CN105636987A - 新型抗-Fc-γ受体IIB抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗-FcγRIIB抗体，与现有技术抗体相比，其显著地增强了FcγRIIB的ITIM磷酸化并因此能够用于自身免疫性疾病的治疗或预防。

Description

新型抗-Fc-γ受体IIB抗体及其用途

背景技术

作为蛋白质的免疫球蛋白基因超级家族的成员，FcγRII受体是由两个细胞外免疫球蛋白结构域、一个单跨膜结构域和一个长度变化的胞浆结构域组成的单一多肽链40kDa完整膜结合的糖蛋白。FcγRII受体在多种造血细胞上表达，是人血小板和巨核细胞上的唯一Fc-受体(Cassel,McKenzie,1993)。已知人的三种FcγRII受体，FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC，它们均结合IgG(例如以1-2x10⁶M^-1的亲和性结合IgG₁)或免疫复合物(IC，例如IgG调理的病原体)。FcγRIIA和FcγRIIB主要由于胞质结构域中的差异而互不相同，所述差异最终导致受体连接后的功能性异质反应。FcγRIIA触发导致细胞的活化(例如吞噬作用和呼吸爆发)，而FcγRIIB起始抑制性信号，从而导致例如B细胞活化的抑制。FcγRIIC与FcγRIIB共享胞外结构域，与FcγRIIA共享胞质结构域，从而在结合IgG或IC后传递活化信号。FcγRIIB在除T细胞和NK细胞以外的所有白细胞上表达，是在人B细胞上表达的唯一的抑制性Fc受体。单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞共表达活化的FcγRIIA，而抑制性FcγRIIB受体和FcγRIIC在自然杀伤细胞(NK细胞)上表达并构成该类细胞上的唯一FcγR。已知FcγRIIB的两种在生物学功能不同的同种型。FcγRIIB-1唯一地在B细胞上表达，而发现在IC结合后引起内吞-/吞噬作用诱导的FcγRIIB-2在所有其他FcγRIIB表达细胞上表达(Nimmerjahn,Ravetch,2008)。

FcγRIIB在胞外区中与FcγRIIA享有93％的同源性。如上所述，FcγRIIB与FcγRIIA之间的主要差异存在于胞质结构域。FcγRIIB包含ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)，而FcγRIIA包含ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)。

通过IC结合的FcγRIIA簇集引起ITAM基序与引发ITAM基序(共有序列：Y-X₂-L/I-X₈-Y-X₂-L/I，Isakov，1997)中酪氨酸残基磷酸化的受体相关激酶的共定位以及随后与激酶Syk相互作用，所述激酶Syk通过大量下游信号传导和基因活化事件来引发细胞的活化(Ghazizadeh等,1994)。结合活性FcγRIIA的免疫球蛋白引起促炎性反应，该促炎性反应随后导致病原体的去除，但在自身抗体的情况下，还可导致健康组织的破坏，从而达到病理性自体免疫疾病峰。因此，需要对抗体特异性的严格控制和否定性反馈系统来避免免疫系统对机体的异常破坏。所述抑制性FcγRIIB受体就是该否定性反馈系统的一部分。

FcγRIIB的特征在于在胞质结构域中存在ITIM基序(共有序列：V/I-X-Y-X₂-V/L，Isakov，1997)，其在Ig-聚集体或IC结合和与携带ITAM的活化Fcγ受体共连接后被激酶Lyn磷酸化。经磷酸化的ITIM吸引多磷酸肌醇5’-磷酸酶的SH2-结构域(SHIP)，SHIP转而水解磷酸肌醇信使，所述磷酸肌醇信使由于含ITAM的FcγR-介导的酪氨酸激酶活化而释放，因而阻止细胞内Ca²⁺的流入。FcγRIIB交联抑制对FcγR连接的活化反应，其继而抑制B细胞活化、增殖和抗体分泌。

FcγRIIB具有两种抑制活性。如上所述，其一依赖于ITIM基序并在FcγRIIB连接到携带ITAM的受体(例如FcγRIIA)时发生，导致ITAM触发的钙动员和细胞增殖的抑制。这就意味着诸如脱粒作用、吞噬作用、ADCC、细胞因子释放和促炎活化的钙依赖性过程以及B细胞增殖都被FcγRIIB阻断。FcγRIIB的第二种抑制活性包括B细胞上受体的同型聚集(FcγRIIB簇集)。同型聚集将促细胞凋亡信号递送到细胞质中，这可被FcγRIIB与B细胞受体(BCR)的连接所阻断。多价-抗原结合后的BCR信号传导的特征在于簇集的BCR通过Lyn(Src家族的一种激酶)磷酸化。这种Lyn作用下的磷酸化与BCR和被称作“脂筏”的富含鞘脂和胆固醇的膜微结构域的联合一起发生。这些不溶的“脂筏”在免疫突触的形成中起着重要作用。已观察到，BCR与APC(抗原提呈细胞)上的抗原的相互作用致使在所接合的B细胞和APC的界面处形成该免疫突触。FcγRIIB与BCR的共连接使BCR与脂筏的联合去稳定，随后阻断B细胞的免疫突触的形成。BCR信号传导的FcγRIIB抑制包含受体的细胞质结构域的ITIM中的酪氨酸残基被激酶Lyn磷酸化以及随后的肌醇磷酸酶SHIP的募集(Daeron等.,1995,RavetchandBolland,2001)。

科学界接受这样的观点：FcγRIIB可被看作外周B细胞发育过程中较晚检查点(checkpoint)，并且其还直接调节浆细胞存活。因此FcγRIIB被认为是用于治疗B细胞障碍、特别是B细胞介导的免疫反应的重要靶标。

在小鼠和人中的研究已经阐明FcγRIIB对B细胞活性和体液耐受的影响，其中FcγRIIB表达的降低或缺少造成了明显的自身免疫性疾病的发展或加剧。事实上，FcγRIIB在诸如原发免疫性血小板减少症、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、大疱性天疱疮、寻常型天疱疮和其他天疱疮形式、B细胞驱动的多发性硬化症的自身免疫性疾病以及其他以病原性免疫复合物发展为特征的自身免疫性疾病的发展和过程中起到关键作用。在健康个体的免疫反应期间，已经进入血液循环的病原体受到针对病原体生物体的表位的抗体(免疫球蛋白，Ig)的调理，并继而导致所谓的免疫复合物的形成。这些免疫复合物随后会被免疫系统的特定细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞、吞噬细胞)所吞噬，这导致病原体生物体从血液循环中被清除。另外已经证明，FcγRIIB在外周耐受性方面也起着关键作用，因为FcγRIIB敲除小鼠发展自发的自身免疫性疾病。FcγRIIB不足导致对诱发的自身免疫性疾病的易感性(Bolland和Ravetch，2000)。

与健康人相比，在遭受自身免疫性疾病的患者中，FcγRIIB在B细胞上的表达通常会减弱或降低。然而例如幼稚B细胞显示出正常的FcγRIIB表达，来自RA患者的记忆B细胞和浆母细胞则显示出这一受体的表达降低(Catalán，2010)。Xiang及同事也能够表明，在来自健康捐赠者的浆母细胞上通过表面耦合的抗-FcγRIIB抗体2.4G2的FcγRIIB交联导致细胞凋亡(Xiang等，2007)

基于上述的FcγRIIB在自身免疫性疾病中的显著作用，已经开发了针对该受体的抗体，以便治疗或诊断患者。WO2009/083009公开了针对FcγRIIB两种同种型的抗体，而WO2004/016750公开了与内源表达于人细胞上的FcγRIIB的细胞外结构域特异性结合的抗体，其亲和力是与表达于人细胞上的FcγRIIA结合的此类抗体的亲和力的至少10倍(记住FcγRIIA和FcγRIIB的细胞外结构域享有高度同一性)。EP1709073公开了对FcγRIIB具有高度特异性的抗体及其用于诊断和治疗自身免疫性疾病、感染病、肿瘤和其他异常病症的用途。

为了这样的目的，十分需要使用对该受体具有高特异性和亲和性的抗体。特别是高特异性降低所述抗体交叉反应的风险，由此降低不利副作用，而高亲和性增强其应用的效力和功效。同时也需要这样的抗体是非阻断性的，即它们通过其可变区与Fc受体的结合不会干扰免疫复合物(IC)或聚集的IgG与细胞的结合。而且，针对FcγRIIB的抗体的一个非常有利的优势在于：其影响FcγRIIB抑制耦合机制以控制B细胞活化。也就是说，已知FcγRIIB的细胞内部分包含所谓的ITIM，并且通过携带ITIM的受体的信号传导往往在免疫系统的调节中是抑制性的。如上所述，已知FcγRIIB在被IgG分子的Fc部分结合时具有抑制性调节功能。因此，需要利用FcγRIIB的抑制性调节功能，以期对包含在特别是自身免疫性疾病中的B细胞进行控制。总而言之，尽管现有技术已经公开了若干具有不同特异性和亲和性的抗FcγRIIB抗体，但仍然需要改善的抗FcγRIIB抗体用于治疗、预防和诊断受试者的自身免疫性疾病。

通过提供本文下文描述的、在权利要求中进行表征且通过随附的实施例和附图进行说明的抗体，本申请满足了这一需求。

使本发明的发明人十分惊讶的是，他们观察到本发明所提供的抗体显著地增强了ITIM的磷酸化。与现有技术中公开的也与FcγRIIB特异性结合的抗体相比，根据本发明所述的抗体惊人地表现出意料之外的更强的对ITIM磷酸化的作用。这样更强的作用是有益的。尤其是活化-抑制耦合，即阳性信号与抑制环的配对，控制许多生物过程的量级和持续时间。在B淋巴细胞中，克隆型B细胞受体(BCR)对抗原的识别诱导能够指导克隆扩增、分化、细胞因子释放并最终产生Ig的信号。活化刺激物的枯竭以及包含抑制性Fcγ受体(FcγR)即FcγRIIb(CD32B)的负反馈环的触发防止不受控制的活化。后一种机制在BCR识别免疫复合抗原时触发，从而导致通过复合结合的IgG的Fc结构域的CD32B共存接合，因而防止与被可溶性IgG识别的那种享有相同特异性的B细胞克隆的扩增。因此，成功的负调节策略应形成用于负信号传导环的分子基础。

发明内容

本发明提供的抗体在CD32B的ITIM磷酸化方面表现出显著更强的作用，因而预期它们对由CD32B的ITIM磷酸化触发的负信号传导环具有更强的影响，这继而控制特别是包含在自身免疫性疾病中的B细胞。

特别地，与未经所述抗体处理的Daudi细胞相比，本发明的抗体优选地增强Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化。所述增强优选为1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。从与CD32B结合的现有技术抗体，既无法预料也无法预见本发明所述的抗体的有利性质，更不必说成功提供它们的合理预期，特别是本文所表征的CDR或可变重和/或轻链。除了本发明抗体这一改善的性质，本文所述的抗体还对人FcγRIIB具有高特异性和/或是非阻断性的，即它们通过其可变区与Fc受体的结合不会干扰免疫复合物(IC)或聚集的IgG与细胞的结合。

