BR112015012942B1 - Anticorpos isolados, fragmentos de ligação a antígenos isolados, seus usos, célula isolada, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ISOLADOS OU FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AOS ANTÍGENOS DOS MESMOS, SEU USO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO OU ÁCIDOS NUCLEICOS, CÉLULA ISOLADA, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se aos anticorpos e fragmentos de anticorpos que se ligam a BDCA2. Também são descritos métodos de uso dos anticorpos e fragmentos de anticorpos para induzir a morte de uma célula dendrítica plasmocitoide, inibir a produção ou a secreção de citoquinas inflamatórias e quimiocinas, e tratar ou prevenir os distúrbios imunológicos, tais como doenças inflamatórias e autoimunes.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos de Patente Relacionados

[1] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US N ° 61/735,362 depositado em 10 de dezembro de 2012 e Pedido de Patente Provisório US N ° 61/763,270 depositado em 11 de fevereiro de 2013 os conteúdos de ambos as quais são incorporados na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

Antecedentes da Técnica

[2] Antígeno de célula dendrítica sanguínea 2 (BDCA2) é uma subunidade de lectina do tipo C expressa em células humanas plas- mocitoides dendríticas (pDCs) (Dzionek et al, J. Immunol, 165: 6037 a 6046 (2000)), uma população especializada de células derivadas da medula óssea as quais secretam interferonas do tipo I (IFNs) em resposta aos ligantes dos receptores do tipo toll (TLR). BDCA2 consiste em um único domínio extracelular de reconhecimento de hidratos de carbono (CRD), que pertencem ao grupo lectina do tipo C do tipo II, na sua extremidade do terminal C, uma região transmembranar e uma curta cauda citoplasmática no seu terminal N que não abriga um motivo de sinalização. BDCA2 transmite sinais intracelulares por meio de um adaptador transmembranar associado, a FcεRlY, e induz a uma cascata de sinalização do tipo do receptor de célula B (BCR).

Sumário

[3] A presente descrição é baseada, pelo menos em parte, na identificação e na caracterização de anticorpos que se ligam a BDCA2. Tais anticorpos podem reduzir ou inibir a secreção de citoquinas e quimiocinas inflamatórias. Os anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção também são capazes de esgotar pDCs por meio da citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou por meio da citotoxicidade mediada por complemento (CDC). Além disso, os anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção podem regular de forma negativa os níveis de CD32A e/ou CD62L na superfície de pDCs. Além disso, os anticorpos anti-BDCA2 da presente invenção podem mediar a internalização de BDCA2 a partir da superfície celular de pDCs. Para, pelo menos, estas razões, os anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção são úteis no tratamento ou prevenção de condições inflamatórias e autoimunes. Esta descrição também mostra que os anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção podem ser combinados com um agente antimalárico para efeitos me-lhorados.

[4] Em um aspecto, a descrição proporciona um anticorpo iso lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva ao ectodomínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1) e compete com BIIB059 para a ligação ao domínio extracelular de BDCA2 humano.

[5] Um anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo compete com BIIB059 para a ligação a BDCA2 quando o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é antes da ligação a BDCA2 completa ou parcialmente inibe a posterior ligação do BIIB059 para BDCA2. Por exemplo, um anticorpo anti-BDCA2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete com BIIB059 para a ligação a BDCA2 quando o anticorpo anti- BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é antes da ligação a BDCA2 completamente inibindo a posterior ligação do BIIB059 para BDCA2. Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, antes da ligação a BDCA2 resulta em, pelo menos, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de inibição de posterior ligação de BIIB059 para BDCA2.

[6] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que de forma seletiva se liga ao ectodomínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1) e: (i) inibe a secreção de interferonas do tipo I e/ou interfero- nas do tipo III além deoutras citocinas e quimiocinas a partir de células dendríticas plasmocitoides; ou (ii) induz ou aumenta a depleção de células dendríticas plasmocitoides in vitro. Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 regula de forma negativa CD32A e/ou CD62L a partir da superfície de pDCs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 medeia a internalização de BDCA2 a partir da superfície celular de pDCs. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a BDCA2 cinomólogo (SEQ ID NO: 72) e BDCA2 Rhesus (SEQ ID NO: 72). Em certas modalidades, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe a secreção ou a produção de interferona do tipo I, in- terleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral α (TNF-α), interferona do tipo III, em proteínas inflamatórias de macrófagos 1 (PIM-1) -α/CCL3, MIP-1β/CCL4, quimioquina (motivo CC) ligante 5 (CCL5/RANTES), ou proteína-10 induzida por interferona Y (IP-10/CXCL10).

[7] Em algumas modalidades dos dois aspectos acima, o anti corpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ainda compreende ou consiste, de forma opcional, em um, dois, três, quatro, cinco, ou seis, das seguintes características: um EC50 (BDCA2 humano) de 0,5 para 3 μg/mL ou 4 nM a 10 nM; um EC50 (BDCA2 ci- nomólogo) de 0,5 a 3 mg/mL ou 5 nM a 10 nM; um pI de 7 a 7,5; não se liga ao Clec4b2 de rato, ou se liga ao Clec4b2 de rato com uma afinidade de ligação mais baixa do que BDCA2 humano, cinomólogo ou rhesus; inibe a produção ou a secreção de quimiocinas, tais como a MIP-1-α/CCL3, MIP-1β/CCL4, CCL5/RANTES, IP-10/CXCL10; um CDR1 da cadeia pesada, um CDR2 da cadeia pesada, e um CDR3 da cadeia pesada, em que o CDR1 da cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos que consiste na sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 8; o CDR2 da cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10; e o CDR3 da cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; e uma cadeia pesada variável que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 24. Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 89; um CDR2 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 91; e um CDR3 da cadeia pesada que consiste na sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; um CDR2 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 92; e um CDR3 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 90; um CDR2 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 93; e um CDR3 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 94. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tem um EC50 (BDCA2 humano) de 4,5 nM, 4,6 nM, 4,7 nM, 4,8 nM, 4,9 nM, 5,0 nM, 5,1 nM, 5,2 nM, 5,3 nM, 5,4 nM, ou 5,5 nM. Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tem um EC50 (BDCA2 humano) de 4,9 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tem um EC50 (BDCA2 cinomólogo) de 4,0 nM, 4,1 nM, 4,2 nM, 4,3 nM, 4,4 nM, 4,5 nM, 4,6 nM, 4,7 nM, 4,8 nM, 4,9 nM, ou 5,0 nM. Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tem um EC50 (BDCA2 cinomólogo) de 4,4 nM. Em certas modalidades deste aspecto, o anticorpo tem uma região da constante cadeia pesada e cadeia leve humana. Em certas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH1 e uma região de dobradiça. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH3. Se a região constante da cadeia pesada inclui substituições, tais substituições modificam as propriedades do anticorpo (por exemplo, aumentam ou diminuem uma ou mais: ligação ao receptor F, glicosilação de anticorpos, número de resíduos de cisteína, a função celular efetora, ou função complementar a). Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em modalidades específicas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 7-15 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 10 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 11 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 12 μg/mL.

[8] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva ao ectodomínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1), e compreende um CDR1 da cadeia pesada, um CDR2 da cadeia pesada, e um CDR3 da cadeia pesada. O CDR1 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFT- FSTYTMS (SEQ ID NO: 9) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR2 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TISPGDSFGYYYP- DSVQG (SEQ ID NO: 10) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR3 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. Em um outro aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um CDR1 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 89 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos; um CDR2 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 91 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de ami- noácidos; e um CDR3 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. Em um outro aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um CDR1 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos; um CDR2 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresenta- da na SEQ ID NO: 92 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos; e um CDR3 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de ami- noácidos. Em um outro aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um CDR1 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 90 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de ami- noácidos; um CDR2 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 93 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos; e um CDR3 da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 94 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. Estes anticorpos (i) ligam ao BDCA2 macaco humano ou cinomólogo, mas não ligam significativamente BDCA2 das espécies filogenéticas abaixo primatas; e/ou (ii) inibem interferona do tipo I induzida por TLR9/TLR7 e outra produção de cito- cina ou quimiocina de PDC humana; e/ou (iii) medeiam a internaliza- ção de BDCA2 a partir da superfície de pDCs; e/ou (iv) sobre-regulam CD32A e/ou CD62L a partir da superfície de pDCs; e/ou (v) esgotarm pDCs in vitro por meio de ADCC ou CDC. Em certas modalidades deste aspecto, o anticorpo tem uma cadeia pesada e uma cadeia leve humana da região constante.

[9] Em certas modalidades, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a BDCA2 humano tem um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 com a substituição de uma ou duas posições de aminoácidos; um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoá- cidos TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; e um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DIY- YNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9); um CDR2 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoáci- dos TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10); e um CDR3 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11). Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um CDR1 da cadeia leve, um CDR2 da cadeia leve e um CDR3 da cadeia leve. O CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7) ou na sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 com a substituição de uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. Em certas modalidades, o CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; o CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoá- cidos; e o CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SQQANEDPRT (SEQ ID NO: 7) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 com a substituição de uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9); um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10); um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DIY- YNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11); um CDR1 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KASQSVDYD- GDSYMN (SEQ ID NO: 5); um CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6); e um CDR3 da cadeia leveque compreende ou consiste na sequência de aminoácidos QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7).

[10] Em certas modalidades, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva BDCA2 humano compreende um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TYTMS (SEQ ID NO: 8) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 com a substituição de uma ou duas posições de aminoácidos; um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; e um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de ami- noácidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11) ou na sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 11 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TYTMS (SEQ ID NO: 8); um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10); e um CDR3 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11). Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um CDR1 da cadeia leve, um CDR2 da cadeia leve e um CDR3 da cadeia leve. O CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KAS- QSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 com a substituição de uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. Em certas modalidades, o CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; o CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; e o CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 com a substituição de uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TYTMS (SEQ ID NO: 8); um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de ami- noácidos TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10); um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoá- cidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11); um CDR1 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KASQSV- DYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5); um CDR2 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6); e um CDR3 da cadeia leveque que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7).

[11] Em certas modalidades, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva ao BDCA2 humano compreende um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFTFSTY (SEQ ID NO: 89) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 89 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SPGDSFG (SEQ ID NO: 91) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 91 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; e um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de ami- noácidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11) ou na sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 11 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFTFSTY (SEQ ID NO: 89); um CDR2 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SPGDSFG (SEQ ID NO: 91); e um CDR3 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DIY- YNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11). Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um CDR1 da cadeia leve, um CDR2 da cadeia leve e um CDR3 da cadeia leve. O CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SQQANEDPRT (SEQ ID NO: 7) ou na sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 com a substituição de uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. Em certas modalidades, o CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; o CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoá- cidos; e o CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste Na sequência de aminoácidos SQQANEDPRT (SEQ ID NO: 7) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 com a substituição de uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFTFSTY (SEQ ID NO: 89); um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SPGDSFG (SEQ ID NO: 91); um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11); um CDR1 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5); um CDR2 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6); e um CDR3 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoáci- dos SQQANEDPRT (SEQ ID NO: 7).

[12] Em certas modalidades, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva ao BDCA2 humano compreende um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 com a substituição de uma ou duas posições de aminoáci- dos; um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TISPGDSFGYY (SEQ ID NO: 92) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 92 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; e um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de ami- noácidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11) ou na sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 11 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9); um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TISPGDSFGYY (SEQ ID NO: 92); e um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11). Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um CDR1 da cadeia leve, um CDR2 da cadeia leve e um CDR3 da cadeia leve. O CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KAS- QSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SQQANEDPRT (SEQ ID NO: 7) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 com a substituição de uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. Em certas modalidades, o CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; o CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de ami- noácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; e o CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SQQANEDPRT (SEQ ID NO: 7) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 com a substituição de uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9); um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TISPGDSFGYY (SEQ ID NO: 92); um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de ami- noácidos DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11); um CDR1 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos KAS- QSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5); um CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6); e um CDR3 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SQQANEDPRT (SEQ ID NO: 7).

[13] Em certas modalidades, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva BDCA2 humano compreende um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos STYTMS (SEQ ID NO: 90) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 90 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos WVATISPGDSFGYY (SEQ ID NO: 93) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 93 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; e um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de ami- noácidos TRDIYYNYGAWFA (SEQ ID NO: 94) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 94 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos STYTMS (SEQ ID NO: 90); um CDR2 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos WVATISPGDSFGYY (SEQ ID NO: 93); e um CDR3 da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TRDIYYNYGAWFA (SEQ ID NO: 94). Em outras modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um CDR1 da cadeia leve, um CDR2 da cadeia leve e um CDR3 da cadeia leve. O CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DYDGDSYMNWY (SEQ ID NO: 95) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 95 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos LLIYAASTLE (SEQ ID NO: 96) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 96 com uma substi-tuição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. O CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de ami- noácidos QQANEDPR (SEQ ID NO: 97) ou na sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 97 com uma substituição em uma, duas, três, ou quatro posições de aminoácidos. Em certas modalidades, o CDR1 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DYDGDSYMNWY (SEQ ID NO: 95) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 95 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos; o CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos LLIYAASTLE (SEQ ID NO: 96) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 96 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoáci- dos; e o CDR3 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos QQANEDPR (SEQ ID NO: 97) ou na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 97 com uma substituição em uma ou duas posições de aminoácidos. Em outras modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui um CDR1 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos STYTMS (SEQ ID NO: 90); um CDR2 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos WVATISPGDSFGYY (SEQ ID NO: 93); um CDR3 da cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos TRDIY- YNYGAWFA (SEQ ID NO: 94); um CDR1 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos DYDGDSYMNWY (SEQ ID NO: 95); um CDR2 da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos LLIYAASTLE (SEQ ID NO: 96); e um CDR3 da cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos QQANEDPR (SEQ ID NO: 97).

[14] Em certas modalidades dos aspectos acima, o anticorpo tem uma cadeia pesada e uma cadeia leve humana da região constante. Em certas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH1 e uma região de dobradiça. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH3. Se a região constante da cadeia pesada inclui substituições, tais substituições modificam as propriedades do anticorpo (por exemplo, aumentam ou diminuem uma ou mais: ligação ao receptor F, glicosilação de anticorpos, número de resíduos de cisteína, a função celular efetora, ou a função complementar). Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em modalidades específicas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 7-15 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 10 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se a liga FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 11 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 12 μg/mL.

[15] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva ao ectodomínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1), e compreende um CDR1 da cadeia pesada, um CDR2 da cadeia pesada, e um CDR3 da cadeia pesada de VH de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 49, ou 52. Em algumas modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um CDR1 da cadeia leve, um CDR2 da cadeia leve e um CDR3 da cadeia leve de VL de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 54, 56, ou 58. CDR podem ser CDR de Kabat ou qualquer um dos CDRs alternados. Em certas mo-dalidades, o anticorpo tem uma cadeia pesada e uma cadeia leve humana da região constante. Em certas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH1 e uma região de dobradiça. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH3. Se a região constante da cadeia pesada inclui substituições, tais substituições modificam as propriedades do anticorpo (por exemplo, aumentam ou diminuem uma ou mais de: ligação ao receptor F, glicosilação de anticorpos, do número de resíduos de cisteína, a função celular efetora, ou a função complementar). Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em modalidades específicas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em certas modalidades, o anti-corpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 7-15 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 10 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma re gião Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 11 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 12 μg/mL. Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva ao ectodomínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1) e compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) que é pelo menos 80 % idêntico ao da sequência de aminoácidos do domínio VH de BIIB059 (SEQ ID NO: 24), ou o domínio VH de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 49, ou 52. Estes anticorpos (i) ligam BDCA2 humano ou de macaco cinomólogos, mas não ligam significativamente BDCA2 de espécies filogenéticas primatas abaixo; e/ou (ii) inibem interferona do tipo I induzida por TLR9/TLR7 e outra produção de citocina ou quimiocina de PDC humana; e/ou (iii) medeiam a internalização de BDCA2 a partir da superfície de pDCs; e/ou (iv) sobre-regulam CD32A e/ou CD62L a partir da superfície de pDCs; e/ou (v) esgotam pDCs in vitro por ADCC ou CDC.

[16] Em certas modalidades deste aspecto, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo compreende ou consiste em um domínio VH, que é pelo menos 90 % idêntico à sequência de aminoáci- dos do domínio VH de BIIB059 (SEQ ID NO: 24), ou o domínio VH de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 49, ou 52. Em algumas modalidades deste aspecto, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo compreende ou consiste em um domínio VH, que é pelo menos 95 % idêntico para a sequência de aminoácidos do domínio VH de BIIB059 (SEQ ID NO: 24), ou o domínio VH de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 49, ou 52. Em outras modalidades neste aspecto, o domínio VH do anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é idêntico à sequência de aminoácidos do domínio VH de BIIB059 (SEQ ID NO: 24), ou o domínio VH de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 49, ou 52. Em certas modalidades, a cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades deste aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ou consiste em um domínio variável da cadeia leve (VL) que é pelo menos 80 % idêntico à sequência de aminoácidos do domínio VL de BIIB059 (SEQ ID NO: 23), ou o domínio VL de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 54, 56, ou 58. Em algumas modalidades deste aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ou consiste em um domínio VL que é pelo menos 90 % idêntico à sequência de aminoácidos do domínio VL de BIIB059 (SEQ ID NO: 23), ou o domínio VL de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 54, 56, ou 58. Em algumas modalidades deste aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ou consiste em um domínio VL que é pelo menos 95 % idêntico à sequência de aminoácidos do domínio VL de BIIB059 (SEQ ID NO: 23), ou o domínio VL de acordo com qualquer uma de SEQ ID NOs: 54, 56, ou 58. Em algumas modalidades deste aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ou consiste em um domínio VH, que é idêntico à sequência de aminoácidos do domínio VH de BIIB059 (SEQ ID NO: 24) e um domínio VL que é idêntico à sequência de aminoácidos do domínio VL de BIIB059 (SEQ ID NO: 23). Em algumas modalidades deste aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ou consiste em um domínio VH que é idêntico à sequência de aminoácidos de um domínio VH de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 49, ou 52 e um domio VL de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 54, 56, ou 58. Em uma modalidade particular, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ou consiste em uma cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3. Estas modalidades referem-se a todos os aspectos acima referidos e as suas modalidades. Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo da cadeia simples. Em outras mo-dalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fab’, um fragmento Fsc, um fragmento Fv, um fragmento scFv, um fragmento SC (Fv)2, ou um dia- corpo. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante da cadeia pesada de IgG1.

[17] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo isolado do mesmo que se liga de forma seletiva ao ectodomínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1) e compreende um CDR1 da cadeia pesada, um CDR2 da cadeia pesada, e um CDR3 da cadeia peasada do anticorpo produzido por meio do hibridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA-13450. Em certas modalidades deste aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda um CDR1 da cadeia leve, um CDR2 da cadeia leve, e um CDR3 da cadeia leve do anticorpo produzido por meio do hi- bridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA- 13450. Em certas modalidades deste aspecto, o anticorpo tem uma cadeia pesada e uma cadeia leve humana da região constante. Em certas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH1 e uma região de dobradiça. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH3. Se a região constante da cadeia pesada inclui substituições, tais substituições modificam as propriedades do anticorpo (por exemplo, aumentam ou diminuem uma ou mais: ligação ao receptor F, glicosila- ção de anticorpos, do número de resíduos de cisteína, a função celular efetora, ou a função complementar). Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em modalidades específicas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 7-15 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 10 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 11 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 12 μg/mL. Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo isolado do mesmo que se liga de forma seletiva ao ectodo- mínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1) e compreende a variante de CDR1 da cadeia pesada, CDR2 da cadeia pesada, e CDR3 da cadeia pesada do anticorpo produzido por meio do hibridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA-13450, em que a cadeia pesada de variante de CDR1, CDR2, e CDR3 inclui uma, duas ou três substituições de aminoácidos em comparação com o CDR1 da cadeia pesada, CDR2 e CDR3, de maneira respectiva, do anticorpo produzido por meio do hibridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA-13450. Em certas modalidades deste aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda a variante de CDR1 da cadeia leve, CDR2 da cadeia leve, e CDR3 da cadeia leve do anticorpo produzido por meio do hibridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA-13450, em que a variante de CDR1 da cadeia leve, CDR2 e CDR3 inclui uma, duas ou três substituições de aminoácidos, em comparação com CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve, de maneira respectiva, do anticorpo produzido por meio do hibridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA- 13450. Em certas modalidades deste aspecto, o anticorpo tem uma cadeia pesada e uma cadeia leve humana da região constante. Em certas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH1 e uma região de dobradiça. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH3. Se a região constante da cadeia pesada inclui substituições, tais substituições modificam as propriedades do anticorpo (por exemplo, aumentam ou diminuem uma ou mais de: ligação ao receptor F, glico- silação de anticorpos, do número de resíduos de cisteína, a função celular efetora, ou a função complementar). Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em modalidades específicas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 7-15 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 10 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 11 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 12 μg/mL. Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um anticorpo isolado ou a um fragmento de ligação do antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva ao ecto- domínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1) ereticula a ligação do anticorpo produzido por meio do hibridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA -13.450. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em modalidades específicas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 7-15 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 10 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 11 ng/mL. Em certas modalidades, o anti-corpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 12 μg/mL. Em ainda outro aspecto, a presente invenção apresenta um fragmento de anticorpo isolado ou a ligação do antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva ao ectodomínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1), ao mesmo epítopo como o anticorpo produzido por meio do hibridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA-13450. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em modalidades específicas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 7-15 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 10 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 11 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 12 μg/mL. Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um anticorpo isolado ou a um fragmento de ligação do antígeno do mesmo que se liga de forma seletiva ao ectodomínio de BDCA2 humano (SEQ ID NO: 1) e compreende um domínio VH, que é pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, em menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, em menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, idêntico ao domínio VH do anticorpo produzido por meio do hibridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA-13450. Em certas modalidades deste aspecto, o anticorpo isolado fragmento de ligação do antígeno do mesmo compreende um domínio VL que é pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, ou, pelo menos, 98 % idêntico ao domínio VL do anticorpo produzido por meio do hibridoma depositado na ATCC com o número de designação PTA- 13450.

[18] Em todos os cinco aspectos acima, o anticorpo ou o frag mento de ligação ao antígeno do mesmo ainda: (i) inibe a secreção de interferonas do tipo I e/ou de interferonas do tipo III, além de outras citocinas e quimiocinas a partir de células dendríticas plasmocitoides; ou (ii) induz ou aumenta a depleção de células dendríticas plasmoci- toides in vitro. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo regula de forma negativa CD32A e/ou CD62L em um PDC (em relação a um PDC que não é posto em contato com um anticorpo anti-BDCA2). Em certas modalidades, o anticorpo medeia a internali- zação de BDCA2 a partir da superfície de pDCs. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a BDCA2 cinomólogo (SEQ ID NO: 72) e BDCA2 de Rhesus (SEQ ID NO: 72). Em certas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe a secreção ou a produção de inter- ferona do tipo I, interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral α (TNF- α), interferona do tipo III, proteína inflamatória de macrófagos-1 (MIP- 1) -α/CCL3, MIP-1β/CCL4, quimioquina (motivo CC) ligante 5 (CCL5/RANTES), ou interferona Y induzida por meio da proteína 10 (IP-10/CXCL10). Em certas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo da cadeia simples. Em outras modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um fragmento Fab, um fragmento F (ab’) 2, um fragmento Fab', um fragmento Fsc, um fragmento Fv, um fragmento scFv, um fragmento sc(Fv)2, ou um diacorpo. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo tem uma região constante da cadeia pesada de IgG1. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo tem uma região constante da cadeia pesada de IgG2. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo tem uma cadeia pesada de região constante de IgG4. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo é um híbrido da cadeia pesada das regiões cons-tantes de IgG1 e IgG4.

[19] Em certas modalidades, a presente invenção proporciona uma célula isolada que produz qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno acima descritos.

[20] Em outras modalidades, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno acima descritos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos acima descritos formulados em uma composição que compreende citrato a 10 a 25 mM, cloreto de sódio a 100 a 200 mM, e com um pH de 5,5 a 6,5. Em certas modalidades a composição farmacêutica inclui opcionalmente Tween-80 (0,01 a 0,3 %, por exemplo, 0,03 %). Em ainda outras modalidades, a composição farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos descritos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos acima formulados em uma composição compreendendo citrato de sódio a 20 mM, cloreto de sódio a 150 mM e um pH de 6,0.

[21] Em um outro aspecto, a presente invenção providencia um método para a preparação de um anticorpo anti-BDCA2. O método envolve o fornecimento de uma célula que compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve do anticorpo BDCA2, incubação da célula sob condições que permitem a expressão do anticorpo e o isolamento do anticorpo. O método compreende, opcionalmente, purificar o anticorpo. Em certas modalidades, a célula é uma célula CHO. Em outras modalidades, a célula é uma célula 293. Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-BDCA2 é BIIB059. Em uma modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui uma cadeia pesada e cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende ou consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4, e a cadeia leve compreende ou consiste a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ou consiste em um CDR1 de VH que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, um CDR2 de VH que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e um CDR3 de VH que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ou consiste em um CDR1 de VH que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, um CDR2 de VH que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, um CDR3 de VH que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, um CDR1 de VL que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, uma CDR2 DE VL que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e um CDR3 de VL que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

[22] Em um outro aspecto, a presente invenção providencia um método para detectar a presença de uma célula dendrítica plasmoci- toides em um tecido. O método compreende fazer contactar o tecido com um anticorpo anti-BDCA2. Em certas modalidades, o tecido é uma biópsia da pele de um indivíduo com lúpus eritematoso sistêmico. Em certas modalidades, o tecido é uma biópsia da pele de um indivíduo com esclerodermia. Em certas modalidades, o tecido é uma biópsia da pele de um indivíduo possuindo morfeia. Em certas modalidades, o tecido é uma biópsia da pele de um indivíduo com artrite reuma- toide. Em certas modalidades, o tecido é uma biópsia da pele de um indivíduo possuindo psoríase. Em certas modalidades, o tecido é uma biópsia da pele de um indivíduo possuindo dermatomiosite. Em certas modalidades, o tecido é uma biópsia da pele de um indivíduo tendo polimiosite. Em certas modalidades, o tecido é uma biópsia da pele de um indivíduo com doença inflamatória do intestino. Em modalidades específicas, o lúpus eritematoso sistêmico é lúpus cutâneo, lúpus dis- coide, ou nefrite lúpica. O anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser marcado, por exemplo, com um fluoróforo (por exemplo, Alexa Fluor 647). Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 é BIIB059. Em outras modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 é um clone de 124B3.13 (dendríticas). Em certas modali- dades, o método compreende ainda fazer contactar o tecido com um anticorpo anti-CD123.

[23] Em um outro aspecto, a presente invenção providencia um método de induzir a morte de uma célula dendrítica plasmocitoide em um indivíduo com essa necessidade. O método envolve a administração a um indivíduo, ou o contato de uma célula dendrítica plasmocitoi- de que expressa BDCA2 com qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção.

[24] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um método de redução da produção de citoquinas inflamatórias ou quimi- ocinas por meio de uma célula dendrítica plasmocitoide em um indivíduo com essa necessidade. O método compreende a administração a um indivíduo, ou o contato de uma célula dendrítica plasmocitoide que expressa BDCA2 com uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção. Em certas modalidades, as citoquinas inflamatórias ou quimiocinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em: interferona tipo I, IL-6, ou TNF-α, interferona do tipo III, a MIP- 1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, CCL5/RANTES, e IP-10/CXCL10.

[25] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um método para regular de forma negativa a expressão de CD32A na superfície de uma célula dendrítica plasmocitoide. O método compreende o contato da célula dendrítica plasmocitoide com um anticorpo anti- BDCA2 descrito na presente invenção. Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 tem uma região constante da cadeia pesada de IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante da cadeia pesada de IgG2. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma cadeia pesada de região constante de IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo é um híbrido da cadeia pesada das regiões cons- tantes de IgG1 e IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo é aglicosi- lado. Em uma modalidade específica, o anticorpo é um híbrido aglico- silado da cadeia pesada das regiões constantes de IgG1 e IgG4.

[26] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um método para regular de forma negativa a expressão de CD32A (FcYRIIa) na superfície de uma célula dendrítica plasmocitoide em um indivíduo humano com essa necessidade. O método compreende a administração a um indivíduo humano de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção. Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 tem uma região constante da cadeia pesada de IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante da cadeia pesada de IgG2. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma cadeia pesada de região constante de IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo é um híbrido da cadeia pesada das regiões constantes de IgG1 e IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo é aglicosilado. Em uma modalidade específica, o anticorpo é um híbrido aglicosilado da cadeia pesada das regiões constantes de IgG1 e IgG4.

[27] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um método de inibir a estimulação de uma célula dendrítica plasmocitoide por meio dos complexos imunes em um indivíduo humano com essa necessidade. O método compreende a administração a um indivíduo humano de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção. Em algumas modalidades, a administração reduz o nível de CD32A na superfície de pDCs. Em algumas modalidades, o indivíduo tem hipersensibilidade do tipo III. Em uma modalidade, o indivíduo humano tem LES. Em uma outra modalidade, o indivíduo humano sofre de artrite reumatoide. Em ainda outra modalidade, o indivíduo tem síndrome de Sjogren. Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 tem uma região constante da cadeia pesada de IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante da cadeia pesada de IgG2. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma cadeia pesada de região constante de IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo é um híbrido da cadeia pesada das regiões constantes de IgG1 e IgG4.

[28] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um método para regular de forma negativa a expressão (ou libertação) de CD62L (L-selectina) na superfície de uma célula dendrítica plasmoci- toide em um indivíduo humano com essa necessidade. O método compreende a administração a um indivíduo humano de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito na presente invenção. Em modalidades específicas, a administração do anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aumenta o nível de uma ou mais meta- loproteinases. Em certas modalidades, a regulação negativa de CD62L ocorre através de clivagem por meio de uma metaloproteinase. Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 tem uma região constante da cadeia pesada de IgG1. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo tem uma região constante da cadeia pesada de IgG2. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo tem uma cadeia pesada de região constante de IgG4. Em algumas modalidades dos cinco aspectos acima, o anticorpo é um híbrido da cadeia pesada das regiões constantes de IgG1 e IgG4.

[29] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um método de tratamento de um distúrbio inflamatório em um indivíduo com essa necessidade. O método envolve a administração a um indivíduo com essa necessidade de uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos anti-BDCA2 ou dos fragmentos de ligação ao antí- geno dos mesmos descritos na presente invenção. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório é selecionado a partir do grupo que consiste em lúpus eritematoso sistêmico (SLE), o lúpus cutâneo, lúpus discoide, nefrite de lúpus, artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, esclerose sistêmica, esclerodermia, psoríase, diabetes do tipo I, dermatomiosite, polimiosite, e doença de Sjogren. Em uma modalidade particular, o distúrbio inflamatório é lúpus. Em uma outra modalidade particular, o distúrbio inflamatório é lúpus discoide. Em ainda uma outra modalidade particular, o distúrbio inflamatório é lúpus nefri- te. Em uma outra modalidade particular, o distúrbio inflamatório é lúpus cutâneo. Em certas modalidades, o indivíduo tem SLE geral. Em certas modalidades, o indivíduo tem SLE moderado. Em certas modalidades, o indivíduo tem SLE moderado sem CNS grave ativo e/ou envolvimento renal grave ativo. Em certas modalidades, o indivíduo tem SLE moderado com CNS grave ativo e/ou envolvimento renal grave ativo. Em certas modalidades, o indivíduo tem manifestações cutâneas de SLE (por exemplo, malares ou rash discoide). Em certas modalidades, o indivíduo tem SLE grave. Em certas modalidades, o indivíduo tem SLE grave sem CNS grave ativo e/ou envolvimento renal grave ativo. Em certas modalidades, o indivíduo tem SLE grave com CNS grave ativo e/ou envolvimento renal grave ativo. Lúpus moderado ou grave é uma encenação de lúpus (vide, por exemplo, Orientações para a Referência e Gestão de Lúpus Eritematoso Sistêmico em adultos, Artrites & Reumatismo, 42 (9): 1785 a 1795 (1999); Gladman, prognóstico e tratamento do lúpus sistêmico eritematoso, Curr Opin Rheumatol, 8: 430 a 437 (1996); Kalunian et al, Definição, Classificação, Atividade e índices de danos Em : Lúpus eyrthematosus de Dubois 5° ed, Baltimore: Williams e Wilkins, pp 19 a 30 (1997)).

[30] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um método de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo com essa necessidade. O método envolve a administração a um indivíduo com essa necessidade de uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos anti-BDCA2 ou dos fragmentos de ligação ao antí- geno dos mesmos descritos na presente invenção.

[31] Em qualquer um dos aspectos acima mencionados relacio nados com métodos, em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em qualquer dos aspectos acima mencionados relacionados com os métodos, em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de antígeno de ligação anti-BDCA2 é administrado em combinação com pelo menos um de: um antimalárico (por exemplo, hidroxicloro- quina), um inibidor da sinalização TLR7, um inibidor da sinalização TLR9, ou um corticosteroide. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-BDCA2 compreende CDRs das cadeias pesadas e leves de cadeia BIIB059. Em uma modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada estabelecidos na SEQ ID NOs. 8, 10, e 11, de maneira respectiva e CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de ma-neira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 89, 91, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti- BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 9, 92, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 90, 93, e 94, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 95, 96, e 97, de maneira respectiva. Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 compreende ainda uma região Fc, que se liga a CD32A com um EC50 de, pelo menos, cerca de 7 a 15 μg/mL (por exemplo, 10, 11, 12 μg/mL). Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-BDCA2 é BIIB059.

[32] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta uma combinação compreendendo um antimalárico (por exemplo, hidroxiclo- roquina) e um anticorpo ou um fragmento de antígeno de ligação dos mesmos anti-BDCA2. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti- BDCA2 compreende CDRs da cadeia pesada (ou CDRs alternados) das SEQ ID NO: 24. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti- BDCA2 compreende CDRs da cadeia leve (ou CDRs alternados) de SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti- BDCA2 compreende CDRs das cadeias pesadas e das cadeias leves de BIIB059. Em uma modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 8, 10, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 89, 91, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 9, 92, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 90, 93, e 94, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 95, 96, e 97, de maneira respectiva. Em certas modalidades, o anticorpo anti- BDCA2 compreende ainda uma região Fc, que se liga a CD32A com um EC50 de, pelo menos, cerca de 7 a 15 μg/mL (por exemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14 μg/mL). Em uma modalidade específica, o anticorpo an- ti-BDCA2 é BIIB059.

[33] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta uma combinação compreendendo um Inibidor de sinalização TLR7 e/ou TLR9 e um anticorpo ou um fragmento de antígeno de ligação dos mesmos anti-BDCA2. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti- BDCA2 compreende CDRs da cadeia pesada (ou CDRs alternados) das SEQ ID NO: 24. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti- BDCA2 compreende CDRs da cadeia leve (ou CDRs alternados) de SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti- BDCA2 compreende CDRs das cadeias pesadas e das cadeias leves de BIIB059. Em uma modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 8, 10, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 89, 91, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 9, 92, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 90, 93, e 94, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 95, 96, e 97, de maneira respectiva. Em certas modalidades, o anticorpo anti- BDCA2 compreende ainda uma região Fc, que se liga a CD32A com um EC50 de, pelo menos, cerca de 7 a 15 μg/mL (por exemplo, 10, 11, 12 μg/mL). Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-BDCA2 é BIIB059.

[34] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta uma combinação compreendendo um corticosteroide e um anticorpo ou um fragmento de antígeno de ligação dos mesmos anti-BDCA2. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-BDCA2 compreende CDRs da cadeia pesada (ou CDRs alternados) das SEQ ID NO: 24. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende CDRs da cadeia leve (ou CDRs alternados) de SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-BDCA2 compreende CDRs das cadeias pesadas e das cadeias leves de BIIB059. Em uma modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 8, 10, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 89, 91, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 9, 92, e 11, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 5, 6, e 7, de maneira respectiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 compreende o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, estabelecidos na SEQ ID NOs. 90, 93, e 94, de maneira respectiva e o CDR1 CDR2, e CDR3 da cadeia leve, estabelecidos na SEQ ID NOs. 95, 96, e 97, de maneira respectiva. Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 compreende ainda uma região Fc, que se liga a CD32A com um EC50 de, pelo menos, cerca de 7 a 15 μg/mL (por exemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14 μg/mL). Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-BDCA2 é BIIB059.

[35] A menos que de outro modo seja definido, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado que o normalmente entendido por meio de uma pessoa que seja versada na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos na presente invenção possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais exemplares são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionados na presente invenção são incorporados por meio de referência na sua totalidade. Em caso de conflito, o presente pedido de Patente, incluindo as definições, irá controlar. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

[36] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, e a partir das reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos

[37] A Figura 1 é uma representação esquemática de sinaliza ção BDCA2 em uma célula dendrítica plasmocitoide (Vide, Geijtenbeek et al, Nature Reviews Immunology, 9: 465 a 479 (2009)).

