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA，优选天然人FcγRIIA的亲和性，和/或与2B6或3H7克隆产生的单克隆抗体结合相同的FcγRIIB抗原表位，且结合FcγRIIB的亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性。此外，本发明还提供了细胞株2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2，其ATCC登记号分别为PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959。在一个特定的实施方案中，本发明提供了2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2抗体，或者其嵌合、人源化其它工程化形式，以预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤，或者其一种或多种症状。在一个特定的实施方案中，工程化形式包括一种或多种Fc区中的突变。所述一种或多种Fc区中的突变可产生具有改变了的抗体介导的效应因子功能、改变了的与其它Fc受体(例如，Fc活化受体)的结合、改变了的ADCC活性、或改变了的C1q结合活性、或改变了的补体依赖性细胞毒活性或上述任意组合的抗体。在优选的实施方案中，人源化2B6包括具有氨基酸序列SEQ IDNO：24的重链可变区以及具有氨基酸序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或者SEQ ID NO：22的轻链可变区。在另一优选的实施方案中，将人源化2B6或人源化3H7抗体的重链的Fc结构域工程化以在位置240、243、247、255、270、292、300、316、370、392、396、416、419或421产生至少一个氨基酸取代，该氨基酸在其位置用另一种氨基酸取代。在更优选的实施方案中，所述人源化2B6重链的Fc结构域在位置247为亮氨酸，在位置421为赖氨酸，在位置270为谷氨酸；在位置392为苏氨酸，在位置396为亮氨酸，以及在位置270为谷氨酸；或者在位置270为谷氨酸，在位置316为天冬氨酸以及在位置416为甘氨酸。在本发明的某些实施方案中，所述抗体不是克隆2B6或3H7产生的单克隆抗体或其嵌合、人源化或其它的工程化形式。

在本发明的某些实施方案中，提供了人源化2B6抗体，所述人源化2B6抗体包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：24的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：20的轻链可变区，其中所述人源化2B6重链的Fc结构域在位置247为亮氨酸，位置421为赖氨酸并在位置270为谷氨酸；或者在位置270为谷氨酸，在位置316为天冬氨酸，以及在位置416为甘氨酸。

本发明还包括编码本发明的抗体的多聚核苷酸。在一个实施方案中，本发明提供编码抗体或其片段的重链或轻链的分离的核酸序列，该抗体或其片段特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性。本发明还涉及包括所述核酸的载体。本发明还提供了包含编码重链的第一核酸分子和编码轻链的第二核酸分子的载体，所述重链和轻链为特异性结合FcγRIIB的抗体或其片段的重链和轻链，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性。在一个特定的实施方案中，所述载体为表达载体。本发明还提供了含有编码本发明的抗体的多聚核苷酸的载体的宿主细胞。优选地，本发明包括多聚核苷酸，该多聚核苷酸编码由保藏的克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2所产生的抗体的重链和轻链、或其部分，例如CDR、可变区等等以及其人源化形式，这些克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959。

活化性和抑制性Fc受体，例如FcγRIIA和FcγRIIB的平衡功能和适当的细胞免疫反应是关键的。本发明包括本发明的抗体在治疗与此平衡的丧失和Fc受体信号途径的调控有关的任意疾病中的用途。因此本发明的FcγRIIB抗体具有调节免疫反应的作用，例如抑制与自身免疫或炎性疾病或过敏反应有关的免疫反应。本发明的FcγRIIB抗体也可用于改变某些效应因子功能以增强，例如治疗性抗体介导的细胞毒作用。

本发明的抗体可用于癌症的预防或治疗，例如，在一个实施方案中，作为单一试剂治疗。在优选的实施方案中，本发明的抗体可用于黑色素瘤的治疗和/或预防。在另一实施方案中，所述抗体可用于癌症的预防或治疗，具体地用于增强具有细胞毒活性的癌抗原特异性治疗抗体的细胞毒活性，以增强肿瘤细胞的杀伤和/或增强抗体依赖性细胞毒细胞(“ADCC”)活性、补体依赖性细胞毒(“CDC”)活性或者治疗性抗体的吞噬作用。本发明提供了在患有以癌抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的第一抗体或其片段和第二抗体，所述第一抗体或其片段特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性，所述第二抗体特异性结合所述癌抗原且是细胞毒性的。本发明提供了在患有以癌抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的抗体或其片段以及特异性结合所述癌抗原且是细胞毒性的抗体，所述抗体或其片段特异性结合FcγRIIB、优选天然人FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA、优选天然人FcγRIIA的亲和性，该抗体或其片段的不变区是细胞毒性的，且当所述抗体为单体如FcγRIIIA，和特异性结合癌抗原的抗体时，其还对一种或多种Fc活化受体具有增强的亲和性。在特定的实施方案中，所述Fc活化受体为FcγRIIIA。在具体的实施方案中，给予本发明的所述抗体，其剂量使得所述抗体与中性粒细胞的结合不可检测。

在本发明另一优选实施方案中，本发明的抗体可用于预防或治疗B细胞恶性肿瘤，特别是非何杰金氏淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。因此，本发明提供了治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤的方法，该方法通过单独给予或与一种或多种其它治疗联合给予特异性结合FcγRIIB，且优选地不结合FcγRIIA的抗体及其衍生物、类似物以及此抗体的抗原结合片段来实施。在具体的实施方案中，所述个体的癌症是用一种或多种标准或试验性治疗方法特别是Rituxan治疗难于治疗的。本发明的方法可用于治疗、控制、预防或改善B细胞疾病，如B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、非何杰金氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、具有弥散大B细胞淋巴瘤区域的滤泡淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤以及弥散性小卵裂细胞淋巴瘤。

在另一实施方案中，本发明提供了与治疗性试剂或药物结合的FcγRIIB-特异性抗体的用途。可以与抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段结合的治疗性试剂的例子包括但不限于细胞因子、毒素、放射性元素和抗代谢物。

在一个实施方案中，本发明提供了将FcγRIIB-特异性抗体与B细胞恶性肿瘤的标准或试验性治疗方案(例如化疗、放射性免疫治疗或放疗)联合使用。这种联合治疗可增强标准或试验性治疗的效果。与FcγRIIB特异性抗体或其抗原结合片段联合用于预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤的治疗性试剂的例子包括但不限于Rituxan、干扰素-α和抗癌剂。与FcγRIIB特异性抗体或其抗原结合片段联合的化疗剂包括但不限于烷基化试剂、抗代谢物、天然产物和激素。本发明的联合治疗能够减少向B细胞恶性肿瘤患者给予抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段的剂量，和/或降低向该患者给予抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段的频率，以实现治疗或预防的效果。

在另一实施方案中，抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段的使用能够延长诊断患有B细胞恶性肿瘤的个体的活存。

在另一实施方案中，本发明提供了在用细胞毒性抗体治疗的个体中增强抗体介导的细胞毒作用方法，所述方法包括向所述患者给予足以增强所述细胞毒性抗体的细胞毒作用剂量的本发明的抗体或其片段。在另一实施方案中，本发明提供了在用细胞毒性抗体治疗的个体中增强抗体介导的细胞毒作用方法，所述方法包括向所述患者给予足以增强所述细胞毒性抗体的细胞毒作用剂量的本发明的抗体或其片段，当该抗体或其片段为单体时，还对Fc活化受体具有增强的亲和性。在另一实施方案中，本发明提供了还包括给予一种或多种其它癌症治疗性试剂的方法。

本发明包括将本发明的抗体与任何治疗性抗体联合使用，所述治疗性抗体通过细胞杀伤来加强抗体的治疗活性从而介导其治疗作用。在特定的实施方案中，本发明的抗体通过增强抗体介导的效应因子功能来增强所述抗体的治疗活性。在本发明的另一实施方案中，本发明的抗体通过增强靶治疗细胞的吞噬作用和调理作用来增强细胞毒性抗体的治疗活性。在本发明的另一实施方案中，本发明的抗体通过在靶肿瘤细胞破坏中增强抗体依赖性细胞毒性(″ADCC″)来增强所述抗体的治疗活性。在某些实施方案中，本发明的抗体与Fc融合蛋白联合使用以增强ADCC。

在一些实施方案中，本发明包括将本发明的抗体与治疗性抗体联合使用，所述治疗性抗体通过细胞杀伤来加强抗体的治疗活性从而介导其治疗作用。在特定的实施方案中，本发明包括与具有激动活性的治疗性凋亡诱导抗体(例如抗Fas抗体)联合使用本发明的抗体。治疗性凋亡诱导抗体可对本领域已知的任何调节凋亡途径的死亡受体具有特异性，例如，对TNFR受体家族成员或TRAIL家族成员具有特异性。

本发明包括利用本发明的抗体来阻断巨噬细胞介导的肿瘤细胞的发展和转移。本发明的抗体特别地用于实体瘤(其中发生巨噬细胞渗透)的治疗。本发明的拮抗性抗体特别地用于控制瘤细胞的转移，例如通过减少或消除肿瘤位点处的巨噬细胞数量来减少和消除肿瘤细胞的转移。本发明还包括能有效耗竭或消除免疫效应因子细胞(例如，树突状细胞)的抗体，该免疫效应因子细胞表达FcγRIIB，但不是巨噬细胞。利用本发明的抗体有效耗竭或消除免疫效应因子细胞可减少效应因子细胞的数量的50％、60％、70％、80％、优选90％、和最优选99％。在具体的实施方案中，本发明的抗体以使其与中性粒细胞的结合不可检测的剂量给药。

在一些实施方案中，本发明所述的激动性抗体特别地用于非造血来源的肿瘤的治疗，包括黑色素肿瘤。

在一些实施方案中，本发明包括将本发明的抗体与免疫特异性结合肿瘤抗原的治疗性抗体联合使用，所述抗原不在肿瘤细胞本身上表达，但在周围反应性和肿瘤支持性非恶性细胞，包括瘤基质中表达。在优选的实施方案中，本发明的抗体用于与特异性结合成纤维细胞上的肿瘤抗原，如成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗体联合使用。

本发明提供了在有此需要的患者中治疗自体免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的一种或多种本发明的抗体。本发明还提供了在有此需要的患者中治疗自体免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的一种或多种抗炎剂和/或一种或多种免疫调节剂。

本发明还提供了在有此需要的患者中治疗炎性疾病的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的一种或多种本发明抗体。本发明还提供了在有此需要的患者中治疗炎性疾病的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的一种或多种抗炎剂和/或一种或多种免疫调节剂。

本发明提供了在个体中增强疫苗组合物的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体给与特异性结合FcγRIIB的抗体或其抗原结合片段，该特异性结合的亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA和疫苗组合物的亲和性，从而使所述抗体或其片段以在所述个体中增强所述疫苗组合物的免疫反应的有效量给药。本发明的抗体可用于增强针对所述疫苗组合物的抗原的体液和/或细胞介导的免疫反应。本发明的抗体可用于与本领域公知的任何疫苗联合。本发明包括将本发明的抗体用于预防或治疗特定疾病，其中针对特定抗原和多种抗原的的增强的免疫反应对治疗和预防该疾病和病症是有效的。

本发明还提供了在有此需要的患者中治疗或预防IgE介导的过敏性疾病的方法，该方法包括向所述患者给予治疗有效量的本发明的激动性抗体。本发明还提供了在有此需要的患者中治疗或预防IgE介导的过敏性疾病的方法，该方法包括向所述患者给予本发明的抗体和用于治疗或预防IgE介导的过敏性疾病的其它治疗性抗体或疫苗组合物。

本发明还提供了增强对感染性试剂的免疫治疗的方法，其中将本发明的抗体给予已被诸如HIV、HCV或HSV的病原体感染的患者，以增强感染细胞的调理作用和吞噬作用。

本发明提供了治疗具有损害的凋亡介导信号发生的疾病的方法，例如癌症、自体免疫性疾病。在特定的实施方案中，本发明包括治疗具有缺陷的Fas介导凋亡的疾病，所述方法包括将本发明的抗体与抗Fas抗体联合给药。

本发明包括用本发明的抗体来检测生物样品中是否特定地存在FcγRIIB(即FcγRIIB，而不是FcγRIIA)。

在另一实施方案中，本发明提供了在个体中诊断自体免疫性疾病的方法，该方法包括：(i)用有效量的本发明的抗体接触来自所述个体的生物样品；和(ii)检测所述抗体或其片段的结合，其中所述可检测的标记的检测结果高于本底或标准水平，这表明所述个体患有自体免疫性疾病。

本发明还提供了药学组合物，其包括(i)治疗有效量的抗体或其片段，其特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性；和(ii)药学可接受的载体。本发明还提供了药物组合物，其包括(i)治疗有效量的抗体或其片段，其特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性；(ii)特异性结合癌抗原的细胞毒性抗体；和(iii)药学可接受的载体。

在本发明的某些实施方案中，提供了根据本发明的方法使用的药物组合物，所述药物组合物包括预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或其一种或多种症状有效量的抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段，及药学可接受的载体。本发明还提供了根据本发明的方法使用的药物组合物，所述药物组合物包括抗FcγRIIB抗体或或其抗原结合片段，非FcγRIIB拮抗剂的预防或治疗性试剂，及药学可接受的载体。

3.1 定义

本发明所用的术语“特异性结合FcγRIIB”和类似术语指抗体和其片段(或任何其它FcγRIIB结合分子)其特异性结合FcγRIIB或其片段，且不特异性结合其它的Fc受体，特别是FcγRIIA。此外，本领域所属技术人员应理解，特异性结合FcγRIIB的抗体可通过所述抗体的可变区或恒定区来结合。如果特异性结合FcγRIIB的抗体通过其可变区结合，则本领域所属技术人员应理解其并非是聚集的，即是单体。特异性结合FcγRIIB的抗体可以以较低的亲和性与其它肽或多肽结合，这可由例如免疫分析、BIAcore或本领域公知的其它分析来确定。优选地，特异性结合FcγRIIB或其片段的抗体或片段并不与其它抗原发生交叉反应。特异性结合FcγRIIB的抗体或片段可以鉴定，如通过免疫分析、BIAcore或本领域公知的其它分析来鉴定。当其与FcγRIIB结合的亲和性高于与任何交叉反应抗原结合的亲和性时，抗体或其片段就是特异性结合FcγRIIB的，这可以用如印记、放射性免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析(ELISA)等试验技术来确定。对于抗体特异性的讨论参见例如，Paul编，1989，Fundamental Immunology Second Edition，Raven Press，New York，332-336页。

本发明所用的术语“天然FcγRIIB”指内源性表达且在细胞表面呈递的FcγRIIB。在一些实施方案中，“天然FcγRIIB”包括在哺乳动物细胞中重组表达的蛋白。优选地，所述天然FcγRIIB不在细菌细胞，即大肠杆菌中表达。最有选的所述天然FcγRIIB不变性，即其处于生物活性构象。

本发明所用的术语“天然FcγRIIA”指内源性表达且在细胞表面呈递的FcγRIIA。在一些实施方案中，“天然FcγRIIA”包括在哺乳动物细胞中重组表达的蛋白。优选地，所述天然FcγRIIA不在细菌细胞，即大肠杆菌中表达。最优选的所述天然FcγRIIA不变性，即其处于生物活性构象。

本发明在蛋白样试剂(例如，蛋白、多肽和抗体)的叙述中所用的术语“类似物”指与第二蛋白样试剂具有相似和相同的功能，但不必需包含与该第二蛋白样试剂相似和相同的氨基酸序列的蛋白样试剂，或与第二蛋白样试剂具有相似或相同结构的蛋白样试剂。具有相似氨基酸序列的蛋白样试剂指第二蛋白样试剂是以下的至少一种：(a)氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％与第二蛋白样试剂的氨基酸序列相同的蛋白样试剂；(b)由核苷酸序列编码的蛋白样试剂，该核苷酸序列在严格条件下，与编码第二蛋白样试剂的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基或至少150个连续氨基酸残基的核苷酸序列杂交；和(c)由核苷酸序列编码的蛋白样试剂，该核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或者至少99％与编码第二蛋白样试剂的核苷酸序列相同。与第二蛋白样试剂结构类似的蛋白样试剂指与第二蛋白样试剂具有类似的二级、三级或四级结构的蛋白样试剂。所述多肽的结构可由本领域公知的方法来确定，包括但不限于肽测序、X-线晶体衍射、核磁共振、循环二色性以及结晶型电子显微镜。

为确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的一致性百分比，对所述序列进行比对以最佳地比较(例如，为了与第二氨基酸或核酸序列最佳地比对可将缺口引入到第一氨基酸或核酸序列的序列中)。随后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷。但第一序列中的某位置与第二序列的相应位置被相同的氨基酸残基或核苷占据时，那么所述两分子在该位置相同。两序列间的一致性百分比为该序列共有的相同位置数量的函数(即，一致性％＝相同的重叠位置的数目/位置的总数×100％)。在一个实施方案中，所述两种序列长度相同。

两序列间的一致性百分比还可用数学运算法则来完成。用于比较两序列的数学运算法则的优选的非限制性例子是Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2264-2268中的运算法则，其在Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5877中进行了改进。这种运算法则被整合到了Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序中。可利用NBLAST核苷酸序列参数组来实施BLAST核酸搜寻，例如score＝100，wordlength＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可利用XBLAST参数组来实施BLAST蛋白搜寻，例如score＝50，wordlength＝3，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得有缺口的比对以用于比较，可使用Altschul等，1997，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402所述的缺口BLAST。或者，可使用PSI-BLAST来实施反复搜寻以测定分子间的距离关系(Id.)。当利用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如NCBI网址)。另一用于序列比较的运算法则的优选的非限制性例子为Myers和Miller，1988，CABIOS，4：11-17中的运算法则。这种运算法则被整合到了ALIGN程序(2.0版)中，作为GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重表，缺口长度罚值为12和缺口罚值为4。

两序列间的一致性百分比可利用上述类似的技术来确定，允许或不允许缺口。在计算一致性百分比时，通常仅计算准确匹配。

本发明所用的术语“类似物”在非蛋白样试剂的上下文中指第二有机或无机分子，其与第一有机或无机分子具有相似或相同的功能并与第一有机或无机分子具有相似的结构。

本发明所用的术语“拮抗剂”指任何蛋白、多肽、肽、抗体、抗体片段、大分子活小分子(低于10kD)，其阻断、抑制、降低或中和另一种分子的功能、活性和/或表达，如FcγRIIB的功能、活性和/或表达。在不同的实施方案中，相对于诸如磷酸盐缓冲液(PBS)的对准组，拮抗剂降低了另一种分子的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的功能、活性和/或表达。

本发明所用的术语″抗体″指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、camelized抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、细胞内抗体、和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如，本发明的抗体的抗-Id和抗-抗-Id抗体)，以及上述任何一种的抗原表位结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以时任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，族(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)或亚族。

本发明所用的术语“B细胞恶性肿瘤”指任何的B细胞淋巴增殖疾病。B细胞恶性肿瘤包括B细胞来源的肿瘤。B细胞恶性肿瘤包括但不限于淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、何杰金氏病、非何杰金氏病、弥散性大B细胞淋巴瘤、具有弥散大B细胞淋巴瘤区域的滤泡淋巴、小淋巴细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤和弥散性小卵裂细胞淋巴瘤。

本发明所用的术语“癌症”指由细胞的异常不受控生长所导致的瘤或肿瘤。在本发明中，癌症明确地包括白血病和淋巴瘤。术语“癌症”指有细胞参与的疾病，该细胞具有转移至远处位点并表现出不同于非癌细胞的表型特征的潜能，例如，在三维基质如软琼脂中形成克隆，或在三维基底膜或胞外基质制剂中形成管状网络或网状矩阵。非癌细胞在软琼脂中部形成克隆，且在三维基础膜或胞外基质制剂中不形成明显的球状结构。癌细胞在其发展过程中获得其特征性的功能性能力，虽然是通过不同的机制获得。这些能力包括规避凋亡，生长信号的自我满足、对抗生长信号不敏感、组织浸润/转移、无限制的扩展潜能以及持续的血管形成。所述术语“癌细胞”包括恶化前的和恶性的癌细胞。在一些实施方案中，癌是指良性肿瘤，其保持在局部。在另一些实施方案中，癌指恶性肿瘤，其侵入和破坏邻近的机体结构并扩散指远处。在另一些实施方案中，所述癌与特定的癌抗原与有关。

本发明所用的术语″衍生物″在多肽或蛋白包括抗体的上下文中，指包含通过引入氨基酸残基的取代、缺失或添加而发生了改变的氨基酸序列的多肽或蛋白。本发明所用的术语“衍生物”也指已经被修饰的多肽或蛋白，即将任意类型的分子与该多肽或蛋白共价连接。例如但并不限于，抗体可通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、氨基化、通过公知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解、连接至细胞配体或其它蛋白等而被修饰。可通过利用本领域所属技术人员公知的化学修饰，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等来产生衍生的多肽或蛋白。此外衍生的多肽或蛋白衍生物与其来源多肽或蛋白具有相似或相同的功能。

本发明所用的与FcγRIIB关联的术语“衍生物”指含有FcγRIIB多肽、FcγRIIB多肽片段、免疫特异性结合FcγRIIB多肽的抗体或免疫特异性结合FcγRIIB多肽的抗体片段的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列通过引入氨基酸残基的取代、缺失或添加(即突变)而发生了改变。在一些实施方案中，抗体衍生物或其片段在CDR中包含一种或多种氨基酸残基的取代、缺失或添加。与非衍生的抗体相比，所述抗体衍生物具有基本相同的结合、更好的结合或更差的结合。在特定的实施方案中，所述CDR的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被取代、缺失或添加(即突变)。本发明所用的与FcγRIIB关联的术语“衍生物”还指经修饰的FcγRIIB多肽、FcγRIIB多肽片段、免疫特异性结合FcγRIIB多肽的抗体或免疫特异性结合FcγRIIB多肽的抗体片段，即将任何类型的分子与该多肽共价连接。例如但不限于，抗体可通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、氨基化、通过公知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解、连接至细胞配体或其它蛋白等来修饰。FcγRIIB多肽、FcγRIIB多肽片段、抗体或抗体片段的衍生物可通过利用本领域所属技术人员公知的化学修饰，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等来修饰。此外，FcγRIIB多肽、FcγRIIB多肽片段、抗体或抗体片段的衍生物可含有一种或多种非典型氨基酸。在一个实施方案中，抗体衍生物与其母本抗体具有相似或相同的功能。在另一实施方案中，当与未改变的抗体相比，抗体、抗体片段的衍生物的活性发生改变。例如，衍生物抗体或其片段可与其抗原表位更加牢固地结合或对蛋白酶水解更具抗性。

本发明所用的术语“病症”和“疾病”可交换使用，是指个体的状态。具体地，术语“自体免疫性疾病”与术语“自体免疫性病症”可交换使用，指有个体的状态，其特征在于该个体对其自身细胞、组织和/或器官的免疫反应引起的细胞、组织和/或器官损伤。术语“炎性疾病”与术语“炎性病症”可交换使用，指个体以炎症、优选慢性炎症为特征的状态。自体免疫性疾病可能与或不与炎症有关。此外，炎症可能由或不由自体免疫性疾病引起。因此，某些疾病的特征可能包括自体免疫性和炎性疾病。

本发明所用的术语“表型”指抗体特异性结合的抗原分子上的区域。

本发明所用的术语“片段”指包含另一多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续的氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续的氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。在特定的实施方案中，多肽片段保留所述多肽的至少一种功能。优选地，抗体片段为抗原表位结合片段。

本发明所用的术语“人源化抗体”指包含人框架区和来自非人(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一种或多种CDR的免疫球蛋白。提供CDR的所述非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的所述人免疫球蛋白称为“受体”。恒定区不需要存在，但如果存在其基本上与人免疫球蛋白恒定区相同，即至少约85-90％、优选约95％或更多相同。因此，可能除了CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有区域基本与天然人免疫球蛋白序列的对应部分相同。“人源化抗体”为包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体不包含典型的嵌合抗体，因为，例如嵌合抗体的全部可变区是非人的。可以说，通过人源化过程，所述供体抗体已被“人源化”，因为期望产生的人源化抗体与提供CDR的供者抗体结合相同的抗原。对于大多数部分，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，受体的高可变区残基被具有所需特异性、亲和性和容量的非人种类高可变区残基(供体)所替代，该非人种类如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类。在一些例子中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由对应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包括在受体抗体和供体抗体中不存在的残基。这些修饰是为了更进一步地改进抗体的性能。一般来说，所述人源化抗体基本上包含至少一个，通常两个可变区的全部，其中全部或基本上全部高可变区与非人免疫球蛋白的高可变区对应，并且全部或基本上全部的FR为人免疫球蛋白序列的FR。所述人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白免疫特异性结合FcγRIIB多肽的部分，其已通过引入氨基酸残基的取代、缺失或添加(即突变)而发生了改变。在一些实施方案中，人源化抗体为衍生物。这种人源化抗体在一种或多种非人CDR中包含氨基酸残基取代、缺失或添加。与非衍生的人源化抗体相比，所述人源化抗体衍生物可具有基本相同的、更好、或更差的结合。在特定的实施方案中，CDR的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被取代、缺失或添加(即突变)。有关人源化抗体的更详细资料参见，欧洲专利EP 239,400、EP 592,106和EP 519,596、国际公开WO 91/09967和WO 93/17105、美国专利5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886和6,407,213；以及Padlan，1991，Molecular Immunology，28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering，7(6)：805-814；Roguska等，1994，Proc Natl Acad Sci USA，91：969-973；Tan等，2002，J.Immunol.169：1119-25；Caldas等，2000，Protein Eng.13：353-60；Morea等，2000，Methods，20：267-79；Baca等，1997，J.Biol.Chem.272：10678-84；Roguska等，1996，Protein Eng.9：895-904；Couto等，1995，Cancer Res.55(23 Supp)：5973-5977；Couto等，1995，Cancer Res.55：1717-22；Sandhu，1994，Gene 150：409-10；Pedersen等，1994，J.Mol.Biol.235：959-73；Jones等，1986，Nature，321：522-525；Reichmann等，1988，Nature，332：323-329；和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。

本发明所用的术语“超变区”指抗体负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of protein of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或“超变环”的那些残基(即轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917)。Eph099B-208.261和Eph099B-233.152的CDR残基列在表1中。“框架区”或“FR”残基为本文所定义的那些可变区残基而不是超变区。

本发明所用的术语“免疫调节剂”及其变体包括但不限于免疫调节剂，是指调节宿主免疫系统的试剂。在某些实施方案中，免疫调节剂为免疫抑制剂。在某些其它的实施方案中，免疫调节剂为免疫刺激剂。免疫调节剂包括但不限于小分子、肽、多肽、融合蛋白、抗体、无机分子、模拟试剂和有机分子

本发明所用的术语“控制”是指个体从预防或治疗性试剂的给药中获得的有益效果，其不会治愈疾病。在某些实施方案中，给予个体一种或多种预防或治疗性试剂来“控制”疾病从而预防该疾病的进展和恶化。

本发明所用的术语“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA和RNA分子的组合和杂交DNA/RNA分子，及DNA或RNA分子的类似物。这种类似物可利用例如包括但不限于次黄嘌呤核苷或三苯甲基碱基的核苷酸类似物来产生。这种类似物还可包括含有修饰的骨架的DNA或RNA分子，该修饰的骨架赋予该分子有益属性，例如核酸酶抗性或增加的跨膜能力。所述核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，也可同时包括单链和双链部分，且可含有三链部分，但优选是双链DNA。

本发明所用的术语“预防”指通过给予预防或治疗试试剂而在个体中防止疾病的一种或多种症状的出现和/或复发或发作。

本发明所用的术语“预防性试剂”指可用于预防疾病或预防疾病的复发或扩散的任何试剂。预防有效量是指在患者中足以预防过度增殖性疾病，特别是癌症的复发或扩散，或上述疾病的出现的预防性试剂的量，所述患者包括但不限于可能患过度增殖性疾病的患者，例如有癌症遗传因素或以前暴露于致癌物质的患者。预防有效量也可指在疾病的预防中产生预防有益效果的预防性试剂的量。此外，与本发明预防性试剂有关的预防有效量是指单独的预防性试剂的量、或与其它试剂联合的量，其在疾病的预防中提供预防有益效果。在与本发明的FcγRIIB抗体的量联合使用时，该术语包括改善全面的预防或增强预防效果或与其它预防性试剂协同作用的量，这些其它预防性试剂例如但不限于治疗性抗体。在某些实施方案中，术语“预防性试剂”指激动性FcγRIIB-特异性抗体。在其它实施方案中，术语“预防性试剂”指拮抗性FcγRIIB-特异性抗体。在某些其它实施方案中，术语“预防性试剂”指癌症的化疗、放疗、激素治疗、生物学治疗(例如，免疫治疗)和/或本发明的FcγRIIB抗体。在其它实施方案中，可组合给予多种预防性试剂。

本发明所用的短语“副作用”包括预防性试剂或治疗性试剂的不需要的和不利的效果。不利的效果通常是不需要的，但不需要的效果并非必然为不利的。预防性试剂或治疗性试剂的不利效果可以是有害的、不舒服的或危险的。化疗的副作用包括但不限于消化道毒性，例如但不限于早期和晚期形成的腹泻和胃肠气胀、恶心、呕吐、食欲减退、白细胞减少、贫血、中性粒细胞减少、虚弱、腹部绞痛、发烧、疼痛、体重降低、脱水、脱发、呼吸困难、失眠、头昏、粘膜炎、口干症及肾衰、以及便秘、神经和肌肉效应、肾脏或膀胱的暂时或永久性损伤、流感样症状、体液驻留及暂时或永久不育。放疗的副作用包括但不限于疲劳、口干、食欲降低。生物学治疗/免疫治疗的副作用包括但不限于给药位点的皮疹或肿胀，流感样症状如发烧、寒战和疲劳，消化道问题和过敏反应。激素治疗的副作用包括但不限于恶心、生育问题、抑郁、食欲降低、眼部问题、头痛和体重波动。患者通常经历的其它不希望的作用有许多且是本领域公知的，参见例如，Physicians′Desk Reference(第56版，2002)，本文将其全部引入作为参考。

本发明所用的术语“单链Fv”或“scFv”指包括抗体的VH和VL区的抗体片段，其中这些结构域出现在单一多肽链中。通常，Fv多肽还包括VH和VL区间的多肽接头，其使得scFv形成用于抗原结合的所需结构。sFv的综述参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编.Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。在特定的实施方案中，scFv包括双特异性scFv和人源化scFv。

本发明所用的术语“个体”和“患者”可交换使用。如在本发明中，个体优选指哺乳动物，如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等等)和灵长类(例如猴子和人)，最优选人。

本发明所用的“治疗有效量”指足以治疗或控制FcγRIIB相关疾病或病症以及任何与Fc受体信号途径的调节的丧失有关的疾病，或增强另一种治疗如治疗性抗体、疫苗治疗或预防等的疗效的治疗性试剂的量。治疗有效量可指足以延迟或最小化疾病的发作，如延迟或最小化癌症的扩散的治疗性试剂的量。治疗有效量也可指在疾病的治疗和控制中提供治疗益处的治疗性试剂的量。此外，与本发明治疗性试剂相关的治疗有效量是指单独的治疗性试剂的量、或与其它治疗组合的量，其在疾病的治疗或控制中提供治疗益处，例如，足以增强足以治疗或控制疾病的治疗性抗体的疗效。与本发明FcγRIIB抗体剂量联用时，该术语可包括改善整个治疗、减少或避免不需要的作用，或者增强疗效或与其它治疗性试剂的协同作用的量。

本发明所用的术语“治疗”指根除、减少或改善与Fc受体信号途径的调节的丧失有关的疾病或病症的症状，或者增强另一种治疗如治疗性抗体、疫苗治疗或预防的疗效。在一些实施方案中，治疗指通过给予一种或多种治疗性试剂使原发性的、区域性的或转移性的癌组织根除、去除、改变或控制。在某些实施方案中，此术语是指通过向患有该疾病的个体给予一种或多种治疗性试剂而使癌症最小化或延迟扩散。在其它实施方案中，此术语是指使细胞疾病消除。

本发明所用的术语“联合”是指使用多种预防性试剂和/或治疗性试剂。使用术语“联合”并不限制预防性试剂和/或治疗性试剂对患病如过度增殖细胞疾病，特别是癌症的个体进行给药的顺序。第一预防性试剂或治疗性试剂可在第二预防性试剂或治疗性试剂之前(例如在1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如在1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)给予患有或怀疑患有疾病的个体。所述预防性试剂或治疗性试剂相继地或以一定的时间间隔向个体给药，以使本发明的试剂可与其它试剂一起发挥作用，从而提供比用其它方式给药更加有益的效果。任何其它预防性试剂或治疗性试剂可以以任何顺序与另外的其它预防性试剂或治疗性试剂给药。

4.附图简述

图1A和1B：由克隆3H7产生的抗体与FcγRIIB和FcγRIIA的直接结合。(A)将由一些杂交瘤培养物产生的抗体与FcγRII的直接结合在ELISA分析中与商业提供的抗FcγRII抗体进行比较，其中培养板用受体包被。在所述培养板上孵育上清液的不同稀释液(1∶10)，用山羊抗小鼠HRP轭合的抗体检测结合的抗体，并在650nm处检测吸光度。(B)3H7杂交瘤培养物产生的抗体的天然(左侧插图)和纯化(右侧插图)形式与FcγRIIA和FcγRIIB的直接结合，利用与1A相同的ELISA分析进行比较。

图2：3H7杂交瘤产生的抗体和聚集的生物素化人IgG与FcγRIIB的竞争结合。利用阻断性ELISA试验检测3H7抗体和聚集的生物素化人IgG竞争结合FcγRIIB的能力。用FcγRIIB包被ELISA培养板并与含有3H7抗体的上清液和来自同一杂交瘤但不含抗体的上清液(阴性对照)一起孵育。然后将聚集的生物素化人IgG的从200ng/孔开始的不同稀释液(1∶3)加入到所述培养板中，用轭合的链霉亲和素-辣根过氧化物酶来测定结合的聚集，用TMB显影反应并在650nm处检测吸光度。

图3：抗体与细菌或哺乳动物系统中产生的FcγRIIB的直接结合的比较。利用ELISA分析检测3H7抗体与FcγRIIB的直接结合，比较与细菌或哺乳动物产生的FcγRIIB的结合。抗体的滴定直接使用的上清液，随后用1∶10的稀释液。利用山羊抗小鼠HRP轭合的抗体检测结合的抗体，用TMB显影反应并在650nm处检测吸光度。

图4：3H7抗体与FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA的直接结合。利用ELISA分析比较纯化的3H7抗体与哺乳动物中表达的FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA的直接结合。用三种受体(100ng/孔)包被ELISA培养板。在包被的培养板上孵育纯化的3H7抗体的不同稀释液。山羊抗小鼠HRP轭合的抗体用来检测结合的抗体，用TMB显影反应并在650nm处检测吸光度。

图5：克隆2B6中纯化的抗体与FcγRIIA和FcγRIIB的直接结合与其它三种商业可获得的抗FcγRII单克隆抗体的直接结合得比较。将2B6抗体与FcγRIIA(右上插图)和FcγRIIB(左上插图)的结合与三种其它商业可获得的抗FcγRII抗体的结合进行比较。ELISA的形式与图4的描述相同。

图6A和B：克隆2B6产生的抗体与聚集的生物素化人IgG与FcγRIIB竞争结合。A：利用阻断性ELISA试验检测克隆2B6上清液中存在的抗体与聚集的生物素人IgG竞争结合FcγRIIB的能力。将该2B6抗体的竞争能力与来自杂交瘤的阴性对照以及3H7抗体的竞争能力进行比较。用FcγRIIB包被该ELISA培养板并与上清液的不同稀释液(1∶10)一起孵育。洗涤培养板后，将培养板与固定量的聚集的生物素化人IgG(1mg/孔)一起孵育，并用轭合的链霉亲和素-HRP来检测结合的聚集体。用TMB显影反应并在650nm处检测吸光度。B：用纯化的2B6抗体进行插图A所述的相同的阻断性ELISA，并且所用的阻断抗体的浓度(4mg/孔)的数据表示在柱状图中。将2B6阻断聚集的人IgG结合FcγRIIB的能力与小鼠IgG1同种型对照的能力进行比较。

图7A-C：2B6抗体和聚集的生物素化人IgG与FcγRIIB的竞争结合，用双着色FACS分析检测。利用稳定转染了全长哺乳动物FcγRIIB的CHO-K1细胞实施双着色FACS分析来表征2B6抗体。A：用小鼠IgG1同种型对照着色转染的细胞，随后用山羊抗小鼠FITC轭合的抗体和链酶亲和索-PE着色，B：在用小鼠IgG1同种型对照标记之后用聚集的生物素化人IgG着色转染的细胞，并用山羊抗小鼠FITC轭合的抗体标记以检测结合的单克隆抗体，用轭合的链霉亲和素-PE来检测结合的聚集体。C：用2B6抗体来着色细胞，通过洗涤去除抗体，并将细胞与聚集的生物素化人IgG一起孵育。洗涤细胞并用山羊抗小鼠FITC轭合的抗体标记以检测结合的单克隆抗体，并用轭合的链霉亲和素-PE来检测结合的聚集体。

图8A-C：与连接了CD32B(插图A)、CD32A(H131)(插图B)和CD32A(R131)(插图C)的表面结合的2B6和KB6.1抗体的Biacore分析。

图9A-C：人B淋巴细胞的单克隆抗FcγRIIB抗体和CD20共染色。用抗CD20-FITC轭合的抗体着色获自人血的细胞(″白血球衣″)，以选择B淋巴细胞群，以及3H7和2B6。用山羊抗小鼠PE轭合的抗体测定结合的抗FcγRIIB抗体。A.用抗CD20-FITC抗体和小鼠IgG1同种型对照共着色细胞。B.用抗CD20-FITC抗体和3H7抗体共着色细胞。C.用抗CD20-FITC抗体和2B6抗体共染着色细胞。

图10A和B：表达FcγRIIB的CHO细胞的着色。A.用小鼠IgG1同种型对照(左侧插图)和3H7抗体(右侧插图)着色CHO/IIB细胞。B.用小鼠IgG1同种型对照(左侧插图)和2B6抗体(右侧插图)染色CHO/IIB细胞。用山羊抗小鼠PE轭合的抗体标记该细胞结合的抗体。

图11：表达FcγRIIB的CHO细胞的着色。将表达huFcγRIIB的CHO细胞与抗CD32B抗体一起孵育，如每一插图的上部所示。洗涤细胞并在冰上向该细胞加入9μg/ml聚集的人IgG。用FITC轭合的山羊抗人IgG检测所述人聚集的IgG。通过FACS分析样品。......同种型对照+山羊抗huIgG-FITC，—同种型对照+聚集的人IgG+山羊抗人IgG-FITC，—抗CD32B抗体+聚集的人IgG+山羊抗人IgG-FITC。还用山羊抗小鼠PE轭合的抗体检测了各样品组中的与细胞上的受体结合的每一种抗体的含量(插图)。

图12A-J：利用CD32B特异性抗体、2B6和CD32A/B反应性抗体、FLI8.26对转化细胞株中的CD32B表达进行得流式细胞仪分析。细胞株：表达CD32A(A，B)或CD32B(C，D)的转染293H细胞，伯基特淋巴瘤(Burkitt′slymphoma)细胞株，Daudi(E，F)和Raji(G，H)，以及单核细胞株，THP-I(I，J)。

图13：用2B6、3H7和IV.3抗体进行的人PBMC细胞着色。人PBMC用2B6、3H7和IV.3着色，如插图的右侧所示，接着用山羊抗小鼠青色素(Cy5)轭合的抗体着色；利用以下抗体进行双染色：对B淋巴细胞用FITC轭合的抗CD20，对单核细胞用PE轭合的抗CD14，对NK细胞用PE轭合的抗CD56以及对粒细胞用PE轭合的抗CD16。

图14A和B：β-己糖胺酶释放分析。A.β-己糖胺酶释放分析的示意图。用小鼠IgE使表达人FcγRIIB的转染子致敏并用多克隆山羊抗小鼠IgG的F(ab′)₂片段来激发以聚集FcγRI。由于多克隆抗体具有识别鼠IgE抗体的与FcγRI结合的轻链的能力，因而发生交联。将用鼠IgE致敏并与B6抗体一起预孵育的转染子还用多克隆山羊抗小鼠IgG的F(ab′)₂片段来激发以使FcγRI与FcγRIIB交联。B.在表达huFcγRIIB的RBL-2H3细胞中，由山羊抗小鼠F(ab)₂片段(GAM F(ab)₂)诱导的β-己糖胺酶释放。在用小鼠IgE(0.01μg/ml)和IgG1和用纯化的2B6抗体(3μg/ml)组致敏后，细胞用不同浓度的GAM F(ab)₂(0.03μg/ml至30μg/ml)进行刺激。37℃1小时后，收集上清液并裂解细胞。利用p-硝基苯基N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷通过比色分析测定释放到所述上清液中的和细胞内的β-己糖胺酶活性。用相对于总活性的释放活性的百分比来表示所释放的β-己糖胺酶活性。

图15A-C：2B6能够功能性地阻断CD32B的Fc结合位点并防止活化的和抑制性的受体发生共连接。A.试验模型B和C的示意图。在人IgG1存在的条件下用BSA-DNP-FITC复合物，和在存在或不存在3μg/ml的2B6的F(ab)2片段的条件下用与嵌合物D265A4-4-20复合的BSA-DNP-FITC(B)刺激RBL-2H3/CD32B细胞(B)。在人IgG1存在的条件下还用BSA-DNP-FITC复合物，和在存在或不存在3μg/ml的2B6的F(ab)2片段的条件下用与嵌合物4-4-20复合的BSA-DNP-FITC刺激细胞(C)。30分钟后收集上清液并裂解细胞。利用p-硝基苯基N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷通过比色分析测定释放到所述上清液中的和细胞内的β-己糖胺酶活性。用相对于总活性的释放活性的百分比来表示所释放的β-己糖胺酶活性。

图16A-C：卵巢和乳腺肿瘤细胞株表达不同水平的Her2/neu。A着色：用纯化的ch4D5着色卵巢IGROV-I，B：用纯化的4D5抗体着色卵巢OVCAR-8，C：用纯化的ch4D5，然后用山羊抗人轭合的藻红蛋白(PE)着色乳腺癌SKBR-3细胞。相对的同种型对照IgG1用抗Her2neu抗体着色显示在左侧。

图17A-C：淘选的表达全部FcγRs的单核细胞：A.从供体1获得的MDM；B.从供体2获得的MDM，在人血清或者人血清和GMCSF中增殖；C.解冻并立即着色的单核细胞。用人FcγR受体特异性抗体对单核细胞衍生的巨噬细胞进行着色。每一图中的实心柱代表背景色。每一图中的空心柱代表利用特异性抗人FcγR抗体的染色。

图18A和B：利用PBMC，Ch4D5介导的卵巢和乳腺癌细胞株的有效ADCC。来自抗体非依赖裂解的特异裂解如A所示，为卵巢肿瘤细胞株、IGROV-I的效应因子∶靶比例为75∶1，且如B所示，为乳腺肿瘤细胞株SKBR-3，效应因子∶靶比例为50∶1，含有不同浓度的ch4D5。

图19A-C：人卵巢腹水的组织化学染色显示了肿瘤细胞和其它炎性细胞。A.卵巢肿瘤患者腹水的H&E着色。通过不规则大小和形状、散在的胞浆以及不规则密度的胞核可鉴定三种瘤性细胞。B.严重卵巢肿瘤患者腹水的姆萨着色显示了短箭头所示得紧挨着的两个间皮细胞。还显示了长箭头所示的五个恶性上皮细胞。在背景中可看见红细胞。C.另一严重卵巢肿瘤患者的姆萨着色，显示了由间皮细胞、淋巴细胞和上皮瘤性细胞组成的细胞簇(箭头)。

图20：Daudi细胞中的ch2B6和非糖基化ch2B6的体外ADCC分析。ch2B6抗体在表达CD32B的daudi细胞中体外介导ADCC。

图21：Raji细胞中的ch2B6和非糖基化ch2B6的体外ADCC分析。ch2B6抗体在表达CD32B的Raji细胞中体外介导ADCC。

图22：Daudi细胞中的嵌合和人源化2B6抗体的体外ADCC活性。用ch2B6、ch2B6 N297Q、hu2B6或hu2B6YA调理铟-111标记的Daudi细胞。

图23：估测个体小鼠中的肿瘤大小。箭头指示注射天数。

图24A-G：在小鼠中Rituxan和2B6变体对肿瘤生长的作用。A：利妥昔单抗(Rituximab)。B：ch2B6、ch2B6 N297Q、hu2B6或hu2B6YA。C：h2B6YA。D：h2B6YA 31/60。E：h2B6YA 38/60。F：h2B6YA 55/60。G.h2B6YA71。

图25A-I：CD20和CD32B的Daudi的体外(Ex vivo)着色。从h2B6(B，E，H)或h2B6YA(C，F，I)处理过的小鼠中收集Daudi肿瘤。将CD20(G，H，I)和CD32B(D，E，F)表达与体外扩展的Daudi细胞的表达(A，D，G)作比较。

图26：获自五个不同患者的B-CLL细胞上的表面膜标记物的表达。用Ficoll-Paque密度梯度离心分离诊断患有B-CLL的患者的PBMC，并分析CD32B的表达以及CD3、CD19、CD20或CD5(最后三例患者)的表达。利用2B6抗体着色细胞来测定CD32B，接着用Cy5-标记的山羊抗小鼠IgG的F(ab)2片段和CD3着色，并用抗CD19、CD20或CD5的FITC或PE直接标记的小鼠抗体进行负染色。用FACSCalibur(Becton Dickinson)分析着色的细胞。

图27A-B：Daudi细胞的免疫组织化学染色。A：抗CD32B抗体，40倍放大。B：抗CD20抗体，40倍放大。

图28A-C：正常扁桃腺组织的化学染色。A：H-E染色，10倍放大。观察到crypt(小箭头)和具有生发中心的淋巴小结(长箭头)的部分。B：抗CD32B，40倍放大。滤泡中的阳性细胞环绕生发中心。C：抗CD20，40倍放大。生发中心显示的淋巴滤泡与抗CD20反应。

图29A-C：正常淋巴结的免疫组织化学染色。A：H-E染色，4倍放大。观察到一些具有生发中心的淋巴滤泡。B：抗CD32B，4倍放大。CD32B阳性细胞环环绕生发中心。C：抗CD20，4倍放大。在生发中心的细胞与抗CD20反应。

图30A-C：患者1的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-19)。观察到浸润的弥散性改变了正常淋巴结的结构的恶性过程的证据。此过程产生多片大的不规则细胞，其具有浓染得胞核且胞浆缺乏。A.H&E染色，4倍放大。B：H&E染色，10倍放大。C.H&E染色，20倍放大。

图31A-B：患者1的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-19)。4倍放大的一系列切片显示了表达CD32B(A：抗CD32B抗体)和CD20(B：抗CD20抗体)的细胞分布图案的差异。

图32A-D：患者1的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-19)。同种型对照位于每一检测抗体的左侧。A.同种型对照(Iso-control)(IgG1)，10倍放大。B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图33A-C：患者2的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-22)。恶性细胞正向还存在正常淋巴结组织(箭头)的区域浸润和扩展。没有观察到淋巴滤泡。A.H&E染色，4倍放大。B：H&E染色，10倍放大。C.H&E染色，20倍放大。

图34A-B：患者2的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-22)。表达CD32b和CD20的细胞的分布和数量的差异。A：抗CD32B抗体，4倍放大。B.抗CD20抗体，4倍放大。

图35A-D：患者2的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-22)。同种型对照与其位于右侧的对应的检测抗体。A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图36A-C：患者3的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-26)。瘤性细胞分布在滤泡中并呈弥散组织学形式。在高功率视野下，观察得到大细胞，其具有不规则的和浓染的胞核。A.H&E染色，4倍放大。B：H&E染色，10倍放大。C.H&E染色，20倍放大。

图37A-B：患者3的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-26)。与抗CD20反应(B)的瘤性细胞比与抗CD32b(A)反应的多。A：抗CD32B，4倍放大。B.抗CD20，4倍放大。

