BR112019012328A2 - anticorpos anti-ox40 e seus usos - Google Patents

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Abstract

a presente divulgação fornece novos anticorpos anti-ox40, composições que incluem os anticorpos, ácidos nucleicos que codificam os anticorpos e métodos de produção e uso dos mesmos.

Description

“ANTICORPOS ANTI-OX40 E SEUS USOS”
1. REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS [001]Este pedido de patente reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. no. 62/434,761, depositado em 15 de dezembro de 2016, cujo conteúdo é incorporado aqui em sua totalidade como referência ao mesmo.
2. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002]O presente pedido de patente contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada aqui como referência em sua totalidade. A dita cópia de ASCII, criada em 30 de outubro de 2017, é chamada 381493-368WO_SL.txt e tem 97.999 bytes de tamanho.
3. CAMPO TÉCNICO [003]O presente pedido de patente refere-se, entre outras coisas, a novos anticorpos anti-OX40, composições que incluem os anticorpos, ácidos nucleicos que codificam os anticorpos e métodos de produção e uso dos mesmos.
4. ANTECEDENTE [004]As terapias para câncer compreendem uma faixa ampla de abordagens terapêuticas, inclusive cirurgia, radiação e quimioterapia. Embora as várias abordagens permitam que uma seleção ampla de tratamentos esteja disponível para o médico atendente tratar o câncer, compostos terapêuticos existentes sofrem de um número de desvantagens, tais como uma falta de seletividade de direcionamento às células cancerosas ao invés das células saudáveis normais e o desenvolvimento de resistência pelo câncer ao tratamento.
[005]Abordagens recentes baseadas em compostos terapêuticos direcionados, que interferem nos processos celulares de células cancerosas preferencialmente no lugar células normais, levaram a regimes quimioterapêuticos com menos efeitos colaterais
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2/96 quando comparados àqueles das terapias não direcionadas tal como o tratamento com radiação.
[006]A imunoterapia para câncer surgiu como uma abordagem terapêutica promissora para complementar padrões de cuidado existentes, ver, por exemplo, Miller, et al. Cancer Cell, 27, 439-449 (2015). Tais abordagens de imunoterapia incluem o desenvolvimento de anticorpos utilizados para modular o sistema imunológico para matar as células cancerosas.
[007]As respostas imunológicas antitumor em pacientes com tumores sólidos foram aprimoradas através do tratamento com compostos biológicos. Por exemplo, há dois anticorpos monoclonais anti-PD-1 aprovados e comercializados: nivolumab (OPDIVO®) e pembrolizumab (KEYTRUDA®), com aprovações nos EUA e na União Européia para tratar doenças tais como melanoma não operável ou metastásico e câncer pulmonar de células não pequenas metastásico. O tratamento de pacientes com estes agentes resultou em respostas antitumor que são medidas através do aumento da sobrevida livre de progressão e/ou da sobrevida global.
[008]O fracasso recente de OPDIVO® no retardo da progressão de câncer de pulmão avançado em uma população de pacientes naive em relação ao tratamento em um teste clínico comparando OPDIVO® com quimioterapia convencional destaca a necessidade de abordagens alternativas e tratamentos para câncer adicionais para complementar os padrões de cuidado terapêutico existentes.
5.SUMÁRIO [009]A presente divulgação fornece anticorpos anti-OX40 que se ligam especificamente e ativam 0X40. As sequências de aminoácidos de exemplos de regiões de determinação de complementaridade (CDRs), das regiões do domínio variável de cadeia pesada (Vh) e do domínio variável de cadeia leve (Vl) (isto é, as cadeias Vh e Vi_,
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3/96 respectivamente) e das cadeias pesada e leve de exemplos de anticorpos anti-OX40 são fornecidas na Descrição Detalhada a seguir. Os anticorpos anti-OX40 fornecidos aqui resultam na ativação da resposta imunológica adaptativa.
[010]Os anticorpos anti-OX40 podem incluir modificações e/ou mutações que alteram as propriedades dos anticorpos, tais como aumento da meia-vida, aumento ou redução da citotoxicidade celular dependente de antigeno (ADCC), como é conhecido na técnica.
[011]São fornecidos aqui ácidos nucleicos que compreendem as sequências de nucleotídeos que codificam os anticorpos anti-OX40 da divulgação, assim como vetores que compreendem os ácidos nucleicos. Adicionalmente, são fornecidas aqui células hospedeiras procarióticas e eucarióticas transformadas com um vetor que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti-OX40 divulgado, bem como células hospedeiras eucarióticas (tais como de mamíferos) engenheiradas para a expressão das sequências de nucleotídeos. Os métodos de produção de anticorpos, através da cultura de células hospedeiras e da recuperação dos anticorpos também são fornecidos e discutidos adicionalmente na Descrição Detalhada a seguir.
[012]Em outro aspecto, a presente divulgação fornece composições que incluem os anticorpos anti-OX40 descritos aqui. As composições geralmente compreendem um ou mais anticorpos anti-OX40 que são descritos aqui e um ou mais excipientes, carreadores ou diluentes.
[013]A presente divulgação fornece métodos de tratamento de indivíduos, tais como indivíduos humanos, diagnosticados com um tumor sólido com um anticorpo anti0X40. O método geralmente envolve a administração ao indivíduo de uma quantidade de um anticorpo anti-OX40 descrito aqui eficaz para fornecer benefício terapêutico. O indivíduo pode ser diagnosticado com qualquer um de um número de tumores sólidos
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4/96 que podem ser recém-diagnosticados, reincidente ou reincidente e refratário. Um anticorpo anti-OX40 pode ser administrado na forma de uma infusão intravenosa uma vez a cada duas semanas.
[014]Os anticorpos anti-OX40 podem ser administrados na forma de agentes terapêuticos isolados (monoterapia) ou de forma adjuntas ou com outros agentes terapêuticos tipicamente, mas não necessariamente, aqueles utilizados para o tratamento de um tumor sólido. Os agentes terapêuticos tipicamente serão utilizados em sua dose, rota de administração e frequência de administração aprovadas.
[015]Os anticorpos anti-OX40 podem ser administrados através de uma variedade de rotas ou modos de administração, incluindo, mas não limitados à infusão e/ou injeção intravenosa e injeção intratumoral. A quantidade administrada dependerá da rota de administração, do planejamento de dosagem, do tipo de câncer que será tratado, do estágio do câncer que será tratado e de outros parâmetros tais como a idade e o peso do paciente, como é bem conhecido na técnica.
6.BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [016]As FIGS. 1A-1D representam a ativação funcional de células T humanas in vitro após o tratamento com o exemplo de anticorpo anti-OX40 Hu3738. A FIG. 1A representa a proliferação de células T CD4+ do sangue periférico humano após o tratamento com o anticorpo anti-OX40 Hu3738 ou o anticorpo da literatura 11D4 ou 18D8. A FIG. 1B representa o aumento na produção de interferon-gama (IFN-γ) por células T CD4+ humanas após o tratamento com o anticorpo anti-OX40 Hu3738 ou o anticorpo da literatura 11D4 ou 18D8. A FIG. 1C representa a proliferação de células T CD4+ do sangue periférico humano após o tratamento com Hu3738 ou o anticorpo da literatura 1A7. A FIG. 1D representa o aumento na produção de IFN-γ por células T CD4+ humanas após o tratamento com Hu3738 ou o anticorpo da literatura 1A7.
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5/96 [017]As FIGS. 2A-2B mostram o efeito de exemplo de anticorpo anti-OX40 Hu3738 sobre a supressão mediada por células T reguladoras (Treg) humanas in vitro. O ensaio de supressão com Treg foi montado utilizado duas proporções diferentes de células T de resposta CD4+/CD25- (Tresp) para células T reguladoras CD4+/CD25+/CD127IOW (Treg). Esferas do reagente Treg Suppression Inspector (Insp) foram adicionadas nos poços de cultura na proporção de esfera-para-célula de 1:1 para estimulação. A barra transparente representa a proliferação de células Tresp na presença de Insp. Os anticorpos anti-OX40 e IgGi humano de controle de isotipo foram testados em triplicata na concentração final de 10 pg/mL na ausência ou na presença do reagente de ligação cruzada (F(ab')2 anti-lgG humana de caprino, Fc específico) na proporção de 1:4. As placas foram incubadas a 37 °C em 5% de CO2 durante quatro dias. 3H-timidina a 1 μθί/poço foi adicionada e as placas foram adicionalmente incubadas durante mais 16 horas. Os gráficos representam a proliferação que é mostrada em contagens por minuto (cpm). A FIG. 2A representa resultados com Tresp para Treg na proporção de 2:1; A FIG. 2B representa resultados com Tresp para Treg na proporção de 4:1.
[018]A FIG. 3 representa a inibição da ligação do exemplo de anticorpo anti0X40 Hu3738 na presença do ligante de 0X40 humano solúvel (OX40L). O gráfico mostra a intensidade de fluorescência média (MFI) vs. a concentração de OX40L (pg/mL). As células Jurkat que expressam 0X40 humana foram coradas simultaneamente com uma titulação do OX40L solúvel não marcado e 0,2 pg/mL de Hu3738 ou anticorpo de controle de isotipo.
[019]A FIG. 4A mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos da 0X40 humana (SEQ ID NO:1) com 0X40 de camundongo (SEQ ID NO:3). A FIG. 4B representa a atividade de ligação do exemplo de anticorpo anti-QX40 Hu3738 às moléculas de 0X40 humanas, de camundongo ou quiméricas ser humano-camundongo expressas na
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6/96 superfície celular que contêm domínios ricos em cisteína de camundongo (CRDs) permutados pelas regiões humanas correspondentes. A 0X40 humana é mostrada como “293s-huOX40”, a 0X40 humana quimérica com CDRI de camundongo é mostrada como “293s-huOX40-muCRDI”, a 0X40 humana quimérica com CDRII de camundongo é mostrada como “293s-huOX40-muCRDH”, a 0X40 humana quimérica com CDRIII de camundongo é mostrada como “293s-huOX40-muCRDIH”, a 0X40 humana quimérica com CDRIV de camundongo é mostrada como “293s-huOX40-muCRDIV”, a 0X40 humana quimérica com CDRII de camundongo e CRDIII de camundongo é mostrada como “293s-huOX40-muCRDII+IH” e a 0X40 de camundongo é mostrada como “293smuOX40”.
[020]A FIG. 5 representa a competição pela ligação à 0X40 humana de superfície celular pelo exemplo de anticorpo anti-OX40 Hu3738 ou um anticorpo da literatura (11D4, 18D8, 106-222, 119-122 ou 1A7).
[021 ]A FIG. 6A representa a ativação de NF-κΒ nas linhagens de células repórteres Jurkat transfectadas com 0X40 humana após o tratamento com o exemplo de anticorpo anti-OX40 Mu3738 ou Hu3738 ou o anticorpo da literatura 11D4, 18D8, 106222 ou 119-122 ou controle de isotipo na ausência de um agente de ligação cruzada adicionado. A FIG. 6B representa a ativação de NF-κΒ nas linhagens de células repórteres Jurkat transfectadas com 0X40 humana após o tratamento com o exemplo de anticorpo anti-OX40 Hu3738, o anticorpo da literatura 1A7 ou o controle de isotipo na presença ou na ausência de um agente de ligação cruzada adicionado.
[022]A FIG. 7 representa a atividade antitumor do exemplo de anticorpo anti0X40 Hu3738 em um modelo de tumor de células adotivas PC3 humanas em camundongos NSG.
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7/96 [023]A FIG. 8 representa níveis de interleucina-8 (IL-8), fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), fator de necrose de tumor alfa (TNF-a) e interferon-gama (IFN-γ) em um modelo de doença de enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) mediada por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) humanas em camundongos NSG, após o tratamento dos camundongos com 1 mg/kg de Hu3738 ou controle de isotipo IgG 1 humano uma vez a cada 7 dias para um total de 4 doses.
7.DESCRIÇÃO DETALHADA [024]A presente divulgação refere-se a anticorpos e fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente à 0X40, composições que compreendem os anticorpos, polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-OX40, células hospedeiras capazes de produzir os anticorpos, métodos e composições úteis para a produção dos anticorpos e vários métodos de uso dos mesmos.
[025]Como será considerado pelos peritos na técnica, os anticorpos e os fragmentos dos mesmos têm natureza “modular”. Ao longo de toda a divulgação, são descritas várias modalidades específicas dos vários “módulos” que compõem os anticorpos anti-OX40 ou os fragmentos de ligação dos mesmos. Como exemplos não limitantes específicos, são descritas várias modalidades específicas das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (Vh), das cadeias Vh, das CDRs do domínio variável de cadeia leve (Vi_) e das cadeias Vl. É pretendido que todas as modalidades específicas possam ser combinadas uma com as outras como se cada combinação específica fosse explicitamente descrita individualmente.
7.1. Abreviações [026]Os anticorpos, os fragmentos de ligação e os polinucleotídeos descritos aqui são, em muitas modalidades, descritos através de suas respectivas sequências
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8/96 polipeptídicas ou polinucleotídicas. A não ser que seja indicado o contrário, as sequências polipeptídicas são fornecidas na orientação N^C; as sequências polinucleotídicas na orientação 5’^3’. Para as sequências polipeptídicas, podem ser utilizadas as abreviações convencionais de três letras ou uma letra para os aminoácidos codificados geneticamente, como mostrado na TEBELA 1, a seguir.___________________
TABELA 1 Abreviações de Aminoácidos Codificados
Aminoácido Abreviação de Três Letras Abreviação de Uma Letra
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
Ácido aspártico Asp D
Cisteína Cys C
Ácido glutâmico Glu E
Glutamina Gin Q
Glicina Gly G
Histidina His H
Isoleucina lie I
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
Serina Ser S
Treonina Thr T
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9/96
TABELA 1 Abreviações de Aminoácidos Codificados
Aminoácido Abreviação de Três Letras Abreviação de Uma Letra
Triptofano Trp W
Tirosina Tyr Y
Valina Vai V
[027]Certas sequências são definidas pelas fórmulas estruturais que especificam os resíduos de aminoácidos que pertencem a certas classes (por exemplo, alifáticos, hidrofóbicos etc.). As várias classes às quais os aminoácidos codificados geneticamente pertencem que são utilizadas aqui são mostradas na TABELA 2, a seguir. Alguns aminoácidos podem pertencer a mais de uma classe. A cisteína, que contém um grupo sulfidrila e a prolina, que é limitada conformacionalmente, não são atribuídas às classes.
TABELA 2 Classes dos Aminoácido Codificados
Classe Aminoácidos
Alifáticos A, I, L,V
Aromáticos F, Y, W
Não Polares M, A, I, L, V
Polares N, Q, S, T
Básicos Η, K, R
Ácidos D, E
Pequenos A, G
7.2. Definições [028]A não ser que seja definido aqui o contrário, os termos científicos e técnicos utilizados em associação com a presente divulgação devem ter os significados que são comumente entendidos pelos peritos comuns na técnica.
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7.3. Anticorpos Anti-OX40 e Fragmentos de Ligação [029]OX40 é uma molécula coestimuladora que possui uma função crítica no aprimoramento de respostas imunológicas nascentes e age concomitantemente suprimindo a atividade de células T reguladoras. 0X40, também conhecida como CD134 ou superfamília de receptor de fator de necrose de tumor 4 (TNFRSF4), é um membro de superfície celular transmembrana do Tipo I da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNF) expresso de forma transitória sobre as células T recentemente ativadas e expresso de forma constitutiva sobre células T reguladoras ativadas. O domínio de ligação ao ligante extracelular de 0X40 é composto de três domínios ricos em cisteína (CRD) e um quarto CRD parcial (CRDI, CRDII, CRDIII e CRDIV, respectivamente). Embora seja primariamente expressa pelas células T CD4+ ativadas, a 0X40 pode ser expressa sobre as células B, as células T CD8+ e as células natural killer (NK) e T natural killer (NKT) após a ativação. Foi relatado que os neutrófilos expressam 0X40 e a sinalização através de 0X40 nos neutrófilos humanos inibe a morte celular apoptótica. O ligante para 0X40 (OX40L), também conhecido como a superfamília de ligante de fator de necrose de tumor 4 (TNFSF4), CD252 ou glicoproteína 34 (gp34), tem sua regulação aumentada por células apresentadoras de antígenos e células B ativadas. A ligação do ligante à 0X40 sobre células T ativadas com o antigeno resulta na translocação a jusante de NF-κΒ e na ativação da via de AKT. A translocação de NF-kB leva ao aumento da regulação de moléculas pró-sobrevivência tais como Bcl-2, Bcl-XL e sobrevivência celular. É pretendido que os anticorpos de ativação direcionados para 0X40 aumentem pelo menos em parte as respostas imunológicas específicas para o antigeno através do prolongamento da ativação e da diferenciação de células T efetoras.
[030]Em adição ao impacto sobre as células T efetoras ativadas pelo antigeno, o direcionamento da 0X40 expressa por células T reguladoras também pode contribuir
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11/96 para o suposto mecanismo de ação. As células T reguladoras expressam altos níveis de 0X40 dentro do microambiente do tumor. Foi mostrado que a ativação de 0X40 tem impacto sobre a capacidade de supressão das células T reguladoras e leva à eliminação ativa de células T reguladoras positivas para 0X40 do microambiente do tumor.
[031 ]Em um aspecto, a divulgação refere-se a anticorpos que se ligam especificamente à 0X40.
[032]Como utilizado aqui, o termo “anticorpo” (Ab) refere-se a uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno particular - aqui, 0X40. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-OX40 da divulgação se ligam à 0X40 humana (SEQ ID NO:1) (NCBI Reference Sequence NP003318) e assim modulam o sistema imunológico. A resposta do sistema imunológico resultante é citotóxica para as células tumorais. Os anticorpos anti-OX40 compreendem regiões de determinação de complementaridade (CDRs), também conhecidas como regiões hipervariáveis, nos domínios variáveis tanto na cadeia leve quanto na cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de framework (estruturais) (FR). como é conhecido na técnica, a posição do aminoácido/limite que representa uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na técnica. Algumas posições dentro de um domínio variável podem ser vistas como posições hipervariáveis híbridas nas quais pode-se considerar que estas posições estão dentro de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios enquanto é considerado que estão fora de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios diferentes. Uma ou mais destas posições também podem ser encontradas nas regiões hipervariáveis estendidas. A divulgação fornece anticorpos que compreendem modificações nestas posições hipervariáveis híbridas. Cada um dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreende quatro regiões FR, basicamente por
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12/96 adotar uma configuração de folha β, conectada por CDRs, que formam laços que se conectam e em alguns casos fazem parte da estrutura de folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação alvo dos anticorpos. Ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Como utilizado aqui, a numeração dos resíduos de aminoácidos da imunoglobulina é realizada de acordo com o sistema de numeração de resíduos de aminoácidos da imunoglobulina de Kabat et al. a não ser que seja indicado o contrário.
[033]Os anticorpos da divulgação podem ser policlonal, monoclonal, engenheirados geneticamente e/ou modificados de outra maneira na natureza, incluindo, mas não limitados a anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos. Em algumas modalidades, a região constante é um isotipo selecionado de: IgA (por exemplo, IgAi ou lgA2), IgD, IgE, IgG (por exemplo, IgGi, lgG2, IgGs ou lgG4) e IgM. Em modalidades específicas, um anticorpo anti-OX40 descrito aqui compreende uma IgGi. Em outras modalidades, os anticorpos anti-OX40 compreendem uma lgG2 ou uma lgG4. Como utilizado aqui, a “região constante” de um anticorpo inclui a região constante natural, alotipos ou variantes naturais, tais como D356E e L358M ou A431G na IgGi humana. Ver, por exemplo, Jefferis e Lefranc, MAbs, 1(4): 332-338 (Jul-Aug 2009).
