CN111961134A - 抗血液树突细胞抗原2抗体及其用途 - Google Patents

抗血液树突细胞抗原2抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

公开了结合BDCA2的抗体和抗体片段。还公开了使用该抗体和抗体片段诱导浆细胞样树突细胞的死亡，抑制炎性细胞因子和趋化因子的产生或分泌，和治疗或预防免疫学病症(如炎性和自身免疫性状况)的方法。

Description

抗血液树突细胞抗原2抗体及其用途
本发明是基于申请日为2013年12月10日，申请号为“201380071162.8” (国际申请号为PCT/US2013/074208)，发明名称为“抗血液树突细胞抗原2 抗体及其用途”的专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2012年12月10日提交的美国临时申请号61/735,362和2013年 2月11日提交的美国临时申请号61/763,270的权益，通过提及将两者的内容完 整并入本文。
发明背景
血液树突细胞抗原2(BDCA2)是一种在人浆细胞样树突细胞(pDC)上表 达的C型凝集素(Dzionek et al.,J.Immunol.,165:6037-6046(2000))，所述人浆 细胞样树突细胞是一种响应toll样受体(TLR)配体而分泌I型干扰素(IFN)的骨 髓衍生细胞的特化群体。BDCA2由在其C端的单个胞外碳水化合物识别域 (CRD)(其属于II类C型凝集素组)、跨膜区和在其N端的短胞质尾区(其不含信 号基序)组成。BDCA2通过相关的跨膜衔接子FcεRIγ传播胞内信号，并诱导B 细胞受体(BCR)样信号传导级联。
发明概述
本公开至少部分地基于鉴定和表征与BDCA2结合的抗体。这种抗体可以 减少或抑制炎性细胞因子和趋化因子的分泌。本文所述的抗BDCA2抗体还能 够通过抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞毒性(CDC)消 耗pDC。此外，本文描述的抗BDCA2抗体可以下调pDC的表面上CD32a和/ 或CD62L的水平。此外，本公开的抗BDCA2抗体可介导BDCA2从pDC细胞 表面的内在化。至少由于这些原因，本文所述的抗BDCA2抗体可用于治疗或 预防自身免疫性和炎性状况。本公开还显示，本文所述的抗BDCA2抗体可与 抗疟剂组合以实现改善的效果。
在一个方面，本公开特征在于分离的抗体或其抗原结合片段，该抗体或 其抗原结合片段选择性结合人BDCA2的胞外域(SEQ ID NO:1)且与BIIB059 竞争对人BDCA2的胞外域的结合。
当抗BDCA2抗体或其抗原结合片段对BDCA2的先前结合完全或部分地 抑制了BIIB059对BDCA2的随后结合时，抗BDCA2抗体或其抗原结合片段与 BIIB059竞争对人BDCA2的结合。例如，当抗BDCA2抗体或其抗原结合片段 对BDCA2的先前结合完全抑制BIIB059对BDCA2的后来结合时，抗BDCA2 抗体或其抗原结合片段与BIIB059竞争对人BDCA2的结合。在某些实施方案 中，抗BDCA2抗体或其抗原结合片段对BDCA2的在前结合导致对BIIB059 对BDCA2的后来结合的至少30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％或99％ 抑制。
在另一个方面，本公开特征在于一种分离的抗体或其抗原结合片段，其 选择性结合人BDCA2的胞外域(SEQ ID NO:1)和：(i)除了来自浆细胞样树 突细胞的其他细胞因子和趋化因子外，还抑制I型干扰素和/或III型干扰素型 的分泌；或(ii)在体外诱导或增强浆细胞样树突细胞的消减。在某些实施方案 中，抗BDCA2抗体下调来自pDC表面的CD32a和/或CD62L。在一些实施方案 中，抗BDCA2抗体介导BDCA2从pDC的细胞表面的内在化。在一些实施方 案中，抗体或其抗原结合片段结合食蟹猴(cynomolgus)BDCA2(SEQ ID NO: 72)和恒河猴(rhesus)BDCA2(SEQ ID NO:72)。在某些实施方案中，分离的抗 体或其抗原结合片段抑制I型干扰素、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、III型干扰素、巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)-α/CCL3、MIP-1β/CCL4、 趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5/RANTES)或干扰素γ诱导的蛋白10(IP-10/ CXCL10)的分泌或产生。
在上述两个方面的一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段任选 地还包含或组成为(consist of)下列一个、两个、三个、四个、五个或六个特 征：EC50(人BDCA2)0.5至3μg/mL或4nM至10nM；EC50(食蟹猴BDCA2)0.5 至3μg/mL或5nM至10nM；7到7.5的pI；不结合大鼠Clec4b2，或比人、食蟹 猴或恒河猴BDCA2以更低的结合亲和力结合大鼠Clec4b2；抑制趋化因子的 产生或分泌，该趋化因子如MIP-1-α/CCL3、MIP-1β/CCL4、CCL5/RANTES、 IP-10/CXCL10；重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，其中重链CDR1具有 由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8所 示的氨基酸序列组成的氨基酸序列；重链CDR2具有由SEQ ID NO:10所示的 氨基酸序列组成的氨基酸序列；并且重链CDR3具有由SEQID NO:11所示的 氨基酸序列组成的氨基酸序列；和可变重链，其包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列组成。在某些实施方案中， 抗体或其抗原结合片段具有由SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列组成的重链 CDR1；由SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成的重链CDR3。在某些实施方案中，抗体或其 抗原结合片段具有由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由 SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO:11所 示的氨基酸序列组成的重链CDR3。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合 片段具有由SEQ IDNO:90示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO:94所示的氨基酸序 列组成的重链CDR3。在一些实施方案中、分离的抗体或其抗原结合片段具 有4.5nM、4.6nM、4.7nM、4.8nM、4.9nM、5.0nM、5.1nM、5.2nM、5.3nM、 5.4nM或5.5nM的EC50(人BDCA2)。在一个特定的实施方案中，分离的抗体 或抗原结合片段具有4.9nM的EC 50(人BDCA2)。在一些实施方案中，分离的 抗体或其抗原结合片段具有4.0nM、4.1nM、4.2nM、4.3nM、4.4nM、4.5nM、 4.6nM、4.7nM、4.8nM、4.9nM或5.0nM的EC50(食蟹猴BDCA2)。在一个特 定的实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段具有4.4nM的EC50(食蟹猴 BDCA2)。在这方面的某些实施方案中，抗体具有人重链恒定区和轻链恒定 区。在某些实施方案中，重链恒定区包含CH1域和铰链区。在一些实施方案 中，重链恒定区包含CH3域。如果重链恒定区包含取代，那么这种取代修饰 抗体的性质(例如，增加或减少下列一个或多个：Fc受体结合、抗体糖基化、 半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能、或补体功能)。在一些实施方案中， 抗体为IgG抗体。在特定的实施方案中，抗体选自：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。 在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以7至15μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以10μg/mL的EC50结合 FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以11μg/mL的EC50 结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以12μg/mL 的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。
在另一个方面，本公开特征在于分离的抗体或其抗原结合片段，其选择 性结合人BDCA2的胞外域(SEQ ID NO:1)，并且包含重链CDR1、重链CDR2 和重链CDR3。重链CDR1包含或组成为氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ ID NO:9)或在SEQ ID NO:9所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具 有取代的氨基酸序列。重链CDR2包含或组成为氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)或在SEQ ID NO:10所示且在一 个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。重链CDR3包 含或组成为氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)或在SEQ ID NO: 11所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。 在另一个方面，抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，重链CDR1由SEQ ID NO:89所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸 位置处具有取代的氨基酸序列组成，所述重链CDR2由SEQ ID NO:91所示且 在一个、两个、三个或四个氨基酸处具有取代的氨基酸序列组成，所述重链 CDR3由SEQ ID NO:11所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有 取代的氨基酸序列组成。在另一个方面，抗体或其抗原结合片段包含重链 CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1由SEQ ID NO:9所示且在一 个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列组成，所述重链 CDR2由SEQ ID NO:92所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有 取代的氨基酸序列组成，重链CDR3由SEQ ID NO:11所示且在一个、两个、 三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列组成。在另一个方面，抗体 或其抗原结合片段包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1 由SEQ ID NO:90所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的 氨基酸序列组成，所述重链CDR2由SEQ ID NO:93所示且在一个、两个、三 个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列组成，所述重链CDR3由SEQ ID NO:94所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸 序列组成。这些抗体(i)结合人或食蟹猴BDCA2但不显著地结合来自灵长类下 的种系发生种类(phylogenetic species)的BDCA2；和/或(ii)抑制TLR7/TLR9诱 导的人pDC的I型干扰素和其它细胞因子或趋化因子产生；和/或(iii)介导BDCA2从pDC表面的内在化；和/或(iv)下调来自pDC表面的CD32a和/或 CD62L；和/或(v)通过ADCC或CDC在体外消耗pDC。在这方面的一些实施方 案中，该抗体具有人重链和轻链恒定区。
在一些实施方案中，特异性结合人BDCA2的分离的抗体或其抗原结合片 段具有重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1包含或组成为氨 基酸序列GFTFSTYTMS(SEQID NO:9)或在SEQ ID NO:9所示且在一个或 两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR2包含或组成为氨 基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)或在SEQ IDNO:10所 示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR3包 含或组成为氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)或在SEQ ID NO: 11所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在这方面的其 他实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段具有重链CDR1、重链CDR2和重 链CDR3，所述重链CDR1包含或组成为氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ ID NO:9)，所述重链CDR2包含或组成为氨基酸序列 TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)，所述重链CDR3包含或组成为氨 基酸序列DIYYNYGAWFAY的(SEQ ID NO:11)。在这方面的其他实施方案 中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。 所述轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)或在SEQ ID NO:5所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置中具 有取代的氨基酸序列。所述轻链CDR2包含或组成为氨基酸序列AASTLES (SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位 置处具有取代的氨基酸序列。所述轻链CDR3包含或组成为氨基酸序列 QQANEDPRT(SEQ ID NO:7)或在SEQ ID NO:7所示且在一个、两个、三个 或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链CDR1 包含或组成为氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)或在SEQ ID NO:5所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列；所述轻 链CDR2包含或组成为氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO: 6所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列；所述轻链CDR3 包含或组成为氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ ID NO:7)或在SEQ ID NO:7所 示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在其他实施方案 中，分离的抗体或其抗原结合片段具有重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、 轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3，所述重链CDR1包含或组成为 GFTFSTYTMS(SEQ ID NO:9)；所述重链CDR2包含或者组成为氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)；所述重链CDR3包含或组成为氨 基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)；所述轻链CDR1包含或组成为 氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)；所述轻链CDR2包含或 者组成为氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)；所述轻链CDR3包含或组成 为氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中，选择性结合人BDCA2的分离的抗体或其抗原结合片 段具有重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1包含或组成为氨 基酸序列TYTMS(SEQ ID NO:8)或在SEQ ID NO:8所示且在一个或两个氨 基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR2包含或组成为氨基酸序 列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)或在SEQ ID NO:10所示且在 一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR3包含或组 成为氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)或在SEQ ID NO:11所示 且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在这方面的其他实施 方案中，分离的抗体或抗原结合片段具有重链CDR1、重链CDR2和重链 CDR3，所述重链CDR1包含或组成为氨基酸序列TYTMS(SEQ IDNO:8)，所 述重链CDR2包含或组成为氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)，所述重链CDR3包含或组成为氨基酸序列DIYYNYGAWFAY的(SEQ ID NO:11)。在这方面的其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包 含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列 KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)或在SEQ ID NO:5所示且在一个、两 个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。所述轻链CDR2包含 或组成为氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6所示且在 一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。轻链CDR3 包含或组成为氨基酸序列QQANEDPRT(SEQID NO:7)或在SEQ ID NO:7所 示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在一 些实施方案中，轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN (SEQID NO:5)或在SEQ ID NO:5所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取 代的氨基酸序列。轻链CDR2包含或组成为氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基 酸序列。轻链CDR3包含或组成为氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ ID NO:7) 或在SEQ ID NO:7所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段具有重链CDR1、重 链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3，所述重链CDR1 包含或组成为氨基酸序列TYTMS(SEQID NO:8)；所述重链CDR2包含或者 组成为氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)；所述重链 CDR3包含或组成为氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)；所述轻 链CDR1包含或组成为氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)； 所述轻链CDR2包含或者组成为氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)；轻链 CDR3包含或组成为氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中，选择性结合人BDCA2的分离的抗体或其抗原结合片 段具有重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1包含或组成为氨 基酸序列GFTFSTY(SEQ IDNO:89)或在SEQ ID NO:89所示且在一个或两个 氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR2包含或组成为氨基酸 序列SPGDSFG(SEQ ID NO:91)或在SEQ ID NO:91所示且在一个或两个氨 基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR3包含或组成为氨基酸序 列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)或在SEQ ID NO:11所示且一个或两个 氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在这方面的其他实施方案中，分离的 抗体或抗原结合片段具有重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链 CDR1包含或组成为氨基酸序列GFTFSTY(SEQ IDNO:89)，所述重链CDR2 包含或组成为氨基酸序列SPGDSFG(SEQ ID NO:91)，所述重链CDR3包含或 组成为氨基酸序列DIYYNYGAWFAY的(SEQ ID NO:11)。在这方面的其他实 施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链 CDR3。轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)或在SEQ ID NO:5所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处 具有取代的氨基酸序列。轻链CDR2包含或组成为氨基酸序列AASTLES (SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位 置处具有取代的氨基酸序列。轻链CDR3包含或组成为氨基酸序列 QQANEDPRT(SEQ ID NO:7)或在SEQ ID NO:7所示且在一个、两个、三个 或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链CDR1 包含或组成为氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)或在SEQ ID NO:5所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。轻链 CDR2包含或组成为氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6 所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。轻链CDR3包含 或组成为氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ IDNO:7)或在SEQ ID NO:7所示且 在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在其他实施方案中，分 离的抗体或其抗原结合片段具有重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3，所述重链CDR1包含或组成为氨基酸序列 GFTFSTY(SEQ ID NO:89)；所述重链CDR2包含或者组成为氨基酸序列 SPGDSFG(SEQ ID NO:91)；所述重链CDR3包含或组成为氨基酸序列 DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)；所述轻链CDR1包含或组成为氨基酸序 列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)；所述轻链CDR2包含或者组成为 氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)；所述轻链CDR3包含或组成为氨基酸 序列QQANEDPRT(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中，选择性结合人BDCA2的分离的抗体或其抗原结合片 段包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1包含或组成为氨 基酸序列GFTFSTYTMS(SEQID NO:9)或在SEQ ID NO:9所示且在一个或 两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR2包含或组成为氨 基酸序列TISPGDSFGYY(SEQ ID NO:92)或在SEQ ID NO:92所示且在一个 或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR3包含或组成为 氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)或在SEQ ID NO:11所示且在 一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在这方面的其他实施方案 中，分离的抗体或抗原结合片段具有重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3， 所述重链CDR1包含或组成为氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ ID NO:9)，所 述重链CDR2包含或组成为氨基酸序列TISPGDSFGYY(SEQ ID NO:92)，所述重链CDR3包含或组成为氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)。 在这方面的其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1、 轻链CDR2和轻链CDR3。轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列 KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)或在SEQ ID NO:5所示且在一个、两 个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。轻链CDR2包含或组 成为氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6所示且在一个、 两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。轻链CDR3包含或 组成为氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ IDNO:7)或在SEQ ID NO:7且在一 个、两个、三个或四个氨基酸位置具有取代的氨基酸序列。在一些实施方案 中，轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)或在SEQ ID NO:5所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基 酸序列。轻链CDR2包含或组成为氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)或在 SEQ ID NO:6所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。轻 链CDR3包含或组成为氨基酸序列QQANEDPRT(SEQID NO:7)或在SEQ ID NO:7所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在其他实 施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段具有重链CDR1、重链CDR2、重链 CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3，所述重链CDR1包含或组成为 氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ IDNO:9)；所述重链CDR2包含或者组成为 氨基酸序列TISPGDSFGYY(SEQ ID NO:92)；所述重链CDR3包含或组成为 氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)；所述轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)；所述轻链CDR2包含 或者组成为氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)；所述轻链CDR3包含或组 成为氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ IDNO:7)。
在一些实施方案中，选择性结合人BDCA2的分离的抗体或其抗原结合片 段包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1包含或组成为氨 基酸序列STYTMS(SEQ IDNO:90)或在SEQ ID NO:90所示且在一个或两个 氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR2包含或组成为氨基酸 序列WVATISPGDSFGYY(SEQ ID NO:93)或在SEQ ID NO:93所示且在一个 或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列，所述重链CDR3包含或组成为氨基酸序列TRDIYYNYGAWFA(SEQ ID NO:94)或在SEQ ID NO:94所示且 在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在这方面的其他实施方 案中，分离的抗体或抗原结合片段具有重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3， 所述重链CDR1包含或组成为氨基酸序列STYTMS(SEQ ID NO:90)，所述重 链CDR2包含或组成为氨基酸序列WVATISPGDSFGYY(SEQ ID NO:93)，所 述重链CDR3包含或组成为氨基酸序列TRDIYYNYGAWFA(SEQ ID NO:94)。在这方面的其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻 链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列 DYDGDSYMNWY(SEQ ID NO:95)或在SEQ ID NO:95所示且在一个、两 个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。轻链CDR2包含或组 成为氨基酸序列LLIYAASTLE(SEQ ID NO:96)或在SEQ ID NO:96所示且 在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。轻链CDR3 包含或组成为氨基酸序列QQANEDPR(SEQ ID NO:97)或在SEQ ID NO:97 所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。在 一些实施方案中，轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列DYDGDSYMNWY(SEQ ID NO:95)或在SEQ ID NO:95所示且在一个或两个氨基酸位置处具有 取代的氨基酸序列；轻链CDR2包含或组成为氨基酸序列LLIYAASTLE(SEQ ID NO:96)或在SEQ ID NO:96所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代 的氨基酸序列；轻链CDR3包含或组成为氨基酸序列QQANEDPR(SEQ ID NO:97)或在SEQ ID NO:97所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的 氨基酸序列。在其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段具有重链 CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3，所 述重链CDR1包含或组成为氨基酸序列STYTMS(SEQ ID NO:90)；所述重链 CDR2包含或者组成为氨基酸序列WVATISPGDSFGYY(SEQ ID NO:93)；所 述重链CDR3包含或组成为氨基酸序列TRDIYYNYGAWFA(SEQ ID NO:94)；所述轻链CDR1包含或组成为氨基酸序列DYDGDSYMNWY(SEQ ID NO:95)；所述轻链CDR2包含或者组成为氨基酸序列LLIYAASTLE(SEQ ID NO:96)；所述轻链CDR3包含或组成为氨基酸序列QQANEDPR(SEQ ID NO:97)。
在上述方面的一些实施方案中，抗体具有人重链恒定区和轻链恒定区。 在一些实施方案中，重链恒定区包含CH1域和铰链区。在一些实施方案中， 重链恒定区包含CH3域。如果重链恒定区包括取代，这种取代修饰抗体的性 质(例如，增加或减少下列一个或多个：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨 酸残基的数目、效应细胞功能、或补体功能)。在一些实施方案中，抗体为IgG 抗体。在特定的实施方案中，抗体选自下组：IgG1、IgG2的、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以7至15μg/mL的EC50结合FcγRIIa (CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以10μg/mL的EC50结合 FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以11μg/mL的EC50 结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以12μg/mL 的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。
在另一个方面，本公开特征在于分离的抗体或其抗原结合片段，所述分 离的抗体或其抗原结合片段选择性结合人BDCA2的胞外域(SEQ ID NO:1)， 并且包含SEQ ID NO:40、42、44、46、49或52中任一项所示的VH的重链 CDR1、重链CDR2和重链CDR3。在这个方面的一些实施方案中，分离的抗 体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:54、56或58中任一项所示的VL的轻链 CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。CDR可以是Kabat的CDR或任何替代的CDR。 在一些实施方案中，抗体具有人重链恒定区和轻链恒定区。在一些实施方案 中，重链恒定区包含CH1域和铰链区。在一些实施方案中，重链恒定区包含 CH3域。如果重链恒定区包括取代，那么这种取代修饰抗体的性质(例如，增 加或减少下列一个或多个：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、 效应细胞功能、或补体功能)。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体。在特定 的实施方案中，抗体选自下组：IgG1、IgG2的、IgG3和IgG4。在一些实施方 案中，抗体包含人Fc区，其以7至15μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在 一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以10μg/mL的EC50结合FcγRIIa (CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以11μg/mL的EC50结合 FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以12μg/mL的EC50 结合FcγRIIa(CD32a)。在另一个方面，本公开特征在于分离的抗体或其抗原 结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段选择性结合人BDCA2的胞外域 (SEQ IDNO:1)，并且包含可变重(VH)域，其与BIIB059的VH域的氨基酸序 列(SEQ ID NO:24)或SEQID NO:40、42、44、46、49或52中任一项所示的 VH的氨基酸序列是至少80％相同的。这些抗体(i)结合人或食蟹猴BDCA2但 不显著地结合来自灵长类之下的种系发生种类的BDCA2；和/或(ii)抑制TLR7/ TLR9诱导的人pDC的I型干扰素和其它细胞因子或趋化因子产生；和/或(iii) 介导BDCA2从pDC表面的内在化；和/或(iv)下调来自pDC表面的CD32a和/或CD62L；和/或(v)通过ADCC或CDC在体外消耗pDC。
在这个方面的一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含或组成为 VH域，该VH域与BIIB059的VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)或SEQ ID NO:40、42、44、46、49或52中任一项所示的VH域是至少90％相同的。在这 个方面的一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含或组成为VH域，该 VH域与BIIB059的VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)或SEQ IDNO:40、42、 44、46、49或52中任一项所示的VH域是至少95％相同的。在这个方面的其他 实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段的VH域与BIIB059的VH域的氨基 酸序列(SEQ IDNO:24)或SEQ ID NO:40、42、44、46、49或52中任一项所示 的VH域是相同的。在一些实施方案中，重链包含或者组成为SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列。在这个方面的一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段 包含或组成为可变轻(VL)域，该VL域与BIIB059的VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)或SEQ ID NO:54、56或58中任一项所示的VL域是至少80％相同 的。在这个方面的一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含或组成为VL 域，该VL域与BIIB059的VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)或SEQ ID NO: 54、56或58中任一项所示的VL域是至少90％相同的。在这个方面的一些实施 方案中，抗体或其抗原结合片段包含或组成为VL域，该VL域与BIIB059的 VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)或SEQ ID NO:54、56或58中任一项所示 的VL域是至少95％相同的。在这个方面的其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含或组成为VH域和VL域，该VH域与BIIB059的VH域的氨基酸序列 (SEQ ID NO:24)相同，该VL域与BIIB059的VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)相同。在这个方面的其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含或 组成为VH域和SEQ ID NO:54、56或58中任一项所示的VL域相同，该VH域 与SEQ ID NO:40、42、44、46、49或52中任一项所示的VH域的氨基酸序列 相同。在一个特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含或组成为重链 和轻链，该重链包含或组成为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，该轻链包含 或者组成为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。这些实施方案涉及上述所有方 面及其实施方案。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化抗体。 在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施方案中， 抗体或抗原结合片段是单链抗体。在其他实施方案中，抗体或抗原结合片段 是多克隆抗体、嵌合抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fsc片段、Fv片 段、scFv、sc(Fv)2或双抗体(diabody)。在一些实施方案中，抗体具有IgG1重 链恒定区。
在另一个方面，本公开提供了分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的 抗体或其抗原结合片段选择性结合人BDCA2的胞外域(SEQ ID NO:1)，并且 包含由以指定号PTA-13450保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体的重链CDR1、 重链CDR2和重链CDR3。在这个方面的一些实施方案中，抗体或其抗原结合 片段进一步包含由以指定号PTA-13450保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体的 轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。在这方面的某些实施方案中，抗体具 有人重链恒定区和轻链恒定区。在某些实施方案中，重链恒定区包含CH1域 和铰链区。在一些实施方案中，重链恒定区包含CH3域。如果重链恒定区包 含取代，那么这种取代修饰抗体的性质(例如，增加或减少下列一个或多个：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能、或补体功 能)。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体。在特定的实施方案中，抗体选自 下组：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其 以7至15μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含 人Fc区，其以10μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗 体包含人Fc区，其以11μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方 案中，抗体包含人Fc区，其以12μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在另 一个方面，本公开提供了分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其 抗原结合片段选择性结合人BDCA2的胞外域(SEQ ID NO:1)，并且包含由以 指定号PTA-13450保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体的变体重链CDR1、重链 CDR2和重链CDR3，其中分别与由以指定号PTA-13450保藏于ATCC的杂交 瘤产生的抗体的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3相比，变体重链CDR1、 CDR2和CDR3包括一个、两个或三个氨基酸取代。在这个方面的其他实施方 案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含由以指定号PTA-13450保藏于ATCC 的杂交瘤产生的抗体的变体轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，其中分别 与由以指定号PTA-13450保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体的轻链CDR1、轻 链CDR2和轻链CDR3相比，变体轻链CDR1、CDR2和CDR3包括一个、两个 或三个氨基酸取代。在这方面的某些实施方案中，抗体具有人重链恒定区和 轻链恒定区。在某些实施方案中，重链恒定区包含CH1域和铰链区。在一些 实施方案中，重链恒定区包含CH3域。如果重链恒定区包含取代，那么这种 取代修饰抗体的性质(例如，增加或减少下列一个或多个：Fc受体结合、抗 体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能、或补体功能)。在一些实 施方案中，抗体为IgG抗体。在特定的实施方案中，抗体选自下组：IgG1、 IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以7至15μg/mL 的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以 10μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区， 其以11μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含 人Fc区，其以12μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在另一个方面，本公 开特征在于分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段 选择性结合人BDCA2的胞外域(SEQ ID NO:1)，并且交叉阻断由以指定号 PTA-13450保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体的结合。在一些实施方案中，抗 体为IgG抗体。在特定的实施方案中，抗体选自下组：IgG1、IgG2的、IgG3 和IgG4。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以7至15μg/mL的EC50结 合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以10μg/mL的 EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以11 μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区， 其以12μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在另一个方面，本公开特征在于 分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段在与以指定 号PTA-13450保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体在相同表位选择性结合人 BDCA2的胞外域(SEQ IDNO:1)。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体。在 特定的实施方案中，抗体选自下组：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施 方案中，抗体包含人Fc区，其以7至15μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。 在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以10μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以11μg/mL的EC50结合 FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以12μg/mL的 EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在另一个方面，本公开表征了分离的抗体或其抗 原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段选择性结合人BDCA2的胞外域 (SEQ ID NO:1)，并且包含VH域，其与由以指定号PTA-13450保藏于ATCC 的杂交瘤产生的抗体的VH域是至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、 至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、 至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％的同一性。在这个方面 的一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含VL域，该VL域与由 以指定号PTA-13450保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体的VL域是至少75％、 至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％ 或至少98％相同的。
