RS60664B1 - Anti-ox40 antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-ox40 antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS60664B1
RS60664B1 RS20200923A RSP20200923A RS60664B1 RS 60664 B1 RS60664 B1 RS 60664B1 RS 20200923 A RS20200923 A RS 20200923A RS P20200923 A RSP20200923 A RS P20200923A RS 60664 B1 RS60664 B1 RS 60664B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
human
antibodies
cells
seq
Prior art date
Application number
RS20200923A
Other languages
English (en)
Inventor
Fiona A Harding
Original Assignee
Abbvie Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbvie Biotherapeutics Inc filed Critical Abbvie Biotherapeutics Inc
Publication of RS60664B1 publication Critical patent/RS60664B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
1. UPUĆIVANJE NA SRODNE PRIJAVE
[0001] Ova prijava zahteva prioritet pod 35 U.S.C. § 119(e) iz Američke Privremene prijave br. 62/434,761, podnete 15. decembra 2016.
2. LISTA SEKVENCI
[0002] Sadašnja prijava sadrži listu sekvenci koja je elektronski podneta u ASCII formatu i ovde je uključena referencom u celosti. Navedena ASCII kopija, kreirana 30. oktobra 2017. godine je nazvana 381493-368WO_SL.txt i veličine je 97,999 bajtova.
3. OBLAST TEHNIKE
[0003] Predmetna prijava odnosi se, između ostalog, na nova anti-OX40 antitela, preparate koji uključuju antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju antitela i metode njihove izrade i upotrebe.
4. POZADINA
[0004] Lečenje kancera obuhvata širok spektar terapijskih pristupa, uključujući hirurgiju, radijacionu i hemoterapiju. Iako različiti pristupi omogućavaju medicinskom praktičaru dostupnost širokog terapijskog izbora u lečenju kancera, postojeći terapeutici nose brojne nedostatke, kao što su nedostatak selektivnosti ciljanja kancerogenih ćelija nad normalnim, zdravim ćelijama i razvoj rezistencije karcinoma prema lečenju.
[0005] Nedavni pristupi zasnovani na ciljanim terapeuticima, koji preferencijalno interferiraju sa ćelijskim procesima kancerogenih ćelija u odnosu na normalne ćelije, doveli su do hemoterapijskih režima sa manje neželjenih efekata u poređenju sa terapijama koje nisu ciljane, kao što je lečenje zračenjem.
[0006] Imunoterapija kancera se pojavila kao obećavajući terapijski pristup koji će upotpuniti postojeće standarde nege. Videti, na primer, Miller, et al. Cancer Cell, 27, 439-449 (2015).
Takvi imunoterapijski pristupi uključuju, razvoj antitela koja se koriste za modulaciju imunskog sistema za uništavanje malignih ćelija.
[0007] Lečenjem sa biološkim lekovima pojačani su anti-tumorski imunološki odgovori kod pacijenata sa čvrstim tumorima. Na primer, postoje dva odobrena i na tržištu prisutna monoklonska antitela protiv PD-1: nivolumab (OPDIVO®) i pembrolizumab (KEYTRUDA®), odobrena u Americi i Evropskoj uniji, za lečenje bolesti kao što su neresektabilni ili metastatski melanom i metastatski karcinom pluća koji nije sitnoćelijski. Lečenje pacijenata sa ovim agensima je rezultiralo antitumorskim odgovorima sa izmerenim poboljšanjem, bilo preživljavanjem bez progresije i / ili ukupnim preživljavanjem.
[0008] Nedavni neuspeh OPDIVO® da uspori progresiju uznapredovalog karcinoma pluća u lečenju populacije naivnih pacijenata u kliničkom ispitivanju, upoređujući OPDIVO® sa konvencionalnom hemoterapijom naglašava potrebu za alternativnim pristupima i dodatnim tretmanima raka da bi se upotpunili postojeći terapijski standardi nege.
[0009] WO2016/073380 opisuje agonistička anti-OX40 antitela 1A7, 3C8, i 1D2 i njihovu upotrebu za lečenje raka. WO2012/027328 opisuje agonistička anti-OX40 monoklonska antitela 106-222 i 119-122 i njihovu upotrebu za lečenje raka.
5. SAŽETAK
[0010] Sadašnji pronalazak obezbeđuje anti-OX40 antitela koja se specifično vezuju i aktiviraju OX40. Aminokiselinske sekvence primernih regiona za određivanje komplementarnosti (CDR-a), regiona varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL) (tj. VHi VLlanci, respektivno), i teški i laki lanci primernih anti-OX40 antitela su obezbeđeni niže u detaljnom opisu. Ovde obezbeđena anti-OX40 antitela rezultiraju aktiviranjem adaptivnog imunološkog odgovora.
[0011] Antitela protiv OX40, mogu da uključuju modifikacije i / ili mutacije koje menjaju svojstva antitela, kao što su povećanje poluživota, povećanje ili smanjenje ćelijske citotoksičnosti zavisne od antigena (ADCC), kao što je poznato u tehnici.
[0012] Ovde su obezbeđene nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju anti-OX40 antitela iz pronalaska, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Pored toga, ovde su obezbeđene prokariotske i eukariotske ćelije domaćina transformisane vektorom koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira otkriveno antitelo protiv OX40, kao i eukariotske (poput sisarskih) ćelija domaćina konstruisanih da izražavaju nukleotidne sekvence. Takođe su obezbeđeni postupci za proizvodnju antitela, kultivisanjem ćelija domaćina i obnavljanjem antitela, koji su dalje razmotreni niže u detaljnom opisu.
[0013] U drugom aspektu, sadašnji pronalazak obezbeđuje preparate koji uključuju ovde opisana anti-OX40 antitela. Preparati uglavnom sadrže jedno ili više antitela protiv OX40 kao što je ovde opisano, i jedan ili više ekscipijenasa, nosača ili razblaživača.
[0014] Sadašnji pronalazak obezbeđuje metode lečenja subjekata, kao što su ljudi, kojima je dijagnostikovan čvrsti tumor, sa anti-OX40 antitelom. Metoda obično uključuje, primenu kod subjekta izvesne količine anti-OX40 antitela, ovde opisanih, za obezbeđivanje terapijske koristi. Subjektu se može dijagnostikovati bilo koji od niza čvrstih tumora koji mogu biti novo dijagnostikovani, recidivi ili recidivi i refraktorni. Antitelo protiv OX40, može biti primenjeno u obliku intravenske infuzije jednom na svake dve nedelje.
[0015] Antitela protiv OX40, mogu biti primenjivana u obliku pojedinačnih terapeutskih agenasa (monoterapija) ili dodatno sa ili sa drugim terapeutskim agensima, tipično, ali ne nužno, onim koji se koriste za lečenje čvrstog tumora. Terapijski agensi će obično biti korišćeni pri njihovoj odobrenoj dozi, načinu primene i učestalošću primene.
[0016] Antitela protiv OX40 mogu biti primenjena različitim putevima ili načinima primene, uključujući, ali ne ograničavajući se na, intravensku infuziju i/ili injekciju i intratumoralnu injekciju. Primenjena količina će zavisiti od načina primene, rasporeda doziranja, tipa kancera koji se leči, stadijuma kancera koji se leči i drugih parametara, kao što su starost i težina pacijenta, kao što je dobro poznato u tehnici.
6. KRATAK OPIS SLIKA
[0017] SL.1A-1D prikazuju funkcionalnu aktivaciju humanih T ćelija in vitro, nakon tretmana sa anti-OX40 antitelom Hu3738 iz primera. SL. 1A prikazuje proliferaciju humanih CD4<+>T ćelija periferne krvi nakon tretmana sa anti-OX40 antitelom Hu3738, ili antitelom 11D4 ili 18D8 iz literature. SL.1B prikazuje povećanje proizvodnje gama interferona (IFN-γ) od strane humanih CD4+ T ćelija nakon tretmana sa anti-OX40 antitelom Hu3738, ili literaturnim antitelom 11D4 ili 18D8. SL.1C prikazuje proliferaciju humanih CD4<+>T ćelija periferne krvi nakon tretmana sa Hu3738 ili antitelom 1A7 iz literature. SL.1D prikazuje porast proizvodnje IFN-γ od strane humanih CD4+ T ćelija nakon tretmana sa Hu3738, ili antitelom 1A7 iz literature.
[0018] SL.2A-2B pokazuju efekat anti-OX40 antitela Hu3738 iz primera, na in vitro supresiju posredovanu humanim T regulatornim (Treg) ćelijama. Ispitivanje Treg supresije je postavljeno korišćenjem dva različita odnosa CD4<+>/CD25<->T ćelija odgovora (Tresp) prema CD4<+>/CD25<+>/CD127low T regulatornim ćelijama (Treg). Zrna reagensa za nadgledanje Treg supresije (Insp) su dodata u bazenčiće za kulturu, pri odnosu između zrna i ćelije od 1: 1 za stimulaciju. Jasan bar predstavlja proliferaciju Tresp ćelija u prisustvu Insp. Anti-OX40 i humana IgG1antitela za kontrolu izotipa su ispitivana u triplikatu, pri konačnoj koncentraciji od 10 µg/mL u odsustvu ili prisustvu reagensa za umrežavanje (F (ab’)2kozji anti-humani IgG, specifičan za Fc) u odnosu 1: 4. Ploče su se inkubirane na 37 ° C u 5% CO2tokom četiri dana. Dodat je 1 μCi/bazenčić<3>H-timidina i ploče su dalje inkubirane tokom dodatnih 16 sati. Grafikoni predstavljaju proliferaciju, kao što je prikazano u brojevima po minuti (cpm). SL.
2A prikazuje rezultate Tresp prema Treg u odnosu 2: 1; SL. 2B prikazuje rezultate Tresp sa Treg u odnosu 4: 1.
[0019] SL.3 prikazuje inhibiciju vezivanja primernog anti-OX40 antitela Hu3738 u prisustvu rastvorljivog humanog OX40 liganda (OX40L). Grafikon pokazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) nasuprot koncentracije OX40L (µg/mL). Humane Jurkat-ove ćelije koje eksprimiraju OX40 su zajedno obojene sa titracijom neobeleženog rastvorljivog OX40L i 0,2 µg/mL Hu3738 ili izotipskim kontrolnim antitelom.
[0020] SL.4A prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence humanog OX40 (SEK ID BR: 1) sa mišjim OX40 (SEK ID BR: 3). SL.4B prikazuje aktivnost vezivanja primernih anti-OX40 antitela Hu3738 na humane, mišje ili himerne humane-mišje molekule OX40, izražene na površini ćelije koje sadrže mišje domene bogate cisteinom (CRD) zamenjene za odgovarajuće humane regione. Humani OX40 je prikazan kao "293s-huOX40", himerni humani OX40 sa mišjim CRDI je prikazan kao "293s-huOX40-muCRDI," himerni humani OX40 sa mišjim CRDII je prikazan kao "293s-huOX40-muCRDII", himerni humani OX40 sa mišjim CRDIII je prikazan kao "293s-huOX40-muCRDIII," himerni humani OX40 sa mišjim CRDIV je prikazan kao "293s-huOX40-muCRDIV", himerni humani OX40 sa mišjim CRDII i mišjim CRDIII je prikazan kao "293s-huOX40-muCRDII III," i mišji OX40 je prikazan kao "293smuOX40. "
[0021] SL. 5 prikazuje kompetitivno vezivanje humanog OX40 na površine ćelije od strane anti-OX40 antitela Hu3738 iz primera ili antitela iz literature (11D4, 18D8, 106-222, 119-122 ili 1A7).
[0022] SL. 6A prikazuje aktivaciju NF-κΒ u humanim Jurkat-ovim reporterskim ćelijskim linijama transficiranim sa OX40, nakon tretmana sa anti-OX40 antitelom Mu3738 ili Hu3738 iz primera, ili literaturnim antitelom 11D4, 18D8, 106-222 ili 119-122, ili izotipskom kontrolom u odsustvu dodatnog unakrsnog veznika. SL. 6B prikazuje aktivaciju NF-κΒ u humanim Jurkat-ovim reporterskim ćelijskim linijama transficiranim sa OX40, nakon tretmana sa primernim anti-OX40 antitelom Hu3738, antitelom iz literature 1A7 ili izotipskom kontrolom u prisustvu ili odsustvu dodatog unakrsnog linkera.
[0023] SL.7 prikazuje antitumorsku aktivnost primernog anti-OX40 antitela Hu3738 u modelu humanog PC3 adoptivnog ćelijskog tumora kod NSG miševa.
[0024] SL. 8 prikazuje nivoe interleukina-8 (IL-8), faktora stimulacije granulocitnomakrofagnih kolonija (GM-CSF), faktora nekroze tumora alfa (TNF-α) i interferona-gama (IFN-γ) u humanim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) posredovane modelom bolesti grafta vs. domaćina (GVHD) kod NSG miševa, nakon tretiranja miševa sa 1 mg/ kg Hu3738 ili humanom IgG1izotipskom kontrolom jednom svakih 7 dana, za ukupno 4 doze.
7. DETALJAN OPIS
[0025] Sadašnji pronalazak se odnosi na antitela i njihove fragmente koji specifično vezuju OX40, preparate koji sadrže antitela, polinukleotide koji kodiraju antitela protiv OX40, ćelije domaćina sposobne da proizvode antitela, metode i preparate korisne za izradu antitela, i različite metode njihovog korišćenja.
[0026] Kao što će biti uvaženo od strane iskusnih stručnjaka, antitela i njihovi fragmenti su "modularne" prirode. Kroz pronalazak su opisane različite specifične realizacije različitih "modula" koji sadrže anti-OX40 antitela ili njihove vezujuće fragmente. Kao specifični neograničavajući primeri, opisane su različite specifične realizacije od varijabilnog domena teškog lanca (VH) regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), VHlanaca, varijabilnog domena lakog lanca (VL) CDR-a i VLlanaca. Nameravano je da sve specifične realizacije mogu biti kombinovane jedna sa drugom kao da je svaka specifična kombinacija izričito opisana pojedinačno.
7.1. Skraćenice
[0027] Antitela, fragmenti za vezivanje i polinukleotidi, ovde opisani, su u mnogim realizacijama opisani pomoću njihovih odgovarajućih polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci. Ukoliko nije drugačije naznačeno, obezbeđene su polipeptidne sekvence u N → C orijentaciji; polinukleotidne sekvence u 5 '→ 3' orijentaciji. Za polipeptidne sekvence mogu se koristiti konvencionalne skraćenice od tri ili jednog slova za genetski kodirane aminokiseline, kao što je navedeno u TABELI 1, ispod.
[0028] Određene sekvence su definisane strukturnim formulama koje specificiraju aminokiselinske ostatke koji pripadaju određenim klasama (npr., alifatične, hidrofobne, itd.). Različite klase kojima pripadaju genetski kodirane aminokiseline, kao što je ovde korišćeno, navedene su u Tabeli 2, niže. Neke aminokiseline mogu da pripadaju više klasa od jedne. Cisteinu, koji sadrži sulfhidrilnu grupu, i prolinu, koji je konformacijski ograničen, nisu dodeljene klase.
7.2. Definicije
[0029] Ukoliko nije drugačije ovde definisano, naučni i tehnički pojmovi koji se koriste u vezi sa sadašnjim pronalaskom imaće značenja koja su uobičajeno shvaćena od strane prosečnjog stručnjaka iz ove oblasti.
7.3. Anti-OX40 antitela i vezujući fragmenti
[0030] OX40 je ko-stimulatorni molekul koji ima kritičnu ulogu u poboljšanju nastalih imunoloških odgovora i istovremeno deluje na suzbijanje aktivnosti regulatornih T ćelija. OX40, takođe poznat kao CD134 ili receptor faktora nekroze tumora superfamilije 4 (TNFRSF4), je Tip 1 transmembranskog člana na površini ćelije iz superfamilije receptora faktora nekroze tumora (TNF), koji je prolazno izražen na nedavno aktiviranim T ćelijama i konstitutivno eksprimiran na aktiviranim T regulatornim ćelijama. Ekstracelularni domen za vezivanje liganda iz OX40 je sastavljen od tri domena bogata cisteinom (CRD) i četvrtog delimičnog CRD-a (CRDI, CRDII, CRDIII, i CRD IV, respektivno). Iako je primarno eksprimiran od strane aktiviranih CD4<+>T ćelija, OX40 može biti eksprimiran na B ćelijama, CD8<+>T ćelijama i ćelijama prirodnih ubica (NK) i prirodnih ubica T (NKT) nakon aktivacije. Takođe je objavljeno da su neutrofili eksprimirali OX40, a signalizacija preko OX40 na humanim neutrofilima inhibira apoptotičnu ćelijsku smrt. Ligand za OX40 (OX40L), takođe poznat kao ligand faktora tumorske nekroze superfamilije 4 (TNFSF4), CD252 ili glikoprotein 34 (gp34), ushodno je regulisan od strane aktiviranih ćelija koje predstavljaju antigen i B ćelija.
Vezivanje liganda za OX40 na T ćelijama aktiviranim antigenom rezultira nishodnom NF-κΒ translokacijom i aktivacijom puta AKT. Translokacija NF-κΒ dovodi do povećanja preživljavanja molekula kao što su Bcl-2, Bcl-XL i preživljavanja ćelija. Aktiviranje antitela usmerenih na OX40 je namenjeno delimično poboljšanju antigen-specifičnih imunoloških odgovora produženom aktivacijom i diferencijacijom T efektorskih ćelija.
[0031] Pored uticaja na T efektorske ćelije aktivirane antigenom, ciljanje OX40 izraženo pomoću T regulatornih ćelija takođe, može doprineti navodnom mehanizmu delovanja. T regulatorne ćelije izražavaju visoke nivoe OX40 unutar tumorskog mikrookruženja. Pokazano je da aktivacija OX40 utiče na supresivnu sposobnost T regulatornih ćelija i da dovodi do aktivnog trošenja OX40 pozitivnih T regulatornih ćelija iz tumorskog mikrookruženja.
[0032] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na antitela koja specifično vezuju OX40.
[0033] Kao što je ovde korišćen, izraz "antitelo" (At) se odnosi na molekul imunoglobulina koji se specifično vezuje za određeni antigen, ovde - OX40. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitela iz pronalaska se vezuju za humani OX40 (SEK ID BR: 1) (NCBI referentna sekvenca NP003318) i na taj način modulišu imuni sistem. Nastali odgovor imunskog sistema je citotoksičan za ćelije tumora. Antitela protiv OX40 sadrže regione za određivanje komplementarnosti (CDR-ove), takođe poznate kao hipervarijabilne regione, i u varijabilnim domenima lakog i teškog lanca. Delovi varijabilnih domena koji su više očuvani se nazivaju okvirnim (FR). Kao što je poznato u struci, položaj/granica aminokiseline koja ograničava hipervarijabilni region antitela može varirati, zavisno od konteksta i različitih definicija poznatih u tehnici. Neki položaji unutar varijabilnog domena se mogu posmatrati kao hibridni hipervarijabilni položaji u tome da se ovi položaji mogu smatrati da budu unutar hipervarijabilnog regiona pod jednim setom kriterijuma, dok se mogu smatrati da budu izvan hipervarijabilnog regiona pod različitim setom kriterijuma. Jedan ili više ovih položaja se mogu naći i u proširenim hipervarijabilnim regionima. Pronalazak obezbeđuje antitela koja sadrže modifikacije u ovim hibridnim hipervarijabilnim položajima. Svaki od varijabilnih domena nativnih teških i lakih lanaca sadrži četiri regiona FR, uglavnom usvajanjem konfiguracije β lista, povezanih sa tri CDR-a, koji obrazuju spajanjem petlje, a u nekim slučajevima čine deo strukture β-lista. CDR-ovi u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini regiona FR i, sa CDR-ovima iz drugog lanca, doprinose formiranju ciljnog mesta vezivanja antitela. Videti Kabat i sar., Sekvence proteina od imunološkog interesa (Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, Md. 1987). Kao što je ovde korišćeno, numerisanje aminokiselinskih ostataka imunoglobulina se vrši prema sistemu numerisanja imunoglobulinskih aminokiselinskih ostataka od strane Kabat i sar., osim ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0034] Antitela prema pronalasku mogu biti poliklonska, monoklonska, genetski konstruisana i / ili na neki drugi način modifikovana u prirodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na himerna antitela, humanizovana antitela i humana antitela. U nekim realizacijama, konstantni region je izotip izabran od: IgA (npr., IgA1ili IgA2), IgD, IgE, IgG (npr., IgG1, IgG2, IgG3ili IgG4) i IgM. U specifičnim realizacijama, anti-OX40 antitelo, ovde opisano, sadrži IgG1. U drugim realizacijama, anti-OX40 antitela sadrže IgG2ili IgG4. Kao što je ovde korišćeno, "konstantni region" antitela uključuje, prirodni konstantni region, alotipove ili prirodne varijante, kao što su D356E i L358M, ili A431G u humanom IgG1. Videti, npr., Jefferis i Lefranc, MAbs, 1 (4): 332-338 (jul-avg 2009).