[38] A Figura 2 é um gráfico que mostra as variantes de ligação hu24F4 Hx/L1 a BDCA2 humano.

[39] A Figura 3 é um gráfico que mostra as variantes de ligação hu24F4 Hx/L1 a BDCA2 cinomólogo.

[40] A Figura 4 é um mapa esquemático de pJP009 plasmídeo que codifica a cadeia leve anti-BDCA2. A sequência de ácido nucleico da cadeia leve anti-BDCA2 está sob o controle transcricional do promotor de hCMV IE e as sequências de poliadenilação de hGH. O gene da fosfotransferase de aminoglicosídeo (resistência à neomicina) está sob o controle transcricional das sequências de fosfoglicerina quinase (muPGK) do promotor e de poliadenilação de murino. As sequências restantes, incluindo o gene para a beta-lactamase são para propagação e seleção em E. coli.

[41] A Figura 5 é um mapa esquemático de pJP010 plasmídeo que codifica a cadeia pesada de anti-BDCA2. A sequência de ácido nucleico da cadeia pesada anti-BDCA2 está sob o controle transcricio- nal do promotor de hCMV IE e sequências de poliadenilação de crescimento humano de hGH. O gene para a di-hidrofolato redutase (dhfr) está sob o controle transcricional das sequências do promotor e de poliadenilação SV40E. As sequências restantes, incluindo o gene para a beta-lactamase são para propagação e seleção em E. coli.

[42] A Figura 6 é um gráfico de linhas que mostra a ligação de BIIB059 em células dendríticas plasmocitoides cinomólogas (A) e humanas (B). O sangue total de macaco cinomólogo (A) ou de ser humano (B) foi incubado com concentrações variadas de anticorpo marcado com Alexa647 BIIB059 (círculos), ou um isotipo IgG humano (quadrados) em gelo. Os dados foram adquiridos usando a máquina de FACS LSRII-4 em cores, e analisados usando o software Prism GraphPad e FlowJo.

[43] A Figura 7 é um gráfico de linhas que mostra os resultados de um ensaio AlphaScreen para a autoassociação. Chave: diamante = BIIB059; quadrado = 5c8; e triângulo = LT105.

[44] A Figura 8 é um gráfico de linhas que mostra os resultados de uma fluorometria de varrimento diferencial para testar a estabilidade de BIIB059 ao longo de diferentes condições. Este gráfico mostra os dados com cloreto de sódio a 150 mM e sacarose a 250 mM como uma função do pH.

[45] A Figura 9 é um gráfico de linhas que mostra o efeito na agregação de agitação ao longo do tempo. A agregação foi suprimida com a adição de Tween 80.

[46] A Figura 10 é um gráfico de linhas que mostra a ligação di reta de AC144 para superfície BDCA2 humana e cinomóloga.

[47] A Figura 11 é uma série de gráficos que mostra os resulta dos da análise por meio da cromatografia de exclusão por tamanho das proteínas de fusão de Fc.

[48] A Figura 12 é um gráfico que mostra o efeito do cálcio so bre a ligação a BIIB059 a BDCA2. A Ligação de BIIB059 a BDCA2 é melhorada por meio da adição de cálcio em relação ao EDTA sobre dando um sinal 2 vezes superior.

[49] A Figura 13 é um gráfico que mostra os resultados de liga ção de octeto a BIIB059 para ectodomínios de BDCA humanos e de macaco cinomólogo.

[50] A Figura 14 é um gráfico que mostra que BIIB059 inibe po tencialmente IFNa a partir de PBMC estimulados com agonista de TLR9. Cada símbolo representa IC50 a partir de um experimento independente e as linhas verticais representam o SEM.

[51] As Figuras 15 A a C mostram uma série de gráficos que mostram que BIIB059 inibe potencialmente citocinas e quimiocinas a partir de sangue total estimulado com TLR9 ligante. A Figura 15A mostra a inibição de IFNa usando sangue venoso heparinizado a partir de doadores saudáveis. A Figura 15B mostra a inibição de IFNa usando sangue total de dois doentes com SLE (painéis superiores), em comparação com os resultados usando sangue total de dois doadores saudáveis (painéis inferiores). A Figura 15C apresenta uma série de gráficos de barras que mostram que o tratamento BIIB059 conduziu à inibição de uma grande variedade de citoquinas e quimiocinas.

[52] A Figura 16 é um gráfico de barras que mostra que BIIB059 inibe a expressão de interferona do tipo I.

[53] A Figura 17 inclui dois gráficos lineares que mostram que a ligação de BDCA2 com BIIB059 inibe a produção de citocinas induzida por TLR9 em pDCs purificadas.

[54] A Figura 18 é um gráfico de barras que mostra que a liga ção de BDCA2 suprime a indução da produção de IFN-α no SLE soro estimulado por pDCs.

[55] A Figura 19A é um gráfico linear mostrando que BDCA2 é internalizado após a ligação com BIIB059. A Figura 19B é um gráfico linear mostrando que a internalização não afeta a inibição mediada por meio de BIIB059 de produção de IFN-α.

[56] A Figura 20 é uma série de gráficos mostrando a ligação de BIIB059 a receptores Fcy.

[57] A Figura 21 apresenta os resultados de ELISA C1q de monstrando a ligação de C1q a concentrações crescentes (0-15 μg/mL) de anticorpo revestido.

[58] As Figuras 22 A a D são uma série de gráficos que mos tram que BIIB059 medeia a morte celular através de ADCC. A linhagem celular CHO (EAG2456 T1F2 Clone 34.16.7) foi usada como a célula-alvo. O nível de expressão de BDCA2 na superfície de células CHO, foi determinado por meio de FACS usando um anticorpo anti- BDCA2 mAb marcado com APC (clone AC144, Miltenyi). As células NK foram usadas como as células efetoras. ADCC foi avaliada usando o kit de Ensaio de Citotoxicidade Vybrant (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. O ensaio detecta G6PD a partir das células danificadas com base na redução dependente da G6PD de resazurina que emite fluorescência a 590 nm após excitação a 530 nm. O ensaio de ADCC representado na Figura 22A foi realizado usando elevado BDCA2 expressando as células CHO (Figura 22C) enquanto o ensaio de ADCC na Figura 22B usou as células de CHO com menor expressão de BDCA2 (Figura 22D).

[59] A Figura 23 é um gráfico linear mostrando que BIIB059 me deia a morte celular através da CDC. As células CHO (EAG2456 T1F2 Clone 34.16.7) foram semeadas a 5 x 104 células em placas de 96 poços de poços de colágeno negro e incubadas a 370C durante 48 horas. As placas foram então lavadas e incubadas com complemento de soro de coelho e de iodeto de propídio (PI) na presença de competente efetor anti-BDCA2 mAbs (24F4S e BIIB059), a função efetora mAbs deficiente (24F4S-Agly e 24F4A-Agly) ou controle de isotipo de IgG1 durante 1 h a 37 0°C. O controle negativo consistiu em poços contendo células CHO, complemento de coelho, soro de PI, sem anticorpos.

[60] A Figura 24 é uma série de gráficos usados para determiner EC50 de ligação a BIIB059 ("direta") e ligação a BIIB059-A647 competitiva ("indireto") em pDCs de macaco cinomólogo. Antes da injeção in vivo de BIIB059, recolheu-se sangue a partir de doze macacos cino- mólogos, uma vez por semana durante três semanas dadas. A citome- tria de fluxo foi usada para determinar o valor EC50 de Ligação de BIIB059 a BDCA2 na superfície celular pDC (método "direto"), e a quantidade de receptor disponível BDCA2 disponível na presença de BIIB059 (método "indireto"). O sangue foi incubado com uma titulação de seis pontos de BIIB059 na faixa de 40 a 0,04 pg/mL. pDCs foram identificados por meio da citometria de fluxo como CD20-CD14- CD123+HLA-DR +, e tratado com uma IgG PE anti-humano marcado secundário, ou BIIB059-A647 rotulado a 10 μg/mL. O MFI de PE (símbolos abertos, representados graficamente no eixo dos Y esquerdo) ou A647 (símbolos cheios, representados graficamente no eixo dos Y direito) foi calculado em software FlowJo, e representado graficamente usando o software GraphPad Prism (quatro parâmetros de regressão não linear de ajuste de curva de dados transformados em log). Os gráficos representativos de quatro dos doze macacos cinomólogos são mostrados na presente invenção.

[61] A Figura 25 é um gráfico representativo apresentando a li gação do anticorpo BIIB059 anti-BDCA2 à superfície celular em BDCA2 pDCs em todo o sangue dos macacos cinomólogos. O sangue foi incubado com uma titulação de seis pontos de BIIB059 na faixa de 40 a 0,04 pg/mL. pDCs foram identificados por meio da citometria de fluxo como CD20-CD14-CD123 + HLA-DR +, e tratados com uma IgG PE anti-humano marcada secundária. O MFI de PE foi calculado em software FlowJo, e a porcentagem de ligação máxima, usando a 40 μg/mL como ponto de 100 %, foi calculada. Cada linha representa um macaco cinomólogo individualmente, para um total de doze macacos cinomólogos, e representados graficamente usando o software GraphPad Prism (quatro parâmetros de regressão não linear de ajustamento da curva dos dados transformados em log). A coloração foi re-petida uma vez por semana durante três semanas dadas. As linhas tracejadas demonstram que uma concentração de 10 μg/mL de BIIB059 satura o receptor BDCA2 de ligação para todos os macacos cinomólogos.

[62] As Figuras 26 A a C abordam os níveis de limite BIIB059 e coloração sem BDCA2 no veículo tratado com macacos cinomólogos. A Figura 26A é uma série de histogramas FACS que mostram a coloração de fundo PE em veículo tratado com macacos cinomólogo. Aos macacos cinomólogos 1, 4 e 12, foi administrada uma injeção única IV de controle do veículo (citrato de sódio) no tempo 0. Após 1 hora, foi tirado sangue total, e pDCs foram identificados por meio da citometria de fluxo como CD20-CD14-CD123 + HLA-DR +, e tratados com PE anti-IgG humano (histogramas a branco) ou tampão FACS como fluorescência PE menos um controle (FMO) (histogramas a cheio). A Figura 26B é um gráfico da coloração de PE em pDCs do sangue que é baseado em três macacos cinomólogos tratados com veículo, nos pon-tos de tempo indicados. O MFI de PE foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software GraphPad Prism. A Figura 26C é um gráfico da coloração A647 em pDCs a partir do sangue que é ba- seado em três macacos cinomólogos tratados com veículo, nos pontos de tempo indicados. BIIB059-A647 a 10 μg/mL foi adicionado ao sangue retirado dos três macacos cinomólogos tratados com veículo em cada um dos pontos de tempo indicados, e ensaiados para a coloração A647 em pDCs. MFI do A647 foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software GraphPad Prism.

[63] As Figuras 27 A a C mostram que o receptor ligado a BIIB059 e BDCA2 já não está disponível na superfície celular pDC após uma única dose de BIIB059 10 mg/kg em macaco cinomólogo. A Figura 27A é uma série de histogramas FACS que mostram a coloração BIIB059 em BIIB059 10 mg/kg de macacos cinomólogos tratados. Aos macacos cinomólogos de 3, 8 e 10 foi administrada uma única injeção IV de BIIB059 a 10 mg/kg no tempo 0. Após 1 hora, foi tirado sangue total, e foram identificados como pDCs CD20-CD14- CD123+HLA-DR +, e tratados com PE anti-IgG humano (histogramas a branco) ou tampão FACS como controle PE FMO (histogramas a cheio). A Figura 27B é um gráfico da coloração de PE em pDCs do sangue que é baseado em três macacos cinomólogos tratados com BIIB059 nos pontos de tempo indicados. O MFI de PE foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software GraphPad Prism. A Figura 27C é um gráfico da coloração A647 em pDCs a partir do sangue que é baseado em três macacos cinomólogos tratados com BIIB059 nos pontos de tempo indicados. BIIB059-A647 a 10 μg/mL foi adicionado ao sangue retirado dos três macacos cinomólogos tratados com BIIB059 em cada um dos pontos de tempo indicados, e ensaiados para a coloração A647 em pDCs. MFI do A647 foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software GraphPad Prism.

[64] As Figuras 28 A a C mostram que o receptor ligado a BIIB059 e BDCA2 já não estão disponíveis na superfície celular pDC após uma única dose de BIIB059 a 1 mg/kg em macaco cinomólogo. A Figura 28A é uma série de histogramas FACS que mostram a coloração de BIIB059 em macacos cinomólogos tratados com BIIB059 a 1 mg/kg. Aos macacos cinomólogos 3, 8 e 10 foi administrada uma única injeção IV de BIIB059 a 1 mg/kg no tempo 0. Após 1 hora, foi tirado sangue total, e foram identificados como pDCs CD20-CD14- CD123+HLA-DR +, e tratado com PE anti-IgG humano (histogramas a branco) ou tampão FACS como controle PE FMO (histogramas a cheio). A Figura 28B é um gráfico da coloração de PE em pDCs do sangue que é baseado em três macacos cinomólogos tratados com BIIB059 nos pontos de tempo indicados. O MFI de PE foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software GraphPad Prism. A Figura 28C é um gráfico da coloração A647 em pDCs a partir do sangue que é baseado em três macacos cinomólogos tratados com BIIB059 nos pontos de tempo indicados. BIIB059-A647 a 10 μg/mL foi adicionado ao sangue retirado dos três macacos cinomólogos tratados com BIIB059 em cada um dos pontos de tempo indicados, e ensaiados para a coloração A647 em pDCs. MFI do A647 foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software GraphPad Prism.

[65] As Figuras 29 A a C mostram que o receptor ligado a BIIB059 e BDCA2 já não está disponível na superfície celular pDC após uma dose única por via subcutânea (SC) de BIIB059 0,2 mg/kg em macaco cinomólogo. A Figura 29A é uma série de histogramas FACS que mostram a coloração BIIB059 no SC de macacos cinomó- logos tratados com BIIB059 a 0,2 mg/kg. Aos macacos cinomólogos 4, 6 e 12 foram administrados em uma única injeção SC de BIIB059 a 0,2 mg/kg no tempo 0. Após 1 hora, foi tirado sangue total, e foram identificados como pDCs CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, e tratados com PE anti-IgG humano (histogramas a branco) ou tampão FACS como controle PE FMO (histogramas a cheio). A Figura 29B é um gráfico da coloração de PE em pDCs do sangue que é baseado em três macacos cinomólogos tratados com BIIB059 nos pontos de tempo indicados. MFI de PE foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software GraphPad Prism. A Figura 29C é um gráfico da coloração A647 em pDCs a partir do sangue que é baseado em três macacos cinomó- logos tratados com BIIB059 nos pontos de tempo indicados. BIIB059- A647 a 10 μg/mL foi adicionado ao sangue retirado dos três macacos cinomólogos tratados com BIIB059 em cada um dos pontos de tempo indicados, e ensaiadas para a coloração A647 em pDCs. MFI do A647 foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software GraphPad Prism.

[66] A Figura 30 é uma série de gráficos que mostra as correla ções observadas PK/PD para macacos cinomólogos que receberam BIIB059 IV a 1 mg/kg, e macacos cinomólogos que receberam BIIB059 IV a 10 mg/kg. Para cada gráfico nesta figura, a concentração de soro BIIB059 é representada no eixo y-esquerda (símbolos abertos), e a densidade do receptor BDCA2 é representada no eixo y direito (símbolos a cheio). O procedimento acelerado observado em macaco cino- mólogo 5 foi provavelmente devido a imunogenicidade para BIIB059.

[67] A Figura 31 é uma série de gráficos que mostra as correla ções observadas PK/PD para macacos cinomólogos que receberam BIIB059 SC a 0,2 mg/kg. Para cada gráfico nesta figura, a concentração de soro BIIB059 é representada no eixo y-esquerda (símbolos abertos), e densidade do receptor BDCA2 é representada no eixo y direito (símbolos a cheio).

[68] A Figura 32 é uma série de gráficos de barras que mostra os resultados de ensaios de ELISA ou multiplex para medir as concentrações de citocinas inflamatórias e quimiocinas produzidas por pDCs tratados com CpG-A, CpG-A na presença de anti-BDCA2, e CpG-A na presença de controle de isotipo. Cada barra representa a média e o desvio-padrão (SD) para poços em duplicado a partir de um doador humano saudável representativode de 5 testados. As linhas verticais representam o SD.

[69] A Figura 33 é uma série de gráficos de barras que mostram os resultados de ensaios de ELISA ou multiplex para medir concentrações de citocinas inflamatórias e quimiocinas produzidas por pDCs tratados com complexos imunes Sm/RNP, complexos imunes Sm/RNP na presença de anti-BDCA2, e complexos imunes Sm/RNP na presença de controle de isotipo. Cada barra representa a média e o desvio- padrão (SD) para poços em duplicado a partir de um doador humano saudável representativo de 5 testados. As linhas verticais representam o SD.

[70] A Figura 34 é uma série de gráficos de barras que mostra os resultados de ensaios de qPCR para determinar o efeito de BIIB059 na transcrição do IFN do tipo I em subtipos Sm/RNP de pDCs estimulados por IC a partir de doadores humanos saudáveis. Cada barra representa a variação média relativa de dobra para poços em quadruplicado de um doador representativo de 3 testados (n = 3) e as linhas verticais representam o desvio-padrão (SD).

[71] A Figura 35A mostra a inibição dependente da dose media da por BIIB059 de IFNa induzida por TLR9 por PBMC de um representante do doador humano saudável de 18 testados. Cada símbolo representa a média e desvio-padrão (DP) de poços duplicados. A Figura 35B mostra a inibição dependente da dose mediada por BIIB059 de IFNa induzida por TLR9 por PBMC de um paciente representante SLE de 11 testados. Cada símbolo representa a média e desvio-padrão (DP) de poços duplicados. A Figura 35C mostra os valores de IC50 para a inibição dependente da dose mediada por BIIB059 de IFNa induzida por TLR9 em doadores humanos saudáveis (HD) em comparação com pacientes com SLE (LES). Cada símbolo representa um doa-dor individual e as linhas verticais representam o SD.

[72] A Figura 36A mostra a inibição dependente da dose media da por BIIB059 de IFNa induzida por TLR9 de um ensaio de sangue total representante de 12 testados. Cada símbolo representa a média e desvio-padrão (DP) de poços duplicados. A Figura 36B mostra os valores de IC50 para a inibição da produção de BIIB059 de IFNa induzida por TLR9 em ensaios de sangue total, em comparação com ensaios de PBMC. Cada símbolo representa um doador individual e linhas verticais descreve o SD.

[73] A Figura 37 mostra PBMC de doadores humanos saudáveis que foram estimulados com 1 uM do ligante TLR3 (poli I: C) e tratados com concentrações de BIIB059 que variam de 10 μg/mL a 0,5 ng/mL em um volume total de ensaio de 250 pL/poço em uma placa de 96 poços. As placas foram incubadas durante a noite (18 horas) a 37°C e 5 % de CO2. 200 μL dos sobrenadantes foram recolhidos para avaliação dos níveis de IFNa por ELISA. Cada símbolo representa os níveis médios de IFNa produzidos em cada condição de tratamento. Os dados de dois doadores independentes são apresentados. As linhas verticais representam o desvio-padrão (SD).

[74] A Figura 38A mostra a internalização de BDCA2 mediada pela dose-dependente BIIB059 de um doador humano saudável representante. Os círculos representam MFI de coloração 2D6 nas várias doses de BIIB059. O triângulo representa a MFI de 2D6 na presença do controle do isotipo (coloração máxima). O diamante representa o MFI de controle FMO (coloração de fundo). A Figura 38B mostra EC50 de internalização induzido por BIIB059 BDCA2 em pDCs em ensaios de sangue total de doadores humanos saudáveis (círculos a cheio, n = 10 doadores). A EC50 média foi de 0,017 ± 0,005 μg/mL.

[75] A Figura 39 é uma representação gráfica de valores da intensidade de fluorescência média (IFM) de coloração 2D6-FITC de CD14- CD20-HLA-DR + CD123 + pDCs fechado. O Isotipo (iso) repre- senta a coloração máxima, FMO (fluorescência menos um controle) consistiu no coquetel de coloração FACS menos 2D6-FITC que representam a coloração de fundo. É mostrado nesta figura um experimento representativo de quatro experimentos independentes realizados.

[76] A Figura 40 são imagens confocais de PDC humanas puri ficadas do sangue periférico e depois incubadas com 10 μg/mL de BIIB059-AF647 (branco) a 4°C (à esquerda) ou a 37°C em 5 % de CO2 (para a direita) durante 15 min. A distribuição de célula BIIB059 foi avaliada por meio da microscopia confocal, e uma imagem representativa é mostrada para cada condição.

[77] A Figura 41 é uma representação gráfica do efeito da inter- nalização de BDCA2 na inibição da produção de IFNa. Esta figura é um representante de 3 experimentos independentes.

[78] A Figura 42 é uma representação gráfica que mostra que os valores de EC50 de internalização de BDCA2 mediada por BIIB059 correlaciona-se com valores de IC50 de inibição mediada por BIIB059 de IFNa induzida por TLR9 em ensaios de sangue total (n = 10). Valor de R2 de 0,57.

[79] A Figura 43A mostra os resultados expressos como a mé dia e desvio-padrão (DP) dos coeficientes de colocalização Manders para localização de TLR9 no compartimento LAMP1 +. A Figura 43B mostra os resultados expressos como a média e SD de os coeficientes de colocalização Manders para localização de BIIB059/BDCA2 no compartimento de TLR9 +. A Figura 43C mostra os resultados expressos como a média e desvio-padrão de colocalização dos coeficientes Manders para localização de BIIB059/BDCA2 no compartimento LAMP1 +. Cada símbolo representa uma célula individual; linhas horizontais representam a média, as linhas verticais representam o SD.

[80] A Figura 44A é um histograma de um experimento repre sentativo de sangue total tratado com 10 μg/mL de BIIB059 (histogra- ma de cor), 10 μg/mL de controle do isotipo (linha tracejada) ou de sangue total estimulado com o ligante TLR9, CpG-A (linha cheia). A Figura 44B é uma representação gráfica do resultado do efeito do tratamento de sangue total BIIB059 no derramamento de CD62L (quadrados fechados). O quadrado aberto representa o tratamento de iso- tipo (10 μg/mL). Esta figura é representativa de três experimentos independentes.

[81] A Figura 45 é uma representação gráfica da expressão da superfície de CD62L que foi ensaiada por meio da citometria de fluxo. A Expressão de CD62L foi medida na presença de BIIB059 sozinho, e com concentrações crescentes de GM6001 (círculos). O quadrado aberto representa o isotipo de controle tratado (10 μg/mL). O triângulo invertido representa BIIB059 controle de DMSO tratado. Este valor é representativo de dois experimentos independentes.

[82] A Figura 46A é uma representação gráfica de internalização dependente da dose mediada por BIIB059 e 24F4A-Agly de BDCA2 na superfície de PDC de um doador humano saudável representativo (n = 5). pDCs de doadores saudáveis humanos foram isolados usando duas etapas contas magnéticas de procedimento de separação (kit MACS, Miltenyi Biotec). pDCs foram tratados com concentrações crescentes de BIIB059 (círculos) ou a uma forma glicosilada do anti- corpo-24F4-Agly- (quadrados). As células foram também tratadas com 10 μg/mL de um controle do isotipo (triângulo) e incubadas durante 16 horas a 37°C. pDCs foram então corados para expressão de superfície de CD32 e BDCA2. A Figura 46B é um histograma que mostra os níveis de CD32 sobre pDCs isolados tratados com 10 μg/mL de BIIB059 (sombreado) ou o controle de isotipo (pontilhado) (n = 5). A Figura 46C é um histograma que mostra os níveis de CD32 sobre pDCs isolados tratados com 10 μg/mL de uma forma 24F4-A a-glicosilada (sombreada) ou o controle de isotipo (pontilhado). A linha sólida representa as células não coradas (n = 5). A Figura 46D é uma representação gráfica da dose de BIIB059 mediada por modulação a jusante dependente de CD32 na superfície de PDC de um doador humano saudável representativo (n = 5). A Figura 46E é um histograma que mostra os níveis de CD32 sobre pDCs isolados tratados durante 1 hora a 4°C na presença de 10 μg/mL de BIIB059 (sombreado), a uma forma glicosilada (tracejada), ou um controle de isotipo (pontilhado). Após incubação, pDCs foram avaliados para a expressão de superfície CD32. A linha preta sólida representa as células não coradas (n = 3). A Figura 46F é um histograma que mostra os níveis de CD32 sobre pDCs isolados tratados durante 1 hora a 37°C na presença de 10 μg/mL de BIIB059 (sombreado), a uma forma glicosilada (tracejado), ou um controle de isotipo (pontilhado). Após incubação, pDCs foram avaliados para a expressão de superfície CD32. A linha preta sólida representa células não coradas (n = 3).

[83] A Figura 47A é uma representação gráfica dos níveis de IFNa pDCs isolados tratados com concentrações crescentes de BIIB059 (quadrados), concentrações crescentes de uma forma glicosi- lada do anticorpo 24F4-A (círculos), ou controle isotipo a 10 μg/mL (triângulo). pDCs foram estimulados na presença de CpG-A (75 μg/mL) ou não estimulados (triângulo invertido) para a esquerda. pDCs foram incubados durante 16 horas a 37°C e os sobrenadantes foram recolhidos e ensaiados por ELISA para IFNa. É mostrada o experimento representativo de duas realizadas. A Figura 47B é uma representação gráfica dos níveis de IFNa pDCs isolados tratados com concentrações crescentes de BIIB059 (quadrados), concentrações crescentes de uma forma glicosilada de o anticorpo 24F4-A (círculos), controle isotipo a 10 μg/mL (triângulo), ou o mAb anti-CD32 humano de 10 μg/mL. Os com-plexos imunes Sm/RNP (IC) foram pré-formados através da mistura de Sm-RNP a partir de timo de vitelo e de anticorpos anti-RNP de forma purificadas de soros de pacientes com SLE, durante 30 minutos em meio isento de soro. As células isoladas foram estimuladas com complexos imunes ou tratadas com o antígeno isolado (não estimulado). As células foram incubadas durante 16 horas a 37°C e os sobrenadan- tes foram recolhidos e ensaiados por ELISA para IFNa. É mostrada uma figura representativa de 3 realizadas. Cada símbolo representa a média e desvio-padrão (DP) de poços duplicados.

[84] A Figura 48A é um gráfico de barras que mostra a expres são de CD32 de pDCs isolados tratados com complexos imunitários na presença de 10 μg/mL de BIIB059, 24F4-A, anti CD32 mAb (clone AT10), anticorpo anti CD40 humanizado, ou controle de isotipo. As células foram incubadas durante 16 horas a 37°C. pDCs foram corados para expressão de superfície de CD32 e CD40. A Figura 48B é um gráfico de barras que mostra os níveis de IFNa medidos por ELISA nos sobrenadantes recolhidos a partir de A. É mostrada uma figura representativa (n = 3). A Figura 48C é um histograma que mostra a expressão de CD40 na superfície de pDCs. A linha tracejada representa a expressão de CD40 na superfície celular. O histograma corado representa os níveis de CD40 em pDCs após o tratamento com anti-corpo anti-CD40. A linha sólida representa as células não coradas.

[85] A Figura 49 mostra o impacto de HCQ em potência de BIIB059. Cada símbolo representa concentrações de IFNa medidas a partir de um doador humano saudável individual e as linhas verticais representam o SD. PBMC de doadores humanos saudáveis foram tratados com concentrações variáveis de BIIB059 sozinho, HCQ sozinho ou em combinação (BIIB059 + HCQ) em um volume total de ensaio de 250 μL/poço. As concentrações de BIIB059 variaram de 10 μg/mL a 0,1 ng/mL. As concentrações de HCQ variaram de 10 uM a 156 nM. 1x106 PBMC células/poço foram estimuladas com 5 uM do ligante TLR7 (R848). As placas contendo as PBMC foram incubadas durante a noite (18 horas) a 37°C e 5% de CO2. 200 μL dos sobrenadantes foram recolhidos para avaliação de IFNa ELISA (PBL InterferonaSource).

[86] A Figura 50 mostra o impacto de HCQ em potência de BIIB059. Cada símbolo representa concentrações de IFNa medidas a partir de um doador representativo dos dois doadores saudáveis testados e as linhas verticais representam o desvio-padrão (SD). PBMC de sangue venoso heparinizado de doadores humanos saudáveis ou de pacientes com SLE foram isolados por meio da centrifugação em gradiente descontínuo sobre Ficoll, lavados em PBS e ressuspensos em meio de cultura completo (RPMI com 3 % de FBS). PBMC foram tratados com concentrações variáveis de BIIB059 sozinho, HCQ sozinho ou em combinação (BIIB059 + HCQ) em um volume total de ensaio de 250 μL/poço. As concentrações de BIIB059 variaram de 10 μg/mL a 0,1 ng/mL. As concentrações de HCQ variaram de 10 uM a 156 nM. 1x106 PBMC células/poço foram estimuladas com 1 uM do ligante de TLR9 (CPG-A). As placas contendo as PBMC foram incubadas durante a noite (18 horas) a 37°C e 5 % de CO2. 200 μL dos sobrenadantes foram recolhidos para avaliação de IFNa ELISA (PBL InterferonaSource).

[87] A Figura 51 mostra as distribuições da porcentagem de circulação de pDC em todos os macacos cinomólogos de sangue saudável na escala original (painel esquerdo) e na escala log (painel direito). O sangue total foi elaborado a partir de doze macacos cinomólogos uma vez por semana para quatro semanas totais. pDCs foram identificados por meio da citometria de fluxo como CD20-CD14-CD123+HLA- DR +. pDC como uma porcentagem de células CD20-CD14- foi calculada com o software FlowJo. Graph foi obtido usando a linguagem R para computação estatística.

[88] A Figura 52 é uma representação gráfica da porcentagem de circulação de PDC (em escala logarítmica) em um conjunto de macaco cinomólogo de sangue saudável por meio dos diferentes pontos de tempo antes da injeção IV de BIIB059. Nos pontos de tempo indicados, o sangue total foi tirado, e pDCs foram identificados por meio da citometria de fluxo como CD20-CD14-CD123 + HLA-DR +. O percentual de PDCs foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software R.

[89] A Figura 53 é uma representação de um modelo final equi pado para a porcentagem de circulação de pDC (em escala logarítmica) em todos os macacos cinomólogos de sangue saudável por meio de diferentes pontos de tempo antes da injeção IV de BIIB059. Um modelo de efeitos mistos linear para log (% PDC) com valores de diferentes momentos como os fatores e cinos fixos como as intercepções aleatórias não mostra diferenças entre os índices das médias geométricas da % de valores de pDC medidos por meio da diferença em semanas (p-valor com base no F -test para todos os efeitos tempo igual a zero é 0,67). O gráfico e a análise estatística foram calculados usando a linguagem R para computação estatística. A linha preta mostra o modelo ajustado final, que inclui apenas uma interceptação fixa e as interceptações aleatórias para osmacacos cinomólogos. O pacote lme4 em R foi usado para ajustar o modelo linear de efeitos mistos.

[90] A Figura 54 mostra que a porcentagem de circulação de pDC descrita na escala de log antes e após a dose IV do veículo citrato de sódio, BIIB059 1 mg/kg ou BIIB059 10 mg/kg em macaco cino- mólogo. Três macacos cinomólogos foram administrados para cada grupo de dose no tempo 0. Nos pontos de tempo indicados, o sangue total foi tirado, e pDCs foram identificados por meio da citometria de fluxo como CD20-CD14-CD123+HLA-DR +. O percentual PDCs foi calculada em software FlowJo, e gráficos usando software R.

[91] A Figura 55 descreve modelo ajustado final para pDC por cento em circulação na escala de log antes e após a dose IV do veículo citrato de sódio, BIIB059 1 mg/kg e BIIB059 10 mg/kg em macacos cinomólogos. Um modelo linear de efeitos mistos para log (% PDC) com fatores de valores fixos para grupo de dose, níveis de tempo de 1 hora, 6 horas e superior a 28 dias, e com intercepto aleatório para macacos cinomólogos. A linha sólida mostra o modelo ajustado. O pacote lme4 em R foi usado para ajustar o modelo linear de efeitos mistos. O gráfico e análise estatística foram calculados usando a linguagem R para computação estatística.

[92] A Figura 56 mostra a porcentagem de circulação de pDC após dose SC de BIIB059 0,2 mg/kg em macaco cinomólogo. Os macacos cinomólogos 4, 6 e 12 foram administrados em uma única injeção SC de BIIB059 0,2 mg/kg no tempo 0. Fora dos três macacos ci- nomólogos, o macaco cinomólogo 6 foi doseado comBIIB059 mg/kg no estudo anterior. Os macacos cinomólogos 4 e 12 foram tratados com veículo no estudo anterior. Nos pontos de tempo indicados, o sangue total foi tirado, e pDCs foram identificados por meio da citometria de fluxo como CD20-CD14-CD123 + HLA-DR +. O percentual de PDCs foi calculado em software FlowJo, e gráficos usando software R.

[93] A Figura 57 retrata o modelo ajustado final para a porcentagem de circulação de pDC após dose SC de BIIB059 0,2 mg/kg em macacos cinomólogos. Um modelo linear de efeitos mistos está equipado para valores (% PDC) com efeitos fixos para tempo contínuo e tempo em 1 hora, log e com macacos cinomólogos uma vez que intercepta osaleatórios. A linha sólida mostra o modelo ajustado. O pacote lme4 em R foi usado para ajustar o modelo linear de efeitos mistos. O Gráfico e análise estatística foram calculados usando a linguagem R para computação estatística.

[94] A Figura 58 é uma representação esquemática do Desenho Experimental de macaco Cinomólogo PK/PD. Nove macacos Cinomó- logos completaram o estudo através da por via intravenosa (IV). Os macacos cinomólogos foram sangrados antes e depois da administra- ção IV do veículo, 1 mg/kg BIIB059, ou 10 mg/kg BIIB059 acordo com o esquema de sangramento mostrado. Após a conclusão deste estudo, três macacos cinomólogos passaram a completar uma dose de estudo subcutânea (SC), onde receberam uma única injeção SC de 0,2 mg/kg BIIB059. Em cada ponto de tempo de hemorragia, um ensaio de sangue total que foi realizado em sangue total a partir dos macacos cinomólogos foi diluído 1: 4 com meio RPMI 1640 completo e foi estimulado com CPG-A para uma concentração final de 200 μg/mL em um poço de tecido de fundo redondo de 96 placa de cultura e incubadas a 37°C, 5 % de CO2 durante 18 a 20 horas. No final da cultura, o sangue total estimulado foi centrifugado a colheita do soro. No bioen- saio MxA, as células A549 foram estimuladas com o soro colhido por 19 a 20 horas a 37°C, 5 % de CO2 para induzir proteína MxA. Após 20 horas, as células A549 foram lisadas e uma sanduíche de ELISA foi realizado para detectar as concentrações de proteína MxA. Os níveis de IFNa (unidades/mL) foram calculados de volta a partir de uma curva padrão gerada por meio do tratamento de células A549 com doses de rIFNa crescente.

[95] A Figura 59 é uma representação gráfica da tendência para a redução da produção de IFN-TLR9 induzida em macacos cinomólo- gos a receber uma dose intravenosa única de BIIB059 relação às médias de tratamento pré. O sangue total de macacos cinomólogos tratados com uma dose intravenosa única de veículo, de 1 mg/kg BIIB059, ou 10 mg/kg BIIB059 foi diluída 1: 4 com meio RPMI 1640 completo e foram estimulados com CPG-A (2216) para uma concentração final de 200 μg/mL em uma placa de cultura de 96 poços de fundo redondo de tecido e incubados a 37°C, 5 % de CO2 durante 18 a 20 horas. No final da cultura, o sangue total estimulado foi centrifugado a colheita do soro. As células A549 foram estimuladas com o soro colhido por 19 a 20 horas a 37°C, 5 % de CO2 para induzir proteína MxA. Após 20 ho- ras, as células A549 foram lisadas e um sanduíche de ELISA foi realizado para detectar as concentrações de proteína MxA. Os níveis de IFNa (unidades/mL) foram calculados de volta a partir de uma curva padrão gerada por meio do tratamento de células A549 com doses de rIFNa crescente. A concentração média de IFNa pré-sangramento foi calculada para cada macaco por meio da média de todas as medições de IFNa dos pontos temporais pré-purga (Dias -21, -14, -7 e T0). A % de IFNa foi então calculada para cada ponto de tempo de sangramen- to seguinte da administração de BIIB059 até ao dia 14 dividindo a concentração de IFNa pelo tempo da média pré-sangramento para o referido animal e multiplicando por 100. Estes valores foram então calculados a média para cada grupo de tratamento. O gráfico representa a média ± erro padrão da média. O gráfico e análise estatística foram calculados usando Excel e GraphPad software 6.0 (GraphPad, San Diego, CA).

