JP2016530256A - 新規な抗−Fc−ガンマレセプタIIB抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
FcγRIIBが周囲のB細胞進化の間における後期のチェックポイントとして考えられ得ること、形質細胞の生存性を直接的に調整することは、科学界に受け入れられている。従って、FcγRIIBは、B細胞異常およびとりわけB細胞が媒介する免疫応答の治療のための有益なターゲットであると考えられる。
概して、従来技術が異なる特異性や親和性を有するいくつかの抗−FcγRIIB抗体を既に開示しているものの、対象における自己免疫疾患の治療、予防処置および診断に使用される改善された抗−FcγRIIB抗体への要求が未だ残されている。
本発明により提供される抗体はCD32BのITIMリン酸化に顕著により強い効果を示しており、このため、CD32BのITIMリン酸化によりトリガされ、特に自己免疫疾患に包含されるB細胞を順にコントロールするネガティブシグナリングループにより強い影響を与えることが期待される。
特に、本発明の抗体は、ダウジ(Daudi)細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、好適に増加させる。その増加は、好適には、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9または10倍である。CD32Bと結合する従来技術の抗体から、本発明の抗体の有利な特性は、期待されたものでも予見されたものでもなく、特にここに特徴づけられるようなCDRsや可変の重鎖および/または軽鎖を提供するための成功の合理的な予想があったことはもちろんである。本発明の抗体のこの改善された特性に加えて、ここに記載された抗体は、ヒトFcγRIIBに高度な特異性を有しており、および/または、非ブロッキング性であり、すなわち、それらの可変領域を介したFcレセプタへの結合が免疫複合体(ICs)や凝集IgGの細胞への結合を妨げない。
従来の抗体であるGB3(国際公開WO2005/051999参照)および2B6(国際公開2004/016750参照)は、8A6等の−キメラまたはヒト化した8A6抗体のいずれかのような本発明の抗体により増加され得るように、FcγRIIBのITIMリン酸化を増加させることができないことが図7から明らかである。このため、FcγRIIBのITIMリン酸化を増加させるための能力または無力は、それぞれCDRs、特に、8A6に存在するもののGB3および/または2B6のそれぞれに存在しないいくつかのキー残基(key residues)に依存しているようである。それゆえ、2B6またはGB3のCDRでのそれぞれの位置に対応する位置で8A6のCDRsにのみ存在するアミノ酸は、「キー残基」とみなされる。
従って、本発明の抗体のH−CDR1は、配列番号20に示されるようなH−CDR1に対し、60%以上、例えば70%、80%または90%同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のH−CDR2は、配列番号21に示されるようなH−CDR2に対し、36%以上、例えば40%、50%、60%、70%、80%または90%同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のH−CDR3は、配列番号22に示されるようなH−CDR3に対し、50%以上、例えば60%、70%、80%または90%同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のL−CDR1は、配列番号23に示されるようなL−CDR1に対し、64%以上、例えば70%、80%または90%同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のL−CDR2は、配列番号24に示されるようなL−CDR2に対し、29%以上、例えば30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のL−CDR3は、配列番号25に示されるようなL−CDR3に対し、78%以上、例えば80%または90%同一であるものとして好適に特徴づけられる。
好適には、そのような抗体は、重鎖および軽鎖可変領域CDRsに、配列番号29、30、31(H−CDRs)に定められるような「キー残基」および配列番号32、33および34(L−CDRs)に定められるような「キー残基」をさらに含む。
そのような抗体は、好適には、ダウジ細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、約4−10倍増加させる。
配列番号15および21に示されるH−CDR2配列は、配列番号30に示されるH−CDR2の好適な種配列(species sequences)である。
配列番号16および22に示されるH−CDR3配列は、配列番号31に示されるH−CDR3の好適な種配列(species sequences)である。
配列番号17および23に示されるL−CDR1配列は、配列番号32に示されるL−CDR1の好適な種配列(species sequences)である。
配列番号18および24に示されるL−CDR2配列は、配列番号33に示されるL−CDR2の好適な種配列(species sequences)である。
配列番号19および25に示されるL−CDR3配列は、配列番号34に示されるL−CDR3の好適な種配列(species sequences)である。
(a)その重鎖可変領域に配列番号14、15および16に示されるようなH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3を含み、その軽鎖可変領域に配列番号17、18および19に示されるL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3を含むもの、または
(b)その重鎖可変領域に配列番号20、21および22に示されるようなH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3を含み、その軽鎖可変領域に配列番号23、24および25に示されるL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3を含むもの、であり、
その抗体は、好適には、ダウジ細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、約4−10倍増加させる。
定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接的に包含されるものではないが、抗体依存性細胞障害作用(ADCC)の関与等の種々のエフェクタ機能を表すことができる。抗体がADCCを発揮するとすれば、それは好適にはIgG1サブタイプのものであり、一方ではIgG4サブタイプがADCCを発揮するための能力を有していない。