图38A-D：患者3的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-26)。同种型对照位于每一检测抗体的左侧。A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图39A-C：患者4的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-27)。观察到正常淋巴结被弥散性增殖的具有浓染胞核的大细胞取代。A.H&E染色，4倍放大。B.H&E染色，10倍放大，C.H&E染色，20倍放大。

图40A-B：患者4的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-27)。瘤性细胞对抗CD32B抗体具有更高的亲和性。A：抗CD32B抗体，4倍放大。B.抗CD20抗体，4倍放大。

图41A-D：患者4的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-27)。A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图42A-C：患者5的淋巴结的免疫组织化学染色(MG05-CHTN-03)。此肿瘤组织成弥散形式，并由具有浓染胞核的中间到大的细胞组成。A.H&E染色，4倍放大。B：H&E染色，10倍放大。C.H&E染色，20倍放大。

图43A-B：患者5的淋巴结的免疫组织化学染色(MGO5-CHTN-O3)。肿瘤细胞与抗CD32B(A)反应强烈。A：抗CD32B抗体，4倍放大。B.抗CD20抗体，4倍放大。

图44A-D：患者5的淋巴结的免疫组织化学染色(MG05-CHTN-03)。

A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。

C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图45A-C：患者6的淋巴结的免疫组织化学染色(MG05-CHTN-05)。观察到这种淋巴结的显性弥散性浸润，其继发于具有圆形胞核的大细胞增殖，且与分散的小和正常淋巴细胞混杂。A.H&E染色，4倍放大。B：H&E染色，10倍放大。C.H&E染色，20倍放大。

图46A-B：患者6的淋巴结的免疫组织化学染色(MG05-CHTN-05)。抗CD20在此淋巴瘤病例中强烈结合所述细胞(B)，而一些细胞与抗CD32B反应(A)。A：抗CD32B抗体，4倍放大。B.抗CD20抗体，4倍放大。

图47A-D：患者6的淋巴结的免疫组织化学染色(MG05-CHTN-05)。

A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。

C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图48A-C：患者7的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-30)。观测到具有由小淋巴细胞引起的弥散性浸润的淋巴结，该小淋巴细胞具有圆形和嗜碱性胞核并缺乏胞浆。不存在细胞学异型。A.H&E，10倍放大。C.H&E染色，20倍放大。

图49A-D：患者7的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-30)。同种型对照与其对应的检测抗体位于右侧。A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。

B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。

D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图50A-C：患者8的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-31)。观测到其正常结构完全被具有圆形胞核且缺乏胞浆的大至中型细胞所取代的淋巴结。A.H&E染色，4倍放大。B：H&E染色，10倍放大。C.H&E染色，20倍放大。

图51A-D：患者8的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-31)。同种型对照与其对应的检测抗体位于右侧。A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。

B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。

D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图52A-C：患者9的脾脏的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-36)。此脾脏显示大量的红脾。在高倍视野下，观察到大至中型的缺乏胞浆的恶性细胞。A.H&E染色，4倍放大。B.H&E染色，10倍放大。C.H&E染色，20倍放大。

图53A-D：患者9的脾脏的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-36)。A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图54A-C：患者10的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-41)。尽管此淋巴结存在很少表明淋巴小结形式的结构，但其是显性弥散的。在高倍视野下，这些细胞是小的，具有稍微不规则的胞核。A.H&E染色，4倍放大。B：H&E染色，10倍放大。C.H&E染色，20倍放大。

图55A-D：患者10的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-41)。

A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。

C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

图56A-C：患者11的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-05)。此淋巴结以大细胞型的恶性淋巴瘤为特征。该肿瘤具有以弥散形式分布的大细胞的单一增殖。A.H&E染色，4倍放大。B.H&E染色，10倍放大。

C.H&E染色，20倍放大。

图57A-D：患者11的淋巴结的免疫组织化学染色(MG04-CHTN-05)。

A.同种型对照(IgG1)，10倍放大。B.抗CD32B抗体(m2B6)，10倍放大。

C.同种型对照(IgG2a)，10倍放大。D.抗CD20抗体(1F5)，10倍放大。

5.优选实施方案的详细描述

5.1 FcγRIIB-特异性抗体

本发明包括特异性结合FcγRIIB、优选人FcγRIIB、更优选天然人FcγRIIB的抗体(优选单克隆抗体)或其片段，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA、优选人FcγRIIA、更优选天然人FcγRIIA的亲和性。代表性抗体如美国临时申请2004/0185045和美国临时申请60/569,882中的公开，其全部引入本文作为参考。本发明包括FcγRIIB-特异性抗体、其类似物、衍生物或抗原结合片段(例如，FcγRIIB-特异性抗体的一种或多种互补决定区(″CDR″))在预防、治疗、控制或改善疾病或其一种或多种症状中的用途，所述疾病例如癌症，特别是B细胞恶性肿瘤。优选地，本发明的抗体结合天然人FcγRIIB的胞外区。在某些实施方案中，所述抗体或其片段结合FcγRIIB的亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性2倍、4倍、6倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍或10⁸倍。在另一些实施方案中，本发明包括排它性地结合FcγRIIB而对FcγRIIA没有亲和性的FcγRIIB抗体的用途，该亲和性利用本领域公知或本发明所公开的标准方法来测定。在优选的实施方案中，所述抗体为人或人源化抗体。

在另一实施方案中，本发明的抗体也不结合Fc活化受体，例如FcγIIIA、FcγIIIB等。在一个实施方案中，本发明的FcγRIIB-特异性抗体不是称为KB61的单克隆抗体，如Pulford等，1986(Immunology，57：71-76)所述，或称为MAbII8D2的单克隆抗体，如Weinrich等，1996，(Hybridoma，15(2)：109-6)所述。在特定的实施方案中，本发明的FcγRIIB-特异性抗体不结合与单克隆抗体KB61或II8D2相同的抗原表位和/或不与单克隆抗体KB61或II8D2竞争结合。优选本发明的FcγIIIB特异性抗体不结合对应于FcγRIIb2同种型位置135-141的氨基酸序列SDPNFSI。

在具体实施方案中，本发明的抗体或其片段激动FcγRIIB的至少一种活性。在本发明的一个实施方案中，所述活性为抑制B细胞受体介导的信号发生。在另一实施方案中，本发明所述激动性抗体抑制B细胞活化、B细胞增殖、抗体产生、B细胞的胞内钙内流、细胞周期进行或FcγRIIB信号转导途径中一种或多种下游信号分子的活性。在另一实施方案中，本发明的激动性抗体增强招募的FcγRIIB或SHIP的磷酸化。在本发明的另一实施方案中，所述激动性抗体在B细胞受体介导的信号途径中抑制MAP激酶活性或者Akt招募。在另一实施方案中，本发明的激动性抗体激动FcγRIIB介导的FcεRI信号发生的抑制。在具体的实施方案中，所述抗体抑制FcεRI诱导的肥大细胞活化、钙代谢、脱颗粒、细胞因子产生或5-羟色胺释放。在另一实施方案中，本发明所述激动性抗体刺激FcγRIIB的磷酸化、刺激SHIP招募、刺激SHIP磷酸化及其与Shc的关联、或抑制MAP激酶家族成员(例如Erk1、Erk2、JNK、p38等)的活化。在另一实施方案中，本发明所述激动性抗体增强p62dok的酪氨酸磷酸化及其与SHIP和rasGAP的关联。在另一实施方案中，本发明所述激动性抗体抑制单核细胞或巨噬细胞中的FcγR介导的吞噬作用。

在另一实施方案中，本发明的抗体或其片段拮抗FcγRIIB的至少一种活性。在一个实施方案中，所述活性为活化B细胞受体介导的信号发生。在具体的实施方案中，本发明的拮抗性抗体增强B细胞活性、B细胞增殖、抗体产生、胞内钙内流、或FcγRIIB信号转导途径中一种或多种下游信号分子的活性。在另一实施方案中，本发明的拮抗性抗体减少招募的FcγRIIB或SHIP的磷酸化。在本发明的另一实施方案中，所述拮抗性抗体在B细胞受体介导的信号途径中增强MAP激酶活性或者Akt招募。在另一实施方案中，本发明所述拮抗性抗体拮抗FcγRIIB介导的FcεRI信号发生的抑制。在具体的实施方案中，本发明的拮抗性抗体增强FcεRI诱导的肥大细胞活化、钙代谢、脱颗粒、细胞因子产生或5-羟色胺释放。在另一实施方案中，本发明所述拮抗性抗体抑制FcγRIIB的磷酸化、抑制SHIP招募、抑制SHIP磷酸化及其与Shc的关联、或增强MAP激酶家族成员(例如Erk1、Erk2、JNK、p38等)的活化。在另一实施方案中，本发明的拮抗性抗体抑制p62dok的酪氨酸磷酸化及其与SHIP和rasGAP的关联。在另一实施方案中，本发明的拮抗性抗体增强单核细胞或巨噬细胞中的FcγR介导的吞噬作用。在另一实施方案中，本发明的拮抗性抗体防止脾巨噬细胞引起的吞噬作用、调理颗粒的清除。

在其它实施方案中，本发明的抗体或其片段可以用于靶向一个细胞群而不靶向其它的细胞群。不受任何理论的限制，本发明人发现如以往所设想的一样，FcγRIIB不在中性粒细胞上高度表达。高浓度的抗FcγRIIB抗体与中性粒细胞反应。然而，随着抗FcγRIIB浓度的降低，中性粒细胞的反应性迅速消失。在低浓度的抗FcγRIIB抗体下，具有与CD20+B细胞的反应性。因此，本发明的抗体与中性粒细胞的反应性可以降低从而不影响非相关的细胞群，如中性粒细胞或血小板。因此，在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体可以以充分识别其靶群而不识别其它细胞群的水平使用。

本发明的抗体包括但不限于单克隆抗体、合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、camelized抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、细胞内抗体、和上述任一种的抗原表位结合片段。具体地，本发明的方法中使用的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含抗原结合位点的分子，其免疫特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述免疫球蛋白分子结合FcγRIIA的亲和性。抗体类似物还可以包括FcγRIIB-特异性T-细胞受体，例如，嵌合T-细胞受体(参见例如，美国专利申请公开2004/0043401)、与单链抗体连接的单链T细胞受体(参见例如，美国专利6,534,633)以及蛋白支架(参见例如，美国专利6,818,418)。在某些实施方案中，本发明的抗体类似物不是单克隆抗体。

本发明的方法所用的抗体可以是动物来源的，包括鸟类和哺乳动物(例如人、非人灵长类、鼠、驴、绵羊、家兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。优选地，所述抗体为人或人源化单克隆抗体。在本发明中所用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并包括分离自人免疫球蛋白文库或合成的人免疫球蛋白编码序列的文库的抗体，或获自表达人基因的抗体的小鼠。

本发明的方法所用的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性的。多特异性抗体可以免疫特异性地结合FcγRIIB的不同抗原表位，或免疫特异性结合FcγRIIB抗原表位和异源的抗原表位，例如异源多肽或固体支持材料。参见例如，国际公开WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360和WO 92/05793；Tutt等，1991，J.Immunol.147：60-69；美国专利4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920和5,601,819；及Kostelny等，1992，J.Immunol.148：1547-1553；Todorovska等，2001，Journal ofImmunological Methods，248：47-66。

在具体的实施方案中，本发明的抗体是多特异性的，对FcγRIIB和癌抗原或期望杀伤的细胞(例如免疫细胞，如T细胞或B细胞)特有的任何其它细胞标记物具有特异性，例如在治疗或预防具体的疾病或病症中具有特异性，或对其它Fc受体，例如FcγRIIIA、FcγRIIIB等具有特异性。

在特定的实施方案中，所述抗体衍生自由克隆2B6或3H7产生的小鼠单克隆抗体，所述克隆分别具有ATCC登记号PTA-4591和PTA-4592。产生抗体2B6和3H7的杂交瘤已于2002年8月13日被保藏于美国典型培养物保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，VA.20110-2209)，该中心是根据布达佩斯条约用于专利程序的的的国际承认的微生物保藏单位，并分别被分配有登记号PTA-4591(产生2B6杂交瘤)和PTA-4592(产生3H7的杂交瘤)，本发明将其引入作为参考。在特定的实施方案中，本发明包括抗体，其含有具有氨基酸序列SEQ ID NO：28的重链和具有氨基酸序列SEQ IDNO：26的轻链。在优选的实施方案中，本发明的抗体为人或被人源化抗体，优选克隆3H7或2B6产生的人源化形式的抗体。

本发明还包括其它抗体、优选单克隆抗体或其片段的用途，所述抗体或其片段特异性结合FcγRIIB、优选人FcγRIIB、更优选天然人FcγRIIB，其来自包括但不限于ATCC登记号分别为PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959的1D5、2E1、2H9、2D11和1F2的克隆。产生上述鉴定克隆的杂交瘤根据布达佩斯条约已于2004年5月7日保藏于美国典型培养物保藏中心(10801，University Blvd.，Manassas，VA.，20110-2209)，本发明将其引入作为参考。在优选的实施方案中，上述抗体为嵌合的或人源化的抗体。

在特定的实施方案中，用于本发明方法的抗体为由克隆2B6或3H7产生的抗体或其抗原结合片段(例如，包含一种或多种互补决定区(CDR)，优选所有6个CDR)，所述克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591和PTA-4592(例如重链CDR3)。在特定的实施方案中，用于本发明所述方法的抗体为由克隆1D5、2E1、2H9、2D11和1F2产生的抗体或其抗原结合片段(例如，包括一种或多种互补决定区(CDR)，优选所有6个CDR)，所述克隆的ATCC登记号分别为PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959(例如重链CDR3)。在另一实施方案中，用于本发明所述方法中的抗体与克隆2B6或3H7产生的小鼠单克隆抗体结合相同抗原表位，所述克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591和PTA-4592；和/或与克隆2B6或3H7产生的小鼠单克隆抗体竞争结合，所述克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591和PTA-4592，这可通过，例如ELISA分析或其它适合的竞争免疫分析来测定；也可结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性。在另一实施方案中，用于本发明所述方法中的抗体与克隆1D5、2E1、2H9、2D11和1F2产生的小鼠单克隆抗体结合相同抗原表位，所述克隆的ATCC登记号分别为PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959；和/或与克隆1D5、2E1、2H9、2D11和1F2产生的小鼠单克隆抗体竞争结合，所述克隆的ATCC登记号分别为PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959，这可根据，例如ELISA分析或其它适合的竞争免疫分析来测定；还可结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性。

本发明还包括抗体或其片段，其可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的可变重链和/或轻链的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同，上述克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959。本发明还包括特异性结合FcγRIIB的抗体或其片段，其结合亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性，所述抗体或其片段包括一种或多种CDR的氨基酸序列，该氨基酸序列与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的一种或多种CDR的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同，上述克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959。通过本领域所属技术人员公知的方法可确定两种氨基酸序列的相同性百分比，包括BLAST蛋白搜寻。

本发明还包括特异性结合FcγRIIB的抗体或抗体片段的用途，其结合亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性，其中所述抗体或抗体片段由核苷酸序列编码，该核苷酸序列在严格的条件下与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的核苷酸序列杂交，上述克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959。在优选的实施方案中，本发明提供了特异性结合FcγRIIB的抗体或其片段，其结合亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性，所述抗体或抗体片段包括由核苷酸序列编码的可变重链和/或可变轻链，该核苷酸序列在严格的条件下与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的可变重链和/或可变轻链的核苷酸序列杂交，上述克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959。在另一优选的实施方案中，本发明提供特异性结合FcγRIIB的抗体或其片段，其结合亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性，所述抗体或抗体片段包括由核苷酸序列编码的一种或多种CDR，该核苷酸序列在严格条件下与克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的一种或多种CDR的核苷酸序列杂交，上述克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959。严格的杂交条件包括但不限于：在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、于45℃与滤膜结合的DNA杂交，随后在0.2×SSC/0.1％SDS中于约50-65℃洗涤一次或多次，高度严格条件如在6×SSC中在45℃下与滤膜结合的DNA杂交，随后在0.1×SSC/0.2％SDS中于约60℃洗涤一次或多次，或者本领域所属技术人员公知的任何其它的严格杂交条件(参见例如，Ausubel，F.M.等编.1989，Current Protocols in Molecular Biology，vol.1，Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley和Sons，Inc.，NY p：6.3.1-6.3.6和2.10.3，本发明将其引入作为参考)。

可根据所需抗体的功能来选择所述抗体的恒定区，特别是根据所需的效应子的功能来选择。在一些实施方案中，所述抗体的恒定区为人IgA、IgE、IgG或IgM结构域。

用于本发明方法中的抗体包括经修饰的衍生物，即通过将任意类型的分子与所述抗体共价结合而形成共价连接来修饰。例如但不限于，所述抗体衍生物包括经修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、氨基化、通过公知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解、连接至细胞配体或其它蛋白等修饰。可通过公知的技术来进行任意的各种化学修饰，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等。此外所述衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。

另外，可通过本领域所属技术人员公知的技术，利用本发明的抗体来产生抗独特型抗体(参见例如，Greenspan & Bona，1989，FASEB J.7：437-444；和Nissinoff，1991，J.Immunol.147：2429-2438)。本发明提供了使用多聚核苷酸的方法，该多聚核苷酸包含编码本发明的抗体或其片段的核苷酸序列。

本发明包括单结构域抗体，包括camelized单结构域抗体(参见例如，Muyldermans等，2001，Trends Biochem.Sci.26：230；Nuttall等，2000，Cur.Pharm.Biotech.1：253；Reichmann和Muyldermans，1999，J.Immunol.Meth.231：25；国际公开WO 94/04678和WO 94/25591；美国专利6,005,079，本发明将其全部引入作为参考)。在一个实施方案中，本发明提供了单结构域抗体，其包括两个经修饰的VH结构域而形成单一结构域抗体。

本发明所述的方法还包括在哺乳动物、优选人中具有半衰期(例如，血清半衰期)的抗体或其片段的用途，所述的半衰期超过15天、优选超过20天、超过25天、超过30天、超过35天、超过40天、超过45天、超过2个月、超过3个月、超过4个月或超过5个月。本发明的抗体或其片段在哺乳动物、优选人中的半衰期增加可使所述哺乳动物中具有较高血清滴度的所述抗体或抗体片段，因此，降低了所述抗体或抗体片段的给药频率和/或降低了所述抗体或抗体片段的给药浓度。通过本领域所属技术人员公知的技术可使抗体或其片段在体内的半衰期升高。例如，可以通过修饰(例如取代、缺失或添加)经鉴定参与Fc结构域与FcRn受体的相互作用的氨基酸残基来使抗体或其片段的体内半衰期升高。可通过Ward等人描述的方法将本发明的抗体工程化以使生物半衰期升高(参见美国专利6,277,375 B1)。例如，可在铰链区将本发明的抗体工程化来使体内半衰期或血清半衰期升高。

可以通过将所述抗体或抗体片段与聚合分子，如高分子量的聚乙二醇(PEG)结合来使抗体或其片段在体内的半衰期升高。利用或不利用多功能接头，或通过将PEG位点特异性地连接到所述抗体或抗体片段的N或C末端或者通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基基团，可将PEG结合到所述抗体或抗体片段上。使用产生最小生物活性损失的直链或支链多聚衍生物。可通过SDS-PAGE和质谱密切监视结合的程度，以确保PEG分子与所述抗体适当结合。未反应的PEG可从抗体-PEG轭合物中分离出来，例如通过分子排阻或离子交换层析分离。

也可通过Davis等人所述的方法和耦合试剂来修饰本发明的抗体(参见美国专利4,179,337)以提供可被注射到哺乳动物循环系统而基本没有免疫原应答的组合物。

本发明还包括抗体或抗体片段的用途，该抗体或抗体片段包括在框架或CDR结构域中有突变(例如，一种或多种氨基酸取代)的本发明任意抗体的氨基酸序列。优选地，这些抗体中的突变维持或增强了所述抗体对其免疫结合的FcγRIIIB的亲合力和/或亲和性。可利用本领域所属技术人员公知的标准技术(例如，免疫分析)来分析抗体对具体抗原的亲和性。

本发明还包括修饰本发明抗体的效应子功能的方法，其中所述方法包括修饰用于本发明公开的方法或本领域公知的方法修饰该抗体的碳水化合物含量。

可利用本领域所属技术人员公知的标准技术在编码抗体或其片段的核苷酸序列中诱导突变，包括例如定点突变和PCR介导的突变，其产生氨基酸取代。优选地，所述衍生物相对于原始抗体或其片段包括少于15个氨基酸的取代、少于10氨基酸取代、少于5氨基酸取代、少于4氨基酸取代、少于3氨基酸取代或少于2氨基酸取代。在优选的实施方案中，所述衍生物在一个或多个预期的非必需氨基酸残基处具有保守的氨基酸取代。

对于一些应用，包括在人体内使用抗体和在体外检测，优选使用人、嵌合的或人源化的抗体。完全的人抗体对人个体的治疗性处理是特别理想的。通过本领域公知的不同方法可制备人抗体，包括上文所述的利用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。也参见美国专利4,444,887和4,716,111；以及国际公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，本文将其各自均全部引入作为参考。

5.1.1人源化抗体

在优选的实施方案中，所述的抗体是人源化抗体。人源化抗体为能够结合优势抗原，并包含基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的框架区和基本上具有非人免疫球蛋白氨基酸序列的CDR的抗体、其变体或其片段。人源化FcγRIIB特异性抗体可包含基本全部的至少一个和典型的两个可变区，在该可变区中，所有或基本上全部的CDR区域对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区域，所有或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。优选地，本发明的人源化抗体还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的部分。根据抗体的预期功能来选择本发明的人源化抗体的恒定区，特别是根据需要的效应子功能来选择。在一些实施方案中，本发明的人源化抗体的恒定区为人IgA、IgE、IgG或IgM结构域。在特定的实施方案中，当欲治疗性使用本发明的人源化抗体和需要抗体效应子功能时，采用人IgG恒定区、特别是IgG1和IgG3同种型的恒定区。在可选择的实施方案中，当欲治疗目的使用本发明的人源化抗体而不需要抗体效应子功能时，使用IgG2和IgG4同种型。人源化FcγRIIB特异性抗体如分别在2004年5月10日和2004年6月21日提交的美国申请60/569,882和60/582,043中公开。

在一些实施方案中，所述抗体含有轻链和至少重链的可变区。在其它实施方案中，所述抗体还可包含一种或多种重链的CH1、铰链区、CH2、CH3和CH4区。所述人源化抗体可选自免疫球蛋白的任意类型，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE以及任意同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。在一些实施方案中，所述恒定区为互补固定的恒定区，且一般为IgG₁亚型，在该区所述人源化抗体表现出细胞毒活性是理想的。在其它实施方案中，当不需要这种细胞毒活性时，所述恒定区可以是IgG₂亚型。所述人源化抗体可包括来自多种亚型和同种型的序列，并且选择特定的恒定区来优化所需的效应子功能是本领域所属技术人员公知的。

人源化抗体的框架区和CDR区不必与母序列精确对应，例如，供体CDR或共有框架区可通过至少一个残基的取代、添加或缺失而突变从而使该CDR或框架区在该位点处的残基与该共有抗体或供体抗体不对应。然而这种突变优选地范围不广泛。通常，至少75％的人源化抗体残基与其母框架区(FR)和CDR序列的残基对应、更常见地是90％、并最优选超过95％对应。人源化抗体可利用多种本领域公知的技术来产生，包括但不限于CDR-嫁接(欧洲专利EP 239,400；国际公开WO 91/09967；和美国专利5,225,539、5,530,101和5,585,089)，镶盖(veneering)或表面重建(resurfacing)(欧洲专利EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology，28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering，7(6)：805-814；和Roguska等，1994，Proc Natl Acad Sci USA，91：969-973)，链穿梭(chain shuffling)(美国专利5,565,332)，以及以下公开的技术，例如，美国专利6,407,213、5,766,886、5,85,089，国际公开WO 9317105，Tan等，2002，J.Immunol.169：1119-25，Caldas等，2000，Protein Eng.13：356-60，Morea等，2000，Methods，20：267-79，Baca等，1997，J.Biol.Chem.272：10678-84，Roguska等，1996，Protein Eng.9：895-904，Couto等，1995，Cancer Res.55(23 Supp)：5973-5977，Couto等，1995，Cancer Res.55：1717-22，Sandhu，1994，Gene，150：409-10，Pedersen等，1994，J.Mol.Biol.235：959-73，Jones等，1986，Nature，321：522-525，Riechmann等，1988，Nature，332：323，和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。通常，在所述框架区内的框架区残基被CDR供体抗体的对应残基取代以改变，优选改善抗原结合。可用本领域公知的方法鉴定这些框架区的取代，例如，通过模建所述CDR与框架区残基的相互作用来鉴定对抗原结合很重要的框架区残基，和通过序列比较来鉴定在特定位置的不常见框架区残基(参见例如，Queen等，美国专利5,585,089；美国专利2004/0049014和2003/0229208；美国专利6,350,861、6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,,089和5,530,101以及Riechmann等，1988，Nature，332：323，本发明将其全部引入作为参考)。

本发明提供了FcγRIIB特异性人源化抗体分子的用途，其中人抗体(受者抗体)的重链和/或轻链可变区的一个或多个CDR的一个或多个区域被供体单克隆抗体的一个或多个CDR的类似部分取代，其特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于对FcγRIIA的亲和性，例如，由ATCC登记号分别为PTA-4591和PTA-4592的克隆2B6或3H7产生的单克隆抗体。在其它实施方案中，所述人源化抗体结合到与2B6或3H7相同的抗原表位。在最优选的实施方案中，所述人源化抗体特异性结合与供体鼠抗体相同的抗原表位。本领域所述技术人员应理解，本发明通常包括抗体的CDR嫁接。因此，所述供体和受者抗体可衍生自相同物种的动物甚至相同抗体类型或亚型。然而更常见的供体和受者抗体衍生自不同物种的动物。典型地所述供体抗体为非人抗体，例如啮齿类MAb，而受者抗体为人抗体。

在一些实施方案中，将供体抗体的至少一种CDR嫁接至人抗体。在其它的实施方案中，将每一重链和/或轻链可变区的至少两种，优选所有的三种CDR嫁接至人抗体。所述CDR可包括Kabat CDR、结构环CDR或其组合。在一些实施方案中，本发明包括人源化FcγRIIB抗体，其包括至少一种CDR嫁接的重链和至少一种CDR嫁接的轻链。

在优选的实施方案中，所述人源化FcγRIIB特异性抗体的CDR区衍生自FcγRIIB特异的鼠抗体。在一些实施方案中，本发明所述的人源化抗体包括改变，包括但不限于受体抗体，即保持供体单克隆抗体的结合特异性所必需的人的重链和/或轻链可变区框架区的氨基酸缺失、插入、修饰。在一些实施方案中，本发明所述的人源化抗体框架区不必需精确地由天然发生的人抗体可变区的框架区氨基酸序列组成，而是包含不同的改变，包括但不限于改变该人源化抗体特性的氨基酸缺失、插入、修饰，例如，改善人源化抗体区域的结合特性，该区域特异于鼠FcγRIIB特异性抗体的相同的靶。在最优选的实施方案中，对框架区进行最少数量的改变，以避免大规模引入非人框架区残基，并保证所述人源化抗体在人体中具有最小免疫原性。所述供体单克隆抗体优选是由克隆2B6和3H7(具有ATCC登记号分别为PTA-4591和PTA-4592)产生的结合FcγRIIB的单克隆抗体。

在特定的实施方案中，本发明包括使用CDR嫁接抗体，该抗体特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA亲和性，其中所述CDR嫁接抗体包括重链可变区结构域，该结构域含有受体抗体的框架区残基和供体单克隆抗体的残基，并以高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性特异性结合FcγRIIB，例如，克隆2B6和3H7产生的单克隆抗体。在另一特定的实施方案中，本发明包括使用CDR嫁接抗体，该抗体特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA亲和性，其中所述CDR嫁接抗体包括轻链可变区结构域，该结构域含有受体抗体的框架区残基和供体单克隆抗体的残基，并以高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性特异性结合FcγRIIB，例如，由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的单克隆抗体。

优选地，所述人源化抗体结合天然人FcγRIIB的胞外区。本发明的人源化抗FcγRIIB抗体可具有重链可变区，其包括CDR1(SEQ ID NO.1或SEQID NO.29)和/或CDR2(SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.30)和/或CDR3(SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.31)氨基酸序列，和/或轻链可变区，其包括CDR1(SEQID NO.8或SEQ ID NO.38)和/或CDR2(SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQID NO.11或SEQ ID NO.39)和/或CDR3(SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.40)氨基酸序列。

在特定的实施方案中，本发明包括含2B6或3H7的CDR的人源化抗体在预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或其一种或多种症状中的用途。具体地，包含具有SEQ ID NO：24氨基酸序列的重链可变区和具有SEQID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22氨基酸序列的轻链可变区的抗体在预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或其一种或多种症状中的用途。在特定的实施方案中，本发明包括包含具有SEQ ID NO：37氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：46氨基酸序列的轻链可变区的人源化抗体在预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或其一种或多种症状中的用途。在另一实施方案中，所述人源化抗体不结合Fc活化受体，例如，FcγIIIA、FcγIIIB等。

在一个特定的实施方案中，提供了人源化2B6抗体，其中的VH区域包括人种系VH片段VH1-18的FR片段(Matsuda等，1998，J.Exp.Med.188：2151062)和JH6(Ravetch等，1981，Cell，27(3 Pt.2)：583-91)，和2B6 VH的一种或多种CDR区，该CDR区具有SED ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQID NO.3的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述2B6 VH具有SEQ ID NO.24的氨基酸序列。在另一特定的实施方案中，所述人源化2B6抗体还包括VL区，其包含人种系VL片段VK-A26的FR片段(Lautner-Rieske等，1992，Eur.J.Immunol.22：1023-1029)和JK4(Hieter等，1982，J.Biol.Chem.257：1516-22)，及2B6VL的一种或多种CDR区域，该CDR区具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述2B6 VL具有SEQ ID NO.18、SEQ IDNO：20或SEQ ID NO：22的氨基酸序列。

在另一特定的实施方案中，提供了人源化3H7抗体，其中的VH区包含人种系VH片段的FR片段和3H7VH的CDR区，该3H7VH具有SED IDNO.37的氨基酸序列。在另一特定的实施方案中，所述人源化3H7抗体还包括VL区，其包含人种系VL片段的FR片段和3H7VL的CDR区，该3H7VH具有SEQ ID NO.46的氨基酸序列。

具体地，提供了免疫特异性结合天然人FcγRIIB的胞外区的人源化抗体，该抗体包括(或可选择地由以下组成)：2B6或3H7的CDR序列，其具有以下任意在组合：VH CDR1和VL CDR1；VH CDR1和VL CDR2；VHCDR1和VL CDR3；VH CDR2和VL CDR1；VH CDR2和VL CDR2；VHCDR2和VL CDR3；VH CDR3和VH CDR1；VH CDR3和VL CDR2；VHCDR3和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2和VL CDR1；VH CDR1、VH CDR2和VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2和VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1、VH CDR2、VH CDR3和VL CDR2；VH CDR2、VH CDR2和VL CDR3；VH CDR1、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR2、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR3、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3和VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1、VHCDR2、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1和VLCDR2；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2，和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，或本发明公开的上述VH CDR与VL CDR的任意组合。

5.1.2 人抗体

可用转基因小鼠来产生人抗体，该小鼠不能表达功能性的内源性免疫球蛋白，但可表达人免疫球蛋白基因。例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机或通过同源重组导入到小鼠胚胎干细胞中。可选择地，除人重链和轻链基因之外，所述人可变区、恒定区和多样性区域均可导入到小鼠胚胎干细胞中。使所述小鼠的重链和轻链免疫球蛋白基因丧失功能，这可以与通过同源重组导入人免疫球蛋白位点分别或同时进行。具体地，J_H区域的同源缺失防止内源性的抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞并微注射至胚泡来产生嵌合小鼠。然后喂养嵌合小鼠以产生表达人抗体的同源后代。利用常规的方法学用选定抗原，如本发明多肽的全部或部分来免疫该转基因小鼠。采用常规的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得该抗原的单克隆抗体。所述转基因小鼠中的人免疫球蛋白转移基因在B细胞分化过程中发生再排列，并随后经历类型转换和体细胞突变。因此，利用这种技术，有可能产生治疗用途的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。产生人抗体技术的总结参见Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.13：65-93，本发明将其全部引入作为参考)。产生人抗体和人单克隆抗体的技术以及产生这种抗体的方法的详细描述参见例如，国际公开WO 98/24893，WO 96/34096和WO96/33735；以及美国专利5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，本发明将其全部引入作为参考。此外，诸如Abgenix，Inc(Freemont，CA)和Medarex(Princeton，NJ)的公司可利用上述类似技术提供选定抗原的人抗体。

5.1.3 嵌合抗体

嵌合抗体是该抗体的不同部分来自不同的免疫球蛋白分子的分子，例如具有来自非人抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。本发明提供克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2的嵌合抗体，这些克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959。产生嵌合抗体的方法是本领域公知的。参见例如，Morrison，1985，Science，229：1202；Oi等，1986，BioTechniques，4：214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods，125：191-202；和美国专利6,311,415、5,807,715、4,816,567和4,816,397，本发明将其全部引入作为参考。可利用本领域公知的不同的技术来产生包含一种或多种来自人物种的CDR和来自人免疫球蛋白分子的框架区的嵌合抗体，例如CDR-嫁接(EP239,400；国际公开WO 91/09967；和美国专利5,225,539、5,530,101和5,585,089)，镶盖或表面重建(欧洲专利EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology，28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，ProteinEngineering，7：805；和Roguska等，1994，PNAS，91：969)以及链穿梭(美国专利5,565,332)，本发明将其全部引入作为参考。

通常，将在所述框架区的框架区残基用CDR供体抗体的对应残基取代以改变，优选改善抗原结合。这些框架区的取代可用本领域公知的方法鉴定，例如，通过模建所述CDR与框架区残基的相互作用来鉴定对抗原结合重要的框架区残基，和通过序列比较来鉴定在特定位置的不常见框架区残基(参见例如，Queen等，美国专利5,585,089；美国专利2004/0049014和2003/0229208；美国专利6,350,861、6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101以及Riechmann等，1988，Nature，332：323，本发明将其全部引入作为参考)。

5.1.4 Fc区修饰

本发明包括具有Fc恒定区的抗体，该Fc恒定区包括改变抗体效应子功能的一种或多种氨基酸修饰，例如在美国专利申请公开U.S.2005/0037000和2005/0064514；美国专利5,624,821和5,648,260以及欧洲专利EP 0307434中公开的那些；本发明将所有这些文献全部引入作为参考。与无氨基酸修饰的相当抗体比较，这些抗体表现出改善了的ADCC活性(即2倍、10倍、100倍、500倍等)。

本发明包括含有修饰，优选位于Fc区的修饰的抗体，该修饰改善了该抗体对一种或多种FcγR的结合亲和性。修饰抗体以改变其对一种或多种FcγR的结合的方法在本领域是公知的，参见例如，PCT公开WO 04/029207、WO 04/029092、WO 04/028564、WO 99/58572、WO 99/5 1642、WO 98/23289、WO 89/07142、WO 88/07089、以及美国专利5,843,597和5,642,821，本发明将其每一个全部引入作为参考。在一些实施方案中，本发明包括对活化的FcγR，如FcγRIIIA具有改变了的亲和性的抗体。优选这种修饰还具有改变了的Fc-介导的效应子功能。影响Fc-介导的效应子功能的修饰是本领域公知的(参见美国专利6,194,551，本发明将其全部引入作为参考)。根据本发明的方法可进行修饰的氨基酸包括但不限于脯氨酸329、脯氨酸331和赖氨酸322。脯氨酸329、脯氨酸331、赖氨酸322优选用丙氨酸来替代，然而，也可考虑用其它的任意氨基酸来替代。参见国际公开WO 00/42072和美国专利6,194,551，本发明将其全部引入作为参考。

在特定的实施方案中，Fc区的修饰包括该Fc区中的一种或多种突变。该Fc区的一种或多种突变可导致该抗体具有改变的抗体介导的效应子功能，改变了的与Fc受体(例如Fc活化受体)的结合，以及改变了的ADCC活性、或改变了的C1q结合活性，或改变了的补体依赖性细胞毒活性或任何上述的组合。在一些实施方案中，本发明包括含有变体Fc区的分子，该Fc区在以下一种或多种位置具有氨基酸修饰：119，125，132，133，141，142，147，149，162，166，185，192，202，205，210，214，215，216，217，218，219，221，222，223，224，225，227，229，231，232，233，235，240，241，242，243，244，246，247，248，250，251，252，253，254，255，256，258，261，262，263，268，269，270，272，274，275，276，279，280，281，282，284，287，288，289，290，291，292，293，295，298，301，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，315，316，317，318，319，320，323，326，327，328，330，333，334，335，337，339，340，343，344，345，347，348，352，353，354，355，358，359，360，361，362，365，366，367，369，370，371，372，375，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，404，406，407，408，409，410，411，412，414，415，416，417，419，420，421，422，423，424，427，428，431，433，435，436，438，440，441，442，443，446或447。优选地，Fc部分的工程化导致肿瘤细胞的细胞介导杀伤和/或补体介导的杀伤增加。

本发明包括含有变异的Fc区的分子，该Fc区包含以下表2所列的任意突变。

表2.示例性突变

单一位置突变	双位置突变
		K392R	Q347H，A339V
N315I	S415L，L251F
		S132I	K290E，L142P
P396L	G285E，P247H
		P396H	K409R，S166N
A162V	E334A，K334A
		R292L	R292L.K334E
T359N	K288N，A330S
		T366S	R255L，E318K
V379L	F243L，E318K
		K288N	V279L，P395S
A330S	K246T，Y319F
		F243L	F243I，V379L
E318K	K288M，K334E
		V379M	K334E，E308D
S219Y	E233D，K334E
		V282M	K246T，P396H
D401V	H268D，E318D

K222N	K246I，K334N
		K334I	K320E，K326E
K334E	S375C，P396L
		I377F	K288N，K326N
P247L	P247L，N421K
		F372Y	S298K，W381R
K326E	R255Q，K326E
		H224L	V284A，F372L
F275Y	T394M，V397M
		L398V	P247L，E389G
K334N	K290T，G371D
		S400P	P247L，L398Q
S407I	P247L，I377F
		F372Y	K326E，G385E
T366N	S298N，S407R
		K414N	E258D，N384K
M352L	F241L，E258G
		T225S	K370N，S440N
I377N	K317N，F423-删除
		K248M	P227S，K290E
R292G	K334E，E380D
		S298N	P291S，P353Q
D270E	V240I，V281M
		E233G	P232S，S304G
	P247L，L406F
		D399E，M428L
	L251F，F372L
		D399E，G402D
	D399E，M428L
		K392T，P396L
	H268N，P396L
		K326I，P396L
	H268D，P396L
		K210M，P396L
	L358P，P396L
		K334N，P396L
	V379M，P396L
		P227S，P396L
	P217S，P396L
		Q419H，P396L
	K370E，P396L
		L242F，P396L
	R255L，P396L
		V240A，P396L
	T250A，P396L
		P247S，P396L

	L410H，P396L
		Q419L，P396L
	V427A，P396L
		E258D，P396L
	N384K，P396L
		V323I，P396L
	P244H，P396L
		V305L，P396L
	S400F，P396L
		V303I，P396L
	A330V，Q419H
		V263Q，E272D
	K326E，A330T

在另一些实施方案中，本发明包括含有变异的Fc区的分子，该Fc区具有超过两种的氨基酸修饰。这种变体的非限制性例子如下表所列(表3)。本发明包括表3所列的变体，该变体还包括一种或多种氨基酸修饰，如本文所公开的修饰。

表3.示例性组合变体

D399E，R292L，V185M
	R301C，M252L，S192T
P291S，K288E，H268L，A141V
	S383N，N384K，T256N，V262L，K218E，R214I，K205E，F159Y，K133M
S408I，V215I，V125L
	G385E，P247H
V348M，K334N，F275I，Y202M，K147T
	H310Y，T289A，Y407V，E258D
R292L，P396L，T359N
	F275I，K334N，V348M
F243L，R255L，E318K
	K334E，T359N，T366S
T256S，V305I，K334E，N390S
	T335N，K370E，A378V，T394M，S424L
K334E，T359N，T366S，Q386R
	K288N，A330S，P396L
P244H，L358M，V379M，N384K，V397M
	P217S，A378V，S408R
P247L，I253N，K334N

D312E，K327N，I378S
	D280E，S354F，A431D，L441I
K218R，G281D，G385R
	P247L，A330T，S440G
T355N，P387S，H435Q
	P247L，A431V，S442F
P343S，P353L，S375I，S383N
	E216D，E345K，S375I
K288N，A330S，P396L
	K222N，T335N，K370E，A378V，T394M
G316D，A378V，D399E
	N315I，V379M，T394M
K326Q，K334E，T359N；T366S
	A378V，N390I，V422I
V282E，V369I，L406F
	V397M，T411A，S415N
T223I，T256S，L406F
	L235P，V382M，S304G，V305I，V323I
P247L，W313R，E388G
	D221Y，M252I，A330G，A339T，T359N，V422I，H433L
F243I，V379L，G420V
	A231V，Q386H，V412M
T215P，K274N，A287G，K334N，L365V，P396L
	P244A，K326I，C367R，S375I，K447T
R301H，K340E，D399E
	C229Y，A287T，V379M，P396L，L443V
E269K，K290N，Q311R，H433Y
	E216D，K334R，S375I
T335N，P387S，H435Q
	K246I，Q362H，K370E
K334E，E380D，G446V
	V303I，V369F，M428L
K246E，V284M，V308A
	E293V，Q295E，A327T
Y319F，P352L，P396L
	D221E，D270E，V308A，Q311H，P396L，G402D
K290T，N390I，P396L
	K288R，T307A，K344E，P396L
V273I，K326E，L328I，P396L
	K326I，S408N，P396L

K261N，K210M，P396L
	F243L，V305I，A378D，F404S，P396L
K290E，V369A，T393A，P396L
	K210N，K222I，K320M，P396L
P217S，V305I，I309L，N390H，P396L
	K246N，Q419R，P396L
P217A，T359A，P396L
	V215I，K290V，P396L
F275L，Q362H，N384K，P396L
	A330V，H433Q，V427M
V263Q，E272D，Q419H
	N276Y，T393N，W417R
V282L，A330V，H433Y，T436R
	V284M，S298N，K334E，R355W
A330V，G427M，K438R
	S219T，T225K，D270E，K360R
K222E，V263Q，S298N
	E233G，P247S，L306P
S219T，T225K，D270E
	S254T，A330V，N361D，P243L
V284M，S298N，K334E，R355W，R416T
	D270E，G316D，R416G
K392T，P396L，D270E
	R255L，P396L，D270E
V240A，P396L，D270E
	Q419H，P396L，D270E
K370E，P396L，D270E
	P247L，N421K，D270E
R292P，V305I
	R292P，V305I，F243L
V284M，R292L，K370N

在特定的实施方案中，所述变异的Fc区具有在位置247的亮氨酸、在位置421的赖氨酸和在位置270的谷氨酸(MgFc31/60)；在位置392的苏氨酸，在位置396的亮氨酸和在位置270的谷氨酸(MgFc38/60)；在位置392的苏氨酸，在位置396的亮氨酸，在位置270的谷氨酸和在位置243的亮氨酸(MgFc38/60/F243L)；在位置419的组氨酸，在位置396的亮氨酸和在位置270的谷氨酸(MGFc51/60)；在位置419的组氨酸，在位置396的亮氨酸，在位置270谷氨酸和在位置243的亮氨酸(MGFc51/60/F243L)；在位置255的赖氨酸和在位置396的亮氨酸(MgFc55)；在位置255的赖氨酸，在位置396的亮氨酸和在位置270的谷氨酸(MGFc55/60)；在位置255的赖氨酸，在位置396的亮氨酸，在位置270的谷氨酸和在位置300的赖氨酸(MGFC55/60/Y300L)；在位置255的赖氨酸，在位置396的亮氨酸，在位置270的谷氨酸和在位置243的亮氨酸(MgFc55/60/F243L)；在位置370的谷氨酸，在位置396的亮氨酸和在位置270的谷氨酸(MGFc59/60)；在位置270的谷氨酸，在位置316的天冬氨酸和在位置416的甘氨酸(MgFc71)；在位置243的亮氨酸，在位置292的脯氨酸，在位置305的异亮氨酸和在位置396的亮氨酸(MGFc74/P396L)；在位置297的谷氨酸，或单独取代的任意组合。

5.1.5 碳水化合物修饰

本发明还提供具有改变了的寡糖含量的抗体。本发明中的寡糖是指含两个或多个单糖的碳水化合物，且这两个术语可交换使用。可参考本领域常用命名来描述本发明的碳水化合物部分。有关碳水化合物化学的综述参见例如，Hubbard等，1981 Ann.Rev.Biochem.，50：555-583，本发明将其全部引入作为参考。这种命名包括例如，Man，代表甘露糖；GIcNAc，代表2-N-乙酰葡萄糖胺；Gal，代表半乳糖；Fuc，表示海藻糖，而Glc表示葡萄糖。描述唾液酸的缩写NeuNAc表示5-N-乙酰神经氨酸，NeuNGc表示5-乙二醇神经氨酸。

抗体的重链恒定区的保守位置一般含有碳水化合物部分，且高达30％的人IgG具有糖基化的Fab区。IgG在CH2结构域中的Asn 297处具有单个N-连接的双触(biantennary)碳水化合物结构(Jefferis等，1998，Immunol.Rev.163：59-76；Wright等，1997，Trends Biotech，15：26-32)。人IgG一般具有以下结构的碳水化合物：GlcNAc(海藻糖)GlcNAc-Man-(ManGlcNAc)₂。然而IgG中碳水化合物的含量变化会引起功能改变，参见例如，Jassal等，2001，Biochem.Biophys.Res.Commun.288：243-9；Groenink等，1996，J.Immunol.26：1404-7；Boyd等，1995，Mol.Immunol.32：1311-8；Rumpel等，1994，Human Antibody hybridomas，5：143-51。本发明包括与Asn 297连接的碳水化合物部分发生了改变的抗体。在一个实施方案中，碳水化合物部分在末端GlcNAc和/或第三GlcNac臂(对开GlcNAc)的一个或两个中具有半乳糖和/或半乳糖-唾液酸。

在一些实施方案中，本发明的抗体基本上不合有一种或多种预选的糖基团，例如，一种或多种唾液酸唾液酸残基、一种或多种半乳糖残基、一种或多种海藻糖残基。可通过本领域公知的方法来制备基本上不含一种或多种预选糖基团的抗体，包括例如在宿主细胞中重组产生的本发明的抗体，该宿主细胞在将预选糖基团添加到所述抗体的碳水化合物部分方面是有缺陷的，因此在组合物中约90-100％的抗体缺乏与碳水化合物部分连接的预选糖基团。制备这种抗体的可选择方法包括例如：在防止或减少一种或多种预选糖基团添加的条件下培养细胞，或翻译后去除一种或多种预选糖基团。

在特定的实施方案中，本发明包括制备基本同源的抗体制剂的方法，其中在组合物中有约80-100％的抗体在其碳水化合物部分，如Asn297连接的所述碳水化合物中没有海藻糖。这种抗体可以制备，例如通过如下方法来制备：(a)使用工程化宿主细胞，该宿主细胞在海藻糖代谢方面有缺陷，因而在其中表达海藻糖化蛋白的能力降低；(b)在防止或降低海藻糖化的条件下培养细胞；(c)翻译后移除海藻糖，例如使用海藻糖酶来移除；或(d)纯化所述抗体，以选择没有海藻糖化的产物。最优选地，在宿主细胞中表达编码所需抗体的核酸，该宿主细胞海藻糖化其表达的所述抗体的能力降低。优选所述宿主细胞是二氢叶酸还原酶缺陷的中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，例如Lec 13 CHO细胞(外源凝集素抗性CHO突变细胞株；Ribka & Stanley，1986，Somatic Cell & Molec.Gen.12(1)：51-62；Ripka等，1986，Arch.Biochem.Biophys.249(2)：533-45)，CHO-K1，DUX-B11，CHO-DP12或CHO-DG44，它们已经过修饰，因而所述抗体基本上没有海藻糖化。因此，对于参与将海藻糖添加到N-连接的寡糖上的海藻糖转移酶(fucoysltransferase)或另一种酶或底物，所述细胞可以表现出改变了的表达和/或活性，从而使所述酶在该细胞中具有降低了的活性和/或减少了的表达水平。产生具有改变了的海藻糖含量的抗体的方法，参见例如WO 03/035835和Shields等，2002，J.Biol.Chem.277(30)：26733-40；本发明将其全部引入作为参考。