在上述全部五个方面，抗体或其抗原结合片段进一步：(i)除了来自浆 细胞样树突细胞的其他细胞因子和趋化因子外，还抑制I型干扰素和/或III型 干扰素型的分泌；或(ii)在体外诱导或增强浆细胞样树突细胞的消减。在上述 五个方面的一些实施方案中，抗体下调pDC上的CD32a和/或CD62L(相对于 不接触抗BDCA2抗体的pDC)。在一些实施方案中，抗体介导BDCA2从pDC 的细胞表面上的内在化。在上述五个方面的一些实施方案中，抗体或其抗原 结合片段结合食蟹猴BDCA2(SEQ ID NO:72)和恒河猴BDCA2(SEQ ID NO: 72)。在上述五个方面的一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段抑 制I型干扰素、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、III型干扰素、巨噬 细胞炎性蛋白-1(MIP-1)-α/CCL3、MIP-1β/CCL4、趋化因子(C-C基序)配体 5(CCL5/RANTES)或干扰素γ诱导的蛋白10(IP-10/CXCL10)的分泌或产生。 在上述五个方面的一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化抗体。 在在上述五个方面的一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是单克隆抗体。 在上述五个方面的一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是单链抗体。在上 述五个方面的其他实施方案中，抗体或抗原结合片段是多克隆抗体、嵌合抗 体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fsc片段、Fv片段、scFv、sc(Fv)2或双抗 体。在上述五个方面的一些实施方案中，抗体具有IgG1重链恒定区。在上述 五个方面的一些实施方案中，抗体具有IgG2重链恒定区。在上述五个方面的 一些实施方案中，抗体具有IgG4重链恒定区。在上述五个方面的一些实施方案中，抗体是IgG1重链恒定区和IgG4重链恒定区杂合物。
在一些实施方案中，本公开提供分离的细胞，其产生任意上述抗体或其 抗原结合片段。
在其他实施方案中，本公开提供药物组合物，其包含任意上述抗体或其 抗原结合片段和药学可接受载体。在一些实施方案中，药物组合物包含配制 在组合物中的任意上述抗体或其抗原结合片段，该组合物含有10-25mM柠檬 酸盐，100-200mM氯化钠，pH值为5.5-6.5。在一些实施方案中，药物组合 物任选地包括Tween-80(0.01％至0.3％，例如，0.03％)。在其他实施方案中， 药物组合物包含配制在组合物中的任意上述抗体或其抗原结合片段，该组合 物含有20mM柠檬酸钠，150mM氯化钠，pH值为6.0。
在另一个方面，本公开提供了用于制备抗BDCA2抗体的方法。该方法涉 及提供包含BDCA2抗体的重链和/或轻链的细胞，在允许抗体表达的条件下 培养细胞和分离抗体。该方法任选地包括纯化抗体。在一些实施方案中，细 胞是CHO细胞。在其它实施方案中，细胞是293细胞。在特定的实施方案中， 抗BDCA2抗体是BIIB059。在一个实施方案中，抗BDCA2抗体或其抗原结合 片段具有重链和轻链，其中重链包含或组成为SEQ ID NO:4所示序列，并且 轻链包含或者组成为SEQ ID NO:3所示序列。在另一个实施方案中，抗 BDCA2抗体或其抗原结合片段包含或者组成为VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3，所述VH CDR1包含或者组成为SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述VH CDR2包含或者组成为SEQ ID NO:10的氨基酸序列，所述VH CDR3包含或者 组成为SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗BDCA2抗体 或其抗原结合片段包含或者组成为VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VLCDR3，所述VH CDR1包含或者组成为SEQ ID NO:9 的氨基酸序列，所述VH CDR2包含或者组成为SEQ ID NO:10的氨基酸序列， 所述VH CDR3包含或者组成为SEQ ID NO:11的氨基酸序列，所述VL CDR1 包含或者组成为SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述VL CDR2包含或者组成为 SEQ ID NO:6的氨基酸序列，所述VL CDR3包含或者组成为SEQ ID NO:7的 氨基酸序列。
在另一个方面，本公开提供了用于检测组织中的浆细胞样树突细胞存在 的方法。该方法包括使组织接触抗BDCA2抗体。在一些实施方案中，组织是 来自具有系统性红斑狼疮的受试者的皮肤生检。在一些实施方案中，组织是 来自具有硬皮病的受试者的皮肤生检。在一些实施方案中，组织是来自具有 硬斑病的受试者的皮肤生检。在一些实施方案中，组织是来自具有类风湿性 关节炎的受试者的皮肤生检。在一些实施方案中，组织是来自具有银屑病的 受试者的皮肤生检。在一些实施方案中，组织是来自具有皮肌炎的受试者的皮肤生检。在一些实施方案中，组织是来自具有多肌炎的受试者的皮肤生检。 在一些实施方案中，组织是来自具有炎性肠病的受试者的皮肤生检。在特定 的实施方案中，系统性红斑狼疮是皮肤狼疮、盘状狼疮或狼疮肾炎。可以用 例如荧光团(例如，Alexa Fluor647)标记抗BDCA2抗体或其抗原结合片段。在 一些实施方案中，抗BDCA2抗体是BIIB059。在其他实施方案中，抗BDCA2 抗体是克隆124B3.13(Dendritics)。在一些实施方案中，该方法还包括使组织 接触抗CD123抗体。
在另一个方面，本公开提供在有此需要的受试者中诱导浆细胞样树突细 胞死亡的方法。该方法涉及给受试者施用或使表达BDCA2的浆细胞样树突细 胞接触本文描述的任意抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本公开特征在于在有此需要的受试者中减少浆细胞样树 突细胞产生炎性细胞因子或趋化因子的方法。该方法包括给受试者施用或使 表达BDCA2的浆细胞样树突细胞接触有效量的本文描述的任意抗体或其抗 原结合片段。在一些实施方案中，炎性细胞因子或趋化因子选自下组：I型 干扰素、IL-6、TNF-α、III型干扰素、MIP-1-α/CCL3、MIP-1β/CCL4、CCL5/ RANTES和IP-10/CXCL10。
在另一个方面，本公开特征在于下调浆细胞样树突细胞的表面上的 CD32a表达的方法。该方法包括使浆细胞样树突细胞接触本文所述的抗 BDCA2抗体。在一些实施方案中，抗BDCA2抗体具有IgG1重链恒定区。在 一些实施方案中，抗体具有IgG2重链恒定区。在一些实施方案中，抗体具有 IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，抗体是IgG1重链恒定区和IgG4重链恒 定区的杂合物。在一些实施方案中，抗体是无糖基化的(aglycosylated)。在特定的实施方案中，抗体是IgG1重链恒定区和IgG4重链恒定区的无糖基化杂合 物。
在另一个方面，本公开特征在由此需要的人受试者中下调浆细胞样树突 细胞的表面上的CD32a(FcγRIIa)表达的方法。该方法包括给人受试者施用有 效量的本文所述的抗BDCA2抗体。在一些实施方案中，抗BDCA2抗体具有 IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，抗体具有IgG2重链恒定区。在一些实 施方案中，抗体具有IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，抗体是IgG1重链 恒定区和IgG4重链恒定区的杂合物。在一些实施方案中，抗体是无糖基化的。 在特定的实施方案中，抗体是IgG1重链恒定区和IgG4重链恒定区的无糖基化杂合物。
在另一个方面，本公开特征在于在有此需要的人受试者中抑制免疫复合 物刺激浆细胞样树突细胞的方法。该方法包括给人受试者施用有效量的本文 所述的抗BDCA2抗体。在一些实施方案中，施用减少了pDC表面上CD32a的 水平。在一些实施方案中，受试者具有III型超敏反应。在一个实施方案中， 受试者患有SLE。在另一个实施方案中，受试者患有类风湿性关节炎。在另 一个实施方案中，受试者患有斯耶格伦病(Sjogren’s disease)。在一些实施方 案中，抗BDCA2抗体具有IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，抗体具有 IgG2重链恒定区。在一些实施方案中，抗体具有IgG4重链恒定区。在一些实 施方案中，抗体是IgG1重链恒定区和IgG4重链恒定区的杂合物。
在另一个方面，本公开特征在于在有此需要的人受试者中下调浆细胞样 树突细胞表面上CD62L(L-选择蛋白)的表达(或脱落)的方法。该方法包括给人 受试者施用有效量的本文所述的抗BDCA2抗体或其抗原结合片段。在特定的 实施方案中，抗BDCA2抗体或其抗原结合片段的施用提高一种或多种金属蛋 白酶的水平。在一些实施方案中，通过金属蛋白酶的切割发生CD62L的下调。 在一些实施方案中，抗BDCA2抗体具有IgG1重链恒定区。在上述五个方面 的一些实施方案中，抗体具有IgG2重链恒定区。在上述五个方面的一些实施方案中，抗体具有IgG4重链恒定区。在上述五个方面的一些实施方案中，抗 体是IgG1重链恒定区和IgG4重链恒定区的杂合物。
在另一个方面，本公开特征在于在有此需要的人受试者中治疗炎性病症 的方法。该方法涉及给人受试者施用有效量的本文所述的任何抗BDCA2抗体 或其抗原结合片段。在一些实施方案中，炎性病症选自下组：系统性红斑狼 疮(SLE)、皮肤狼疮、盘状狼疮、狼疮肾炎、类风湿性关节炎、炎性肠病、 系统性硬化症、硬斑病、银屑病、I型糖尿病、皮肌炎、多肌炎和斯耶格伦 病(Sjogren’s disease)。在一个特定的实施方案中，炎性病症是SLE。在另一 特定实施方案中，炎性病症是盘状狼疮。在又一特定实施方案中，炎性病症 是狼疮肾炎。在另一特定实施方案中，炎性病症是皮肤狼疮。在一些实施方 案中，受试者患有全身性SLE(general SLE)。在一些实施方案中，受试者患 有中度SLE。在一些实施方案中，受试者患有中度SLE，没有重度活动性CNS 和/或重度活动性肾累及(severe active CNS and/orsevere active renal involvement)。在一些实施方案中，受试者患有中度SLE，伴有重度活动性CNS 和/或重度活动性肾累及。在一些实施方案中，受试者具有SLE的皮肤表现(例如面颊疹或盘状疹)。在一些实施方案中，受试者患有重度SLE。在一些实施 方案中，受试者患有重度SLE，没有重度活动性CNS和/或重度活动性肾累及。 在一些实施方案中，受试者患有重度SLE，伴有重度活动性CNS和/或重度活 动性肾累及。中度或重度狼疮是狼疮的分期(参见，例如，Guidelines for Referral and Management of Systemic LupusErythematosus in Adults,Arthritis &Rheumatism,42(9):1785-1795(1999)；Gladman,Prognosis and treatment of systemic lupus erythematosus,Curr.Opin.Rheumatol.,8:430-437(1996)； Kalunian等人，Definition,classification,activity and damageindices.In: Dubois’lupus eyrthematosus.5th ed.,Baltimore:Williams andWilkins；pp. 19-30(1997))。
在另一个方面，本公开特征在于在有此需要的受试者中治疗自身免疫性 疾病的方法。该方法涉及给有此需要的受试者施用有效量的本文所述的任何 抗BDCA2抗体或其抗原结合片段。
在与方法相关的任何上述方面中，在一些实施方案中，受试者是人。在 与方法相关的任何上述方面中，在一些实施方案中，抗BDCA2抗体或抗原结 合片段与下列至少一种组合施用：抗疟药(如，羟氯喹)、TLR7信号传导抑制 剂、TLR9信号传导抑制剂或皮质类固醇。在一个特定的实施方案中，抗 BDCA2抗体包含BIIB059的重链和轻链CDR。在一个实施方案中，抗BDCA2 抗体包含分别在SEQ ID NO.8、10和11中所示的重链CDR1，CDR2和CDR3， 和分别在SEQ ID NO.5、6和7中所示的轻链CDR1，CDR2和CDR3。在另一 个实施方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.89、91和11中所示的 重链CDR1，CDR2和CDR3，和分别在SEQ IDNO.5、6和7中所示的轻链 CDR1，CDR2和CDR3。在一个实施方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.9、92和11中所示的重链CDR1，CDR2和CDR3，和分别在SEQ ID NO. 5、6和7中所示的轻链CDR1，CDR2和CDR3。在另一个实施方案中，抗BDCA2 抗体包含分别在SEQ ID NO.90、93和94中所示的重链CDR1，CDR2和 CDR3，和分别在SEQ ID NO.95、96和97中所示的轻链CDR1，CDR2和 CDR3。在一些实施方案中，抗BDCA2抗体还包含Fc区，其以至少约7至15 μg/mL(例如，10、11、12μg/mL)的EC 50结合CD32a。在一个特定的实施方 案中，抗BDCA2抗体是BIIB059。
在另一个方面，本公开特征在于包含抗疟药(例如，羟氯喹)和抗BDCA2 抗体或其抗原结合片段的组合。在一个特定的实施方案中，抗BDCA2抗体包 含SEQ ID NO:24的重链CDR(或备选的CDR)。在另一个实施方案中，抗 BDCA2抗体包含SEQ ID NO:23的轻链CDR(或备选的CDR)。在一个特定的实 施方案中，抗BDCA2抗体包含BIIB059的重链CDR和轻链CDR。在一个实施 方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.8、10和11中所示的重链 CDR1，CDR2和CDR3，和分别在SEQ ID NO.5、6和7中所示的轻链CDR1， CDR2和CDR3。在另一个实施方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO. 89、91和11中所示的重链CDR1，CDR2和CDR3，和分别在SEQ ID NO.5、6 和7中所示的轻链CDR1，CDR2和CDR3。在一个实施方案中，抗BDCA2抗 体包含分别在SEQ ID NO.9、92和11中所示的重链CDR1，CDR2和CDR3， 和分别在SEQ IDNO.5、6和7中所示的轻链CDR1，CDR2和CDR3。在另一 个实施方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.90、93和94中所示的 重链CDR1，CDR2和CDR3，和分别在SEQ ID NO.95、96和97中所示的 轻链CDR1，CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗BDCA2抗体还包含Fc区， 其以至少约7至15μg/mL(例如，9、10、11、12、13、14μg/mL)的EC 50结合 CD32a。在一个特定的实施方案中，抗BDCA2抗体是BIIB059。
在另一个方面，本公开特征在于包含TLR7和/或TLR9信号传导抑制剂和 抗BDCA2抗体或其抗原结合片段的组合。在一个特定的实施方案中，抗 BDCA2抗体包含SEQ ID NO:24的重链CDR(或备选的CDR)。在另一个实施方 案中，抗BDCA2抗体包含SEQ ID NO:23的轻链CDR(或备选的CDR)。在一个 特定的实施方案中，抗BDCA2抗体包含BIIB059的重链CDR和轻链CDR。在 一个实施方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.8、10和11中所示 的重链CDR1，CDR2和CDR3，和分别在SEQ ID NO.5、6和7中所示的轻链 CDR1，CDR2和CDR3。在另一个实施方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.89、91和11中所示的重链CDR1，CDR2和CDR3，和分别在SEQ ID NO.5、6和7中所示的轻链CDR1，CDR2和CDR3。在另一个实施方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.9、92和11中所示的重链CDR1，CDR2 和CDR3，和分别在SEQ ID NO.5、6和7中所示的轻链CDR1。在另一个实施 方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQID NO.90、93和94中所示的重链 CDR1，CDR2和CDR3，和分别在SEQ ID NO.95、96和97中所示的轻链 CDR1，CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗BDCA2抗体还包含Fc区，其 以至少约7至15μg/mL(例如，10、11、12μg/mL)的EC 50结合CD32a。在一 个特定的实施方案中，抗BDCA2抗体是BIIB059。
在另一个方面，本公开特征在于包含皮质类固醇和抗BDCA2抗体或其抗 原结合片段的组合。在一个特定的实施方案中，抗BDCA2抗体包含SEQ ID NO:24的重链CDR(或备选的CDR)。在另一个实施方案中，抗BDCA2抗体包 含SEQ ID NO:23的轻链CDR(或备选的CDR)。在一个特定的实施方案中，抗 BDCA2抗体包含BIIB059的重链CDR和轻链CDR。在一个实施方案中，抗 BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.8、10和11中所示的重链CDR1，CDR2 和CDR3，和分别在SEQ ID NO.5、6和7中所示的轻链CDR1，CDR2和CDR3。 在另一个实施方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.89、91和11中 所示的重链CDR1，CDR2和CDR3，和分别在SEQ IDNO.5、6和7中所示的 轻链CDR1，CDR2和CDR3。在一个实施方案中，抗BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.9、92和11中所示的重链CDR1，CDR2和CDR3，分别在SEQ ID NO.5、6和7中所示的轻链CDR1，CDR2和CDR3。在另一个实施方案中，抗 BDCA2抗体包含分别在SEQ ID NO.90、93和94中所示的重链CDR1，CDR2 和CDR3，和分别在SEQ ID NO.95、96和97中所示的轻链CDR1，CDR2 和CDR3。在一些实施方案中，抗BDCA2抗体还包含Fc区，其以至少约7至 15μg/mL(例如，9、10、11、12、13、14μg/mL)的EC 50结合CD32a。在一 个特定的实施方案中，抗BDCA2抗体是BIIB059。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普 通技术人员的通常理解具有相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似 或等同的方法和材料可以用于实施本发明，但是以下描述了例示性的方法和 材料。通过提及将本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献 以其整体并入。在存在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外， 材料，方法和实例仅是说明性的，并不意在进行限制。
本发明的其他特征、目的和优点在以下的说明书和权利要求书中是显而 易见的。
附图简述
图1是在浆细胞样树突细胞中的BDCA2信号传导的示意图(参见 Geijtenbeek等人，Nature Reviews Immunology,9:465-479(2009))。
图2是显示hu24F4 HX/L1变体结合人BDCA2的图。
图3是显示hu24F4 HX/L1变体结合食蟹猴BDCA2的图。
图4是编码抗BDCA2轻链的质粒pJP009的示意图。抗BDCA2轻链核酸序 列在hCMVIE启动子和hGH聚腺苷酸化序列的转录控制下。氨基糖苷磷酸转 移酶(新霉素抗性)的基因在鼠磷酸甘油激酶(muPGK)启动子和聚腺苷酸化序 列的转录控制下。其余的序列(包括β-内酰胺酶的基因)用于在大肠杆菌中增 殖和选择。
图5是编码抗BDCA2重链的质粒pJP010的示意图。抗BDCA2重链核酸序 列在hCMVIE启动子和人生长hGH聚腺苷酸化序列的转录控制下。二氢叶酸 还原酶(dhfr)的基因在SV40E启动子和聚腺苷酸化序列的转录控制下。其余的 序列(包括β-内酰胺酶的基因)用于在大肠杆菌中增殖和选择。
图6是显示BIIB059在食蟹猴(A)和人(B)浆细胞样树突细胞上结合的线 图。将食蟹猴(A)或人(B)全血与不同浓度的经Alexa647标记的BIIB059抗体(圆圈)或人IgG同种型(正方形)在冰上一起温育。使用LSRII-4颜色FACS仪 (LSRII-4color FACS machine)收集数据并使用FlowJo和GraphPad Prism软件 分析数据。
图7是显示用于自身缔合的AlphaScreen测试的结果的线图。关键：菱形＝BIIB059；正方形＝5C8；和三角形＝LT105。
图8是显示差示扫描荧光测定法测试BIIB059在不同条件里的稳定性的 结果的线图。该图以pH的函数显示在150mM氯化钠和250mM蔗糖的情况中 得到的数据。
图9是显示搅拌随着时间对聚集的影响的线图。加入Tween 80抑制聚集。
图10是显示AC144直接结合人和食蟹猴表面BDCA2的线图。
图11是显示Fc融合蛋白的大小排阻层析法分析结果的一系列图。
图12是显示钙对BIIB059结合BDCA2的影响的图。相对于EDTA，通过 加入钙增强BIIB059对BDCA2的结合，给出高约2倍的信号。
图13是显示BIIB059对人类和食蟹猴BDCA2胞外域的Octet结合结果的 图。
图14是显示BIIB059有力地抑制来自用TLR9激动剂刺激的PBMC的 IFNα的图。每个符号代表来自独立的实验的IC 50，并且垂直线描述SEM。
图15A-C提供了一系列图，显示BIIB059有力地抑制来自用TLR9配体刺 激的全血的细胞因子和趋化因子。图15A显示使用来自健康供体的肝素化静 脉血抑制IFNα。图15B显示与使用来自2个健康供体的全血(下图)得到的结果 相比，使用来自两个SLE患者的全血(上图)抑制IFNα。图15C提供了一系列 柱状图，显示BIIB059治疗导致一大批细胞因子和趋化因子的抑制。
图16是显示了BIIB059抑制I型干扰素的表达的条形图。
图17包括两个线图，显示BDCA2与BIIB059的连接(ligation)抑制纯化的 pDC中TLR9诱导的细胞因子产生。
图18是显示BDCA2的连接抑制SLE血清刺激的pDC中诱导产生IFN-α的 条形图。
图19A是显示BDCA2在连接BIIB059之后被内在化的线图。图19B显示内 在化不影响BIIB059介导的对IFN-α产生的抑制的线图。
图20是一系列线图，显示BIIB059结合Fcγ受体。
图21提供C1q ELISA结果，显示人C1q与增加浓度的(0-15μg/mL)包被抗 体的结合。
图22A-D是显示BIIB059介导通过ADCC杀死细胞的过程的一系列图。将 CHO细胞系(EAG2456 T1F2克隆34.16.7)用作靶细胞。使用APC标记的抗 BDCA2 mAb(克隆AC144，Miltenyi)，通过FACS测定CHO细胞表面上BDCA2 的表达水平。将NK细胞作为效应细胞。使用Vybrant细胞毒性测定试剂盒 (Vybrant Cytotoxicity Assay kit)(Invitrogen)，按照生产商的说明书评估ADCC。 该测定基于G6PD依赖的刃天青(resazurin)减少来检测来自受损细胞的 G6PD，所述刃天青在530nm处激发后在590nm发出荧光。使用高BDCA2表 达的CHO细胞进行在图22A中描述的ADCC测定(图22C)，而在图22B中的 ADCC测定使用具有较低的BDCA2表达的CHO细胞(图22D)。
图23是显示BIIB059通过CDC介导细胞杀伤的线图。将CHO细胞 (EAG2456 T1F2克隆34.16.7)以5×104个细胞接种在96孔胶原蛋白黑孔板中， 并在37℃温育48小时。然后洗涤板，在有效应器能力的BDCA2单抗(24F4S 和BIIB059)、效应器功能缺乏的mAb(24F4S-Agly和24F4A-Agly)或IgG1同种 型对照的存在下，在37℃用兔血清补体和碘化丙啶(PI)温育板1小时。阴性对 照由含有CHO细胞、兔血清补体、PI且没有抗体的孔组成。
图24是用于测定食蟹猴pDC上的BIIB059结合(“直接”)和竞争 BIIB059-A647结合(“间接”)的EC50的一系列图。在体内注射BIIB059之前，每 周一次总共三周从12个食蟹猴抽取血液。将流式细胞术用于测定BIIB059与 pDC细胞表面上的BDCA2结合的EC50(“直接”方法)和在BIIB059的存在下可 获得的BDCA2受体量(“间接”方法)。将血液与在40-0.04μg/mL范围内的六点 滴定(six-point titration)的BIIB059温育。通过流式细胞术鉴定pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+，并用10ug/mL标记的BIIB059-A647或抗人 IgG PE标记二抗处理pDC。在FlowJo软件中计算PE(空心符号，绘制在左侧y 轴上)或A647(闭合的符号，绘制在右侧y-轴)的MFI，并使用GraphPad Prism 软件(对数转换数据的四参数非线性回归曲线拟合)作图。这里显示来自十二 个食蟹猴中的四个的代表性图。
图25是显示抗BDCA2抗体BIIB059与食蟹猴全血中的pDC上细胞表面 BDCA2的平稳结合的示意图。将血液与在40-0.04μg/mL范围内的六点滴定 的BIIB059温育。通过流式细胞术鉴定pDC为CD20-CD14-CD123+ HLA-DR+，并用抗人IgG PE标记二抗处理pDC。在FlowJo软件中计算PE的MFI，将40μg/mL点作为100％，计算占最大结合的百分比。每条线代表一个食蟹猴个体，总共十二个猕猴，使用GraphPad Prism软件(对数转换数据的四 参数非线性回归曲线拟合)作图。染色每周重复一次，总共三周。虚线表明 对于所有的食蟹猴，10μg/mL浓度的BIIB059的浓度饱和BDCA2受体结合。
图26A-C解决在媒介物处理的食蟹猴上结合的BIIB059和游离的BDCA2 染色的水平。图26A是一系列的FACS直方图，显示在媒介物处理的食蟹猴上 的背景PE染色。在时间0，对食蟹猴1、4和12施用媒介物对照(柠檬酸钠)的 单次IV注射。1小时后，抽出全血，通过流式细胞术鉴定pDC为 CD20-CD14-CD123+HLA-DR+，并用抗人IgG PE(空心直方图)或FACS缓冲 液作为PE荧光-1(flrorescence minus one,FMO)对照(实心直方图)处理pDC。图 26B是来自在指定的时间点从三个经媒介物处理的食蟹猴抽取的血液的pDC 的PE染色图。使用FlowJo软件计算PE的MFI，使用GraphPad Prism软件作图。 图26C是来自在指定的时间点从三个经媒介物处理的食蟹猴抽取的血液的 pDC的A647染色图。将10μg/mL的BIIB059-A647加入到在每个指定的时间点 从三个经媒介物处理的食蟹猴抽取的血液中，并测定pDC上的A647染色。使 用FlowJo软件计算A647的MFI，使用GraphPad Prism软件作图。
图27A-C显示了对食蟹猴的单剂10mg/kg BIIB059后，结合的BIIB059和 BDCA2受体在pDC细胞表面上不再可用。图27A是一系列的FACS直方图， 显示在用10mg/kg BIIB059处理的食蟹猴上的BIIB059染色。在时间0，对食 蟹猴3、8和10施用10mg/kg BIIB059的单次IV注射。1小时后，抽出全血，并 鉴定pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+，并将抗人IgG PE(空心直方图) 或FACS缓冲液作为PE FMO对照(实心直方图)处理pDC。图27B是来自在指定 的时间点从三个经BIIB059处理的食蟹猴抽取的血液的pDC上的PE染色图。 使用FlowJo软件计算PE的MFI，使用GraphPad Prism软件作图。图27C是来自 在指定的时间点从三个经BIIB059处理的食蟹猴抽取的血液的pDC上的A647 染色图。将10μg/mL的BIIB059-A647加入到在每个指定的时间点从三个经 BIIB059处理的食蟹猴抽取的血液中，并测定pDC上的A647染色。使用FlowJo 软件计算A647的MFI，使用GraphPad Prism软件作图。
图28A-C显示了对食蟹猴的单剂1mg/kg BIIB059后，结合的BIIB059和 BDCA2受体在pDC细胞表面上不再可用。图28A是一系列的FACS直方图， 显示在用1mg/kg BIIB059处理的食蟹猴上的BIIB059染色。在时间0，对食蟹 猴3、8和1施用1mg/kg BIIB059的单次IV注射。1小时后，抽出全血，并鉴定 pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+，并将抗人IgG PE(空心直方图)或 FACS缓冲液作为PE FMO对照(实心直方图)处理pDC。图28B是来自在指定的 时间点从三个经BIIB059处理的食蟹猴抽取的血液的pDC的PE染色图。使用 FlowJo软件计算PE的MFI，使用GraphPad Prism软件作图。图28C是来自在指 定的时间点从三个经BIIB059处理的食蟹猴抽取的血液的pDC的A647染色 图。将10μg/mL的BIIB059-A647加入到在每个指定的时间点从三个经 BIIB059处理的食蟹猴抽取的血液中，并测定pDC上的A647染色。使用FlowJo 软件计算A647的MFI，使用GraphPad Prism软件作图。
图29A-C显示了对食蟹猴的单次皮下(SC)剂量的0.2mg/kg BIIB059后， 结合的BIIB059和BDCA2受体在pDC细胞表面上不再可用。图29A是一系列 的FACS直方图，显示在用0.2mg/kg BIIB059 SC处理的食蟹猴上的BIIB059 染色。在时间0，对食蟹猴4、6和12施用0.2mg/kg BIIB059的单次SC注射。1 小时后，抽出全血，并鉴定pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+，并将抗 人IgG PE(空心直方图)或FACS缓冲液作为PE FMO对照(实心直方图)处理pDC。图29B是来自在指定的时间点从三个经BIIB059处理的食蟹猴抽取的血 液的pDC的PE染色图。使用FlowJo软件计算PE的MFI，使用GraphPad Prism 软件作图。图29C是来自在指定的时间点从三个经BIIB059处理的食蟹猴抽取 的血液的pDC的A647染色图。将10μg/mL的BIIB059-A647加入到在每个指 定的时间点从三个经BIIB059处理的食蟹猴抽取的血液中，并测定pDC上的 A647染色。使用FlowJo软件计算A647的MFI，使用GraphPad Prism软件作图。
图30是显示接受IV 1mg/kg的BIIB059食蟹猴和接受IV 10mg/kg的 BIIB059食蟹猴中观察到的PK/PD关系的一系列图。对于在该图中的每个曲 线图，BIIB059血清浓度绘制在左侧y轴(空心符号)，BDCA2受体密度被绘制 在右侧y-轴(实心符号)。在食蟹猴5中观察到的加速清除率可能是由于对 BIIB059免疫原性。
图31是显示接受SC 0.2mg/kg的BIIB059食蟹猴中观察到的PK/PD关系 的一系列图。对于在该图中的每个曲线图，BIIB059血清浓度绘制在左侧y轴 (空心符号)，BDCA2受体密度被绘制在右侧y-轴(实心符号)。
图32是的一系列柱状图，显示ELISA或多重测定法测量由用CpG-A、在 抗BDCA2存在下用CpG-A和在同种型对照存在下用CpG-A处理的pDC产生 的炎性细胞因子和趋化因子的浓度的结果。每个条代表来自测试的5个中的1 个代表性健康人供体的一式两份孔的平均值和标准差(SD)。垂直线描绘SD。
图33是一系列柱状图，显示了ELISA或多重测定测量通过用Sm/RNP免 疫复合物、在抗BDCA2存在下的Sm/RNP免疫复合物和在同种型对照存在下 的Sm/RNP免疫复合物处理的pDC产生的炎性细胞因子和趋化因子的浓度的 结果。每个条代表来自测试的5个中的1个代表性健康人供体的一式两份孔的 平均值和标准差(SD)。垂直线描绘SD。
图34是一系列柱状图，显示qPCR测定法测定BIIB059对经Sm/RNP IC刺 激的来自健康人供体的pDC中I型IFN亚类转录的影响的结果。每个条代表来 自测试的3个(N＝3)中的1个代表性供体的一式四份孔的平均值相对倍性变 化，且垂直线描绘标准偏差(SD)。
图35A是显示对TLR9诱导的PBMC IFNα的BIIB059介导的剂量依赖性抑 制，所述PBMC来自在测试的18个中的1个代表性健康供体。每个符号代表一 式两份孔的平均值和标准差(SD)。图35B对TLR9诱导的PBMC IFNα的 BIIB059介导的剂量依赖性抑制，所述PBMC来自测试的11个中的1个代表性 SLE患者。每个符号代表一式两份孔的平均值和标准差(SD)。图35C显示与 SLE患者(SLE)相比，BIIB059对TLR9诱导的健康人供体(HD)中PBMC产生 IFNα的抑制的IC50值。每个符号代表单个供体，且垂直线描绘SD。
图36A显示在12个测试中的1个代表性全血测定中，BIIB059介导的剂量 依赖性抑制TLR9诱导的IFNα。每个符号代表一式两份孔的平均值和标准差 (SD)。图36B显示与PBMC测定相比，BIIB059在全血测定中抑制TLR9诱导产 生的IFNα的IC 50值。每个符号代表单个供体，且垂直线描绘SD。
图37.在96孔板中在总的测定体积250μL/孔中，用1μM TLR3配体(Poly I:C)刺激并用浓度范围为10μg/mL到0.ng/mL的BIIB059处理来自健康人供体 的PBMC。使板在37℃和5％CO2下温育过夜(18小时)。收集200μL上清液用 于通过ELISA评估IFNα水平。每个符号代表在每个处理条件下产生的平均 IFNα水平。显示两个独立供体的数据。垂直线描绘标准差(SD)。
图38A显示了剂量依赖性BIIB059介导的来自1个代表性健康人供体的 BDCA2内在化。圆圈代表在不同剂量的BIIB0592时，2D6染色的MFI。三角 形代表了在同种型对照的存在下2D6的MFI(最大染色)。菱形代表FMO对照 的MFI(背景染色)。图38B显示了在来自健康人供体的全血测定中BIIB059诱 导的pDC上BDCA2内在化的EC50(实心圆圈；N＝10个供体)。平均EC50为 0.017±0.005μg/mL)。
图39是门控CD14-CD20 HLA-DR+CD123+pDC的2D6-FITC染色的平 均荧光强度(MFI)值的图解。同种型(ISO)表示最大染色，由FACS染色混合物 减去2D6-FITC组成的FMO(荧光-1对照)代表背景染色。该图显示进行的4个 独立实验的一个代表性实验。
图40是从外周血纯化，然后用10μg/mL BIIB059-AF647(白色)在4℃(左) 或在37℃和5％CO 2(右)下温育15分钟的人pDC的共焦图像。BIIB059细胞分 布通过共聚焦显微术评估，并显示了每个条件下的代表性图像。
图41是BDCA2的内在化对抑制IFNα产生的影响的图。该图代表3个独立 实验。
图42是显示BIIB059介导的BDCA2内在化的EC50值与在全血测定(n＝10) 中BIIB059介导的抑制TLR9诱导的IFNα的IC50值相关的图。R2值是0.57。
图43A显示了表示为在LAMP1+区室中TLR9定位的Manders共定位系数 的平均值和标准差(SD)的结果。图43B显示了表示为在TLR9+区室中 BIIB059/BDCA2定位的Manders共定位系数的平均值和SD的结果。图43C显 示了表示为在LAMP1+区室中BIIB059/BDCA2定位的Manders共定位系数的 平均值和SD的结果。各符号表示单个细胞；水平线代表平均值，垂直线代表 SD。
图44A是用10μg/mL的BIIB059(有色直方图)处理的全血，10μg/mL同种 型对照(虚线)处理的全血或用TLR9配体CpG-A刺激的全血(实线)的代表性实 验的直方图。图44B是BIIB059处理全血导致CD62L脱落的效果(实心方块)的 图。空心方块代表同种型处理(10μg/mL)。该图代表3个独立实验。
图45是通过流式细胞术测定CD62L表面表达的图。在仅存在BIIB059的 情况下，以及用增加浓度的GM6001(圆圈)，测定CD62L表达。空心方块代表 同种型处理对照(10μg/mL)。倒三角形代表经BIIB059处理的DMSO对照。该 图代表2个独立实验。
图46A是BIIB059和24F4A-Agly介导的在来自一个代表性的健康人供体 (n＝5)的pDC表面上BDCA2的剂量依赖性内在化的图。使用两步磁珠分离方 法(MACS试剂盒，Miltenyi Biotec)分离来自人健康供体的pDC。用增加浓度 的BIIB059(圆圈)或无糖基化形式的抗体24F4-Agly-(正方形)处理pDC。也用10μg/mL的同种型对照(三角形)处理细胞并在37℃温育16小时。然后染色 pDC用于BDCA2和CD32的表面表达。图46B是直方图，显示用10μg/mL BIIB059(阴影)或同种型对照(虚线)(N＝5)处理的分离的pDC上CD32的水平。 图46C是直方图，显示用10μg/mL无糖基化形式的-24F4-A(阴影)或同种型对 照(虚线)处理的分离的pDC上CD32的水平。实线表示未染色的细胞(N＝5)。 图46D是BIIB059介导的剂量依赖性下调来自一个代表性的健康人供体(n＝5) 的pDC表面上的CD32的图。图46E是直方图，显示在10μg/mL BIIB059(阴影)、 无糖基化形式(虚线)或同种型对照(虚线)的存在下，在4℃处理分离1小时的 分离的pDC上CD32的水平。温育后，对pDC评估CD32表面表达。黑色实线代表未染色的细胞(N＝3)。图46F是直方图，显示在10μg/mL BIIB059(阴影)、 无糖基化形式(虚线)或同种型对照(虚线)的存在下，在37℃处理1小时的分离 的pDC上CD32的水平。温育后，对pDC评估CD32表面表达。黑色实线代表 未染色的细胞(N＝3)。
图47A是来自用增加浓度的BIIB059(正方形)、增加浓度的无糖基化形式 的抗体24F4-A(圆圈)或10μg/mL的同种型对照(三角形)处理的分离的pDC的 IFNα水平的图。在CpG-A(75μg/mL)的存在下刺激pDC或保持未刺激(倒三角 形)。在37℃温育pDC16小时，收集上清液并通过ELISA测定IFN-α。显示进 行的2个实验中的一个代表性实验。图47B是来自用增加浓度的BIIB059(正方 形)、增加浓度的无糖基化形式的抗体24F4-A(圆圈)、10μg/mL的同种型对照 (三角形)或10μg/mL CD32 mAb处理的分离的pDC的IFNα水平的图。通过在 无血清培养基中混合来自小牛胸腺的Sm-RNP和纯化自SLE患者血清的抗 RNP抗体30分钟预先形成Sm/RNP免疫复合物。用免疫复合物刺激或仅用抗 原(未刺激)处理分离的细胞。在37℃温育细胞16小时，收集上清液并通过 ELISA测定IFN-α。显示进行的3个实验中的一个代表性实验。每个符号代表 一式两份孔的平均值和标准差(SD)。
图48A在10μg/mL BIIB059、24F4-A、抗CD32 mAb(AT10克隆)、人源化 的抗CD32或同种型对照的存在下，用免疫复合物处理的分离的pDC上CD62L 表达的条形图。在37℃温育细胞16小时。对pDC染色用于CD32和CD40的表 面表达。图48B是显示通过ELISA测定的从A收集的上清液中的IFN-α水平的 柱状图。显示代表性图(N＝3)。图48C是直方图，显示pDC表面上的CD40表 达。虚线代表在细胞表面上CD40的表达。有色直方图代表用抗CD40抗体处 理后pDC上的CD40水平。实线代表未染色细胞。
图49描绘HCQ对BIIB059效力的影响。每个符号代表从单个健康人供体 测量的IFNα浓度，且垂直线描绘SD。在总测定体积250μl/孔中，用不同浓度 的单独的BIIB059、单独的HCQ或组合(BIIB059+HCQ)处理来自健康人供体 的PBMC。BIIB059的浓度范围为10μg/mL到0.1ng/mL。HCQ的浓度范围为 10μM至156nM。用5μM的TLR7配体(R848)刺激1×10 6PBMC细胞/孔。在37℃ 和5％CO2下温育含有PBMC的板过夜(18小时)。收集200μL上清液用于IFNαELISA(PBL InterferonSource)中的评估。
图50描绘HCQ对BIIB059效力的影响。每个符号代表从2个测试的健康供 体中的一个代表性人供体测量的IFNα浓度，且垂直线描绘标准差(SD)。通过 用蔗聚糖(Ficoll)进行的不连续梯度离心，从健康人供体或SLE患者肝素化静 脉血分离PBMC，在PBS中洗涤PBMC，并重悬于完全培养基(含3％FBS的 RPMI)。在总测定体积250μl/孔中，用不同浓度的单独BIIB059、单独HCQ或 组合(BIIB059+HCQ)处理PBMC。BIIB059的浓度范围为10μg/mL到0.1ng/mL。HCQ的浓度范围为10μM至156nM。用1μM的TLR9配体(CPG-A)刺 激1×10 6PBMC细胞/孔。在37℃和5％CO2下温育含有PBMC的板过夜(18小 时)。收集200μL上清液用于IFNαELISA(PBL InterferonSource)中的评估。
图51显示在健康食蟹猴全血中按原始比例(左图)和对数比例(右图)的百 分比循环PDC分布。每周一次持续四周从12只食蟹猴抽取全血。使用流式细 胞术鉴定pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+。用FlowJo软件计算pDC占 CD20-CD14-细胞的百分比。使用用于统计计算的R语言得到图。
图52是在IV注射BIIB059之前不同的时间点健康食蟹猴全血中百分比循 环的PDC分布的图(对数比例)。在指定的时间点，抽出全血，使用流式细胞 术鉴定pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+。在FlowJo软件中计算pDC的百 分比。使用R软件作图。
图53是在IV注射BIIB059之前不同的时间点健康食蟹猴全血中百分比循 环PDC的最终拟合模型的图(对数尺度)。将不同的时间点作为固定因素和将 食蟹猴作为随机截取的对数(％PDC)线性混合效应模型显示不同周测量的几 何平均％pDC值比率之间无差异(基于等于0的所有时间效应的F-检验的P值 是0.67)。使用用于统计计算的R语言计算图和统计学分析。黑线显示最终拟 合模型，其仅包括用于食蟹猴的固定截取和随机截取。将R中的lme4程序包 用于拟合线性混合效应模型。
图54描绘了在食蟹猴中IV剂量的柠檬酸钠媒介物、1mg/kg的BIIB059 或10mg/kg的BIIB059之前或之后，以对数尺度显示的百分比循环pDC。对 于每个剂量组，在时间0对三只食蟹猴施用。在指定的时间点，抽出全血， 使用流式细胞术鉴定pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+。在FlowJo软件 中计算pDC的百分比，并使用R软件作图。
图55描述了在食蟹猴中IV剂量的柠檬酸钠载体、1mg/kg的BIIB059和 10mg/kg的BIIB059之前或之后，以对数尺度显示的百分比循环PDC的最终拟 合模型。具有剂量组，1小时、6小时和大于28天的时间水平作为固定因素和 具有食蟹猴的随机截取的对数(％pDC)值的线性混合效应模型。实线显示拟 合模型。将R中的lme4程序包用于拟合线性混合效应模型。使用用于统计计 算的R语言计算图和统计分析。
图56显示了在食蟹猴中SC剂量的0.2mg/kg BIIB059之后百分比循环 pDC。在时间0对食蟹猴4、6和12施用单次SC注射0.2mg/kg BIIB059。在三 只食蟹猴中，在以前的研究中对食蟹猴6施用了BIIB059 mg/kg。在以前的研 究中对食蟹猴4和12施用了媒介物。在指定的时间点，抽出全血，使用流式 细胞术鉴定pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+。在FlowJo软件中计算pDC 的百分比，并使用R软件作图。
图57描述了在食蟹猴中SC剂量的0.2mg/kg的BIIB059之后百分比循环 PDC的最终拟合模型。对对数(％pDC)值拟合的线性混合效应模型，具有连 续时间和1小时时间作为固定效应和具有食蟹猴作为随机截取。实线显示拟 合模型。将R中的lme4程序包用于拟合线性效应模型。使用用于统计计算的 R语言计算图和统计分析。
图58是食蟹猴PK/PD试验设计的示意图。九只食蟹猴完成了静脉内(IV) 剂量研究。根据所示的取血时间表，在IV施用媒介物、1mg/kg BIIB059或 10mg/kg BIIB059之前或之后，对食蟹猴取血。在完成这项研究后，3只食蟹 猴继续完成皮下(SC)剂量研究，其中它们接受0.2mg/kg BIIB059的单次SC注 射。在各取血时间点，进行了全血测定，其中用完全RPMI1640以1:4稀释来 自食蟹猴的全血并用CPG-A刺激至在96孔圆底组织培养板中200μg/ml的终 浓度，并在37℃、5％CO2下温育18-20小时。在培养结束时，将受刺激的全 血离心以收获血清。在MxA生物测定中，在37℃、5％CO 2下，用收获血清 刺激A549细胞19-20小时，来诱导MxA蛋白。20小时后，裂解A549细胞并进 行夹心ELISA法来检测MxA蛋白浓度。通过用增加剂量的rIFNα处理A549细 胞产生的标准曲线反算IFNα水平(单位/mL)。
图59是相对于处理前的平均值，在接受单个静脉内剂量的BIIB059的食 蟹猴中TLR9诱导IFNα产生减少的趋势的图解。用单个静脉内剂量的媒介物、 将1mg/kg BIIB059或10mg/kg BIIB059处理的食蟹猴全血用完全RPMI1640 以1:4稀释，并用CPG-A(2216)刺激至在96孔圆底组织培养板中200μg/ml的 终浓度，并在37℃、5％CO2下温育全血18-20小时。在培养结束时，将受刺 激的全血离心以收获血清。在37℃、5％CO 2下，用收获血清刺激A549细胞 19-20小时，来诱导MxA蛋白。20小时后，裂解A549细胞并进行夹心ELISA 法来检测MxA蛋白浓度。通过用增加剂量的rIFNα处理A549细胞产生的标准 曲线反算IFNα水平(单位/mL)。通过平均取血前时间点(第21、14、7和0天) 的所有IFNα测量计算每只猴的平均取血前IFNα浓度。然后，BIIB059施用多 达14天之后的每一取血时间点的％IFNα通过IFNα在该时间的浓度除以此动 物的取血前平均值并乘以100来计算。将每个治疗组的这些值平均。图描述 了平均值±平均值的标准误差。使用Excel和GraphPad6.0软件(GraphPad,SanDiego,CA)计算图和统计分析。
图60是在经BIIB059静脉内处理的食蟹猴的离体全血测定中，TLR9诱导 IFNα的产生减少的图解。用单个静脉内剂量的媒介物(上图)、1mg/kg BIIB059(中间图)或10mg/kgBIIB059(下图)处理的食蟹猴全血用完全 RPMI1640以1:4稀释并用CPG-A (2216)刺激至在96孔圆底组织培养板中200 μg/ml的终浓度，并在37℃、5％CO 2下温育全血18-20小时。在培养结束时， 将受刺激的全血离心以收获血清。在37℃、5％CO 2下，用收获血清刺激A549细胞19-20小时，来诱导MxA蛋白。20小时后，裂解A549细胞并进行夹心 ELISA法来检测MxA蛋白浓度。通过用增加剂量的rIFNα处理A549细胞产生 的标准曲线反算IFNα水平(单位/mL)。将双因素混合效应方差分析(ANOVA) 适用于计算的IFNα浓度的log10值。将IFNα值相对于每个剂量组中的每个动 物的取血天数作图(在log10标度上)。垂直线表示将取血天数分组成施用前、 施用后多达31天和施用后大于31天。在分析中未使用大于31天的取血天数。 基于模型估计的几何平均IFNα值表示为每个图中施用前和施用后的区域内 粗黑水平线。使用用于统计计算的R语言计算图和统计分析。
图61是在经BIIB059皮下处理的食蟹猴的离体全血测定中，TLR9诱导 IFNα的产生减少的图解。用单个皮下剂量0.2mg/kg BIIB059处理食蟹猴全血 用完全RPMI1640以1:4稀释并用CPG-A(2216)刺激至在96孔圆底组织培养 板中200μg/ml的终浓度，并在37℃、5％CO2下温育全血18-20小时。在培养 结束时，将受刺激的全血离心以收获血清。在37℃、5％CO2下，用收获血 清刺激A549细胞19-20小时，来诱导MxA蛋白。20小时后，裂解A549细胞并 进行夹心ELISA法来检测MxA蛋白浓度。通过用增加剂量的rIFNα处理A549 细胞产生的标准曲线反算IFNα水平(单位/mL)。将具有随机效应的单因素方 差分析(ANOVA)适用于计算的IFNα浓度的log10值。将IFNα值相对于每个动 物的取血天数作图(在log10标度上)。垂直线表示将取血天数分组成施用前、 施用后多达33天和施用后大于33天的组。在分析中未使用晚于33天的取血天 数。基于模型估计的几何平均IFNα值表示为每个图中施用前和施用后的区域 内粗黑水平线。使用用于统计计算的R语言计算图和统计分析。
发明详述
BIIB059是特异性结合人BDCA2的示例性单克隆抗体。本文所述的抗 BDCA2抗体抑制pDC产生和/或分泌炎性细胞因子和趋化因子。此外，本文 所述的抗BDCA2抗体可以下调pDC的表面上CD32a和/或CD62L的水平。另 外，本公开的抗BDCA2抗体可介导BDCA2从pDC的表面的内在化。此外， 本文描述的抗BDCA2抗体可用于通过ADCC或CDC消耗pDC并且可用于治 疗或预防免疫病症，例如炎性和自身免疫性状况。本公开还显示，与用任一 药剂单独治疗相比，组合抗疟药与本文中所述的抗BDCA2抗体可产生改善的 效果。
BDCA2
BDCA2是在pDC上特异性表达的II型C-型凝集素BDCA2由C-端的单个 胞外糖类识别域(CRD)、跨膜区和N-端短的胞质尾区(不具有信号基序)组成。 BDCA2通过相关的跨膜衔接子FcεRIγ(参见图1)发送胞内信号。抗体介导的 BDCA2的结合导致脾酪氨酸激酶(SYK)募集到FcεRIγ的基于磷酸化免疫受体 酪氨酸的活化基序(ITAM)。Syk的活化导致B细胞连接体(BLNK)，Bruton酪 氨酸激酶(BTK)和磷脂酶Cγ2(PLCγ2)的激活，从而导致Ca2+的流动。
人BDCA2蛋白的氨基酸序列(Genbank登录号NP_569708.1)显示如下(跨 膜域表示成斜体；胞外域加下划线)。
Figure BDA0002495922490000331
人FcεRIγ的氨基酸序列(Genbank登录号NP_004097.1)显示如下。
1MIPAVVLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV
51RKAAITSYEK SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQ*(SEQ ID NO:2)
最接近的大鼠BDCA2同源物大鼠Clec4b2(Genbank登录号 NM_001005896)，与人类BDCA2共享仅51.0％的同一性。与此相反，食蟹猴 和恒河猴BDCA2与人BDCA2共享90.6％的同一性。此外，食蟹猴和恒河猴猴 的FcεRIγ蛋白序列(它们彼此相同)与人FcεRIγ蛋白共享98.9％的同一性。
人、食蟹猴和恒河猴BDCA2蛋白可以用作制备抗BDCA2抗体的免疫原。 为了制备人抗BDCA2抗体，可以将人BDCA2蛋白用作免疫原。然后，抗人 BDCA2抗体可用于鉴定具有以下所述的一个或多个特征(例如，减少I型干扰 素或III型干扰素、IL-6、TNF-α、MIP-1-α,MIP-1β,CCL5和IP-10/CXCL10中 的一种或多种的分泌/产生；消耗pDC；与BIIB059竞争结合BDCA2的胞外域； 选择性结合人、食蟹猴和恒河猴BDCA2的胞外域，但不结合大鼠Clec4b2；在人类银屑病异种移植模型中抑制疾病的发展)的抗体。
抗-BDCA2抗体
本公开包括单克隆抗体BIIB059的序列，BIIB059能结合人、食蟹猴和恒 河猴BDCA2，但不结合大鼠Clec4b2。BIIB059不结合来自灵长类下的种系发 生物种(phylogenetic species)的BDCA2或不显示对来自灵长类下的种系发生 物种的BDCA2的显著结合。
BIIB059
BIIB059是特异性识别浆细胞样树突细胞的表面上的BDCA2的人源化 IgG1抗体。如下自结合BDCA2的鼠抗体(24F4)衍生它。用基因枪将编码全长 人BDCA2的质粒注入小鼠。将来自该小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并且 所得到的杂交瘤产生24F4抗体。将24F4抗体工程化改造成野生型人IgG1框 架，以维持完全的效应器功能。下面显示了预测的成熟BIIB059重链和轻链 氨基酸序列。可变轻链(VL)和可变重链(V H)的互补决定区(CDR)1、2和3以 从成熟的VL和VH序列的N端到C端的次序显示，并且两者是加下划线和加粗 的。将由以下列出的成熟重链(SEQ ID NO:4)和成熟轻链(SEQ ID NO:3)组成 的抗体称为BIIB059。
成熟的BIIB059轻链(LC)
Figure BDA0002495922490000341
成熟的BIIB059重链(HC)
Figure BDA0002495922490000342
BIIB059的可变轻链(VL)具有以下的氨基酸序列:
Figure BDA0002495922490000343
BIIB059的可变重链(V H)具有以下的氨基酸序列:
Figure BDA0002495922490000344
下面列出了BII059的VL CDR的氨基酸序列:
VL CDR1:KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)；
VL CDR2:AASTLES(SEQ ID NO:6)；和
VL CDR3:QQANEDPRT(SEQ ID NO:7).