用語「ヒト化抗体」は、一般に、HCおよびLCのCDRsをエンコードする特異性が適当なヒトの可変フレームワークに移植された抗体で定義される(「CDRグラフト」)。用語「抗体」は、また、scFvs、一本鎖抗体、二重特異性抗体(diabodies)または四重特異性抗体(tetrabodies)、ドメイン抗体(dAbs)およびナノボディ(nanobodies)を含む。本発明の用語において、用語「抗体」は、いくつかの抗原結合サイト、好適にはそれらの少なくとも1つがFcγRIIB特異的結合サイトである二重−、三重−や多重結合の抗体、または、二重−、三重−や多重機能性の抗体も含む。
図6、7および8に示される結果から、キメラ8A6(ch8A6)抗体(ラット可変領域およびヒト定常領域を含む)またはヒト化8A6抗体(hu8A6)のいずれでも、従来技術の抗体GB3と比較してITIMリン酸化を顕著に増加させることが明らかである。キメラおよびヒト化8A6抗体間のCDRsがほぼ同一であり、それらのフレームワーク領域(FRs)が異なるものの、FcγRIIBのITIMリン酸化を増加させるための両方の抗体の力価がほぼ同じである(図8参照)ことを心に留めておくべきであり、CDRsは、例えば抗体GB3と比較して、ITIMリン酸化を顕著に増加させるために本発明の抗体の有利な性質の原因となることを結論付けることが合理的である。
当業者は、本発明の抗体についてここに記載されたようなCDRsを適当なフレームワークにグラフトすること、または、その反対にフレームワーク領域を本発明の抗体のCDRsを有する抗体にグラフトすることがたやすい立場にあり、この結果の抗体が有利な特性、とりわけ、ここに記載されたようなCD32BのITIMリン酸化を増加させる特性を有している。
本発明に包含される抗体によりもたらされるダウジ細胞のFcγRIIB(CD32B)のITIMリン酸化における増加は、好適には、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、約4倍またはそれ以上、約5倍またはそれ以上、約6倍またはそれ以上、約7倍またはそれ以上、約8倍またはそれ以上、約9倍またはそれ以上、または、約10倍(すなわちほぼ10倍でも)である。
ダウジ細胞のCD32B(FcガンマIIBレセプタ)のITIMリン酸化は、好適には、次のように測定される:
1%FBS(ウシ胎児血清)を追加したRPMI1640メディウムに懸濁させた3×105のダウジ細胞を、処理しないまま残す(コントロール)か、または、抗−IgM(抗−ヒト、マウス)および抗−マウスIgG(ラビット)を含有する抗体混合物とともに37℃、5%二酸化炭素で25分間インキュベートしたままとするが、ここで、その抗体混合物が2μg/mlのα−hIgM(mAB、クローンUHB)および20μg/mlのα−mIgGを含む。続いて、細胞を、本発明に包含される抗体、または、以下に定義されるような対象の抗体、例えば国際公開WO2005/051999のGB3抗体のいずれか、および、選択的にコントロール(w/o)としてバッファでそれぞれ37℃、5%二酸化炭素で20分間処理し、好適にはいずれの抗体も等しい濃度で適用する。細胞を、4℃でのインキュベーション後に回収し、溶解させ、ウェスタンブロット分析(Western Blot-analysis)を行うことにより、(抗−)ホスホチロシン抗体(抗−CD32B(ホスホY292)抗体)でリン酸化を検出する。ウェスタンブロットは、例えばウェスタンブロット分析用の負荷例(loading control)として作用するβ−アクチンを検出する抗体で選択的に精査される。ダウジ細胞の代替として、PBMCsやラジ(Raji)細胞を用いることも可能である。従って、ダウジ細胞を適用する全ての実施形態において、ITIMリン酸化を測定するときにダウジ細胞をラジ細胞やPBMCsに置き換えることも可能である。
シグナル生成グループは、ホスホチロシン抗体と共有的または非共有的に結合することができる。シグナルは、ホスホチロシン抗体のシグナル生成グループによりもたらされるシグナルとして測定され得る。シグナルは、例えば、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能ないずれのシグナルであってもよい。
しばしば、FcγRIIBは、ここで「CD32B」とも呼ばれる。このため、この用語および上述したようにFcガンマレセプタIIBを表すために用いられる他の用語は、用語「CD32B」と交換可能に用いられ得る。FcガンマレセプタIIBは、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリィに属しており、多くの造血性の系統で見出される。その名称が示しているように、FcレセプタIIBは、抗体のFc部(フラグメント、結晶形成性)、すなわち、抗体の両重鎖における2つのC末端ドメインに対応し、エフェクタ分子や細胞と典型的に相互作用するフラグメントを認識し結合する。好適なFcγRIIBは配列番号5に示されている。好適な可溶性FcγRIIBは配列番号12に示されている。
配列番号6に表されるアミノ酸配列の位置297にアラニン残基を有する本発明による抗体は、抗体依存性細胞障害作用が低減しているかまたは有しておらず、抗体のFc部のFcレセプタへの結合が低減しているかまたは存在しないことによるものである。そのようなN297A定常領域のアミノ酸配列は、配列番号28に示される。従って、本発明の抗体は、定常領域として、配列番号28に示されるアミノ酸配列を含有してもよい。そのような抗体は、欧州連合タンパク質番号付けによる位置297でグリコシル化が欠損している。このため、本発明は、重鎖定常領域の欧州連合タンパク質番号付けによる位置297でグリコシル化が欠損している抗体を包含するものの、重鎖定常領域の欧州連合タンパク質番号付けによる位置297でグリコシル化された抗体をも包含する。
ここで用いられるように、用語「エピトープ」は、動物に免疫原活性をもたらすポリペプチドまたはタンパク質の部分をいうものであり、抗体が特異的に結合する。
さらに好適には、その抗体が配列番号5におけるモチーフGTHSPESを含むエピトープと特異的に結合する。このアミノ酸モチーフは、FcγRIIBの極めて特異的なエピトープであることが示されている。このエピトープに特異的に結合する抗体は、ヒトFcγRIIAと結合しない。このエピトープへの本発明の抗体の可変領域を介した結合は、好適には、抗体のFc部のレセプタへの結合で妨げられず、レセプタの通常の生理学的機能をブロックしない。
本発明によれば、発明の抗体をコードする核酸配列は、本発明による抗体の特異的結合特性をもたらす抗体の少なくとも1部をエンコードするヌクレオチドを含む。