因此，本发明提供一种抗-FcγRIIB抗体，优选为IgG型的抗-FcγRIIB抗体，所述抗体在其重链可变区中包含SEQIDNOs.29、30和31中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.32、33和34中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增强约4至10倍。

从图7中明显可见，现有技术抗体GB3(见WO2005/051999)和2B6(见WO2004/016750)不能如本发明的抗体(诸如8A6，或者作为嵌合的或作为人源化的8A6抗体)那样增强FcγRIIB的ITIM磷酸化。故而能否增强FcγRIIB的ITIM磷酸化似乎取决于CDR，特别是取决于存在于8A6中而非GB3和/或2B6中的一些关键残基。因此，仅存在于8A6的CDRs中的处于对应于2B6或GB3的CDR内各自位置的位置处的氨基酸可以被看作“关键残基”。

对2B6、GB3和8A6中的CDR关键残基的视觉比较表明，本发明的抗体在H-CDR1中包含SEQIDNO.29中所示的氨基酸序列，在H-CDR2中包含SEQIDNO.30中所示的氨基酸序列，在H-CDR3中包含SEQIDNO.31中所示的氨基酸序列，在L-CDR1中包含SEQIDNO.32中所示的氨基酸序列，在L-CDR2中包含SEQIDNO.33中所示的氨基酸序列，在L-CDR3中包含SEQIDNO.34中所示的氨基酸序列。

8A6、GB3和2B6的CDR的氨基酸序列之间的差异还可以被表示为在使用8A6的CDR作为参考序列时在本发明的抗体的CDR中所允许的同一性程度(以同一性百分比表示)。因此，本发明的抗体的H-CDR1优选地表征为与SEQIDNO.20中所示的H-CDR1具有60％或更多(诸如70％、80％或90％)同一性。

本发明的抗体的H-CDR2优选地表征为与SEQIDNO.21中所示的H-CDR2具有36％或更多(诸如40％、50％、60％、70％、80％或90％)同一性。

本发明的抗体的H-CDR3优选地表征为与SEQIDNO.22中所示的H-CDR3具有50％或更多(诸如60％、70％、80％或90％)同一性。

本发明的抗体的L-CDR1优选地表征为与SEQIDNO.23中所示的L-CDR1具有64％或更多(诸如70％、80％或90％)同一性。

本发明的抗体的L-CDR2优选地表征为与SEQIDNO.24中所示的L-CDR2具有29％或更多(诸如30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)同一性。

本发明的抗体的L-CDR3优选地表征为与SEQIDNO.25中所示的L-CDR3具有78％或更多(诸如80％或90％)同一性。

因此，本发明提供一种抗-FcγRIIB抗体，所述抗体在其重链可变区中包含与SEQIDNO.20中所示的H-CDR1序列具有60％或更多同一性的H-CDR1序列，与SEQIDNO.21中所示的H-CDR2序列具有36％或更多同一性的H-CDR2序列，与SEQIDNO.22中所示的H-CDR3序列具有50％或更多同一性的H-CDR3序列，与SEQIDNO.23中所示的L-CDR1序列具有64％或更多同一性的L-CDR1序列，与SEQIDNO.24中所示的L-CDR2序列具有29％或更多同一性的L-CDR2序列，和与SEQIDNO.25中所示的L-CDR3序列具有78％或更多同一性的L-CDR3序列。

优选地，所述抗体在其重链和轻链可变区CDR中仍然包含如SEQIDNOs.29、30、31(H-CDR)和SEQIDNOs.32、33、34(L-CDR)中所定义的“关键残基”。

优选地，相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增强约4至10倍。

本文所用术语“同一性百分比”是指在以如可得自www.clustal.org的ClustalW或X技术或者等同技术所示例的最佳序列比对来比较两个氨基酸序列时，序列内相应位置处的相同氨基酸残基的百分数。例如，在CDR比对的情况下，SEQIDNOs.20-25中所示的每个CDR(分别来自重链和轻链可变区)都分别作为重链或轻链可变区的目标CDR序列的参考序列，例如SEQIDNO.20的H-CDR1与目标H-CDR1比对。因此，比对两个序列(参考序列和目标序列)，两个序列之间相同的氨基酸残基被识别，然后将相同氨基酸的总数分别除以SEQIDNO.20、21、22、23、24或25氨基酸的总数(氨基酸长度)，具体取决于是比对H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2还是L-CDR3。相除的结果是一个百分比值，即同一性百分比值/程度。

SEQIDNOs.14和20中所示的H-CDR1序列是SEQIDNO.29中所示的H-CDR1的优选序列种类。

SEQIDNOs.15和21中所示的H-CDR2序列是SEQIDNO.30中所示的H-CDR2的优选序列种类。

SEQIDNOs.16和22中所示的H-CDR3序列是SEQIDNO.31中所示的H-CDR3的优选序列种类。

SEQIDNOs.17和23中所示的L-CDR1序列是SEQIDNO.32中所示的L-CDR1的优选序列种类。

SEQIDNOs.18和24中所示的L-CDR2序列是SEQIDNO.33中所示的L-CDR1的优选序列种类。

SEQIDNOs.19和25中所示的L-CDR3序列是SEQIDNO.34中所示的L-CDR3的优选序列种类。

因此，本发明提供一种抗-FcγRIIB抗体，优选为IgG型的抗-FcγRIIB抗体，所述抗体

(a)在其重链可变区中包含SEQIDNOs.14、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.17、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；或者

(b)在其重链可变区中包含SEQIDNOs.20、21和22中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.23、24和25中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，

其中，优选地，相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增强约4至10倍。

在其重链可变区中包含SEQIDNOs.14、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.17、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的抗-FcγRIIB抗体，或者在其重链可变区中具有SEQIDNOs.20、21和22中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3并且在其轻链可变区中具有SEQIDNOs.23、24和25中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的抗-FcγRIIB抗体是优选的抗体。优选地，相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述优选的抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增强约4至10倍。

本文所用“抗体”是包含一个或多个基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽(其包含一个或多个结合结构域，优选抗原结合结构域)的蛋白质。本文所述术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”可互换使用。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。特别地，本文所用的“抗体”是典型地由两个轻(L)链(每个约25kDa)和两个重(H)链(每个约50kDa)组成的四聚体糖基化蛋白。在抗体中可以发现两种轻链，称作λ和κ。取决于重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白划分为五个主要类别：A、D、E、G和M，这些中若干类别可进一步划分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，其中IgG在本发明内容中是优选的。还设想本发明的抗体具有被Fcε受体I结合的IgE恒定结构域或其一部分。IgM抗体由5个基本异源四聚体单元连同一个另外的称为J链的多肽组成，并含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含与J链组合的2-5个可聚合形成多价聚集体的基本4-链单元。在IgG的情况下，4-链单元通常约150,000道尔顿。每个轻链包括一个N端可变(V)结构域(VL)和一个恒定(C)结构域(CL)。每个重链包括一个N端V结构域(VH)、三或四个C结构域(CH)和一个铰链区。所述恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，而是可展现出多种效应物作用，诸如参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。如果抗体会施加ADCC，则其优选为IgG1亚类，而IgG4亚类不会具有施加ADCC的能力。

本文所用术语“抗体”不仅指免疫球蛋白(或完整的抗体)，还指其片段，并涵盖任何包含抗原-结合片段或抗原-结合结构域的多肽。优选地，所述片段诸如Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、scFv、Fd、二硫键连接的Fv(sdFv)以及其他保有本文所述的抗原-结合功能的抗体片段。典型地，这样的片段将包含抗原-结合结构域并与本文所述抗体具有相同的性质。

术语“抗体”还包括但不限于涵盖单克隆，单特异性、聚-或多-特异性抗体诸如双特异性抗体、人源化的、骆驼化的、人的、单链、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的、移植的和在体外产生的抗体，其中优选嵌合的或人源化的抗体。术语“人源化的抗体”通常被定义为其中HC和LC的特异性编码CDR已经被转移到适当的人可变框架(“CDR移植”)的抗体。术语“抗体”还包括scFv、单链抗体、双体或四体、结构域抗体(dAb)和纳米抗体。就本发明而言，术语“抗体”应还包含具有若干抗原结合位点的双、三或多聚抗体或者双、三或多功能抗体，优选地，所述抗原结合位点中的至少一个是FcγRIIB特异性结合位点。

此外，本发明中所用术语“抗体”还涉及本文所述抗体(包括片段)的衍生物。抗体的“衍生物”包含由引入氨基酸残基置换、缺失或添加而被改变的氨基酸序列。此外，衍生物涵盖由任意类型分子共价连接到抗体或蛋白质而被修饰的抗体。这样的分子的例子包括糖、PEG、羟基、乙氧基、羧基或氨基，但不限于这些。实际上，所述抗体的共价修饰导致糖基化、聚乙二醇化、乙酰化、磷酸化和酰胺化，而又不限于这些。

本发明所述的抗体优选为“分离的”抗体。本文用以描述抗体的“分离的”意味着已经从其产生环境的组分中识别、分离和/或回收的抗体。优选地，所述分离的抗体不与来自其产生环境的任何其他组分关联。其产生环境的污染物组分，诸如由重组转染细胞引起的，是典型地干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在优选实施方案中，所述抗体将被纯化(1)至足够通过使用旋转杯测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(2)至使用考马斯蓝或优选地使用银染在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE同质。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。

本文所用术语“特异性结合”是指抗体或其片段或其衍生物与FcγRIIB或其片段特异性结合而不与其他Fc受体特异性结合。根据本发明的抗体或其片段或其衍生物通过抗体的可变结构域与FcγRIIB结合。然而，这些抗体也可以被FcγRIIB通过它们的Fc结构域结合。

VH和VL配对一起形成单一抗原-结合位点。离VH最近的CH结构域被指定为CH1。每个L链通过一个共价二硫键连接到H链，而两个H链则通过一个或多个二硫键彼此连接，具体取决于H链同种型。所述VH和VL结构域包括四个相对保守的序列区域，称为构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其为三个高变序列区域(互补决定区，CDR)形成支架。所述CDR包含负责抗体与抗原的特异性相互作用的大部分残基。CDR被称作CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR成分被称作H1或H-CDR1、H2或H-CDR2和H3或H-CDR3，而轻链上的CDR成分被称作L1或L-CDR1、L2或L-CDR2和L3或L-CDR3。