[0035] Laki konstantni region anti-OX40 antitela, može biti kappa (κ) laki region ili lambda (λ) region. Laki region λ može biti bilo koji od poznatih podtipova, npr., λ1, λ2, λ3ili λ4. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži laki region kappa (κ).
[0036] Izraz "monoklonska antitela" kako se ovde koristi nije ograničen na antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma. Monoklonsko antitelo je izvedeno iz pojedinačnog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fagni klon, bilo kojim sredstvom dostupnim ili poznatim u stanju tehnike. Monoklonska antitela koja su korisna u ovom otkriću mogu se pripremiti korišćenjem širokog spektra tehnika poznatih u struci, uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantnih i tehnologija prikaza faga, ili kombinaciju istih. U mnogim upotrebama sadašnjeg pronalaska, uključujući in vivo upotrebu antitela protiv OX40 kod ljudi, mogu se koristiti himerna, humanizovana ili humana antitela.
[0037] Izraz "himerno" antitelo, kao što je ovde korišćeno se odnosi na antitelo koje ima varijabilne sekvence izvedene iz imunoglobulina koji nije humani, kao što su pacovsko ili mišje antitelo, i humane imunoglobulinske konstantne regione, tipično izabrane iz humanog imunoglobulinskog šablona. Postupci za proizvodnju himernih antitela su poznati u stanju tehnike. Videti npr., Morrison, 1985, Science 229 (4719): 1202-7; Oi i sar., 1986, BioTechniques 4: 214-221; Gillies i sar., 1985, J. Immunol. Metode 125: 191-202; Američki patenti br.5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397.
[0038] "Humanizovani" oblici nehumanih (npr., mišjih) antitela su himerni imunoglobulini koji sadrže minimalne sekvence izvedene iz nehumanog imunoglobulina. Uopšteno, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od najmanje jednog i tipično dva varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima iz imunoglobulina koji nije humani i svi ili suštinski svi regioni FR-a su oni iz humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo takođe, može da sadrži najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), tipično onog od konsenzusne sekvence humanog imunoglobulina. Postupci humanizacije antitela su poznati u stanju tehnike. Videti, npr., Riechmann i sar., 1988, Nature 332: 323-7; američki patenti br. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6,180,370 do Queen i sar.; EP239400; PCT publikaciju WO 91/09967; US patent br.5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka i sar., 1994, Prot. Eng.
7:805-814; Roguska i sar., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973; i američki patent br.
5,565,332.
[0039] "Humana antitela" uključuju, antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz biblioteka humanih imunoglobulina ili iz životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina i koje ne izražavaju endogene imunoglobuline. Humana antitela mogu biti izrađena različitim postupcima poznatim u tehnici, uključujući metode prikaza faga koristeći biblioteke antitela izvedene iz humanih imunoglobulinskih sekvenci. Videti Američke patente br.4,444,887 i 4,716,111; i PCT objave WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; i WO 91/10741. Humana antitela takođe, mogu biti proizvedena korišćenjem transgenih miševa koji nisu u stanju da eksprimiraju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu da eksprimiraju humane imunoglobulinske gene. Videti, npr., PCT publikacije WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Američki patenti br. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; i 5,939,598. Pored toga, kompanije poput LakePharma, Inc. (Belmont, CA) ili Creative BioLabs (Shirley, NY) mogu biti angažovane da obezbede humana antitela usmerena protiv izabranog antigena, koristeći tehnologiju sličnu gore opisanoj. Potpuno humana antitela koja prepoznaju odabrani epitop, mogu biti generisana korišćenjem tehnike koja se naziva "vođena selekcija". "U ovom pristupu, izabrano monoklonsko antitelo koje nije humano, npr., mišje antitelo, koristi se za usmeravanje selekcije kompletno humanog antitela koje prepoznaje isti epitop (videti, Jespers i sar., 1988, Biotechnology 12: 899-903) .
[0040] Takođe su razmatrani vezivni fragmenti antitela protiv OX40. Vezujući fragmenti prema pronalasku uključuju, one koji su sposobni za specifično vezivanje OX40. Primeri vezivnih fragmenata antitela uključuju, primera radi i bez ograničenja, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv fragmente, jednolančane Fv (scFv) fragmente i fragmente jednog domena.
[0041] Fab fragment sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodavanjem nekoliko ostataka na karboksilnom završetku CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. Fab’ fragmenti nastaju cepanjem disulfidne veze na spojnim cisteinima iz produkta digestije pepsina F(ab’)2. Dodatna hemijska spajanja fragmenata antitela su poznata onima koji su prosečni stručnjaci u ovoj oblasti. Fragmentima Fab i F(ab’)2nedostaje region fragmenta koji može kristalisati (Fc) iz netaknutog antitela, brže se odstranjuju iz cirkulacije životinja i mogu imati manje nespecifično vezivanje za tkiva od netaknutog antitela (videti npr. Wahl i sar., 1983, J. Nucl. Med.24:316).
[0042] Kao što je uobičajeno razumljivo u tehnici, "Fc" region je konstantni region kristališućeg fragmenta antitela koji ne sadrži antigen specifični vezivni region. Kod izotipova IgG, IgA i IgD antitela, Fc region je sastavljen od dva identična proteinska fragmenta, izvedena iz drugog i trećeg konstantnog domena (domena CH2 i CH3, respektivno) iz dva teška lanca antitela. IgM i IgE Fc regioni sadrže tri konstantna domena teškog lanca (domeni CH2, CH3 i CH4) u svakom polipeptidnom lancu.
[0043] "Fv" fragment je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto ciljnog prepoznavanja i vezivanja. Ovaj region se sastoji od dimera iz varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca u uskoj, nekovalentnoj asocijaciji (VH-VLdimer). U ovoj konfiguraciji, tri CDR-a svakog varijabilnog domena stupaju u interakciju kako bi definisali ciljno mesto vezivanja na površini VH-VLdimera. Često, šest CDR-ova daju antitelu specifičnost ciljnog vezivanja. Međutim, u nekim slučajevima čak i jedan promenljivi domen (ili polovina Fv koji sadrži samo tri CDR-a specifična za cilj) može imati sposobnost prepoznavanja i vezivanja cilja, mada sa nižim afinitetom od celog vezivnog mesta.
[0044] Vezujući fragmenti antitela "jednolančani Fv" ili "scFv" sadrže VHi VLdomene antitela, gde su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni veznik između VHi VLdomena koji omogućava scFv da obrazuje strukturu povoljnu za ciljno vezivanje.
[0045] "Fragmenti pojedinačnih domena" su sastavljeni od jednog VHili VLdomena koji pokazuju dovoljan afinitet prema OX40. U specifičnoj realizaciji, fragment jednog domena je transformisan (videti, npr., Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231: 25-38).
[0046] Antitela protiv OX40 prema pronalasku uključuju derivatizovana antitela. Na primer, derivatizovana antitela su obično modifikovana glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatim zaštitnim / blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, povezivanjem sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinom. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može biti izvedena poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Pored toga, derivat može da sadrži jednu ili više ne-prirodnih aminokiselina, npr., koristeći ambrx tehnologiju (Videti, npr., Wolfson, 2006, Chem. Biol.13(10): 1011-2).
[0047] Antitela protiv OX40 mogu biti antitela čije su sekvence modifikovane da izmene najmanje jednu funkciju biološkog efektora posredovanu konstantnim regionom. Na primer, u nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo može biti modifikovano da redukuje najmanje jednu funkciju biološkog efektora posredovanu konstantnim regionom u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr., redukovano vezivanje za jedan ili više Fc receptora (FcγR), kao što su FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA i / ili FcγRIIIB. Vezivanje FcγR može biti smanjeno mutiranjem segmenta konstantnog regiona imunoglobulina antitela u određenim regionima potrebnim za FcγR interakcije (Videti, npr., Canfield i Morrison, 1991, J. Exp. Med.173: 1483 -1491; i Lund i ostali, 1991, J. Immunol.147:2657-2662). Smanjenje sposobnosti vezivanja FcγR od antitela može takođe da smanji ostale efektorske funkcije koje se oslanjaju na FcγR interakcije, kao što su opsonizacija, fagocitoza i antigen zavisna ćelijska citotoksičnost ("ADCC"). U ilustrativnom primeru, varijanta CH2 domena koja ima supstituciju V263L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S ili V273Y u CH2 domenu Fc regiona može pokazati smanjeni afinitet prema FcyRIIB u poređenju sa odgovarajućim konstantnim regionom divljeg tipa.
[0048] Ovde opisano anti-OX40 antitelo uključuje, antitela koja su modifikovana da bi se stekla ili poboljšala najmanje jedna funkcija biološkog efektora posredovana konstantnim regionom u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr., da bi se poboljšala interakcija FcγR (Videti, npr., američku patentnu prijavu br. 2006/0134709). Na primer, anti-OX40 antitelo iz pronalaska može da ima konstantni region koji vezuje FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA i / ili FcγRIIIB sa većim afinitetom od odgovarajućeg konstantnog regiona divljeg tipa. U ilustrativnom primeru, varijanta CH2 domena koja ima supstituciju V263L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S ili V273Y u CH2 domenu Fc regiona može ispoljiti veći afinitet prema FcγRIIIA u poređenju sa odgovarajućom konstantnim regionom divljeg tipa.
[0049] Stoga, antitela protiv OX40 prema pronalasku mogu imati promene u biološkoj aktivnosti koje rezultiraju povećanom ili smanjenom opsonizacijom, fagocitozom ili ADCC-om. Takve izmene su poznate u struci. Na primer, modifikacije antitela koje smanjuju ADCC aktivnost opisane su u američkom patentu br.5,834,597. Primer varijante za snižavanje ADCC odgovara "mutantu 3" (takođe poznat kao "M3", prikazanom na slici 4 američkog patenta br.
5,834,597) u kome su ostaci 234 i 237 (koristeći EU numerisanje) supstituisani sa alaninima. Varijacija mutanta 3 (poznata i kao "M3") može biti korišćena u velikom broju izotipa antitela, npr., humani IgG2M3.
[0050] Dodatne supstitucije koje mogu modifikovati FcγR vezivanje i / ili ADCC efektorsku funkciju anti-OX40 antitela uključuju, supstituciju K322A ili dvostruku supstituciju L234A i L235A u Fc regionu, na primer, humani IgG1koji ima dvostruku supstituciju L234A / L235A. Videti npr., Hezareh i sar. J. Virol., 75 (24): 12161-12168 (2001).
[0051] U nekim realizacijama, antitela protiv OX40 imaju niske nivoe ili nedostatak fukoze. Antitela kojima nedostaje fukoza su u korelaciji sa pojačanom ADCC aktivnošću, posebno pri niskim dozama antitela. Videti Shields i sar., 2002, J. Biol. Chem.277:26733-26740; Shinkawa i sar., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73. Postupci pripreme antitela bez fukoze uključuju rast mijelomskih ćelija YB2/0 pacova (ATCC CRL 1662). YB2/0 ćelije eksprimiraju niske nivoe mRNK FUT8, koja kodira α-1,6-fukoziltransferazu, enzim neophodan za fukozilaciju polipeptida.
[0052] Antitela protiv OX40 mogu da sadrže modifikovane (ili varijantne) CH2 domene ili kompletne Fc domene koji uključuju supstitucije aminokiselina koje povećavaju vezivanje za FcγRIIB i/ili redukuju vezivanje za FcγRIIIA u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg divljeg tipa CH2 ili Fc regiona. Varijante CH2 ili varijante Fc domena su opisane u američkoj patentnoj br.2014/0377253. Varijanta CH2 ili varijanta Fc domena obično uključuje jednu ili više supstitucija na položaju 263, položaju 266, položaju 273 i položaju 305, pri čemu je numerisanje ostataka u Fc domenu prema EU indeksu kao u Kabatu. U nekim realizacijama, antitela protiv OX40 sadrže jednu ili više supstitucija izabranih od V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K i V305W, u odnosu na divlji tip domena CH2. U specifičnim realizacijama, jedna ili više supstitucija CH2 domena su izabrane od V263L, V273E, V273F, V273M, V273S i V273Y, u odnosu na CH2 domen humanog IgG1. Na primer, jedna ili više supstitucija CH2 domena IgG1može biti V273E. U drugoj specifičnoj realizaciji, anti-OX40 antitelo iz pronalaska sadrži varijantu CH2 domena IgG1koja sadrži aminokiselinsku supstituciju V263L.
[0053] Ostali primeri varijante CH2 ili varijante Fc domena koji mogu da obezbede povećano vezivanje za FcγRIIB i / ili smanjeno vezivanje za FcγRIIIA u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg divljeg tipa CH2 ili Fc regiona uključuju one koji su nađeni u Vonderheide, et al. Clin. Cancer Res., 19 (5), 1035-1043 (2013), kao što su S267E ili S267E / L328F u humanom IgG1.
[0054] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitela uključuju modifikacije koje povećavaju ili smanjuju njihove afinitete vezivanja za fetalni Fc receptor, FcRn, na primer, mutiranjem segmenta konstantnog regiona imunoglobulina u određenim regionima uključenim u FcRn interakcijama (videti npr., WO 2005/123780). U posebnim realizacijama, anti-OX40 antitelo klase IgG je mutirano tako da je najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka 250, 314 i 428 konstantnog regiona teškog lanca supstituisan samostalno, ili u bilo kojoj njihovoj kombinaciji, kao što je na položajima 250 i 428, ili na položajima 250 i 314, ili na položajima 314 i 428, ili na položajima 250, 314 i 428, sa položajima 250 i 428 specifične kombinacije. Za položaj 250, aminokiselinski ostatak koji se supstituiše, može biti bilo koji aminokiselinski ostatak osim treonina, uključujući, ali nije ograničen na, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, valin, triptofan ili tirozin. Za položaj 314, supstitucioni aminokiselinski ostatak može biti bilo koji aminokiselinski ostatak osim leucina, uključujući, ali nije ograničen na, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Za položaj 428, supstitutivni aminokiselinski ostaci mogu biti bilo koji aminokiselinski ostaci osim metionina, uključujući, ali nisu ograničeni na, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Primer supstitucije za koji je poznato da modifikuje funkciju Fc efektora je Fc supstitucija M428L, koja se može dogoditi u kombinaciji sa Fc supstitucijom T250Q. Dodatne specifične kombinacije pogodnih supstitucija aminokiselina su identifikovane u Tabeli 1 američkog patenta br. 7,217,797. Takve mutacije povećavaju vezivanje za FcRn, koje štite antitelo od razgradnje i povećavaju njegov poluživot.
[0055] Antitelo protiv OX40 može imati jednu ili više aminokiselina umetnutih u jedan ili više njegovih CDR-ova, na primer kako je opisano od strane Junga i Pluckthuna, 1997, Protein Engineering 10: 8, 959-966; Yazaki i sar., 2004, Eng. Des Sel. 17(5):481-9. Epub 2004, avg 17; i američka patentna prijava br.2007/0280931.
[0056] Antitela protiv OX40 sa visokim afinitetom za humani OX40 (SEK ID BR: 1) mogu biti poželjna za terapijske i dijagnostičke upotrebe. Prema tome, sadašnje otkriće razmatra antitela koja imaju visoki vezivni afinitet za humani OX40. U specifičnim realizacijama, anti-OX40 antitela vezuju humani OX40 sa afinitetom od najmanje oko 100 nM, ali mogu da ispoljavaju veći afinitet, na primer, najmanje oko 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, ili čak i viši. U nekim realizacijama, antitela vezuju humani OX40 sa afinitetom u rasponu od oko 1 pM do oko 100 nM, ili afinitetom koji se kreće između bilo koje od prethodno navedenih vrednosti, kao što je, ali nije ograničeno, od oko 0,001 do 10 nM, 0,001 do 5 nM, 0,01 do 100 nM, 0,01 do 50 nM, 0,01 do 10 nM, 0,01 do 5 nM, ili 0,01 do 1 nM.
[0057] Afinitet antitela protiv OX40 za humani OX40, može biti određen korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci ili ovde opisanih, kao što su na primer, ali ne ograničavajući se na, ELISA, izotermalnu titracionu kalorimetriju (ITC), površinsku plazmonsku rezonancu ili ispitivanje fluorescentne polarizacije.
[0058] Antitela protiv OX40 obično sadrže teški lanac koji sadrži varijabilni region (VH) koji ima tri regiona za određivanje komplementarnosti ("CDR-a") ovde se odnose na (u N → C redu) kao VHCDR # 1, VHCDR # 2 i VHCDR # 3, i laki lanac koji sadrži varijabilni region (VL) koji ima tri regiona za određivanje komplementarnosti ovde se odnose na (u N → C redu) kao VLCDR # 1, VLCDR # 2 i VLCDR # 3. Ovde su obezbeđene aminokiselinske sekvence primernih CDR-ova, kao i aminokiselinska sekvenca VHi VLregiona teških i lakih lanaca primernog anti-OX40. Specifične realizacije anti-OX40 antitela uključuju ove ogledne CDR-ove i / ili VHi / ili VLsekvence, kao i antitela koja se takmiče za vezivanje humanog OX40 sa takvim antitelima.
[0059] U nekim realizacijama, aminokiselinske sekvence CDR regiona anti-OX40 antitela imaju sekvence odabrane iz njihovih respektivnih VHi VLCDR sekvenci u Tabeli 3 ispod:
(nastavak)
[0060] Ovde su opisane specifične realizacije antitela protiv OX40 iz primera sa gore navedenim CDR regionima. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima CDR regione prema SEK ID BR-a: 101, 102, 103, 104, 105 i 106. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima CDR-ove prema SEK ID BR-a: 111, 112, 113, 114, 115, i 116. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima CDR-ove prema SEK ID BR-a: 121, 122, 123, 114, 125 i 126. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima CDR regione prema SEK ID BR-a: 131, 132, 133, 114, 115, i 136.
[0061] Ovde opisani CDR-ovi obrazuju vezivne elemente unutar VHi VLlanaca anti-OX40 antitela iz pronalaska. TABELE 4 i 5 niže opisuju VHi VLlance koji odgovaraju anti-OX40 antitelima iz primera, koja sadrže gore opisane CDR regione. CDR-ovi su podvučeni ispod u TABELAMA 4 i 5. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži jedan VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je opisano u TABELI 4:
(nastavak)
edan VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je opisano u TABELI 5:
[0062] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži jedan VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 21 i jedan VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 31. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži jedan VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 23 i jedan VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 33. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 25 i VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEK ID BR: 35. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 27 i VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 37.
[0063] U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 je pogodno za primenu na ljudima. U specifičnoj realizaciji, anti-OX40 antitelo je humanizovano. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 22 i VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 32. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 24 i VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 34. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 26 i VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 36. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 28 i VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 38.
[0064] Izvesne mutacije VHili VLsekvence u anti-OX40 antitelu ovde opisane biće razumljive stručnjaku da daju antitela protiv OX40 u okviru obima pronalaska. Mutacije mogu da uključuju supstitucije aminokiselina, dodavanja ili brisanja iz VHili VLsekvence kao što je ovde otkriveno, zadržavajući značajnu aktivnost protiv OX40. Prema tome, u nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 sadrži VHsekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa bilo kojom od VHsekvenci prikazanih u TABELI 4. Antitelo protiv OX40 može da sadrži VHsekvencu koja ima do 8, do 7, do 6, do 5, do 4, do 3 ili do 2 mutacije u poređenju sa bilo kojom od VHsekvenci prikazanih u TABELI 4. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo može sadrži VHsekvencu koja ima 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje mutacija u poređenju sa bilo kojom od VHsekvenci prikazanih u TABELI 4. U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 sadrži VLsekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa bilo kojom od VLsekvenci prikazanih u TABELI 5. Antitelo protiv OX40 može da sadrži VLsekvencu koja ima do 8, do 7, do 6, do 5, do 4, do 3 ili do 2 mutacije u poređenju sa bilo kojom od VLsekvenci prikazanih u TABELI 5. U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 može da sadrži VLsekvencu koja ima 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje mutacija u poređenju sa bilo kojom od VLsekvenci prikazanih u TABELI 5.