在一些实施方案中，所述改变了的碳水化合物修饰调节以下一种或多种：抗体溶解、亚细胞转运和抗体分泌的易化、促进抗体装配、构象的完整性、以及抗体介导的效应因子功能。在特定的实施方案中，所述改变了的碳水化合物修饰与缺乏所述抗体碳水化合物修饰的抗体相比增强了抗体介导的效应子功能。导致改变了的抗体介导的效应子功能的碳水化合物修饰是本领域公知的(例如，参见Shields R.L.等，2001，J.Biol.Chem.277(30)：26733-40；Davies J.等，2001，Biotechnology & Bioengineering，74(4)：288-294)。在另一特定的实施方案中，所述改变了的碳水化合物修饰增强本发明抗体与FcγRIIB受体的结合。本发明的方法改变的碳水化合物修饰包括，例如增加所述抗体的碳水化合物含量或降低所述抗体的碳水化合物含量。改变碳水化合物含量的方法是本领域所属技术人员公知的，参见例如，Wallick等，1988，Journal of Exp.Med.168(3)：1099-1109；Tao等，1989，Journal of Immunology，143(8)：2595-2601；Routledge等，1995，Transplantation，60(8)：847-53；Elliott等，2003；Nature Biotechnology，21：414-21；Shields等，2002，Journal of Biological Chemistry，277(30)：26733-40；本发明将所有文献的全部引入作为参考。

在一些实施方案中，本发明包括包含一种或多种糖基化位点从而使一种或多种碳水化合物部分与所述抗体共价结合的抗体。在其它实施方案中，本发明包括包含一种或多种糖基化位点和在Fc区的一种或多种修饰的抗体，例如上述文献公开的和本领域所属技术人员公知的那些。在优选的实施方案中，相对于包含野生型Fc区的抗体，在Fc区的一种或多种修饰增强了所述抗体对活化的FcγR，如FcγRIIIA的亲和性。具有一种或多种糖基化位点和在Fc区的一种或多种修饰的本发明的抗体具有增强的抗体介导的效应子功能，例如，增强的ADCC活性。在一些实施方案中，本发明还包括含有氨基酸的一种或多种修饰的抗体，该氨基酸直接或间接与所述抗体的碳水化合物部分发生反应，包括但不限于在位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301的氨基酸。直接或间接与抗体的碳水化合物部分发生反映的氨基酸是本领域所属技术人员公知的，参见例如，Jefferis等，1995，Immunology Letters，44：111-7，本发明将其全部引入作为参考。

本发明包括抗体，该抗体通过将一个或多个糖基化位点引入到所述抗体的一个或多个位点上而进行修饰，但优选不改变所述抗体的功能，例如与FcγRIIB的结合活性。可将糖基化位点引入到本发明的抗体的可变区和/或恒定区中。本发明中的“糖基化位点”包括抗体中的任何特定氨基酸序列，寡糖(即含有相互连接的两个或多个单糖的碳水化合物)特异性且共价地与该序列连接。寡糖侧链一般通过N-或O-连接与抗体的骨架连接。N-连接的糖基化是指寡糖部分与天冬氨酸残基侧链结合。O-连接的糖基化是指寡糖部分与羟基氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸结合。本发明的抗体可包括一个或多个糖基化位点，包括N-连接和O-连接的糖基化位点。用于N-连接或O-连接的糖基化的本领域公知的任意糖基化位点都可用于本发明。可用于本发明方法的示例性N-连接的糖基化位点为氨基酸序列Asn-X-Thr/Ser，其中X可以为任意氨基酸，Thr/Ser为苏氨酸或丝氨酸。利用本发明所属领域公知的方法，可将这种位点导入到本发明的抗体中。参见例如，″In vitroMutagenesis，″Recombinant DNA：A Short Course，J.D.Watson等，W.H.Freeman and Company，New York，1983，第8章，pp.106-116，本发明将其全部引入作为参考。将糖基化位点导入到本发明的抗体中的示例性方法包括：修饰或突变所述抗体的氨基酸序列从而获得所需的Asn-X-Thr/Ser序列。

在一些实施方案中，本发明包括通过添加或删除糖基化位点来改变本发明抗体的碳水化合物含量的方法。改变抗体的碳水化合物含量的方法是本领域公知的且包含在本发明的范围内，参见例如，美国专利6,218,149、EP 0 359 096 B1、美国公开US 2002/0028486、WO 03/035835、美国公开2003/0115614、美国专利6,218,149、美国专利第6,472,511，本发明将其全部引入作为参考。在其它实施方案中，本发明包括通过删除抗体的一种或多种内源性碳水化合物部分来改变本发明抗体的碳水化合物含量的方法。

在一些特定的实施方案中，本发明包括修饰的FcγRIIB抗体的用途，其中CDR2区的N-糖基化共有位点Asn₅₀-Val-Ser被修饰，因此在位置50处的糖基化位点被去除。尽管并不意欲受到特定的作用机制的限制，但去除糖基化位点可限制所述抗体在制备中的潜在变化和药物学应用中的潜在免疫原性。在特定的实施方案中，本发明包括人源化FcγRIIB抗体的用途，其中在位置50处的氨基酸被修饰，例如缺失或取代。在另一特定的实施方案中，本发明还包括具有氨基酸修饰的抗体的用途，例如在位置51处缺失或取代。在一个特定的实施方案中，本发明包括人源化FcγRIIB抗体的用途，其中用酪氨酸来替代位置50处的氨基酸。在更特定的实施方案中，本发明包括FcγRIIB抗体的用途，其中用酪氨酸来替代位置50处的氨基酸，其中用丙氨酸来替代位置51处的氨基酸。

5.1.6 FcγRIIB激动剂和拮抗剂

除了FcγRIIB-特异性抗体、其类似物、衍生物或其抗原结合片段用于本发明的方法和组合物中外，其它的FcγRIIB激动剂和拮抗剂也可用于本发明的方法中。FcγRIIB激动剂和拮抗剂包括但不限于蛋白性分子(例如蛋白、多肽(例如可溶性FcγRIIB多肽)、肽、融合蛋白(例如与治疗部分轭合的可溶性FcγRIIB多肽)、核酸分子(例如FcγRIIB反义核酸分子，三螺旋、介导RNAi的dsRNA或编码蛋白分子的核酸分子)、有机分子、无机分子、小有机分子、药物和小无机分子，它们阻断、抑制、减少或中和FcγRIIB多肽的功能、活性和/或表达，该FcγRIIB多肽由免疫细胞、优选B细胞表达。在一些实施方案中，用于本发明的方法的FcγRIIB激动剂或拮抗剂不是小有机分子、药物或反义分子。可利用本领域公知的或本发明所描述的技术来鉴定FcγRIIB激动剂和拮抗剂

本发明的多肽和治疗性化合物包括但不限于蛋白性分子，包括但不限于肽、多肽、蛋白(包括翻译后修饰的蛋白)、抗体等；小分子(少于1000道尔顿)、无机或有机化合物；核酸分子，包括但不限于双链或单链DNA、双链或单链RNA，以及三螺旋核酸分子。预防和治疗性化合物可获自任何已知的有机体(包括但不限于动物、植物、细菌、真菌和原生物或病毒)或来自合成的分子文库。

在某些实施方案中，FcγRIIB拮抗剂在患有B细胞恶性肿瘤的个体中降低FcγRIIB多肽的功能、活性和/或表达。在其它实施方案中，所述FcγRIIB拮抗剂直接结合FcγRIIB多肽并直接或间接地调节B淋巴细胞的活性和/或功能。在具体的实施方案中，FcγRIIB拮抗剂在患有B细胞恶性肿瘤的个体中抑制或降低B-细胞增殖，这可通过本发明所描述的或本领域所属技术人员公知的标准的体内和/或体外分析来测定。在特定的实施方案中，FcγRIIB拮抗剂在患有B细胞恶性肿瘤的个体中介导淋巴细胞的耗损，特别是外周血B细胞，这可通过本发明所描述的或本领域所属技术人员公知的标准的体内和/或体外分析来测定。在另一实施方案中，通过利用抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，FcγRIIB拮抗剂直接或间接调节B淋巴细胞的活性和/或功能。

在优选的实施方案中，用作FcγRIIB拮抗剂的蛋白、多肽或肽(包括抗体和融合蛋白)衍生自与所述蛋白、多肽或肽的受体相同的物种，从而减少对那些蛋白、多肽或肽发生免疫反应的可能性。在另一优选的实施方案中，当所述个体为人时，用作FcγRIIB拮抗剂的所述蛋白、多肤或肽为人的或人源化的。

根据本发明的方法，可将编码用作FcγRIIB拮抗剂的蛋白、多肽或肽的核酸分子向患有B细胞恶性肿瘤的个体给药。此外，根据本发明的方法，可将编码用作FcγRIIB拮抗剂的蛋白、多肽或肽的衍生物、类似物、片段或变体的核酸分子向患有B细胞恶性肿瘤的个体给药。优选地，这种衍生物、类似物、变体和片段保留了全长野生型蛋白、多肽或肽的FcγRIIB拮抗剂活性。

5.2 抗体轭合物

本发明包括与异源多肽(即不相关的多肽或其部分，优选至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)重组融合或化学轭合(包括共价和非共价轭合)而产生融合蛋白的抗体。所述融合不必需是直接的，但可通过接头序列来产生。该抗体可以用于，例如通过将所述抗体融合或轭合到特定细胞表面受体特异性抗体上而在体外或体内将异源多肽靶定到该特定细胞类型上。采用本领域公知方法可将与异源多肽融合或轭合的抗体用于体外免疫分析和纯化方法中。参见例如，PCT公开WO 93/21232；EP439,095；Naramura等，1994，Immunol.Lett.，39：91-99；美国专利5,474,981；Gillies等，1992，Proc Natl Acad Sci，89：1428-1432；和Fell等，1991，J.Immunol.，146：2446-2452，本发明将其各自全部引入作为参考。

此外，抗体可与改变给定生物反应的治疗性试剂或药物部分轭合。不应将治疗性试剂或药物部分解释成仅限于传统的化学治疗性试剂。例如，所述药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白或多肽。这种蛋白可包括例如毒素如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素(即PE-40)或白喉毒素、蓖麻毒素、白树毒素和美洲商陆抗病毒蛋白，蛋白如肿瘤坏死因子，干扰素包括但不限于α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)，神经生长因子(NGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)，细胞凋亡剂(例如TNF-α、TNF-β、如PCT公开号WO 97/33899所公开的AIM I)，AIM II(参见例如PCT公开号WO 97/34911)，Fas配体(Takahashi等，1994，J.Immunol.，6：1567-1574)，和VEGI(PCT公开号WO 99/23105)，血栓形成剂或抗血管生成剂(例如，血管他丁(angiostatin)或内皮他丁(endostatin))，或生物反应调节剂，例如，淋巴因子(例如白介素-1(″IL-1″)，白介素-2(″IL-2″)，白介素-6(″IL-6″)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)，粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″))，巨噬细胞集落刺激因子，(″M-CSF″)，或生长因子(例如，生长激素(″GH″)；蛋白酶或核糖核酸酶。

可将抗体与标记物序列，如肽融合以方便纯化。在优选的实施方案中，所述标记物氨基酸序列为六-组氨酸肽，例如pQE载体中提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)以及其它标签，这些都是商业可获得的。例如如Gentz，等，1989，Acad.Sci.USA，86：821-824所述，六组氨酸为所述融合蛋白的纯化提供了方便。用于纯化的其它肽标签包括但不限于血凝素″HA″标签，其与衍生自流感血凝素蛋白的抗原表位对应(Wilson等，1984，Cell，37：767)以及″flag″标签(Knappik等，1994，Biotechniques，17(4)：754-761)。

本发明还包括含有与抗体片段融合或轭合的异源多肽的组合物的用途。例如，所述异源多肽可与Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)₂片段或其部分融合或轭合。将多肽与抗体部分融合或轭合的方法是本领域公知的。例如，美国专利5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利EP 307,434；EP 367,166；国际公开WO 96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10535-10539；Zheng等，1995，J.Immunol.154：5590-5600；和ViI等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：11337-11341(本发明将上述文献全部引入作为参考)。

可通过基因穿梭(gene-shuffling)、基序穿梭(motif-shuffling)、外显子穿梭(exon-shuffling)和/或密码子穿梭(codon-shuffling)(统称为DNA穿梭(″DNA shuffling″))技术来产生其它融合蛋白。可使用DNA穿梭来改变本发明抗体或其片段的活性(例如，具有较高亲和性和较低解离速率的抗体或其片段)。通常参见，美国专利5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458；以及Patten等，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.16：76；Hansson，等，1999，J.Mol.Biol.287：265；和Lorenzo和Blasco，1998，BioTechniques，24：308(本发明将这些专利和出版物均全部引入作为参考)。在重组之前，可利用易错PCT、随机插入或其它方法进行随机突变来改变抗体或其片段、或所述编码的抗体或其片段。可将编码特异性结合FcγRIIB的抗体或抗体片段的多聚核苷酸的一个或多个部分与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、片段、结构域、片段等重组。

本发明还包括与诊断或治疗性试剂或其它任何分子轭合，从而使所需血清半衰期提高的抗体。所述抗体可诊断性地用于例如，监测疾病、病症和感染的发展和进程，其作为临床检验程序的一部分以，例如确定所给治疗方案的有效性。通过将抗体与可检测物质耦合以便于测定。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、阳离子发射金属以及非放射性顺磁金属离子。利用本领域公知的技术可将所述可检测物质直接或通过中间物(例如，本领域公知的接头)间接地耦合和轭合到所述抗体上。对于可与抗体轭合以用于本发明诊断的金属离子参见例如美国专利4,741,900。这种诊断和测定可通过将所述抗体与可检测物质耦合来实现，该可检测物质包括但不限于各种酶，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸(酯)酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶的酶；辅基复合物，例如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，例如但不限于7-羟基香豆素、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基氨基荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺(luminal)；生物发光材料，例如但不限于荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；放射性材料，例如但不限于铋(²¹³Bi)、碳(¹⁴C)、铬(⁵¹Cr)、钴⁵⁷Co)、氟(¹⁸F)、钆(¹⁵³Gd、¹⁵⁹Gd)、钆(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、(⁶⁸Ge)、钆(¹⁶⁶Ho)、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In)、碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、镧(¹⁴⁰La)、镏(¹⁷⁷Lu)、锰(⁵⁴Mn)、钼(⁹⁹Mo)、钯(¹⁰³Pd)、磷(³²P)、镨(¹⁴²Pr)、钷(¹⁴⁹Pm)、铼(¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re)、铑(¹⁰⁵Rh)、钌(⁹⁷Ru)、钐(¹⁵³Sm)、钪(⁴⁷Sc)、硒(⁷⁵Se)、锶(⁸⁵Sr)、硫(³⁵S)、锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、锡(¹¹³Sn、¹¹⁷Sn)、氚(³H)、氙(¹³³Xe)、镱(¹⁶⁹Yb、¹⁷⁵Yb)、钇(⁹⁰Y)、锌(⁶⁵Zn)；利用各种阳离子发射断层术的阳离子发射材料和非放射性顺磁金属离子。

抗体可与治疗部分，如细胞毒素(例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂)，治疗性试剂或放射性元素(例如α-发射剂、γ-发射剂等)轭合。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有毒的任何试剂。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔毛霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、以及嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗性试剂包括但不限于抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)，烷化试剂(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环硫酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C、和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类抗生素(例如柔毛霉素(以往的道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如放线菌素D(以往的放线菌素)，博来霉素，光辉霉素和安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。

此外，可将抗体与治疗性部分如放射性材料，或用于轭合放射性离子的大环螯合剂(参见上述房舍性材料的例子)轭合。在某些实施方案中，所述大环合剂为1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″-四乙酸(DOTA)，其通过接头分子与抗体连接。这种接头分子在本领域是公知的，如Denardo等，1998，Clin Cancer Res.4：2483-90；Peterson等，1999，Bioconjug.Chem.10：553及Zimmerman等，1999，Nucl.Med.Biol.26：943-50所述，本发明将其每一文献引入作为参考。

将这种治疗性部分与抗体轭合的技术是本领域公知的；参见例如，Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编)，1985，pp.243-56，Alan R.Liss，Inc.；Hellstrom等，″Antibodies For DrugDelivery″，in Controlled Drag Delivery(第2版)，Robinson等(编)，1987，pp.623-53，Marcel Dekker，Inc.)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentIn Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological AndClinical Applications，Pinchera等(编)，1985，pp.475-506；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy，Baldwin等(编)，1985，pp.303-16，Academic Press；和Thorpe等，Immunol.Rev.，62：119-58，1982.

含有或不合有与其轭合的治疗部分的抗体或其片段可作为治疗性试剂单独或与细胞毒性因子和/或细胞因子联合给药。

可选择地，可将抗体与第二抗体轭合以形成抗体异源轭合物，如Segal在美国专利4,676,980中所述，本发明将其全部引入作为参考。

抗体还可与固体支持物连接，其在免疫分析或靶抗原的纯化中特别有用。这种固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙稀。

5.3 本发明单克隆抗体的制备与表征

可利用本领域公知的多种技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组、和噬菌体展示技术或其组合。例如，可用杂交瘤技术来制备单克隆抗体，包括本领域公知的和有教导的杂交瘤，例如Harlow等，Antibody：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling 等，Monoclonal Antibodies and T-CeIl hybridomas，pp.563-681(Elsevier，N.Y.，1981)中的教导(本发明将上述两篇文献引入作为参考)。本发明所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指获自单一克隆的抗体，包括获自任何真核细胞、原核细胞或噬菌体克隆的抗体以及不是由所述方法所产生的抗体。

利用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的且是本领域公知的。在非限制性例子中，可用目标抗原或表达此抗原的细胞来免疫小鼠。一旦检测到免疫反应，例如在该小鼠的血清中检测到该抗原的特异性抗体，就收集该小鼠的脾脏并分离脾细胞。随后通过公知技术将所述脾细胞与任意适合的骨髓瘤细胞融合。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。然后用本领域公知的方法对杂交瘤中分泌能结合所述抗原的细胞进行分析。腹水通常含有高水平的抗体，其通过将阳性杂交瘤克隆种植到小鼠中来产生。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了制备特异性结合FcγRIIB的单克隆抗体的方法，其结合FcγRIIB的亲和性高于该单克隆抗体结合FcγRIIA的亲和性，该方法包括：用纯化的人FcγRIIB胞外区，即氨基酸1-180免疫一种或多种FcγRIIA转基因小鼠(参见美国专利5,877,396号和5,824,487)；从所述小鼠脾细胞中产生杂交瘤细胞株，从该杂交瘤细胞株中筛选产生特异性结合FcγRIIB抗体的一种或多种杂交瘤细胞株，该结合FcγRIIB的亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性。在另一特定的实施方案中，本发明提供了制备特异性结合FcγRIIB、特别是人FcγRIIB的单克隆抗体的方法，该结合FcγRIIB的亲和性高于所述单克隆抗体结合FcγRIIA的亲和性，所述方法还包括：用纯化的FcγRIIB或其免疫原片段免疫一种或多种FcγRIIA转基因小鼠，加强免疫所述小鼠足够的次数以激发免疫反应，从所述一种或多种小鼠的脾细胞中产生杂交瘤细胞株，从该杂交瘤细胞株中筛选产生特异性结合FcγRIIB抗体的一种或多种杂交瘤细胞株，该结合FcγRIIB的亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性。在本发明的一个实施方案中，用纯化的FcγRIIB免疫所述小鼠，该纯化的FcγRIIB已与任何本领域公知的佐剂混合以增强免疫反应。可用于本发明方法中的佐剂包括但不限于蛋白佐剂；细菌佐剂，例如全细菌(BCG，短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)，明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota))以及细菌组分，包括细胞壁骨架，海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate)，单磷酰脂质A，结核杆菌的甲醇提取残余物(MER)，完全或不完全弗氏佐剂；病毒佐剂；化学佐剂，例如氢氧化铝、碘醋酸盐和半琥珀酸胆固醇或裸DNA佐剂。可用于本发明的方法中的其它的佐剂包括霍乱毒素，paropox蛋白，MF-59(Chiron Corporation；参见Bieg等，1999，Autoimmunity，31(1)：15-24，本发明将其全部引入作为参考)，MPL^(Corixa Corporation；也参见LodmellD.I.等，2000，Vaccine，18：1059-1066；Ulrich等，2000，Methods in MolecularMedicine，273-282；Johnson等，1999，Journal of Medicinal Chemistry，42：4640-4649；Baldridge等，1999，Methods，19：103-107，本发明将其全部引入作为参考)，RC-529佐剂(Corixa Corporation；获自Corixa的氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)化学文库的关键化合物，也参见 www.corixa.com)，以及DETOX^TM佐剂(Corixa Corporation；DETOX^TM佐剂，包括MPL^佐剂(单磷酰脂质A)和分支杆菌细胞壁骨架；也参见Eton等，1998，Clin.Cancer Res，4(3)：619-27；和Gubta R.等，1995，Vaccine，13(14)：1263-76，本发明将其全部引入作为参考)。

可通过本领域公知的技术来产生识别特异性抗原表位的抗体片段。例如，可利用酶，如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)₂片段)，通过免疫球蛋白分子的蛋白酶裂解来产生Fab和F(ab′)₂片段。F(ab′)₂片段含有全长的轻链、可变区、CH1区和至少部分的重链铰链区。

例如，还可利用本领域公知的各种噬菌体展示技术来产生抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带其编码多聚核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。在具体的实施方案中，这些噬菌体可用于展示全套(repertoire)或组合抗体文库(例如，人或鼠)所表达的抗原结合结构域，例如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。与目标抗原结合的抗原结合结构域的表达噬菌体可利用抗原来选择或鉴定，例如，利用标记的抗原或结合或捕获到固体表面或小珠的抗原来选择或鉴定。用于本发明的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13。该抗原结合结构域表达为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合的重组融合蛋白。可用于制备本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体文库方法的例子包括以下所述：Brinkman等，J.Immunol.Methods，182：41-50，1995；Ames等，J.Immunol.Methods，184：177-186，1995；Kettleborough等，Eur.J.Immunol，24：952-958，1994；Persic等，Gene，187：9-18，1997；Burton等，Advances in Immunology，57：191-280，1994；PCT申请PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及美国专利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108，本发明将其每一份全部引入作为参考。

如上述文献所述，在选择噬菌体后，可从噬菌体中分离抗体编码区并用于产生完整的抗体，包括人抗体或任何其它所需的片段，并在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下文所祥述。例如，还可使用重组生产Fab、Fab′和F(ab′)₂片段的技术，利用本领域公知的方法，如PCT公开WO 92/22324；Mullinax等，BioTechniques，12(6)：864-869，1992；以及Sawai等，AJRI，34：26-34，1995；和Better等，Science，240：1041-1043，1988中所述的方法(本发明将每一份均全部引入作为参考)。可用于产生单链Fv和抗体的方法的例子包括美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等，Methods in Enzymology，203：46-88，1991；Shu等，Proc Natl Acad Sci USA，90：7995-7999，1993；以及Skerra等，Science，240：1038-1040，1988中所述的方法。

可用噬菌体展示技术来提高本发明的抗体与FcγRIIB的亲和性。此技术可用于获得可用于本发明的组合方法中的高亲和性抗体。该技术称作亲和力成熟，其采用突变或CDR步行和再选择，利用FcγRIIB或其抗原片段来鉴定与初始抗体或母抗体相比以更高亲和性与所述抗原结合的抗体(参见例如，Glaser等，1992，J.Immunology 149：3903)。突变全部密码子而非单一核苷酸可产生半随机的整套(repertoire)氨基酸突变。可将文库构建成包含一组变体克隆，每一克隆的单个CDR中的单个氨基酸改变都不同，且该克隆含有代表各个CDR残基的各个可能氨基酸取代的变体。对所述抗原的结合亲和性提高的突变可通过将固定的突变与标记的抗原接触来筛选。可采用任何本领域公知的筛选方法来鉴定对所述抗原的结合活性提高的突变抗体(例如ELISA)(参见Wu等，1998，Proc Natl.Acad Sci.USA，95：6037；Yelton等，1995，J.Immunology，155：1994)。也可使用使轻链随机化的CDR步行(参见Schier等，1996，J.MoL Bio.263：551)。

本发明的抗体还可以通过抗原表位作图来表征，以选择与FcγRIIA比较对FcγRIIB具有最高特异性的抗体。抗体的抗原表位作图方法是本领域公知的且包括在本发明的方法中。在某些实施方案中，包含FcγRIIB的一个或多个区域的融合蛋白可用于对本发明抗体的抗原表位作图。在特定的实施方案中，所述融合蛋白包含与人IgG2的Fc部分融合的FcγRIIB区域的氨基酸序列。每一融合蛋白可进一步包含所述受体的具有氨基酸取代和/或替代的某些区域和同源受体的对应区域，例如FcγRIIA，如以下表4所示。pMGX125和pMGX132含有FcγRIIB受体的IgG结合位点，前者带有FcγRIIB的C-末端，而后者带有FcγRIIA的C-末端，可用于区分C-末端结合。其它的在IgG结合位点，和FcγIIA或FcγIIB的N-末端具有FcγRIIA取代。这些分子可辅助确定抗体结合的受体分子部分。

表4是可用于研究单克隆抗FcγRIIB抗体的抗原表位的融合蛋白的列表。残基172-180属于FcγRIIA和B的IgG结合位点。来自FcγRIIA序列的特异氨基酸以粗体表示。C-末端序列APSSS为SEQ ID NO：57，C-末端序列VPSMGSSS为SEQ ID NO：58。

质粒	受体	N-末端	172-180	SEQ IDNO：	C-末端
						pMGX125	Rllb	IIb	KKFSRSDPN	51	APS------SS(IIb)
pMGX126	Rlla/b	IIa	QKFSRLDPN	52	APS------SS(IIb)
						pMGX127		IIa	QKFSRLDPT	53	APS------SS(IIb)
pMGX128		IIb	KKFSRLDPT	54	APS------SS(IIb)
						pMGX129		Ila	QKFSHLDPT	55	APS------SS(IIb)
pMGX130		IIb	KKFSHLDPT	56	APS------SS(IIb)
						pMGX131		IIa	QKFSRLDPN	52	VPSMGSSS(IIa)
pMGX132		IIb	KKFSRSDPN	51	VPSMGSSS(IIa)
						pMGX133	RIIa-131R	Ila	QKFSRLDPT	53	VPSMGSSS(IIa)
pMGX134	RIIa-131H	IIa	QKFSHLDPT	55	VPSMGSSS(IIa)
						PMGX135		IIb	KKFSRLDPT	54	VPSMGSSS(IIa)
pMGX136		IIb	KKFSHLDPT	56	VPSMGSSS(IIa)

所述融合蛋白可用于任何生化分析以检测与本发明的抗FcγRIIB抗体的结合，例如ELISA。在其它实施方案中，可通过使用特定残基被FcγRIIA序列取代的肽来进行抗原表位特异性的进一步确证。

可以利用任何本领域公知的用于表征，包括定量所述抗体与FcγRIIB的相互作用的基于免疫或生化的方法来表征本发明的抗体与FcγRIIB的特异性结合。例如可利用基于免疫或生化的方法，包括但不限于ELISA分析、表面胞质基因共振分析、免疫共沉淀分析、亲和层析以及平衡透析来确定本发明抗体与FcγRIIB的特异性结合法。可用于分析本发明的抗体的免疫特异性结合和交叉反应的免疫分析包括但不限于竞争和非竞争性测试系统，其利用技术如Western印记、放射性免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、″夹心″免疫分析、免疫共沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体固定分析、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析等。这些分析是常规的且是本领域公知的(参见例如，Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，JohnWiley & Sons，Inc.，New York，本文将其全部引入作为参考)。

还可以利用任何本领域公知的基于表面胞质共振(surface plasmonresonance，SPR)的分析来检测本发明的抗体，以表征所述抗体与FcγRIIB相互作用的动力学参数。任何商业可获得的SPR设备均可用于本发明，包括但不限于来自Biacore AB(Uppsala，Sweden)的BIAcore设备；由AffinitySensors(Franklin，MA.)提供的IAsys设备；由Windsor ScientificLimited(Berks，UK)生产的IBIS系统，Nippon Laser and ElectronicsLab(Hokkaido，Japan)提供的  SPR-CELLIA系统以及TexasInstruments(Dallas，TX)提供的SPR Detector Spreeta。基于SPR技术的综述参见Mullet等，2000，Methods，22：77-91；Dong等，2002，Review in Mol.Biotech.，82：303-23；Fivash等，1998，Current Opinion in Biotechnology，9：97-101；Rich等，2000，Current Opinion in Biotechnology，11：54-61；本发明将其全部引入作为参考。此外，检测蛋白与蛋白间相互作用的任何SPR设备和基于SPR的方法可参见美国专利6,373,577、6,289,286、5,322,798、5,341,215、6,268,125的描述，其在本发明的方法中予以考虑，本发明将其全部引入作为参考。

简言之，基于SPR的分析涉及将结合对的成员固定到表面上，在溶液中实时监测其与该结合对的另一成员的相互作用。SPR的基础是检测在复合物形成和分裂时在所述表面附近发生的溶剂折射指数改变。所述表面是传感芯片，在其上发生固定，是SPR技术的核心，包括包被了薄层金的玻璃表面，且形成设计用来优化分子与所述表面结合的特异性表面的基底。可商业购买得到各种传感器芯片，特别是从上述公司购买获得，其均可用于本发明的方法中。传感器芯片的例子包括由BIAcore AB，Inc.供应的那些，例如传感器芯片CM5、SA、NTA和HPA。本发明分子可用任何本领域公知的固定方法和化学方法固定到传感器芯片的表面上，该方法包括但不限通过氨基基团直接共价连接，通过巯基直接共价连接，与抗生素蛋白包被的表面的生物素连接，与碳水化合物基团的醛连接，以及通过组氨酸标签与NTA芯片连接。

本发明包括表征本发明的方法所产生的抗体的方法，其通过使用用于鉴定本发明的抗体的功能，特别是调节FcγRIIB信号产生的活性的特征分析方法来进行。例如，本发明的特征分析方法可检测FcγRIIB的ITIM基序中的酪氨酸残的磷酸化，或检测B细胞受体产生的钙动员受到的抑制。本发明的特征分析方法可以是基于细胞的或无细胞的分析。

[00250]本领域已经在肥大细胞中建立了FcγRIIB的共聚集，其对IgE受体，即FcεRI具有高亲和性，从而使抗原介导的脱颗粒、钙动员以及细胞因子产生受到抑制(Metcalfe D.D.等1997，Physiol.Rev.77：1033；Long E.O.1999，Annu Rev.Immunol，17：875)。该信号途径的分子机制最近得到了阐述(Ott V.L.，2002，J.Immunol.162(9)：4430-9)。一旦与FcεRI发生共聚集，FcγRIIB快速磷酸化其ITIM基序中的酪氨酸，并随后招募含肌醇-5-磷酸酶的Src同源物-2(SHIP)，含磷酸肌醇-5-磷酸酶的SH2结构域，其随后被磷酸化并与Shc和p62^dok关联(p62^dok为调节子分子家族的原型，包括信号结构域，如氨基末端pleckstrin同源结构域(PH结构域)、PTB结构域和含PXXP的羧基末端区域和众多的磷酸化位点(Carpino等，1997，Cell，88：197；Yamanshi等，1997，Cell，88：205)。

本发明包括对本发明的抗FcγRIIB抗体调节一种或多种IgE介导的应答进行表征。优选地，将共表达IgE的高亲和性受体和FcγRIIB的低亲和性受体的细胞株用于对本发明的抗FcγRIIB抗体调节一种或多种IgE介导的应答进行表征。在特定的实施方案中，用全长人FcγRIIB转染的大鼠嗜碱性白血病细胞株(RBL-H23；Barsumian EX.等，1981，Eur.J.Immunol.11：317，本发明将其全部引入作为参考)的细胞可用于本发明的方法中。RBL-2H3是得到清楚表征的大鼠细胞株，其已广泛地用研究IgE介导的细胞活化后的信号发生机制。当FcγRIIB在RBL-2H3细胞中表达并与FcεRI共聚集时，FcγRIIB抑制FcεRI诱导的钙动员、脱颗粒和细胞因子产生(Malbec等，1998，J.Immunol.160：1647；Daeron等，1995，J.Clin.Invest.95：577；Ott等，2002，J.of Immunol.168：4430-4439)。

在一些实施方案中，本发明包括对本发明的抗FcγRIIB抗体抑制FcεRI诱导的肥大细胞的活化进行表征。例如，用IgE致敏已被FcγRIIB转染的大鼠嗜碱性白血病细胞株(RBL-H23；Barsumian E.L.等，1981，Eur.J.Immunol.11：317)的细胞，并将其用兔抗小鼠IgG的F(ab′)₂片段刺激以使FcεRI单独地聚集，或用完整的兔抗小鼠IgG来刺激以使FcγRIIB和FcεRI发生共聚集。在此系统中，可以根据所述致敏的和刺激的细胞中添加的本发明的抗体来分析下游信号分子的间接调节作用。例如，可以分析FcγRIIB的酪氨酸磷酸化、招募以及SHIP的磷酸化、MAP激酶家族成员，包括但不限于Erk1、Erk2、JNK或p38的活化；p62^dok酪氨酸磷酸化及其与SHIP和RasGAP相关性。

测定本发明的抗体对FcεRI诱导的肥大细胞活化的抑制的一个示例性分析方法可包括以下步骤：用人FcγRIIB转染RBL-H23细胞；用IgE致敏RBL-H23细胞；用兔抗小鼠IgG的F(ab′)₂片段刺激RBL-H23细胞(单独聚集FcεRI并引发FcεRI介导的信号产生，作为对照)，或用完整的兔抗小鼠IgG刺激RBL-H23细胞(共聚集FcγRIIB和FcεR，对FcεRI介导的信号发生产生抑制)。用完整的兔抗小鼠IgG刺激的细胞还进一步用本发明的抗体预孵育。检测已与本发明的抗体预孵育的细胞和未与本发明的抗体预孵育的细胞的FcεRI依赖性活性，并比较这些细胞中的FcεRI依赖性活性水平，这可表明本发明的抗体对FcεRI-依赖性活性的调节。

上述的示例性分析方法可用于，例如鉴定抗体，该抗体阻断配体(IgG)与FcγRIIB受体结合，并通过防止FcγRIIB与FcεRI共聚集而拮抗FcγRIIB-介导的FcεRI信号发生抑制。此分析方法同样能够鉴定这种抗体，其增强FcγRIIB与FcεRI的共聚集，并通过促进FcγRIIB与FcεRI的共聚集而激动FcεRI信号产生的FcγRIIB-介导性抑制。

在优选的实施方案中，FcεRI-依赖性活性是以下的至少一种或多种：调节下游信号分子发生，例如调节FcγRIIB磷酸化状态，调节SHIP招募，调节MAP激酶活性，调节SHIP磷酸化状态，调节SHIP及Shc与SHIP和Shc的相关性，调节p62^dok磷酸化状态，调节p62^dok与SHIP的相关性，调节p62^dok与RasGAP的相关性，调节钙动员，调节脱颗粒，以及调节细胞因子产生。在另一实施方案中，FcεRI-依赖性活性是5-羟色胺释放和/或细胞外Ca⁺²内流和/或IgE依赖性肥大细胞活化。本领域所属技术人员公知，FcγRIIB和FcεRI的共聚集刺激FcγRIIB酪氨酸磷酸化，刺激SHIP的招募，刺激SHIP酪氨酸磷酸化及与Shc的相关性，并抑制MAP激酶家族成员，包括但不限于Erk1、Erk2、JNK、p38的活化。本领域所属技术人员公知，FcγRIIB和FcεRI的共聚集刺激p62^dok酪氨酸磷酸化增强及其与SHIP和RasGAP的相关性。

在一些实施方案中，通过监测和/或检测肥大细胞或嗜碱性粒细胞的脱颗粒，优选在基于细胞的分析中监测和/或检测来对本发明的抗FcγRIIB抗体调节IgE介导的应答的能力进行表征。优选地，用于此分析的肥大细胞或嗜碱性粒细胞通过本领域公知的标准方法已被工程化而含有人FcγRIIB。在特定的实施方案中，在基于细胞的β-己糖胺酶(包含在所述颗粒中的酶)释放分析中对本发明的抗FcγRIIB抗体调节IgE介导的应答的能力进行表征，β-己糖胺酶从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中的释放是急性过敏反应和炎症状态的初级事件(Aketani等，2001，Immunol.Lett.75：185-9；Aketani等，2000，Anal.Chem.72：2653-8)。根据本发明的方法，可以检测其它炎性介质的释放，包括但不限于5-羟色胺和组织胺的释放来分析IgE介导的应答。尽管并不倾向于受具体作用机制的限制，但从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中释放颗粒，如β-己糖胺酶颗粒是细胞内钙浓度依赖性过程，该过程由FcγRI与多价抗原的交联启动。

表征本发明的抗FcγRIIB抗体介导IgE介导的应答的示例性分析方法是β-己糖胺酶释放分析，其包括以下步骤：用人FcγRIIB转染RBL-H23细胞；单独用小鼠IgE，或小鼠IgE和本发明的抗FcγRIIB抗体一起致敏所述细胞；用不同浓度，优选0.03μg/mL至30μg/mL的山羊抗小鼠F(ab)₂刺激所述细胞约1小时；收集上清液；裂解细胞；及分析通过比色分析来检测释放在所述上清液中的β-己糖胺酶活性，例如使用p-硝基苯基N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷来检测。释放的β-己糖胺酶活性表示为释放活性对总活性的百分比。在单独用抗原，单独IgE，IgE和本发明的抗FcγRIIB抗体一起处理的细胞中，检测并比较释放的β-己糖胺酶活性。尽管不倾向于受具体作用机制的限制，但一旦细胞单独用小鼠IgE致敏并用多克隆山羊抗小鼠IgG的F(ab)₂片段刺激，就会发生FcγRI的聚集和交联，因为该多克隆抗体识别与FcγRI结合的鼠IgE的轻链，因而引起肥大细胞活化和脱颗粒。另一方面，当细胞用小鼠IgE和本发明的抗FcγRIIB抗体一起致敏，并用多克隆山羊抗小鼠IgG的F(ab)₂片段刺激时，FcγRI与FcγRIIB会发生交联，从而抑制FcγRI诱导的脱颗粒。在另一种情况下，山羊抗小鼠F(ab)₂诱导剂量依赖性β-己糖胺酶释放。在一些实施方案中，所述与FcγRIIB受体结合并与FcγRI交联的抗FcγRIIB抗体并不影响抑制途径的活化，即在抗FcγRIIB抗体存在的情况下，脱颗粒水平不发生改变。在其它实施方案中，所述抗FcγRIIB抗体介导抑制性受体，即FcγRIIB(当与抗FcγRIIB抗体结合时)的更强活化，从而与FcγRI产生有效交联并活化同源聚集的FcγRIIB的抑制途径。

本发明还包括通过本领域所属技术人员公知的方法用钙动员分析方法来表征本发明的抗FcγRIIB抗体对IgE介导的细胞响应的作用。示例性钙动员分析方法可包括以下步骤：用IgE初始化嗜碱性粒细胞或肥大细胞；用诸如Fura 2的钙指示剂孵育所述细胞；如上所述刺激细胞；及监测和/或定量细胞内钙浓度，例如通过流式细胞术来监测和/或定量。本发明包括通过任何本领域所属技术人员公知的方法来监测和/或定量细胞内钙浓度，公知方法参见例如，Immunology Letters，2001，75：185-9；British J.of Pharm，2002，136：837-45；J.of Immunology，168：4430-9和J.of Cell Biol.，153(2)：339-49，本发明将其全部引入作为参考。

在优选的实施方案中，本发明的抗FcγRIIB抗体抑制IgE介导的细胞活化。在其它实施方案中，本发明的抗FcγRIIB抗体阻断FcγRIIB调节的抑制途径，或阻断FcγRIIB上的配体结合位点，并由此增强免疫反应。

由于没有合适的长期人肥大细胞培养基，因此对人肥大细胞的研究能力受到限制。最近从肥大细胞肉瘤/白血病患者的骨髓抽吸物中建立了称为LAD1和LAD2的两种干细胞因子依赖性人肥大细胞株(Kirshenbaum等，2003，Leukemia research，27：677-82，本发明将其全部引入作为参考)。据描述，这两种细胞株均表达FcεRI和一些人肥大细胞标记物。本发明包括在本发明的方法中使用LAD1和LAD2细胞来评价本发明的抗体对IgE介导的应答的作用。在特定的实施方案中，基于细胞的β-己糖胺酶释放分析，如诸如上文所述的分析可用于LAD细胞中来测定本发明的抗FcγRIIB抗体对IgE-介导的应答的任何调节。在示例性分析中，用嵌合的人IgE抗硝基酚(NP)初始化并用BSA-NP(多价抗原)刺激人肥大细胞，例如LAD1，通过检测释放在上清液中的β-己糖胺酶来监测细胞脱颗粒(Kirshenbaum等，2003，Leukemia research，27：677-682，本发明将其全部引入作为参考)。

在一些实施方案中，如果人肥大细胞具有低表达的内源性FcγRIIB(这可通过本领域公知的标准方法来测定，如FACS染色)，那么监测和/或测定本发明的抗FcγRIIB抗体介导的抑制途径活化差异可能会很困难。因此，本发明包括替代的方法，其中可以通过使用细胞因子和特定的生长条件来上调FcγRIIB表达。已有描述通过使用IL4，FcγRIIB在人单核细胞细胞株如THP1和U937(Tridandapani等，2002，J.Biol.Chem.，277(7)：5082-5089)以及原始的人单核细胞(Pricop等，2001，J.of Inmunol.，166：531-537)中高度上调。已有描述用二丁酰基环AMP使U937细胞分化来增加FcγRII的表达(Cameron等，2002，Immunology Letters，83：171-179)。因此，可利用细胞因子如IL-4、IL-13来上调用于本发明方法中的人肥大细胞中的内源性FcγRIIB的表达以增加测定灵敏性。

本发明还包括表征本发明的抗FcγRIIB抗体对B-细胞受体(BCR)-介导的信号发生的抑制。BCR-介导的信号发生可包括至少一种或多种下游的生物学反应，例如B细胞的活化和增殖、抗体产生等。FcγRIIB与BCR共聚集使细胞周期进程和细胞存活受到抑制。而且，FcγRIIB与BCR共聚集使BCR-介导的信号发生受到抑制。

特别地，BCR-介导的信号发生包括至少以下的一种或多种：调节下游信号分子，例如，FcγRIIB的磷酸化状态、SHIP招募、Btk和/或PLCγ定位、MAP激酶活性、Akt(抗凋亡信号)招募、钙动员、细胞周期进展以及细胞增殖。

尽管FcγRIIB-介导的BCR信号发生抑制的无数效应子功能都是SHIP介导的，但是最近证明，来自SHIP缺陷小鼠的脂多糖(LPS)-活化的B细胞表现出显著的FcγRIIB-介导的钙动员、Ins(1，4，5)P₃产生以及Erk和Akt磷酸化的抑制(Brauweiler A等，2001，Journal of Immunology，167(1)：204-211)。因此，来自SHIP缺陷小鼠的体外B细胞可用于表征本发明的抗体。用于测定本发明的抗体所引起的FcγRIIB-介导的BCR信号发生抑制的一个示例性分析方法可包括以下步骤：从SHIP缺陷小鼠中分离出脾B细胞；用脂多糖活化所述细胞；并用F(ab′)₂抗IgM刺激所述细胞以聚集BCR，或用抗IgM刺激所述细胞以共聚集BCR和FcγRIIB。已用完整的抗IgM刺激而使BCR和FcγRIIB共聚集的细胞可进一步与本发明的抗体预孵育。通过本领域公知的标准方法来检测细胞的FcγRIIB-依赖活性。比较与本发明的抗体一起预孵育过和没有与本发明的抗体一起预孵育过的细胞中的FcγRIIB-依赖性活性的水平，所比较该水平显示出本发明的抗体对FcγRIIB-依赖性活性的调节。

检测FcγRIIB-依赖性活性可包括例如，通过流式细胞术检测细胞内钙动员，检测Akt和/或Erk的磷酸化，检测BCR-介导的PI(3，4，5)P₃蓄积或检测FcγRIIB-介导的B细胞增殖。

所述分析可用于例如鉴定抗体，该抗体通过阻断FcγRIIB受体的配体(IgG)结合位点来调节FcγRIIB-介导的BCR信号发生抑制，并通过防止FcγRIIB与BCR发生共聚集来拮抗BCR信号发生的FcγRIIB-介导性抑制。该分析还可用于这种抗体：其促进FcγRIIB与BCR的共聚集、和激动BCR信号发生的FcγRIIB-介导性抑制。

本发明涉及表征本发明的抗FcγRIIB抗体在人单核细胞/巨噬细胞中的FcγRII-介导的信号发生。利用SHIP作为其效应子，FcγRII与具有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)B的受体共聚集使FcγR-介导的吞噬作用下调(Tridandapani等，2002，J.Biol.Chem.277(7)：5082-9)。FcγRIIA与FcγRIIB共聚集使FcγRIIB的ITIM基序上的酪氨酸残基快速磷酸化，从而促进SHIP磷酸化、SHIP与Shc关联、以及具有120kDa和60-65kDa分子量的蛋白磷酸化。此外，FcγRIIA与FcγRIIB共聚集使Akt磷酸化下调，Akt为参与细胞调节并负责抑制细胞凋亡的丝氨酸-苏氨酸激酶。

本发明还包括表征本发明的抗FcγRIIB抗体在人单核细胞/巨噬细胞中对FcγR-介导的吞噬作用的抑制。例如，可用抗FcγRII的小鼠单克隆抗体IV.3的Fab片段和山羊抗小鼠抗体(单独聚集FcγRIIA)来刺激来自人单核细胞株的细胞、THP-I，或用完整的IV.3小鼠单克隆抗体和山羊抗小鼠抗体(共聚集FcγRIIA和FcγRIIB)来刺激来自人单核细胞株的细胞、THP-I。在此系统中，用向所刺激的细胞添加的本发明的抗体可分析下游信号分子的调节，例如FcγRIIB的酪氨酸磷酸化、SHIP的磷酸化、SHIP与Shc的相关性、Aktd磷酸化以及分子量为120kDa和60-65kDa的蛋白的磷酸化。此外，在存在和不存在本发明的抗体的情况下，可直接检测单核细胞细胞株的FcγRIIB-依赖性吞噬效率。

用于测定本发明的抗体在人单核细胞/巨噬细胞中抑制FcγR-介导的吞噬作用的另一示例性分析包括以下步骤：用IV.3小鼠抗FcγRII抗体的Fab片段和山羊抗小鼠抗体(以单独聚集FcγRIIA并激发FcγRIIA-介导的信号发生)刺激THP-I细胞，或用小鼠抗FcγRII抗体和山羊抗小鼠抗体(以共聚集FcγRIIA和FcγRIIB并抑制FcγRIIA-介导的信号发生)刺激THP-1细胞。用小鼠抗FcγRII抗体和山羊抗小鼠抗体刺激的细胞还可与本发明的抗体进一步预孵育。检测与本发明的抗体一起预孵育过和没有与本发明的抗体一起预孵育过的刺激细胞的FcγRIIA-依赖性活性，并比较这些细胞中的FcγRIIA-依赖性活性的水平，这表现出本发明的抗体对FcγRIIA-依赖性活性的调节。