术语“可变(的)”是指免疫球蛋白结构域中在其序列上展现出可变性并且参与决定特定抗体的特异性和结合亲和性的部分(即所述的“可变结构域”)。可变性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域；而是集中于每个重链可变区和轻链可变区的亚结构域。这些亚结构域称为“互补性决定区”(CDR)。术语“CDR”及其复数“CDRs”是指这样的互补性决定区(CDR)：其三个(L1-CDRL1、L2-CDR和L3-CDR)构成轻链可变区的结合特征，并且三个(H1-CDR、H2-CDR和H3-CDR)构成重链可变区的结合特征。CDR促进抗体分子的功能活性并被包含支架或框架区的氨基酸序列分开。精确的定义上的CDR边界和长度从属于不同的分类和编号系统。因此CDR可以适用于Kabat、Chothia、contact或者任何其他的边界定义，包括本文所述的编号系统。尽管边界不同，但这些系统中每一个都在构成所谓的“高变区”的序列方面具有一定程度的重叠。因此，关于邻近的骨架区，根据这些系统的CDR定义在长度和边界区域上可能不同。参见例如Kabat、Chothia和/或MacCallum等(Kabat等,上述引文；Chothia等,J.MoI.Biol,1987,196:901；和MacCallum等,J.MoI.Biol,1996,262:732)。然而，优选根据所谓的Kabat系统的编号。

本发明所述抗体的优选的可变区如SEQIDNos.1、2、3和4中所示。

术语“框架区”是指抗体可变区中存在于更相异的(即高变的)CDR之间的领域公认部分。该框架区典型地是指框架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)，并且在三维空间为六个CDR(三个来自重链，三个来自轻链)的呈现提供支架以形成抗原-结合表面。

相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，本发明所述的抗体(包括其片段和衍生物)优选地或有利地增强Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化约4或更多倍，诸如约4倍或更多，约5倍或更多，约6倍或更多，约7倍或更多，约8倍或更多，约9倍或更多或者约10倍(即甚至接近10倍)。对于这一比较，本发明的抗体用量优选在5μg/ml至50μg/ml的范围内，诸如10、15、20或25μg/ml。

从图6、7和8中所示的结果来看，很明显，与现有技术抗体GB3相比，嵌合的8A6(ch8A6)抗体(包含大鼠可变区和人恒定区)或人源化的8A6抗体(hu8A6)显著地增强ITIM磷酸化。记住嵌合的和人源化的8A6抗体之间的CDR是几乎相同的，而它们的框架区(FR)是不同的，并且这两种抗体增加FcγRIIBs的ITIM磷酸化的效能是几乎相同的(见图8)，有理由推断，所述CDR是使本发明的抗体显著增强(例如与抗体GB3相比)ITIM磷酸化的有利性质的原因。

技术人员易于有能力按照本文所述将本发明抗体的所述CDR移植到适当的框架中，或者反之亦然，将框架区移植到具有本发明抗体的所述CDR的抗体中，以致如此产生的抗体具有有利性质，特别是本文所述增强CD32B的ITIM磷酸化的性质。

如上所述，本发明的抗体优选地或有利地具有增强Daudi细胞的FcγRIIB(CD32B)的ITIM磷酸化的性质，例如，与WO2005/051999中所述的现有技术抗体GB3相比，所述GB3的特征在于具有WO2005/051999的SEQIDNO:7(见SEQIDNO.26)中所示的重链的可变区和WO2005/051999的SEQIDNO:5(见SEQIDNO.27)中所示的轻链的可变区。

相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，受本发明涵盖的抗体影响的Daudi细胞的FcγRIIB(CD32B)的ITIM磷酸化增强优选为约4倍或更多，约5倍或更多，约6倍或更多，约7倍或更多，约8倍或更多，约9倍或更多或者约10倍(即甚至接近10倍)。

Daudi细胞的CD32B(FcγRIIB受体)的ITIM磷酸化优选地如下测定：悬浮在补充有1％的FBS(胎牛血清)的RPMI1640培养基中的3x10⁵Daudi细胞或者不进行处理(对照组)，或者在37℃、5％的CO₂下用包含抗-IgM(抗-人，小鼠)和抗-小鼠IgG(兔)的抗体混合物一起孵育25分钟，其中所述抗体混合物包含2μg/ml的α-hIgM(mAB，克隆UHB)和20μg/mlα-mIgG。随后在37℃、5％的CO₂下将所述细胞或者用本发明涵盖的抗体或者用本文下文所述的目标抗体(诸如WO2005/051999的GB3抗体)分别处理20分钟，两种抗体都优选地应用相同的浓度，并可选地用缓冲液作为对照组(w/o)。在4℃下孵育后收获细胞，将其裂解并进行蛋白质印迹分析，由此通过(抗-)磷酸酪氨酸抗体(抗-CD32B(磷光体Y292)抗体)检测磷酸化。所述蛋白质印迹分析可选地用检测例如作为蛋白质印迹分析的加载对照的β-Actin的抗体进行探测。作为Daudi细胞的替代选择，还可以使用PBMC或Raji细胞。因此，在所有测定ITIM磷酸化时应用Daudi细胞的实施方式中，Daudi细胞都可以被Raji细胞或PBMC替代。

所述磷酸酪氨酸抗体优选地与信号生成基团耦联。信号生成基团是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的组合物。例如，有用的标记包括放射性标记诸如³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光染料(例如Cy-3、Cy-5)；发色团，电子致密的试剂；生成可检测信号的酶(例如，如ELISA中通常使用的)；或者自旋标记。所述标记或可检测部分具有或产生可测量的信号，诸如放射性、显色的或荧光的信号，这些信号可用来量化样品中结合的可检测部分的量。

所述信号生成基团可共价地或非共价地与磷酸酪氨酸抗体结合。信号可以通过磷酸酪氨酸抗体的信号生成基团提供的信号来测定。所述信号可以是可通过例如光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的任何信号。

通过如下方式测定ITIM磷酸化的增强：比较(i)由与未经处理的细胞的CD32B的ITIM基序结合的磷酸酪氨酸抗体的信号生成基团所生成的信号(“参考值”)与(ii)由与经本发明涵盖的抗体处理的细胞的CD32B的ITIM基序结合的磷酸酪氨酸抗体的信号生成基团所生成的信号，由此如果信号(ii)高于信号(i)，则由本发明涵盖的抗体实现了CD32B的ITIM磷酸化的增强。对于所述比较，本发明所述的抗体优选地以5μg/ml至50μg/ml范围内的量使用，诸如10、15、20或25μg/ml。例如，在将现有技术抗体GB3或任何其他与CD32B结合的抗体(统称为“目标抗体”)(优选结合本文所述的CD32B上的表位的抗体和/或如本文所述非封闭性的抗体)与本发明涵盖的抗体相比较、以便测定目标抗体和本发明涵盖的抗体中每个抗体可增强CD32B的ITIM磷酸化多少倍的能力时，如上所述测定目标抗体和本发明涵盖的抗体的ITIM磷酸化。即，用未经处理的细胞得到目标抗体的用于比较的值，用未经处理的细胞得到本发明涵盖的抗体的用于比较的值。这些值可以相互比较以便确定本发明涵盖的抗体具有在更高程度上增强ITIM磷酸化的能力，所述更高程度诸如是目标抗体的4至10倍(包括4、5、6、7、8、9、10)。对于所述比较，目标抗体和本发明所述的抗体优选地以5μg/ml至50μg/ml范围内的量使用，诸如10、15、20或25μg/ml。

本文所用术语“Fcγ受体IIB”可与“FcgRIIB”或“Fcgamma受体IIB”或“Fcγ受体IIB”或“FcγRIIB”互换，并且同时包含膜FcγRIIB和可溶性(即FcγIIB受体的细胞外部分)FcγRIIB。所述术语还包括FcγRIIB的变体，诸如以在FcγRIIB1的细胞质结构域中的19个氨基酸序列插入而彼此相区别不同的FcγRIIB1和FcγRIIB2。所述术语涵盖的另一个变体是与FcγRIIB2相同但缺少假定的信号肽酶切割位点的信息。

有时候，FcγRIIB还可以指本文的“CD32B”。因此，该术语以及用以指定如上所述的Fcγ受体IIB的其他术语都可以与术语“CD32B”替换使用。Fcγ受体IIB属于蛋白质的免疫球蛋白超家族，并且可见于许多造血谱系。正如其名称所表明的，Fc受体IIB识别并结合抗体的Fc(片段，可结晶的)部分，即对应于所述抗体的两条重链的两个C-端结构域并且典型地与效应分子和细胞相互作用的片段。一种优选的FcγRIIB如SEQIDNO.5中所示。一种优选的可溶性FcγRIIB如SEQIDNO.12中所示。

“可溶性FcγRIIB”也称为“sFcγRIIB”。本文所用的术语“可溶性Fcγ受体IIB”和类似术语是指Fcγ受体IIB的细胞外部分。该部分可溶解于液体中。一般而言，任何FcγR类型、同种型或等位基因的可溶形式都可以通过前缀“s”进行识别，例如，sCD32或sFcγRII是指可溶性FcγRII受体。典型地，相比于膜(即膜结合的)FcγR，可溶性FcγR不包含跨膜区或胞质内尾。

优选地，本发明所述的FcγRIIB具有人起源或是人FcγRIIB。所述术语“具有人起源”以其最广义理解。通常其意味着FcγR(或其区域或片段)就氨基酸序列和/或结构而言类似于人FcγR(即在人体内发现的蛋白)或与人FcγR(即在人体发现的蛋白)相似。

或者，“具有人起源的”FcγRIIB可以是通过在宿主细胞内表达重组核酸而获得的重组FcγRIIB，例如Sondermann和Jacob(1999),Bioll.Chem.380(6),717-721中所述的。简言之，从生物体获得目标基因并将其引入载体中，所述载体例如质粒或病毒，其随后被用于将所述基因转移到表达所述重组基因并产生重组蛋白产品的宿主细胞内。本领域的技术人员易于知晓选择何种宿主细胞以便获得例如适用于药物组合物的制备的FcγRIIB。例如，在一些实施方案中，可能需要非糖基化的FcγRIIB。本领域的技术人员可以选择缺少蛋白质糖基化所必需的酶机制的原核宿主细胞来表达所述FcγRIIB。在一个实施方案中，所述FcγRIIB可以在原核生物中表达，随后根据WO00/32767所述进行纯化并重新折叠。

在另一个实施方案中，在真核表达系统中能够容易而价廉地产生高纯度的FcγRIIB。有用的系统包括具有用于产生细胞外蛋白的专门机构(apparatus)的真核细胞，例如B细胞。其他可用的真核表达系统包括但不限于CHO或HEK细胞。因此所述可溶性FcγRIIB是重组的、可溶的且糖基化的FcγRIIB。

本文所指的FcγRIIB进一步涵盖相比于野生型FcγR，就氨基酸序列已经修改或改变并且包括例如另外的糖基化位点等的FcγRIIB。然而，非糖基化形式的FcγRIIB也被设想到，并且是FcγRIIB的一个优选实施方案。