[0065] Sekvence aminokiselina teškog i lakog lanca pune dužine obično sadrže gore opisani VHili VLlanac povezan sa odgovarajućim konstantnim regionom imunoglobulina, npr., humani IgG1ili laki konstantni region kappa. Mogu se pojaviti post-translacione modifikacije sekvenci pune dužine antitela protiv OX40, kao što je cepanje jednog ili više (npr. 1, 2, 3 ili više) aminokiselinskih ostataka na C-terminalnom kraju teškog lanca antitela. Takvi proizvodi cepanja mogu da sadrže neko ili čitavo anti-OX40 antitelo kao što je izraženo.
[0066] Prema tome, u nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca, kao što je opisano u TABELI 6:
(nastavak)
(nastavak)
lanca, kao što je opisano u TABELI 7:
u kojima podvučene aminokiseline predstavljaju CDR regione, a aminokiseline u italiku predstavljaju konstantne regione.
[0067] U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEK ID BR: 41 ili 42 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEK ID BR: 51. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEK ID BR: 43 ili 44 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEK ID BR: 52. U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema SEK ID BR: 45 ili 46 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEK ID BR: 53. U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca u skladu sa SEK ID BR: 47 ili 48 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema SEK ID BR: 54.
[0068] U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 sadrži sekvencu teškog lanaca koja ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa sekvencom teškog lanca prema bilo kojoj od SEK ID BR-a: 41-48. Antitelo protiv OX40 može da sadrži sekvencu teškog lanca koja ima do 8, do 7, do 6, do 5, do 4, do 3 ili do 2 mutacije u poređenju sa sekvencom teškog lanca prema bilo kojoj od SEK ID BR-a: 41-48. U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 može da sadrži sekvencu teškog lanca koja ima 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje mutacija u poređenju sa sekvencom teškog lanca u skladu sa bilo kojom od SEK ID BR-a: 41- 48.
[0069] U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 sadrži sekvencu lakog lanca koja ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa sekvencom lakog lanca u skladu sa bilo kojom od SEK ID BR-a: 51-54. Antitelo protiv OX40 može da sadrži sekvencu lakog lanca koja ima do 8, do 7, do 6, do 5, do 4, do 3 ili do 2 mutacije u poređenju sa sekvencom lakog lanca prema bilo kojoj od SEK ID BR-a: 51-54. U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 može da sadrži sekvencu lakog lanca koja ima 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje mutacija u poređenju sa sekvencom lakog lanca prema bilo kojoj od SEK ID BR-a: 51- 54.
[0070] Dodatne post-translacione modifikacije antitela protiv OX40, mogu da uključuju glikozilaciju. Uobičajeni biantenarni kompleksi, mogu biti sastavljeni od jezgraste strukture koja sadrži dva N-acetilglukozamina (GlcNAc), tri manoze i dva GlcNAc ostatka koji su β-1,2 povezani sa α-6 manozom i α-3 manozom da obrazuju dve antene. Mogu biti spojeni za jezgro jedan ili više ostataka fukoze (Fuc), galaktoze (Gal), visoko manoznih glukana Man-5 ili Man-9, razdvajajući GlcNAc i sijalinsku kiselinu uključujući, ostatke N-acetilneuraminske kiseline (NANA) ili N-glikolilneuraminske kiseline (NGNA). N-vezani glikoformi mogu da uključuju G0 (protein koji ima jezgro biantenarne strukture glikozilacije), G0F (fukozilovani G0), G0F GlcNAc, G1 (protein koji ima jezgro glikozilacione strukture sa jednim ostatkom galaktoze), G1F (fukozilovani G1), G2 (protein koji ima jezgro glikozilacione strukture sa dva ostatka galaktoze) i / ili G2F (fukozilovani G2) .
[0071] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitela se takmiče za vezivanje humanog OX40 (SEK ID BR: 1) u in vitro ispitivanjima sa referentnim antitelom. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitela se takmiče za vezivanje humanog OX40 na ćelijama koje eksprimiraju humani OX40. Referentno antitelo može biti bilo koje od ovde opisanih anti-OX40 antitela. U nekim realizacijama, referentno antitelo je antitelo koje ima VHprema onom opisanom u TABELI 4 i VLprema onom opisanom u TABELI 5. U specifičnim realizacijama, referentno antitelo je mišje antitelo koje sadrži Mu3726 VHi Mu3726 VL("Mu3726"), mišje antitelo koje sadrži Mu3738 VHi Mu3738 VL("Mu3738"), mišje antitelo koje sadrži Mu3739 VHi Mu3739 VL("Mu3739"), ili mišje antitelo koje sadrži Mu3741 VHi Mu3741 VL("MU3741"). U nekim realizacijama, referentno antitelo je humanizovana verzija Mu3726, Mu3738, Mu3739 ili Mu3741. U nekim realizacijama, referentno antitelo je humanizovano antitelo koje sadrži teški lanac prema SEK ID BR: 41 ili 42 i laki lanac prema SEK ID BR: 51 ("Hu3738"), humanizovano antitelo koje sadrži teški lanac prema SEK ID BR: 43 ili 44 i laki lanac prema SEK ID BR: 52 ("Hu3726"), humanizovano antitelo koje sadrži teški lanac prema SEK ID BR: 45 ili 46 i laki lanac prema SEK ID BR: 53 ("Hu3739"), ili humanizovano antitelo koje sadrži teški lanac prema SEK ID BR: 47 ili 48 i laki lanac prema SEK ID BR: 54 ("Hu3741").
[0072] Ovde opisana anti-OX40 antitela se uglavnom specifično vezuju za humani OX40. Unakrsna reaktivnost antitela za vezivanje OX40 drugih vrsta, na primer, iz majmuna, npr., majmuna cinomolgus, može dati prednosti, poput sposobnosti testiranja bioloških aktivnosti na životinjskim modelima majmuna. Takva ispitivanja na životinjskim modelima mogu se koristiti za skrining anti-OX40 antitela za odabir svojstava koja se odnose na efikasnost, npr., pogodnu farmakokinetiku ili onih koji se odnose na bezbednost, npr., smanjenu toksičnost za jetru. U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 se vezuje za OX40 cinomolgusa (SEK ID BR: 2) (NCBI referentna sekvenca XP005545179) kao i za humani OX40. U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 se ne vezuje za mišji OX40 (SEK ID BR: 3) (NCBI Referentna sekvenca NP037181).
[0073] Kompetitivni testovi uključuju, ali nisu ograničeni na, radioaktivni materijal obeležen imunološkim ispitivanjem (RIA), enzimski-povezan imunosorbentni test (ELISA), sendvič ELISA, ispitivanje sortiranja ćelija aktiviranih fluorescencijom i ispitivanja površinske plazmonske rezonance.
[0074] Testovi površinske plazmonske rezonance (SPR) omogućavaju direktno merenje kinetike vezivanja između dva proteina, npr., receptora i antitela, kao što su humani OX40 receptor i antitelo protiv OX40, bez potrebe za reporterskim signalom ili oznakom. I konstanta ravnoteže disocijacije KD, mera vezivnog afiniteta, kao i njene dve komponente - konstante kinetičke brzine vezivanja, ka(M<-1>-sek<-1>) (konstanta asocijacije, konili „on rate“) i kd(sek<-1>) (konstanta disocijacije, koffili "off rate") - mogu biti određene korišćenjem SPR-a. Konstante su povezane sledećom jednačinom:
KD= kd/ ka.
[0075] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitela imaju KDnajmanje oko 100 nM, ali mogu da ispoljavaju veći afinitet, na primer, najmanje oko 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, ili čak i viši. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima KDu opsegu od oko 1 pM do oko 100 nM, ili afinitet koji je u rasponu između bilo koje od prethodno navedenih vrednosti, kao što su, ali nisu ograničene do, od oko 0,001 do 10 nM, 0,001 do 5 nM, 0,01 do 100 nM, 0,01 do 50 nM, 0,01 do 10 nM, 0,01 do 5 nM, ili oko 0,01 do 1 nM.
[0076] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima konstantu disocijacije kdne višu od oko 10 sek<-1>, na primer, ne više od oko 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 sek<-1>, ili čak nižu. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima kdu opsegu od oko 0,001 sek<-1>do oko 10 sek-1, ili kdu opsegu između bilo kojih od prethodno navedenih vrednosti, kao što su, ali nisu ograničene na, od oko 0,01 do 10 sek<-1>, 0,001 do 0,5 sek<-1>, 0,001 do 0,2 sek<-1>, 0,001 do 0,1 sek-1, 0,01 do 1 sek<-1>, 0,001 do 0,05 sek<-1>ili oko 0,001 do 1 sek<-1>.
[0077] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima konstantnu asocijacije kanajmanje oko 10<4>M<-1>-sek<-1>, na primer, najmanje oko 1 x 10<4>, 5 x 10<4>, 1 x 10<5>, 5 x 10<5>, 1 x 10<6>, 5 x 10<6>, 1 x 10<7>M<-1>-sek<-1>ili još veću. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima kdu opsegu od oko 10<4>M<-1>-sek<-1>do oko 10<7>M<-1>-sek<-1>, ili kau opsegu između bilo koje od prethodnih vrednosti, kao što su, ali nisu ograničene na, od oko 5 x 10<4>do 1 x 10<7>M<-1>-sek<-1>, 5 x 10<4>do 5 x 10<6>M<-1>-sek<-1>, ili oko 1 x 10<4>do 5 x 10<6>M<-1>-sek<-1>.
[0078] Antitelo protiv OX40 prema pronalasku, može da ispolji KD, kdili kau opsegu oko konstante vezivnih kinetika izmerene za bilo koje od ovde opisanih primernih antitela protiv OX40. Na primer, u nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo ima konstantu disocijacije kdu opsegu od oko 0,01 do oko 100 puta, npr., oko 0,1 do oko 10 puta, ili oko 0,5 do oko 5 puta, kdbilo kojeg od Hu3738, Hu3726, Hu3739 i Hu3741. U nekim realizacijama, antitelo protiv OX40 ima konstantnu asocijacije kau opsegu od oko 0,01 do oko 100 puta, npr., oko 0,1 do oko 10 puta, ili oko 0,5 do oko 5 puta, kabilo kojeg od Hu3738, Hu3726, Hu3739 i Hu3741.
[0079] U sprovođenju ispitivanja kompeticije antitela između referentnog antitela i ispitivanog antitela (bez obzira na vrstu ili izotip), prvo se može označiti referenca sa detektibilnom oznakom, kao što su fluorofor, biotin ili enzimska (ili čak radioaktivna) oznaka da bi se omogućila naknadna identifikacija. U ovom slučaju, ćelije koje eksprimiraju humani OKX40 su inkubirane sa neobeleženim ispitivanim antitelom, dodaje se obeleženo referentno antitelo i meri se intenzitet vezane oznake. Ako se ispitivano antitelo takmiči sa obeleženim referentnim antitelom vezivanjem za preklapajući epitop, intenzitet će biti smanjen u odnosu na kontrolnu reakciju koja je izvedena bez ispitivanog antitela.
[0080] U specifičnoj realizaciji ovog testa, prvo je određena koncentracija obeleženih referentnih antitela koja daje 80% maksimalnog vezivanja ("konc80%") pod uslovima ispitivanja (npr., specifična gustina ćelija) i sprovodi se kompeticioni test. sa 10X konc80%neobeleženih ispitivanih antitela i konc80%obeleženih referentnih antitela.
[0081] Inhibicija se može izraziti kao konstanta inhibicije ili Ki, koja se izračunava prema sledećoj formuli:
Ki= IC50/ (1 [referentna koncentracija At] / Kd),
gde je IC50koncentracija ispitivanog antitela koja daje smanjenje od 50% u vezivanju referentnog antitela i Kdje konstanta disocijacije referentnog antitela, merilo njegovog afiniteta za humani OX40. Antitela koja se takmiče sa ovde opisanim anti-OX40 antitelima, mogu imati Kiod 10 pM do 100 nM, pod ovde opisanim uslovima ispitivanja.
[0082] U različitim realizacijama, smatra se da se ispitivano antitelo takmiči sa referentnim antitelom ako ono smanjuje vezivanje referentnog antitela za najmanje oko 20% ili više, na primer, za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50% , 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak više, ili procentom u rasponu između bilo koje od prethodnih vrednosti, pri referentnoj koncentraciji antitela koja je 80% od maksimalnog vezivanja pod specifičnim uslovima ispitivanja, i koncentraciji ispitivanog antitela koja je 10 puta veća od koncentracije referentnog antitela.
[0083] Specifični test i uslovi ispitivanja korisni za procenu da li se antitelo takmiči za vezivanje humanog OX40 sa referentnim antitelom kao što je ovde opisano, navedeno je u odeljku 8.1.4.
[0084] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitela iz pronalaska aktiviraju humani OX40 (SEK ID BR: 1). Aktivacija receptora OX40 može da se dogodi brojnim mehanizmima, na primer, pružanjem aktivnosti poput liganda protiv OX40 receptora. U takvim slučajevima, anti-OX40 antitelo se nadmeće za vezivanje za OX40 receptor sa humanim ligandom OX40 (OX40L, CD252; UniProtKB/Swiss-Prot kod P23510.1) (SEK ID BR: 4).
[0085] Antitelo protiv OX40 prema pronalasku, može generalno aktivirati OX40 receptor u prisustvu unakrsnog povezivanja. Specifičan test i uslovi ispitivanja korisni za procenu da li anti-OX40 antitelo može da aktivira OX40 receptor, npr., humani OX40 receptor (SEK ID BR: 1), u prisustvu umrežavanja, obezbeđen je u odeljku 8.1.8. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo aktivira humani OX40 receptor u prisustvu unakrsnog povezivanja sa EC50od oko 1 pM do oko 500 nM, kao što su, ali nisu ograničene na, od oko 0,01 do oko 300 nM, od oko 0,01 do oko 100 nM, od oko 0,01 do oko 10 nM, od oko 0,01 do oko 1 nM, od oko 0,1 do oko 300 nM, od oko 0,1 nM do oko 100 nM, od oko 1 nM do oko 100 nM, ili od oko 0,1 nM do oko 100 nM. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo pri 100 µg/mL može da aktivira humani OX40 receptor u prisustvu unakrsnog povezivanja do aktivnosti najmanje oko 3 puta, kao što su od oko 3 do oko 1000, npr., oko 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 400, 500, 700, 800 ili oko 1000 puta više u poređenju sa aktivnošću humanog OX40 receptora u odsustvu antitela protiv OX40.
[0086] Umrežavanje može biti obezbeđeno brojnim metodama, uključujući dodavanje egzogenog umrežavanja, npr., pomoću antitela ili fragmenata antitela F (ab')2, specifičnih za teške, lake ili varijabilne regione humanih ili humanizovanih antitela; rastvorljivim ili imobilizovanim proteinom A; transficiranim ćelijskim linijama Fc receptora; endogenim Fc receptorima koji eksprimiraju ćelijske linije; direktnim oblaganjem predmetnih antitela na plastične površine; plastičnim površinama obloženim egzogenim umrežavajućim antitelima ili Fc receptorima; ili zrnima konjugovanim sa bilo kojim od gore navedenih. U ilustrativnom primeru, predmetna antitela mogu biti konjugovana sa proteinom kao što je biotin, a rastvorljivi ili imobilizovani avidin ili streptavidin je korišćen kao umreženi linker. U drugom primeru, u humanim limfnim čvorovima in vivo, aktivacija OX40 nakon vezivanja za antitelo protiv OX40 je očekivana da se dogodi nakon unakrsnog vezivanja receptora obezbeđenog endogenim FcγR ćelijama koje predstavljaju antigene.
[0087] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo se vezuje za i aktivira humani OX40 receptor u odsustvu unakrsnog vezivanja. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo aktivira OX40 receptor, npr., humani OX40 receptor (SEK ID BR: 1), u odsustvu OX40L, npr., humani OX40L (SEK ID BR: 4). Specifičan test i uslovi ispitivanja korisni za procenu da li anti-OX40 antitelo može da aktivira OX40 receptor bez umrežavanja su obezbeđeni u odeljku 8.1.8. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo aktivira humani OX40 receptor bez unakrsnog vezivanja sa EC50vrednošću od oko 1 pM do oko 500 nM, kao što je, ali nije ograničena na, od oko 0,01 do oko 300 nM, od oko 0,01 do oko 100 nM, od oko 0,1 do oko 300 nM, od oko 0,1 nM do oko 100 nM, od oko 1 nM do oko 100 nM, od oko 0,1 nM do oko 100 nM, od oko 1 do oko 300 nM, od oko 1 do oko 100 nM, od oko 1 do oko 50 nM, ili od oko 10 do oko 100 nM. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo pri 100 µg/mL može da aktivira humani OX40 receptor bez unakrsnog vezivanja sa aktivnošću koja je najmanje oko 5 puta, kao što je od oko 5 do oko 1000, npr., oko 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 800 ili oko 1000 puta viša u poređenju sa aktivnošću humanog OX40 receptora doziranog sa ekvivalentnom količinom izotipskog antitela. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo pri 10 µg/mL može aktivirati humani OX40 receptor bez umrežavanja sa aktivnošću najmanje oko 3-puta, kao što je od oko 3 do oko 300, npr., oko 3, 5, 6 , 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 ili oko 300 puta viša u poređenju sa aktivnošću humanog OX40 receptora doziranog sa ekvivalentnom količinom izotipskog antitela. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo pri 1 µg/mL može aktivirati humani OX40 receptor bez umrežavanja sa aktivnošću koja je najmanje oko 3 puta, kao što je od oko 3 do oko 150, npr., oko 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100 ili oko 150 puta viša u poređenju sa aktivnošću humanog OX40 receptora doziranog sa ekvivalentnom količinom izotipskog antitela.
[0088] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo aktivira OX40 receptor, npr. humani OX40 receptor (SEK ID BR: 1), pri višem nivou u prisustvu umrežavanja u poređenju sa bez umrežavanja. Specifično ispitivanje i uslovi ispitivanja korisni za određivanje nivoa pri kome anti-OX40 antitelo može aktivirati OX40 receptor bez umrežavanja su obezbeđeni u Odeljku 8.1.8. Nivo aktivnosti se može meriti, na primer, u izrazima EC50i/ili uočene maksimalne aktivacije. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo pri 100 µg/mL aktivira receptor OX40, npr., humani OX40 receptor (SEK ID BR: 1), bez unakrsnog vezivanja, pri oko 20% do oko 95% aktivnosti NF-κB, kao što je oko 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80% ili oko 90% u poređenju sa aktivnošću NF-κB sa umrežavanjem u testu u skladu sa odeljkom 8.1.8.
[0089] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo aktivira humani OX40 receptor bez umrežavanja sa EC50od oko 0,1 nM do oko 500 nM, kao što je, ali nije ograničena na, od oko 1 nM do oko 100 nM, od oko 0,1 nM do oko 100 nM, od oko 1 do oko 300 nM, od oko 1 do oko 100 nM, od oko 1 do oko 50 nM, ili od oko 10 do oko 100 nM, u testu prema Odeljku 8.1.8. U nekim takvim realizacijama, anti-OX40 antitelo pri 10 µg/mL može aktivirati humani OX40 receptor bez umrežavanja sa aktivnošću koja je najmanje oko 3-puta, kao što je od oko 3 do oko 300, npr., oko 3, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 ili oko 300 puta viša u poređenju sa aktivnošću humanog OX40 receptora doziranog sa ekvivalentnom količina izotipskog antitela. U nekim takvim realizacijama, anti-OX40 antitelo aktivira humani OX40 receptor u prisustvu umrežavanja sa EC50vrednošću od oko 1 pM do oko 300 nM, kao što je, ali nije ograničena na, oko 0,01 do oko 300 nM, od oko 0,01 do oko 100 nM, od oko 0,01 do oko 10 nM, od oko 0,01 do oko 1 nM, od oko 0,1 do oko 300 nM, od oko 0,1 nM do oko 100 nM, od oko 1 nM do oko 100 nM, ili od oko 0,1 nM do oko 100 nM, u testu prema Odeljku 8.1.8. U nekim takvim realizacijama, anti-OX40 antitelo može da aktivira humani OX40 receptor u prisustvu umrežavanja pri nižem EC50, kao što je od oko 1,5 do oko 100 puta, kao što je od oko 1,5 do oko 10 puta, npr., oko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili oko 10 puta niže, u poređenju sa EC50antitela 1A7 opisanom u američkoj publikaciji br. 2015/0307617 u testu prema Odeljku 8.1.8.