[034]A região constante leve de um anticorpo anti-OX40 pode ser uma região leve kappa (κ) ou uma região lambda (λ). Uma região leve λ pode ser de qualquer um dos subtipos conhecidos, por exemplo, Ai, λ2, Â3 ou À4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 compreende uma região leve kappa (κ).
[035]O termo “anticorpo monoclonal” como utilizado aqui não é limitado aos anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. Um anticorpo monoclonal é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago,
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13/96 através de quaisquer meios disponíveis ou conhecidos na técnica. Os anticorpos monoclonais úteis com a presente divulgação podem ser preparados utilizando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo o uso das tecnologias de hibridoma, recombinantes e de exibição em fago ou uma combinação das mesmas. Em muitos usos da presente divulgação, incluindo o uso in vivo dos anticorpos anti-OX40 em humanos, podem ser utilizados anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos.
[036]O termo anticorpo “quimérico” como utilizado aqui refere-se a um anticorpo que possui sequências variáveis derivadas de uma imunoglobulina não humana, tal como um anticorpo de rato ou camundongo e regiões constantes de imunoglobulinas humanas, tipicamente escolhidas de um molde de imunoglobulina humana. Os métodos para produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes U.S. Nos. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397.
[037]Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, de camundongo) são imunoglobulinas quiméricas que contêm sequências mínimas derivadas de imunoglobulina não humana. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente tudo de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. Os métodos de humanização de anticorpo são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Riechmann etal., 1988, Nature 332:323-7; Patentes U.S. Nos:
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5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370 a Queen et al.; EP239400; Publicação PCT WO 91/09967; Patente U.S. No. 5.225.539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska etal., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; e Patente U.S. No. 5.565.332.
[038]“Anticorpos humanos” incluem anticorpos que possuem a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgênicos em relação a uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas. Os anticorpos humanos podem ser produzidos através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de exibição em fago utilizando bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulinas humanas. Ver Patentes U.S. Nos. 4.444.887 e 4.716.111; e Publicações PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; e WO 91/10741. Os anticorpos humanos também podem ser produzidos utilizando camundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulinas humanas. Ver, por exemplo, Publicações PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patentes U.S. Nos. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; e 5.939.598. Em adição, empresas tais como LakePharma, Inc. (Belmont, CA) ou Creative BioLabs (Shirley, NY) podem ser engajar em fornecer anticorpos humanos direcionados contra um antigeno selecionado utilizando tecnologia similar àquela descrita acima. Anticorpos totalmente humanos que reconhecem um epítopo selecionado podem ser gerados utilizando uma técnica referida como “seleção guiada”. Nesta abordagem, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de
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15/96 camundongo, é utilizado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítopo (ver, Jespers etal., 1988, Biotechnology 12:899-903).
[039]São também considerados os fragmentos de ligação do anticorpo anti0X40. Os fragmentos de ligação da divulgação incluem aqueles que são capazes de se ligar especificamente à 0X40. Exemplos de fragmentos de ligação do anticorpo incluem com a finalidade de exemplo e não de limitação, os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, fragmentos de Fv de cadeia única (scFv) e fragmentos de domínio único.
[040]Um fragmento Fab contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio da cadeia pesada CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Os fragmentos Fab' são produzidos através da divagem da ligação dissulfeto nas cisteínas da dobradiça do produto da digestão da pepsina F(ab')2. Acoplamentos químicos adicionais de fragmentos de anticorpo são conhecidos pelos peritos comuns na técnica. Os fragmentos Fab e F(ab')2 não possuem a região do Fragmento cristalizável (Fc) de um anticorpo intacto, são eliminados mais rapidamente da circulação dos animais e podem ter menos ligação ao tecido inespecífica que um anticorpo intacto (Ver, por exemplo, Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316).
[041]Como é comumente entendido na técnica, uma região “Fc” é a região constante do Fragmento cristalizável de um anticorpo que não compreende região de ligação específica ao antígeno. Nos isotipos de anticorpo In IgG, IgA e IgD, a região Fc é composta de dois fragmentos de proteína idênticos, derivados do segundo e do terceiro domínios constantes (domínios CH2 e CH3, respectivamente) das duas cadeias pesadas de um anticorpo. As regiões Fc de IgM e IgE contêm três domínios constantes de cadeia pesada (domínios CH2, CH3 e CH4) em cada cadeia polipeptídica.
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16/96 [042]Um fragmento “Fv” é o fragmento mínimo de um anticorpo que contém um sítio de reconhecimento e de ligação ao alvo completo. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em uma associação não covalente forte (dímero Vh-Vl). É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao alvo sobre a superfície do dímero Vh-Vl. Frequentemente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação ao alvo ao anticorpo. Entretanto, em alguns casos mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um alvo) pode ter a capacidade de reconhecer e se ligar ao alvo, embora a uma afinidade menor que o sítio de ligação inteiro.
[043]Os fragmentos de ligação do anticorpo “Fv de cadeia única” ou “scFv” compreendem os domínios Vh e Vl de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo de Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios Vh e Vl que possibilita que o scFv forme uma estrutura favorável para a ligação do alvo.
[044]Os “fragmentos de domínio único” são compostos de um único domínio Vh ou Vl que exibe afinidade suficiente com a 0X40. Em uma modalidade específica, o fragmento de domínio único é camelizado (Ver, por exemplo, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).
[045]Os anticorpos anti-OX40 da divulgação incluem anticorpos derivatizados. Por exemplo, os anticorpos derivatizados são tipicamente modificados por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, divagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína. Qualquer uma de várias modificações químicas pode ser realizada através de técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a, divagem química específica,
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17/96 acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina etc. Adicionalmente, o derivativo pode conter um ou mais aminoácidos não naturais, por exemplo, utilizando a tecnologia ambrx (Ver, por exemplo, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011 -2).
[046]Os anticorpos anti-OX40 podem ser anticorpos cujas sequências foram modificadas para alterar pelo menos uma função efetora biológica mediada pela região constante. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 pode ser modificado para reduzir pelo menos uma função efetora biológica mediada pela região constante em relação ao anticorpo não modificado, por exemplo, ligação reduzida a um ou mais dos receptores de Fc (FcyR) tais como FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA e/ou FcyRIIIB. A ligação ao FcyR pode ser reduzida através da mutação do segmento da região constante de imunoglobulina do anticorpo em regiões particulares necessárias para as interações com FcyR (Ver, por exemplo, Canfield e Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; e Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). A redução na capacidade de se ligar ao FcyR do anticorpo também pode reduzir outras funções efetoras que se baseiam nas interações com o FcyR, tais como opsonização, fagocitose e citotoxicidade celular dependente de antigeno (“ADCC”). Em um exemplo ilustrativo, um domínio CH2 variante que possui uma substituição V263L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S ou V273Y no domínio CH2 da região Fc pode exibir afinidade reduzida ao FcyRIIB quando comparado com a região constante do tipo selvagem correspondente.
[047]O anticorpo anti-OX40 descrito aqui inclui anticorpos que foram modificados para adquirir ou aprimorar pelo menos uma função efetora biológica mediada pela região constante em relação a um anticorpo não modificado, por exemplo, para aprimorar as interações com o FcyR (Ver, por exemplo, Pedido de Patente US No. 2006/0134709). Por exemplo, um anticorpo anti-OX40 da divulgação pode ter uma região constante que
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18/96 se liga a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA e/ou FcyRIIIB com maior afinidade que a região constante do tipo selvagem correspondente. Em um exemplo ilustrativo, um domínio CH2 variante que possui uma substituição V263L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S ou V273Y no domínio CH2 da região Fc pode exibir maior afinidade com o FcyRIIIA quando comparado com a região constante do tipo selvagem correspondente.
[048]Assim, os anticorpos anti-OX40 da divulgação podem ter alterações na atividade biológica que resultam em maior ou menor opsonização, fagocitose ou ADCC. Tais alterações são conhecidas na técnica. Por exemplo, as modificações nos anticorpos que reduzem a atividade de ADCC são descritas na Patente U.S. No. 5.834.597. Um exemplo de variante que reduz a ADCC corresponde ao “mutante 3” (também conhecido como “M3”, mostrado na FIG. 4 da Patente U.S. No. 5.834.597) no qual os resíduos 234 e 237 (utilizando a numeração EU) são substituídos por alaninas. Uma variação do mutante 3 (também conhecido como “M3”) pode ser utilizada em um número de isotipos de anticorpos, por exemplo, M3 de lgG2 humana.
[049]Substituições adicionais que podem modificar a ligação ao FcyR e/ou ADCC a função efetora de um anticorpo anti-OX40 incluem a substituição K322A ou a substituição dupla L234A e L235A na região Fc, por exemplo, uma IgGi humana que possui a substituição dupla L234A/L235A. Ver, por exemplo, Hezareh, et al. J. Virol., 75 (24): 12161-12168 (2001).
[050]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-OX40 possuem níveis baixos ou não possuem fucose. Os anticorpos que não possuem fucose foram correlacionados com maior atividade de ADCC, especialmente em doses baixas de anticorpo. Ver Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73. Os métodos de preparação de anticorpos sem fucose incluem o
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19/96 crescimento em células YB2/0 de mieloma de rato (ATCC CRL 1662). As células YB2/0 expressam níveis baixos de mRNA de FUT8, que codifica a a-1,6-fucosiltransferase, uma enzima necessária para a fucosilação de polipeptídeos.
[051 ]Os anticorpos anti-OX40 podem compreender domínios CH2 modificados (ou variantes) ou domínios Fc inteiros que incluem substituições de aminoácidos que aumentam a ligação ao FcyRIIB e/ou reduzem a ligação ao FcyRIIIA quando comparada com a ligação de um CH2 ou uma região Fc do tipo selvagem correspondente. O CH2 variante ou os domínios Fc variantes foram descritos no Pedido de Patente U.S. No. 2014/0377253. Um CH2 variante ou um domínio Fc variante inclui tipicamente uma ou mais substituições na posição 263, na posição 266, na posição 273 e na posição 305, em que a numeração dos resíduos no domínio Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-OX40 compreendem uma ou mais substituições selecionadas de V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K e V305W, em relação ao domínio CH2 do tipo selvagem. Em modalidades específicas, a uma ou mais substituições do domínio CH2 são selecionadas de V263L, V273E, V273F, V273M, V273S e V273Y, em relação ao domínio CH2 de uma IgGi humana. Por exemplo, a uma ou mais substituições de um domínio CH2 de IgGi podem ser V273E. Em outra modalidade específica, o anticorpo anti-OX40 da divulgação compreende um domínio CH2 de IgGi variante que compreende a substituição de aminoácido V263L [052]Outros exemplos de domínios CH2 variantes ou Fc variantes que podem produzir maior ligação ao FcyRIIB e/ou ligação reduzida ao FcyRIIIA quando comparada com a ligação de uma região CH2 ou Fc do tipo selvagem correspondente incluem aqueles encontrados em Vonderheide, et al. Clin. Cancer Res., 19(5), 1035-1043 (2013), tal como S267E ou S267E/L328F na IgGi humana.
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20/96 [053]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-OX40 incluem modificações que aumentam ou reduzem suas afinidades de ligação ao receptor de Fc fetal, FcRn, por exemplo, através da mutação do segmento da região constante de imunoglobulina em regiões particulares envolvidas nas interações com o FcRn (ver, por exemplo, WO 2005/123780). Em modalidades particulares, um anticorpo anti-OX40 da classe IgG sofre mutação de forma que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 250, 314 e 428 da região constante de cadeia pesada seja substituído individualmente ou em quaisquer combinações dos mesmos, tal como nas posições 250 e 428 ou nas posições 250 e 314 ou nas posições 314 e 428 ou na posições 250, 314 e 428, com uma combinação específica das posições 250 e 428. Para a posição 250, o resíduo de aminoácido de substituição pode ser qualquer resíduo de aminoácido sem ser a treonina, incluindo, mas não limitado a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, triptofano ou tirosina. Para a posição 314, o resíduo de aminoácido de substituição pode ser qualquer resíduo de aminoácido sem ser leucina, incluindo, mas não limitado a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptofano ou tirosina. Para a posição 428, os resíduos de aminoácidos de substituição podem ser qualquer resíduo de aminoácido sem ser metionina, incluindo, mas não limitado a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptofano ou tirosina. Um exemplo de substituição conhecido por modificar a função efetora de Fc é a substituição M428L no Fc, que pode ocorrer em combinação com a substituição T250Q no Fc. Combinações específicas adicionais de substituições de aminoácidos adequadas são identificadas na Tabela 1 da Patente U.S.
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No. 7.217.797. Tais mutações aumentam a ligação ao FcRn, que protege o anticorpo da degradação e aumenta sua meia-vida.
[054]Um anticorpo anti-OX40 pode ter um ou mais aminoácidos inseridos em uma ou mais de suas CDRs, por exemplo, como é descrito em Jung e Plückthun, 1997, Protein Engineering 10:8, 959-966; Yazaki etal., 2004, Protein Eng. Des Sei. 17(5):4819. Epub 2004 Aug 17; e Pedido de Patente U.S. No. 2007/0280931.
[055]Os anticorpos anti-OX40 com alta afinidade com a 0X40 humana (SEQ ID NO:1) podem ser desejáveis para usos terapêuticos e para diagnóstico. Consequentemente, a presente divulgação considera anticorpos que possuem uma alta afinidade de ligação com a 0X40 humana. Em modalidades específicas, os anticorpos anti-OX40 se ligam à 0X40 humana com uma afinidade de pelo menos aproximadamente 100 nM, mas podem exibir afinidade mais alta, por exemplo, pelo menos aproximadamente 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM ou ainda maior. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam à 0X40 humana com uma afinidade na faixa de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM ou uma afinidade que varia entre qualquer um dos valores anteriores, tal como, mas não limitados a desde aproximadamente 0,001 a 10 nM, 0,001 a 5 nM, 0,01 a 100 nM, 0,01 a 50 nM, 0,01 a 10 nM, 0,01 a 5 nM ou 0,01 a 1 nM.
[056]A afinidade dos anticorpos anti-OX40 com a 0X40 humana pode ser determinada utilizando técnicas bem conhecidas na técnica ou descritas aqui, tal como por exemplo, mas não com a finalidade de limitação, ELISA, calorimetria com titulação isotérmica (ITC), ressonância de plasmon de superfície ou ensaio de polarização fluorescente.
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22/96 [057]Os anticorpos anti-OX40 geralmente compreendem uma cadeia pesada que compreende uma região variável (Vh) que possui três regiões de determinação de complementaridade (“CDRs”) referidas aqui (na ordem N^C) como VhCDR#1, Vh CDR#2 e Vh CDR#3 e uma cadeia leve que compreende uma região variável (Vl) que possui três regiões de determinação de complementaridade referidas aqui (na ordem N^C) como Vl CDR#1, Vl CDR#2 e Vl CDR#3. São fornecidas aqui as sequências de aminoácidos de exemplos de CDRs, bem como a sequência de aminoácidos das regiões Vh e Vl das cadeias pesada e leve de exemplos de anti-OX40. Modalidades específicas de anticorpos anti-OX40 incluem estes exemplos de CDRs e/ou sequências de Vh e/ou VL, bem como anticorpos que competem pela ligação à 0X40 humana com tais anticorpos.
[058]Em algumas modalidades, as sequências de aminoácidos das CDRs de um anticorpo anti-OX40 possuem sequências selecionadas de suas respectivas sequências de CDR de Vh e Vl na TABELA 3 a seguir:_____________________________________
TABELA 3 Exemplos de Sequências de CDR
CDR Sequência Identificador
VhCDR#1: GFTFSRYGMS GYSIASGYYWN GFNIKDTYMH GFSLTSYGVH (SEQ ID NO:101) (SEQ ID NO:111) (SEQ ID NO:121) (SEQ ID NO:131)
Vh CDR#2: TINSNGGRTYYPDSVKG YISYDGSNNYNPSLG RIDPANGNTKYDPKFQG VIWSGGSTDYNAAFIS (SEQ ID NO:102) (SEQ ID NO:112) (SEQ ID NO:122) (SEQ ID NO:132)
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TABELA 3 Exemplos de Sequências de CDR
CDR Sequência Identificador
Vh CDR#3: EGITTAYAMDY TLPYYFDY GGPAWFVY EEFDY (SEQ ID NO:103) (SEQ ID NO:113) (SEQ ID NO:123) (SEQ ID NO:133)
VlCDR#1: KASQSVDYDGDSYMH RASQDISNYLN (SEQ ID NQ:104) (SEQ ID NO:114)
Vl CDR#2: AASILES YTSRLHS YTSRLRS (SEQ ID NQ:105) (SEQ ID NO:115) (SEQ ID NO:125)
VlCDR#3: QQSNEDPRT QQGNTLPLT QQGNTLPWT QQGYTLPPT (SEQ ID NQ:106) (SEQ ID NO:116) (SEQ ID NO:126) (SEQ ID NO:136)
[059]São descritos aqui exemplos específicos de modalidades de anticorpos anti-OX40 com as CDRs acima. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 possui as CDRs de acordo com as SEQ ID NOS: 101, 102, 103, 104, 105 e 106. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 possui as CDRs de acordo com as SEQ ID NOS: 111, 112, 113, 114, 115 e 116. Em algumas modalidades, um anticorpo anti0X40 possui as CDRs de acordo com as SEQ ID NOS: 121, 122, 123, 114, 125 e 126. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 possui as CDRs de acordo com as SEQ ID NOS: 131, 132, 133, 114, 115e 136.
[060]As CDRs descritas aqui formam elementos de ligação dentro das cadeias Vh e Vl dos anticorpos anti-QX40 da divulgação. As TABELAS 4 e 5 a seguir descrevem
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24/96 as cadeias Vh e Vl que correspondem aos exemplos de anticorpos anti-OX40 que contêm as CDRs descritas anteriormente. As CDRs estão sublinhadas abaixo nas TABELAS 4 e
5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos que é descrita na TABELA 4:______________
TABELA 4 Exemplos de Sequências de Vh
Vh Sequência Identificador
Mu3738 Vh EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMS WVRQTPDKRLELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISR DNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGITTAYAMDY WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:21)
Hu3738 VH,1b EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMS WVRQAPGKGLELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGITTAYAMDY WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:22)
Mu3726 Vh NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSIASGYYWN WIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLGNRISITRD TSKNQVFLKLNSVTTEDTATYYCVKTLPYYFDYWGQ GTTLTVSS (SEQ ID NO:23)
Hu3726 VH,1a EVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSIASGYYWN WIRQPPGKGLEWMGYISYDGSNNYNPSLGNRITISRD TSKNQVSLKLSSVTAVDTAVYYCVKTLPYYFDYWGQ GTTVTVSS (SEQ ID NO:24)
Mu3739 Vh EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHW VKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITAD TSSNTAYLQLSSLTSEDTDVYYCARGGPAWFVYWGQ GTLVTVSA (SEQ ID NO:25)
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TABELA 4 Exemplos de Sequências de Vh
Vh Sequência Identificador
Hu3739 VH,1b EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHW VRQAPGQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGRATITAD TSTNTA YM E LSS L RS E DTA VYYC A RGGPAWFVYW G QGTLVTVSS (SEQ ID NO:26)
Mu3741 Vh QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHW V RQS PG KG LE W LGVIWSGGSTDYNAAFISRLSIS KD N SKSQVFFKMNSLQADDTAIYCCAREEFDYWGQGTTL TVSS (SEQ ID NO:27)
Hu3741 VH.2b EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGVHW VRQAPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLTISKDN SKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREEFDYWGQGTTV TVSS (SEQ ID NO:28)
e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos que é descrita na TABELA 5:
TABELA 5 Exemplos de sequências de VL
VL Sequência Identificador
Mu3738 Vl DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSY MHWYQQKPGQPPKLLIYAASILESGIPARFSGSGSG TDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPRTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:31)
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TABELA 5 Exemplos de sequências de VL
VL Sequência Identificador
Hu3738 Vl,1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSY MHWYQQKPGQPPKLLIYAASILESGVPDRFSGSGS GTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPRTFGGGTK VEIK (SEQ NO:32) ID
Mu3726 Vl DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWY QQKPDGTVKLLIFYTSRLHSGVPSRFSGGGSGTDY SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPLTFGAGTKLELK (SEQ NO:33) ID
Hu3726 VL,1b DIQMTQTPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWY QQKPGKAPKLLIFYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYT LTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPLTFGQGTKLEIK (SEQ NO:34) ID
Mu3739 Vl DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWY QQKPDGTVKLLIYYTSRLRSGLPSRFSGSGSGTDYS LTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ NO:35) ID
Hu3739 VL,1b DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWY QQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGLPSRFSGSGSGTDYT LTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK (SEQ NO:36) ID
Mu3741 Vl DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWF QQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYS LTISNLEQEDIATYFCQQGYTLPPTFGGGTKLEIK (SEQ NO:37) ID
Hu3741 VL,1c DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWF QQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYT LTISSLQPEDFATYYCQQGYTLPPTFGGGTKVEIK (SEQ NO:38) ID
[061 ]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:21 e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID
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N0:31. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:23 e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:25 e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:35. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:27 e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:37.