至于本发明所述抗体的重链可变区，优选地，本发明所述抗体的重链可变区包含SEQIDNO.3中所示的氨基酸序列，并具有选自下述的突变中的至少一个：位置1处的氨基酸Q被E替代，位置11处的氨基酸V被L替代，位置42处的氨基酸G被K替代，位置50处的氨基酸S被V替代，位置53处的氨基酸Y被S替代，位置58处的氨基酸K被T替代，位置61处的氨基酸G被A替代，位置75处的氨基酸S被T替代，位置76处的氨基酸K被R替代，位置77处的氨基酸N被S替代，和位置78处的氨基酸T被N替代。这样的抗体优选具有以下特征：包含重链恒定区即SEQIDNO.6中所示的氨基酸序列和/或轻链恒定区即SEQIDNO.7中所示的氨基酸序列。

本发明所述的抗体优选地具有以下特征：包含重链恒定区即SEQIDNO.6中所示的氨基酸序列和/或轻链恒定区即SEQIDNO.7中所示的氨基酸序列。

在本发明所述的优选抗体中，所述重链的恒定区在位置297(根据Edelman等1969年所述的EU蛋白质编号，对应于图2所示的SEQIDNO.6代表的序列的编号)处包含丙氨酸残基(N297A)。本文为具有在位置297处包含丙氨酸(Ala，A)残基(N297A)的重链的抗体指定了后缀“_N297A”，而在所述位置处具有天冬氨酸(Asn，N)残基的抗体是“野生型”的，因而为其指定了后缀“(wt)”。如图2中可见，人源化抗体8A6野生型的所述重链可变区以位置113(根据EU蛋白质编号)处的氨基酸残基“S”结尾。所述抗体的恒定区以位置118开始。产生的4个氨基酸残基的显著间隙是由对于恒定区转换成EU蛋白质编号系统引起的，而不意味着任何氨基酸残基的丢失。

根据本发明在SEQIDNO.6代表的所述氨基酸序列的位置297处具有丙氨酸残基的所述抗体由于抗体的Fc部分与Fc受体的结合减少或不存在而确实具有减少的或者没有抗体依赖性细胞毒性。SEQIDNO.28中显示了这类N297A恒定区的氨基酸序列。因此，本发明所述的抗体可以包含SEQIDNO.28中所示的氨基酸序列作为恒定区。这样的抗体在位置297(根据EU蛋白质编号)处缺少糖基化。因此，本发明不仅涵盖在位置297(根据重链恒定区的EU蛋白质编号)处缺少糖基化的抗体，还涵盖在位置297(根据重链恒定区的EU蛋白质编号)处发生糖基化的抗体。

在本发明的优选实施方案中，根据本发明所述的抗体的恒定结构域(Fc结构域)具有在位置214处包含氨基酸K(Lys)、在356位置处包含氨基酸E(Glu)、在位置358处包含氨基酸M(Met)以及在位置431处包含氨基酸A(Ala)并且缺少C-端K(Lys)的同种异型G1m17(Beck等，2010)。

本文所用术语“同种异型”是指根据本发明所述抗体的人同种异型。同种异型是特定同种型的恒定区序列内的等位基因/遗传变体。所述同种异型以等位基因的方式进行遗传。因此物种的不同成员就他们从其亲本继承的给定同种型的特定等位基因而彼此不同。Km1和Km2是人κ链的同种异型；G1m(4)和G1m(17)是人γ1链的同种异型。

至于本发明所述抗体的轻链可变区，优选地，本发明所述抗体的轻链可变区包含SEQIDNO.4中所示的氨基酸序列，并具有选自下述的突变中的至少一个：位置1处的氨基酸Q被N替代，位置28处的氨基酸S被N替代，位置31处的氨基酸S被T替代，位置33处的氨基酸V被L替代，位置34处的氨基酸D被A替代，位置49处的氨基酸Y被F替代，位置53处的氨基酸T被N替代，位置55处的氨基酸Y被A替代，位置89处的氨基酸L被Q替代，和位置93处的氨基酸N被Y替代。这样的抗体优选具有以下特征：包含重链恒定区即SEQIDNO.6中所示的氨基酸序列和/或轻链恒定区即SEQIDNO.7中所示的氨基酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，所述恒定轻结构域是在位置153处包含氨基酸A(Ala)并在位置191处包含氨基酸V(Val)的Km3同种异型。

本发明所述的抗体优选地包含SEQIDNO.1或3中所示的重链可变区和/或SEQIDNO.2或4中所示的轻链可变区。因此，本发明所述的抗体优选地包含SEQIDNO.1中所示的重链可变区和SEQIDNO.2中所示的轻链可变区，或者包含SEQIDNO.3中所示的重链可变区和SEQIDNO.4中所示的轻链可变区。

本发明所述的抗体优选地包含SEQIDNO.1中所示的重链可变区、SEQIDNO.2中所示的轻链可变区、重链恒定区即SEQIDNO.6中所示的氨基酸序列和轻链恒定区即SEQIDNO.7中所示的氨基酸序列。

或者，本发明所述的抗体优选地包含SEQIDNO.3中所示的重链可变区、SEQIDNO.4中所示的轻链可变区、重链恒定区即SEQIDNO.6中所示的氨基酸序列和轻链恒定区即SEQIDNO.7中所示的氨基酸序列。

本发明所述的抗体优选地与根据SEQIDNO.5的人FcγRIIB的第20-40号氨基酸范围内的表位特异性结合。

本文所用术语“表位”是指抗体与其特异性结合的赋予在动物体内免疫原性活性的多肽或蛋白质的一部分。

更优选地，所述抗体与包含SEQIDNO.5中的基序GTHSPES的表位特异性结合。已经表明，该氨基酸基序是FcγRIIB的非常特异的表位。与该表位特异性结合的抗体不与人FcγRIIA结合。优选地，本发明所述的抗体通过其可变区与该表位的结合不会干扰抗体的Fc部分与所述受体的结合并且不会阻断所述受体的正常生理功能。

优选地，本发明所述的抗体在体外以具有至少4.9x10^-4s^-1的解离速率(off-rate)常数的亲和性结合人FcγRIIb。解离速率常数(k_off)可通过表面等离子体共振实验进行测量。特别是，与sFcγRIIB结合的抗体可通过使用BIAcoreT200生物传感器(GEHealthcare/BIAcore)的表面等离子体共振来分析。

本文所用术语“亲和性”是指抗体或其片段或其衍生物的一个重链和一个轻链的可变区与其抗原(例如FcγRIIB受体)之间的结合强度，并且在体外进行测量。亲和性决定了表位与抗体的抗原结合位点之间相互作用的强度。可以使用以下公式计算亲和性：

KA＝[AB-AG]/[AB]*[AG]＝k_on/k_off

其中：

KA＝亲和性常数；

[AB]＝抗体上未被占用的结合位点的摩尔浓度

[AG]＝抗原上未被占用的结合位点的摩尔浓度

[AB-AG]＝抗体-抗原复合物的摩尔浓度

本文所用术语“亲合力(avidity)”是指抗体-抗原复合物的整体强度的测量值，其实际上取决于以下参数：(1)抗体对表位的亲和力，(2)抗体和抗原的效价，和(3)相互作用部分的结构布置。

本发明还提供了编码本文所述的抗体的核酸序列。本文所用术语“核酸”或“核苷酸序列”是指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA(mRNA)、其组合或者包含DNA和RNA的杂合分子。所述核酸可以是双链或单链的，还可以同时包含双链和单链的片段。最优选的是双链DNA分子。

根据本发明，编码发明的抗体的核酸序列包含至少编码赋予根据本发明所述的抗体特异性结合性质的抗体的那些部分的核苷酸。

优选地，根据本发明所述的核酸序列编码所述可变区，优选地至少编码本文所述的CDR。

SEQIDNOs.8-11显示了根据本发明的核酸序列的优选的实例。本领域的技术人员能够知晓，这些核苷酸序列可以根据所用的表达方法和所用系统而变化。

本发明进一步提供一种核酸载体，其包含至少一种本文所述的编码本发明的抗体的核酸序列。所述载体优选地包含启动子，上述核酸序列位于所述启动子的控制下。所述载体可以是原核或真核表达载体，其中重组核酸或单独表达或与其他肽或蛋白融合表达。

本发明还提供一种用上述载体转染的宿主细胞。所述宿主细胞可以是任何细胞、原核细胞或者真核细胞，并且可用于至少产生根据本发明所述的抗体或其片段或衍生物的部分。

本发明还提供一种用于产生本发明所述的抗体的方法，所述方法包括在允许表达被本发明所述的核酸载体包含的核酸序列的条件下培养本文所述的宿主细胞，并回收如此产生的抗体。

根据本发明所述的抗体或其片段或衍生物可有利地用于药物组合物。该药物组合物可应用于治疗或预防疾病或障碍，优选自身免疫性疾病。

根据本发明所述的FcγRIIB特异性抗体抑制B细胞、树突状细胞和活化的粒细胞(例如巨噬细胞)中的免疫反应，这引起免疫刺激介质的产量降低，并使抗体的产量以及抗原呈递降低(例如，在树突状细胞和巨噬细胞上导致T细胞募集减少)。总之，所述抗体产生的反馈环和免疫系统的再刺激是被抑制的。

重要的是，本发明所述的FcγRIIB抗体通过其可变区与受体的结合不会干扰IC或抗体与所述受体的Fc片段结合，并且与已知的阻断性抗体相对照，保持了Fc受体的正常功能。

因此，另一方面，本发明涉及包含根据本发明所述的抗体或其片段或衍生物作为活性成分的药物组合物。所述药物组合物可以包含至少一种药学上可接受的载体或佐剂或赋形剂。

抗体可以在本领域已知的或列于公认的用于动物、更特别地用于人的药典中的药学上可接受的组合物中提供。

所述组合物，如果需要，还可以包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、缓释试剂等的形式。

本发明所述的组合物可以配制为中性或盐的形式。

药学上可接受的盐包括但不限于与诸如衍生自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的那些阴离子形成的盐，和与诸如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些阳离子形成的盐。

上述药物组合物可用于治疗或预防或诊断任何疾病或障碍，优选自身免疫性疾病，最优选特征在于产生自身抗体的自身免疫性疾病。

所述术语“治疗有效的”和“预防有效的”涵盖了施用的剂量和频率。施用剂量和频率会进一步典型地根据对每个患者特定的因素而变化，具体取决于施用的特定治疗性或预防性制剂、疾病种类、施药途径以及患者的年龄、体重、反应和既往病史。本领域的技术人员能够选择合适的方案。本文所用术语“治疗有效量”是指足以治疗或改善疾病或障碍、推迟疾病发作或在疾病的治疗或管理中提供任何治疗有益效果的所述治疗活性组分或试剂的量。

对于本发明涵盖的抗体，给患者施用的剂量典型地为0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，所述施用剂量为约15mg/kg。众所周知，人抗体在人体内的半衰期要比来自其他物种的抗体长。因此，与来自其他物种的抗体通常所用的剂量相比，本发明所述的抗体或其片段或衍生物的施用剂量和频率可以降低。