好適には、本発明による核酸配列は、可変領域、好ましくはここに記載された少なくともCDRsをエンコードする。
本発明による核酸配列の好適な実施例は、配列番号8−11に表されている。当業者は、これらのヌクレオチド配列が発現に用いられる方法およびそのために用いられるシステムに依存して変更し得ることを承知している。
本発明によるFcγRIIB特異的抗体は、B細胞、樹状細胞および活性化顆粒球(例えば、マクロファージ)において、免疫刺激メディエータの減少した産生、ならびに、抗体産生および抗原提示における低減に導く(例えば、樹状細胞やマクロファージでのT細胞集合の減少に導く)免疫応答を抑制する。抗体産生のフィードバックループおよび免疫システムの再刺激がともに行われることで抑制される。
レセプタへの本発明の抗−FcγRII抗体の可変領域を介した結合は、レセプタへのICsや抗体のFcフラグメント結合で阻害されず、公知のブロッキング抗体と違ってFcレセプタの通常の機能が維持される。
抗体は、動物における、より特徴的にはヒトにおける使用のために、従来知られたような、または、一般的に承認された薬局方に挙げられたような薬学的に受容可能な組成物に供給されてもよい。
本発明の組成物は、中性または塩の形態として剤型することができる。
薬学的に受容可能な塩は、制限されるものではないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から派生したようなアニオンで形成されたもの、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から派生したようなカチオンで形成されたものを含む。
本発明に包含される抗体について、患者に投与される用量は、典型的には、患者の体重あたり、0.0001mg/kgから100mg/kgである。好適には、投与される用量は、約15mg/kgである。ヒト抗体が他の種からの抗体と比べて人の身体でより長い半減期を有することがよく知られている。それゆえ、本発明の抗体またはそのフラグメントや誘導体の投与の用量および頻度は、他の種からの抗体の通常用いられる用量と比較して減少させてもよい。
本発明の抗体またはそのフラグメントや誘導体を投与する方法は、制限されるものではないが、非経口的投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下)、硬膜外投与、粘膜投与(例えば、鼻腔内および経口経路)を含む。特徴的な実施形態において、本発明の抗体は、筋肉内、静脈内または皮下に投与される。組成物は、好都合な経路により、例えば、点滴や大量注射(bolus injection)により、上皮や粘膜皮膚(口腔粘膜、直腸粘膜、腸粘膜、等)のライニング(linings)を通じた吸収により投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与されてもよい。投与は、全身または局所とすることができる。さらに、例えば、吸入器やネブライザの使用により、エアロゾル状薬剤の剤型で肺投与が用いられることも可能である。
ここで用いられるように、用語「治療する」および「治療」は、本発明による医薬品組成物の治療上効果的な量を対象に投与することをいう。「治療上効果的な量」は、疾患や異常を治療または改善するために、疾患の開始を遅らせるために十分であるか、または、疾患の治療や管理において治療学上の利益をもたらす医薬品組成物または抗体の量をいう。
ここで用いられるように、用語「予防処置」は、疾患や異常の開始の妨げのための薬剤の使用をいう。「予防上効果的な量」は、疾患の開始または再発を妨げるために十分な活性成分または薬学的薬剤の量を定義する。
ここで用いられるように、用語「異常」および「疾患」は、交換可能に用いられ、対象の状態をいう。特に、用語「自己免疫疾患」は、用語「自己免疫異常」と交換可能に用いられ、対象自身の細胞、組織および/または器官に対する免疫反応で引き起こされる細胞、組織および/または器官の傷害により特徴づけられる対象の状態をいう。
それゆえ、本発明は、本発明の抗体を含む診断上の組成物にもさらに関する。
ここに用いられるように、用語「診断上」は、自己免疫疾患に関するFcγRIIBの存在を診断するための本発明の抗体の使用、例えば、個体や患者の細胞における内生的なFcγRIIBの表面発現の量や程度の測定をいう。また、抑制性FcγRIIsに対する活性化FcγRIIsの比、例えば、FcγRIIBに対する発現したFcγRIIAの比の測定をもいう。
配列番号1:ラット抗体8A6の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号2:ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号3:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号4:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号5:ヒトFcγRIIBのアミノ酸配列
配列番号6:ヒト化抗体hu8A6_wtの重鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号7:ヒト化抗体hu8A6_wtの軽鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号8:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域をエンコードする核酸配列
配列番号9:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域をエンコードする核酸配列
配列番号10:ヒト化抗体hu8A6_wtの重鎖定常領域をエンコードする核酸配列
配列番号11:ヒト化抗体hu8A6_wtの軽鎖定常領域をエンコードする核酸配列
配列番号12:ヒト可溶性FcγRIIA(sFcγRIIA)のアミノ酸配列
配列番号13:突然変異させたヒト可溶性FcγRIIA(sFcγRIIAmut)のアミノ酸配列
配列番号14:ラット抗体8A6の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
配列番号15:ラット抗体8A6の重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
配列番号16:ラット抗体8A6の重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
配列番号17:ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
配列番号18:ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