[0090] Antitelo protiv OX40 iz pronalaska može aktivirati humani OX40 receptor bez umrežavanja sa EC50od oko 1 nM do oko 100 nM u ispitivanju prema odeljku 8.1.8, i može aktivirati humani OX40 receptor u prisustvu unakrsnog vezivanja pri nižem EC50, kao što je od oko 1,5 do oko 10 puta niže, u poređenju sa EC50antitela 1A7 opisanom u američkoj publikaciji br. 2015/0307617 u testu prema Odeljku 8.1.8. Primerna anti-OX40 antitela koja imaju gore navedena svojstva uključuju Mu3738 i Hu3738, kao što je ovde opisano u primerima 2 do 8.
[0091] Generalno, aktivacija OX40 nakon tretmana sa anti-OX40 antitelom rezultira transdukcijom signala, kao što je povećanje proizvodnje citokina (npr., interferona gama (IFN-γ)) i/ili povećanje ćelijske proliferacije, npr., proliferacija CD4<+>T ćelija. U nekim realizacijama, povećanje proizvodnje IFN- γ nakon tretmana sa 1 µg/mL anti-OX40 antitela je od oko 1,5 do oko 50 puta, kao što je oko 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, ili oko 50 puta od nivoa produkcije IFN-γ nakon tretmana sa ekvivalentnom količinom izotipskog antitela. U nekim realizacijama, porast proliferacije CD4<+>T ćelija nakon tretmana sa 1 µg/ mL anti-OX40 antitela je od oko 1,5 do oko 20 puta, kao što je oko 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 ili otprilike 20 puta veći od nivoa proliferacije CD4<+>T ćelija nakon tretmana sa ekvivalentnom količinom izotipskog antitela. Testovi za određivanje nivoa citokina ili za određivanje nivoa proliferacije ćelija su poznati u stanju tehnike. Specifični uslovi ispitivanja i ispitivanja za određivanje proizvodnje IFN-γ i / ili CD4<+>T ćelijske proliferacije su ovde obezbeđeni u Odeljku 8.1.12.
7.4. Polinukleotidi koji kodiraju Anti-OX40 antitela, ekspresioni sistemi i metode izrade istih
[0092] Sadašnji pronalazak obuhvata molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju gene lakog i teškog lanca imunoglobulina za anti-OX40 antitela, vektore koji sadrže takve nukleinske kiseline i ćelije domaćina sposobne da proizvode anti-OX40 antitela prema pronalasku.
[0093] Antitelo protiv OX40 prema pronalasku, može biti pripremljeno rekombinantnom ekspresijom imunoglobulinskih gena lakog i teškog lanca u ćeliji domaćina. Da bi se antitelo rekombinantno eksprimiralo, ćelija domaćina je transficirana sa jednim ili više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose fragmente DNK koji kodiraju imunoglobulinske lake i teške lance antitela, tako da su laki i teški lanci izraženi u ćeliji domaćina i, po izboru, sekretovani u medijum u kome su kultivisane ćelije domaćina, medijuma iz kojeg se antitela mogu oporaviti. Standardne rekombinantne DNK metodologije se koriste za dobijanje gena teških i lakih lanaca antitela, inkorporiranje ovih gena u rekombinantne ekspresione vektore i uvođenje vektora u ćelije domaćina, poput onih opisanih u Molekularnom kloniranju; Laboratorijski priručnik, drugo izdanje (Sambrook, Fritsch i Maniatis (izd.), Cold Spring Harbor, N.Y, 1989), Trenutni protokoli u molekularnoj biologiji (Ausubel, FM i sar., Izd., Greene Publishing Associates, 1989) i u U.S. Patentu broj 4,816,397.
[0094] Da bi se generisale nukleinske kiseline koje kodiraju takva anti-OX40 antitela, prvo se dobijaju fragmenti DNK koji kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca. Ove DNK se mogu dobiti amplifikacijom i modifikacijom germinativne linije DNK ili cDNK koje kodiraju varijabilne sekvence lakog i teškog lanca, na primer korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR). Sekvence DNK germinativne linije za humane gene varijabilnog regiona teškog i lakog lanca su poznate u struci (videti, npr., "VBASE" baza podataka sekvenci humanih germinativnih linija; videti takođe Kabat, E.A. i sar., 1991, Sekvence proteina od imunološkog interesa, peto izdanje, Američko Ministarstvo zdravlja i ljudskih usluga, ΝIH Publikacija br.
91-3242; Tomlinson i sar., 1992, J. Mol. Biol. 22T: 116-198; i Cox i sar., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836).
[0095] Jednom kada su dobijeni fragmenti DNK koji kodiraju VHi VLsegmente povezane sa antitelom protiv OX40, ovi fragmenti DNK mogu biti dalje manipulisani standardnim rekombinantnim DNK tehnikama, na primer, da bi se geni varijabilnog regiona konvertovali u gene lanca antitela kompletne dužine, u gene Fab fragmenta ili u scFv gen. U ovim manipulacijama, DNK fragment koji kodira VL- ili VH- je operativno povezan sa drugim fragmentom DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Izraz "operativno povezan", kako je korišćeno u ovom kontekstu, ima za cilj da označava da su dva fragmenta DNK spojena tako da aminokiselinske sekvence kodirane sa dva fragmenta DNK ostaju unutar okvira.
[0096] Izolovana DNK koja kodira VHregion može biti konvertovana u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem DNK koja kodira VH- sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2, CH3 i, opciono, CH4). Sekvence humanih gena konstantnih regiona teškog lanca su poznate u struci (Videti, npr., Kabat, E.A., i sar., 1991, Sekvence proteina od imunološkog interesa, Peto izdanje, Američko ministarstvo zdravlja i ljudskih usluga, NIH publikacija br.91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu biti dobijeni standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD, ali u određenim ostvarenjima je IgG1ili IgG4. Za gen teškog lanca fragmenta Fab, DNK koja kodira VHmože biti operativno povezana sa drugom molekulom DNK koja kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.
[0097] Izolovana DNK koja kodira VLregion može biti konvertovana u gen lakog lanca pune dužine (kao i gen lakog lanca Fab) operativnim povezivanjem DNK koja kodira VLsa drugom molekulom DNK koja kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona humanog lakog lanca su poznate u struci (Videti, npr., Kabat, i sar., 1991, Sekvence proteina od imunološkog interesa, peto izdanje, Američko Ministarstvo zdravlja i ljudskih usluga, ΝIH Publikacija br. 91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kappa ili lambda konstantni region, ali u nekim rešenjima je kappa konstantan region. Da bi se stvorio scFv gen, DNK fragmenti koji kodiraju VHi VLsu operativno povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni veznik, npr., kodirajući aminokiselinsku sekvencu (Gli4~Ser)3(SEK ID BR: 60), tako da VHi VLsekvence mogu biti izražene kao povezani jednolančani protein, sa VLi VHregionima pridruženim fleksibilnim veznikom (videti, npr. Bird i sar., 1988, Science 242: 423-426; Huston i sar., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty i sar., 1990, Nature 348: 552-554).
[0098] Da bi se izrazila anti-OX40 antitela prema pronalasku, DNK koje kodiraju lake i teške lance delimične ili pune dužine, dobijene kao što je gore opisano, ubačene su u ekspresione vektore tako da su geni operativno povezani sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U tom kontekstu, izraz "operativno povezan" namenjen je da označava da je gen antitela vezan u vektoru tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence u vektoru služe svojoj namenjenoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i kontrolne sekvence ekspresije su izabrane da budu kompatibilne sa korišćenom ekspresionom ćelijom domaćina. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu biti ubačeni u odvojene vektore ili, tipičnije, oba gena su ubačena u isti ekspresioni vektor.
[0099] Geni antitela se ubacuju u ekspresioni vektor pomoću standardnih metoda (npr. ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na genskom fragmentu antitela i vektoru ili prostom krajnjom ligacijom ako nema restrikcionih mesta). Pre ubacivanja sekvenci lakog ili teškog lanca koje se odnose na anti-OX40 antitela, ekspresioni vektor već može da nosi sekvence konstantnih regiona antitela. Na primer, jedan pristup za konvertovanje VHi VLsekvenci koje se odnose na anti-OX40 monoklonsko antitelo u gene antitela pune dužine je njihovo umetanje u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog i lakog lanca, respektivno, tako da je VHsegment operativno povezan sa CHsegmentom(ima) unutar vektora i VLsegment je operativno povezan sa CLsegmentom unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može biti kloniran u vektoru tako da je signalni peptid povezan u okviru sa amino završetkom iz gena lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz proteina koji nije imunoglobulin).
[0100] Pored gena lanca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori prema pronalasku nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćina. Izraz "regulatorna sekvenca" je namenjen da uključuje promotore, pojačivače i druge elemente za kontrolu ekspresije (npr., poliadenilacione signale) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel, Tehnologija ekspresije gena: Methode u enzimologiji 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990. Stručnjaci u ovoj oblasti tehnike znaće da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci može da zavisi od faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja će biti transformisana, nivoa ekspresije željenog proteina, itd. Pogodne regulatorne sekvence za ekspresiju ćelija domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV) (poput CMV promotera/pojačivača), Simijan Virusa 40 (SV40 ) (kao što je SV40 promoter/pojačivač), adenovirusa (npr. glavni adenovirusni kasni promoter (AdMLP)) i polioma. Za dalji opis virusnih regulatornih elemenata i njihovih sekvenci videti, npr. američki patent br.5,168,062 od strane Stinski-a, američki patent br.4,510,245 od strane Bell-a i sar. i američki patent br.4,968,615 od strane Schaffner-a i sar.
[0101] Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, vektori rekombinantne ekspresije iz pronalaska mogu da nose dodatne sekvence, poput sekvenci koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr. poreklo replikacije) i selektivnih gena markera. Selektivni gen markera olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden (Videti, npr., američki patenti br-a.4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi od Axel i sar.). Na primer, tipično selektivni gen markera daje otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliji domaćina u koju je vektor uveden. Pogodni markerski geni koji se mogu odabrati, uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u DHFR- ćelijama domaćina sa izborom metotreksata / amplifikacijom) i neo gen (za G418 selekciju). Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodiraju teške i lake lance su transficirani u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici izraza "transfekcija" su namenjeni da obuhvate širok spektar tehnika koje se obično koriste za unošenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr., elektroporacija, lipofekcija, precipitacija kalcijum-fosfata, transfekcija DEAE-dekstranom i slično.
[0102] Moguće je eksprimirati anti-OX40 antitela prema pronalasku bilo u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina. U odrđenim realizacijama, ekspresija antitela je izvršena u eukariotskim ćelijama, npr., ćelijama domaćina sisara, optimalne sekrecije pravilno uvijenih i imunološki aktivnih antitela. Primerne ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela ovog otkrića uključuju, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući DHFR-CHO ćelije, opisane od strane Urlauba i Chasina, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, korišćene sa DHFR selektivnim markerom, npr., kako je opisano od strane Kaufmana and Sharpa, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), NSO mijelomske ćelije, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada su rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedeni u ćelije domaćina sisara, antitela su proizvedena kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda dovoljnog da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili izlučivanje antitela u medijum za kulturu u kome su uzgajane ćelije domaćina. Antitela se mogu obnoviti iz medijuma za kulturu korišćenjem standardnih metoda prečišćavanja proteina. Ćelije domaćina takođe, mogu biti korisćene za proizvodnju vezivnih fragmenata antitela protiv OX40, kao što su Fab fragmenti ili molekule scFV-a. Podrazumeva se da su varijacije gornjeg postupka unutar obima sadašnjeg pronalaska. Na primer, može biti poželjno transficirati ćeliju domaćina sa DNK koja kodira ili laki lanac ili teški lanac (ali ne oba) anti-OX40 antitela iz ovog pronalaska.
[0103] Rekombinantna DNK tehnologija takođe, može biti korišćena za uklanjanje nekih ili svih DNK koje kodiraju jedan ili oba laka i teška lanca, što nije neophodno za vezivanje za humani OX40. Molekuli eksprimirani iz takvih skraćenih molekula DNK su takođe obuhvaćeni antitelima prema pronalasku.
[0104] Za rekombinantnu ekspresiju anti-OX40 antitela iz pronalaska, ćelija domaćina može biti ko-transficirana sa dva ekspresiona vektora prema pronalasku, gde prvi vektor kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugi vektor kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu da sadrže identične selektivne markere, ili svaki može da sadrži odvojeni selektivni marker. Alternativno, može biti korišćen pojedinačni vektor koji kodira polipeptide i teškog i lakog lanca.
[0105] Kada se jednom dobije nukleinska kiselina koja kodira jedan ili više delova antitela protiv OX40, mogu biti uvedene dodatne izmene ili mutacije u kodirajućoj sekvenci, na primer da bi se generisale nukleinske kiseline koje kodiraju antitela sa različitim CDR sekvencama, antitela sa smanjenim afinitetom prema Fc receptoru, ili antitela iz različitih podklasa.
[0106] Anti-OX40 antitela prema pronalasku takođe, mogu biti proizvedena hemijskom sintezom (npr., postupcima opisanim u Sintezi peptida čvrste faze, drugo izd., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, III.). Varijantna antitela takođe, mogu biti generisana korišćenjem platforme bez ćelija (Videti, npr. Chu sar., Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals) i Murray i sar., 2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17: 420-426 ).
[0107] Kada je jednom proizvedeno anti-OX40 antitelo prema pronalasku pomoću rekombinantne ekspresije, ono može biti prečišćeno bilo kojom metodom poznatom u struci za prečišćavanje imunoglobulinske molekule, na primer, hromatografijom (npr., jonska izmena, afinitet i dimenzioniranje hromatografije na koloni), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Nadalje, anti-OX40 antitela sadašnjeg pronalaska mogu biti fuzionisana sa heterolognim polipeptidnim sekvencama koje su ovde opisane ili su na drugi način poznate u struci da bi se olakšalo prečišćavanje.
[0108] Jednom izolovano, anti-OX40 antitelo može, ako je poželjno, biti dalje prečišćeno, npr., tečnom hromatografijom visoke performanse (videti npr. Fisher, Laboratorijske tehnike u biohemiji i molekularnoj biologiji, Work i Burdon, izd., Elsevier, 1980), ili gel filtracionom hromatografijom na koloni Superdex ™ 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala , Švedska).
7.5. Farmaceutski preparati
[0109] Ovde opisana antitela protiv OX40, mogu biti u obliku preparata koji sadrže antitelo i jedan ili više nosača, ekscipijenasa i/ili razblaživača (koji se ovde u celosti nazivaju "nosačima"), tj. agenasa za puferovanje, stabilizatora, konzervanasa, izotonifikatora, nejonskih deterdženata, antioksidansa i drugih raznih aditiva. Videti, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje (Osol, izd.1980). Preparati mogu biti formulisani za specifične namene, kao što su za veterinarsku ili farmaceutsku upotrebu kod ljudi. Oblik preparata (npr., suvi prašak, tečna formulacija itd.) i korišćenih nosača će zavisiti od namenjene primene antitela i za terapeutsku upotrebu, načina primene.
[0110] Za terapijske primene, preparati mogu biti isporučeni kao deo sterilnog, farmaceutskog preparata koji uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovaj preparat može biti u bilo kom pogodnom obliku (zavisno od željenog načina njegove primene kod pacijenta). Farmaceutski preparat može biti primenjen kod pacijenta na različite načine kao što su intravenski, intratumorski ili intratekalno. Najprikladniji način primene u bilo kom datom slučaju zavisiće od određenog antitela, subjekta i prirode i težine bolesti i fizičkog stanja subjekta. Obično se farmaceutski preparat primenjuje intravenski.
[0111] Farmaceutski preparati mogu biti pogodno predstavljeni u jediničnim doznim oblicima koji sadrže prethodno određenu količinu antitela protiv OX40, ovde opisanog, po dozi. Količina anti-OX40 antitela uključenih u jediničnu dozu zavisiće od bolesti koja se leči, kao i od drugih faktora koji su dobro poznati u stanju tehnike. Takve jedinične doze mogu biti u obliku liofilizovanog suvog praška koji sadrži količinu antitela pogodnu za jednokratnu primenu, ili u obliku tečnosti. Jedinični dozni oblici suvog praška može biti pakovani u kompletu sa špricom, sa pogodnom količinom nosača i/ili drugim komponentama korisnim za primenu. Jedinične doze u tečnom obliku, mogu biti pogodno isporučene u obliku špriceva, prethodno napunjenih količinom anti-OX40 antitela pogodnih za pojedinačnu primenu.
[0112] Farmaceutski preparati takođe, mogu biti isporučeni u obliku balka koji sadrži količine anti-OX40 antitela pogodnog za višestruke primene.
[0113] Farmaceutski preparati mogu biti pripremljeni za čuvanje u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa opcionalnim farmaceutski prihvatljivim nosačima koji se obično koriste u struci. Takvi aditivi ne smeju biti toksični za primaoce pri korišćenim dozama i koncentracijama.
[0114] Na primer, za intravensku primenu, preparat može biti u obliku liofilizovanog praška koji nakon rekonstitucije sa sterilnom vodom ili drugim rastvorom pogodnim za injekciju ili infuziju (na primer, 0,9% fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, laktatni Ringerov rastvor, itd.) daje vodeni preparat.
7.6. Metode upotrebe
7.6.1. Terapijska korist
[0115] Podaci koji su ovde obezbeđeni pokazuju da otkrivena anti-OX40 antitela aktiviraju OX40 receptor u prisustvu ćelija raka i ispoljavaju moćnu in vivo antikancerogenu aktivnost protiv raka. U skladu sa tim, anti-OX40 antitela i/ili farmaceutski preparati koje sadrže anti-OX40 antitela, mogu biti korišćeni terapeutski za lečenje karcinoma.
[0116] U nekim realizacijama, rak je solidni tumor. Solidni tumori koji se mogu lečiti anti-OX40 antitelima uključuju, rak mokraćne bešike, rak dojke (npr., trostruko negativni karcinom dojke), rak glave i vrata, rak bubrega (npr., karcinom bubrežnih ćelija), rak jetre (npr., hepatocelularni karcinom, holangiokarcinom), karcinom pluća (npr., karcinom pluća koji nije mikrocelularni, mezoteliom, mikrocelularni karcinom pluća), melanom (npr., neresektabilni ili metastatski melanom, uznapredovali maligni melanom), rak kože (npr., Merkelov ćelijski karcinom), rak jajnika, rak želuca i tumori sa dokazom nedostatka popravke pogrešno uparene DNK. Rak se može sastojati od tumora koji sadrže ćelije koje izražavaju OX40; sastojati od tumora od kojih neki sadrže ćelije koje izražavaju OX40, a neki ne; ili se sastoji od tumora kojima nedostaju ćelije koje izražavaju OX40. Rak može biti novo dijagnostikovan i naivan prema lečenju, ili može biti recidiviran, refraktoran, ili recidiviran i refraktoran, ili metastatski oblik čvrstog tumora. U nekim realizacijama, čvrsti tumor je naivan prema PD-1 ili PD-L1 ciljajućem agensu. U drugim realizacijama, čvrsti tumor je recidiviran ili refraktoran nakon tretmana sa PD-1 ili PD-L1 ciljajućim agensom. U nekim realizacijama, čvrsti tumor je izabran od raka mokraćne bešike, raka dojke, raka glave i vrata, raka bubrega, raka pluća, melanoma i raka želuca. U nekim realizacijama, čvrsti tumor je izabran od: melanoma (npr., neresektabilnog ili metastatskog melanoma), raka pluća (npr., ćelijskog karcinoma pluća koji nije mikrocelularni) i karcinoma bubrežnih ćelija (npr., uznapredovalog karcinoma bubrežne ćelije). U nekim realizacijama, čvrsti tumor je izabran od trostruko negativnog karcinoma dojke, raka jajnika, hepatocelularnog karcinoma, karcinoma želuca, sitnoćelijskog karcinoma pluća, mezotelioma, holangiokarcinoma, karcinoma Merkelovih ćelija i tumora sa pokazanim nedostatkom popravke neusklađenosti u DNK. U određenim realizacijama, karcinom pluća je metastatski karcinom pluća koji nije sitnoćelijski sa progresijom uz ili nakon hemoterapije na bazi platine. U određenim realizacijama, karcinom pluća je lokalno uznapredovali ili metastatski nesitnoćelijski karcinom pluća koji nije uspeo terapijom na bazi platine i terapijom agensom za ciljanje PD-1 ili PD-L1. U određenim realizacijama, karcinom glave i vrata je recidivirani karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata koji nije kandidat za lečenje lokalnom ili sistemskom terapijom ili metastatski (diseminovani) karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata usne šupljine, orofarinksa, hipofarinksa i larinksa koji se smatra neizlečivim sa lokalnim terapijama.
