CN109627339B

CN109627339B - 抗人pdl1抗体及其用途

Info

Publication number: CN109627339B
Application number: CN201910073699.7A
Authority: CN
Inventors: 刘志刚
Original assignee: Beijing Wisdomab Biotechnology Co ltd
Current assignee: BEIJING WISDOMAB BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109627339A

Abstract

本申请公开了结合人PDL1的抗体或其抗原结合部分，编码所述抗体或其抗原结合部分的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合部分的应用。

Description

抗人PDL1抗体及其用途

技术领域

本申请大体涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，涉及抗人PDL1抗体领域及其用途。本申请开发了新的抗人PDL1抗体，并提供了该抗体在预防或治疗PDL1介导的疾病中的用途。

背景技术

T细胞通过抗原特异性T细胞受体接受抗原递呈细胞呈递的抗原，启动激活过程，进而增殖分化为抗原特异性效应T细胞。抗原与T细胞受体的作用是T细胞激活的初级信号，决定了免疫反应的特异性，同时T细胞还需要T细胞和抗原递呈细胞之间的二级信号(即共刺激信号)来调节免疫反应水平或实现对自身抗原的耐受。通过抗原递呈细胞表面分子和T细胞表达的特异性受体传递共刺激信号(包括激活信号和抑制信号)。B7-1/B7-2-CD28/CTLA4通路是研究较多的共刺激信号通路，对T细胞激活或耐受具有重要作用，其中CD28共刺激信号介导T细胞激活，CTLA4免疫检查点介导T细胞抑制，二者之间存在精妙平衡。PDL1-PD1是一条抑制活性通路，该通路强化了免疫检查点维持自身耐受的作用。对于肿瘤免疫而言，CTLA-4信号在淋巴结T细胞反应早期调节T细胞活性，而PD1则是在肿瘤生长后期限制肿瘤微环境中的T细胞活性，一些恶性肿瘤细胞通过高表达共抑制配体PDL1，使得肿瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞失能。

PDL1也被称为B7-H1，与B7-1/B7-2是同源分子，但不与ICOS、CD28或CTLA4作用。PDL1表达于B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突细胞和肥大细胞等免疫细胞上，也在胰岛细胞、肝Kupffer细胞、血管内皮细胞和一些上皮细胞等非免疫细胞上表达，并且在多种恶性实体肿瘤和血液肿瘤的癌细胞或肿瘤微环境免疫细胞中表达上调。40％-100％的黑色素瘤、35％-95％的NSCLC、68％-100％的鼻咽癌以及17％-94％的淋巴瘤患者高表达PDL1。PDL1属于B7家族蛋白，是一种53kD的I型跨膜糖蛋白，胞外区有IgV和IgC结构域，胞内区有30个氨基酸残基，没有明显的信号结构域，但存在一个蛋白激酶C磷酸化位点。

PD1是免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，全长288个氨基酸残基，N端是单一的IgV样结构域，约20个氨基酸残基的茎结构将IgV结构与细胞膜隔开，C端是跨膜区和胞内区。PD1与CD28、ICOS和CTLA-4同源性高，胞外区结构相似，属于CD28家族成员，但CD28、CTLA-4和ICOS的胞内区有src同源结构域(SH2)结合基序(YxxM)，而PD1胞内区有两个活性结构域，靠近N端的序列(VDYGEL)构成免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-basedinhibition motif,ITIM)，通过其募集含SH2的磷酸酶；靠近C端的序列TEYATI构成免疫受体酪氨酸开关基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif,ITSM)，执行PD1的抑制功能。PD1与CD28家族成员的另一个区别是细胞表面的CD28、CTLA-4和ICOS是二聚体，而PD1以单体形式存在。PD1表达于树突细胞(DC)、B细胞、激活的T细胞(CD4⁺和CD8⁺)以及自然杀伤细胞(NK)。C57BL/6小鼠缺失PD1导致慢性进行性狼疮样肾小球肾炎和关节炎；Balb/c小鼠缺失PD1导致严重的扩张型心肌病、胃炎、高水平血清肌钙蛋白IgG1等自身免疫疾病。