[96] A Figura 60 é uma representação gráfica da produção de TLR9 IFNa induzida por diminuída em um Ensaio de sangue total ex vivo de macacos cinomólogos tratados por via intravenosa com BIIB059. O sangue total de macacos cinomólogos tratados com uma dose intravenosa única de veículo (painel superior), 1 mg/kg BIIB059 (painel do meio), ou 10 mg/kg BIIB059 (painel inferior) foi diluído 1: 4 com meio RPMI 1640 completo e estimulado com CPG-A (2216) para uma concentração final de 200 μg/mL em um poço volta da placa de cultura de tecido de fundo 96 e incubadas a 37°C, 5 % de CO2 durante 18 a 20 horas. No final da cultura, o sangue total estimulado foi centrifugado a colheita do soro. As células A549 foram estimuladas com o soro colhido por 19 a 20 horas a 37°C, 5 % de CO2 para induzir proteína MxA. Após 20 horas, as células A549 foram lisadas e um sanduíche de ELISA foi realizado para detectar as concentrações de proteína MxA. Os níveis de IFNa (unidades/mL) foram calculados de volta a partir de uma curva padrão gerada por meio do tratamento de células A549 com doses de IFNa crescente. Uma análise bidirecional de efeitos mistos de variância (ANOVA) estava apto a log10 dos valores de concentrações calculadas de IFNa. Os valores de IFNa são plotados (na escala log10) versus dia da sangria para cada animal em cada grupo de dose. As linhas verticais representam agrupamentos de sangue em dias de pré-dose, após a dose até 31 dias, e pós-dose superior a 31 dias. Dias de sangria até ao dia 31 não foram usados na análise. As estimativas baseadas em modelos de valores de IFNa médias geométricas são representadas por meio das linhas horizontais pretas espessas no interior das regiões pré e pós-dose de cada painel. O grá-fico e análise estatística foram calculados usando a linguagem R para computação estatística.

[97] A Figura 61 é uma representação gráfica da produção dimi nuída IFNa induzida por TLR9 em um Ensaio de sangue total ex vivo de macacos cinomólogos tratados subcutaneamente com BIIB059. O sangue total de macacos cinomólogos tratados com uma dose única subcutânea de 0,2 mg/kg BIIB059 foi diluído 1: 4 com meio RPMI 1640 completo e estimulado com CPG-A (2216) para uma concentração final de 200 μg/mL em um poço de tecido de fundo redondo de 96 placa de cultura e incubadas a 37°C, 5 % de CO2 durante 18 a 20 horas. No final da cultura, o sangue total estimulado foi centrifugado a colheita do soro. As células A549 foram estimuladas com o soro colhido por 19 a 20 horas a 37°C, 5 % de CO2 para induzir proteína MxA. Após 20 horas, as células A549 foram lisadas e um sanduíche de ELISA foi realizado para detectar concentrações de proteína MxA. Os níveis de IFNa (unidades/mL) foram calculados de volta a partir de uma curva padrão gerada por meio do tratamento de células A549 com doses de IFNa crescente. A análise de uma via de variância (ANOVA) com efeitos aleatórios estava apta a log10 de valores das concentrações calcula- das de IFNa. Os valores de IFNa são plotados (na escala log10) versus dia da sangria para cada animal. As linhas verticais representam os agrupamentos de sangue em dias de pré-dose, após a dose até 33 dias, e pós-dose superior a 33 dias. Os dias de sangria até ao dia 33 não foram usados na análise. As estimativas baseadas em modelos de valores de IFNa de médias geométricas são representadas por meio das linhas horizontais pretas espessas no interior das regiões pré e pós-dose de cada painel. O Gráfico e análise estatística foram calculados usando a linguagem R para computação estatística.

Descrição Detalhada

[98] BIIB059 é um anticorpo monoclonal exemplar que se liga especificamente para BDCA2 humano. Os anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção inibem a produção e/ou secreção de citoquinas inflamatórias e quimiocinas PDC. Além disso, os anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção podem regular de forma negativa os níveis de CD32A e/ou CD62L na superfície de pDCs. Além disso, os anticorpos anti-BDCA2 da presente invenção podem mediar a internalização de BDCA2 a partir da superfície de pDCs. Além disso, os anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção podem ser usados para esgotar pDCs por meio de ADCC ou CDC e podem ser usados para tratar ou prevenir distúrbios imunológicos, tais como doenças inflamatórias e autoimunes. Esta descrição também mostra que a combinação de um antimalárico com um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção pode proporcionar efeitos melhorados em comparação com o tratamento com qualquer agente sozinho.

BDCA2

[99] BDCA2 é uma lectina do tipo II do tipo C que é expressa especificamente em pDCs. BDCA2 consiste em um único domínio ex- tracelular de reconhecimento de hidratos de carbono (CRD) na sua extremidade Do terminal C, uma região transmembranar e uma curta cauda citoplasmática no seu terminal N que não abriga um motivo de sinalização. BDCA2 transmite sinais intracelulares por meio de um adaptador transmembranar associado, FcεRlY (vide Figura 1). A ligação mediada por anticorpos de BDCA2 leva ao recrutamento de baço de tirosina quinase (SYK) do imunorreceptor baseado em tirosina fos- forilada do motivo de ativação (ITAM) de FcεRlY. A ativação de Syk conduz à ativação de células B ligante (Blnk), tirosina quinase de Bruton (BTK), e fosfolipase CY2 (PLCY2), levando a mobilização de Ca2 +.

[100] A sequência de aminoácidos da proteína BDCA2 humana (Acesso Genbank NP_569708.1) é mostrada abaixo (o domínio trans- membranar está em itálico, o ectodomínio está sublinhado). 1 MVPEEEPQDR EKGLWWFQLK VWSMAVVSIL LLSVCFTVSS VVPHNFMYSK 51 TVKRLSKLRE YQQYHPSLTC VMEGKDIEDW SCCPTPWTSF QSSCYFISTG 101 MQSWTKSQKN CSVMGADLVV INTREEQDFI IQNLKRNSSY FLGLSDPGGR 151 RHWQWVDQTP YNENVTFWHS GEPNNLDERC AIINFRSSEE WGWNDIHCHV 201 PQKSICKMKK IYI* (SEQ ID NO:1)

[101] A sequência de aminoácidos do FcεRlY humano (Acesso Genbank NP_004097.1) é mostrada abaixo.1 MIPAVVLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV 51 RKAAITSYEK SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQ*(SEQ ID NO:2)

[102] O homólogo BDCA2 de rato mais próximo, Clec4b2 de rato (Acesso Genbank NM_001005896), compatilha somente 51,0 % de identidade com BDCA2 humano. Em contraste, as partes do macaco rhesus e cinomólogo BDCA2 compartilham 90,6 % de identidade com BDCA2 humano. Além disso, a sequência da proteína FcεRIY do macaco cinomólogo e de rhesus, que são idênticas umas as outras, compartilham 98,9 % de identidade com a proteína humana FcεRIY.

[103] As proteínas BDCA2 humanas, de macaco rhesus, e cino-mólogo podem ser usadas como imunogênios para preparar os anticorpos anti-BDCA2. Para se preparar os anticorpos anti-BDCA2 hu- manos, a proteína BDCA2 humana pode ser usada como o imunogê- nio. Os anticorpos BDCA2 anti-humanos podem então ser pesquisados para identificar anticorpos com uma ou mais das características descritas na presente invenção (por exemplo, redução da produ- ção/secreção de uma ou mais de interferonas do tipo I ou do tipo III, IL-6, TNF-α, MIP 1-α, MIP-1β, CCL5 e IP-10/CXCL10; esgotamento de pDCs; competir para a ligação ao domínio extracelular de BDCA2 com BIIB059; ligação de forma seletiva do ectodomínio de BDCA2 humano, cinomólogo e Rhesus mas não obrigatório do Clec4b2 de rato; inibição do desenvolvimento da doença em um modelo de xenoenxerto psoriá- tico humano).

Anticorpos Anti-BDCA2

[104] Esta descrição inclui as sequências de um anticorpo monoclonal, BIIB059, que se liga ao BDCA2 humano, cinomólogo e rhesus, mas não de Clec4b2 de rato. O BIIB059 não se liga ou não mostra significativa ligação a BDCA2 de espécies de primatas filogenéticas abaixo.

BIIB059

[105] BIIB059 é um anticorpo IgG1 humanizado que reconhece especificamente BDCA2 na superfície de células dendríticas plasmoci- toides. Foi derivado a partir de um anticorpo de murino (24F4) que se liga BDCA2 como se segue. Um plasmídeo que codifica BDCA2 humano de comprimento total foi injetado em camundongos com uma pistola de genes. Os esplenócitos dos camundongos foram fundidos deste para as células de mieloma e o hibridoma resultante produziu o anticorpo 24F4. O anticorpo 24F4 foi manipulado em uma estrutura de IgG1 humana do tipo selvagem para manter a função efetora completa. As sequências de aminoácidos previstas para as cadeias leve e pesada de BIIB059 maduro são apresentadas abaixo. As regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2, e 3 da cadeia leve va- riável (VL) e da cadeia pesada variável (VH) são mostradas na ordem a partir do terminal N para o C das sequências de VL e VH maduras e são ambas sublinhadas e em negrito. Um anticorpo que consiste na cadeia pesada madura (SEQ ID NO: 4) e na cadeia leve madura (SEQ ID NO: 3) listadas abaixo é denominado BIIB059. BIIB059 maduro da cadeia leve (LC) DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGKAPKL LIYAASTLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQANEDPR TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO:3) BIIB059 maduro da cadeia pesada (HC) DVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAAS GFTFS TYTMSWVRQA PGKGLEWVAT ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCTRD IYYNYGAWFA YWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GCHAVEKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G (SEQ ID NO:4) A variável da cadeia leve (VL) de BIIB059 tem a seguinte sequência de aminoácido: DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGKAPKL LIYAASTLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQANEDPR TFGQGTKVEI K (SEQ ID NO:23) A variável da cadeia pesada (VL) de BIIB059 tem a seguinte sequência de aminoácido: DVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAAS GFTFS TYTMSWVRQA PGKGLEWVAT ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCTRD IYYNYGAWFA YWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO:24) As sequências de aminoácido de CDRS de VL de BII059 são listadas abaixo: CDR1 de VL: KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO:5); CDR2 de VL: AASTLES (SEQ ID NO:6); e CDR3 de VL: QQANEDPRT (SEQ ID NO:7). As sequências de aminoácido de CDRS de VH de BII059 são listadas abaixo: CDR1 de VH: TYTMS (SEQ ID NO:8) (Kabat CDR1) or GFTFSTYTMS (SEQ ID NO:9) (Chothia melhorada/AbM CDR1); CDR2 de VH: TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO:10); CDR3 de VH: DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO:11)

[106] Tal como indicado acima, a definição de CDR de Chothia/AbM melhorada de CDR1 de VH é 5 aminoácidos mais longa do que a definição de Kabat deste CDR. Os cinco aminoácidos adicionais de CDR1 de VH de Chothia/AbM melhorada são GFTFS (SEQ ID NO: 12).

[107] Os anticorpos anti-BDCA2 da presente invenção, também podem compreender CDR "alternativos" de BIIB059. CDR "alternativos" são entendidos por CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) definidas de acordo com qualquer uma das Chothia, de Abysis, CDR de Chothia/AbM melhorada, ou as definições de contato. Estes CDR alternativos podem ser obtidos, por exemplo, usando a base de dados AbYsis (www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotat ion.cgi). As sequências de aminoácidos de CDR "alternativos" 1, 2 e 3 da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve de BIIB059 são comparadas com as CDR de acordo com Kabat definidos na Tabela abaixo.

[108] Os anticorpos anti-BDCA2 podem englobar CDR 1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e da cadeia leve de acordo com a definição de Kabat, a definição de Chothia Abysis, a definição de Chothia/AbM CDR melhorada, ou a definição de contato. Estes anticorpos podem ter, por exemplo, 1, 2 ou 3 substituições dentro de um ou mais (ou seja, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) dos CDRs. Estes anticorpos (i) se ligam ao BDCA2 de macaco, humano ou cinomólogo mas não se ligam significativamente aos BDCA2 de espécies filogenéticas primatas abaixo; e/ou (ii) inibem a interferona do tipo I induzida por TLR9/TLR7 e outra produção de citocina ou quimiocina de PDC humanas; e/ou (iii) medei-am a internalização de BDCA2 a partir da superfície de pDCs; e/ou (iv) sobre regulam CD32A e/ou CD62L a partir da superfície de pDCs; e/ou (v) esgotam pDCs in vitro por ADCC ou CDC.

[109] Os anticorpos IgG humanos são moléculas tetraméricas que contêm duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Cada cadeia leve de BIIB059 está covalentemente ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação de inter-cadeias de dissulfureto (LC Cys 218 225 Cis-HC) e as cadeias pesadas são emparelhadas entre si por duas intercadeias de dissulfuretos (HC-231 Cys Cys 231 e Cys 234- Cys 234). Todas as outras cisteínas formam dissulfuretos intra- moleculares que estabilizam os domínios constantes e variáveis.

[110] Em certas modalidades, os anticorpos anti-BDCA2 incluem uma cadeia pesada e uma cadeia leve humana da região constante. Em certas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH1 e uma região de dobradiça. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende um domínio CH3. Se a região constante da cadeia pesada inclui substituições, tais substituições modificam as propriedades do anticorpo (por exemplo, aumentam ou diminuem uma ou mais de: ligação ao receptor F, glicosilação de anticorpos, número de resíduos de cisteína, a função celular efetora, ou a função complementar). Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em modalidades específicas, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com uma afinidade de 7 ng/mL para 15 μg/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga FcyRII (CD32A) com um EC50 de 10 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 11 ng/mL. Em certas modalidades, o anticorpo inclui uma região Fc humana que se liga a FcYRIIa (CD32A) com um EC50 de 12 μg/mL. A Tabela 1 fornece uma lista das propriedades do anticorpo BIIB059.TABELA 1

[111] BIIB059 exibe as propriedades físico-químicas adequadas para um anticorpo terapêutico. Este anticorpo mostra baixos níveis de agregação. A estrutura de IgG1 do tipo selvagem contém um único local de glicosilação ligado a N na molécula e BIIB059 e se liga a receptores de Fc com afinidades típicas desta classe de moléculas. O pI calculado de 7,26 é um pouco baixo para um anticorpo. A heterogeneidade de carga detectada no BIIB059 sugere que uma fração significativa de BIIB059 contém modificações. O nível de glicação de até cerca de 10 % detectado em lotes purificados de BIIB059 conta, pelo menos em parte para esta heterogeneidade de cargas. A Tm para dobrar o BIIB059 é, na extremidade inferior de valores típicos observados para detecção de anticorpos, enquanto que aqueles para os domínios CH2 e CH3 são típicos para um mAb IgG1 totalmente glicosilado. Com base na fluorimetria de digitalização e na viscosidade, as medições diferenciais do BIIB059 podem ser formuladas, por exemplo, a 50 mg/mL em citrato de sódio 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 6,0. Este anticorpo também pode ser formulado em concentrações muito mais elevadas, tal como 150 a 300 mg/mL (por exemplo, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 300 mg/mL).

[112] BIIB059 é completamente humanizado, IgG1 competente da função Fc de camundongo que exibe uma elevada afinidade para BDCA2 e se liga igualmente bem a BDCA2 humano e cinomólogo nativo. BIIB059 é um inibidor potente de todos os tipos IFNs do tipo I induzidas por TLR9, bem como outras citocinas e quimiocinas de pDCs. BIIB059 é igualmente potente na inibição da do interferona do tipo I induzida por TLR9 em pDCs de doadores humanos saudáveis e de pacientes com LES. BIIB059 inibe especificamente IFN do tipo I induzida por TLR9 pDCs e não tem impacto sobre a produção de IFN por outros tipos de células desencadeadas com diferentes ligantes de TLR. BIIB059 conduz à internalização rápida de BDCA2 da superfície da célula. Após estimulação, BDCA2 colocaliza com TLR9 no compartimento endossomal/lisossomal, que parece ser necessário para a sua inibição da sinalização de TLR9. BIIB059 foi encontrado para causar derramamento de CD62L a partir da superfície de pDCs humanos o que pode causar impacto no seu acolhimento aos órgãos alvo. Em ci- totoxicidade mediada por células in vitro dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) estudos sugerem que BIIB059 pode ter atividade de depleção de células em linhagens celulares que sobre-expressam BDCA2. No entanto, o fato de BIIB059 levar a interiorização rápida e completa do BDCA2 a partir da superfície de pDCs torna menos provável que BIIB059 teria efeito de depleção de pDCs sustentado in vivo. A combinação de BIIB059 e hidroxicloroquina (HCQ) conduziu a um efeito inibitório aditivo em TLR7 e produção de IFN-TLR9 induzida por PBMC a partir de doadores humanos saudáveis. Esses dados destacam o potencial aditivo benefício terapêutico de BIIB059 quando administrado com compostos antimaláricos, como HCQ.

[113] Os anticorpos, tais como BIIB059, podem ser feitos, por exemplo, por meio da preparação e da expressão de genes sintéticos que codificam as sequências de aminoácidos referidas ou por meio da mutação de genes da linha germinal humana para proporcionar um gene que codifica as sequências de aminoácidos referidas. Além disso, este anticorpo e a outros anticorpos anti-BDCA2 podem ser obtidos, por exemplo, usando um ou mais dos seguintes métodos.

Métodos de obtenção de anticorpos anti-BDCA2

[114] Estão disponíveis diversos métodos para a obtenção de anticorpos, em particular anticorpos humanos. Um método exemplar inclui bibliotecas de rastreio de expressão de proteína, por exemplo, ou bibliotecas de fagos de apresentação de ribossoma. A exibição em fagos é descrita, por exemplo, em US 5,223,409; Smith, Science 228: 1315-1317 (1985); WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 90/02809. A exibição de Fab nos fagos é descrita, por exemplo, na Pat. Nos 5.658.727.; 5.667.988; e 5.885.793.

[115] Em adição à utilização de bibliotecas de apresentação, outros métodos podem ser usados para se obter um anticorpo que se liga a BDCA2. Por exemplo, a proteína BDCA2 ou um peptídeo, pode ser usada como um antígeno em um animal não humano, por exem- plo, um roedor, por exemplo, um camundongo, hamster, ou um rato. Além disso, as células transfectadas com um cDNA que codifica BDCA2 podem ser injetadas em um animal não humano, como um meio de produzir anticorpos que se ligam eficazmente à proteína BDCA2 superfície celular.

[116] Em uma modalidade, o animal não humano inclui pelo me nos uma parte de um gene de imunoglobulina humana. Por exemplo, é possível engendrar as cepasde camundongo deficientes na produção de anticorpos do camundongo com grandes fragmentos dos locais de Ig humana. Usando a tecnologia de hibridoma, os anticorpos monoclo- nais específicos do antígeno derivados a partir dos genes com a especificidade desejada podem ser produzidos e selecionados. Vide, por exemplo, XENOMOUSE™, Green et al, Nature Genetics 7: 13 a 21 (1994), US 2003-0070185, WO 96/34096, e WO 96/33735.

[117] Em uma outra modalidade, um anticorpo monoclonal é obtido a partir do animal não humano, e, em seguida, modificao, por exemplo, humanizado ou desumanizado. Winter descreve um método de enxerto de CDR exemplar que pode ser usado para preparar os anticorpos humanizados descritos na presente invenção (US 5225539). Todos ou alguns dos CDRs de um anticorpo humano particular podem ser substituídos com, pelo menos, uma porção de um anticorpo não humano. Pode ser apenas necessário substituir os CDRs necessários para a ligação ou determinantes de tais CDR que se ligam ao chegar a um anticorpo humanizado útil que se liga a BDCA2.

[118] Os anticorpos humanizados podem ser gerados através da substituição de sequências de região variável de Fv que não estão diretamente envolvidas na ligação ao antígeno com as sequências equivalentes de regiões variáveis Fv humanas. Os métodos gerais para gerar anticorpos humanizados são fornecidos por Morrison, SL, Science, 229: 1202 a 1207 (1985), por Oi et al, BioTechniques, 4: 214 (1986), e em US 5585089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; e US 6.407.213. Estes métodos incluem isolar, manipular e expressar as sequências de ácidos nucleicos que codificam a totalidade ou parte das regiões variáveis da imunoglobulina Fv de, pelo menos, um de uma cadeia pesada ou de cadeia leve. As fontes de tal ácido nucleico são bem conhecidas por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica e, por exemplo, podem ser obtidas a partir de um hibridoma que produz um anticorpo contra um alvo predeterminado, conforme descrito acima, a partir de genes de imunoglobulina da linha germinal, ou de constructos sintéticos. O DNA recombinante que codifica para o anticorpo humanizado pode ser depois clonado em um vetor de expressão apropriado.

[119] As sequências da linha germinal humana, por exemplo, são descritas em Tomlinson, IA et al., J. Mol. Biol., 227: 776 a 798 (1992); Cook, G. P. et al., Immunol. Today, 16: 237 a 242 (1995); Chothia, D. et al., J. Mol. Bio. 227: 799 a 817 (1992);. e Tomlinson et al, EMBO J., 14: 4.628 a 4.638 (1995). O diretório de BASE V fornece uma lista completa de sequências da região variável de imunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, IA et al. Centre. MRC para Engenharia de Proteína, Cambridge, UK). Estas sequências podem ser usadas como uma fonte de sequência humana, por exemplo, para regiões de estrutura e CDRs. O consenso regiões de estrutura humana também pode ser usado, por exemplo, como descrito na Pat. No. 6.300.064.

[120] Um anticorpo de ligação ao BDCA2 não humano pode também ser modificado por meio da deleção específica de epítopos de células T humanas ou por meio da "desumanização" pelos métodos descritos em WO 98/52976 e WO 00/34317. Resumidamente, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo podem ser analisadas para os peptídeos que se ligam ao MHC de Classe II; estes peptídeos representam potenciais epítopos de células T (conforme de- finido nos documentos WO 98/52976 e WO 00/34317). Para a detecção de potenciais epítopos de células T, uma abordagem de modelagem de computador denominada "peptídeo de enfiamento" pode ser aplicada, e, além disso, uma base de dados de peptídeos de ligação MHC de classe II humana pode ser pesquisada para motivos presentes nas sequências de VH e VL, como descrito em WO 98/52976 e WO 00/34317. Estes motivos ligam-se a qualquer um dos 18 principais alotipos de MHC de classe II DR, e constituem, portanto, potenciais epítopos de células T. Os epítopos de células T potenciais detectados podem ser eliminados substituindo por um pequeno número de resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis, ou de preferência, por meio das substituições de um único aminoácido. Na medida do possível, as substituições conservativas são feitas. Muitas vezes, mas não exclusivamente, pode ser usado um aminoácido comum a uma posição em sequências de anticorpos da linha germinal humana. Após as alterações de desumanização terem sido identificadas, os ácidos nu- cleicos que codificam para VH e VL podem ser construídos por meio da mutagênese ou outros métodos de síntese (por exemplo, síntese de novo, cassete de substituição, e assim por diante). Uma sequência variável mutagenizada pode, opcionalmente, ser fundida com uma região constante humana, por exemplo, IgG1 humana, ou regiões constantes kappa.

[121] Em alguns casos, um epítopo de célula T potencial irá inclu ir resíduos conhecidos ou previstos como sendo importantes para a função do anticorpo. Por exemplo, potenciais epítopos de células T estão geralmente inclinados para CDR. Além disso, potenciais epíto- pos de células T podem ocorrer em resíduos estruturais importantes para a estrutura do anticorpo e de ligação. As alterações para eliminar estes potenciais epítopos vão, em alguns casos requerer mais escrutínio, por exemplo, por fazer e testar as cadeias com e sem a mudança.Sempre que possível, os epítopos de células T potenciais que se sobrepõem os CDRs podem ser eliminados por meio das substituições fora das CDRs. Em alguns casos, uma alteração dentro de uma CDR é a única opção, e, dessa maneira, as variantes com e sem esta substituição podem ser testadas. Em outros casos, a substituição necessária para remover um potencial de epítopo de célula T é a posição de um resíduo dentro da estrutura que pode ser crítica para a ligação do anticorpo. Nestes casos, as variantes com e sem esta substituição são testadas. Dessa maneira, em alguns casos, várias variantes desuma- nizadas das regiões variáveis da cadeia pesada e leve são concebidas e várias combinações da cadeias pesadas/leves são testadas para identificar o anticorpo desumanizado óptimo. A escolha do anticorpo desumanizado final pode então ser feita considerando a afinidade de ligação dos diferentes variantes em conjunto com a extensão de de- sumanização, em particular, o número de epítopos de células T potenciais remanescentes na região variável. A desumanização pode ser usada para modificar qualquer anticorpo, por exemplo, um anticorpo que inclui uma sequência não humana, por exemplo, um anticorpo sintético, um anticorpo de murino outro anticorpo monoclonal não humano, ou um anticorpo isolado de uma biblioteca de exibição.

[122] Outros métodos para a humanização de anticorpos podem também ser usados. Por exemplo, outros métodos podem ser responsáveis para a estrutura do anticorpo tridimensional, posições de estrutura que estão em três dimensõesde proximidade aos determinantes de ligação, e as sequências de peptídeos imunogênicos. vide, por exemplo, WO 90/07861; Pat US Nos 5.693.762.; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; e 6.407.213; Tempest et al. (1991) Biotechnology 9: 266 a 271. Ainda outro método é denominado "engenharia humana" e está descrito, por exemplo, em US 2005-008625.

[123] O anticorpo pode incluir uma região Fc humana, por exem- plo, uma região Fc do tipo selvagem ou uma região Fc que inclui uma ou mais alterações. Em uma modalidade, a região constante é alterada, por exemplo, mutada, para modificar as propriedades do anticorpo (por exemplo, para aumentar ou diminuir uma ou mais: ligação ao receptor F, anticorpo de glicosilação, o número de resíduos de cisteína, a função celular efetora, ou função complementar). Por exemplo, a região constante da IgG1 humana pode ser mutada em uma ou mais resíduos, por exemplo, um ou mais dos resíduos 234 e 237 (com base na numeração de Kabat). Os anticorpos podem ter mutações na região CH2 da cadeia pesada que reduzem ou alteram a função efetora, por exemplo, a ligação ao receptor Fc e a ativação do complemento. Por exemplo, os anticorpos podem ter mutações, tais como os descritos na Patente dos EUA 5.624.821 e 5.648.260 Nos.. Os anticorpos podem também ter mutações que estabilizam a ponte de dissulfureto entre as duas cadeias pesadas de uma imunoglobulina, tais como mutações na região dobradiça de IgG4, tal como descrito na técnica (por exemplo, Angal et al (1993) Mol Immunol 30: 105-08). Vide também, por exemplo, EUA 2005-0.037.000.

Maturação de Afinidade

[124] Em uma modalidade, um anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento do mesmo é modificado, por exemplo, por meio da mutagêne- se, para fornecer um banco de anticorpos modificados de ligação ao antígeno. Os anticorpos modificados são então avaliados para identificar um ou mais anticorpos com propriedades funcionais alteradas (por exemplo, ligação melhorada, uma estabilidade melhorada, antigenici- dade reduzida, ou uma maior estabilidade in vivo). Em uma modalidade, a tecnologia de biblioteca de exibição é usada para selecionar ou rastreiar o conjunto de anticorpos modificados. Os anticorpos de afinidade mais elevados são então identificados da segunda biblioteca, por exemplo, usando condições de maior rigor ou de ligação e de lavagem mais competitivos. Também podem ser usadas outras técnicas de ras- treio.

[125] Em algumas implementações, a mutagênese é direcionada para regiões conhecidas ou suscetíveis de estarem na interface de ligação. Se, por exemplo, as proteínas de ligação identificadas são anticorpos, em seguida, a mutagênese pode ser dirigida para as regiões CDR das cadeias pesadas ou leves, tal como descrito na presente invenção. Além disso, a mutagênese pode ser dirigida a regiões estruturais próximas ou adjacentes aos CDRs, por exemplo, regiões estruturais, especialmente dentro de 10, 5 ou 3 aminoácidos de um CDR de junção. No caso de anticorpos, a mutagênese pode também ser limitada a um ou alguns dos CDRs, por exemplo, para introduzir melhorias etapa a etapa.

[126] Em uma modalidade, a mutagênese é usada para produzir um anticorpo mais semelhante a uma ou mais sequências da linha germinal. Um método de linha germinal exemplar pode incluir: a identificação de uma ou mais sequências da linha germinal que são semelhantes (por exemplo, mais semelhante em uma base de dados em particular) com a sequência do anticorpo isolado. Em seguida, as mutações (ao nível dos aminoácidos) podem ser feitas no anticorpo isolado, ou incrementalmente, em combinação, ou ambos. Por exemplo, uma biblioteca de ácido nucleico que inclui as sequências que codificam algumas ou todas as possíveis mutações da linha germinal é feita. Os anticorpos mutados são em seguida avaliados, por exemplo, para identificar um anticorpo que tem um ou mais resíduos de linha germinal relativamente ao anticorpo isolado e que continua a ser útil (por exemplo, tem uma atividade funcional). Em uma modalidade, o maior número possível de resíduos da linha germinal é introduzido em um anticorpo isolado.

[127] Em uma modalidade, a mutagênese é usada para substituir ou inserir um ou mais resíduos de linha germinal para uma região CDR. Por exemplo, o resíduo de CDR da linha germinal pode ser a partir de uma sequência da linha germinal, que é semelhante (por exemplo, mais semelhante) para a região variável a ser modificado. Após a mutagênese, a atividade (por exemplo, ligação ou outras ativi-dades funcionais) do anticorpo pode ser avaliada para determinar se o resíduo da linha germinal ou de resíduos são tolerados. A mutagênese semelhante pode ser realizada nas regiões de estrutura.

[128] A seleção de uma sequência da linha germinal pode ser realizada de maneiras diferentes. Por exemplo, uma sequência da linha germinal pode ser selecionada se encontra critérios predeterminados para a seletividade ou semelhança, por exemplo, pelo menos uma determinada porcentagem de identidade, por exemplo, pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 99,5 % de identidade, em relação ao anticorpo doador não humano. A seleção pode ser realizada usando, pelo menos, 2, 3, 5, ou 10 sequências da linha germinal. No caso de CDR1 e CDR2, a identificação de uma sequência da linha germinal semelhante pode incluir selecionar uma tal sequência. No caso de RDC3, a identificação de uma sequência da linha germinal semelhante pode incluir selecionar uma tal sequência, mas pode incluir usar duas sequências da linha germinal que contribuem separadamente para a porção amino-terminal e a porção carbóxi-terminal. Em outras implementações, mais do que uma ou duas sequências da linha germinal são usadas, por exemplo, para formar uma sequência de consenso.

[129] Os cálculos de "identidade de sequência" entre duas sequências são realizados como se segue. As sequências estão alinhadas para fins de comparação óptima (por exemplo, podem ser introduzidas em lacunas em uma ou ambas de uma primeira e uma sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico para o segundo alinhamento óptimo e as sequências não homólogas podem ser ignoradas para efeitos de comparação). O alinhamento óptimo é determinado como a melhor pontuação usando o programa GAP no pacote de software GCG com uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de lacuna de 4 estender, e uma penalidade de lacuna da estrutura 5. Os resíduos de aminoácido ou os nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotí- deos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou de nucleotídeos como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas por meio das sequências.

[130] Em outras modalidades, o anticorpo pode ser modificado para ter um padrão de glicosilação alterado (ou seja, alterar o padrão de glicosilação original ou nativo). Tal como usado neste contexto, "alterado" significa ter uma ou mais porções hidrato de carbono eliminadas, e/ou tendo um ou mais locais de glicosilação adicionados ao anticorpo original. A adição de locais de glicosilação ao dos anticorpos presentemente descritos pode ser realizada alterando a sequência de aminoácidos para conter sequências de consenso local de glicosila- ção; tais técnicas são bem conhecidas na literatura. Outro meio de aumentar o número de porções hidrato de carbono em anticorpos é por meio do acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos a resíduos de aminoácidos do anticorpo. Estes métodos são descritos em, por exemplo, WO 87/05330 e Aplin e Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259 a 306. A remoção de quaisquer porções de hidrato de carbono presentes nos anticorpos pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente tal como descrito na técnica (Hakimuddin et al (1987) Arch Biochem Biophys, 259: 52; Edge et al (1981) Anal Bio- chem., 118: 131; e Thotakura et al (1987) Meth Enzymol, 138: 350) vide, por exemplo, Pat EUA. No. 5.869.046 para uma modificação que aumenta em meia vida in vivo, proporcionando um epítopo de ligação ao receptor de salvamento.

[131] Em uma modalidade, um anticorpo tem sequências de CDR (por exemplo, um Chothia ou CDR de Kabat), que diferem das do anticorpo monoclonal BIIB059. As sequências de CDR que diferem das do anticorpo monoclonal BIIB059 incluem as alterações de aminoácidos, tais como substituições de 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos se o CDR é de 5 a 7 aminoácidos de comprimento, ou substituições de 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 de aminoácidos na sequência de um CDR se o CDR é de 10 ou mais aminoácidos em comprimento. O aminoácido que é substituído pode ter carga, hidrofobicidade, ou características estereoquímicas semelhantes. Em algumas modalidades, a(s) substituição(ões) de aminoá- cidos é uma substituição conservativa. Em outras modalidades, a(s) substituição(ões) de aminoácidos é uma substituição não conservativa. Tais substituições estão dentro do conhecimento de uma pessoa que é versada na técnica. Os fragmentos de anticorpo ou anticorpos dos mesmos, que contêm os CDRs substituídos podem ser pesquisados para identificar anticorpos com uma ou mais das características descritas na presente invenção (por exemplo, redução da produção/se- creção de interferonas do tipo I ou tipo III, IL-6, TNF-α, MIP -1-α/CCL3, MIP-1β/CCL4, CCL5/RANTES, IP-10/CXCL10; esgotamento de pDCs; competição para a ligação ao domínio extracelular de BDCA2 com BIIB059; ligação de forma seletiva o ectodomínio de BDCA2 humano, cinomólogo e de Rhesus mas não envolve Clec4b2 de rato ou ligação de Clec4b2 de rato com uma afinidade de ligação mais baixa do que para BDCA2humano, cinomólogo ou rhesus; inibição do desenvolvimento da doença em um modelo de xenoenxerto psoriático humano).

[132] Ao contrário de CDRs, as alterações mais substanciais na estrutura de regiões estruturais (FRs) podem ser feitas sem afetar adversamente as propriedades de ligação de um anticorpo. As alterações em FRs incluem, mas não estão limitadas a, humanizar uma estrutura não humana derivada de engenharia ou certos resíduos estruturais que são importantes para o contato com o antígeno ou para estabilizar o local de ligação, por exemplo, alterar a classe ou subclasse da regi-ão constante, mudando os resíduos de aminoácidos específicos que podem alterar uma função efetora, tais como ligação ao receptor Fc (Lund et al, J. Immun, 147: 2657 a 62 (1991); Morgan et al, Immunology, 86: 319 a 24 (1995)), ou mudando a espécie a partir da qual a região constante é derivada.

[133] Os anticorpos anti-BDCA2 podem estar na forma de anticorpos de comprimento completo, ou sob a forma de formas de baixo peso molecular (por exemplo, fragmentos de anticorpos biologicamente ativos ou minicorpos) dos anticorpos anti-BDCA2, por exemplo, Fab, Fab’, F (ab’) 2, Fv, Fd, dAb, scFv, e SC (Fv) 2. Outros anticorpos anti- BDCA2 englobados por meio da presente invenção incluem os anticorpos de domínio único (sdAb) contendo uma única variável da cadeia tais como, VH ou VL, ou um fragmento do mesmo biologicamente ativo. Vide, por exemplo, Moller et al., J. Biol. Chem., 285 (49): 38.348 a 38.361 (2010); Harmsen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 77 (1): 13-22 (2007); EUA 2005/0079574 e Davies et al. (1996) Protein Eng, 9 (6): 531 a 7. Como um anticomprimento total, um sdAb é capaz de se ligar de forma seletiva a um antígeno específico. Com um peso mole-cular de apenas 12 a 15 kDa, sdAbs são muito menores do que os anticorpos comuns e ainda assim menores do que os fragmentos Fab e fragmentos variáveis da cadeia única.