下面列出了BII059的VH CDR的氨基酸序列:
VH CDR1:TYTMS(SEQ ID NO:8)(Kabat CDR1)或
GFTFSTYTMS(SEQ ID NO:9)(增强的Chothia/AbM CDR1)；
VH CDR2:TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)；
VH CDR3:DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)
如上所述，VH CDR1的增强Chothia/AbM CDR的定义比此CDR的Kabat 定义长5个氨基酸。增强的Chothia/AbM VH CDR1的五个额外的氨基酸是 GFTFS(SEQ ID NO:12)。
本公开的抗BDCA2抗体还可以包含BIIB059的“备选CDR”。“备选”CDR 指的是根据Chothia(来自Abysis)、增强Chothia/AbM CDR或接触定义(contact definition)中的任一项限定的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。例如，可以通过 使用AbYsis数据库(www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cg)可以得到这些备选的CDR。在下表中，将BIIB059的重链可变区和轻链可变区 的“备选”CDR1、2和3的氨基酸序列与根据Kabat定义的CDR比较。
Figure BDA0002495922490000351
Figure BDA0002495922490000361
抗-BDCA2抗体可以包含根据Kabat定义、来自Abysis的Chothia定义、增 强Chothia/AbM CDR定义或接触定义的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3。 这些抗体可以具有一个或多个(即，1、2、3、4、5或6)CDR内的例如1、2或3 个取代。这些抗体(i)结合人或食蟹猴BDCA2但不显著地结合来自灵长类下的 种系发生种类的BDCA2；和/或(ii)抑制TLR7/TLR9诱导的人pDC的I型干扰素 和其它细胞因子或趋化因子产生；和/或(iii)介导BDCA2从pDC表面的内在 化；和/或(iv)下调来自pDC表面的CD32a和/或CD62L；和/或(v)通过ADCC或CDC在体外消耗pDC。
人IgG抗体是含有两条轻链和两条重链的四聚体分子。BIIB059的每条轻 链通过链间二硫键(LC Cys 218-HC Cys 225)和重链共价连接，重链通过两个 链间二硫化物(HCCys 231-Cys 231和Cys 234-Cys 234)彼此配对。所有其他半 胱氨酸形成稳定恒定域和可变域的分子内二硫键。
在某些实施方案中，抗BDCA2抗体包括人重链恒定区和轻链恒定区。在 某些实施方案中，重链恒定区包含CH1域和铰链区。在一些实施方案中，重 链恒定区包含CH3域。如果重链恒定区包括取代，那么这种取代修饰抗体的 性质(例如，增加或减少以下性质中的一个或多个：Fc受体结合、抗体糖基 化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能、或补体功能)。在一些实施方案 中，抗体为IgG抗体。在特定的实施方案中，抗体选自下组：IgG1、IgG2的、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以7μg/mL至15μg/mL 的亲和力结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区，其以 10μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区， 其以11μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。在一些实施方案中，抗体包含人 Fc区，其以12μg/mL的EC50结合FcγRIIa(CD32a)。表1提供了BIIB059抗体 的性质的列表。
表1
Figure BDA0002495922490000371
BIIB059显示适合于抗体治疗剂的理化性质。这个抗体显示了低水平的 聚集。野生型IgG1框架包含分子内的单个N-连接的糖基化位点和BIIB059， 并且以这类分子通常的亲和力结合Fc受体。对于抗体，计算的7.26的pI是稍 低的。在BIIB059中检测的电荷异质性表明相当大分数的BIIB059含有修饰。 在纯化的BIIB059批次中检测到高达约10％的糖基化水平至少部分造成这种 电荷异质性。BIIB059的折叠Tm处于对抗体观察到的典型值的下端，而CH2 和CH3域的折叠Tm通常针对完全糖基化的IgG1单抗。基于差示扫描荧光测 定法和粘度测量可以将BIIB059例如以50mg/mL配制在20mM柠檬酸钠、150 mM NaCl、pH 6.0中。也可以高得多的浓度配制该抗体，如150-300mg/mL(例 如，150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL)。
BIIB059是一个完全人源化的，有Fc功能能力的IgG1 mAb，其表现出对 BDCA2的高亲和力并且同样良好地结合未免疫的人和食蟹猴BDCA2。 BIIB059是pDC的所有TLR9诱导的I型IFN和其它细胞因子和趋化因子的有力 抑制剂。在抑制TLR9诱导的来自健康人供体和SLE患者的pDC产生的I型干 扰素上，BIIB059同样有效。BIIB059特异性抑制TLR9诱导的pDC的I型IFN， 并且不影响引发不同的TLR配体触发的其它细胞类型产生IFN。BIIB059导致BDCA2从细胞表面迅速内在化。当刺激时，BDCA2与TLR9在内体/溶酶体区 室共定位，这似乎是其抑制TLR9信号传导所必需的。发现BIIB059导致 CD62L从人pDC的表面上脱落，这可能影响CD62L归巢至靶器官。体外抗体 依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)研究表明， BIIB059在过表达BDCA2细胞系中可以具有细胞消耗活性。但是，BIIB059 导致BDCA2从pDC表面上快速和完全内在化的事实使得BIIB059不太可能在 体内影响持续消耗pDC。BIIB059和羟氯喹(HCQ)的组合导致了对TLR7和 TLR9诱导的由来自健康人供体的PBMC产生的IFNα的叠加抑制作用。这些数 据突出显示当与抗疟疾化合物如HCQ一起施用时，BIIB059具有潜在的叠加 治疗益处。
例如，可以通过以下方式可以制备抗体，如BIIB059：制备并表达编码 所列举的氨基酸序列的合成基因，或突变人种系基因以提供编码所列举的氨 基酸序列的基因。此外，例如，可以使用以下一种或多种方法得到这种抗体 和其它抗-BDCA2抗体。
获得抗-BDCA2抗体的方法
多种方法可用于获得抗体，特别是人抗体。一种示例性方法包括筛选蛋 白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示描述在例如U.S. 5,223,409；Smith,Science 228:1315-1317(1985)、WO 92/18619、WO 91/17271、 WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690 和WO 90/02809中。FAB在噬菌体上的展示描述在例如U.S.Pat.Nos. 5,658,727、5,667,988和5,885,793中。
除了使用展示文库，可以使用其他方法获得BDCA2结合抗体。例如， BDCA2蛋白或其肽可以用作在非人类动物(例如啮齿类动物，例如、小鼠、 仓鼠或大鼠)中的抗原。此外，作为产生有效地结合细胞表面BDCA2蛋白的 抗体的方法，可以将经编码BDCA2的cDNA转染的细胞注入非人动物中。
在一个实施方案中，非人动物包括至少一部分人免疫球蛋白基因。例如， 可能是用人Ig基因座的大片段改造小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系。使用杂交 瘤技术，可制备和选择来源于具有期望特异性的基因的抗原特异性单克隆抗 体择。参见例如XenoMouseTM,Green等人，Nature Genetics 7:13-21(1994), U.S.2003-0070185,WO 96/34096和WO 96/33735。
在另一个实施方案中，从非人动物获得单克隆抗体，然后修饰，例如， 人源化或去免疫化。Winter描述了示例性CDR移入方法，该方法可用于制备 本文所述的人源化抗体(U.S.5,225,539)。可以用非人抗体的至少一部分替换 特定的人抗体的全部或部分CDR。可以仅必需替换结合需要的CDR或这类 CDR的结合决定簇以得到结合BDCA2的有用的人源化抗体。
可以通过将不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列替换成来自人Fv可 变区的等同序列来产生人源化抗体。用于产生人源化抗体的一般方法由 Morrison,S.L.,Science,229:1202-1207(1985),by Oi等人， BioTechniques,4:214(1986)和US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205以及US 6,407,213提供。这些方法包括分离，操纵和表达编码来自 至少一个重链或轻链的整个或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列。对于本 领域技术人员，此类核酸的来源是公知的，例如，可以获自如上所述的产生 针对预定靶物的抗体的杂交瘤，获自种系免疫球蛋白基因或获自合成构建 体。然后可以将编码人源化抗体的重组DNA克隆到合适的表达载体中。
人种系序列例如公开在Tomlinson,I.A.等人，J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)；Cook,G.P.等人，Immunol.Today,16:237-242(1995)；Chothia,D.等 人，J.Mol.Bio.227:799-817(1992)；and Tomlinson等人，EMBO J., 14:4628-4638(1995)。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目 录(由Tomlinson,I.A.等人编译，MRCCentre for Protein Engineering, Cambridge,UK)。这些序列可用作人序列(例如框架区和CDR)的来源。也可 以使用例如在U.S.Pat.No.6,300,064中描述的共有人框架区。
还可通过公开于WO98/52976和WO00/34317的方法，特异性缺失人T细 胞表位或“去免疫化”修饰非人BDCA2结合抗体。简言之，可以将抗体的重链 可变区和轻链可变区用于分析与MHC II类结合的肽；这些肽代表潜在的T细 胞表位(如在WO98/52976和WO00/34317中定义的)。为检测潜在的T细胞表 位，可以应用称为“肽穿线”(“peptidethreading”)的计算机建模方法，此外如 在WO98/52976和WO00/34317所描述的，可以对人II类MHC结合肽的数据库 搜索VH和VL序列中存在的基序。这些基序结合18种主要MHC II类DR同种异 型中的任一种，因此构成潜在的T细胞表位。可以通过在可变区取代少量的 氨基酸残基或优选通过单个氨基酸取代消除检测到的潜在T细胞表位。尽可 能地，进行保守取代。经常但非专门，可以使用人种系抗体序列的位置上共 有的氨基酸。鉴定去免疫化的改变后，可以通过诱变或其它合成方法(例如， 从头合成、盒替换等)构建编码VH和VL的核酸。诱变的可变序列可以任选地 融合到人恒定区，例如，人IgG1或κ恒定区。
在一些情况下，潜在的T细胞表位将包括已知或预测为对于抗体功能重 要的残基。例如，潜在的T细胞表位通常偏向CDR(biased towards the CDR)。 此外，潜在的T细胞表位可以存在于对于抗体的结构和结合重要的框架残基。 在一些情况下，需要例如，消除这些潜在的表位导致的变化会需要较多仔细 检查，例如通过制备和检测有和没有变化的链。在可能的情况，可以通过CDR 以外的取代消除与CDR重叠的潜在T细胞表位。在一些情况下，在CDR内的 改变是唯一的选择，因而可以测试具有和没有这种取代的变体。在其他情况下，除去潜在的T细胞表位所需要的取代是对于抗体结合可以是关键的框架 内的残基位置。在这些情况下，测试具有和没有这种取代的变体。因此，在 一些情况下，设计几种变异去免疫化的重链和轻链可变区，并且测试各种重 /轻链组合，以鉴定最佳的去免疫化抗体。然后，可以通过考虑不同的变体的 结合亲和力与去免疫化的程度(特别是，在可变区中剩下的潜在T细胞表位的 数目)产生最终去免疫化抗体的选择。去免疫化可以用来修饰任何抗体，例 如，包括非人类序列的抗体，如合成抗体、鼠抗体、其它非人单克隆抗体或 从展示文库中分离的抗体。
也可使用使抗体人源化的其他方法。例如，其它方法可负责该抗体的三 维结构，与结合决定簇在三维上接近的框架位置和免疫原性肽序列。参见， 例如,WO 90/07861；U.S.Pat.Nos.5,693,762；5,693,761；5,585,089；5,530,101； 和6,407,213；Tempest etal.(1991)Biotechnology 9:266-271。另一种方法被称 为“humaneering”，并描述于例如US2005-008625中。
抗体可以包含人Fc区，例如，野生型Fc区或包括一个或多个改变的Fc区。 在一个实施方案中，改变(例如突变)恒定区，以修饰抗体的性质(例如，增加 或减少以下性质中的一个或多个：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基 的数目、效应细胞功能或补体功能)。例如，人IgG1恒定区可以在一个或多 个残基，例如，残基234和237(根据Kabat编号)中的一个或多个上进行突变。 抗体可具有重链CH2区的突变，其减少或改变效应器功能，例如，Fc受体结 合和补体活化。例如，抗体可具有如在美国专利号5,624,821和5,648,260中描 述的突变。如本领域公开的，抗体还可以具有稳定免疫球蛋白的两条重链之 间的二硫键的突变，如在IgG4的铰链区的突变(例如,Angal等人，(1993) Mol.Immunol.30:105-08)。还参见，例如,U.S.2005-0037000。
亲和力成熟
在一个实施方案中，例如，通过诱变修饰抗BDCA2抗体或其抗原结合片 段，以提供经修饰的抗体的集合。然后评估经修饰的抗体以鉴定具有改变的 功能性质(例如，改善的结合、改善的稳定性、降低的抗原性或增加的体内 稳定性)的一种或多种抗体。在一个实施方案中，将展示文库技术用于选择 或筛选经修饰的抗体的集合。然后，例如，通过使用更高的严格性或更强的 竞争性结合和洗涤条件从第二个文库鉴定较高亲和力的抗体。也可以使用其 它筛选技术。
在一些实施方案中，诱变靶向已知或可能处在结合界面的区域。如果， 例如，所鉴定的结合蛋白是抗体，那么诱变可以涉及如本文所述的重链或轻 链的CDR区。此外，诱变可以涉及CDR附近或邻近CDR的框架区，例如，特 别是CDR连接的10、5或3个氨基酸内的框架区。在抗体的情况下，可以将诱 变限定至一个或几个CDR，例如产生逐步的改进。
在一个实施方案中，使用诱变来制备更类似于一个或更多种系序列的抗 体。一个示例性的种系化的方法可以包括：鉴定类似于(例如，在一个特定 数据库中最类似于)分离的抗体的序列的一个或多个种系序列。然后可以递 增、组合或这两种方式在分离的抗体中进行突变(在氨基酸水平)。例如，制 备核酸文库，其包括编码一些或全部可能的种系突变的序列。然后评估突变 的抗体，例如，以鉴定相对于分离的抗体具有一个或多个额外种系残基，并 且仍然有用的(例如，具有功能活性)的抗体。在一个实施方案，将尽可能多 的种系残基引入到分离的抗体中。
在一个实施方案中，使用诱变将一个或多个种系残基取代或插入到CDR 区。例如，种系的CDR残基可以来自类似于(例如，最类似于)被修饰的可变 区的种系序列。在诱变后，可以评估抗体的活性(例如，结合或其他功能性 活性)，以确定一个或多个种系残基或残基是否容许的。可在框架区进行类 似诱变。
可以以不同的方式进行种系序列的选择。例如，如果种系序列满足预定 的选择性或相似性标准，例如，相对于供体的非人抗体，至少一定的百分比 同一性，例如至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或99.5％的同一性，那么可以选择它。可以使用至少2、3、5、或10种系序列 来进行选择。在CDR1和CDR2的情况下，鉴定类似的种系序列可包括选择一 种这类序列。在CDR3的情况下，鉴定类似的种系序列可包括选择一种这类 序列，但可包括使用分别有助于氨基末端部分和羧基端部分的两个种系序 列。在其他实施方式中，使用多于一个或两个的种系序列，例如，以形成共 有序列。
如下进行两个序列之间的“序列同一性”的计算。比对序列以用于最优 比较的目的(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中 的一个或两个中引入缺口，并且为了比较目的，可以忽视非同源序列)。确 定最优比对为使用GCG软件包中的具有Blossum62评分矩阵的GAP程序得到 的最好评分，其中缺口罚分为12、缺口延伸罚分为4和移码缺口罚分为5。然 后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序 列中的位置被第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则 分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位 置的数目的函数。
在其他实施方案中，可以修饰抗体以具有改变的糖基化模式(即，从原 始或天然的糖基化模式改变)。如用于本上下文中，“改变的”指使一个或多个 碳水化合物部分缺失，和/或对一个或多个糖基化位点添加到原始抗体。可以 通过改变氨基酸序列以包含糖基化位点的共有序列实现将糖基化位点添加 到当前公开的抗体；这样的技术是本领域公知的。增加抗体上碳水化合物部 分的数目的另一种方法是通过使糖苷与抗体的氨基酸残基化学或酶促偶联。 这些方法描述于例如WO 87/05330,Aplin和Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.,22:259-306。可通过化学方法或酶方法实现抗体上存在的任何碳水 化合物部分的除去，如本领域中描述的(Hakimuddin等人，(1987)Arch. Biochem.Biophys.,259:52；Edge等人，(1981)Anal.Biochem.,118:131；和 Thotakura等人，(1987)Meth.Enzymol.,138:350)。通过提供补救受体(salvage receptor)结合表位增加体内半衰期的修饰，参见例如U.S.Pat.No.5,869,046。
在一个实施方案中，抗体具有CDR序列(例如，Chothia或Kabat CDR)， 其不同于BIIB059单克隆抗体中的CDR序列。不同于BIIB059单克隆抗体中的 CDR序列的CDR序列包括氨基酸改变，诸如如果CDR具有5-7个氨基酸的长 度，那么取代1、2、3或4个氨基酸；如果CDR具有10个或更长的氨基酸的长 度，那么取代CDR序列中的1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。取代的氨基酸 可以具有相似电荷、疏水性或立体化学特征。在一些实施方案中，氨基酸取 代是保守取代。在其它实施方案中，氨基酸取代是非保守取代。这样的取代 在技术人员的普通技能之内。可以筛选包含经取代的CDR的抗体或其抗体片 段用于鉴定具有一个或多个本文中描述的特征的抗体(例如，减少I型干扰素 或III型干扰素、IL-6、TNF-α、MIP-1-α,MIP-1β,CCL5和IP-10/CXCL10的分 泌或产生；消耗pDC；与BIIB059竞争结合BDCA2的胞外域；选择性结合人、 食蟹猴和恒河猴BDCA2的胞外域，但不结合大鼠Clec4b2，或以比与人、食 蟹猴和恒河猴BDCA2更低的结合亲和力结合大鼠Clec4b2；在人类银屑病异 种移植模型中抑制疾病的发展)。
与CDR中不同，在结构框架区(FR)中可进行更实质的改变，而不会不利 地影响抗体的结合性质。FR的改变包括但不限于人源化非人衍生的框架或工 程化改造对于抗原接触或稳定结合位点重要的某些框架残基，例如，改变恒 定区的类或亚类，改变可能改变效应器功能，如Fc受体结合的特定的氨基酸 残基(Lund等人，J.Immun.,147:2657-62(1991)；Morgan等人，Immunology, 86:319-24(1995))或改变衍生恒定区的物种。
抗BDCA2抗体可以是全长抗体的形式，或是抗BDCA2抗体的低分子量 形式(例如，生物活性的抗体片段或小型抗体)，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、 Fd、dAb、scFv和sc(Fv)2。本公开包括的其它抗BDCA2抗体包括含有单个可 变链如VH或VL，或其生物活性片段的单域抗体(sdAb)。参见例如，Moller等 人，J.Biol.Chem.,285(49):38348-38361(2010)；Harmsen等人，Appl. Microbiol.Biotechnol.,77(1):13-22(2007)；U.S.2005/0079574及Davies等人 (1996)Protein Eng.,9(6):531-7。类似于完整抗体，sdAb能够选择性地结合特 定抗原。由于仅具有12-15kDa的分子量，sdAbs比常见的抗体小得多，甚至 比Fab片段和单链可变片段小。
本文提供了组合物，其包含抗BDCA2抗体或其抗原结合片段与一种或多 种酸性变体的混合物，例如，其中酸性变体的量少于约80％、70％、60％、 60％、50％、40％、30％、30％、20％、10％、5％或1％。还提供了包含含有 至少一个脱酰胺位点的抗BDCA2抗体或其抗原结合片段的组合物，其中该组 合物的pH为约5.0至约6.5，使得例如，至少约90％的抗-BDCA2抗体不是脱酰 胺的(即，少于约10％的抗体是脱酰胺的)。在某些实施方案中，小于约5％、 3％、2％或1％的抗体是脱酰胺的。pH可以是5.0至6.0，如5.5或6.0。在某些实 施方案中，组合物的pH值是5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、 6.4或6.5。
“酸性变体”是目的多肽的变体，其比目的多肽更具酸性(例如通过阳离子 交换层析测定)。酸性变体的一个实例是脱酰胺的变体。
多肽分子的“脱酰胺”变体是多肽，其中原始多肽的一个或多个天冬酰胺 残基已被转化成天冬氨酸，即中性的酰胺侧链已被转化为具有整体酸性特征 的残基。
提及包含抗BDCA2抗体或其抗原结合片段的组合物，本文所用的术语 “混合物”是指存在所希望的抗BDCA2抗体或其抗原结合片段与其一种或多 种酸性变体两者。酸性变体可以包含大部分脱酰胺的抗-BDCA2抗体和少量 的其它酸性变体。
在某些实施方案中，经突变以消除脱酰胺的抗体的结合亲和力(KD)、结 合速率(KD结合)和/或解离速率(KD解离)类似于野生型抗体的，例如，具有小 于约5倍、2倍、1倍(100％)、50％、30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％的 差异。
在某些实施方案中，抗BDCA2抗体或其抗原结合片段或其低分子量抗体 与pDC上的BDCA2结合并抑制或减少pDC产生和/或分泌I型干扰素和III型干 扰素、IL-6、TNF-α以及其他炎性细胞因子和趋化因子(例如，MIP-1-α/CCL3、 MIP-1β/CCL4、CCL5和IP-10/CXCL10)；并且通过ADCC或CDC或凋亡消 耗pDC；和/或当施用于患有下列一种或多种的人患者，或下列的动物模型时， 可减少症状的严重程度：系统性红斑狼疮、皮肤狼疮、盘状狼疮、狼疮肾炎、 硬皮病、硬斑病、类风湿性关节炎、多肌炎-皮肌炎、银屑病、斯耶格伦综 合征、血管炎和I型糖尿病。在一个实施方案中，抗BDCA2抗体或其抗原结 合片段或其低分子量抗体在人类银屑病异种移植模型中抑制疾病的发展 (Nestle等人，J.Exp.Med.,202(1):135-143(2005))。可以根据实施例中描述 的方法以及通过本领域中已知的其它方法测量抗BDCA2抗体或其抗原结合 片段或其低分子量抗体的这些特征。
抗体片段
可以通过完整抗体的蛋白水解消化来制备抗体片段(例如、Fab、Fab’、 F(ab’)2、Facb和Fv)。例如，可以通过用酶(如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶 酶)处理完整抗体获得抗体片段。木瓜蛋白酶消化完整抗体产生F(ab)2或Fab 片段；胃蛋白酶消化完整抗体产生F(ab')2或Fab'；并且纤溶酶消化完整抗体 产生Facb片段。
或者，可重组产生抗体片段。例如，可以构建编码目的抗体片段的核酸， 将其引入到表达载体中，并在合适的宿主细胞中表达。参见例如Co,M.S.等 人，J.Immunol.,152:2968-2976(1994)；Better,M.和Horwitz,A.H.,Methods in Enzymology,178:476-496(1989)；Plueckthun,A.和Skerra,A.,Methods in Enzymology,178:476-496(1989)；Lamoyi,E.,Methods in Enzymology, 121:652-663(1989)；Rousseaux,J.等人，Methodsin Enzymology,(1989) 121:663-669(1989)；和Bird,R.E.等人，TIBTECH,9:132-137(1991))。可以在 大肠杆菌(E.coli)中表达和分泌抗体片段，从而容许容易地产生大量的这些片 段。可以从抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可以直接从大肠杆菌回收 Fab'-SH片段并将其化学偶联以形成F(ab)2片段(Carter等人，Bio/Technology, 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物分离 F(ab')2片段。在U.S.Pat.No.5,869,046中描述了包含补救受体结合表位残基 的具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段。
小型抗体(Minibody)
抗BDCA2抗体的小型抗体包括双抗体，单链(scFv)和单链(Fv)2(sc(Fv)2)。
“双抗体”是通过基因融合构建的二价小型抗体(参见例如Holliger,P.等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6444-6448(1993)；EP 404,097；WO 93/11161)。双抗体是由两个多肽链组成的二聚体。双抗体的每一多肽链的VL 和VH域通过接头结合。组成接头的氨基酸残基的数目可以是2至12个残基(例 如，3-10个残基或五或大约五个残基)。在双抗体中多肽的接头通常太短而不 允许VL和VH彼此结合。因此，编码在同一多肽链中的VL和VH无法形成单 链可变区片段，而是形成具有不同的单链可变区片段的二聚体。因此，双抗 体具有两个抗原结合位点。
scFv是通过用接头连接VH和VL获得的单链多肽的抗体(参见例如 Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)；和Plickthun, “The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies”Vol.113,Ed Resenburg and Moore,Springer Verlag,NewYork,pp.269-315,(1994))。待连接的VH和VL的 顺序没有特别的限制，可以以任意顺序排列它们。排列的实例包括：[VH] 接头[VL]；或[VL]接头[VH]。scFv中的H链V区和L链V区可以源自本文所述 任何抗-BDCA2抗体或其抗原结合片段。
sc(Fv)2是小型抗体，其中两个VH和两个VL通过接头连接形成单链 (Hudson,等人，J.Immunol.Methods,(1999)231:177-189(1999))。例如，可 以通过用接头连接scFv制备sc(Fv)2。本发明的sc(Fv)2优选地包括这样的抗 体，其中两个VH和两个VL以以下顺序排列：从单链多肽的N端开始，VH， VL，VH和VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])；然而两个VH和两个VL的 顺序并不限于上述排列，可以以任意顺序排列它们。下面列出排列的实例：
[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]
[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]
[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]
[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]
[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]
通常，当连接四个抗体可变区时需要3个接头；所使用的接头可以相同 或不同。对连接小型抗体的VH和VL区的接头没有特别限制。在一些实施方 案中，接头是肽接头。可将包含约3至25个残基(例如、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18)的任何任意单链肽用作接头。此类肽接头 的实例包括:Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；Gly GlyGly Ser(SEQ ID NO:13)；Ser Gly Gly Gly(SEQ ID NO:14)；Gly Gly Gly Gly Ser(SEQID NO:15)；Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:16)；Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ IDNO:17)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:18)；Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQID NO:19)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO: 20)；(Gly Gly Gly Gly Ser(SEQID NO:21)n,其中n是1或更大的整数；和(Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:22)n,其中n是1或更大的整数。
在某些实施方案中，接头是合成化合物接头(化学交联剂)。在市场上可 获得的交联剂的实例包括N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、 双琥珀酰基辛二酸酯(disuccinimidylsuberate)(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基) 辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate,BS3)、二巯基二(琥珀酰亚胺基丙酸 酯)(dithiobis(succinimidylpropionate))(DSP)、二巯基二(磺基琥珀酰亚胺基丙 酸酯)(dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate))(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺 基琥珀酸酯)(ethyleneglycol bis(succinimidylsuccinate))(EGS)、乙二醇双(磺基 琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(ethyleneglycol bis(sulfosuccinimidylsuccinate))(磺基 -EGS)、二琥珀酰亚胺酒石酸酯(disuccinimidyl tartrate)(DST)、二磺基琥珀酰 亚胺酒石酸酯(disulfosuccinimidyl tartrate)((磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺基 氧羰基氧)乙基]砜(bis[2-(succinimido oxycarbonyloxy)ethyl]sulfone) (BSOCOES)和双[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧羰基氧)乙基]砜 (bis[2-(sulfosuccinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone(sulfo-BSOCOES))(磺基 -BSOCOES)。
在小型抗体中的VH或VL的氨基酸序列可包括修饰如取代、缺失、添加 和/或插入。例如，修饰可以在抗BDCA2抗体或其抗原结合片段(例如， BIIB059)的CDR中的一个或多个中。在某些实施方案中，修饰涉及在抗 BDCA2小型抗体的VH和/或VL域的一个或多个CDR中的一个、两个或三个 氨基酸取代。进行此类取代以提高抗BDCA2小型抗体的结合和/或功能活性。 在其他实施方案中，当VH和VL结合时，只要有BDCA2的结合和/或功能活 性，那么可以删除或添加抗BDCA2抗体或其抗原结合片段(例如，BIIB059) 的CDR中一个、两个或三个氨基酸。
双特异性抗体
双特异性抗体是具有针对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。示例 性双特异性抗体可结合到BDCA2蛋白的两种不同表位。其它此类抗体可组合 BDCA2结合位点与另一种蛋白质的结合位点。双特异性抗体可制备成全长抗 体或其低分子量形式(例如，F(ab')2双特异性抗体，sc(Fv)2双特异性抗体， 双抗体双特异性抗体)。
全长双特异性抗体的传统生产是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共 表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature,305:537-539 (1983))。在一种不同的方法中，将具有所希望的结合特异性的抗体可变域与 免疫球蛋白恒定域序列融合。将编码免疫球蛋白重链融合物以及(如果需要) 免疫球蛋白轻链的DNA插入到各自的表达载体中，并共转染到合适的宿主细 胞中。这为调整三种多肽片段的比例提供了更大的灵活性。然而，可能的是 当至少两种多肽链以相同比例表达导致较高的产量时将两种或全部三种多 肽链的编码序列插入到单个表达载体中。
根据U.S.Pat.No.5,731,168中描述的另一种方法，可以工程化改造一对 抗体分子之间的界面以最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分 比。优选的界面包含至少CH3域的一部分。在这个方法中，将第一抗体分子 界面的一个或多个小氨基酸侧链替换成较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。 通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第 二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的互补性“空腔” (Compensatory“cavities”)。这提供了相对于其它不想要的终产物例如同二聚 体，用于提高异二聚体的产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合”(heteroconjugate)的抗体。例如， 异源缀合物中的一个抗体可以偶联至抗生物素蛋白，另一个抗体偶联至生物 素。可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合物抗体。
“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的备选机制。该片段包含 通过接头与VL连接的VH，该接头太短而不允许同一条链上的两个域间配对。 因此，一个片段上的VH和VL域被迫与另一片段的互补VL和VH域配对，由 此形成两个抗原结合位点。
多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快地被表达与抗体结合的抗原的细胞内在 化(和/或分解代谢)。在本文中描述的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合 位点的多价抗体(例如，四价抗体)，其可以通过编码抗体多肽链的核酸的重 组表达容易地产生。多价抗体可包含二聚化域和三个或更多个抗原结合位 点。示例性二聚化域包含(或组成为)Fc区或铰链区。多价抗体可包含(或组成 为)三个至约八个(例如，四个)抗原结合位点。多价抗体任选包含至少一条多 肽链(例如，至少两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例 如，多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2 是第二可变域，Fc是Fc区的多肽链，X1和X2代表氨基酸或肽间隔区，并且n 是0或1。
缀合抗体
本文公开的抗体可以是与各种分子结合的缀合抗体，所述分子包括大分 子物质如聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、用PEG改性的聚乙烯亚胺 (PEI)(PEI-PEG)、聚谷氨酸(PGA)、(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚 物)、透明质酸、放射性材料(例如90Y,131I)、荧光物质、发光物质、半抗原、 酶、金属螯合物、药物和毒素(例如，calcheamicin、假单胞菌外毒素A、蓖 麻蛋白(例如，去糖基化蓖麻蛋白A链))。
在一个实施方案中，为了改进抗BDCA2抗体的细胞毒性作用，从而提高 它们的治疗效力，使抗体与剧毒物质(highly toxic substance)(包括放射性同位 素和细胞毒剂)缀合。这些缀合物可以选择性递送毒性负载(toxic load)到靶部 位(即，表达由抗体识别的抗原的细胞)，而剩下不被抗体识别的细胞。为了 使毒性最小化，通常基于具有短的血清半寿期的分子(因此，使用鼠序列和 IgG3或IgG4同种型)工程化改造缀合物。
在一些实施方案中，用模块修饰抗BDCA2抗体或其抗原结合片段，所述 模块改善其稳定性和/或循环(例如在血液、血清或其它组织中)中的保留，例 如达至少1.5、2、5、10或50倍。例如，抗BDCA2抗体或其抗原结合片段可 以与聚合物(例如基本上无抗原性的聚合物，如聚环氧烷(polyalkylene oxide) 或聚环氧乙烷(polyethylene oxide))结合(例如，缀合)。合适的聚合物按重量计 会实质性变化。可以使用具有范围为约200至约35,000道尔顿(或约1,000至约 15,000，和2,000至约12,500)的平均数分子量的聚合物。例如，可以将抗BDCA2抗体或其抗原结合片段缀合至水溶性聚合物，例如，亲水性聚乙烯基 聚合物，例如，聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。这种聚合物的实例包括聚环氧 烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化多元醇 (polyoxyethylenated polyol)，其共聚物和其嵌段共聚物(条件是维持该嵌段共 聚物的水溶性)。其它有用的聚合物包括聚氧烯烃(polyoxyalkylene)如聚氧乙 烯、聚氧丙烯以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯；卡 波姆；和支链的或无支链的多糖。
上述缀合抗体可通过在本文所述的抗体或其较低分子量形式上进行化 学修饰来制备。抗体的修饰方法是本领域公知的(例如，US 5057313和US 5156840)。
产生抗体的方法
可以在细菌或真核细胞中产生抗体。一些抗体(例如Fab)可以在细菌细 胞，例如大肠杆菌细胞中产生。可以在真核细胞(例如经转化的细胞系(例如 CHO、293E、COS))中产生抗体。此外，可以在酵母细胞如毕赤酵母(Pichia)(参 见例如，Powers等人，J ImmunolMethods.251:123-35(2001))，Hanseula或 酿酒酵母(Saccharomyce)中产生抗体(例如，scFv)。为产生目的抗体，构建编 码抗体的多核苷酸，将其引入到表达载体中，然后在合适的宿主细胞中表达。 将标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体， 培养宿主细胞和回收所述抗体。