配列番号19:ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
配列番号20:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
配列番号21:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
配列番号22:ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
配列番号23:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
配列番号24:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
配列番号25:ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
配列番号26:抗体GB3の重鎖可変領域のアミノ酸配列(国際公開WO2005/051999の配列番号7も参照)
配列番号27:抗体GB3の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(国際公開WO2005/051999の配列番号5も参照)
配列番号28:位置297でのNからAへの置換を含む重鎖定常領域のアミノ酸配列(配列表に示される配列の位置1が位置118であるとみなす)
配列番号29:キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーのアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
配列番号30:キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーのアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
配列番号31:キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーのアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
配列番号32:キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーのアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
配列番号33:キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーのアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
配列番号34:キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーのアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
組換え可溶性ヒトFcγRIIBレセプタでロング−エバンス(Long-Evans)ラットを免疫することによりモノクローナル抗体クローン8A6を生産した。FcγRIIAに対するより大きい親和性でヒトFcγRIIBに特異的に結合する抗体のためにラット脾臓細胞からのハイブリドーマ細胞株を生産しスクリーニングした(screen)。次に、上述したハイブリドーマにより産生された抗体を、非ブロッキング特性について、すなわち、これらの抗体がIgGまたはICsの膜結合FcγRIIBに対する結合をまだ許容することについて、従来公知の技術を用いて選別した。
精製した組換え可溶性ヒトFcγRIIB(sFcγRIIB、配列番号5)の50μgを、5nmolのCpG2006(ティブ モルバイオル(TIB MOLBIOL)、ベルリン、ドイツ)を追加したフロイントの不完全アジュバントを用い、LOU/Cラットに腹腔内(i.p.)または皮下(s.c.)に注入した。6週のインターバル後に、50μgのsFcγRIIBおよびCpG2006での最終的な追加免疫を、融合の3日前にi.p.またはs.c.に行った。骨髄腫(myeloma)細胞株のラット免疫脾臓細胞との融合を標準的な手順により行った。ハイブリドーマの上清を、sFcγRIIBまたは関連性のないsFcγRIIA(配列番号12)のタンパク質コートしたELISAプレートでの固相免疫アッセイでテストした。ラットIgGアイソタイプ(TIB173抗−IgG2a、TIB174抗−IgG2b、TIB170抗−IgG1の全てがATCCからのもの、R−2c抗−IgG2cが手製のもの)に対するmAbsを接合したHRPでタンパク質に結合した組織培養上清からのMAbsを検出し、このようなIgMクラスのmAbsを回避する。抗体特異的ELISAアッセイを用いることで、mAb8A6(ラットIgG2a)は、FcγRIIBを認識し、FcγRIIAに結合しなかった。天然抗原の特異的結合のための抗体を選別するために、FACSベースのアッセイを用いた。さらに、非ブロッキング特性、つまり、これらの抗体がIgGや免疫複合体の膜結合FcγRIIBに対する結合をまだ許容することについて、抗体を選別した。
感染の前日に、細胞を0.5×106cells/mlで播種(seed)した。最終細胞濃度の20×106cells/mlを得るために、細胞を遠心分離し、メディウムに再懸濁させた。それぞれの感染用に、3mlの細胞懸濁液を6ウェルプレートに移した。ハイスピード プラスミド マキシ キット(HiSpeed Plasmid Maxi Kit)(キアゲン(Qiagen))を用い、製造者の指示により、感染用のプラスミドDNAを分離し、エンドトキシンフリーの水に溶出させた。
それぞれの感染用に、軽鎖をエンコードするプラスミドDNAの75μgおよび重鎖をエンコードするプラスミドDNAの75μgを細胞懸濁液に添加し、穏やかに混合した。その後、PEI(ポリプラス(Polyplus))を添加し穏やかに混合した。連続的な振盪(100rpm)下、37℃および5%二酸化炭素で、細胞を3時間インキュベートした。最終細胞濃度の4×106cells/mlを得るために、細胞懸濁液をメディウムで最終容量の15mlとし、125mlフラスコに移した。連続的な振盪(100rpm)下、37℃および5%二酸化炭素で細胞をインキュベートし、6日後に、それを2回遠心分離(4000rpm、5分間)することにより上清を回収した。上清を0.2μmフィルタで濾過し、抗体力価を測定した(以下を参照)。