[062]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 é adequado para administração a seres humanos. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-QX40 é humanizado. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:22 e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:32. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:24 e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:34. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:26 e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:36. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:28 e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:38.
[063]Seria entendido por um perito na técnica que certas mutações de uma sequência de Vh ou Vl em um anticorpo anti-QX40 descrito aqui produziríam anticorpos
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28/96 anti-OX40 dentro do âmbito da divulgação. As mutações podem incluir substituições, adições ou deleções de aminoácidos de uma sequência de Vh ou Vl que é divulgada aqui enquanto se mantém a atividade anti-OX40 significativa. Consequentemente, em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma sequência de Vh que possui pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de Vh mostradas na TABELA 4. Um anticorpo anti-OX40 pode compreender uma sequência de Vh que possui até 8, até 7, até 6, até 5, até 4, até 3 ou até 2 mutações comparada com qualquer uma das sequências de Vh mostradas na TABELA 4. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 pode compreender uma sequência de Vh que possui 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou ou menos mutações comparada com qualquer uma das sequências de Vh mostradas na TABELA 4. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma sequência de Vl que possui pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de Vl mostradas na TABELA 5. Um anticorpo anti-OX40 pode compreender uma sequência de Vl que possui até 8, até 7, até 6, até 5, até 4, até 3 ou até 2 mutações comparada com qualquer uma das sequências de Vl mostradas na TABELA 5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 pode compreender uma sequência de Vl que possui 5 ou menos, 4 ou menos, ou menos ou 2 ou menos mutações comparada com qualquer uma das sequências de Vl mostradas na TABELA 5.
[064]As sequências de aminoácidos de cadeias pesada e leve de comprimento completo geralmente compreendem uma cadeia Vh ou Vl descrita anteriormente ligada a uma região constante de imunoglobulina apropriada, por exemplo, região constante de
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IgGi humana ou kappa leve. Podem ocorrer modificações pós-tradução nas sequências de um anticorpo anti-OX40 de comprimento completo, tal como a divagem de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou mais) resíduos de aminoácidos na extremidade C-terminal da cadeia pesada do anticorpo. Tais produtos de divagem podem compreender parte ou todo o anticorpo anti-OX40 que é expresso.
[065]Consequentemente, em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que é descrita na TABELA 6:
TABELA 6 Exemplos de Sequências de Cadeia Pesada
Sequência Identific ador
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGL ELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCAREGITTAYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSWPLAPSS/ÍSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS S VVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDG VE VHNAKTKPREEQ YNS TYR WS VL TVLHQD WLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKL TVDKSR W QQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 41
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TABELA 6 Exemplos de Sequências de Cadeia Pesada
Sequência Identific ador
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGL ELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCAREGITTAYAMDYWGQGTTVTVSSAST/ÍGPSVFPLAPSS/ÍSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS S VVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDG VE VHNAKTKPREEQ YNS TYR WS VL TVLHQD WLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKL TVDKSR W QQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 42
E VQLQESG PG LVKPS DTLS LTCAVSGYSIASGYYWNW1RQPPG KG LE WMGYISYDGSNNYNPSLGNRITISRDTSKNQVSLKLSSVTAVDTAVY YCVKTLPYYFOYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA lgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtv pssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapell GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV E VHNAKTKPREEQYNS TYR WS VL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 43
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TABELA 6 Exemplos de Sequências de Cadeia Pesada
Sequência Identific ador
E VQLQESG PG LVKPS DTLS LTCAVSGYSIASGYYWNW1RQPPG KG LE WMGYISYDGSNNYNPSLGNRITISRDTSKNQVSLKLSSVTAVDTAVY YCVKTLPYYFDYWGQGTTVTVSSAST/ÍGPSVFPLAPSS/ÍSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV E VHNAKTKPREEQYNS TYRWS VL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 44
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLE WIGRIDPANGNTKYDPKFQGRATITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVY YCARGGPAWFVYWGQGTLVTVSSAST/ÍGPSVFPLAPSS/ÍSTSGGTA ALGOL VKDYFPEPVTVSWNSGAL TSG VHTFPA VLQSSGL YSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 45
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TABELA 6 Exemplos de Sequências de Cadeia Pesada
Sequência Identific ador
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLE WIGRIDPANGNTKYDPKFQGRATITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVY YCARGGPAWFVYWGQGTLVTVSSAST/ÍGPSVFPLAPSS/ÍSTSGGTA ALGOL VKDYFPEPVTVSWNSGAL TSG VHTFPA VLQSSGL YSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 46
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGVHWVRQAPGKGL EWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKSTVYLQMNSLRAEDTAV YYCAREEFDYWGQGTTVTVSSAST/<GPS\/FPLAPSS/<STSGGTAAL GOL VKD YFPEP VTVS WNSGAL TSG VHTFPA VLQSSGL YSLSS VVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI A VE WESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVF SOS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 47
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TABELA 6 Exemplos de Sequências de Cadeia Pesada
Sequência Identific ador
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGVHWVRQAPGKGL EWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKSTVYLQMNSLRAEDTAV YYCAREEFDYWGQGTTVTVSSAST/íGPSt/FPLAPSS/íSTSGGTAAL GCL VKD YFPEP VTVS WNSGAL TSG VHTFPA VLQSSGL YSLSS VVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI A VE WESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVF SCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 48
e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve que é descrita na TABELA 7:
TABELA 7 Exemplos de Sequências de Cadeia Leve
Sequência Identific ador
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMHWYQQKPGQ PPKLLIYAASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ SNEDPRTFGGGTKVE1KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 51
DIQMTQTPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLI FYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLP ETFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE SEQ ID NO: 52
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TABELA 7 Exemplos de Sequências de Cadeia Leve
Sequência Identific ador
AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLI YYTSRLRSGLPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLP WTFGGGTKVE\KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC SEQ ID NO: 53
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWFQQKPGKAPKLLI YYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTLP PTFGGGTKVE\KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC SEQ ID NO: 54
em que os aminoácidos sublinhados representam as CDRs e os aminoácidos em itálico representam as regiões constantes.
[066]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO:41 ou 42 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO:51. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO:43 ou 44 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO:52. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO:45 ou 46 e uma sequência de aminoácidos
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35/96 de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO:53. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO:47 ou 48 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO:54.
[067]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma sequência de cadeia pesada que possui pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS:41-48. Um anticorpo anti-OX40 pode compreender uma sequência de cadeia pesada que possui até 8, até 7, até 6, até 5, até 4, até 3 ou até 2 mutações comparada com a sequência de cadeia pesada de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS:41-48. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 pode compreender uma sequência de cadeia pesada que possui 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos mutações comparada com a sequência de cadeia pesada de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS:41-48.
[068]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 compreende uma sequência de cadeia leve que possui pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS:51-54. Um anticorpo anti-OX40 pode compreender uma sequência de cadeia leve que possui até 8, até 7, até 6, até 5, até 4, até 3 ou até 2 mutações comparada com a sequência de cadeia leve de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS:51-54. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 pode compreender uma sequência de cadeia leve que possui 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou
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36/96 menos ou 2 ou menos mutações comparada com a sequência de cadeia leve de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS:51-54.
[069]Modificações pós-tradução adicionais de um anticorpo anti-OX40 podem incluir glicosilação. Complexos biantenários comuns podem ser compostos de uma estrutura central que possui dois resíduos de N-acetilglucosamina (GlcNAc), três de manose e dois de GlcNAc que são β-1,2 ligados à a-6 manose e à a-3 manose para formar duas antenas. Um ou mais resíduos de fucose (Fuc), galactose (Gal), manose glicanas superiores Man-5 ou Man-9, GlcNAc bifurcado e ácido siálico incluindo ácido Nacetilneuramínico (NANA) ou ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) podem ser ligados no centro. Glicoformas N-ligadas podem incluir GO (proteína que possui uma estrutura de glicosilação biantenária central), GOF (fucosilada GO), GOF GlcNAc, G1 (proteína que possui uma estrutura de glicosilação central com um resíduo de galactose), G1F (G1 fucosilada), GG2 (proteína que possui uma estrutura de glicosilação central com dois resíduos de galactose) e/ou G2F (G2 fucosilada).
[070]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-QX40 competem pela ligação à 0X40 humana (SEQ ID N0:1) em ensaios in vitro com um anticorpo de referência. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-OX40 competem pela ligação à 0X40 humana sobre as células que expressam 0X40 humana. O anticorpo de referência pode ser qualquer um dos anticorpos anti-OX40 descritos aqui. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo que possui uma Vh de acordo com uma descrita na TABELA 4 e uma Vl de acordo com uma descrita na TABELA 5. Em modalidades específicas, o anticorpo de referência é anticorpo de camundongo que compreende Vh de Mu3726 e Vl de Mu3726 (“Mu3726”), anticorpo de camundongo que compreende Vh de Mu3738 e Vl de Mu3738 (“Mu3738”), anticorpo de camundongo que compreende Vh de Mu3739 e Vl de Mu3739 (“Mu3739”) ou anticorpo de camundongo que compreende
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Vh de Mu3741 e Vl de Mu3741 (“Mu3741”). Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é uma versão humanizada de Mu3726, Mu3738, Mu3739 ou Mu3741. Em certas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo humanizado que compreende uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO:41 ou 42 e uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO:51 (“Hu3738”), um anticorpo humanizado que compreende uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO:43 ou 44 e uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO:52 (“Hu3726”), um anticorpo humanizado que compreende uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO:45 ou 46 e uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO:53 (“Hu3739”) ou um anticorpo humanizado que compreende uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO:47 ou 48 e uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO:54 (“Hu3741”).
[071 ]Os anticorpos anti-OX40 descritos aqui geralmente se ligam especificamente à 0X40 humana. A reatividade cruzada dos anticorpos para ligação à 0X40 de outras espécies, por exemplo, de macaco, por exemplo, macaco cynomolgus, pode oferecer vantagens, tal como a capacidade de testar em modelos de animais de macacos em relação à atividade biológica. Tal teste em modelo de animal pode ser utilizado para separar anticorpos anti-OX40 para selecionar propriedades relacionadas à eficácia, por exemplo, farmacocinética favorável ou aquelas relacionadas à segurança, por exemplo, toxicidade hepática reduzida. Em algumas modalidades, um anticorpo anti0X40 se liga à 0X40 de cynomolgus (SEQ ID NO:2) (NCBI Reference Sequence XP005545179) bem como à 0X40 humana. Em algumas modalidades, um anticorpo anti0X40 não se liga à 0X40 de camundongo (SEQ ID NO:3) (NCBI Reference Sequence NP037181).
[072]Os ensaios para competição incluem, mas não estão limitados a, um ensaio imunológico marcado com material radioativo (RIA), um ensaio imunoabsorvente ligado
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38/96 à enzima (ELISA), um ELISA em sanduíche, ensaios de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) e ensaios de ressonância de plasmon de superfície.
[073]Os ensaios de ressonância de plasmon de superfície (SPR) permitem a medida direta da cinética de ligação entre duas proteínas, por exemplo, um receptor e um anticorpo, tal como receptor da 0X40 humana e um anticorpo anti-OX40, sem a necessidade de um sinal repórter ou marcação. Tanto a constante de dissociação em equilíbrio Kd, uma medida da afinidade de ligação, quanto seus dois componentes - as constantes da velocidade cinética de ligação, ka (M 1-s 1) (constante de associação, kon ou “taxa on”) e kd (s1) (constante de dissociação, kou ou “taxa off”) - podem ser determinados utilizando SPR. As constantes são relacionadas pela equação a seguir:
Kd = kd / ka.
[074]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-OX40 possuem uma Kd de pelo menos aproximadamente 100 nM, mas podem exibir afinidade mais alta, por exemplo, pelo menos aproximadamente 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM ou ainda maior. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 possui uma Kd na faixa de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM ou uma afinidade que varia entre qualquer um dos valores anteriores, tais como, mas não limitados a desde aproximadamente 0,001 a 10 nM, 0,001 a 5 nM, 0,01 a 100 nM, 0,01 a 50 nM, 0,01 a 10 nM, 0,01 a 5 nM ou aproximadamente 0,01 a 1 nM.
[075]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 possui uma constante de dissociação kd de não mais que aproximadamente 10s1, por exemplo, de não mais que aproximadamente 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 s-1 ou ainda menor. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 possui uma kd na faixa de aproximadamente 0,001 s-1 a aproximadamente 10 s-1 ou uma kd que varia entre qualquer
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39/96 um dos valores anteriores, tais como, mas não limitados a desde aproximadamente 0,01 a 10 s-1, 0,001 a 0,5 s1, 0,001 a 0,2 s1, 0,001 a 0,1 s1, 0,01 a 1 s1, 0,001 a 0,05 s1 ou aproximadamente 0,001 a 1 s-1.
[076]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 possui uma constante de associação kade pelo menos aproximadamente 104 h/H-s-1, por exemplo, pelo menos aproximadamente 1 χ 104, 5 χ 104, 1 χ 105, 5 χ 105, 1 χ 106, 5 χ 106, 1 χ 107 h/H-s-1 ou ainda maior. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 possui uma kd na faixa de aproximadamente 104 h/H-s1 a aproximadamente 107 h/H-s-1 ou uma kaque varia entre qualquer um dos valores anteriores, tais como, mas não limitados a desde aproximadamente 5 χ 104 a 1 χ 107 M’1-S’1, 5 χ 104 a 5 χ 106 h/H-s-1 ou aproximadamente 1 χ 104a5 χ 106 M-1-s-1.
[077]Um anticorpo anti-OX40 da divulgação pode exibir uma Kd, kd ou ka em uma faixa em torno de uma constante de cinética de ligação medida para qualquer um dos exemplos de anticorpos anti-OX40 descritos aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 possui uma constante de dissociação kd em uma faixa de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 vezes, por exemplo, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 vezes ou aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 vezes, a kd de qualquer um de Hu3738, Hu3726, Hu3739 e Hu3741. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 possui uma constante de associação ka em uma faixa de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 vezes, por exemplo, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 vezes ou aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 vezes, a ka de qualquer um de Hu3738, Hu3726, Hu3739 e Hu3741.
[078]Na condução de um ensaio de competição de anticorpo entre um anticorpo de referência e um anticorpo de teste (independentemente da espécie ou do isotipo), pode-se primeiramente marcar a referência com uma marcação detectável, tal como um
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40/96 fluoróforo, biotina ou uma marcação enzimática (ou até mesmo radioativa) para possibilitar a identificação subsequente. Neste caso, as células que expressam a 0X40 humana são incubadas com anticorpo de teste não marcado, o anticorpo de referência marcado é adicionado e a intensidade da marcação ligada é medida. Se o anticorpo de teste competir com o anticorpo de referência marcado através da ligação com o um epítopo sobreposto, a intensidade será reduzida em relação a uma reação de controle realizada sem o anticorpo de teste.
[079]Em uma modalidade específica deste ensaio, a concentração do anticorpo de referência marcado que fornece 80% da ligação máxima (“concso%”) sob as condições de ensaio (por exemplo, uma densidade especificada de células) é primeiramente determinada e um ensaio de competição é realizado com 10X concso% do anticorpo de teste não marcado e concso% do anticorpo de referência marcado.
[080]A inibição pode ser expressa na forma de uma constante de inibição ou Kj, que é calculada de acordo com a fórmula a seguir:
Ki = IC50/ (1 + [concentração do Ab de referência]/Kd), em que IC50 é a concentração de anticorpo de teste que causa uma redução de 50% na ligação do anticorpo de referência e Kd é a constante de dissociação do anticorpo de referência, uma medida de sua afinidade pela 0X40 humana. Os anticorpos que competem com os anticorpos anti-OX40 divulgados aqui podem ter uma K, de 10 pM a 100 nM sob as condições de ensaio descritas aqui.
[081 ]Em várias modalidades, é considerado que um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência se este reduzir a ligação do anticorpo de referência em pelo menos aproximadamente 20% ou mais, por exemplo, em pelo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou ainda mais ou em uma porcentagem que varia entre qualquer um dos valores anteriores, em uma
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41/96 concentração do anticorpo de referência que é 80% da ligação máxima sob as condições de ensaio específicas utilizadas e uma concentração do anticorpo de teste que é 10 vezes maior que a concentração do anticorpo de referência.
[082]Um ensaio e condições de ensaio específicos úteis para avaliar se um anticorpo compete pela ligação à 0X40 humana com um anticorpo de referência que é descrito aqui são fornecidos na Seção 8.1.4.
[083]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-OX40 da divulgação ativam a 0X40 humana (SEQ ID NO:1). A ativação do receptor de 0X40 pode ocorrer através de um número de mecanismos, por exemplo, através do fornecimento de atividade similar à do ligante contra receptor de 0X40. Nestes casos, um anticorpo anti-OX40 compete pela ligação ao receptor de 0X40 com o ligante 0X40 humana (OX40L, CD252; UniProtKB/Swiss-Prot Code P23510,1) (SEQ ID NO:4).
[084]Um anticorpo anti-OX40 da divulgação pode geralmente ativar o receptor de 0X40 na presença de ligação cruzada. Um ensaio e condições de ensaio específicos úteis para avaliar se um anticorpo anti-OX40 pode ativar o receptor de 0X40, por exemplo, o receptor da 0X40 humana (SEQ ID NO:1), na presença de ligação cruzada são fornecidos na Seção 8.1.8. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 ativa o receptor da 0X40 humana na presença de ligação cruzada com uma EC50 de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 nM, tal como, mas não limitada a desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 300 nM, desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 nM, desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 nM, desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 300 nM, desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM ou desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40
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42/96 a 100 pg/mL pode ativar o receptor da 0X40 humana na presença de ligação cruzada até uma atividade pelo menos aproximadamente 3 vezes, tal como desde aproximadamente 3 a aproximadamente 1000, por exemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 400, 500, 700, 800 ou aproximadamente 1000 vezes maior comparada com a atividade do receptor da 0X40 humana na ausência do anticorpo anti-OX40.