PD1通过ITSM结构域与T细胞受体临近的含SHP-2结构域的蛋白酪氨酸激酶作用，抑制T细胞受体临近激酶的激活，导致Lck介导的TCR CD3ζ链磷酸化下调，抑制T细胞受体下游阳性信号分子PI3K/Akt激活。PDL1/PD1对另一个重要的信号途径Ras/MEK/Erk通路也有抑制作用。通过对以上信号通路的抑制，PDL1/PD1抑制T细胞增殖，降低炎性细胞因子IFNγ和IL2等的分泌。因此，PDL1/PD1信号负向调节T细胞反应，在免疫系统中具有至关重要的作用。肿瘤细胞表面表达PDL1有助于促进肿瘤浸润淋巴细胞耗竭和失能，刺激向肿瘤微环境中分泌免疫抑制细胞因子，刺激Treg细胞功能，保护肿瘤细胞不被特异的细胞毒T细胞裂解，逃逸免疫反应。

基于临床需求，探索和研发可以抑制PDL1分子的功能，通过提高T细胞活性治疗疾病特别是肿瘤的药物具有重要的生物学和医学意义。

发明概述

第一方面，本申请提供了一种结合人PDL1的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中

所述HCDR1氨基酸序列为GFNFTDS，所述HCDR2氨基酸序列为SPYGGS，所述HCDR3氨基酸序列为RHWPGGFNF，所述LCDR1氨基酸序列为RASQDIHNWLN，所述LCDR2氨基酸序列为GASTLQS，所述LCDR3氨基酸序列为QQGHSTPPT；或者

所述HCDR1氨基酸序列为GFTFSDS，所述HCDR2氨基酸序列为SPFGGS，所述HCDR3氨基酸序列为RHWPGGFDF，所述LCDR1氨基酸序列为RASQDIHNWLN，所述LCDR2氨基酸序列为GASTLQS，所述LCDR3氨基酸序列为QQGHSTPPT；或者

所述HCDR1氨基酸序列为GFNFTDS，所述HCDR2氨基酸序列为SPYGGS，所述HCDR3氨基酸序列为RHWPGGFNF，所述LCDR1氨基酸序列为RASQNVRNYLN，所述LCDR2氨基酸序列为SASSRPS，所述LCDR3氨基酸序列为QQEWHVPMT；或者

所述HCDR1氨基酸序列为GFTFSDS，所述HCDR2氨基酸序列为SPFGGS，所述HCDR3氨基酸序列为RHWPGGFDF，所述LCDR1氨基酸序列为RASQNVRNYLN，所述LCDR2氨基酸序列为SASSRPS，所述LCDR3氨基酸序列为QQEWHVPMT；

其中HCDR和LCDR氨基酸序列根据Chothia定义。

在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17或者18所示。

在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19或者20所示。

在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:17所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

第二方面，本申请提供了一种结合人PDL1的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:17或者18中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:19或者20中任何一项具有至少90％的一致性。

在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段或单链Fv片段(scFv)。

在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全人源抗体。

在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。

在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。

在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能抑制PD1与PDL1的结合。

在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能促进T细胞激活。

第三方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合部分。

第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗PDL1介导的疾病。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤为黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、白血病或晚期实体瘤。

第五方面，本申请提供了第一方面或第二方面所述的抗体在制备用于预防或治疗PDL1介导的疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

第六方面，本申请提供了预防或治疗PDL1介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面或第二方面所述的抗体或第四方面所述的药物组合物。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