[0117] Kao što je gore razmatrano, trenutno otkrivena anti-OX40 antitela modulišu imunološki odgovor. Shodno tome, pacijenti koji imaju kompromitovan imuno sistem mogu biti isključeni iz lečenja. U nekim realizacijama, pacijent je isključen nakon ispunjavanja jednog ili više od sledećih kriterijuma: (1) Aktivna ili prethodno dokumentovana autoimunska bolest (uključujući, ali ne ograničavajući se na, upalnu bolest creva, celijačnu bolest, Wegenerov sindrom) u poslednje 2 godine. (Subjekti sa atopijom ili astmom u detinjstvu, vitiligom, alopecijom, Hašimotovim sindromom, Gravesovom bolešću ili psorijazom koja ne zahteva sistemsko lečenje (u poslednje 2 godine) nisu isključeni); (2) Istorija primarne imunodeficijencije, transplantacija koštane srži, hronična limfocitna leukemija, transplantacija čvrstih organa ili prethodna klinička dijagnoza tuberkuloze; (3) Istorija koagulopatije ili poremećaja trombocita; (4) Potvrđeni pozitivni rezultati ispitivanja na virus humane imunodeficijencije (HIV), ili osobe sa hroničnim ili aktivnim hepatitisom B ili C. (Subjekti koji imaju istoriju hepatitisa B ili C koji su zabeležili izlečenja nakon antivirusne terapije mogu biti upisani); (5) Neurotoksičnost ili pneumonitis imunološki posredovan prethodnim stepenom 3 dok su primali imunoterapiju (uključujući, ali ne ograničavajući se na agense usmerene protiv CTLA-4, PD-L1 ili PD-1). Pored toga, bilo koji drugi imuno-posredovani neželjeni događaj prethodnog stepena 3 tokom primanja imunoterapije koji nije razrešen ili postao asimptomatski u roku od 3 meseca; (6) Primanje žive, atenuirane vakcine unutar 28 dana pre prve doze antitela protiv OX40.
[0118] Antitelo protiv OX40 prema pronalasku, može biti primenjeno samostalno (monoterapija) ili dodatno, ili sa drugim terapijama protiv raka i/ili ciljanim ili ne-ciljanim agensima protiv raka. Kada je primenjeno kao monoterapija protiv OX40, može biti korišćeno jedno ili više antitela. Bez obzira da li se primenjuje kao monoterapija ili kao dodatna terapija ili sa drugim terapijama ili sredstvima, primenjena je količina antitela protiv OX40 tako da celokupni režim lečenja obezbeđuje terapijsku korist.
[0119] Pod terapeutskom korišću podrazumeva se da upotreba antitela protiv OX40 za lečenje raka kod pacijenta rezultira bilo kojom pokazanom kliničkom korišću u poređenju sa odsustvom terapije (kada je to prikladno) ili sa poznatim standardom nege. Klinička korist može biti procenjena bilo kojom metodom poznatom prosečnom stručnjaku u struci. U jednoj realizaciji, klinička korist je procenjena na osnovu objektivne stope odgovora (ORR) (utvrđene korišćenjem RECIST verzije 1.1), trajanja odgovora (DOR), preživljavanja bez progresije (PFS) i / ili ukupnog preživljavanja (OS). U nekim realizacijama, potpuni odgovor ukazuje na terapijsku korist. U nekim realizacijama, delimični odgovor ukazuje na terapijsku korist. U nekim realizacijama, stabilna bolest ukazuje na terapijsku korist. U nekim realizacijama, povećanje ukupnog preživljavanja ukazuje na terapijsku korist. U nekim realizacijama, terapijska korist predstavlja poboljšanje vremena do napredovanja bolesti i / ili poboljšanje simptoma ili kvaliteta života. U drugim realizacijama, terapeutska korist se ne odnosi na povećani period kontrole bolesti, već na znatno smanjeno opterećenje simptomima što rezultira poboljšanim kvalitetom života. Kao što će biti očigledno stručnjacima iz ove oblasti tehnike, terapeutska korist može biti primećena korišćenjem antitela protiv OX40 samostalno (monoterapija) ili dodatno, ili sa drugim terapijama protiv raka i / ili ciljanim ili neciljanim agensima protiv raka.
[0120] Obično se terapijska korist procenjuje korišćenjem standardnih kliničkih testova namenjenih merenju odgovora na novo lečenje raka. Za procenu terapijskih koristi anti-OX40 antitela, ovde opisanih, može biti korišćen jedan ili kombinacija sledećih testova: (1) Kriterijumi za ocenu odgovora u čvrstim tumorima (RECIST) verzija 1.1, (2) imunološkipovezan RECIST (irRECIST) ), (3) Status učinka Istočne Kooperativne Onkološke Grupe (ECOG), (4) imuno-povezani kriterijumi odgovora (irRC), (5) bolest koja se može proceniti procenom tumorskih antigena, (6) validirani bolesnik je prijavio skale ishoda i / ili (7) procene Kaplan-Mejera za ukupno preživljavanje i opstanak bez progresije.
[0121] Procena promene težine tumora je važna karakteristika kliničke procene lekova protiv raka. I smanjenje tumora (objektivni odgovor) i vreme razvoja progresije bolesti su važne završne tačke u kliničkim ispitivanjima raka. Standardizovani kriterijumi odgovora, poznati kao RECIST (Kriterijumi za ocenjivanje odgovora u čvrstim tumorima), objavljeni su 2000. godine. Ažuriranje (RECIST 1.1) je objavljeno 2009. godine. Kriterijumi RECIST se obično koriste u kliničkim ispitivanjima, gde je objektivni odgovor krajnja tačka primarne studije, kao i u ispitivanjima gde se preduzete procena analize stabilne bolesti, progresije tumora ili analize vremena progresije, jer se ove mere ishoda zasnivaju na proceni anatomskog opterećenja tumorom i njegovu promenu tokom ispitivanja. Tabela 8 daje definicije kriterijuma odgovora korišćenih za određivanje objektivnog odgovora tumora prema ispitivanom leku, kao što su ovde opisana anti-OX40 antitela.
(nastavak)
[0122] Mere sekundarnog ishoda koje se mogu koristiti za utvrđivanje terapeutske koristi anti-OX40 antitela, ovde opisanih uključuju: Objektivnu stopu odgovora (ORR), Preživljavanje bez progresije (PFS), Ukupno preživljavanje (OS), Trajanje ukupnog odgovora (DOR), i dubinu odgovora (DpR). ORR je definisan kao proporcija učesnika koji postižu kompletan odgovor (CR) ili delimičan odgovor (PR). PFS je definisan kao vreme od datuma prve doze anti-OX40 antitela do progresije bolesti ili smrti, bez obzira koji se prvi desi. OS je definisan kao vremensko razdoblje bilo od datuma dijagnoze ili početka lečenja bolesti, ako su pacijenti kojima je dijagnostikovana bolest još uvek živi. DOR se definiše kao vreme od početnog CR ili PR učesnika do vremena progresije bolesti. DpR je definisan kao procenat smanjenja tumora posmatran pri maksimalnoj tački odgovora u poređenju sa osnovnim tumorskim opterećenjem. Kliničke krajnje tačke za ORR i PFS mogu biti određene na osnovu gore opisanih kriterijuma RECIST 1.1.
[0123] Dodatni kriterijumi koji se mogu koristiti za kliničku procenu specifičnu za pacijente obolele od raka koji su podvrgnuti tretmanu imunoterapije uključuju standardizovane imunopovezane kriterijume RECIST (irRECIST). Videti npr., Nishino, M. i sar. Eur. J. Radiol., 84 (7), stranice 1259-1268 (juli 2015). Ove smernice su modifikovale gornji kriterijum RECIST 1.1, uzimajući u obzir potencijalne imunomodulatorne efekte. TABELA 9 daje definicije kriterijuma odgovora koji se koriste za određivanje objektivnog odgovora tumora na imunomodulatorni lek, kao što su ovde opisana antitela anti-OX40.
(nastavak)
[0124] ECOG Skala radnog statusa prikazana u TABELI 10 je korišćena za opisivanje nivoa funkcionisanja pacijenata u smislu njihove sposobnosti da se brinu o sebi, dnevnim aktivnostima i fizičkim sposobnostima. Skalu je razvila Istočna Kooperativna Onkološka Grupa (ECOG), koja je sada deo grupe za istraživanje raka ECOG-ACRIN, a objavljena je 1982. godine.
[0125] Još jedan set kriterijuma koji se mogu koristiti za potpunu karakterizaciju i određivanje odgovora na imunoterapijska sredstva, kao što su terapije raka zasnovane na antitelima, su kriterijumi odgovora imunološki povezani (irRC), koji su razvijeni za merenje čvrstih tumora 2009. godine, i ažurirani 2013. godine (Wolchok i sar. Clin. Cancer Res.2009; 15 (23): 7412-7420 i Nishino, i sar. Clin. Cancer Res.2013; 19 (14): 3936-3943). Ažurirani irRC kriterijumi se obično koriste za procenu efekta imunoterapijskog sredstva, kao što je ovde opisano anti-OX40 antitelo, na tumorsko opterećenje i definiše odgovor prema TABELI 11.
[0126] Jedan primer terapijske koristi koja je rezultat upotrebe ovde opisanih antitela protiv OX40, za lečenje solidnih tumora, bilo da su primenjena kao monoterapija ili kao dodatak ili sa drugim terapijama ili agensima, je kompletan odgovor. Sledeća primerna terapijska korist nastala iz upotrebe antitela protiv OX40 za lečenje čvrstih tumora, bilo da su primenjena kao monoterapija ili kao dodatak ili sa drugim terapijama ili sredstvima, je delimičan odgovor.
[0127] Validirane skale ishoda izražene od strane pacijenta takođe, mogu biti korišćene za označavanje odgovora obezbeđenog od strane svakog pacijenta kroz poseban sistem izveštavanja. Umesto da su fokusirane na bolesti, takve skale ishoda bave se zadržanom funkcijom dok upravljaju hroničnim stanjem. Jedan neograničavajući primer validirane skale izražene od pacijenta je PROMIS® (Informacioni sistem za merenje ishoda pacijenata) iz Državnih instituta za zdravstvo Sjedinjenih Država. Na primer, PROMIS® instrument za fizičke funkcije odraslih pacijenata sa karcinomom, može da proceni samo-prijavljene sposobnosti za funkcionisanje gornjih ekstremiteta (npr., okretnost), donjih ekstremiteta (npr., hodanje ili pokretljivost) i centralnih regiona (npr., vratna, leđna pokretljivost), i uključuje rutinske dnevne aktivnosti, kao što su radni nalozi.
[0128] Kaplan-Mejerove krive (Kaplan i Meier, J. Am. Stat. Assoc.1958; 53 (282): 457-481) takođe se mogu koristiti za procenu ukupnog preživljavanja i preživljavanja bez progresije kod pacijenata sa karcinomom koji su podvrgnuti terapiji antitelima protiv OX40 u poređenju sa standardom nege.
7.6.2. Dodatne terapije
[0129] Antitela protiv OX40 mogu biti korišćena kao dodatak ili sa drugim sredstvima ili tretmanima koji imaju antikancerogena svojstva, uključujući standardne terapije nege, kao što je terapija anti-PD-1 antitelom. Kada se primenjuju dodatno, anti-OX40 antitelo i drugi agens (i) mogu biti formulisani zajedno u jednoj, kombinovanoj farmaceutskoj formulaciji, ili se mogu formulisati i primenjivati odvojeno, bilo pri jednom koordinisanom režimu doziranja ili pri različitim režimima doziranja. Sredstva koja su primenjena dodatno ili sa anti-OX40 antitelima obično imaju komplementarne aktivnosti u odnosu na antitela protiv OX40 tako da antitela i drugi agensi ne utiču negativno jedni na druge.
7.7. Doziranje i režimi primene
[0130] Količina primenjenih antitela protiv OX40 zavisiće od različitih faktora, uključujući, ali nije ograničena na, određeni tip raka koji se leči, stadijum raka koji se leči, način primene, učestalost primene, željenu terapijsku korist i druge parametre, kao što su starost, težina i druge karakteristike pacijenta, itd. Određivanje efikasnih doza za obezbeđivanje terapijske koristi za specifične načine i učestalost primene su u okviru mogućnosti stručnjaka u struci.
[0131] Doze efikasne za pružanje terapijske koristi mogu se u početku proceniti na in vivo modelima životinja. U struci su poznati pogodni životinjski modeli za širok spektar bolesti.
[0132] Ovde otkrivena antitela protiv OX40, mogu biti primenjivana bilo kojim načinom koji odgovara stanju koje će biti tretirano. U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela sa teškim lancem koji ima aminokiselinsku sekvencu prema bilo kojoj od SEK ID BR-a: 41-48, i lakim lance koji ima aminokiselinsku sekvencu prema bilo kojoj jedan od SEK ID BR: 51-54. U određenim realizacijama, antitelo protiv OX40 ima teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 41 ili 42, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEK ID BR: 51. Antitelo protiv OX40 će obično biti primenjivano parenteralno, tj. infuzijom, intravenska (IV), intratekalna, bolusna, intratumoralna injekcija ili epiduralno (Shire i sar., 2004, J. Pharm. Sciences 93 (6): 1390-1402). U jednoj realizaciji, antitelo protiv OX40 je obezbeđeno u obliku liofilizovanog praška u bočici. Pre primene, liofilizovani prašak se rekonstituiše sterilnom vodom za injekcije (SWFI) ili drugim pogodnim medijumom da bi se dobio rastvor koji sadrži antitelo protiv OX40. U nekim realizacijama, dobijeni rekonstituisani rastvor se dalje razblažuje fiziološkom rastvorom ili drugim pogodnim medijumom za infuziju i primenjuje putem IV infuzije jednom u dve nedelje, tj. svakih 13, 14 ili 15 dana.
[0133] U nekim realizacijama, anti-OX40 antitelo je primenjeno u obliku IV infuzije jednom svake dve nedelje pri 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg ili 3,0 mg/kg.
[0134] Kada se primenjuju dodatno sa ili sa drugim agensima, kao što su druga hemoterapijska sredstva, antitela protiv OX40 mogu biti primenjena po istom rasporedu kao i druga sredstva ili drugačijim rasporedom. Kada se primenjuje po istom rasporedu, anti-OX40 antitelo može biti primenjivano pre, posle ili istovremeno sa drugim sredstvom.
[0135] Kao što će razumeti stručnjaci u ovoj oblasti, preporučene doze za različite agense gore opisane, možda će biti potrebne da se prilagode da bi se optimizovao odgovor pacijenta i maksimalizovala terapijska korist.
8. PRIMERI
[0136] Sledeći primeri, koji ističu određene karakteristike i svojstva oglednih realizacija anti-OX40 antitela, ovde opisanih, dati su u svrhu ilustracije, a ne ograničavanja.
Primer 1: Materijali i metode
8.1.1. Anti-OX40 antitelo koje se vezuje za humani OX40 pomoću ELISA
[0137] Ploče Immunolon 4xHB sa 96 bazenčića (Thermo Scientific) obložene su sa 1 µg/mL humanog OX40-FC (R&D sistemi), na 4 ° C preko noći. Ploče su blokirane sa fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) koji sadrži 1% goveđeg serumskog albumina (BSA) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim tri puta isprane sa PBST-om (PBS sa 0,1% Tween 20) korišćenjem mašine za pranje ploča. Ploče obložene OX40 su zatim inkubirane sa naznačenim koncentracijama ispitivanog antitela, na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Ploče su isprane četiri puta sa PBST i zatim inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa 100 µL kozjih anti-humanih specifičnih Fab fragmenata-Biotina (Jackson ImmunoResearch), pripremljenog do razblaženja od 1: 5000 u PBS-u koji sadrži 1% BSA. Ploče su zatim isprane pet puta u PBST-u i dodato je 100 µL od razblaženja u odnosu 1: 1000 od streptavidinaperoksidaze rena (HRP) (Thermo Scientific) u svaki bazenčić i inkubirano tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su naknadno isprane pet puta u PBST-u i dodato je 100 µL TMB One component (Surmodics) u svaki bazenčić i inkubirano na sobnoj temperaturi (RT) do razvijanja boje (približno 5-10 minuta). Optička gustina (OD) je očitana na 650 nm (Molecular Devices Spectromax190).
8.1.2. Anti-OX40 antitela koja se vezuju za OX40 Cinomolgus majmuna pomoću ELISA
[0138] Ploče Imunolon 4xHB sa 96 bazenčića (Thermo Scientific) su obložene sa 1 µg/mL Cyno OX40-Fc fuzije, na 4 ° C preko noći. Ploče su blokirane sa PBS-om koji sadrži 1% goveđeg serumskog albumina (BSA) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim isprane tri puta sa PBST-om (PBS sa 0,1% Tween 20). Ploče obložene OX40 su zatim inkubirane sa naznačenim koncentracijama anti-OX40 antitela, na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Ploče su isprane četiri puta sa PBST-om i zatim inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa 100 μL kozjeg anti-humanog Fab fragmenta specifičnog-Biotina (Jackson ImmunoResearch), pripremljenog do razblaženja od 1: 5000 u PBS-u koji sadrži 1% BSA. Ploče su zatim isprane pet puta u PBST-u i dodato je 100 μL razblaženja streptavidina-HRP-a (Thermo Scientific) od 1: 1000 u svaki bazenčić i inkubirano tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pet puta u PBST-u i dodato je 100 μL TMB One component (Surmodics) u svaki bazenčić i inkubirano na sobnoj temperaturi do razvijanja boje (približno 5-10 minuta). Optička gustina (OD) je očitana na 650 nm (Molecular Devices Spectromax190).
8.1.3. Anti-OX40 antitelo koje se vezuje za OX40 Rhesusa protočnom citometrijom
[0139] Rhesus macaque (Macaca mulatta) OX40 je identičan na aminokiselinskom nivou cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) OX40 (SEK ID BR: 2). Ćelijska linija 293 NF-κΒ reportera koja izražava OX40 rhezusa je kultivisana u Dulbeccovom modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (FBS) i penicilin/streptomicin. Za ispitivanje vezivanja, ćelije su ponovo suspendovane na 5 miliona ćelija po mL. 50 μL (250, 000 ćelija) po bazenčiću je prebačeno u svaki bazenčić ploče sa 500 μL polipropilena od 96 bazenčića (Nunc). U posebnoj ploči za razblaživanje je pripremljeno 2X osnovnog rastvora ispitivanog anti-OX40 antitela ili izotipskog kontrolnog monoklonskog antitela pri 666, 333, 111, 37,03, 12,34, 4,11, 0,457, 0,152, 0,0508, 0,0169, 0,00564 nM, u medijumu za kulturu. Monoklonska antitela (50 μL po bazenčiću) su prebačena u odgovarajuće bazenčiće na ispitivanoj ploči. Ćelije su inkubirane sa primarnim antitelima tokom 30 minuta na 4 ° C i isprane dva puta sa 250 μL po bazenčiću PBS-a, centrifugiranjem pri 800 o/min tokom 3 minuta. Vezano antitelo je detektovano sa Cy5-anti-humanim IgG magarca (H L) (Jackson ImmunoResearch) razblaženog do 2 μg/mL (50 μL po bazenčiću) u PBS-u, tokom 30 minuta na 4 ° C. Ćelije su isprane jednom sa 250 μL/bazenčić PBS-a, resuspendovane u PBS-u koji sadrži 1% formalmaldehida i analizirane na dualnom laseru FACSCalibur (Becton Dickinson).