[085]Ligação cruzada pode ser fornecida através de um número de métodos, que incluem a adição de agente de ligação exógeno, por exemplo, por anticorpos ou fragmentos F(ab’)2 de anticorpos específicos para regiões pesadas, leves ou variáveis de anticorpos humanos ou humanizados; por proteína A solúvel ou imobilizada; por linhagens de células transfectadas com o receptor de Fc; por linhagens de células que expressam o receptor de Fc endógeno; por revestimento direto dos anticorpos de objetivo em superfícies plásticas; por superfícies plásticas revestidas com anticorpos de ligação cruzada ou receptores de Fc exógenos; ou por esferas conjugadas com qualquer um dos anteriores. Em um exemplo ilustrativo, os anticorpos de objetivo podem ser conjugados com uma proteína tal como biotina e avidina ou estreptavidina solúvel ou imobilizada é utilizada como um ligante cruzado. Em outro exemplo, nos nódulos linfáticos humanos in vivo, é esperado que a ativação de 0X40 após a ligação a um anticorpo anti-OX40 ocorra após a ligação cruzada do receptor fornecida pelas células apresentadoras de antígenos FcyR+ endógenas.
[086]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 se liga e ativa o receptor da 0X40 humana na ausência de ligação cruzada. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 ativa o receptor de 0X40, por exemplo, o receptor da 0X40 humana (SEQ ID NO:1), na ausência de OX40L, por exemplo, OX40L humana (SEQ ID NO:4). Um ensaio e condições de ensaio específicos úteis para avaliar se um anticorpo anti
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0X40 pode ativar o receptor de 0X40 sem ligação cruzada são fornecidos na Seção 8.1.8. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 ativa o receptor da 0X40 humana sem ligação cruzada com uma EC50 de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 nM, tal como, mas não limitada a desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 300 nM, desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 300 nM, desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 1 a aproximadamente 300 nM, desde aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 1 a aproximadamente 50 nM ou desde aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nM. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 a 100 pg/mL pode ativar 0 receptor da 0X40 humana sem ligação cruzada a uma atividade pelo menos aproximadamente 5 vezes, tal como desde aproximadamente 5 a aproximadamente 1000, por exemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80,100, 200, 300, 400, 500, 700, 800 ou aproximadamente 1000 vezes maior comparada com a atividade do receptor da 0X40 humana dosado com uma quantidade equivalente de anticorpo para isotipo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 a 10 pg/mL pode ativar 0 receptor da 0X40 humana sem ligação cruzada a uma atividade pelo menos aproximadamente 3 vezes, tal como desde aproximadamente 3 a aproximadamente 300, por exemplo, aproximadamente 3, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 ou aproximadamente 300 vezes maior comparada com a atividade do receptor da 0X40 humana dosado com uma quantidade equivalente de anticorpo para isotipo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 a 1 pg/mL pode ativar 0 receptor da 0X40 humana sem ligação cruzada a uma atividade pelo menos aproximadamente 3 vezes, tal como desde aproximadamente 3 a
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44/96 aproximadamente 150, por exemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100 ou aproximadamente 150 vezes maior comparada com a atividade do receptor da 0X40 humana dosado com uma quantidade equivalente de anticorpo para isotipo.
[087]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-OX40 ativa o receptor de 0X40, por exemplo, o receptor da 0X40 humana (SEQ ID NO:1), em um nível maior na presença de ligação cruzada comparado àquele sem ligação cruzada. Um ensaio e condições de ensaio específicos úteis para a determinação do nível no qual um anticorpo anti-QX40 pode ativar o receptor de 0X40 sem ligação cruzada são fornecidos na Seção 8.1.8. O nível de atividade pode ser medido, por exemplo, em termos de EC50 e/ou uma ativação máxima observada. Em algumas modalidades, 0 anticorpo anti-QX40 a 100 pg/mL ativa 0 receptor de 0X40, por exemplo, 0 receptor da 0X40 humana (SEQ ID NO:1), sem ligação cruzada a aproximadamente 20% a aproximadamente 95% de atividade de NF-κΒ, tal como aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou aproximadamente 90%, quando comparada à atividade de NF-κΒ com ligação cruzada em um ensaio de acordo com a Seção 8.1.8.
[088]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-QX40 ativa 0 receptor da 0X40 humana sem ligação cruzada com uma EC50 de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 500 nM, tal como, mas não limitada a desde aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 1 a aproximadamente 300 nM, desde aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 1 a aproximadamente 50 nM ou desde aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nM, em um ensaio de acordo com a Seção 8.1.8. Em algumas destas modalidades, um anticorpo anti-QX40 a 10 pg/mL pode ativar 0 receptor da 0X40 humana sem ligação cruzada a uma atividade pelo menos
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45/96 aproximadamente 3 vezes, tal como desde aproximadamente 3 a aproximadamente 300, por exemplo, aproximadamente 3, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 ou aproximadamente 300 vezes maior comparada com a atividade do receptor da 0X40 humana dosado com uma quantidade equivalente de anticorpo para isotipo. Em algumas destas modalidades, um anticorpo anti-OX40 ativa o receptor da 0X40 humana na presença de ligação cruzada com uma EC50 de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 300 nM, tal como, mas não limitada a desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 300 nM, desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 nM, desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 nM, desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 300 nM, desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM ou desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, em um ensaio de acordo com a Seção 8.1.8. Em algumas destas modalidades, um anticorpo anti-OX40 pode ativar 0 receptor da 0X40 humana na presença de ligação cruzada a uma EC50 menor, tal como desde aproximadamente 1,5 a aproximadamente 100 vezes, tal como desde aproximadamente 1,5 a aproximadamente 10 vezes, por exemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou aproximadamente 10 vezes menor, comparada com a EC50 do anticorpo 1A7 descrito na Publicação US no. 2015/0307617 em um ensaio de acordo com a Seção 8.1.8.
[089]Um anticorpo anti-OX40 da invenção pode ativar 0 receptor da 0X40 humana sem ligação cruzada com uma EC50 de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM em um ensaio de acordo com a Seção 8.1.8 e pode ativar 0 receptor da 0X40 humana na presença de ligação cruzada a uma EC50 menor, tal como desde aproximadamente 1,5 a aproximadamente 10 vezes menor, comparada com a EC50 do anticorpo 1A7 descrito na Publicação US no. 2015/0307617 em um ensaio de
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46/96 acordo com a Seção 8.1.8. Os exemplos de anticorpos anti-OX40 que possuem as propriedades citadas acima incluem Mu3738 e Hu3738 que são descritos nos Exemplos 2 a 8 aqui.
[090]Geralmente, a ativação de 0X40 após o tratamento com um anticorpo anti0X40 resulta em uma transdução de sinal, tal como um aumento na produção de citocinas (por exemplo, interferon-gama (IFN-γ)) e/ou um aumento na proliferação celular, por exemplo, proliferação de células T CD4+. Em algumas modalidades, o aumento na produção de IFN-γ após o tratamento com 1 pg/mL de um anticorpo anti-OX40 é desde aproximadamente 1,5 a aproximadamente 50 vezes, tal como aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ou aproximadamente 50 vezes o nível de produção de IFN-γ após o tratamento com uma quantidade equivalente de um anticorpo para isotipo. Em algumas modalidades, o aumento na proliferação de células T CD4+ após o tratamento com 1 pg/mL de um anticorpo anti-OX40 é desde aproximadamente 1,5 a aproximadamente 20 vezes, tal como aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 ou aproximadamente 20 vezes o nível de proliferação de células T CD4+ após o tratamento com uma quantidade equivalente de um anticorpo para isotipo. Os ensaios para determinação dos níveis de citocinas ou para determinação da proliferação celular níveis são conhecidos na técnica. Um ensaio e condições de ensaio específicos para determinação de produção de IFN-γ e/ou proliferação de células T CD4+ são fornecidos aqui na Seção 8.1.12.
7.4. Polinucleotídeos que Codificam os Anticorpos Anti-OX40, Sistemas de Expressão e Métodos de Produção dos Mesmos [091 ]A presente divulgação abrange moléculas de ácidos nucleicos que codificam genes de cadeias leve e pesada de imunoglobulina para anticorpos anti-OX40,
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47/96 vetores que compreendem tais ácidos nucleicos e células hospedeiras capazes de produzir os anticorpos anti-OX40 da divulgação.
[092]Um anticorpo anti-OX40 da divulgação pode ser preparado através da expressão recombinante de genes de cadeias leve e pesada de imunoglobulina em uma célula hospedeira. Para expressar um anticorpo de forma recombinante, uma célula hospedeira é transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinante que carregam fragmentos de DNA que codifica as cadeias leve e pesada de imunoglobulina do anticorpo de forma que as cadeias leve e pesada sejam expressas na célula hospedeira e, opcionalmente, secretadas no meio no qual as células hospedeiras são cultivadas, de cujo meio os anticorpos podem ser recuperados. Metodologias do DNA recombinante padronizadas são utilizadas para a obtenção de genes das cadeias pesada e leve do anticorpo, para incorporar estes genes nos vetores de expressão recombinante e introduzir os vetores nas células hospedeiras, tais como aquelas descritas em Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch e Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. etal., eds., Greene Publishing Associates, 1989) e na Patente U.S. No. 4.816.397.
[093]Para gerar ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos anti-OX40, são primeiramente obtidos os fragmentos de DNA que codifica as regiões variáveis de cadeias leve e pesada. Estes DNAs podem ser obtidos através da amplificação e da modificação do DNA de linhagem germinativa ou do cDNA que codifica sequências variáveis das cadeias leve e pesada, por exemplo, utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR). As sequências de DNA de linhagem germinativa para os genes da região variável das cadeias pesada e leve humanos são conhecidas na técnica (Ver, por exemplo, o banco de dados de sequências de linhagem germinativa humana “VBASE”; ver também Kabat, E. A. et a!., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,
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Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; e Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836).
[094]Uma vez que os fragmentos de DNA que codifica os segmentos de Vh e Vl relacionados ao anticorpo anti-OX40 são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser adicionalmente manipulados através de técnicas do DNA recombinante padronizadas, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeias do anticorpo de comprimento completo, em genes do fragmento Fab ou em um gene de scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA que codifica Vl ou Vh é ligado de forma operacional a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante do anticorpo ou um ligante flexível. É pretendido que o termo “ligado de forma operacional”, como é utilizado neste contexto, significa que os dois fragmentos de DNA são ligados de forma que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem em in-frame.
[095]O DNA isolado que codifica a região Vh pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento completo através da ligação de forma operacional do DNA que codifica Vh com outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2, CH3 e, opcionalmente, CH4). As sequências dos genes da região constante de cadeia pesada humanos são conhecidas na técnica (Ver, por exemplo, Kabat, E.A., etal., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e os fragmentos de DNA que abrangem estas podem ser obtidos através da amplificação por PCR padronizada. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGi, lgG2, IgGs, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas em certas modalidades é uma IgGi ou uma lgG4. Para um gene de cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA que
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49/96 codifica Vh pode ser ligado de forma operacional a outra molécula de DNA que codifica somente a região constante CH1 de cadeia pesada.
[096]O DNA isolado que codifica a região Vl pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento completo (bem como um gene de cadeia leve de Fab) através da ligação de forma operacional do DNA que codifica Vl a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências dos genes da região constante de cadeia leve humanos são conhecidas na técnica (Ver, por exemplo, Kabat, et a!., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e os fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padronizada. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda, mas em certas modalidades é uma região constante kappa. Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA que codifica Vh e Vl são ligados de forma operacional a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4~Ser)3 (SEQ ID NQ:60), de forma que as sequências de Vh e Vl possam ser expressas na forma de uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões Vl e Vh ligadas pelo ligante flexível (Ver, por exemplo, Bird et a!., 1988, Science 242:423-426; Huston et a!., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty etal., 1990, Nature 348:552-554).
[097]Para expressar os anticorpos anti-QX40 da divulgação, os DNAs que codificam cadeias leve e pesada parciais ou de comprimento completo, obtidos como descrito acima, são inseridos nos vetores de expressão de forma que os genes sejam ligados de forma operacional às sequências de controle da transcrição e da tradução. Neste contexto, é pretendido que o termo “ligado de forma operacional” signifique que um gene de anticorpo está ligado dentro de um vetor de forma que as sequências de
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50/96 controle da transcrição e da tradução dentro do vetor exerça sua função pretendida de regulação da transcrição e da tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controle da expressão são escolhidas para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão.
[098]Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodos padronizados (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento do gene de anticorpo e no vetor ou ligação de pontas cegas são não houver a presença de sítios de restrição. Antes da inserção das sequências de cadeia leve ou pesada relacionada ao anticorpo anti-OX40, o vetor de expressão já pode carregar as sequências da região constante do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem para converter as sequências de Vh e Vl relacionadas ao anticorpo anti-OX40 monoclonal nos genes de anticorpo de comprimento completo é inseri-las nos vetores de expressão que já codificam as regiões constante de cadeia pesada e constante de cadeia leve, respectivamente, de forma que o segmento de Vh seja ligado de forma operacional ao(s) segmento(s) de CH dentro do vetor e que o segmento de Vl seja ligado de forma operacional ao segmento de CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de forma que o peptídeo sinal seja ligado in-frame ao terminal amino do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína que não é imunoglobulina).
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51/96 [099]Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinante da divulgação carregam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. É pretendido que o termo “sequência reguladora” inclua promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou a tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, GA, 1990. Será considerado pelos peritos na técnica que o projeto do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira que será transformada, o nível de expressão de proteína desejado etc. As sequências reguladoras adequadas para expressão em células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/intensificador de CMV), Simian Virus 40 (SV40) (tal como o promotor/intensificador de SV40), adenovirus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP)) e polioma. Para descrição adicional de elementos reguladores virais e suas sequências, ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.168.062 por Stinski, Patente U.S. No. 4.510.245 por Bell et al. e Patente U.S. No. 4.968.615 por Schaffner et al.
[0100]Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e às sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinante da divulgação podem carregar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor nas células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção das células hospedeiras nas quais o vetor
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52/96 foi introduzido (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel etal.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis adequados incluem o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras DHFR- com de seleção/amplificação com metotrexato) e o gene neo (para seleção com G418). Para a expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesada e leve é(são) transfectado(s) em uma célula hospedeira através de técnicas padronizadas. É pretendido que as várias formas do termo “transfecção” abranjam uma ampla variedade de técnicas comumente utilizadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, lipofecção, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextran e similares.
[0101 ]É possível expressar is anticorpos anti-OX40 da divulgação em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. Em certas modalidades, a expressão de anticorpos é realizada em células eucarióticas, por exemplo, células hospedeiras de mamíferos, de secreção ótima de um anticorpo dobrado apropriadamente e imunologicamente ativo. Os exemplos de células hospedeiras de mamíferos para expressão dos anticorpos recombinantes da divulgação incluem de Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células CHO DHFR-, descritas em Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, utilizadas com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, como descrito em Kaufman e Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 -621), células de mieloma NOS, células COS e células SP2. Quando os vetores de expressão recombinante que codificam genes do anticorpo são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos através da cultura das células hospedeiras
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53/96 durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou a secreção do anticorpo dentro do meio de cultura no qual as células hospedeiras são crescidas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura utilizando métodos de purificação de proteína padronizados. As células hospedeiras também podem ser utilizadas para produzir fragmentos de anticorpos de ligação anti-OX40, tais como fragmentos Fab ou moléculas de scFv. É entendido que variações no procedimento acima estão dentro do âmbito da presente divulgação. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com o DNA que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada (mas não as duas) de um anticorpo anti-OX40 desta divulgação.
[0102]A tecnologia do DNA recombinante também pode ser utilizada para remover parte ou todo o DNA que codifica qualquer uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não é necessário para a ligação à 0X40 humana. As moléculas expressas partindo destas moléculas de DNA truncadas também são abrangidas pelos anticorpos da divulgação.
[0103]Para a expressão recombinante de um anticorpo anti-OX40 da divulgação, a célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois vetores de expressão da divulgação, o primeiro vetor codificando um polipeptideo derivado da cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptideo derivado da cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos ou cada um pode conter um marcador selecionável separado. Alternativamente, pode ser utilizado um único vetor que codifica os polipeptídeos tanto de cadeia pesada quanto leve.
[0104]Uma vez que foi obtido um ácido nucleico que codifica uma ou mais porções de um anticorpo anti-OX40, alterações ou mutações adicionais podem ser introduzidas na sequência codificadora, por exemplo, para gerar ácidos nucleicos que
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54/96 codificam anticorpos com sequências CDR diferente, anticorpos com afinidade reduzida pelo receptor de Fc ou anticorpos de subclasses diferentes.
[0105]Os anticorpos anti-OX40 da divulgação também podem ser produzidos através de síntese química (por exemplo, através dos métodos descritos em Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, III.). Anticorpos variantes também podem ser gerados utilizando uma plataforma livre de células (Ver, por exemplo, Chu etal., Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals) e Murray etal., 2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17:420-426).
[0106]Uma vez que um anticorpo anti-OX40 da divulgação foi produzido através da expressão recombinante, este pode ser purificado através de qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica, afinidade e coluna de separação por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial ou através de qualquer outra técnica padronizada para a purificação de proteínas. Ainda, os anticorpos anti0X40 da presente divulgação podem ser fundidos a sequências polipeptídicas heterólogas descritas aqui ou de outra maneira conhecidas na técnica por facilitarem a purificação.
[0107]Uma vez isolado, o anticorpo anti-OX40 pode, se desejado, ser adicionalmente purificado, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho (Ver, por exemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980) ou por cromatografia de filtração em gel em uma coluna Superdex™ 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suécia).
7.5. Composições Farmacêuticas [0108]Os anticorpos anti-OX40 descritos aqui pode estar na forma de composições que compreendem o anticorpo e um ou mais carreadores, excipientes e/ou
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55/96 diluentes (dos quais todos são referidos aqui como “carreadores”), isto é, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes não iônicos, antioxidantes e outros aditivos mistos. Ver, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). As composições podem ser formuladas para usos específicos, tal como para usos veterinários ou usos farmacêuticos em humanos. A forma da composição (por exemplo, pó seco, formulação líquida etc.) e os carreadores utilizados dependerão dos usos pretendidos do anticorpo e, para usos terapêuticos, do modo de administração.
[0109]Para usos terapêuticos, as composições podem ser fornecidas como parte de uma composição farmacêutica estéril que inclui um carreador farmaceuticamente aceitável. Esta composição pode estar em qualquer forma adequada (dependendo do método de administração desejado a um paciente). A composição farmacêutica pode ser administrada a um paciente através de uma variedade de rotas tal como intravenosa, intratumoral ou intratecal. A rota mais adequada para administração em qualquer caso fornecido dependerá do anticorpo particular, do indivíduo e da natureza e da gravidade da doença e da condição física do indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica será administrada de forma intravenosa.
[0110]As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dosagem unitária que contêm uma quantidade predeterminada de um anticorpo anti-OX40 descrito aqui por dose. A quantidade de anticorpo anti-OX40 incluída em uma dose unitária dependerá da doença que será tratada, bem como de outros fatores que são bem conhecidos na técnica. Tais dosagens unitárias podem estar na forma de um pó seco liofilizado que contém uma quantidade de anticorpo adequada para uma única administração ou na forma de um líquido. As formas de dosagem unitária em pó seco podem ser embaladas em um kit com uma seringa, uma
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56/96 quantidade adequada de carreador e/ou outros componentes úteis para administração. As dosagens unitárias na forma líquida podem ser fornecidas de forma conveniente na forma de uma seringa preenchida previamente com uma quantidade do anticorpo anti0X40 adequada para uma única administração.
[0111]As composições farmacêuticas também podem ser fornecidas na forma a granel contendo quantidades de anticorpo anti-OX40 adequadas para várias administrações.
[0112]As composições farmacêuticas podem ser preparadas para armazenamento na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas através da mistura de um anticorpo que possui o grau de pureza desejado com carreadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais tipicamente empregados na técnica. Tais aditivos devem ser atóxicos para os receptores nas dosagens e nas concentrações empregadas.
[0113]Por exemplo, para administração intravenosa, a composição pode estar na forma de um pó liofilizado que, após a reconstituição com água estéril ou outra solução adequada para injeção ou infusão (por exemplo, solução salina a 0,9%, solução de Ringer, solução de Ringer com lactato etc.) fornece uma composição aquosa.