用治疗或预防有效量的本发明所述的抗体或其片段或衍生物对患者进行治疗可以包括单次治疗，或者优选地可以包括一系列治疗。在一个优选实施方案中，可以用约0.1至30mg/kg体重范围内的本发明所述的抗体或其片段或衍生物对患者进行治疗，达每周一次、约1至10周、优选地2至8周、更优选地约3至7周。可以选择最有利的应用形式和方法以最有益于待治疗的患者。

施用本发明所述的抗体或其片段或衍生物的方法包括但不限于肠胃外给药(例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜给药(例如鼻内和口服途径)。在一个特殊的实施方案中，肌肉内、静脉内或皮下施用本发明所述的抗体。可以通过任何方便的途径施用所述组合物，例如，通过输液注射或弹丸注射、通过上皮或皮肤黏膜衬里(例如口腔黏膜、直肠粘膜和肠粘膜等)，还可以与其他生物活性剂一起施用。可以全身或局部施用。此外，还可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器以及具有雾化剂的制剂。

本文所用术语“处理”和“治疗”是指对患者施用治疗有效量的根据本发明所述的药物组合物。“治疗有效量”是指足以治疗或改善疾病或障碍、推迟疾病发作或在疾病的治疗或管理中提供任何治疗有益效果的所述药物组合物或抗体的量。

本文所用术语“预防”是指用于预防疾病或障碍发作的试剂的使用。“预防有效量”定义足以预防疾病的发作或复发的所述活性组分或药剂的量。

本文所用术语“障碍”和“疾病”交替使用，用以指代受试者的病况。特别地，所述术语“自身免疫性疾病”与术语“自身免疫性障碍”可互换使用，用以指受试者的具有以下特征的病况：由受试者对其自身细胞、组织和/或器官的免疫性反应引起的细胞、组织和/或器官损伤。

此外，本发明所述的抗体可用于诊断的目的以检测、诊断或监控疾病或障碍，特别是自身免疫性疾病。根据本发明所述的抗体或其片段或衍生物可用于通过本文所述的或本领域技术人员已知的经典的免疫组化方法测定生物学样品中的FcγRIIB水平(例如参见Jalkanen等，1985,J.Cell.Biol.101:976-985；Jalkanen等,1987,J.Cell.Biol.105:3087-3096)。其他用于检测蛋白基因表达的基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。

因此，本发明进一步涉及包含本发明所述抗体的诊断组合物。

本文所用术语“诊断(的)”是指用于诊断与自身免疫性疾病相关的FcγRIIB的存在的发明抗体的任何用途，例如对内源FcγRIIB在个体或患者细胞上的表面表达的量或程度的测定。其还指活化性FcγRII与抑制性FcγRII的比率测定，例如表达的FcγRIIA与FcγRIIB的比率。

在本发明所述的一个优选实施方案中，上述诊断组合物用于检测和诊断任何疾病或障碍，特别是特征在于产生自身抗体的自身免疫性疾病。示例性的自身免疫性疾病包括免疫性血小板减少症、全身性红斑狼疮、恶性贫血、艾迪生病、1型糖尿病、类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肤肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、Reiter综合征、格氏病、寻常型和大疱性天疱疮、自身免疫性肝炎、溃疡性结肠炎、冷凝集素病、自身免疫性周围神经病变，但不限于这些。

在一个优选实施方案中，本发明所述的抗体用于人的自身免疫性疾病的诊断。例如，根据本发明所述的抗体可用于测定患有自身免疫性疾病的个体细胞上的FcγRIIB表面表达。优选地，使用所述抗体在FACS分析中检测FcγRIIB在B细胞或浆B细胞上的表达。对此，可以通过标记物试剂、荧光标记物或本领域技术人员已知的任何其他标记物来修饰所述抗体以便能够使用标准程序进行检测。根据本发明所述的抗体还可以与本领域已知的人FcγRIIA特异性抗体相组合来用作诊断工具。因此，可以测定FcγRIIB和患有自身免疫性疾病或炎性疾病的个体的细胞上的FcγRIIB的表达，也可以计算出比率作为所述疾病状态或疾病进展的标志，或者作为用于诊断所述疾病的标志。

本发明进一步提供一种用于检测自身免疫性疾病的诊断试剂盒，其包含根据本发明所述的抗体或其片段或衍生物和可选的标记物试剂、载体试剂和/或合适的和需要的容器。

序列

SEQIDNO.1：大鼠抗体8A6的重链可变区的氨基酸序列

SEQIDNO.2：大鼠抗体8A6的轻链可变区的氨基酸序列

SEQIDNO.3：人源化抗体hu8A6的重链可变区的氨基酸序列

SEQIDNO.4：人源化抗体hu8A6的轻链可变区的氨基酸序列

SEQIDNO.5：人FcγRIIB的氨基酸序列

SEQIDNO.6：人源化抗体hu8A6_wt的重链恒定区的氨基酸序列

SEQIDNO.7：人源化抗体hu8A6_wt的轻链恒定区的氨基酸序列

SEQIDNO.8：编码人源化抗体hu8A6的重链可变区的核酸序列

SEQIDNO.9：编码人源化抗体hu8A6的轻链可变区的核酸序列

SEQIDNO.10：编码人源化抗体hu8A6_wt的重链恒定区的核酸序列

SEQIDNO.11：编码人源化抗体hu8A6_wt的轻链恒定区的核酸序列

SEQIDNO.12：人可溶性FcγRIIA(sFcγRIIA)的氨基酸序列

SEQIDNO.13：突变的人可溶性FcγRIIA(sFcγRIIAmut)的氨基酸序列

SEQIDNO.14：大鼠抗体8A6的重链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQIDNO.15：大鼠抗体8A6的重链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQIDNO.16：大鼠抗体8A6的重链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQIDNO.17：大鼠抗体8A6的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQIDNO.18：大鼠抗体8A6的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQIDNO.19：大鼠抗体8A6的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQIDNO.20：人源化抗体hu8A6的重链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQIDNO.21：人源化抗体hu8A6的重链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQIDNO.22：人源化抗体hu8A6的重链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQIDNO.23：人源化抗体hu8A6的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQIDNO.24：人源化抗体hu8A6的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQIDNO.25：人源化抗体hu8A6的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQIDNO.26：抗体GB3的重链可变区的氨基酸序列(还见WO2005/051999的SEQIDNO.7)

SEQIDNO.27：抗体GB3的轻链可变区的氨基酸序列(还见WO2005/051999的SEQIDNO.5)

SEQIDNO.28：位置297处包含N到A的置换的重链恒定区的氨基酸序列(假定序列表中所示的所述序列的位置1是位置118)

SEQIDNO.29：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的重链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQIDNO.30：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的重链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQIDNO.31：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的重链可变区的CDR3的氨基酸序列

SEQIDNO.32：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列

SEQIDNO.33：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列

SEQIDNO.34：包含来自嵌合的和人源化抗体8A6的关键氨基酸残基的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列

附图说明

图1：根据SEQ.ID.No.3和4的人源化8A6的表面等离子体共振分析，其为野生型或N297A形式、ch8A6_N297A(根据SEQ.ID.NO.14和15)和chGB3_N297A。

图2：hu8A6_wt和hu8A6_N297A序列，示出了在N297A形式中N到A的氨基酸交换的位置。

图3：ch8A6_N297A的非封闭性特征。用设置量的聚集人IgG和不同量的ch8A6_N297A、chGB3_N297A或封闭性抗体2B6或R&DAb孵育Raji细胞。根据本发明所述的抗体是非封闭性的。

图4：15μg/ml至0.005μg/ml的蛋白质A纯化的抗体(hu8A6_VL+hu8A6_VH和ch8A6_N297A)与在Raji细胞上表达的幼稚FcγRIIB结合。人源化的8A6变体以高亲合性与在Raji细胞上表达的FcγRIIB结合。

图5：15μg/ml的抗体(hu8A6_VH+hu8A6_VL和ch8A6_N297A)与在K562细胞上表达的幼稚FcγRIIA结合。根据本发明所述的抗体不与K-562上的FcγRIIA结合。

图6a：在来自健康捐赠者的PBMC中嵌合的8A6(ch8A6_N297A)增强ITIM-磷酸化。使用Ficoll分离法从健康捐赠者分离PBMC，随后不做处理或者用包含抗-IgM(抗-人，小鼠)和抗-小鼠IgG(兔)的抗体混合物孵育25分钟。随后，用5μg/mL的ch8A6_N297A或缓冲液(作为对照组(w/o))处理所述细胞20分钟。孵育后收获细胞并根据操作程序进行裂解。对裂解物进行WB-分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图6b：ITIM-磷酸化的对照实验。将Daudi细胞不经处理或用同种型对照抗体、多克隆抗-人抗-IgM(polycl.抗-hIgM)、单克隆抗人IgM(抗-hIgM)、抗-hIgM+5μg/mLch8A6_N297A、来自兔的抗-小鼠IgG(α-小鼠IgG)、α-小鼠IgG+5μg/mLch8A6_N297A、抗-hIgM和α-小鼠IgG的混合物(Ab混合物)或Ab混合物+5μg/mLch8A6_N297A处理25分钟。β-肌动蛋白＝上样对照。

图6c：本发明所述的抗体在存在或不存在BCR和FcγRIIB的交联/连接的情况下在原代PBMC中增强ITIM的磷酸化。

图7：ch8A6_N297A与现有技术抗体(chGB3_N297A)的比较。用包含抗-IgM(抗-人，小鼠)和抗-小鼠IgG(兔)的抗体混合物孵育人Daudi细胞25分钟或者不经处理。随后用不同量的chGB3_N297A或ch8A6_N297A或缓冲液(对照组(w/o))处理所述细胞20分钟。孵育后收获细胞并根据操作程序进行裂解。对裂解物进行WB-分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图8：人源化变体hu8A6_N297A和ch8A6_N297A以及chGB3_N297A对原代PBMC中的ITIM磷酸化的影响的比较。将BCR和FcγRIIB通过抗体混合物进行交联后，以5μg/ml加入不同抗体并对ITIM磷酸化进行蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图9：磷酸化的SHIP-1与FcγRIIBITIM的免疫共沉淀。用抗体混合物和ch8A6_N297A、封闭性抗-FcγRIIB抗体2B6或chGB3_N297A(5μg/mL)对Daudi细胞进行刺激后，FcγRIIB从细胞裂解物中沉淀，对磷酸酶SHIP-1进行蛋白质印迹分析。利用pan抗-CD32抗体(AF1330)的抗-CD32＝上样对照。