8.1.4. Afinitet vezivanja anti-OX40 antitela za humani i Rezusni OX40 pomoću površinske plazmonske rezonance
[0140] Kinetike vezivanja anti-OX40 antitela za rekombinantno rastvorljivi OX40 ECD (vanćelijski domen) su određene merenjima zasnovanim na površinskoj plazmonskoj rezonanci na Biacore T200 instrumentu (GE Healthcare), na 25 ° C korišćenjem pristupa ispitivanja anti-Fc hvatanja. Rekombinantni ekstracelularni domeni (ECD) humanog OX40 (ostaci 1-216) i rezus makaki OX40 (ostaci 28-214) su nabavljeni (Creative Biomart) i dalje prečišćeni gel filtracijom korišćenjem Superdex200 (GE Healthcare) u 10 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonske kiseline (HEPES), pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA). Rhesus macaque (Macaca mulatta) OX40 je na nivou aminokiselina identičan cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) OX40 (SEK ID BR: 2). Priprema čipa i merenja kinetike vezivanja su izvedeni u ispitivanom puferu HBS-EP (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% Tween 20). Za pripremu čipa protiv Fc hvatanja, oko 2000 rezonantnih jedinica (RU) kozjeg anti-humanog IgG Fc poliklonskog antitela (Thermo Fisher Scientific Inc.), razblaženog do 25 μg/mL u 10 mM natrijum acetata (pH 4,5), bilo je direktno imobilisano preko CM5 biosenzornog čipa koristeći standardni set za kuplovanje amina prema uputstvima i postupcima proizvođača. Ostaci koji nisu reagovali na površini biosenzora blokirani su sa etanolaminom. Za merenja kinetike vezivanja, svaki ciklus ispitivanja se sastojao od sledećih koraka: 1) hvatanje ispitivanog anti-OX40 antitela samo na ispitivanoj površini; 2) injektovanje analita (samo OX40 ECD ili pufera) i preko referentne i ispitivane površine, 240 μL pri 80 μL/min, nakon čega je praćena disocijacija tokom 900 sekundi pri 80 μL/min; 3) regeneracija površine hvatanja pomoću 10 mM glicina-HCl, injekcije pH 1,5 i preko referentne i ispitivane površine.
Tokom ispitivanja, sva merenja su upućivana samo prema površini hvatanja (tj. bez zarobljenih ispitivanih antitela) i samo injekcije pufera su korišćene za dvostruko referenciranje. Injekcije OX40 su se kretale u koncentraciji od 900 nM ili 300 nM do 11,11 nM u randomizovanim serijskim razblaženjima od 9-ili 3-puta. Podaci su obrađeni i podešeni globalno na model vezivanja 1: 1 korišćenjem softvera Biacore T200 evaluacije za određivanje konstanti kinetičke brzine vezivanja, ka(M<-1>s<-1>) i kd(s<-1>) i konstante ravnoteže disocijacije KD(M).
8.1.5. Blokiranje OX40 liganda sa Anti-OX40 antitelom
[0141] Jurkat-ove ćelije stabilno transficirane sa humanim OX40, kultivisane pri 2 x 10<5>ćelija po bazenčiću su istovremeno bile inkubirane sa 0,2 µg/mL ispitivanog antitela protiv OX40 i titracijom rastvorljivog humanog OX40L (R&D systems) u PBS-u koji sadrži 1% BSA, u ploči okruglog dna sa 96 bazenčića, tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane dva puta i inkubirane tokom dodatnih 30 minuta sa 100 μL razblaženja od 1: 500 kozjeg-antihumanog Fc-PE po bazenčiću (Jackson ImmunoResearch). Ćelije su zatim isprane dva puta i uzete korišćenjem FACSCanto (BD Biosciences), i analizirane korišćenjem FACSDiva.
8.1.6. Vezivanje Anti-OX40 antitela na ćelijsku površinu izraženog humanog OX40
[0142] Jurkat-ova NF-κΒ ćelijska linija reportera koja izražava humani OX40 protein je kultivisana u DMEM-u koji sadrži 10% FBS-a i penicilin / streptomicin (pen / strep). Za ispitivanje vezivanja, svaka ćelijska linija je ponovo suspendovana na 5 miliona ćelija po mL.
50 μL (250,000 ćelija) / bazenčić je prebačeno u svaki bazenčić ploče sa 96 bazenčića od 500 μL polipropilena (Nunc). Pripremljen je 2X osnovni rastvor ispitivanog anti-OX40 antitela ili izotipskog kontrolnog mAt u odvojenoj ploči za razblaživanje na 666, 333, 111, 37,03, 12,34, 4,11, 0,457, 0,152, 0,0508, 0,0169, 0,00564 nM u medijumu za kulturu. Svako antitelo (50 μL /bazenčić) je prebačeno u odgovarajuće bazenčiće ispitivane ploče. Ćelije su inkubirane tokom 30 minuta na 4 ° C sa ispitivanim anti-OX40 antitelom ili izotipskim kontrolnim antitelima i isprane dva puta sa 250 μL/bazenčić PBS-a centrifugiranjem pri 800 o/min tokom 3 minuta. Vezano antitelo je detektovano sa Cy5-anti-humanim IgG magarca (H+L) (Jackson ImmunoResearch) razblaženog na 2 µg/mL (50 μL/bazenčić) u PBS-u, tokom 30 minuta na 4 ° C. Ćelije su isprane jednom sa 250 μL/bazenčić PBS-a, resuspendovane u PBS-u koji sadrži 1% formalmaldehida i analizirane na dualnom laseru FACSCalibur (Becton Dickinson).
8.1.7. Vezivanje Anti-OX40 antitela za himerni receptor OX40
[0143] Transfektanti na bazi 293s su generisani da izraze himerne verzije humanog molekula OX40 sa mišjim domenima OX40 bogatim cisteinom (CRD-ovima) pojedinačno zamenjenim u odgovarajuće humane CRD-ove. Nakon selekcije G418, preživele ćelije su sortirane za ekspresiju na protočnom citometru MoFlo (Beckman): 293s-huOX40, 293s-huOX40-muCRD1, 293s-huOX40-muCRDII, 293s-huOX40-muCRDIII, 293s-huOX40-muCRDIV, 293s-huOX40-muCRDII+III i 293s-muOX40. Ukupno 2 x 10<5>od svake 293 s OX40 himerne ćelije transfektanta je dodato po bazenčiću u 500 μL polipropilenske ploče od 96 bazenčića (Nunc). Nakon nanošenja ćelija na ploču, 50 μL Hu3738 ili izotipskog kontrolnog antitela u koncentraciji od 2 µg/mL je dodato u odgovarajuće bazenčiće u duplikatu za svaku ćelijsku liniju i ostavljeno da se inkubira na ledu tokom 30 minuta. Nakon inkubacije, 200 μL Dulbeccovog fosfatno puferovanog fiziološkog rastvora (DPBS) je dodato u svaki bazenčić i ploče su centrifugirane na 1000 obrtaja tokom tri minuta. Supernatanti su uklonjeni iz svakog bazenčića i dodato je 50 μL Cy5-magarećeg anti-humanog IgG (Jackson ImmunoResearch) sekundarnog antitela u razblaženju od 1: 250, koje je zatim inkubirano tokom 30 minuta na ledu na tamnom. Nakon perioda inkubacije, dodato je 200 μL DPBS-a pre centrifugiranja ploče na 1000 obrtaja tokom tri minuta. Supernatanti su uklonjeni i svaki bazenčić je ponovo suspendovan sa 100 μL DPBS-a 1% formalmaldehida. Uzorci su analizirani na dualnom laserskom FACSCalibur protočnom citometru (Becton Dickinson).
8.1.8. NF-κB Fluorescentna reporterska aktivnost za humani i rezusni OX40
[0144] Jurkat-NF-κB-huOX40 i 293-NF-κB-RhOX40, NF-κB ćelijske linije reportera koje eksprimiraju humane i rezusne OX40 proteine, respektivno, održavane su u medijumu za kulturu koji sadrži DMEM koji sadrži 10% FBS-a i penicilin / streptomicin (100 U/mL). Za ispitivanje NF-κΒ reportera, ćelijska linija Jurkat-NF-κB-huOX40 je resuspendovana u medijumu za rast (identična kulturi medijuma) pri 1 milion/mL (krajnjih 50,000 ćelija po bazenčiću) i ćelijska linija 293-NF-κB-RhOX40 linija je ponovo suspendovana u medijumu za rast pri 0,5 miliona/mL (finalnih 25,000 ćelija/bazenčić). 50 μL/bazenčić je prebačeno u unutrašnjost 60 bazenčića ploče za ispitivanje sa 96 bazenčića sa belim/bistrim dnom (Costar 3903). Napravljen je 3X štok sledećih antitela na odvojenoj ploči za razblaživanje sa 96 bazenčića sa U-dnom (Becton Dickinson): antitela protiv PD-1 korišćenog kao negativno kontrolno antitelo i anti-OX40 antitela. Serijska razblaženja za ispitivanje aktivnosti antitela bez egzogenog linkera umrežavanja uključuju 2000, 500, 125, 31,25, 7,812, 1,953, 0,488, 0,122, 0,0305, 0,00762 nM u medijumu za kulturu. Serije razblaženja za ispitivanje efekta unakrsnog linkera na aktivnost antitela protiv OX40 uključuju 200, 50, 12,5, 3,125, 0,7812, 0,1953, 0,0488, 0,0122, 0,00305, 0,000762 nM antitelo. U duplikatu, 50 μL antitela po bazenčiću je prebačeno u odgovarajuće bazenčiće ispitivane ploče. U ploče koje sadrže samo antitelo, dodato je 50 μL po bazenčiću medijuma u 60 unutrašnjih bazenčića. Za serije razblaženja umreženih linkera, kozji anti-humani IgG Fc specifični (Jackson ImmunoResearch) je razblažen na 800, 200, 50, 12,5, 3,125, 0,7812, 0,1953, 0,0488, 0,0122, 0,00305 nM i 50 µL/bazenčić je prebačeno u 60 unutrašnjih bazenčića da bi se održao odnos 4: 1 anti-OX40 antitela i unakrsnog linkera. Medijum za rast (150 μL) je dodat u spoljne bazenčiće da spreči isparavanje u 60 unutrašnjih bazenčića. Ploče su inkubirane na 37 ° C tokom približno 18 sati. Aktivnost luciferaze je kvantifikovana sa BriteLite Plus (Perkin Elmer). Ukratko, supstrat je rastvoren sa 10 ml pufera obezbeđenog od dobavljača, a 75 μL supstrata po bazenčiću je dodato 60 unutrašnjim bazenčićima iz svake ploče. Ploče su analizirane na Victor5 (Molekularni uređaji) koristeći podešavanja luminiscencije.
8.1.9. Ispitivanje ADCC reportera
[0145] ADCC efektorske ćelije koje eksprimiraju humani FcyRIII (Promega) su odmrznute i uzgajane u skladu sa preporukama protokola. Ćelije su podeljene dva puta pre upotrebe. Kao ciljne ćelije korišćene su HEK293 ćelije stabilno transficirane bilo sa ljudskim ili rezusnim OX40. Ove ćelije su umnožene u HyClone™ DMEM-u sa 10% toplotno inaktiviranim FBS-om (Sigma) i 5 μg/mL Blasticidina (Gibco Life Technologies).
[0146] Dan pre ispitivanja, sakupljene su ciljne ćelije HEK293 koje izražavaju OX40 sa 0,25% Tripsina (Gibco Life Technologies). Ćelije su isprane, prebrojane i zasejane na 10,000 ćelija po bazenčiću u Costar ploče sa 96 bazenčića (Corning). Ploče su inkubirane preko noći na 37 ° C u DMEM-u 10% FBS. Efektorske ćelije ADCC bioeseja, protokol modela širenja G7102 je praćen za test. Odnos efektora prema ciljnoj ćeliji je bio 7,5: 1. Luminescencija je merena EnSpire Alpha čitačem (Perkin Elmer) korišćenjem EnSpireManager softvera. Antitela koja su testirana u ovom testu uključuju, izotipsko kontrolno antitelo i anti-OX40 antitela.
8.1.10. Vezivanje anti-OX40 antitela za aktivirane humane CD4 T ćelije
[0147] Humane mononuklearne ćelije periferne krvi su izolovane iz sastojaka krvi koji sadrže znatan udeo leukocita i krvnih pločica nabavljenih od Stanford Blood Center (Palo Alto, Kalifornija). Ukratko, "buffy coats" su razblaženi u odnosu 1: 1 sa PBS-om bez magnezijuma i kalcijuma (GE Healthcare). Razblažena krv (30 mL) je naneta preko 15 mL 90% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) pripremljenog u PBS-u bez magnezijuma i kalcijuma (GE Healthcare) sadržanog u epruvetama SepMate (Stemcell Technologies). Epruvete su centrifugirane na 1200 g tokom 10 minuta. Interfaza je sakupljena i isprana dva puta u IX PBS-u. CD4<+>T ćelije su izolovane korišćenjem kompleta za obogaćivanje Stemcell Technologies CD4 (tehnologija matičnih ćelija). Ćelije su ponovo suspendovane pri 2x10<6>ćelija/mL u RPMI/10% FBS. Zrna Dynal CD3/28 (Life Technologies) su dodata u odnosu 1: 1. Ćelije su inkubirane na kraju preko kraja rotatora na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta. Ćelije su kultivisane u ploče sa 6 bazenčića, tokom 24 sata na 37 ° C.
[0148] Nakon 24 sata, zrna su uklonjena sa magnetom. Ćelije su izbrojane i resuspendovane do 1,5x10<6>/mL. Korišćen je alikvot ćelijske suspenzije (100 μL) po mrlji. Ispitivano antitelo je titrirano u serijama razblaženja od 4 puta polazeći od 1 µg/mL. Ćelije su obojene tokom 30 minuta i isprane dva puta. Razblaženje u odnosu 1: 250 od (4 µg/mL) kozjeg anti-humanog Fc specifičnog-PE po bazenčiću (Jackson ImmunoResearch) je dodato u 100 μL/bazenčić PBS-a koji sadrži 1% BSA. Ćelije su obojene tokom dodatnih 30 minuta i isprane dva puta, prebačene u epruvete i uzete korišćenjem protočnog citometra BD LSR Fortessa i analizirane korišćenjem softvera za analizu FACSDiva verzije 8.0.1.
8.1.11 Vezivanje anti-OX40 antitela za aktivirane T ćelije Cinomolgusa
[0149] Cela krv Cinomolgus majmuna je dobijena od majmuna širom sveta. Za izolovanje PBMC-a, cela krv je razblažena u odnosu 1: 1 sa PBS-om bez magnezijuma i kalcijuma (GE Healthcare). Razblažena krv (30 mL) je naneta slojevito ispod 13 mL 95% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) pripremljenog u PBS-u bez magnezijuma i kalcijuma (GE Healthcare) u konusnim epruvetama od 50 ml. Epruvete su centrifugirane na 1000 g tokom 25 minuta. Interfaza je sakupljena i isprana dva puta u IX PBS-u. Ćelije su resuspendovane na 2 x 10<6>ćelija/mL u RPMI / 10% FBS-u. Ćelije su inkubirane tokom 72 sata sa 10 mg/mL fitohemaglutinina (PHA) (Sigma) i 100 U/mL rekombinantnog humanog interleukina-2 (IL-2) (Proleukin®, Prometheus) u pločama sa 6 bazenčića. Nakon 24 sata, ćelije su isprane, prebrojane i ponovo suspendovane do 2x10<6>/mL. Korišćeno je 100 μL ćelija po mrlji. Ispitivano anti-OX40 antitelo je titrirano četvorostrukim serijskim razblaženjima polazeći od 1 µg/mL. Ćelije su obojene tokom 30 minuta i isprane dva puta. Razblaženje u odnosu 1: 250 od (4 µg/mL) kozjeg anti-humanog IgG Fc specifičnog-PE (Jackson ImmunoResearch) u 100 μL PBS-a koji sadrži 1% BSA je dodato po bazenčiću. Ćelije su obojene tokom dodatnih 30 minuta i isprane dva puta, prebačene u epruvete i dobijene korišćenjem protočnog citometra BD LSR Fortessa i analizirane korišćenjem softvera za analizu FACSDiva verzije 8.0.1.
8.1.12. Proliferacija aktiviranih humanih T ćelija i indukcija IFN-γ
[0150] Humani sastojci krvi za značajnim udelom leukocita i krvnih pločica ("buffy coats") su nabavljeni iz Centra za krv u Stenfordu (Palo Alto, Kalifornija). Za izolovanje humanih PBMC-a, "buffy coats" su razblaženi u odnosu 1: 1 sa PBS-om bez magnezijuma i kalcijuma (GE Healthcare). Razblažena krv (30 mL) je naneta slojevito preko 15 mL 90% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) pripremljenog u PBS-u bez magnezijuma i kalcijuma (GE Healthcare) koji je sadržan u epruvetama SepMate (Stemcell Technologies). Epruvete su centrifugirane na 1200 g tokom 10 minuta. Interfaza je sakupljena i isprana dva puta u IX PBS-u. CD4<+>T ćelije su izolovane iz PBMC-a korišćenjem EasySep kompleta za obogaćivanje CD4<+>T ćelija (Stemcell Technologies). CD4<+>T ćelije su kultivisane pri 2 x 10<6>ćelija/mL u RPMI 10% FCS plus 2 µg/mL PHA (Sigma) i 20 IU/mL rekombinantnog humanog IL-2 (Proleukin®, Prometheus) u pločama sa 6 bazenčića tokom 72 sata.
[0151] Bio-obložene kontrolne ploče za aktivaciju T ćelija - ploče sa 96 bazenčića (Corning) su obložene sa 2 µg/mL kozjeg anti-mišjeg IgG Fc-specifičnog (Jackson ImmunoResearch) i 2 µg/mL kozjeg anti-humanog IgG-Fc specifičnog (Jackson ImmunoResearch) u 100 µL/bazenčić PBS-a, preko noći na 4 ° C. Ploče su blokirane sa 200 µL po bazenčiću 1% BSA (Rockland) u PBS-u, tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane dva puta sa 200 µL po bazenčiću PBS-a. Dodato je 4 ng/mL anti-humanog CD3 OKT3 (eBioscience) u 100 µL/bazenčić PBS-a i inkubirano tokom 90 minuta na 37 ° C. Ploče su isprane dva puta sa 200 µL/bazenčić PBS-a. Pločama su dodata trostruka serijska razblaženja anti-OX40 antitela i izotipskog kontrolnog monoklonskog antitela polazeći od 5 µg/mL u 100 μL PBS-a. Ploče su inkubirane tokom 90 minuta na 37 ° C. Ploče su isprane dva puta sa 200 μL/bazenčiću PBS-a. Isprane PHA i IL-2 aktivirane CD4<+>T ćelije (2x10<5>) su dodate u svaki bazenčić.
[0152] Nakon 48 sati kulture na 37 ° C, sakupljeno je 30 μL supernatanta iz svakog duplikata za analizu IFN-γ sa Luminexom (Millipore) i analizirano na Bioplex Manager 6.0 (BioRad).
Ploče su pulsirane sa 0,25 μCi<3>H-timidina (Perkin Elmer) preko noći i sakupljene sledećeg jutra na Filtermats (Perkin Elmer) sa 5 ml Ultima Gold Scintilacione tečnosti (Perkin Elmer). Filterske podloge su izbrojane na 1450 Microbeta Wallac Trilux brojaču (PerkinElmer).