7.6. Métodos de Uso
7.6.1. Benefício terapêutico [0114]Os dados fornecidos aqui demonstram que os anticorpos anti-OX40 divulgados ativam o receptor de 0X40 na presença de células cancerosas e exercem atividade anticâncer potente contra câncer in vivo. Consequentemente, os anticorpos anti-OX40 e/ou as composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos anti0X40 podem ser utilizadas terapeuticamente para tratar cânceres.
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57/96 [0115]Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido. Os tumores sólidos que podem ser tratados com o anticorpo anti-OX40 incluem câncer de bexiga, câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo negativo), câncer de cabeça e pescoço, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais), câncer de fígado (por exemplo, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma), câncer de pulmão (por exemplo, câncer pulmonar de células não pequenas, mesotelioma, câncer pulmonar de células pequenas), melanoma (por exemplo, melanoma não operável ou metastásico, melanoma maligno avançado), câncer de pele (por exemplo, carcinoma de célula de Merkel), câncer de ovário, câncer gástrico e tumores com evidência de deficiência no reparo de pareamentos errados do DNA. O câncer pode ser compreendido de tumores que contêm células que expressam 0X40; compreendido de tumores, dos quais alguns contêm células que expressam 0X40 e dos quais alguns não o fazem; ou compreendido de tumores que não possuem células que expressam 0X40. O câncer pode ser recém-diagnosticado e naive em relação ao tratamento ou pode ser reincidente, refratário ou reincidente e refratário ou uma forma metastásica de um tumor sólido. Em algumas modalidades, o tumor sólido é naive em relação a um agente que se direciona a PD-1 ou PD-L1. Em outras modalidades, o tumor sólido é reincidente ou refratário após o tratamento com um agente que se direciona a PD-1 ou PD-L1. Em algumas modalidades, o tumor sólido é selecionado de câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer renal, câncer de pulmão, melanoma e câncer gástrico. Em algumas modalidades, o tumor sólido é selecionado de: melanoma (por exemplo, melanoma não operável ou metastásico), câncer de pulmão (por exemplo, câncer pulmonar de células não pequenas) e carcinoma de células renais (por exemplo, carcinoma de células renais avançado). Em algumas modalidades, o tumor sólido é selecionado de câncer de mama triplo negativo, câncer de ovário, carcinoma hepatocelular, câncer gástrico, câncer
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58/96 pulmonar de células pequenas, mesotelioma, colangiocarcinoma, carcinoma de célula de Merkel e tumores com evidência de deficiência no reparo de pareamentos errados do DNA. Em certas modalidades, o câncer de pulmão é câncer pulmonar de células não pequenas metastásico com progressão durante ou após quimioterapia à base de platina. Em certas modalidades, o câncer de pulmão é câncer pulmonar de células não pequenas avançado localmente ou metastásico que que não foi bem-sucedido com a terapia à base de platina e a terapia com um agente que se direciona a PD-1 ou PD-L1. Em certas modalidades, o câncer de cabeça e pescoço é carcinoma de cabeça e pescoço de célula escamosa recorrente que não é um candidato para tratamento curativo com terapia local ou sistêmica ou carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço metastásico (disseminado) da cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e laringe que é considerado incurável por terapias locais.
[0116]Como discutido acima, os anticorpos anti-OX40 divulgados aqui modulam uma resposta imunológica. Consequentemente, pacientes que possuem os sistemas imunológicos compreendidos podem ser excluídos do tratamento. Em algumas modalidades, um paciente é excluído após satisfazer um ou mais dos critérios a seguir: (1) Doença autoimune ativa ou documentada anteriormente (incluindo, mas não limitada a, doença inflamatória intestinal, doença celíaca, síndrome de Wegener) dentro dos últimos 2 anos. (Indivíduos com atopia ou asma na infância, vitiligo, alopecia, síndrome de Hashimoto, doença de Grave ou psoríase que não requer tratamento sistêmico (dentro dos últimos 2 anos) não são excluídos); (2) Histórico de imunodeficiência primária, transplante de medula óssea, leucemia linfocítica crônica, transplante de órgão sólido ou diagnóstico clínico prévio de tuberculose; (3) Histórico de uma coagulopatia ou um distúrbio de plaquetas; (4) Resultados de teste positivo confirmado para vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou indivíduos com hepatite B ou C crônica ou ativa.
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59/96 (Podem ser incluídos indivíduos que possuem um histórico de hepatite B ou C que têm curas documentadas após terapia antiviral); (5) Grau prévio > 3 de neurotoxicidade mediada pelo sistema imunológico ou pneumonite durante o recebimento de imunoterapia (incluindo, mas não limitada a agentes direcionados contra CTLA-4, PD-L1 ou PD-1). Em adição, qualquer outro grau prévio > 3 de evento mediado pelo sistema imunológico durante o recebimento de imunoterapia que não foi solucionado ou se tornou assintomático dentro de 3 meses; (6) Recebimento de vacina atenuada viva dentro de 28 dias antes da primeira dose do anticorpo anti-OX40.
[0117]Um anticorpo anti-OX40 da divulgação pode ser administrado individualmente (monoterapia) ou de forma adjunta a ou com outras terapias anticâncer e/ou agentes anticâncer direcionados ou não direcionados. Quando administrado na forma de uma monoterapia anti-OX40, um ou mais anticorpos podem ser utilizados. Quando administrado na forma de monoterapia ou de forma adjunta a ou com outras terapias ou agentes, é administrada uma quantidade de anticorpo anti-OX40 de forma que o regime de tratamento total forneça benefício terapêutico.
[0118]Por benefício terapêutico entende-se que o uso de anticorpos anti-OX40 para tratar câncer em um paciente resulta em qualquer benefício clínico demonstrado comparado a não terapia (quando apropriado) ou a um padrão de cuidado conhecido. O benefício clínico pode ser avaliado através de qualquer método conhecido por um perito comum na técnica. Em uma modalidade, o benefício clínico é avaliado com base na taxa de resposta objetiva (ORR) (determinada utilizando RECIST versão 1.1), na duração da resposta (DOR), na sobrevida livre de progressão (PFS) e/ou na sobrevida global (OS). Em algumas modalidades, uma resposta completa indica benefício terapêutico. Em algumas modalidades, uma resposta parcial indica benefício terapêutico. Em algumas modalidades, doença estável indica benefício terapêutico. Em algumas modalidades, um
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60/96 aumento na sobrevida global indica benefício terapêutico. Em algumas modalidades, benefício terapêutico constitui um aprimoramento no tempo até a progressão da doença e/ou uma melhora nos sintomas ou na qualidade de vida. Em outras modalidades, benefício terapêutico não se traduz em um período maior de controle da doença, mas ao invés disso em uma carga de sintomas notavelmente reduzida resultando em melhor qualidade de vida. Como será evidente para os peritos na técnica, um benefício terapêutico pode ser observado utilizando os anticorpos anti-OX40 individualmente (monoterapia) ou de forma adjunta a ou com outras terapias anticâncer e/ou agentes anticâncer direcionados ou não direcionados.
[0119]Tipicamente, o benefício terapêutico é avaliado utilizando testes clínicos padronizados planejados para medir a resposta a um novo tratamento para câncer. Para avaliar os benefícios terapêuticos dos anticorpos anti-OX40 descritos aqui, um ou uma combinação dos testes a seguir pode ser utilizada: (1) os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST) versão 1.1, (2) RECIST com relação imunológica (irRECIST), (3) o Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) Performance Status, (4) critérios de resposta com relação imunológica (irRC), (5) doença que pode ser avaliada pela análise de antígenos de tumor, (6) escalas de resultados relatados pelo paciente validadas e/ou (7) estimativas de Kaplan-Meier para sobrevida global e sobrevida livre de progressão.
[0120]A avaliação na alteração da carga tumoral é uma característica importante da avaliação clínica de agentes terapêuticos para câncer. Tanto o encolhimento do tumor (resposta objetiva) quanto tempo até o desenvolvimento de progressão de doença são pontos finais importantes nos testes clínicos de câncer. Os critérios de resposta padronizados, conhecidos como RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos), foram publicados em 2000. Uma atualização (RECIST 1.1) foi liberada
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61/96 em 2009. Os critérios RECIST são tipicamente utilizados em testes clínicos nos quais a resposta objetiva é o ponto final primário do estudo, bem como em testes nos quais a avaliação das análises de doença estável, progressão de tumor ou tempo até a progressão é realizada porque estas medidas dos resultados se baseiam em uma avaliação do fardo tumoral anatômico e sua alteração ao longo do curso do teste. A TABELA 8 fornece as definições dos critérios de resposta utilizados para determinar a resposta de tumor objetiva a um fármaco do estudo, tal como os anticorpos anti-OX40 descritos aqui.__________________________________________________________________________
TABELA 8
Resposta Critérios
Resposta Completa (CR) Desaparecimento de todas as lesões alvos. Quaisquer nódulos linfáticos patológicos (alvos ou não alvos) têm que ter redução no eixo curto até <10 mm.
Resposta Parcial (PR) Pelo menos uma redução de 30% na soma dos diâmetros de lesões alvos, considerando como referência os diâmetros da soma na linha de base.
Doença Progressiva (PD) Pelo menos um aumento de 20% na soma dos diâmetros de lesões alvos, considerando como referência a menor soma no estudo (esta inclui a soma na linha de base se esta for a menor no estudo). Em adição ao aumento relativo de 20%, a soma também tem que demonstrar um aumento absoluto de pelo menos 5 mm. (Observação: o aparecimento de uma ou mais lesões novas também é considerado progressão).
Doença Estável (SD) Nenhum encolhimento suficiente para qualificar RP nem aumento suficiente para qualificar DP, considerando como referência a menor soma dos diâmetros durante o estudo.
[0121]As medidas de resultados secundários que podem ser utilizadas para determinar o benefício terapêutico dos anticorpos anti-OX40 descritos aqui incluem, Taxa
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62/96 de Resposta Objetiva (ORR), Sobrevida Livre de Progressão (PFS), Sobrevida Global (OS), Duração de Resposta Total (DOR) e Profundidade da Resposta (DpR). A ORR é definida como a proporção dos participantes que atingiu uma resposta completa (CR) ou uma resposta parcial (PR). PFS é definida como o tempo a partir da data da primeira dose de um anticorpo anti-OX40 até a progressão de doença ou morte, o que ocorrer primeiro. OS é definida como o período de tempo desde a data de diagnóstico ou o início de tratamento para uma doença, durante o qual os pacientes diagnosticados com a doença ainda estarão vivos. DOR é definida como o tempo partindo da RC ou da RP inicial do participante até o tempo de progressão de doença. DpR é definida como a porcentagem de encolhimento do tumor observada no ponto de resposta máxima comparada com a carga tumoral na linha de base. Os pontos finais clínicos para ORR e PFS podem ser determinados com base nos critérios RECIST 1.1 descritos anteriormente.
[0122]Os critérios adicionais que podem ser utilizados para avaliação clínica específica para pacientes com câncer que estão passando por tratamento com terapia imunológica incluem os critérios RECIST com relação imunológica (irRECIST) padronizados. Ver, por exemplo, Nishino, M. et al. Eur. J. Radiol., 84(7), pages 12591268 (2015 July). Estas normas de procedimento modificaram os critérios RECIST 1.1 acima considerando os efeitos imunomoduladores potenciais. A TABELA 9 fornece as definições dos critérios de resposta utilizados para determinar a resposta de tumor objetiva a um fármaco imunomodulador, tal como os anticorpos anti-QX40 descritos aqui.
TABELA 9
Resposta Critérios
Resposta Completa (irCR) Desaparecimento completo de todas as lesões mensuráveis e não mensuráveis. Os nódulos linfáticos têm que diminuir até < 10 mm no eixo curto.
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TABELA 9
Resposta Critérios
Resposta Parcial (irPR) Redução > 30% na carga tumoral medida total em relação à linha de base, lesões não alvos são irNN e nenhuma progressão não equivocada de novas lesões não mensuráveis
Doença Progressiva (irPD) Pelo menos um aumento de 20% e pelo menos um aumento absoluto de 5 mm em TMTB comparado com nadir ou irPD para lesões não alvos ou novas não mensuráveis. A confirmação de progressão é recomendada pelo menos 4 semanas após a primeira avaliação de irPD.
Não irCR ou não irPD (irNN) Nenhuma doença alvo foi identificada na linha de base e no acompanhamento o paciente não foi bem-sucedido em satisfazer os critérios para irCR ou irPD
Doença Estável (irSD) Nenhum encolhimento suficiente para qualificar irPR nem aumento suficiente para qualificar irPD, considerando como referência a menor soma dos diâmetros durante o estudo.
irNE Utilizado em casos excepcionais em que há dados insuficientes.
[0123]A Escala de Status de Desempenho do ECOG mostrada na TABELA 10 é utilizada para descrever o nível de funcionamento de um paciente em termos de sua capacidade de se cuidar, atividade diária e aptidão física. A escala foi desenvolvida pelo Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG), agora parte do ECOG-ACRIN Cancer Research Group e publicada em 1982.__________________________________________
TABELA 10
Grau Status de Desempenho do ECOG
0 Totalmente ativo, capaz de continuar com todo o desempenho prédoença sem restrição
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TABELA 10
Grau Status de Desempenho do ECOG
1 Limitado em atividade fisicamente pesada, mas de ambulatório e capaz de realizar trabalho de natureza leve ou sedentária, por exemplo, trabalho doméstico leve, trabalho em escritório
2 Ambulatório e capaz de se cuidar, mas incapaz de realizar quaisquer atividades de trabalho; até e aproximadamente mais de 50% das horas acordado
3 Capaz de se cuidar apenas de forma limitada; confinado à cama ou à cadeira mais de 50% das horas acordado
4 Completamente incapacitado; não pode se cuidar de forma alguma; totalmente confinado à cama ou à cadeira
5 Morto
[0124]Outro conjunto de critérios que pode ser utilizado para caracterizar completamente e para determinar a resposta a agentes imunoterapêuticos, tais como terapias para câncer baseadas em anticorpo, é os critérios de resposta com relação imunológica (irRC), que foi desenvolvido para a medida de tumores sólidos em 2009 e foi atualizado em 2013 (Wolchok, et al. Clin. Cancer Res. 2009; 15(23): 7412-7420 e Nishino, et al. Clin. Cancer Res. 2013; 19(14): 3936-3943). Os critérios irRC atualizados são tipicamente utilizados para avaliar o efeito de um agente imunoterapêutico, tal como um anticorpo anti-OX40 descrito aqui, sobre a carga tumoral e define a resposta de acordo com a TABELA 11.
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TABELA 11
Resposta Critérios
Resposta Completa (CR) Desaparecimento de todas as lesões alvos em duas observações consecutivas espaçadas não menos que 4 semanas
Resposta Parcial (PR) Pelo menos uma redução de 30% na soma dos diâmetros mais longos de lesões alvos, considerando como referência os diâmetros da soma na linha de base.
Doença Progressiva (PD) Pelo menos um aumento de 20% na soma dos diâmetros de lesões alvos, considerando como referência a menor soma no estudo (esta inclui a soma na linha de base se esta for a menor no estudo). (Observação: o aparecimento de uma ou mais lesões novas não é considerado progressão. A medida de novas lesões é incluída na soma das medidas).
Doença Estável (SD) Nenhum encolhimento suficiente para qualificar PR nem aumento suficiente para qualificar PD, considerando como referência a menor soma dos diâmetros durante o estudo.
[0125]Um exemplo de benefício terapêutico que resulta do uso de anticorpos anti0X40 descritos aqui para tratar tumores sólidos, quando administrados na forma de monoterapia ou de forma adjunta a ou com outras terapias ou agentes, é uma resposta completa. Outro exemplo de benefício terapêutico que resulta do o uso de anticorpos anti-OX40 para tratar tumores sólidos, quando administrados na forma de monoterapia ou de forma adjunta a ou com outras terapias ou agentes, é uma resposta parcial.
[0126]As escalas de resultados relatados pelo paciente validadas também podem ser utilizadas para indicar a resposta fornecida por cada paciente através um sistema de relatório específico. Ao invés de ficar concentradas na doença, tais escaladas de resultados se referem à função mantida enquanto uma condição crônica é controlada. Um exemplo não limitante de uma escala de resultados relatados pelos pacientes
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66/96 validade é PROMIS® (Patient Reported Outcomes Measurement Information System) dos United States National Institutes of Health. Por exemplo, PROMIS® Physical Function Instrument para pacientes adultos com câncer pode avaliar capacidades relatadas por eles para o funcionamento de extremidades superiores (por exemplo, destreza), extremidades inferiores (por exemplo, caminhar ou mobilidade) e regiões centrais (por exemplo, mobilidade do pescoço, costas) e inclui atividades diárias rotineiras, tal como a realização de tarefas.
[0127]Curvas de Kaplan-Meier (Kaplan e Meier, J. Am. Stat. Assoe. 1958; 53(282): 457-481) também podem ser utilizadas para estimar a sobrevida global e a sobrevida livre de progressão para pacientes com câncer submetidos à terapia com anticorpo anti-OX40 em comparação com o padrão de cuidado.
7.6.2. Terapias Adjuntas [0128]Os anticorpos anti-OX40 podem ser utilizados de forma adjunta a ou com outros agentes ou tratamentos que possuem propriedades anticâncer, incluindo terapias de padrão de cuidado, tal como terapia com um anticorpo anti-PD-1. Quando utilizado de forma adjunta, o anticorpo anti-QX40 e outro(s) agente(s) podem ser formulados juntos em uma única formulação farmacêutica de combinação ou podem ser formulados e administrados separadamente, em um único regime de dosagem coordenado ou em regimes de dosagem diferentes. Os agentes administrados de forma adjunta a ou com os anticorpos anti-QX40 terão tipicamente atividades complementares a dos anticorpos anti-QX40 de forma que os anticorpos e os outros agentes não afetem cada um adversamente.
7.7. Dosagens e Regimes de Administração [0129]A quantidade de anticorpos anti-QX40 administrada dependerá de uma variedade de fatores, incluindo, mas não limitados a, o tipo particular de câncer tratado,
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67/96 o estágio do câncer que será tratado, o modo de administração, a frequência de administração, o benefício terapêutico desejado e outros parâmetros tais como a idade, o peso e outras características do paciente etc. A determinação de dosagens eficazes para fornecer benefício terapêutico para modos e frequência de administração específicos está dentro das capacidades dos peritos na técnica.
[0130]As dosagens eficazes para fornecer benefício terapêutico podem ser estimadas inicialmente partindo de modelos de animais in vivo. Os modelos de animais adequados para uma ampla variedade de doenças são conhecidos na técnica.
[0131 ]Os anticorpos anti-OX40 divulgados aqui podem ser administrados através de qualquer rota apropriada para a condição que será tratada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 é qualquer um dos anticorpos humanizados com uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS:41-48 e uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS:51-54. Em certas modalidades, o anticorpo anti-QX40 possui uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:41 ou 42 e uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:51. Um anticorpo anti-QX40 será tipicamente administrado de forma parenteral, isto é, infusão, injeção intravenosa (IV), intratecal, em bolus, intratumoral ou epidural (Shire et al., 2004, J. Pharm. Sciences 93(6):1390-1402). Em uma modalidade, um anticorpo anti-QX40 é fornecido na forma de um pó liofilizado em um frasco. Antes da administração, o pó liofilizado é reconstituído com água estéril para injeção (SWFI) ou outro meio adequado para fornecer uma solução que contém anticorpo anti-QX40. Em algumas modalidades, a solução reconstituída resultante é adicionalmente diluída com solução salina ou outro meio adequado para infusão e
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68/96 administrada através de uma infusão IV uma vez a cada duas semanas, isto é, a cada 13, 14 ou 15 dias.
[0132]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 é administrado na forma de uma infusão IV uma vez a cada duas semanas a 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg ou 3,0 mg/kg.