所述的示例性分析可用于例如鉴定抗体，该抗体阻断FcγRIIB受体的配体结合，并通过防止FcγRIIB和FcγRIIA共聚集而拮抗FcγRIIB-介导的FcγRIIA信号发生抑制。此分析同样可鉴定这种抗体：其促进FcγRIIB和FcγRIIA的共聚集并激动FcγRIIB-介导的FcγRIIA信号发生抑制。

在本发明的另一实施方案中，本发明涉及表征本发明的抗体的功能，这通过以往所述方法(Tridandapani等，2000，J.Biol.Chem.275：20480-7)测定THP-I细胞吞噬荧光标记的IgG-调理的绵羊红细胞(SRBC)的能力来进行。例如，检测吞噬作用的示例性分析包括：用本发明的抗体或用不结合FcγRII的对照抗体处理THP-I细胞；比较所述细胞的活性水平，其中所述细胞活性(例如，重排活性(结合IgG-包被的SRBC的THP-I细胞的数量)，附着活性(结合THP-I细胞的SRBC总数)，以及吞噬率)的差异表现出本发明的抗体对FcγRIIA-依赖性活性的调节。此分析也可用于鉴定，例如抗体，该抗体阻断FcγRIIB受体的配体结合并拮抗FcγRIIB-介导的吞噬作用抑制。此分析也可鉴定促进FcγRIIB-介导的FcγRIIA信号产生抑制的抗体。

在优选的实施方案中，本发明的抗体在人单核细胞/巨噬细胞中调节FcγRIIB-依赖性活性，其以下列一种或多种方式来进行：调节下游信号分子(例如，调节FcγRIIB的磷酸化状态、调节SHIP磷酸化、调节SHIP与Shc的相关性、调节Akt磷酸化、调节分子量为120kDa和60-65kDa的其它蛋白的磷酸化)以及调节吞噬作用。

本发明包括利用本领域所属技术人员公知的方法来表征本发明的抗体，以鉴定所述抗体对治疗性抗体的效应子细胞功能的作用，例如，其增强治疗性抗体的肿瘤特异性ADCC活性的能力。可用于本发明方法的治疗性抗体包括但不限于抗肿瘤抗体、抗病毒抗体、抗微生物(例如，细菌和单细胞寄生虫)抗体，其例子如本发明所述(5.4.6节)。具体地，本发明包括表征本发明的抗体对FcγR-介导的治疗性抗体，例如肿瘤特异性单克隆抗体的效应子细胞功能的作用。可根据本发明进行分析的效应子细胞功能的例子包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、吞噬作用、调理作用、调理吞噬作用、C1q结合以及不同依赖性的细胞介导的细胞毒性作用。可使用任何本领域所属技术人员公知的基于细胞和无细胞的分析方法来确定效应子细胞功能活性(对于效应子细胞分子，参见Perussia等，2000，Methods，Mol.Biol.121：179-92；Baggiolini等，1998，Experientia，44(10)：841-8；Lehmann等，2000，J.Immunol.Methods，243(1-2)：229-42；Brown EJ.1994，Methods Cell Biol.，45：147-64；Munn等，1990，J.Exp.Med.，172：231-237，Abdul-Majid等，2002，Scand.J.Immunol.55：70-81；Ding等，1998，Immunity8：403-411，本发明将上述全部引入作为参考)。

利用本领域所属技术人员公知的标准方法(参见例如，Perussia等，2000，Methods Mol.Biol.121：179-92)，可分析本发明的抗体在效应子细胞，如天然杀伤细胞中对治疗性抗体的FcγR-介导的ADCC活性的作用。本发明所用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用”和“ADCC”具有本领域通常和惯用的意义，是指体外细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒细胞(例如，单核细胞如天然杀伤细胞(NK)和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并从而使该靶细胞裂解。原则上，具有活化的FcγR的任何效应子细胞都可引发而介导ADCC。介导ADCC的初级细胞是仅表达FcγRIII的NK细胞，而单核细胞依赖于其活化、定位或分化状态而表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。对于在造血细胞上表达FcγR的综述参见例如，Ravetch等，1991，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92，本发明将其全部引入作为参考。

效应子细胞是表达一种或多种FcγR且表现出效应子功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII且表现出ADCC效应子功能。可用于本发明方法的效应子细胞包括但不限于：外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤细胞(NK)、单核细胞和中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。可从天然来源分离所述效应子细胞，例如，从如本发明所述的血液或PBMC中分离。优选地，用于本发明的ADCC分析的效应子细胞为外周血单核细胞(PBMC)，其优选用本领域所属技术人员公知的标准方法，例如Ficoll-Paque密度梯度离心从正常人血液中纯化。例如，通过将全血加到Ficoll-Hypaque层上以500g室温离心30分钟所述细胞来分离PBMC。收集白细胞作为效应子细胞。可用于本发明的ADCC分析的其它效应子细胞包括但不限于单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)。可用作本发明方法中的效应子细胞的MDM优选获自冷冻库存或新鲜使用材料(例如，获自Advanced Biotechnologies，MD)。在最优选的实施方案中，将淘选的人单核细胞用作本发明方法中的效应子细胞。淘选的人单核细胞表达活化的受体FcγRIIIA和FcγRIIA以及抑制性受体FcγRIIB。人单核细胞可商业购买获得，或将冷冻库存在含10％人AB血清的基础培养液或含细胞因子的人血清的基础培养液中解冻获得。所述细胞中的FcγR表达水平可直接测定，例如使用FACS分析测定。可选择地，还可以在培养中使细胞成熟为巨噬细胞。在巨噬细胞中FcγRIIB的表达水平可能增加。用于测定FcγR表达水平的抗体包括但不限于抗人FcγRIIA抗体，例如IV.3-FITC；抗FcγRI抗体，例如32.2 FITC；以及抗FcγRIIIA抗体，例如3G8-PE。

用于本发明ADCC分析中的靶细胞包括但不限于：乳腺癌细胞株，例如ATCC登记号为HTB-30的SK-BR-3(参见例如，Tremp等，1976，CancerRes.33-41)；B淋巴细胞；衍生自Burkitts淋巴瘤的细胞，例如ATCC登记号为CCL-86的Raji细胞(参见例如，Epstein等，1965，J.Natl.Cancer Inst.34：231-240)，ATCC登记号为CCL-213的Daudi细胞(参见例如，Klein等，1968，Cancer Res.28：1300-10)；卵巢肿瘤细胞株，例如ATCC登记号为HTB-161的OVCAR-3(参见例如，Hamilton，Young等，1983)、SK-OV-3、PA-I、CAOV3、OV-90和IGROV-I(获自NCI保藏中心，Benard等，1985，Cancer Research，45：4970-9，本发明将其全部引入作为参考)。所述靶细胞必需被待分析的所述抗体的抗原结合位点识别。用于本发明的方法中的靶细胞可具有低、中或高的癌抗原表达水平。癌抗原的表达水平可利用本领域公知的常规方法来测定，例如FACS分析。例如，本发明包括卵巢癌细胞的用途，该卵巢癌细胞如IGROV-I，其中Her2/neu以不同水平表达；或OV-CAR-3(ATCC登记号为HTB-161，其特征为比SK-BR-3乳腺癌细胞株更低地表达Her2/neu)。可用作本发明方法中的靶细胞的其它卵巢肿瘤细胞株包括OVCAR-8(Hamilton等，1983，Cancer Res.43：5379-89，本发明将其全部引入作为参考)、SK-OV-3(ATCC登记号为HTB-77)、Caov-3(ATCC登记号为HTB-75)、PA-I(ATCC登记号为CRL-1572)、OV-90(ATCC登记号为CRL-11732)、以及OVCAR-4。可用于本发明方法中的其它乳腺癌细胞株包括BT-549(ATCC登记号为HTB-122)、MCF7(ATCC登记号为HTB-22)和Hs578T(ATCC登记号为HTB-126)，所有上述均由NCI保藏中心和ATCC提供并全部引入本发明作为参考。用于本发明方法中的其它细胞株包括但不限于CCRF-CEM(白血病)，HL-60(TB，白血病)，MOLT-4(白血病)，RPMI-8226(白血病)，SR(白血病)，A549(非小细胞肺癌)，EKVX(非小细胞肺癌)，HOP-62(非小细胞肺癌)，HOP-92(非小细胞肺癌)，NC1-H226(非小细胞肺癌)，NC1-H23(非小细胞肺癌)，NC1-H322M(非小细胞肺癌)，NC1-H460(非小细胞肺癌)，NC1-H522(非小细胞肺癌)，COLO 205(克罗恩氏病)，HCC-2998(克罗恩氏病)，HCT-116(克罗恩氏病)，HCT-15(克罗恩氏病)，HT29(克罗恩氏病)，KM12(克罗恩氏病)，SW-620(克罗恩氏病)，SF-268(CNS)，SF-295(CNS)，SF-539(CNS)，SNB-19(CNS)，SNB-75(CNS)，U251(CNS)，LOX 1MV1(黑色素瘤)，MALME-3M(黑色素瘤)，M14(黑色素瘤)，SK-MEL-2(黑色素瘤)，SK-MEL-28(黑色素瘤)，SK-MEL-5(黑色素瘤)，UACC-257(黑色素瘤)，UACC-62(黑色素瘤)，IGR-OV1(卵巢癌)，OVCAR-3、4、5、8(卵巢癌)，SK-OV-3(卵巢癌)，786-0(肾癌)，A498(肾癌)，ACHN(肾癌)，CAK1-I(肾癌)，SN12C(肾癌)，TK-10(肾癌)，UO-31(肾癌)，PC-3C(前列腺癌)，DU-145(前列腺癌)，NC1/ADR-RES(乳腺癌)，MDA-MB-231/ATCC(乳腺癌)，MDA-MB-435(乳腺癌)，DMS114(小细胞肺癌)，以及SHP-77(小细胞肺癌)，上述所有均由NCI提供并引入本发明作为参考。

用于测定本发明的抗体对治疗性抗体的ADCC活性的示例性分析是基于⁵¹Cr释放分析，其包括：用[⁵¹Cr]Na₂CrO₄(因其结合胞浆蛋白，因此该细胞膜通透分子通常用于标记，并且尽管其自发地从细胞中以较低的动力学释放，但其主要是在靶细胞裂解后释放)标记靶细胞，优选地，所述靶细胞表达一种或多种肿瘤抗原，该抗原通过免疫特异性结合在该靶细胞的细胞表面表达的肿瘤抗原的一种或多种抗体来调理所述靶细胞，此时存在或不存在本发明的抗体存，例如2B6，3H7；在微滴定板中以适合的靶细胞对效应子细胞比例将调理的放射性标记的靶细胞与效应子细胞结合；孵育所述细胞混合物，优选优选在37℃孵育，优选持续16-18小时；收集上清液；并分析上清液样品中的放射性。在存在或不存在本发明的抗体的情况下，治疗性抗体的细胞毒性可以随后利用，例如以下公式确定：百分比特异性裂解＝(试验性裂解-抗体非依赖性裂解/最大裂解-抗体非依赖性裂解)×100％。可根据改变的靶：效应子细胞比值或抗体浓度来作图。

在另一实施方案中，本发明包括根据前述方法表征本发明的抗体的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)，参见例如，Ding等，Immunity，1998，8：403-11，本发明将其全部引入作为参考。

在一些实施方案中，本发明包括表征本发明的抗体在体外分析和/或动物模型中增强治疗性抗体的ADCC活性的功能。

在特定的实施方案中，本发明包括利用卵巢癌模型和/或乳腺癌模型来测定本发明的抗体增强肿瘤特异性ADCC的功能。

优选地，本发明的ADCC分析利用多种癌细胞株来进行，通过表达至少一种癌抗原来表征，其中所述癌抗原的表达水平在所用的癌细胞株中是不同的。尽管不倾向于受任何特的作用机制的制约，但在多种其中的癌抗原表达水平不同的细胞株中进行ADCC分析可以测定本发明的抗体清除肿瘤的严谨性。在一个实施方案中，本发明的ADCC分析利用具有不同的癌抗原表达水平的癌细胞株来实施。

在示例性分析中，OVCAR3(卵巢癌细胞株)可用作表达肿瘤抗原Her2/neu和TAG-72的肿瘤靶；表达活化的FcγRIIIA和FcγRIIA以及抑制性FcγRIIB的人单核细胞可用作效应子；及肿瘤特异性鼠抗体，ch4D5和chCC49可用作肿瘤特异性抗体。OVCAR-3细胞可从ATCC获得(登记号为HTB-161)。优选地，OVCAR-3细胞在添加了0.01mg/ml牛胰岛素的培养液中繁殖。可将5×10⁶个活的OVCAR-3细胞用Matrigel皮下注射到年龄体重匹配的裸无胸腺小鼠(Becton Dickinson)中。可通过以下公式计算估计的肿瘤重量：长度-(宽度)²/2，且优选不超过3g。6-8周后可分离锚定依赖性肿瘤(anchorage-dependent tumor)，向每克肿瘤细胞中加入1μg胶原酶(Sigma)并加入5mg/mL的Rnase来分散所述细胞，使其通过细胞滤网和尼龙网以分离细胞。随后冷冻细胞用于长期储存，以用于建立异种移植物模型的皮下注射。

分泌CC49和4D5抗体的杂交瘤可以是ATCC登记号HB-9459和CRL-3D463，其重链和轻链核苷酸序列处于公知领域(Murray等，1994，Cancer，73(35)：1057-66，Yamamoto等，1986，Nature，319：230-4，本发明将其全部引入作为参考)。优选地，通过本领域公知的常规方法嵌合4D5和CC49抗体，从而使人Fc序列，例如人IgG1的恒定区嫁接到鼠抗体的可变区上以提供效应子功能。该嵌合的4D5和CC49抗体通过其可变区结合靶细胞株并通过其Fc区结合在人效应子细胞上表达的FcγR。CC49被导向到TAG-72，其是在许多腺癌和卵巢癌细胞上水平高表达的高分子量粘液素(Lottich等，1985，Breast Cancer Res.Treat.6(1)：49-56；Mansi等，1989，Int.J.Rad.Appl.Instrum B.16(2)：127-35；Colcher等，1991，Int.J.Rad.Appl.Instrum B.18：395-41，本发明将其全部引入作为参考)。4D5被导向到人上皮生长因子受体2(Carter等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-9，本发明将其引入作为参考)。于是，本发明的抗体通过阻断抑制性FcγRIIB可用于研究肿瘤特异性抗体的ADCC活性增强。尽管不倾向于受任何特定作用机制的限制，一旦表达至少一种活化的FcγR，如FcγRIIA的效应子细胞被活化，则抑制性受体(FcγRIIB)的表达就会增强，且这会限制肿瘤清除，因为FcγRIIA的ADCC活性受到抑制。然而，本发明的抗体可用作阻断抗体，即防止抑制信号被活化的抗体，因而该活化信号，如ADCC活性可在较长的时间内保持稳定并使潜在的肿瘤清除。

优选地，用于增强ADCC活性的本发明的抗体已被修饰而包含至少一种氨基酸修饰，从而使它们与FcγR的结合减少，优选地消除。在一些实施方案中，本发明的抗体被修饰而包含至少一种氨基酸修饰，该修饰与本发明的野生型抗体相比减少了所述恒定区与活化的FcγR，如FcγRIIIA、FcγRIIA的结合，同时保留了最大的FcγRIIB阻断活性。可根据本领域公知的和本发明所公开的任何方法来修饰本发明的抗体。已知破坏效应子功能的任何氨基酸修饰都可用于本发明的方法中，例如参见，美国申请60/439,498(2003年1月9日提交)和60/456,041(2003年3月19日提交)，本发明将其全部引入作为参考。在一些实施方案中，本发明的抗体被修饰从而在位置265被修饰，例如，在位置265用丙氨酸取代。在优选的实施案中，本发明的鼠抗体的恒定区被对应的人恒定区来交换，该人恒定区在位置265的氨基酸被丙氨酸取代，从而消除了效应子功能而保留了FcγRIIB阻断活性。已经证明在IgG1重链的位置265处的单一氨基酸改变可显著地降低对FcγR的结合(基于ELISA分析)，Sheilds等，2001，J.Biol.Chem.，276(9)：6591-604，本发明将其全部引入作为参考，且使肿瘤体积变小。在其它实施方案中，本发明的抗体被修饰而在位置297被修饰，例如，位置297被谷氨酸取代，从而消除了N-连接的糖基化位点(参见例如，Jefferies等，1995，Immunol，lett，44：111-7；Lund等，1996，J.Immunol.，157：4963-69；Wright等，1994，J.Exp.Med.180：1087-96；White等，1997；J.Immunol.158：426-35，本发明将其全部引入作为参考。已经报道，在此位点的修饰可消除所有与FcγR的相互作用。在优选的实施方案中，本发明鼠抗体的恒定区被对应的人恒定区交换，该人恒定区包括位置265和/或297的氨基酸取代，从而消除了效应子功能而保留了FcγRIIB阻断活性。

在存在或不存在本发明的抗体的情况下下，测定肿瘤特异性抗体的ADCC活性的示例性分析是基于非放射性铕的荧光分析(BATDA，PerkinElmer)并包括以下步骤：用荧光增强酯酰氧甲基酯标记靶细胞，该酯通过其水解形成与细胞膜亲水的配体(TDA)；此复合物不能离开细胞且仅在效应子裂解细胞后释放；在存在抗肿瘤抗体和本发明的抗体的情况下将标记的靶加入到效应子细胞中；孵育靶和效应子细胞的混合物6至16小时，优选在37℃孵育。通过测定释放并与铕(DELFIA反应试剂；PerkinElmer)反应的配体的量来分析ADCC活性。该配体与铕形成稳定且高荧光性的螯合物(EuTDA)，并且所测定的荧光与裂解的细胞数量直接成比例。特异性裂解百分比可用以下公式计算：(试验性裂解-抗体非依赖性裂解/最大裂解抗体-非依赖性裂解×100％)。

在以下实施方案中，如果基于荧光的ADCC分析的敏感性过低以至于不能测定治疗性抗体的ADCC活性，本发明包括基于放射性的ADCC分析，例如⁵¹Cr释放分析。基于放射性的分析可替代基于荧光的ADCC分析或与其联合使用。

用于表征本发明的抗体的示例性⁵¹Cr释放分析可包括以下步骤：用⁵¹Cr标记1-2×10⁶个靶细胞，如OVCAR-3细胞；在存在和不存在本发明抗体的抗体的情况下用抗体4D5和CC49调理靶细胞并加入5×10³个细胞至96孔板。优选地4D5和CC49的浓度为1-15μg/mL；将调理的靶细胞加入到单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)(效应子细胞)中；优选地，以10∶1至100∶1的比值范围变化；在37℃孵育所述细胞混合物16-18小时；收集上清液；及分析所述上清液的放射性。可随后确定在存在和不存在本发明抗体的存在下的4D5和CC49的细胞毒性，例如采用以下公式确定：特异性裂解百分比＝(试验性裂解-抗体非依赖性裂解/最大裂解抗体-非依赖性裂解)×100％。

在一些实施方案中，在异种移植物人肿瘤模型中确定本发明的FcγRIIB抗体的体内活性。可利用上述任意癌细胞株建立肿瘤。在一些实施方案中，可利用两种癌细胞株建立肿瘤，其中第一癌细胞株的特征为低表达癌抗原，第二癌细胞株的特征为高表达相同的癌抗原。然后，利用本领域所属技术人员公知的方法，利用免疫特异性结合第一和第二癌细胞株的癌抗原的抗肿瘤抗体，以及适合的小鼠模型，如Balb/c裸小鼠模型(例如，JacksonLaboratories，Taconic)，和合适转染的人单核细胞和MDM作为效应子细胞来测定肿瘤的清除。可检测此动物模型中的上述任何抗体以评价本发明的抗FcγRIIB抗体在肿瘤清除中的作用。可用于本发明中的小鼠包括例如FcγRIII-/-(其中FcγRIIIA被敲除)；Fcγ-/-裸鼠(其中FcγRI和FcγRIIIA被敲除)；或人FcγRIIB转入小鼠或转基因敲入小鼠，其中位于染色体1的小鼠fcgr2和fcgr3位点被失活，且该小鼠表达人FcγRIIA、人FcγRIIA、人FcγRIIB、人FcγRIIC、人FcγRIIIA和人FcγRIIIB。

检测本发明抗体的体内活性的示例性方法可包括以下步骤：利用以癌抗原表达为特征的癌细胞株建立异种移植物鼠模型，并测定在介导肿瘤清除中本发明的抗体对该癌细胞株中表达的癌抗原特异性抗体的作用。优选地，平行利用两种癌细胞株来检测所述的体内活性，其中所述第一癌细胞株的特征为低水平表达第一癌抗，而第二癌细胞株的特征为相对于第一癌细胞株以较高水平表达相同的癌抗原。因此，这些试验会增加评价本发明的抗体在肿瘤清除中的作用的严谨性。例如，可用IGROV-I细胞株来建立肿瘤，并可评价本发明的抗FcγRIIB抗体在Her2/neu特异性抗体的肿瘤清除中的作用。为了建立异种移植物肿瘤模型，可将5×10⁶个活细胞，例如IGROV-I，SKBR3注射，例如用Matrigel皮下注射入小鼠，例如，8只年龄和体重匹配的雌性裸无胸腺小鼠(Becton Dickinson)中。估计的肿瘤重量可由以下公式确定：长度×(宽度)²/2；且优选不超过3g。IGROV-I细胞的皮下注射使肿瘤快速生长，而腹腔内途径诱导产生腹腔肿瘤，其在2月内杀死小鼠(Benard等，1985，Cancer Res.45：4970-9)。因为IGROV-I细胞在5周内形成肿瘤，因此在肿瘤细胞注射后的第一天，将作为效应子的单核细胞与Her2/neu特异性治疗性抗体和本发明的抗体一起进行腹腔内共注射，治疗性抗体如Ch4D5和本发明的抗体，如上文所述的嵌合2B6或3H7。优选地，所述抗体以4μg每克小鼠体重(mbw)注射。初始注射之后，每周注射抗体2μg/wk，持续4-6周。每两周一次补充人效应子细胞。一组小鼠不接受治疗性抗体，但注射嵌合的4D5，该嵌合的4D5包含N297A突变和人IgG1，分别作为抗肿瘤和抗FcγRIIB抗体的同种型对照抗体。小鼠分成4组且每周检测三次。

下表5为本发明的肿瘤清除的示例性例子。如表5所示，需要6组小鼠，每组8只以测试本发明抗体在肿瘤清除中的作用，其中使用了一种靶细胞和效应子细胞组合，而且使用了两种不同的抗体浓度组合。在组A中，只有肿瘤细胞被注射；在组B，肿瘤细胞和单核细胞被注射；在组C中，肿瘤细胞、单核细胞、抗肿瘤抗体(ch4D5)被注射；在D中，肿瘤细胞、单核细胞、抗肿瘤抗体和抗FcγRII抗体被注射；在组E中，肿瘤细胞、单核细胞和抗FcγRIIB抗体被注射；在组F中，肿瘤细胞、单核细胞、Ch4D5(N297Q)和人IgG1被注射。本领域所属技术人员应理解，可在上述肿瘤模型中检测不同抗体组合的不同抗体浓度。优选地，利用乳腺癌细胞株，如SKBR3进行上述试验的平行研究。

表5：小鼠中示例性试验的例子

每组8只小鼠	第0天皮下给予肿瘤细胞	第一天腹腔内给予单核细胞	第1天腹腔内给予4μg/gm/mbw的ch4D5	第1天腹腔内给予4μg/gm/mbw的ch4D5N297Q	第1天腹腔内给予4μg/gm/mbw的ch2B6N297Q	第1天腹腔内给予4μg/gm/mbw的人IgG1
							A	+	-	-	-	-	-
B	+	+	-	-	-	-
							C	+	+	+	-	-	-
D	+	+	+	-	+	-
							E	+	+	-	-	+	-
F	+	+	-	+	-	+

利用本领域所属技术人员公知的方法，根据肿瘤的大小、小鼠的体重、存活时间和癌症的组织化学和组织病理学检验来确定异种移植物肿瘤模型的终点。评价表5中每一组小鼠。优选每周监测三次小鼠。肿瘤生长的标准可以是腹部膨胀、腹膜腔存在明显肿块。优选相对于种植后天数计算肿瘤重量的估计值。将组D中小鼠与其它组小鼠的上述标准进行比较将确定本发明的抗体在肿瘤清除增强中的作用。优选地，在对照组之后再观察抗体处理的动物2个月。

在可选择的实施方案中，在鼠效应子细胞中表达人FcγRIIB的人FcγRIIB“转入”小鼠可用于建立本发明抗体的体内活性，而不需要适当转染效应子细胞。可通过在小鼠FcγRIIB位点“转入”人FcγRIIB而产生表达人FcγRIIB的起始小鼠(founder mice)。该起始小鼠可随后与空白背景回交并表达人FcγRIIB受体。所产生的鼠效应子细胞表达内源活化的FcγRI和FcγRIIIA以及抑制性人FcγRIIB受体。

本发明的抗体的体内活性可以利用人原始肿瘤衍生细胞，如人原始卵巢和乳腺肿瘤衍生细胞在异种移植物鼠模型中进行进一步检测。利用利用本领域所属技术人员公知的方法，可检测癌症患者的腹水和胸膜渗出液样品的Her2/neu表达。可通过如下方式处理卵巢癌患者的样品：4℃下6370g离心腹水20分钟；裂解红细胞；和用PBS洗涤细胞。一旦在肿瘤细胞中检测到Her2/neu表达，可选择中和高度表达的两个样品用于皮下种植以建立异种移植物肿瘤模型。也可将所分离的肿瘤细胞腹腔内注射入小鼠来扩增该细胞。大约10只小鼠可被腹腔内注射，而且每只小鼠的腹水可进一步转入两只小鼠以从总计20只的小鼠中获得腹水，该腹水可用于对一组80只的小鼠进行注射。可利用与腹水相同的方法来处理胸膜渗出液样品。来自胸膜渗出液样品的Her2/neu+肿瘤细胞可注射至小鼠的上右和左侧乳房垫(mammary pad)中。

在一些实施方案中，如果腹水或胸膜渗出液样品中的瘤性细胞百分比与其它细胞组分相比较低，则可体外扩增该瘤性细胞。在其它实施方案中，可利用如上述所述的CC49抗体(抗-TAG-72)-包被的磁株来纯化肿瘤细胞，参见例如，Barker等，2001，Gynecol.Oncol.82：57，63，本发明将其全部引入作为参考。简言之，用CC49抗体包被的磁株来分离卵巢肿瘤细胞，该细胞在37℃孵育过夜后会与该磁株分离。在一些实施方案中，如果肿瘤细胞缺乏TAG-72抗原，则可用阴性耗尽法(negative depletion)使用抗体鸡尾酒来富集该肿瘤细胞，例如Stem Cell Technologies，Inc.，Canada提供的抗体。

在其它实施方案中，可以使用Her2/neu之外的其它肿瘤标记物来将来自腹水和胸膜渗出液样品的肿瘤细胞与非肿瘤细胞分开。对于胸膜渗出液或乳腺组织，最近有报道CD44(粘附分子)、B38.1(乳腺癌/卵巢癌特异性标记物)、CD24(粘附分子)可用作标记物，参见例如，Al Hajj，等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：3983，8，本发明将其全部引入作为参考。一旦肿瘤细胞被纯化，其可被皮下注射到小鼠中进行扩增。

优选地，对患者的腹水和胸膜渗出液进行免疫组化和组织化学方法来分析肿瘤的结构特征。这种方法是本领域所属技术人员公知的且包括在本发明中。可被监测的标记物包括例如细胞角蛋白(鉴定卵巢肿瘤和来自炎症和间充质细胞的间皮细胞)、钙视网膜蛋白(从Her2neu阳性瘤性细胞中分离间皮细胞)、和CD45(从样品的细胞群的余下部分中分离炎性细胞)。可利用的其它标记物包括CD3(T细胞)、CD20(B细胞)、CD56(NK细胞)和CD14(单核细胞)。本领域所属技术人员应理解，上述的免疫组化和组织化学方法可类似地用于本发明方法中使用的任何肿瘤细胞。皮下注射肿瘤植入物后，观察小鼠的临床和解剖学改变。如需要，可对小鼠进行尸检以将总肿瘤发生与特异性器官定位关联起来。

在特定的实施方案中，利用肿瘤细胞株如IGROV-I、OVCAR-8、SK-B和OVCAR-3细胞，和人卵巢癌腹水和乳腺癌患者的胸膜渗出液来建立肿瘤。所述腹水优选含有效应子和待检测抗体的肿瘤靶。人单核细胞转化作效应子。

也可在动物模型中检测本发明的抗体的体内活性，例如，Balb/c裸小鼠，其用表达FcγRIIB的细胞注射，该细胞包括但不限于ATCC登记号为HTB-30的SK-BR-3细胞(参见例如，Tremp等，1976，Cancer Res.33-41)；B-淋巴细胞；衍生自Burkitts’淋巴瘤的细胞，例如ATCC登记号为CCL-86的Raji细胞(参见例如，Epstein等，1965，J.Natl.Cancer Inst.34：231-240)，ATCC登记号为CCL-213的Daudi细胞(参见例如，Klein等，1968，CancerRes.28：1300-10)；卵巢肿瘤细胞株，例如ATCC登记号为HTB-161的OVCAR-3细胞(参见例如，Hamilton，Young等，1983)、SK-OV-3、PA-I、CAOV3、OV-90和IGROV-I细胞(得自NCI保藏中心，Benard等，1985，Cancer Research，45：4970-9，本发明将其全部引入作为参考。

用于检测本发明的抗体体内活性的示例性分析包括以下步骤：在第0天用表达FcγRIIB的细胞，如5×10⁶个Daudi细胞注射，例如通过皮下途径注射Balb/c裸雌性小鼠(Taconic，MD)。小鼠(例如，每组5只小鼠)还可接受腹腔内注射PBS(阴性对照)，作为阴性对照的ch 4.4.20(抗FITC抗体)，和作为阳性对照的另一种治疗性癌抗体，如本发明所述的癌抗体，如，Rituxan(例如10μg/g)或10μg/g的ch2B6，在第0天开始每周一次。观察小鼠，例如在注射后每周观察两次，并使用例如测径器来测定肿瘤大小(长和宽)。用以下公式肿瘤的估计重量(mg)：(长×宽²)/2。

优选地，当以相同的剂量给药时，例如以10μg/g给药至少14天、至少21天、至少28天或至少35天时，本发明的抗体相对于癌症治疗性抗体在减少肿瘤方面具有增强的效力。在最优选的实施方案中，相对于相同剂量的癌症治疗性抗体，本发明的抗体减少肿瘤的尺寸至少10倍、至少100倍、至少1000倍。在另一实施方案中，本发明的抗体能够完全消除肿瘤。

5.3.1 多聚核苷酸编码的抗体

本发明还包括编码本发明的抗体的多聚核苷酸(例如，由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体，这些克隆的ATCC登记号分别为PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959)，或由本发明的免疫方法产生的其它单克隆抗体、其人源化形式，及其制备方法。

本发明还包括多聚核苷酸，其编码ATCC登记号为PTA-4591的2B6抗体的重链，具有SEQ ID NO.27所述的序列。本发明还包括多聚核苷酸，其编码ATCC登记号为PTA-4591的2B6抗体的轻链，具有SEQ ID NO.25所述的序列。

本发明的方法还包括多聚核苷酸，其在不同的严格条件下，例如高度严格、中度严格或低严格条件下与编码本发明的抗体的多聚核苷酸杂交。所述杂交可在不同的严格条件下进行。例如但不限于，利用低严格条件的过程如下所述(也参见Shilo和Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，6789-6792)。40℃下在含有35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性大马哈鱼精子DNA的溶液中预处理含DNA的滤膜6小时。杂交可在包含以下改变的相同溶液中进行：02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml大马哈鱼精子DNA、10％(wt/vol)硫酸右旋糖苷、以及使用5-20×10⁶ cpm³²P-标记的探针。将滤膜与杂交混合物在40℃孵育18-20小时，随后在含有2×SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中55℃洗涤1.5小时。用新鲜的溶液替换洗涤溶液，并在60℃孵育另外的1.5小时。转印干燥滤膜并进行放射性自显影暴露。如果需要，在65-68℃洗涤滤膜三次并再次暴露到底片上。可用的其它低严格杂交条件是本领域公知的(例如，如用于交叉物种的杂交)。例如但不限于，用于高度严格条件的杂交过程如下：在含有6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml变性大马哈鱼精子DNA的缓冲液中在65℃预杂交含DNA的滤膜8小时至过夜。将滤膜在65℃、在含有100μg/ml变性三文鱼精子DNA和5-20×10⁶cpm的³²P-标记探针的预杂交混合物中杂交48小时。在含有2×SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中在37℃洗涤滤膜1小时。在放射性自显影之前，在1×SSC中50℃洗涤1小时。可用的其它高度严格杂交条件是本领域公知的。对于这些严格的适合条件的选择是本领域公知的(参见例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；也可参见Ausubel等编，in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory techniquemanuals，1987-1997，Current Protocols，^1994-1997 John Wiley and Sons，Inc.；特别参见Dyson，1991，″Immobilization of nucleic acids and hybridizationanalysis″，In：Essential Molecular Biology：A Practical Approach，Vol.2，T.A.Brown编，pp.111-156，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，UK)。

可获得所述多聚核苷酸，并且通过任何本领域公知的方法测定所述多聚核苷酸的核苷酸序列。

通过与Ig特异性探针杂交和/或利用与所述序列的3′和5′末端杂交的合成引物进行PCR扩增，或通过利用用于，例如从编码所述抗体的cDNA文库中鉴定cDNA克隆的特定基因序列的特异性寡核苷酸探针来进行克隆，可由合适来源产生编码抗体的多聚核苷酸(例如来自表达该抗体的任何组织或细胞的cDNA文库，或分离自表达该抗体的任何组织或细胞的核酸、优选多聚A+RNA，如选择来表达本发明的抗体的杂交瘤细胞，如2B6或3H7)。利用本领域公知的任何方法，随后将PCT产生的扩增核酸克隆至可复制的克隆载体中。

一旦确定了所述抗体的核苷酸序列，可利用本领域公知的用于操作核苷酸序列的方法来操作该抗体的核苷酸序列，例如用重组DNA技术、定点突变、PCR等(参见例如，Sambrook等，1990，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等编，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，NY所述的技术，本发明将其全部引入作为参考)来产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。

在特定的实施方案中，利用常规的重组DNA技术将一个或多个CDR插入到框架区中。该框架区可以是天然产生的或是共有的(consensus)框架区，并优选人框架区(对于人框架区列表，参见例如，Chothia等，1998，J.MoL Biol.278：457-479)。优选地，由框架区CDR组合产生的多聚核苷酸编码特异性结合FcγRIIB的抗体，其结合亲和性高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性。优选地，如上所述，可在所述的框架区进行一个或多个氨基酸取代，并优选地，所述氨基酸取代提高了本发明的抗体与FcγRIIB的结合。代表性质粒pMGx608(pCI-neo[Invitrogen，Inc.]，含有人源化2B6重链与作为框架区的人VH1-18和JH6种系序列，2B6小鼠CDR和人IgG₁ Fc恒定区)和pMGx611(pCI-neo，含有人源化2B6轻链和作为框架区的人VK-A26和JK4，作为恒定区的人kappa，以及小鼠2B6轻链CDR与CDR2中的N₅₀→Y和V₅₁→A)，它们的ATCC登记号分别为PTA-5963和PTA-5964，根据布达佩斯条约于2004年5月7日分别存放于美国典型培养物保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，VA.20110-2209)，本发明将其引入作为参考。由这些重链和轻链形成的抗体称为h2B6YA。

在另一实施方案中，通过本领域公知的标准技术可筛选人文库或任何其它文库，以克隆编码本发明的抗体的核酸。

5.3.2 抗体的重组表达

一旦获得编码本发明的抗体的核酸序列，利用本领域公知技术的重组DNA技术可产生制备所述抗体的载体。本领域所属技术人员公知的方法可用于构建含有所述抗体编码序列和适合的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、以及体内遗传重组(参见例如，Sambrook等，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等编，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY所述的技术)。

通过常规技术(例如电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)可将包含抗体核苷酸序列的表达载体转化到宿主细胞中，而且利用常规技术培养所转化的细胞以产生本发明的抗体。在特定的实施方案中，通过组成型、诱导型或组织特异性的启动子来调节所述抗体的表达。

用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞可以是诸如大肠杆菌的细菌细胞，或者优选地是真核细胞，特别是用于表达完整的重组免疫球蛋白分子的真核细胞。具体地，连接有载体，例如来自人巨细胞病毒的主要中间体(major intermediate)早期基因启动子元件的哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等，1998，Gene，45：101；Cockett等，1990，Bio/Technology，8：2)。

可利用各种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体。这种宿主表达系统不仅表现为产生并随后纯化所述抗体的编码序列的载体，还表现为用适合的核苷酸编码序列转化或转染时可在原位表达本发明的抗体的细胞。这些系统的例子包括但不限于：用含有免疫球蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有免疫球蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有免疫球蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有免疫球蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染的或用含有免疫球蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的大鼠肾脏细胞))，其含有包括衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫因启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体。

在细菌系统中，根据表达抗体的期望用途，可有利地选择许多表达载体。例如，当要大量地生产这种蛋白以用于抗体的药物组合物时，指导易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体是理想的。这种载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983，EMBO J.2：1791)，其中所述抗体编码序列各自可与框架中具有lac Z编码区的所述载体连接从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，1985，Nucleic acids Res.13：3101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.24：5503-5509)等等。也可利用pGEX载体来表达外源多肽作为与谷光甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这种融合蛋白是可溶的，且通过吸附和与基质谷光甘肽-琼脂糖小珠结合，并随后在游离的谷光苷肽存在下洗脱而容易地纯化。该pGEX载体设计成包含凝学酶或因子Xa蛋白酶裂解位点从而使所述克隆靶基因产物可从GST部分释放。

在昆虫系统中，将苜蓿银纹夜蛾(Autographa califomica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来表达外源基因。该病毒在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。所述的抗体编码序列可单独地克隆至该病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可使用许多基于病毒的表达系统。当将腺病毒用作表达载体时，可将感兴趣的抗体编码序列连接到腺病毒的转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子(late promoter)和三重引导序列中。通过离体和在体重组可随后将此嵌合基因插入至腺病毒基因组。在病毒基因组的非必需区(例如，区域E1或E3)插入会产生活的且能够在感染的宿主中表达所述免疫球蛋白分子的重组病毒(例如参见，Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：355-359)。也可使用特异性起始信号以使插入的抗体编码序列有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，该起始密码子必须与所需的编码序列有相同的阅读框，以确保全部插入序列的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是不同来源的，天然的和合成的。通过加入适合的转录增强子元件、转录终止子等可以增强表达的效率(参见Bittner等，1987，Methods in Enzymol.153：51-544)。

此外，可选择宿主细胞株，其以所需的特定方式调节插入序列的表达，或修饰和加工基因产物。这种蛋白产物的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对所述蛋白的功能可能是重要的。不同的宿主细胞对蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰性都具有特征性的和特定的机制。可选择适合的细胞株或宿主系统来保证表达的外源蛋白的准确修饰和加工。为此，可使用真核宿主细胞，其具有对基因产物的原始转录子进行适当加工、糖基化和磷酸化的细胞机器。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeIa、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。

为了长期且高产量地制备重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，可工程化稳定表达本发明的抗体的细胞株。胜于含有病毒来源复制子的表达载体，可用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等等)和选择性标记物控制的DNA来转化宿主细胞。引入外源DNA后，可使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，随后转入选择培养基。在重组质粒中的选择性标记物会对该选择表现出抗性并使细胞稳定地将所述质粒整合到其染色体中并长成集落，于是该集落被克隆并扩增成细胞株。该方法可有利地用于工程化表达本发明的抗体的细胞株。这种工程化细胞株在筛选和评价直接或间接与本发明的抗体互作的化合物方面特别有用。

可使用的许多选择系统，包括但不限于：分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用的带状疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell，11：223)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：202)以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，1980，Cell，22：817)基因。另外，抗代谢物耐受性可用于选择以下基因的基础：dhfr，其对甲氨喋呤耐受(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：357；O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1527)；gpt，其对霉酚酸耐受(Mulligan& Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072)；neo，其对氨基糖苷G-418耐受，Clinical Pharmacy，12：488-505；Wu和Wu，1991，3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science，260：926-932；及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIB TECH，11(5)：155-215)。可利用的重组DNA技术的本领域公知的方法如Ausubel等(编)，1993，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；和Dracopoli等(编)，1994，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY.第12和13章；Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.150：1所述；以及hygro，其对潮霉素耐受性(Santerre等，1984，Gene，30：147)。

通过载体的扩增可增加本发明的抗体的表达水平(有关综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3.(Academic Press，New York，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的时，在宿主细胞培养物中抑制剂的水平增加会增加标记物基因的拷贝数。因为扩增的区域与抗体的核苷酸序列有关，所以所述抗体的制备也会增加(Crouse等，1983，Mol.Cell.Biol.3：257)。

所述的宿主细胞可用本发明的两种表达载体来共转染，第一种载体编码重链衍生多肽，而第二载体编码轻链衍生多肽。这两种载体可含有相同的选择标记物，其能够同等表达重链和轻链多肽。或者，可使用既编码重链多肽也编码轻链多肽的单一载体。在这种情况下，所述轻链应置于所述重链之前以避免过量的毒性游离重链(Proudfoot，1986，Nature，322：52；Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：2197)。所述重链和轻链的编码序列包括cDNA或基因组DNA。

一旦本发明的抗体被重组表达，可用本领域公知的用于纯化抗体的方法纯化，例如，通过层析(例如，离子交换层析；亲和层析，特别是在蛋白A之后的特定抗原的亲和层析；以及分子排阻柱层析)、离心、差异溶解或或其它的用于蛋白纯化的标准技术。

5.4 预防与治疗方法

本发明包括基于抗体的治疗，其包括向动物，优选向哺乳动物，最优选向人给予一种或多种本发明的抗体，以预防、治疗或改善与FcγRIIB的异常水平或活性有关的疾病、病症或感染的相关症状，和/或改变与FcγRIIB活性有关的免疫系统功能、或增强第二治疗性抗体的细胞毒活性、或提高疫苗组合物的效果。在一些实施方案中，给予一种或多种本发明的抗体的治疗与给予一种或多种治疗方法联合进行，所述治疗方法例如但不限于化疗、放疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗。

抗体可以以药学上可接受的组合物的形式提供，如本领域所公知或本发明所述。如下文所详细描述的那样，本发明的抗体可用于癌症的治疗方法(特别地用于增强被动免疫治疗或癌症疫苗的效果)、自体免疫性疾病、炎性疾病或过敏反应(例如，用于增强用于治疗过敏反应性疾病的疫苗的效果)中。

已经发现FcγRIIB(CD32B)在以下组织类型中表达：脂肪、b-细胞、骨、脑、软骨、结肠、内分泌腺、眼、胚胎、胃肠道、泌尿生殖器、生殖细胞、头和颈、肾脏、肺、淋巴结、淋巴网状内皮细胞、乳腺、肌肉、神经、卵巢、前列腺、胰腺小岛、垂体、胎盘、视网膜、皮肤、软组织、滑膜和子宫(数据收集自the Cancer Genome Anatomy Project of the National CancerInstitute)。因此，本发明的抗体可用于在任何这些组织中激动或拮抗FcγRIIB的活性。例如，FcγRIIB在胎盘中表达并在转运IgG至胎儿和清除免疫复合物中发挥作用(Lyden等，2001，J.Immunol.166：3882-3889)。在本发明的某些实施方案中，抗FcγRIIB抗体可用作堕胎剂。

本发明人已经惊奇地发现中性粒细胞不表达显著水平的FCγRIIB。据此，本发明提供了方法和用于此方法中的药物组合物，包括一定量的CD32-特异性抗体，该CD32-特异性抗体结合肿瘤细胞或非中性粒细胞类型，如巨噬细胞并对其具有活性，但对中性粒细胞不具有可测定的结合或可测定的活性。在某些实施方案中，本发明的抗体可用于去除CD32B⁺细胞，例如巨噬细胞或表达CD32B的肿瘤细胞。

作为疾病、病症或感染的预防性试剂和或治疗性试剂的本发明的抗体可对动物、优选哺乳动物、并最优选人给药，以治疗、预防或改善一种或多种与所述疾病、病症或感染有关的症状。本发明的抗体可与一种或多种用于治疗、预防或控制与FcγRIIB异常水平或活性有关的疾病、病症或感染，和/或改变与FcγRIIB活性有关的免疫功能的其它预防和/或治疗性试剂联合给药。在某些实施方案中，将一种或多种本发明的抗体给予哺乳动物，优选人，并同时给予一种或多种其它治疗性试剂以治疗癌症。所用术语“同时”并不限于预防性试剂或治疗性试剂在精确的相同时间给药，而是指将本发明的抗体和其它试剂相继并以一定时间间隔向个体进行给药，从而使本发明的抗体可与其它试剂共同发挥作用，以提供比以其它形式给药更好的有益效果。例如，可以同时或在不同的时间点以一定的顺序相继给予各预防或治疗性试剂；然而，如果不是同时给药，它们给药的时间应足够接近以便提供所需的治疗或预防效果。各治疗性试剂可分别地以任何合适的形式并以任何合适的途径给予。

在不同的实施方案中，所述预防性试剂或治疗性试剂以少于1小时的时间间隔、以约1小时的时间间隔、以约1小时至约2小时的时间间隔、以约2小时至约3小时的时间间隔、以约3小时至约4小时的时间间隔、以约4小时至约5小时的时间间隔、以约5小时至约6小时的时间间隔、以约6小时至约7小时的时间间隔、以约7小时至约8小时的时间间隔、以约8小时至约9小时的时间间隔、以约9小时至约10小时的时间间隔、以约10小时至约11小时的时间间隔、以约11小时至约12小时的时间间隔，以不超过24小时的时间间隔或不超过48小时的时间间隔给药。在优选的实施方案中，两种或多种组分在同一次患者访问时给予。

本发明的给药剂量和给药频率包含在术语治疗有效和预防有效中。根据每一患者的具体因素，并根据所给于的具体治疗或预防性试剂，癌症的严重性和类型，给药途径，以及年龄、体重和该患者的以往给药史，所述剂量和频率通常可以变化。本领域所属技术人员通过考虑这些因素并根据下文所述的，例如文献的报道的剂量和Physician′s Desk Reference(第56版，2002)的推荐剂量可选择合适的方案。

本发明的抗体也可有利地与其它单克隆抗体或嵌合抗体、Fc融合蛋白，或与淋巴因子、细胞因子或造血生长因子(例如，IL-2，IL-3，IL-4，IL-7，IL-10和TGF-β)联合使用，该联合会提高FcγRIIB，例如增加与所述抗体互作的效应子细胞的数量或活性并增强免疫反应。在某些实施方案中，细胞因子与抗FcγRIIB抗体轭合。

本发明的抗体也可有利地与其它一种或多种药物联合用于治疗疾病、病症或感染，该药物例如抗癌剂、抗炎剂或抗病毒剂，例如如下文5.4.6节和5.4.5节所述。

5.4.1 癌症

本发明的抗体可单独使用或与其它本领域公知的治疗性抗体联合使用以预防、抑制或降低原发性肿瘤的生长或肿瘤性细胞的转移，或者本发明的抗体可与癌免疫治疗性抗体联合使用。本发明包括联合使用本发明所述抗体与另一种治疗性抗体，通过增加治疗性抗体的效应子功能效应来加强这种免疫治疗的效果，所述效应子功能例如是ADCC、CDC、吞噬作用、调理作用等等。本发明无意受任何特定作用机制的限制，但本发明的抗体阻断FcγRIIB，优选阻断单核细胞和巨噬细胞上的FcγRIIB，并由此通过例如增强由活化的FcγR介导的肿瘤清除，来增强肿瘤特异性抗体的临床有效性，从而获得治疗收益。据此，当与另一种特异性结合癌抗原并具有细胞毒性的抗体联合给药时，本发明提供预防或治疗具有癌抗原特征的癌症的方法。本发明的抗体可用于癌症的预防或治疗，特别是提高癌抗原-特异性治疗性抗体的细胞毒活性，通过本发明的抗体增强杀伤肿瘤细胞的细胞毒活性和/或增强例如，所述治疗性抗体的ADCC活性或CDC活性。在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体与Fc融合蛋白一同给药。在特定的实施方案中，本发明的抗体，当单独给药或与细胞毒性治疗性抗体联合给药时，相对于没有给予本发明抗体治疗的原发性肿瘤的生长或癌细胞的转移，抑制或降低至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％的原发性肿瘤的生长或癌细胞的转移。在优选的实施方案中，本发明的抗体与细胞毒性治疗性抗体联合给药，相对于没有给予本发明抗体治疗的原发性肿瘤的生长或癌细胞的转移，抑制或降低至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％的原发性肿瘤的生长或癌细胞的转移。