如果要在细菌细胞(例如，大肠杆菌)中表达抗体，那么表达载体应具有 允许在细菌细胞中扩增该载体的特征。此外，当将大肠杆菌如JM109，DH5 α，HB101或XL1-Blue用作宿主时，载体必须具有可以允许在大肠杆菌中有 效表达的启动子，例如lacZ启动子(Ward等人，341:544-546(1989)、araB启 动子(Better等人，Science,240:1041-1043(1988))或T7启动子。此类载体的 实例包括例如M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、 pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress system”(QIAGEN)、pEGFP和pET(当 使用该表达载体时，宿主优选是表达T7 RNA聚合酶的BL21)。表达载体可以 包含用于抗体分泌的信号序列。为了产生到大肠杆菌的周质中，可以将pelB 信号序列(Lei等人，J.Bacteriol.,169:4379(1987))用作抗体分泌的信号序列。 对于细菌表达，可将氯化钙方法或电穿孔方法用于将表达载体引入到细菌细 胞中。
如果要在动物细胞如CHO、COS和NIH3T3细胞中表达抗体，那么表达 载体包括在这些细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等 人，Nature,277:108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等 人，Nucleic Acids Res.,18:5322(1990))或CMV启动子。除编码免疫球蛋白或 其域的核酸序列之外，重组表达载体可以携带额外的序列，如调节载体在宿 主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因便于 选择已经引入了载体的宿主细胞(参见例如U.S.Pat.Nos.4,399,216,4,634,665 和5,179,017)。例如，通常选择标记基因在已经引入了载体的宿主细胞中赋 予对药物例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的抗性。具有选择性标记的载体的实 例包括PMAM、PDR2、质粒pBK-RSV、质粒pBK-CMV、pOPRSV和pOP13 等。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中产生抗体。用于表达抗体的示例 性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin (1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中描述的dhfr–CHO细胞，其与 例如在Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中描述的DHFR选择标 记一起使用)、人胚肾293细胞(例如，293、293E、293T)、COS细胞、NIH3T3 细胞、淋巴细胞性细胞系，例如，NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、以及来自转 基因动物(例如，转基因哺乳动物)的细胞。例如，细胞是乳腺上皮细胞。
在用于抗体表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗 BDCA2抗体(例如，BIIB059)的抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引 入dhfr–CHO细胞中。在重组表达载体中，将抗体重链和轻链基因各自可操 作连接至增强子/启动子调节元件(例如，源自SV40、CMV、腺病毒等，如 CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元 件)，以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使 用甲氨蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养经选择的转化体 宿主细胞，以允许抗体重链和轻链的表达并从培养基中回收抗体。
也可以通过转基因动物产生抗体。例如，U.S.Pat.No.5,849,992描述了 在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建包括乳特异性启动子、编 码目的抗体的核酸和用于分泌的信号序列的转基因。由这种转基因哺乳动物 的雌性产生的乳包括分泌在其中的目的抗体。可以从乳中纯化抗体，或者对 于一些应用，直接使用乳。也提供了包含本文描述的一种或多种核酸的动物。
可以从宿主细胞的内部或外部(如培养基)分离本公开的抗体并纯化为基 本上纯的且均质的抗体。可将通常用于抗体纯化的分离和纯化方法用于抗体 的分离和纯化，并且不受限于任何特定的方法。可以通过适当地选择和组合 例如柱层析、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦、透析和重结晶来分离及纯化抗体。 层析包括例如，亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析 和吸附层析(Strategies for Protein Purification and Characterization:ALaboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等人，Cold Spring HarborLaboratory Press,1996)。可以使用液相层析例如HPLC和FPLC进行层析。用 于亲和层析的柱子包括蛋白A柱和蛋白G柱。使用蛋白A柱的柱的例子包括 Hyper D、POROS和SepharoseFF(GE Healthcare Biosciences)。本公开还包括 使用这些纯化方法高度纯化的抗体。
抗体的表征
可以通过任何标准方法(例如下面的方法中的一种或多种：
Figure BDA0002495922490000521
表面等离振子共振(SPR)，BIACORETM分析，酶联免疫吸附测定(ELISA)， EIA(酶联免疫测定)，RIA(放射免疫法测定)和荧光共振能量转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer)(FRET))测量本文描述的抗体的 BDCA2结合性质。
可以使用
Figure BDA0002495922490000522
系统分析目的蛋白质(抗BDCA2抗体)与靶标(例如， BDCA2)的结合相互作用。在该方法中，将FortéBio公司制备的仪器的几种变 型(例如，
Figure BDA0002495922490000523
QKe和QK)中的一个用于测定蛋白质的相互作用、结合特 异性以及表位作图。
Figure BDA0002495922490000524
系统通过测量定制尖端下行进，然后返回到传 感器的偏振光的改变，提供了一种监控实时结合的简单方法。
可以使用表面等离振子共振(SPR)来分析目的蛋白质(抗BDCA2抗体)与 靶标(例如，BDCA2)的结合相互作用。SPR或生物分子相互作用分析 (Biomolecular InteractionAnalysis,BIA)实时检测生物特异性相互作用，不用 标记任何相互作用物。在BIA芯片结合表面上的质量的变化(指示结合事件) 导致表面附近的光的折射率的改变(表面等离振子共振(SPR)的光学现象)。折 射性的变化产生可检测的信号，将其测量为生物分子之间的实时反应的指 示。例如，在U.S.Pat.No.5,641,640；Raether(1988)Surface PlasmonsSpringer Verlag；Sjolander和Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338-2345；Szabo等 人，(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705中描述了使用SPR的方法，并且 BIAcoreInternational AB(Uppsala,瑞典)提供了在线资源。来自SPR的信息可 用于提供对生物分子结合靶标的平衡解离常数(Kd)和动力学参数，包括Kon和Koff的精确且定量的测量。
也可以使用BIACORE层析技术(Pharmacia BIAtechnology Handbook, "EpitopeMapping",Section 6.3.2,(May 1994)；还参见Johne等人，(1993)J. Immunol.Methods,160:191-198)直接定位表位以评估不同抗体彼此竞争对人 BDCA2的结合的能力。
当采用酶免疫测定法时，将含有抗体的样品(例如抗体产生细胞的培养 上清液)或纯化的抗体添加到经抗原包被的板中。加入用酶如碱性磷酸酶标 记的二抗，温育板，洗涤后，加入酶底物如对硝基苯磷酸盐 (p-nitrophenylphosphate)，并测量吸光度来评价抗原结合活性。
可在Antibodies:A Laboratory Manual,ed.by Harlow and Lane,Cold SpringHarbor press(1988))中发现用于评估抗体的其他一般性指导，例如 Western印迹和免疫沉淀测定。
保藏物
在2013年1月15日，在国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯 条约的条款下将产生抗BDCA2单克隆抗体的杂交瘤(命名为鼠杂交瘤 BDCA2-1P24F4.1.1.1)保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为 PTA-13450。申请人承诺在保藏中心在对其授予的专利期限前由于保藏物条 件而不能在请求时提供样品情况下其替换保藏物的义务。申请人还承诺他们 负责对ATCC通知该专利的授权，此时保藏物会变为公众可获得的。在此之 前，在37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§112的条款下，保藏物会是专利专员可获 得的。
具有改变的效应器功能的抗体
抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统细胞的相互作用触发多种反应，在 此称为效应器功能。免疫介导的效应器功能包括两个主要机制：抗体依赖性 细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。它们两者都是由 免疫球蛋白蛋白质的恒定区介导的。因此，抗体Fc域是限定与免疫效应机制 相互作用的部分。
IgG抗体通过结合细胞表面Fcγ受体家族成员和补体系统的C1q，激活免 疫系统的效应器途径。聚簇抗体对效应蛋白的连接触发多种应答，包括释放 炎性细胞因子、调节抗原产生、胞吞作用和细胞杀伤。在一些临床应用中， 这些应答对于单克隆抗体的效力是关键性的。在其它应用中，它们引发不想 要的副作用如炎症和抗原携带细胞的消除。因此，本发明进一步涉及BDCA2 结合蛋白，包括具有改变的(例如增加或减少的)效应器功能的抗体。
可以使用许多已知的测定法之一来测定本发明的抗BDCA2抗体的效应 器功能。相对于第二抗BDCA2抗体，抗BDCA2抗体的效应器功能可以是增 加或降低的。在一些实施方案中，第二抗BDCA2抗体可以是特异性结合 BDCA2的任何抗体。在其他实施方案中，第二BDCA2特异性抗体可以是本 发明的任何抗体，如BIIB059。在其他实施方案中，当已经修饰目的抗BDCA2 抗体来增加或降低效应器功能时，第二抗BDCA2抗体可以是抗体的未修饰或 亲本形式。
效应器功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(由此抗体结 合细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞上的Fc受体，从而导致细 胞死亡)和依赖补体的细胞毒性(CDC)(其是通过激活补体级联诱导的细胞死 亡)(在Daeron,Annu.Rev.Immunol.,15:203-234(1997)；Ward和Ghetie, Therapeutic Immunol.,2:77-94(1995)；及Ravetchand Kinet,Annu.Rev. Immunol.9:457-492(1991)中的综述)。此种效应器功能一般要求Fc区与结合 域(例如抗体可变域)结合，并且可以使用本领域已知的标准测定法来评估效 应器功能(参见例如WO 05/018572,WO 05/003175和U.S.6,242,195)。
可以通过使用缺乏Fc域的抗体片段(如Fab、Fab'2或单链Fv)避免效应器 功能。一种备选是使用IgG4亚型抗体，其结合FcγRI，但与C1q和FcγRII和RIII 较差结合。IgG2亚型也具有降低的与Fc受体的结合，但保留与FcγRIIa的H131 同种异型和C1q的显著结合。因此，需要在Fc序列中的额外改变，以消除与 所有的Fc受体和C1q的结合。
通过结合抗体Fc区的Fc受体(FcR)介导几种抗体效应器功能，包括 ADCC。可通过改变抗体的Fc和/或恒定区的氨基酸序列和/或翻译后修饰调 节抗体对特定FcR的亲和力和因此由抗体介导的效应器活性。
FcR以其对免疫球蛋白同种型的特异性限定；IgG抗体的Fc受体称为FcγR，IgE的Fc受体称为FcεR，IgA的Fc受体称为FcαR，等等。已经鉴定出 FcγR的三种亚类：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRII 和FcγRIII两者都具有两种类型：FcγRIIa(CD32a)和FcγRIIB(CD32b)；及 FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。由于每个FcγR亚类由两种或三种基因 编码，并且RNA可变剪接导致多种转录物，存在FcγR同等性(isoform)的广泛 多样性。例如，FcγRII(CD32)包括同种型IIa、IIb1、IIb2 IIb3、和IIc。
先前已经将FcγR在人类和鼠抗体上的结合位点定位到所谓的“较低铰链 区”，其由残基233-239组成(EU索引编号，如在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991),Woof等人，Molec.Immunol. 23:319-330(1986)；Duncan等人，Nature 332:563(1988)；Canfield and Morrison,J.Exp.Med.173:1483-1491(1991)；Chappel等人，Proc.Natl.Acad. Sci USA 88:9036-9040(1991)中的)。在残基233-239中，P238和S239在那些引 用为可能参与结合的残基中。可能参与结合FcγR的其他以前引用的的区域 是：用于人FcγRI的G316-K338(人IgG)(Woof et al.,Mol.Immunol., 23:319-330(1986))；用于人FcγRIII的K274-R301(人IgG1)(Sarmay et al., Molec.Immunol.21:43-51(1984))；及用于人FcγRIII的Y407-R416(人IgG) (Gergely et al.,Biochem.Soc.Trans.12:739-743(1984)及Shields et al.,J Biol Chem 276:6591-6604(2001),Lazar GA et al.,Proc Natl Acad Sci 103: 4005-4010(2006)。通过检查Ig-FcR复合体的晶体结构，参与FcR结合的这些 或其它的氨基酸残基区段或区域对于熟练技术人员可以是显而易见的(参见 例如Sondermann等人,2000Nature 406(6793):267-73和Sondermann等人， 2002Biochem Soc Trans.30(4):481-6)。因此，本发明的抗BDCA2抗体包括一 个或多个上述残基的修饰(根据需要，增加或降低效应器功能)。
用于改变单克隆抗体效应器功能的另一种方法包括突变单克隆抗体表 面上的参与效应器结合相互作用的氨基酸(Lund,J.等人，(1991)J.Immunol. 147(8):2657-62；Shields,R.L.等人，(2001)J.Biol.Chem.276(9):6591-604)。
现有技术中公知增加抗体的效应器功能的方法(参见例如，Kelley等人， MethodsMol.Biol.,901:277-93(2012)；Natsume等人，Drug Des Devel Ther., 3:7-16(2009)；US8,188,231、US 7,960,512)。在一个实施方案中，BDCA2抗 体在选自以下的位置处具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或 更多个氨基酸取代：221、222、223、224、225、227、228、230、231、232、 233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、 247、249、255、258、260、262、263、264、265、266、267、268、269、 270、271、272、273、274、275、276、278、280、281、282、283、284、 285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、313、317、318、320、322、323、324、 325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337， 其中Fc区中残基的编号是Kabat中的EU索引的编号。在某些实施方案中， BDCA2抗体具有选自下组的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个氨基酸取代：D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、 H224E、H224Y、T225E、T225K、T225W、P227E、P227G、P227K、P227Y、 P228E、P228G、P228K、P228Y、P230A、P230E、P230G、P230Y、A231E、 A231G、A231K、A231P、A231Y、P232E、P232G、P232K、P232Y、E233A、E233D、E233F、E233G、E233H、E233I、E233K、E233L、E233M、E233N、 E233Q、E233R、E233S、E233T、E233V、E233W、E233Y、L234A、L234D、 L234E、L234F、L234G、L234H、L234I、L234K、L234M、L234N、L234P、 L234Q、L234R、L234S、L234T、L234V、L234W、L234Y、L235A、L235D、L235E、L235F、L235G、L235H、L235I、L235K、L235M、L235N、L235P、 L235Q、L235R、L235S、L235T、L235V、L235W、L235Y、G236A、G236D、 G236E、G236F、G236H、G236I、G236K、G236L、G236M、G236N、G236P、 G236Q、G236R、G236S、G236T、G236V、G236W、G236Y、G237D、G237E、G237F、G237H、G237I、G237K、G237L、G237M、G237N、G237P、G237Q、 G237R、G237S、G237T、G237V、G237W、G237Y、P238D、P238E、P238F、 P238G、P238H、P238I、P238K、P238L、P238M、P238N、P238Q、P238R、 P238S、P238T、P238V、P238W、P238Y、S239D、S239E、S239F、S239G、S239H、S239I、S239K、S239L、S239M、S239N、S239P、S239Q、S239R、 S239T、S239V、S239W、S239Y、V240A、V240I、V240M、V240T、F241D、 F241E、F241L、F241R、F241S、F241W、F241Y、F243E、F243H、F243L、 F243Q、F243R、F243W、F243Y、P244H、P245A、K246D、K246E、K246H、K246Y、P247G、P247V、D249H、D249Q、D249Y、R255E、R255Y、E258H、 E258S、E258Y、T260D、T260E、T260H、T260Y、V262A、V262E、V262F、V262I、V262T、V263A、V263I、V263M、V263T、V264A、V264D、V264E、 V264F、V264G、V264H、V264I、V264K、V264L、V264M、V264N、V264P、V264Q、V264R、V264S、V264T、V264W、V264Y、D265F、D265G、D265H、 D265I、D265K、D265L、D265M、D265N、D265P、D265Q、D265R、D265S、 D265T、D265V、D265W、D265Y、V266A、V266I、V266M、V266T、S267D、 S267E、S267F、S267H、S267I、S267K、S267L、S267M、S267N、S267P、S267Q、S267R、S267T、S267V、S267W、S267Y、H268D、H268E、H268F、 H268G、H268I、H268K、H268L、H268M、H268P、H268Q、H268R、H268T、 H268V、H268W、E269F、E269G、E269H、E269I、E269K、E269L、E269M、 E269N、E269P、E269R、E269S、E269T、E269V、E269W、E269Y、D270F、D270G、D270H、D270I、D270L、D270M、D270P、D270Q、D270R、D270S、 D270T、D270W、D270Y、P271A、P271D、P271E、P271F、P271G、P271H、 P271I、P271K、P271L、P271M、P271N、P271Q、P271R、P271S、P271T、 P271V、P271W、P271Y、E272D、E272F、E272G、E272H、E272I、E272K、E272L、E272M、E272P、E272R、E272S、E272T、E272V、E272W、E272Y、 V273I、K274D、K274E、K274F、K274G、K274H、K274I、K274L、K274M、 K274N、K274P、K274R、K274T、K274V、K274W、K274Y、F275L、F275W、 N276D、N276E、N276F、N276G、N276H、N276I、N276L、N276M、N276P、N276R、N276S、N276T、N276V、N276W、N276Y、Y278D、Y278E、Y278G、 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P329S、P329T、P329V、P329W、P329Y、A330E、A330F、A330G、A330H、 A330I、A330L、A330M、A330N、A330P、A330R、A330S、A330T、A330V、 A330W、A330Y、P331D、P331F、P331H、P331I、P331L、P331M、P331Q、P331R、P331T、P331V、P331W、P331Y、I332A、I332D、I332E、I332F、 I332H、I332K、I332L、I332M、I332N、I332P、I332Q、I332R、I332S、I332T、 I332V、I332W、I332Y、E333F、E333H、E333I、E333L、E333M、E333P、 E333T、E333Y、K334F、K334I、K334L、K334P、K334T、T335D、T335F、T335G、T335H、T335I、T335L、T335M、T335N、T335P、T335R、T335S、 T335V、T335W、T335Y、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337H和S337N， 其中Fc区中残基的编号是Kabat中的EU索引的编号。在一个特定的实施方案 中，BDCA2抗体包含选自以下突变中的一个、两个或三个：S239D、 S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、S239D/I332E/G236A、S298A、A330L I332E、E333A和K334A。
寡糖(具体是在IgG1的CH2域的天冬酰胺-297处的N-连接寡糖)的存在对 于结合FcγR以及C1q是重要的。减少抗体的岩藻糖含量改善效应器功能(参见 例如，US 8,163,551)。在某些实施方案中，BDCA2抗体具有减少的岩藻糖基 化和增加效应器功能的氨基酸取代(例如，下述突变中的一个、两个或三个： S298A、E333A和K334A)。也可以通过在以抑制剂浓度约60-200ng/mL(例如， 60ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、150ng/ml)的α-甘露糖苷酶I抑制剂(例如， kifunensine)的存在下制备和表达本文所述的抗BDCA2抗体来实现效应器功能。在α-甘露糖苷酶I抑制剂的存在下表达的抗体主要含有寡甘露糖型聚糖并 且通常表现出增加的ADCC活性和对FcγRIIIa的亲和力，然而降低的C1q结 合。
具有增加的效应器功能的本公开的抗BDCA2抗体包括相对于亲本或非 变体的抗BDCA2抗体，具有针对一个或多个Fc受体(FcR)的增加的结合亲和 力的抗体。因此，具有增加的FcR结合亲和力的抗BDCA2抗体包括与亲本或 非变体的抗BDCA2抗体相比，在针对一个或多个Fc受体的结合亲和力上显示 出1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、或5倍或更高的增加的抗BDCA2抗体。在 一些实施方案中，相对于亲本或非变体抗体，具有增加的效应器功能的抗BDCA2抗体以高于约10倍的亲和力结合FcR。在其他实施方案中，相对于亲 本或非变体抗体，具有增加的效应器功能的抗BDCA2抗体以高约15倍的亲和 力或高约20倍的亲和力结合FcR。FcR受体可以是以下中的一个或多个： FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII和它们的亚型、以及FcεR、FcμR、FcδR 和/或FcαR。在特定的实施方案中，具有增加的效应器功能的抗BDCA2抗体 在对FcγRIIa的结合亲和力上显示出1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更 高的增加。
为降低效应器功能，可以使用不同亚型序列区段的组合(例如，IgG2和 IgG4的组合)，以产生比单独任一亚型在与Fcγ受体的结合上更大的降低(Armour等人，Eur.J.Immunol.,29:2613-1624(1999)；Mol.Immunol., 40:585-593(2003))。此外，作为减少效应器功能的方法，可以除去N连接糖 基化的位点。本领域已知对一些或全部的Fc受体亚型具有改变的和/或减少的 亲和力(并因此在效应器功能方面)的大量Fc变体。参见例如US 2007/0224188； US 2007/0148171；US 2007/0048300；US 2007/0041966；US 2007/0009523；US 2007/0036799；US 2006/0275283；US 2006/0235208；US 2006/0193856；US2006/0160996；US 2006/0134105；US 2006/0024298；US 2005/0244403；US 2005/0233382；US 2005/0215768；US 2005/0118174；US 2005/0054832；US 2004/0228856；US 2004/132101；US 2003/158389；还参见US 7,183,387； 6,737,056；6,538,124；6,528,624；6,194,551；5,624,821；5,648,260。
具有降低的效应器功能的本发明的抗BDCA2抗体包括相对于亲本或非 变体的抗BDCA2抗体，具有针对一个或多个Fc受体(FcR)的减少的结合亲和 力的抗体。因此，具有减少的FcR结合亲和力的抗BDCA2抗体包括与亲本或 非变体抗BDCA2抗体相比，在针对一个或多个Fc受体的结合亲和力上显示出 1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高降低的抗BDCA2抗体。在一些实 施方案中，相对于亲本或非变体抗体，具有减少的效应器功能的抗BDCA2 抗体以低约10倍的亲和力结合FcR。在其他实施方案中，相对于亲本或非变 体抗体，具有减少的效应器功能的抗BDCA2抗体以低约15倍的亲和力或低约 20倍的亲和力结合FcR。FcR受体可以是以下中的一个或多个：FcγRI(CD64)、 FcγRII(CD32)、FcγRIII和它们的亚型、以及FcεR、FcμR、FcδR和/或FcαR。 在特定的实施方案中，具有减少的效应器功能的抗BDCA2抗体在对FcγRIIa 的结合亲和力上显示出1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高的降低。
在CDC中，抗体-抗原复合物结合补体，导致补体级联的激活并产生膜 攻击复合物。通过补体系统的第一组分(C1q)结合与其关联抗原结合的抗体 (合适的亚类)起始经典补体途径的激活；因而通过免疫球蛋白与补体C1q蛋 白的结合亲和力部分调节补体级联的激活。为激活补体级联，必要的是C1q 结合对抗原性靶物附着的至少两个分子的IgG1、IgG2或IgG32，但仅一个分 子的IgM(Ward和Ghetie,Therapeutic Immunology 2:77-94(1995)p.80)。为 了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如在Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods,202:163(1996)中描述的。
已经提出IgG分子的多个残基参与对C1q的结合，包括CH2域上的Glu318、Lys320和Lys322残基，位于极其靠近相同的β链的转角(turn)上的氨 基酸残基331，位于较低铰链区中的Lys235和Gly237残基和位于CH2域的N- 端区域中的残基231至238(参见例如Xu等人，J.Immunol.150:152A (Abstract) (1993),WO94/29351；Tao等人,J.Exp.Med.,178:661-667(1993)；Brekke等人， Eur.J.lmmunol.,24:2542-47(1994)；Burton等人；Nature,288:338-344(1980)； Duncan和Winter,Nature 332:738-40(1988)；Idusogie等人，J Immunol164: 4178-4184(2000；U.S.5,648,260和U.S.5,624,821)。
具有改善的Clq结合的抗BDCA2抗体可在人IgG Fc区的氨基酸位置326， 327，333和334的一处、两处、三处或四处包含氨基酸取代，其中在IgG Fc 区中残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。在一个实施方案中，抗 BDCA2抗体包括以下氨基酸取代：K326W/E333S，这已知用于增加IgG1抗 体与C1q的结合(Steurer W.等人，J Immunol.,155(3):1165-74(1995))。
具有减少的Clq结合的抗BDCA2抗体可在人IgG Fc区的氨基酸位置270、 322、329和331的一处、两处、三处或四处包含氨基酸取代，其中在IgG Fc 区残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。如IgG1中的实例，在人IgG1 CH2域的COOH端区域中的两个突变(K322A和P329A)不激活CDC途径，并显 示出导致在C1q的结合中超过100倍的降低(US 6,242,195)。
因此，在某些实施方案中，相对于第二抗BDCA2抗体，本发明的抗 BDCA2抗体表现出与补体蛋白的增加或降低的结合。在某些实施方案中，相 对于第二抗BDCA2抗体，本发明的抗BDCA2抗体表现出与C1q的结合增加或 减少约1.5倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更 多、约6倍或更多、约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更 多或约15倍或更多。
因此，在本发明的某些实施方案中，可以修饰、取代或除去这些残基中 的一个或多个，或者可以插入一个或多个氨基酸残基，以便增加或降低本文 所提供的抗BDCA2抗体的CDC活性。
在某些其他实施方案中，本发明提供抗BDCA2抗体，其表现出与一种或 多种FcR受体的降低的结合但维持其结合补体的能力(例如类似或在一些实 施方案中，以比天然的、非变体或亲本抗BDCA2抗体更小的程度)。因此， 本发明的抗BDCA2抗体可结合并激活补体，同时表现出与FcR(例如 FcγRIIa(例如血小板上表达的FcγRIIa)的降低的结合。具有降低的或无对FcγRIIa(例如血小板上表达的FcγRIIa)的结合，但可以结合C1q并至少一定程 度激活补体级联的这种抗体将降低血栓栓塞事件的风险，同时维持可能期望 的效应器功能。在备选实施方案中，本发明的抗BDCA2抗体表现出与一种或 多种FcR的降低的结合，但维持其结合一个或多个其它FcR的能力。参见例 如US 2007-0009523,2006-0194290,2005-0233382,2004-0228856,和 2004-0191244，其描述产生具有与FCRI、FcRII和/或FcRIII的降低的结合的 抗体的各种氨基酸修饰，以及导致与一种FcR结合增加但与另一种FcR结合 降低的氨基酸取代。
因此，可以通过改变恒定区，尤其是Fc区的性质调节涉及抗BDCA2抗体 的恒定区的效应器功能。在某些实施方案中，与第二抗体比较具有增加的或 减少的效应器功能的抗BDCA2抗体，该第二抗体具有效应器功能，并且可以 是包含介导效应器功能的天然恒定区或Fc区的非变体，天然的或亲本的抗 体。
天然序列Fc或恒定区包含的氨基酸序列与在自然界中发现的Fc或恒定 区的氨基酸序列相同。优选地，用于评估相对效应器功能的对照分子包含与 测试抗体或变体抗体相同的类型/亚型Fc区。变体或改变的Fc或恒定区包含氨 基酸序列，其由于至少一个氨基酸的修饰(诸如例如翻译后修饰、氨基酸取 代、插入或缺失)而不同于天然序列的重链区的氨基酸序列。因此，变体恒 定区可含有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，这导致改变的翻译后修饰， 包括例如改变的糖基化模式。亲本抗体或Fc区是例如具有正常效应器功能的变体，其用于构建具有改变的(例如增加的)效应器功能的恒定区(即Fc)。
可通过工程化改造或产生具有变体恒定区、Fc区或重链区的抗体来产生 具有改变的(例如，增加)的效应器功能的抗体。可将重组DNA技术和/或细胞 培养和表达条件用于产生具有改变的功能和/或活性的抗体。例如，可将重组 DNA技术用于在影响抗体功能(包括效应器功能)的区域(诸如例如，Fc或恒定 区)中工程化改造一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。或者，可以通过 操作宿主细胞、细胞培养和产生抗体的表达条件实现翻译后修饰(例如糖基 化模式)的变化。
本发明的某些实施方案涉及抗BDCA2抗体，其包含选自以下的一个或多 个重链CDR序列：SEQ ID NO:9的VH CDR1，SEQ ID NO:10的VH CDR2和 SEQ ID NO:11的VH CDR3；或选自以下的一个或多个重链备选CDR序列：SEQ ID NO:8的VH CDR1，SEQ ID NO:10的VHCDR2和SEQ ID NO:11的VH CDR3；或选自以下的一个或多个重链备选CDR序列：SEQ ID NO:89的VH CDR1，SEQ ID NO:91的VH CDR2和SEQ ID NO:11的VH CDR3；或选自以 下的一个或多个重链备选CDR序列：SEQ ID NO:9的VH CDR1，SEQ ID NO:92的VH CDR2和SEQ ID NO:11的VH CDR3；或选自以下的一个或多个 重链备选CDR序列：SEQ ID NO:90的VH CDR1，SEQ IDNO:93的VH CDR2 和SEQ ID NO:94的VH CDR3，其中抗体还包含相比于天然的或亲本Fc区，赋予增加或降低的效应器功能的变体Fc区。在其他的实施方案中，抗BDCA2 抗体包含至少两个CDR(或备选的CDR)，而在其他实施方案中，抗体包含全 部三个重链CDR序列(或备选的CDR)。这些抗BDCA2抗体i)除了来自浆细胞 样树突细胞的其他细胞因子和趋化因子外，还抑制I型干扰素和/或III型干扰 素的分泌；和/或(ii)在体外诱导或增强浆细胞样树突细胞的消耗。
本发明的其他实施方案涉及抗BDCA2抗体，其包含选自以下的一个或多 个轻链CDR序列：SEQ ID NO:5的VL CDR1，SEQ ID NO:6的VL CDR2和SEQ ID NO:7的VL CDR3；或选自以下的一个或多个轻链备选CDR序列：SEQ ID NO:95的VL CDR1，SEQ ID NO:96的VL CDR2和SEQ ID NO:97的VL CDR3， 抗体还包含相比于天然的或亲本Fc区，赋予增加或降低的效应器功能的变体 Fc区。在其他的实施方案中，抗BDCA2抗体包含至少两个轻链CDR(或备选的CDR)，而在其他实施方案中，抗体包含全部三个轻链CDR序列(或备选的 CDR)。这些抗BDCA2抗体i)除了来自浆细胞样树突细胞的其他细胞因子和趋 化因子外，还抑制I型干扰素和/或III型干扰素的分泌；和/或(ii)在体外诱导或 增强浆细胞样树突细胞的消耗。
在本发明的进一步的实施方案中，具有增加的或减少的效应器功能的抗 BDCA2抗体包含全部三个轻链CDR序列或SEQ ID NO:3的备选轻链CDR，并 包含全部三个重链CDR序列或SEQ ID NO:4的备选重链CDR。
在其他实施方案中，本发明涉及包含含有SEQ ID NO:23的VL序列的抗 BDCA2抗体，所述抗体还包含相比于天然或亲本Fc区，赋予降低的效应器功 能的变体Fc区。在其他实施方案中，本发明涉及包含含有SEQ ID NO:24的 VH序列的抗BDCA2抗体，所述抗体还包含相比于天然或亲本Fc区，赋予降 低的效应器功能的变体Fc区。
本领域公知产生包含氨基酸取代的任何上述抗BDCA2抗体变体的方法。 这些方法包括但不限于通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式 诱变制备编码抗体或至少该抗体的恒定区的制备DNA。定点诱变是本领域公 知的(参见例如Carter等人，NucleicAcids Res.,13:4431至4443(1985)和 Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488(1987))。PCR诱变也适合于 制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见，Higuchi,in PCRProtocols,pp.177-183 (Academic Press,1990)；和Vallette等人，Nuc.Acids Res.17:723-733(1989)。 用于制备序列变体的另一种方法(盒式诱变)基于Wells等人，Gene, 34:315-323(1985)所描述的技术。
具有改变的糖基化的抗-BDCA2抗体
不同的糖形可以深刻地影响治疗剂的性质，包括药代动力学，药效学， 受体相互作用和组织特异性靶向(Graddis等人，2002,Curr Pharm Biotechnol. 3:285-297)。特别地，对于抗体，除了抗体的效应器功能(例如结合补体复合 体C1(这诱导CDC)和结合FcγR受体(这负责调节ADCC途径))之外，寡糖结构 可影响与以下相关的性质：蛋白酶抗性，由FcRn受体介导的抗体的血清半寿 期、吞噬作用和抗体反馈(Nose和Wigzell,1983；Leatherbarrow和Dwek, 1983；Leatherbarrow等人,1985；Walker等人，1989；Carter等人，1992, PNAS,89:4285-4289)
因此，调节抗体的效应器功能的另一种方法包括改变抗体恒定区的糖基 化。改变的糖基化包括例如糖基化残基数目的减少或增加、糖基化残基的模 式或位置的变化以及在糖结构内的变化。在人IgG中发现的寡糖影响其效应 器功能的程度(Raju,T.S.BioProcess International April 2003.44-53)；人IgG寡 糖的微不均一性可影响生物学功能如CDC、ADCC、与多种Fc受体的结合以 及与Clq蛋白的结合(Wright A.&MorrisonSL.TIBTECH 1997,15 26-32； Shields等人，J Biol Chem.2001 276(9):6591-604；Shields等人，J Biol Chem.2002；277(30):26733-40；Shinkawa等人，J Biol Chem.2003278(5):3466-73；Umana等人，Nat Biotechnol.1999Feb；17(2):176-80)。例 如，IgG结合C1q和激活补体级联的能力可取决于位于两个CH2域之间的碳水 化合物部分(其通常在Asn297上锚定)的存在、缺乏或修饰(Ward和Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94(1995)。