图10：人源化的8A6变体(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)与ch8A6_N297A的比较。用缓冲液(未经处理的)或包含抗-IgM(抗-人，小鼠)和抗-小鼠IgG(兔)的混合物(抗体混合物)孵育Daudi细胞25分钟。随后用0.25μg/mL的ch8A6_N297A或人源化的8A6变体(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)处理所述细胞20分钟。孵育后收获细胞并根据操作程序进行裂解。对裂解物进行WB-分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图11：人源化的8A6变体(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)与ch8A6_N297A、封闭性抗-FcγRIIB抗体和chGB3_N297A的比较。用缓冲液(未经处理的)或包含抗-IgM(抗-人，小鼠)和抗-小鼠IgG(兔)的混合物(抗体混合物)孵育Daudi细胞25分钟。随后用0.25μg/mL的ch8A6_N297A、人源化的8A6变体(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)、封闭性抗-FcγRIIB抗体或chGB3_N297A处理所述细胞20分钟。孵育后收获细胞并根据操作程序进行裂解。对裂解物进行WB-分析。β-肌动蛋白＝上样对照。

图12：SLE-PBL小鼠模型的实验建立。将来自人SLE患者的PBL转移到免疫妥协小鼠体内。植入PBL细胞，随后用对照(PBS)或根据本发明所述的抗-FcγRIIBch8A6_N297A抗体处理小鼠。

图13：在移植了来自患有SLE的人捐赠者的PBL的小鼠体内的人IgG总体水平[μg/mL]。图示为用对照(#2，PBS)或ch8A6_N297A(#3和#4)处理的小鼠。

图14：在使用来自患有SLE的人捐赠者的PBL进行SLE-PBL转移/移植后第4周开始，在经ch8A6_N297A处理的小鼠体内的疾病特异性人抗-DNAIgG的下降。图示为在两种不同小鼠即#3和#4(用ch8A6_N297A处理)体内的抗-DNAIgG滴度，#2显示了PBS对照组。

具体实施方式

单克隆抗体8A6的制备

通过用重组的可溶性人FcγRIIB受体使Long-Evans大鼠免疫以产生单克隆抗体克隆8A6。从大鼠脾细胞产生杂交瘤细胞系，并对其进行抗体筛选，所述抗体以比与FcγRIIA结合更高的亲和力与人FcγRIIB特异性结合。第二，使用本领域已知的技术筛选由前述杂交瘤产生的抗体的非阻断性特征，即这些抗体仍允许IgG或IC与膜结合的FcγRIIB相结合。

使用补充5nmolCpG2006(TIBMOLBIOL，德国柏林)的弗氏不完全佐剂，向LOU/C大鼠中腹膜内(i.p.)和皮下(s.c.)注射50μg纯化的重组可溶性人FcγRIIB(sFcγRIIB，SEQIDNO.5)。6周间隔后，在融合前3天，腹膜内(i.p.)和皮下(s.c.)施以50μg的sFcγRIIB和CpG2006的最后增强。根据标准程序进行所述骨髓瘤细胞系与大鼠免疫脾细胞的融合。用涂到ELISA板上的sFcγRIIB或不相关的sFcγRIIA(SEQIDNO.12)蛋白在固相免疫测定中测试杂交瘤上清液。用抗大鼠IgG同种型的缀合HRP的mAb(来自ATCC的TIB173抗-IgG2a、TIB174抗-IgG2b、TIB170抗-IgG1；自制的R-2c抗-IgG2c)检测到来自组织培养上清液的与所述蛋白质相结合的MAb，从而避免IgM类的mAb。所述mAb8A6(大鼠IgG2a)识别FcγRIIB，并且通过所述抗原-特异性ELISA测定未与FcγRIIA结合。用基于FACS的测定针对幼稚抗原的特异性结合对所述抗体进行筛选。此外，筛选抗体的非阻断性特征，即这些抗体仍允许IgG或免疫复合物与膜结合的FcγRIIB相结合。

为了给所述嵌合的和人源化的构建体的表征产生足够量的抗体，瞬时转染FreeStyle^TMCHO-S细胞。

转染前一天，以0.5x10⁶个细胞/ml接种细胞。将细胞离心并重悬浮于培养基中以得到最终的20x10⁶个细胞/ml的细胞浓度。对于每次转染，将3ml的所述细胞悬浮液转移到6孔板中。按照制造商的使用说明用HiSpeedPlasmidMaxiKit(Qiagen)分离用于转染的质粒DNA并在无内毒素的水中洗脱。

对于每次转染，将75μg编码所述轻链的质粒DNA和75μg编码所述重链的质粒DNA加入到所述细胞悬浮液中并轻轻混合。然后加入PEI(Polyplus)并轻轻混合。在37℃、5％CO₂下，在连续摇晃(100rpm)下，孵育所述细胞3小时。用培养基填充所述细胞悬浮液至最终15ml的体积，以得到最终的4x10⁶个细胞/ml的细胞浓度，并将细胞悬浮液转移到125ml的烧瓶内。在37℃、5％CO₂下，在连续摇晃(100rpm)下，孵育所述细胞，6天后通过对其进行2次离心(4000rpm，5分钟)收获上清液。通过0.2μm的过滤器过滤所述上清液，测定抗体滴度(参见下文)。

通过两种不同的HPLC方法，反相(RP)HPLC和蛋白质A-HPLC法，进行所述抗体滴度测定。用Agilent1200系列HPLC系统进行所述RP-HPLC分析。用“LC系统化学工作站(ChemStationforLCSystem)”Rev.B.04.02软件对数据进行分析。溶剂组分为：异丙醇(HPLC级；Roth)，乙腈(HPLC梯度级；Roth)，H₂O(0.2μm过滤)和四氟乙酸(TFA)(用于肽合成；Sigma)。溶剂A：H₂O，0.1％TFA；溶剂B：60％异丙醇，30％乙腈，9.9％H₂O和0.1％TFA。使用多孔性为的PhenomenexJupiter柱(#525166-6)以及颗粒直径为5μm的分离材料。在10分钟内，以30％至43％的溶剂B线性梯度对结合的抗体进行洗脱。用UV/VIS检测器在λ＝210nm处进行检测。

用Agilent1200系列HPLC系统进行所述蛋白质的A-HPLC分析。用“化学工作站(Chemstation)”版Rev.B.04.02软件进行数据分析。使用以下溶剂：溶剂A：0.05MTris/HCl，0.1M甘氨酸，0.15MNaCl，pH8.0；溶剂B：0.05MTris/HCl，0.1M甘氨酸，0.15MNaCl，pH3.0。为进行分析，用120μl的AppliedBiosystems20A灌注层析介质(Lifetechnologies)装填Upchurch2x20mm分析型保护柱。用100％的溶剂B对结合的抗体进行洗脱。如果收集到纯化的抗体，则用pH8.056mM的Tris对级分进行中和。

通过快速蛋白液相色谱法(Explorer)用1mlHiTrap^TMrProteinAFF柱(GEHealthcare)对表达的抗体进行纯化。运行缓冲液包含10mMpH8.0的Tris-HCl、150mMNaCl，洗脱缓冲液由pH2.7的100mM甘氨酸、150mMNaCl组成。用60mMpH8.0的Tris-HCl中和经洗脱的抗体，浓缩，无菌过滤并在-80℃下贮藏。

抗体筛选和8A6的特征化

用本领域已知的技术，例如ELISA-结合测定、Biacore测定或FACS-结合分析，对杂交瘤上清液进行筛选。为测试嵌合的8A6或人源化的变体的抗原特异性结合，将ELISA板(Nunc-ImmunoPlate，F96Maxisorp)用在PBS(100μl/孔)中的1μg/ml的sFcγRIIB、sFcγRIIA(SEQIDNO.12)或sFcγRIIAmut(SEQIDNO.13)涂覆，在4℃下过夜。在PBS中0.01％的吐温中三次洗涤步骤后，室温下用在PBS(300μl/孔)中的2％的BSA进行封闭2小时。三次洗涤步骤后，应用纯化的抗体或上清液的系列稀释物(100μl/孔)并在室温下孵育1小时。纯化的抗体在PBS,2％BSA中稀释。给上清液补充10倍PBS和20％BSA以得到PBS中2％BSA的最终浓度。用山羊-抗-人FcγRIIA(R&DSystems，AF1875)作为用于FcγRIIA的阳性对照。在PBS中0.01％的吐温中的三次洗涤步骤后，室温下孵育各自的第二抗体驴-抗-山羊-HRP(F(ab′)₂，Jackson-Immuno-Research)或山羊-抗-人-HRP(F(ab′)₂，Dianova)1小时(100μl/孔)。在PBS中0.01％的吐温中洗孔6次。加入底物(包含0.03％H₂O₂的OPD)(100μl/孔)，用4MH₂SO₄(50μl/孔)停止反应。然后用光谱仪在492nm下测量吸光度。

通过Raji(CCL-86^TM)和K-562细胞(CCL-243^TM)上的细胞结合对嵌合的8A6或人源化的变体与幼稚抗原的特异性结合进行分析。

通过离心(400g，5min)使细胞成粒状并在FACS-缓冲液(Hanks平衡盐溶液，1％FCS，0.01％NaN₃)中洗涤。再进行一次离心步骤后，将细胞重悬在FACS-缓冲液中以得到2x10⁶个细胞/ml的最终细胞浓度，将50μl的所述细胞悬浮液分装在96-孔U型底的板中。在FACS-缓冲液中制备所述人源化的变体和ch8A6的系列稀释物。

为验证FcγRIIA在K-562细胞上的表达，在FACS-缓冲液中对小鼠-抗-人CD32抗体(StemCellTecnolgogiesInc.，克隆VI.3)进行稀释。向细胞中加入50μl所述稀释的抗体，在4℃下孵育30分钟。在FACS-缓冲液中洗涤T细胞2次。然后，将50μl山羊-抗-人IgG-PE缀合的(F(ab′)₂，Dianova)或山羊-抗-小鼠IgG-PE缀合的(F(ab′)₂，Dianova)第二抗体在FACS-缓冲液中稀释，加入所述细胞中，并在4℃下孵育30分钟。在FACS-缓冲液中进行两次洗涤步骤后，将细胞重悬在300μlFACS-缓冲液中并在BDFACSCanto^TMII(软件：BDFACSDiva^TM)中进行测量。

为确定FcγRIIB抗体是否仍允许IgG或免疫复合物与膜结合的FcγRIIB的结合，进行基于FACS的测定。通过离心(400g，5min)使细胞成粒状并在FACS-缓冲液(Hanks平衡盐溶液，1％FCS，0.01％NaN₃)中洗涤。再进行一次离心步骤后，将细胞重悬在FACS-缓冲液中以得到2x10⁶个细胞/ml的最终细胞浓度。在FACS-缓冲液中制备抗体(ch8A6_N297A、chGB3_N297A、R&DAbmab1875)的系列稀释物。将25μl所述稀释的抗体在96-孔U型底的板中与25μlAlexa488-标记的聚集Beriglobin(2.5μl/孔)混合。在Superdex-200(16/60)上通过尺寸排阻色谱法将聚集人IgG与商购可用的合并的IgG(Beriglobin)产品分离。