从正常状态至恶性状态的转变是涉及遗传与外部变化的多步骤过程。事实上，许多改变发生在促进此进程的细胞调节环路上，该进程可使肿瘤细胞逃避正常调节组织稳态的终止分化和静止的命令。一些基因具有癌细胞的浸润和转移的潜能，例如CSF-1(集落刺激因子1或巨噬细胞集落刺激因子)。尽管不意欲受特定作用机制的限制，CSF-1可通过在肿瘤处聚集巨噬细胞，巨噬细胞在此处促进肿瘤进展，从而调节肿瘤进程和转移。现在认为，巨噬细胞在介导肿瘤进程和转移中，通过分泌促血管生成因子，例如胸腺嘧啶磷酸化酶、血管内皮衍生的生长因子；通过分泌生长因子，例如可作为旁分泌因子作用于肿瘤细胞的上皮生长因子，而起到调控营养并由此促进肿瘤细胞的迁出和侵入血管的作用(参见例如，Lin等，2001，J.Exp.Med.193(6)：727-739；Lin等，2002，Journal of Mammary Gland Biology andNeoplasam，7(2)：147-162；Scholl等，1993，Molecular Carcinogenesis，7：207-11；dynes等，2000，Nature Medicine，6(4)：443-446；Fidler等，1985，Cancer Research，45：4714-26)。

本发明包括利用本发明的抗体来阻断巨噬细胞介导的肿瘤细胞进程和转移。本发明的抗体特别用于发生巨噬细胞浸润的实体肿瘤的治疗。本发明的拮抗性抗体特别用于控制，例如，通过减少或去除位于肿瘤位点的巨噬细胞群，来减少或消除肿瘤细胞转移。在一些实施方案中，单独使用本发明的抗体来控制肿瘤细胞转移。尽管不意欲受特定作用机制的限制，但当单独给予时，本发明的拮抗性抗体结合巨噬细胞上的抑制性FcγRIIB并优选地减少巨噬细胞群，由此限制肿瘤细胞的进程。因为FcγRIIB优选表达在活化的单核细胞和巨噬细胞，包括肿瘤浸润的巨噬细胞上，本发明的拮抗性抗体减少或优选去除位于肿瘤位点的巨噬细胞。在一些实施方案中，本发明的抗体用于治疗以过表达CSF-1为特征的癌症，包括但不限于乳腺癌、子宫癌和卵巢癌。

本发明还包括有效清除或去除表达FcγRIIB的巨噬细胞之外的其它免疫细胞，例如，树突状细胞和B-细胞。利用本发明的抗体能够有效地消耗或去除免疫细胞，免疫细胞群减少的范围为50％、60％、70％、80％、优选90％，并最优选99％。因此，本发明的抗体单独使用或与第二抗体诸如抗肿瘤抗体、抗病毒抗体、抗微生物抗体的治疗性抗体联合使用，具有增强的治疗效果。在一些实施方案中，所述治疗性抗体对癌细胞或炎症细胞具有特异性。在其它实施方案中，所述第二抗体结合正常的细胞。尽管不意欲受特定作用机制的限制，当本发明的抗体单独用于消耗表达FcγRIIB的细胞时，所述细胞群重新分布，剩余的细胞有效地具有活化性Fc受体，从而减轻FcγRIIB的抑制。当与诸如治疗性抗体的第二抗体联合使用时，通过增强Fc-介导的该抗体的效应子功能，增强所述第二抗体的效力。

本发明的方法和组合物能够治疗或预防的癌症和相关病症包括但不限于：白血病，包括但不限于急性白血病、急性淋巴细胞白血病，急性髓性细胞白血病诸如成髓细胞、前髓细胞、髓样单核细胞、单核细胞、红白血病性白血病和骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于，慢性髓性(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于何杰金氏病、非何杰金氏病；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；Waldenstrom′s巨球蛋白血症；意义未定的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆性丙种球蛋白病；重链疾病；骨和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨组织肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤，纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤(Kaposi′ssarcoma)、脂肉瘤，淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤包括但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜细胞瘤、少突神经胶质瘤、非胶质瘤，听神经鞘瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、硬脑膜肉瘤、松果体瘤、成松果体细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳腺癌包括但不限于，腺癌、小叶小细胞癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘蛋白乳腺癌、管状乳腺癌、乳头状乳腺癌、派杰氏(Paget′s)病和炎症性乳腺癌；肾上腺癌包括但不限于嗜铬细胞瘤或肾上腺皮质癌；甲状腺癌例如但不限于乳突状或滤泡甲状腺癌、髓样甲状腺癌和间变甲状腺癌；胰腺癌包括但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、血管活性肠肽肿瘤、生长抑素分泌肿瘤和类癌或胰岛细胞肿瘤；垂体癌包括但不限于库兴氏病、催乳素分泌肿瘤、肢端巨大症及糖尿病；眼部肿瘤，包括但不限于眼黑色素瘤例如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤和睫状体黑色素瘤，和视网膜母细胞瘤；阴道癌，包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌和黑色素瘤；外阴癌，包括但不限于鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和派杰氏(Paget′s)病；宫颈癌，包括但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，包括但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌包括但不限于卵巢上皮癌、交界瘤、生殖细胞瘤和间质细胞瘤；食道癌包括但不限于鳞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌包括但不限于腺癌，真菌样(息肉状的)、成为溃疡性、表浅散布、弥散性散布，恶性淋巴瘤、脂肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；克隆氏病癌症；直肠癌；肝癌包括但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌包括但不限于腺癌；胆管癌包括但不限于乳头状、结节和弥漫性；肺癌包括但不限于非小细胞肺癌、鳞状上皮细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌包括但不限于生殖细胞瘤、精原细胞瘤，间变的、标准的(典型的)、精母细胞性非精原细胞瘤，胚胎性癌、畸胎瘤、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)；前列腺癌包括但不限于腺癌，、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；阴茎癌；口腔癌包括但不限于鳞状上皮细胞癌；基底癌；唾液腺癌包括但不限于腺癌、粘液上皮样癌和腺样囊性癌；咽癌包括但不限于鳞状上皮细胞癌和疣状癌；皮肤癌包括但不限于基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌和黑色素瘤、表浅散布黑色素瘤、结节状黑色素瘤、痣恶性黑色素瘤、肢端雀斑状黑色素瘤；肾癌包括但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和或尿道)；维尔姆氏(Wilms’)肿瘤；膀胱癌包括但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤、成骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(上述病症的综述参见Fishman等，1985，Medicine，第2版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia和Murphy等，1997，Informed Decision.The Complete Book of Diagnosis，Treatment，and Recovery，Viking Penguin，Penguin Books U.S.A.，Inc.，美国)。

因此，本发明的方法和组合物也可用于不同癌症或其它异常增生性疾病的治疗或预防，包括但不限于：发生在以下器官的癌症，包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、前列腺、胃、宫颈、甲状腺和皮肤；包括鳞状细胞癌；淋巴系造血细胞肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病，急性淋巴母细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、Berketts淋巴瘤；髓系造血细胞瘤，包括急性和慢性髓性白血病和前髓白血病；间充质来源的肿瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它的肿瘤包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间质细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肉瘤和骨肉瘤；以及其它肿瘤，包括黑色素瘤、着色干皮病xenoderma pegmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。也应考虑，由细胞凋亡异常引起的癌症也可由本发明的方法和组合物来治疗。这种癌症包括但不限于滤泡淋巴瘤、p53突变的癌症、乳腺癌的激素依赖肿瘤、前列腺癌和卵巢癌，以及癌前病变诸如家族性腺瘤息肉和骨髓异常增生综合征。具体的实施方案中，可通过本发明的方法和组合物来治疗或预防卵巢、膀胱、乳腺癌、结肠癌、皮肤、前列腺或子宫的恶性或异常增殖性改变(例如化生和发育异常)或高度增殖性疾病。在其它的具体的实施方案中，可通过本发明的方法和组合物来治疗或预防肉瘤、黑色素瘤或白血病。

可通过本发明的抗体与结合癌抗原并具有细胞毒性的抗体联合给药来治疗或预防与所述癌抗原相关的癌症。在特定的实施方案中，本发明的抗体增强癌抗原特异性抗体介导的细胞毒作用。例如，但并非限制，可通过本发明的方法和组合物治疗与以下癌抗原相关的癌症。KS1/4 pan-癌抗原(Perez和Walker，1990，J.Immunol.142：32-37；Bumal，1988，Hybridoma，7(4)：407-415)，卵巢癌抗原(CA 125)(Yu等，1991，Cancer Res.51(2)：48-475)，前列腺酸性磷酸酶(Tailor等，1990，Nucl.Acids Res.18(1)：4928)，前列腺特异性抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.10(2)：903-910；Israell等，1993，Cancer Res.53：227-230)，黑色素瘤相关抗原p97(Estin等，1989，J.Natl.Cancer Instil，81(6)：445-44)，黑色素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等，1990，J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)，高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等，1987，Cancer，59：55-3；Mittelman等，1990，J.Clin.Invest.86：2136-2144))，前列腺特异性膜抗原，癌胚抗原(CEA)(Foon等，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13：294)，多形上皮粘液素抗原、人乳脂肪球抗原、直肠结肠肿瘤相关抗原如CEA，TAG-72(Yokata等，1992，Cancer Res.52：3402-3408)，CO17-1A(Ragnhammar等，1993，Int.J.Cancer，53：751-758)；GICA 19-9(Herlyn等，1982，J.Clin.Immunol.2：135)，CTA-I和LEA，Burkitt′s淋巴瘤抗原-38.13，CD19(Ghetie等，1994，Blood，83：1329-1336)，人B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等，1994，Blood，83：435-445)，CD33(Sgouros等，1993，J.Nucl.Med.34：422-430)，黑色素瘤特异性抗原例如神经节苷脂GD2(Saleh等，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)，神经节苷脂GD3(Shitara等，1993，Cancer Immunol.Immunother.36：373-380)，神经节苷脂GM2(Livingston等，1994，J.Clin.Oncol.12：1036-1044)，神经节苷脂GM3(Hoon等，1993，Cancer Res.53：5244-5250)，细胞表面抗原的肿瘤特异性移植型(TSTA)例如病毒诱导的肿瘤抗原包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原，癌胚抗原例如甲胎蛋白、克隆氏病的CEA、膀胱肿瘤癌胚抗原(Hellstrom等，1985，Cancer.Res.45：2210-2188)，分化抗原例如人肺癌抗原L6、L20(Hellstrom等，1986，Cancer Res.46：3917-3923)，纤维肉瘤抗原、人白血病T细胞抗原Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等，1988，J.of Immun.141：1398-1403)，神经糖蛋白、神经鞘脂类，乳腺癌抗原诸如EGFR(上皮生长因子受体)、HER2抗原(p185^HER2)，多形上皮粘液素(PEM)(Hilkens等，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17：359)，恶性人淋巴细胞抗原-APO-1(Bernhard等，1989，Science，245：301-304)，分化抗原(Feizi，1985，Nature，314：53-57)诸如在胚胎红细胞和原始内胚层发现的I型抗原、在胃腺癌中发现的I(Ma)、乳腺上皮中发现的M18和M39、髓样细胞中发现的SSEA-I、在结肠直肠癌中发现的VEP8、VEP9、MyI、VIM-D5和D₁56-22，结肠腺癌中发现的C14、TRA-1-85(H型血)，肺腺癌中发现的F3，在胃癌中发现的AH6，Y半抗原，胚胎性癌发现的Le^y，TL5(A型血)，A431细胞中发现的EGF受体，在前列腺癌中发现的E₁系列(B型血)，在胚胎性癌细胞和胃腺癌中发现的FC 10.2，在腺癌中发现的CO-514(Le^a型血)，在腺癌中发现的NS-10、CO-43(Le^b型血)、G49，在结肠腺癌中发现的EGF受体，(ALe^b/Le^y型血)，在结肠腺癌中发现的19.9，胃癌粘液素，在髓样细胞细胞中发现的T₅A₇，在黑色素瘤中发现的R₂₄，4.2、G_D3、D1.1、OFA-1、G_M2、OFA-2、G_D2，在胚胎癌性细胞中发现的M1：22：25：8，在4-8-细胞阶段胚胎中发现的SSEA-3、SSEA-4。在另一实施方案中，所述抗原为来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生肽(参见Edelson，1998，The Cancer Journal，4：62)。

本发明的抗体可与任何本领域公知的治疗性癌抗体联合以增强治疗效果。例如，本发明的抗体可与任何表7所列的抗体一起使用，这些抗体已经被证明在癌症治疗中有治疗作用。通过增强至少一种所述治疗癌抗体的抗体介导的效应子功能，本发明的抗体增强了治疗癌抗体的治疗效果。在特定的实施方案中，通过增强所述治疗癌抗体的补体依赖性级联反应，本发明抗体增强治疗效果。在本发明的另一实施方案中，通过增强对靶肿瘤细胞的吞噬作用和调理作用，本发明的抗体增强治疗效果。在本发明的另一实施方案中，在破坏靶肿瘤细胞的过程中通过加强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(“ADCC”)，本发明抗体增强治疗效果。

本发明的抗体可与基于胞嘧啶-鸟嘌呤双核苷酸(″CpG″)的产品联合使用，该产品作为先天和获得性免疫反应的激活剂已被开发(ColeyPharmaceuticals)或正在开发。例如，本发明包括CpG 7909，CpG 8916，CpG8954(Coley Pharmaceuticals)在用于治疗和/或预防癌症的方法和组合物中的用途(也参见Warren等，2002，Semin Oncol.，29(1 Suppl 2)：93-7；Warren等，2000，Clin Lymphoma，1(1)：57-61，本发明将其全部引入作为参考)。

本发明的抗体可与不通过细胞杀伤来介导其治疗作用的治疗性抗体联合使用来增强抗体的治疗活性。在具体的实施方案中，本发明包括联合使用本发明所述抗体与具有激动活性的治疗性诱导凋亡的抗体。例如，抗Fas抗体。抗Fas抗体是本领域公知的，包括例如Jo2(Ogasawara等，1993，Nature，364：806)和HFE7(Ichikawa等，2000，Int.Immunol.12：555)。尽管不意欲受特定作用机制的限制，FcγRIIB参与了促进抗Fas介导的细胞凋亡中，参见例如，Xu等，2003，Journal of Immunology，171：562-568。事实上，FcγRIIB的胞外区可用作Fas受体的交联剂，形成功能复合物，并促进Fas依赖的细胞凋亡。在一些实施方案中，本发明的抗体阻断抗Fas抗体与FcγRIIB的相互作用，导致Fas-介导的凋亡活性降低。导致Fas-介导的凋亡活性降低的本发明抗体与具有不良副作用例如肝中毒的抗Fas抗体联合使用特别有益。在其它实施方案中，本发明抗体增强抗Fas抗体与FcγRIIB的相互作用，导致Fas-介导的凋亡活性增强。本发明的抗体与具有激动活性的治疗性凋亡诱导抗体的结合，具有增强的治疗效果。

用于本发明方法的治疗性凋亡诱导抗体可以是任何本领域公知的调节凋亡途径的死亡受体，例如TNFR受体家族特异性抗体，。

本发明提供了治疗凋亡介导信号减弱的疾病，例如，癌症、自体免疫性疾病的方法。在特定的实施方案中，本发明包括治疗Fas-介导凋亡有缺陷的疾病的方法，所述方法包括与抗Fas抗体联合给予本发明的抗体。

在一些实施方案中，本发明的激动性抗体特别用于非造血来源的肿瘤的治疗，包括黑色素瘤细胞肿瘤。尽管不意欲受特定作用机制的限制，本发明激动抗体的效力部分归因于FcγRIIB抑制途径的活化，因为非造血来源的肿瘤，包括黑色素瘤细胞肿瘤表达FcγRIIB。事实上，最近的试验证明，在黑色素瘤细胞中FcγRIIB的表达通过以细胞浆内依赖的方式与抗肿瘤抗体的直接相互作用(例如，通过结合抗肿瘤抗体的Fc区)，调节肿瘤生长(Cassard等，2002，Journal of Clinical Investigation，110(10)：1549-1557)。

在一些实施方案中，本发明包括本发明的抗体与治疗性抗体的联合应用，该治疗性抗体免疫特异性结合肿瘤抗原，该肿瘤抗原不在所述肿瘤细胞本身表达但在周围反应性和包括肿瘤基质的肿瘤支持性非恶性细胞中表达。所述肿瘤基质包括内皮细胞形成的新血管和环绕肿瘤脉管系统的基质成纤维细胞。在特定的实施方案中，本发明的抗体与免疫特异性结合内皮细胞肿瘤抗原的抗体联合使用。在优选的实施方案中，本发明的抗体与免疫特异性结合成纤维细胞上肿瘤抗原的抗体联合使用，例如，成纤维细胞活化蛋白(FAP)。FAP为95Kda同源二聚体II型糖蛋白，其在许多实体肿瘤的基质成纤维细胞中高度表达，包括但不限于肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌。(参见例如，Scanlan等，1994；Proc.Natl.Acad.USA，91：5657-61；Park等，1999，J.Biol.Chem.，274：36505-12；Rettig等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：3110-3114；Garin-Chesea等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：7235-7239)。免疫特异性结合FAP的抗体是本领域公知的并包括在本发明之中，参见例如，Wuest等，2001，Journal of Biotechnology，159-168；Mersmann等，2001，Int.J.Cancer，92：240-248；美国专利6,455,677，本发明将其全部引入作为参考。

最近，IgE被证明可作为肿瘤生长的调节剂，并且事实上IgE-靶定的快速超敏和过敏性炎症性应已经被提出是参与抗肿瘤反应的天然机制(综述参见例如，Mills等，1992，Am.Journal of Epidemiol.122：66-74；Eriksson等，1995，Allergy，50：718-722)。事实上，最近的研究表明，加载IgE的肿瘤细胞会减慢生长，有时导致肿瘤的排斥。根据该研究，IgE加载的肿瘤细胞不仅具有治疗潜能而且表现长期的抗肿瘤免疫，包括先天免疫效应子的活化和T细胞介导过继性免疫反应，参见Reali等，2001，Cancer Res.61：5516-22；本发明将其全部引入作为参考。本发明的拮抗性抗体与IgE的给药联合可用于治疗和/或预防癌症，以增强IgE-介导的癌症治疗效果。尽管不意欲受特定作用机制的限制，本发明的抗体通过阻断抑制途径增强IgE的肿瘤治疗疗效。本发明的拮抗性抗体通过以下途径可增强IgE介导的癌症治疗的疗效，(i)增强肿瘤生长延缓的作用；(ii)增强肿瘤进展减慢的作用；(iii)增强肿瘤排斥；或(iv)相对于单独用IgE治疗癌症，增强保护性免疫。

癌症治疗性试剂及其剂量、给药途径和建议的用法是本领域公知的并如文献所述，参见例如，Physician′s Desk Reference(第56版，2002，本发明将其引入作为参考)。

5.4.1.1 B细胞恶性肿瘤

本发明包括对动物、优选哺乳动物、并最优选人给予抗FcγRIIB抗体的治疗，以预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或其一种或多种症状。这些治疗相是对现行治疗的加强。在某些病例中，对现行治疗有抗性的患者可接受本发明方法的治疗。在一些实施方案中，通过给予一种或多种本发明抗体的治疗与一种或多种例如但不限于化疗、放射性治疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗的治疗联合。

本发明包括对B细胞恶性肿瘤或其一种或多种症状的治疗方案，其提供比现行的单一试剂治疗或组合治疗更好的预防和治疗特性。本发明提供以FcγRIIB抗体为基础的治疗，从而预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或其一种或多种症状的。特别是，本发明提供预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或其一种或多种症状的预防和治疗方案，包括对需要的个体给予FcγRIIB-特异性抗体、其类似物、衍生物或抗原片段。

本发明的激动性抗体可用于治疗或预防任何B细胞恶性肿瘤、特别是非何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。其它的B细胞恶性肿瘤包括小淋巴细胞淋巴瘤，Burkitt′s淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、弥散性小裂细胞淋巴瘤、大多数滤泡性淋巴瘤和一些弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在恶性淋巴瘤中，特别是在B-细胞非何杰金氏淋巴瘤中，FcγRIIB是染色体移位导致反常的靶点，(参见Callanan M.B.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97(1)：309-314)。因此，本发明的抗体用于治疗或预防任何B细胞系的慢性淋巴细胞白血病。B细胞系的慢性淋巴细胞白血病参见Freedman的综述(参见综述，Freedman，1990，Hemtaol.Oncol.Clin.North Am.4：405)。尽管不意欲受特定作用机制的限制，本发明的激动性抗体通过抑制B细胞增殖和/或活化抑制或防止B细胞恶性肿瘤。本发明还包括本发明的激动性抗体与其它本领域公知的治疗(例如，化疗和放疗)的联合应用，以预防和/或治疗B细胞恶性肿瘤。本发明还包括本发明的激动性抗体与其它本领域公知的预防和/或治疗B细胞恶性肿瘤的抗体联合应用。例如，本发明的激动性抗体可与抗C22或如Goldenberg等人所述的抗CD19抗体(美国专利6,306,393)、抗CD20抗体、抗CD33抗体或抗CD52抗体联合应用。

本发明的抗体也可与例如但不限于Oncoscint(靶标：CEA)，Verluma(靶标：GP40)，Prostascint(靶标：PSMA)，CEA-SCAN(靶标：CEA)，Rituxin(靶标：CD20)，赫赛汀(靶标：HER-2)，Campath(靶标：CD52)，Mylotarge(靶标：CD33)，LymphoCide(CD22)，Lymphocide Y-90(CD22)和Zevalin(靶标：CD20)联合使用。

5.4.2 自体免疫性疾病和炎性疾病

本发明的激动性抗体可用于治疗或预防自体免疫性疾病或炎性疾病。本发明提供预防、治疗或控制个体中与自体免疫性疾病或炎性疾病相关的一种或多种症状的方法，包括对所述的个体给予治疗有效量的本发明抗体或其片段。本发明还提供预防、治疗或控制个体中与炎性疾病相关的一种或多种症状的方法，进一步包括对所述的个体给予治疗有效量的一种或多种抗炎制剂的给药。本发明还提供预防、治疗或控制个体中与自体免疫性疾病相关的一种或多种症状的方法，进一步包括给予所述个体治疗有效量的一种或多种免疫调节制剂。5.4.5节提供了非限制性的抗炎制剂和免疫调节制剂的例子。

本发明的抗体还可与本领域公知的用于治疗和/或预防自体免疫性疾病或炎性疾病的抗体联合应用。用于治疗或预防炎性疾病的所述抗体或Fc融合蛋白的非限制性例子如表6A所示，用于治疗或预防自体免疫性疾病的所述抗体或Fc融合蛋白的非限制性例子如表6B所示。本发明的抗体可例如，增强如表6A和6B所示的治疗性抗体或Fc融合蛋白的疗效。例如，但非限制，本发明的抗体可增强用表6A和6B所示抗体或Fc融合蛋白治疗的个体的免疫反应。

本发明的抗体还可与例如但非限制Orthoclone OKT3、ReoPro、Zenapax、Simulec、利妥昔单抗(Rituximab)、Synagis和Remicade联合使用。

本发明的抗体还可与基于胞嘧啶-鸟嘌呤双核苷酸(″CpG″)的产品联合使用，该产品作为先天和获得性免疫反应的促进剂已被开发(ColeyPharmaceuticals)或正在开发。例如，本发明包括在本发明治疗和/或预防自身免疫学疾病或炎性疾病的方法和组合物中使用CpG 7909，CpG 8916，CpG8954(Coley Pharmaceuticals)(Warren等，2002，Semin Oncol.，29(1 Suppl 2)：93-7；Warren等，2000，Clin Lymphoma，1(1)：57-61，本发明将其全部引入作为参考)。

通过给予本发明的抗体来治疗的自体免疫性疾病的例子包括但不限于，局限性脱发、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自体免疫性阿狄森氏病、肾上腺的自体免疫性疾病、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性肝炎、自体免疫性卵巢炎和睾丸炎、自体免疫性血小板减少症、贝切特氏病(Behcet′sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、腹部炎性皮炎(celiac sprue-dermatitis)、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)，慢性炎症脱髓鞘性多神经病、丘-施二氏综合征、疤痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、自发混合的冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯氏病、Guillain-Barre、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA神经病变、幼年型关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、梅尼尔氏病(Meniere′s disease)、混合性结缔组织病、多发性硬化症、I型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性软骨炎(polychrondritis)，多腺体综合征、风湿性多肌病、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏征、莱特尔氏综合征(Reiter′s syndrome)、类风湿性关节炎，伯克氏肉样瘤、硬皮病、干燥角膜结膜炎综合征、强直人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、短暂性动脉炎/巨细胞关节炎、溃疡性结肠炎、眼色素膜炎、诸如疱疹样皮炎血管炎的血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)。炎性疾病的例子包括但不限于，哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、过敏反应性疾病、败血症性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节病、未分化的关节病、关节炎、炎症性骨质溶解和慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症。如3.1节所述，一些自体免疫性疾病与炎症性病症有关。因此，应考虑自体免疫性疾病与炎性疾病的重叠。所以一些自体免疫性疾病可以炎性疾病为特征。可通过本发明的方法预防、治疗或控制的炎性疾病的例子包括但不限于，哮喘、脑炎，炎性肠病、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、过敏反应性疾病、败血症性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节病、未分化的关节病、关节炎、炎症性骨质溶解和慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症。

在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体可用于治疗有性别偏好的自体免疫性疾病。例如在女性中Graves′疾病的发病与FcγRIIB2的表达相关(参见Estienne等，2002，FASEB J.16：1087-1092)。

本发明的抗体还可用于减轻患有炎性疾病的动物、特别是哺乳动物的炎症。在特定的实施方案中，相对于没有给予抗体的动物中的炎症，所述抗体减轻动物炎症的至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或者至少10％。在另一实施方案中，相对于没有给予抗体的动物中的炎症，抗体的组合减轻动物炎症的至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或者至少10％。

表6A用于炎性疾病和自体免疫性疾病并可与本发明的抗体联合使用的抗体。

抗体名称	靶抗原	产品类型	同种型	生产商	适应症
						5G1.1	补体(C5)	人源化	IgG	Alexion Pharm Inc	类风湿性关节炎
5G1.1	补体(C5)	人源化	IgG	Alexion Pharm Inc	SLE
						5G1.1	补体(C5)	人源化	IgG	Alexion Pharm Inc	肾炎
5G1.1-SC	补体(C5)	人源化	ScFv	Alexion Pharm Inc	CardiopulmanoBypass
						5G1.1-SC	补体(C5)	人源化	ScFv	Alexion Pharm Inc	心肌梗塞

5G1.1-SC	补体(C5)	人源化	ScFv	Alexion Pharm Inc	血管成型术
						ABX-CBL	CBL	人		Abgenix Inc	GvHD
ABX-CBL	CD147	鼠	IgG	Abgenix Inc	同种异体移植物排斥
						ABX-IL8	IL-8	人	IgG2	Abgenix Inc	牛皮癣
Antegren	VLA-4	人源化	IgG	Athena/Elan	多发性硬化症
						抗CD11a	CD11a	人源化	IgG1	GenentechInc/Xoma	牛皮癣
抗CD18	CD18	人源化	Fab′2	Genentech Inc	心肌梗塞
						抗LFA1	CD18	鼠	Fab′2	Pasteur-Merieux/Immunotech	同种异体移植物排斥
Antova	CD40L	人源化	IgG	Biogen	同种异体移植物排斥
						Antova	CD40L	人源化	IgG	Biogen	SLE
BTI-322	CD2	大鼠	IgG	Medimmune Inc	GvHD，牛皮癣
						CDP571	TNF-α	人源化	IgG4	Celltech	克罗恩氏病
CDP571	TNF-α	人源化	IgG4	Celltech	类风湿性关节炎
						CDP850	E-选择素	人源化		Celltech	牛皮癣
Corsevin M	Fact VII	嵌合		Centocor	抗凝血剂
						D2E7	TNF-α	人		CAT/BASF	类风湿性关节炎
Hu23F2G	CD11/18	人源化		ICOS Pharm Inc	多发性硬化症
						Hu23F2G	CD11/18	人源化	IgG	ICOS Pharm Inc	中风
IC14	CD14			ICOS Pharm Inc	中毒性休克
						ICM3	ICAM-3	人源化		ICOS Pharm Inc	牛皮癣
IDEC-114	CD80	Primatised		IDECPharm/Mitsub ishi	牛皮癣
						IDEC-131	CD40L	人源化		IDEC Pharm/Eisai	SLE
IDEC-131	CD40L	人源化		IDEC Pharm/Eisai	多发性硬化症
						IDEC-151	CD4	Primatised	IgG1	IDECPharm/GlaxoSmithKline	类风湿性关节炎
IDEC-152	CD23	Primatised		IDEC Pharm	哮喘/过敏反应
						Infliximab	TNF-α	嵌合	IgG1	Centocor	类风湿性关节炎
Infiximab	TNF-α	嵌合	IgG1	Centocor	克罗恩氏病
						LDP-01	β2-整合素	人源化	IgG	Millennium Inc(LeukoSite Inc.)	中风
LDP-01	β2-整合素	人源化	IgG	Millennium Inc(LeukoSite Inc.)	同种异体移植物排斥

						LDP-02	α4β7	人源化		Millennium Inc(LeukoSite Inc.)	溃疡性结肠炎
MAK-195F	TNFα	鼠	Fab′2	Knoll PharmBASF	中毒性休克
						MDX-33	CD64(FcR)	人		Medarex/Cent eon	自体免疫性造血性疾病
MDX-CD4	CD4	人	IgG	Medarex/Eisai/Genmab	类风湿性关节炎
						MEDI-507	CD2	人源化		Medimmune Inc	牛皮癣
MEDI-507	CD2	人源化		Medimmune Inc	GvHD
						OKT4A	CD4	人源化	IgG	Ortho Biotech	同种异体移植物排斥
OrthoCloneOKT4A	CD4	人源化	IgG	Ortho Biotech	自体免疫性疾病
						Orthoclone/抗CD3 OKT3	CD3	鼠	mIgG2a	Ortho Biotech	同种异体移植物排斥
RepPro/阿昔单抗(Abciximab)	gpIIbIIIa	嵌合	Fab	Centocor/Lilly	冠状动脉血管成形术并发症
						rhuMab-E25	IgE	人源化	IgG1	Genentech/Novartis/TanoxBiosystems	哮喘/过敏反应
SB-240563	IL5	人源化		Glaxo Smith Kline	哮喘/过敏反应
						SB-240683	IL-4	人源化		Glaxo Smith Kline	哮喘/过敏反应
SCH55700	IL-5	人源化		Celltech/Schering	哮喘/过敏反应
						Simulect	CD25	嵌合	IgG1	Novartis Pharm	同种异体移植物排斥
SMARTa-CD3	CD3	人源化		Protein Design Lab	自体免疫性疾病
						SMARTa-CD3	CD3	人源化		Protein Design Lab	同种异体移植物排斥
SMARTa-CD3	CD3	人源化	IgG	Protein Design Lab	牛皮癣
						Zenapax	CD25	人源化	IgG1	Protein DesignLab/Hoffman-LaRoche	自体免疫性疾病

表6B.用于自体免疫性疾病的抗体和Fc融合蛋白

抗体

指征

靶抗原

ABX-RB2		针对T细胞、B细胞和NK细胞上的CBL抗原的抗体来自转基因鼠(Xenomouse)的全人抗体
			IL1-ra	类风湿性关节炎	重组抗炎症蛋白
sTNF-RI	慢性炎性疾病类风湿性关节炎	可溶性肿瘤坏死因子a-受体I型阻断TNF作用
			5c8(抗CD-40配体抗体)	II期临床试验在99年10中止，检测“不良反应”	CD-40
IDEC 131	系统性红斑狼疮(SLE)	抗CD40人源化
			IDEC 151	类风湿性关节炎	灵长源的；抗CD4
IDEC 152	哮喘	灵长源的；抗CD23
			IDEC 114	牛皮癣	灵长源的；抗CD80
MEDI-507	类风湿性关节炎；多发性硬化症；克罗恩氏病；牛皮癣	抗CD2
			LDP-02(抗b7mAb)	炎症性肠病；克罗恩氏病；溃疡性结肠炎	白细胞上a4b7整合素受体
SMART抗γ干扰素抗体	自体免疫性疾病	抗γ干扰素
			Verteportin	类风湿性关节炎
Thalomid(沙利度胺)	麻风病-已批准投放市场；克罗恩氏病；类风湿性关节炎	肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂
			SeICIDs(选择性细胞因子抑制药物		磷酸二酯酶4型酶(PDE-4)高度特异性抑制剂增加cAMP(环腺苷一磷酸)水平活化蛋白疾病A(PKA)阻断转录因子NK-kB防止TNF-a基因转录减少TNF-a产生
IMiDs(免疫调节药物)	一般自体免疫性疾病	沙利度胺抑制的TNF-a的结构类似物
			MDX-33	自体免疫性反应引起的血液疾病；先天性血小板减少症Purpurea(ITP)；自体免疫性溶血性贫血	抗FcRI受体的单克隆抗体
MDX-CD4	治疗类风湿性关节炎和其它自体免疫性疾病	抗CD4受体分子的单克隆抗体
			VX-497	自体免疫性疾病；多发性硬化症；类风湿性关节炎；炎	次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶抑制剂(淋巴细胞增殖制备所需核

	症性肠病；狼疮；牛皮癣	苷酸中使用，产生新RNA和DNA所需要的酶)
			VX-740	类风湿性关节炎	ICE抑制剂白介素-1β抑制剂(转化酶，控制导致攻击性免疫反应的途径并调节细胞因子)
VX-745	对炎症特异参与免疫反应发作和炎症进程的化学信号	P38MAP激酶、有丝分裂原活化蛋白激酶抑制剂
			Enbrel(etanercept)		靶向TNF(肿瘤坏死因子)
IL-8		抗IL-8的全人MAB(白介素8)(阻断IL-8阻断炎性反应)
			5G1.1	类风湿性关节炎类天疱疮(危险的皮疹)牛皮癣狼疮	补体C5抑制剂
Apogen MP4		重组抗原选择性破坏疾病相关T-细胞的诱导细胞凋亡通过程序性细胞死亡来去除T-细胞，不再攻击机体自身细胞特异性凋亡原(apogens)靶向特异性T细胞

5.4.3 过敏反应

本发明提供治疗或预防个体的IgE-介导的和或FcγRI介导的过敏反应性疾病的方法，包括给予所述个体治疗有效量的本发明的激动性抗体或其片段。尽管不意欲受特定作用机制的限制，本发明的抗体可用于抑制FcεRI-诱导的导致急性和晚期的过敏反应的肥大细胞活化(Metcalfe D.等，1997，Physiol.Rev.77：1033)。优选地，与本领域治疗和/或预防IgE介导的过敏反应病症的常规方法比较，本发明的激动性抗体具有增强的疗效和/或降低的副作用。用于治疗和/或预防IgE介导的过敏反应病症的常规方法包括但不限于，抗炎症药物(例如，对于哮喘，口服和吸入皮质类固醇)，抗组胺药(例如，用于过敏性鼻炎和特应性皮炎)，半胱氨酰白(细胞)三烯类(例如，用于治疗哮喘)；抗IgE抗体；以及具体的免疫治疗或脱敏治疗。

IgE-介导的过敏反应的例子包括但不限于，哮喘、过敏性鼻炎、胃肠道过敏、嗜曙红细胞增多症、结膜炎、特应性皮炎、风疹、过敏性休克，或肾小球肾炎。

本发明包括分子，例如免疫球蛋白，其被工程化而与FcγRI和人FcγRIIB形成复合物，即特异性结合FcγRI和人FcγRIIB。优选地，这种分子对IgE和FcγRI-介导的病症具有治疗效果。尽管不意欲受特定作用机制的限制，这些工程化分子的治疗效果部分归因于其抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞的功能。

在具体的实施方案中，特异性结合FcγRI和人FcγRIIB的分子含有FcγRI结合位点和FcγRIIB结合位点的嵌合融合蛋白，。这种分子可根据本领域所属技术人员公知的标准重组DNA方法被工程化。在优选的具体的实施方案中，用于本发明方法的嵌合融合蛋白包括本发明的抗FcγRIIB单克隆抗体的F(ab′)单链，其与一桥区域连接而在C末端与huFcγ融合。用于本发明的方法的一个示例性嵌合融合蛋白包括：V_L/C_H(FcγRIIB)-铰链区-V_H/C_H(FcγRIIB)-接头-C_Hε2-C_Hε3-C_кε4。用于所述嵌合分子的接头可以是5、10、优选15个氨基酸长度。所述接头的长度可以不同以优化所述分子与FcγRIIB和FcγRI的结合。在具体实施方案中，所述接头为15个氨基酸的接头，由序列(Gly₄Ser)₃组成。尽管不意欲受特定作用机制的限制，柔性肽接头可促进链的配对和最大减少可能的再折叠，并使得所述的嵌合分子到达所述两种受体，即细胞上的FcγRIIB和FcγRI并将其交联。优选地，将所述的嵌合分子克隆至哺乳动物表达载体，例如，pCI-neo，含匹配的启动子，例如，巨细胞病毒启动子。根据本发明的方法制备的所述融合蛋白可包含FcεRI(CHε2CHε3)和FcγRIIB(VL/CL，-铰链区-VH/CH)的结合位点。根据本发明的方法制备的编码所述融合蛋白的核酸优选被转染入293细胞，所分泌的蛋白可通过本领域公知的常规方法来纯化。

可利用本领域所属技术人员公知的用于测定与FcγR结合的常规方法来评价所述嵌合分子对人FcεRI和FcγRIIB结合。优选地，例如通过抑制抗原驱动的脱颗粒和抑制细胞的活化，本发明的嵌合分子在治疗IgE介导的病症中具有治疗效果。在用于人类之前，可在转基因小鼠中测定本发明的嵌合分子在阻断IgE驱动的FcεRI-介导的肥大细胞脱颗粒的效果，该转基因小鼠被工程化以表达人FcεRα和人FcγRIIB。

本发明提供了双特异性抗体在IgE-介导的和/或FcγRI-介导的过敏反应性病症治疗和/或预防中的用途。双特异性抗体(BsAb)结合两种不同的通常位于不同抗原上的抗原表位。BsAb具有潜在的临床应用并已经用于靶向病毒，特别是感染细胞和细菌病原体，以及向血凝块传输5-羟色胺剂(Cao Y.，1998，Bioconj.Chem，9：635-644；Koelemij等，1999，J.Immunol.，22，514-524；Segal等，Curr.Opin.Immunol，11，558-562)。BsIgG和其它相关双特异性分子的制备技术是已有的(参见例如，Carter等，2001，J.of Immunol.Methods，248，7-15；Segal等，2001，J.of Immunol.Methods，248，7-15，本发明将其全部引入作为参考)。本发明提供双特异性抗体，其含有抗FcγRIlB抗体的一个F(ab′)和一种已有的单克隆抗huIgE抗体的F(ab′)，其在同一细胞的表面聚集两种受体FcγRIIB和FcεRI。可采用本领域公知的和本发明公开的任何方来产生用于本发明方法的双特异性抗体。在特定的实施方案中，如上所述，可通过化学交联抗FcγRIlB抗体的F(ab’)片段和抗huIgE抗体来产生BsAb，参见例如，Glennie等，1995，Tumor Immunobiology，Oxford University press，Oxford，p.225；本发明将其全部引入作为参考)。通过胃蛋白酶的有限蛋白水解和巯基乙醇胺还原来提供具有游离铰链区巯基(SH)的Fab′片段，制备F(ab’)片段。可用过量的邻苯二马来酰亚胺(O-PDM)烷基化在一个Fab′(SH)片段的SH，以提供游离的马来酰亚胺基(mal)。可以适当的比例组合两种制备的Fab′(mal)和Fab′(SH)，优选以1∶1比例产生异源二聚构建体。可以通过本领域所属技术人员公知的方法用分子排阻层析纯化该BsAb，并用HPLC来表征。

特别是，本发明涉及包含第一重链-轻链对和第二重链-轻链对的双特异性抗体，所述第一重链-轻链对结合FcγRIIB，其亲和性高于所述重链-轻链对结合FcγRIIA的亲和性，所述第二重链-轻链对结合IgE受体，条件是，所述第一重链-轻链对首先结合FcγRIIB。本发明的双特异性抗体可利用本领域公知的方法来工程化以保证对FcγRIIB结合先于对IgE受体的结合。本领域所属技术人员应理解，工程化所述的双特异性抗体，例如，从而使所述的双特异性抗体结合FcγRIIB的亲和性高于所述抗体结合IgE受体的亲和性。此外，可通过本领域公知的技术工程化所述双特异性抗体，例如通过添加接头从而使所述抗体的铰链区长度增加，使所述双特异性抗体具有柔韧性以在同一细胞上结合所述IgE受体和FcγRIIB受体。

本发明的抗体也可与其它本领域公知用于治疗和预防IgE-介导的过敏反应性病症的治疗性抗体或药物联合使用。例如，本发明的抗体可与以下药物任意联合使用：氮卓斯汀(azelastine)、氮卓斯汀喷雾剂(Astelin)、倍氯美松双丙酸酯吸入剂、二丙酸倍氯米松制剂(Vanceril)、倍氯美松双丙酸酯鼻吸入剂/喷雾剂、Vancenase、伯克纳(Beconase)的布地奈德(budesonide)鼻吸入剂/喷雾剂、雷诺考特的西替立嗪(Rhinocort cetirizine)、仙特明的氯苯那敏(Zyrtec chlorpheniramine)，假麻黄碱(pseudoephedrine)、Deconamine、盐酸伪麻黄碱(Sudafed)、色甘酸钠(cromolyn)、Nasalcrom，、色甘酸钠(Intal)、Opticrom、地氯雷他定(desloratadine)、Clarinex、非索非那定(fexofenadine)和假麻黄碱、Allegra-D、非索非那定、Allegra去氟肤轻松鼻喷雾剂、鼻松丙酸氟替卡松鼻吸入剂/喷雾剂(Nasalide fluticasone propionate nasalinhaler/spray)、丙酸氟替卡松口腔吸入剂(Flonase fluticasone propionate oralinhaler)、Flovent、安他乐(hydroxyzine)、羟嗪口服剂(Vistaril)、Ataraxloratadine、假麻黄碱、克敏能(Claritin-D)、氯雷他定(loratadine)、克敏能(Claritin)、强的松龙(prednisolone)、Prednisolone、泼尼松磷酸钠口服液(Pediapred Oral Liquid)、美卓乐泼尼松(Medrol prednisone)、去氢可的松(Deltasone)、液态Predsalmeterol、施立稳的曲安奈德吸入剂(Sereventtriamcinolone acetonide inhaler)、Azmacortd曲安缩松鼻吸入剂/喷雾剂、Nasacort或NasacortAQ。本发明的抗体可与基于胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(″CpG″)的产品联合使用，该CpG已被开发(Coley Pharmaceuticals)或目前正在被开发作为先天和获得性免疫反应的活化剂。例如，本发明包括在治疗和/或预防IgE-介导的过敏反应性疾病的本发明方法和组合物中使用CpG7909、CpG 8916、CpG 8954(Coley Pharmaceuticals)(也参见Weeratna等，2001，FEMS Immunol Med Microbiol，32(1)：65-71，本发明将其引入作为参考)。

本发明包括本发明的抗体与其它本领域公知的用于治疗过敏性疾病的任何治疗性抗体联合使用，例如，Xolai^TM(Omalizumab；Genentech)；rhuMAB-E25(BioWorld Today，1998年11月10日，p.1；Genentech)；CGP-51901(人源化抗IgE抗体)等等。

此外，本发明包括本发明的抗体与其它用于治疗过敏性疾病的组合物的联合使用。特别是，如Carson等人(US 6,426,336、US 2002/0035109A1、US 2002/0010343)公开的方法和组合物，本发明将其全部引入作为参考。

5.4.4 免疫调节剂和抗炎剂

本发明的方法提供自体免疫性疾病和炎性疾病的治疗方法，包括本发明的抗体与其它治疗性试剂的联合给药。免疫调节剂的例子包括但不限于，methothrexate、ENBREL、REMICADE^TM、来氟米特(leflunomide)、环磷酰胺、环胞素A和大环内酯类抗生素(例如，FK506(他克莫司))、甲基强地松龙(MP)、皮质激素、类固醇、霉酚酸酯、雷怕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那(brequinar)、malononitriloamindes(例如，来氟米特)、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。

抗炎剂已证明能成功地治疗炎症和自体免疫性疾病治疗，是目前这些疾病的常规和标准治疗方法。本领域所属技术人员公知的任何抗炎剂可用于本发明的方法中。抗炎剂的非限制性例子包括非甾体抗炎药(NSAID)、甾体抗炎药、β激动剂、anticholingeric试剂和甲基黄嘌呤。NSAID的例子包括但不限于阿司匹林、布洛芬、塞来考昔(CELEBREX^TM)、双氯芬酸(VOLTAREN^TM)、依托度酸(LODINE^TM)、非诺洛芬(NALFON^TM)、吲哚美辛(INDOCIN^TM)、酮咯酸(ketoralac(TORADOL^TM))、噁丙嗪(DAYPRO^TM)、萘丁美酮(RELAFEN^TM)、舒林酸(CLINORIL^TM)，tolmentin(TOLECTIN^TM)、罗非考昔(VIOXX^TM)、甲氧萘丙酸(ALEVE^TM，NAPROSYN^TM)、酮洛芬(ACTRON^TM)和萘普酮(RELAFEN^TM)。这种NSAID通过抑制环氧化酶(例如，COX-I和/或COX-2)来发挥作用。甾体抗炎药的例子包括但不限于，糖皮质激素、地塞米松(DECADRON^TM)、考的松、氢化可的松、泼尼松(DELTASONE^TM)、强的松龙、去炎松(triamcinolone)、柳氮磺吡啶和诸如前列腺素、血栓素和白三烯。

5.4.5 抗癌剂和治疗性抗体

在具体的实施方案中，本发明的方法包括给予一种或多种血管生成抑制剂，例如但不限于：血管他丁(纤溶酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III；Angiozyme；ABT-627；Bay 12-9566；Benefm；贝伐单抗Bevacizumab；BMS-275291；软骨衍生的抑制因子(CDI)；CAI；CD59补体片段；CEP-7055；Col 3；考布他汀A-4(Combretastatin A4)；内皮他丁(Endostatin，胶原XVIII片段)；EGFr阻断剂/抑制剂(Iressa^，Tarceva^，Erbitux^，和ABX-EGF)；纤维连接蛋白片段；Gro-β；溴氯哌喹酮(Halofuginone)；肝素酶(Heparinases)；肝素多聚己糖片段；HMV833；人绒毛膜促性腺激素(hCG)；IM-862；干扰素α/β/γ；干扰素诱导蛋白(IP-IO)；白介素-12；Kringle 5(纤溶酶原片段)；Marimastat；金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)；2-甲氧雌二醇Methoxyestradiol；MMI 270(CGS 27023A)；MoAb IMC-ICl 1；新伐司他Neovastat；NM-3；Panzem；PI-88；胎盘的核糖核酸酶抑制剂；纤溶酶原激活物抑制剂；血小板因子-4(PF4)；普啉司他(Prinomastat)；催乳激素16kD片段；多育曲菌素相关蛋白(PRP)；PTK 787/ZK 222594；类视黄醇；索利司他(Solimastat)；角鲨胺；SS3304；SU5416；SU6668；SU11248；四氢皮质醇-S；四硫钼酸盐；反应停(thalidomide)；凝血酶敏感素-1(TSP-I)；TNP-470；转化生长因子-β(TGF-β)；Vasculostatin；凡索昔(Vasostatin)(钙网织蛋白片段)；ZD6126；ZD6474；法尼基转移酶抑制剂(FTI)；和二膦酸盐。