附图说明

图1显示ELISA分析抗人PDL1单克隆抗体抑制PD1与PDL1结合的能力。

图2显示ELISA分析不同抗人PDL1单克隆抗体抑制PD1与PDL1结合的能力。

图3显示ELISA分析不同抗人PDL1单克隆抗体与不同种属PDL1的结合能力。

图4显示不同抗PDL1单克隆抗体的生物活性检测结果。

序列说明

SEQ ID NO:1显示人(homo sapiens)PDL1胞外区(hPDL1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2显示小鼠(mus musculus)PDL1胞外区(mPDL1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3显示恒河猴(Macaca mulatta)PDL1胞外区(mmPDL1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4显示人(homo sapiens)PD1胞外区(hPD1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5显示His标签(His)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6显示小鼠(mus musculus)抗体的Fc段(mFc1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7显示人(homo sapiens)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8显示人(homo sapiens)IgG2亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9显示人(homo sapiens)IgG4亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10显示人(homo sapiens)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11显示人(homo sapiens)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12显示重组抗人PDL1对照抗体MEDI4736的重链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO:13显示重组抗人PDL1对照抗体MEDI4736的轻链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO:14显示重组抗人PDL1对照抗体MPDL3280A的重链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO:15显示重组抗人PDL1对照抗体MPDL3280A的轻链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO:16显示重组抗人PDL1抗体S3D6的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17显示重链可变区突变体H4A11的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18显示重链可变区突变体H5F4的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19显示轻链可变区突变体L1B1的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20显示轻链可变区突变体L2G2的氨基酸序列。

发明详细描述

本申请的发明人通过抗体工程技术得到了新的抗人PDL1抗体。在本申请的多个方面，提供了新的抗人PDL1抗体或其抗原结合片段，编码该抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用。根据本申请提供的抗体的可变区的序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于治疗临床上由PDL1介导的疾病。

除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。

除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

定义

如本文所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。标靶包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。

通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链变异区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。

如本文所用术语“抗原结合片段或抗原结合部分”，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Chothia定义和kabat定义。(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Chothia定义或者Kabat定义来确定VH和VL序列中的CDR序列。在本申请的实施方案中，利用Chothia定义CDR序列。

对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列的中CDR序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。

抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')₂片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scFv)₂，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。

如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。

如本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。

本文所用术语“肿瘤”指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶性的。

如本文所用术语“恶性肿瘤”是指或描述哺乳动物的生理条件，其典型的特征在于不受调控的细胞生长。示例性恶性肿瘤包括：癌、实体瘤、黑素瘤肉瘤、血液肿瘤、生殖细胞瘤和胚细胞瘤。恶性肿瘤的更多具体实例包括：肾癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌的肺癌，膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，肝癌(hepatic carcinoma)，包括胃肠癌的胃癌，前列腺癌，胰腺癌，腹膜癌，肝细胞癌，成胶质细胞瘤，卵巢癌，肝癌(livercancer)，尿路癌，肝细胞瘤，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)，外阴癌，甲状腺癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，脑癌及头颈癌以及相关转移灶。

如本文所用术语“血液肿瘤”是指由于异常细胞的生长增殖不受控制引起的，在多数情况下这些不正常的细胞的起源部位是骨髓，这也正是血液细胞产生的地方。示例性血液肿瘤包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。血液肿瘤的更多具体实例包括：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞白血病、幼年型粒-单核细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、伯基特白血病和成人T细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、原发性巨球蛋白血症(

macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、赛谢综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特指型外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。

如本文所用术语“白血病”为血液或骨髓的恶性肿瘤，特征在于白细胞的异常增多。白血病是广义术语，其涵盖了一系列疾病。因此，白血病是更广泛的称为血液肿瘤的疾病种类的一部分。白血病细分为多个大类；第一种分类是白血病的急性和慢性形式。急性白血病的特征在于未成熟的血细胞数量的快速增长。由于这些细胞的积聚使得骨髓不能制造健康的血细胞。慢性白血病的特征在于相对成熟、但仍为异常的白细胞的过度产生。通常通过数月或数年的发展，所述细胞的产生速率大大高于正常细胞，导致血液中有很多的异常白细胞。白血病也可以通过受累的血细胞进行细分。这样的分界将白血病划分为成淋巴细胞或淋巴细胞白血病和骨髓性(myeloid)或骨髓性(myelogenous)白血病。在成淋巴细胞或淋巴细胞白血病中，癌变发生在通常继续形成淋巴细胞的骨髓细胞类型中。在骨髓性(myeloid)或骨髓性(myelogenous)白血病中，癌变发生在通常继续形成红细胞、一些其他类型的白细胞和血小板的骨髓细胞类型中。结合这两种分类提供了总共四种主要类别。在这四种主要分类的每一种中，通常有一些亚类别。还存在分类方案之外的罕见类型。示例性的白血病包括：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞白血病、幼年型粒-单核细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、伯基特白血病和成人T细胞性白血病。