[134] São fornecidas na presente invenção as composições compreendendo uma mistura de um anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uma ou mais variantes ácidas dos mesmos, por exemplo, em que a quantidade da(s) variante(s) ácida(s) é inferior a cerca de 80 %, 70 %, 60 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % ou 1 %. Proporcionam-se também AS composições que compreendem um anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo pelo menos um local de de- samidação, em que o pH da composição é desde cerca de 5,0 a cerca de 6,5, de tal modo que, por exemplo, pelo menos cerca de 90 % dos anticorpos anti -BDCA2 não são desamidados (ou seja, menos do que cerca de 10 % dos anticorpos são desamidados). Em certas modalidades, menos do que cerca de 5 %, 3 %, 2 % ou 1 % dos anticorpos são desamidados. O pH pode ser 5,0 a 6,0, tal como 5,5 ou 6,0. Em certas modalidades, o pH da composição é de 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 ou 6,5.

[135] Uma "variante ácida" é uma variante de um polipeptídeo de interesse que é mais ácida (por exemplo, tal como determinado por meio da cromatografia de troca catiônica) do que o polipeptídeo de interesse. Um exemplo de uma variante ácida é uma variante desami- dada.

[136] Uma variante "desamidada" de uma molécula polipeptídica é um polipeptídeo em que um ou mais resíduos de asparagina do poli- peptídeo original foram convertidos em aspartato, ou seja, a cadeia lateral de amida neutra foi convertida em um resíduo com um caráter global ácido.

[137] O termo "mistura", tal como usado na presente invenção em referência a uma composição compreendendo um anticorpo anti- BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, significa a presença tanto do anticorpo desejado anti-BDCA2 quanto do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uma ou mais variantes ácidas dos mesmos. As variantes ácidas podem compreender anticorpo anti- BDCA2 predominantemente desamidado, com menores quantidades de outra(s) variante(s) ácida(s).

[138] Em certas modalidades, a afinidade de ligação (Kd), a taxa de associação (em KD) e/ou a taxa de dissociação (KD desligado) do anticorpo que foi mutada para eliminar desamidação é semelhante à do anticorpo do tipo selvagem, por exemplo, tendo uma diferença de menos de cerca de 5 vezes, 2 vezes, uma dobra (100 %), 50 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 3 %, 2 % ou 1 %.

[139] Em certas modalidades, um anticorpo anti-BDCA2 ou frag mento de ligação ao antígeno do mesmo de anticorpos ou o peso molecular baixo dos mesmos se ligam a BDCA2 sobre pDCs e inibem ou reduzem a produção e/ou secreção por pDCs de IFN do tipo I e do tipo III, IL-6, TNF-α, e outras citoquinas e quimioquinas inflamatórias (por exemplo, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, CCL5 e IP-10/CXCL10); e/ou esgota pDCs por ADCC ou CDC ou apoptose; e/ou reduz a gravidade dos sintomas quando administrado a pacientes humanos com um ou mais de, ou de modelos animais: o lúpus eritematoso sistêmico, lúpus cutâneo, lúpus discoide, nefrite de lúpus, escleroderma, morfeia, artrite reumatoide, polimiosite, dermatomiosite, psoríase, diabetes do tipo I, síndrome de Sjogren, e vasculite. Em uma modalidade, o anticorpo anti- BDCA2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou anticorpos de baixo peso molecular do mesmo inibi o desenvolvimento da doença em um modelo de xenoenxerto psoriático humano (Nestle et al, J. Exp Med, 202 (1): 135 a 143 (2005)). Estas características de um anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou anticorpos de baixo peso molecular do mesmo podem ser medidas de acordo com os métodos descritos nos Exemplos, bem como por meio de outros métodos conhecidos na técnica.

Os fragmentos de anticorpo

[140] Os fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab’, F (ab') 2, FACB, e Fv) podem ser preparados por meio da digestão pro- teolítica de anticorpos intactos. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos tratando o anticorpo com uma enzima tal como a papaína, a pepsina, ou plasmina. A digestão com papaína de anticorpos inteiros produz fragmentos F (ab) 2 ou Fab; a digestão com pepsina de anticorpos inteiros produz F (ab’) 2 ou Fab'; e a digestão de plasmina produz fragmentos de anticorpos inteiros FACB.

[141] De maneira alternativa, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos de forma recombinante. Por exemplo, os ácidos nuclei- cos que codificam os fragmentos de anticorpo de interesse podem ser construídos, introduzido em um vetor de expressão e expressos em células hospedeiras adequadas. Vide, por exemplo, Co, M.S. et al, J. Immunol, 152: 2968 a 2976 (1994); Better, M. e Horwitz, AH, Methods in Enzymology, 178: 476 a 496 (1989); Plueckthun, A. e Skerra, A., Methods in Enzymology, 178: 476 a 496 (1989); Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 121: 652 a 663 (1989); Rousseaux, J. et al, Methods in Enzymology, (1989) 121: 663 a 669 (1989);. e Bird, R.E. et al.,TIBTECH, 9: 132 a 137 (1991)). Os fragmentos de anticorpos podem ser expressos em, e segregados por E. coli, permitindo dessa maneira a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas de fa- gos de anticorpos. De maneira alternativa, os fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar F (ab) 2 (Carter et al, Bio/Technology, 10:163 a 167 (1992)). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F (ab’) 2 podem ser isolados diretamente a partir de cultura de células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos Fab e F(ab)2 com o aumento da semi-vida in vivo compreendendo um receptor de salvamento dos resíduos de epítopo de ligação encontram-se descritos na Pat. US No. 5.869.046.

Minicorpos

[142] Os minicorpos de anticorpos anti-BDCA2 incluem diacor- pos, da cadeia simples (scFv), e da cadeia simples (Fv) 2 (sc (Fv) 2).

[143] Um "diacorpo" bivalente é um minicorpo construído por meio da fusão de genes (vide, por exemplo, Holliger, P. et al, Proc Natl Acad Sci EUA, 90: 6444 a 6448 (1993); EP 404097; WO 93/11161). Os diacorpos são dímeros constituídos por meio de duas cadeias poli- peptídicas. O domínio de cada cadeia polipeptídica do diacorpo VL e VH são ligados por ligantes. O número de resíduos de aminoácidos que constituem um ligante pode situar-se entre 2 a 12 resíduos (por exemplo, 3 a 10 ou cinco resíduos ou cerca de cinco resíduos). Os li- gantes dos polipeptídeos em um diacorpo são tipicamente demasiadamente curtos para permitir que VL e VH venham a se ligar uns aos outros. Dessa maneira, o VL e VH codificado na mesma cadeia de po- lipeptídeo não pode formar um fragmento de região variável da cadeia simples, mas em vez disso formar um dímero com um fragmento da região variável da cadeia simples diferente. Como resultado, um dia- corpo possui dois locais de ligação ao antígeno.

[144] Um scFv representa um polipeptídeo de anticorpo da cadeia simples obtido por meio da ligação de VH e VL com um ligante (vide, por exemplo, Huston et al, Proc Natl Acad Sci EUA, 85: 5879 a 5883 (1988); e Plickthun, "The Pharmacology de Monoclonal Antibodies" Vol.113, Ed Resenburg e Moore, Springer Verlag, Nova Iorque, páginas 269 a 315, (1994)). A ordem em que VHs e VLs são ligados não é particularmente limitada, e eles podem ser dispostos em qualquer ordem. Exemplos de disposições incluem: [VH] ligante [VL]; ou [VL] ligante [VH]. A região V da cadeia H e a região V da cadeia L no scFv pode ser um derivado de qualquer anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito na presente invenção.

[145] Um sc(Fv) 2 é um minicorpo em que dois VHS e dois VLs estão ligados por meio de um ligante para formar uma única cadeia (Hudson et al, J. Immunol Methods, (1999) 231: 177 a 189 (1999)). Um SC (Fv) 2 pode ser preparado, por exemplo, através da ligação com um ligante de scFv. O sc (Fv) 2 da presente invenção inclui anticorpos de preferência no qual dois VHS e dois VLs estão dispostos na ordem de: VH, VL, VH e VL ([VH] ligante [VL] ligante [VH] ligante [VL ]), co-meçando a partir do terminal N de um polipeptídeo da cadeia simples; no entanto, a ordem das dois VHS e dois VLs não se limita à disposição acima, e eles podem ser dispostos em qualquer ordem. Exemplos de disposições estão listados abaixo:

[146] [VL] ligante [VH] ligante [VH] ligante [VL]

[147] [VH] ligante [VL] ligante [VL] ligante [VH]

[148] [VH] ligante [VH] ligante [VL] ligante [VL]

[149] [VL] ligante [VL] ligante [VH] ligante [VH]

[150] [VL] ligante [VH] ligante [VL] ligante [VH]

[151] Normalmente, três ligantes são necessários quando quarto regiões variáveis de anticorpos estão ligadas; os ligantes usados podem ser idênticos ou diferentes. Não há qualquer limitação particular sobre os ligantes que ligam as regiões VH e VL dos minicorpos. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante peptídico. Qualquer pep- tídeo arbitrário da cadeia simples compreendendo cerca de três a 25 resíduos (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) podem ser usados como um ligante. Exemplos de tais ligantes peptídi- cos incluem: Ser; Gly Ser; Gly Gly Ser; Ser Gly Gly; Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 13); Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 14); Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 15); Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 16); Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 17); Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 18); Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 19); Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 20); (Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 21) n, em que n é um número inteiro de um ou mais; e

[152] (Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 22)n, em que n é um número inteiro de um ou mais.

[153] Em certas modalidades, o ligante é um ligante sintético composto (agente de reticulação química). Exemplos de agentes de reticulação que estão disponíveis no mercado incluem a N- hidroxissuccinimida (NHS), dissuccinimidilsuberato (DSS), bis (sulfos- succinimidil) suberato (BS3), ditiobis (succinimidilpropionato) (DSP), ditiobis (sulfossuccinimidilpropionato) (DTSSP), etilenoglicol bis (succi- nimidilsuccinato) (EGS), etilenoglicol bis (sulfossuccinimidilsuccinato) (sulfo-EGS), tartarato de disuccinimidila (DST), tartarato de disulfosuc- cinimidila (sulfo-DST), bis [2- (succinimido) etil] sulfona (BSOCOES), e cloreto de bis [2- (sulfossuccinimidoxicarbonilóxi) etil] sulfona (sulfo- BSOCOES).

[154] A sequência de aminoácidos de VH ou VL nos minicorpos podem incluir as modificações, tais como substituições, deleções, adições, e/ou inserções. Por exemplo, a modificação pode ser em um ou mais dos CDRs do anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, BIIB059). Em certas modalidades, a modificação envolve uma, duas, ou três substituições de aminoácidos em um ou mais CDRs de VH e/ou VL do minicorpo anti-BDCA2. Estas substituições são feitas para melhorar a atividade de ligação e/ou funcional do minicorpo anti-BDCA2. Em outras modalidades, um, dois ou três aminoácidos de CDRs do anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, BIIB059) podem ser apagados ou adicionados, desde que haja ligação BDCA2 e/ou atividade funcional quando VH e VL estão associados.

Anticorpos Biespecíficos

[155] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Os anticorpos biespecíficos exemplificativos podem ligar-se a dois epí- topos diferentes da proteína BDCA2. Outros tais anticorpos podem combinar um local de ligação BDCA2 com um local de ligação para uma outra proteína. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo ou baixas formas de peso molecular dos mesmos (por exemplo, anticorpos biespecíficos de sc (Fv) 2, anticorpos biespecíficos de F (ab’) 2, anticorpos biespecíficos de diacorpo).

[156] A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento completo é baseado na coexpressão de dois pares da cadeia pesada de imunoglobulina da cadeia leve, onde as duas cadeias possuem diferentes especificidades (Millstein et al, Nature, 305: 537 a 539 (1983)). Em uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas estão fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina. Os DNA que codificam as fusões da cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotransfectados para uma célula hospedeira adequada. Isto proporciona maior flexibilidade no ajuste das proporções dos três fragmentos de polipeptídeo. É, no entanto, possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas em um só vetor de expressão quando a expres-são de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resultam em rendimentos elevados.

[157] De acordo com outra abordagem descrita na Pat. US N ° 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura celular recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). As "cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) grande(s) lateral(is) é(são) criadas na interface da segunda molécula de anticorpo substituindo as cadeias laterais grandes de aminoácidos por menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero relativamente a outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.

[158] Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos "heterocon-jugados" ou reticulados. Por exemplo, um dos anticorpos no hetero- conjugado podem ser acoplados a avidina, o outro a biotina. Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos usando quaisquer métodos de ligação cruzada convenientes.

[159] A tecnologia de "diacorpo" fornece um mecanismo alternativo para preparar os fragmentos de anticorpo biespecíficos. Os fragmentos compreendem um VH ligado a um VL por um ligante que é demasiadamente curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Deste modo, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios complementares VL e VH de outro fragmento, formando dessa maneira dois locais de ligação ao antígeno.

Anticorpos polivalentes

[160] Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou ca-tabolizado) mais rapidamente que um anticorpo bivalente por meio de uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos descritos na presente invenção podem ser anticorpos multivalentes com três ou mais locais de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos por meio da expressão recombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais locais de ligação de antígeno. Um domínio de dimerização exemplar compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região de articulação. Um anticorpo multivalente pode compreender (ou consistir em) três a cerca de oito locais (por exemplo, quatro) de ligação ao antígeno. O anticorpo multivalente compreende, opcionalmente, pelo menos, uma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, pelo menos duas cadeias polipeptidi- cas), em que a(s) cadeia(s) de polipeptídeo compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeo pode(m) compreender VD1- (X1) n-VD2- (X2) n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 um segundo domínio variável, Fc uma cadeia de polipeptídeo de um Fc região, X1 e X2 representa um ami- noácido ou um peptídeo espaçador, e n é 0 ou 1.

Os anticorpos conjugados

[161] Os anticorpos descritos na presente invenção podem ser conjugados com os anticorpos que estão ligados a várias moléculas, incluindo as substâncias macromoleculares, tais como os polímeros (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polietilenoimina (PEI) modificada com PEG (PEI-PEG), ácido glutâmico (PGA) (copolímeros N- (2- hidroxipropil) metacrilamida (HPMA)), ácido hialurônico, materiais radioativos (por exemplo, 90Y, 131I), substâncias fluorescentes, substâncias luminescentes, haptenos, enzimas, quelatos de metais, fármacos e toxinas (por exemplo, calcheamicin, Pseudomonas exotoxin A, ricina (por exemplo, cadeia de ricina A desglicosilada)).

[162] Em uma modalidade, para melhorar as ações citotóxicas de anticorpos anti-BDCA2 e, consequentemente, a sua eficácia terapêutica, os anticorpos são conjugados com substâncias altamente tóxicas, incluindo os radioisótopos e os agentes citotóxicos. Estes conjugados podem entregar uma carga tóxica seletiva para o local alvo (ou seja, células que expressam o antígeno reconhecido por meio do anticorpo), enquanto as células que não são reconhecidas por meio do anticorpo são poupadas. A fim de minimizar a toxicidade, os conjugados são geralmente engenheirados com base nas moléculas com uma meia-vida de soro de curto (dessa maneira, a utilização de sequências de muri- no, e isotipos IgG3 ou IgG4).

[163] Em certas modalidades, um anticorpo anti-BDCA2 ou o fra gmento de ligação ao antígeno do mesmo são modificados com uma fração que aumenta a sua estabilização e/ou retenção em circulação, por exemplo, em sangue, soro, ou outros tecidos, por exemplo, por, pelo menos, 1,5, 2, 5, 10, ou 50 vezes. Por exemplo, o anticorpo anti- BDCA2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser associado com (por exemplo, conjugado a) um polímero, por exemplo, um polímero substancialmente não antigênico, tal como um óxido de polialquileno ou um óxido de polietileno. Os polímeros adequados irão variar substancialmente em peso. Os polímeros com pesos moleculares médios em número variam de cerca de 200 a cerca de 35.000 Daltons (ou cerca de 1.000 a cerca de 15.000, e de 2.000 a cerca de 12.500) podem ser usados. Por exemplo, o anticorpo anti-BDCA2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser conjugado com um polímero solúvel em água, por exemplo, um polímero hidrofílico de polivinila, por exemplo, álcool polivinílico ou polivinilpirrolidona. Exemplos desses polímeros incluem homopolímeros de óxido de polialquile- no tais como polietilenoglicol (PEG) ou polipropileno glicóis, polióis po- lioxietilenados, seus copolímeros e seus copolímeros de bloco dos mesmos, desde que a solubilidade na água dos copolímeros de bloco seja mantida. Os polímeros úteis incluem os polioxialquilenos, tais como polioxietileno, polioxipropileno, e copolímeros de bloco de polioxie- tileno e polioxipropileno; polimetacrilatos; carbômeros; e polissacarí- deos ramificados ou não ramificados.

[164] Os anticorpos conjugados acima descritos podem ser preparados por meio d realização de modificações químicas sobre os an- ticorpos ou as formas de peso molecular mais baixas dos mesmos descritos na presente invenção. Os métodos para a modificação de anticorpos são bem conhecidos na técnica (por exemplo, US 5.057.313 e US 5.156.840).

Métodos de produção de anticorpos

[165] Os anticorpos podem ser produzidos em células bacteria- nas ou eucarióticas. Alguns anticorpos, por exemplo, Fab, podem ser produzidos em células bacterianas, por exemplo, células de E. coli. Os anticorpos também podem ser produzidos em células eucarióticas, tais como as linhagens celulares transformadas (por exemplo, CHO, 293E, COS). Além disso, os anticorpos (por exemplo, scFv) podem ser expressos em uma célula de levedura, tais como Pichia (vide, por exemplo, Powers et al, J Immunol Methods 251: 123 a 35 (2001)), Hanseu- la, ou Saccharomyces. Para produzir o anticorpo de interesse, um po- linucleotídeo que codifica para o anticorpo é construído, introduzido em um vetor de expressão, e, em seguida, expresso em células hospedeiras adequadas. As técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar os transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo.

[166] Se o anticorpo é para ser expresso em células bacterianas (por exemplo, E. coli), o vetor de expressão deve possuir características que permitem a amplificação do vetor nas células bacterianas. Além disso, quando E. coli, tais como JM109, DH5a, HB101, ou XL1- Blue são usados como um hospedeiro, o vetor deve ter um promotor, por exemplo, um promotor lacZ (Ward et al, 341: 544 a 546 (1989), o promotor araB (Better et al, Science, 240: 1041 a 1043 (1988).), ou o promotor T7, que pode permitir a expressão eficiente em E. Coli. Os exemplos de tais vetores incluem, por exemplo, os vetores de M13- série, vetores de pUC série E, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "Sistema QIAexpress" (QIAGEN), pEGFP, e PET (quando este vetor de expressão é usado, o anfitrião é de preferência BL21 expressando T7 RNA polimerase.) O vetor de expressão pode conter uma sequência sinal para a secreção de anticorpos para a produção para o periplasma de E. coli, a sequência de sinal pelB (Lei et al, J. Bacteriol, 169: 4379 (1987).) pode ser usada como a sequência sinal para a secreção de anticorpos. Para a expressão bacteriana, os métodos de cloreto de cálcio ou os métodos de eletroporação podem ser usados para introduzir o vetor de expressão na célula bacteri- ana.

[167] Se o anticorpo é para ser expresso em células animais, tais como CHO, COS, e células NIH3T3, o vetor de expressão inclui um promotor necessário para a expressão nessas células, por exemplo, um promotor de SV40 (Mulligan et al, Nature, 277: 108 (1979)), MMLV- LTR, promotor EF1α (Mizushima et al, Nucléic Acids Res., 18: 5322 (1990)), ou o promotor de CMV. Em adição à sequência de ácido nu- cleico que codifica para a imunoglobulina ou domínio da mesma, os vetores de expressão recombinantes podem transportar as sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e os genes marcadores de seleção. O gene marcador de seleção facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, Pat. US Nos. 4399216, 4634665 e 5179017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador de seleção confere resistência aos fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os exemplos de vetores com marcadores de seleção incluem pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK- CMV, pOPRSV, e pOP13.

[168] Em uma modalidade, os anticorpos são produzidos em cé lulas de mamífero. Exemplos de células hospedeiras de mamífero para a expressão de um anticorpo incluem ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo as células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Cha- sin (1980) Proc Natl Acad Sci EUA 77: 4216 a 4220, usado com um marcador de seleção DHFR, por exemplo, como descrito em Kaufman e Sharp (1982) Mol Biol 159: 601 a 621), células 293 do rim embrionárias humanas (por exemplo, 293, 293E, 293T), células COS, células NIH-3T3, linhagens celulares linfocíticas, por exemplo, NS0 de mielo- ma e células SP2, e uma célula a partir de um animal transgênico, por exemplo, um mamífero transgênico. Por exemplo, a célula é uma célula epitelial mamária.

[169] Em um sistema exemplificativo para a expressão de anti corpo, um vetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada do anticorpo quanto a cadeia leve do anticorpo de um anticorpo anti-BDCA2 (por exemplo, BIIB059) é introduzido em dhfr de células CHO por meio da transfecção mediada por cálcio-fosfato. No vetor de expressão recombinante, os genes de anticorpo da cadeia leve e pesada são, cada um ligados operacionalmente a elementos reguladores de potenciador/promotor (por exemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus e semelhantes, tais como um elemento regulador de promotor CMV/potenciador AdMLP ou um elemento regulador) potenciador SV40/promotor AdMLP para dirigir os elevados níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também transporta um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando metotrexato de sele- ção/amplificação. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão do anticorpo da cadeia pesada e leve e o anticorpo é recuperado a partir do meio de cultura.

[170] Os anticorpos também podem ser produzidos por meio de um animal transgênico. Por exemplo, Pat US EUA. No. 5.849.992 descreve um método de expressar um anticorpo na glândula mamaria de um mamífero transgênico. Um transgene é construído, que inclui um promotor e ácidos nucleicos específicos do leite que codificam o anticorpo de interesse e uma sequência de sinal para secreção. O leite produzido por fêmeas de tais mamíferos transgênicos inclui, segregados nele, o anticorpo de interesse. O anticorpo pode ser purificado a partir do leite, ou para algumas aplicações, usado diretamente. Os animais também são fornecidos compreendendo um ou mais dos ácidos nucleicos descritos na presente invenção.

[171] Os anticorpos da presente invenção podem ser isolados a partir de dentro ou do lado de fora (tal como o meio) da célula hospedeira e purificados como anticorpos substancialmente puros e homogêneos. Os métodos para o isolamento e purificação vulgarmente usados para a purificação de anticorpos podem ser usados para o isolamento e purificação de anticorpos, e não estão limitados a qualquer método em particular. Os anticorpos podem ser isolados e purificados por meio da seleção apropriada e combinação de, por exemplo, cro- matografia em coluna, filtração, ultrafiltração, para as trocas salinas, a precipitação de solvente, extração com solvente, a destilação, a imu- noprecipitação, eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, focagem isoelétrica, diálise, e recristalização. A cromatografia inclui, por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, croma- tografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia de fase reversa, e cromatografia de adsorção (Estratégias para Purificação de Proteína e Caracterização: Um Manual de Curso Laboratorial de Ed Daniel R. Marshak et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). A croma- tografia pode ser realizada usando a cromatografia de fase líquida, tal como HPLC e FPLC. As colunas usadas para cromatografia de afinidade incluem coluna de proteína A e coluna de proteína G. Exemplos de colunas usando coluna de proteína A incluem Hyper D, Poros, e Sepharose FF (GE Healthcare Biosciences). A presente descrição também inclui os anticorpos que são altamente purificados usando estes métodos de purificação.

Caracterização dos Anticorpos

[172] As propriedades de ligação ao BDCA2 dos anticorpos des critos na presente invenção podem ser medidas por meio de qualquer método padrão, por exemplo, um ou mais dos seguintes métodos: OCTET®, Ressonância de Superfície Plasmática (SPR), análise de BIACORE ™, Ensaio Imunossorvente ligado à Enzima (ELISA), EIA (ensaio imunoenzimático), RIA (radioimunoensaio) e Transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).

[173] A interação de ligação de uma proteína de interesse (um anticorpo anti-BDCA2) e um alvo (por exemplo, BDCA2) pode ser analisada usando os sistemas OCTET®. Neste método, uma das diversas variações de instrumentos (por exemplo, OCTET® QKE e qk), fabricados pela empresa FortéBio são usadas para determinar as interações protéicas, especificidade de ligação e mapeamento de epítopos. Os sistemas OCTET® fornecem uma maneira fácil de monitorar em tempo real a ligação medindo as mudanças na luz polarizada que percorre uma ponta personalizada e, em seguida, de volta para um sensor.

[174] A interação de ligação de uma proteína de interesse (um anticorpo anti-BDCA2) e um alvo (por exemplo, BDCA2) pode ser analisada por meio da Superfície de Ressonância Plasmônica (SPR). SPR ou Análise de Interação Biomolecular (BIA) detecta as interações bio- específicas em tempo real, sem qualquer rotulagem dos interatuantes. As mudanças na massa na superfície de ligação (indicativos de um evento de ligação) do resultado de chips BIA em alterações do índice de refração de luz perto da superfície (o fenômeno óptico de ressonância de plasma de superfície (SPR)). As alterações na refratividade geram um sinal detectável, que são medidos como uma indicação de reações em tempo real entre as moléculas biológicas. Os métodos pa- ra a utilização de SPR são descritos, por exemplo, na Pat. US No. 5.641.640; Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander e Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63: 2338 a 2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699 a 705 e recursos on-line fornecidos por BIAcore International AB (Uppsala, Suécia). A informação de SPR pode ser usada para proporcionar uma medida exata e quantitativa da constante de equilíbrio de dissociação (Kd), e os parâmetros cinéticos, incluindo Kon e Koff, para a ligação de uma biomolécula a um alvo.

[175] Os epítopos também podem ser mapeados diretamente através da avaliação da capacidade de anticorpos diferentes para competir uns com os outros para a ligação a BDCA2 humano usando as técnicas cromatográficas BIACORE (Pharmacia BIAtechnology Handbook, "Mapeamento de Epítopos", Seção 6.3.2, (Maio de 1994); vide também Johne et al (1993) J. Immunol Methods, 160: 191 a 198).

[176] Quando se emprega um imunoensaio enzimático, uma amostra contendo um anticorpo, por exemplo, um sobrenadante da cultura de células produtoras de anticorpo ou um anticorpo purificado é adicionada a uma placa revestida com antígeno. Um anticorpo secundário marcado com uma enzima, tal como fosfatase alcalina é adicionado, a placa é incubada, e após a lavagem, um substrato da enzima tal como p-nitrofenilfosfato é adicionado, e a absorvância é medida para avaliar a atividade de ligação ao antígeno.

[177] Orientações gerais adicionais para a avaliação de anticorpos, por exemplo, Western blot e ensaios de imunoprecipitacão, podem ser encontrados em Antibodies: A Laboratory Manual, ed. por Harlow e Lane, Cold Spring Harbor press (1988)).

Depósitos

[178] Um hibridoma que produz o hibridoma de murino designado anti-BDCA2 anticorpo monoclonal BDCA2-1P24F4.1.1.1 foi depositado com a American Type Culture Collection (ATCC) ao abrigo dos termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para o Propósito de Procedimento de Patentes, em 15 de janeiro de 2013, e tem número de acesso PTA- 13450. Os candidatos reconheceram seu dever de substituir os depósitos devido ao fato de o depositário não ser capaz de fornecer uma amostra quando solicitado devido à condição do depósito antes do final do prazo de uma patente concedida do mesmo. Os candidatos também reconhecem sua responsabilidade de notificar o ATCC da emissão de uma tal patente, momento em que o depósito será disponibilizado ao público. Antes desse tempo, o depósito será colocado à disposição do Comissário de Patentes, nos termos do 37 CFR § 1.14 e 35 U.S.C. § 112.

Anticorpos com alteração da função efetora

[179] A interação de anticorpos e de complexos anticorpo- antígeno com as células do sistema imunitário provoca uma variedade de respostas, referidas na presente invenção como as funções efeto- ras. As funções efetoras mediadas imunes incluem dois mecanismos principais: anticorpo dependente da citotoxicidade mediada por células (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Ambos são mediados por meio da região constante de imunoglobulina da proteína. O domínio de Fe de anticorpo é, por conseguinte, a porção que define as interações com os mecanismos efetores imunitários.

[180] Os anticorpos IgG ativam as vias efetoras do sistema immune através da ligação aos membros da família de receptores de superfície celular Fcy e a C1q do sistema do complemento. A ligação de proteínas efetoras por meio dos anticorpos agrupados desencadeia uma variedade de respostas, incluindo a libertação de citocinas inflamatórias, a regulação da produção de antígeno, a endocitose, e morte celular. Em algumas aplicações clínicas, estas respostas são cruciais para a eficácia de um anticorpo monoclonal. Em outras, eles provocam efeitos colaterais indesejáveis, tais como a inflamação e a eliminação de células contendo antigenes. Por conseguinte, a presente invenção refere-se ainda a proteínas de ligação a BDCA2, incluindo os anticorpos, com funções efetoras alteradas, por exemplo, aumentadas ou reduzidas.

[181] A função efetora de um anticorpo anti-BDCA2 da presente invenção pode ser determinada usando um dos muitos ensaios conhecidos. A função efetora do anticorpo anti-BDCA2 pode ser aumentada ou reduzida em relação a um segundo anticorpo anti-BDCA2. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo anti-BDCA2 pode ser qualquer anticorpo que se liga especificamente a BDCA2. Em outras modalidades, o segundo anticorpo específico para BDCA2 pode ser qualquer um dos anticorpos da presente invenção, como BIIB059. Em outras modalidades, em que o anticorpo anti-BDCA2 de interesse tem sido modificado para aumentar ou reduzir a função efetora, o segundo anticorpo anti-BDCA2 pode ser a versão não modificada ou o anticorpo parental.

[182] As funções efetoras incluem citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), em que os anticorpos se ligam aos receptores Fc em células T citotóxicas, células assassinas naturais (NK), ou macrófagos que conduzem à morte celular, e citoto- xicidade dependente do complemento (CDC), o qual é a morte de célula induzida através da ativação da cascata do complemento (revisto em Daeron, Annu Rev. Immunol, 15: 203 a 234 (1997); Ward e Ghetie, Therapeutic Immunol., 2: 77 a 94 (1995); e Ravetch e Kinet., Annu Rev. Immunol. 9: 457 a 492 (1991)). Tais funções efetoras requerem geralmente que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando ensaios padrão que são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, WO 05/018572, WO 05/003175, e US 6.242.195).

[183] As funções efetoras podem ser evitadas pelo uso de frag mentos de anticorpos que não possuam o domínio de Fc, tais como Fab, Fab'2, ou Fv da cadeia simples. Uma alternativa é usar o anticorpo lgG4 subtipo, que se liga a FcyRI, mas que se liga fracamente a C1q e mal FcyRII e RIII. O subtipo IgG2 também reduziu a ligação a receptores Fc, mas retém uma ligação significativa para o alotipo de FcYRIIa H131 e a C1q. Dessa maneira, as alterações adicionais na sequência de Fc são necessárias para eliminar a ligação de todos os receptores de Fc e a C1q.

[184] Diversas funções efetoras de anticorpo, incluindo ADCC, são mediadas por meio dos receptores de Fc (FcR), que se ligam a região Fc de um anticorpo. A afinidade de um anticorpo para um determinado FcR, e, portanto, a atividade efetora mediada pelo anticorpo, pode ser modulada através da alteração da sequência de aminoá- cidos e/ou modificações pós-traducionais de Fc e/ou a região constante do anticorpo.

[185] Os FcR são definidos pela sua especificidade para os isoti- pos de imunoglobulinas; Receptores de Fc para os anticorpos IgG são referidos como FcyR, para IgE como FcεR, para IgA como FcαR e assim por diante. Três subclasses de FcyR foram identificadas: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). Ambos FcyRII e FcyRIII têm dois tipos: FcYRIIa (CD32A) e FCYRIIB (CD32b); e FCYRIIIA (CD16a) e FCYRIIIB (CD16b). Uma vez que cada subclasse FcyR é codificada por dois ou três genes, e o fatiamento alternativo de RNA conduz a várias transcrições, uma ampla diversidade de isoformas FcyR existe. Por exemplo, FcyRII (CD32) inclui as isoformas IIa, IIb1, IIb2 IIb3, e IIc.

[186] O local de ligação de anticorpos humanos e de murídeo para FcyR foi anteriormente mapeado para a chamada "região de dobradiça inferior" que consiste nos resíduos 233 a 239 (numeração índice EU como em Kabat et al., Sequências de Proteínas de Intersse Imuno- lógico, 5th Ed. Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, MD (1991), Woof et al, Molec Immunol 23: 319 a 330 (1986); Duncan et al, Nature 332: 563 (1988); Canfield e Morrison, J. Exp Med 173: 1483 a 1491 (1991); Chappel et al, Proc Natl Acad Sci EUA 88: 9036 a 9040 (1991)). Dos resíduos 233 a 239, P238 e S239 estão entre aqueles citados como sendo possivelmente envolvidos na ligação. Outras áreas anteriormente citadas, possivelmente, envolvidas na ligação de FcyR são: G316-K338 (IgG humana) para FcyRI humano (Woof et al, Mol Immunol, 23: 319 a 330 (1986)); K274-R301 (IgG1 humana) para FcyRIII humano (Sarmay et al, Molec Immunol 21: 43 a 51 (1984)); e Y407-R416 (IgG humana) para FcyRIII humano (Gergely et al, Biochem Soc Trans 12: 739 a 743 (1984) e Shields et al, J Biol Chem 276: 6591 a 6604 (2001), Lazar. GA et al, Proc Natl Acad Sci. 103: 4005 a 4010 (2006) Estas e outras extensões ou regiões de resíduos de aminoácidos envolvidas na ligação de FcR podem ser evidentes para a pessoa que é versada na técnica a partir de uma análise das estruturas de cristal de complexos Ig-FcR (vide, por exemplo, Sondermann et al 2000 Nature 406 (6793): 267 a 73 e Sondermann et al 2002 Biochem Soc Trans 30 (4): 481 a 6). Por conseguinte, os anticorpos anti-BDCA2 do presente invenção incluem modificações de um ou mais dos resíduos acima mencionados (para aumentar ou diminuir a função efetora, conforme necessário).

[187] Outra abordagem para alterar a função efetora do anticorpo monoclonal inclui a mutação de aminoácidos na superfície do anticorpo monoclonal que estão envolvidos em interações de ligação efetoras (Lund, J., et al (1991) J. Immunol 147 (8): 2657 a 62; Shields, RL et al (2001) J. Biol Chem 276 (9): 6591 a 604).