能够在本发明的药物组合物、剂型和试剂盒中与本发明的多种实施方案中的抗体联合应用的抗癌剂包括但不限于：阿西维辛(acivicin)；阿柔比星(aclarubicin)；盐酸阿考达唑(acodazole hydrochloride)；阿克罗宁(acronine)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；六甲蜜胺(altretamine)；安波霉素(ambomycin)；醋酸双氢胺蒽醌(ametantrone)(acetate)；氨鲁米特(aminoglutethimide)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；安曲霉素(anthramycin)；天冬酰胺酶(asparaginase)；曲林菌素(asperlin)；阿扎胞苷(azacitidine)；阿扎替派(azetepa)；阿佐霉素(azotomycin)；巴马司他(batimastat)；苄替派(benzodepa)；比卡鲁胺(bicalutamide)；盐酸比山群(bisantrene hydrochloride)；双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新(bizelesin)；硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)；布喹那钠(brequinar sodium)；溴匹立明(bropirimine)；白消安(busulfan)；放线菌素(cactinomycin)；7β，17α-二甲睾酮(calusterone)；卡醋胺(caracemide)；carbetimer；卡铂(carboplatin)；卡莫司汀(carmustine)；盐酸卡柔比星(carubicin hydrochloride)；卡折来新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；西罗里霉素(cirolemycin)；顺铂(cisplatin)；克拉屈滨(cladribine)；克立那托铁胺(crisnatomesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷(cytarabine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；更生霉素(dactinomycin)；盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)；地西他滨(decitabine)；右奥马铂(dexormaplatin)；地扎呱宁(dezaguanine)；甲磺酸(dezaguanine mesylate)；地吖醌(diaziquone)；多西紫杉醇(docetaxel)；多柔比星(doxorubicin)；盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride)；屈洛昔芬(droloxifene)；柠檬酸屈洛昔芬(droloxifene citrate)；丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)；偶氮霉素(duazomycin)；依达曲沙(edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(eflornithine hydrochloride)；依沙芦星(elsamitrucin)；恩洛铂(enloplatin)；苯环丙炔酯(enpromate)；双环氧哌啶(epipropidine)；盐酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)；厄布洛唑(erbulozole)；盐酸依索比星(esorubicin hydrochloride)；磷雌氮芥(estramustine)；雌氮芥磷酸钠(estramustine phosphate sodium)；依他硝唑(etanidazole)；依托泊苷(etoposide)；磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)；氯苯乙嘧胺(etoprine)；盐酸法罗唑啉(fadrozole hydrochloride)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维A胺(fenretinide)；氟脲嘧啶脱氧核苷(floxuridine)；磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)；氟尿嘧啶(fluorouracil)；氟环胞苷(flurocitabine)；磷喹酮(fosquidone)；福司曲星钠(fostriecin sodium)；吉西他汀(gemcitabine)；吉西他汀盐酸盐(gemcitabine hydrochloride hydrpxurea)；盐酸伊达比星(idarubicinhydrochloride)；异磷酰胺(ifosfamide)；依莫佛新(ilmofosine)；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂(iproplatin)；盐酸依立替康(irinotecanhydrochloride)；醋酸兰瑞肽(lanreotide acetate)；来曲唑(letrozole)；醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)；盐酸利阿唑(liarozole hydrochloride)；洛美曲索钠(lometrexol sodium)；罗莫司丁(lomustine)；盐酸洛索蒽醌(losoxantronehydrochloride)；马丙考(masoprocol)；美登素(maytansine)；盐酸甲氯乙胺(mechlorethamine hydrochloride)；醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)；醋酸美仑孕酮(melengestrol acetate)；美法仑(melphalan)；美诺立尔(menogaril)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；甲氨喋呤钠(methotrexatesodium)；氯苯氨啶(metoprine)；美妥替哌(meturedepa)；米丁度胺(mitindomide)；米托克星(mitocarcin)；丝裂红素(mitocromin)；丝裂吉菌素(mitogillin)；丝裂马菌素(mitomalcin)；丝裂霉素(mitomycin)；丝裂帕菌素(mitosper)；米托坦(mitotane)；盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)；霉酚酸(mycophenolic acid)；噻氨酯哒唑(nocodazole)；诺加霉素(nogalamycin)；奥马铂(ormaplatin)；亚磺酰吡啶(oxisuran)；太平洋紫杉醇(paclitaxel)；培门冬酶(pegaspargase)；佩利霉素(peliomycin)；溴新斯的明(pentamustine)；硫酸培来霉素(peplomycin sulfate)；过磷酰胺(perfosfamide)；哌泊溴烷(pipobroman)；哌泊舒凡(piposulfan)；盐酸吡罗蒽醌(piroxantronehydrochloride)；普卡霉素(plicamycin)；普鲁美斯坦(plomestane)；卟吩姆钠(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；泼尼莫司汀(prednimustine)；盐酸甲基苄肼(procarbazine hydrochloride)；嘌罗霉素(puromycin)；盐酸嘌罗霉素(puromycinhydrochloride)；4-羟基-3-β-D-呋喃核糖基-1H-吡唑-5-甲酰胺(pyrazofurin)；利波腺苷(riboprirne)；洛太米特(rogletimide)；沙芬戈(safmgol)；盐酸沙芬戈(safingol hydrochloride)；司莫司汀(semustine)；辛曲秦(simtrazene)；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；稀疏霉素(sparsomycin)；盐酸螺旋锗(spirogermanium hydrochloride)；螺莫司汀(spiromustine)；顺螺铂(spiroplatin)；链黑霉素(streptonigrin)；链脲霉素(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；他利霉索(talisomycin)；替可加兰钠(tecogalan sodium)；喃氟啶(tegafur)；替洛蒽醌(teloxantrone hydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；鬼臼噻吩甙(teniposide)；替罗昔隆(teroxirone)；睾内酯(testolactone)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；硫鸟嘌呤(thioguanine)；塞替派(thiotepa)；噻唑呋林(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；枸橼酸托瑞米芬(toremifene citrate)；曲托龙(trestolone acetate)；硫酸曲西立滨(triciribine phosphate)；曲美沙特(trimetrexate)；曲美沙特葡萄糖醛酸(trimetrexate glucuronate)；曲普瑞林(triptorelin)；盐酸妥布氯唑(tubulozole hydrochloride)；尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；尿烷亚胺(uredepa)；伐普肽(vapreotide)；verteporfm；长春花碱(vinblastine sulfate)；硫酸长春新碱(vincristine sulfate)；长春花碱酰胺(vindesine)；硫酸长春花碱酰胺(vindesine sulfate)；硫酸长春匹定(vinepidinesulfate)；盐酸长春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸环氧长春碱(vinleurosinesulfate)；酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)；硫酸异长春碱(vinrosidinesulfate)；硫酸长春利定(vinzolidine sulfate)；伏氯唑(vorozole)；折尼拉汀(zeniplatin)；新制癌菌素(zinostatin)；盐酸柔红霉素苯腙(zorubicinhydroehloride。其它的抗癌剂包括但不限于：20-epi-1，25二羟维生素D3(dihydroxyvitamin D3)；5-ethynyluracil；阿比特龙(abiraterone)；阿柔比星(aclarubicin)；acylfulvene；adecypenol；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；ALL-TK拮抗剂；六甲密胺(altretamine)；氨莫司汀(ambamustine)；磺胺异噁唑(amidox)；阿米斯丁(amifostine)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶(amsacrine)；阿那格雷(anagrelide)；阿纳托(司)唑(anastrozole)；穿心莲乙素(andrographolide)；血管生成抑制剂(angiogenesis inhibitors)；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯(antarelix)；抗dorsalizing形成蛋白-1；抗雄激素物质(antiandrogen)，前列腺癌；雌激素对抗剂(antiestrogen)；抗瘤酮(antineoplaston)；反义寡核苷酸；阿非迪霉素甘氨酸酯(aphidicolin glycinate)；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；外尿酸(apurinic acid)；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨基酶；asulacrine；阿他美坦(atamestane)；阿曲氮芥(atrimustine)；axinastatin1；axinastatin2；axinastatin3；阿扎司琼(azasetron)；阿扎毒素(azatoxin)；重氮酪氨酸(azatyrosine)；浆果赤霉素(baccatin)III衍生物；balanol；巴马司他(batimastat)；BCR/ABL拮抗剂；benzochlorins；benzoylstaurosporine；β内酰胺衍生物；beta-alethine；betaclamycin B；白桦脂酸(betulinic acid)；bFGF抑制剂；比卡鲁胺(bicalutamide)；比山群(bisantrene)；bisaziridinylspermine；双奈法德(bisnafide)；bistratene A；bizelesin；breflate；溴匹立明(bropirimine)；布多替钛(budotitane)；buthionine sulfoximine；卡泊三醇(calcipotriol)；钙感光蛋白(calphostin C)；喜树碱衍生物；金丝雀痘(canarypox IL-2)；卡培他滨(capecitabine)；carboxamide amino-triazole；carboxyamidotriazole；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生抑制剂；卡折来新(carzelesin)；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺(castanospermine)；天蚕抗菌肽(cecropin B)；西曲瑞克(cetrorelix)；chlorlns；chloroquinoxaline sulfonamide；西卡前列素(cicaprost)；顺式卟啉(cis-porphyrin)；克拉屈滨(cladribine)；氯米芬类似物(clomifeneanalogues)；克霉唑(clotrimazole)；collismycin A；collismycin B；考布他汀(combretastatin)A4；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托(crisnatol)；cryptophycin 8；cryptophycin A衍生物；curacin A；cyclopentanthraquinones；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷(cytarabineocfosfate)；细胞溶解因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗(dacliximab)；地西他滨(decitabine)；dehydrodidemnin B；地洛瑞林(deslorelin)；地塞米松(dexamethasone)；dexifosfamide；右丙亚胺(dexrazoxane)；右维拉帕米(dexverapamil)；地吖醌(diaziquone)；代代宁(didemnin B)；didox；diethylnorspermine；二氢-5-氮胞苷；dihydrotaxol；9-dioxamycin；联苯螺莫司汀(diphenyl spiromustine)；紫杉萜(docetaxel)；二十二(烷)醇(docosanol)；多拉司琼(dolasetron)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；屈洛昔芬(droloxifene)；屈大麻酚(dronabinol)；duocarmycin SA；依布硒啉(ebselen)；依考莫司汀(ecomustine)；依地福新(edelfosine)；依决洛单抗(edrecolomab)；依洛尼塞(eflomithine)；榄香烯(elemene)；乙嘧替氟(emitefur)；表柔比星(epirubicin)；依立雄胺(epristeride)；磷雌氮芥类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑(etanidazole)；磷酸鬼臼乙叉甙(etoposide phosphate)；依西美(exemestane)；法倔唑(fadrozole)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维A胺(fenretinide)；非格司亭(filgrastim)；非那司提(finasteride)；flavopiridol；氟卓斯汀(flezelastine)；(fluasterone)；氟达拉滨(fludarabine)；fluorodaunorunicinhydrochloride；福酚美克(forfenimex)；福美坦(formestane)；福司曲星(fostriecin)；福替目丁(fotemustine)；钆gadolinium texaphyrin；硝酸镓(galliumnitrate)；加洛他滨(galocitabine)；加尼瑞克(ganirelix)；明胶酶抑制剂；吉西他汀(gemcitabine)；谷光甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；乙撑-双乙酰胺(hexamethylene bisacetamide)；金丝桃素(hypericin)；伊班膦酸(ibandronicacid)；去甲氧正定霉素idarubicin)；碘昔芬idoxifene)；伊决孟酮idramantone)；依莫佛新ilmofosine)；伊洛马司他ilomastat)；imidazoacridones；咪喹莫特imiquimod)；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍(iobenguane)；碘阿霉素(iododoxorubicin)；甘薯苦醇(ipomeanol，4-；伊罗普拉(iroplact)；伊索格拉定(irsogladine)；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼(itasetron)；jasplakinolide；kahalalide F；lamellarin-N triacetate；兰乐肽(ianreotide)；(ieinamycin；来诺拉提(ienograstim)；硫酸香菇多糖；ieptolstatin；来曲唑(letrozole)；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；leuprolide+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林(leuprorelin)；左旋咪唑(levamisole)；利阿唑(liarozole)；直链多胺类似物；亲脂二糖肽1；亲脂铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂(lobaplatin)；胍乙基磷酸丝氨酸(lombricine)；洛美曲索(lometrexol)；氯尼达明(lonidamine)；洛索蒽醌(losoxantrone)；罗伐他丁(lovastatin)；罗唑利宾(loxoribine)；勒托替康(lurtotecan)；lutetium texaphyrin(一种光敏药物)；lysofylline；溶解肽；美坦新(maitansine)；mannostatin A；马马司他(marimastat)；马丙考(masoprocol)；maspin；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；merbarone；美替瑞林(meterelin)；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺(metoclopramide)；MIF抑制剂；米非司酮(mifepristone)；米替福新(miltefosine)；米立司亭(mirimostim)；不匹配的双链RNA；丙米腙(mitoguazone)；二溴卫矛醇(mitolactol)；丝裂霉素C类似物；胺硝萘酞胺(mitonafide)；mitotoxin成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫法罗汀(mofarotene)；莫拉司亭(molgramostim)；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；单磷酸类脂A+myobacterium细胞壁sk；单哌潘生丁(mopidamol)；多重药物抗性基因抑制剂；基于多瘤抑制基因1的治疗；芥子抗癌剂；mycaperoxide B；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林(N-acetyldinaline)；N-取代的苯酰胺类；纳发阮林(nafarelin)；那瑞替喷(nagrestip)；naloxone-pentazodine；napavin；naphterpin；那托司亭(nartograstim)；奈达铂(nedaplatin)；nemorabicin；奈立膦酸(neridronic acid)；中性肽链内切酶；尼鲁米特(nilutamide)；nisamycin；氧化亚氮调节剂；一氧化二氮抗氧化剂；nitrullyn；06-benzylguanine；善得定(octreotide；okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮(onapristone)；奥坦西隆(ondansetron)；奥坦西隆(ondansetron)；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂(ormaplatin)；奥沙特隆(osaterone)；奥沙利铂(oxaliplatin)；oxaunomycin；太平洋紫杉醇(paclitaxel)；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；(palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸(pamidronic acid)；panaxytriol；人参(炔)三醇(panomifene)；parabactin；帕折普汀(pazelliptine)；天门冬酰胺酶(pegaspargase)；培得星(peldesine)；戊聚硫钠(pentosanpolysulfate sodium)；喷司他丁(pentostatin)；pentrozole；潘氟隆(perflubron)；过磷酰胺(perfosfamide)；perillyl alcohol；phenazinomycin；乙酸苯酯(phenylacetate)；磷酸酶抑制剂；溶链菌(picibanil)；pilocaine hydrochloride；吡喃阿霉素(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；placetin A；placetin B；纤维蛋白溶酶原激活因子抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；泼尼松(prednisone)；丙基二-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A-的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微合金(microalgal)；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫色素(purpurins)；吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)；吡醇羟乙酯(pyridoxylated hemoglobin)聚氧乙烯轭合物；raf拮抗剂；雷替曲塞(raltitrexed)；雷莫司琼(ramosetron)；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基瑞替普汀(retelliptinedemethylated)；铼1861-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸；根霉素(rhizoxin)；核酶；RII维胺酯(retinamide)；洛太米特(rogletimide)；rohitukine；胞壁酰基二肽(romurtide)；罗喹美克(roquinimex)；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈(safingol)；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙莫司亭(sargramostim)；Sdi 1模拟物；司莫司丁(semustine)；衰老衍生抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃(sizofiran)；索布佐生(sobuzoxane)；普罗比妥钠(sodium borocaptate)；苯乙酸钠(sodiumphenylacetate)；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明(sonermin)；膦门冬酸(sparfosic acid)；spicamycin D；螺莫司汀(spiromustine)；splenopentin；spongistatin 1；squalamine；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；间充质溶解素抑制剂；sulfmosine；强力血管肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明(suramin)；苦马豆碱(swainsonine)；合成的葡萄糖胺聚糖；他莫司汀(tallimustine)；蛋氨酸它莫西芬(tamoxifen methiodide)；牛碘莫司汀(tauromustine)；他佐罗汀(tazarotene)；替可加兰钠(tecogalan sodium)；喃氟啶(tegafur)；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；噻吗洛尔(temoporfm)；替莫唑胺(temozolomide)；鬼臼噻吩甙(teniposide)；tetrachlorodecaoxide；四虫体(tetrazomine)；thaliblastine；噻可拉林(thiocoraline)；血小板生成素(thrombopoietin)；血小板生成素模拟物(thrombopoietin mimetic)；胸腺法新(thymalfasin)；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南(thymotrinan)；促甲状腺激素；乙基锡初紫红素(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明(tirapazamine)；环戊二烯钛(titanocene bichloride)；topsentin；托瑞米芬(toremifene)；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸(tretinoin)；三乙酰尿核甙；曲西立滨(triciribine)；曲美沙特(trimetrexate)；曲普瑞林(triptorelin)；托吡西隆(tropisetron)；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸激酶的阻断剂(tyrphostins)；UBC抑制剂；乌苯美司(ubenimex)；泌尿生殖器窦衍生生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽(vapreotide)；variolin B；载体系统，红细胞基因治疗；维拉雷琐(velaresol)；藜芦明(veramine)；verdins；维替泊芬(verteporfin)；长春瑞滨(vinorelbine)；vinxaltine；vitaxin；vorozole；zeniplatin；亚苄维C(zilascorb)；以及净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)。优选的其它的抗癌药为5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸。

能够用于本发明方法中的治疗性抗体的的例子包括但不限于赫赛汀^(Trastuzumab)(Genentech，CA)，其为用于转移乳腺癌患者的治疗的人源化抗HER2单克隆抗体；REOPRO^(abciximab)(Centocor)，其为用于预防血凝块形成的血小板上糖蛋白IIb/IIIa受体的抗体；ZENAPAX^(daclizumab)(Roche Pharmaceuticals，Switzerland)，其为免疫抑制性、用于预防急性肾同种移植物排斥反应的人源化抗-CD25单克隆抗体；PANOREX^TM(edrecolomab)，其为小鼠抗17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(Glaxo Wellcome/Centocor)；BEC2，其为小鼠抗独特型(GD3抗原表位)IgG抗体(ImClone System)；Erbitux^(cetuximab)，其为嵌合抗EGFR IgG抗体(ImClone System)；VITAXIN^TM其为人源化抗-αVβ3整合素抗体(AppliedMolecular Evolution/Medlmmune)；Campath 1H/LDP-03，其为人源化抗CD52IgG1抗体(Leukosite)；Smart M195，其为人源化抗-CD33 IgG抗体(ProteinDesign Lab/Kanebo)；RITUXAN^TM(rituximab)，其为嵌合抗CD20 IgG1抗体(IDEC Pharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDE^TM(epratuzumab)，其为人源化抗CD22 IgG抗体(Immunomedics)；ICM3，其为人源化抗ICAM3抗体(ICOS Pharm)；IDEC-114，其为primatied抗CD80抗体(IDECPharm/Mitsubishi)；ZEVALlN^TM，其为放射性标记鼠抗CD20抗体(IDEC/Schering AG)；IDEC-131其为人源化抗CD40L抗体(IDEC/Eisai)；IDEC-15l，其为prmatized抗CD4抗体(IDEC)；IDEC-152，其为primatized抗CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗CD3，其为人源化抗CD3IgG(Protein Design Lab)；5G1.1，其为人源化抗补体因子5(C5)抗体(AlexionPharm)；Humira^，其为人抗TNF-α抗体(Abbott Laboratories)；CDP870，其为人源化抗TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151，其为primatized抗CD4IgG1抗体(IDEC Pharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4，其为人抗CD4 IgG抗体(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571，其为人源化抗TNF-α IgG4抗体(Celltech)；LDP-02，其为人源抗α4β7抗体(LeukoSite/Genentech)；OrthoCloneOKT4A，其为人源化抗CD4 IgG抗体(Ortho Biotech)；ANTOVA^TM，其为人源化抗CD40L IgG抗体(Biogen)；ANTEGREN^TM，其为人源化抗VLA-4IgG抗体(Elan)；以及CAT-152，其为人抗TGF-β₂抗体(Cambridge Ab Tech)。

可与本发明抗体联合使用的治疗性抗体的其它例子如表7所示。

表7：用于癌症治疗的与本发明抗体联合使用的单克隆抗体。

公司	产品	疾病	靶标
				AbgenixAltaRex	ABX-EGFOvaRexBravaRex	癌症卵巢癌转移性癌症	EGF受体肿瘤抗原CA125肿瘤抗原MUC1
Antisoma	Theragyn(pemtumomabytrrium-90)Therex	卵巢癌乳腺癌	PEM抗原PEM抗原
				BoehringerIngelheim	blvatuzumab	头和颈部的癌	CD44
Centocor/J&JConxa	PanorexReoProReoProReoProBexocar	结肠直肠癌PTCA急性MI缺血性休克NHL	17-1AgpIIIb/IIIagpIIIb/IIIagpIIIb/IIIaCD20
				CRC Technology	单克隆抗体，独特型的105AD7	结肠直肠癌疫苗	gp72
Crucell	抗EpCAM	癌症	Ep-CAM
				Cytoclonal	单克隆抗体，肺癌	非小细胞肺癌	NA
Genentech	赫赛汀赫赛汀Rituxan	转移性乳腺癌早期乳腺癌复发/顽固低度或滤泡NHL	HER-2HER-2CD20

	RituxanMAb-VEGFMAb-VEGFAMDFabE-26(2nαgen.IgE)	中度&高度NHLNSCLC，转移性结肠直肠癌，转移性年龄相关黄斑变性变应性哮喘&鼻炎	CD20VEGFVEGFCD18IgE
				IDEC	Zevalin(Rituxan+钇-90)	低度滤泡，复发或顽固，CD20-阳性，B细胞NHL和Rituximab-抗性NHL	CD20
mClone	Cetuximab+innotecanCetuximab+顺铂&放疗Cetuximab+吉西他汀Cetuximab+铂+5FU或紫杉醇Cetuximab+卡铂+太平洋紫杉醇Cetuximab+顺铂Cetuximab+放疗BEC2+卡介苗	顽固性结肠直肠癌新诊断或复发的头颈癌新诊断或转移性胰腺癌复发或转移性头颈癌新诊断非小细胞肺癌头颈癌(广泛性的难治愈的局部-区域性疾病&远处转移)局部晚期头颈癌小细胞肺癌	EGF受体EGF受体EGF受体EGF受体EGF受体EGF受体EGF受体模拟物神经节苷脂GD3

	BEC2+卡介苗IMC-1C11	黑色素瘤结肠直肠癌伴肝转移	模拟物神经节苷脂GD3VEGF-受体
				ImmonoGen	nuC242-DM1	结肠直肠、胃和胰腺癌	nuC242
ImmunoMedics	LymphoCideLymphoCide Y-90CEA-CideCEA-Cide Y-90CEA-Scan(Tc-99m-标记的阿西莫单抗)CEA-Scan(Tc-99m-标记的阿西莫单抗)CEA-Scan(Tc-99m-标记的阿西莫单抗)CEA-Scan(Tc-99m-标记的阿西莫单抗)LeukoScan(Tc-99m-标记的硫索单抗)LymphoScan(Tc-99m-标记的)AFP-Scan(Tc-99m-标记的)	非何杰金氏淋巴瘤非何杰金氏淋巴瘤转移性实体瘤转移性实体瘤结肠直肠癌(放射呈像)乳腺癌(放射呈像)肺癌(放射呈像)手术探查到的肿瘤(放射呈像)软组织感染(放射呈像)淋巴瘤(放射呈像)肝7 gem-细胞癌(放射呈像)	CD22CD22CEACEACEACEACEACEACEACD22AFP
				Intracel	HumaRAD-HN(+钇-90)	头颈癌	NA
Medarex	HumaSPECTMDX-101(CTL A-4)MDX-210(her-2过表达)	结肠直肠呈像前列腺癌和其它癌前列腺癌	NACTLA-4HER-2

MedlmmuneMerck KGaA	MDX-210/MAKVitaxinMAb425IS-IL-2	癌症癌症多种癌症多种癌症	HER-2αvβ3EGF受体Ep-CAM
				MillenniumNeoRx	Campath(阿仑单抗)CD20-链霉亲和素(+生物素-钇90)Avidicin(白蛋白+NRLU13)	慢性淋巴细胞白血病非何杰金氏病淋巴瘤转移性癌症	CD52CD20NA
Peregrine	Oncolym(+碘-131)Cotara(碘-131)	非何杰金氏病淋巴瘤不能切除的恶性胶质瘤	HLA-DR 10βDNA-相关蛋白
				PharmaciaCorporationProtein DesignLabsTitan	C215(+葡萄球菌肠毒素)单克隆抗体，肺/肾癌他那可单抗(C242+葡萄球菌肠毒素)NuvionSMART M195SMART ID10CEAVacTriGemTriAb	胰腺癌肺/肾癌结肠&胰腺癌T细胞恶性肿瘤AMLNHL结肠直肠癌，晚期转移性黑色素瘤&小细胞肺癌转移性乳腺癌	NANANACD3CD33HLA-DR抗原CEAGD2-神经节苷脂MUC-1
Trilex	CEAVacTriGemTriAb	结肠直肠癌，晚期转移性黑色素瘤&小细胞肺癌转移性乳腺癌	CEAGD2-神经节苷脂MUC-1
				Viventia Biotech	NovoMAb-G2标记的Monopharm CGlioMAb-H(+白树毒素)	非何杰金氏病淋巴瘤结肠直肠癌&胰腺癌神经胶质瘤，黑色素瘤&成神经细胞瘤	NASK-1抗原NA
Xoma	RituxanRituxanING-1	复发/顽固性低度或滤泡NHL中度&高度NHL肾上腺癌	CD20CD20Ep-CAM

5.4.6 疫苗治疗

本发明提供了增强个体对疫苗组合物的免疫反应的方法，所述方法包括给予所述个体特异性结合FcγRIIB的抗体或其片段、以及疫苗组合物，所述抗体或其片段与FcγRIIB的亲和性高于其结合FcγRIIA的亲和性，其中所述抗体或其片段增强个体对所述疫苗组合物的免疫反应。在一个特定实施方案中，通过增强所述疫苗针对的抗原的抗原呈递和/或抗原加工来增强个体对所述疫苗组合物的免疫反应。本领域公知的任何疫苗组合物可与本发明的抗体或其片段联合使用。

在一个实施方案中，本发明包括本发明的抗体与任何本领域公知的癌症疫苗的联合使用，例如，CanvaxinTM(Cancer Vax，Corporation，黑色素瘤和结肠癌)；Oncophage(HSPPC-96；Antigenics；转移性黑色素瘤)；HER-2/neu癌症疫苗等等。用于本发明方法和组合物中的所述的癌症疫苗可以是，例如抗原-特异性疫苗、抗独特型的疫苗、树突状细胞疫苗或DNA疫苗。本发明包括本发明的抗体与如Segal等人(美国专利6,403,080)所述的基于细胞的疫苗的联合使用，本发明将该专利全部引入作为参考。与本发明的抗体联合使用的所述基于细胞的疫苗可以是自体的或同种异体的。简言之，如Segal等人所述的基于癌症的疫苗为Genitrix，LLC的产品Opsonokine(TM)。Opsonokines(TM)为遗传工程化细胞因子，当与所述肿瘤细胞混合时，自动附着于所述细胞表面。当“装饰”的细胞作为疫苗给药时，在所述细胞上的细胞因子活化受者的主要抗原呈递细胞，同时也使抗原呈递细胞摄取肿瘤细胞。所述抗原提呈细胞随后能够指导“杀伤”T细胞来发现并破坏整个机体内的类似肿瘤细胞。因此，Opsonokine(TM)产品将所述肿瘤细胞转化有效的抗肿瘤治疗。

在一个实施方案中，本发明包括本发明的抗体与任何本领域公知的过敏症疫苗的联合应用。本发明的抗体可用于，例如，与编码主要梯牧草花粉变态原的重组杂交分子联合，该分子用于草花粉过敏反应的疫苗，如Linliart等人所述(2000，FASEB Journal，16(10)：1301-3，本发明将其引入作为参考)。此外，本发明的抗体可与基于DNA的疫苗联合使用，如Horner等人所述(2002，Allergy，57 Suppl，72：24-9，本发明将其引入作为参考)。本发明的抗体可与Bacille Clamett-Guerin(″BCG″)疫苗联合使用以下调IgE分泌，如Choi等人(2002，Ann.Allergy Asthma Immunology，88(6)：584-91)和Barlan等人(2002，Journal Asthma，39(3)：239-46)所述，本发明将其全部引入作为参考。本发明的抗体可用于治疗食物过敏症。特别是，本发明的抗体可与疫苗或其它本领域公知的免疫治疗联合使用，治疗花生过敏症(参见，Hourihane等，2002，Curr.Opin.Allergy Clin Immunol.2(3)：227-31)。

本发明的方法和组合物可与需要抗原免疫性的疫苗联合使用。这种抗原可以是本领域公知的任何抗原。本发明的抗体可用于增强免疫反应，例如对感染因子、疾病或异常细胞，例如但不限于细菌(例如，革兰式阳性细菌、革兰式阴性细菌、需氧细菌、螺旋菌、分枝杆菌、立克次(氏)体、衣原体等等)、寄生虫、真菌(例如，白色念珠菌，曲霉菌等等)、病毒(例如，DNA病毒、RNA病毒等等)或肿瘤。病毒感染包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒；丁型肝炎病毒；或其它肝炎病毒；巨细胞病毒、带状疱疹病毒-1(-2、-3、4、-5、-6)、人乳突状瘤病毒；呼吸道合胞体病毒(RSV)，副流感病毒(PIV)、伊波(Epstein Barr)病毒、人间质肺病毒(metapneumovirus)(HMPV)，流感病毒、重症急性呼吸综合症(SARS)或任何其它病毒感染。

本发明包括含本发明的抗体、抗原和细胞因子的方法和疫苗组合物。优选地，所述细胞因子为IL4、IL-10或TGF-β。

本发明还包括使用本发明所述抗体增强疫苗组合物所针对的抗原的体液和/或细胞介导的反应。本发明还包括本发明的抗体在与预防或治疗特定病症的用途，其中针对特定抗原或多种抗原的免疫增强对治疗或预防所述的疾病或病症是有效的。这种疾病和病症包括但不限于，病毒感染，例如HIV、CMV、肝炎、疱疹病毒、麻疹等等，细菌感染，真菌和寄生虫感染，癌症以及其它疾病或病症，这些疾病或病症刻意通过增强针对特定抗原或多种抗原的免疫加以治疗或预防。

5.5 组合物和给药方法

通过给予个体有效量的本发明融合蛋白或轭合分子，或含本发明融合蛋白或轭合的分子的药物组合物，本发明提供了含本发明抗体的方法和药物组合物。本发明还提供了治疗、预防和改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状的方法。优选的，抗体或融合蛋白或轭合分子是基本纯的(即基本不合限制其作用或产生副作用的物质)。在具体的实施方案中，所述个体为动物，优选哺乳动物，例如非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)以及灵长类(例如，诸如短尾猴和人的猴类)。在优选的实施方案中，所述个体为人。

多种公知的给药系统可用于给予含有本发明抗体的组合物，例如，脂质体中的包囊、微颗粒、微囊、能够表达所述抗体或融合蛋白的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体部分的核酸构建体等等。

在一些实施方案中，本发明的抗体被装配在脂质体中靶向传输。脂质体为由向心排列的内含水相的脂质双层组成。脂质体通常包括不同类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂。脂质体的组分排列成双层结构，类似于生物膜的脂质排列。脂质体为特别优选的传输载体，部分由于其生物匹配性、低免疫原性和低毒性。制备脂质体的方法是本领域公知的并包括在本发明中，参见例如，Epstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688；Hwang等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030-4；美国专利4,485,045和4,544,545，本发明将其全部引入作为参考。

本发明还包括制备具有长血清半衰期，即增加的循环时间的脂质体的方法，例如美国专利5,013,556所述。用于本发明方法的优选脂质体不会从循环中快速清除，即不被摄入单核巨噬系统(MPS)。本发明包括空间排列稳定的脂质体，其利用本领域所属技术人员公知的方法来制备。尽管不意欲受特定作用机制的限制，空间排列稳定的脂质体含有具有大量高柔韧性的亲水半族的脂质组分，其减少脂质体与血清蛋白的不良反应，减少与血清成分的调理作用，并减少被MPS识别。空间排列稳定的脂质体优选由聚乙二醇来制备。对于制备脂质体和空间排列稳定的脂质体参见例如，Bendas等，2001，BioDrugs，15(4)：215-224；Allen等，1987，FEBS Lett.223：42-6；Klibanov等，1990，FEBSLett.，268：235-7；Blum等，1990，Biochim.Biophys.Acta.，1029：91-7；Torchilin等，1996，J.LiposomeRes.6：99-116；Litzinger等，1994，Biochim.Biophys.Acta，1190：99-107；Maruyama等，1991，Chem.Pharm.Bull.，39：1620-2；Klibanov等，1991，Biochim BiophysActa，1062；142-8；Allen等，1994，Adv.DragDeliv.Rev，13：285-309；本发明将其全部引入作为参考。本发明还包括特异器官靶向(参见例如，美国专利4,544,545)或特异细胞靶向(参见例如，美国专利申请公开2005/0074403)的脂质体。用于本发明组合物和方法的特别有用的脂质体可利用含卵磷脂、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物，通过反向蒸发方法来产生。通过确定尺寸孔的过滤器挤出脂质体以产生所需直径的脂质体。在一些实施方案中，本发明抗体的片段，例如F(ab′)，可利用上述方法轭合至所述脂质体，参见例如，Martin等，1982，J.Biol.Chem.257：286-288，本发明将其全部引入作为参考。

本发明的抗体也可配制成免疫脂质体。免疫脂质体指本发明抗体或其片段被共价或非共价连接在表面的脂质体组合物。连接抗体至所述脂质体表面的化学方法是本领域公知的并被包括在本发明中，参见例如，美国专利6,787,153；Allen等，1995，Stealth Liposomes，Boca Rotan：CRC Press，233-44；Hansen等，1995，Biochim.Biophys.Acta，1239：133-44；本发明将其全部引入作为参考。在最优选的实施方案中，用于本发明方法和组合物中的免疫脂质体是空间结构稳定的。优选地，本发明的抗体被共价或非共价连接至疏水锚，疏水锚被稳定地根植在脂质体的脂质双层中。疏水锚的例子包括但不限于磷脂，例如，phosoatidylethanolamine(PE)，phospahtidylinositol(PI)。为实现抗体与疏水锚的共价连接，可使用本领域公知的任何生物化学方法，参见例如，J.Thomas August编，1997，GeneTherapy：Advances in Pharmacology，Vol.40，Academic Press，San Diego，CA.，p.399-435，本发明将其全部引入作为参考。例如，抗体分子的功能基团可与连接在疏水锚上的脂质体活化基团反应，例如，用水溶性碳化二亚胺活化，抗体上的赖氨酸侧链的氨基基团可耦合至连接有N-戊二酰基-磷脂酰乙醇胺的脂质体；或通过巯基反应性锚诸如吡啶基硫丙酰化(pyridylthiopropionyl)-磷脂酰乙醇胺，被还原的抗体的巯基可耦合至脂质体上。参见例如，Dietrich等，1996，Biochemistry，35：1100-1105；Loughrey等，1987，Biochim.Biophys.Acta，901：157-160；Martin等，1982，J.Biol.Chem.257：286-288；Martin等，1981，Biochemistry，20：4429-38，本发明将其全部引入作为参考。尽管不意欲受特定作用机制的限制，包含本发明抗体的免疫脂质体制剂作为治疗性试剂是特别有效的，因为它们传输抗体至靶细胞的胞浆，即，所述细胞含有所述抗体结合的FcγRIIB受体。所述免疫脂质体优选具有延长的血液半衰期，特别是靶细胞内半衰期，并可内化进入靶细胞的胞浆，由此避免治疗剂的损失或内吞溶酶体途径的降解。

本发明涉及包含本发明的抗体或其片段的免疫脂质体。在一些实施方案中，所述免疫脂质体进一步包括一种或多种其它的治疗性试剂，例如本发明所公开的那些。

本发明的免疫脂质体组合物包括一种或多种可以形成囊的脂质、本发明抗体或其片段或衍生物，并任选包括亲水多聚体。囊形成脂质优选为具有两个碳水化合物链的脂质，该碳水化合物链可以是例如酰基链和极性头部基团。囊形成脂质的例子包括磷脂，例如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂，以及醣脂，例如脑苷脂、神经节苷脂。用于本发明制剂中的其它脂质为本领域所属技术人员公知并包括在本发明中。在一些实施方案中，所述免疫脂质体组合物进一步包括亲水聚合体，例如聚乙二醇和神经节苷脂GM1，其增加所述脂质体的血清半衰期。轭合亲水聚合物到脂质体的方法是本领域公知的并包括在本发明中。关于免疫脂质体的综述和其制备方法，参见例如，美国专利申请公开2003/0044407；PCT国际公开WO 97/38731，Vingerhoeads等，1994，Immunomethods，4：259-72；Maruyama，2000，Biol.Pharm.Bull.23(7)：791-799；Abra等，2002，Journalof Liposome Research，12(1&2)：1-3；Park，2002，Bioscience Reports，22(2)：267-281；Bendas等，2001，BioDrugs，14(4)：215-224，J.Thomas August编，1997，Gene Therapy：Advances in Pharmacology，Vol.40，Academic Press，San Diego，CA.，p.399-435，本发明将其全部引入作为参考。

本发明抗体的给药方法包括但不限于，肠道外给药(例如，皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内和皮下)，硬膜外和粘膜(例如，鼻内和口服途径)。在特定的实施方案中，本发明的抗体通过肌肉内、静脉内和皮下给药。可通过任意常规的途径进行所述组合物的给药，例如，输注或大丸集中注射，通过上皮或粘膜皮肤层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等等)，并可与其它的生物活性剂一同给药。可以是系统或局部给药。此外，可采用肺给药，例如，通过使用吸入器和喷雾器，并用雾化剂雾化组方。参见例如，美国专利6,019,968；5,985,20；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078号；以及PCT公开WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903，本发明将其全部引入作为参考。

本发明还提供将本发明所述抗体包装在密封的容器中，例如，指示抗体量的安瓿或袋中。在一个实施方案中，本发明抗体在密封的容器中以无菌冻干粉或无水浓缩物提供，并可用水或盐水恢复原状形成适当的浓度来对个体给药。优选地，本发明的抗体在密封的容器中以无菌冻干粉提供，其剂量单位至少为5mg、更优选至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg或至少75mg。所述冻干的本发明抗体在其原容器中应储存在2-8℃并且所述抗体在还原后应在12小时内、优选6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内给药。在另一实施方案中，本发明抗体在指示所述抗体、融合蛋白或轭合分子的剂量和浓度的密封容器中以液体提供。优选地，所述抗体的液体形式在密封容器中以至少1mg/ml、更优选至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml的抗体提供。

可通过标准的技术来确定治疗、预防或改善与疾病相关的一种或多种症状的本发明组合物的有效量。制剂中的准确剂量也依赖于药途径，所述疾病状态的严重程度，并根据从业者的判断和每一患者的情况而定。可从体外或动物模型试验系统的量效曲线中推断有效量。

对于本发明包含的抗体，给予患者的剂量通常为0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，所述对患者的给药剂量为0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001mg/kg至2mg/kg、0.0001mg/k至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001mg/k至0.15mg/kg、0.0001mg/k至0.10mg/kg、0.001mg/k至0.5mg/kg、0.01mg/k至0.25mg/kg或0.01mg/k至0.10mg/kg的患者体重。通常，由于对外来多肽的免疫反应，人源性抗体比其它物种的抗体在人体内具有较长的半衰期。因此，以较低剂量和较低频率给予人源性抗体是可行的。此外，通过修饰诸如脂质化抗体以增加摄入和组织渗透，来减少本发明的抗体或其片段的给药剂量和频率。

在一个实施方案中，当作为单一制剂治疗时，给予患者0.01mg至1000mg/天的本发明的抗体。在另一实施方案中，本发明抗体与其它的治疗组合物联合使用，而且给予患者的剂量低于所述抗体作为单一制剂治疗的剂量。

在具体的实施方案中，可能需要在需要治疗的区域内局部给予本发明的药物组合物；这种给药可通过，例如局部输注、注射和植入物来实现，所述植入物为多孔、非多孔或凝胶材料，包括膜，例如sialastic膜或纤维。优选地，当给予本发明的抗体时，应注意使用不吸收所述抗体或融合蛋白的材料。

在另一实施方案中，所述组合物可在囊中特别是脂质体中传输(参见Langer，Science，249：1527-1533(1990)；Treat等，in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(编)，Liss，NewYork，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同前，pp.317-327；参见同前)。

在另一实施方案中，所述组合物可以通过控释或缓释系统来传输。本领域所属技术人员公知的任何技术都可以用于制备含有一种或多种本发明抗体的缓释制剂。参见例如，美国专利4,526,938；PCT公开WO 91/05548号；PCT公开WO 96/20698；Ning等，1996，″IntratumoralRadioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using aSustained-Release Gel″，Radiotherapy&Oncology，39：179-189，Song等，1995，″Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions″，PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology，50：372-397；Cleek等，1997，″Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody forCardiovascular Application″，Pro.Int′l Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：853-854；以及Lam等，1997，″Microencapsulation of Recombinant HumanizedMonoclonal Antibody Local Delivety″，Proc.Int′l.Symp.ControlReI.Bioact.Mater.24：759-760，本发明将这些文献全部引入作为参考。在一个实施方案中，在控释系统中可以使用泵(参见Langer，如上述；Sefton，1987，CRCCrit Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等，1980，Surgety，88：507；以及Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一实施方案中，聚合材料可用于实现抗体的控制释放(参见例如，Medical Applications ofControlled Release，Langer和Wise(编)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen和Ball(编)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy等，1985，Science，228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)；美国专利5,679,377；美国专利5,916,597；美国专利5,912,015；美国专利5,989,463；美国专利5,128,326；PCT公开WO 99/15154；和PCT公开WO 99/20253)。用于缓释制剂的聚合物的例子包括但不限于聚(2-羟基异丁烯酸乙酯)，聚(异丁烯酸甲酯)，聚(丙烯酸)，聚乙烯醋酸乙酯，聚(异丁烯酸)，聚乙醇酸(PLG))，聚酸酐，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙稀酰胺，聚(乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(聚丙交酯-乙醇酸)(PLGA)，和聚原磷酯。在另一实施方案中，控释系统可放置在所述治疗靶(例如，肺)的附近，从而仅需要系统剂量的一部分(参见例如Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，如上述，vol.2，pp.115-138(1984))。在另一实施方案中，聚合组合物被用作控释植入物，参见Dunn等人(参见美国专利5,945,155)。具体的方法可基于所述聚合物系统中生物活性材料的原位控释的治疗效果。植入可通常发生在需要治疗的患者体内的任何地方。在另一实施方案中，使用非聚合物的缓释系统，从而在个体内使用非聚合植入物作为药物释放系统。在体内植入后，所述植入物的有机溶剂将会消散、分散和从所述组合物中沥滤出来进入周围组织液，并且所述非聚合材料将会逐步凝结和沉淀形成固体、微孔基质(参见美国专利5,888,533)。

Langer(1990，Science，249：1527-1533)的综述对控释系统进行了讨论。含有本发明的一种或多种治疗制剂的缓释制剂可以用本领域所属技术人员公知的任何技术制备。参见例如，美国专利4,526,938；国际公开WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等，1996，Radiotherapy&Oncology，39：179-189；Song等，1995，PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology，50：372-397；Cleek等，1997，Pro.Int′l.Symp.Control.ReI.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam等，1997，Proc.Int′l.Symp.Control ReI.Bioact.Mater.24：759-760，本发明将其全部引入作为参考。

特定的实施方案中，本发明的组合物为编码抗体的核酸，将所述核酸体内给药以促进其编码抗体的表达，该给药通过将所述核酸构建成合适的表达载体的部分并进行给药使其成为细胞内的，如使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)；或通过直接注射；或通过使用微粒轰击(例如基因枪，Biolistic，Dupont)，用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被；或通过将其与已知进入胞核的同源异型盒样肽连接给药(参见例如，Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：1864-1868)等来实施。可选择地，核酸可导入到细胞内并整合到宿主细胞DNA中而进行同源重组表达。

对于抗体，向所述个体给予的治疗或预防有效量通常为0.1mg/kg至200mg/kg所述个体体重。优选地，对个体的给药剂量为0.1mg/kg至20mg/kg个体体重，且更优选地对予个体的给药剂量为1mg/kg至10mg/kg所述个体的体重。还可以通过修饰例如脂质化来提高所述抗体或融合蛋白的摄取和组织渗透(例如进入肺)来减少本发明抗体给药的所述剂量和频率。

利用治疗或预防有效量的本发明的抗体对个体进行治疗，包括单一治疗，或优选地包括系列治疗。在优选的实施方案中，用本发明的抗体来治疗个体，其剂量范围为约0.1至30mg/kg体重，每周1次，进行约1至10周，优选2至8周，更优选3至7周、更优选约4、5或6周。在其它实施方案中，本发明的药物组合物可一天一次、一天两次和一天三次地给药。在其它实施方案中，所述药物组合物可每周一次、每周两次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两月一次、每年两次和每年一次地给药。应理解，根据具体治疗阶段，用于治疗的所述抗体的有效量可增加或减少。

5.5.1 药物组合物

本发明的组合物可包括用于制备药物组合物的原料药组合物(例如，不纯的或非无菌的组合物)和用于制备单位剂型的药物组合物(即，适于对个体或患者给药的组合物)。这种组合物包括本发明所公开的预防或治疗有效量的预防和/或治疗性试剂或这些试剂的组合以及药学上可接受的载体。优选地，本发明的组合物包括预防或治疗有效量的本发明的抗体和药学上可接受的载体。

在特定的实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的与FcγRIIB结合的抗体或其片段，其结合特异性高于所述抗体或片段结合FcγRIIA的亲和性；特异性结合癌抗原的细胞毒性抗体；以及药学上可接受的载体。在另一实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种抗癌剂。

在特定的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指用于动物，优选用于人的经联邦或州立政府管理局批准的或列入美国药典、或其它公认药典的调节性试剂。术语“载体”指与治疗一起给予的稀释剂、佐剂(例如，Freund′s佐剂(完全的和不完全的)、赋形剂或运载体。这种药学上的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括来源于石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当所述药物组合物通过静脉内给予时，水是优选的载体。盐溶液和水性右旋糖以及甘油溶液也可用作液体载体，特别是注射用溶液。适合的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单酯、滑石、氯化钠、干燥脱脂奶、甘油、丙稀、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，该组合物可含有微量的润湿剂和乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液、悬浮液、乳化液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释剂型等形式。

通常，本发明的组合物成分可以单独提供或混合成单位剂型提供，例如，以密封在容器，例如指示活性成分的量的安瓿或袋中的冻干粉末或无水浓缩物提供。当所述组合物通过灌输给药时，其用装有无菌药物级水或盐水的灌输瓶来分散。当所述组合物通过注射给药时，提供安瓿量的无菌水或盐水以在给药前将所述成分混合。

本发明的组合物可配制为中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于与阴离子形成的盐，例如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的盐，以及与阳离子形成的盐，例如钠、钾、铵、钙、铁氢化物、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的盐。

本发明还提供了药物组合物和试剂盒，其包含用于预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤，或其一种或多种症状的FcγRIIB拮抗剂。具体地，本发明提供药物组合物和试剂盒，其包括FcγRIIB拮抗剂，其类似物、衍生物或抗FcγRIIB抗体或其抗原结合片段。