如本文所用术语“实体瘤”是指可通过临床检查如X线摄片、CT扫描、B超或触诊扪及到的有形肿块。临床上诊治过的实体瘤分恶性和良性两种。恶性实体瘤包括：儿童霍奇金淋巴瘤：淋巴细胞为主型、结节硬化型、混合细胞型、淋巴细胞消减型；儿童非霍奇金淋巴瘤：前淋巴母细胞淋巴瘤、小无裂细胞淋巴瘤(伯基特/非伯基特淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤等；儿童肾脏肿瘤：肾母细胞瘤(Wilms瘤)、肾透明细胞癌、肾横纹肌样瘤、肾透明细胞肉瘤、肾原始神经外胚叶瘤等；儿童神经母细胞瘤：神经母细胞瘤、节细胞神经母细胞瘤、节细胞神经瘤；儿童颅外生殖细胞瘤：成熟畸胎瘤、未成熟畸胎瘤、内胚窦瘤(卵黄囊瘤)、精原细胞瘤、无性细胞瘤、绒毛膜上皮癌、胚胎癌等；骨肉瘤及软骨肉瘤；儿童横纹肌肉瘤：胚胎型、腺泡型、多形型等；儿童软组织肉瘤：纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、恶性神经鞘瘤、腺泡状软组织肉瘤、上皮样肉瘤、透明细胞肉瘤、恶性黑色素瘤、滑膜肉瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤等；尤文氏家族肉瘤：尤文氏肉瘤、原始神经外胚叶瘤；儿童肝脏肿瘤：肝母细胞瘤(胚胎型、胎儿型、未分化型)、肝细胞癌；视网膜母细胞瘤；其他肿瘤：后颅窝髓母细胞瘤、鼻咽癌、甲状腺乳头状癌、胸腺瘤、肺母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰岛细胞瘤、回盲部类癌、间皮瘤等。良性实体瘤包括：淋巴管瘤、血管瘤、甲状舌管囊肿等。

其中HCDR和LCDR氨基酸序列根据Chothia定义。

在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:SEQ IDNO:17或者18所示。

在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:SEQ IDNO:19或者20所示。

在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；或者

在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述重链恒定区为IgG1亚型或IgG4亚型。

在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述中的一种或多种：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。

在一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。

在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。

在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

在其他方面，本申请还提供编码本发明抗体或其轻链或重链的分离的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞以及产生所述抗体的方法。在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。在一些实施方案中，产生抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中，产生抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收抗体。

此外，本文所述的特异性结合人PDL1的抗体也可用于检测生物样品中PDL1的存在。基于抗体的检测方法在本领域是众所周知的，并且包括例如ELISA、免疫印迹、放射免疫试验、免疫荧光、免疫沉淀以及其它相关技术。