[188] Os métodos de aumento da função efetora de anticorpos são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Kelley et al, Me-thods Mol Biol, 901: 277 a 93 (2012), Natsume et al, Drug Des Devel Ther 3: 7 a 16 (2009); US 8.188.231, US 7.960.512). Em uma modalidade, os anticorpos BDCA2 tem uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, ou mais substituições de aminoácidos em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243,244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267,268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283,284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299,300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325,326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, e 337, em que a numeração dos resíduos na região Fc é o índice de EU como em Kabat. Em certas modalidades, os anticorpos BDCA2 têm uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, ou mais das substituições de aminoáci- dos selecionadas a partir do grupo que consiste em: D221K, D221Y, K222E, K222Y, T223E, T223K, H224E, H224Y, T225E, T225K, T225W, P227E, P227G, P227K, P227Y, P228E, P228G, P228K, P228Y, P230A, P230E, P230G, P230Y, A231E, A231G, A231K, A231P, A231Y, P232E, P232G, P232K, P232Y, E233A, E233D, E233F, E233G, E233H, E233I, E233K, E233L, E233M, E233N, E233Q, E233R, E233S, E233T, E233V, E233W, E233Y, L234A, L234D, L234E, L234F, L234G, L234H, L234I, L234K, L234M, L234N, L234P, L234Q, L234R, L234S, L234T, L234V, L234W, L234Y, L235A, L235D, L235E, L235F, L235G, L235H, L235I, L235K, L235M, L235N, L235P, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, G236A, G236D, G236E, G236F, G236H, G236I, G236K, G236L, G236M, G236N, G236P, G236Q, G236R, G236S, G236T, G236V, G236W, G236Y, G237D, G237E, G237F, G237H, G237I, G237K, G237L, G237M, G237N, G237P, G237Q, G237R, G237S, G237T, G237V, G237W, G237Y, P238D, P238E, P238F, P238G, P238H, P238I, P238K, P238L, P238M, P238N, P238Q, P238R, P238S, P238T, P238V, P238W, P238Y, S239D, S239E, S239F, S239G, S239H, S239I, S239K, S239L, S239M, S239N, S239P, S239Q, S239R, S239T, S239V, S239W, S239Y, V240A, V240I, V240M, V240T, F241D, F241E, F241L, F241R, F241S, F241W, F241Y, F243E, F243H, F243L, F243Q, F243R, F243W, F243Y, P244H, P245A, K246D, K246E, K246H, K246Y, P247G, P247V, D249H, D249Q, D249Y, R255E, R255Y, E258H, E258S, E258Y, T260D, T260E, T260H, T260Y, V262A, V262E, V262F, V262I, V262T, V263A, V263I, V263M, V263T, V264A, V264D, V264E, V264F, V264G, V264H, V264I, V264K, V264L, V264M, V264N, V264P, V264Q, V264R, V264S, V264T, V264W, V264Y, D265F, D265G, D265H, D265I, D265K, D265L, D265M, D265N, D265P, D265Q, D265R, D265S, D265T, D265V, D265W, D265Y, V266A, V266I, V266M, V266T, S267D, S267E, S267F, S267H, S267I, S267K, S267L, S267M, S267N, S267P, S267Q, S267R, S267T, S267V, S267W, S267Y, H268D, H268E, H268F, H268G, H268I, H268K, H268L, H268M, H268P, H268Q, H268R, H268T, H268V, H268W, E269F, E269G, E269H, E269I, E269K, E269L, E269M, E269N, E269P, E269R, E269S, E269T, E269V, E269W, E269Y, D270F, D270G, D270H, D270I, D270L, D270M, D270P, D270Q, D270R, D270S, D270T, D270W, D270Y, P271A, P271D, P271E, P271F, P271G, P271H, P271I, P271K, P271L, P271M, P271N, P271Q, P271R, P271S, P271T, P271V, P271W, P271Y, E272D, E272F, E272G, E272H, E272I, E272K, E272L, E272M, E272P, E272R, E272S, E272T, E272V, E272W, E272Y, V273I, K274D, K274E, K274F, K274G, K274H, K274I, K274L, K274M, K274N, K274P, K274R, K274T, K274V, K274W, K274Y, F275L, F275W, N276D, N276E, N276F, N276G, N276H, N276I, N276L, N276M, N276P, N276R, N276S, N276T, N276V, N276W, N276Y, Y278D, Y278E, Y278G, Y278H, Y278I, Y278K, Y278L, Y278M, Y278N, Y278P, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278T, Y278V, Y278W, D280G, D280K, D280L, D280P, D280W, G281D, G281E, G281K, G281N, G281P, G281Q, G281Y, V282E, V282G, V282K, V282P, V282Y, E283G, E283H, E283K, E283L, E283P, E283R, E283Y, V284D, V284E, V284L, V284N, V284Q, V284T, V284Y, H285D, H285E, H285K, H285Q, H285W, H285Y, N286E, N286G, N286P, N286Y, K288D, K288E, K288Y, K290D, K290H, K290L, K290N, K290W, P291D, P291E, P291G, P291H, P291I, P291Q, P291T, R292D, R292E, R292T, R292Y, E293F, E293G, E293H, E293I, E293L, E293M, E293N, E293P, E293R, E293S, E293T, E293V, E293W, E293Y, E294F, E294G, E294H, E294I, E294K, E294L, E294M, E294P, E294R, E294S, E294T, E294V, E294W, E294Y, Q295D, Q295E, Q295F, Q295G, Q295H, Q295I, Q295M, Q295N, Q295P, Q295R, Q295S, Q295T, Q295V, Q295W, Q295Y, Y296A, Y296D, Y296E, Y296G, Y296H, Y296I, Y296K, Y296L, Y296M, Y296N, Y296Q, Y296R, Y296S, Y296T, Y296V, N297D, N297E, N297F, N297G, N297H, N297I, N297K, N297L, N297M, N297P, N297Q, N297R, N297S, N297T, N297V, N297W, N297Y, S298D, S298E, S298F, S298H, S298I, S298K, S298M, S298N, S298Q, S298R, S298T, S298W, S298Y, T299A, T299D, T299E, T299F, T299G, T299H, T299I, T299K, T299L, T299M, T299N, T299P, T299Q, T299R, T299S, T299V, T299W, T299Y, Y300A, Y300D, Y300E, Y300G, Y300H, Y300K, Y300M, Y300N, Y300P, Y300Q, Y300R, Y300S, Y300T, Y300V, Y300W, R301D, R301E, R301H, R301Y, V302I, V303D, V303E, V303Y, S304D, S304H, S304L, S304N, S304T, V305E, V305T, V305Y, W313F, K317E, K317Q, E318H, E318L, E318Q, E318R, E318Y, K320D, K320F, K320G, K320H, K320I, K320L, K320N, K320P, K320S, K320T, K320V, K320W, K320Y, K322D, K322F, K322G, K322H, K322I, K322P, K322S, K322T, K322V, K322W, K322Y, V323I, S324D, S324F, S324G, S324H, S324I, S324L, S324M, S324P, S324R, S324T, S324V, S324W, S324Y, N325A, N325D, N325E, N325F, N325G, N325H, N325I, N325K, N325L, N325M, N325P, N325Q, N325R, N325S, N325T, N325V, N325W, N325Y, K326I, K326L, K326P, K326T, A327D, A327E, A327F, A327H, A327I, A327K, A327L, A327M, A327N, A327P, A327R, A327S, A327T, A327V, A327W, A327Y, L328A, L328D, L328E, L328F, L328G, L328H, L328I, L328K, L328M, L328N, L328P, L328Q, L328R, L328S, L328T, L328V, L328W, L328Y, P329D, P329E, P329F, P329G, P329H, P329I, P329K, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329R, P329S, P329T, P329V, P329W, P329Y, A330E, A330F, A330G, A330H, A330I, A330L, A330M, A330N, A330P, A330R, A330S, A330T, A330V, A330W, A330Y, P331D, P331F, P331H, P331I, P331L, P331M, P331Q, P331R, P331T, P331V, P331W, P331Y, I332A, I332D, I332E, I332F, I332H, I332K, I332L, I332M, I332N, I332P, I332Q, I332R, I332S, I332T, I332V, I332W, I332Y, E333F, E333H, E333I, E333L, E333M, E333P, E333T, E333Y, K334F, K334I, K334L, K334P, K334T, T335D, T335F, T335G, T335H, T335I, T335L, T335M, T335N, T335P, T335R, T335S, T335V, T335W, T335Y, I336E, I336K, I336Y, S337E, S337H, and S337N, em que a numeração dos resíduos na região Fc é a do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade particular, os anticorpos BDCA2 compreendem uma, duas ou três das seguintes mutações: S239D, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S239D/I332E/G236A, S298A, A330L I332E, E333A, and K334A.

[189] A presença de oligossacarídeos - especificamente, o oli-gossacarídeo ligado a N na asparigina-297 no domínio CH2 de IgG 1 - é importante para a ligação a FcyR bem como C1q. A redução do teor de fucose de anticorpos melhora a função efetora (vide, por exemplo, US 8.163.551). Em certas modalidades os anticorpos BDCA2 reduziram a fucosilação e as substituições de aminoácidos que aumentam a função efetora (por exemplo, uma, duas, ou três das seguintes muta- ções: S298A; E333A, K334A e). A função efetora pode também ser alcançada através da preparação e que expressa os anticorpos anti- BDCA2 descritos na presente invenção, na presença de inibidores de alfa-manosidase I (por exemplo, kifunensine) a uma concentração de inibidor de cerca de 60 a 200 ng/mL (por exemplo, 60 ng/mL, 75 ng/mL, 100 ng/mL, 150 ng/mL). Os anticorpos expressos na presença de inibidores alfa-manosidase contêm principalmente oligomanose gli- canos do tipo I e geralmente demonstram um aumento da atividade de ADCC e afinidade para FCYRIIIA, mas reduziram a ligação C1q.

[190] Os anticorpos anti-BDCA2 da presente invenção com o aumento da função efetora incluem os anticorpos com afinidade de ligação aumentada para um ou mais receptores de Fc (FcR) em relação a um anticorpo anti-BDCA2 parental ou não variante. Consequentemente, os anticorpos anti-BDCA2 com afinidade de ligação de FcR aumentada inclui anticorpos anti-BDCA2 que exibem um 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou superior ou aumento na afinidade de ligação para um ou mais receptores de Fc, em comparação com um dos anticorpos anti-BDCA2 parentais ou não variantes. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-BDCA2 com o aumento da função efetora se liga a um FcR com cerca de 10 vezes maior afinidade relativa de um anticorpo parental ou não variante. Em outras modalidades, um anticorpo anti-BDCA2 com o aumento da função efetora se liga a um FcR com cerca de afinidade 15 vezes superior ou com cerca de afinidade 20 vezes superior relativa de um anticorpo parental ou não variante. O receptor de FcR pode ser um ou mais de FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII, e suas isoformas, e FcεR, FcμR, FcδR, e/ou FcαR. Em modalidades particulares, um anticorpo anti- BDCA2 com o aumento da função efetora exibe um 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou superior ou aumento na afinidade de ligação para FcyRIIa.

[191] Para reduzir a função efetora, pode-se utilizar as combinações de segmentos de sequência de subtipo diferente (por exemplo, IgG2 e IgG4) combinadas para se obter uma maior redução na ligação a receptores do que Fcy sozinho ou subtipo (Armour et al., Eur. J. Immunol., 29: 2613 a 1624 (1999); Mol Immunol, 40: 585 a 593 (2003)). Além disso, os locais de glicosilação ligados a N podem ser removidos como um meio de reduzir a função efetora. Um grande número de variantes de afinidades com Fc alterada e/ou reduzida para alguns ou todos os subtipos de receptores de Fc (e, dessa maneira, para as funções efetoras) são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, US 2007/0224188; US 2007/0148171; US 2007/0048300; US 2007/0041966; US 2007/0009523; US 2007/0036799; US 2006/0275283; US 2006/0235208; US 2006/0193856; US 2006/0160996; US 2006/0134105; US 2006/0024298; US 2005/0244403; US 2005/0233382; US 2005/0215768; US 2005/0118174; US 2005/0054832; US 2004/0228856; US 2004/132101; US 2003/158389; vide também US 7.183.387;6.737.056; 6.538.124; 6.528.624; 6.194.551; 5.624.821; 5.648.260.

[192] Os anticorpos anti-BDCA2 da presente invenção com fun ção efetora reduzida incluem os anticorpos com afinidade de ligação reduzida para um ou mais receptores de Fc (FcR) em relação a um anticorpo anti-BDCA2 parental ou não variante. Consequentemente, os anticorpos anti-BDCA2 com afinidade de ligação reduzida de FcR inclui os anticorpos anti-BDCA2 que exibem um 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou superior ou diminuição na afinidade de ligação para um ou mais receptores de Fc, em comparação com um dos anticorpos anti-BDCA2 parentais ou não variantes. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-BDCA2 com função efetora reduzida se liga a um FcR com cerca de 10 vezes menos afinidade em relação a um anticorpo parental ou não variante. Em outras modalida- des, um anticorpo anti-BDCA2 com função efetora reduzida se liga a um FcR com cerca de 15 vezes menos afinidade ou com cerca de 20 vezes menos afinidade em relação a um anticorpo parental ou não variante. O receptor de FcR pode ser um ou mais de FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII, e suas isoformas, e FcεR, FcμR, FcδR, e/ou um FcαR. Em modalidades particulares, um anticorpo anti-BDCA2 com função efetora reduzida exibe uma 1,5 veze, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou superior ou diminuição da afinidade de ligação para FcYRIIa.

[193] Em CDC, o complexo anticorpo-antígeno liga o complemento, resultando na ativação da cascata do complemento e a formação do complexo de ataque à membrana. A ativação da via clássica do complemento é iniciada por meio da ligação do primeiro componente do sistema do complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada) que estão ligados ao seu antígeno cognato; dessa maneira, a ativação da cascata do complemento é regulada em parte por meio da afinidade de ligação da imunoglobulina à proteína C1q. Para ativar a cascata do complemento, que é necessário para se ligar a C1q, pelo menos, duas moléculas de IgG1, IgG2, ou IgG3, mas apenas uma molécula de IgM, são ligadas ao alvo antigênico (Ward e Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77 a 94 (1995) p. 80). Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996), pode ser realizado.

[194] Tem sido proposto que vários resíduos da molécula de IgG estejam envolvidos na ligação a C1q incluindo os resíduos de Glu318, Lys320 e Lys322 no domínio CH2, o resíduo de aminoácido 331 localizado em uma volta em estreita proximidade com a mesma cadeia beta, e os resíduos Lys235 Gly237 localizados na região dobradiça inferior, e os resíduos 231-238 localizados na região do terminal n do do mínio CH2 (vide, por exemplo, Xu et al, J. Immunol 150: 152A (Resumo) (1993), WO94/29351; Tao et al, J. Exp Med, 178: 661 a 667 (1993); Brekke et al, Eur J. Immunol, 24: 2542 a 47 (1994); Burton et al; Nature, 288: 338 a 344 (1980); Duncan e Winter, Nature 332: 738 a 40 (1988); Idusogie et al J Immunol 164: 4178 a 4184 (2000; US 5.648.260 e US 5.624.821).

[195] Os anticorpos anti-BDCA2 com ligação melhorada a C1q podem compreender uma substituição de aminoácidos em um, dois, três, ou quatro dos aminoácidos nas posições 326, 327, 333 e 334 da região Fc de IgG humana, em que a numeração dos resíduos no IgG região Fc é o índice de EU como em Kabat. Em uma modalidade, os anticorpos anti-BDCA2 incluem as seguintes substituições de aminoá- cidos: K326W/E333S, que são conhecidos para aumentar a ligação de um anticorpo IgG1 de C1q (Steurer W. et al, J. Immunol, 155 (3):. 1165 a 74 (1995)).

[196] Os anticorpos anti-BDCA2 com ligação reduzida a C1q po de compreender uma substituição de aminoácidos em um, dois, três, ou quatro dos aminoácidos nas posições 270, 322, 329 e 331 da região Fc de IgG humana, em que a numeração dos resíduos no IgG na região Fc é o índice de EU como em Kabat. Como um exemplo em IgG1, duas mutações na região do terminal COOH do domínio CH2 da IgG1 humana, K322A e P329A não ativam a via CDC e foram mostradas para resultar em mais do que uma diminuição de 100 vezes na ligação C1q (US 6.242.195).

[197] Dessa maneira, em certas modalidades, um anticorpo anti- BDCA2 da presente invenção exibe um aumento ou uma diminuição da ligação a uma proteína do complemento em relação a um segundo anticorpo anti-BDCA2. Em certas modalidades, um anticorpo anti- BDCA2 da presente invenção exibe ligação aumentada ou reduzida a C1q por um fator de cerca de 1,5 vez ou mais, cerca de 2 vezes ou mais, cerca de 3 vezes ou mais, cerca de 4 vezes ou mais, cerca de 5 vezes ou mais, cerca de 6 vezes ou mais, cerca de 7 vezes ou mais, cerca de 8 vezes ou mais, cerca de 9 vezes ou mais, cerca de 10 vezes ou mais, ou cerca de 15 vezes ou mais, relativamente a um segundo anticorpo anti-BDCA2.

[198] Dessa maneira, em certas modalidades da presente invenção, um ou mais destes resíduos podem ser modificados, substituídos ou removidos, ou um ou mais resíduos de aminoácido podem ser inseridos, de modo a aumentar ou diminuir a atividade CDC dos anticorpos anti-BDCA2 proporcionados na presente invenção.

[199] Em certas outras modalidades, a presente invenção pro porciona um anticorpo anti-BDCA2 que exibe uma reduzida ligação a um ou mais receptores FcR, mas que mantém a sua capacidade para se ligar ao complemento (por exemplo, a um ou semelhante, em algumas modalidades, a um menor grau do que um anticorpo anti-BDCA2 nativa, não variante, ou parental). Deste modo, um anticorpo anti- BDCA2 da presente invenção pode ligar-se e ativar o complemento, enquanto exibindo ligação reduzida a um FcR, tais como, por exemplo, FcYRIIa (por exemplo, FcYRIIa expressa em plaquetas). Um tal anticorpo com reduzida ou nenhuma ligação a FcYRIIa (tais como FcYRIIa expresso em plaquetas, por exemplo), mas que pode se ligar a C1q e ativa a cascata do complemento a pelo menos um certo grau irá reduzir o risco de eventos tromboembólicos mantendo ao mesmo tempo as funções efetoras talvez desejáveis. Em modalidades alternativas, um anticorpo anti-BDCA2 da presente invenção exibe ligação reduzida para um ou mais FcR, mas mantém a sua capacidade para se ligar a um ou mais outros FcR. Vide, por exemplo, US 2007-0009523, 20060194290, 2005-0233382, 2004-0228856, 2004-0191244 e, que descrevem várias modificações de aminoácidos que geram anticorpos com ligação reduzida para FcRI, FcRII, e/ou FcRIII, enquanto bem como substituições de aminoácidos que resultam no aumento da ligação a um FcR, mas diminuição da ligação a uma outra FcR.

[200] Por conseguinte, as funções efetoras que envolvem a região constante de um anticorpo anti-BDCA2 podem ser moduladas através da alteração das propriedades da região constante, e a região Fc em particular. Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 que tem a função efetora aumentada ou diminuída é comparado com um segundo anticorpo com função efetora e o qual pode ser um anticorpo não variante, nativo ou parental compreendendo uma constante nativa ou na região Fc que medeia a função efetora.

[201] Um Fc de sequência nativa ou região constante compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoáci- dos de uma região Fc ou cadeia constante encontrada na natureza. De preferência, uma molécula de controle usada para avaliar a função efetora em relação compreende o mesmo tipo de região/subtipo de Fc tal como o anticorpo de teste ou variante. Uma variante de Fc ou alterada ou região constante compreende uma sequência de aminoácidos que difere da de uma região da cadeia pesada de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido (como, por exemplo, a modificação pós-translacional, substituição de aminoáci- dos, a inserção ou supressão). Por conseguinte, a região constante da variante pode conter uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos que resultam em modificações pós-traducionais alteradas, incluindo, por exemplo, um padrão de glicosilação alterado. Um anticorpo parental ou região Fc é, por exemplo, uma variante que tem a função normal efetora usada para construir uma região constante (ou seja, Fc) que tenha sido alterada, por exemplo, o aumento da função efetora.

[202] Os anticorpos com função(ões) efetora(s) alterada(s) (porexemplo, aumentada) podem ser gerados por meio de engenharia ou a produção de anticorpos com regiões constantes variantes Fc, ou da cadeias pesadas. Tecnologia de DNA recombinante e/ou de cultura de células e expressão de condições podem ser usadas para produzir anticorpos com a função e/ou atividade alterada. Por exemplo, a tecnologia do DNA recombinante pode ser usada para manipular uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos de regiões (tais como, por exemplo, Fc ou regiões constantes) que afetam a função do anticorpo, incluindo as funções efetoras. Em alternativa, alterações nas modificações pós-translacionais, tais como, por exemplo, padrões de glicosilação, podem ser conseguidas através da manipulação da célula hospedeira e a cultura de células e condições de expressão, através da qual o anticorpo é produzido.

[203] Certas modalidades da presente invenção referem-se a umanticorpo anti-BDCA2 compreendendo uma ou mais sequências de CDR da cadeia pesada selecionadas a partir de CDR1 de VH de SEQ ID NO: 9, CDR2 de VH de SEQ ID NO: 10, e CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11 ; ou uma ou mais sequências alternativas de CDR da cadeia pesada selecionadas a partir de: CDR1 de VH de SEQ ID NO: 8, CDR2 de VH de SEQ ID NO: 10, e CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11; ou uma ou mais sequências alternativas de CDR da cadeia pesada selecionadas a partir de: CDR1 de VH de SEQ ID NO: 89, CDR2 de VH de SEQ ID NO: 91, e CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11; ou uma ou mais sequências alternativas de CDR da cadeia pesada selecionada a partir de: CDR1 de VH de SEQ ID NO: 9, CDR2 de VH de SEQ ID NO: 92, e CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11; ou uma ou mais sequências alternativas de CDR da cadeia pesada selecionadas a partir de: CDR1 de VH de SEQ ID NO: 90, CDR2 de VH de SEQ ID NO: 93, e CDR3 de VH de SEQ ID NO: 94, em que o anticorpo compreende ainda uma região Fc variante que confere a função efetora aumentada ou reduzida em comparação com uma região Fc nativa ou parental. De acordo com outras variantes, o anticorpo anti-BDCA2 compreende, pelo menos, dois de CDRs (ou CDRs alternados), e em outras modalidades o anticorpo compreende todas as três sequências de CDR da cadeia pesada (ou CDRs alternados). Estes anticorpos anti-BDCA2 i) inibem a secreção de interferonas do tipo I e/ou interferonas do tipo III, além de outras citocinas e quimiocinas a partir de células dendríticas plas- mocitoides; e/ou (ii) induzem ou aumentarm a depleção de células dendríticas plasmocitoides in vitro.

[204] Outras modalidades da presente invenção referem-se a um anticorpo anti-BDCA2 compreendendo uma ou mais sequências de CDR da cadeia leve selecionadas a partir de CDR1 de VL de SEQ ID NO: 5, CDR2 de VL de SEQ ID NO: 6, e CDR3 de VL de SEQ ID NO: 7 ; ou uma ou mais sequências alternativas de CDR da cadeia leve selecionadas a partir de CDR de CDR1 DE VL da SEQ ID NO: 95, CDR2 de VL de SEQ ID NO: 96, e CDR3 de VL de SEQ ID NO: 97, o anticorpo que compreende ainda uma região Fc variante que confere aumento ou função efetora reduzida em comparação com uma região Fc nativa ou parental. De acordo com outras variantes, o anticorpo an- ti-BDCA2 compreende, pelo menos, dois de CDR da cadeia leve (ou CDRs alternados), e em outras modalidades o anticorpo compreende todas as três sequências de CDR da cadeia leve (ou CDRs alternados). Estes anticorpos anti-BDCA2 i) inibem a secreção de interfero- nas do tipo I e/ou interferonas do tipo III, além de outras citocinas e quimiocinas a partir de células dendríticas plasmocitoides; e/ou (ii) induzem ou aumentam a depleção de células dendríticas plasmocitoides in vitro.

[205] De acordo com outras modalidades da presente invenção,o anticorpo anti-BDCA2 com o aumento ou redução da função efetora compreende todas as três sequências de CDR da cadeia leve ou CDRs alternados da cadeia leve da ID SEQ NO: 3 e compreende to das as três sequências de CDR da cadeia pesada ou CDRs alternados da cadeia pesada de SEQ ID NO: 4

[206] Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a um anticorpo anti-BDCA2 compreendendo uma sequência de VL com-preendendo SEQ ID NO: 23, o anticorpo que compreende ainda uma região Fc variante que confere a função efetora reduzida em comparação com uma região Fc nativa ou parental. Em ainda outras modalidades, a presente invenção refere-se a um anticorpo anti-BDCA2 compreendendo uma sequência VH que compreende a SEQ ID NO: 24, o anticorpo que compreende ainda uma região Fc variante que confere a função efetora reduzida em comparação com uma região Fc nativa ou parental.

[207] Os métodos de geração de qualquer uma das variantes dos anticorpos anti-BDCA2 acima mencionados compreendendo as substituições de aminoácidos são bem conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, preparação por meio da mu- tagênese dirigida ao local (ou mediada por meio de oligonucleotídeos), mutagênese por PCR, e um cassete de uma molécula de DNA que codifica o anticorpo preparado ou, pelo menos, a região constante do anticorpo. A mutagênese dirigida é bem conhecida na técnica (vide, por exemplo, Carter et al, Nucleic Acids Res., 13: 4431 a 4443 (1985) e Kunkel et al, Proc Natl Acad Sci EUA, 82: 488 (1987)). A mutagêne- se por PCR também é apropriada para fazer as variantes da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de partida. Vide Higuchi, em PCR Protocols, pp.177 a 183 (Academic Press, 1990); e Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723 a 733 (1989). Outro método para a preparação de variantes de sequências, a mutagênese por cassete, é baseado na técnica descrita por Wells et al, Gene, 34: 315 a 323 (1985).

Os anticorpos anti-BDCA2 com glicosilação alterada

[208] Diferentes glicoformas podem afetar profundamente as propriedades de um agente terapêutico, incluindo farmacocinética, farmacodinâmica, receptor de interação e direcionamento específico de tecido (Graddis et al, 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3: 285 a 297). Em particular, para os anticorpos, a estrutura de oligossacarídeo pode afetar as propriedades relevantes para a resistência da protease, a sua meia-vida no soro do anticorpo mediada pelo receptor, fagocitose e realimentação de anticorpo FcRn, além das funções efetoras do anticorpo (por exemplo, a ligação ao complexo complementar C1, o que induz CDC, e ligação a receptores de FcyR, que são responsáveis pela modulação da via ADCC) (Nose e Wigzell, 1983; Leatherbarrow e Dwek, 1983; Leatherbarrow et al, 1985; Walker et al, 1989; Carter et al, 1992, PNAS, 89: 4285 a 4289).

[209] Por conseguinte, um outro meio de modulação da função efetora de anticorpos inclui alterar a glicosilação de anticorpo da região constante. A glicosilação alterada inclui, por exemplo, uma diminuição ou aumento do número de resíduos glicosilados, uma mudança no padrão ou na localização de resíduos glicosilados, assim como uma mudança na(s) estrutura(s) de açúcar. Os oligossacarídeos encontrados em IgG humanas afetam seu grau de função efetora (Raju, TS. BioProcess Internacional Abril de 2003. 44 a 53); a micro- heterogeneidade dos oligossacarídeos de IgG humana pode afetar as funções biológicas tais como ADCC e CDC, a ligação a vários receptores de Fc, e ligação à proteína Clq (Wright & A. Morrison SL TIBTECH 1997, 15, 26 a 32; Shields et al J Biol Chem. 2001 276 (9): 6591 a 604; Shields et al. J Biol Chem 2002; 277 (30): 26.733 a 40; Shinkawa et al J Biol Chem 2003 278 (5): 3466-73; Umana et al. Nat Biotechnol 1999 Feb; 17 (2): 176 a 80). Por exemplo, a capacidade da IgG para se ligar a C1q e ativar a cascata do complemento pode depender da presença, ausência ou alteração da porção hidrato de carbono posicionada entre os dois domínios CH2 (que normalmente é ancorada na Asn297) (Ward e Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77 a 94 (1995).

[210] Os locais de glicosilação em um polipeptídeo contendo Fc, por exemplo, um anticorpo tal como um anticorpo de IgG, podem ser identificados por meio das técnicas convencionais. A identificação do local de glicosilação pode ser experimental ou com base na análise de sequência ou de dados de modelação. Motivos de consenso, ou seja, a sequência de aminoácidos reconhecida por diversas glicosil- transferases, têm sido descrita. Por exemplo, o motivo de consenso para um motivo de glicosilação N-ligado é frequentemente NXS ou NXT, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. Vários algoritmos para localizar um potencial motivo de glicosilação também têm sido descritos. Por conseguinte, para identificar os potenciais locais de glicosilação dentro de um anticorpo ou um fragmento contendo Fc, a sequência do anticorpo é examinada, por exemplo, usando ban-cos de dados publicamente disponíveis tais como o local fornecido pelo Centro de Análise de Sequência biológica (vide serviços NetNGlyc para prever os locais de glicosilação ligados a N e serviços NetOGlyc para prever locais de glicosilação ligados a O).

[211] Estudos in vivo confirmaram a redução na função efetora de anticorpos aglicosila. Por exemplo, um anticorpo anti-CD8 aglicosila é incapaz de esgotar as células portadoras de CD8 em camundongos (Isaacs, 1992 J. Immunol 148: 3062.) E um anticorpo anti-CD3 aglico- sila não induz à síndrome de libertação de citoquinas em camundongos ou seres humanos (Boyd, 1995, supra; Friend, 1999 Transplantation 68: 1632). As formas aglicosiladas do anticorpo BDCA2 também reduziram a função efetora.

[212] Importante, enquanto a remoção dos glicanos do domínio CH2 parece ter um efeito significativo sobre a função efetora, outras propriedades funcionais e físicas do anticorpo permanecem inalteradas. Especificamente, demonstrou-se que a remoção dos glicanos te- ve pouco ou nenhum efeito sobre a meia-vida no soro e de ligação ao antígeno (Nose, 1983 supra; Tao, 1989 supra; Dorai, 1991 supra; Hand, 1992 supra; Hobbs, 1992 Mol Immunol 29: 949).

[213] Os anticorpos anti-BDCA2 da presente invenção podem ser modificados ou alterados para extrair o aumento ou diminuição da (s) função (ões) efetora (s) (em comparação com um segundo anticorpo específico para BDCA2). Os métodos para alterar locais de glicosila- ção de anticorpos estão descritos, por exemplo, no documento US 6.350.861 e US 5.714.350, WO 05/18572 e WO 05/03175; estes métodos podem ser usados para produzir anticorpos anti-BDCA2 da presente invenção com alterada, reduzida, ou sem glicosilação.

Indicações

[214] Um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção pode ser usado para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios imunológicos, tais como distúrbios inflamatórios e autoimunes. Os anticorpos anti-BDCA2 são úteis para tratar ou prevenir tais distúrbios, pelo menos, porque eles desativam ou empobrecem pDCs, e/ou inibem as citocinas inflamatórias e quimiocinas produzidas por pDCs, e/ou regulam de forma negativa CD32A, e/ou inibem a estimulação do complexo imune de pDCs, e/ou regulam de forma negativa ou causam a disseminação de CD62L. Os anticorpos anti-BDCA2 da presente invenção podem ser combinados com um agente antimalárico (por exemplo, HCQ) para efeitos terapêuticos melhorados no tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes. Os anticorpos anti-BDCA2 podem ser usados para reduzir os níveis de citocinas e quimiocinas, tais como: as interferonas do tipo I, interferonas do tipo III, IL-6, TNF-α, MIP1-α e MIP1-β, CCL5 e IP-10. As IFNs do tipo I constituem uma família de múltiplos membro de citocinas, incluindo 13 subtipos de IFN-α, IFN-β, -ε, -K, -w, -δ e -T. (Theofilopoulos, Annu Rev. Immunol., 23: 307 a 36 (2005)). As interferonas do tipo III consistem em três moléculas de IFN-À chamadas IFN-À1, IFN-À2 e IFN-À3 (também referido como IL29, IL28A e IL28B, de maneira respectiva). Ao esgotar-se e/ou amortecer PDC, os anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção proporcionam uma abordagem de tratamento mais robusta do que os tratamentos que tentam reduzir os subtipos de IFN específicos com anticorpos neutralizantes. Além disso, a abordagem de tratamento focada em PDC dos anticorpos anti-BDCA2 é mais seletiva e potencialmente mais segura do que o bloqueio global da resposta de IFN. Por exemplo, os anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção efetivamente eliminam IFNs do tipo I derivadas de PDC mantendo ao mesmo tempo outras fontes de IFN que podem ser necessárias em caso de infecções virais.

[215] O termo "tratamento" refere-se à administração de uma composição descrita na presente invenção, em uma quantidade, forma, e/ou de modo eficaz para melhorar uma condição, sintoma ou parâmetro associado com um distúrbio ou para prevenir a progressão ou agravamento da doença (incluindo danos secundários causados por meio do distúrbio), quer para um grau estatisticamente significativo ou a um grau detectável para uma pessoa que é versada na técnica.

[216] As doenças ou condições que podem ser tratadas com um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção incluem, por exemplo, lúpus eritematoso sistemático (SLE) (por exemplo, lúpus moderado ou severo), lúpus cutâneo, lúpus discoide, nefrite de lúpus, esclerose sistêmica (esclerodermia), morfeia, psoríase, artrite reuma- toide, doença inflamatória do intestino (IBD), deratomiosite, polimiosite, e diabetes do tipo I.

[217] O SLE é uma doença crônica autoimune, onde múltiplos órgãos são danificados por complexos imunes e autoanticorpos de ligação ao tecido (vide, Diretrizes para Referência e Gestão de Lúpus Eritematoso Sistêmico em adultos, Arthritis & Rheumatism, 42 (9):1785 a 1795 (1999)). Os autoanticorpos estão presentes no SLE e podem preceder o desenvolvimento da doença clínica (Arbuckle et al, N. Engl J. Med, 349 (16):1526 a 1533 (2003)). A internalização do auto- anticorpo contendo os complexos imunes através de receptores Fc leva à produção de interferona tipo I, que por sua vez promove a perda de tolerância, perpetuando o ciclo vicioso de autoimunidade (Means et al, Ann NY Acad Sci, 1062: 242 a 51 (2005)). SLE é heterogêneoquanto à sua apresentação clínica, curso, prognóstico e genética. Afro- americanos partilham um risco aumentado para o SLE que muitas vezes é mais grave em comparação com pacientes brancos. Deficiências do complemento foram reconhecidas antecipadamente como fatores de risco para o desenvolvimento de SLE. Mais recentemente, os polimorfismos genéticos associados com vias de interferona tipo I foram descritos para conferir susceptibilidade. Por exemplo, DNA da cadeia dupla e de anti-anticorpos anti-Ro de autoanticorpos estão associados com um determinado haplótipo do fator de transcrição do fator regulador de interferona 5 (IRF5). O haplótipo também previu níveis elevados de IFN-α no soro de pacientes com SLE (Niewold et al, Ann Rheum Dis, 71 (3): 463 a 8 (2012)). Os níveis de IFN-α mais elevados foram correlacionados com um maior grau de envolvimento de múltiplos ór-gãos em pacientes com SLE (Bengtsson et al, Lupus, 9 (9): 664 a 71 (2000)). Além disso, a chamada "assinatura interferona" parece ser proeminente em SLE. A assinatura Interferona representa um padrão de expressão de mRNA de interferona de genes induzíveis. Uma assinatura interferonas do tipo I é encontrada em mais de metade dos pacientes com SLE e está associada a uma maior atividade da doença (Baechler et al, Proc Natl Acad Sci EUA, 100 (5): 2610 a 5 (2003)). Os anticorpos monoclonais IFN-α têm entrado agora clínicas e os resultados de uma fase sifalimumab e rontalizumab demonstraram uma redução dependente da dose na assinatura de IFN tipo I em todo o sangue dos doentes com SLE (McBride et al., Arthritis Rheum., 64 (11): 3666 a 76 (2012); Yao et al, Arthritis Rheum, (6): 1785 a 1796 (2009)). Índices validados têm sido desenvolvidos para a avaliação da atividade da doença e a gravidade da doença (por exemplo, moderada, severa) (vide, por exemplo, Gladman, Prognóstico e tratamento de lúpus eritematoso sistêmico, Curr Opin Rheumatol., 8: 430 a 437 (1996); Kalunian et al, Definição, classificação, atividade e danos índices In: Dubois' Lúpus eyrthematosus 5° ed, Baltimore: Williams e Wilkins, pp 19 a 30 (1997)).

[218] A esclerose sistêmica ou esclerodermia sistêmica é uma doença autoimune sistêmica ou doença sistêmica do tecido conjuntivo que é um subtipo de esclerodermia. É caracterizada por meio da deposição de colágeno na pele e, mais raramente, nos rins, coração, pulmões e estômago. A relação feminino para masculino para esta doença é de 4: 1. O pico de idade de início da doença é entre 30 a 50 anos.

[219] A psoríase é uma doença autoimune que afeta a pele. Ela ocorre quando sistema imunológico erra em relação às células da pele como um patógeno, e envia sinais defeituosos que aceleram o ciclo de crescimento das células da pele. A psoríase tem sido associada a um risco aumentado de acidente vascular cerebral, e tratamento dos níveis de lipídios no sangue elevados pode conduzir a uma melhoria. Existem cinco tipos de psoríase: placas, gutata, inverso, pustulosa, e eritrodérmica. A forma mais comum de psoríase, a em placas, é co- mumente visto como tons de vermelho e branco de manchas escamosas que aparecem na parte superior da primeira camada da epiderme. No entanto, alguns pacientes não apresentam sinais ou sintomas dermatológicos.