[0133]Quando administrados de forma adjunta com outros agentes, tais como outros agentes quimioterapêuticos, os anticorpos anti-OX40 podem ser administrados na mesma programação que o(s) outro(s) agente(s) ou em uma programação diferente. Quando administrado na mesma programação, o anticorpo anti-OX40 pode ser administrado antes, depois ou concorrentemente com o outro agente.
[0134]Como será considerado pelos peritos na técnica, as dosagens recomendadas para os vários agentes descritos anteriormente podem precisar ser ajustadas para otimizar a resposta do paciente e maximizar o benefício terapêutico.
8. EXEMPLOS [0135]Os Exemplos a seguir, que destacam certas características e propriedades dos exemplos de modalidades dos anticorpos anti-OX40 descritos aqui são fornecidos com a finalidade de ilustração e não de limitação.
Exemplo 1: Materiais e Métodos
8.1.1. Ligação do Anticorpo Anti-OX40 à 0X40 Humana por ELISA [0136]Placas Immunolon 4xHB de 96 poços (Thermo Scientific) foram revestidas com 1 pg/mL de 0X40 humana-FC (R&D Systems) a 4 °C durante toda a noite. As placas foram bloqueadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de albumina do soro bovino (BSA) durante 30 minutos à temperatura ambiente e então lavadas três vezes com PBST (PBS com 0,1% de Tween 20) utilizando uma lavadora de placas. As placas revestidas com 0X40 foram então incubadas com as concentrações
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69/96 indicadas de anticorpo de teste à temperatura ambiente durante uma hora. As placas foram lavadas quatro vezes com PBST e então incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com 100 μΙ_ de Biotina específica antifragmento Fab humano de caprino (Jackson ImmunoResearch) preparada a uma diluição de 1:5000 em PBS contendo 1% de BSA. As placas foram então lavadas cinco vezes em PBST e 100 pL de uma diluição 1:1000 de estreptavidina-peroxidase de raiz forte (HRP) (Thermo Scientific) foram adicionados em cada poço e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram subsequentemente lavadas cinco vezes em PBST e 100 pL de TMB One Component (Surmodics) foram adicionados em cada poço e incubados à temperatura ambiente (RT) até que a cor se desenvolvesse (aproximadamente 5-10 minutos). A densidade óptica (DO) foi lida em 650 nm (Molecular Devices Spectromax190).
8.1.2.Ligação do Anticorpo anti-OX40 à 0X40 de Macaco Cynomolgus por ELISA [0137]Placas Immunolon 4xHB de 96 poços (Thermo Scientific) foram revestidas com 1 pg/mL da fusão Cyno OX40-Fc a 4 °C durante toda a noite. As placas foram bloqueadas com PBS contendo 1 % de albumina do soro bovino (BSA) durante 30 minutos à temperatura ambiente e então lavadas três vezes com PBST (PBS com 0,1% de Tween 20). As placas revestidas com 0X40 foram então incubadas com concentrações indicadas de anticorpo anti-OX40 à temperatura ambiente durante uma hora. As placas foram lavadas quatro vezes com PBST e então incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com 100 pL de Biotina específica antifragmento Fab humano de caprino (Jackson ImmunoResearch) preparada a uma diluição de 1:5000 em PBS contendo 1% de BSA. As placas foram então lavadas cinco vezes em PBST e 100 pL de uma diluição 1:1000 de estreptavidina-HRP (Thermo Scientific) foram adicionados em cada poço e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas cinco vezes em PBST e 100 pL de TMB One component (Surmodics) foram adicionados
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70/96 em cada poço e incubados à temperatura ambiente até que a cor se desenvolvesse (aproximadamente 5-10 minutos). A densidade óptica (DO) foi lida em 650 nm (Molecular Devices Spectromax190).
8.1.3.Ligação do Anticorpo anti-OX40 à 0X40 de Rhesus por Citometria de Fluxo [0138]A 0X40 de macaco rhesus (Macaca mulatta) é idêntica à 0X40 de macaco cynomolgus (Macaca fascicularis) (SEQ ID NO:2) no nível de aminoácido. Uma linhagem de célula repórter de NF-kB 293 expressando 0X40 de rhesus foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e Penicilina/Estreptomicina. Para o ensaio de ligação, as células foram ressuspensas a 5 milhões de células por mL. 50 pL (250.000 células)/poço foram transferidos para cada poço de uma placa de 96 poços de polipropileno de 500 pL (Nunc). Um estoque 2X de anticorpo de teste anti-OX40 ou anticorpo monoclonal de controle de isotipo foi preparado em uma placa de diluição separada a 666, 333, 111, 37,03, 12,34, 4,11, 0,457, 0,152, 0,0508, 0,0169, 0,00564 nM em meio de cultura. Os anticorpos monoclonais (50 pL/poço) foram transferidos para dentro dos respectivos poços da placa de ensaio. As células foram incubadas com os anticorpos primários durante 30 minutos a 4 °C e lavadas duas vezes com 250 pL/poço de PBS através da centrifugação a 800 rpm durante 3 minutos. O anticorpo ligado foi detectado com Cy5-anti-lgG humana de burro (H+L) (Jackson ImmunoResearch) diluído a 2 pg/mL (50 pL/poço) em PBS durante 30 minutos a 4 °C. As células foram lavadas uma vez com 250 pL/poço de PBS, ressuspensas em PBS contendo 1% de Formaldeído e analisadas em um FACSCalibur com laser dual (Becton Dickinson).
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8.1.4.Afinidade de Ligação do Anticorpo Anti-OX40 à 0X40 Humana e de Rhesus por Ressonância de Plasmon de Superfície [0139]A cinética de ligação de um anticorpo anti-OX40 ao ECD (domínio extracelular) da 0X40 solúvel recombinante foi determinada por medidas baseadas na ressonância de plasmon de superfície realizadas em um equipamento Biacore T200 (GE Healthcare) a 25 SC utilizando uma abordagem de ensaio de captura anti-Fc. Os domínios extracelulares recombinantes (ECDs) da 0X40 humana (resíduos 1-216) e da 0X40 de macaco rhesus (resíduos 28-214) foram obtidos (Creative Biomart) e adicionalmente purificados por filtração em gel utilizando Superdex200 (GE Healthcare) em 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES), pH 7,4, 150 mM de NaCI, 3 mM de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA). A 0X40 de macaco rhesus (Macaca mulatta) é idêntica à 0X40 de macaco cynomolgus (Macaca fascicularís) (SEQ ID NO:2) no nível de aminoácido. A preparação do chip e as medidas da cinética de ligação foram realizadas no tampão de ensaio HBS-EP+ (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCI, 3 mM de EDTA, 0,05% de Tween 20). Para a preparação do chip de captura anti-Fc, aproximadamente 2000 Unidades de Ressonância (UR) de anticorpo policlonal anti-Fc de IgG humana de caprino (Thermo Fisher Scientific Inc.), diluído a 25 pg/mL em 10 mM de acetato de sódio (pH 4,5), foram imobilizadas diretamente ao longo de um chip biossensor CM5 utilizando um kit de acoplamento de amina padrão de acordo com as instruções e os procedimentos do fabricante. Os grupamentos não reagidos sobre a superfície do biossensor foram bloqueados com etanolamina. Para as medidas da cinética de ligação cada ciclo consistia das etapas a seguir: 1) captura do anticorpo de teste anti-OX40 apenas sobre a superfície de teste; 2) injeção do analito (ECD de 0X40 ou apenas tampão) sobre tanto a superfície de referência quanto de teste, 240 pL a 80 pL/min, após o que a dissociação foi monitorada durante 900 segundos a 80 pL/min; 3)
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72/96 regeneração da superfície de captura por 10 mM de Glicina-HCI, pH 1,5 injeções tanto sobre a superfície de referência quanto de teste. Durante o ensaio, todas as medidas foram referidas apenas contra a superfície de captura (isto é, com sem anticorpo de teste capturado) e injeções de apenas tampão foram utilizadas para referência dupla. As injeções de 0X40 variavam em relação à concentração de 900 nM ou 300 nM a 11,11 nM em uma série de diluições aleatórias de 9 ou 3 vezes, respectivamente. Os dados foram processados e ajustados de forma global em um modelo de ligação 1:1 utilizando o software de avaliação Biacore T200 para determinar as constantes da velocidade cinética de ligação, ka (M1 s 1) e kd (s1) e a constante de dissociação em equilíbrio Kd (M).
8.1.5. Bloqueio do Ligante de 0X40 com Anticorpo Anti-OX40 [0140]As células Jurkat transfectadas de forma estável com 0X40 humana cultivadas a 2 χ 105 células/poço foram incubadas simultaneamente com 0,2 pg/mL de anticorpo de teste anti-OX40 e uma titulação de OX40L humana solúvel (R&D systems) em PBS contendo 1% de BSA em uma placa de 96 poços de fundo arredondado durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes e incubadas durante mais 30 minutos com 100 pL de diluição 1:500 de anti-Fc humano PE de caprino por poço (Jackson ImmunoResearch). As células foram então lavadas duas vezes e adquiridas utilizando FACSCanto (BD Biosciences) e analisadas utilizando FACSDiva.
8.1.6. Ligação do Anticorpo Anti-OX40 à 0X40 Humana Expressa na Superfície Celular [0141]Uma linhagem de célula Jurkat repórter de NF-κΒ expressando a proteína 0X40 humana foi cultivada em DMEM contendo 10% de FBS e penicilina/estreptomicina (pen/strep). Para o ensaio de ligação, cada linhagem de célula foi ressuspensa a 5 milhões de células por mL. 50 pL (250.000 células)/poço foram transferidos para cada poço de uma placa de 96 poços de polipropileno de 500 pL (Nunc). Um estoque 2X de
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73/96 anticorpo de teste anti-OX40 ou controle de isotipo mAb foi preparado em uma placa de diluição separada a 666, 333, 111, 37,03, 12,34, 4,11, 0,457, 0,152, 0,0508, 0,0169, 0,00564 nM em meio de cultura. Cada anticorpo (50 pL/poço) foi transferido para dentro dos respectivos poços da placa de ensaio. As células foram incubadas com o anticorpo de teste anti-OX40 ou anticorpos de controle de isotipos durante 30 minutos a 4 °C e lavadas duas vezes com 250 pL/poço de PBS através da centrifugação a 800 rpm durante 3 minutos. O anticorpo ligado foi detectado com Cy5-anti-lgG humana de burro (H+L) (Jackson ImmunoResearch) diluído a 2 pg/mL (50 pL/poço) em PBS durante 30 minutos a 4 °C. As células foram lavadas uma vez com 250 pL/poço de PBS, ressuspensas em PBS contendo 1% de Formaldeído e analisadas em um FACSCalibur com laser dual (Becton Dickinson).
8.1.7.Ligação do Anticorpo Anti-OX40 ao Receptor de 0X40 Quimérico [0142]Transfectantes baseados na 293 foram gerados para expressar versões quiméricas da molécula de 0X40 humana com domínios ricos em cisteína (CRDs) da 0X40 de camundongo permutados individualmente dentro dos CRDs humanos correspondentes. Após a seleção com G418, as células sobreviventes foram separadas em relação à expressão no citômetro de fluxo MoFIo (Beckman): 293s-huOX40, 293shuOX40-muCRD1, 293s-huOX40-muCRDII, 293s-huOX40-muCRDIII, 293s-huOX40muCRDIV, 293s-huOX40-muCRDII+lll e 293s-muOX40. Um total de 2 x 105 de cada uma das células transfectantes com 0X40 quimérica de 293 foi adicionado por poço em placas de 96 poços de polipropileno de 500 pL (Nunc). Após o plaqueamento das células, 50 pL de Hu3738 ou anticorpo de controle de isotipo a 2 pg/mL foram adicionados nos poços correspondentes em duplicata para cada linhagem de célula e foi permitido que fossem incubados em gelo durante 30 minutos. Após a incubação, 200 pL de Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS) foram adicionados dentro de cada poço e
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74/96 as placas foram centrifugadas a 1000 rpm durante três minutos. Os sobrenadantes de cada poço foram removidos e 50 μΙ_ de anticorpo secundário Cy5-anti-lgG humana de burro (Jackson ImmunoResearch) foram adicionados em uma diluição 1:250, que foram então incubados durante 30 minutos em gelo na escuridão. Após o período de incubação, 200 μΙ_ de DPBS foram adicionados antes da centrifugação da placa a 1000 rpm durante três minutos. Os sobrenadantes foram removidos e cada poço foi ressuspenso com 100 μΙ_ de DPBS + 1% de Formaldeído. As amostras foram analisadas no citômetro de fluxo FACSCalibur com laser dual (Becton Dickinson).
8,1.8.Atividade Repórter com Fluorescência de NF-κΒ para 0X40 Humana e de Rhesus [0143]As linhagens de células repórteres de NF-κΒ, Jurkat-NF-KB-huOX40 e 293NF-KB-RhOX40, que expressam as proteínas 0X40 humana e de rhesus, respectivamente, foram mantidas em meio de cultura compreendendo DMEM contendo 10% de FBS e penicilina/estreptomicina (100 U/mL). Para o ensaio repórter de NF-κΒ, a linhagem de célula Jurkat-NF-KB-huOX40 foi ressuspensa em meio de crescimento (idêntico ao meio de cultura) a 1 milhão/mL (final 50.000 células/poço) e a linhagem de célula 293-NF-KB-RhOX40 foi ressuspensa em meio de crescimento a 0,5 milhão/mL (final 25.000 células/poço). 50 pL/poço foram transferidos para o interior de 60 poços de uma placa de ensaio de 96 poços de fundo branco/transparente (Gostar 3903). Um estoque 3X dos anticorpos a seguir foi feito em uma placa de diluição de 96 poços com fundo em U separada (Becton Dickinson): anticorpo anti-PD-1 utilizado como um anticorpo de controle negativo e anticorpo anti-OX40. As diluições em série para testar a atividade dos anticorpos sem agente de ligação exógeno incluíam 2000, 500, 125, 31,25, 7,812, 1,953, 0,488, 0,122, 0,0305, 0,00762 nM em meio de cultura. As diluições em série para testar o efeito de agente de ligação cruzada sobre a atividade do anticorpo anti
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0X40 incluíam 200, 50, 12,5, 3,125, 0,7812, 0,1953, 0,0488, 0,0122, 0,00305, 0,000762 nM de anticorpo. Em duplicata, 50 pL/poço dos anticorpos foram transferidos para dentro dos respectivos poços da placa de ensaio. Às placas com anticorpo apenas, 50 pL/poço do meio foram adicionados no interior dos 60 poços. Para a diluição em séria do agente de ligação cruzada, o agente específico anti-Fc de IgG humana de caprino (Jackson ImmunoResearch) foi diluído a 800, 200, 50, 12,5, 3,125, 0,7812, 0,1953, 0,0488, 0,0122, 0,00305 nM e 50 pL/poço foram transferidos para o interior dos 60 poços para manter uma proporção 4:1 de anticorpo anti-OX40 e agente de ligação cruzada. O meio de crescimento (150 μΙ_) foi adicionado na parte externa dos poços para prevenir a evaporação no interior dos 60 poços. As placas foram incubadas a 37 °C durante aproximadamente 18 horas. A atividade da luciferase foi quantificada com BriteLite Plus (Perkin Elmer). Sucintamente, o substrato foi dissolvido com 10 mL do tampão fornecido pelo vendedor e 75 pL de substrato/poço foram adicionados no interior dos 60 poços de cada placa. As placas foram analisadas no Victorõ (Molecular Devices) utilizando as configurações de Luminescência.
8.1.9.Ensaio Repórter de ADCC [0144]As células efetoras de ADCC que expressam FcyRIII humano (Promega) foram descongeladas e crescidas seguindo as recomendações do protocolo. As células foram divididas duas vezes antes do uso. As células HEK293 transfectadas de forma estável com 0X40 humana ou de rhesus foram utilizadas como as células alvos. Estas células foram propagadas em HyClone™ DMEM com 10% de FBS inativado com calor (Sigma) e 5 pg/mL de Blasticidin (Gibco Life Technologies).
[0145]No dia anterior ao ensaio, as células alvos HEK293 expressando 0X40 foram coletadas com 0,25% de Tripsina (Gibco Life Technologies). As células foram lavadas, contadas e plaqueadas a 10.000 células/poço em Costar Plates de 96 poços
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76/96 (Corning). As placas foram incubadas a 37°C durante toda a noite em DMEM com 10% de FBS. O protocolo G7102 do Modelo de Propagação de Células Efetoras para Ensaio Biológico de ADCC foi seguido para o ensaio. A proporção de células Efetoras para Alvos era de 7,5:1. A luminescência foi medida com a leitora EnSpire Alpha (Perkin Elmer) utilizando o software EnSpireManager. Os anticorpos que foram testados neste ensaio incluíam anticorpo de controle de isotipo e anticorpos anti-OX40.
8.1.10.Ligação do Anticorpo Anti-OX40 às Células T CD4+ Humanas Ativadas [0146]As PBMCs humans foram isoladas das camadas leucoplaquetárias obtidas no Stanford Blood Center (Palo Alto, CA). Sucintamente, as camadas leucoplaquetárias foram diluídas em uma proporção 1:1 com PBS sem magnésio e cálcio (GE Healthcare). O sangue diluído (30 mL) foi colocado sobre 15 mL de 90% de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) preparado em PBS sem magnésio e cálcio (GE Healthcare) contido em tubos SepMate (Stemcell Technologies). Os tubos foram centrifugados a 1200 g durante 10 minutos. A interfase foi coletada e lavada duas vezes em 1X PBS. As células T CD4+ foram isoladas utilizando o Stemcell Technologies CD4 Enrichment Kit (Stem Cell Technologies). As células foram ressuspensas a 2x106 células/mL em RPMI/10% de FBS. Esferas Dynal CD3/28 (Life Technologies) foram adicionadas em uma proporção 1:1. As células foram incubadas em um rotor “end over end” à temperatura ambiente durante 20 minutos. As células foram cultivadas em placas de 6 poços durante 24 horas a 37 °C.
[0147]Após 24 horas, as esferas foram removidas com um imã. As células foram contadas e ressuspensas a 1,5x106/mL. Uma alíquota da suspensão de células (100 pL) foi utilizada para coloração. O anticorpo de teste foi titulado em uma diluição em série de 4 vezes partindo de 1 pg/mL. As células foram coradas durante 30 minutos e lavadas duas vezes. Uma diluição 1:250 (4 pg/mL) de agente específico anti-Fc de IgG humana
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77/96 de caprino-PE/poço (Jackson ImmunoResearch) foi adicionada em 100 pL/poço de PBS contendo 1% de BSA. As células foram coradas durante mais 30 minutos e lavadas duas vezes, transferidas para tubos e adquiridas utilizando o citômetro de fluxo BD LSR Fortessa e analisadas utilizando o software de análise FACSDiva versão 8.0.1.
8.1.11 Ligação do Anticorpo Anti-OX40 às Células T de Cynomolgus Ativadas [0148]O sangue total de macaco cynomolgus foi obtido em Worldwide Primates. Para o isolamento das PBMCs, o sangue total foi diluído em uma proporção 1:1 com PBS sem magnésio e cálcio (GE Healthcare). O sangue diluído (30 mL) foi colocado sob 13 mL de 95% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) preparado em PBS sem magnésio e cálcio (GE Healthcare) em tubos cônicos de 50 mL. Os tubos foram centrifugados a 1000 g durante 25 minutos. A interfase foi coletada e lavada duas vezes em 1X PBS. As células foram ressuspensas a 2 χ 106 células/mL em RPMI/10% de FBS. As células foram incubadas durante 72 horas com 10 mg/mL de fitohemaglutinina (ΡΗΑ) (Sigma) e 100 U/mLde interleucina-2 humana recombinante (IL-2) (Proleukin®, Prometheus) em placas de 6 poços. Após 24 horas, as células foram lavadas, contadas e ressuspensas a 2x106/mL. 100 pL das células foram utilizados para coloração. O anticorpo de teste anti0X40 foi titulado em uma diluição em série de 4 vezes partindo de 1 pg/mL. As células foram coradas durante 30 minutos e lavadas duas vezes. Uma diluição 1:250 (4 pg/mL) do agente específico anti-Fc de IgG humana de caprino-PE (Jackson ImmunoResearch) em 100 pL de PBS contendo 1% de BSA foi adicionada por poço. As células foram coradas durante mais 30 minutos e lavadas duas vezes, transferidas para tubos e adquiridas utilizando o citômetro de fluxo BD LSR Fortessa e analisadas utilizando o software de análise FACSDiva versão 8.0.1.