8.1.13. Ispitivanja supresije humane regulatorne T ćelije
[0153] Sveže mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su dobijene putem AllCells ili Stemcell tehnologija. Ćelije su centrifugirane, ćelijski pelet je ponovo suspendovan sa IX PBS-om i ponovo je centrifugiran na 1200 obrtaja, tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Supernatanti su uklonjeni i ćelije su ponovo suspendovane sa RoboSep puferom (Stemcell Technologies). Stabilnost ćelija i broj ćelija su određivani korišćenjem Vi-Cell XR ćelijskog brojača Beckman Coulter.100-150 miliona ćelija je izdvojeno za obogaćivanje CD4<+>T ćelija korišćenjem Stemcell kompleta EasySep humanog CD4<+>T ćelijskog obogaćivanja. Obogaćene CD4<+>T ćelije su zatim ispražnjene od CD25<+>ćelija korišćenjem selekcionog kompleta Stemcell EasySep Humani CD25<+>. Ovaj proces je rezultirao prečišćenim CD4<+>/ CD25<->T ćelijama odgovora (Tresp). Preostali PBMC su korišćene za izolovanje regulatornih T ćelija (Treg) praćenjem uputstava iz kompleta Stemcell EasySep Human CD4<+>/CD1271ow/CD49d-Regulatornog T ćelijskog obogaćivanja. Nakon izolacije CD4<+>/ CD25<->Tresp i Treg, ćelije su ponovo suspendovane sa RPMI 1640 sa 10% toplotno inaktiviranim FBS-om i 0,01 mM 2-Merkaptoetanolom na 1 x 10<6>ćelija/mL i 5 x 10<5>ćelija / mL respektivno .
[0154] Ispitivanje supresije Treg je postavljeno korišćenjem dva različita odnosa Tresp-a prema Treg-a od 2: 1 i 4: 1. Za odnos 2: 1, 5 x 10<4>Tresp ćelija i 2,5 x 10<4>Treg ćelija je dodato u ploče sa U-dnom sa 96 bazenčića. Za odnos 4: 1, na ploču sa 96 bazenčića dodato je 5 x 10<4>Tresp ćelija i 1,25 x 10<4>Treg ćelija. Zrnasti reagens za praćenje supresije Treg (Miltenyi Biotec) je takođe dodat bazenčićima pri odnosu zrna prema ćeliji od 1: 1 za stimulaciju. Antitelo protiv OX40 i izotipski kontrolni humani IgG1su ispitivani u triplikatu pri finalnoj koncentraciji od 10 µg/mL u odsustvu ili prisustvu F(ab')2kozjeg anti-humanog (GxHu) IgG, specifičnog za Fc (Jackson ImmunoResearch), u odnosu 1: 4. Ploče su inkubirane na 37 ° C u 5% CO2tokom četiri dana. Ploče su tretirane sa 1 μCi/bazenčić<3>H-timidina i dalje inkubirane dodatnih 16 sati, na 37 ° C u 5% CO2. Nakon inkubacije, ploče su sakupljene i proliferacija izmerena korišćenjem Ultima Gold scintilacione tečnosti (Perkin Elmer) i 1450 Microbeta Wallac Trilux scintilacionim brojačem (PerkinElmer).
8.1.14. Model tumora miša PC-3 sa ugrađenim humanim imunološkim ćelijama
[0155] Na dan inokulacije, izbrojane su pomoću Vi-Cell XR (Beckman Coulter) humane T ćelije, autologne humane moDC (dendritske ćelije izvedene iz monocita) i PC-3 ćelije i kombinovane za isporuku potkožnom injekcijom od 1 x 10<7>PC-3, 1 x 10<6>T ćelija i 5 x 10<5>moDC kod NSG miševa (NOD.Cg-Prkdc<scid>II2rg<tmlWjl>/SzJ miš) u 100 μL Dulbeccovog fosfatno puferovanog fiziološkog rastvora (DPBS) (GE Lifesciences). Tretirane grupe (n = 8 miševa/ grupa) od 10 mg/kg izotipskog kontrolnog monoklonskog antitela i 10 mg/kg Hu3738 su pripremljene u 200 μL DPBS-a za intraperitonealnu injekciju. Jedna doza antitela je injektovana u vreme inokulacije ćelijske smeše. Merenje rasta tumora je procenjeno standardnim merenjima kalibra i izračunata je zapremina rasta tumora (dužina x širina x visina / 2).
8.1.15. Humani PBMC GVHD model kod NSG miševa
[0156] Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su nabavljene od AllCells (Oakland, Kalifornija). Imunodeficijentni NSG miševi (NOD.Cg-Prkdc<scid>II2rg<tmlWjl>/SzJ) su inokulirani sa 2 x 10<7>humanih PBMC-a intraperitonealno 1. dana. Antitelo protiv OX40 Hu3738 ili izotipska kontrola je primenjeno intraperitonealno jednom nedeljno počevši od prvog dana. Jednom kada su miševi ispoljili znake ponašanja bolesti kalema protiv domaćina (GVHD) (npr., pogrbljeno držanje, razbarušeno krzno), dobijeni su uzorci seruma i određeni su nivoi citokina u serumu korišćenjem eseja matrice Luminex zrna (Millipore).
Primer 2: Generacija i humanizacija mišjih anti-OX40 antitela
[0157] Miševi su imunizovani prema metoda poznatim u struci (E. Harlow, D. Lane. Antitelo: Laboratorijski priručnik, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998)). Izotip svakog monoklonskog antitela je određen korišćenjem kompleta za izotipovanje miša (Roche). Klonovi hibridoma koji proizvode antitela od interesa su prečišćeni i dalje okarakterisani na afinitet površinskom plazmonskom rezonancom i za kompeticiju liganda pomoću FACS-a.
[0158] Kloniranje i konstrukcija vektora ekspresije su postignuti postupcima poznatim u struci, za ekspresiju rekombinantnih monoklonskih antitela.
[0159] Humanizacija V regiona antitela je izvedena kao što je navedeno od strane Queen, C. i sar. (Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 1989; 86: 10029-10033). Kanonske strukture CDR-a su određene prema Huang i sar. (Methods, 2005; 36: 35-42). Identifikovane su humane varijabilne sekvence matične linije sa istim ili većinom sličnih kanonskih struktura CDR-a, i odgovarajuće sekvence humanog VH, VLi J segmenta su odabrane da obezbede okvire za varijabilni region anti-OX40. U okvirnim položajima u kojima računarski model sugeriše značajan kontakt sa CDR-om, aminokiseline iz mišjih anti-OX40 V regiona su zamenjene originalnim ljudskim okvirnim aminokiselinama (povratne mutacije).
[0160] Antitela miša protiv OX40 Mu3726, Mu3738, Mu3739 i Mu3741 su humanizovana u skladu sa gore opisanom metodom. Humanizovana verzija Mu3726 VHje bila Hu3726 VH.1a koji je imao humane VH4-28 okvirne regione, sa sedam povratnih mutacija od I48M, V67I, M69I, V71R, F78V, A93V i R94K. Hu3726 VH.1a je kombinovan sa njegovim odgovarajućim humanizovanim lakim lancem Hu3726 VL.1b koji je imao humane regione okvira VK1-39, sa dve povratne mutacije Y48F i F71Y. Humanizovana verzija Mu3738 VHje bila Hu3738 VH.
1b koji je imao humane regione okvira VH3-7, sa jednom povratnom mutacijom W47L. Hu3738 VH. 1b je kombinovan sa njegovim odgovarajućim humanizovanim lakim lancem Hu3738 VL.1 koji je imao humane VK4-1 okvirne regione i nije imao povratne mutacije. Humanizovana verzija Mu3739 VHje bila Hu3739 VH.1b koji je imao humane VH1-69 okvirne regione, sa četiri povratne mutacije M48I, V67A, E73T i S76N. Hu3739 VH.1b je kombinovan sa odgovarajućim humanizovanim lakim lancem Hu3739 VL.1b koji je imao humane VK1-39 okvirne regione, sa dve povratne mutacije V58L i F71Y. Humanizovana verzija Mu3741 VHje bila Hu3741 VH.2b koja je imala humane VH3-66 okvirne regione, sa sedam povratnih mutacija A24V, V48L, S49G, F67L, R71K, N76S i L78V. Hu3741 VH.2b je kombinovan sa odgovarajućim humanizovanim lakim lancem Hu3741 VL. 1C koji je imao humane VK1-39 okvirne regione, sa dve povratne mutacije Y36F i F71Y.
Primer 3: Afinitet vezivanja antitela protiv OX40
[0161] Tabela 3-1 niže prikazuje podatke o afinitetu vezivanja in vitro anti-OX40 antitela Hu3738 iz primera, ili literaturnih anti-OX40 antitela 11D4 ili 18D8, opisanih u US patentu br.
7,960,515. Svaki od 11D4 i 18D8 je humani IgG1, sa lakim kappa regionom.
[0162] Kao što je ovde korišćeno, 11D4 ima VHsa aminokiselinskom sekvencom prema:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIDY AD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSS
(SEK ID BR: 61) i
VLsa aminokiselinskom sekvencom prema:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPS RFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIK (SEK ID BR: 62).
[0163] 18D8 ima VHsa aminokiselinskom sekvencom prema:
EVQLVESGGGLVQPGRLSRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSI GYA DSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDQSTADYYFYYGMDVWGQGT TVT VSS ( SEK ID BR: 63) i
VLsa aminokiselinskom sekvencom prema:
EIVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA RFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIK (SEK ID BR: 64).
[0164] Hu3738 je pokazao snažna svojstva vezivanja za humani OX40 pomoću površinske plazmonske rezonance ili u transficiranim Jurkat NF-κB reporterskim ćelijama koje eksprimiraju humani OX40, kao što je mereno u ispitivanjima iz Primera 1, i veći afinitet vezivanja pomoću SPR-a u poređenju sa Hu3739 ili Hu3741.
[0165] Primerno anti-OX40 antitelo Hu3738 ispoljava unakrsnu reaktivnost protiv OX40 cinomolgus ili rezus majmuna, ali ne pokazuje značajno vezivanje za OX40 miša ili pacova. Aktivnost vezivanja Hu3738 za rekombinantni humani ili cinomolgusni (cino) OX40, ili za humani ili rezus majmuna OX40 na površini ćelije, kao što je određeno testovima opisanim u Primeru 1, sumirano je u Tabeli 3-2.
Primer 4: In vitro biološka aktivnost anti-OX40 antitela Hu3738
[0166] Da bi se procenilo vezivanje Hu3738 za endogeno eksprimirani humani OX40, ispitivane su protočnom citometrijom i aktivirane CD4<+>T ćelije i nestimulisane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). Tabela 4-1 rezimira podatke vezivanja Hu3738 za ćelijski površinski OX40 na humanim CD4<+>T ćelijama aktiviranim CD3/CD28 zrnima, ili CD4<+>T ćelijama cinomolgus majmuna aktiviranim fitohemaglutininom (PHA) i interleukinom-2 (IL-2), prema ispitivanjima opisanim u Primeru 1. Kao što je prikazano u Tabeli 4-1, Hu3738 se snažno vezuje za OX40 na aktiviranim CD4<+>T ćelijama u T ćelijskim kulturama ljudi i cinomolgusa.
[0167] Subnanomolarno vezivanje humanog OX40 pomoću Hu3738 daje funkcionalnu aktivaciju, što je pokazano povećanom proliferacijom humanih CD4<+>T ćelija periferne krvi i pojačanom proizvodnjom interferona-γ od strane humanih CD4<+>T ćelija nakon in vitro lečenja sa Hu3738, prema ispitivanjima opisanim u Odeljku 8.1.12 (Slike 1A, 1B). Kao što je prikazano u tipičnom eksperimentu prikazanom na Sl. 1A, Hu3738 je postigao povećanu proliferaciju humanih CD4<+>T ćelija periferne krvi od oko 1,5 puta do oko 6 puta u poređenju sa izotipskim kontrolnim huIgG1, što je bilo uporedivo ili veće od povećanja proliferacije primećene kada su T ćelije dozirane sa ekvivalentom količina literaturnih anti-OX40 antitela 11D4 ili 18D8. Hu3738 je pokazao EC50= 0,11 nM (16 ng/mL) u proseku davanja od osam davaoca.
[0168] SL.1C pokazuje da je proliferacija humanih CD4<+>T ćelija periferne krvi nakon in vitro tretmana sa Hu3738 bila slična sa anti-OX40 antitelom iz literature 1A7 u širokom rasponu koncentracija antitela od oko 0,001 do oko 1 μg/mL, kada je svaka testirana u skladu sa ispitivanjem proliferacije T ćelija opisanom u Odeljku 8.1.12.
[0169] Antitelo 1A7 opisano u američkoj publikaciji br.2015/0307617 je humani IgG1sa lakim lancima kappa, koji ima VHaminokiselinsku sekvencu prema:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDSYMSWVKQSHGKTLEWIGDMYP DNGDSSYNQKFREKVTLTVDKSSTTAYMEFRSLTSEDSAVYYCVLAPRWYFSV WGTGTTVTVSS (SEK ID br.69) i,
VLaminokiselinsku sekvencu u skladu sa:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLR SGVPSRFSGSGSGKDYFLTISNLEQEDVAAYFCQQGHTLPPTFGGGTKLEIK
(SEK ID BR: 70).
[0170] Kao što je prikazano u tipičnom eksperimentu opisanom na SL.1B, povećana je proizvodnja IFN-γ u humanim CD4<+>T ćelijama od oko 2 do 10 puta kada je tretirano sa Hu3738 u ispitivanom rasponu koncentracije. U pogledu proizvodnje IFN-γ, Hu3738 je ispoljio EC50= 0,16 nM (24 ng/mL) u proseku davanja od devet davaoca. Literaturna anti-OX40 antitela 11D4 i 18D8 takođe, pokazuju sličan efekat na proizvodnju IFN-γ pod ovim uslovima ispitivanja.
[0171] SL.1D pokazuje da Hu3738 utiče na veći porast produkcije IFN-γ u humanim CD4<+>T ćelijama u poređenju sa literaturnim anti-OX40 antitelom 1A7, kada je svako testirano u skladu sa ispitivanjem proizvodnje IFN-γ od strane T ćelija opisanom u Odeljku 8.1.12.
[0172] Pored efekata nishodne signalne aktivacije u povećanju proliferacije CD4<+>T ćelija i povećanju proizvodnje IFN-γ, anti-OX40 antitelo Hu3738 iz primera, takođe inhibira aktivnost humanih T regulatornih ćelija in vitro, sugerišući da T regulatorne ćelije unutar čvrstog tumora, koje mogu inhibirati imunološki odgovor od strane tela da napadne tumor, mogu biti suzbijene primenom Hu3738.
[0173] Uticaj Hu3738 na T regulatornu aktivnost je procenjen in vitro prema ispitivanju opisanom u odeljku 8.1.13. Autologne CD4<+>/ CD25<->T ćelije odgovora (Tresp) ćelije su zajedno kultivisane sa CD4<+>/CD25<+>/CD127low T regulatornim (Treg) ćelijama i aktivatorskim zrnima (Insp) u odnosu Tresp: Treg od 2: 1 ili 4: 1 (SL. 2A, 2B). U nedostatku Treg-a, Tresp ćelije su proliferisale kao odgovor prema zrnima aktivatora. U prisustvu Treg ćelija, proliferacija je inhibirana. Uključivanje 10 μg/mL Hu3738 u medijume za kulturu nije uticalo na suzbijanje posredovano Treg ćelijama. Izotipska kontrola koja je korišćena za ovo ispitivanje T regulatornog suzbijanja je bio huIgG1sa varijantama konstantnog regiona L234A i L235A. Odvojeni eksperimenti izvedeni upotrebom huIgG1izotipske kontrole sa unakrsnim linkerom nisu pokazali efekat na ispitivanje.
[0174] Suprotno tome, u prisustvu egzogenog unakrsnog linkera, Hu3738 je rezultirao potpunom obnovom Tresp proliferacije (slike 2A i 2B). Hu3738 u prisustvu unakrsnog linkera poboljšava proliferaciju u ovom testu iznad nivoa Tresp odgovora prema zrnima aktivatora samostalno. Ovaj rezultat sugeriše da signali OX40 mogu prevazići supresiju posredovanu T regulatornim ćelijama i mogu poboljšati antigen specifične odgovore u skladu sa gore navedenim rezultatima.
[0175] ADCC aktivnost posredovana od strane Hu3738 je procenjena korišćenjem komercijalno dostupnog ADCC reporterskog eseja, kao što je opisano u odeljku 8.1.9. Ovaj esej je koristio konstruisane Jurkat-ove ćelije koje eksprimiraju humani FcyRIIIa i nuklearni faktor aktiviranih T ćelija (NFAT) reportera kao efektorske ćelije. HEK 293 ćelije koje eksprimiraju humani OX40 korišćene su kao ciljane ćelije, a očekuje se da se antitelo protiv OX40 vezuje za OX40 eksprimiran na ciljnim ćelijama. Pored toga, očekivano je da će se Fc region Hu3738 vezati za FcyRIIIa receptore na ćelijskoj površini ćelija reportera. Ovi događaji vezivanja bi rezultirali višestrukim umrežavanjem dve vrste ćelija što dovodi do aktivacije ADCC reporterske aktivnosti, efekta koji je meren očitavanjem luminescencije kao rezultat aktivacije NFAT puta. U poređenju sa izotipskom kontrolom, Hu3738 je povećao ADCC reportersku aktivnost, sa EC50= 0,51 nM (77 ng/mL).
Primer 5: Klasifikacija epitopa oglednih anti-OX40 antitela
8.5.1. Vezivanje Hu3738 sa humanim/mišjim himernim OX40
[0176] Rastvorljivi OX40L je blokirao vezivanje Hu3738 za OX40 sa IC50= 67 pM (10 ng/ mL) u eseju Jurkat ćelije koja eksprimira humani OX40, opisano u Odeljku 8.1.5 (Slika 3), sugerišući da se Hu3738 vezuje za humani OX40 u regionu molekula za vezivanje liganda.
[0177] Za detaljnije mapiranje epitopa od strane vezivnog antitela Hu3738, stvoren je niz ćelijskih linija koje izražavaju humani/mišji domen bogat cisteinom (CRD) zamenjen molekulama OX40. Ova metoda se zasniva na zapažanju da Hu3738 ne vezuje mišji OX40 (slika 4B). Sekvencijalno poravnanje ljudskog OX40 (SEK ID BR: 1) sa mišjim OX40 (SEK ID BR: 3) prikazano je na Sl. 4A. Iz analize sekvenci, generisana je serija od 293s transfektanata koji izražavaju himerne verzije humanog OX40 receptora sa izmenjenim mišjim CRD sekvencama i bojenih sa Hu3738.
[0178] Aminokiselinske sekvence (uključujući signalne sekvence) himera humanog-mišjeg receptora OX40, sa regionima izmenjenim od miša koji su označeni kao podvučeni, su kao što sledi. Himera humanog OX40 sa mišjim CRDI koji zamenjuje humani CRDI ima aminokiselinsku sekvencu prema:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCD HTRDTLCHPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQP LDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPAT QPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAI LLALYLLRRDQRL PPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEK ID BR: 5),
humana OX40 himera sa mišjim CRD II koji zamenjuje humani CRDII ima aminokiselinsku sekvencu prema:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCS RSQNTVCRPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRAGTQP LDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPAT QPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAI LLALYLLRRDQRL PPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEK ID BR: 6),
humana OX40 himera sa mišjim CRDIII koji zamenjuje humani CRDIII ima aminokiselinsku sekvencu prema:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCS RSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRPGTQP RQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDP PATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGP LAILLALYLLRRDQ RLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEK ID BR: 7),
humana OX40 himera sa mišjim CRD IV koji zamenjuje humani CRD IV ima aminokiselinsku sekvencu prema:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCS RSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQP LDSYKP
GVDCAPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLDAVCEDRDPPATQPQET QGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYL LRRDQR LPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEK ID BR: 8),
i humana OX40 himera sa mišjim CRDII i CRDIII koji zamenjuje humani CRDII i CRD III ima sekvencu aminokiselina u skladu sa:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCS RSQNTVCRPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRPGTQP RQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDP PATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGP LAILLALYLLRRDQ RLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEK ID BR: 9).