[220] A artrite reumatoide é uma doença inflamatória crônica que afeta muitos tecidos e órgãos, mas principalmente ataca as articulações flexíveis. O processo envolve uma resposta inflamatória da cáp- sula em torno das articulações secundárias ao aumento das células sinoviais, o excesso de fluido sinovial, bem como o desenvolvimento de tecido fibroso (pannus) na sinóvia. A patologia do processo da doença muitas vezes conduz à destruição da cartilagem articular e anqui- lose das articulações. A artrite reumatoide também pode produzir inflamação difusa nos pulmões, a membrana que envolve o coração (pericárdio), as membranas do pulmão (pleura), e branco do olho (esclera), e também lesões nodulares, mais comuns no tecido subcutâneo. Embora a causa da artrite reumatoide é desconhecida, a autoimunida- de desempenha um papel central em ambos sua cronicidade e progressão, e RA é considerada uma doença autoimune sistêmica. Mais expressão de TNFa e de outras citoquinas pró-inflamatórias tem sido observadas em pacientes com artrite (Feldmann et al, Prog Growth Factor Res, 4: 247 a 55 (1992)). Além disso, os animais transgênicos que sobre expressam o TNFa humano desenvolvem uma poliartrite erosiva com muitas características associadas com a doença (Keffer et al, EMBO J., 10 (13): 4025 a 31 (1991)). Os fármacos analgésicos e anti-inflamatórios, incluindo esteroides, são usados para suprimir os sintomas, enquanto que os fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (DMARDs) são necessários para inibir ou interromper o processo imune subjacente e prevenir danos a longo prazo. Mais recentemente, a terapia de anticorpo anti-TNFa (Rituximab) tem sido usado para controlar a doença (Edwards, et al, N. Engl J. Med, 350 (25): 2572 a 81 (2004)).

[221] A doença inflamatória do intestino (IBD) é um grupo de condições inflamatórias do cólon e do intestino delgado. Os principais tipos de IBD são a doença de Crohn e colite ulcerativa (UC). A principal diferença entre a doença de Crohn e UC é a localização e a natureza das alterações inflamatórias: a doença de Crohn pode afetar qualquer parte do trato gastrintestinal, da boca ao ânus (pulando le- sões), embora a maioria dos casos, começam no íleo terminal; considerando-se que, a UC é restrita para o cólon e para o reto. Dependendo do grau de severidade, IBD pode exigir imunossupressão para controlar os sintomas, tais como a prednisona, a inibição de TNF, a azati- oprina (Imuran), metotrexato, ou 6-mercaptopurina. Mais vulgarmente, o tratamento de IBD requer uma forma de mesalazina.

[222] A dermatomiosite (DM) é um tipo de doença autoimune do tecido conjuntivo relacionado com à polimiosite (PM) que é caracterizada por meio da inflamação dos músculos e da pele. Enquanto DM mais frequentemente afeta a pele e os músculos, é uma doença sistêmica que também pode afetar as articulações, o esôfago, pulmões, e, menos comumente, o coração.

[223] A polimiosite (PM) ("inflamação de muitos músculos") é um tipo de inflamação crônica dos músculos (miopatia inflamatória) relacionada com dermatomiosite e inclusão no corpo de miosite.

[224] A diabetes do tipo I é uma forma de diabetes mellitus que resulta da destruição autoimune das células beta produtoras de insulina do pâncreas. A subsequente falta de insulina conduz ao aumento da glucose no sangue e na urina. Os sintomas clássicos são poliúria, polidipsia, polifagia, e perda de peso.

[225] Exemplos de outras doenças adequadas para tratamento com anticorpos anti-BDCA2 descritos na presente invenção incluem a asma, doença de Behcet, síndroma de CREST, doença de Crohn, dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, diabetes mellitus, lúpus erite- matoso discoide, fibrose pulmonar, glomerulonefrite autoimune, glome- rulopatia membranosa, artrite juvenil artrite (artrite crônica juvenil), doença mista do tecido conectivo, esclerose múltipla, síndrome nefrótica, paniculite, penfigoide, pênfigo, pênfigo eritematoso, pênfigo foliáceo, pênfigo vulgar, polimialgia reumática, esclerose sistêmica, esclerose sistêmica progressiva (escleroderma), morféia (esclerodermia localiza- da), esclerose múltipla, psoríase, artrite psoriática, fibrose pulmonar, fenômeno/síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, e colite ulcerosa.

[226] Um indivíduo que está em risco de, diagnosticado com, ou que tem um destes distúrbios pode ser administrado um anticorpo anti- BDCA2 em uma quantidade e durante um tempo para proporcionar um efeito terapêutico global. O anticorpo anti-BDCA2 pode ser administrado isoladamente (monoterapia) ou em combinação com outros agentes (terapia de combinação). Em uma modalidade, o agente para utilização na terapia de combinação com um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção é um agente antimalárico. Em uma modalidade, o agente para utilização na terapia de combinação com um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção é um inibidor da sinalização TLR7 e/ou TLR9. Em uma outra modalidade, o agente para utilização em terapia de combinação com um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção é um corticosteroide. Em certas modali-dades, o agente para utilização na terapia de combinação com um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção é um fármaco anti- malário e/ou um inibidor de quinase (por exemplo, inibidor da BTK (por exemplo, Ibrutinib (PCI-32765), AVI-292, ONO-GT-307), inibidor de JAK1, inibidor de JAK2, inibidor de JAK3, inibidor de Tyk2). Em uma modalidade específica, o agente para utilização na terapia de combinação com um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção é hidroxicloroquina. As quantidades e tempos de administração de terapias de combinação podem ser aquelas que fornecem, por exemplo, um aditivo ou um efeito terapêutico sinérgico. Além disso, a administração do anticorpo anti-BDCA2 (com ou sem o segundo agente) pode ser usada como um tratamento primário, por exemplo, o tratamento de primeira linha, ou como um tratamento secundário, por exemplo, em indivíduos que têm uma resposta inadequada a uma terapia previa- mente administrada (ou seja, um que não seja uma terapia com um anticorpo anti-BDCA2). Em algumas modalidades, a terapia de combinação inclui a utilização de um anticorpo anti-BDCA2 e um ou mais dos seguintes: agentes de glucocorticoides, NSAID, prednisona, hidro- xicloroquina, cloroquina, amodiaquina, pirimetamina, proguanil, meflo- quina, dapsona, primaquina, metotrexato, micofenolato mofetil, azatio- prina, talidomida, ciclofosfamida, ciclosporina A, rapamicina, prostaci- clina, inibidores da fosfodiesterase, os antagonistas da endotelina, es- tatina, inibidor da ECA e bloqueadores dos canais de cálcio. Em outras modalidades, a terapia de combinação inclui a utilização de um anticorpo anti-BDCA2 e qualquer um ou mais dos seguintes: sulfasalazina, doxiciclina, minociclina, penicilamina, tofacitinib, e leflunomida.

Composições Farmacêuticas

[227] Um anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo descrito na presente invenção pode ser formulado como uma composição farmacêutica para administração a um indivíduo, por exemplo, para tratar um distúrbio descrito na presente invenção. Tipicamente, uma composição farmacêutica que inclui um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal como usado na presente invenção, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento da absorção e isotônicos, e semelhantes, que são fisiologicamente compatíveis. A composição pode incluir um seu sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um sal de adição de ácido ou um sal de adição de base (vide, por exemplo, Berge, SM, et al (1977) J. Pharm Sci 66: 1 a 19).

[228] A formulação farmacêutica é uma técnica bem estabeleci da, e é ainda descrita, por exemplo, em Gennaro, Remington: The Science and Practice de Pharmacy, 20a ed, Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472.); Ansel et al, phrmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Ed, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); e Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X).

[229] As composições farmacêuticas podem estar em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, as formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como as soluções liquidas (por exemplo, soluções injetáveis e administráveis por infusão), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida pode depender do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. Tipicamente, as composições para os agentes descritos na presente invenção são na forma de soluções injetáveis ou para infusão.

[230] Em uma modalidade, um anticorpo anti-BDCA2 descrito na presente invenção é formulado com materiais excipientes, tais como cloreto de sódio, citrato de sódio, hepta-hidrato de fosfato de sódio di- básico, fosfato monobásico de sódio, Tween-80, e um estabilizador. Pode ser fornecido, por exemplo, em uma solução tamponada a uma concentração apropriada e pode ser armazenado a 2 a 8°C. Em algumas outras modalidades, o pH da composição é entre cerca de 5,8 e 6,6 (por exemplo, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6).

[231] As composições farmacêuticas podem também incluir agentes que reduzem a agregação do anticorpo BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo quando formulados. Exemplos de agentes de agregação de redução incluem um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em metionina, arginina, lisina, ácido aspártico, glicina, e ácido glutâmico. Estes aminoácidos podem ser adicionados à formulação a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145 mm (por exemplo, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM). As composições farmacêuticas também po- dem incluir um açúcar (por exemplo, sacarose, trealose, manitol, sorbitol, ou xilitol) e/ou um modificador de tonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol, ou sorbitol) e/ou um agente tensoativo (por exemplo, polissorbato-20 ou polissorbato-80).

[232] Tais composições podem ser administradas por um modo parentérico (por exemplo, de uma forma intravenosa, subcutânea, in-traperitoneal ou intramuscular). Em uma modalidade, as composições do anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo são administradas subcutaneamente. Em uma modalidade, as composições do anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo são administradas por via intravenosa. As frases "administração parentérica" e "administrado parentericamente", tal como usado na presente invenção refere-se aps meios de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e incluem, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmi- ca, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraspinal, injeção e infusão peridural e intrasternal.

[233] A composição pode ser formulada como uma solução, mi-croemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura ordenada adequada para armazenamento estável a alta concentração. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação de um agente descrito na presente invenção na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização por meio da filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por meio da incorporação de um agente descrito na presente invenção em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem em vácuo e liofiliza- ção que produzem um pó de um agente descrito na presente invenção mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma sua solução previamente esterilizada por meio da filtração. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[234] Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 ou frag mento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser preparado com um veículo que irá proteger o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de vinila de etile- no, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são geralmente conhecidos. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, JR Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978).

[235] Em uma modalidade, a formulação farmacêutica compreende um anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, BIIB059) a uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL a 300 mg/mL (por exemplo, 1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 175 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL), formulado com citrato de sódio, cloreto de sódio e, opcionalmente, de Tween-80 (0,01 a 0,1 %, por exemplo, 0,03 %, 0,05 % ou 0,7 %). O pH da formulação pode ser en- tre 5.5 e 7.5 (por exemplo, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2 6,3, 6,4 6,5, 6,6 6,7, 6,8, 6,9 7,0, 7,1, 7,3).

Administração

[236] O anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo pode ser administrado a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo em necessidade do mesmo, por exemplo, um indivíduo humano, por meio de uma variedade de métodos. Para muitas aplicações, a via de administração é um dos seguintes: injeção intravenosa ou infusão (IV), injeção subcutânea (SC), intraperitonealmente (IP), ou injeção intramuscular. É também possível usar a entrega intraarticular. Outros modos de administração parenteral também podem ser usados. Exemplos de tais modos incluem: intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal e epidural e intra-esternal. Em alguns casos, a administração pode ser oral.

[237] A via e/ou modo de administração do anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode também ser adaptada para o caso individual, por exemplo, através da monitorização do indivíduo, por exemplo, usando imagiologia tomográfica, por exemplo, para visualizar um tumor.

[238] O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser administrado como uma dose fixa, ou em uma dose em mg/kg. A dose também pode ser escolhida para reduzir ou evitar a produção de anticorpos contra o anticorpo anti-BDCA2. Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta desejada, por exemplo, uma resposta terapêutica ou um efeito terapêutico combinatório. Geralmente, as doses do anticorpo anti-BDCA2 (e, opcionalmente, um segundo agente) podem ser usadas a fim de proporcionar um indivíduo com o agente em quantidades biodisponíveis. Por exemplo, as doses na proporção de 0,1 a 100 mg/kg, de 0,5 a 100 mg/kg, de 1 mg/kg a 100 mg/kg, de 0,5 a 20 mg/kg, de 0,1 a 10 mg/kg, ou de 1 a 10 mg/Kg podem ser administradas. Outras doses podem também ser usadas. Em modalidades específicas, a um indivíduo em necessidade de tratamento com um anticorpo anti-BDCA2 é administrado o anticorpo a uma dose de 2 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, ou 40 mg/kg.

[239] Uma composição pode compreender cerca de 1 mg/mL a 100 mg/mL ou cerca de 10 mg/mL a 100 mg/mL ou cerca de 50 a 250 mg/mL ou cerca de 100 a 150 mg/mL ou cerca de 100 a 250 mg/mL de anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[240] Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em uma composição é pre-dominantemente na forma monomérica, por exemplo, pelo menos cerca de 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 98,5% ou 99% em forma monomé- rica. Certas composições de anticorpos anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem compreender menos do que cerca de 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3 ou 0,1 % de agregados, tal como detectado, por exemplo, por luz UV a A280 nm. Certas composições dos anticorpos anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendem menos do que cerca de 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 ou 0,1 % de fragmentos, tal como detectado, por exemplo, por luz UV a A280 nm.

[241] A forma de unidade de dosagem ou "dose fixa" tal como usado na presente invenção refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido e opcionalmente em associação com o outro agente. As dosagens únicas ou múltiplas podem ser administradas. Em alternativa, ou além disso, o anticorpo pode ser administrado através de infusão contínua.

[242] Uma dose do anticorpo anti-BDCA2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser administrada, por exemplo, em um intervalo periódico durante um período de tempo (um curso do tratamento), suficiente para abarcar pelo menos 2 doses, 3 doses, 5 doses, 10 doses, ou mais, por exemplo, uma vez ou duas vezes por dia, ou cerca de uma a quatro vezes por semana, ou de preferência semanal, quinzenal (de duas em duas semanas), a cada três semanas, mensalmente, por exemplo, para entre cerca de 1 a 12 semanas, de preferência entre 2 a 8 semanas, mais de preferência entre cerca de 3 a 7 semanas, e ainda mais de preferência durante cerca de 4, 5, ou 6 semanas. Os fatores que podem influenciar a dosagem e tempo necessário para tratar eficazmente um indivíduo incluem, por exemplo, a gravidade da doença ou distúrbio, a formulação, a via de entrega, os tratamentos anteriores, o estado de saúde geral e/ou a idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto pode incluir um único tratamento ou, de preferência, pode incluir uma série de tratamentos.

[243] Se um indivíduo está em risco de desenvolver um distúrbio imunológico descrito na presente invenção, o anticorpo pode ser administrado antes do início da completa deficiência imunológica, por exemplo, como uma medida preventiva. A duração de tal tratamento preventivo pode ser uma única dose do anticorpo ou o tratamento pode continuar (por exemplo, várias doses). Por exemplo, um indivíduo em risco para a doença ou que tem uma predisposição para a doença pode ser tratado com o anticorpo durante dias, semanas, meses ou mesmo anos, de modo a evitar que o distúrbio ocorra ou seja fulminante.

[244] Uma composição farmacêutica pode incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente descrito na presente invenção. Tais quantidades eficazes podem ser determinadas com base no efeito do agente administrado, o efeito combinatório ou de agentes, se mais do que um agente for usado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente também pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do composto para induzir uma resposta desejada no indivíduo, por exemplo, a melhoria de pelo menos parâmetro um distúrbio ou melhoria de pelo menos um sintoma do distúrbio. Uma quantidade tera- peuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da composição são compensados por meio dos efeitos terapeuticamente benéficos.

[245] Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é administrado por via subcutânea, a uma concentração de cerca de 1 mg/mL a cerca de 300 mg/mL (por exemplo, 1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 175 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL). Em uma modalidade, o anticorpo anti- BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é administrado por via subcutânea, a uma concentração de 50 mg/mL. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é administrado por via intravenosa a uma concentração de cerca de 1 mg/mL a cerca de 300 mg/mL. Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é administrado por via intravenosa a uma concentração de 50 mg/mL.

Dispositivos e Kits para Terapia

[246] As composições farmacêuticas que incluem o anticorpo an- ti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser administradas com um dispositivo médico. O dispositivo pode ser concebido com características tais como a portabilidade, armazenamento à temperatura ambiente, e a facilidade de utilização, de modo que ele pode ser usado em situações de emergência, por exemplo, por um indivíduo não treinado ou pelo pessoal de emergência no campo, removidos a partir de instalações médicas e outros instrumentos de equipamentos médicos. O dispositivo pode incluir, por exemplo, uma ou mais caixas para armazenamento de preparações farmacêuticas que incluem o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e pode ser configurado para fornecer uma ou mais doses unitárias de anticorpo. O dispositivo pode ser ainda configurado para administrar um segundo agente, por exemplo, um agente quimio terapêutico, quer como uma única composição farmacêutica que também inclui o anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou como duas composições farmacêuticas separadas.

[247] A composição farmacêutica pode ser administrada com uma seringa. A composição farmacêutica também pode ser administrada com um dispositivo de injeção sem agulha hipodérmica, tal como os dispositivos descritos no documento US 5.399.163; 5.383.851;5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes bem conhecidos e módulos incluem: US 4.487.603, a qual descreve uma bomba de micro-infusão implantável para a distribuição de medicação a uma taxa controlada; Patente US 4.486.194, que descreve um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente US 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicação para o fornecimento de medicação a uma taxa de infusão precisa; US 4.447.224, que descreve um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para entrega contínua de fárma- cos; US 4.439.196, que divulga um sistema de administração de fár- maco osmótico com compartimentos de câmaras múltiplas; e Patente US 4.475.196, que descreve um sistema de entrega osmótica de fár- maco. Muitos outros dispositivos, implantes, sistemas de distribuição e módulos também são conhecidos.

[248] Um anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo pode ser proporcionado em um kit. Em uma modalidade, o kit inclui (a) um recipiente que contém uma composição que inclui o anticorpo anti-BDCA2 e, opcionalmente, (b) material informativo. O material de informação pode ser descritivo, de instrução, ou outro material de marketing que se relaciona com os métodos descritos na presente invenção e/ou a utilização dos agentes para benefício terapêutico.

[249] Em uma modalidade, o kit inclui ainda um segundo agente para o tratamento de uma doença descrita na presente invenção (por exemplo, inibidor BTK, um antimalárico, glucocorticoide, NSAID, pred- nisona, hidroxicloroquina, amodiaquina, pirimetamina, proguanil, sulfo- namidas, mefloquina, atovaquona, primaquina, artemisinina e os derivados dos mesmos, halofantrina, doxiciclina, clindamicina, metotrexa- to, micofenolato de mofetila, azatioprina, ciclofosfamida, sulfasalazina ou leflunomida). Por exemplo, o kit inclui um primeiro recipiente que contém uma composição que inclui o anticorpo anti-BDCA2, e um segundo recipiente que inclui o segundo agente.

[250] O material de informação dos kits não está limitado na sua forma. Em uma modalidade, o material de informação pode incluir informação sobre a produção do composto, o peso molecular do composto, a concentração, a data de expiração, e informações do lote de produção, e assim por diante. Em uma modalidade, o material informativo refere-se aos métodos de administração do anticorpo anti-BDCA2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, em uma dose adequada, forma de dosagem, ou o modo de administração (por exemplo, uma dose, forma de dosagem, ou o modo de administração descrito na presente invenção), para tratar um indivíduo que teve ou quem está em risco de uma disfunção imunológica descrita na presente invenção. As informações podem ser fornecidas em uma variedade de formatos, incluem texto impresso, material de leitura computadorizado, gravação de vídeo ou uma gravação de áudio, ou informações que fornecem um link ou endereço de material de material, por exemplo, na internet.

[251] Em adição ao anticorpo, a composição no kit pode incluir outros ingredientes, tais como um solvente ou tampão, um estabilizador, ou um conservante. O anticorpo pode ser proporcionado em qualquer forma, por exemplo, líquido, pó ou forma liofilizada, de preferência, substancialmente pura e/ou esterilizada. Quando os agentes são fornecidos em uma solução líquida, a solução líquida é de preferência uma solução aquosa. Quando os agentes são fornecidos como uma forma seca, em geral, é a reconstituição por meio da adição de um solvente adequado. O solvente, por exemplo, água estéril ou de tampão, pode opcionalmente ser fornecido no kit.

[252] O kit pode incluir um ou mais recipientes para a composi ção ou composições que contêm os agentes. Em algumas modalidades, o kit contém recipientes separados, divisórias ou compartimentos para a composição e o material informativo. Por exemplo, a composição pode estar contida em uma garrafa, frasco ou seringa, e o material de informação pode ser contido em uma parte da bainha de plástico ou em pacotes. Em outras modalidades, os elementos separados do kit estão contidos dentro de um recipiente único, não dividido. Por exemplo, a composição está contida em uma garrafa, frasco ou seringa, que tem a ele ligado o material de informação sob a forma de umo marcador. Em algumas modalidades, o kit inclui uma pluralidade (por exemplo, um pacote) de recipientes individuais, cada um contendo uma ou mais formas de dosagem unitária (por exemplo, uma forma de dosa- gem descrita na presente invenção) dos agentes. Os recipientes podem incluir uma combinação de unidade de dosagem, por exemplo, uma unidade que inclui tanto o anticorpo anti-BDCA2 quanto o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e o segundo agente, por exemplo, em uma proporção desejada. Por exemplo, o kit inclui uma pluralidade de seringas, ampolas, saquetas, embalagens de plástico- bolha ou dispositivos médicos, por exemplo, cada uma contendo uma dose unitária de única combinação. Os recipientes dos kits podem ser selados ao ar, à prova de água (por exemplo, impermeável a mudanças na umidade ou evaporação), e/ou à prova de luz.

[253] O kit inclui opcionalmente um dispositivo adequado para a administração da composição, por exemplo, uma seringa ou outro dispositivo de entrega adequado. O dispositivo pode ser proporcionado pré-carregado com um ou ambos os agentes, ou pode estar vazio, mas adequado para o carregamento.

Usos Diagnósticos

[254] Os anticorpos anti-BDCA2 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser usados em um método de diagnóstico para detectar a presença de BDCA2, in vitro (por exemplo, uma amostra biológica, tal como tecido, biópsia) ou in vivo (por exemplo, imagiologia in vivo em um assunto). Por exemplo, os anticorpos anti- BDCA2 humanos ou eficazmente humanos podem ser administrados a um indivíduo para detectar BDCA2 dentro do indivíduo. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado, por exemplo, com um marcador de ressonância magnética detectável ou um marcador radioativo. O indivíduo pode ser avaliado usando um meio para detectar o marcador detectá- vel. Por exemplo, o indivíduo pode ser digitalizado para avaliar a loca-lização do anticorpo dentro do indivíduo. Por exemplo, o indivíduo é imaginado, por exemplo, por meio de RMN ou outros meios de tomo- grafia.

[255] Exemplos de marcadores úteis para diagnóstico por ima gem incluem os marcadores radioativos tais como 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 33P, 125I, 3H, 14C, e 188Rh, marcadores fluorescentes, tais como flu- oresceína e rodamina, marcadores de ressonância magnético ativos nucleares, isótopos emissores de pósitron detectáveis por uma varredura de tomografia por emissão de pósitrons ("PET"), quimiolumines- centes tais como luciferina, e marcadores enzimáticos, tais como peroxidase ou fosfatase. Os emissores de radiação de curto alcance, tais como isótopos detectáveis por detectores de sondas de curto alcance, podem também ser empregados. A proteína ligante pode ser marcada com tais reagentes usando as técnicas conhecidas. Por exemplo, vide Wensel e Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York para as técnicas relacionadas com a radio- marcação de anticorpos e Colcher et al. (1986) Meth. Enzymol. 121: 802 a 816.

[256] O indivíduo pode ser "trabalhado" in vivo usando as técni cas conhecidas, tais como a digitalização radionuclear usando, por exemplo, uma câmara de raios gama ou tomografia por emissão. Vide, por exemplo, A. R. Bradwell et al., "Evolução da Imagem de Anticorpo", Mionoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (Eds.), Pp 65 85 (Academic Press, 1985). De maneira alternativa, uma varredura de tomografia de emissão de pósitron tran- saxial, tal como designado para PET VI localizado no Brookhaven National Laboratory, pode ser usado onde o marcador radioativo emite pósitron (por exemplo, 11C, 18F, 15O e 13N).

[257] A Imagem por Ressonância Magnética (MRI) utiliza RMN para visualizar as características internas do indivíduo vivo, e é útil para o prognóstico, diagnóstico, tratamento e cirurgia. MRI pode ser usada sem compostos traçadores radioativos para benefício óbvio. Algumas técnicas de MRI estão resumidas na EP0 502 814 A. Geralmente, as diferenças relativas às constantes de tempo de relaxação T1 e T2 de prótons de água em ambientes diferentes são usadas para gerar uma imagem. No entanto, essas diferenças podem ser insuficientes para fornecer as imagens de alta resolução afiadas.

[258] As diferenças entre estas constantes de tempo de relaxação podem ser aumentadas por meio dos agentes de contraste. Exemplos de tais agentes de contraste incluem um número de agentes magnéticos, agentes paramagnéticos (que alteram essencialmente T1) e agentes ferromagnéticos ou superparamagnéticos (que alteram essencialmente a resposta T2). Quelatos (por exemplo, quelatos EDTA, DTPA e NTA) podem ser usados para ligar (e reduzir a toxicidade) de algumas substâncias paramagnéticas (por exemplo, Fe3+, Mn2+, Gd3+). Outros agentes podem estar na forma de partículas, por exemplo, menos de 10 μm a cerca de 10 nm de diâmetro). As partículas podem ter propriedades ferromagnéticas, antiferromagnéticas ou superparamag- néticas. As partículas podem incluir, por exemplo, a magnetite (Fe3O4), Y-Fe2O3, ferrite, e outros compostos minerais magnéticos de elementos de transição. As partículas magnéticas podem incluir um ou mais cristais magnéticos com ou sem material não magnético. O material não magnético pode incluir os polímeros sintéticos ou naturais (tais como sefarose, dextrano, dextrina, amido e semelhantes).

[259] Os anticorpos anti-BDCA2 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem igualmente ser marcados com um grupo que contém o grupo indicativo de átmo de 19F de RMN ativo, ou uma pluralidade de tais átomos na medida em que (i) substancialmente todos os átomos de flúor naturalmente abundantes são o isótopo 19F e, dessa maneira, substancialmente todos os compostos contendo flúor são RMN ativos; (ii) muitos compostos polifluorados quimicamente ativos, tais como o anidrido trifluoroacético estão comercialmente disponíveis a custo relativamente baixo, e (iii) muitos compostos fluorados têm sido encontrados medicamente aceitáveis para utilização em seres humanos, tais como os poliéteres perfluorados usados para transportar oxigênio como substitutos de hemoglobina. Após permitir o tempo para a tal incubação, uma MRI de comprimento total é realizada usando um aparelho tal como um dos descritos por Pykett (1982) Scientific American, 246: 78 a 88 para localizar e distribuição da imagem de BDCA2.

[260] Em um outro aspecto, a presente invenção providencia um método para detectar a presença de BDCA2 em uma amostra in vitro (por exemplo, uma amostra biológica, tal como soro, plasma, tecido, biópsia). O método da presente invenção pode ser usado para diagnosticar um distúrbio, por exemplo, uma doença autoimune (por exemplo, SLE) ou uma para detectar níveis de pDCs em uma amostra. O método inclui: (i) contactar a amostra ou uma amostra de controle com o anticorpo anti-BDCA2; e (ii) avaliar a amostra para a presença de BDCA2, por exemplo, através da detecção de formação de um complexo entre o anticorpo anti-BDCA2 e BDCA2, ou através da detecção da presença do anticorpo ou BDCA2. Por exemplo, o anticorpo pode ser imobilizado, por exemplo, sobre um suporte, e a retenção do antígeno no suporte é detectada, e/ou vice-versa. O anticorpo usado pode ser marcado, por exemplo, com um fluoróforo. Uma amostra de controle pode ser incluída. O controle positivo pode ser uma amostra de concentração conhecida como tendo a doença ou distúrbio a ser avaliada, e um controle negativo pode ser uma amostra de um indivíduo que não possui a doença ou distúrbio a ser avaliada. Uma alteração estatisticamente significativa na formação do complexo na amostra em relação à amostra de controle pode ser indicativa da presença de BDCA2 na amostra. Geralmente, um anticorpo anti-BDCA2 pode ser usado em aplicações que incluem a polarização de fluorescência, microscopia, ELISA, centrifugação, cromatografia, e separação de cé-lulas (por exemplo, a separação de células ativadas por fluorescência). Em certas modalidades, o anticorpo anti-BDCA2 é BIIB059 ou clone dendrítico de 124B3.13. Em algumas modalidades, o método envolve ainda a imunocoloração uma amostra de tecido com um anticorpo anti- CD123. A amostra de tecido pode ser, por exemplo, biópsias da pele de pacientes humanos com condições autoimunes, por exemplo, SLE.

[261] Os seguintes são exemplos da prática da presente invenção. Eles não são para ser interpretados como limitando o âmbito da presente invenção de qualquer forma.

EXEMPLOS

[262] Os exemplos seguintes são proporcionados para melhor ilustrar a presente invenção reivindicada e não devem ser interpretados como limitativos do âmbito da presente invenção. Na medida em que os materiais específicos são mencionados, é meramente para fins de ilustração e não se destina a limitar a presente invenção. Uma pessoa que é versada na técnica pode desenvolver meios ou reagentes equivalentes, sno exercício da capacidade inventiva e sem sair do âmbito da presente invenção.

Exemplo 1: Clonagem das cadeias pesada e leve de anticorpos anti- BDCA2 murino

[263] O hibridoma 24F4 murino (IgG1, kappa) foi derivado de um camundongo Balb/c imunizado por Gene Gun com o plasmídeo pE- AG2456, um vetor de expressão de mamífero que coexpressa o BDCA2 e FcεRtycDNAs de comprimento completo humano (vide Exemplo 17).

[264] O RNA celular total a partir de células de hibridoma murino 24F4 foi preparado usando um mini-kit de Qiagen RNeasy, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Os cDNAs que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve foram clonados por RT- PCR a partir do RNA celular total usando o kit de Síntese de cDNA do Primeiro Filamento da GE Healthcare seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante, usando hexâmeros aleatórios para o escorva- mento.

[265] Para a amplificação por PCR dos domínios variáveis de imunoglobulina de murino com as sequências de sinal intacto, foram usados um coquetel de iniciadores diretos degenerados que hibridam com várias sequências de sinal da família de genes de imunoglobulina de murino e um único iniciador específico de volta para a extremidade 5’ do domínio constante de murino tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Wiley and Sons, 1999). O domínio variável da cadeia pesada 24F4 foi amplificado com os seguintes iniciadores: 5’ ACT AGT CAT CGA GRA CTT CTT CAG TGG GYT TAB TT 3' (R = A/G e Y = C/T) (SEQ ID NO: 25) e 5’ TCT AGA AGG AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (R = A/G e Y = C/T) (SEQ ID NO: 26). O domínio variável da cadeia leve 24F4 com a sua sequência sinal foi amplificado com os seguintes iniciadores: 5’ ACT AGT CAT CGA GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT 3' (W = A/T e Y = C/T) (SEQ ID NO: 27) e 5’ GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATG GA 3' (SEQ ID NO: 28).

[266] Os produtos de PCR foram purificados em gel usando um kit de extração de gel Qiaquick da Qiagen, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Os produtos de PCR purificados foram sub- clonados no vetor pCR2.1TOPO da Invitrogen usando seu kit de clonagem TOPO, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. As inserções de vários subclones independentes foram sequenciadas para estabelecer uma sequência de consenso (a partir de clone da cadeia pesada designado pYL647 e clone da cadeia leve pYL651).

[267] A variação nas sequências entre os clones foi consistente com posições de degenerescência dos iniciadores. A análise BLAST das sequências de domínio variável confirmou sua identidade imuno- globulina. As sequências N-terminais da cadeia leve e da cadeia pesada maduras deduzidas correspondem às das cadeias 24F4 autênticas derivados a partir de dados de degradação de Edman. As massas intactas deduzidas a partir de sequências hipotéticas montadas adicionando as sequências de domínio constante deduzidas a partir de cDNA da cadeia pesada clonada Balb/c IgG1 e cadeia leve kappa com as sequências do domínio variável maduras deduzidas foram consistentes com aquelas do derivado de hibridoma 24F4 purificado que foi determinado por meio da espectroscopia de massa.

[268] O domínio variável da cadeia pesada (VH) de murino 24F4 é um membro do subgrupo III de murino (D). A sequência do domínio variável da cadeia pesada (VH) de murino 24F4 com CDR H1, CDR H2 e CDR H3 sublinhada em que a ordem é mostrada abaixo:1 DVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT 51 ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNTL FLQMSSLKSE DTAMYYCTRD 101 IYYNYGAWFA YWGQGTLVTV SA (SEQ ID NO:29)

[269] domínio variável da cadeia leve de murino 24F4 (VL) é um membro do subgrupo III kappa de murino. A sequência do domínio variável da cadeia leve (VL) de murino 24F4 com CDR L1, CDR L2, e CDR L3 sublinhada em que a ordem é mostrada abaixo:1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL 51 LIYAASTLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQCNEDPR 101 TFGGGTKLEI K (SEQ ID NO:30)

[270] Uma cisteína não emparelhada está presente no resíduo 95 em CDRL3 na sequência de VL de murino 24F4 acima (em Kabat esta nomenclatura Cys é o resíduo 91).

Exemplo 2. Quimerizaçãodo anticorpo murino 24F4

[271] Os cDNAs que codificam os domínios variáveis de murino 24F4 foram usados para construir os vetores para a expressão de quimeras de murino-humano (ch24F4) em que as regiões variáveis mu24F4 foram ligadas a IgG1 humana e as regiões constantes kappa.

[272] Os domínios variáveis foram manipulados pela primeira vez por PCR para adicionar uma sequência de Kozak 5’ e para introduzir as sequências humanas e novos locais de restrição nos cruzamentos de FR4/domínio constante de imunoglobulina de fusão para os domínios constantes humanos. As sequências de cDND da região variável nos plasmídeos resultantes foram confirmadas por meio do sequenci- amento de DNA. O domínio variável da cadeia pesada em plasmídeo pYL647 foi usado como molde para PCR com os iniciadores 5’ GAT CCG CGG CCG CAC CAT GGA CTT GTT TGG CTT CAG G 3' (SEQ ID NO: 31) (local de adição de NotI e sequência Kozak) e 5’ GAT GGG CCC TTG GTG GAA GCT GCA GAG ACA GTG ACC AGA G 3' (SEQ ID NO: 32) (adição de sequências de IgG1 de CH1 humano na junção de domínio FR4/constante e um local Apal), amplificando um fragmento de 0,45 kb que foi purificado e subclonado no vetor de clonagem Invitrogen pCRBluntIITOPO, gerando pYL668. Para a construção da quimera da cadeia pesada, o fragmento 0,45 kb NotI-Apal dodomínio variável da cadeia pesada 24F4 e o constructo pYL668 0,98 kb ApaI- BamHI de pEAG1325 (um plasmídeo contendo um cDNA de huIgG1 domínio constante da cadeia pesada confirmado da sequência (com o resíduo de lisina de IgG1 no terminal C geneticamente removidos) foram subclonados no vetor da estrutura principal do vetor de expressão de pV90 (em que a expressão do gene heterólogo é controlada por um promotor de CMV-IE e um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento humano e que transporta um marcador de seleção dhfr, vide Patente US 7.494.805), para produzir o vetor de expressão pYL672. A sequência de cDNA da cadeia pesada no plasmídeo pYL672resultante foi confirmada por meio do sequenciamento de DNA. A sequência da proteína deduzida da cadeia pesada madura ch24F4-huIgG1 codificada por pYL672 é mostrada abaixo: 1 DVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT 51 ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNTL FLQMSSLKSE DTAMYYCTRD 101 IYYNYGAWFA YWGQGTLVTV SAASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 201 QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 251 KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 301 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE 351 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 401 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 451 G (SEQ ID NO:33)

[273] Uma forma aglicosila de baixa função efetora de ch24F4 também foi construída por meio da subclonagem a 0,45 kb do fragmento NotI-Apal a partir do domínio variável da cadeia pesada 24F4 do constructo pYL668 e a 0,98 kb do fragmento ApaI-BamHI de pE- AG2412 (um plasmídeo contendo uma sequência confirmada de S228P/N299Q huIgG4/IgG1 da cadeia pesada híbrida de cDNA de domínio constante com o resíduo lisina Ddo terminal C de IgG1 geneticamente removido) foram subclonados na estrutura principal do vetor do vetor de expressão pV90, gerando o plasmídeo pYL670. A sequência de cDNA da cadeia pesada no plasmídeo pYL670 resultante foi confirmada por meio do sequenciamento de DNA. A sequência da proteína da cadeia pesada deduzida madura ch24F4-huIgG4/G1 híbrido codificada por pYL670 é mostrada abaixo: 1 DVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT 51 ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNTL FLQMSSLKSE DTAMYYCTRD 101 IYYNYGAWFA YWGQGTLVTV SAASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFQS 301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV 351 YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG (SEQ ID NO:34)

[274] O domínio variável da cadeia leve kappa no plasmídeo pYL65foi usado como molde para PCR com os iniciadores 5’ GAT CCG CGG CCG CCA CCA TGG AGA CAG CAC ACA TCC TG 3' (SEQ ID NO: 35) (local de adição de Notl 5’ e sequência Kozak) e 5’ CCG CCA TAC GTT TGA TTT CCA GCT TGG TGC 3' (SEQ ID NO: 36) (adição das sequências de domínio constante kappa humana na junção do domínio FR4/constante e um local 3’ BsiWI), a amplificação de 0,4 kb do fragmento que foi purificado e subclonado no vetor de clonagem Invitrogen pCRBluntIITOPO, gerando pYL669. As sequências de CDNA da região variável no plasmídeo pYL669 foram confirmadas por meio do sequenciamento de DNA. Para a construção da quimera da cadeia leve, 0,4 kb do fragmento NotI-BsiWI do domínio variável da cadeia leve de pYL669 e 0,34 kb do fragmento BamHI- BsiWI do plasmídeo pEAG1572 (contendo uma cadeia leve kappa humana de domínio constante confirmada da sequência de cDNA) foram subclonados a estrutura do vetor de PV100 (em que a expressão do gene heterólogo é controlada por meio de um promotor de CMV-IE e um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento humano e que transporta um marcador de seleção de neomicina), para produzir o vetor de expressão pYL671. A sequência de cDNA da cadeia leve no plasmídeo pYL671resultante foi confirmada por meio do sequenciamento de DNA. A sequência da proteína da cadeia leve kappa humana madura deduzida de ch24F4 codificada por pYL671 é mostrada abaixo:I DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL 51 LIYAASTLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQCNEDPR 101 TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV 151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 201 THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO:37)

[275] Os vetores de expressão (vetores da cadeia pesada ch24F4 de pYL670 ou pYL672 e vetor da cadeia leve ch24F4 de pYL671) foram cotransfectados em células 293-EBNA transfectadas e as células foram testadas quanto à secreção de anticorpo e especificidade (vetor vazio - e um vetor mAb irrelevante molecularmente clona- do - de células transfectadas serviram como controles). A análise de Western blot (desenvolvida com anticorpos da cadeia pesada e leve anti-humanos) de meio condicionado de células indicou que ch24F4 transfectados eficientemente sintetizaram e segregaram as cadeias pesadas e leves. A ligação direta de FACS à superfície BDCA2 humana confirmou a especificidade da ch24F4. A EC50 de ligação de ambas as variantes de ch24F4 foi equivalente ao do mAb 24F4 murino por meio da ligação direta à superfície expressa de BDCA2 humano por meio da titulação de diluição do ensaio de FACS. As linhas estáveis de células CHO secretoras de ch24F4-huIgG1, kappa mAb e agly ch24F4-huIgG4/kappa híbrida G1 mAb foram produzidas por meio da cotransfecção com pYL672/pYL671 e pYL670/pYL671, de maneira respectiva.