将50μl的所述细胞悬浮液加入到所述抗体-Beriglobin混合物中并在4℃下孵育1小时。在FACS-缓冲液中洗涤细胞2次。然后，将50μl山羊-抗-人IgG-PE缀合的(F(ab′)₂，Dianova)或抗-大鼠-PE第二抗体在FACS-缓冲液中稀释，加入所述细胞中，并在4℃下孵育30分钟。在FACS-缓冲液中进行两次洗涤步骤后，将细胞重悬在300μlFACS-缓冲液中并在BDFACSCanto^TMII(软件：BDFACSDiva^TM)中进行测量(图3)。

FACS结合测定

通过Raji和K-562细胞上的细胞结合对嵌合的8A6或人源化的变体与幼稚抗原的特异性结合进行分析。

通过离心(400g，5min)使细胞成粒状并在FACS-缓冲液(Hanks平衡盐溶液，1％FCS，0.01％NaN₃)中洗涤。再进行一次离心步骤后，将细胞重悬在FACS-缓冲液中以得到2x10⁶个细胞/ml的最终细胞浓度，将50μl的所述细胞悬浮液分装在96-孔U型底的板中。在FACS-缓冲液中制备所述人源化的变体和ch8A6的系列稀释物。

用浓度渐增的人源化的抗体和嵌合的抗体孵育Raji和K562细胞作为对照组。用Raji细胞来测试FcγRIIB上的结合(图4)，用K562细胞来分析与FcγRIIA的非特异性结合(图5)。用PE缀合的第二抗体检测细胞结合的抗体。全部人源化的变体以比得上ch8A6_N297A的亲和性与FcγRIIB结合，全部人源化的变体还以比FcγRIIA高的亲合结合FcγRIIB。

用BiacoreT200生物传感器(GEHealthcare/Biacore)通过表面等离子共振对与sFcγRIIB和sFcγRIIA抗体结合的进行分析。在LMU生物学和微生物学系ServiveUnitBioanalytic进行实验。按照制造厂商的操作程序，使用人抗体捕获试剂盒(HumanAntibodyCaptureKit)在SeriesSSensorChipCM5传感器芯片上捕获经分析的抗体。在10nM的浓度下捕获Hu8A6变体或ch8A61分钟。以不同浓度注射分析物sFcγRIIB3分钟。在25℃和持续流(10μl/min)下进行测量。使用BiacoreT200评估软件(1.0版本)对数据进行评估，假定1:1结合。

8A6大鼠抗体的嵌合

通过将大鼠8A6VH区与信号肽和人IgG1恒定区相融合来构建抗-FcγRIIB嵌合的单克隆抗体8A6。此外，使用包含N297A突变的IgG1恒定结构域使所述重链的去糖基化变体产生。为构建所述8A6轻链基因，同样将所述大鼠8A6VL区与信号序列和人κ恒定区的序列相融合。在Geneart/LifeTechnologies进行重链和轻链的DNA合成，随后亚克隆到哺乳动物表达载体中。

体外测定

细胞，试剂和抗体

从DSMZ购买人Burkitt淋巴瘤细胞系Daudi和Ramos(ACC78和ACC603)，并在37℃、5％CO₂下维持在补充有10％FBS(Gibco/Invitrogen)、MEMNEAA(Gibco/Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(Gibco/Invitrogen)和2mML-谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)的RPMI1640(Gibco/Invitrogen)中。使用Ficoll密度梯度(Leucosep,GreinerBio-One,BiocollSeparatingSolution,Biochrom)和负磁分离(DynabeadsUntouchedHumanBCells,Invitrogen)从健康捐赠者的肝素化血液中纯化原代人B细胞。通过用抗-hCD19-APC(BDPharmingen#555415)、抗-hCD3-PerCP-Cy5.5(BDBiosciences#332771)和抗-hCD56-PE(BDPharmingen#555515)染色的FACS分析研究富集的B细胞的纯度。原代B细胞直接用于实验而不进行进一步的培养。根据EP1534335封闭抗-FcγRIIB抗体2B6。

使用可溶性抗体刺激混合物的刺激操作程序

为同时刺激BCR和FcγRIIB，使用2μg/ml单克隆小鼠抗-hIgM(SouthernBiotech#9022-01，克隆UHB)和20μg/ml单克隆兔抗-mIgG(1、2a、3)(Epitomics#3020-1，克隆M111-2)(其Fc部分与人FcγRIIB受体交叉反应)，建立抗体体系。用20μg/ml多克隆兔抗-hIgM(antibodiesonline#ABIN117299)或包含2μg/ml抗-hIgM和同种型对照mIgG2b(克隆MPC-11，BDPharmingen#557351)的混合物进行对照。

通过离心收获淋巴瘤细胞系Daudi或Ramos和原代B细胞的3x10⁵个细胞，然后在37℃下在测定介质(RPMI1640+1％FBS)中用不同的刺激混合物孵育20分钟。

随后，将5μg/ml抗-FcγRIIB抗体ch8A6(1:10稀释，0.8μl)、2B6(1:10稀释，1.5μl)或chGB3_N297A(1:10稀释，1.1μl)加入到所述样本中，进一步孵育细胞25-30分钟。分别如所述进行裂解。

磷酸化模式的蛋白质印迹分析

细胞裂解

在4℃下使细胞成粒，用冰冷的PBS洗涤并在冰上在10μL补充有磷酸酶抑制剂(PhosStop，Roche)、蛋白酶抑制剂(CompleteUltraMini，无EDTA，Roche)和1mMPMSF(FlukaBiochemica)的裂解缓冲液(RIPA缓冲液(CellSignaling))中孵育30-45分钟。

SDS-PAGE

离心后，使用应用于SDSPAGE(NuPAGENovexBis-TrisMiniGels，MESSDSRunningBuffer(Invitrogen))的样品缓冲液(NuPAGELDSSampleBuffer,NuPAGESampleReducingAgent,Invitrogen)将上清液上样。对于SDS-PAGE，加入LDS样品缓冲液和还原剂，并且在95℃下加热样品5分钟。在-20℃下贮藏样品或通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法直接分析样本。

向PVDF膜的蛋白质转移和检测

随后，将蛋白质转移至PVDF膜(Roti-PVDF,Roth，转移缓冲液10mMTris、100mM甘氨酸、10％甲醇，转移条件240mA常数，在4℃下90分钟)。用TBS-T(10mMTris，150mMNaCl，0,1％吐温20)中5％BSA将膜封闭并用抗-FcγRIIB/CD32Phospho(pY292)(CellEpitomics#2308-1，1:50000，4℃过夜)或抗-磷酸化SHIP(1:1000，CellSignaling#3941)和抗-兔-HRP(JacksonImmunoResearch#111-036-045，TBS-T中1:50,000，1hRT)对膜进行染色。在X射线膜上检测化学发光(用WesternLightningPlus,PerkinElmer显影)。

剥离

为了对抗其他磷酸化蛋白的抗体进行随后的分析，将膜剥离(Re-BlotPlus，Millipore)10分钟，洗涤，封闭，然后用抗-β-肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich#A1978，1:50,000和抗-小鼠IgG-HRP，Sigma-Aldrich#A9044)或用于其他信号传导蛋白的抗体染色。

来自健康捐赠者的PBMC中FcγRIIB-ITIM磷酸化由本发明所述的抗体显著增强

从健康捐赠者分离PBMC，或者不经处理，或者用刺激混合物(单克隆小鼠抗-hIgM和单克隆兔抗-mIgG)孵育25分钟。随后，用ch8A6或缓冲液处理细胞作为对照组。使用如上所述的适当的检测抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。检测到细胞(PBMC，B细胞)的FcγRIIB-IITIM基序的磷酸化显著增强(图6a)。单独用刺激混合物或仅单克隆小鼠抗-hIgM、单克隆兔抗-mIgG与ch8A6组合的细胞刺激的对照实验未显示出增强的FcγRIIB-ITIM-磷酸化(图6b)。因此，本发明所述的抗体显示出对具有交联的BCR和膜结合(内源性表达)的FcγRIIB的人细胞的ITIM-磷酸化的显著影响，但不影响未经刺激的细胞，即无交联的BCR和膜结合的FcγRIIB的细胞。在自身免疫性疾病期间，BCR和膜结合的FcγRIIB将被自体-抗原或免疫复合物(IC)交联。本发明所述的抗体在自身免疫性疾病中能够通过增强FcγRIIB-ITIM-磷酸化而抑制致病性自身反应性B细胞。然而，本发明所述抗体还能够在没有交联的BCR的情况下增强ITIM-磷酸化(图6c)。

ch8A6与现有技术抗体(chGB3_N297A)的影响的比较

克隆ch8A6_N297A和克隆chGB3_N297A对ITIM磷酸化的影响的比较。先用抗体混合物，然后用上述ch8A6_N297A、chGB3_N297A或2B6处理人Daudi细胞。与ch8A6_N297A相似，抗体chGB3_N297A也是一种非阻断性抗-FcγRIIB抗体并且识别相似的表位。

向经抗体混合物处理的细胞中添加ch8A6_N297A在0.05μg/ml浓度下显示出FcγRIIB-ITIM磷酸化的增强。尽管chGB3_N297A的浓度渐增表现出抑制性基序的磷酸化的剂量依赖型刺激，但令人惊讶的是，该抗体克隆不能够达到可与8A6相比的水平。用“ImageJ”软件进行的X射线膜的光密度定量，计算出最大2.8倍磷酸化信号的值，而与未经处理的细胞相比，hu8A6_N297A导致了9.8倍的增强(图7)。因此，与现有技术抗体相比，本发明所述的抗体清楚而惊人地显示出增强的FcγRIIB-ITIM-磷酸化。

人源化的变体hu8A6、嵌合的8A6_N297A和chGB3_N297A对原代PBMC中ITIM磷酸化的影响的比较

比较抗体chGB3_N297A、ch8A6_N297A和人源化的8A6对原代人PBMC的FcγRIIB-ITIM磷酸化的影响。通过所述抗体混合物对BCR和FcγRIIB进行交联后，以5μg/ml加入不同抗体并对ITIM磷酸化进行蛋白质印迹分析。与现有技术抗体相比，本发明所述抗体再次惊人地对FcγRIIB-ITIM-磷酸化表现出显著增强的影响(图8)。

磷酸化的FcγRIIB-ITIM基序和SHIP-1的免疫共沉淀

受体交联后，磷酸酶SHIP通过其SH₂结构域与FcγRIIB-ITIM基序中磷酸-酪氨酸的结合而被募集到膜，随后在SHIP-1的C端结构域的NPXY基序处进行酪氨酸磷酸化。在膜中的重定位和随后的NPXY基序磷酸化对SHIP-1的调节功能是必不可少的。其对钙通量、细胞存活、生长、细胞周期阻滞和细胞凋亡的影响通过PI3K和Akt途径介导。Tyr1021定位于SHIP-1的NPXY基序之一中，并且其磷酸化对SHIP-1的功能很重要(Nimmerjahn,Ravetch,2008)。