可以通过标准技术鉴定在含Fc的多肽(例如抗体，如IgG抗体)中的糖基化 位点。可以通过实验或基于序列分析或建模数据鉴定糖基化位点。已描述了 共有基序，即由多种糖基转移酶识别的氨基酸序列。例如，对于N-连接糖基 化，共有基序通常是NXT或NXS，其中X可以是除了脯氨酸之外的任何氨基 酸。也描述了用于定位潜在的糖基化基序的几种算法。因此，为了鉴定抗体 或含有Fc的片段内的潜在糖基化位点，例如通过使用可公开获得的数据库， 如由生物序列分析中心(Center for Biological Sequence Analysis)提供的网站 (参见用于预测N连接的糖基化位点的NetNGlyc服务和用于预测O连接的糖 基化位点的NetOGlyc服务)检查抗体序列。
体内研究已证实无糖基抗体的效应器功能的降低。例如，在小鼠中，无 糖基抗CD8抗体不能消耗具有CD8的细胞(Isaacs,1992J.Immunol.148: 3062)，并且在小鼠或人中，无糖基抗CD3抗体不诱导细胞因子释放综合征 (Boyd,1995同上；Friend,1999Transplantation 68:1632)。BDCA2抗体的无糖 基化形式也具有降低的效应器功能。
重要地，虽然CH2域中的聚糖的除去似乎对效应器功能具有显著影响， 但是抗体的其它功能和物理性质保持不变。具体地，已经显示聚糖的除去对 血清半衰期和与抗原的结合影响很小影响至没有影响(Nose,1983同上；Tao, 1989同上；Dorai,1991同上；Hand,1992同上；Hobbs,1992Mol.Immunol. 29:949)。
可以修饰或改变本发明的抗BDCA2抗体以引发增加或减少的效应器功 能(相比于第二BDCA2特异性抗体)。例如，在美国6,350,861和美国5,714,350， WO 05/18572和WO 05/03175中描述了用于改变抗体的糖基化位点的方法； 这些方法可用于产生具有改变的、降低的或无糖基化的本发明的抗BDCA2 抗体。
适应症
本文中所述的抗BDCA2抗体可用于治疗或预防多种免疫病症，如炎性和 自身免疫性疾病。抗BDCA2抗体可用于治疗或预防这些病症，至少是因为它 们使pDC失效或消耗pDC，和/或抑制由pDC产生的炎性细胞因子和趋化因 子，和/或下调CD32a，和/或抑制pDC的免疫复合物刺激，和/或下调CD62L 或引起CD62L的脱落。本公开的抗BDCA2抗体可以与抗疟剂(例如，HCQ) 组合以实现在炎性和自身免疫性疾病的治疗中的改善的治疗效果。抗BDCA2抗体可用于降低细胞因子和趋化因子的水平，诸如：I型干扰素、III型干扰 素、IL-6、TNF-α、MIP1-α、MIP1-β、CCL5和IP-10。I型IFN组成了细胞因 子的多成员家族，包括13种IFN-α亚型、IFN-β、-ε、-κ、-ω、-δ和-τ(Theofilopoulos, Annu.Rev.Immunol.,23:307-36(2005))。III型干扰素由称作IFN-λ1，IFN-λ2 和IFN-λ3(也分别称为IL29、IL28A和IL28B)的3种IFN-λ分子组成。相比于尝 试用中和抗体减少特异性IFN亚型的治疗，本文所述的抗BDCA2抗体通过消 耗和/或抑制pDC的功能，提供了更有力的治疗方法。此外，抗BDCA2抗体 的pDC聚焦(foucus)治疗方法比IFN反应的全面抑制更有选择性并且可能更 安全。例如，本文所述的抗BDCA2抗体有效地消除了pDC衍生的I型IFN，同 时维持了其他来源的IFN，其在病毒感染的事件中可能是必需的。
术语“治疗/处理”是指以在统计学显著的程度或在本领域技术人员可检 测的程度有效改善状况、症状或与病症相关的参数或防止病症进展或恶化 (包括由病症引起的继发性损害)的量、方式和/或模式施用本文中所述的组合 物。
可以用本文中所描述的抗BDCA2抗体进行治疗的疾病或病症包括例如 系统性红斑狼疮(SLE)(例如，中度或重度狼疮)、皮肤狼疮、盘状狼疮、狼 疮肾炎、系统性硬化症(硬皮病)、硬斑病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性 肠病(IBD)、皮肌炎、多肌炎、银屑病和I型糖尿病。
SLE是一种慢性的自身免疫性疾病，其中多个器官被免疫复合物和组织 结合自身抗体损伤(参见Guidelines for Referral and Management of Systemic LupusErythematosus in Adults,Arthritis&Rheumatism,42(9):1785-1795 (1999))。自身抗体存在于SLE中，并且可以在临床疾病的发展前(Arbuckle等 人，N.Engl.J.Med.,349(16):1526-33(2003))。通过Fc受体内在化含有自身抗 体的免疫复合物导致产生I型干扰素，其继而促进耐受性的丧失，这使自身 免疫的恶性循环永存(Means等人，Ann N Y Acad Sci.,1062:242-51(2005))。 SLE就其临床表现、过程、预后和遗传学而言是异质的。相比于白人患者， 非裔美国人共享增加的经常更严重的SLE的风险。早期认为补体缺陷是SLE 发展的危险因素。最近，已描述与I型干扰素途径相关的遗传多态性赋予易 感性。例如，抗双链DNA和抗Ro自身抗体均与转录因子干扰素调节因子 5(IRF5)的某一单倍型相关。单倍型也预测SLE患者的血清中IFN-α的高水平 (Niewold等人，Ann.Rheum.Dis.,71(3):463-8(2012))。较高的IFN-α水平已 经与SLE患者中多器官累及的更大程度相关(Bengtsson等人，Lupus,9(9):664-71(2000))。此外，所谓的“干扰素标记”在SLE中似乎是显著的。干 扰素标记代表干扰素诱导型基因的mRNA表达模式。在半数以上SLE患者中 发现了I型干扰素标记，并且其与更大的疾病活动性相关(Baechler等人，Proc. Natl.Acad.Sci USA,100(5):2610-5(2003))。现在，IFN-α的单克隆抗体现在已 经进入临床，并且sifalimumab和rontalizumab的I期结果已经证明在SLE患者 的全血中，I型干扰素标记的剂量依赖性降低(McBride等人，Arthritis Rheum., 64(11):3666-76(2012)；Yao等人，Arthritis Rheum.,(6):1785至96(2009))。已 经产生了用于评估疾病活性和疾病严重程度(例如中度、重度)的验证指数(参 见例如，Gladman,Prognosis and treatment of systemic lupus erythematosus,Curr.Opin.Rheumatol.,8:430-437(1996)；Kalunian等人，Definition, classification,activity and damage indices.In:Dubois’lupus eyrthematosus. 5th ed.,Baltimore:Williams和Wilkins；pp.19-30(1997))。
系统性硬化症或系统性硬皮病是一种系统性自身免疫性疾病或系统性 结缔组织疾病，其是硬皮病的一种亚型。其特征在于在皮肤中，以及不太常 见在肾、心脏、肺和胃中沉积胶原。对于这种疾病，女性与男性的比例为4:1。 这种疾病发病的高峰年龄为30-50岁。
银屑病是一种影响皮肤的自身免疫性疾病。它在免疫系统错将皮肤细胞 当作病原体，并发送加速皮肤细胞的生长周期的错误信号时发生。已将银屑 病与增加的中风风险相联系，并且治疗高血脂水平可能导致改善。有五种类 型的银屑病：斑块状(plaque)、滴状(guttate)、皮褶(inverse)、脓疱性(pustular) 和红皮性(erythrodermic)。最常见的形式(斑块状银屑病)通常以上部第一层表 皮上出现红色和白色的鳞状斑。然而，一些患者没有皮肤病学体征或症状。
类风湿性关节炎是一种慢性炎性病症，其影响许多组织和器官，但主要 攻击活动关节。该过程涉及围绕关节的囊(capsule)的炎性应答，其继发于滑 膜细胞的肿胀、过量的滑液和在滑膜中的纤维组织(血管翳)的发展。疾病过 程的病理学往往导致关节软骨的破坏和关节僵硬。类风湿性关节炎还可以在 肺、心脏周围的膜(心包膜)、肺膜(胸膜)中产生弥漫性炎症，和白眼球(white of the eye)(巩膜)以及最常见于皮下组织的结节损害。虽然类风湿性关节炎的 病因是未知的，但自身免疫在其慢性和进展两者中均发挥关键作用，并且认 为RA是一种系统性自身免疫性疾病。在具有关节炎的患者中已经观察到 TNFα和其它促炎性细胞因子的过表达(Feldmann等人，Prog Growth Factor Res.,4:247-55(1992))。此外，过表达人TNFα的转基因动物产生了侵蚀性多 关节炎，其具有与疾病相关的许多特征(Keffer等人，EMBO J., 10(13):4025-31(1991))。虽然为了抑制或阻止潜在的免疫过程并防止长期损 害需要疾病改善的抗风湿药(DMARD)，将镇痛药和消炎药(包括类固醇)用于 抑制症状。最近，已将抗TNFα抗体治疗(利妥昔单抗)用于管理该疾病 (Edwards,等人，N.Engl.J.Med.,350(25):2572–81(2004))。
炎性肠病(IBD)是一组结肠和小肠炎性病症。IBD的主要类型是克罗恩氏病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎(UC)。克罗恩氏病和UC之间的主要区别是 炎症变化的位置和性质：尽管大多数的病例在回肠末端起始，但克罗恩病可 以影响胃肠道的任何部分(从口腔到肛门)(跳跃性病变)，而UC被限制在结肠 和直肠。根据严重程度，IBD可能需要免疫抑制以控制症状，如泼尼松、TNF 抑制、硫唑嘌呤(azathioprine)(依木兰(Imuran))、甲氨蝶呤或6-巯嘌呤。更常 见地，IBD的治疗需要美沙拉嗪的一种形式。
皮肌炎(DM)是与多肌炎(PM)相关的一类自身免疫性结缔组织病，其特 征在于肌肉和皮肤的炎症。DM最常影响皮肤和肌肉，它是也可能会影响关 节、食道、肺和(不太常见)心脏的一种系统性病症。
多肌炎(PM)(“许多肌肉的炎症”)是一类与皮肌炎和包涵体肌炎相关的慢 性肌肉炎症(炎性肌病)。
I型糖尿病是糖尿病的一种形式，其起因于胰腺的胰岛素产生β细胞的自 身免疫性破坏。随后的胰岛素缺乏导致增加的血液和尿液葡萄糖。典型的症 状是多尿、多饮、多食和体重减轻。
适合用本文所述的抗BDCA2抗体治疗的其它疾病的实例包括哮喘、贝切 特氏病、CREST综合征、克罗恩氏病、皮肌炎、青少年型皮肌炎、糖尿病、 盘状红斑狼疮、肺纤维化、自身免疫性肾小球肾炎、膜性肾小球病、幼年型 类风湿关节炎(幼年型慢性关节炎)、混合性结缔组织病、多发性硬化、肾病 综合征、脂膜炎、类天疱疮、天疱疮、红斑型天疱疮、落叶型天疱疮、寻常 型天疱疮、风湿性多肌痛、系统性硬化症、进行性系统性硬化症(硬皮病)、 硬斑病(局部性硬皮病)、多发性硬化、银屑病、银屑病关节炎、肺纤维化、 雷诺现象/综合征、斯耶格伦综合征和溃疡性结肠炎(asthma,Behcet's disease, CREST syndrome,Crohn'sdisease,dermatomyositis,juvenile dermatomyositis, diabetes mellitus,discoidlupus erythematosus,pulmonary fibrosis, autoimmune glomerulonephritis,membranous glomerulopathy,juvenile rheumatoid arthritis(juvenile chronicarthritis),mixed connective tissue disease, multiple sclerosis,nephroticsyndrome,panniculitis,pemphigoid,pemphigus, pemphigus erythematosus,pemphigusfoliaceus,pemphigus vulgaris,rheumatic polymyalgia,systemic sclerosis,progressive systemic sclerosis(scleroderma), morphea(localized scleroderma),multiple sclerosis,psoriasis,psoriatic arthritis, pulmonary fibrosis,Raynaud's phenomenon/syndrome,Sjogren's syndrome,and ulcerative colitis)。
可以对有这些中一种病症的风险、诊断患有或具有这些中一种病症的受 试者施用一定量的抗BDCA2抗体达一定时间，从而提供总体治疗效果。可以 单独施用(单一疗法)或与其他药剂组合施用(联合治疗)抗BDCA2抗体。在一 个实施方案中，用于与本文所述的抗BDCA2抗体的联合治疗的药剂是抗疟 剂。在一个实施方案中，用于与本文所述的抗BDCA2抗体的联合治疗的药剂 是TLR7和/或TLR9信号传导抑制剂。在另一个实施方案中，用于与本文所述 的抗BDCA2抗体的联合治疗的药剂是皮质类固醇。在某些实施方案中，用于 与本文所述的抗BDCA2抗体的联合治疗的药剂是抗疟药和/或激酶抑制剂 (例如，BTK抑制剂(如ibrutinib(PCI-32765)、AVI-292、ONO-WG-307)、JAK1 抑制剂、JAK2抑制剂、JAK3抑制剂、TYK2抑制剂)。在一个特定的实施方 案中，用于与本文所述的抗BDCA2抗体的联合治疗的药剂是羟氯喹。用于联 合治疗的施用的量和时间可以是提供例如添加或协同的治疗效果的那些量 和时间。此外，该抗BDCA2抗体(与或不与第二种药剂一起)的施用可以用作 一级治疗，例如一线治疗，或作为二级治疗(secondary treatment)，例如用于 具有对先前施用的治疗(即与用抗BDCA2抗体治疗不同的治疗)反应不足的 受试者。在一些实施方案中，联合治疗包括使用抗BDCA2抗体和以下药剂中 的一个或多个：糖皮质激素、NSAID、泼尼松(prednisone)、羟氯喹、氯喹、 阿莫地喹(amodiaquine)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、氯胍(proguanil)、甲氟喹 (mefloquine)、氨苯砜(dapsone)、伯氨喹(primaquine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、 麦考酚酸莫酯(mycophenolate mofetil)、硫唑嘌呤(azathioprine)、沙利度胺 (thalidomide)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环孢素A(cyclosporine A)、雷帕霉素(rapamycin)、前列环素(prostacyclin)、磷酸二酯酶抑制剂 (phosphodiesteraseinhibitor)、内皮素拮抗剂(endothelin antagonists)、抑制蛋 白(statin)、ACE抑制剂和钙通道阻滞剂(calcium channel blocker)。在其他实施 方案中，联合治疗包括使用抗BDCA2抗体和以下中的任何一个或多个：柳氮 磺吡啶(sulfasalazine)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、青霉 胺(penicillamine)、tofacitinib和来氟米特(leflunomide)。
药物组合物
可将本文所述的抗BDCA2抗体或其抗原结合片段配制为施用于受试者 (例如以治疗本文所述的病症)的药物组合物。通常，药物组合物包括药学可 接受载体。如本文所使用，“药学可接受载体”包括生理上相容的任何和所 有溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸附延缓剂等。 组合物可以包括药学可接受盐，例如，酸加成盐或碱加成盐(参见例如，Berge, S.M.,等人，(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。
药物配制剂是一种完善建立的技术，并且例如在Gennaro(ed.), Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,20th ed.,Lippincott,Williams &Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,7th Ed.,Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)；和Kibbe(ed.),Handbook of Pharmaceutical Excipients AmericanPharmaceutical Association,3rd ed.(2000) (ISBN:091733096X)中进一步描述。
药物组合物也可呈多种形式。这些包括(例如)液体、半固体和固体剂型， 例如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸 剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式可取决于意图的施用模式和治疗应用。 通常，本文所述药剂的组合物呈可注射或可输注溶液的形式。
在一个实施方案中，将本文所述的抗BDCA2抗体与赋形剂材料(如氯化 钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钠七水合物(sodium phosphate dibasic heptahydrate)、 磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)、Tween-80)和稳定剂一起配制。它 可以以合适的浓度在例如缓冲溶液中提供，并且可以将其储存于2-8℃。在 一些其它实施方案中，组合物的pH在约5.8和6.6之间(例如5.8、5.9、6.0、6.1、 6.2、6.3、6.4、6.5、6.6)。
药物组合物还可以包括配制时减少BDCA2抗体或其抗原结合片段的聚 集的药剂。聚集减少剂的实例包括选自由甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸，天冬 氨酸，甘氨酸和谷氨酸组成的组的一种或多种氨基酸。可以以约0.5mM至约 145mM(例如，0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM) 的浓度将这些氨基酸加入到制剂中。药物组合物还可以包括糖(例如，蔗糖、 海藻糖、甘露醇、山梨糖醇或木糖醇)和/或张力调节剂(tonicity modifier)(例如，氯化钠、甘露醇或山梨糖醇)和/或表面活性剂(例如，聚山梨醇(polysorbate) 20或聚山梨酯80)。
此类组合物可通过肠胃外方式(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内 注射)施用。在一个实施方案中，皮下施用抗BDCA2抗体或其抗原结合片段 组合物。在一个实施方案中，静脉内施用抗BDCA2抗体或其抗原结合片段组 合物。如本文所使用的短语“肠胃外施用”指除肠和表面施用之外的施用方 式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊 内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、 蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可将组合物配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或其它适于高浓度稳 定储存的有序结构。可如下制备无菌可注射溶液，即在具有上面列举的成分 的一种或组合的适当溶剂中并入所需量的本文所述药剂，根据需要，接着过 滤灭菌。通常，通过将本文所述药剂并入含有基础分散介质和来自上面列举 成分的需要的其它成分的无菌媒介物中制备分散体。在用于制备无菌可注射 溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生 本文所述药剂的粉剂加上来自其先前无菌过滤溶液的任何附加期望成分。例如，可通过使用诸如卵磷脂的涂层材料，在分散体的情况下通过保持所需粒 度和通过使用表面活性剂来保持溶液的适当流动性。可通过使延缓吸收的药 剂，例如单硬脂酸盐和明胶包括在组合物内来使可注射组合物的吸收延长。
在某些实施方案中，可以将抗BDCA2抗体或其抗原结合片段与会保护化 合物免于快速释放的载体(如受控释放制剂，包括植入物，以及微囊化递送 系统)一起制备。可以使用可生物降解的，生物相容的聚合物，如乙烯醋酸 乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。 许多用于制备此类制剂的方法取得了专利或通常是已知的。参见例如， Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed., Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。
在一个实施方案中，药物制剂以约0.5mg/mL至300mg/mL的浓度(例 如、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100 mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、250mg/mL)包 含用柠檬酸钠，氯化钠和任选地Tween-80(0.01％-0.1％，例如，0.03％，0.05％ 或0.7％)一起配制的抗BDCA2抗体或其抗原结合片段(例如，BIIB059)。制剂 的pH可以是在5.5和7.5之间(例如，5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、 6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.3)。
施用
可以通过多种方法将抗BDCA2抗体或其抗原结合片段施用于受试者，例 如有此需要的受试者，例如人类受试者。对于许多应用，施用途径是下列之 一：静脉内注射或输注(IV)，皮下注射(SC)，腹膜内(IP)或肌内注射。另外， 也可能使用关节内递送。也可以使用肠胃外施用的其它方式。此种方式的实 例包括：动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、表皮下、关节 内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射。在一些情况下，施用可以是口服。
也可以针对各个病例调整抗体或其抗原结合片段的施用途径和/或方式， 例如通过监测受试者，例如使用断层成像进行，例如以显现肿瘤。
可以以固定剂量或以mg/kg的剂量施用抗体或其抗原结合片段。也可以 选择剂量以减少或避免产生针对抗BDCA2抗体的抗体。调整剂量方案以提供 期望反应，例如治疗反应或组合治疗效果。通常，可使用抗BDCA2抗体(和 任选地第二药剂)的剂量以为受试者提供生物可用量的药剂。例如，可以施 用0.1-100mg/kg、0.5-100mg/kg、1mg/kg–100mg/kg、0.5-20mg/kg、0.1-10 mg/kg或1-10mg/kg范围中的剂量。也可以使用其他剂量。在特定的实施方案 中，对需要用抗BDCA2抗体治疗的受试者施用2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、 10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、35mg/kg或40mg/kg剂量的抗体。
组合物可包含约1mg/mL至100mg/mL，或约10mg/mL至100mg/mL，或 约50至250mg/mL，或约100至150mg/mL，或约100至250mg/mL的抗BDCA2 抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，在组合物中的抗BDCA2抗体或其抗原结合片段主要 是单体形式，例如，至少约90％、92％、94％、96％、98％、98.5％或99％的 单体形式。某些抗BDCA2抗体或其抗原结合片段组合物可包含小于约5、4、3、2、1、0.5、0.3或0.1％的聚集体，如例如通过UV在A280nm处检测的。某 些抗BDCA2抗体或其抗原结合片段组合物包含小于约5％、4％、3％、2％、 1％、0.5％、0.3％、0.2％或0.1％的片段，如例如通过UV在A280nm处检测的。
如本文所使用的，剂量单位形式或“固定剂量”指适合作为用于待治疗 的受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算以产生期望治疗 效果的预定量的活性化合物连同需要的药物载体并且任选地连同其它药剂。 可给予单剂或多剂。或者/另外，可以通过连续输注施用抗体。
可以例如在足以涵盖至少2剂、3剂、5剂、10剂或更多的一段时间(治疗 过程)内以定期间隔施用抗BDCA2抗体或其抗原结合片段剂量，例如每天一 次或两次，或每周约一至四次，或优选每周，两周(每两周)，每三周，每月， 例如持续在约1至12周之间，优选在约2至8周之间、更优选在约3至7周之间、 甚至更优选在约4、5或6周中。可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时机 的因素包括例如疾病或病症的严重程度、制剂、递送途径、先前的治疗、受 试者的一般健康和/或年龄和目前存在的疾病。此外，用治疗有效量的化合物 治疗受试者可以包括单一治疗，或优选地可包括一系列治疗。
如果受试者处在发展成本文所述的免疫病症的风险，那么可以在免疫病 症完全发作之前施用抗体，例如作为预防措施。这种预防性治疗的持续时间 可以是单剂抗体或治疗可以继续(例如多剂)。例如，可以用抗体处理处在病 症的风险或具有病症的素因的受试者达数天、数周、数月、甚至数年，以防 止该病症的发生或暴发。
药物组合物可包括“治疗有效量”的本文所述药剂。可根据施用药剂的 效果或药剂的组合效果(如果使用一种以上药剂)确定此类有效量。药剂的治 疗有效量也可以根据下述因素改变，所述因素诸如疾病状态、个体的年龄、 性别和重量和化合物在个体中引起期望反应的能力，例如改善至少一种病症 参数或改善病症的至少一种症状。治疗有效量也是治疗有益作用超出组合物 的任何毒性或有害作用的量。
在某些实施方案中，以约1mg/mL至约300mg/mL(例如，1mg/mL、5mg/ mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、 150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、250mg/mL)的浓度皮下施用抗BDCA2 抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，以50mg/mL的浓度皮下施用抗 BDCA2抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，以约1mg/mL至约300mg/mL的浓度静脉内施用抗BDCA2抗体或其抗原结合片段。在一个特定 的实施方案中，以50mg/mL的浓度静脉内施用抗BDCA2抗体或其抗原结合 片段。
用于治疗的装置和试剂盒
用医疗装置施用包括抗BDCA2抗体或其抗原结合片段的药物组合物。所 述装置可设计为具有诸如轻便、室温储存和易于使用的特征，从而它可在紧 急情况下从医疗设施和其它医疗设备上取出，例如由未经训练的受试者或在 场的紧急救援人员使用。所述装置可包括(例如)一个或多个用于储存包括抗 BDCA2抗体或其抗原结合片段的药物制剂的外壳(housing)，并且可构造为递 送一个或多个单位剂量的抗体。可以进一步配置装置为以还包括抗BDCA2 抗体或其抗原结合片段的单一药物组合物的形式或以两种单独的药物组合物的形式施用第二药剂，例如，化学治疗剂。
可以用注射器施用药物组合物。还可用无针皮下注射装置，例如US 5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556 中公开的装置施用药物组合物。众所周知的植入物和模块的实例包括：US 4,487,603(其公开了用于以受控速率分散药物的可植入微型输注泵)；US 4,486,194(其公开了用于通过皮肤施用药剂的治疗设备)、US 4,447,233(其公 开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵)；US 4,447,224(其公开了 用于持续药物递送的可变流动可植入输注装置)；US 4,439,196(其公开了具 有多室隔的渗透药物递送系统)和US 4,475,196(公开了渗透药物递送系统)。 许多其他装置、植入物、递送系统和模块也是已知的。
可在试剂盒中提供抗BDCA2抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案 中，试剂盒包括(a)装有包括抗BDCA2抗体的组合物的容器，任选地(b)信息 材料。信息材料可为涉及本文所述方法和/或药剂用于治疗益处的用途的描述 性、指导性、营销材料或其它材料。
在一个实施方案中，试剂盒还包括用于治疗本文描述的病症的第二药剂 (例如，BTK抑制剂、抗疟药、糖皮质激素、NSAID、泼尼松、羟氯喹、阿 莫地喹(amodiaquine)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、氯胍、磺胺、甲氟喹 (mefloquine)、阿托伐醌(atovaquone)、伯氨喹(primaquine)、青蒿素及其衍生 物、卤泛群(halofantrine)、多西环素、克林霉素(clindamycin)、甲氨蝶呤、麦 考酚酸莫酯(mycophenolate mofetil)、硫唑嘌呤、环磷酰胺、柳氮磺吡啶或来 氟米特)。例如，试剂盒包括装有包括抗BDCA2抗体的组合物的第一容器和 包括第二药剂的第二容器。
试剂盒的信息材料在起形式上没有限制。在一个实施方案中，信息材料 可包括关于化合物的生产、化合物的分子量、浓度、有效期、批次和生产地 点信息等的信息。在一个实施方案中，信息材料涉及例如以适合剂量、剂型 或施用模式(例如，本文所述的剂量、剂型或施用模式)施用抗BDCA2抗体或 其抗原结合片段以治疗患有本文所述的免疫病症或处于发展成本文所述的 免疫病症的风险中的受试者的方法。信息可以以各种格式提供，包括印刷文 本、计算机可读材料、录象记录或录音记录或提供实质性材料的链接或地址 (例如，在因特网上)的信息。
除抗体外，试剂盒中的组合物可包括其它成分，例如溶剂或缓冲液、稳 定剂或防腐剂。抗体可以以任何形式提供，例如液体、干燥或冻干形式，优 选地基本上纯的和/或无菌的。当于液体溶液中提供药剂时，液体溶液优选为 水溶液。当作为干燥形式提供药剂时，通常通过添加适合溶剂重建。任选地， 可以在试剂盒中提供溶剂，例如无菌水或缓冲液。
试剂盒可包括一个或多个用于一种或多种含有药剂的组合物的容器。在 一些实施方案中，试剂盒装有用于组合物和信息材料的不同容器、分配器或 区室。例如，组合物可装在瓶、小瓶或注射器中，而信息材料可装在塑料套 管或袋中。在其它实施方案中，试剂盒的不同元件可装在单个未分割容器中。 例如，组合物装在以标签形式贴有信息材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些 实施方案中，试剂盒包括若干(一包)单独容器，每个容器装有一个或多个单 位剂型(例如，本文所述剂型)的药剂。容器可包括组合单位剂量，例如包括 例如呈所需比例的抗BDCA2抗体或其抗原结合片段和第二药剂的单位。例 如，试剂盒包括若干注射器、安瓿、铝箔包、泡板包装或医疗设备，例如每 一个均装有单次组合单位剂量。试剂盒的容器可为气密性、防水(例如，不 受水分或蒸发改变)和/或不透光。
试剂盒任选地包括适于施用组合物的设备，例如注射器或其它适合的递 送装置。提供预先装载一种或两种药剂的装置或装置可为空的但是适合装 载。
诊断用途
抗BDCA2抗体或其抗原结合片段可用于诊断方法，其用于在体外(例如， 生物样品，如组织，活组织检查)或在体内(例如，受试者中的体内成像)检测 BDCA2的存在。例如，可将人或有效地人抗BDCA2抗体施用于受试者以检 测受试者中的BDCA2。例如，可以用MRI可检测标记或放射性标记标记抗体。 可以使用用于检测可检测标记的手段评估受试者。例如，可以扫描受试者， 以评估抗体在受试者中的定位。例如，通过NMR或其他断层成像手段使受试 者成像。
可用于诊断成像的标记的实例包括放射性标记，如131I、111In、123I、99mTc、 32P、33P、125I、3H、14C和188Rh，荧光标记如荧光素和罗丹明，核磁共振活性 标记，通过正电子发射断层摄影术(“PET”)扫描仪可检测的正电子发射同位 素，化学发光剂如萤光素，和酶标记如过氧化物酶或磷酸酶。也可以使用短 程辐射发射器(short-range radiation emitter)，例如通过短程检测器探头可检测 的同位素。可以使用已知的技术用此种药剂标记蛋白质配体。例如参见 Wensel和Meares(1983)Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy,Elsevier,New York for techniques relating to the radiolabeling of antibodies，以 及Colcher等人，(1986)Meth.Enzymol.121:802-816。
可以使用已知的技术(诸如放射性核扫描(Radionuclear scanning)，例如使 用γ照相机或发射断层摄影术进行)使受试者体内成像。参见例如A.R. Bradwell等人，“Developments in Antibody Imaging”,Monoclonal Antibodies for Cancer Detectionand Therapy,R.W.Baldwin等人，(eds.),pp 65-85(Academic Press 1985。或者，当放射性标记发射正电子(例如，11C、18F、15O和13N)时， 可以使用正电子发射横轴断层摄影术扫描仪(positron emission transaxial tomography scanner)，如位于Brookhaven NationalLaboratory称作Pet VI。
磁共振成像(MRI)使用NMR来现象活体受试者的内部特征，并且可用于 预后，诊断，治疗和手术。可以在没有放射性示踪剂化合物的情况下使用 MRI以实现明显益处。一些MRI技术总结在EP0502814A。一般来说，将与 不同环境中水质子的弛豫时间常数T1和T2相关的差异用于生成图像。然而， 这些差异可以不足以提供明显的高分辨率图像。
可通过造影剂增强这些弛豫时间常数的差异。这样的造影剂的例子包括 许多磁剂、顺磁剂(主要改变T1)、铁磁性剂或超顺磁性剂(主要改变T2的反 应)。可以将螯合物(例如，EDTA，DTPA和NTA螯合物)用于一些顺磁物质(例 如，Fe3+,Mn2+,Gd3+)的附着(并降低其毒性)。其它药剂可以为例如直径少于 10μm至约10nm的颗粒的形式。颗粒可具有铁磁性、反铁磁性或超顺磁性特 性。颗粒可以包括例如磁石(Fe3O4)、γ-Fe2O3、铁素体(ferrite)和过渡元素的其 他磁性矿物化合物。磁性颗粒可以包括一种或多种具有和没有非磁性材料的 磁性晶体。非磁性材料可包括合成的或天然的聚合物(如Sepharose、右旋糖 苷、糊精、淀粉等)。
也可以用含有NMR-活性19F原子的指示基团，或多个这样的原子标记抗 BDCA2抗体或其抗原结合片段，这是因为(i)基本上全部天然丰富的氟原子是 19F同位素，因此基本上含氟的全部化合物都是NMR-活性的；(ii)许多化学活 性聚氟化化合物如三氟醋酐(trifluoracetic anhydride)是以相对低成本商品化 的，和(iii)已经发现许多氟化化合物对于在人中的使用是医学可接受的，如 用于携带氧的全氟聚醚(perfluorinatedpolyether)作为血红蛋白替代。允许温 育一段时间后，使用装置(如Pykett(1982)Scientific American,246:78-88描述 的装置之一)进行全身MRI以对BDCA2的分布进行定位和成像。
在另一方面，本公开提供了用于体外检测样品(例如，生物样品，如血 清、血浆、组织、活组织检查)中BDCA2的存在的方法。该主题方法可以用 于诊断病症，例如自身免疫性病症(例如，SLE)，或检测样品中pDC的水平。 该方法包括：(i)使样品或对照样品与抗BDCA2抗体接触；和(ii)例如通过检 测抗BDCA2抗体和BDCA2之间的复合物形成，或通过检测抗体或BDCA2的 存在来对样品评价BDCA2的存在。例如，可将抗体固定在例如支持体上，并 且检测保留在支持体上的抗原，和/或反之亦然。例如，可以用荧光团标记所 使用的抗体。对照样品可包括在内。阳性对照可以是已知具有评估的疾病或 病症的样品，而阴性对照可以是来自没有评估的疾病或病症的受试者的样 品。相对于对照样品，在样品中复合物形成的统计学显著变化可以指示样品 中BDCA2的存在。一般地，抗BDCA2抗体可以用于这些应用，其包括荧光 偏振、显微术、ELISA、离心、层析和细胞分选(例如，荧光激活细胞分选)。 在某些实施方案中，抗BDCA2抗体是BIIB059或Dendritics克隆124B3.13。在 一些实施方案中，该方法进一步涉及用抗CD123抗体免疫染色组织样品。组 织样品可以来自例如具有自身免疫性状况(例如SLE)的人类患者的皮肤活组 织检查。
以下是本发明实践的实例施。它们不应当被解释为以任何方式限制本发 明的范围。
实施例
提供了以下实施例来更好地说明所要求保护的发明，并且不应当将实施 例解释为限制本发明的范围。就提到具体材料而言，它仅仅是用于说明的目 的，并不意在限制本发明。本领域技术人员可以在不运用创造性能力的情况 下且在不偏离本发明的范围的前提下开发等同手段或反应物。
实施例1：鼠抗BDCA2抗体的重链和轻链的克隆
24F4鼠杂交瘤(IgG1，κ)是来源于通过基因枪用质粒pEAG2456免疫的 Balb/c小鼠，质粒pEAG2456是共表达全长人BDCA2和FcεRIγcDNA的哺乳 动物表达载体(见实施例17)。
使用Qiagen RNeasy小型试剂盒，按照制造商的推荐的方案制备来自 24F4鼠杂交瘤细胞的总细胞RNA。使用GE Healthcare First Strand cDNA Synthesis kit，按照制造商的推荐方案，使用用于引发的随机六聚物，通过 RT-PCR从总细胞RNA克隆编码重链和轻链的可变区的cDNA。
对于具有完整信号序列的鼠免疫球蛋白可变域的PCR扩增，使用如 CurrentProtocols in Immunology(Wiley和Sons,1999)中所述的与多个鼠免 疫球蛋白基因家族信号序列杂交的简并正向引物和对鼠恒定域的5'端特异的 单一反向引物(single backprimer)的混合物。使用以下引物扩增24F4重链可变 域：5'ACT AGT CGA CAT GRA CTT TGGGYT CAG CTT GRT TT 3' (R＝A/G和Y＝C/T)(SEQ ID NO:25)和5'AGG TCT AGA AYC TCCACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3'(R＝A/G和Y＝C/T)(SEQ ID NO:26)。 使用以下引物扩增24F4轻链可变域：5'ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT 3'(W＝A/T和Y＝C/T)(SEQ ID NO:27)和5' GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATG GA 3'(SEQ ID NO:28)。
使用Qiagen Qiaquick凝胶提取试剂盒，根据制造商的推荐方案，对PCR 产物凝胶纯化。使用Invitrogen的TOPO克隆试剂盒，按照制造商的推荐方案， 将纯化的PCR产物亚克隆到Invitrogen的pCR2.1TOPO载体中。对来自多个独 立亚克隆的插入物进行测序，以(从称作pYL647的重链克隆和轻链克隆 pYL651)建立共有序列。
克隆中序列的变化是与引物的简并位置一致的。可变域序列的BLAST 分析证实其免疫球蛋白的身份。推导的成熟轻链和重链的N-端序列匹配来源 于埃德曼(Edman)降解数据的真正24F4链的那些序列。从假设的序列推导的 完整质量与通过质谱术测定的纯化的杂交瘤衍生24F4的质量一致，所述假设 的序列是通过将从克隆的Balb/c IgG1重链和κ轻链cDNA的推导的恒定域序 列加入至推导的成熟可变域序列装配的。
鼠24F4重链可变域(VH)是鼠亚组III(D)的成员。下文显示了具有以所述 次序加下划线的CDR H1、CDR H2和CDR H的鼠24F4成熟重链可变域的序 列：
1DVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT
51ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNTL FLQMSSLKSE DTAMYYCTRD
101IYYNYGAWFA YWGQGTLVTV SA(SEQ ID NO:29)。
鼠24F4轻链可变域((VL))是鼠κ亚组III的成员。下文显示了具有以所述次 序加下划线的CDR L1、CDR L2和CDR L3的鼠24F4成熟轻链可变域的序列：
1DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL
51LIYAASTLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQCNEDPR
101TFGGGTKLEI K(SEQ ID NO:30)。
未配对的半胱氨酸存在于上述鼠24F4 VL序列的CDRL3中的残基95处 (Kabat命名法中此半胱氨酸是残基91)。