5.5.2 基因治疗

在特定的实施方案中，用包含抗体或融合蛋白的编码序列的核酸给药，以通过基因治疗的方式治疗、预防或改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状。基因治疗指通过向个体给与表达的或可表达的核酸来进行的治疗。在本发明的该实施方案中，所述核酸产生其编码的抗体或融合蛋白，该抗体或融合蛋白介导治疗或预防作用。

本领域现有的任何基因治疗方法均可用于本发明。以下描述了示例性方法。

基因治疗方法的一般性综述参见Goldspiel等，1993，Clinical Pharmacy，12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy，3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，Science，260：926-932(1993)；Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIBTECH，11(5)：155-215；及Scholl，2003，J.BiomedBiotechnol，2003：35-47。可使用的重组DNA技术的本领域公知的常规方法如Ausubel等(编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)所述。

在优选的方面，本发明的组合物包括编码抗体的核酸，所述核酸为在适合宿主中表达所述抗体的表达载体的一部分。具体地，这种核酸具有启动子，优选异源启动子，其可操作地与所述抗体的编码区连接，所述启动子为诱导型或组成型，并任选地为组织特异性的。在另一特定的实施方案中，所使用的核酸分子的所述抗体编码序列和任意其它所需的序列与促进基因组所需位点处的同源重组的区域侧翼连接，因此提供了所述抗体编码核酸的染色体内表达(Roller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8932-8935；和Zijlstra等，1989，Nature，342：435-438)。

在另一优选的方面，本发明的组合物包括编码融合蛋白的核酸，所述核酸为在适合宿主中表达所述融合蛋白的表达载体的一部分。具体地，这种核酸具有启动子，优选异源启动子，其可操作地与所述融合蛋白的编码区连接，所述启动子为诱导型或组成型的，并任选为组织特异性的。在另一特定的实施方案中，所使用的核酸分子的所述融合蛋白编码序列和任意其它所需的序列与在基因组所需位点处促进同源重组的区域侧翼连接，因此提供了所述融合蛋白编码核酸的染色体内表达。

将所述核酸传输进入个体可以是直接的，在这种情况下，所述个体直接暴露于所述核酸或携带核酸的载体；或者是间接的，在这种情况下，首先用所述核酸来体外转化细胞，随后移植入所述个体。分别作为体内或体外基因治疗，这两种方法都是公知的。

在特定的实施方案中，在体内直接给予所述核酸序列，在其中该核酸序列得到表达而产生编码产物。这可通过本领域公知的无数方法来实现，例如通过将它们构建成适合的核酸表达载体的部分并进行给药从而使它们成为细胞内的，例如，通过利用缺陷的或减毒的逆转录病毒或其它病毒载体(参见美国专利4,980,286)感染；或通过直接注射裸DNA；或通过使用微粒轰击(例如基因枪，Biolistic，Dupont)；或通过用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，在脂质体、微粒或微囊中包囊；或通过将它们与公知的进入胞核的肽连接来给药；或通过将其与配体连接而参与受体介导的内吞作用(参见例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)(其可用于靶向特异表达所述受体的细胞类型)等来实现。在另一实施方案中，可形成核酸配体复合物，其中所述配体包含融合(fusogenic)病毒肽而破坏内涵体的，从而使得所述核酸避免被溶酶体降解。在另一实施方案中，通过靶向的特异性受体，可以将所述核酸在体内定位以进行细胞特异性摄取和表达(参见例如，美国专利申请公开2005/0002903、PCT公开WO 92/06180、WO92/22635、W092/20316、W093/14188、WO 93/20221)。或者，通过同源重组，可以将所述核酸导入到细胞内并整合到宿主细胞DNA中表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8932-8935；和Zijlstra等，1989，Nature，342：435-438)。

在特定的实施方案中，使用含编码抗体或融合蛋白的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等，1993，Meth.Enzymol.217：581-599)。这些逆转录病毒载体含有病毒基因组正确包装并整合入所述细胞的DNA的必需组分。将编码用于基因治疗的抗体或融合蛋白的所述核酸序列克隆进一种或多种载体，其促进所述核苷酸序列传输到个体中。有关逆转录病毒的更详细描述参见Boesen等人(1994，Biotherapy，6：291-302)所述，其描述了使用逆转录病毒载体将mdr 1基因传输到造血干细胞中，而使得所述干细胞对化疗更有抗性。其它的说明基因治疗逆转录病毒载体应用的文献有Clowes等，1994，J.Clom.Invest.93：644-651；Klein等，1994，Blood，83：1467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，Human Gene Therapy，4：129-141；和Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114。

腺病毒是可用于基因治疗的另一种病毒载体。腺病毒是传输基因到呼吸上皮中的特别有吸引力的载体。腺病毒自然地感染呼吸上皮并引起轻度疾病。基于腺病毒传输系统的其它靶为肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分化细胞的优点。Kozarsky和Wilson(CurrentOpinion in Genetics and Development，3：499-503，1993)阐述了基于腺病毒的基因治疗。Bout等，(Human Gerne Therapy，5：3-10，1994)证明了腺病毒载体在将基因转移到恒河猴的呼吸上皮中的用途。在基因治疗中使用腺病毒的其它例子可参见Rosenfeld等，1991，Science，252：431-434；Rosenfeld等，1992，Cell，68：143-155；Mastrangeli等，1993，J.Clin.Invest.91：225-234；PCT公开WO 94/12649；Wang等，1995，Gene Therapy，2：775-783。在优选的实施方案中，使用腺病毒载体。

还建议在基因治疗中使用腺伴随病毒(AAV)(参见例如，Walsh等，1993，Prpc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300和美国专利5,436,146)。

基因治疗的另一种方式涉及通过诸如电穿孔、脂质体感染、磷酸钙介导的转染或病毒感染等方法来将基因转化到组织培养的细胞中。通常，转化的方法包括用选择性标记物转化细胞。随后将所述细胞置于选择条件条件下来分离被摄取并表达转化基因的细胞。随后将这些细胞传输给个体。

在此实施方案中，将所述核酸导入细胞，然后进行该获得细胞的体内给药。可利用任何本领域公知的方法来完成这种导入，包括但不限于转染、电穿孔、微注射、用含所述核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球状体融合等等。将外源基因导入细胞中的许多技术是本领域公知的(参见例如，Loeffler和Behr，1993，Meth.Enzymol.217：599-618，Cohen等，1993，Meth.Enzymol.217：618-644；和Clin.Pharma.Ther.29：69-92，1985)，且可根据本发明来使用，条件是受体细胞必需的发育和生理学功能没有破坏。所述技术应该提供来将所述核酸稳定转化到所述细胞，以使所述细胞表达所述核酸，并优选该细胞的后代遗传和表达该核酸。

利用本领域公知的不同方法可将所的得到的重组细胞传输给个体。重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选静脉内给予。本领域所属技术人员依据所需效果、患者状态等可以确定所需的细胞量。

导入核酸以用于基因治疗目的的核酸包括任何需要的现有的细胞类型，包括但不限于上皮细胞，内皮细胞，角化细胞，成纤维细胞，肌肉细胞，肝细胞，血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞，多种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等中获得的干细胞。

在优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是所述个体自体同源的。

在重组细胞用于基因治疗的实施方案中，将编码抗体或融合蛋白的核酸序列导入到所述细胞中而使它们被该细胞或其后裔表达，随后将所述重组细胞进行体内给药以产生治疗效果。在特定的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。任何在体外分离并维持的干细胞或祖细胞都可能用于本发明的此实施方案中(参见例如，PCT公开WO 94/08598；Stemple和Anderson，1992，Cell，71：973-985；Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A：229；和Pittelkow和Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61：771)。

在特定的实施方案中，被介入以用于基因治疗的核酸包含可操作地与编码区连接的诱导型启动子，从而通过控制合适转录诱导剂的存在与否来控制所述核酸的表达。

5.5.3 试剂盒

本发明提供药物包或试剂盒，其包含装有本发明抗体的一种或多种抗体的容器。此外，所述的药物包或试剂盒还可包含一种或多种其它用于疾病治疗的预防性试剂或治疗性试剂。本发明还提供药物包或试剂盒，其包含装有本发明药物组合物的一种或多种成份。任选地，这种容器可以附有说明书，其形式符合管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府部门所规定的形式，表明用于向人给药得到制造、使用或销售的管理部门的批准。

本发明提供了可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒包含一种或多种本发明的抗体。在另一实施方案中，该试剂盒还包括一种或多种装在一种或多种容器中的用于治疗癌症的其它预防性试剂或治疗性试剂。在另一实施方案中，该试剂盒还包含一种或多种与一种或多种癌相关癌抗原结合的细胞毒抗体。在某些实施方案中，所述其它的预防性试剂或治疗性试剂为化疗剂。在其它实施方案中，所述预防性试剂或治疗性试剂为生物或激素治疗性试剂。

5.6 治疗型应用的表征和证明

本发明的药物组合物或预防性试剂或治疗性试剂的一些方面优选在用于人之前体外测试其目标治疗活性，例如在细胞培养系统中测试，随后在体内测试，例如在动物模型有机体，例如啮齿动物模型系统内测试。例如，用于确定是否要给予药物组合物的分析包括细胞培养分析，其中在培养基中生长患者的组织样品，并将其暴露于或以其它方式与药物组合物接触，并观察这种组合物对组织样品的作用，例如，对生长和/或在软琼脂中形成集落或在三维基质膜或细胞外基质制剂中形成管状网络的抑制或减少。可从患者的活检组织中获得这种组织样品。这种测试能够鉴定各个患者的治疗最有效的预防或治疗性分子。或者，替代培养患者的细胞，可利用肿瘤细胞或恶性细胞株筛选治疗性试剂和方法。在多种特定的实施方案中，利用参与自身免疫或炎性疾病的细胞类型的代表细胞来进行体外分析(例如，T细胞)，以确定本发明的药物组合物是否对这些细胞类型具有所需的作用。本领域的许多分析标准可用于评价这种存活和/或生长，例如，可通过检测³H-胸苷掺入，通过直接的细胞计数，通过检测已知基因，例如原癌基因(例如fos、myc)或细胞周期标记物的转录活性变化来分析细胞增殖；通过苔盼兰染色来评价细胞活力；基于组织学改变、生长和/或在软琼脂中形成的集落或在三维基质膜或细胞外基质制剂等中形成的管状网络的减少来评价细胞分化。其它的分析包括raft相关性、CDC、ADCC和细胞凋亡分析，如本领域所公知的和实施例的描述。

在用于人之前，可在适合的动物模型系统中检测预防和/或治疗性试剂的组合。这种动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴子、猪、狗、兔子等。可使用本领域公知的任何动物系统。在本发明特定的实施方案中，在小鼠模型系统中检测预防和/或治疗性试剂的组合。这种模型系统广泛地使用并是本领域所属技术人员所公知的。可重复给药预防和/或治疗性试剂。给药方法的几个方面可以不同，例如，所述预防和/或治疗性试剂的临时给药方案，以及这些试剂是分开给药还是作为混合物来给药。

用于本发明方法的优选动物模型为：例如在小鼠效应子细胞上表达FcγR的转基因小鼠，例如，在美国专利5,877,396(本发明将其全部引入作为参考)中所述的任何小鼠模型。用于本发明方法的转基因小鼠包括但不限于携带人FcγRIIIA的小鼠、携带人FcγRIIA的小鼠、携带人FcγRIIB和人FcγRIIIA的小鼠、携带人FcγRIIB和人FcγRIIA的小鼠。

一旦在动物模型中检测了本发明的预防和/或治疗性试剂，则它们就可在临床试验中进行测试以建立其有效性。可根据本领域所属技术人员公知的方法学来实施临床试验，并利用常规试验来优化本发明的组合物的给药剂量和途径以及毒性特征。

本发明的组合治疗的抗炎活性可利用炎性关节炎的各种试验动物模型来确定，这些模型是本领域公知的且如Crofford LJ.和Wilder R.L.，″Arthritisand Autoimmunity in Animals″，in Arthritis and Allied Conditions：A Textbookof Rheumatology，McCarty等(编)，第30章(Lee和Febiger，1993)所述。还可采用炎性关节炎和自体免疫性风湿病的试验或自发性动物模型来评价本发明的组合治疗的抗炎活性。以下是一些评价方法，仅作为例子，并不产生任何限制。

本领域公知的并广泛使用的关节炎或炎性疾病的主要动物模型包括：佐剂诱导的关节炎大鼠模型，胶原诱导的关节炎大鼠和小鼠模型，和抗原诱导的关节炎大鼠、兔子和仓鼠模型，所有上述如Crofford LJ.和WilderR.L.，″Arthritis and Autoimmunity in Animals″，in Arthritis and AlliedConditions：A Textbook of Rheumatology，McCarty等(编)，第30章(Lee和Febiger，1993)中所述，本发明将其全部引入作为参考。

可利用卡拉胶诱导的关节炎大鼠模型来评价本发明的组合治疗的抗炎症活性。卡拉胶诱导的关节炎也可用于兔子、狗和猪的慢性关节炎或炎症研究中。用定量的组织形态度量分析法来确定疗效。使用这种卡拉胶诱导的关节炎模型的方法如Hansra P.等，″Carrageenan-induced Arthritis in theRat″，Inflammatory，24(2)：141-155，(2000)所述。其它常用的方法有本领域所述和公知的酵母聚糖诱导的炎症动物模型。

也可通过检测大鼠卡拉胶诱导的爪水肿的抑制来评价本发明的组合治疗的抗炎活性，使用的方法如Winter C.A.等，″Carrageenan-induced Edemain Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs″，Proc.Soc.Exp.Biol Med.I11，544-547，(1962)中所述的改良方法。此分析方法已用作大多数NSAID的抗炎活性的初级体内筛选法，并认为能测试对人的疗效。所测试的预防性试剂或治疗性试剂的抗炎活性表示为相对于载体剂量对照组，试验组的后爪重量增加的抑制百分比。

此外，炎性肠病的动物模型也可用来评价本发明的组合治疗的疗效(Kim等，1992，Scand.J.Gastroentrol.27：529-537；Strober，1985，Dig.Dis.Sci.30(增刊12′)：3S-10S)。溃疡性结肠炎(Ulcerative cholitis)和克罗恩氏病是可在动物中中诱导的人炎性肠病。可口服给予动物硫酸化多糖包括但不限于支链淀粉、角叉菜、硫酸支链淀粉和硫酸右旋糖苷或化学刺激物，包括但不限于三硝基苯磺酸(TNBS)和醋酸，以诱导炎性肠病。

哮喘动物模型也可用于评价本发明的组合治疗的疗效。一个这种模型的例子为鼠过继性转移模型(adoptive transfer model)，其中TH1或TH2受体小鼠的气源性致敏原激发使TH效应细胞迁移到气道中，并与强烈的中性粒细胞(TH1)和嗜酸性粒细胞(TH2)肺粘膜炎性反应关联(Cohn等，1997，J.Exp.Med.1861737-1747)。

自体免疫性疾病的动物模型也可用于评价本发明的组合治疗的疗效。已经建立了自体免疫性疾病的动物模型例如：I型糖尿病、甲状腺自体免疫性疾病、系统性红斑狼疮和肾小球性肾炎的模型(Flanders等，1999，Autoimmunity，29：235-246；Krogh等，1999，Biochimie，81：511-515；Foster，1999，Semin.Nephrol.19：12-24)。

此外，任何本领域所属技术人员公知的分析方法均可用于评价本发明所公开的组合治疗在预防和/或治疗自体免疫性和/或炎性疾病中的预防和/或治疗作用。

可通过标准药物学方法在细胞培养物或试验动物中测定本发明的预防和/或治疗方案的毒性和效果，例如，测定LD₅₀(50％群体的致死剂量)和ED₅₀(50％群体的治疗有效剂量)。毒性和治疗效果的剂量比值为治疗指数，并表示为比值LD₅₀/ED₅₀。显示治疗指数大的预防和/或治疗性试剂是优选的。也可使用表现出毒性副作用的预防和/或治疗性试剂，这时应注意设计将这种试剂靶向到受影响组织位点的传输系统来最小化对非感染细胞的潜在损伤，从而降低副作用。

从所述细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的所述预防和/或治疗性试剂的剂量范围。这种试剂的剂量优选在包扩ED₅₀且具有很少或没有毒性的循环浓度范围内。依据所采用的剂型和给药途径，所述剂量可以变化。对于用于本发明方法中的任何试剂，所述的治疗有效量最初可以根据细胞培养分析评估。可以在动物模型中配制剂量，以确定包括在细胞培养中测定的IC₅₀(即，实现症状半数最大抑制的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这些信息可用于更准确地确定用于人的剂量。可检测血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱检测。

本发明所使用的治疗性试剂的抗癌活性也可通过用于癌研究的各种试验动物模型来评价，例如，具有人异种移植物的SCID小鼠模型或转基因小鼠或裸鼠，动物模型如仓鼠、兔子等，其是本领域公知的，如Toumer Modelsfor Anticancer Drug Development(1999年编.Fiebig和Burger)；Contributionsto Oncology(1999，Karger)；The Nude Mouse in Oncology Research(1991年编，Boven和Winograd)；和Anticancer Drug Development Guide(1997年编，Teicher)中所述，本发明将其全部引入作为参考。

在用于人体之前，本发明的方案和组合物优选对所需的治疗或预防活性进行体外测试，并随后进行体内测试。可利用肿瘤或恶性细胞株来筛选治疗性试剂和方法。多种本领域的分析标准可用于评价这种存活和/或生长。例如，细胞增殖可通过检测³H-胸苷的掺入，通过直接的细胞计数，通过检测已知基因如致癌基因(例如fos、myc)或细胞周期标记物的转录活性的改变来分析；细胞的活力通过苔盼兰染色来评价；分化根据可视的组织学改变、在软琼脂中的生长和/或集落形成的减少，或在三维基底膜或细胞外基质制剂等中形成的管状网络的减少来评价。

在人中测试之前，可在适合的动物模型系统中检测用于治疗的化合物，该系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴子、兔子、仓鼠等等，以及例如上文所述的动物模型。该化合物可随后用于适合的临床试验。

此外，本领域所属技术人员任何已知的分析方法均可用于评价本发明所公开的治疗组合在治疗或预防癌症、炎性疾病或自体免疫性疾病中的预防性和/或治疗性应用。

5.7 诊断方法

本发明标记的抗体可用于诊断目的以诊断或监测疾病、病症或感染。本发明提供了检测或诊断疾病、病症或感染，特别是自体免疫性疾病，该检测或诊断包括：(a)用免疫特异性结合FcγRIIB的一种或多种抗体抗体检测个体的细胞或组织样品中的FcγRIIB的表达；和(b)比较抗原的水平与对照的水平，如正常组织样本中的水平，因此，抗原的检测水平与抗原的对照水平相比增加是疾病、病症或感染的指征。

利用本发明所述的或本领域所属技术人员公知的传统的免疫组化方法(例如，参见Jalkanen等，1985，J.Cell.Biol.101：976-985；Jalkanen等，1987，J.Cell.Biol.105：3087-3096)，将本发明的抗体用于检测生物样品中的FcγRIIB水平。其它用于检测蛋白基因表达的基于抗体的方法包括免疫分析，例如酶联免疫(ELISA)和放射性分析(RIA)。适合的抗体分析标记是本领域公知的且包括酶标记，如碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶；放射性核素，如碘(¹²⁵I，¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹²¹In)和锝(^99mTc)；发光标记，如鲁米诺；和荧光标记，如荧光素和若丹明。

本发明的一个方面是在人中检测和诊断疾病、病症或感染。在一个实施方案中，诊断包括：a)向个体给予有效量的免疫特异性结合FcγRIIB的标记的抗体(例如肠胃外、皮下或腹腔内给予)；b)给药后等待一定的时间间隔，以使得所述标记的抗体在所述个体的表达FcγRIIB的位点达到优选浓度(并将来结合的标记分子清除到背景水平)；c)测定背景水平；和d)检测个体中的标记的抗体，于是，检测到高于背景水平的上述标记的抗体表明所述个体患有所述疾病、病症或感染。根据这一实施方案，用成像部分来标记所述抗体，该成像部分能够利用本领域所属技术人员公知的成像系统来检测。可通过不同方法，包括将检测到的标记的分子的量与以前检测到的特定系统的标准值进行比较来测定背景水平。

本领域所属技术人员应理解，所述个体的大小和所用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的质量。使用放射性核酸部分时，对于人个体，所注射的放射性的量通常为5-20毫居里^99mTc。随后将所标记的抗体优选在含有该特异性蛋白的细胞区域积累。体内肿瘤成像在S.W.Burchiel等，″Immunopliarmacokinetics of Radiolabeled Antiboby and TheirFragments.″(在Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer的第13章)，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编，Masson Publishing Inc.(1982)中有描述。

根据一些变量包括所用的标记类型、给药方式，给药后使得所述标记抗体在所述个体的位点优选地积累并使未结合的标记分子清除至背景水平的时间间隔为6至48小时、或6至24小时、或6至12小时。在另一实施方案中，给药后的时间间隔为5至20天或5至10天。

在一个实施方案中，通过重复诊断所述疾病、病症或感染的方法来监测该疾病、病症或感染，例如，在初次诊断后1个月、初次诊断后6个月、初次诊断后1年重复。

利用本领域公知的用于体内扫描的方法，可检测所述个体中存在的所述标记分子。这些方法依赖于所使用的标记的类型。本领域所属技术人员能够确定用于检测具体标记的适合方法。可以用于本发明的诊断方法中的方法和装置包括但不限于：计算机断层扫描(CT)，全身扫描如正电子断层扫描仪(PET)，核磁共振成像(MRI)和超声扫描。

在特定的实施方案中，用放射性核素来标记分子并利用放射性反应外科设备来在所述患者中进行检测(Thurston等，美国专利5,441,050)。在另一实施方案中，用荧光化合物来标记所述分子，并在所述患者中利用荧光反应扫描设备来检测。在另一实施方案中，用正电子发射金属来标记所述分子，并在所述患者中利用正电子发射断层扫描设备来检测。在另一实施方案中，用顺磁来标记所述分子，并在所述患者中利用核磁共振成像(MRI)来检测。

6. 实施例

6.1 单克隆抗体的制备

用ATCC登记号分别为PTA-4591和PTA-4592的克隆3H7或2B6产生小鼠单克隆抗体。产生特异性结合FcγRIIB的小鼠单克隆抗体，其结合亲和性高于所述单克隆抗体结合FcγRIIA的亲和性。用纯化自293细胞的上清液的FcγRIIB来免疫转基因FcγRIIA小鼠(由洛克菲勒大学的Dr.Ravetch实验室制备)，该293细胞已用编码人FcγRIIB受体的细胞外结构域，即残基1-180的cDNA转染。产生来自这些小鼠脾细胞的杂交瘤细胞株并筛选以高于所述抗体结合FcγRIIA的亲和性特异性结合FcγRIIB的抗体。

6.2 抗体筛选和表征

6.2.1 材料与方法

利用ELISA筛选杂交瘤培养物的上清液对FcγRIIA或FcγRIIB的免疫反应。在每一种情况下，用100ng/孔的FcγRIIA或FcγRIIB包被培养板。通过在650nm检测吸光度，用山羊抗小鼠HRP轭合的抗体来检测所述抗体与特定受体的结合。

在阻断性ELISA试验中，监测杂交瘤上清液的抗体阻断聚集的IgG与FcγRIIB的结合的能力。用适合的“阻断试剂”来封闭所述培养板，并用洗涤缓冲液(PBS加0.1％Tween)洗三次(200μl/孔)。该培养板在37℃下与杂交瘤上清液一起预孵育1小时。封闭后，加入固定量的聚集的生物素化人IgG(1μg/孔)到所述孔中使得所述聚集物与FcγRIIB受体结合。此反应在37℃进行2小时。进一步洗涤后，用检测结合的聚集IgG的链霉亲和素辣根过氧化物酶轭合物进行监测。在650nm处的吸光度与结合的聚集IgG成比例。

在β-己糖苷酶释放分析中，监测杂交瘤上清液的抗体抑制Fcγ-诱导的β-己糖苷酶释放的能力。用人FcγRIIB转染RBL-2H3细胞；用0.03μg/mL至30μg/mL的不同浓度的山羊抗小鼠F(ab)2片段来刺激细胞；用小鼠IgE(0.01μg/mL)单独或与抗FcγRIIB抗体一起致敏。在37℃孵育14、时后，旋下所述细胞；收集上清液；并裂解所述细胞。在比色分析中用p-硝基苯基N-乙酰-βD-氨基葡萄糖苷测定上清液中的释放的β-己糖苷酶活性。所述释放的β-己糖苷酶活性表示为释放活性相对于总活性的百分比。

BIAcore分析：通过在293H细胞中表达的受体的可溶性细胞外结构域，在BIAcore 3000生物传感器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)中，利用表面细胞质基因共振来分析与CD32A-H¹³¹、CD32A-R¹³¹或CD32B结合的抗体。

根据制造商建议的程序，将捕获的抗体、山羊抗小鼠Fc-特异性抗体的F(ab′)₂片段(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)固定在CM-5传感器芯片上。简言之，利用含0.2M N-乙基-N-(3-乙基氨(dietylamino)-丙基)碳二亚胺和0.05M N-羟基-琥珀酰亚胺的溶液注射来活化传感器芯片表面上的羧基。随后在10mM醋酸钠，pH5.0中将F(ab′)₂片段注射到活化的CM-5表面，流速为5μl/分钟，进行420秒，然后用1M乙醇胺来去活化。在HBS-P缓冲液中进行结合试验，该缓冲液含10mM Hepes，pH7.4，150mM NaCl和0.005％P20表面活性剂。通过注射300nM-抗体溶液到CM-5芯片上捕获每一单克隆抗体，该注射的流速为5μl/分钟，共进行240分钟，随后注射浓度为100nM的单体可溶性受体，流速为50μl/分钟，共进行120秒，解离时间为180秒。通过脉冲注射pH1.5的50mM甘氨酸和50mM NaOH来进行F(ab′)₂ GAM表面的再生。通过将各可溶性受体注射到没有捕获抗体的固定的F(ab′)₂GAM表面来获得参考曲线。减去参考曲线并将反应标准化为捕获抗体的相同水平。为了获得可溶性受体与捕获的抗体结合的动力学参数，将对应浓度下的对应IgG的结合曲线减去。用单独的ka/kd拟和来分析所产生的曲线。KD值计算为在两种不同的浓度下的四个曲线的平均值。

FACS分析：用各种抗体着色表达FcγRIIB的CHO细胞并进行FACS分析。在一系列试验中，直接标记所述细胞来测定所述单克隆抗体是否识别所述受体。

在阻断FACS试验中，监测杂交瘤上清液中的抗体阻断聚集的IgG与FcγRIIB结合的能力。对于每一样品，将约1百万个细胞(表达FcγRIIB的CHO细胞)在冰上与2μg的同种型对照(小鼠IgG1)或与2B6或3H7抗体孵育30分钟。用PBS+1％BSA洗涤细胞1次，并在冰上与1μg聚集的生物素化人IgG孵育30分钟。洗涤细胞并加入二级抗体，加入山羊抗小鼠FITC来检测结合的抗体，加入PE轭合的链霉亲和素来检测结合的聚集生物素化人IgG，并在冰上孵育30分钟。洗涤细胞并用FACS进行分析。

着色B淋巴细胞以检测FcγRIIB和CD20的存在。在冰上将每一样品的200μl″白血球衣″与2μg的同种型对照或单克隆抗体2B6或3H7一起孵育。用PBS+1％BSA洗涤细胞1次，并在冰上与1μl的山羊抗小鼠PE抗体孵育30分钟。洗涤细胞1次并在所述样品中加入CD20-FITC抗体(2μg)，在冰上孵育30分钟。用PBS+1％BSA洗涤所有样品1次并用FACS分析。

用2B6、3H7和IV.3抗体，随后用山羊抗小鼠青色素(Cyanine)(Cy5)轭合的抗体着色人PBMC(双色染色，对B淋巴细胞用轭合的抗CD20-FITC，对于单核细胞用轭合的抗CD14-PE，对NK细胞用轭合的抗CD56-PE，和对粒细胞用轭合的抗CD16-PE)。

ADCC分析：用2，2′：6′，2″-三吡啶-叔-6″-二羧酸二乙酰氧甲基酯(DELFIABATDA试剂，Perkin Elmer/Wallac)来标记4-5×10⁶个表达Her2/neu抗原的靶细胞(IGROV-I或SKBR-3细胞)。向细胞中加入BATDA反应试剂并将该混合物在37℃、5％CO₂下孵育至少30分钟。随后用磷酸缓冲液洗涤所述细胞，例如用含0.125mM亚磺毗哇酮(sulfinpyrazole)的PBS，和含0.125mM亚磺毗哇酮的培养液来冲洗。将标记的靶细胞加入到效应子细胞，例如PBMC中来产生约50∶1、75∶1或100∶1的效应子∶靶比例。通过使全血细胞在聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)(Sigma)上分层并在室温下500g离心30分钟来分离PBMC。收集白细胞层作为基于铕的ADCC分析的效应子。冷冻或新鲜分离的淘选的单核细胞(Advanced Biotechnologies，MD)作为效应子，以100∶1到10∶1的各种效应子与靶比值与肿瘤靶细胞株一起使用，且所述抗体的浓度的滴定度为1-15μg/ml。在ADCC分析中将用细胞因子刺激的冷冻存储的单核细胞用作效应子细胞。如果冷冻的单核细胞表现优良，则其将常规地使用，否则使用新鲜的细胞。通过用细胞因子GM-CSF或M-CSF处理来制备MDM，已知该细胞因子能提高培养的单核细胞的活力和分化。用细胞因子刺激MDM并用FACS分析来测定各种FcγR(I，HA，HB和IIIA)的表达。

在靶细胞上表达的抗原，即Her2/neu特异性抗肿瘤抗体存在的情况下，和在抗FcγRIIB抗体存在或不存在的情况下，在37℃、5％CO₂下孵育所述效应子和靶细胞至少2小时，且至多16小时。嵌合4D5抗体被工程化而含有N297A突变，将其作为阴性对照，因为该抗体通过其可变区结合肿瘤靶细胞。这个位点处的糖基化缺失消除了该抗体的Fc区与FcγR的结合。商业提供的人IgG1/k用作抗FcγRIIB抗体的同种型对照。收集细胞上清液并加入至酸性铕溶液中(例如DELFIA铕溶液，Perkin Elmer/allac)。铕-TDA螯合形成的的荧光通过时间分辩荧光仪(time-resolved fluorometer)(例如Victor1420，Perkin Elmer/Wallac)来定量。通过将靶细胞分别与1％TX-100和单独的培养液孵育来测定最大释放(MR)和同时释放(SR)。在无抗体存在的情况下，用靶和效应子细胞孵育来测定抗体非依赖性细胞毒性(AICC)。每个分析优选重复三次。平均的特异裂解百分率计算为：试验性释放(ADCC)-AICC)/(MR-SR)×100。

6.2.2 克隆3H7产生的单克隆抗体的表征

不同批次的杂交瘤培养物的直接结合：利用ELISA分析来比较不同批次的杂交瘤培养物与FcγRIIA和FcγRIIB的直接结合(图1A)。检测编号1、4、7、9、和3的上清液的特异性结合，并且将其结合与商业提供的抗体FL18.26比较。如图1A(左侧插图)所示，来自克隆7的上清液具有与FcγRIIB的最大结合，其在饱和状态比商业提供的抗体与FcγRIIB的结合高约4倍。然而，克隆7的上清液与FcγRIIA几乎没有任何亲和性，如右侧插图所示，而商业提供的抗体与FcγRIIA的结合要高至少4倍。

克隆3H7产生的抗体与FcγRIIA和FcγRIIB的直接结合：检测3H7上清液原液和纯化的3H7上清液的结合(图1B)。在每一种情况下，以70μg/ml的浓度提供所述上清液并稀释至多6倍。如图1B所示，在饱和状态下，3H7上清液结合FcγRIIB是其结合FcγRIIA的4倍。利用蛋白G柱纯化，3H7上清液与每种免疫原的绝对结合得到提高。

由克隆3H7产生的抗体阻断聚集的人IgG与FcγRIIB的结合：如果杂交瘤上清液中的抗体在IgG结合位点结合FcγRIIB并阻断IgG结合，那么所述聚集的IgG不能与该受体结合，且因而可在650nm处不能检测到吸光度。有这种效果的抗体为“阻断性试剂”，其阻断FcγRIIB中的IgG结合位点。作为对照，利用无阻断、利用对照上清液和利用来自克隆3H7的上清液来进行ELISA。如图2所示，3H7上清液完全阻断IgG结合，因为聚集的IgG不能结合受体，这以650nm处没有吸光度为证。然而，所述对照上清液不能阻断IgG的结合，聚集的IgG结合受体，这以650nm处可读出的吸光度为证。所述对照上清液与没有阻断的条件相似。

克隆3H7产生抗体的对细菌和哺乳动物FcγRIIB的直接结合的比较：如图3所示，来自3H7克隆的上清液同等结合哺乳动物和细菌的FcγRIIB。在饱和条件下，所述3H7上清液结合哺乳动物和细菌FcγRIIB比其结合FcγRIIA高约3倍。因此，来自克隆3H7的单克隆抗体能够特异性结合哺乳动物的已被翻译后修饰(例如，糖基化)的FcγRIIB。

克隆3H7产生抗体的与FcyRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA的直接结合：利用ELISA分析来比较3H7细胞株的杂交瘤培养物的上清液与FcyRIIA、FcγRIIIA和FcγRIIA的直接结合(图4)。

克隆3H7产生的抗体对FcγRIIIA没有亲和性，且其结合FcγRIIB的亲和性高于其结合FcγRIIA的亲和性4倍。

6.2.2.1 克隆2B6产生的单克隆抗体的表征

由克隆2B6产生的抗体和其它三种商业提供的单克隆抗体与FcyRII直接结合的比较：通过ELISA分析，将克隆2B6产生的抗体与FcγRIIA和FcγRIIB的结合与其它三种商业提供的抗体AT10、FL18.26和IV.3与FcγRII的结合进行比较。如图5A所示，由克隆2B6产生的抗体结合FcγRIIB比其它商业提供的抗体高达4.5倍。此外，由克隆2B6产生的抗体与FcγRIIA具有最小的亲和性，而其它三种商业提供的抗体以饱和方式结合FcγRIIA，且是来自克隆2B6的抗体结合FcγRIIA的两倍(图5B)。

由克隆2B6产生的抗体阻断聚集的人IgG与FcγRIIB的结合：通过阻断性ELISA分析来检测克隆2B6产生的抗体阻断聚集的人IgG与FcγRIIB结合的能力，并与由克隆3H7产生的抗体的阻断进行比较。如图6A所示，所述对照上清液在IgG结合位点不结合FcγXIIB，而聚集的IgG可结合该受体且由此在650nm处的吸光度最大。然而，克隆3H7阻断IgG的结合高达75％。克隆2B6完全阻断IgG结合位点的结合且使聚集的IgG不与该受体结合，即使在高的稀释度下在650nm处也不能检测到吸光度。图6B以柱状图显示该数据。

利用双色染色FACS分析检测2B6抗体和聚集的IgG在结合FcγRIIB中的竞争：将双色染色FACS分析用来表征在全长FcγRIIB转染的CHO细胞中克隆2B6产生的抗体。

如图7C所示，由克隆2B6产生的抗体在CHO中有效地阻断聚集的IgG与FcγRIIB受体结合，因在所述细胞与所述单克隆抗体预孵育之后，没有观察到生物素化聚集的IgG染色。仅在较低的右侧插图中，所述细胞被染色，这表明大多数细胞与克隆2B6的单克隆抗体结合。在对照试验中，用IgG1作为同种型对照(图7A)，当所述细胞用同种型标记的IgG染色时，没有观察到染色，因为单体IgG不以任何可检测的亲和性与FcγRIIB结合，而在图7B中，约60％的细胞用聚集的IgG来标记，其能够结合FcγRIIB。

利用表面胞浆基因共振分析对CD32B的特异性和选择性：利用表面胞浆基因共振分析研究了对人CD32B和CD32A的特异性和相对亲和性。通过固定的山羊抗小鼠抗体的F(ab′)₂片段在芯片表面段捕获所有额抗体。注入可溶性单体形式的人CD32A-H¹³¹、CD32A-R¹³¹或CD32B来监测与所捕获的抗体间的相互作用。如图8A-C所示，在不存在与CD32A的可检测结合的情况下(图B和C)，2B6与CD32B(图A)相互作用。良好表征的商业化的抗huCD32抗体和KB61也用于比较分析。KB61显示与两受体都结合。因此，在不存在可检测的CD32A识别的情况下，2B6排它性地与CD32B反应。

6.2.3  FACS分析

单克隆抗FcyRIIB抗体和CD20共着色人B淋巴细胞：用双着色FACS分析表征由克隆2B6和3H7在人B淋巴细胞中产生的抗体。用FITC轭合的抗CD20抗体(用于选择B淋巴细胞群)和山羊抗小鼠过氧化物酶标记的克隆3H7和2B6产生的抗体着色细胞。横轴代表抗CD20抗体荧光的密度，纵轴代表单克隆抗体荧光的密度。如图9B和C所示，用抗CD20抗体以及由克隆2B6和3H7产生的抗体来对细胞双着色，然而，由克隆2B6产生的抗体比克隆3H7产生的抗体显示更强的着色。图9A显示了同种型对照，即小鼠IgG1的着色。

表达FcγRIIB的CHO细胞的着色：用IgG1同种型对照来着色稳定表达FcγRIIB的CHO细胞(图10A，左侧插图)，或用3H7杂交瘤的上清液(图10B，右侧插图)来着色。山羊抗小鼠过氧化物酶轭合的抗体用作次级抗体。随后用FACS来分析所述细胞，用3H7杂交瘤上清液着色的细胞显示较强的荧光信号且其峰向右侧偏移，这表明通过H7杂交瘤的上清液在CHO细胞中检测到了FcγRIIB。与用IgG1着色的细胞比较，用2B6杂交瘤的上清液着色细胞也显示处显著的荧光且峰移向右侧，这表明利用2B6杂交瘤的上清液在CHO细胞中检测到了FcγRIIB。

将表达hyFcγRIIB的CHO细胞与抗CD32B抗体、2B6或3H7孵育，在冰上洗涤细胞并向该细胞中加入9μg/ml的聚集的人IgG。用FITC轭合的山羊抗人IgG来测定所述的人聚集的IgG。通过FACS来分析样品，在聚集的人IgG存在下，用2B6或3H7标记的细胞显示处显著的荧光峰(图11)。2BG抗体完全阻断聚集的IgG的结合，这以向左移的荧光峰为证。而所述3H7抗体部分阻断聚集的IgG的结合，如中间的荧光峰所示。其它抗体，即1D5、1F2、2E1、2H9和2D11不阻断聚集的IgG的结合。在独立的样品组中，利用山羊抗小鼠PE轭合的抗体，结合细胞上受体的每种抗体的量也被测定(插图)。

细胞表面CD32B的识别：进行试验以测试所述抗体区分细胞上表达的CD32B和CD32A并识别人细胞株上的天然CD32B分子的能力。为评价抗体的特异性，在FACS分析中，利用293-HEK人细胞Daudi、Raji和THP-I细胞检测2B6和pan-抗-CD32抗体，即FLI.826，该293-HEK人细胞被编码人CD32A-R¹³¹或CD32B蛋白的表达载体稳定转化(图12A-J)。

2B6与CD32B转染的293-HEK，以及Daudi和Raji细胞反应(表达CD32B的Burkitt′s淋巴瘤衍生的淋巴母细胞株)，而其不着色已知排它地表达CD32A(H¹³¹形式)的THP1单核细胞株。相反，FLI8.26与所有细胞株反应，这表明在CD32A与CD32B之间没有偏好。

利用2B6、3H7和IV.3抗体对人外周血白细胞进行的FACS的特征：抗FcγRIIB抗体和IV.3抗体的FACS特征显示出它们能区分在人造血细胞上表达的两种FcγRII同种型，即HB和HA。用于确定FcγRII的第一抗体之一IV.3(可从商业途径获得)显示出对FcγRIIA有结合偏好。

在主要的人造血细胞中同种型表达具有特征性和功能性显著差异。人B淋巴细胞排它性地表达huFcγRIIB同种型，而人单核细胞表达显性的huFcγRIIA同种型。粒细胞为FcγRIIA显著阳性，且有限的证据表明，FcγRIIB迁移地在该细胞群中表达(Pricop等，2000，J.Immunol.166.531-537)。为进一步表征抗FcγRIIB抗体的反应性，用抗FcγRIIB抗体2B6和3H7并用IV.3着色huPBL，IV.3优选(但非排它地)识别所述受体的FcγRIIA同种型，基于FSC对SSC设门(gating)，选择白细胞群(图13)并用特异性标记物来鉴定：CD20(B细胞)，CD56或CD16(NK细胞，淋巴细胞门)，CD14(单核细胞)和CD16(粒细胞，中性粒细胞门)(图13)。2B6、3H7均一地着色CD20-阳性细胞(B细胞)，IV.3着色大部分的CD20-阳性细胞。对于CD16/CD56阳性NK细胞，没有观察到着色，而仅有部分CD14-(单核细胞)和CD16-(粒细胞)阳性细胞被2B6、3H7着色。相反，IV.3强烈着色绝大部分的CD-14阳性单核细胞和全部CD16阳性粒细胞(图13)。一边是2B6与3H7，另一边是IV.3，它们之间的反应性的差异表明该新的单克隆抗体与FcγRIIB反应强烈，但不与FCγRIIA反应，而IV.3在体内不能区分FcγRIIA与FcγRIIB同种型。

6.2.4 2B6 释放的B-己糖胺酶的抑制

为检验抗CD32B抗体在调节速发型超敏反应中的作用，研究了活化性受体(FcεRI)和抑制性受体(FcγRIIB)诱导共聚集的作用。选择大鼠嗜碱性白血病细胞株，即RBL-2H3作为模型系统，因为其作为过敏反应模型在本领域被广泛用于研究IgE-介导的肥大细胞活化的潜在机制(Ott等，2002，J.Immunol.168：4430-9)。将表达FcγRIIB的转染的RBL细胞悬浮在含0.01μg/ml鼠抗DNP IgE的新鲜培养液中，并以2×10⁴细胞/孔的浓度种入96孔培养板。在37℃有CO₂的条件下过夜孵育细胞，随后用预温的释放缓冲液(10mM HEPES，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.4mM磷酸二氢钠、5.6mM葡萄糖、1.8mM氯化钙，1.3mM硫酸镁和0.04％BSA，pH7.4)洗两次。在37℃，在2B6抗体、1F2抗体或鼠IgG1同种型对照存在的条件下，在100μl/孔的缓冲液中用系列稀释的与嵌合的4-4-20抗体复合的BSA-DNP-FITC，或与嵌合的D265A 4-4-20抗体复合的BSA-DNP-FITC处理细胞。可选择地，用多克隆山羊抗小鼠IgG的F(ab′)₂片段来激发所述细胞以聚集FcγRI(Genzyme)。发生FcγR的交联，因为多克隆抗体识别与FcγRI结合的鼠IgE抗体的轻链。此试验的流程如图14A所示。

30分钟后将所述细胞置于冰上终止反应。移除每孔的50μl上清液并等渗裂解所述细胞。将细胞裂解液与p-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(5mM)孵育90分钟，用甘氨酸(0.1M，pH10.4)来终止该反应并在3分钟后检测405nm处的吸光度。将释放的β-己糖胺酶计算为总培养液OD/总的上清液OD/总的上清液+总的细胞裂解液OD。

结果：为检测ch2B6限制由活化的受体激发的炎症或过敏反应的能力，利用如上述的F(ab′)₂片段来聚集活化的受体或抑制性受体与活化性受体的组合。当仅用IgE致敏细胞时，多克隆山羊抗小鼠IgG的F(ab′)₂片段识别与FcεRI结合的鼠IgE的轻链，聚集这些活化性受体并释放β-己糖胺酶(脱颗粒的标记物)(Aketani等，2001，Immunol.Lett.75：185-9)，伴随增加的IgE而增加(图14B)。相反，当与2B6或1F2孵育后用IgE致敏细胞，F(ab′)₂片段在效果上共交联大鼠FcεRI和CD32B，并使β-己糖胺酶释放相对于用不相关的鼠IgG₁同种型对照匹配抗体预孵育的致敏细胞显著降低。在单独用抗CD32B抗体处理的细胞中没有测得超出背景的任何脱颗粒(数据未显示)。因此，所述人抑制性受体，即CD32B可诱导大鼠嗜碱性细胞的阴性信号，这证实了这些转染子可作为抗人CD32B抗体研究的模型。

为了测试抗CD32B抗体是否还可以提高这种反应，通过阻断CD32B以防止所述抑制性受体和活化性受体共结合。当抗原通过抗原结合表位与表面结合的IgE，且通过与该抗原自身复合的抗原特异性IgG的Fc决定子与CD32B同时相互作用时，认为会生理性发生这些受体的共结合(图15A)。为模拟这种状态，通过开发能与IgE、IgG或二者复合的抗原替代物，操作RBL-2H3模型以获得FcεRI和CD32B的共结合。用鼠IgE抗DNP单克隆抗体致敏HuCD32B⁺RBL-2H3细胞。所述刺激抗原，即BSA-DNP进一步与FITC轭合以提供额外的抗原表位，该抗原表位可被4-4-20的嵌合形式(一种鼠抗荧光素抗体，其Fc部分被人IgG₁ Fc取代以优与人CD32B的结合)所识别。还产生具有在位置265处含有突变(天冬氨酸变为丙氨酸)的人IgG1Fc的4-4-20嵌合形式。该嵌合的D265A 4-4-20抗体缺乏结合FcγR，包括CD32B的能力。BSA-DNP-FITC诱导β-己糖胺酶从IgE-致敏的RBL-2H3细胞中的剂量依赖性释放(图15C)。

当刺激抗原为与嵌合的D265A 4-4-20复合的BSA-DNP-FITC时，观察到相同程度的脱颗粒，这表明BSA-DNP-FITC-嵌合的D265A 4-4-20如所设想的那样不能招募CD32B到活化的受体。在存在与嵌合的4-4-20复合的BSA-DNP-FITC的条件下，观察到β-己糖胺酶释放的实质性降低(图15B)。因此，多价抗原能够聚集FcεRI，因而产生脱颗粒，而与IgG复合的替代抗原共聚集CD32B而使脱颗粒减少。为了阻断CD32B并使同时结合FcγR的机会最小化，在用免疫复合抗原活化前将制备的F(ab)₂片段和细胞与2B6F(ab)₂一起预孵育。在这些条件下，在单独用多价抗原处理的细胞中观察到β-己糖胺酶释放百分比恢复至最高水平(图15C)。在较高浓度的免疫复合抗原下，仍观察到减少的脱颗粒，这可能是因为ch4-4-20与2B6 F(ab)₂竞争CD32B的Fc结合位点。这些数据显示2B6能够功能性地阻断CD32B的Fc结合位点，阻止活化性和抑制性受体与IgG-复合的抗原共联接。作用的可能模式可能可以用于调节免疫复合物介导的细胞活化。

6.2.5 体外ADCC检测

6.2.5.1 使用PBMC，用卵巢和乳腺癌细胞株，CH4D5介导有效的ADCC

为了确定IGROV-I、OVCAR-8和SKBR-3细胞是否表达Her2/neu抗原，用纯化的4D5或ch4D5抗体在冰上着色细胞。用含叠氮钠的PBS/BSA缓冲液洗去未结合的抗体，并分别用与PE轭合的山羊抗小鼠或山羊抗人抗体来测定4D5或ch4D5的结合(Jackson Laboratories)。不相关的IgG1抗体(BectonDickinson)作为非特异性结合对照。如图16A-C所示，与乳腺癌细胞株相比，所述卵巢肿瘤细胞株表达较低的Her2/neu抗原，且平行评价这些细胞株可确定本发明的抗FcγRIIB抗体的清除肿瘤的严谨性。