抗体力価測定を逆相(RP)HPLCおよびプロテインA−HPLCの2つの異なるHPLC法を介して行った。アギレント(Agilent)1200シリーズHPLCシステムでRP−HPLC分析を行った。データをソフトウェア「ケム ステーション フォー LCシステムズ(Chem Station for LC systems)」Rev.B.04.02で分析した。溶媒成分を:イソプロパノール(HPLCグレード;ロス)、アセトニトリル(HPLC勾配グレード;ロス)、H20(0.2μm濾過済)およびテトラフルオロアセテート(TFA)(ペプチド合成用;シグマ(Sigma))とした。溶媒A:水、0.1%TFA;溶媒B:60%イソプロパノール、30%アセトニトリル、9.9%水および0.1%TFA。300Å(オングストローム)の多孔性を有するフェノメネクス ジュピター カラム(Phenomenex Jupiter column)(番号525166−6)および粒子直径5μmの分離材を用いた。結合した抗体を溶媒Bの30%から43%までの直線勾配で10分間で溶出させた。検出をUV/VIS検出器でλ=210nmで行った。
ファースト(fast)タンパク質液体クロマトグラフィ(エクタ エクスプローラ)を介した1mlのハイトラップ(HiTrap、登録商標)rプロテインA FFカラム(ジーイーヘルスケア(GE Healthcare))で、発現した抗体を精製した。ランニングバッファは10mMトリス−塩酸、pH8.0、150mM塩化ナトリウムを含有し、溶出バッファは100mMグリシン、150mM塩化ナトリウム、pH2.7で構成した。溶出した抗体を60mMトリス−塩酸、pH8.0で中和し、濃縮し、滅菌濾過し、−80℃で保存した。
最新技術で公知のテクニック、例えば、ELISA結合アッセイ、バイアコアアッセイやFACS−結合アッセイを用いて、ハイブリドーマ上清のスクリーニング(選別)を行う。キメラ8A6またはヒト化変異体の抗体特異的結合をテストするために、ELISAプレート(ヌンク−イムノプレート(Nunc-Immuno Plate)、F96 マキシソープ(Maxisorp))をPBS中1μg/mlのsFcγRIIB、sFcγRIIA(配列番号12)またはsFcγRIIAmut(配列番号13)で、4℃にて一晩コートした(100μl/ウェル)。PBS中0.01%ツイン(Tween)での3回の洗浄ステップの後、PBS中2%BSAでのブロッキングを室温で2時間行った。3回の洗浄ステップの後、精製抗体または上清の系列希釈を適用し(100μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートした。
精製抗体をPBS、2%BSAで希釈した。PBS中2%BSAの最終濃度を得るために、上清に10倍PBSおよび20%BSAを追加した。FcγRIIAのためのポジティブコントロールとして、ヤギ−抗−ヒトFcγRIIA(R&Dシステムズ(R&D Systems)、AF1875)を用いた。PBS中0.01%ツインでの3回の洗浄ステップの後、ロバ−抗−ヤギ−HRP(F(ab’)2、ジャクソン−イムノ−リサーチ(Jackson-Immuno-Research))またはヤギ−抗−ヒト−HRP(F(ab’)2、ディアノヴァ(Dianova))のそれぞれの二次抗体を室温で1時間インキュベートした(100μl/ウェル)。ウェルをPBS中0.01%ツインで6回洗浄した。基質(0.03%過酸化水素を含有するOPD)を添加し(100μl/ウェル)、反応を4M硫酸で停止した(50μl/ウェル)。その後、分光器で492nmでの吸光度を計測した。
キメラ8A6またはヒト化変異体の天然抗原に対する特異的結合の分析をラジ(ATCC(登録商標)CCL−86(登録商標))およびK−562細胞(ATCC(登録商標)CCL−243(登録商標))での細胞結合を介して行った。
細胞を遠心分離(400g、5分間)によりペレット化し、FACS−バッファ(ハンクス(Hanks)バランス塩溶液、1%FCS、0.01%アジ化ナトリウム)で洗浄した。追加の遠心分離ステップの後、最終細胞濃度2×106cells/mlを得るために細胞をFACS−バッファに再懸濁させ、その細胞懸濁液の50μlを96ウェルのU底状プレートに分注した。FACS−バッファでヒト化変異体およびch8A6の系列希釈を準備した。
細胞懸濁液の50μlを抗体−ベリグロビン混合物に添加し、4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACS−バッファで2回洗浄した。その後、ヤギ−抗−ヒトIgG−PE結合二次抗体(F(ab’)2、ディアノヴァ)または抗−ラット−PE二次抗体の50μlをFACS−バッファで希釈し、細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。FACS−バッファでの2回の洗浄ステップの後、細胞を300μlのFACS−バッファに再懸濁させ、BD FACSカント(登録商標)II(ソフトウェア:BD FACSディバ(登録商標))で計測した(図3)。
キメラ8A6またはヒト化変異体の天然抗原に対する特異的結合の分析をラジおよびK−562細胞での細胞結合を介して行った。
細胞を遠心分離(400g、5分間)によりペレット化し、FACS−バッファ(ハンクスバランス塩溶液、1%FCS、0.01%アジ化ナトリウム)で洗浄した。追加の遠心分離ステップの後、最終細胞濃度2×106cells/mlを得るために細胞をFACS−バッファに再懸濁させ、その細胞懸濁液の50μlを96ウェルのU底状プレートに分注した。FACS−バッファでヒト化変異体およびch8A6の系列希釈を準備した。
ヒト化抗体およびコントロールとしてのキメラ抗体の増加させた濃度でラジおよびK562細胞をインキュベートした。FcγRIIBでの結合をテストするためにラジ細胞を用い(図4)、FcγRIIAに対する非特異的な結合を分析するためにK562細胞を用いた(図5)。抗体を結合した細胞をPE−結合二次抗体で検出した。全てのヒト化変異体はch8A6_N297Aに相当する親和性でFcγRIIBに結合しており、全てのヒト化変異体がFcγRIIAより大きな結合活性でまだFcγRIIBを結合する。
ラット8A6のVH領域をシグナルペプチドおよびヒトIgG1定常領域と融合させることにより、抗−FcγRIIBキメラモノクローナル抗体8A6を構成した。さらに、重鎖の脱グリコシル化変異体を、N297A突然変異を含有するIgG1定常ドメインを用いて生成させた。8A6軽鎖遺伝子を構成するために、ラット8A6のVL領域を、同様に、シグナル配列およびヒトカッパ定常領域の配列と融合させた。重鎖および軽鎖のDNA合成を、ジーンアート/ライフテクノロジィズ(Geneart/Life Technologies)で行い、続いて哺乳動物の発現ベクタへのサブクローニングを行った。
(細胞、試薬および抗体)