实施例2：鼠24F4抗体的嵌合化
将编码鼠24F4可变域的cDNA用于构建用于表达鼠-人嵌合体(ch24F4)的 载体，在所述鼠-人嵌合体中mu24F4可变区与人IgG1和κ恒定区连接。
首先通过PCR工程化改造可变域，以增加5'Kozak序列，并且在FR4/恒定 域连接处引入人序列和新的限制位点以融合到人免疫球蛋白恒定域。通过 DNA测序证实得到的质粒中的可变区cDNA序列。使用质粒pYL647中的重链 可变域作为模板以用引物5'GAT CCG CGGCCG CAC CAT GGA CTT TGG GTT CAG CTT G 3'(SEQ ID NO:31)(添加NotI位点和Kozak序列)和5'GAT GGG CCC TTG GTG GAA GCT GCA GAG ACA GTG ACC AGA G 3'(SEQ ID NO:32)(在FR4/恒定域连接处添加人IgG1 CH1序列和ApaI位点)进行 PCR，扩增了0.45kb的片段，纯化该片段并亚克隆到Invitrogen pCRBluntIITOPO克隆载体中，产生pYL668。为了构建重链嵌合体，将来自 24F4重链可变域构建体pYL668的0.45kb的NotI-ApaI片段和来自pEAG1325 (含有经序列证实的huIgG1重链恒定域cDNA(用遗传方法除去了IgG1的C-端 赖氨酸残基)的质粒)的0.98kb的ApaI-BamHI片段亚克隆到表达载体pV90(其 中异源基因表达受CMV-IE启动子和人生长激素多聚腺苷酸化信号控制，并 且携带dhfr选择标记，参见美国专利7494805)的载体主链中，以产生表达载 体pYL672。通过pYL672编码的推定的成熟ch24F4-huIgG1重链蛋白质序列如 下所示：
Figure BDA0002495922490000801
还通过亚克隆来自24F4重链可变域构建体pYL668的0.45kb的NotI-ApaI 片段构建ch24F4的无糖基化低效应器功能形式，并且将来自pEAG2412(该质 粒含有经序列确认的S228P/N299Q huIgG4/IgG1的杂合重链恒定域cDNA， 通过遗传方法除去了IgG1的C-端赖氨酸残基)的0.98kb的ApaI-BamHI片段亚 克隆到表达载体pV90的载体主链中，产生质粒pYL670。通过DNA测序证实 得到的质粒pYL670中的重链cDNA序列。通过pYL670编码的推定的成熟agly ch24F4-huIgG1杂合重链蛋白质序列如下所示：
Figure BDA0002495922490000802
Figure BDA0002495922490000811
使用质粒pYL651中的κ轻链可变域作为模板以用引物5'GAT CCG CGG CCG CCACCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TG 3'(SEQ ID NO:35) (添加5'NotI位点和Kozak序列)和5'CCA CCG TAC GTT TGA TTT CCA GCT TGG TGC 3'(SEQ ID NO:36)(在FR4/恒定域连接处添加人κ恒定域序 列和3'BsiWI位点)进行PCR，扩增了0.4kb的片段，纯化该片段并亚克隆到 Invitrogen pCRBluntIITOPO克隆载体中，产生pYL669。通过DNA测序证实质 粒pYL669中的可变区cDNA序列。为了构建轻链嵌合体，将来自pYL669的0.4 kb的NotI-BsiWI的轻链可变域片段和来自pEAG1572(含有经序列证实的人 κ轻链恒定域的cDNA)的0.34kb的BsiWI-BamHI片段亚克隆到pV100(其中 异源基因表达受CMV-IE启动子和人生长激素多聚腺苷酸化信号控制，并且 携带新霉素选择标记)的载体主链中，以产生表达载体pYL671。通过DNA测 序证实得到的质粒pYL671中的轻链cDNA序列。通过pYL671编码的推定的成 熟ch24F4-人κ轻链蛋白质序列如下所示：
Figure BDA0002495922490000812
将表达载体(ch24F4重链载体pYL670或pYL672和ch24F4轻链载体 pYL671)共转染到293-EBNA细胞中，并且测试经转染的细胞的抗体分泌和特 异性(将空载体和分子克隆的无关mAb载体转染的细胞充当对照)。条件化培 养基的Western印迹分析(用抗人重链和轻链抗体显色)表明经ch24F4转染的 细胞合成并有效地分泌重链和轻链。与表面人BDCA2的直接FACS结合证实 ch24F4的特异性。ch24F4的两个变体的EC50结合等同于通过稀释滴定FACS 测定法通过对表面表达的人BDCA2的直接结合得到的鼠24F4 mAb的。分别 通过用pYL672/pYL671和pYL670/pYL671共转染产生了分泌 ch24F4-huIgG1，κmAb和无糖基化的ch24F4-huIgG4/G1杂合κmAb的稳定 的CHO细胞系。
实施例3：除去嵌合的24F4抗体的CDRL3中未配对的半胱氨酸残基
在暴露的CDR中的未配对的半胱氨酸可以产生产物异质性或不稳定性， 将ch24F4轻链表达载体质粒pYL671作为模板，通过定点诱变构建ch24F4变 体C95S和C95T。
使用Agilent的QuikChange II诱变试剂盒，按照制造商的推荐方案进行定 点诱变。如下构建C95S变体：使用诱变引物5'GCA ACC TAT TAC TGT CAA CAA AGT AAT GAG GATCCT CGG AC 3'(SEQ ID NO:38)和其反向互补物 (其引入了新的HincII位点)，产生质粒pEAG2678。如下构建C95T变体：使用 诱变引物CAA CCT ATT ACT GTC AGC AAA CTA ATGAAG ATC CTC GGA CGT TCG 3'(SEQ ID NO:39)和其反向互补物(其除去了BamHI位点)，产生 质粒pEAG2679。通过筛选引入的限制位点改变鉴定突变质粒。通过DNA测 序证实得到的质粒中全长轻链cDNA序列。通过共转染pYL672和pYL671， pEAG2678或pEAG2679在293E细胞中瞬时表达野生型ch24F4、C95S和C95T 变体mAb。转染后2天收获条件化培养基。两个变体的滴度(在抗人Fc尖端上 通过Octet测定)类似于野生型ch24F4的滴度，并且非还原性SDS-PAGE的 Western印迹表明相对于野生型ch24F4单抗，没有大体聚集或明显的剪切。在 表面BDCA2上通过FACS的直接结合表明，C95S变体结合的表观EC 50等同 于野生型ch24F4的，而C95T变体的EC50结合减少了几倍。通过Octet对含有 ch24F4和C95变体mAb的条件化培养基评估与人BDCA2胞外域的结合。使来 自瞬时转染细胞的条件化培养基的抗体结合抗人Fc尖端，然后在Octet尖端上 流过单体huBDCA2，以检查结合和解离。野生型ch24F4和C95S变体的Octet 结合和解离动力学相当，而C95T变体的解离速率比野生型ch24F4的解离速率 快。基于这些结果，将C95S并入到人源化24F4轻链CDRL3中。
实施例4：示例性人源化24F4重链和轻链
7个人源化的(hu)24F4重链(huIGHV3-21*01框架/24F4 VH CDR)和它们 的相应的DNA序列的实例如下所示。每个重链中的CDR 1、2和3以所述 次序加下划线。框架回复突变显示为小写加粗字体。通过CDR序列内的阴 影显示CDR残基自鼠24F4的变化。根据Chothia定义限定可变重链的 CDR1(CDR H1)，所述Chothia定义比Kabat定义长5个氨基酸；将CDRH1 中的斜体残基鉴定形成Chothia CDR H1的额外的5个氨基酸(即， GFTFS(SEQ ID NO:12))。可变重链域的最N-端的氨基酸(即，在H0，H1， H2和H3形式中的谷氨酸和在H4，H5，和H6形式中的天冬氨酸)可能直接 接触抗原，并影响结合亲和力。在Kabat位置49的隐蔽残基可能影响重链 CDR2的构象(在H0，H1，H2和H3形式中的丝氨酸和在H4，H5，和H6 形式中的丙氨酸)。在Kabat位置93的残基可能影响重-轻链配对(在H0，H1， H2和H3形式中的丙氨酸和在H4，H5，和H6形式中的苏氨酸)。将CDR H1， H2和H3区中不同于鼠24F4 CDR H1，H2和H3的氨基酸残基加上阴影。
H0形式
Figure BDA0002495922490000831
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC AAGGGACTGGAGTGGGTCTCTGCTATTAGTGGTAGCGGAGGTAGTACATACTATGCAGACAGT GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATGAAC AGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCTCGAGATATCTACTATAATTACGGA GCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC(SEQID NO:41) (pYL742)
H1形式
Figure BDA0002495922490000832
Figure BDA0002495922490000842
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC AAGGGACTGGAGTGGGTCTCTACCATTAGTCCAGGAGACAGTTTCGGATACTATCCAGACAGT GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATGAAC AGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCTCGAGATATTTACTATAATTACGGA GCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC(SEQID NO:43) (pYL743)
H2形式
Figure BDA0002495922490000841
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC AAGGGACTGGAGTGGGTCTCTACCATTAGTCCAGGAGACAGTAGCACTATCTACTATGCAGAC AGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATG AACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCCGAGATATTTACTATAATTAC GGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC(SEQ ID NO:45) (pYL744)
H3形式
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISPGDSFGYYYPD SVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:46)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC TGCGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC AAGGGACTGGAGTGGGTCTCTACCATTAGTCCAGGAGACAGTTTCGGCTACTACTATCCAGAC AGTGTGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATG AACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCCGAGATATTTACTATAATTAC GGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC(SEQ ID NO:47) (pYL745)
H4形式
dVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVaTISPGDSFGYYYPD SVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCtRDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:24)
GACGTCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC TGCGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC AAGGGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTCCAGGAGACAGTTTCGGCTACTACTATCCAGAC AGTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATG AACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCCGAGATATTTACTATAATTAC GGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC(SEQ ID NO:48)(pYL746)
H5形式
dVQLVqSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVaTISPGDSFGYYYPDSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNrLRAEDTAVYYCtRDIYYNYGAWFAYWGrGTLVTVSS(SEQ ID NO:49)
GACGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC TGCGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC AAGGGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTCCAGGAGACAGTTTCGGCTACTACTATCCAGAC AGTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATG AACAGGCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCCGAGATATTTACTATAATTAC GGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCAGAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC(SEQ ID NO:50) (pYL747)
H6形式
Figure BDA0002495922490000851
以下显示了H0至H6形式的氨基酸序列的比对:
Figure BDA0002495922490000852
Figure BDA0002495922490000861
三种人源化的24F4轻链(huIGKV1-13*02框架/24F4 VL CDR)和它们的相 应的DNA序列的实例如下所示。每个轻链中的CDR 1、2和3以所述的顺序加 下划线。突出显示了Ser91(依照Kabat编号方式)，其已在所有轻链中被取代 成Cys91。轻链可变域的最N-端的氨基酸(即，在L0形式中的丙氨酸和在L1 及L2形式中的天冬氨酸)可以直接接触抗原，并影响结合亲和力。框架回复 突变显示为小写加粗字体。第一形式(L0)包含最少回复突变且第三形式(L2) 包含最多回复突变(即最少“人源化”)。
L0形式
Figure BDA0002495922490000862
GCTATTCAGCTGACCCAATCTCCATCCTCTTTGTCCGCCTCTGTGGGGGACAGG GTCACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTAT ATGAACTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTACGCT GCATCCACTCTCGAGTCTGGGGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACAATCAGCTCACTCCAGCCAGAGGATTTCGCAACCTAT TACTGTCAGCAAAGCAACGAGGATCCTCGGACGTTCGGTCAGGGCACCAAAGTG GAAATCAAG(SEQ ID NO:55)(pYL729)
L1形式
Figure BDA0002495922490000871
GACATTCAGCTGACCCAATCTCCATCCTCTTTGTCCGCCTCTGTGGGGGACAGG GTCACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTAT ATGAACTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTACGCT GCATCCACTCTCGAGTCTGGGGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACAATCAGCTCACTCCAGCCAGAGGATTTCGCAACCTAT TACTGTCAGCAAAGCAACGAGGATCCTCGGACGTTCGGTCAGGGCACCAAAGTG GAAATCAAG(SEQ ID NO:57)(pYL730)
L2形式
Figure BDA0002495922490000872
GACATTCAGCTGACCCAATCTCCATCCTCTTTGTCCGTCTCTGTGGGGGACAGG GCAACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTAT ATGAACTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTACGCT GCATCCACTCTTGAGTCTGGGGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACAATCAGCTCAGTGCAGCCAGAGGATTTCGCAACCTAT TACTGTCAGCAAAGCAACGAGGATCCTCGGACGTTCGGTCAGGGCACCAAAGTG GAAATCAAG(SEQ ID NO:59)(pYL731)
以下显示了L0至L2形式的氨基酸序列的比对：
Figure BDA0002495922490000873
Figure BDA0002495922490000881
以上人源化VH和VL氨基酸序列不含任何潜在的N-连接的糖基化位点 或Asn-Gly脱酰胺位点。在种系序列中观察了VH和VL域两者中的甲硫氨酸， 并且其不是表面暴露的，因此甲硫氨酸氧化的风险似乎是最小的。
蛋白质的溶解度可以与它们的pI相关。使用在Bjellqvist等人，(Electrophoresis,14:1023-31(1993)；Electrophoresis,15:529-39(1994))中的 氨基酸的pK计算设计的构建体的pI。使用人IgG1重链计算下面所示的值。每 个人源化抗体具有显著高于7的pI，因此，预期在中性pH具有显著的正电荷。 表中的每个条目是完整的组合抗体的计算pI值，括号中是净电荷。
分子 计算的pI(净电荷)
嵌合24F4 6.94(-2)
人源化H4L1 7.26(0)
实施例5：Hx/L1对BDCA2的结合
通过共转染重链和轻链质粒在293E细胞中瞬时表达hu24F4重链和轻链 的全部21个可能的变体(如实施例4所述)和ch24F4。装配和分泌了hu24F4的所 有形式，滴度超过了ch24F4的滴度(通过Octet结合抗人Fc尖端通过定量在条 件化培养基中的mAb测定)。相对于ch24F4，嵌合和人源化24F4 mAb的非还 原性SDS-PAGE分析的Western印迹没有显示大体聚集或明显剪切的证据。
在经稳定转染的共表达全长BDCA2和FcεRIγ(人或食蟹猴)的cDNA(相 关表达载体是人类BDCA2/FcεRIγ:pEAG2456，食蟹猴BDCA2/FcεRIγ: pEAG2668)的DG44 CHO细胞上通过直接结合FACS测定了条件化培养基。在 与表面人或食蟹猴BDCA2的直接结合中，对hu24F4的H0，H1和H2系列观察 到结合的完全丧失，对hu24F4的H3系列观察到结合亲和力的显著丧失，对 hu24F4的H4和H5系列两者观察到亲和力的良好保留，并且对hu24F4变体的H6系列观察到结合中度丧失(图2和3)。基于直接结合FACS的分析中的滴度 和表观EC50值，确定H4/L1和H5/L1为hu24F4的“最好”变体。
通过Octet测定了含有ch24F4和所有hu24F4变体mAb的条件化培养基与 人BDCA2胞外域的结合。通过蛋白水解切割自纯化的muIgG2a Fc-huBDCA2 融合蛋白(相关质粒：pEAG2423)制备单体huBDCA2胞外域。使来自瞬时转 染细胞的条件化培养基的抗体结合到抗人Fc尖端，然后单体huBDCA2流过 Octet尖端，来检查结合和解离。hu24F4变体的H4和H5系列显示了对 huBDCA2的最好的亲和力。
样品名称 KD(M) 结合速率(kon)(1/Ms) 解离速率(kdis)(1/s)
H6/L0 5.00E-09 2.73E+05 1.37E-03
H0/L1 9.50E-11 1.00E+05 9.50E-06
H1/L1 5.03E-11 1.00E+05 5.03E-06
H2/L1 3.35E-11 1.00E+05 3.35E-06
H3/L1 1.30E-08 4.52E+05 5.86E-03
H4/L1 7.44E-10 5.49E+05 4.08E-04
ch24F4 2.17E-09 1.61E+06 3.49E-03
5C8对照 2.51E-14 1.00E+05 2.51E-09
实施例6：增强hu24F4亲和力
为了探查通过在24F4形式L1 CDR L3未配对的半胱氨酸的位置上的取 代(在hu24F4轻链表达载体pYL740中的C95S)增强hu24F4亲和力的可能性， 通过定点诱变构建许多形式L1变体。通过定点诱变构建到未配对半胱氨酸 (即S95C)的回复突变，产生质粒pYL749。通过定点诱变构建变体S95T，S95A 和S95V，分别产生质粒pYL750，pYL751，和pYL752。通过DNA测序证实 在所得质粒中的全长轻链cDNA序列。通过共转染hu24F4 H4重链pYL746或 hu24F4 H5重链pYL747与hu24F4 L1变体轻链C95S pYL740，S95C pYL749， S95TpYL750，S95A pYL751或S95V pYL752质粒在293E细胞中瞬时表达C95 变体hu24F4mAb。转染后2天收获条件化培养基。所有变体的滴度(在抗人Fc 尖端上通过Octet测定)相似，并且非还原SDS-PAGE的Western印迹指示没有 大体聚集或明显的剪切。通过Octet测定含有C95变体mAb的条件化培养基与 人BDCA2胞外域的结合。使来自瞬时转染细胞的条件化培养基的抗体结合到 抗人Fc尖端，然后单体huBDCA2流过Octet尖端，来检查结合和解离。C95A 变体具有最慢的解离速率。
Figure BDA0002495922490000901
基于这些结果，产生了用于hu24F4 H4/L1 C95T和C95A变体以及H5/ L1 C95T和C95A变体(其具有最慢的表观解离速率)的稳定CHO细胞系。对 纯化的hu24F4 mAb重复进行Octet结合研究。将hu24F4 H4/L1 C95A变体 选择为前导候选者。将质粒pYL746(hu 24F4H4重链)和pYL751((hu 24F4 L1 轻链)的序列用于重新编码和构建表达载体，用于CHO产生细胞系生成。
由pYL751编码的推导的成熟hu24F4 L1 C95A轻链氨基酸序列如下所 示(对CDRL1，CDR L2和CDR L3加下划线)：
Figure BDA0002495922490000902
由pYL746编码的推导的成熟hu24F4 hulgG1重链氨基酸序列如下所示 (对CDRH1，CDR H2，和CDR H3加下划线)：
Figure BDA0002495922490000903
Figure BDA0002495922490000911
由上文列出的成熟重链(SEQ ID NO:4)和成熟轻链(SEQ ID NO:3)组成的 抗体称作BIIB059。
实施例7：重新编码重链和轻链基因
为潜在地改善表达，在不改变氨基酸序列的情况下重新编码轻链和重链 基因的核苷酸序列。用于抗BDCA2轻链基因的经修饰的DNA序列如下所示。 氨基酸1-240含有轻链序列。氨基酸1-22(小写的核苷酸)包含天然的轻链信号 肽。成熟N端开始于第23位氨基酸(D)。
Figure BDA0002495922490000912
Figure BDA0002495922490000921
用于抗BDCA2重链基因的经修饰的DNA序列如下所示。氨基酸1至470 含有重链序列。氨基酸1-19(小写的核苷酸)包含天然的重链信号肽。成熟N 端开始于第20位氨基酸(D)。
Figure BDA0002495922490000922
Figure BDA0002495922490000931
Figure BDA0002495922490000941
实施例8：表达盒和载体
将重链基因和轻链基因切出并连接到单独的表达载体中。每个基因处于 人巨细胞病毒立即早期启动子和人生长激素基因的聚腺苷酸化序列的转录 控制下。
表达轻链的质粒pJP009还包含用于新霉素磷酸转移酶基因(neo)的表达 盒，其含有鼠磷酸甘油酸激酶(muPGK)早期启动子和muPGK多聚腺苷酸化序 列(图4)。表达重链的质粒pJP010还包含dhfr基因的表达盒，其用作选择和甲 氨蝶呤可扩增标记。质粒pJP009和pJP010的主要特征总结如下。
Figure BDA0002495922490000942
Figure BDA0002495922490000951
缩写：人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)，早期猴病毒40(SV40E)，鼠磷酸甘 油酸激酶(muPGK)，人生长激素(hGH)，新霉素磷酸转移酶基因(G418抗性)， 二氢叶酸还原酶基因(dhfr)，对氨苄青霉素抗性的细菌基因(β-内酰胺酶)。
质粒pJP009的完整核苷酸序列显示如下。三个可读框是24F4轻链，新霉 素磷酸转移酶和β-内酰胺酶。
Figure BDA0002495922490000952
Figure BDA0002495922490000961
Figure BDA0002495922490000971
Figure BDA0002495922490000981
质粒pJP010的完整核苷酸序列(图5)显示如下。三个可读框是24F4重链， 鼠二氢叶酸还原酶和β-内酰胺酶。
Figure BDA0002495922490000982
Figure BDA0002495922490000991
Figure BDA0002495922490001001
Figure BDA0002495922490001011
Figure BDA0002495922490001021
实施例9：构建细胞系
使用的宿主细胞是中国仓鼠卵巢二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷的宿主细胞 系CHO-DG44。在使用之前已经测试了DG44宿主细胞库，并且发现在偶发 媒介物的存在方面呈阴性。将DG44宿主(CER-00-05-01)用于构建表达抗 BDCA2的细胞系。
通过电穿孔分别将表达抗BDCA2的重新编码的轻链和重链的质粒 pJP009和pJP010转染到宿主细胞系中。使用缺乏α核苷的培养基选择表达dhfr 的经转染的细胞。在上述的无αMEM核苷的培养基中选择后，用荧光激活细 胞分选和Genetix Clonepix FL仪(CER-00-09-03)的组合对仅转染的集合富集 高表达细胞系。将通过ClonePix FL分离的细胞集落从半固体培养基挑取到96 孔板上。扩充各个孔并评估生产力。将在摇瓶分批补料分析中显示出最高滴 度的细胞系(#49)转移到研究动物发酵(Research AnimalFermentation)以在10L生物反应器中生长，从而产生用于表征的物质。
在起始的细胞系筛选后，选择最高生产的细胞系用于扩增。将最高的细 胞系进行甲氨蝶呤(MTX)扩增。使用有限稀释(以每孔0.5个细胞的理论密度) 将扩增集合亚克隆到384孔板中。用Cellavista仪(Innovatis)在每个的单细胞存 在方面对384孔板的各个孔成像，并证实是克隆的。
基于按比例缩小的补料分批摇瓶和产品质量分析选择前四种经扩增的 克隆细胞系。从在生物反应器中评估的这前4种细胞系制备Pre-Master Cell Banks(Pre-MCB)。基于生物反应器性能和产品质量分析选择一个前导(lead) 亚克隆。将前导细胞系的Pre-MCB小瓶转移到主细胞库产生制备 (Manufacturing for Master Cell Bank generation)。
实施例10：抗BDCA2抗体BIIB059的翻译后修饰
a)氧化
抗BDCA2 BIIB059抗体的Endo-Lys C肽定位揭示了重链Met-257、 Met-433和Trp-163是易于氧化的位点。水平范围为4％至7％。实验数据表明， 许多氧化与样品制备有关。
b)脱酰胺
BIIB059抗体的Endo-Lys-C肽图的分析显示，重链中各约2.5％的 Asn-389、Asn-394和Asn-395是脱酰胺的(复合的脱酰胺和琥珀酰亚胺形成)， 并且重链中约2.5％的Asn-320是脱酰胺的(以琥珀酰亚胺形式)。在轻链中， Asp-32和Asp-34的琥珀酰亚胺形式的总量为约3％。在轻链中，Asp-32和 Asp-34的组合异构化为约5％。与氧化相似，这些修饰中的一些可以与样品制 备有关。
c)糖化(Glycation)
糖化是由蛋白质上氨基与培养基的组分葡萄糖反应引起的非酶促修饰。 糖化是在蛋白质中常规检测的，并且水平随细胞培养条件而广泛变化。在 BIIB059抗体中，如通过非还原性蛋白质的完整质量分析测定的糖化水平为 约10％。肽定位分析显示轻链的Lys-107上约0.46％的糖化，轻链的Lys-103 上0.28％的糖化和在O-连接的重链的Lys-295上约0.2％的糖化。
d)糖基化
BIIB059没有可检测的O-连接的的糖基化。
e)其他修饰(例如羟赖氨酸等)
分析显示BIIB059抗体的<1％的重链是无糖基形式。分析显示，在抗体 中没有Asn到Ser的取代，并且抗体中没有≥1％水平的未知修饰或突变。
实施例11：BIIB059与浆细胞样树突细胞的细胞表面的直接结合
开发了全血流式细胞测定法来评估BIIB059与人或食蟹猴浆细胞样树突 细胞(pDC)上的BDCA2的结合。将食蟹猴(Toxikon,Inc,Bedford,MA)或人外 周血(Biogen Idec)收集在肝素钠收集管中，并保持在室温。将用于鉴定pDC 的FACS染色抗体混合物加入到掺入了CD20，CD14，CD123和HLA-DR 抗体的每个全血等分试样中。将经Alexa647标记的BIIB059(Biogen Idec, Lot#17073-057)或经Alexa647标记的hIgG同种型对照以0至40μg/mL的浓 度加入到FACS染色混合物中。将血液在冰上在避光情况下温育30分钟。 30分钟后，用已在37℃温育至少1小时的10mL(食蟹猴)或2mL(人)的1X Easy Lyse Buffer(LeincoTechnologies)处理每500μL的全血(食蟹猴)或 100μL(人)等分试样。在室温下温育10-15分钟后，在1400rpm离心样品5 分钟。倒出上清液，仅留下白细胞(WBC)沉淀物。用5mL的FACS缓冲液(在 PBS中，1％BSA+0.002％叠氮化钠(NaAzide)+1mM CaCl2+1mM MgCl2) 洗涤每个WBC沉淀物，并以1400rpm离心5分钟。倾出上清液，将每个 WBC沉淀物重悬浮于200μL的FACS缓冲液中，并转移到96孔圆底板(Fisher Scientific)。以1400rpm离心该板5分钟。将上清液倾倒出板，并且用200μL FACS缓冲液洗涤每个WBC沉淀物。以1400rpm离心该板5分钟，并将上 清液倾倒出该板。在洗涤(如上述)后，将WBC重悬在200μL的含有1％多聚 甲醛(PFA)的PBS中，并在4℃避光固定过夜。用60微米尼龙筛网过滤板 (Millipore公司)过滤WBC，之后立即进行流式细胞术分析。然后将每个沉淀 物转移到新的96孔圆底板中，并以1400rpm离心5分钟。将每个WBC沉 淀物重悬浮于250μL的FACS缓冲液中，并且在LSRII 4色FACS仪上测量 荧光强度。使用抗鼠Ig Compensation Particle珠组(BD Biosciences)获得单色 补偿。使用FlowJo和GraphPad Prism软件进行分析。BIIB059以1-2μg/mL (7-13nM)的EC50类似地结合食蟹猴和人细胞(图6)。
实施例12：评估BIIB059的自身缔合
AlphaScreen测定法是利用谷胱甘肽供体和受体珠(Perkin Elmer)结合人FcRIIa(CD32a)GST进行的均质接近测定法(homogeneous proximity assay)。将 待测试的不同浓度的抗体加入到混合物中。由于抗体与FcRIIa的结合是单价 的，将产生信号的唯一方式是，如果供体和受体珠均具有一个结合的抗体， 然后所述结合的抗体缔合，使珠在200nm内，从而允许生产生单线态氧和随 之而来的光发射。通过Envision(Perkin Elmer)仪检测的发射水平与自身缔合 的程度成比例。
图7显示了与5c8(阴性对照)和LT105(具有强的自身缔合的阳性对照)相 比，BIIB059的Alpha Screen结果。
实施例13：评估BIIB059的非特异性结合
交叉相互作用层析(Cross-interaction chromatography，CIC)是一种用于初 步评估mAb候选者的粘性的高通量方法(Jacobs等人，Pharm Res.,27(1):65-71 (2010))。在该方法中，将大批多克隆人IgG以化学方法偶联到NHS活化的层 析树脂上。然后将BIIB059在非衍生化的和IgG衍生化的柱上的保留时间与 表现良好的和表现不佳的mAb的对照组比较。根据此方法，BIIB059没有显 示非特异性结合的证据，如通过其低保留时间和K’值证明的。
显示溶解度和非特异性结合的CIC数据
Figure BDA0002495922490001051
实施例14：评估BIIB059的稳定性
将差示扫描荧光分析法用于测试BIIB059在用于初始研究制剂的一定范 围的缓冲液条件里的稳定性。在Mx3005p实时PCR系统(Agilent Technologies) 上使用50μL PBS(pH为7.0)中的10μg蛋白质以96孔形式监测了蛋白质的 解折叠，所述PBS补充有10X(基于1000X的Invitrogen储液名称)终浓度的 SYPRO橙荧光团。以1℃/min将样品从25℃加热至95℃，每1℃测量荧光 强度3次。将荧光强度以温度的函数绘图。通过选取负导数(negativederivative)(在Mx3005p软件中“-R’(T)”)，并选择导数图(derivative plot)的 局部最小值，从这些曲线推导出Tm。使用20mM柠檬酸钠的基础缓冲液， 将pH从5.0改变至7.5，将NaCl和蔗糖的浓度从50mM改变至250mM。
稳定性贯穿这些缓冲液的范围是相似的。图8显示出用150mM NaCl和 250mM蔗糖作为pH函数得到的数据。相对于蔗糖，选择20mM柠檬酸钠、 150mM NaCl pH 6.0作为研究制剂，这是由于利用研究离心浓缩器用蔗糖难 以达到高浓度。
实施例15：评估BIIB059的搅拌稳定性
在室温下使用设置于600rpm的Lab-Line Instruments 4626型Titer PlateShaker，在2mL玻璃小瓶(Waters,WAT270946C)中往复振动(reciprocal shaking) 在20mM柠檬酸钠，pH6.0，150mM氯化钠中的0.2mL体积的1mg/mL BIIB059 mAb溶液。通过使用Beckman DU640分光光度计在320nm处监测 浊度的增加来评估聚集。BIIB059显示时间依赖性聚集。通常，野生型人IgG1 抗体在这些搅拌条件下不聚集。如图9所示，通过加入0.03％Tween 80(一 个常用的制剂赋形剂)完全抑制了聚集。搅拌诱导的聚集有时可以是高度依赖于pH的。无糖基的IgG4/IgG1比BIIB059显示更快速且更广泛的聚集。 添加Tween 80也抑制无糖基IgG4/IgG1的聚集。
实施例16：评估BIIB059的粘度
在150mg/mL及更大的高浓度下测量BIIB059样品的稳定性和粘度，以 支持用于皮下施用的产品的潜在开发。在超速离心管中离心BIIB059溶液， 以限制体积，并且通过UV扫描测定实现的浓度。在2-8℃储存一周和两周 后通过大小排阻层析测定稳定性。对在20mM柠檬酸盐，pH 6，150mM NaCl 缓冲液中的少量蛋白质容易地实现大于200mg/mL的蛋白质浓度并且聚集 体在2-8℃两周后仍然较低(0.68％)。使用Viscopro2000仪(CambridgeViscosity) 测定粘度。在柠檬酸盐/盐水缓冲液中，在150mg/mL时的粘度仅为8cP。 这些结果表明，BIIB059的高浓度制剂应该是可实现的。
实施例17：克隆人类BDCA2基因
将全长人类BDCA2(huBDCA2)cDNA亚克隆到来自Open Biosystems 的InvitrogenpCR4TOPO克隆载体中：将此质粒命名为pEAG2367。DNA测 序证实它的cDNA等同于在参照Genbank登录号NM_130441中的全长人类BDCA2的cDNA。pEAG2420编码的huBDCA2全长可读框如下所示，对 TM-HMM预测的跨膜域加下划线：
Figure BDA0002495922490001071
如下显示了pEAG2413编码的huFcεRIγ全长可读框，其等同于Genbank 登录号NP_004097中的参照序列：
Figure BDA0002495922490001072
通过将来自pEAG2413的2.11kb SpeI片段亚克隆到pEAG2420的线性 化的、经磷酸酶处理的6.71kb的SpeI载体主链中，得到称作pEAG2456的 “univector”，来构建在串联转录单位中共表达人类BDCA2和FcεRIγ cDNA 两者的CHO表达载体。对pEAG2420中的人类BDCA2和FcεRIγ cDNA进 行序列确认。通过用pEAG2456转染产生稳定共表达BDCA2和FcεRIγ cDNA 的稳定CHO细胞系。
实施例18：克隆食蟹猴和恒河猴BDCA2基因
通过pEAG2384编码的推导的食蟹猴BDCA2可读框和在pEAG2383中 观察到的SNP形式之一如下所示。下面将这种SNP形式称为食蟹猴BDCA2 的E73 SNP形式。在恒河猴中，观察到与食蟹猴BDCA2的E73 SNP形式相 同的单个序列。
Figure BDA0002495922490001073
在食蟹猴BDCA2的第二个SNP形式中，以上突出显示的残基 73(GAA＝Glu，E)是赖氨酸(AAA＝Lys，K)。将此第二个SNP形式称为食蟹 猴BDCA2的K73 SNP形式。在人类BDCA2中，残基73是谷氨酸。下文 显示了在人类(上部)和食蟹猴(下部)BDCA2序列的有缺口比对，这两种序列 共享90.6％的同一性。将潜在的N-连接的糖基化位点加上阴影。食蟹猴 BDCA2缺少人中存在的一个潜在的N-连接的糖基化位点(在人类中的 137-139处的NSS对比在食蟹猴中的NSA)。
Figure BDA0002495922490001081
共有的食蟹猴FcεRIγ可读框如下所示：
Figure BDA0002495922490001082
食蟹猴FcεRIγ cDNA序列与以下序列完全匹配:在Genbank登录号 XM_001115585中描述的预测的恒河猴cDNA(基于基因组短读出)和由 Genentech的科学家以Genbank登录号AF485816保藏的食蟹猴序列。食蟹 猴FcεRIγ蛋白序列与人类FcεRIγ蛋白共享98.9％的同一性，区别仅在于单 个保守取代。人类(上部)和食蟹猴(下部)FcεRIγ之间的比对如下：
Figure BDA0002495922490001083
Figure BDA0002495922490001091
通过将来自pCN652的2.11kb SpeI片段亚克隆到pCN654的线性化的， 经磷酸酶处理的6.72kb的SpeI载体主链中，得到称作pEAG2668的 “univector”，来构建在串联转录单位中共表达食蟹猴BDCA2的E73 SNP 形式和FcεRIγcDNA的CHO表达载体。对在pEAG2668中的食蟹猴BDCA2 和FcεRIγ cDNA进行序列确认。通过用pEAG2668转染产生稳定共表达BDCA2和FcεRIγ cDNA的稳定CHO细胞系。
实施例19：人与食蟹猴BDCA2之间的交叉反应性
为确定食蟹猴E73/K73 BDCA2 SNP是否影响抗BDCA2的结合，用携 带EGFP报道基因(pEAG1458)和BDCA2和FcεRIγ cDNA(人类BDCA2: pEAG2420和FcεRIγ:pEAG2413；食蟹猴E73 BDCA2:pCN652或K73 BDCA2:pCN656和食蟹猴FcεRIγ:Pcn652)的表达载体以1:1:1的摩尔比共转 染293E细胞。转染后3天，收获细胞并在直接结合稀释滴定FACS中用PE 缀合的Miltenyi抗人BDCA2 AC144 mAb(Miltenyi Biotec目录号130-090-511) 染色细胞，门控绿色EGFP阳性细胞。图10显示了AC144与人类和食蟹猴 猴表面BDCA2的直接结合。