人单核细胞是参与ADCC的效应子细胞群，其表达活化性和抑制性受体。用FACS分析检测FcγR的表达，使用一些冷冻的单核细胞，因为这些细胞会作为效应子过继性转移以研究ch2B6在肿瘤清除中的作用。在商业获得的含10％人AB血清的基础培养液和含人血清和25-50ng/ml的GM-CSF的基础培养液中融化冻存的淘选的单核细胞。将细胞直接着色，或使其向巨噬细胞成熟7-8天(MDM)，提出塑料，随后用IV.3-FITC(抗huFcγRIIA)、32.2-FITC(抗FcγRI)、CD16-PE(Pharmingen)或3G8(抗FcγRIII)-山羊抗小鼠PE、3H7(抗FcγRIIB)以及单核细胞的CD14标记物(Pharmingen)着色，相关的同种型作为对照。两种供体的MDM的代表性FACS谱如图17A-C所示，描述了在新鲜融化的单核细胞和培养的单核细胞上的FcγR表达。

这些结果表明FcγRIIB在单核细胞中中度表达(5-30％依赖于供体)。但是，当其成熟为巨噬细胞时，这种表达增加。最初的数据显示在人肿瘤样本中的肿瘤浸润巨噬细胞对FcγRIIB阳性着色(数据未显示)。在一些冷冻的单核细胞中发现FcγR的模式和形态学分化为巨噬细胞的能力是可重复的。这些数据表明这种来源的细胞满足过继性转移试验的要求。

使用PBMC，用卵巢和乳腺癌细胞株，Ch4D5介导的有效的ADCC：基于铕的分析中检测抗Her2/neu抗体的ADCC活性。卵巢细胞株、IGROV-I和乳腺癌细胞株SKBR-3在4小时检测中用作标记的靶，人PBL用作效应子细胞。图18A和B显示，在介导表达Her2/neu的靶裂解中ch4D5具有功能性活性。随后检测本发明的抗体对抗Her2/neu抗体的ADCC活性的作用。

6.2.5.2 嵌合的抗CD32抗体，即CH2B6体外介导抗体介导的细胞毒性 作用(ADCC)

检测嵌合的抗CD32B抗体(ch2B6)及其非糖基化形式(ch2B6AgIy)在体外针对表达CD32B的B细胞淋巴瘤株、Daudi和Raji细胞介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。还在Daudi细胞中检测人源化抗CD32B抗体(h2B6)及其非糖基化形式(hu2B6YA)。

抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)的评价方法类似于如上所述(Ding等，1998，Immunity)和本发明所描述。简言之，来自表达CD32B的B细胞淋巴瘤株、Daudi和Raji细胞的靶细胞用铕螯合的2，2′：6′，2″-三吡啶-叔-6″-二羧酸二乙酰氧甲基酯(DELFIA BATDA Reagent，Perkin Elmer/Wallac)或铟-111来标记。随后用嵌合抗CD32B(ch2B6)或非糖基化嵌合抗CD32B(ch2B6AgIy)抗体以如图20和21所示浓度，或用ch2B6、ch2B6Agly、hu2B6和hu2b6YA以图21所示浓度来调理所标记的靶细胞(包被)。通过Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia)梯度离心分离的外周血单核细胞(PBMC)用作效应子细胞(效应子对靶的比值为75比1)。在37℃、5％CO₂孵育3.5小时后，收集细胞上清液并加入到酸性铕溶液(DELFIA铕溶液，PerkinElmer/Wallac)中。铕-TDA螯合物形成的荧光度在时间分辩荧光仪(Victor²1420，Perkin Elmer/Wallac)或伽马计数器(Wizard 1470，Wallac)中定量。通过靶细胞分别与2％Triton X-100和单独的培养液孵育测定最大释放(MR)和自发释放(SR)。将靶与效应子细胞在无抗体存在的条件下孵育以测定抗体非依赖性细胞性细胞毒作用(AICC)。每一分析重复三次。平均特异性裂解百分比计算为：(ADCC-AICC)/(MR-SR)×100。

如图20和21所示，针对表达CD32B的B细胞淋巴瘤株、Daudi和Raji细胞，嵌合抗CD32B抗体ch2B6体外介导ADCC的浓度为高于约10ng/ml。此活性似乎是Fc依赖性的，因为该抗体不与Fc-受体相互作用的非糖基化形式ch2B6Agly在该分析活性降低。如图22所示，人非糖基化形式不能与Fc-受体发生相互作用。

6.2.6 体内ADCC分析

6.2.6.1  FcyRIIB抗体在使用人肿瘤细胞株的异种移植物鼠模型中的活 性

将6至8周的雌性Balb/c裸鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME；Taconic)用于建立异种移植物卵巢和乳腺癌模型并在BIOCON公司(Rockville，Maryland)维持(参见所附的方案)。将小鼠养在2级生物安全设备中以用于异种移植物模型，该模型利用腹水衍生的卵巢细胞和胸膜衍生的乳腺癌细胞作为肿瘤来源。在这些试验中将小鼠分为4组并每周监测三次。记录小鼠的重量和存活时间，肿瘤生长的标准是腹部膨胀和可触知的肿瘤。将显示明显不适迹象和肿瘤重量达到5g的小鼠用二氧化碳安乐死并尸解。所述抗体处理的动物在对照组之后再观察2个月。

用肿瘤细胞株建立异种移植物肿瘤模型。为建立异种移植物肿瘤模型，将5×106个活的IGROV-I或SKBR-3细胞用Matrigel皮下注射入三只年龄体重匹配的雌性裸无胸腺鼠(Becton Dickinson)中。通过以下公式计算肿瘤的估计体重：长度×(宽度)²/2，不超过3g。为了进行细胞的体内扩增传代，分离锚定依赖性肿瘤，每克肿瘤加入1μg胶原酶(Sigma)37℃过夜以分散细胞。

皮下注射IGROV-I细胞使肿瘤快速生长，而腹腔途径引起腹膜癌扩散而在2个月内杀死小鼠。因为IGROV-I细胞5周内形成肿瘤，因此在肿瘤注射后第一天，将单核细胞作为效应子与治疗性抗体ch4D5和ch2B6以4μg每克小鼠体重(mbw)的剂量(表8)腹腔内共注射。初次注射后，每周注射抗体，持续4-6周。两周一次补充人效应子细胞。一组小鼠不接受治疗性抗体但用ch4D5 N297A和人IgG1来注射，其分别作为抗肿瘤和ch2B6抗体同种型的对照抗体。

表8：在裸鼠异种移植物肿瘤模型中，用抗Her2neu抗体、ch4D5和ch2B6、抗FcγRIIB抗体进行的肿瘤清除研究，该裸鼠用过继性转移的人单核细胞作为ADCC效应子。MWB(小鼠体重)。

每组8只小鼠	第0天皮下给予肿瘤细胞	第一天腹腔内给予单核细胞	第1天腹腔内给予4μg/gm/mbw的ch4D5	第1天腹腔内给予4μg/gm/mbw的ch4D5N297A	第1天腹腔内给予4μg/gm/mbw的ch2B6N297A	第1天腹腔内给予4μg/gm/mbw的人IgG1
							A	+	-	-	-	-	-
B	+	+	-	-	-	-
							C	+	+	+	-	-	-
D	+	+	+	-	+	-
							E	+	+	-	-	+	-

F

+

+

-

+

-

+

如表8所示，需要6组，每组8只小鼠来检测抗FcγRIIB抗体在肿瘤清除中的作用，该检测利用靶和效应子的一种组合，抗体浓度的两种不同组合。这些组为：A)肿瘤细胞，B)肿瘤细胞和单核细胞，C)肿瘤细胞、单核细胞、抗肿瘤抗体ch4D5，D)肿瘤细胞、单核细胞、抗肿瘤抗体ch4D5和抗FcγRIIB抗体，如ch2B6，E)肿瘤细胞、单核细胞和抗FcγRIIB抗体，如ch2B6，以及F)肿瘤细胞、单核细胞，ch4D5 N297A和人IgG1。抗体浓度的不同组合以相似的方案检测。

由于SKBR-3细胞过表达Her2/neu，用乳腺癌细胞株，即SKBR-3通过IGROV-I模型进行平行研究。这会增加评价抗FcγRIIB抗体在肿瘤清除中的作用的严谨性。基于用IGROV-I细胞的肿瘤清除研究的表现，对其它靶的实验室设计进行调整以进行进一步试验。

基于表8中每组的肿瘤大小(小鼠的重量)、存活时间和组织学报告来确定异种移植物肿瘤模型的终点。每周监测三次，肿瘤生长的标准是腹部膨胀和腹腔中存在可触知的肿块。计算种植后肿瘤相对于天数的估计重量。根据表8的D组小鼠对其它组小鼠的这三个标准来定义抗FcγRIIB抗体在增强肿瘤清除中的作用。显示可视疼痛和达到5g肿瘤重量的小鼠用二氧化碳安乐死并尸解。所述抗体处理的动物在此时间点之后再观察2个月。

6.2.6.2 FCγIIB  抗体用人原发性卵巢和乳腺癌衍生细胞在异种移植物 鼠模型中的体内活性

通过转化从癌扩散患者的分泌物中分离的肿瘤细胞来用原发性卵巢癌和乳腺癌建立原发性肿瘤。为将这些研究转化为临床，用分别来自两个卵巢癌患者和两个乳腺癌症患者的腹水衍生肿瘤细胞和胸膜渗出物衍生肿瘤细胞来评价所述异种移植物模型。胸膜渗出物是乳腺癌细胞的来源，其与恶性乳腺组织的移植物已用于成功建立异种移植物鼠模型，参见例如，Sakakibara等，1996，Cancer J. Sci.Am.2：291，本发明将其全部引入作为参考。这些研究将确定抗FcγRIIB抗体在原始细胞的肿瘤清除中的广泛应用。利用抗肿瘤抗体，ch4D5和抗FcγRIIB抗体，如ch2B6，在Balb/c裸鼠模型中用过继性转移的人单核细胞来检测肿瘤清除。

人腹水和胸膜渗出物衍生的原发性肿瘤细胞：卵巢癌患者的腹水和乳腺癌患者的胸膜渗出物，由St.Agnes Cancer Center，Baltimore，Maryland提供。来自患者的所述腹水和胸膜渗出液可含有40-50％的肿瘤细胞，高表达Her2neu+中瘤细胞的样品可用来建立异种移植物模型。

在建立异种移植物肿瘤模型前，检测腹水胸膜渗出液样品中瘤性细胞的Her2/neu表达。测定瘤性细胞对其它可影响肿瘤模型建立的细胞亚型的百分比。常规地分析卵巢癌和乳腺癌患者的腹水和胸膜渗出液，以测定瘤性细胞上Her2/neu+的表达水平。用FACS分析来测定Her2/neu+瘤性细胞在临床样品中的百分比。选择具有高百分比的Her2/neu+瘤性细胞的样品来进行Balb/c小鼠中肿瘤的初始化。

组织化学和免疫化学：在卵巢癌患者的腹水和胸膜渗出液中进行组织化学和免疫组织化学来分析肿瘤的结构特征。监测的标记物为细胞角蛋白(以鉴定来自炎性细胞和间叶细胞的卵巢肿瘤细胞和间皮细胞)；钙结合蛋白(以将间皮细胞与Her2/neu阳性瘤性细胞分离)和CD45(以将炎性细胞与样品中的其它细胞群分离)。随后会使用的其它标记物包括CD3(T细胞)、CD20(B细胞)、CD56(NK细胞)和CD14(单核细胞)。

对于免疫组织化学染色，通过标准技术来制备冷冻切片和石蜡包埋组织。用类似的染色方法来染色所示的冷冻和脱石蜡的切片。通过将切片浸润在3％过氧化氢中并用PBS洗涤5分钟来淬灭组织中的内源性过氧化氢酶。封闭切片，并将第一抗体ch4D5加入封闭血清中30分钟，随后用PBS洗涤3次。加入生物素轭合的刺激人抗体30分钟，并用PBS洗涤该切片5分钟。加入抗生物素蛋白(Avidin)-生物素过氧化氢酶复合物(Vector Labs)30分钟，随后洗涤。通过将在新鲜的底物DAB溶液中孵育切片来显色，并用流水冲洗来终止反应。对于H&E染色，将切片脱蜡，然后在不同的乙醇浓度中水化。在流水中冲洗切片并放入苏木精中5分钟。利用酸性乙醇、随后为氨水和水来去除过量染色。将该切片放入曙红中，随后用90-100％乙醇洗涤来脱水。最后，该切片放入二甲苯并覆盖定色剂以长期保存。在所有情况下，用Papanicolaou染色来确定肿瘤细胞百分比。

组织化学染色：用苏木精和曙红(H&E)和姬姆萨染色两例不同卵巢癌患者的腹水来分析肿瘤细胞和其它细胞类型的百分比。组织化学染色结果如图19所示。

鼠模型：通过将腹水在4℃、6370g离心20分钟，裂解红细胞，随后用PBS洗涤细胞来处理卵巢癌患者的样品。根据每种样品中Her2/neu+肿瘤细胞的百分比，选择中和高表达者以用于皮下种植来建立异种移植物模型，以评价抗FcγRIIB抗体在肿瘤清除中的作用。有报道，肿瘤细胞构成未处理的腹水细胞亚型的40-50％，纯化后，从2升腹水中获得约10-50×10⁶个肿瘤细胞(Barker等，2001，Gynecol.Oncol.82：57-63)。所分离的腹水细胞被腹腔内注射入小鼠来扩增该细胞。约10只小鼠会被腹腔内注射，并且将每只小鼠的腹水进一步传代至两只小鼠，以从共20小鼠中获得腹水，其可用于注射一组80只小鼠。以与腹水相似的方式来处理胸膜渗出液，并且将Her2neu+肿瘤细胞matrigel注射到上右和上左乳房垫中。肿瘤细胞皮下植入后，将鼠用于临床和解剖分析。如果需要，尸检小鼠来分析总肿瘤负载与特定器官定位的相关性。

6.2.7  CH2B6抗体对肿瘤生长的作用

试验设计：在第0天对Balb/c裸雌鼠(Taconic，MD)皮下注射5×10⁶个Daudi细胞。小鼠(每组5只)还接受PBS(阴性对照)、10μg/g的ch4.4.20(抗FITC抗体，阴性对照)、10μg/g的Rituxan(阳性对照)或10μg/g的ch2B6的腹腔内注射，一周一次，在第0天开始。注射后每周观察一次，并利用测径器来测定肿瘤大小(长和宽)。利用以下公式来估计肿瘤的大小：(长×宽²)/2。

结果：如图23所示，在肿瘤细胞注射后约第21天，Daudi细胞开始在Balb/c裸雌鼠形成皮下肿瘤。在第35天，接受PBS(全部的5只小鼠)或10μg/g的ch4.4.20(全部的5只小鼠)的小鼠中检测到皮下肿瘤。接受10μg/g的Rituxan的小鼠很少检测到肿瘤(5只小鼠中的1只)，且接受10μg/g的ch2B6的小鼠没有检测到肿瘤(5只小鼠中的0只)。

6.2.8 2B6 变体在鼠异种移植物模型中对肿瘤生长的作用

试验设计：8周大的Balb/c FoxN1雌性小鼠(Taconic，Germantown，NY)在第0天被皮下注射5×10⁶个Daudi细胞，和腹腔内注射2B6抗体变体(2.5μg、7.5μg或25μg的ch2B6、chN297Q、h2B6、h2B6YA、h2B6YA 31/60、h2B6YA 38/60、h2B6YA 55/60或h2B6 YA 71)，Rituximab(阳性对照，剂量为2.5μg、7.5μg、25μg或250μg)或PBS(阴性对照)。随后用抗体或PBS处理小鼠，每周1次直到第42天(总计7次注射)，并且每周2次用测径器测量肿瘤大小。利用以下公式来估计肿瘤重量：(宽²×长)/2。

结果：为了评价抗CD32B mAb变体在体内预防肿瘤生长的作用，同时用Daudi细胞和抗CD32B mAb变体注射Balb/c FoxN1 小鼠(图24A-G)。阳性对照Rituximab处理以剂量依赖方式显著减少肿瘤细胞的生长(图24A)。抗CD32B mAb 2B6的三种不同变体(嵌合2B6(ch2B6)、人源化2B6(h2B6)和Fv区(h2B6YA)中的变体)对减缓肿瘤生长均有效(24B)。h2B6YA变体在2.5μg(0.1μg/gm)剂量下显示肿瘤生长显著的降低。Rituximab的相同剂量对防止肿瘤生长没有效果。分析具有Fc突变的四种不同h2B6YA mAb变体(h2B6YA 31/60、h2B6YA 38/60、h2B6YA 55/60和h2B6YA 71)来测定体内的抗肿瘤活性是否得到提高。突变h2B6YA 31/60、h2B6YA 38/60和h2B6YA55/60均发挥与含野生型Fc的Fch2B6YA一样的或更好的作用(图24C、D、E和F)。突变h2B6YA 71显示剂量依赖性活性(图24G)，在2.5μg和25μg剂量下显示肿瘤细胞生长减缓，然而注意到在7.5μg下对肿瘤生长有很少的或没有作用(图24G)。

这些结果证明，与ch2B6或h2B6YA相比，h2B6YA 31/60和h2B6YA55/60提高了在体内的抗肿瘤活性。

6.2.9 对CD20和CD32B进行DAUDI的体外着色

试验设计：从用25μg的h2B6或h2B6YA处理的小鼠中收集Daudi肿瘤。将CD20和CD32B的表达与体外扩增的Daudi细胞的表达进行比较。如6.2.1节所述进行FACS分析。

结果：如图25A-I所示，体内扩增的细胞维持CD20和CD32B的表达，即使在抗CD32B处理后。

6.3  CD32B在B-CLL细胞上的表达

在FACS分析中，通过染色分离的细胞来分析CD32B特异性抗体与从B-CLL患者中分离的细胞上的CD32B反应的能力。

从患者中分离B细胞的方法：通过利用Ficoll-Paque PLUS(AmesrhamPharmacia Biotech)梯度离心分离来自正常供体和B细胞瘤患者的外周血白细胞的单核白细胞，并等份保藏在液氮中。用含10％人血清的PBS洗涤来自每一患者的等份新鲜分离的PBMC，并立即用标准的FACS分析来分析CD32B表达。以类似的方式制备淋巴结活检样本的单细胞悬液，并立即分析，且保藏在液氮中。

从每一样品中获得两张细胞旋转涂片，一张立即用May-Grunwald姬姆萨Giemsa(MGG)染色来进行形态学评价。分析之前，融化患者细胞等份，评价融化后的存活，且如果需要(回收的存活＜80％)进行Ficoll-Paque PLUS离心。在FACS分析中利用抗к或λ链抗体通过克隆性来估计肿瘤细胞的量。通过利用直接轭合的抗CD3、CD20、CD56、CD14和CD16抗体，并用适当的FSC和SCC选门来进行白细胞表型分析。进一步分析B-CLL B细胞的CD5、CD23、CD25、CD27、CD38、CD69和CD71(Damle等，2002，Blood，99：4087-4093；Chiorazzi&Ferrarini，2003，Ann Rev Immunol，21：841-894)。保存计算机记录，记载小瓶数量、每小瓶中的细胞数量以及冷冻保藏前后的细胞存活、肿瘤细胞或白细胞表型的数量。

FACS分析的方法：将细胞与抗CD32B单克隆抗体2B6孵育，然后用次级(Cy5轭合的)山羊-抗小鼠(Fab)₂片段抗体孵育。洗涤后，加入FITC或PE-轭合的系特异性抗体(抗CD3、CD19、CD20和CD5)，并在双色模式下用FACSCalibur分析样品。将CD3阳性细胞(T细胞)用作内对照，因为它们不表达CD32B且不与2B6抗体反应，CD20、CD19和CD5抗体鉴定B细胞系亚群。在＞10位健康人个体中进行初步研究，以基于与供体B细胞的反应性(表示为CD20阳性)来校准单独的抗CD32B抗体的量。对于各种抗体，选择在滴度试验中产生100％反应性和最高MCF值的最小量抗体用于后续使用。

结果：如图26所示，用抗CD32B抗体强染色分离自B-CLL患者的B细胞。来自所有5例患者的细胞均为CD32B-阳性，与2B6抗体发生反应，但仅不同程度地表达B细胞系标记物。这些结果表明，CD32B在B-CLL患者的B细胞上表达。

6.4  CD32B在非何杰金氏淋巴瘤患者的淋巴结中的表达

为了研究CD32B在非何杰金氏淋巴瘤患者的淋巴结中的表达，对一系列患者的淋巴组织进行组织学分析和免疫组织化学分析，该患者基于组织学和FACS分析标准确诊宦游B细胞肿瘤。

组织样本：从Cooperative Human Tissue Network(CHTN)，Mid-AtlanticDivision(Charlottesville，Virginia)获得冷冻的淋巴结。在干冰中接受该组织，并将获得的组织分成两部分，一份用于肿瘤的组织病理学分析，另一份用免疫组织化学分析。

组织病理学分析和免疫组织化学

将全部11例固定在10％中性缓冲的福尔马林(NBF)中并在组织处理器(Miles Scientific)中进行石蜡包埋。石蜡处理后，用Leica Microtome(LeicaMicrosystems，Bannockburn，Illinois)以5微米切割组织块。将切片放置在玻片上，用二甲苯脱蜡并用苏木精和曙红(H-E)组织染色方法处理(Luna，Histopathologic methods and Color Atlas Of Special Stains and Tissue Artifacts1992 American Histolabs，Inc.，Publications Division，KoIb Center，7605-FAirpark Road，Gaithersburg，MD 2087)。Daudi B细胞是一种参与B细胞淋巴瘤的恶性细胞株，将其用作阳性对照。正常扁桃腺和淋巴结用作附加的对照以显示表达CD20和CD32B的细胞在正常组织中的分布。

这些样品的保留部分放入冷藏模(cryomolds)中并用OCT冷藏化合物(cryocompound)(Tissue-Tek)包埋。一旦组织块准备好，将每一快用Cryostat(Leica Microsystems)以6微米切割。将玻片放置在4℃丙酮中，并固定10分钟。固定数小时后，将玻片在空气中干燥，并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。随后在0.3％过氧化氢溶液中孵育30分钟封闭内源性过氧化物活性。在PBS中洗涤该玻片，并在2％正常的人血清中用10％正常的山羊血清孵育30分钟。此步骤后，将玻片分成两组。使用两种单克隆抗体并在相同组织上平行孵育，该两抗体为抗CD20(1F5-杂交瘤，ATCC登记号为HB-9645，在Macrogenics纯化)和鼠单克隆抗CD32B抗体2B6。每组与一种单克隆抗体和其各自的同种型对照一起孵育，对于2B6/抗CD32B组用IgG1(BDBiosciences，San Jose，California)孵育，对于1F5/抗CD20用IgG2a(BDBiosciences)孵育。使用小鼠IgG1和鼠IgG2a分别作为抗CD32B和抗CD20的同种型对照。室温孵育1小时后，用PBS洗涤该玻片，并与次级抗体山羊抗小鼠标记的过氧化物酶(Jackson ImmunoResearch Laboratories，WestGrove，Pennsylvania)孵育。用PBS洗涤后，将切片孵育在氨基-9-乙基咔唑(AEC)和过氧化氢(Koretz等，1987，Histochemistry，86：471-478)中。用苏木精复染。

在低倍放大的光学显微镜下计分抗CD20和CD32B的表达，根据以下标准：0计分(-)表示没有可检测的反应性；加/减记分(+/-)表示在1-10％的细胞中可检测到反应；一个加号(+)相应于10-30％阳性细胞；两个加号(++表示组织的阳性细胞为30-70％；以及三个加号(+++)表示组织中的细胞有70％至100％为阳性。

结果：通过免疫组织化学显示，两组阳性对照，即参与B细胞淋巴瘤恶性细胞株(Daudi细胞，图27A-B)和已知含有淋巴组织的正常组织(扁桃腺：图28A-C，淋巴结：图29A-C)对抗Cd32B和抗CD20抗体的反应均为阳性。正常的扁桃腺组织和淋巴结被抗CD32B抗体和抗CD20抗体不同地染色。显示生发中心的淋巴滤泡与抗CD20反应，而在环绕生发中心的滤泡细胞与抗CD32B反应。因此可通过免疫组织化学利用这两种抗体来检测形态学差异。

分析了得自CHTN的全部10个淋巴结和一个脾脏(11例)。参见图30A-57D。结果总结在表9中。

表9：免疫组织化学结果

患者编号	最终病理学诊断	组织	2B6	1F5
					MG04-CHIN-19	弥散性大B细胞淋巴瘤	淋巴结	++	++
MG04-CHIN-22	弥散性大B细胞淋巴瘤	淋巴结	++	+/-
					MG04-CHIN-26	含弥散性大B细胞淋巴瘤的滤泡淋巴瘤	淋巴结	+	++
MG04-CHIN-27	弥散性大B细胞淋巴瘤	淋巴结	+++	+
					MG05-CHIN-03	伴有浆细胞样特征的弥散性小淋巴细胞淋巴瘤	淋巴结	+++	+/-
MG05-CHIN-05	弥散性大B细胞淋巴瘤	淋巴结	+	++

MG04-CHIN-30	小淋巴细胞淋巴瘤	淋巴结	-	-
					MG04-CHIN-31	弥散性大B细胞淋巴瘤	淋巴结	++	+
MG04-CHIN-36	弥散性大B细胞淋巴瘤	脾	+++	++
					MG04-CHIN-41	外套细胞淋巴瘤/弥散性小卵裂细胞淋巴瘤	淋巴结	++	+/-
MG04-CHIN-05	弥散性大B细胞淋巴瘤	淋巴结	-	-

8例为弥散性大B细胞淋巴瘤，2例为小淋巴细胞淋巴瘤，及1例为外套细胞淋巴瘤/弥散性小卵裂细胞淋巴瘤。在小淋巴细胞淋巴瘤分类中，一种具有浆细胞样特征。检查所有苏木精和曙红(H&E)染色玻片来确诊。

CD20的表达在18％病例中为阴性，并在约30％中为弱阳性，在余下50％的病例中为中等/强阳性。在80％的病例中检测到CD32B并仅在两例中发现为阴性。

结论：在80％的NHL试验病例中检测到CD32B表达。CD32B的表达与CD20相比通常在更多的细胞中检测到。CD32B可能是NHL治疗的有用靶标。

6.5 CD32B-特异性单克隆抗体的筛选

根据反应性、raft相关性、CDC以及对B细胞淋巴瘤细胞株和B细胞恶性肿瘤患者的细胞的凋亡的诱导来筛选CD32B特异性抗体。患者中细胞的分离和反应性筛选如上所述。

Raft相关性：常规地检测抗体使抗原再分布到特定膜微区的能力，即脂质raft相关性，该分析通过检测用0.5％TX-100在4℃裂解后在去污剂不溶的细胞部分中回收到的抗体的量来进行(Veri等，2001，Mol Cell Bio，21：6939-6950；Cragg等，2004，Blood，103：2738-43)。在典型的试验中，在冰上用目标抗体来包被细胞并洗涤。将等份用适合的次级抗体进行附加的交联。成团细胞采用TX-100去污剂来分离。可用葡萄糖苷、破坏脂质rafts的已知去污剂，或直接用基于SDS的Laemmli样品缓冲液来溶解平行样品，以获得总量的细胞相关抗体。可用SDS-PAGE分析和Western印记分析不溶部分。可通过密度比较来比较有或无附加的交联的脂质rafts的再分布。

CDC：可通过本领域公知的几种方法之一来评价CDC，例如FACS分析中的碘化丙啶(PI)排除(Cragg等，2004，Blood，103：2738-43)或传统的放射性标记释放(例如，⁵¹Cr和¹¹¹In释放)。简言之，将细胞与滴定含量的目标抗体在37℃孵育15分钟，然后加入作为补体源的血清(20％终浓度)，并在检测之前继续孵育另外5分钟。由于人血清高度可变，因此可用Pel-Freeze兔血清作为补体的标准来源。也可制备混合的正常人AB血清。相对用于质控的兔血清，可在红细胞裂解中检测每一批血清。

细胞凋亡：通过标准的基于FACS的方法学对可溶的或培养板固定的抗CD32B抗体诱导的细胞凋亡进行研究，该研究在多色分析中使用annexinV膜移位和PI染色(Cragg等，2004，Blood，103：2738-43)而对目标群(例如，Cy5-CD19)进行鉴定。简言之，可将细胞用滴定量的游离在溶液和固定在96孔培养板中的目标抗体处理不同的时间间隔(2至18小时)。然后通过轻柔的刮和/或离心来回收细胞，并用1μg/ml的FITC-annexinV加10μg/ml的PI来染色细胞以区分早期凋亡和继发性坏死。

6.6 淋巴瘤鼠肿瘤异种移植物模型中的体内肿瘤清除研究

在小鼠淋巴瘤模型中预防肿瘤的能力是确定抗体进入临床研究的潜力的重要标准。

可获得一些良好表征的Burkitt′s淋巴瘤细胞株用作NHL模型(Epstein等，1966，J Natl Cancer Inst，37：547-559；Klein等，1968，Cancer Res，28：1300-1310；Klein等，1975，Intervirology，5：319-334；Nilsson等，1977，Intl J Cancer，19：337-344；Ohsugi等，1980，J Natl Cancer Inst，65：715-718)。淋巴瘤形式的异种移植物模型类似于以往报道的模型在裸鼠中建立(Vallera等，2003，Cancer Biother Radiopharm，18：133-145；Vuist等，1989，Cancer Res，49：3783-3788)。

简言之，将Burkitt′s淋巴瘤细胞株，即Daudi(5-10×10⁶个细胞)皮下移植入免疫缺陷nu/nu小鼠株中。BALB/c nu/nu小鼠株与用作效应子细胞的、从健康供体中纯化的、过继性转移的人PBMC一起使用。人PBMC中主要的效应子细胞群以NK细胞为代表，起通过其CD16A(FcγRIIIa)产生ADCC作用。也可使用鼠CD16A基因被敲除、并遗传工程化表达人CD16A的nu/nu小鼠株。此CD 16A-/-huCD16Atg、nu/nu小鼠使得能够进行人Fc受体的抗肿瘤活性检测，而无需过继性转移人细胞。

可在第1、4、7和15天用选择的嵌合抗体腹腔内注射来处理小鼠。可使用4μg/g体重的起始剂量，但可检测其它的剂量以在此模型中建立抗体的相对效力。将Rituxan和Campath用于比较。此外，也可研究与Rituxan或Campath组合治疗的潜在协同作用。在这些研究中，检测肿瘤生长和发病率来比较抗体治疗和对照组。如果小鼠垂死或在研究结束时，处死小鼠。切除肿瘤并进行大体和显微验尸。对石蜡包埋切片进行细胞病理学研究，并对冰冻切片进行免疫组织化学研究，以进行肿瘤和细胞浸润的形态学和免疫学评价。

本发明并不限于特定实施方案的范围，所描述的实施方案是本发明个别方面的单独示例性说明，且功能性等价方法和组分也包含在本发明的范围之内。事实上，除了本发明所描述的这些实施方案外，还可以对本发明进行各种修改，这对于本领域所属技术人员来说并参考附图是显而易见的。这些修改包含在所附权利要求的范围之内。

本文所引用的各种参考文献，其公开全部引入本文作为参考。

                             序列表

<110>宏观基因有限公司

<120>FcYRIIB-特异性抗体及其使用方法

<130>11183-014-228

<140>

<141>

<150>US 60/562,804

<151>2004-04-16

<150>US 60/582,044

<151>2004-06-21

<150>US 60/582,045

<151>2004-06-21

<150>US 60/654,713

<151>2005-02-18

<160>58

<170>Patentin 3.2

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>2B6重链可变区-CDR1

<400>1

Asn Tyr Trp Ile His

 1               5

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>2B6重链可变区-CDR2

<400>2

Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys

 1                5                 10                  15

Gly

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>2B6重链可变区-CDR3

<400>3

Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Tyr

1                5                  10

<210>4

<211>30

<212>PRT

<213>智人

<220>

<223>人种系VH1-18和JH6-FR1的框架序列

<400>4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1                5                  10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

            20                  25                  30

<210>5

<211>14

<212>PRT

<213>智人

<220>

<223>人种系VH1-18和JH6-FR2的框架序列

<400>5

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

 1               5                  10

<210>6

<211>32

<212>PRT

<213>智人

<220>

<223>人种系VH1-18和JH6-FR3的框架序列

<400>6

Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

 1                5                 10                  15

Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

            20                  25                  30

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<220>

<223>人种系VH1-18和JH6-FR4的框架序列

<400>7

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

 1                5                 10

<210>8

<211>11

<211>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>2B6轻链可变区-CDR1

<400>8

Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His

 1                5                 10

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>2B6轻链可变区-CDR2

<400>9

Asn Val Ser Glu Ser Ile Ser

 1               5

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>2B6轻链可变区-CDR2

<400>10

Tyr Val Ser Glu Ser Ile Ser

 1               5

<210>11

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>2B6轻链可变区-CDR2

<400>11

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

 1               5

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>2B6轻链可变区-CDR3

<400>12

Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe Thr

 1               5

<210>13

<211>23

<212>PRT

<213>智人

<220>

<223>人种系VK-A26和JK4-FR1的框架序列

<400>13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

 1               5                  10                  15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys

            20

<210>14

<211>15

<212>PRT

<213>智人

<220>

<223>人种系VK-A26和JK4-FR2的框架序列

<400>14

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys

 1                5                 10                  15

<210>15

<211>32

<212>PRT

<213>智人

<220>

<223>人种系VK-A26和JK4-FR3的框架序列

<400>15

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

 1                5                 10                  15

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<220>

<223>人种系VK-A26和JK4-FR4的框架序列

<400>16

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1               5                  10

<210>17

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化2B6轻链可变区-Hu2B6VL-1

<400>17

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca 120

gatcagtctc caaagctcct catcaagaat gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240

gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a                                           321

<210>18

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化2B6轻链可变区-Hu2B6VL-1

<400>18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

 1                5                 10                  15

Glu Lyg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

            20                  25                  30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Lys Asn Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>19

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化2B6轻链可变区-Hu2B6VL-2

<400>19

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca 120

gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gtttetgagt ctatctctgg agtcccatcg 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240

gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa  a                                          321

<210>20

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化2B6轻链可变区-Hu2B6VL-2

<400>20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

 1                5                 10                  15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

            20                  25                  30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Lys Tyr Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>21

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化2B6轻链可变区-Hu2B6VL-3

<400>21

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc  60

atcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca  120

gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttctgagt ctatctctgg agtcccatcg  180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct  240

gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga  300

gggaccaagg tggagatcaa a                                            321

<210>22

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化2B6轻链可变区-Hu2B6VL-3

<400>22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

 1                5                 10                  15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

            20                  25                  30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Lan Leu Ile

        35                  40                  45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65                  70                   75                  80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>23

<211>363

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化重链可变区-Hu2B6VH-1

<400>23

caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc  60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactactgga tacactgggt gcgacaggcc  120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtg attgatcctt ctgatactta tccaaattac  180

aataaaaagt tcaagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac  240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaaacggt  300

gattccgatt attactctgg tatggactac tgggggcaag ggaccacggt caccgtctcc  360

tca                                                                363

<210>24

<211>121

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化重链可变区

<400>24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

 1                5                 10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>25

<211>321

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<223>小鼠2B6轻链可变区

<400>25

gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga gagagtcagt 60

ttttcctgea ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtatca gcaaagaaca 120

aatggttttc caaggcttct cataaagaat gtttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180

aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttattctta gcatcaacag tgtggagtct 240

gaagatattg cagattatta ttgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a                                           321

<210>26

<211>107

<212>PRT

<213>鼠

<220>

<223>小鼠2B6轻链可变区

<400>26

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

 1                5                 10                  15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

            20                  25                  30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Phe Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Lys Asn Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Phe

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>27

<211>363

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<223>小鼠2B6重链可变区

<400>27

caggtccaat tgcagcagcc tgtgactgag ctggtgaggc cgggggcttc agtgatgttg 60

tcctgcaagg cttctgacta ccccttcacc aactactgga tacactgggt aaagcagagg 120

cctggacaag gcctggagtg gatcggagtg attgatcctt ctgatactta tccaaattac 180

aataaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagtcg tatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgacgat tctgcggtct attactgtgc aagaaacggt 300

gattccgatt attactctgg tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca                                                               363

<210>28

<211>121

<212>PRT

<213>鼠

<220>

<223>小鼠2B6重链可变区

<400>28

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Val Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

 1                5                 10                  15

Ser Val Met Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Thr Tyr Pro Asn Tyr Asn Lys Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Val Val Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>29

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7重链可变区-CDR1

<400>29

Asp Ala Trp Met Asp

 1                5

<210>30

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7重链可变区-CDR2

<400>30

Glu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn Leu Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser

 1              5                   10                  15

Val Lys Gly

<210>31

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7重链可变区-CDR3

<400>31

Tyr Ser Pro Phe Ala Tyr

 1               5

<210>32

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7重链可变区-FWR1

<400>32

Glu Val Lys Phe Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

 1                5                 10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

<210>33

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7重链可变区-FWR2

<400>33

Trp Val Arg Gln Gly Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

 1                5                 10

<210>34

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7重链可变区-FWR3

<400>34

Arg Phe Thr Ile Pro Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu His

 1                5                 10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

<210>35

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7重链可变区-FWR4

<400>35

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

 1                5                 10

<210>36

<211>345

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<223>小鼠3H7重链可变区

<400>36

gaagtgaagt ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60

tcttgtgctg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgccagggt 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaaaca aagctaataa tcttgcaaca 180

tactatgctg agtctgtgaa agggaggttc accatcccaa gagatgattc caaaagtagt 240

gtctacctgc acatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgttatagt 300

ccctttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca                 345

<210>37

<211>115

<212>PRT

<213>鼠

<220>

<223>小鼠3H7重链可变区

<400>37

Glu Val Lys Phe Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

 1                5                 10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

            20                  25                  30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Gly Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn Leu Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Pro Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65                  70                  75                  80

Val Tyr Leu His Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Tyr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

            100                 105                 110

Val Ser Ala

        115

<210>38

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7轻链可变区-CDR1

<400>38

Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser

 1                5                 10

<210>39

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7轻链可变区-CDR2

<400>39

Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser

 1               5

<210>40 <211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7轻链可变区-CDR3

<400>40

Leu Gln Tyr Val Ser Tyr Pro Tyr Thr

 1               5

<210>41

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7轻链可变区-FWR1

<400>41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

 1                5                 10                  15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys

            20

<210>42

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7轻链可变区-FWR2

<400>42

Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Arg Arg Leu Ile Tyr

 1                5                 10                  15

<210>43

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7轻链可变区-FWR3

<400>43

Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Trp Ser Gly Ser Asp Tyr Ser

 1                5                 10                  15

 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys

             20                  25                  30

<210>44

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>3H7轻链可变区-FWR4

<400>44

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

 1                5                 10

<210>45

<211>321

<212>DNA

<213>鼠

<220>

<223>小鼠3H7轻链可变区

<400>45

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt  60

ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca  120

gatggaacta ttagacgcct gatctacgcc gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa  180

aggttcagtg gcagttggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct  240

gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tatgttagtt atccgtatac gttcggaggg  300

gggaccaagc tggaaataaa a                                            321

<210>46

<211>107

<212>PRT

<213>鼠

<220>

<223>小鼠3H7轻链可变区

<400>46

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

 1                5                 10                  15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

            20                  25                  30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Arg Arg Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Trp Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Ser Tyr Pro Tyr

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>47

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物-SJ15R

<400>47

ggtcactgtc actggctcag gg                                            22

<210>48

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物-SJ16R

<400>48

aggcggatcc aggggccagt ggatagac           28

<210>49

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物-SJ17R

<400>49

gcacacgact gaggcacctc cagatg             26

<210>50

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物-SJ18R

<400>50

cggcggatcc gatggataca gttggtgcag catc    34

<210>51

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白-部分序列

<400>51

Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn

 1               5

<210>52

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白-部分序列

<400>52

Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Asn

 1               5

<210>53 <211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白-部分序列

<400>53

Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr

 1               5

<210>54

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白-部分序列

<400>54

Lys Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr

 1               5

<210>55

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白-部分序列

<400>55

Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr

 1               5

<210>56

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白-部分序列

<400>56

Lys Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr

 1               5

<210>57

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白-部分序列

<400>57

Ala Pro Ser Ser Ser

1                5

<210>58

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白-部分序列

<400>58

Val Pro Ser Met Gly Ser Ser Ser

 1               5

Claims (64)

1.特异性结合天然人FcγRIIB胞外区的分离的抗体或其片段，其亲和性高于所述抗体或其片段结合天然人FcγRIIA的亲和性。

2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为2B6抗体。

3.如权利要求2所述的抗体，其中所述2B6抗体为人源化抗体。

4.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为人抗体。

5.如权利要求3所述的抗体，其中所述人源化2B6包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：24的重链可变区，和具有氨基酸序列SEQ ID NO：18、SEQID NO：20或SEQ ID NO：22的轻链可变区。

6.如权利要求1或5所述的抗体，还包括在所述重链的Fc结构域的至少一种修饰。

7.如权利要求6所述的抗体，其中所述抗体的重链的Fc结构域包含至少一个在位置240、243、247、255、270、292、300、316、370、392、396、416、419或421处的氨基酸取代，该氨基酸在其位置被另一氨基酸取代。

8.如权利要求6所述的抗体，其中所述抗体的重链的Fc结构域在位置247处具有亮氨酸，在位置421处具有具有赖氨酸，并在位置270处具有谷氨酸；在位置392处具有苏氨酸，在位置396处具有亮氨酸，并在位置270处具有谷氨酸；或在位置255处具有赖氨酸，在位置396处具有亮氨酸，以及在位置270处具有谷氨酸。

9.如权利要求1所述的抗体，其中所述片段为F(ab′)₂片段或F(ab)片段。

10.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为单链抗体。

11.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体可操作地与异源多肽连接。

12.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与治疗性试剂轭合。

13.如权利要求12所述的抗体，其中所述治疗性试剂为细胞毒素。

14.如权利要求1所述的抗体，其阻断Ig-Fc与FcγRIIB的结合。

15.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体比Rituxin更有效地减少肿瘤生长。

16.分离的核酸，其包含编码权利要求1所述抗体或其片段的重链或轻链的核苷酸序列。

17.载体，其包括权利要求16所述的核酸分子。

18.包含编码重链的第一核酸分子和编码轻链的第二核酸分子的载体，所述重链和轻链为权利要求1所述的抗体或其片段的重链和轻链。

19.如权利要求17所述的载体，其为表达载体。

20.含权利要求17所述载体的宿主细胞。

21.宿主细胞，其含有可操作地与异源启动子连接的第一核酸，和可操作地与相同或不同异源启动子连接的第二核酸，所述第一核酸和第二核酸分别编码权利要求1所述抗体的重链和轻链。

22.重组制备FcγRIIB特异性抗体的方法，所述方法包括：

(i)在适合表达所述抗体的条件下，在培养基中培养权利要求20所述的宿主细胞；及

(ii)从所述培养基中回收所述抗体。

23.双特异性抗体，其包含特异性结合FcγRIIB的第一重链-轻链对，和特异性结合肿瘤抗原的第二重链-轻链对，所述第一重链-轻链对的结合亲和性高于该重链-轻链对结合FcγRIIA的亲和性。

24.治疗患者癌症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的抗体或其片段，该抗体或其片段特异性结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体为2B6抗体。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体为人源化抗体。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述2B6抗体为人源化抗体。

29.如权利要求26所述的方法，其中所述人源化2B6包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：24的重链可变区，和具有氨基酸序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22的轻链可变区。

30.如权利要求26或29所述的方法，其中所述2B6抗体的重链的Fc结构域包含至少一个在位置240、243、247、255、270、292、300、316、370、392、396、416、419或421处的氨基酸取代，该氨基酸在其位置被另一氨基酸取代。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述2B6抗体的重链的Fc结构域在位置247处具有亮氨酸，在位置421处具有具有赖氨酸，并在位置270处具有谷氨酸；在位置392处具有苏氨酸，在位置396处具有亮氨酸，并在位置270处具有谷氨酸；或在位置255处具有赖氨酸，在位置396处具有亮氨酸，以及在位置270处具有谷氨酸。

32.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌或胰腺癌。

33.如权利要求24所述的方法，还包括给予一种或多种其它癌治疗。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述其它癌治疗选自化疗、免疫治疗、放疗、激素治疗和手术治疗。

35.如权利要求24所述的方法，其中所述患者为人。

36.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体以使所述抗体不可检测地与中性粒细胞结合的剂量给药。

37.治疗或改善个体的B细胞恶性肿瘤或一种或多种症状的方法，所述方法包括向由此需要的个体给予治疗有效量的FcγRIIB-特异性抗体。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述FcγRIIB-特异性抗体结合FcγRIIB，其结合亲和性高于所述FcγRIIB-特异性抗体结合FcγRIIA的亲和性。

39.如权利要求37所述的方法，其中给予所述治疗有效量的FcγRIIB-特异性抗体延长所述个体的存活。

40.如权利要求37所述的方法，其中所述个体为人。

41.如权利要求37所述的方法，其中所述FcγRIIB-特异性抗体为2B6或3H7。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述2B6或3H7为人源化抗体。

43.如权利要求37所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤为B细胞淋巴细胞白血病或非何杰金氏淋巴瘤。

44.如权利要求37所述的方法，其中所述FcγRIIB-特异性抗体与治疗性试剂或药物轭合。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述治疗性试剂为异源多肽。

46.如权利要求44所述的方法，其中所述治疗性试剂为免疫特异性结合细胞表面受体而非FcγRIIB的抗体。

47.如权利要求44所述的方法，其中所述治疗性试剂是免疫特异性结合肿瘤相关抗原的抗体。

48.如权利要求37所述的方法，还包括向所述个体给予治疗有效量的B细胞恶性肿瘤的一种或多种标准或试验性治疗。

49.如权利要求48所述的方法，其中至少一种所述治疗为抗体治疗、细胞因子治疗、化疗、造血干细胞移植、B细胞介导的治疗、生物学治疗、放疗、激素治疗或手术治疗。

50.如权利要求48所述的方法，其中在给予FcγRIIB特异性抗体或其抗原结合片段之前、同时或之后给予所述标准或试验性治疗。

51.如权利要求37所述的方法，其中所述个体以前进行过给予B细胞恶性肿瘤的一种或多种标准或试验性治疗的治疗，但没有进行过给予FcγRIIB拮抗剂或其抗原结合片段的治疗。

52.如权利要求37所述的方法，其中所述FcγRIIB-特异性抗体通过静脉内、皮下、肌肉内、口服或鼻内给药。

53.药物组合物，其包含(i)治疗有效量的特异性结合FcγRIIB的抗体或其片段，其结合亲和性高于所述抗体或其片段结合FcγRIIA的亲和性；及(ii)药学上可接受的载体。

54.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述抗体为单克隆抗体。

55.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述抗体为2B6抗体。

56.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述抗体为人源化抗体。

57.如权利要求55所述的药物组合物，其中所述2B6抗体为人源化抗体。

58.如权利要求57所述的药物组合物，其中所述人源化2B6抗体包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：24的重链可变区，和具有氨基酸序列SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22的轻链可变区。

59.如权利要求53或58所述的药物组合物，其中所述2B6抗体的重链的Fc结构域包括至少一个在位置240、243、247、255、270、292、300、316、370、392、396、416、419或421处的氨基酸取代，该氨基酸在其位置被另一氨基酸取代。

60.如权利要求59所述的药物组合物，其中所述2B6抗体的重链的Fc结构域在位置247处具有亮氨酸，在位置421处具有具有赖氨酸，并在位置270处具有谷氨酸；或在位置392处具有苏氨酸，在位置396处具有亮氨酸，并在位置270处具有谷氨酸；或在位置255处具有赖氨酸，在位置396处具有亮氨酸，以及在位置270处具有谷氨酸。

61.如权利要求53所述的药物组合物，还包含一种或多种其它的抗癌剂。

62.如权利要求61所述的药物组合物，其中所述抗癌剂为化疗剂、放疗剂、激素治疗性试剂或免疫治疗性试剂。

63.药物组合物，其包含预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤有效量的一种或多种FcγRIIB-特异性抗体，和药学上可接受的载体。

64.如权利要求63所述的药物组合物，还包括一种或多种化疗剂、放疗剂、激素治疗性试剂或免疫治疗性试剂。

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