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8.1.12. Prol iteração de Células T Humanas Ativadas e Indução de IFN-γ [0149]As camadas leucoplaquetárias humanas foram obtidas no Stanford Blood Center (Palo Alto, CA). Para o isolamento das PBMCs humanas, as camadas leucoplaquetárias foram diluídas em uma proporção 1:1 com PBS sem magnésio e cálcio (GE Healthcare). O sangue diluído (30 mL) foi colocado sobre 15 mL de 90% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) preparado em PBS sem magnésio e cálcio (GE Healthcare) contido em tubos SepMate (Stemcell Technologies). Os tubos foram centrifugados a 1200 g durante 10 minutos. A interfase foi coletada e lavada duas vezes em 1X PBS. As células T CD4+ foram isoladas das PBMCs utilizando o EasySep CD4+ T Cell Enrichment Kit (Stemcell Technologies). As células T CD4+ foram cultivadas a 2 x 106 células/mL em RPMI+10% de FCS mais 2 pg/mL de PHA (Sigma) e 20 UI/mL IL-2 humana recombinante (Proleukin®, Prometheus) em placas de 6 poços durante 72 horas.
[0150]Placas de 96 poços de placas de controle da ativação de células T Biocoat (Corning) foram revestidas com 2 pg/mL de agente específico anti-Fc de IgG de camundongo de caprino (Jackson ImmunoResearch) e 2 pg/mL de agente específico anti-Fc de IgG humana de caprino (Jackson ImmunoResearch) em 100 pL/poço de PBS durante toda a noite a 4 °C. As placas foram bloqueadas com 200 pL/poço de 1% de BSA (Rockland) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de PBS. 4 ng/mL de OKT3 anti-CD3 humano (eBioscience) foram adicionados em 100 pL/poço de PBS e incubados durante 90 minutos a 37°C. As placas foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de PBS. Uma diluição em série de 3 vezes de anticorpo anti-OX40 e anticorpo monoclonal de controle de isotipo partindo de 5 pg/mL foi adicionada às placas em 100 pL de PBS. As placas foram incubadas durante 90 minutos a 37°C. As placas foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de PBS. As
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79/96 células T CD4+ ativadas com PHA e IL-2 (2 x 105) lavadas foram adicionadas em cada poço.
[0151 ]Após 48 horas de cultura a 37°C, 30 pL de sobrenadante de cada duplicata foram agrupados para a análise de IFN-γ com Luminex (Millipore) e analisados em Bioplex Manager 6.0 (BioRad). As placas foram pulsadas com 0,25 pCi de 3H-timidina (Perkin Elmer) durante toda a noite e coletadas na manhã seguinte em Filtermats (Perkin Elmer) com 5 mL de fluido de cintilação Ultima Gold (Perkin Elmer). Os Filtermats foram contados no contador 1450 Microbeta Wallac Trilux (PerkinElmer).
8.1.13.Ensaios de Supressão de Células T Reguladoras Humanas [0152]As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) frescas foram obtidas na AllCells ou Stemcell Technologies. As células foram centrifugadas, a pelota de células foi ressuspensa com 1X PBS e centrifugada mais uma vez a 1200 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram removidos e as células foram então ressuspensas com tampão RoboSep (Stemcell Technologies). A viabilidade das células e a contagem de células foram determinadas utilizando o Vi-Cell XR cell Counter Beckman Coulter. 100-150 milhão células foram separadas para o enriquecimento de células T CD4+ utilizando o Stemcell EasySep Human CD4+ T cell Enrichment Kit. As células T CD4+ enriquecidas foram então separadas das células CD25+ utilizando Stemcell EasySep Human CD25+ Selection kit. Este processo resulto em células T de resposta CD4+/CD25- (Tresp) purificadas. As PBMCs residuais foram utilizadas para o isolamento de células T reguladoras (Treg) seguindo as instruções do Stemcell EasySep Human CD4+/CD127low/CD49d- Regulatory T cell Enrichment Kit. Após o isolamento de Tresp e Treg CD4+/CD25-, as células foram ressuspensas com RPMI 1640 com 10% FBS inativado com calor e 0,01 mM de 2-Mercaptoetanol a 1 x 106 células/mL e 5 x 105 células/mL respectivamente.
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80/96 [0153]O ensaio de Supressão de Treg foi montado utilizando duas proporções diferentes de Tresp para Treg a 2:1 e 4:1. Para uma proporção 2:1,5 x 104 células Tresp e 2,5 x 104 células Treg foram adicionadas nas placas com fundo em U de 96 poços. Para uma proporção 4:1,5 x 104 células Tresp e 1,25 x 104 células Treg foram adicionadas na placa de 96 poços. O Treg Suppression Inspector Bead Reagent (Miltenyi Biotec) também foi adicionado nos poços na proporção 1:1 de esfera para célula para estimulação. O anticorpo anti-OX40 e o controle de isotipo IgGi humano foram testados em triplicata à concentração final de 10 pg/mL na ausência ou na presença de F(ab')2 Goat Anti-Human (GxHu) IgG, Fc specific (Jackson ImmunoResearch) na proporção 1:4. As placas foram incubadas a 37 °C em 5% de CO2 durante quatro dias. As placas foram tratadas com 1 pCi/poço de 3H-timidina e incubadas adicionalmente durante mais 16 horas a 37 °C em 5% de CO2. Após a incubação, as placas foram coletadas e a proliferação foi medida utilizando o fluido de cintilação Ultima Gold (Perkin Elmer) e o contador de cintilação 1450 Microbeta Wallac Trilux (PerkinElmer).
8.1.14.Modelo de Tumor de Camundongo de Célula Imunológica Humana-PC-3 Enxertada [0154]No dia da inoculação, as células T humanas, moDC humanas autólogas (células dendríticas derivadas de monócitos) e as células PC-3 foram contadas pelo ViCell XR (Beckman Coulter) e combinadas para fornecer uma injeção subcutânea de 1 x 107 PC-3, 1 x106 células T e 5 x 105 moDC por camundongos NSG (camundongo NOD.Cg-Prkdc30^ ll2rgtm1wUSzS} em 100 μΙ_ de Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS) (GE Lifesciences). Os grupos de tratamento (n = 8 camundongos/grupo) de 10 mg/kg de anticorpo monoclonal de controle de isotipo e 10 mg/kg de Hu3738 foram preparados em 200 pL de DPBS para injeção intraperitoneal. Uma única dose de anticorpo foi injetada no momento da inoculação da mistura de
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81/96 células. A medida de crescimento do tumor foi realizada através da medida com calibre padrão e o volume de crescimento do tumor foi calculado (Comprimento x largura x altura/2).
8.1.15. Modelo de GVHD de PBMC Humanas em Camundongos NSG [0155]As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) humanas foram obtidas em AllCells (Oakland, CA). Os camundongos imunodeficientes NSG (NOD.CgPrkdc30^ H2rgtm1wl'/Sz3) foram inoculados com 2 x 107 PBMCs humanas de forma intraperitoneal no dia 1. O anticorpo anti-OX40 Hu3738 ou o controle de isotipo foi administrado de forma intraperitoneal uma vez por semana a partir do dia 1. Assim que os camundongos exibiram sinais comportamentais de doença de enxerto-versushospedeiro (GVHD) (por exemplo, postura encurvada, pelo eriçado), as amostras de soro foram obtidas e os níveis de citocinas no soro foram determinados utilizando um Luminex Bead Array Assay (Millipore).
Exemplo 2:Produção e Humanização de Anticorpos Anti-OX40 de Camundongo [0156]Os camundongos foram imunizados de acordo com os métodos conhecidos na técnica (E. Harlow, D. Lane. Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998)). O isotipo de cada anticorpo monoclonal foi determinado utilizando o Mouse Isotyping kit (Roche). Os clones de hibridoma produzindo os anticorpos de interesse foram purificados e adicionalmente caracterizados por afinidade por ressonância de plasmon de superfície e por competição de ligantes por FACS.
[0157]A clonagem e a construção do vetor de expressão foram realizadas através de métodos conhecido na técnica para expressão de anticorpos monoclonais recombinantes.
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82/96 [0158]A humanização da região V do anticorpo foi realizada como mostrado por Queen, C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989; 86:10029-10033). As estruturas canônicas das CDRs foram determinadas de acordo com Huang et al. (Methods, 2005; 36:35-42). As sequências de linhagem germinativa variáveis humanas com as mesmas estruturas canônicas de CDR ou mais similares foram identificadas e sequências de segmentos de Vh, Vl e J humanas apropriadas foram selecionadas para fornecer as estruturas para a região variável anti-OX40. Nas posições estruturais nas quais o modelo de computador sugere contato significativo com as CDRs, os aminoácidos das regiões V anti-OX40 de camundongo foram substituídos pelos aminoácidos estruturais humanos originais (retromutações).
[0159]Os anticorpos anti-OX40 de camundongo Mu3726, Mu3738, Mu3739 e Mu3741 foram humanizados de acordo com o método descrito acima. A versão humanizada de Vh de Mu3726 era Vn.lade Hu3726 que tinha regiões estruturais de Vh428 humana, com sete retromutações de I48M, V67I, M69I, V71R, F78V, A93V e R94K. A Vn.1a de Hu3726 foi combinada com sua respectiva cadeia leve humanizada Vi_.1b de Hu3726 que tinha regiões estruturais de VK1-39 humano, com duas retromutações de Y48F e F71Y. A versão humanizada de Vh de Mu3738 era Vn.1b Hu3738 que tinha regiões estruturais de Vh 3-7 humana, com uma retromutação de W47L. Vh.1 b de Hu3738 foi combinada com sua respectiva cadeia leve humanizada Vi_-1 de Hu3738 que tinha regiões estruturais VK4-1 humano e nenhuma retromutação. A versão humanizada de Vh de Mu3739 era Vn.1b de Hu3739 que tinha regiões estruturais da Vh1-69 humana, com quatro retromutações de M48I, V67A, E73T e S76N. A Vn.1b de Hu3739 foi combinada com sua respectiva cadeia leve humanizada Vi_.1b Hu3739 que tinha regiões estruturais de VK1-39 humano, com duas retromutações de V58L e F71Y. A versão humanizada de Vh de Mu3741 era Vn.2b de Hu3741 que tinha regiões estruturais de Vh3-66 humana,
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83/96 com sete retromutações de A24V, V48L, S49G, F67L, R71K, N76S e L78V. A Vn.2b de Hu3741 foi combinada com sua respectiva cadeia leve humanizada Vl.1 c de Hu3741 que tinha regiões estruturais de VK1-39 humano, com duas retromutações de Y36F e F71Y.
Exemplo 3:Afinidade de Ligação dos Anticorpos Anti-OX40 [0160]A Tabela 3-1 abaixo mostra os dados de afinidade de ligação in vitro do exemplo de anticorpo anti-OX40 Hu3738 ou anticorpos anti-OX40 da literatura 11D4 ou 18D8 descritos na Patente U.S. No. 7.960.515. Cada um de 11D4 e 18D8 é uma IgGi humana, com uma região kappa leve.
[0161]Como utilizado aqui, 11D4 possui uma Vh com a sequência de aminoácidos de acordo com:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYI ssssstidyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslrdedtavyycaresgwylfdywg QGTLVTVSS (SEQ ID NO:61) e uma Vl com a sequência de aminoácidos de acordo com:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:62).
[0162]18D8 possui uma Vh com a sequência de aminoácidos de acordo com:
EVQLVESGGGLVQPGRLSRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGI swnsgsigyadsvkgrftisrenaknslylqmnslraedtalyycakdqstadyyfyy GMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:63) e uma Vl com a sequência de aminoácidos de acordo com:
EIVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASN RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:64).
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84/96 [0163]Hu3738 exibiu propriedades de ligação potentes à 0X40 humana por ressonância de plasmon de superfície ou nas células repórteres de NF-κΒ Jurkat transfectadas que expressam 0X40 humana que é medida nos ensaios do Exemplo 1 e afinidade de ligação mais alta por SPR quando comparado com Hu3739 ou Hu3741.
Tabela 3-1 Propriedades de Ligação de Exemplos de Anticorpos contra 0X40 Humana
Anticorpo Kd (M)* kd (1/sec)* EC50 de ligação à supefície de células Jurkat (ng/mL)
11D4 1.6E-09 2,7E-04 55
18D8 9.1E-09 1,1E-01 258
Hu3738 4,2E-08 4,2E-02 75
Hu3739 3,6E-07 1.6E-02 N/A
Hu3741 3,0E-06 3,1 E-01 N/A
*que é determinada por ressonância de plasmon de superfície de acordo com o Exemplo 1; notação exponencial mostrada (por exemplo, 3,0E-09 = 3,0 χ 10-9); N/A = não disponível.
[0164]Os exemplos de anticorpo anti-OX40 Hu3738 exibiram reatividade cruzada contra 0X40 de macaco cynomolgus ou rhesus, mas não demonstraram ligação significativa contra 0X40 de camundongo ou rato. A atividade de ligação de Hu3738 à 0X40 humana recombinante ou de cynomolgus (cyno) ou à 0X40 humana ou de macaco rhesus na superfície celular, que é determinada através dos ensaios descritos no Exemplo 1, é resumida na Tabela 3-2.
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Tabela 3-2 Propriedades de Ligação de Hu3738 contra 0X40 Humana, de Cynomolgus ou de Rhesus
Ensaio EC50 (nM)
ELISA Humana 0,044
Cyno 0,039
Célula NF-kB Jurkat Humana 0,50
rhesus 2,1
Exemplo 4:Atividade Biológica In Vitro do Anticorpo Anti-OX40 Hu3738 [0165]Para avaliar a ligação de Hu3738 à 0X40 humana expressa de forma endógena, tanto células T CD4+ ativadas quanto células mononucleares do sangue periférico (PBMC) não estimuladas foram analisadas por citometria de fluxo. A Tabela 41 resume os dados para ligação de Hu3738 à 0X40 na superfície celular nas células T CD4+ humanas ativadas com esferas CD3/CD28 ou células T CD4+ de macaco cynomolgus ativadas com fitohemaglutinina (PHA) e interleucina-2 (IL-2), de acordo com os ensaios descritos no Exemplo 1. Como é mostrado na Tabela 4-1, Hu3738 se ligou de forma potente à 0X40 nas células T CD4+ ativadas em culturas de células T humanas e de cynomolgus.
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Tabela 4-1 Ligação de células T CD4+ do Exemplo de Anticorpo Hu3738
Espécie da 0X40 EC50 (nM)
Humana 0,053
De Cynomolgus 0,024
[0166]A ligação subnanomolar de 0X40 humana por Hu3738 forneceu ativação funcional como é demonstrado pela proliferação de células T CD4+ do sangue periférico humano aumentada e pela maior produção de interferon-γ pelas células T CD4+ humanas após o tratamento in vitro com Hu3738 de acordo com os ensaios descritos na Seção 8.1.12 (FIGS. 1A, 1B). Como mostrado em um experimento típico representado na FIG. 1A, Hu3738 efetuou uma proliferação de células T CD4+ do sangue periférico humano aumentada aproximadamente 1,5 a aproximadamente 6 vezes quando comparado com o controle de isotipo hulgGi, que era comparável ou maior que o aumento na proliferação observado quando as células T foram dosadas com uma quantidade equivalente de anticorpo da literatura anti-OX40 11D4 ou 18D8. Hu3738 exibiu EC50 = 0,11 nM (16 ng/mL) em uma media de reações de oito doadores.
[0167]A FIG. 1C mostra que a proliferação de células T CD4+ do sangue periférico humano após o tratamento in vitro com Hu3738 era similar à do anticorpo da literatura anti-OX40 1A7 ao longo de uma faixa ampla de concentrações de anticorpo desde aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1 pg/mL, quando cada uma foi testada de acordo com o ensaio de proliferação de células T descrito na Seção 8.1.12.
[0168]O anticorpo 1A7 descrito na Publicação US no. 2015/0307617 é um IgGi humano com cadeias kappa leves, que possui uma sequência de aminoácidos de Vh de acordo com:
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EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDSYMSWVKQSHGKTLEWIGDMY PDNGDSSYNQKFREKVTLTVDKSSTTAYMEFRSLTSEDSAVYYCVLAPRWYFSVWGT GTTVTVSS (SEQ ID NO:69) e uma sequência de aminoácidos de Vl de acordo com:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRL RSGVPSRFSGSGSGKDYFLTISNLEQEDVAAYFCQQGHTLPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NQ:70).
[0169]Como mostrado em um experimento típico representado na FIG. 1B, a produção de IFN-γ aumentou nas células T CD4+ humanas aproximadamente 2 a aproximadamente 10 vezes quando tratadas com Hu3738 ao longo da faixa de concentrações testada. Em relação à produção de IFN-γ, Hu3738 exibiu EC50 = 0,16 nM (24 ng/mL) em uma média de reações de nove doadores. Os anticorpos anti-QX40 da literatura 11D4 e 18D8 também demonstraram um efeito similar sobre a produção de IFN-
Y sob estas condições de ensaio.
[0170]A FIG. 1D mostra que Hu3738 efetua um aumento na produção de IFN-γ maior nas células T CD4+ humanas quando comparado com 0 anticorpo de literatura anti-QX40 1A7, quando cada um foi testado de acordo com 0 ensaio de produção de IFN-
Y pelas células T descrito na Seção 8.1.12.
[0171]Em adição aos efeitos de ativação a jusante no aumento da proliferação de células T CD4+ e no aumento da produção de IFN-γ, 0 exemplo de anticorpo anti0X40 Hu3738 também inibiu a atividade de células T reguladoras humanas in vitro, sugerindo que as células T reguladoras dentro de um tumor sólido, que podem inibir uma resposta imunológica pelo corpo para atacar 0 tumor, podem ser suprimidas com a administração de Hu3738.
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88/96 [0172]O efeito de Hu3738 sobre a atividade de T reguladora foi avaliado in vitro de acordo com o ensaio descrito na Seção 8.1.13. As células T de resposta (Tresp) CD4+/CD25- autólogas foram cocultivadas com células T reguladoras (Treg) CD4+/CD25+/CD127IOW e esferas de ativação (Insp) em uma proporção 2:1 ou 4:1 de Tresp : Treg (FIGS. 2A, 2B). Na ausência de Treg, as células Tresp se proliferaram em resposta às esferas de ativação. Na presença de Treg, a proliferação foi inibida. A inclusão de 10 pg/mL de Hu3738 no meio de cultura não teve impacto sobre a supressão mediada por Treg. O controle de isotipo utilizado para este ensaio de supressão de T reguladora era hulgGi com as variantes de região constante L234A e L235A. Experimentos separados realizados utilizando o controle de isotipo hulgGi com agente de ligação cruzada não exibiram efeito sobre o ensaio.
[0173]Em contraste, na presença de um agente de ligação exógeno, Hu3738 resultou na restauração completa da proliferação de Tresp (FIGS. 2A e 2B). Hu3738 na presença de agente de ligação cruzada aumentou a proliferação neste ensaio acima do nível da resposta de Tresp às esferas de ativação isoladamente. Este resultado sugeriu que os sinais de 0X40 podem superar a supressão mediada por células T reguladoras e podem aumentar respostas específicas ao antígeno coerentes com os resultados relatados anteriormente.