ヒトバーキットリンパ腫細胞株のダウジおよびラモス(Ramos)をDSMZ(ACC78およびACC603)から入手し、10%FBS(ギブコ/インビトロゲン(Gibco/Invitrogen))、MEM NEAA(ギブコ/インビトロゲン)、1mMのピルビン酸ナトリウム塩(ギブコ/インビトロゲン)および2mMのL−グルタミン(ギブコ/インビトロゲン)を追加したRPMI1640(ギブコ/インビトロゲン)中、37℃および5%二酸化炭素で維持した。フィコール(Ficoll)密度勾配(リューコセプ(Leucosep)、グライナー バイオ−ワン(Greiner Bio-One)、バイオコール分離溶液(Biocoll Separating Solution)、バイオクロム(Biochrom))およびネガティブ磁気分離(ダイナビーズ アンタッチド(Dynabeads Untouched)ヒトB細胞、インビトロゲン)を用いて、一次ヒトB細胞を健全ドナーのヘパリン血から精製した。濃縮したB細胞の純度を、抗−hCD19−APC(BDファーミンゲン(BD Pharmingen)、番号555415)、抗−hCD3−PerCP−Cy5.5(BDバイオサイエンシーズ(BD Biosciences)、番号332771)および抗−hCD56−PE(BDファーミンゲン、番号555515)で染色することでFACS分析により調査した。一次B細胞をさらに培養することなく直接的に実験に用いた。ブロッキング抗−FcγRIIB抗体2B6は欧州特許1534335による。
BCRおよびFcγRIIBの同時刺激のために、2μg/mlのモノクローナルマウス抗−hIgM(サザン バイオテク(Southern Biotech)、番号9022−01、クローンUHB)および20μg/mlのモノクローナルラビット抗−mIgG(1、2a、3)(エピトミクス(Epitomics)、番号3020−1、クローンM111−2)の抗体混合物であってFc部がヒトFcγRIIBレセプタとクロス反応する抗体混合物を用いることで抗体システムを構成した。20μg/mlのポリクローナルラビット抗−hIgM(抗体 オンライン 番号ABIN117299)、または、2μg/mlの抗−hIgMおよびアイソタイプコントロールmIgG2b(クローンMPC−11、BDファーミンゲン、番号557351)を含有する混合物、をコントロールとした。
リンパ腫細胞株のダウジまたはラモスおよび一次B細胞の3×105細胞を遠心分離により回収し、アッセイメディウム(RPMI1640+1%FBS)中の異なる刺激混合物とともに、37℃で20分間インキュベートした。
(細胞溶解)
細胞を4℃でペレット化し、氷冷PBSで洗浄し、ホスファターゼ阻害剤(ホスストップ(PhosStop)、ロシュ(Roche))、プロテアーゼ阻害剤(コンプリート ウルトラ ミニ(Complete Ultra Mini)、EDTAフリー、ロシュ)および1mMのPMSF(フルカ バイオケミカ(Fluka Biochemica))を追加した溶解バッファ(RIPAバッファ(セル シグナリング)(Cell Signaling))の10μl中、氷上で30−45分間インキュベートした。
遠心分離後、上清をサンプルバッファ(NuPAGE LDSサンプルバッファ、NuPAGEサンプル還元剤(Reducing Agent)、インビトロゲン)とともにロードし、SDS PAGE(NuPAGEノヴェックス ビス−トリス ミニ ゲルズ(Novex Bis-Tris Mini Gels)、MES SDSランニングバッファ(インビトロゲン))に適用した。SDS−PAGEのために、LDSサンプルバッファおよび還元剤を添加し、サンプルを95℃で5分間加熱した。サンプルを−20℃で保存するか、または、直接的にSDS−PAGEおよびウェスタンブロットにより分析した。
続いて、タンパク質をPVDFメンブラン(ロティ(Roti)−PVDF、ロス(Roth)、転写バッファ 10mMトリス、100mMグリシン、10%メタノール、転写条件 240mA一定、90分間、4℃)に転写した。メンブランをTBS−T(10mMトリス、150mM塩化ナトリウム、0.1%ツイン20)中5%BSAでブロックし、抗−FcγRIIB/CD32ホスホ(pY292)(セル エピトミクス(Cell Epitomics)、番号2308−1、1:50000、4℃、一晩)または抗−ホスホSHIP(1:1000、セル シグナリング、番号3941)および抗−ラビット−HRP(ジャクソン イムノリサーチ)、番号111−036−045、TBS−T中1:50,000、1時間、室温)で染色した。化学発光(ウェスタンライトニング プラス(WesternLightning Plus)で生じる、パーキンエルマ(Perkin Elmer))をX線フィルム上で検出した。
他のリン酸化タンパク質に対して示された抗体での続いての分析のために、メンブランを10分間ストリップし(リ−ブロット プラス(Re-Blot Plus)、ミリポア(Millipore))、抗−β−アクチン抗体(シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)、番号A1978、1:50,000)および抗−マウスIgG−HRP(シグマ−アルドリッチ、番号A9044)または他のシグナリングタンパク質用の抗体で染色する前に洗浄し、ブロックした。
健全なドナーからのPBMCを分離し、処理しないまま残すか、または、刺激混合物(モノクローナルマウス抗−hIgMおよびモノクローナルラビット抗−mIgG)とともに25分間インキュベートしたままとした。続いて、細胞を、ch8A6またはコントロールとしてのバッファのいずれかで処理した。細胞溶解物で、先に概説したような適切な検出抗体を用いるウェスタンブロット分析を行った。細胞(PBMC、B細胞)のFcγRIIB−ITIMモチーフのリン酸化における顕著な増加が検出された(図6a)。刺激混合物単独、または、モノクローナルマウス抗−hIgMのみ、ch8A6と組み合わせたモノクローナルラビット抗−mIgGでの細胞の刺激をともなうコントロール実験では、増加したFcγRIIB−ITIM−リン酸化を示さなかった(図6b)。このため、本発明の抗体は、架橋BCRおよび膜結合(内生的に発現した)FcγRIIBを有するヒト細胞のITIM−リン酸化に顕著な効果を示し、刺激していない細胞、すなわち、架橋BCRおよび膜結合FcγRIIBを有していない細胞で効果を示さない。自己免疫疾患の間では、BCRおよび膜結合FcγRIIBが自己抗原または免疫複合体(ICs)により架橋されるであろう。本発明の抗体は、FcγRIIB−ITIM−リン酸化を増加させることにより自己免疫疾患における病原性の自己反応性B細胞を抑制することが可能である。しかしながら、本発明の抗体は、架橋BCRを有することなくITIM−リン酸化を増加させることも可能である(図6c)。
クローンch8A6_N297AおよびクローンchGB3_N297AのITIMリン酸化における効果の比較である。ヒトダウジ細胞を抗体混合物で処理し、続いて、上述したようにch8A6_N297A、chGB3_N297Aまたは2B6で処理した。ch8A6_N297A様の抗体chGB3_N297Aは、非ブロッキング抗−FcγRIIB抗体であり、同様のエピトープを認識する。