[0179] Određivanje vezivanja Hu3738 za ovu seriju himera je izvršeno prema ispitivanju opisanom u Odeljku 8.1.7 za lokalizaciju mesta vezivanja za specifične CRD regione. Gubitak u vezivanju sugerisao je koji su CRD-ovi kritični za prepoznavanje OX40 određenim antitelom. U ovom slučaju, odsustvo detektibilnog vezivanja za specifični CRD-zamenjeni region kod miša ukazuje na region humanog OX40 receptora prepoznat od strane Hu3738. Pokazano je da anti-OX40 antitelo Hu3738 gubi vezivanje kada je humani CRDII zamenjen sa odgovarajućim mišjim CRDII, u skladu sa Hu3738 vezivanjem za CRDII humanog OX40 (SL.
4B).
8.5.2. Ispitivanje takmičenja sa primernim anti-OX40 antitelom Hu3738 vezanim za humani OX40
[0180] Generisana su dodatna humanizovana anti-OX40 antitela iz literature da bi se uporedila sa oglednim anti-OX40 antitelima prema pronalasku. Antitela 106-222 i 119-122, opisana u američkoj publikaciji br.2013/0280275, su humani IgG1sa lakim lancima kappa.
[0181] Antitelo 106-222 ima VHaminokiselinsku sekvencu prema:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLKWMGWINTETG EPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCANPYYDYVSYYAMDYWGQ GTTVT VSS (SEK, ID BR: 65), i
VLaminokiselinsku sekvencu prema:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYTGVPS RFS GSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPRTFGQGTKLEIK (SEK ID BR: 66).
[0182] Antitelo 119-122 ima VHaminokiselinsku sekvencu prema:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYEFPSHDMSWVRQAPGKGLELVAAINSDGGST YYPDTMERRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYDDYYAWFAYWGQGT MVTVSS (SEK ID BR: 67), i
VLaminokiselinsku sekvencu u skladu sa:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLES GVP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK (SEK ID BR: 68).
[0183] Vezivanje Hu3738 za OX40 izražen na ćelijskoj površini se pokazalo da je kompetitivno sa nekim, ali ne svim anti-OX40 antitelima iz literature pomoću direktnih kompeticionih studija. Kao što je prikazano na SL. 5, ćelije Jurkat-NF-κB-huOX40 tretirane doznom titracijom antitela iz literature, su zatim naknadno podvrgnute prema 2 µg/mL Hu3738 obeleženog fluorescentnim ALEXA FLUOR® 647, za određivanje kompeticionog vezivanja. Analiza je izvršena protočnom citometrijom. Literaturna anti-OX40 antitela 106-222 ili 1A7 su bila kompetitivna sa Hu3738. Međutim, antitela 11D4, 18D8 ili 119-122 se ne takmiče sa Hu3738 do 100 µg/mL.
Primer 6: Aktivacija OX40 od strane oglednih anti-OX40 antitela Hu3738
[0184] Podaci Jurkat NF-κΒ ćelije naglašavaju aktivirajuću sposobnost primernog anti-OX40 antitela Hu3738, čak i u odsustvu unakrsnog veznika (slike 6A, 6B). Kao što je prikazano na SL. 6A, jedina antitela protiv OX40 koja su pokazala značajnu NF-κΒ signalnu aktivnost u opsegu koncentracija od oko 0,001 do oko 100 µg/mL antitela su Hu3738 i odgovarajuće mišje Mu3738. Svakom od anti-OX40 antitela iz literature 11D4, 18D8, 106-222 i 119-122 je nedostajao značajan NF-κB signalni efekat do oko 100 µg/mL antitela.
[0185] Aktivnost Hu3738 u odsustvu egzogenog unakrsnog vezivanja se suprotstavljala nedostatku aktivnosti drugih antitela protiv OX40 iz literature, pod istim uslovima ispitivanja. Sažetak podataka NF-κB ćelijske signalizacije je prikazan u tabelama 6-1 i 6-2. Iako se Hu3738 takmičio da veže humani OX40 sa literaturnim anti-OX40 antitelima 106-222 i 1A7, Hu3738 je ispoljio drugačiju funkcionalnu aktivnost u poređenju sa svakim antitelom u odsustvu unakrsnog veznika.
[0186] Pored svoje sposobnosti da utiče na NF-κΒ signalizaciju u odsustvu egzogenog unakrsnog veznika u ćeliji Jurkat-NF-κB-huOX40, Hu3738 takođe pokazuje veću jačinu, kao što je izmereno pomoću EC50sa unakrsnim veznikom, u poređenju sa literaturnim anti-OX40 antitelima 11D4, 18D8, 106-222 i 119-122 (Tabela 6-1).
[0187] Uporedno poređenje Hu3738 sa 1A7 je prikazano na SL. 6B i sažeto je u tabeli 6-2 ispod. Pored nedostatka NF-κΒ signalizacije u odsustvu egzogenog unakrsnog veznika u ćeliji Jurkat-NF-κB-huOX40, svako od antitela koja su opisana u literaturi je takođe ispoljilo niži EC50u poređenju sa Hu3738.
Primer 7: Antitumorska aktivnost Hu3738 u modelu usvojenog transfera humane ćelije kod miša
[0188] Hu3738 je pokazao antitumorsku aktivnost u in vivo NSG modelu miša nakon pojedinačne dozne inokulacije sa ljudskim PC3 ćelijama, T ćelijama i autolognim dendritskim ćelijama dobijenim iz autolognih monocita (moDC), prema protokolu opisanom u Odeljku 8.1.14 (Slika 7). Na dan inokulacije, humane T ćelije, moDC i PC3 ćelije su isporučene subkutanom injekcijom svakom NSG mišu. Monoklonsko antitelo za kontrolu izotipa ili Hu3738 (10 mg / kg) je svako dozirano intraperitonealno po životinji u svakoj grupi za lečenje (n = 8), pri čemu se doza antitela ubrizgavala u trenutku inokulacije. Merenje rasta tumora procenjeno je standardnim merenjima kalibra i izračunata je zapremina rasta tumora (dužina x širina x visina / 2).
[0189] Kao što je prikazano na SL. 7, Hu3738 značajno inhibira rast PC3 tumora kod NSG miševa 17 dana nakon inokulacije u poređenju sa ekvivalentnom dozom antitela za kontrolu izotipa.
Primer 8: In vivo imuno aktivacija u humanom PBMC GVHD modelu
[0190] NSG miševi su bili inokulirani intraperitonealno sa humanim PBMC-om. Miševi su zatim tretirani sa 1 mg/kg Hu3738 ili huIgG1izotipskom kontrolom q7d X 4 (tj. jednom u 7 dana za ukupno 4 doze), sa prvom dozom prvog dana neposredno nakon inokulacije sa humanim ćelijama. 22. dana, miševi su žrtvovani i određivani su nivoi citokina u serumu korišćenjem eseja Luminex-ove matrice sa zrncima (Millipore).
[0191] Rezultati na SL. 8 pokazuju da je primećeno pojačanje interleukina-8 (IL-8), faktora koji stimuliše koloniju granulocita makrofaga (GM-CSF), faktora nekroze tumora alfa (TNF-α) i interferona-gama (IFN-γ) nakon doziranja anti-OX40 antitela Hu3738 u poređenju sa izotipom, što sugeriše porast imunološkog odgovora kod miša usled Hu3738.

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Antitelo protiv OX40 koje sadrži (i) VHlanac koji sadrži tri CDR-a; i (ii) VLlanac koji sadrži tri CDR-a, naznačeno time:
VHCDR#1 ima aminokiselinsku sekvencu GFTFSRYGMS (SEK ID BR: 101), VHCDR #2 ima aminokiselinsku sekvencu TINSNGGRTYYPDSVKG (SEK ID BR: 102), VHCDR#3 ima aminokiselinsku sekvencu EGITTAYAMDY (SEK ID BR: 103), VLCDR#1 ima aminokiselinsku sekvencu KASQSVDYDGDSYMH (SEK ID BR: 104), VLCDR#2 ima aminokiselinsku sekvencu AASILES (SEK ID BR: 105), i VLCDR#3 ima aminokiselinsku sekvencu QQSNEDPRT (SEK ID BR: 106).
2. Antitelo protiv OX40 prema patentnom zahtevu 1, koje je monoklonsko.
3. Antitelo protiv OX40 prema patentnom zahtevu 1, koje je humanizovano.
4. Antitelo protiv OX40 prema patentnom zahtevu 3, koje sadrži VHlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVATINSNG
GRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVYYCAREGITTAYAMDY
WGQGTTVTVSS (SEK ID BR: 22);
i VLlanac koji ima aminokiselinsku sekvencu:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMHWYQQKPGQPPKLLIYAA
SILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPRTFGGGTKVEIK
(SEK ID BR: 32).
5. Antitelo protiv OX40 prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koje je IgG.
6. Antitelo protiv OX40 prema patentnom zahtevu 5, koje je IgG1.
7. Antitelo protiv OX40 prema patentnom zahtevu 4 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEK ID BR-a: 41 ili 42; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEK ID BR: 51.
8. Jedna ili više nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju anti-OX40 antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7.
9. Jedan ili više vektora koji sadrže jednu ili više nukleinskih kiselina prema patentnom zahtevu 8.
10. Eukariotska ćelija domaćina transformisana sa jednim ili više vektora prema patentnom zahtevu 9.
11. Eukariotska ćelija domaćina konstruisana da eksprimira jednu ili više nukleinskih kiselina prema patentnom zahtevu 8.
12. Eukariotska ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 10 ili 11 koja je ćelija domaćina sisara.
13. Postupak za proizvodnju anti-OX40 antitela, koji sadrži: (i) kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11; i (b) obnavljanje anti-OX40 antitela.
RS20200923A 2016-12-15 2017-12-15 Anti-ox40 antitela i njihove upotrebe RS60664B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662434761P 2016-12-15 2016-12-15
PCT/US2017/066680 WO2018112346A1 (en) 2016-12-15 2017-12-15 Anti-ox40 antibodies and their uses
EP17826089.9A EP3504242B1 (en) 2016-12-15 2017-12-15 Anti-ox40 antibodies and their uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60664B1 true RS60664B1 (sr) 2020-09-30

Family

ID=60937946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200923A RS60664B1 (sr) 2016-12-15 2017-12-15 Anti-ox40 antitela i njihove upotrebe

Country Status (37)

Country Link
US (7) US10556962B2 (sr)
EP (2) EP3504242B1 (sr)
JP (2) JP6772385B2 (sr)
KR (2) KR102341926B1 (sr)
CN (1) CN110573527A (sr)
AR (1) AR110526A1 (sr)
AU (1) AU2017377036B2 (sr)
BR (2) BR112019012328A2 (sr)
CA (1) CA3045940A1 (sr)
CL (1) CL2019001646A1 (sr)
CO (1) CO2019007288A2 (sr)
CR (1) CR20190330A (sr)
CY (1) CY1123274T1 (sr)
DK (1) DK3504242T3 (sr)
DO (1) DOP2019000165A (sr)
EC (1) ECSP19050049A (sr)
ES (1) ES2813057T3 (sr)
HR (1) HRP20201259T1 (sr)
HU (1) HUE050399T2 (sr)
IL (1) IL267070A (sr)
LT (1) LT3504242T (sr)
MA (1) MA53184A (sr)
MX (1) MX2019007121A (sr)
MY (1) MY198059A (sr)
PE (1) PE20191403A1 (sr)
PH (1) PH12019501357A1 (sr)
PL (1) PL3504242T3 (sr)
PT (1) PT3504242T (sr)
RS (1) RS60664B1 (sr)
RU (1) RU2753493C2 (sr)
SG (1) SG10201914126RA (sr)
SI (1) SI3504242T1 (sr)
SM (1) SMT202000462T1 (sr)
TW (1) TWI734879B (sr)
UA (1) UA125041C2 (sr)
UY (1) UY37523A (sr)
WO (1) WO2018112346A1 (sr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20191403A1 (es) * 2016-12-15 2019-10-04 Abbvie Biotherapeutics Inc Anticuerpos anti-ox40 y sus usos
EP3635011A1 (en) * 2017-06-09 2020-04-15 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination therapy with icos agonist and ox40 agonist to treat cancer
US11242398B2 (en) * 2017-08-01 2022-02-08 Remd Biotherapeutics, Inc. Anti-OX40 antibodies and methods of activating OX40
CN110790837A (zh) * 2018-08-02 2020-02-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗btla抗体
WO2020119789A1 (en) * 2018-12-14 2020-06-18 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Fully human antibodies against ox40, method for preparing the same, and use thereof
US12195545B2 (en) 2018-12-25 2025-01-14 Hanx Biopharmaceutics, Inc Anti-OX40 monoclonal antibody and application thereof
CN110172090B (zh) * 2019-06-03 2020-04-03 中山标佳生物科技有限公司 Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用
WO2021098851A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof
CN114867749A (zh) 2019-12-17 2022-08-05 安进公司 用于疗法中的双重白介素-2/tnf受体激动剂
CN113045654A (zh) * 2019-12-27 2021-06-29 南开大学 抗ox40抗体及其用途
CN111303285B (zh) * 2019-12-27 2023-06-02 百力司康生物医药(杭州)有限公司 靶向ox40的抗体及其制备方法和应用
EP4130039A4 (en) * 2020-03-23 2024-07-31 Bio-Thera Solutions, Ltd. DEVELOPMENT AND APPLICATION OF AN IMMUNE CELL ACTIVATOR
AU2021256226A1 (en) * 2020-04-17 2022-11-17 Hutchison Medipharma Limited Anti-OX40 antibody and uses thereof
CN115461371B (zh) * 2020-06-30 2026-02-13 和铂医药(上海)有限责任公司 靶向ox40的抗体及其制备方法和应用
AU2021313058A1 (en) * 2020-07-23 2023-03-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes and uses thereof
CN111704671B (zh) * 2020-08-19 2020-11-24 广东赛尔生物科技有限公司 Ox40抗体及其在治疗癌症中的应用
CN112442121A (zh) * 2020-08-20 2021-03-05 山东兴瑞生物科技有限公司 Ox40抗体、其编码基因、及抗体的制备方法和在增强人体免疫功能中的应用
CN114106173A (zh) * 2020-08-26 2022-03-01 上海泰槿生物技术有限公司 抗ox40抗体、其药物组合物及应用
CN111763258B (zh) * 2020-09-01 2020-12-29 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN114515335A (zh) * 2020-11-19 2022-05-20 百奥泰生物制药股份有限公司 抗ox40抗体在治疗肿瘤或癌症中的应用
EP4255929A2 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
CN115260312B (zh) * 2021-04-30 2025-02-14 保诺科技（北京）有限公司 结合ox40的抗体或抗原结合片段

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
SI0970126T1 (en) 1997-04-14 2001-08-31 Micromet Ag Novel method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6312700B1 (en) 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
EP1997893A1 (en) 1998-02-24 2008-12-03 Sisters of Providence in Oregon Compositions containing an OX-40 receptor binding agent or a nucleic acid encoding the same and methods for enhancing antigen-specific immune response
EP1135498B1 (en) 1998-11-18 2008-01-23 Genentech, Inc. Antibody variants with higher binding affinity compared to parent antibodies
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
DE60317677T2 (de) 2002-06-13 2008-10-30 Crucell Holland B.V. Ox40 (=cd134) rezeptor agonisten und therapeutische verwendung
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
US20080286286A1 (en) 2006-01-13 2008-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods to Treat Disease States by Influencing the Signaling of Ox-40-Receptors and High Throughput Screening Methods for Identifying Substances Therefor
HUE032735T2 (en) 2007-12-14 2017-10-30 Bristol Myers Squibb Co Binding molecules for the human OX40 receptor
PL2609118T3 (pl) * 2010-08-23 2017-07-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Przeciwciała anty-OX40 i sposoby ich stosowania
KR101685262B1 (ko) * 2011-08-23 2016-12-21 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 항-ｏｘ４０ 항체 및 이의 사용 방법
CA2904528C (en) 2013-03-15 2021-01-19 Abbvie Biotherapeutics Inc. Fc variants
NZ712903A (en) * 2013-03-18 2018-07-27 Biocerox Prod Bv Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
RU2016142476A (ru) 2014-03-31 2018-05-07 Дженентек, Инк. Комбинированная терапия, включающая антиангиогенезные агенты и агонисты, связывающие ох40
TW201619200A (zh) 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
CN107109484B (zh) * 2014-11-03 2021-12-14 豪夫迈·罗氏有限公司 用于ox40激动剂治疗的功效预测和评估的方法和生物标志物
PH12017502013B1 (en) * 2015-05-07 2022-07-22 Agenus Inc Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
US11008396B2 (en) * 2015-05-21 2021-05-18 Alligator Bioscience Ab Polypeptides
US20160347848A1 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 Medimmune Limited Therapeutic combinations and methods for treating neoplasia
EP3383914A4 (en) 2015-12-02 2019-10-30 Agenus Inc. ANTI-OX40 ANTIBODIES AND METHOD OF USE THEREOF
PE20191403A1 (es) * 2016-12-15 2019-10-04 Abbvie Biotherapeutics Inc Anticuerpos anti-ox40 y sus usos

Also Published As

Publication number Publication date
PL3504242T3 (pl) 2020-11-16
JP6772385B2 (ja) 2020-10-21
SI3504242T1 (sl) 2020-10-30
US10604584B2 (en) 2020-03-31
BR122020025629B1 (pt) 2022-05-31
CA3045940A1 (en) 2018-06-21
US20210017289A1 (en) 2021-01-21
KR20190092552A (ko) 2019-08-07
RU2019121895A (ru) 2021-01-15
HRP20201259T1 (hr) 2020-11-13
PH12019501357A1 (en) 2020-01-20
PT3504242T (pt) 2020-08-26
HUE050399T2 (hu) 2020-12-28
MX2019007121A (es) 2020-02-05
AU2017377036B2 (en) 2022-06-23
DOP2019000165A (es) 2019-07-15
SMT202000462T1 (it) 2020-09-10
US20180171023A1 (en) 2018-06-21
US20200181282A1 (en) 2020-06-11
CL2019001646A1 (es) 2019-08-23
CN110573527A (zh) 2019-12-13
PE20191403A1 (es) 2019-10-04
DK3504242T3 (da) 2020-08-17
US10556962B2 (en) 2020-02-11
RU2019121895A3 (sr) 2021-02-15
EP3504242B1 (en) 2020-06-24
UY37523A (es) 2018-07-31
RU2753493C2 (ru) 2021-08-17
US20200048363A1 (en) 2020-02-13
US10040864B2 (en) 2018-08-07
AR110526A1 (es) 2019-04-10
EP3725809A1 (en) 2020-10-21
MY198059A (en) 2023-07-31
JP2021019603A (ja) 2021-02-18
ECSP19050049A (es) 2019-07-31
TW201825520A (zh) 2018-07-16
US20220112304A1 (en) 2022-04-14
KR102341926B1 (ko) 2021-12-23
CR20190330A (es) 2019-12-19
TWI734879B (zh) 2021-08-01
EP3504242A1 (en) 2019-07-03
KR20210157471A (ko) 2021-12-28
IL267070A (en) 2019-08-29
US20180194855A1 (en) 2018-07-12
CO2019007288A2 (es) 2019-08-20
CY1123274T1 (el) 2021-12-31
BR112019012328A2 (pt) 2019-11-19
JP2020504101A (ja) 2020-02-06
WO2018112346A1 (en) 2018-06-21
US20180346593A1 (en) 2018-12-06
LT3504242T (lt) 2020-09-10
AU2017377036A1 (en) 2019-07-11
ES2813057T3 (es) 2021-03-22
SG10201914126RA (en) 2020-02-27
UA125041C2 (uk) 2021-12-29
MA53184A (fr) 2021-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10604584B2 (en) Anti-OX40 antibodies and their uses
US10233258B2 (en) Bispecific binding proteins that bind CD40 and mesothelin
JP6703520B2 (ja) Ｃｄ３イプシロンおよびｂｃｍａに対する二特異性抗体
JP2023051968A (ja) 多重特異的ＮＫｐ４６結合タンパク質
CN107660214B (zh) 针对cd3和cd20的双特异性抗体
CA3004830A1 (en) Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
RS66234B1 (sr) Anti-ccr8 antitela
HK40029314A (en) Anti-ox40 antibodies and their uses
HK40003363A (en) Anti-ox40 antibodies and their uses
HK40003363B (en) Anti-ox40 antibodies and their uses
HK40074511A (en) Bispecific antibodies against cd3 and cd20