人类BDCA2和食蟹猴BDCA2的E73和K73 SNP形式两者的表观EC50 基本上等同。鉴于这种结果，使用人BDCA2/FcεRIγ表达载体pEAG2456和 食蟹猴E73 SNP BDCA2/FcεRIγ表达载体pEAG2668产生针对表面全长 BDCA2的CHO稳定转染子。将这些系用于人/食蟹猴交叉反应性抗BDCA2 抗体的分类(triage)。
实施例20：人和食蟹猴BDCA2胞外域的Fc融合构建体
工程化改造人类和食蟹猴BDCA2 ECD的5种Fc融合构建体。在三个 构建体中，BDCA2经由G4S接头序列与人IgG1铰链和Fc的C-端连接。在 两个构建体中，G4S接头替换为TEV蛋白酶切割位点ENLYFQC。
由于BDCA2是II型膜蛋白(C端在细胞外)，可溶性Fc融合蛋白的设计 包括将BDCA2的C端胞外域(人类BDCA2的残基45-213)添加到工程化IgG Fc的C端，其中分泌由符合读码框的鼠κ轻链的信号序列驱动。将全长 huBDCA2构建体pEAG2367用作模板以使用引物5'CAGTGT CTG TTT CAC TCC CGG GGG TGG CGG TGG TAG CAA TTT TAT GTA TAG C 3' (SEQ IDNO:74)(直接在huBDCA2胞外域5’端之前添加5'XmaI(Pro-Gly)和 Gly4Ser接头)和5'CCAGGG AGA ATA GGA TCC TTA TAT GTA GAT CTT 3'(SEQ ID NO:75)(直接在huBDCA2终止子之后添加3'BamHI位点)进行 PCR。纯化0.56kb的PCR产物，并亚克隆到Invitrogen的pCRBluntIITOPO 克隆载体中，产生pEAG2417，其插入物cDNA序列得到了证实。将来自pEAG2417的0.53kb的XmaI-BamHI片段和来自pEAG1397的0.75kb的 NotI-XmaI片段(携带工程化huIgG1 Fc，其分泌由符合读码框的工程化鼠κ 轻链的信号序列驱动)与来自表达载体pV90的1.89kb的BamHI-XbaI和4.17 kb的XbaI-NotI载体主链片段连接，产生huIgG1 Fc-huBDCA2融合蛋白表 达载体pEAG2421，其cDNA插入物序列得到确认。通过pEAG2421编码的推导的可读框显示如下：
Figure BDA0002495922490001101
κ轻链信号序列：上面的残基1-19(斜体)
人IgG1 Fc：上面的残基20-250
G4S接头：上面的残基251-255(加粗)
huBDCA2胞外域：上面的残基256-424(加下划线)
为了构建用于muIgG2a Fc-huBDCA2融合蛋白的表达载体，将来自 pEAG2417的0.53kb的XmaI-BamHI片段和来自pEAG1442的0.75kb的 NotI-XmaI片段(携带工程化的鼠IgG2a Fc，其分泌由符合读码框的工程化鼠 κ轻链的信号序列驱动)与来自表达载体pV90的1.89kb的BamHI-XbaI和 4.17kb的XbaI-NotI载体主链片段连接，产生pEAG2423，其cDNA插入物 序列得到确认。通过pEAG2423编码的推导的可读框显示如下：
Figure BDA0002495922490001111
κ轻链信号序列：上面的残基1-19(斜体)
鼠IgG2a Fc：上面的残基20-251
G4S接头：上面的残基252-256(加粗)
huBDCA2胞外域：上面的残基257-425(加下划线)
通过用表达载体pEAG2421和pEAG2423转染产生了生产Fc-huBDCA2 融合蛋白的稳定CHO细胞系。在ELISA和Octet结合测定中使用这些融合 蛋白，用于在候选物筛选期间的抗体分类。
为工程化改造食蟹猴(cyno)BDCA2以制备Fc融合蛋白，使用引物5' CTC TGT GTCTGT TTC ACT CCC GGG GGT GGC GGT GGT AGC AAT TTT ATG TAT AGC 3'(SEQ ID NO:78)和它的反向互补物对构建体pCN648 中的食蟹猴BDCA2的全长E73 SNP变体进行定点诱变，以直接在huBDCA2 胞外域的5'端之前添加5'XmaI(Pro-Gly)和Gly4Ser接头，产生了构建体pEAG2675，其cDNA插入物序列得到了确认。为了构建用于muIgG2a Fc- 食蟹猴BDCA2融合蛋白的表达载体，将来自pEAG2675的0.53kb XmaI-BamHI片段和来自pEAG1442的0.75kbNotI-XmaI片段(携带工程化 的鼠IgG2a Fc，其分泌由符合读码框的工程化鼠κ轻链的信号序列驱动)与 来自表达载体pV90的1.89kb BamHI-XbaI和4.17kb的XbaI-NotI载体主链 片段连接，产生pEAG2677，其cDNA插入物序列得到了确认。通过pEAG2677 编码的推导的可读框显示如下：
Figure BDA0002495922490001121
κ轻链信号序列：上面的残基1-19(斜体)
鼠IgG2a Fc：上面的残基20-251
G4S接头：上面的残基252-256(加粗)
食蟹猴BDCA2胞外域：上面的残基257-424(加下划线)
通过用表达载体pEAG2677转染产生了生产Fc-食蟹猴BDCA2融合蛋 白的稳定CHO细胞系。
将muIgG2a Fc-BDCA2融合蛋白进行有限的蛋白水解，以分离单体 BDCA2胞外域蛋白。为促进重组可溶的BDCA2胞外域的分离，构建了新 的Fc融合构建体，其中在Fc的C-端和BDCA2胞外域的N端之间插入了 TEV蛋白酶切割位点。设计了合成基因(Syngene)并作为在其专用的 pUC57-amp克隆载体中的XmaI-BamHI插入物通过GeneWiz递送，所述合 成基因携带工程化人或食蟹猴BDCA2胞外域，具有用于融合至Fc C端的 5'XmaI位点(Pro-Gly)，之后是融合至BDCA2序列的残基45的符合读码框 的TEV切割位点(ENLYFQG)，和BDCA2终止子后的3'BamHI位点。证实 了在工程化XmaI-BamHI TEV-BDCA2胞外域cDNA构建体pEAG2917(人)和pEAG2918(食蟹猴)中的插入物的序列。为构建用于huIgG1 Fc-TEV-BDCA2融合蛋白的基于pV90-IRES-dhfr-的CHO表达载体，将来自 pEAG1397的0.75kb NotI-XmaI片段和来自pEAG2917或pEAG2918的0.54 kb XmaI-BamHI片段亚克隆到pXJC194的5.4kb BglII-NotI载体主链片段中， 产生pEAG2937(FC-huBDCA2)或pEAG2938(Fc-食蟹猴BDCA2)。在 pEAG2937和pEAG2938中的插入物cDNA是序列确认的。通过用pEAG2937 和pEAG2938转染产生稳定的CHO细胞系。由pEAG2937编码的 huFc-TEV-huBDCA2融合蛋白的推导的可读框显示如下：
Figure BDA0002495922490001131
κ轻链信号序列：上面的残基1-19(斜体)
人IgG1 Fc:上面的残基20-250
TEV切割位点：上面的残基251-257(加粗)
huBDCA2胞外域：上面的残基258-426(加下划线)
由pEAG2938编码的huFc-TEV-食蟹猴BDCA2融合蛋白的推导的可读 框如下所示：
Figure BDA0002495922490001132
Figure BDA0002495922490001141
κ轻链信号序列：上面的残基1-19(斜体)
人IgG1 Fc:上面的残基20-250
TEV切割位点：上面的残基251-257(加粗)
食蟹猴BDCA2胞外域：上面的残基258-425(加下划线)
实施例21：BIIB059与BDCA2-Fc融合蛋白的结合
通过SEC评估了BIIB059结合溶液中的huBDCA2-Fc的能力(图11)。 当单独分析时，BIIB059(上图)和huBDCA2(中图)以具有约150kDa分子量的 单尖峰洗脱。当将BIIB059和huBDCA2-Fc混合在一起并分析(下图)时， BIIB059和huBDCA2-Fc偏移到>550kDa的更高分子量，这根据在层析谱中 它们在较前面的位置洗脱是明显的。推测洗脱峰的异质性由以下事实引起： BIIIB059和BDCA2-Fc两者均各含有2个结合位点，因此形成了大量的具有 不同化学计量的BIIB059和BDCA2的复合体。
还通过SEC评估了食蟹猴BDCA2 ECD对BIIB059的结合，并且相似 地其导致了向更高分子量复合体的定量偏移。
实施例22：钙增强了BIIB059与BDCA2的结合
在Octet结合测定中研究了，在钙或EDTA的存在下，BIIB059与融合 至鼠Fc的人BDCA2(huBDCA2-MUFC)的结合。在抗鼠Fc生物传感器上捕 获huBDCA2-MUFC蛋白，随后是BIIB059的缔合和解离步骤。所有步骤在 含有10mM CaCl2或10mM EDTA的50mM HEPES,pH7,100mM NaCl,1 mg/ml BSA,0.02％Tween 20和0.001％的叠氮化物中运行。
图12显示了相对于EDTA，加入钙使BIIB059的结合增强，导致了高 约2倍的信号。钙影响缔合速率和解离速率两者。
实施例23：结合测量
将Octet用于监测BIIB059与BDCA2-Fc融合蛋白和BDCA2 ECD的结 合。图13显示了Octet实验，其中以20μg/mL的浓度将BIIB059装载到抗 人Fc Octet尖端上。对于缔合步骤，以2μg/mL的浓度加入人和食蟹猴 BDCA2 ECD。该实验的缓冲液为50mM HEPES,pH 7,100mMNaCl,5mM CaCl2,1mg/ml BSA,0.02％Tween 20和0.001％的叠氮化物。在这些条件下，BIIB059与人和食蟹猴BDCA2 ECD的结合是相当的。
实施例24：用于确定BIIB059抑制TLR9诱导的IFNα产生的IC50值的PBMC测定
已显示BDCA2结合激活BCR-样信号传导级联，这有力地抑制了pDC 响应于TLR配体而产生I型IFN和其它细胞因子的能力(Cao W.等人，PLoS Biol.,5(10):e248(2007))。使用对TLR9诱导的PBMC的IFNα生成的抑制作 为用于筛选的主要细胞测定。
通过在Ficoll上不连续梯度离心分离来自健康供体的肝素化静脉血的 PBMC，在PBS中洗涤PBMC，并重悬浮于完全培养基(含3％FBS的RPMI) 中。每孔接种1x106个细胞，并在200μL/孔的总测定体积下，在存在范围为 10μg/mL至1pg/mL的BIIB059和24F4A-Agly(BIIB059的Fc削弱形式)，或 同种型对照mAb的剂量下，用10μg/mL的TLR9配体CpG-AODN2216)刺 激细胞。在37℃温育板过夜(18小时)，并收集上清液，以用于在IFNαELISA 测定法(PBL InterferonSource)中评估。根据制造商的方案进行该测定法。测 试BIIB059和24F4A agly的滴度，以确定抑制TLR9诱导的IFNα产生的IC50 值。共12个独立实验给出BIIB059的平均IC50为0.001μg/mL。无糖基化的 mAb是不太有力的，具有0.007μg/mL的平均IC50(图14)。
也测试了用生理学上相关配体，即来自SLE患者的血清刺激后抗 BDCA2 mAb抑制IFNα产生的能力。认为SLE血清通过抗DNA自身抗体 和刺激TLR9的免疫刺激性低甲基化DNA的复合体诱导I型IFN。用来自 SLE患者的血清(由Dr.Gregg Silverman,NYU提供)刺激PBMC，并以1/5的 最终稀释度使用。与BIIB059相差1个氨基酸残基的抗体24F4S H4/L1C95S完全消除了经SLE血清刺激的pDC的IFNα产生(图18)。
实施例25：在全血测定中TLR9诱导的IFNα产生
在TLR9诱导的IFNα产生的全血测定中，也评价了BIIB059的活性。
从健康供体的肝素化静脉抽取全血。在200μl/孔的总测定体积中， BIIB059和24F4A-Agly的剂量范围为10μg/mL至1pg/mL。添加200μg/mL (其确定为对于刺激全血中IFNα产生是最佳的)的CpG-A。在37℃温育板18小时，并且收集上清液以用于IFNαELISA测定(PBL InterferonSource)。根 据制造商的方案进行测定。图15A中显示了进行的6个独立实验的代表性实 验。BIIB059在全血中的TLR9诱导的IFNα测定中的抑制效力类似于在 PBMC测定中看到的效力。除了抑制pDC衍生的细胞因子(IFN-α，IL-6)外， BIIB059治疗也导致一大批细胞因子和趋化因子的抑制(图15C)。
进行了下面的实验，以确定是否与健康志愿者类似，BIIB059可以在来 自SLE患者的全血中抑制TLR9诱导的IFNα产生。为此，在10μg/ml BIIB059 的存在下，用200μg/mlCpGA刺激来自2名SLE患者或2名健康对照的全 血，并且通过ELISA评估了IFNα的产生。具体而言，通过Bioreclamation LLC 经过夜运输提供来自2名SLE患者或2名健康供体的全血。抵达后，用 10μg/mL BIIB059或同种型对照处理血液，用200μg/mL CpG-A刺激，并在 96孔板中分配。在37℃温育板18小时，并收集上清液，以用于IFNαELISA 测定(PBLInterferonSource)。根据制造商的方案进行测定。
如图15B所示，与健康志愿者相比，BIIB059在来自SLE患者的全血中 显示了类似的效力。
实施例26：评估BIIB059介导的对I型干扰素的抑制
使用用合成的TLR激动剂(CpG-A)或更为生理性的刺激物(SLE血清)刺 激的纯化的pDC也证实了BIIB059的抑制活性。也测定了BDCA2交联对其他 pDC衍生的细胞因子(IL-6)的抑制效应。采用多种方法(如定性聚合酶链反应 和ELISA)证实了BIIB059活性。
a)Q-PCR
在人类中存在13个IFNα亚型和单个IFNβ成员。用TLR9激动剂刺激 导致大多数I型IFN的上调(Ito T.等人，Blood,107(6):2423-31(2006))。使用 定性聚合酶链反应(Q-PCR)测定评估了对个别I型IFN基因的抑制。
使用两步磁珠分离方法(MACS试剂盒,Miltenyi Biotec)纯化pDC。在存 在或缺乏增加浓度的BIIB059或10μg/mL同种型对照的情况下，用5μM CPG-A刺激5×104个pDC/孔。总测定体积为200μl/孔。在37℃温育板育18 小时，使用Trizol试剂(Invitrogencorporation)从细胞提取RNA，并使用 RNeasy微型柱(Qiagen Sciences)进一步纯化RNA。从Applied Biosystems Inc 购买所有引物和探针。通过使用序列检测软件(SequenceDetection Software) (Applied Biosystems Inc.)与寡核苷酸标准曲线比较对每个样品测定相对转录 物数量，并且相对于对照(GAPDH)标准化。
用BIIB059处理抑制了测试的所有I型IFN的转录，从而重述了以前使 用抗BDCA2抗体克隆AC144得到的先前数据(Cao W.等人，PLoS Biol., 5(10):e248(2007))。
b)ELISA
在蛋白质水平使用ELISA测试BIIB059对抑制pDC细胞因子的影响。在存 在或缺乏增加浓度的BIIB059或10μg/mL同种型对照的情况下，用5μM CPG-A刺激5x104个pDC/孔。图17中显示了从三个测试的健康供体的代表性 供体测量的分泌性IFNα和IL-6的量。
BDCA2与BIIB059的结合有力抑制了IFNα产生，并且大大降低了通过 CpG-A刺激诱导的IL-6产生。
实施例27：BIIB059介导的受体内在化
已经显示BDCA2与抗BDCA2 mAb(克隆AC144，Miltenyi)的结合快速 诱导受体内在化(Dzionek A.等人，J.Immunol.,165(11):6037-46(2000))。下 面的实验涉及确定BIIB059介导的BDCA2内在化的动力学。
在37℃下用10、1、0.1或0.01μg/mL BIIB059或同种型对照(10μg/ml)处 理人全血达指定的时间，然后在4℃下与经FITC-标记的非交叉封闭性抗 BDCA2单抗(克隆2D6)、抗HLADR、抗CD123、抗CD14和抗CD20一起温育 30’。使用1X Easy-裂解缓冲液(BDBioscience)裂解红血细胞(RBC)并固定剩 余细胞。图19A显示了门控的CD14-CD20-HLA-DR+CD123+pDC的 2D6-FITC染色的平均荧光强度(MFI)值。FMO(荧光-1对照)由减去2D6-FITC的FACS染色混合物组成。在该图中的数据是进行的3个独立实验中的1个代 表性实验。
如图19A所示，在与1μg/ml的BIIB059一起温育后，经FITC标记的 2D6染色的强度在37℃温育1小时内迅速降低，达到背景水平。低10倍的 BIIB059浓度(0.1μg/ml)影响胞吞作用的动力学，从而使其延缓2小时。这表 明BDCA2在结合BIIB059时以剂量依赖性动力学被内在化。
进行以下实验以确定BIIB059介导的受体内在化是否影响IFN抑制。从 健康供体的肝素化静脉血收集全血，并与BIIB059(以允许受体内在化)或同 种型一起预温育指定的持续时间。在预温育后的每个时间点，用200μg/mL CpGA攻击细胞并在37℃再温育18小时。收集上清液以用于IFNαELISA测 定(PBL InterferonSource)。根据制造商的方案进行测定。图19B是进行3次 独立实验中的1个代表性实验。如图19B所示，在刺激之前与BIIB059一起 预温育9小时后(对应于最大内在化)不影响IFN抑制，这提示BDCA2胞吞 作用和TLR9抑制是潜在关联的。为了检验这一假设，使用了抗BDCA2 mAb， 其不能介导IFN抑制并证明缺少内在化。此外，我们以前曾显示，对于抗 BDCA2介导的IFN抑制，二价结合是必需的。事实上，Fab片段并没有导 致内在化或IFN抑制。总之，这些数据提出了BDCA2介导的TLR9抑制需要胞吞作用和定位到到含有TLR9的内体区室的可能性。可以使用实时成像 跟踪在BIIB059结合后BDCA2内在化和在细胞中的运输来测试这个假设。
实施例28：抗体效应器功能
BIIB059的Fc域是完全糖基化的人IgG1，并且能够结合细胞Fcγ受体和补 体，并通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)两者诱 导细胞效应器免疫细胞应答。为了确认BIIB059与Fc受体的结合，使用来自 Perkin Elmer的AmplifiedLuminescent Proximity Homogeneous Assay (ALPHA)技术测量了相对结合亲和力(图20)。以竞争形式进行了测定，其中 在4℃使测试抗体的系列稀释液与受体-GST融合蛋白和抗-GST受体珠在96 孔板中温育过夜。也在4℃下使链霉亲合素供体珠和生物素化野生型IgG1在 不同的管中温育过夜，然后次日加入到测定板中。将板于室温温育2小时， 同时轻轻摇动，并在Envision平板读数器(Perkin Elmer)中读数。使用Graphpad Prism软件将数据对4参数曲线拟合(4-parameter curve fit)作图，以计算IC 50 值，从而确定相对结合亲和力。计算BIIB059的IC50值：对FcγR1，0.03μg/mL； FcγR11a，11μg/mL；FcγR11b，17μg/mL；FcγR111a，3μg/mL。这些值与在 此测定中对其他人IgG1抗体观察到的值一致。也测定在研究的食蟹猴中使用 的24F4的G4P/G1 agly低效应器功能形式的IC50值。正如预期的，未检测到 与FcγR11a，FcγR11b，FcγR111a的结合，并且与FcγR1的结合减少了100倍。 在测定中纳入在IgG1 WT和G4P/G1 agly框架两者中的5C8抗体作为比较物。
实施例29：补体结合
已经显示靶标的抗体包被通过ADCC或CDC介导有力的杀伤机制。抗 体的这些效应器功能是由抗体Fc区介导的。这个实验涉及通过ELISA测试 BIIB059对C1q的结合来测试其募集补体的能力。
使用Maxisorb ELISA板在96孔ELISA形式中进行Clq结合测定。在2-8℃用在起始于15μg/mL的PBS中的3倍稀释系列将测试抗体包被过夜， 然后用PBS，0.05％Tween 20洗涤各孔，并用200μl的0.1M磷酸钠，pH 7.2， 0.1M NaCl，0.1％明胶，0.05％Tween20封闭各孔。随后，加入50μl/孔 2μg/mL在封闭液/稀释液中稀释的来自Complement Technology(A099)的人 C1q，在室温下温育2小时。如上吸取和洗涤后，加入在封闭液/稀释液中稀 释8000倍的50μl/孔鸡IgY抗人C1q(由Aves Labs,Inc使用Sigma人C1q， C0660定制生产)。在室温下温育1.5小时后，如上吸取和洗涤孔。以50μl/ 孔加入在封闭液/稀释液中稀释至5000倍的的驴F(ab')2抗鸡IgY HRP缀合 物(Jackson ImmunoResearch 703-030-155)，在室温下温育1小时。如上吸取 和洗涤后，加入100μl TMB底物(在0.1M乙酸钠/柠檬酸缓冲液(pH 4.9)中的 420μM TMB，0.004％H2O2)，并温育2分钟，之后用100μl 2N硫酸终止反 应。用SOFTMAXPRO仪在450nm读取吸光度，并用SOFTMAX软件使用 4参数拟合确定相对结合亲和力(C值)。
图21显示，虽然BIIB059能够结合C1q，但是24F4A IgG4.P/IgG1 agly 基本上没有Clq结合。
实施例30：细胞消减研究
BIIB059在与BDCA2结合后有力抑制I型IFN和IL-6的产生。除了其 激动活性，还进行这些实验以评估BIIB059能否通过其功能性Fc消减携带 BDCA2的pDC。为研究BIIB059的细胞毒性效力，测试了BIIB059在ADCC 和CDC测定中的活性。
a)ADCC测定
ADCC是免疫系统的效应细胞主动裂解其表面受体已经被抗体结合的 靶细胞的机制(图22)。
将CHO细胞系(EAG2456 T1F2克隆34.16.7)用作靶细胞。使用经APC 标记的抗BDCA2单抗(克隆AC144，Miltenyi)通过FACS测定在CHO细胞 表面上BDCA2的表达水平。将NK细胞用作效应细胞，并使用RosetteSep TM人NK细胞富集混合物(Stem CellsTechnologies)，通过阴性选择从全血分 离NK细胞。与混合物在室温下温育20分钟后，通过在Ficoll上不连续梯度 离心分离NK细胞。在效应器活性的抗BDCA2单抗(24F4S和BIIB059)，Fc 消弱单抗(24F4S-Agly和24F4A-Agly)或IgG1同种型对照的存在下，以5:1 的比率(NK:CHO)接种CHO细胞和人NK细胞并在37℃温育4小时。阴性 对照由含有CHO细胞和NK细胞且无抗体的孔组成。将用Tx-100裂解的 NK细胞和CHO细胞用于测定最大杀伤。使用Vybrant Cytotoxicity Assay kit (Invitrogen)，按照生产商的说明书评价ADCC。该测定基于刃天青的G6PD 依赖性降低，检测来自受损细胞的G6PD，所述刃天青在530nm处激发后在 590nm发出荧光。使用BDCA2高表达的CHO细胞实施(小图C)，而图22 小图B使用具有较低BDCA2表达的CHO细胞(小图D)。
24F4S导致携带BDCA2的CHO细胞的100％杀伤，这类似于triton X 裂解。如所预期的，mAb的无糖基化形式(24F4S-agly)未导致ADCC(图22A)。 当与24F4S相比，BIIB059具有相同的ADCC活性(图22B)。值得注意的是， 杀伤效率与CHO细胞上BDCA2的表达水平相关。
b)CDC测定
在补体依赖的细胞毒性(CDC)中，C1q结合抗体，从而触发补体级联并 导致细胞裂解(图23)。如实施例29所示，BIIB059能够有效地结合补体成分 C1q。实施本实验以确认BIIB059可以介导CDC。
将CHO-BDCA2/FcεRIγ稳定转染子细胞(EAG2456 T1F2克隆34.16.7)以 5×104个细胞接种在96孔胶原蛋白黑孔板(96well Collagen black well plate) 中，并在37℃培养48小时。然后洗涤板，在有效应器能力的抗BDCA2单抗 (24F4S和BIIB059)、效应器功能缺失的mAb(24F4S-Agly和24F4A-Agly)或 IgG1同种型对照的存在下，在37℃用兔血清补体和碘化丙啶(PI)温育板1小 时。阴性对照由含有CHO细胞、兔血清补体、PI且没有抗体的孔组成。将用 T-100x裂解的NK细胞和CHO细胞用于确定最大杀伤。使用Cytoflour荧光读板 仪(ex530/em645)对板读数。抗BDCA2 mAb(BIIB059和24F4S)导致通过CDC 的细胞杀死，这类似于Triton裂解。如所预期的，效应器缺失的无糖基化的 mAb(24F4S-Agly和24F4A-Agly)未介导CDC(图23)。BIIB059具有通过其功能 性IgG1 Fc区消减携带BDCA2的pDC的潜力。虽然BIIB059能够在BDCA2过表 达的细胞中有细胞毒性活性，但是预期不在体内消减，这是由于在与BIIB059 结合后受体的迅速的，持续且几乎全部内在化。
实施例31：大鼠BDCA2同源物的克隆和筛选BIIB059的结合
当在NCBI数据库中针对大鼠序列对人BDCA2 cDNA序列进行BLAST 时，最接近的同源物是在Genbank登录号NM_001005896中描述的大鼠 Clec4b2。为确定前导hu24F4 H4/L1C95A mAb能否与人类BDCA2的大鼠 同源物结合，克隆了cDNA并且构建了用于大鼠Clec4b2和大鼠FcεRIγ的 表达载体。全长大鼠Clec4b2蛋白序列与人类BDCA2仅共享51.0％的同一性。人类BDCA2(上)和大鼠Clec4b2(下)的有缺口比对如下显示：
Figure BDA0002495922490001211
用引物5'GAC CTT CTG AAT ATA TGC GGC CGC CAT GAT GCA GGA AAA AC 3'(SEQID NO:83)(其直接在Clec4b2起始密码子甲硫氨酸 前增加了5'NotI位点和Kozak序列)和5'CCC ACA GCC ATG GAG GAC AGG ATC CTC ATA AGT ATA TTT TC 3'(SEQ ID NO:84)(其直接在 Clec4b2终止子后添加了一个3'BamHI位点)通过RT-PCR从大鼠脾第一链 cDNA克隆大鼠Clec4b2。纯化0.64kb的RT-PCR产物并将其亚克隆到 Invitrogen的pCR2.1TOPO克隆载体中，产生构建体pCN815，对其插入物测 序。用引物'CAG GAT TTC ATC AAC GGA ATC CTAGAC ACT CGT TGG G 3'(SEQ ID NO:85)和它的反向互补物在模板pCN815上实施定点诱变，以 校正PCR错误，得到构建体pCN822，确认其Clec4b2推导蛋白序列与 NM_001005896中的蛋白质序列相同。通过以下方式构建了用于大鼠Clec4b2 全长cDNA的哺乳动物表达载体：将来自pCN822的0.64kb NotI-BamHI片 段与来自表达载体pV90的1.89kb BamHⅠ-XbaⅠ和4.17kb XbaI-NotI载体 主链片段连接，产生表达构建体pCN834，其cDNA插入序列得到了确认。
大鼠FcεRIγ cDNA描述于Genbank登录号NM_001131001。大鼠FcεRIγ 蛋白序列与人类FcεRIγ共享90.7％的同一性：如下显示人类(上)和大鼠(下) 的比对：
Figure BDA0002495922490001221
用引物5'CCC AGC GCT GCA GCC CGC GGC CGC CAT GAT CCC AGC GGT 3'(SEQ IDNO:87)(其直接在FcεRIγ起始密码子甲硫氨酸前增加 了NotI位点和Kozak序列)和5'GAACAC GTG TTG GGA TCC TAT TGG GGT GGT TTC TC 3'(SEQ ID NO:88)(其直接在FcεRIγ终止子后添加了一 个3'BamHI位点)通过RT-PCR从大鼠脾第一链cDNA克隆大鼠FcεRIγcDNA。纯化0.27kb的RT-PCR产物并将其亚克隆到Invitrogen的 pCR2.1TOPO克隆载体中，产生构建体pCN816，对其插入物测序，并确认 与NM_001131001中的序列相同。将来自pCN816的0.27kb NotI-BamHI片 段与来自pBHS103的0.66kb BamHI-XhoI和4.16kb XhoI-NotI载体主链片段 连接，以构建哺乳动物表达载体pCN844，其大鼠FcεRIγ cDNA插入序列得 到了确认。
为确定前导hu24F4 H4/L1 C95A mAb能否结合表面大鼠Clec4b2，用 EGFP报道表达载体(pEAG1458)和人BDCA2/FcεRIγ载体(pEAG2420和 pEAG2413)或大鼠Clec4b2/FcεRIγ载体(pCN834和pCN844)载体以1:1:1摩 尔比瞬时共转染293E细胞。转染后3天，收获细胞，并在稀释滴定FACS 结合测定法中用前导hu24F4 H4/L1 C95A mAb染色细胞，从而门控活的 EGFP阳性细胞。虽然观察了hu24F4对表面人BDCA2的高亲和力结合，但 没有检测到对表面大鼠Clec4b2的结合。这表明hu24F4与人类BDCA2的最 接近大鼠同源物没有交叉反应性。
实施例32：将BIIB059施用于健康食蟹猴导致BDCA2可能通过内在化从浆细胞样树 突细胞表面的损失
为了评估BDCA2表面水平在将BIIB059施用于食蟹猴后是否改变，使 用了两种测定法。第一种测定法(即所谓的“直接”方法)用经PE标记的抗 人二抗检测表面结合的BIIB059。理想地，将针对BDCA2的非交叉封闭性 抗体用于检测总BDCA2；然而，这样的抗体不存在。因此，在第二种测定 法，即所谓的“间接”方法中，通过添加与A647缀合的BIIB059检测未占 据的BDCA2。
在施用任何测试制品之前，对于每只食蟹猴，在3个不同的时间点(单 次注射BIIB059之前的-3周、-2周和-1周)建立了BIIB059结合pDC的最大 平均荧光强度(MFI)。在每个时间点，将未标记的BIIB059(40至0.04μg/mL 的终浓度)的滴定添加至血液等分试样中，并用经PE标记的二抗(“直接” 方法)检测BIIB059，或用BIIB059-A647(“间接”方式)评估游离的BDCA2。 在每个测定中最大值取自平稳状态的值(图24和25)。值的评估揭示了对于 每只食蟹猴，在最大MFI中的非常适度的波动，而食蟹猴之间具有更大的变 化，显示出在食蟹猴中，pDC上的BDCA2密度是可变的(见表2)。
表2.BIIB059与食蟹猴全血的pDC上的细胞表面BDCA2的平均EC50结 合的概述
每周一次总共三周从12个食蟹猴抽取血液。将血液与多个浓度的 BIIB059人IgG1(0.04至40ug/mL,6-点曲线,1:4倍稀释)温育。使用流式细胞术 鉴定pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+，并经PE标记的抗人IgG二抗处理 pDC，以检测与PDC上的BDCA2受体结合的BIIB059。用FlowJo软件计算PE 的MFI，并在GraphPad Prism软件中产生EC50曲线。
Figure BDA0002495922490001231
Figure BDA0002495922490001241
*2-3个实验的平均值
施用媒介物后，如所预期的，没有发现BIIB059，并且没有发现BDCA2 水平的显著变化，如通过BIIB059-A647(10μg/ml)的结合评估(图26)。
在以10mg/kg或1mg/kg静脉内(IV)施用BIIB059后，在表面上未检测 到BIIB059，甚至早在注射BIIB059后1小时(图27和28)也未检测到。此外， 对于所有处理的食蟹猴，除食蟹猴5外，到38天如根据BIIB059-A647的缺 乏评估的，也没有游离的BDCA2；在此食蟹猴中的血清浓度在第10天迅速 下降，这可能是由于针对BIIB059产生了免疫原性。
皮下施用较低剂量的BIIB059(0.2mg/kg)后，在pDC的表面上短暂观察 到BIIB059(在1小时，到6小时消失)。在同一时间点(1小时)，观察到了一 些游离的BDCA2(基线MFI的13％，74％，72％)。再次，贯穿剩下的研究没 有检测到药物，并且在BIIB059注射后第14天之前，没有检测到游离的 BDCA2受体(图29)。
在所有食蟹猴中，游离BDCA2的再现与血清药物水平降低得低于 1μg/ml是一致的(图30和31)。因此，1μg/ml似乎是介导所有表面BDCA2 的内在化所需要的最小BIIB059浓度。
表3总结了在与食蟹猴全血中的BIIB059结合后pDC上的BDCA2受体 的EC10，EC50和EC90内在化。使用四参数拟合，在GraphPad Prism软件中 生成EC10-50-90曲线。
Figure BDA0002495922490001242
Figure BDA0002495922490001251
概括地说，在本实施例中描述的实验显示：体内IV施用高剂量(10和1 mg/kg)的BIIB059导致可用的BDCA2和结合的药物从细胞表面快速消失，提 示受体内在化。皮下施用低剂量(0.2mg/kg)的BIIB059导致pDC的表面上 BIIB059的非常瞬时(1小时)检测。到6小时，在pDC的细胞表面上没有检测到 BIIB059。当药物暴露下降得低于1μg/mL时，出现了细胞表面上可用BDCA2 的再现。
实施例33：除所有类型的I型IFN外，BIIB059抑制促炎介质
BDCA2结合抑制pDC响应于TLR配体产生I型IFN的能力(参见图16)。 为证实抗BDCA2 mAb BIIB059的抑制活性，在10μg/mL BIIB059或同种型 对照mAb的存在下，用合成的TLR9配体CpG-A刺激来自健康人供体的纯 化的pDC。具体地，使用两步磁珠分离方法(MACS试剂盒，Miltenyi Biotec) 分离来自人健康供体的pDC。将5X104个纯化的人pDC/孔保持未处理(培养 基)或在10μg/mL BIIB059(CPG-A+BIIB059)或同种型对照(CPG-A+Iso)的存 在下用1μM TLR9配体(CPG-A)刺激。37℃温育含有pDC的平板18小时， 收集上清液以用于ELISA或多重分析以测量炎性细胞因子和趋化因子的浓 度。这些实验表明，BIIB059有力地抑制TLR9诱导的IFNα和其他pDC衍 生的细胞因子如TNFα和IL-6以及TLR-9诱导的趋化因子如CCL3，CCL4， CCL5(图32)。
还研究了用生理学相关的配体，免疫复合物刺激后BIIB059抑制IFNα和 促炎介质产生的能力。具体地，通过在无血清培养基中混合由来自小牛胸腺 的sm-RNP和纯化自SLE患者血清的抗RNP抗体1小时预先形成Sm/RNP免疫 复合物(IC)。使用两步磁珠分离方法(MACS试剂盒，Miltenyi Biotec)分离来 自人健康供体的pDC。将5X 104个pDC/孔保持未处理(培养基)或在10μg/mL BIIB059(IC+BIIB059)或同种型对照(IC+Iso)的存在下用预先形成的 Sm/RNP IC刺激。37℃温育含有pDC的平板18小时，收集上清液以用于ELISA 或多重分析，从而测量炎性细胞因子和趋化因子的浓度。这些实验表明， BIIB059有力地抑制Sm/RNP免疫复合物诱导的IFNα和其他pDC衍生的细胞 因子如TNFα和IL-6。BIIB059还抑制Sm/RNP免疫复合物诱导的趋化因子如 CCL3，CCL4，CCL5(图33)。
实施例34：BIIB059抑制Sm/RNP IC诱导的通过纯化的人pDC转录I型IFN亚型
在人类中存在13个IFNα亚型和单个IFNβ成员。使用定性聚合酶链反 应(Q-PCR)测定评估了BIIB059对在经Sm/RNP IC刺激的来自健康人供体的 pDC中I型IFN亚型转录的影响。
通过在无血清培养基中混合来自小牛胸腺的sm-RNP和纯化自SLE患者 血清的抗RNP抗体30分钟预先形成Sm/RNP免疫复合物(IC)。使用两步磁珠分 离方法(MACS试剂盒，Miltenyi Biotec)分离来自人健康供体的pDC。将7.5 X105个纯化的人pDC/孔保持未处理(培养基)或在10μg/mL BIIB059(IC+ BIIB059)或同种型对照(IC+Iso)的存在下，用预先形成的Sm/RNP IC刺激。 在37℃和5％CO2下温育含有pDC的平板16小时。收集pDC细胞并从pDC分离 RNA用于qPCR反应中的评价。这个实验表明，用BIIB059处理抑制测试的所 有的I型IFN亚型的转录物水平(图34)。
实施例35：BIIB059抑制TLR9诱导的通过来自健康供体和SLE患者的人PBMC产生 IFNα
pDC是响应TLR7和TLR9的刺激的主要IFN生产者。pDC能产生超过任何 其他细胞类型千倍的IFN。这个实验研究BIIB059是否能在不需要pDC分离的 情况下抑制外周血单核细胞(PBMC)培养物中的TLR9诱导的IFNα产生。在总 的测定体积250μL/孔的情况下，用1或5μMTLR9配体(CpG-A)刺激并用浓度 范围为10μg/mL到2ng/mL的BIIB059处理来自健康人供体或SLE患者的 PBMC。使板在37℃和5％CO2下温育过夜(18小时)。收集上清液以在IFNαELISA测定法中评估。
该实验表明，BIIB059抑制TLR9诱导的通过来自健康供体的PBMC产生 IFNα，平均IC50为0.04+/-0.05μg/mL(图35A和35C)。BIIB059在抑制TLR9诱 导的通过来自SLE患者的PBMC产生IFNα中显示出相似的效力，平均IC50为 0.03+/-0.01μg/mL(图35B和35C)。
实施例36：BIIB059抑制在用TLR9配体刺激的全血中的IFNα产生
在全血测定法(WBA)中也评价了BIIB059的活性。在增加浓度的 BIIB059的存在下，用TLR9配体刺激来自健康人供体的全血，并且计算了 各个供体个体的抑制IC50。具体地说，在总的测定体积为200μL/孔的情况 下，将来自健康人供体的全血与增加浓度的BIIB059(浓度范围为10μg/mL 到2ng/mL)或同种型对照温育。添加75μg/mL的CpG-A(空心正方形)，其确 定为对于刺激全血中的IFNα产生是最佳的。37℃温育平板18小时，收集上 清液以用于IFNαELISA测定(PBL InterferonSource)。
BIIB059在全血测定法中显示剂量依赖性抑制TLR9诱导的IFNα产生， 并且展示的IC50与用PBMC培养物可见的IC50相似(图36)。
实施例37：BIIB059不抑制TLR3诱导的通过来自健康人供体的人PBMC产生IFNα
进行该实验，以确定即使在BIIB059的存在下，用不同TLR配体触发 的其他类型的细胞是否仍然能够产生I型IFN。TLR3不在pDC中表达，因 此TLR3配体不诱导pDC产生IFN。用poly:IC刺激来自人健康供体的PBMC， 所述poly:IC是能有力诱导主要地单核细胞的I型IFN的TLR3配体。具体 地，在96孔板中在总的测定体积250μL/孔的情况下，用1μM TLR3配体(Poly I:C)刺激并用浓度范围为10μg/mL到0.5ng/mL的BIIB059处理来自健康人 供体的PBMC。使板在37℃和5％CO2下温育过夜(18小时)。收集200μL 上清液用于通过ELISA评估IFNα水平。如图37所示，BIIB059不影响TLR3 诱导的通过来自健康人供体的PBMC产生IFNα。
总之，实施例33-37表明，BIIB059能有力地抑制TLR9刺激的纯化的pDC、 PBMC和全血培养物的I型干扰素。BIIB059同样有力地抑制TLR9诱导的通过 来自健康人供体和SLE患者的pDC的I型干扰素。除了抑制I型IFN外，BIIB059 能抑制其它pDC衍生的细胞因子和趋化因子的生成。BIIB059特异地抑制 TLR9诱导的pDC的I型IFN，并且不影响通过用不同的TLR配体触发的其它细 胞类型产生IFN。因此，除了其针对TLR7/9诱导的pDC的I型IFN的特异性外， 本文提供的体外数据支持BIIB059的药理学活性和效力。
实施例38：BIIB059介导人pDC上的BDCA2内在化
为确定BIIB059是否诱导BDCA2的内在化，在37℃下将来自10名健 康人供体的人全血与增加浓度的BIIB059温育16小时。使用经FITC-标记的 非交叉封闭性抗BDCA2单抗(克隆2D6)检测剩余的细胞表面BDCA2。
具体地，在37℃和5％CO2下，将来自10名健康人供体的全血与增加 浓度的BIIB059或10μg/ml同种型对照抗体温育16小时，然后在4℃与经 FITC-标记的非交叉封闭性抗BDCA2单抗(克隆2D6)，抗-HLA-DR，抗 CD123，抗CD14和抗CD20温育30分钟。之后，在4℃将全血与50μL的 染色液温育30分钟，所述染色液包括以下mAb：经FITC-标记的非交叉封闭性抗BDCA2单抗(克隆2D6)，抗-HLA-DR，抗CD123，抗CD14和抗CD20。 使用1X裂解/固定液(BD Bioscience)裂解红血细胞(RBC)。
如图38所示，BIIB059导致经FITC-标记2D6染色强度的剂量依赖性降 低，平均EC50为0.017±0.005μg/mL。
实施例39：BDCA2在与BIIB059结合后被快速内在化
为确定BIIB059诱导的BDCA2内在化的动力学，在37℃下将人全血与 不同浓度的BIIB059温育达各个时段。具体地，在37℃下用10、1、0.1或 0.01μg/mL BIIB059或同种型对照抗体(10μg/ml)处理人全血指定的时间，然 后在4℃下将人全血50μL的染色液温育30分钟，所述染色液包括以下mAb： 经FITC-标记的非交叉封闭抗BDCA2单抗(克隆2D6)、抗HLADR、抗CD123、 抗CD14和抗CD20。使用1X裂解/固定液(BD Bioscience)裂解并固定红血细 胞(RBC)。如图39所示，在与1μg/ml的BIIB059一起温育后，经FITC标 记的2D6染色的强度在温育1小时内迅速降低达到背景水平。与低十倍的 BIIB059浓度(0.1μg/ml)一起温育使BDCA2的内在化延缓2小时。这些数据 显示，BDCA2内在化的速率取决于BIIB059的剂量。