抗体chGB3_N297A、ch8A6_N297Aおよびヒト化8A6を、一次ヒトPBMC中のFcγRIIB−ITIMリン酸化への影響について比較した。抗体混合物によるBCRおよびFcγRIIBの架橋後に、異なる抗体を5μg/mlで添加し、ITIMリン酸化についてウェスタンブロット分析を行った。重ねて、本発明の抗体は、驚くべきことに、最新技術の抗体と比較して、FcγRIIB−ITIM−リン酸化を顕著に増加させる効果を有する(図8)。
レセプタの架橋に続いて、ホスファターゼSHIPを、FcγRIIB−ITIMモチーフにおけるホスホ−チロシンへのSH2ドメインの結合を介してメンブランに集合させ、SHIP−1のC−末端ドメインにおけるNPXYモチーフでチロシンリン酸化をさせた。メンブランにおける再配置および続いてのNPXYモチーフのリン酸化は、SHIP−1の抑制性機能のための本質である。カルシウム流動、細胞生存性、増殖、細胞サイクルの停止およびアポプトシスにおけるその効果は、P13KおよびAkt系路を通じて媒介される。チロシン1021(Tyr1021)はSHIP−1におけるNPXYモチーフの1つに位置しており、そのリン酸化はSHIP−1機能に重要である(ニンマヤーン、ラベッチ、2008)。
ラット抗体からの相補性決定領域の配列をヒトのフレームワークにグラフトすることによりch8A6をヒト化した。ヒトのフレームワークを選択するために、VHおよびVLの配列を、ヒトIg可変領域および連結領域(joining region)の生殖細胞系セグメント(germline segments)の配列であって公衆に利用可能なデータベース(IMGT;V−BASE)から得られた配列と比較した。VH_3_30プラスIGHJ4ヒト生殖細胞系配列およびVK3_15プラスIGKJ2ヒト生殖細胞系配列をそれぞれ重鎖および軽鎖のために選択した。
ヒト化重鎖および軽鎖についていくつかの変異体が生成された。ヒト化VHおよびVLの設計配列をコードする遺伝子を、ライフサイエンステクノロジィズ/ジーンアート(Life Science Technologies/ Geneart)で合成し、続いて哺乳動物の発現ベクタにサブクローニングした。抗体変異体のスクリーニング手順では、感染させたCHO−S細胞(インビトロゲン)の上清から直接的に行った。キメラ8A6は、ヒト化変異体のスクリーニング中の感染コントロールおよび標準としての役割を果たした。Hu8A6変異体を、ELISAを介したsFcγRIIBおよびsFcγRIIAでの結合、および、ラジ細胞(上記参照)でのFACSを介した天然FcγRIIBでの結合について分析した。さらに、抗体変異体の動的特性づけを表面プラズモン共鳴で行った。
8A6ヒト化変異体のリン酸化活性をテストするために、ダウジ細胞を、種々の8A6変異体の0.5または5μg/mlで処理した抗体混合物で刺激し、ITIMリン酸化のためのウェスタンブロット分析を行った。
テストした8A6のヒト化変異体の全ては、レセプタのリン酸化を誘導することが可能であり、リン酸化レベルが同じ精製バッチからのch8A6_N297Aにより誘導されたレベルに相当した。このため、第2のヒト化ラウンド後に活性の損失が検出されなかった。バイアコアのデータが重鎖および軽鎖の異なる組み合わせについて異なる親和性を示唆したものの、それらの差異はウェスタンブロット分析で検出され得なかった(図10)。
最終的なヒト化した鎖の組み合わせを選択した後、重鎖VH10を軽鎖VL6と組み合わせたこの変異体は、最終的に、抗体ch8A6_N297A、2B6およびchGB3_N297Aに匹敵する(図11)。
(SLE−PBLモデル)
Rag2/ガンマ−c/Fcγ−/−マウスを6グレイ(Gy)の用量で放射線にさらし、500μlのPBS中でヒト末梢血白血球の量を変えて腹腔内に注入した。
マウスにおけるヒトSLE−患者PBLのグラフトをヒト免疫グロブリンMまたはGの存在により検証した後、細胞の注入前の2週間にマウスの処理を開始した。200μlのバッファ(PBS)、または、200μlのPBS中の20μgの抗体(ch8A6_N297A)で、腹腔内に週2回で4週間マウスを処理した。週一回血清を採取するためにマウスを計量し採血した。血清サンプルをさらに使用するまで−80℃で凍結した(図12)。
ヒトIgG、IgMならびに抗−DNAのIgMおよびIgGの全体の存在についてELISAにより血清サンプルを分析した。
SLEを患っているヒトのドナーからのPBLでグラフトしたマウスにおいて全ヒトIgGレベル(μg/mL)を分析した。PBSおよび抗−FcγRIIB間の全ヒトIgGにおける著しい差異は検出されなかった。本発明による抗体は、全ヒトIgGに著しく影響するものではない(図13)。
SLE−PBL転写/グラフト後の第4週に開始する抗−FcγRIIBマウスにおいて、疾患特異的ヒト抗−DNA IgGの顕著な減少が観察された。本発明の抗体は、疾患関連抗−DNA抗体の量を特に減少させる(図14)。
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Claims (22)
- 抗−FcγRIIB抗体において、
(i)配列番号20に示されるH−CDR1配列と60%以上が同一であるH−CDR1配列、
(ii)配列番号21に示されるH−CDR2配列と36%以上が同一であるH−CDR2配列、
(iii)配列番号22に示されるH−CDR3配列と50%以上が同一であるH−CDR3配列、
(iv)配列番号23に示されるL−CDR1配列と64%以上が同一であるL−CDR1配列、
(v)配列番号24に示されるL−CDR2配列と29%以上が同一であるL−CDR2配列、および
(vi)配列番号25に示されるL−CDR3配列と78%以上が同一であるL−CDR3配列、を含み、
前記抗体は、前記抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、ダウジ細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を約4−10倍増加させることを特徴とする抗体。 - 重鎖可変領域に配列番号29、30および31に示されるようなH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3を含み、軽鎖可変領域に配列番号32、33および34に示されるL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3を含み、前記抗体は、前記抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、ダウジ細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を約4−10倍増加させることを特徴とする請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体は、