Exemplo 3. A remoção de um resíduo de cisteína não emparelhado em CDRL3 do anticorpo quimérico 24F4

[276] Como cisteínas desemparelhadas em uma CDR exposta pode produzir heterogeneidade do produto ou instabilidade, as variantes de ch24F4 C95S e C95T foram construídas por meio da mutagê- nese dirigida a um local usando o vetor de expressão da cadeia leve de ch24F4 do plasmídeo pYL671 como molde.

[277] A mutagênese dirigida ao local foi realizada usando o kit de mutagênese Agilent QuikChange II seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. A variante C95S foi construída usando o iniciador mu- tagênico 5’ GCA ACC TAT TAC TGT CAA CAA AGT GAG AAT GAT CCT CGG AC 3' (SEQ ID NO: 38) e seu complemento inverso, que introduziu um novo local HincII, produzindo o plasmídeo pEAG2678. A variante C95T foi construída usando o iniciador mutagênico 5’ CAA CCT ACT GTC ATT AGC AAA ATG CTA AAG GGA CGT CTC ATC TCG 3' (SEQ ID NO: 39) e o seu complemento inverso, o qual removeu um local BamHI, produzindo o plasmídeo pEAG2679. Os plasmí- deos mutantes foram identificados por meio da triagem para as alterações introduzidas dos locais de restrição. As sequências de cDNA da cadeia leve de comprimento total nos plasmídeos resultantes foram confirmadas por meio do sequenciamento de DNA. Ch24F4 do tipo selvagem e as variantes C95S e mAbs C95T foram expressas transitoriamente em células 293E por meio da cotransfecção de pYL672 e pYL671, pEAG2678 ou pEAG2679. O meio condicionado foi colhido aos 2 dias após a transfecção. Os títulos (ensaiados por Octeto em pontas de anti-Fc humano) de ambas as variantes foram semelhantes aos de ch24F4 do tipo selvagem, e Western blot de SDS-PAGE não redutor indicou nenhuma agregação bruta ou recorte óbvio em relação à cepa selvagem de ch24F4 mAb. A ligação direta por FACS na superfície de BDCA2 indiou que, enquanto a EC50 aparente para a ligação pela variante C95S era equivalente à de ch24F4do tipo selvagem, a ligação EC50 da variante C95T foi reduzida por várias vezes. O meio condicionado contendo ch24F4 e as variantes de mAbs C95 foi ensaiado por octeto para a ligação ao ectodomínio BDCA2 humano. Os anticorpos a partir de meio condicionado de células transfectadas de forma transiente foram ligados a pontas de Fc anti-humano, em seguida, huBDCA2 monomérico foi vertido sobre as pontas de octeto, para examinar a ligação e dissociação. O octeto de ligação e de dissociação para a cinética de ch24F4 do tipo selvagem e a variante C95S foram equivalentes, enquanto a taxa de dissociação da variante C95T foi mais rápida do que o de ch24F4 do tipo selvagem. Com base nestes resultados, C95S foi incorporado ao CDRL3 humanizado da cadeia leve 24F4

Exemplo 4. Cadeias pesadas e leves 24F4 humanizadas exemplares

[278] Exemplos de sete cadeias pesadas (HU) 24F4 humaniza das (CDRs VH de estrutura principal huIGHV3-21 * 01/24F4) e as suas sequências de DNA correspondentes são mostrados abaixo. CDR 1, 2 e 3 em cada cadeia pesada estão sublinhados por meio desta ordem. As estruturas principais de mutações reversas são mostradas em ne- grito com letras minúsculas. As alterações dos resíduos de CDR de 24F4 murino são mostradas pelo sombreamento dentro das sequências de CDR. CDR1 da cadeia pesada variável (CDR H1) é definido de acordo com a definição de Chothia, que é de 5 aminoácidos mais longo do que a definição de Kabat; os resíduos de CDR em itálico na H1 identificam os adicionais 5 aminoácidos (ou seja, GFTFS (SEQ ID NO: 12)) que formam a Chothia CDR H1. O maior aminoácido do terminal N (ou seja, ácido glutâmico em versões H0, H1, H2, e H3 e ácido as- pártico em versões H4, H5, H6 e) do domínio variável da cadeia pesada pode contactar diretamente o antígeno e pode afetar a afinidade de ligação. O resíduo enterrado na posição 49 de Kabat pode afetar a conformação de CDR2 da cadeia pesada (serina em versões H0, H1, H2, e H3, e alanina em versões H4, H5 e H6). O resíduo na posição 93 de Kabat pode ter um efeito sobre a cadeia pesada-leve de empare- lhamento (alanina em versões H0, H1, H2, e H3; e treonina em versões H4, H5 e H6. Os resíduos de aminoácidos em CDR das regiões H1, H2, e H3 que diferem do murino 24F4 CDR H1, H2, e H3 estão sombreados.

[279] Um alinhamento das sequências de aminoácido das versões H0 a H6 é mostrado abaixo:

[280] Exemplos de três cadeias leves humanizadas (CDRs VL 24F4 das estruturas principais de huIGKV1-13 * 02/24F4) e as suas sequências de DNA correspondentes são mostrados abaixo. CDR 1, 2 e 3 em cada um da cadeia leve estão sublinhados por meio desta ordem. Ser91 (de acordo com a numeração de Kabat), que foi substituído por Cys91 em todas as cadeias leves, é realçado. O maior aminoá- cido do terminal N (ou seja, alanina na versão L0 e ácido aspártico nas versões L1 e L2) do domínio da cadeia leve variável pode contactar diretamente o antígeno e afetar a afinidade de ligação. As estruturas principais de mutações reversas são mostradas em negrito em letras minúsculas. A primeira versão (L0) contém o menor número de mutações reversas e a terceira versão (L2) contém a maioria dos mutações reversas (ou seja, pelo menos "humanizadas").

[281] Um alinhamento das sequências de aminoácido das ver sões L0 a L2 é mostrado abaixo:

[282] As sequências de aminoácidos de VH e VL humanizadas acima não contêm quaisquer potenciais locais de glicosilação ligados a N ou locais de desamidação de Asn-Gly. As metioninas em ambas os domínios VH e VL são observadas nas sequências da linha germinal, e não são expostas à superfície, de modo que o risco de oxidação da metionina parece ser mínimo.

[283] A solubilidade de proteínas pode correlacionar-se com o seu pI. O pI de um dos constructos concebidos foi calculado usando pK de aminoácidos em Bjellqvist et al. (Electrophoresis, 14: 1023 a 1031 (1993); Electrophoresis, 15: 529 a 39 (1994)). Os valores abaixo indicados foram calculados usando IgG1 humano das cadeias pesadas. Cada um dos anticorpos humanizados tem um pI significativamente acima de 7 e, portanto, espera-se ter uma carga positiva a pH neutro significativa. Cada entrada na tabela é o valor de pI calculado do anticorpo conjugado completo, com a carga líquida em parênteses.

Exemplo 5. Ligação de Hx/L1 para BDCA2

[284] Todas as 21 possíveis variantes de hu24F4 das cadeias pesadas e leves (descritas no Exemplo 4) e ch24F4 foram expressas transitoriamente em células 293E por meio da cotransfecção de plas- mídeos da cadeia pesada e da cadeia leve. Todas as versões de hu24F4 foram montadas e segregadas, com títulos superiores a de ch24F4 (determinado por meio da quantificação de mAb em meio condicionado por meio da ligação de pontas de Octeto de Fc anti- humano). Os Western blot de não redução da análise de SDS-PAGE de mAb 24F4 quiméricos e humanizados não mostraram nenhuma evidência de agregação bruta ou óbvia em relação ao recorte de ch24F4.

[285] O meio condicionado foi analisado pormeio da ligação direta de FACS em células CHO DG44 transfectadas estavelmente coex- pressando cDNAs de BDCA2 e FcεRlY de comprimento total (macacos cinomólogos ou ser humano), (vetores de expressão relevante são BDCA2/FcεRIY humano: pEAG2456, BDCA2/FcεRIY cino: pEAG2668). Em ligação direta à superfície BDCA2 de macaco cinomólogo ou ser humano, uma perda completa de ligação foi observada para a série H1 e H2de hu24F4 H0, foi observada uma perda significativa de afinidade de ligação para as variantes da série H3 de hu24F4, boa retenção de afinidade para ambos a série H4 e H5 de hu24F4 e uma perda moderada de ligação para a série H6 de hu24F4 (Figuras 2 e 3). Com base em título e valores de EC50 aparentes na análise FACS de ligação direta, H4/L1 e H5/L1 foram determinados como as "melhores" variantes de hu24F4.

[286] O meio condicionado contendo ch24F4 e todas as variants mAbs de hu24F4 foi ensaiado por octeto para a ligação ao ectodomí- nio de BDCA2 humano. O ectodomínio huBDCA2 monomérico foi preparado por meio da clivagem proteolítica da proteína de fusão purificada muIgG2a Fc-huBDCA2 (plasmídeo relevante: pEAG2423). Os anticorpos de meio condicionado de células transfectadas transitoriamente eram obrigados a pontas de Fc anti-humanos, e, em seguida, huBD- CA2 monomérica fluiu sobre as pontas de octeto, para examinar a ligação e dissociação. OAs variantes das séries H4 e H5 de hu24F4 apresentaram as melhores afinidades para huBDCA2.

Exemplo 6. Afinidade melhorada de hu24F4

[287] Para explorar a possibilidade de melhorar a afinidade de hu24F4 por meio da substituição na posição da versão de CDR L1 24F4 de L3 da cisteína desemparelhado (C95S em vetor de expressão da cadeia leve hu24F4 de pYL740), um número de variantes da versão L1 foi construído por meio da mutagênese dirigida ao local. A mutação reversa para a cisteína desemparelhada, ou seja, S95C, foi construída por meio da mutagênese dirigida ao local produzindo o plasmídeo pYL749. As variantes S95T, S95A, e S95V foram construídas através da produção de mutagênese dirigida ao local dos plasmídeos pYL750, pYL751, e pYL752, de maneira respectiva. As sequências de cDNA da cadeia leve de comprimento total nos plasmídeos resultantes foram confirmadas por meio do sequenciamento de DNA. A variante C95 de hu24F4 mAbs foi expressa transitoriamente em células 293E por meio da cotransfecção da cadeia pesada hu24F4 H4 de pYL746 ou cadeia pesada hu24F4 H5 de pYL747 com as variantes das cadeias leves hu24F4 L1 de plasmídeos C95S pYL740, S95C pYL749, S95T pYL750, S95A pYL751 ou S95V pYL752. O meio condicionado foi colhido aos 2 dias após a transfecção. Os títulos de (ensaiados por Octet sobre as pontas de Fc anti-humanos) de todas as variantes foram semelhantes, e Western blot de não redução de análise SDS-PAGE não indicou agregação bruta ou recorte óbvio. O meio condicionado contendo as variantes mAbs C95 foi ensaiada por meio do octeto para a ligação ao ectodomínio de BDCA2 humano. Os anticorpos a partir do meio condicionado de células transfectadas de forma transiente foram ligados as pontas de Fc anti-humano, em seguida, huBDCA2 mono- mérico foi vertido sobre as pontas de octeto, para examinar a ligação e a dissociação. As variantes C95A obtiveram as mais lentas taxas.

[288] Com base nesl tes resultados, as linhagens celulares CHO estáveis foram produzidas para as variantes de hu24F4 H4/L1 C95T e as variantes de C95A e H5/L1 C95T e C95A, que tinham as mais lentas taxas de aparentes. Os estudos de ligação de octeto foram repetidos para hu24F4 mAbs purificados. A variante hu24F4 H4/L1 de C95A foi selecionada como a principal candidata. As sequências de plasmí- deos pYL746 (hu 24F4 H4 da cadeia pesada) e pYL751 ((hu 24F4 L1 da cadeia leve) foram usadas para a recodificação e construção de vetores de expressão para a produção das linhagens celulares CHO.

[289] A sequência de aminoácidos da cadeia leve deduzida ma dura de codificada hu24F4 L1 C95A por pYL751 é mostrada abaixo (CDR L1, CDR L2, e CDR L3 estão sublinhados): 1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGKAPKL 51 LIYAASTLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQANEDPR 101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV 151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 201 THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO:3) A sequência de aminoácidos da cadeia pesada deduzida madura de codificada hu24F4 L1 C95A por pYL746 é mostrada abaixo (CDR H1, CDR H2, e CDR H3 estão sublinhados): 1 DVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS TYTMSWVRQA PGKGLEWVAT 51 ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCTRD 101 IYYNYGAWFA YWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 201 QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 251 KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 301 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GCHAVEKCKVSN KALPAPIEKT ISKKGQPRE 351 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 401 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 451 G (SEQ ID NO:4)

[290] Um anticorpo que consiste na cadeia pesada madura (SEQ ID NO: 4) e na cadeia leve madura (SEQ ID NO: 3) listada acima é de-nominado BIIB059.

Exemplo 7. Recodificando os genes das cadeias pesadas e leves

[291] Para melhorar potencialmente a expressão, as sequências de nucleotídeos dos genes das cadeias leve e pesada foram recodifi- cadas sem alterar a sequência de aminoácidos. A sequência de DNA modificada para o gene da cadeia leve anti-BDCA2 é mostrada abaixo. Os aminoácidos 1 a 240 contêm a sequência da cadeia leve. Os ami- noácidos 1 a 22 (nucleotídeos em letras minúsculas) contêm o peptí- deo de sinal da cadeia leve nativa. O terminal N maduro começa no aminoácido 23 (D).

[292] A sequência de DNA modificada para o gene da cadeia pe sada anti-BDCA2 é mostrada abaixo. Os aminoácidos 1 a 470 contêm a sequência da cadeia pesada. Os aminoácidos 1 a 19 (nucleotídeos em letras minúsculas) contêm o peptídeo de sinal da cadeia pesada nativa. O terminal N maduro começa com o aminoácido 20 (D).

Exemplo 8: Cassetes e Vetores de Expressão

[293] Os genes da cadeia pesada e os genes da cadeia leve foram excisados e ligados em vetores de expressão separados. Cada gene está sob o controle transcricional do promotor imediato e precoce de citomegalovírus humano e do hormônio de crescimento da sequência de poliadenilação do gene humano.

[294] O plasmídeo que expressa a cadeia leve, pJP009, também contém um cassete de expressão para o gene da neomicina fosfo- transferase (neo) que contém o promotor precoce de fosfoglicerato quinase de murino (muPGK) e a sequência de poliadenilação muPGK (Figura 4). O plasmídeo que expressa a cadeia pesada, pJP010, também contém um cassete de expressão para o gene de dhfr, que foi usado como um marcador de seleção e amplificável de metotrexato. As principais características dos plasmídeos pJP009 e pJP010 estão resumidas abaixo.

[295] Abreviaturas: citomegalovírus humano do gene precoce imediato (IE hCMV), vírus símio precoce 40 (SV40E), fosfoglicerato quinase de murino (muPGK), hormônio de crescimento humano (hGH), gene da fosfotransferase de neomicina (resistência a G418), digene de hidrofolato redutase (dhfr), gene bacteriano para resistência à ampicilina (beta-lactamase).

[296] A sequência de nucleotídeos completa do plasmídeo pJP009 é mostrada abaixo. As três estruturas de leitura aberta estão a cadeia leve 24F4, a neomicina-fosfotransferase, e beta-lactamase.

[297] A sequência de nucleotídeos completa do plasmídeo pJP010 (Figura 5) é mostrada abaixo. As três estruturas de leitura aberta estão a cadeia pesada 24F4, a neomicina-fosfotransferase, e beta-lactamase.

Exemplo 9. Construção da Linhagem celular

[298] A célula hospedeira usada foi uma linhagem celular hospe deira deficiente (dhfr) di-hidrofolato redutase de ovário de hamster chinês, CHO-DG44. O banco de células hospedeiras DG44 foi testado e encontrado negativo quanto à presença de agentes adventícios, antes da utilização. O DG44 hospedeiro (CER-00-05-01) foi usado para a construção de linhagens celulares que expressam o anti-BDCA2.

[299] Os plasmídeos pJP009 e pJP010 expressando a cadeia leve e a cadeia pesada recodificada de anti-BDCA2, de maneira respectiva, foram usados para transfectar a linhagem celular hospedeira através de eletroporação. As células transfectadas que expressam dhfr foram selecionadas usando um meio deficiente em α nucleosídeos. Após a seleção nos meios livres de nucleosídeos αMEM descritos acima, o pool transfectado foi enriquecido em altas linhagens celulares que expressam, usando uma combinação de seleção de células ativadas por meio da fluorescência e o instrumento Genetix Clonepix FL (CER-00-09-03). As colônias de células isoladas pelo ClonePix FL foram colhidas a partir do meio semi-sólido para placas de 96 poços. Os poços individuais foram expandidos e a produtividade foi avaliada. A linhagem celular que mostra o título mais elevado em análise de balão de agitação fed-batch (n° 49) foi transferida para Fermentação de Pesquisa Animal para crescimento em um biorreator de 10 L para a geração de material para caracterização.

[300] Após o rastreamento inicial da linhagem celular, as linha gens celulares de produção mais elevadas foram selecionadas para amplificação. As melhores linhagens celulares foram submetidas a me- totrexato (MTX) de amplificação. Os pools amplificados foram subclo- nados usando a diluição limitante a uma densidade teórica de 0,5 células por poço em placas de 384 poços. Os poços individuais de placas de 384 poços foram fotografados usando um instrumento Cellavista (Innovatis) para a presença de uma única célula por poço e verificou- se ser clonal.

[301] As quatro linhagens celulares amplificadas, clonais melho res foram selecionadas com base em uma escala descontínua alimentada do frasco agitado e a análise da qualidade do produto. Os Bancos Celulares Pré-Master (Pré-MCB) foram feitos a partir destas linhagens celulares top 4 que são avaliadas em biorreatores. Um subclone de chumbo foi selecionado com base no desempenho do biorreator e na análise da qualidade do produto. Um frasco pré-MCB da linhagem celular de chumbo foi transferido para Fabricação para geração de Banco de Células Principal.

Exemplo 10. As modificações pós-traducionais de anti-anticorpo BDCA2, BIIB059 a) A Oxidação

[302] O mapeamento de peptídeos Endo-Lys C do anticorpo anti-BDCA2 BIIB059 revelou que a cadeia pesada Met-257, 433 e Met-Trp- 163 são locais suscetíveis à oxidação. Os níveis variaram de 4 a 7 %. Os dados experimentais indicam que a maior parte da oxidação está relacionada com a preparação da amostra.

b) A desamidação

[303] A análise do mapa de peptídeos Endo-Lys-C de anticorpo BIIB059 mostrou que aproximadamente 2,5 % de cada Asn-389, Asn- 394 e Asn-395 na cadeia pesada foi desamidado (desamidação combinada e formação de succinimida), e que aproximadamente 2,5 % de Asn-320 na cadeia pesada foi desamidado (em uma forma de succini- mida). A quantidade total de formas de succinimida para Asp-32 e Asp-34 na cadeia leve foi de aproximadamente 3 %. A isomerização combinada de Asp-32 e Asp-34 na cadeia leve foi de aproximadamente 5 %. Semelhantes à oxidação, algumas destas modificações podem ser relacionadas à preparação da amostra.

c) A glicação

[304] A glicação é uma modificação não enzimática causada pela reação de grupos amino em proteínas com glicose, um componente do meio de cultura. A glicação é rotineiramente detectada em proteínas e os níveis variam amplamente, dependendo das condições de cultura de células. No anticorpo BIIB059, o nível de glicação, tal como medido por meio da análise de massa intacta da proteína não reduzida, foi de aproximadamente 10 %. A análise de mapeamento do peptídeo revelou aproximadamente 0,46 % da glicação em Lys-107 da cadeia leve, 0,28 % em Lys-103 da cadeia leve e aproximadamente 0,2 % em Lys- 295 da cadeia pesada ligada a O.

d) A glicosilação

[305] Não havia nenhuma glicosilação ligada detectável de BIIB059.

e) Outras modificações (por exemplo hidroxilisina, etc.)

[306] As análises mostraram que a < 1 % da cadeia pesada de anticorpo BIIB059 está na forma aglicosila. A análise mostrou que não houve nenhuma das substituições Asn-Ser e não houve modificações desconhecidas ou mutações em um nível de > 1 % no anticorpo.

Exemplo 11. A ligação direta de BIIB059 à superfície celular de células dendríticas de plasmocitoide

[307] Um ensaio de sangue total por meio da citometria de fluxo foi desenvolvido para avaliar a ligação de BIIB059 à BDCA2 sobre as células dendríticas humanas ou plasmocitoides cinomólogos (PDC). O sangue periférico de macaco cinomólogos (Toxikon, Inc, Bedford, MA), ou de humano (Biogen Idec) foi recolhido em tubos de recolha de he- parina de sódio e mantido à temperatura ambiente. Uma mistura de anticorpos de coloração de FACS para identificar pDCs foi adicionada a cada alíquota de sangue total, incorporando CD20, CD14, CD123 e HLA-DR. Alexa647 marcado com BIIB059 (Biogen Idec, Lote no. 17073-057) ou com um controle do isotipo marcado com Alexa647 hlgG foi adicionado para a coloração de coquetel de FACS, a uma concentração de 0 a 40 μg/mL. O sangue foi incubado em gelo, protegido da luz, durante 30 min. Após 30 min., cada alíquota de 500 ul de sangue total (cino) ou 100 ul (humana) foi tratada com 10 mL (cino) ou 2 mL (humanas) de 1X Tampão de Easy Lise (Leinco Technologies) que tinha sido incubado a 37°C durante pelo menos uma hora. Após 10 a 15 minutos em incubação à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 1400 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi decantado, deixando apenas um sedimento de glóbulos brancos (WBC). Cada sedimento de WBC foi lavado com 5 mL de tampão de FACS (1 % de BSA + 0,002 % de Azeto de Na + CaCl2 a 1 mM + MgCl2 a 1 mM em PBS) e centrifugadas a 1400 rpm durante 5 min. O sobrena- dante foi decantado, e cada pélete foi ressuspenso WBC em 200 mL de tampão de FACS e transferido para uma placa de 96 poços de fundo redondo (Fisher Scientific). A placa foi centrifugada a 1400 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi despejado para fora da placa, e cada pélete de WBC foi lavado com 200 mL de tampão de FACS. A placa foi centrifugada a 1400 rpm durante 5 min, e o sobrenadante foi despejado para fora da placa. A seguir à lavagem (como acima), os glóbulos brancos foram ressuspensos em 200 μL de 1 % de paraformaldeído (PFA) em PBS e fixados em 4°C durante a noite, protegidos da luz. Imediatamente antes da análise de citometria de fluxo, os glóbulos brancos foram filtrados usando uma placa de filtro de malha de náilon de 60 micron (Millipore). Cada pélete foi então transferido para uma placa nova, de 96 poços de fundo redondo e centrifugado a 1400 rpm durante 5 min. Cada um dos péletes WBC foi ressuspenso em 250 μL de tampão de FACS e a intensidade de fluorescência medida na máquina de FACS de 4 cores LSRII. A compensação de cor única foi adquirida usando as contas de partículas de Ig anticamundongo de compensação definidas (BD Biosciences). A análise foi realizada usando o software FlowJo e GraphPad Prism. BIIB059 foi ligado às células humanas e cinomólogo de forma semelhante com valores de EC50 de 12 μg/mL (7-13nM) (Figura 6).

Exemplo 12. A avaliação da auto Associação para BIIB059

[308] O ensaio AlphaScreen é um ensaio de proximidade homogênea usando doador de glutationa e aceitador de grânulos (Perkin Elmer) para se à ligar GST de FcRIIa humano (CD32A). Várias concentrações dos anticorpos a serem testadas foram adicionadas a esta mistura. Dado que a ligação do anticorpo ao FcRIIa é monovalente, a única maneira de um sinal ser gerado é se doadores e aceitadores de ambos os grânulos têm um anticorpo ligado que associa trazendo os grânulos a cerca de 200 nm, que permite a produção de oxigênio sin- guleto e consequente luz emissão. O nível de emissão detectada pelo instrumento Envision (Perkin Elmer) é proporcional ao grau de autoas- sociação.

[309] A Figura 7 mostra os resultados do Alpha Screen para BIIB059 comparado com 5C8 (controle negativo) e LT105 (controle positivo forte com autoassociação).

Exemplo 13. Avaliação da ligação não específica de BIIB059

[310] A cromatografia de interação Cruzada (CIC) é um método de alto rendimento para a avaliação preliminar da viscosidade de can-didatos mAb (Jacobs et al, Pharm Res, 27 (1): 65 a 71 (2010)). Neste método, IgG humana policlonal de grandes quantidades é quimicamente acoplada a uma resina de cromatografia de NHS-ativada. Os tempos de retenção de BIIB059 em colunas não derivatizadas e IgG derivatizadas foram, em seguida, em comparação com um painel de controle de mAbs bem comportados e mal comportados. BIIB059 não mostrou nenhuma evidência de ligação não específica por meio deste método, como evidenciado pelos seus tempos de retenção e baixos valores de k’.Dados de CIC que mostra a solubilidade e nenhuma ligação específica

Exemplo 14. Avaliação da estabilidade de BIIB059

[311] A fluorometria de varrimento diferencial foi usada para tes tar a estabilidade de BIIB059 longo de uma gama de condições de tampão para a formulação de pesquisa inicial. O desdobramento da proteína foi monitorizado em tempo real de um sistema de PCR Mx3005P (Agilent Technologies) em um formato de 96 poços, usando 10 ug de proteína em 50 μL de PBS (pH 7,0) suplementado com fluo- róforo laranja SYPRO a uma concentração final de 10X (com base na Invitrogen designação estoque de 1000X). As amostras foram aqueci- das de 25°C a 95°C a 1°C/min, com intensidade de fluorescência medida três vezes por 1°C. As intensidades de fluorescência foram representadas graficamente como uma função da temperatura. Tm foram derivados a partir destas curvas tomando a derivada negativa ('' -R’ (t)'‘ no software Mx3005P) e selecionando os mínimos locais das parcelas derivadas. Usando um tampão de base de citrato de sódio a 20 mM, o pH foi variado de 5,0 a 7,5 e concentrações de NaCl e sacarose foram variadas de 50 a 250 mM.

[312] A estabilidade foi semelhante ao longo destas proporções de tampão. A Figura 8 mostra os dados com NaCl a 150 mM e sacarose a 250 mM como uma função do pH. O citrato de sódio a 20 mM, NaCl a 150 mM pH 6,0 foi escolhido como a formulação de investigação sobre sacarose, devido à dificuldade em atingir altas concentrações com sacarose usando os concentradores centrífugos de investigação.

Exemplo 15. Avaliação da estabilidade de agitação de BIIB059

[313] Um volume de 0,2 mL da solução mAb de BIIB059 a 1 mg/mL em citrato de sódio a 20 mM, pH 6,0, NaCl a 150 mM, foi submetido a recíproca agitação à temperatura ambiente em frascos de vidro de 2 mL (Waters, WAT270946C) usando um modelo da Placa de Título de Agitação Lab-Line Instruments 4626 ajustada a 600 rpm. A agregação foi avaliada através da monitorização do aumento da turbi- dez a 320 nm usando um espectrofotômetro Beckman DU640. BIIB059 exibiu agregação dependente do tempo. Normalmente IgG1 humana do tipo selvagem não se agrega sob estas condições de agitação. Como mostrado na Figura 9, a agregação foi completamente suprimida por meio da adição de 0,03 % de Tween 80, uma formulação de excipiente comum. A agregação induzida por meio da agitação, por vezes, pode ser altamente dependente do pH. A IgG4 aglicosila/IgG1 mostrou uma agregação mais rápida e mais extensa do que BIIB059.A agregação de aglicosila IgG4/IgG1 foi também suprimida com a adição de Tween 80.

Exemplo 16. Avaliação da Viscosidade de BIIB059

[314] A estabilidade e viscosidade de amostras de BIIB059 foram medidas em altas concentrações de 150 mg/mL e maiores, para suportar o desenvolvimento potencial do produto para a administração subcutânea. As soluções de BIIB059 foram centrifugadas em tubos de ultraconcentrador para limitar os volumes e as concentrações obtidas foram determinadas por meio de scans UV. A estabilidade foi determinada por meio da cromatografia de exclusão de tamanhos após armazenagem a 2 a 8°C durante uma e duas semanas. As concentrações de proteína superiores a 200 mg/mL foram prontamente conseguidas por pequenas quantidades de proteína em citrato a 20 mM, pH 6, NaCl a 150 mM e o tampão de agregado manteve-se baixo (0,68 %) após duas semanas a 2 a 8°C. A viscosidade foi medida usando um instrumento Viscopro2000 (Cambridge Viscosidade). A viscosidade a 150 mg/mL foi de apenas 8 cP no tampão de citrato/solução salina. Estes resultados demonstram que uma formulação de elevada concentração de BIIB059 devem ser atingíveis.

Exemplo 17. Clonagem do Gene de BDCA2 Humano

[315] O BDCA2 humano de comprimento completo (huBDCA2) de CDNA foi subclonado no vetor de clonagem pCR4TOPO da Invitro- gen de Open Biosystems: este plasmídeo foi designado pEAG2367. A sequenciação de DNA confirmou que o seu CDNA foi idêntico ao de comprimento completo de CDNA humano BDCA2 na sequência de referência Número de acesso da GenBank NM_130441. A estrutura de leitura aberta de comprimento total codificada por meio de huBDCA2 pEAG2420 é mostrada a seguir, com o domínio de transmembrana previsto de TM-HMM sublinhado: 1 MVPEEEPQDR EKGLWWFQLK VWSMAVVSIL LLSVCFTVSS VVPHNFMYSK 51 TVKRLSKLRE YQQYHPSLTC VMEGKDIEDW SCCPTPWTSF QSSCYFISTG 101 MQSWTKSQKN CSVMGADLVV INTREEQDFI IQNLKRNSSY FLGLSDPGGR 151 RHWQWVDQTP YNENVTFWHS GEPNNLDERC AIINFRSSEE WGWNDIHCHV 201 PQKSICKMKK IYI* (SEQ ID NO:1)

[316] A estrutura de leitura aberta de comprimento total codifica da por meio de huFcεRlY pEAG2420, a qual é idêntica à sequência de referência Número de acesso da GenBank NP_ 004097, é mostrada abaixo: 1 MIPAVVLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV 51 RKAAITSYEK SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQ* (SEQ ID NO:2)

[317] Uma coexpressão do vetor de expressão tanto de CHO BDCA2 humano quanto cDNAs de FcεRlY em unidades de transcrição em tandem foi construída por meio da subclonagem do fragmento de 2,11 kb SpeI de pEAG2413 no vetor da estrutura principal de pE- AG2420 linearizado, fosfatado a 6,71 kb SpeI, resultando em um "uni- vetor" pEAG2456 designado. O BDCA2 humano e cDNA de FcεRlY em pEAG2420 foram de sequência confirmada. Uma linhagem celular CHO estável que coexpressa de forma estável BDCA2 e cDNAs de FcεRIY foi produzida por meio da transfecção com pEAG2456.

Exemplo 18. Clonagem e Gene de BDCA2 de Cino e Rhesus

[318] O BDCA2 de macaco deduzido da estrutura de leitura aber ta codificada por pEAG2384 e uma das formas observadas de SNP em pEAG2383 é mostrado abaixo. Esta forma SNP é referida abaixo como a forma E73 SNP de BDCA2 de cino. No rhesus, uma única sequência idêntica à forma E73 SNP de BDCA2 de cino foi observada. 1 MVPEEEPQDR EKGVWWFQLK VWSVAVVSIL LLCVCFTVSS VASHNFMYSK 51 TVKRLSKLQE YQQYYPSLTC VMEGKDMEDW SCCPTPWTSF QSSCYFISTV 101 MQSWTKSQNN CSVMGADLVV INTKEEQDFI TQNLKINSAY FLGLSDPKGW 151 RHWQWVDQTP YNKNVTFWHS GEPNSPDERC AIINFRSEEW GWNDVHCHVP 201 QKSICKMKKI YI* (SEQ ID NO:72)

[319] Em uma segunda forma de SNP BDCA2 de cino, o resíduo 73 (GAA = Glu, E) destacado acima é Lisina (AAA = Lys, K). Esta segunda forma de SNP é referida como a forma K73 SNP de BDCA2 do macaco cinomólogo. Em BDCA2 humano, o resíduo 73 é o ácido glu- tâmico. O alinhamento de lacunas das sequências de BDCA2 humano (superior) e de macaco (inferior), que partilham 90,6 % de identidade, é mostrado abaixo. Os locais de glicosilação N-ligados potenciais estão sombreados. O BDCA2 de macaco carece de um local de glicosi- lação N-ligado potencial presente em humanos (NSS em 137-139 em humanos vs. NSA em macaco).Um consenso da estrutura de leitura aberta de FcεRlY de macaco ci- nomólogo é mostrado abaixo:1 MIPAVVLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV 51 RKAAIASYEK SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQ (SEQ ID NO :73)

[320] A sequência de cDNA de FcεRIY de macaco cinomólogo é uma correspondência perfeita com a do cDNA de Rhesus previsto (com base em leituras genômicas curtas), descrita no Número de acesso da GenBank XM_001115585 e uma sequência cino depositada como Número de acesso da GenBank AF485816 por cientistas da Ge- nentech. A sequência da proteína FcεRIY de cino compartilha 98,9 % de identidade com a proteína de FcεRIY humano, diferindo apenas por meio de uma substituição única, conservadora. O alinhamento entre FcεRlY humano (superior) e cino (inferior) é mostrado abaixo:

[321] Uma coexpressão do vetor de expressão tanto de, tanto da forma de cino E73 SNP de BDCA2 quanto cDNAs de FcεRlY em unidades de transcrição em tandem foi construída por meio da subclona- gem do fragmento de 2,11 kb SpeI de pCN652 no vetor da estrutura principal linearizado, fosfatado de 6,72 kb SpeI de pCN654, resultando em um "univetor" designado pEAG2668. O BDCA2 cino e CDNAs de FcεRIY ns sequência f pEAG2668 oram confirmados. Uma linhagem celular CHO estável que coexpressa de forma estável BDCA2 e CDNAs de FcεRIY foi produzida por meio da transfecção com pE- AG2668.