应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。

实施例

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。

实施例1：重组蛋白的制备

制备抗PDL1单克隆抗体的过程中用到多种不同的重组蛋白，包括人PDL1胞外区(hPDL1，SEQ ID NO:1)、小鼠PDL1胞外区(mPDL1，SEQ ID NO:2)、恒河猴PDL1胞外区(mmPDL1，SEQ ID NO:3)、人PD1胞外区(hPD1，SEQ ID NO:4)以及重组抗体。这些蛋白具有大量的翻译后修饰(如糖基化或者二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统更有利于保持重组蛋白的结构和功能。此外，为了方便纯化，非抗体类的重组蛋白在C端添加了His标签(His，SEQ ID NO:5)或者鼠抗体的Fc段(mFc1，SEQ ID NO:6)。在制备重组抗体时，抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO:7)、IgG2亚型(SEQ ID NO:8)或者IgG4亚型(SEQ IDNO:9)，抗体轻链恒定区可以是人κ亚型(SEQ ID NO:10)或λ亚型(SEQ ID NO:11)。

根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重组蛋白的基因(包含His标签或者mFc编码基因)。利用分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或者其他阳离子转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。

His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。mFc1融合表达的重组蛋白和重组抗体用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS缓冲液(pH7.2)或者其他合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。

实施例2：利用噬菌体呈现抗体库技术筛选抗人PDL1单克隆抗体

以实施例1制备的重组hPDL1-His(以下简写为PDL1-His)为抗原，利用固相筛选策略筛选呈现人单链抗体库的噬菌体(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例1)，最终获得一株特异性结合人PDL1的全人源单链抗体S3D6(全长序列如SEQID NO:16所示)。

将编码S3D6的轻链和重链氨基酸的核苷酸序列克隆至真核表达载体，制备重组人IgG4-κ形式全人源抗体S3D6，同时制备对照抗体MPDL3280A(Roche开发的抗人PDL1抗体，其重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15)作为阳性对照。

用重组蛋白PD1-Fc包被96孔板(5μg/ml，100μl/孔)，4℃包被过夜。然后用含有50nM重组蛋白PDL1-mFc1的PBST-2％奶粉对S3D6和MPDL3280A抗体蛋白进行梯度稀释。抗体的起始浓度均为70nM，前6个点浓度按照3:4的比例稀释(浓度分别为：70nM、52.5nM、39.4nM、29.5nM、22.1nM和16.6nM)，后4个点按照1:1的比例稀释(浓度分别为：8.3nM、4.2nM、2.1nM和1.0nM)。利用HRP山羊抗鼠IgG(中杉金桥，ZB-2304)检测PD1与PDL1的结合信号，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。ELISA分析结果(图1)显示，S3D6能够有效抑制PD1与PDL1间的结合，其IC₅₀值见表1。

表1.PDL1单克隆抗体抑制PD1与PDL1结合的IC₅₀值

利用NCBI网站在线工具IGBLAST对S3D6的轻重链可变区氨基酸序列进行同源性分析，结果显示S3D6的VH来自IGHV3-23,S3D6的VL来自IGKV1-39。

利用轻链置换和重链CDR突变的策略对S3D6单抗进行体外亲和力成熟(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号)，最终获得多株亲和力提高的抗人PDL1的单克隆抗体，具体氨基酸序列信息如表2所示。

表2.亲和力成熟的抗人PDL1的单克隆抗体的相关信息

实施例3：抗人PDL1单克隆抗体竞争PD1结合PDL1

分析不同抗人PDL1单克隆抗体抑制PDL1和PD1结合的能力：H4A11+L1B1、H4A11+L2G2、H5F4+L1B1、H5F4+L2G2以及两种对照抗体MEDI4736(Medimmune开发的抗人PDL1抗体，其重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13)和MPDL3280A。

利用重组PD1-Fc包被ELISA板(5μg/ml)，然后用含有2.5μg/ml(50nM)PDL1-mFc1的PBST-2％牛奶分别对各种单克隆抗体进行系列稀释。单克隆抗体的起始浓度均为70nM，前6个点浓度按照3:4的比例稀释(浓度分别为：70nM、52.5nM、39.4nM、29.5nM、22.1nM和16.6nM)，后4个点浓度按照1:1的比例稀释(浓度分别为：8.3nM、4.2nM、2.1nM和1.0nM)。利用HRP山羊抗鼠IgG检测PD1与PDL1的结合信号，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图(图2和表3)。数据显示，四种抗人PDL1单克隆抗体(H4A11+L1B1、H4A11+L2G2、H5F4+L1B1和H5F4+L2G2)均能够有效抑制PD1与PDL1的结合，且结合能力与对照抗体(MEDI4736和MPDL3280A)相当。其中，H4A11+L1B1、H4A11+L2G2、H5F4+L2G2以及两种对照抗体MEDI4736和MPDL3280A的重链恒定区为IgG4亚型，H5F4+L1B1的重链恒定区为IgG1亚型。