(a)重鎖可変領域に配列番号14、15および16に示されるようなH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3を含み、軽鎖可変領域に配列番号17、18および19に示されるL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3を含む;または、
(b)重鎖可変領域に配列番号20、21および22に示されるようなH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3を含み、軽鎖可変領域に配列番号23、24および25に示されるL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3を含む、ものであり、
前記抗体は、前記抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、ダウジ細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を約4−10倍増加させることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の抗体。 - 前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする請求項1ないし請求項3のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記重鎖可変領域が配列番号3に示されるアミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、位置1のアミノ酸QがEに置換されていること、位置11のアミノ酸VがLに置換されていること、位置42のアミノ酸GがKに置換されていること、位置50のアミノ酸SがVに置換されていること、位置53のアミノ酸YがSに置換されていること、位置58のアミノ酸KがTに置換されていること、位置61のアミノ酸GがAに置換されていること、位置75のアミノ酸SがTに置換されていること、位置76のアミノ酸KがRに置換されていること、位置77のアミノ酸NがSに置換されていること、および、位置78のアミノ酸TがNに置換されていること、で構成するグループから選択される少なくとも1つの突然変異を有することを特徴とする請求項1ないし請求項4のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記軽鎖可変領域が配列番号4に示されるアミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、位置1のアミノ酸QがNに置換されていること、位置28のアミノ酸SがNに置換されていること、位置31のアミノ酸SがTに置換されていること、位置33のアミノ酸VがLに置換されていること、位置34のアミノ酸DがAに置換されていること、位置49のアミノ酸YがFに置換されていること、位置53のアミノ酸TがNに置換されていること、位置55のアミノ酸YがAに置換されていること、位置89のアミノ酸LがQに置換されていること、および、位置93のアミノ酸NがYに置換されていること、で構成するグループから選択される少なくとも1つの突然変異を有することを特徴とする請求項1ないし請求項5のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号1または3に示される重鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項1ないし請求項6のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号2または4に示される軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項1ないし請求項7のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号5によるヒトFcγRIIBの番号20−24のアミノ酸と特異的に結合することを特徴とする請求項1ないし請求項8のいずれか1項に記載の抗体。
- ヒトFcγRIIbに対し、少なくとも4.9×10−4s−1のオフレート定数を有する親和性でインビトロで結合することを特徴とする請求項1ないし請求項9のいずれか1項に記載の抗体。
- 重鎖定常領域に配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1ないし請求項10のいずれか1項に記載の抗体。
- 軽鎖定常領域に配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1ないし請求項11のいずれか1項に記載の抗体。
- 抗−FcγRIIB抗体において、配列番号1または3に示される重鎖可変領域および/または配列番号2または4に示される軽鎖可変領域を含むことと特徴とする抗体。
- 重鎖定常領域に配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項13に記載の抗体。
- 軽鎖定常領域に配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項13または請求項14に記載の抗体。
- 請求項1ないし請求項15のいずれか1項に記載の抗体をエンコードする核酸配列。
- 請求項16に記載の核酸配列の少なくとも1つがベクタ分子に挿入されたことを含む核酸ベクタ。
- 請求項17に記載の核酸ベクタを感染させたホスト細胞。
- 請求項1ないし請求項15のいずれか1項に記載の抗体を活性成分として含む医薬品組成物。
- 自己免疫疾患の治療または予防処置の方法に用いるための請求項1ないし請求項15のいずれか1項に記載の抗体において、前記自己免疫疾患が自己抗体の産生により特徴づけられることを特徴とする抗体。
- 免疫性血小板減少症、全身紅斑性エリテマトーデス、悪性貧血、アジソン氏病、1型糖尿病、慢性関節リューマチ、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グラーブ疾患、尋常性および水疱性天疱瘡、自己免疫肝炎、潰瘍性大腸炎、寒冷凝集素症、ならびに、自己免疫性末梢神経疾患の治療または予防処置の方法に用いるための請求項1ないし請求項15のいずれか1項に記載の抗体
- 請求項1ないし請求項15のいずれか1項に記載の抗体の産生のための方法であって、
請求項17に記載の核酸ベクタにより構成される核酸配列の発現を許容する条件下で、請求項18に記載のホスト細胞を培養し、産生された抗体を回収することを含む方法。
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