用以上部分所述的抗体混合物刺激人Daudi细胞，在温和的裂解缓冲液(CoIP裂解缓冲液)中进行裂解后，用2B6孵育样品以捕获FcγRIIB。将复合物与蛋白G-耦合的铁磁珠子结合并用磁轨将其分离。

在500μlCoIP裂解缓冲液中制备1x10⁷个细胞/样品的裂解物，在冰上孵育所述细胞30分钟，每10分钟进行涡旋。在4℃下以13,000rpm10分钟将细胞碎片旋转下来，然后将上清液转移到新的管中。在4℃下用10μg2B6孵育500μl所述裂解物2-3小时，上下翻转。用500μl裂解缓冲液洗涤磁性蛋白G-耦合的珠子两次，将50μl珠子(1.5mg)加入裂解物-抗体-复合物中，在4℃下过夜(旋转轮)。通过用200μl裂解缓冲液洗涤两次并在25μl包含还原剂的1xLDS样品缓冲液中加热所述珠子5分钟而使复合物从所述珠子洗脱。在4000xg下离心30秒后，将10μl的上清液应用于SDS-PAGE以进行蛋白质印迹分析。

裂解物的蛋白质印迹分析显示，经抗体混合物和ch8A6_N297A处理的细胞样品中磷酸化-SHIP-1的水平显著提高。由于用FcγRIIB-特异性抗体2B6进行沉淀，因此只有已经与FcγRIIB结合的分离的SHIP-1被共沉淀。经剥离和重染色后的膜显示出在经ch8A6_N297A处理的样品中增强的FcγRIIB-ITIM基序的磷酸化，与磷酸化-SHIP1信号相关联。用α-hFcγRIIBa、b、c进行的第二次重染色在所有样品中显示出相同量的沉淀的受体FcγRIIB，充当SDS-PAGE的上样对照(图9)。

ch8A6的人源化

通过从大鼠抗体向人框架移植互补决定区序列对ch8A6进行人源化。为选择人框架，将V_H和V_L序列与人Ig可变和连接区种系片段的那些序列(获自公共可得的数据库(IMGT；V-BASE))进行比较。重链和轻链分别选择VH_3_30plusIGHJ4人种系序列和VK3_15plusIGKJ2人种系序列。

产生了人源化的重链和轻链的若干变体。在LifeScienceTechnologies/Geneart合成编码所述人源化的V_H和V_L的设计序列的基因，随后亚克隆到哺乳动物表达载体中。所述抗体变体的筛选操作直接由转染的CHO-S细胞(nvitrogen)的上清液进行。嵌合的8A6抗体在人源化的变体的筛选过程中充当转染转染对照和标准。对Hu8A6变体在Raji细胞上通过ELISA分析在sFcγRIIB和sFcγRIIA上的结合，并且通过FACS分析在幼稚FcγRIIB上的结合(参见上述)。此外，用表面等离子体共振进行所述抗体变体的动力学表征。

人源化的8A6变体的测试

为测试8A6人源化变体的磷酸化活性，将Daudi细胞用所述抗体混合物刺激，用0.5或5μg/ml的各种8A6变体处理，并对ITIM磷酸化进行蛋白质印迹分析。

人源化的8A6变体与ch8A6_N297A的比较

全部测试的人源化的8A6变体都能够诱导受体的磷酸化，并且磷酸化水平与由来自相同纯化批次的ch8A6_N297A诱导的磷酸化水平相当。因此，在第二次人源化轮次后未检测到活性丧失。尽管Biacore数据表明，重链和轻链的不同组合物具有不同的亲和性，但通过蛋白质印迹分析未检测到那些不同(图10)。

人源化的8A6变体与ch8A6_N297A、封闭性的抗-FcγRIIB(2B6)和chGB3_N297A的比较

选择最终的人源化链组合后，将组合重链V_H10与轻链V_L6的该变体最终与抗体ch8A6_N297A、2B6和chGB3_N297A进行比较(图11)。

体内测定

SLE-PBL-模型

以6Gy的剂量辐射Rag2/γ-c/Fcγ-/-小鼠，并腹膜内注射不同量的500μlPBS中的人外周血白细胞。

在人SLE-患者PBL移植到小鼠体内并由人免疫球蛋白M或G的存在而得到证实后，对小鼠进行细胞注射后2周开始对小鼠的治疗。用200μl缓冲液(PBS)或200μlPBS中的20μg抗体(ch8A6_N297A)腹膜内注射对小鼠进行治疗，一周两次，治疗四周。每周进行一次称重并取血以得到血清。在-80℃下冷冻血清样品至进一步使用(图12)。

ELISA

通过ELISA分析血清样品中总体人IgG、IgM和抗-DNAIgM与IgG的存在。

为了将血清样品中的总体血清IgM和IgG定量，根据制造厂商的说明使用BethylHumanIgMELISAQuantitationKit和HumanIgGELISAQuantitationKit(Biomol)。用VersaMax可调微量读板仪(MolecularDeivces)在450和650nm下测量OD。

为检测抗-DNA抗体，在室温下用PBS中10μg/mL的甲基化BSA(Sigma)涂覆ELISA板2小时。洗涤后，在4℃下用PBS中50μg/mL的小牛胸腺DNA(Sigma)涂覆该板过夜。在室温下用PBS/0.1％Gelatin/3％BSA/1mMEDTA封闭非特异性结合2小时。在所述封闭溶液中以1:100稀释血清，在室温下孵育1小时。作为检测抗体，使用所述人IgMQuantitationKit(Bethyl)的HRP-缀合的抗体，并在封闭溶液中以1:10000稀释，随后在室温下孵育1小时。PBS用于所有的洗涤步骤。为进行检测，加入TMB溶液，用6％的正磷酸停止反应。

SLEPBL模型，总体人血清免疫球蛋白

分析在移植了来自患有SLE的人捐赠者的PBL的小鼠体内总体人IgG水平[μg/mL]。未检测到PBS或抗-FcγRIIB之间的总体人IgG的显著差异。根据本发明所述的抗体不会显著影响总体人IgG(图13)。

SLEPBL模型，对抗-DNA抗体的影响(疾病特异性IgG)

在SLE-PBL转移/移植后第4周开始在抗-FcγRIIB小鼠体内观察到疾病特异性人抗-DNAIgG的明显减少。本发明所述抗体特异性地减少了疾病相关抗-DNA抗体的量(图14)。

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Claims (22)

1.一种抗FcγRIIB抗体，所述抗体包含：

(i)与SEQIDNO.20中所示的H-CDR1序列具有60％或更多同一性的H-CDR1序列，

(ii)与SEQIDNO.21中所示的H-CDR2序列具有36％或更多同一性的H-CDR2序列，

(iii)与SEQIDNO.22中所示的H-CDR3序列具有50％或更多同一性的H-CDR3序列，

(iv)与SEQIDNO.23中所示的L-CDR1序列具有64％或更多同一性的L-CDR1序列，

(v)与SEQIDNO.24中所示的L-CDR2序列具有29％或更多同一性的L-CDR2序列，和

(vi)与SEQIDNO.25中所示的L-CDR3序列具有78％或更多同一性的L-CDR3序列，

其中，相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增强约4至10倍。

2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体在其重链可变区中包含SEQIDNOs.29、30和31中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.32、33和34中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中与未经所述抗体处理的Daudi细胞相比，所述抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增强约4至10倍。

3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体

(a)在其重链可变区中包含SEQIDNOs.14、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.17、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；或者

(b)在其重链可变区中包含SEQIDNOs.20、21和22中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.23、24和25中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，

其中与未经所述抗体处理的Daudi细胞相比，所述抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增强约4至10倍。

4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体是嵌合的或人源化的。

5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述重链可变区包含SEQIDNO.3中所示的氨基酸序列，并具有选自下述的突变中的至少一个：位置1处的氨基酸Q被E替代，位置11处的氨基酸V被L替代，位置42处的氨基酸G被K替代，位置50处的氨基酸S被V替代，位置53处的氨基酸Y被S替代，位置58处的氨基酸K被T替代，位置61处的氨基酸G被A替代，位置75处的氨基酸S被T替代，位置76处的氨基酸K被R替代，位置77处的氨基酸N被S替代，和位置78处的氨基酸T被N替代。

6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQIDNO.4中所示的氨基酸序列，并具有选自下述的突变中的至少一个：位置1处的氨基酸Q被N替代，位置28处的氨基酸S被N替代，位置31处的氨基酸S被T替代，位置33处的氨基酸V被L替代，位置34处的氨基酸D被A替代，位置49处的氨基酸Y被F替代，位置53处的氨基酸T被N替代，位置55处的氨基酸Y被A替代，位置89处的氨基酸L被Q替代，和位置93处的氨基酸N被Y替代。

7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含SEQIDNO.1或3中所示的重链可变区。

8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含SEQIDNO.2或4中所示的轻链可变区。

9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体与根据SEQIDNO.5的人FcγRIIB的氨基酸No.20-40特异性结合。

10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体在体外以具有至少4.9x10^-4s^-1的解离速率常数的亲和性与人FcγRIIb结合。

11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体在其重链恒定区中包含SEQIDNO.6中所示的氨基酸序列。

12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体在其轻链恒定区中包含SEQIDNO.7中所示的氨基酸序列。

13.一种抗-FcγRIIB抗体，所述抗体包含SEQIDNO.1或3中所示的重链可变区和/或SEQIDNO.2或4中所示的轻链可变区。

14.根据权利要求13所述的抗体，所述抗体在其轻链恒定区中包含SEQIDNO.6中所示的氨基酸序列。

15.根据权利要求13或14所述的抗体，所述抗体在其轻链恒定区中包含SEQIDNO.7中所示的氨基酸序列。

16.一种编码权利要求1至15中任一项所述抗体的核酸序列。

17.一种核酸载体，所述核酸载体包含插入载体分子的根据权利要求16所述的核酸序列中的至少一种。

18.一种用根据权利要求17所述的核酸载体转染的宿主细胞。

19.包含权利要求1至15中任一项所述的抗体作为活性成分的药物组合物。

20.权利要求1至15中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗或预防自身免疫疾病的方法中，所述自身免疫疾病的特征在于产生自身抗体。

21.权利要求1至15中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗或预防免疫性血小板减少症、全身性红斑狼疮、恶性贫血、艾迪生病、1型糖尿病、类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肤肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、Reiter综合征、格氏病、寻常型和大疱性天疱疮、自身免疫性肝炎、溃疡性结肠炎、冷凝集素病和自身免疫性周围神经病变的方法中。

22.一种用于产生权利要求1至15中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括在允许表达被权利要求17所述的核酸载体包含的核酸序列的条件下培养权利要求18所述的宿主细胞，并回收如此产生的抗体。