表3.不同抗PDL1单克隆抗体抑制PD1与PDL1结合的IC₅₀值

实施例4：抗PDL1单克隆抗体的亲和力测定

利用Biacore X100测定不同抗PDL1单克隆抗体(H4A11+L1B1、H4A11+L2G2、H5F4+L1B1、H5F4+L2G2以及两种对照抗体MEDI4736和MPDL3280A)的亲和力。氨基偶联试剂盒、人抗体捕获试剂盒、CM5芯片和pH7.4的10×HBS-EP等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。根据试剂盒中的说明书，使用氨基偶联的方法将抗人Fc段的抗体偶联至CM5芯片表面，然后稀释抗体蛋白至合适浓度(1-10μg/ml)，保证150RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。将人PDL1-His设置一系列的浓度梯度(100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.23nM)流经固定相表面，用3M的MgCl₂对芯片表面进行再生，25℃测定各单克隆抗体的亲和力。使用Biacore X100评估软件2.0.1版对Biacore数据进行分析，拟合结果如表4所示。其中，H4A11+L1B1、H4A11+L2G2、H5F4+L2G2以及对照抗体MEDI4736的重链恒定区为IgG4亚型，H5F4+L1B1和MPDL3280A的重链恒定区为IgG1亚型。

表4.不同抗人PDL1单克隆抗体结合PDL1-His的亲和力常数

	Kon	Koff	KD
				IgG4-MEDI4736	1.001E+6	3.299E-4	3.295E-10
IgG1-MPDL3280A	1.012E+6	3.755E-4	3.712E-10
				IgG4-H4A11+L1B1	2.204E+5	1.083E-3	4.915E-9
IgG4-H4A11+L2G2	5.537E+5	6.258E-4	1.13E-9
				IgG1-H5F4+L1B1	1.106E+6	1.931E-3	1.746E-9
IgG4-H5F4+L2G2	7.153E+5	2.821E-4	3.944E-10

实施例5：抗PDL1单克隆抗体种属交叉分析

用制备的人PDL1(hPDL1)、恒河猴PDL1(mm PDL1)和小鼠PDL1(m PDL1)分别包被96孔ELISA板(1.5μg/ml，100μl/孔)，同时将10％的BSA作为无关对照，4℃包被过夜。利用封闭液(2％牛奶-PBST)在37℃封闭1小时后，分别加入各重组抗PDL1单克隆抗体(H4A11+L1B1、H4A11+L2G2、H5F4+L1B1、H5F4+L2G2以及两种对照抗体MEDI4736和MPDL3280A)，37℃结合1小时。用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入HRP鼠抗人IgG，37℃结合1小时。用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H₂SO₄终止显色，在酶标仪492nm/630nm双波长下测定光密度值。ELISA分析结果(图3)显示，四种重组抗PDL1单克隆抗体(H4A11+L1B1、H4A11+L2G2、H5F4+L1B1和H5F4+L2G2)均能特异性识别人PDL1，并且均和猴PDL1、鼠PDL1存在交叉反应。其中，H4A11+L1B1、H4A11+L2G2、H5F4+L2G2以及两种对照抗体MEDI4736和MPDL3280A的重链恒定区为IgG4亚型，H5F4+L1B1的重链恒定区为IgG1亚型。