[0174]A atividade de mediada por Hu3738 foi avaliada utilizando um ensaio repórter de ADCC disponível comercialmente que é descrito na Seção 8.1.9. Este ensaio utilizou células Jurkat engenheiradas que expressam FcyRIIIa humano e um fator nuclear de repórter de células T ativadas (NFAT) como as células efetoras. As células HEK 293 que expressam a 0X40 humana foram utilizadas como as células alvos e era esperado que o anticorpo anti-OX40 se ligasse à 0X40 expressa sobre as células alvos. Adicionalmente, era esperado que a região Fc de Hu3738 se ligasse aos receptores de
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FcyRllla na superfície celular das células repórteres. Estes eventos de ligação teriam resultado na ligação cruzada múltipla dos dois tipos de células levando à ativação da atividade repórter de ADCC, um efeito que foi medido através da leitura de luminescência como um resultado da ativação da via de NFAT. Comparado com o controle de isotipo, Hu3738 aumentou a atividade repórter de ADCC, com uma EC50 = 0,51 nM (77 ng/mL).
Exemplo 5:Classificação dos Epítopos dos Exemplos de Anticorpos Anti-OX40 8.5.1 .Ligação de Hu3738 com 0X40 Quimérica Humana/Camundongo [0175]O OX40L solúvel bloqueou a ligação de Hu3738 à 0X40 com uma IC50 = 67 pM (10 ng/mL) em um ensaio de células Jurkat expressando a 0X40 humana descrito na Seção 8.1.5 (FIG. 3), sugerindo que Hu3738 se ligava à 0X40 humana na região de ligação ao ligante da molécula.
[0176]Para um mapeamento de epítopos mais detalhado da ligação do anticorpo Hu3738, foi criada uma série de linhagens de células expressando moléculas de 0X40 permutadas com domínios ricos em cisteína (CRD) humanos/camundongo. Este método se baseia na observação de que Hu3738 não se liga à 0X40 de camundongo (FIG. 4B). Um alinhamento de sequências de 0X40 humana (SEQ ID NO:1) com a 0X40 de camundongo (SEQ ID NO:3) é mostrado na FIG. 4A. Partindo da análise das sequências, foi gerada uma série de transfectantes de 293s expressando versões quiméricas do receptor da 0X40 humana com sequências de CRD de camundongo permutadas e corada com Hu3738.
[0177]As sequências de aminoácidos (incluindo sequências sinais) das quimeras de receptor de 0X40 humano-camundongo, com regiões permutadas de camundongo indicadas sublinhadas, são como a seguir. A quimera de 0X40 humana com CRDI de camundongo substituindo 0 CRDI humano possui uma sequência de aminoácidos de acordo com:
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MC VGA R RLG RG PCAALLLLG LG LSTVTG LNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHG MVSRCDHTRDTLCHPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVC RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSD AICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGL GLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:5), a quimera de 0X40 humana com CRDII de camundongo substituindo o CRDII humano possui uma sequência de aminoácidos de acordo com: MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRC S RSQNTVC RPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRC RAG TQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDR DPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGL LGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:6), a quimera de 0X40 humana com CRDIII de camundongo substituindo o CRDIII humano possui uma sequência de aminoácidos de acordo com:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNG MVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVC RCRPGTQPRQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNS SDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAIL GLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:7), a quimera de 0X40 humana com de camundongo CRDIV substituindo o CRDIV humano possui uma sequência de aminoácidos de acordo com:
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MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNG MVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVC RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLD AVÇEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGL GLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID N0:8), e a quimera de 0X40 humana com CRDII e CRDIII de camundongo substituindo CRDII e CRDIII humanos possui uma sequência de aminoácidos de acordo com:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNG MVS RCS RSQNTVC RPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVC RCRPGTQPRQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNS SDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAIL GLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID N0:9).
[0178]A determinação da ligação de Hu3738 a esta série de quimeras foi realizada de acordo com o ensaio descrito na Seção 8.1.7 para localizar o sítio de ligação às regiões de CRD específicas. Uma perda na ligação sugeriu que os CRDs eram críticos para o reconhecimento de 0X40 por um anticorpo particular. Neste caso, a ausência de ligação detectável a uma região com permuta de CRD específica no camundongo sugeriu que a região do receptor da 0X40 humana era reconhecida pelo Hu3738. Foi mostrado que o anticorpo anti-OX40 Hu3738 perde a ligação quando o CRDII humano foi substituído pelo CRDII de camundongo correspondente, coerente com a ligação de Hu3738 ao CRDII da 0X40 humana (FIG. 4B).
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8.5.2.Ensaio de Competição com o Exemplo de Anticorpo Anti-OX40 Hu3738 Ligado à 0X40 Humana [0179]Anticorpos da literatura anti-OX40 humanizados adicionais foram gerados para comparar os exemplos de anticorpos anti-OX40 da divulgação. Os anticorpos 106222 e 119-122, descritos na Publicação U.S. no. 2013/0280275, são IgGi humanas com cadeias kappa leves.
[0180]0 anticorpo 106-222 possui uma sequência de aminoácidos de Vh de acordo com:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLKWMGW
INTETGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCANPYYDYVSYYAM DYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:65) e uma sequência de aminoácidos de Vl de acordo com:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASY LYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:66).
[0181]O anticorpo 119-122 possui uma sequência de aminoácidos de Vh de acordo com:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYEFPSHDMSWVRQAPGKGLELVAAIN SDGGSTYYPDTMERRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYDDYYAWFAY WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:67) e uma sequência de aminoácidos de Vl de acordo com:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQAPRLLIY LASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:68).
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93/96 [0182]Foi mostrado que a ligação de Hu3738 à 0X40 expressa na superfície celular era competitiva com algumas, mas não todos os anticorpos anti-OX40 da literatura através de estudo de competição direta. Como mostrado na FIG. 5, células Jurkat-NFKB-huOX40 tratadas com um título de dose de anticorpos da literatura, então foram subsequentemente submetidas a 2 pg/mL de Hu3738 marcado com ALEXA FLUOR® 647 fluorescente para determinar a competição de ligação. A análise foi realizada por citometria de fluxo. Os anticorpos anti-OX40 da literatura 106-222 ou 1Α7 eram competitivos com Hu3738. Entretanto, os anticorpos 11D4, 18D8 ou 119-122 não competiam com Hu3738 até 100 pg/mL.
Exemplo 6:Ativação de 0X40 pelo Exemplo de Anticorpo Anti-OX40 Hu3738 [0183]Os dados das células Jurkat NF-κΒ evidenciam a capacidade de ativação do exemplo de anticorpo anti-OX40 Hu3738, mesmo na ausência de um agente de ligação cruzada (FIGS. 6Α, 6B). Como mostrado na FIG. 6Α, os únicos anticorpos anti0X40 que demonstraram atividade de sinalização de NF-κΒ significativa ao longo da faixa de concentrações de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 pg/mL de anticorpo foram Hu3738 e o Mu3738 de camundongo correspondente. Cada um dos anticorpos anti-OX40 da literatura 11D4, 18D8, 106-222 e 119-122 não tiveram um efeito de sinalização de NF-κΒ significativo até aproximadamente 100 pg/mL de anticorpo.
[0184]A atividade de Hu3738 na ausência de ligação cruzada exógena contrastou com a falta de atividade de outros anticorpos anti-OX40 da literatura sob as mesmas condições de ensaio. Um resumo dos dados de sinalização celular de NF-κΒ é mostrado nas Tabelas 6-1 e 6-2. Notavelmente, embora o Hu3738 tenha competido para se ligar à 0X40 humana com anticorpos anti-OX40 da literatura 106-222 e 1Α7, Hu3738 exibiu uma atividade funcional diferente comparado com cada um dos anticorpos na ausência de um agente de ligação cruzada.
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Tabela 6-1 Sinalização de NF-κΒ em células Jurkat-NF-KB-huOX40
Anticorpo ECõo Sem Agente de Ligação Cruzada (nM) ECõo com Agente de Ligação Cruzada (nM)
Hu3738 20 0,088
11D4 NS* 0.94
18D8 NS* 0,50
106-222 NS* 0,63
119-122 NS* 0,34
Isotipo NS* NS*
* NS = sem sinalização de NF-κΒ significativa até 100 pg/mL de anticorpo; N/A = não disponível.
[0185]Em adição a sua capacidade de efetuar a sinalização de NF-κΒ na ausência de agente de ligação exógeno na célula Jurkat-NF-KB-huOX40, Hu3738 também demonstrou maior potência quando medido pela EC50 com agente de ligação cruzada, comparado com anticorpos anti-OX40 da literatura 11D4, 18D8, 106-222 e 119122 (Tabela 6-1).
[0186]Uma comparação lado a lado de Hu3738 com 1A7 é mostrada na FIG. 6B e é resumida na Tabela 6-2 abaixo. Em adição à falta de sinalização de NF-κΒ na ausência de agente de ligação exógeno na célula Jurkat-NF-KB-huOX40, cada um dos anticorpos anti-OX40 da literatura descritos anteriormente também exibiu uma EC50 menor quando comparados com Hu3738._________________________________
Tabela 6-2 Sinalização de NF-κΒ nas células Jurkat-NF-KB-huOX40
Anticorpo EC50 Sem Agente de Ligação Cruzada (nM) EC50 com Agente de Ligação Cruzada (nM)
Hu3738 22 0,020
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Tabela 6-2 Sinalização de NF-κΒ nas células Jurkat-NF-KB-huOX40
Anticorpo EC50 Sem Agente de Ligação Cruzada (nM) EC50 com Agente de Ligação Cruzada (nM)
1A7 NS* 0,066
Isotipo NS* NS*
* NS = sem sinalização de NF-κΒ significativa até 100 pg/mL de anticorpo.
Exemplo?:Atividade Antitumor de Hu3738 no Modelo de Transferência Adotiva de Células Humanas em Camundongo [0187]Hu3738 demonstrou atividade antitumor em um modelo de camundongo NSG in vivo após a inoculação de uma única dose com células PC3 humanas, células T e células dendríticas derivadas de monócitos (moDC) autólogas de acordo com o protocolo descrito na Seção 8.1.14 (FIG. 7). No dia da inoculação, as células T humanas, as moDC e as células PC3 foram fornecidas através de injeção subcutânea a cada camundongo NSG. Cada um do anticorpo monoclonal de controle de isotipo ou do Hu3738 (10 mg/kg) foi dosado de forma intraperitoneal por animal em cada grupo de tratamento (n = 8), com a dose de anticorpo injetada no momento da inoculação. A medida do crescimento do tumor foi avaliada por medida com calibre padrão e o volume do crescimento do tumor foi calculado (Comprimento x largura x altura/2).
[0188]Como mostrado na FIG. 7, o Hu3738 inibiu significativamente o crescimento do tumor de PC3 em camundongos NSG 17 dias após a inoculação quando comparado com uma dose equivalente de anticorpo de controle de isotipo.
Exemplo 8:Ativação Imunológica In Vivo no Modelo de GVHD de PBMC Humana [0189]Os camundongos NSG foram inoculados com PBMCs humanas de forma intraperitoneal. Os camundongos foram então tratados com 1 mg/kg de Hu3738 ou controle de isotipo hulgGi q7d X 4 (isto é, uma vez a cada 7 dias para um total de 4
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96/96 doses), com a primeira dose no dia 1 imediatamente após a inoculação com células humanas. No dia 22, os camundongos foram sacrificados e os níveis de citocinas no soro foram determinados utilizando um Luminex Bead Array Assay (Millipore).
[0190]Os resultados na FIG. 8 demonstraram que um aumento na interleucina-8 (IL-8), no fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), no fator de necrose de tumor alfa (TNF-α) e no interferon-gama (IFN-γ) foi observado após a dosagem do anticorpo anti-OX40 Hu3738 quando comparado com o isotipo, sugestivo de um aumento na resposta imunológica no camundongo causado pelo Hu3738.
[0191]Todas as publicações, as patentes, os pedidos de patentes e outros documentos citados neste pedido de patente são incorporados aqui como referência em suas totalidades para todas as finalidades até a mesma extensão como se cada publicação, patente, pedido de patente ou outro documento individual fosse individualmente indicado como sendo incorporado como referência para todas as finalidades.
[0192]Embora várias modalidades específicas tenham sido ilustradas e descritas, será considerado que várias alterações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do âmbito da(s) invenção(ões).

Claims (33)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1.Anticorpo anti-OX40 CARACTERIZADO pelo fato de que compreende (i) uma cadeia Vh que compreende três CDRs; e (ii) uma cadeia Vl que compreende três CDRs,
    em que: CDR#1 de Vh é selecionada de: GFTFSRYGMS GYSIASGYYWN GFNIKDTYMH GFSLTSYGVH (SEQ ID NO:101), (SEQ ID NO:111), (SEQ ID NO:121), (SEQ ID NO:131); CDR#2 de Vh é selecionada de: TINSNGGRTYYPDSVKG YISYDGSNNYNPSLG RIDPANGNTKYDPKFQG VIWSGGSTDYNAAFIS (SEQ ID NO:102), (SEQ ID NO:112), (SEQ ID NO:122), (SEQ ID NO:132); CDR#3 de Vh é selecionada: EGITTAYAMDY TLPYYFDY GGPAWFVY EEFDY (SEQ ID NO:103), (SEQ ID NO:113), (SEQ ID NO:123), (SEQ ID NO:133); CDR#1 de Vl é selecionada de: KASQSVDYDGDSYMH RASQDISNYLN (SEQ ID NO:104), (SEQ ID NO:114); CDR#2 de Vl é selecionada de: AASILES YTSRLHS YTSRLRS (SEQ ID NO:105), (SEQ ID NO:115), (SEQ ID NO:125); CDR#3 de Vl é selecionada de: QQSNEDPRT QQGNTLPLT QQGNTLPWT QQGYTLPPT (SEQ ID NO:106), (SEQ ID NO:116), (SEQ ID NO:126), (SEQ ID NO:136).
  2. 2. Anticorpo anti-OX40 da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que possui uma cadeia Vh que compreende três CDRs das SEQ ID NOS: 101, 102 e 103; e uma cadeia Vl que compreende três CDRs das SEQ ID NOS: 104, 105 e 106.
  3. 3. Anticorpo anti-OX40 da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLELVATIN SNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGITTAYAMDYW
    Petição 870190055424, de 14/06/2019, pág. 102/122
    2/7
    GQGTSVTVSS (SEQ ID N0:21);
    NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSIASGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYI SYDGSNNYNPSLGNRISITRDTSKNQVFLKLNSVTTEDTATYYCVKTLPYYFDYWGQG TTLTVSS (SEQ ID NO:23);
    EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRID PANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTDVYYCARGGPAWFVYWGQ GTLVTVSA (SEQ ID NO:25); ou
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIW SGGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYCCAREEFDYWGQGTTLT VSS (SEQ ID NO:27);
    e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com:
    DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMHWYQQKPGQPPKLLIY AASILESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:31);
    DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIFYTSRL HSGVPSRFSGGGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:33);
    DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRL RSGLPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:35); or
    DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWFQQKPDGTVKLLIYYTSRL HSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTLPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:37).
  4. 4.Anticorpo anti-OX40 da reivindicação 1, 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é monoclonal.
    Petição 870190055424, de 14/06/2019, pág. 103/122
    3/7
  5. 5-Anticorpo anti-OX40 da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é humanizado.
  6. 6.Anticorpo anti-OX40 da reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVATIN
    SNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGITTAYAMDYW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO:22);
    EVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSIASGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYI
    SYDGSNNYNPSLGNRITISRDTSKNQVSLKLSSVTAVDTAVYYCVKTLPYYFDYWGQG TTVTVSS (SEQ ID NO:24);
    EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWIGRID
    PANGNTKYDPKFQGRATITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPAWFVYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO:26); ou
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWLGVI
    WSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREEFDYWGQGTTV TVSS (SEQ ID NO:28);
    e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com:
    DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMHWYQQKPGQPPKLLIY
    AASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:32);
    DIQMTQTPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFYTSRL
    HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:34);
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRL RSGLPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK (SEQ
    Petição 870190055424, de 14/06/2019, pág. 104/122
    4/7
    ID NO:36); ou
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWFQQKPGKAPKLLIYYTSRL HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTLPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:38).
  7. 7. Anticorpo anti-QX40 da reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:22; e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:32.
  8. 8. Anticorpo anti-QX40 da reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:24; e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:34.
  9. 9. Anticorpo anti-QX40 da reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:26; e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:36.
  10. 10. Anticorpo anti-QX40 da reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia Vh que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:28; e uma cadeia Vl que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:38.
  11. 11. Anticorpo anti-QX40 de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que é uma IgG.
  12. 12. Anticorpo anti-QX40 da reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que é uma IgGi.
  13. 13. Anticorpo anti-QX40 da reivindicação 11 CARACTERIZADO pelo fato de que
    Petição 870190055424, de 14/06/2019, pág. 105/122
    5/7 compreende uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 41-48; e uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 51-54.
  14. 14. Anticorpo anti-OX40 da reivindicação 13 CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOS: 41 ou 42; e uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 51.
  15. 15. Anticorpo anti-OX40 da reivindicação 13 CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOS: 43 ou 44; e uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 52.
  16. 16. Anticorpo anti-OX40 da reivindicação 13 CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOS: 45 ou 46; e uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 53.
  17. 17. Anticorpo anti-OX40 da reivindicação 13 CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOS: 47 ou 48; e uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 54.
  18. 18. Anticorpo anti-OX40 de qualquer uma das reivindicações 1 a 17 CARACTERIZADO pelo fato de que possui uma Kd contra 0X40 humana (SEQ ID NO:1) menor que aproximadamente 100 nM.
  19. 19. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo anti-OX40 de qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
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    6/7
  20. 20. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo anti-OX40 de qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
  21. 21. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico da reivindicação 20.
  22. 22. Célula hospedeira procariótica CARACTERIZADA pelo fato de que é transformada com o vetor da reivindicação 21.
  23. 23. Célula hospedeira eucariótica CARACTERIZADA pelo fato de que é transformada com o vetor da reivindicação 21.
  24. 24. Célula hospedeira eucariótica CARACTERIZADA pelo fato de que é engenheirada para expressar o ácido nucleico da reivindicação 20.
  25. 25. Célula hospedeira eucariótica da reivindicação 23 ou 24 CARACTERIZADA pelo fato de que é uma célula hospedeira de mamífero.
  26. 26. Método de produção de um anticorpo anti-OX40, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) a cultura da célula hospedeira da reivindicação 23 ou da reivindicação 24 e (b) a recuperação do anticorpo anti-OX40.
  27. 27. Método de ativação do sistema imunológico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração a um paciente que necessita do mesmo do anticorpo anti-OX40 de qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou da composição farmacêutica de acordo com reivindicação 18.
  28. 28. Método de tratamento de um câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração a um paciente que necessita do mesmo do anticorpo anti0X40 de qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou da composição farmacêutica de acordo com reivindicação 19.
    Petição 870190055424, de 14/06/2019, pág. 107/122
    7/7
  29. 29. Método da reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é selecionado de câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer renal, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de pele e um tumor com evidência de deficiência no reparo de pareamentos errados do DNA.
  30. 30. Método da reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de pulmão é câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células não pequenas ou mesotelioma.
  31. 31 .Método da reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-OX40 é administrado como uma monoterapia.
  32. 32. Método da reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-OX40 é administrado de forma adjunta ou com outro agente comumente utilizado para tratar o câncer.
  33. 33. Método da reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-OX40 é administrado de forma adjunta ou com um anticorpo anti-PD-1.
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