实施例40：BIIB059诱导人浆细胞样树突细胞中的BDCA2内在化
为显现在与BIIB059结合后BDCA2的内在化，将纯化的pDC与经A647- 标记的BIIB059一起温育，并通过共聚焦显微术分析。如所预期的，BDCA2 在4℃定位于pDC的细胞表面上。在37℃短暂的温育后，在细胞内清楚地 检测到BDCA2(图40)。
实施例41：内在化不改变BIIB059介导的对IFN产生的抑制
这个实验研究BIIB059内在化是否改变BIIB059抑制TLR9诱导的pDC 产生IFN的能力。在37℃下将细胞与BIIB059预温育对应于最大BDCA2内 在化的各个时段，然后用TLR9配体再刺激18小时。具体地，从健康供体 的肝素化静脉血收集全血，并与BIIB059或同种型对照抗体一起预温育指定 的持续时间。在预温育后的每个时间点，用200μg/mL TLR9配体(CpG-A) 刺激细胞并在37℃再温育18小时。收集上清液以用于IFNαELISA测定(PBLInterferonSource)。如图41所示，在来自健康人供体的全血测定中，与BIIB059 一起预温育(多达9小时)未改变BIIB059抑制TLR9诱导的IFN产生的能力。 这些数据表明，BDCA2内在化可以是对TLR9信号传导的抑制需要的。
实施例42：BIIB059介导的pDC上的BDCA2内在化的EC50与全血测定中BIIB059介导 的对TLR9诱导的pDC的IFNα的抑制的IC50相关
为进一步探查BDCA2内在化和对TLR9信号传导的抑制之间的联系， 在10个健康人供体中比较了BIIB059介导的pDC上的BDCA2内在化的效 力与对TLR介导的pDC产生IFNα的抑制。
为了评估BIIB059介导的BDCA2内在化，将全血与BIIB059温育16 小时。然后收集全血，裂解，使用缀合有FITC的非交叉封闭性抗体2D6通 过流式细胞术评估BDCA2表达。为了评估BIIB059介导的对TLR9诱导的 pDC的IFNα的抑制，在TLR9配体的存在下使全血与增加浓度的BIIB059 温育16小时。收集上清液并通过ELISA评估IFNα。BIIB059介导的BDCA2内在化的EC50为0.02μg/mL。BIIB059介导的对TLR9诱导的干扰素α的抑 制的IC50为0.07μg/mL。观察到BIIB059介导的BDCA2内在化的EC50与 BIIB059介导的IFNα抑制的IC50之间的相关性，R平方值为0.57(图42)。
实施例43：TLR9活化诱导BDCA2与TLR9以及与溶酶体标记LAMP1共定位
为了检验如下的假设：BIIB059介导的TLR9抑制需要BDCA2内在化 和定位到含有TLR9的内体/溶酶体区室中，将共聚焦显微术用于跟踪 BIIB059结合后BDCA2的胞内分布。培养纯化的人pDC达7天，并在37℃ 与A647-标记的BIIB059温育15分钟。在温育的最后10分钟期间，用1μM TLR9配体CpG-A处理细胞或保持未处理。用荧光标记的针对TLR9和晚期 内体/溶酶体LAMP1的抗体对细胞染色，并通过共聚焦显微术分析。
TLR9在用TLR9配体刺激后被募集到晚期内体/溶酶体区室，如通过 TLR9与LAMP1的共定位增加证明的(图43)。TLR9刺激也显著增加了与TLR9 和LAMP1共定位的BDCA2的分数。这些结果表明，当结合BDCA2时， BIIB059优先地定位于存在激活的TLR9的胞内区室。
总之，实施例38-43显示，针对BDCA2的人源化单克隆抗体BIIB059结合 BDCA2并导致其内在化。刺激后，BDCA2与内体/溶酶体室中的TLR9共定位， 在那里它介导对TLR9信号传导的抑制。这些数据表明，BDCA2内在化是介 导抑制TLR9诱导的pDC的促炎症介质的必要步骤。
实施例44：BIIB059对CD62L水平的影响
循环的pDC表达高水平的CD62L(L-选择素)并且归巢于含有高内皮微 静脉(HEV)淋巴样组织。PNAd是CD62L的配体，其在HEV上组成型表达 并介导CD62L表达细胞归巢到组织化的淋巴组织。在皮肤红斑狼疮病灶中， 发现表皮内皮细胞表达PNAd。凭借着其CD62L表达，pDC可以被募集到 表达PNAd的发炎外周组织。
为确定BIIB059是否影响人pDC表面上CD62L的表达，在不刺激的情 况下在37℃下用不同浓度的BIIB059处理全血1小时。具体地说，在37℃ 和5％CO2下用增加浓度的BIIB059处理来自健康人供体的全血1小时。通 过对由CD14-，CD20-，HLA-DR+和CD123+限定的pDC进行门控测定CD62L 的MFI。
如通过流式细胞术评估的，BIIB059引起人pDC的表面上CD62L表达 的剂量依赖性降低(图44)。用TLR配体刺激pDC不影响CD62L的表达(图 44A)。
实施例45：用GM6001处理GM6001抑制BIIB059介导的从人pDC表面的CD62L脱落
已知金属蛋白酶诱导CD62L从免疫细胞的表面上脱落。为了研究金属 蛋白酶是否参与BIIB059介导的表面CD62L的降低，从健康人供体制备 PBMC，在37℃和5％CO2下，用GM6001(金属蛋白酶抑制剂)预处理30分 钟，随后加入10μg/mL BIIB059达1小时。通过流式细胞术测定CD62L的 表面表达。GM6001以剂量依赖的方式抑制BIIB059介导的下调CD62L(图 45)。这些数据表明，BIIB059以金属蛋白酶依赖性方式诱导CD62L脱落。
总之，实施例44和45表明，BIIB059降低人pDC的表面上CD62L的 表达。BIIB059介导的CD62L下调受到金属蛋白酶抑制剂(GM6001)的抑制， 表明BIIB059至少部分通过金属蛋白酶的激活来诱导CD62L从人pDC表面 的脱落。因此预期BIIB059治疗减少或防止pDC运输到SLE的靶器官。
实施例46：BIIB059的Fc区对免疫复合物介导的浆细胞样树突细胞产生IFN的影响
Fcγ受体IIA(CD32a)是以低亲和力结合IgG的细胞表面蛋白。人浆细胞 样树突细胞专门表达Fcγ受体IIA(CD32a)。已经显示用免疫复合物刺激pDC 依赖于CD32。免疫复合物是通过CD32内在化的并刺激胞内TLR7/9以诱导 pDC的IFN产生。
为测定BIIB059对CD32a表面表达的影响，用增加浓度的BIIB059或 无糖基化形式的抗体24F4处理分离的pDC，并于37℃温育16小时。然后， 用经FITC-标记的BDCA2和经PE标记的抗CD32(克隆AT10)对pDC染色， 并通过流式细胞术评价BDCA2和CD32的表面表达。BIIB059和无糖基化 形式24F4-A在其诱导BDCA2内在化的能力上同等有力(图46A)。如CD32平均荧光强度(MFI)的剂量依赖性降低(图46B-D)所指示的，仅BIIB059能够 诱导pDC细胞表面上CD32的下调。用效应器能力的同种型对照处理对CD32 的表面水平没有影响(图46)。这些数据表明，BIIB059介导的pDC细胞表面 上CD32a水平的下调是BIIB059的Fc区的结合特异性的。
为确保BIIB059的Fc区的结合不仅仅掩盖经FITC标记的抗CD32 mAb 识别的CD32上的表位，用10μg/mL BIIB059在4℃或37℃处理pDC达1 小时，然后用经标记的抗CD32染色。如图46E中所示，在4℃用BIIB059 处理未降低CD32 MFI，这指示用BIIB059处理不会干扰经标记的抗CD32 mAb的结合。CD32a下调仅在37℃与BIIB059一起温育后发生的事实，表明CD32a可以从pDC的细胞表面丢失。
为了确定通过BIIB059的CD32a下调是否具有生物影响，在增加浓度 的BIIB059或无糖基化形式，24F4A-Agly的存在下温育pDC，并用免疫复 合物或合成的TLR9配体(CpG-A)刺激。正如预期的，在抑制CPG-A诱导的 pDC的IFNα的能力方面，BIIB059和24F4A-Agly是无法区分，这是不依赖 于CD32的(图47A)。当用免疫复合物刺激pDC时，BIIB059和24F4A-agly之间的效力明显不同。BIIB059以0.04的IC50抑制免疫复合物诱导的IFNα， 与之相比，24F4A-Agly的IC50为1.4μg/mL(图47B)。这些数据表明，BIIB059 通过其功能性Fc下调CD32a，并且因此抑制免疫复合物对pDC刺激。
为确认CD32a的下调是BIIB059独有的，我们研究了完全人源化抗 CD40抗体对CD32的水平和免疫复合物介导的pDC的IFNα产生的作用。 CD40是在pDC上表达的细胞表面蛋白质。具有完全功能性Fc的抗CD40 抗体具有结合pDC的表面上CD40和CD32的能力。用抗CD40 mAb处理 对CD32表面表达无影响，并且对经免疫复合物刺激的pDC产生IFNα无显 著影响(图48A和B)。通过证明经抗CD40处理的细胞中的最大CD40结合 来证实抗CD40 mAb的结合(图48C)。
如前所示，BDCA2结合BIIB059或无糖基化形式24F4A-Agly导致受体 内在化和抑制TLR9诱导的pDC的IFNα。在这项研究中，我们显示，BIIB059 以Fc依赖性的方式导致pDC上CD32a的下调和抑制免疫复合物刺激的通过 pDC的IFNα产生。由BIIB059触发的CD32a下调并不仅源自具有能结合 pDC上表达的细胞表面分子的功能性Fc的任意抗体。这项研究强调了效应 器能力的抗BDCA2 mAb的新治疗潜力，该抗BDCA2 mAb可通过其Fab'2 和Fc区减弱pDC反应，从而导致增强的功效。
实施例47：BIIB059与羟氯喹(HCQ)的相互作用
已将抗疟剂如羟氯喹(HCQ)用于治疗SLE。在用TLR7和TLR9配体刺 激后，来自用HCQ治疗的SLE患者的pDC具有受损的产生IFNα的能力。 由于BIIB059和HCQ均影响TLR7/9在pDC中诱导IFNα，研究了BIIB059 和HCQ的作用是否可以是冗余的。
为了解决这个问题，从健康供体的血液制备人PBMC，并且在不同浓度 的单独BIIB059、单独HCQ或BIIB059与HCQ组合的存在下，用TLR7或 TLR9配体刺激。18小时后收集上清液并通过ELISA测定IFN-α。加入HCQ 增加了BIIB059的效力，并导致对TLR7和TLR9诱导的来自健康人供体的 PBMC产生IFNα的叠加抑制作用。这些数据表明，BIIB059和HCQ的活性不是冗余的，并强调了当与抗疟疾化合物如HCQ一起施用时，BIIB059的 额外治疗益处。
实施例48：BIIB059对体内表达BDCA2的pDC的作用
本研究的目的是确定对食蟹猴施用BIIB059是否介导外周血中pDC的 消减。
以每周时间间隔从12个食蟹猴收集4份BIIB059给药前血液以建立每 个动物的基线pDC频率(表3)。
表3，在健康食蟹猴全血中平均循环pDC频率的总结。
每周一次总共四周从12只食蟹猴抽取全血。使用流式细胞术鉴定pDC为 CD20-CD14-CD123+HLA-DR+。用FlowJo软件以占CD20-CD14-细胞的百分 比计算pDC。
Figure BDA0002495922490001331
51)。在图51的左图中，pDC频率的原始分布是严重右偏斜的。然而，对数转 化后，经转化的pDC频率的分布(图51，右图)近似遵循正态分布。将这些经 对数转化的数据用于所有的统计分析方法。图52显示在IV注射之前四个时间 点里，每只食蟹猴的对数尺度的pDC水平。使用具有四个时间点作为固定因 素和cyno的随机截取的线性混合效应模型，我们得出的结论是在4个给药前 时间点里，所有猴的pDC百分比的几何平均值相等(图53，基于F检验，时间 的p值：0.67)。这一分析指示，对于食蟹猴，循环pDC的百分比几何平均值 随着时间的推移相对稳定。
将这12只食蟹猴中的9只分成3组(3只/组)，并且随机化以包括每组中的 BDCA2密度和百分比pDC的相等呈现。食蟹猴接受单次静脉内注射媒介物 (柠檬酸钠)、10mg/kgBIIB059或1mg/kg BIIB059。使用流式细胞术鉴定全血 中的循环pDC为CD20-CD14-CD123+HLA-DR+，并在R软件中对每个时间点 的pDC频率(对数尺度)作图(图54)。使用食蟹猴的随机截取和剂量组和时间期 间的固定效应：1小时、6小时、1-27天和大于28天将线性混合效应模型拟合 到对数(pDC)频率。为评估pDC在不同的时间段时在不同剂量组间是否改变，初步模型还包括剂量组和不同的时间段的交互项(interaction term)。基于用于 检验等于0的所有交互项的F检验的p值是0.81，这表明不同剂量组之间的pDC 变化没有区别。因此，最终拟合模型仅包括了时间段和剂量组因子的统计学 显著效应(表4)。
表4.单次静脉内BIIB059或媒介物注射后的时间点的拟合模型估计。
对于在食蟹猴中在IV剂量的柠檬酸钠媒介物、1mg/kg BIIB059，或10 mg/kgBIIB059之前或之后以对数尺度的百分比循环pDC，使用食蟹猴的随机 截取和剂量组和时间水平1小时、6小时和大于28天使用线性混合模型的固定 效应的估值。
Figure BDA0002495922490001341
将固定因素的参数估计指数化，以将它们解释为与BIIB059给药前相比 在这些时间段时pDC频率的比率。全部地，在比较IV注射后1小时的pDC 频率与给药前pDC频率时，比率显著小于1(95％CI:0.43-0.77,p-值:0.0003)。 比较IV注射后6小时的pDC频率与给药前pDC频率，比率显著地大于1 (95％CI：1.18-2.12，p值：0.003)。在比较IV注射后1-28天时段的pDC频 率与给药前pDC频率时比率与1没有显著性不同。在比较IV注射28天后 的pDC频率与给药前pDC频率时比率显著小于1(95％CI:0.55-0.70,p-值: <0.0001)。在图55中绘制了最终拟合模型。结果揭示了，在IV注射后1小 时，体内显著消减食蟹猴中循环pDC，6小时时循环pDC明显增加，注射后28天后显著消减循环pDC，但对于所有处理组，百分比pDC随时间的改变 是相同的。
此外，在完成IV研究时间点后，这些食蟹猴中的三只(4、6和12)接受了 0.2mg/kgBIIB059的皮下单剂，以评估较低剂量对循环pDC频率的影响。在 R软件中对每个时间点的pDC频率(对数尺度)作图(图56)。使用连续时间和1 小时时的时间作为固定因素和食蟹猴作为随机截取，拟合了线性混合效应模 型。结果显示于表5中。
表5：单次皮下BIIB059注射后时间点的拟合模型估计。
在食蟹猴中单次皮下注射0.2mg/kg BIIB059之前或之后，对于以对数尺 度的百分比循环pDC，使用连续时间和1小时时的时间作为固定效应，和食 蟹猴作为随机截取使用线性混合效应模型的固定效应估值。
Figure BDA0002495922490001351
类似于前面的结果，我们观察到在IV注射后1小时，在食蟹猴的体内 显著地消减循环pDC(95％CI:0.34-0.55,p-值<0.0001)，而3只食蟹猴中的％ pDC的几何平均值随着时间增加而稳步上升(95％CI：每天1.00-1.03倍的变 化，p值<0.0001)。在图57绘制了拟合模型。
总之，这些数据显示，当以测试的剂量施用时，BIIB059不介导食蟹猴 的血液中pDC的持续消减。这可能是由于BDCA2的内在化。
实施例49：将BIIB059施用于食蟹猴导致离体全血测定中对TLR9诱导的IFNα产生 的抑制
本研究的目的是确定在离体全血测定法(WBA)中，当体内施用于食蟹猴 时BIIB059是否可以响应TLR9刺激而改变IFNα的产生。
对静脉内和皮下给药途径评估其影响IFNα诱导的能力，这使用MxA生 物测定根据图58中概述的实验方案测量。TLR9配体(CpG-A)在所有时间点 间且在所有食蟹猴中诱导全血培养物中可测量的IFNα量，而在经PBS处理 的对照培养物中未检测到IFNα(数据未显示)。
对于静脉内给药的食蟹猴，将处理后的IFNα值计算为每个动物给药前 平均值的百分数。将14天后的取血数据排除在分析之外，因为在该时间点 之后不进行10mg/kgBIIB059组的全血检测。在药物施用后几天，相比于媒 介物组，在1mg/kg和10mg/kgBIIB059给药组中，观察到趋向于相对于给 药前均值降低的％IFNα(图59)。
使用双因素混合效应方差分析(ANOVA)进行了数据的更全面的分析，以 估计在IV-研究中，每个剂量组的平均IFNα与后对前差异。排除将给药后前 24小时期间的数据，这是由于观察到的外周血浆细胞样树突细胞的百分比的 降低。将给药后31天的出血数据排除在分析之外，这是由于此时观察到了 BDCA2表达的返回。对于媒介物给药组，给药前IFNα几何平均值为362单 位/mL(U/mL)，给药后的几何平均值为314U/mL；对于1mg/kg的给药组，给药前的几何平均值为399U/mL，给药后的几何平均值为237U/mL；对于 10mg/kg的剂量组，给药前IFNα的几何平均值为211U/mL，给药后的 几何平均值为102U/mL(图4)。对于媒介物组，平均log10 IFNα的前后差异 为-0.061(p＝0.511)，对于1mg/kg组，差异为-0.226(p＝0.016)，对于10mg/kg 组，差异为-0.317(p＝0.004)。对逆log10转化后，这些结果揭示，相比于给 药前，给药后媒介物组具有10^(-0.061)＝87％(95％CI：57％-133％)的IFNα 浓度；相比于给药前，给药后1mg/kg组具有10^(-0.226)＝59％(95％CI: 39％-91％)的IFNα浓度；相比于给药前，给药后10mg/kg组具有 10^(-0.317)＝48％(95％CI:29％-79％)的IFNα浓度(图60)。
对于皮下给药的食蟹猴分组，将具有随机效应的单因素方差分析(ANOVA) 用于估计整个组的平均IFNα和后对前差异。排除将给药后前24小时期间的 数据，这是由于观察到了外周血浆细胞样树突细胞的百分比的降低。将给药 后33天的取血数据排除在分析之外，这是由于此时观察到了BDCA2表达的 返回。对于皮下给药组，给药前的几何平均值IFNα为1243U/mL，给药后 的几何平均值为812U/mL，产生的后/前比率为65％。均值log10的后-前差 异估计为-0.185(p＝0.059)，其在逆log10转化后，对应于给药前几何平均数 的10^(-0.185)＝65％；这种效应的95％CI是41％-102％(图61)。
因为实验中仅使用了少量的食蟹猴，所以对每只猴测定的IFNα浓度高 度影响该组的结果。在静脉内研究中由于动物差异导致的变化比例为总变化 性的69％，其余部分主要是由于食蟹猴中时间点之间的差异(26％)导致，少 量(<6％)是由于变化的测定来源导致。食蟹猴之间的变化比食蟹猴内的时间 点之间的变化大得多，这表明与更多出血时间点形成对比，将食蟹猴添加到 本实验中会更好支持该研究。在皮下研究中由于食蟹猴差异导致的变化比例 为总变化的45％，其余部分主要是由于食蟹猴中时间点之间的差异导致，可忽略量(<2％)是由于变化的测定来源导致。
食蟹猴之间和食蟹猴内观察到的变化性可能是由多种因素导致，所述因 素包括在食蟹猴的生理状况的波动，血液的细胞组成，细胞的分子组成和功 能测定的精确性。
虽然在每个动物中，浆细胞样树突细胞的百分比随时间有些波动，但血 液中的％pDC未受到BIIB059处理的影响(参见Rsch-2013-046)，并且没有表 现出与IFNα产生的一致性相关性。此外，在IV和SC BIIB059施用后在pDC 上观察到BDCA2从细胞表面上的快速和持续的丢失，暗示受体占据的高水 平(参见Rsch-2013-043)。考虑到来自食蟹猴的pDC对TLR9刺激的反应性 的高水平变化性，在静脉内和皮下施用BIIB059后，有减弱IFNα反应的趋势，在10mg/kg的IV-给药组中减少得最多，其次是0.2mg/kg SC-组，然 后是1mg/kg的IV组。
总之，当对食蟹猴体内给药时BIIB059在离体的WBA中显示抑制TLR9 诱导的IFN产生的趋势。
其他实施方案
虽然已经结合本发明的详细说明描述了本发明，但是前述描述旨在说明 而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。 其他方面，优点和修改均落入所附权利要求书的范围之内。
本发明涉及以下技术方案：
1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其(i)选择性结合人BDCA2的胞 外域(SEQID NO:1)，和(ii)与BIIB059竞争对人BDCA2的胞外域的结合。
2.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其选择性结合人BDCA2的胞外 域(SEQ IDNO:1)，并且：
(i)抑制TLR诱导的自浆细胞样树突细胞产生I型干扰素、IL-6、TNF-α、 CCL3、CCL4、IP10和RANTES；或
(ii)在体外诱导或增强浆细胞样树突细胞的消减。
3.项1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原 结合片段与食蟹猴BDCA2(SEQ ID NO:72)和恒河猴BDCA2(SEQ ID NO: 72)结合。
4.项2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结 合片段
(i)抑制TLR诱导的自浆细胞样树突细胞产生I型干扰素、IL-6、TNF-α、 CCL3、CCL4、IP10和RANTES；和
(i)在体外诱导或增强浆细胞样树突细胞的消减。
5.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其(i)选择性结合人BDCA2的胞 外域(SEQID NO:1)，和(ii)包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，其中：
所述重链CDR1包含氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ ID NO:9)或在SEQ ID NO:9中所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基 酸序列；
所述重链CDR2包含氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)或在SEQ IDNO:10中所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置 处具有取代的氨基酸序列；和
所述重链CDR3包含氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)或在 SEQ ID NO:11中所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代 的氨基酸序列。
6.项5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述重链CDR1包含氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ ID NO:9)或在SEQ ID NO:9中所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列；
所述重链CDR2包含氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)或在SEQ IDNO:10中所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的 氨基酸序列；和
所述重链CDR3包含氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)或在 SEQ ID NO:11中所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序 列。
7.项5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述重链CDR1包含氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ ID NO:9)；
所述重链CDR2包含氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)；和
所述重链CDR3包含氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)。
8.项5至7中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体 或其抗原结合片段包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，其中：
所述轻链CDR1包含氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5) 或在SEQ ID NO:5中所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取 代的氨基酸序列；
所述轻链CDR2包含氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6中所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基酸 序列；和
所述轻链CDR3包含氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ ID NO:7)或在SEQ ID NO:7中所示且在一个、两个、三个或四个氨基酸位置处具有取代的氨基 酸序列。
9.项8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述轻链CDR1包含氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5) 或在SEQ ID NO:5中所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸 序列；
所述轻链CDR2包含氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6中所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列；和
所述轻链CDR3包含氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ ID NO:7)或在SEQ ID NO:7中所示且在一个或两个氨基酸位置处具有取代的氨基酸序列。
10.项8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中
所述重链CDR1包含氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ ID NO:9)；
所述重链CDR2包含氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO:10)；
所述重链CDR3包含氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO:11)；
所述轻链CDR1包含氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:5)；
所述轻链CDR2包含氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO:6)；和
所述轻链CDR3包含氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ ID NO:7)。
11.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其(i)选择性结合人BDCA2的胞 外域(SEQID NO:1)，和(ii)包含可变重(VH)域，其与BIIB059的VH域的氨基 酸序列(SEQ ID NO:24)是至少80％相同的。
12.项11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH域与 BIIB059的VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)是至少90％相同的。
13.项11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH域与 BIIB059的VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)是至少95％相同的。
14.项11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH域与 BIIB059的VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)是相同的。
15.项11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
16.项11至15中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述 抗体或其抗原结合片段包含可变轻(VL)域，其与BIIB059的VL域的氨基酸序 列(SEQ ID NO:23)是至少80％相同的。
17.项16所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH域与 BIIB059的VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)是至少90％相同的，并且所述 VL域与BIIB059的VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)是至少90％相同的。
18.项16所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH域与 BIIB059的VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)是至少95％相同的，并且所述 VL域与BIIB059的VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)是至少95％相同的。
19.项16所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH域与 BIIB059的VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)是相同的，并且所述VL域与 BIIB059的VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)是相同的。
20.项16所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
21.项1至20任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源 化抗体。
22.项1至20任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克 隆抗体。
23.项1至20任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单链 抗体。
24.项1至20任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是多克 隆抗体、嵌合抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fsc片段、Fv片段、scFv、 sc(Fv)2或双抗体。
25.项1至20任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有 IgG1重链恒定区。
26.一种分离的细胞，其产生前述项中任一项所述的抗体或其抗原结合 片段。
27.一种药物组合物，其包含项1至25中任一项所述的抗体或其抗原结合 片段和药学可接受载体。
28.一种药物组合物，其包含配制在组合物中的项1至25中任一项所述的 抗体或其抗原结合片段，所述组合物包含10-25mM柠檬酸盐，100-200mM 氯化钠，并且pH值为5.5-6.5。
29.项28所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段配制在组 合物中，所述组合物包含20mM柠檬酸钠，150mM氯化钠，并且pH值为6.0。
30.一种在受试者中诱导浆细胞样树突细胞死亡的方法，所述方法包括 使表达BDCA2的浆细胞样树突细胞接触项1至25中任一项所述的抗体或其抗 原结合片段。
31.一种在受试者中减少浆细胞样树突细胞产生I型干扰素、IL-6、 TNF-α、CCL3、CCL4、IP10和RANTES的方法，所述方法包括使表达BDCA2 的浆细胞样树突细胞接触一定量的项1至25中任一项所述的抗体或其抗原结 合片段。
32.一种在有此需要的受试者中治疗炎性病症的方法，所述方法包括对 有此需要的受试者施用有效量的项1至25中任一项所述的抗体或其抗原结合 片段。
33.项32的方法，其中所述炎性病症选自：系统性红斑狼疮、盘状狼疮、 狼疮肾炎、类风湿性关节炎、炎性肠病、系统性硬化症(硬皮病)、银屑病、I 型糖尿病、皮肌炎、多肌炎。
34.项32的方法，其中所述炎性病症是系统性红斑狼疮、盘状狼疮、狼 疮肾炎或皮肤狼疮。
35.项32的方法，其中所述炎性病症是中度至重度狼疮伴活动性中枢神 经系统(CNS)和/或肾累及。
36.项32的方法，其中所述炎性病症是中度至重度的，没有活动性中枢 神经系统(CNS)和/或肾累及。
37.一种在有此需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法，其包括给 有此需要的受试者施用有效量的项1至25中任一项所述的抗体或其抗原结合 片段。
38.项30至37中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

Claims (14)

1.结合人血液树突细胞抗原2(BDCA2)(SEQ ID NO：1)的抗体，其中所述抗体包含重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含VH互补决定区1(CDR1)，VH CDR2和VH CDR3，其中
所述VH CDR1包含氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ ID NO：9)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO：10)；并且
所述VH CDR3包含氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO：11)；并且
其中所述抗体包含轻链可变(VL)结构域，其中所述轻链可变结构域包含VL CDR1，VLCDR2和VL CDR3，其中：
所述VL CDR1包含氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：5)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO：6)；并且
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ ID NO：7)。
2.权利要求1的抗体，其中所述VH结构域：
(i)与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少80％相同；
(ii)与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少90％相同；
(iii)与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少95％相同；或
(iv)与SEQ ID NO：24的氨基酸序列相同。
3.权利要求1的抗体，其中所述VL结构域：
(i)与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少80％相同；
(ii)与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少90％相同；
(iii)与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％相同；或
(iv)与SEQ ID NO：23的氨基酸序列相同。
4.权利要求1的抗体，其中
(i)所述VH结构域与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少90％相同，并且所述VL结构域与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少90％相同；或
(ii)所述VH结构域与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少95％相同，并且所述VL结构域与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％相同。
5.与人BDCA2(SEQ ID NO：1)结合的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含VH结构域，所述VH结构域包含VH CDR1，VH CDR2和VH CDR3，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列GFTFSTYTMS(SEQ ID NO：9)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列TISPGDSFGYYYPDSVQG(SEQ ID NO：10)；并且
所述VH CDR3包含氨基酸序列DIYYNYGAWFAY(SEQ ID NO：11)；并且
其中所述抗原结合片段包含VL结构域，所述VL结构域包含VL CDR1，VL CDR2和VLCDR3，其中：
所述VL CDR1包含氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：5)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AASTLES(SEQ ID NO：6)；并且
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQANEDPRT(SEQ ID NO：7)。
6.权利要求5的抗原结合片段，其中所述VH结构域：
(i)与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少80％相同；
(ii)与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少90％相同；
(iii)与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少95％相同；或
(iv)与SEQ ID NO：24的氨基酸序列相同。
7.权利要求5的抗原结合片段，其中所述VL结构域：
(i)与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少80％相同；
(ii)与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少90％相同；
(iii)与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％相同；或
(iv)与SEQ ID NO：23的氨基酸序列相同。
8.权利要求5的抗原结合片段，其中
(i)所述VH结构域与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少90％相同，并且所述VL结构域与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少90％相同；或
(ii)所述VH结构域与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少95％相同，并且所述VL结构域与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％相同。
9.权利要求5至8中任一项的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为：
(a)单链抗体；
(b)Fab片段；
(c)F(ab’)2片段；
(d)Fab’片段；
(e)Fsc片段；
(f)Fv片段；
(g)scFv；
(h)sc(Fv)2；或
(i)双抗体。
10.分离的细胞，其产生权利要求1至4中任一项的抗体或权利要求5至9中任一项的抗原结合片段。
11.药物组合物，其包含权利要求1至4中任一项的抗体或权利要求5至9中任一项的抗原结合片段和药学上可接受的载体。
12.权利要求1至4中任一项的抗体或权利要求5至9中任一项的抗原结合片段在制备用于在需要其的人类受试者中治疗炎性疾病或自身免疫疾病的药物中的用途。
13.权利要求12的用途，其中：
(a)炎性疾病选自下组：系统性红斑狼疮，盘状狼疮，狼疮肾炎，皮肤性狼疮，类风湿性关节炎，炎性肠病，系统性硬化症(硬皮病)，牛皮癣，I型糖尿病，皮肌炎和多发性肌炎；
(b)炎性疾病为中度至重度狼疮，伴有活动性中枢神经系统(CNS)和/或肾脏受累；或
(c)炎性疾病为中度至重度狼疮，无活动性中枢神经系统(CNS)和/或肾脏受累。
14.体外产生权利要求1至4中任一项的抗体或权利要求5至9中任一项的抗原结合片段的方法，其中所述方法包括：
(a)构建编码所述抗体或所述抗原结合片段的一种或多种多核苷酸；
(b)将所述一种或多种多核苷酸引入一个或多个表达载体中；和
(c)在宿主细胞中表达所述一种或多种多核苷酸。
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