实施例6：抗PDL1单克隆抗体对T细胞激活的作用

基于两种细胞系CHO-PDL1-CD3L细胞系及Jurkat-PD1-NFAT细胞系进行抗PDL1单克隆抗体促进T细胞激活的生物活性分析。CHO-PDL1-CD3L细胞系可以稳定表达PDL1分子和抗CD3-scFv，作为靶细胞；Jurkat-PD1-NFAT细胞系可以稳定表达PD1分子和荧光素酶(Luciferase)，荧光素酶基因受NFAT元件(转录因子)调控(IL-2启动子)，作为效应细胞。PD1与PDL1的结合可以抑制Jurkat-PD1-NFAT细胞中荧光素酶的表达；当加入抗PD-1/PDL1抗体时，PD1与PDL1结合介导的抑制效应减弱，荧光素酶可以表达，从而检测到荧光信号。将CHO-PDL1-CD3L细胞提前一天接种在96孔板中，细胞密度为2*10⁴个细胞/孔，设置抗体起始浓度为10μg/ml，2倍稀释，共10个梯度；Jurkat-PD1-NFAT细胞按照1*10⁵个细胞/孔接种在相应的孔中，效靶比为5:1，孵育6h后进行检测，结果如表5和图4所示，H5F4+L2G2、H5F4+L1B1和H4A11+L2G2与对照抗体(MEDI4736和MPDL3280A)激活CHO-PDL1-CD3L及Jurkat-PD1-NFAT系统的能力相当，H4A11+L1B1的活性较弱。其中，H4A11+L1B1、H4A11+L2G2、H5F4+L2G2以及对照抗体MEDI4736的重链恒定区为IgG4亚型，H5F4+L1B1和MPDL3280A的重链恒定区为IgG1亚型。

表5.抗PDL1单克隆抗体激活CHO-PDL1-CD3L及Jurkat-PD1-NFAT系统的EC₅₀值

序列表

<110> 北京百特美博生物科技有限公司

<120> 抗人PDL1抗体及其用途

<160> 20

<170> CNIPASequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg

210 215 220

<210> 2

<211> 221

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 2

Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile Gln

35 40 45

Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn Phe Arg

50 55 60

Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Cys Cys

85 90 95

Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Val Asp Pro Ala

115 120 125

Thr Ser Glu His Glu Leu Ile Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Glu Ala

130 135 140

Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly Lys Arg

145 150 155 160

Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val Thr Ser

165 170 175

Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe Tyr Cys Thr Phe

180 185 190

Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro

195 200 205

Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His

210 215 220

<210> 3

<211> 220

<212> PRT

<213> 恒河猴(Macaca mulatta)

<400> 3

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Ile

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg

210 215 220

<210> 4

<211> 150

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val

145 150

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ser Gly Ala Ala His His His His His His

1 5 10

<210> 6

<211> 234

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 6

Ala Ser Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

20 25 30

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

50 55 60

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

65 70 75 80

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

85 90 95

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

100 105 110

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

115 120 125

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

130 135 140

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

145 150 155 160

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

165 170 175

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

180 185 190

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

195 200 205

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

225 230

<210> 7

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 8

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 9

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 11

<211> 105

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 12

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 15

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 16

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Thr Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

145 150 155 160

Ser Ile Asn Thr Gly Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu

210 215 220

Trp Arg Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 17

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Thr Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Trp

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Trp His Val Pro Met

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种结合人PDL1的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中

其中HCDR和LCDR氨基酸序列根据Chothia定义。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:17或者18所示。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:19或者20所示。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；或者

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中

所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段或单链Fv片段(scFv)；和/或

所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区；和/或

所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。

7.根据权利要求5所述的抗体，其中所述抗体为全人源抗体。

8.根据权利要求5所述的抗体，其中所述重链恒定区为IgG1亚型或IgG4亚型。

9.核酸分子，其编码权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

10.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

11.权利要求1-8中任一项所述的抗体在制备用于治疗PDL1介导的肿瘤的药物中的用途，其中所述肿瘤为黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、白血病或晚期实体瘤。