Exemplo 19. Reatividade cruzada entre BDCA2 Humano e de Cino

[322] Para determinar se o macaco cinomólogo de E73/K73 BDCA2 SNP afetou a ligação anti-BDCA2, as células 293E foram co- transfectadas com vetores de expressão que transportam um EGFP repórter (pEAG1458) e BDCA2 e CDNAs de FcεRIY (BDCA2 humano: pEAG2420 e FcεRIY: pEAG2413; cino E73 BDCA2: pCN652 ou K73 BDCA2: pCN656 e cino FcεRIY: (pCN652) em proporções molares 1: 1: 1. No 3° dia pós-transfecção, as células foram colhidas e coradas com Miltenyi BDCA2 AC144 mAb anti-humano conjugado com PE (Mil- tenyi Biotec número de catálogo 130-090-511) em uma diluição de titulação de ligação direta de FACS, agrupando em células positivas para EGFP verde. A Figura 10 mostra a ligação direta do AC144 a superfície de BDCA2 humano e de cino.

[323] EC50 aparentes são essencialmente equivalentes para BDCA2 humano e ambas as formas de BDCA2 de macacos cinomólo- gos E73 e K73 SNP. Tendo em conta este resultado, CHO transfectan- tes estáveis para a superfície de comprimento totalde BDCA2 foram gerados usando o vetor de expressão de BDCA2 humano/FcεRlY pE- AG2456 e vetor de expressão E73 SNP BDCA2/FcεRlY de cino pE- AG2668. Estas linhas foram usadas para triagem de anticorpos anti- BDCA2 com reatividade cruzada humanos/de cino.

Exemplo 20. Constructos de fusão de Fc de ectodomínios de BDCA2 humano e de Cinomólogos

[324] Cinco constructos de fusão de Fc de BDCA2 ECD humano e de cino foram manipulados. Em três dos constructos, BDCA2 está ligado por meio de uma sequência ligante G4S para o terminal C da dobradiça de IgG1 humana e Fc. Em dois dos constructos, o ligante G4S foi substituído por um local de clivagem de protease de TEV EN- LYFQC.

[325] Como BDCA2 é uma proteína de membrana do tipo II (o terminal C está do lado de fora da célula), a concepção de proteínas de fusão solúveis de Fc envolveu a adição do ectodomínio do terminal C (resíduos de 45 a 213 de BDCA2 para BDCA2 humano) para o terminal C com a secreção da engenharia de IgG de Fc que foi impulsionado por meio de uma sequência de sinal da cadeia leve murino kappa em estrutura. O constructo huBDCA2 de comprimento completo pEAG2367 foi usado como molde para PCR com os iniciadores 5’ CAG TGT CTG TTT CAC TCC CGG CGG GGG TGG TGG TAG CAA TTT TAT GTA TAG C 3' (SEQ ID NO: 74) (para adicionar um 5’ Xmal (Pro-Gly) e Gly4Ser ligante imediatamente antes dos ectodomínios da extremidade 5’ huBDCA2) e 5' CCA GGG AGA ATA GGA TCC TTA TAT GTA GAT CTT 3’ (SEQ ID NO: 75) (para adicionar um local 3' BamHI imediatamente após o terminador huBDCA2). O produto de PCR de 0,56 kb foi purificado e subclonado do vetor de clonagem Invi- trogen pCRBluntIITOPO, produzindo pEAG2417, cuja sequência de inserção de cDNA foi confirmada. A 0,53 kb do fragmento Xmal-BamHI de pEAG2417 e a 0,75 kb do fragmento NotI-Xmal de pEAG1397 (que leva uma huIgG1 Fc engenheirada cuja secreção é acionada por uma estrutura de engenharia da sequência de sinal da cadeia leve kappa de murino) foram ligados com os fragmentos da estrutura principal de vetor 1,89 kb de BamHI de Xbal e 4,17 kb de Xbal-Notl do vetor de expressão como pV90, produzindo o vetor de expressão da proteína de fusão huIgG1 Fc- huBDCA2 pEAG2421, cuja sequência de inserção de cDNA foi confirmada. A estrutura de leitura aberta deduzida codificada por pEAG2421 é mostrada abaixo: 1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PKSSDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK 51 PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY 101 NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP 151 QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 201 VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 251 GGGGSNFMYS KTVKRLSKLR EYQQYHPSLT CVMEGKDIED WSCCPTPWTS 301 FQSSCYFIST GMQSWTKSQK NCSVMGADLV VINTREEQDF IIQNLKRNSS 351 YFLGLSDPGG RRHWQWVDQT PYNENVTFWH SGEPNNLDER CAIINFRSSE 401 EWGWNDIHCH VPQKSICKMK KIYI*(SEQ ID NO:76) sequência de sinal da cadeia leve kappa : resíduos 1-19 acima (em itálico) Fc de IgG1 humana: resíduos 20-250 acima G4S ligante: resíduos 251-255 acima (em negrito) ectodomínio huBDCA2: resíduos 256-424 acima (sublinhado)

[326] Para construir um vetor de expressão para uma proteína de fusão de Fc-muIgG2a huBDCA2, 0,53 kb do fragmento BamHI-Xmal de pEAG2417 e 0,75 kb do fragmento NotI-Xmal de pEAG1442 (que leva uma IgG2a Fc de murino engenheirada cuja secreção é acionada por meio de uma estrutura de engenharia da sequência de sinal da cadeia leve kappa) foram ligados com os fragmentos da estrutura principal de vetor 1,89 kb de BamHI de Xbal e 4,17 kb de Xbal-Notl do ve- tor de expressão como pV90, produzindo pEAG2423, cuja sequência de inserção de cDNA foi confirmada. A estrutura de leitura aberta deduzida codificada por pEAG2423 é mostrada abaixo: 1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PRGPTIKPSP PCKCPAPNLL GGPSVFIFPP [51] KIKDVLMISL SPIVTCVVVD VSEDDPDVQI SWFVNNVEVH TAQTQTHRED 101 YNSTLRVVSA LPIQHQDWMS GKEFKCKVNN KDLPAPIERT ISKPKGSVRA 151 PQVYVLPPPE EEMTKKQVTL TCMVTDFMPE DIYVEWTNNG KTELNYKNTE 201 PVLDSDGSYF MYSKLRVEKK NWVERNSYSC SVVHEGLHNH HTTKSFSRTP 251 GGGGGSNFMY SKTVKRLSKL REYQQYHPSL TCVMEGKDIE DWSCCPTPWT 301 SFQSSCYFIS TGMQSWTKSQ KNCSVMGADL VVINTREEQD FIIQNLKRNS 351 SYFLGLSDPG GRRHWQWVDQ TPYNENVTFW HSGEPNNLDE RCAIINFRSS 401 EEWGWNDIHC HVPQKSICKM KKIYI*(SEQ ID NO:77) sequência de sinal da cadeia leve kappa : resíduos 1-19 acima (em itálico) Fc de IgG2a humana: resíduos 20-251 acima G4S ligante: resíduos 252-256 acima (em negrito) ectodomínio huBDCA2: resíduos 257-425 acima (sublinhado)

[327] As linhagens celulares de CHO estáveis que produzem as proteínas de fusão Fc-huBDCA2 foram produzidas por meio da trans- fecção com vetores de expressão pEAG2421 e pEAG2423. Essas pro-teínas de fusão foram usadas em ensaios de ELISA para o anticorpo de triagem e Octeto de ligação candidato durante o rastreio.

[328] Para manipular o BDCA2 de cinomólogo (cino) para fazer uma proteína da proteína de fusão de Fc, a variante de comprimento completo E73 SNP de BDCA2 de cino no constructo pCN648 foi submetida a mutagênese dirigida ao local com os iniciadores 5’ CTC TGT GTC TGT TTC ACT CCC GGG GGT GGC GGT GGT AGC AAT TTT ATG TAT CAG 3’ (SEQ ID NO: 78) e o seu complemento inverso, a adicionando-se um 5' Xmal (Pro-Gly) e Gly4Ser ligante imediatamente antes da extremidade 5’ do ectodomínio huBDCA2, produzindo o cons- tructo pEAG2675, cujo cDNA da sequência de inserção foi confirmado. Para construir um vetor de expressão para uma proteína de fusão de Fc-muIgG2a BDCA2 de cino, 0,53 kb do fragmento BamHI-Xmal de pEAG2675 e 0,75 kb do fragmento NotI-Xmal de pEAG1442 (que leva uma IgG2a Fc de murino engenheirada cuja secreção é accionada por meio de uma estrutura de engenharia da sequência de sinal da cadeia leve kappa) foram ligados com os fragmentos da estrutura principal de vetor 1,89 kb de BamHI de Xbal e 4,17 kb de Xbal-Notl do vetor de expressão como pV90, produzindo pEAG2677, cuja sequência de inserção de cDNA foi confirmada. A estrutura de leitura aberta deduzida codificada por pEAG2677 é mostrada abaixo: 1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PRGPTIKPSP PCKCPAPNLL GGPSVFIFPP 51 KIKDVLMISL SPIVTCVVVD VSEDDPDVQI SWFVNNVEVH TAQTQTHRED 101 YNSTLRVVSA LPIQHQDWMS GKEFKCKVNN KDLPAPIERT ISKPKGSVRA 151 PQVYVLPPPE EEMTKKQVTL TCMVTDFMPE DIYVEWTNNG KTELNYKNTE 201 PVLDSDGSYF MYSKLRVEKK NWVERNSYSC SVVHEGLHNH HTTKSFSRTP 251 GGGGGSNFMY SKTVKRLSKL QEYQQYYPSL TCVMEGKDME DWSCCPTPWT 301 SFQSSCYFIS TVMQSWTKSQ NNCSVMGADL VVINTKEEQD FITQNLKINS 351 AYFLGLSDPK GWRHWQWVDQ TPYNKNVTFW HSGEPNSPDE RCAIINFRSE 401 EWGWNDVHCH VPQKSICKMK KIYI*(SEQ ID NO:79) sequência de sinal da cadeia leve kappa : resíduos 1-19 acima (em itálico) Fc de IgG2a de murino: resíduos 20-251 acima G4S ligante: resíduos 252-256 acima (em negrito) Ectodomínio de BDCA2 de cino: resíduos 257-424 acima (sublinhado)

[329] Uma linhagem celular de CHO estável que produz a proteí na de fusão Fc-BDCA2 de cino foi produzida por meio da transfecção com o vetor de expressão de pEAG2677.

[330] As proteínas de fusão Fc-muIgG2a BDCA2 foram sujeitas a proteólise limitada, para isolar as proteínas do ectodomínio BDCA2 monomérico. Para facilitar o isolamento do ectodomínio BDCA2 re- combinante solúvel, novos constructos de fusão de Fc foram construídos em que um local de clivagem de protease de TEV foi inserido entre o terminal C da Fc e o terminal N do ectodomínio BDCA2. A singe- nêse de carregamento de ectodomínos humanos ou BDCA2 de cino modificada com um local 5’ Xmal (Pro-Gly), para a fusão Fc do termi nal C seguido por meio de um local de clivagem de TEV em estrutura (ENLYFQG) fundido ao resíduo 45 da sequência BDCA2 e um local 3’ BamHI após o terminador BDCA2 ter sido planejado e realizado por GeneWiz como inserção de XmaI-BamHI no vetor de clonagem pUC57-amp. As sequências das inserções em ectodomínio engenhei- rado de Xmal-BamHI TEV-BDCA2 de constructos de cDNA, pE- AG2917 (humano) e pEAG2918 (cino), foram confirmadas. Para construir pV90-IRES-DHFR-CHO com base nos vetores de expressão para proteínas de fusão Fc-huIgG1 TEV-BDCA2, 0,75 kb do fragmento No- tI-Xmal de pEAG1397 e 0,54 kb do fragmento BamHI-Xmal de pE- AG2917 ou pEAG2918 foram subclonados nos 5,4 kb do fragmento BglII-Notl de vetor da estrutura principal pXJC194, produzindo pE- AG2937 (Fc-huBDCA2) ou pEAG2938 (Fc-BDCA2 de cino). Os cDNAs de inserção em pEAG2937 e pEAG2938 foram de sequência confirmada. As linhagens celulares CHO estáveis foram geradas por meio da transfecção com pEAG2937 e pEAG2938. A estrutura de leitura aberta deduzida da proteína de fusão huFc-TEV-huBDCA2 codificada por pEAG2937 é mostrada abaixo: 1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PKSSDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK 51 PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY 101 NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP 151 QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 201 VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 251 ENLYFQGNFM YSKTVKRLSK LREYQQYHPS LTCVMEGKDI EDWSCCPTPW 301 TSFQSSCYFI STGMQSWTKS QKNCSVMGAD LVVINTREEQ DFIIQNLKRN 351 SSYFLGLSDP GGRRHWQWVD QTPYNENVTF WHSGEPNNLD ERCAIINFRS 401 SEEWGWNDIH CHVPQKSICK MKKIYI* (SEQ ID NO:80) sequência de sinal da cadeia leve kappa: resíduos 1-19 acima (em itálico) Fc de IgG1 humana: os resíduos 20-250 acima local de clivagem TEV: resíduos 251-257 acima (em negrito) ectodomínio huBDCA2: resíduos 258-426 acima

[331] A estrutura de leitura aberta deduzida da proteína de fusão huFc-TEV-BDCA2 de cino codificada por pEAG2938 é mostrada abaixo: 1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PKSSDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK 51 PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY 101 NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP 151 QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 201 VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 251 ENLYFQGNFM YSKTVKRLSK LQEYQQYYPS LTCVMEGKDM EDWSCCPTPW 301 TSFQSSCYFI STVMQSWTKS QNNCSVMGAD LVVINTKEEQ DFITQNLKIN 351 SAYFLGLSDP KGWRHWQWVD QTPYNKNVTF WHSGEPNSPD ERCAIINFRS 401 EEWGWNDVHC HVPQKSICKM KKIYI* (SEQ ID NO:81) sequência de sinal da cadeia leve kappa: resíduos 1-19 acima (em itálico) Fc de IgG1 humana: os resíduos 20-250 acima local de clivagem TEV: resíduos 251-257 acima (em negrito) ectodomíno de BDCA2 de cino: resíduos 258-425 acima (sublinhado)

Exemplo 21. Ligação de BIIB059 às Proteínas de Fusão BDCA2-Fc

[332] A capacidade de BIIB059 se ligar a huBDCA2-Fc na solu ção foi avaliada por SEC (Figura 11). Quando analisados isoladamente, BIIB059 (painel superior) e huBDCA2 (painel do meio) eludiram como picos agudos únicos com massas moleculares de aproximadamente 150 kDa. Quando BIIB059 e huBDCA2-Fc foram misturados e analisados (painel inferior), houve uma mudança de BIIB059 e huBDCA2-Fc para massas mais elevadas de > 550 kDa, tal como evidente por meio da sua eluição a posições anteriores no cro- matograma. A heterogeneidade no pico de eluição é presumivelmente causada pelo fato de que tanto BIIIB059 quanto BDCA2-Fc cada contém dois locais de ligação e, por conseguinte, um grande número de complexos com diferentes estequiometrias de BIIB059 e BDCA2 é formado.

[333] A ligação de BDCA2 ECD de cino para BIIB059 também foi avaliada por meio de SEC e a similaridade levou a uma mudança quantitativa de complexos de massa molecular superior.

Exemplo 22. O cálcio aumenta a ligação de BIIB059 para BDCA2

[334] A ligação de BIIB059 para BDCA2 humano fundido com Fc murino (muFc-huBDCA2) na presença de cálcio ou EDTA foi estudada em um ensaio de ligação do octeto. A proteína huBDCA2-muFc foi capturada sobre um biossensor anti-Fc de murino, seguindo-se a associação de BIIB059 e a etapa de dissociação. Todas as etapas foram executadas em HEPES a 50 mM, pH 7, NaCl a 100 mM, 1 mg/mL de BSA, 0,02 % de Tween 20 e 0,001 % de azida ou contendo CaCl2 a 10 mM ou EDTA a 10 mM.

[335] A Figura 12 mostra que a ligação de BIIB059 é melhorada por meio da adição de cálcio em relação ao EDTA levando a um sinal de cerca de 2 vezes maior. Ambas as taxas de associação e dissociação foram afetadas pelo cálcio.

Exemplo 23. Medidas de ligação

[336] Octeto foi usado para monitorar a ligação de BIIB059 à proteína de fusão BDCA2-Fc e BDCA2 ECD. A Figura 13 mostra um ex-perimento em que Octeto BIIB059 foi carregado em pontas de octeto de Fc anti-humano a uma concentração de 20 μg/mL. Para a etapa de associação, BDCA2 ECD humano e de cinomólogo foi adicionado a uma concentração de 2 μg/mL. O tampão para este experimento foi de HEPES a 50mM, pH 7, NaCl a 100 mM, CaCl2 a 5 mM, 1 mg/mL de BSA, 0,02 % de Tween 20 e 0,001 % de azida. Sob estas condições, a ligação de BIIB059 ao BDCA2 ECD humano e de cino foi comparável.

Exemplo 24. Ensaio PBMC para Determinar o Valor de IC50 para BIIB059 para a inibição da Produção de IFNa Induzida por TLR9

[337] A ligação de BDCA2 foi mostrada para ativar uma cascata de sinalização do tipo BCR, de forma potente que suprime a capacidade de pDCs para produzir IFN do tipo I e outras citocinas em resposta a ligantes de TLR (Cao W. et al., PLoS Biol., 5 (10): e248 (2007)). A inibição da produção IFNa induzida por TLR9 por PBMC foi usada co- mo o ensaio celular primário para o rastreio.

[338] PBMC de sangue venoso heparinizado de doadores saudá veis foram isolados por meio da centrifugação em gradiente descontínuo sobre Ficoll, lavado em PBS e re-suspenso em meio de cultura completo (RPMI com 3 % de FBS). 1x106 células/poço foram semeadas e estimuladas com 10 ng/mL de ligante de TLR9 (CpG-A ODN 2216), na presença de doses de BIIB059 e 24F4A-Agly (uma versão Fc incapacitada de BIIB059), ou controle de isotipo mAb que vai desde 10 μg/mL a 1 pg/mL em um volume total de ensaio de 200 μL/poço. As placas foram incubadas durante a noite (18 horas) a 37°C, e os sobre- nadantes foram recolhidos para a avaliação em ensaios de ELISA IFNa (PBL InterferonaSource). Os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. As titulações de BIIB059 e 24F4A agly foram testadas para determinar IC50 para a inibição da produção IFNa induzida por TLR9. Um total de doze experimentos independentes deu um valor de IC50 médio de 0,001 μg/mL para BIIB059. O aglicosilado mAb foi menos potente, com um IC50 média de 0,007 g/mL (Figura 14).

[339] A capacidade do anti-BDCA2 mAb para inibir a produção de IFNa no seguimento da estimulação com um ligante fisiologicamente relevante, ou seja, os soros de pacientes com SLE foi também testada. Os soros SLE são acreditados para induzir IFN do tipo I através de complexos de autoanticorpos anti-ADN e DNA hipometilado imunoes- timulante que estimulam TLR9. PBMCs foram estimulados com soro de um paciente com SLE (fornecida pelo Dr. Gregg Silverman, NYU) e usado a uma diluição final de 1/5. O anticorpo 24F4S H4/L1C95S, que difere da BIIB059 por meio de um resíduo de aminoácido, anulou completamente a produção de IFNa a partir de soros de SLE estimulados por pDCs (Figura 18).

Exemplo 25. Produção de IFNa induzida por TLR9 em Ensaio de Sangue Total

[340] A atividade de BIIB059 também foi avaliada em um ensaio de sangue total de produção de IFN induzida por TLR9.

[341] O sangue total foi desenhado a partir de sangue venoso heparinizado de doadores saudáveis. Doses de BIIB059 e 24F4A-Agly variaram de 10 μg/mL a 1 pg/mL em um volume de ensaio total de 200 μL/poço. CpG-A foi adicionado a 200 μg/mL, o qual foi determinado como sendo óptimo para a estimulação da produção de IFNa em sangue total. As placas foram incubadas durante 18 horas a 37°C e os sobrenadantes recolhidos para uso em ensaios de ELISA de IFNa (PBL InterferonaSource). Os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. Mostrado na Figura 15A é um experimento representativo de 6 experimentos independentes realizados. A potência inibidora dos BIIB059 no ensaio de IFNa induzida por TLR9 em sangue total foi semelhante à potência visto nos ensaios de PBMC. Além de inibir as citocinas derivadas (PDC-IFNa, IL-6), o tratamento de BIIB059 também conduziu à inibição de uma grande variedade de ci- toquinas e quimiocinas (Figura 15C).

[342] O experimento seguinte foi realizado para determinar se BIIB059 poderia inibir a produção de IFNa induzida por TLR9 em sangue total de pacientes com SLE semelhante a voluntários saudáveis. Para este fim, o sangue total a partir de dois pacientes com SLE ou dois controles normais foi estimulado com 200 μg/mL CPGA na presença de 10 μg/mL BIIB059 e a produção IFNa foi avaliada por ELISA. Especificamente, o sangue total a partir de 2 pacientes com SLE ou dois doadores saudáveis foi fornecido por Bioreclamation LLC pelo transporte durante a noite. Após a chegada, o sangue foi tratado com 10 μg/mL BIIB059 ou controle de isotipo e estimulado com 200 μg/mL de CpG-A e semeado em placa de 96 poços. As placas foram incubadas durante 18 horas a 37°C e os sobrenadantes recolhidos para uso em ensaios de ELISA de IFNa (PBL InterferonaSource). Os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante.

[343] Como mostrado na Figura 15B, BIIB059 mostrou uma po tência semelhante no sangue total a partir de pacientes com SLE, em comparação com voluntários saudáveis.

Exemplo 26. Avaliação de Inibição Mediada por BIIB059 de interfe- ronas do tipo I

[344] A atividade inibidora de BIIB059 também foi confirmada usando pDCs purificados estimulados com agonistas sintéticos de TLR (CpG-A) ou mais estímulos fisiológicos (soros SLE). O efeito inibitório de BDCA2 de reticulação em outras citoquinas derivadas de pDC (IL- 6) foi também determinado. A atividade BIIB059 foi confirmada usando uma variedade de abordagens, tais como a reação em cadeia da poli- merase qualitativa e ELISA.

a) Q-PCR

[345] Treze subtipos de IFNa e um único membro da IFNβ exis tem em seres humanos. A estimulação com agonista em TLR9 resulta na regulação positiva da maioria das IFNs do Tipo I (Ito T. et al, Blood, 107 (6): 2423 a 31 (2006)). A inibição dos genes de IFN do tipo I individuais foi avaliada usando reação qualitativa em cadeia da polimerase (Q-PCR).

[346] pDCs foram purificados usando um procedimento de sepa ração de contas magnéticas de duas etapas (kit MACS, Miltenyi Biotec). 5 pDCs x104/poço foram estimuladas com 5 uM de CPG-A na presença ou na ausência de concentrações crescentes de BIIB059 ou 10 μg/mL de controle de isotipo. O volume total de ensaio foi de 200 μL/poço. As placas foram incubadas durante 18 horas a 37°C, e o RNA foi extraído a partir de células usando o reagente Trizol (Invitro- gen Corporation) e adicionalmente purificadas usando uma coluna RNeasy Mini (Qiagen Sciences). Todos os iniciadores e as sondas fo- ram adquiridos de Applied Biosystems Inc. As quantidades de transcrição relativa foram determinadas para cada amostra por meio da comparação com a curva padrão usando oligonucleotídeo do Software da Sequência de Detecção (Applied Biosystems Inc.) e normalizados para um controle (GAPDH).

[347] O tratamento com transcrição inibida de BIIB059 de todas as IFN do tipo I testadas, recapitulou assim os dados anteriores usando clone de anticorpo anti-AC144 BDCA2 (Cao W. et al, PLoS Biol, 5 (10): E248 (2007)).

b) ELISA

[348] O efeito de BIIB059 na inibição das citocinas de pDC foi testado ao nível de proteína usando o método ELISA. 5 x104 pDCs pu- rificados/poço foram estimuladas com 5 uM de CPG-A na presença ou na ausência de concentrações crescentes de BIIB059 ou 10 μg/mL de controle de isotipo. Mostrado na Figura 17 são os valores de IFNa e secretados de IL-6, medidos a partir de um doador representativo dos três doadores saudáveis testados.

[349] A ligação de BDCA2 com BIIB059 inibiu potentemente a produção de IFNa e reduziu fortemente a produção de IL-6 induzida por meio da estimulação de CpG-A.

Exemplo 27. Internalização do receptor mediada por BIIB059

[350] A ligação de BDCA2 com o mAb anti-BDCA2 (clone AC144, Miltenyi) foi mostrada para induzir rapidamente a internalização do receptor (Dzionek A. et al, J. Immunol, 165 (11): 6037 a 46 (2000)). O experimento seguinte foi dirigido para determinar a cinética da interna- lização de BDCA2 mediada por BIIB059.

[351] O sangue total humano foi tratado com 10, 1, 0,1 ou 0,01 μg/mL de BIIB059 ou um controle de isotipo (10 μg/mL) a 37°C durante os períodos indicados e, em seguida, incubado durante 30 minutos a 4°C com bloqueio não cruzado de FITC anti-BDCA2 mAb (clone 2D6) e anti-HLADR, anti-CD123, anti-CD14 e anti-CD20. Os glóbulos vermelhos (RBC) foram lisados usando tampão de lise 1X Easy (BD Bioscience) e as células remanescentes fixadas. Mostrada na Figura 19A é a intensidade de fluorescência (IMF) dos valores médios de coloração de 2D6-FITC de CD14- CD20-HLA-DR + CD123 + pDCs fechado. FMO (fluorescência menos um controle) consistiu no coquetel de coloração FACS menos 2D6-FITC. Os dados nesta figura são um experimento representativo de três experimentos independentes realizados.

[352] Como mostrado na Figura 19A, após incubação com BIIB059 a 1 μg/mL, a intensidade de coloração de 2D6 marcado com FITC diminuiu rapidamente atingindo os níveis de base dentro de uma hora de incubação a 37°C. Uma concentração dez vezes menor de BIIB059 (0,1 μg/mL) afetou a cinética de endocitose atrasando-o por 2 horas. Isso demonstra que BDCA2 é internalizado mediante a ligação com BIIB059 com doses cinético dependentes.

[353] O seguinte experimento foi realizado para verificar se a in- ternalização do receptor mediada por BIIB059 afetou a inibição de IFN. O sangue total foi colhido a partir de sangue venoso heparinizado de doadores saudáveis e pré-incubado com BIIB059 (para permitir a in- ternalização do receptor) ou para a duração indicada do isótopo. Em cada ponto de tempo após a pré-incubação, as células foram desafiadas com 200 μg/mL CPGA e incubadas durante mais 18 horas a 37°C. Os sobrenadantes foram recolhidos para uso em ensaios de ELISA de IFNa (PBL InterferonaSource). Os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. A Figura 19B é um experimento representativo de três experimentos independentes realizados. Como mostrado na Figura 19B, após 9 horas, a pré-incubação com BIIB059 antes da estimulação - correspondente a internalização máxima - não afetou a inibição de IFN sugerindo que a endocitose de BDCA2 e a inibição TLR9 estão potencialmente ligadas. Para testar esta hipótese anti-BDCA2 mAbs foram usados os quais foram incapazes de mediar a inibição à IFN e demonstraram falta de internalização. Além disso, os presentes inventores mostraram anteriormente que a ligação bivalente era necessária para inibição de IFN mediada por anti-BDCA2. Na verdade, o fragmento Fab não conduziu a internalização ou inibição de IFN. Tomados em conjunto, estes dados levantam a possibilidade de que a inibição de BDCA2 mediada por TLR9 requer endocitose e localização em compartimentos contendo TLR9 endossomais. Esta hipótese pode ser testada usando imagens ao vivo para acompanhar a inter- nalização de BDCA2 e tráfico de célula após a ligação de BIIB059.

Exemplo 28. Função efetora do anticorpo

[354] O domínio Fc de BIIB059 é uma IgG1 humana totalmente glicosilada, e é competente para ligar ambos os receptores celulares e Fcy complementares, e para induzir as respostas de células efetoras imunitárias celulares, tanto através de citotoxicidade dependente do antígeno (ADCC) quanto a citotoxicidade dependente do complemento (CDC). A fim de confirmar a ligação de BIIB059 aos receptores Fc, as afinidades de ligação relativas foram medidas usando a tecnologia de Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificado (alfa) da Perkin Elmer (Figura 20). O ensaio foi realizado em um formato competitivo, no qual as diluições em série dos anticorpos de teste foram incubadas com as proteínas de fusão do receptor-GST e contas aceitadoras anti-GST durante a noite a 4°C em uma placa de 96 poços. As contas doadoras de estreptavidina e IgG1 biotinilado do tipo selvagem também foram incubadas durante a noite a 4°C em um tubo separado e, em seguida, adicionadas à placa de ensaio no dia seguinte. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 h com agitação suave e lidas em um leitor de placas Envision (Perkin Elmer). Os dados foram representados para uma curva de ajuste de 4 parâmetros usando o software Graphpad Prism para calcular os valores de IC50, a fim de determinar as afinidades de ligação relativas. Os valores de IC50 de BIIB059 para FcyR1: 0,03 μg/mL, FcyR11a: 11 μg/mL FcyR11b: 17 μg/mL FcyR111a: e 3 μg/mL foram calculados. Estes valores estão em linha com aqueles observados para outros anticorpos IgG1 humana neste ensaio. Foram determinados os estudos dos valores de IC50 para a versão de função efetora de G4P/G1 de baixo agli de 24F4 usados no cino. Como esperado, não foi detectada a ligação FcyR11a, FcyR11b, e FcyR111a e ligação a FcyR1 foi reduzida em 100 vezes. O anticorpo 5C8 tanto nas estruturas de IgG1 WT quanto G4P/G1 agli foram incluídos nos ensaios como comparadores.

Exemplo 29. Fixação de Complemento

[355] O anticorpo de revestimento de alvos tem sido demonstra do para mediar os mecanismos de matança potentes via ADCC ou CDC. Estas funções efetoras de anticorpos são mediadas por meio da região Fc de anticorpo. Este experimento foi dirigido para testar a capacidade de BIIB059 recrutar complemento, testando a sua ligação a C1q por ELISA.

[356] O ensaio de ligação de C1q foi realizado em um formato de ELISA de 96 poços, usando as placas de ELISA Maxisorb. O anticorpo de teste foi revestido em uma série de diluições de 3 vezes em PBS a partir de 15 μg/mL durante a noite a 2 a 8°C e as poços foram então lavados com PBS, 0,05% de Tween 20 e bloqueadas com 200 μL de Na fosfato a 0,1 M de pH 7,2, NaCl a 0,1 M, 0,1 % de gelatina, 0,05% de Tween 20. Em seguida, 50 μL /poço de 2 μg/mL de Complemento de Tecnologia C1q humano (A099) foi diluído em tampão de blo- queio/diluente e incubado durante 2 h à temperatura ambiente. Após a aspiração e lavagem como acima, 50 μL/poço de IgY de galinha de C1q anti-humano (produção customizada de Aves Labs, Inc, usando C1q humano Sigma, C0660) diluído 8000 vezes em tampão de blo- queio/diluente, foi adicionado. Após incubação durante 1,5 h à temperatura ambiente as poços foram aspiradas e lavadas como anteriormente. F (ab’) 2 conjugado de asno de antigalinha IgY HRP (Jackson ImmunoResearch 703-030-155) diluído a 5000 vezes em blo- co/diluente foi então adicionado a 50 μL /poço e incubado durante 1 h à temperatura ambiente. Após aspiração e lavagem como acima, com 100 ul de substrato de TMB (TMB a 420μM, 0,004% de H2O2 em tampão de ácido de acetato de sódio/ácido cítrico a 0,1 M, pH 4,9) e incubado durante 2 min antes de paragem com 100 ul de ácido sulfúrico a 2N. A absorvância foi lida a 450 nm com um instrumento Softmax PRO e software Softmax foi usado para determinar a afinidade de ligação relativa (valor de C) com um ajuste de 4 parâmetros.

[357] A Figura 21 mostra que, enquanto BIIB059 é capaz de liga ção à C1q, 24F4A IgG4.P/IgG1 agly é essencialmente desprovido de se ligar a C1q.

Exemplo 30. Estudos de depleção de células

[358] BIIB059 inibe potencialmente IFN do tipo I e a produção de IL-6 após ligação a BDCA2. Além da sua atividade agonista, estes ex-perimentos foram realizados para avaliar se BIIB059 poderia esgotar pDCs rolamento e BDCA2 em virtude do sua Fc funcional. Para investigar a potência citotóxica de BIIB059, a sua atividade em ensaios de ADCC e CDC foi testada.

a) Ensaio de ADCC

[359] ADCC é um mecanismo pelo qual uma célula efetora do sistema imunitário lisa ativamente em uma célula alvo, cujos receptores de superfície têm sido ligados por anticorpos (Figura 22).

[360] A linhagem celular CHO (EAG2456 T1F2 Clone 34.16.7) foi usada como a célula-alvo. O nível de expressão de BDCA2 na superfície de células CHO, foi determinado por FACS usando um anticorpo anti-BDCA2 mAb marcado com APC (clone AC144, Miltenyi). As célu- las NK foram usadas como as células efetoras e foram separadas a partir de sangue total por meio da seleção negativa usando o coquetel de Enriquecimento celular de NK humanas da RosetteSep ™ (Stem Cells). Após uma incubação de 20 minutos com o coquetel à temperatura ambiente, as células NK foram isoladas por meio da centrifugação em gradiente de Ficoll descontínua ao longo do tempo. As células CHO e as células NK humanas foram inoculadas a uma razão de 5: 1 (NK: CHO), na presença de efetores mAbs anti-BDCA2 competentes (24F4S e BIIB059), mAbs incapacitados de Fc (24F4S-Agly e 24F4A- Agly) ou controle de isotipo IgG1 e incubadas durante 4 horas a 37°C. O controle negativo consistiu em poços contendo células CHO e NK sem anticorpos. As células NK e CHO lisadas com Tx-100 foram usadas para determinar morte máxima. ADCC foi avaliada usando o kit de Ensaio de Citotoxicidade Vybrant (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. O ensaio detecta G6PD de células danificadas com base na redução dependente da G6PD de resazurina que emite fluorescência a 590 nm após excitação a 530 nm. O ensaio de ADCC representado na Figura 22 no painel A foi realizado usando de células de CHO com elevada expressão de BDCA2 (painel C), enquanto o ensaio de ADCC na Figura 22, painel B, usou as células de CHO com menor expressão de BDCA2 (painel D).

[361] 24F4S levou a 100% do assassinato de rolamento de BDCA2 das células CHO semelhantes a triton X lise. Como esperado, a versão aglicosilada do mAb (24F4S-agly) não conduziu a ADCC (Figura 22A). Quando comparado com 24F4S, BIIB059 tinha uma atividade de ADCC idêntica (Figura 22 B). De nota, a eficiência da morte correlacionou-se com o nível de expressão de BDCA2 em células CHO (Figura 22C e Figura 22D).

b) Ensaio de CDC

[362] Em citotoxicidade dependente do complemento (CDC), C1q se liga ao anticorpo que desencadeia a cascata do complemento e que conduz à lise celular (Figura 23). Como mostrado na seção do Exemplo 29, BIIB059 pode eficientemente ligar o complemento componente C1q. Este experimento foi realizado para confirmar que BIIB059 pode mediar CDC.

[363] As células transfectantes estáveis CHO BDCA2/FcεRlY (EAG2456 T1F2 Clone 34.16.7) foram semeadas a 5 x 104 células em placas de 96 poços de colágeno de poços pretos e incubadas a 37 oC durante 48 horas. As placas foram então lavadas e incubadas com complemento de soro de coelho e de iodeto de propídio (PI) na presença de efetores anti-BDCA2 mAbs competentes (24F4S e BIIB059), a função efetora de mAbs deficientes (24F4S-Agly e 24F4A-Agly) ou controle de isotipo de IgG1 durante 1 h a 370°C. O controle negativo consistiu nas poços contendo as células CHO, complemento de soro de coelho, e iodeto de propídio (PI) sem anticorpos. As células NK e CHO lisadas com t-100x foram usadas para determinar morte máxima. As placas foram lidas usando leitor de placas de fluorescência Cyto- flour (EX530/em645). Anti-BDCA2 mAbs (BIIB059 e 24F4S) levou à morte celular por CDC semelhante ao Triton lise. Como esperado, mAbs aglicosilados deficientes de efetores (24F4S-Agly e 24F4A-Agly) não mediou CDC (Figura 23). BIIB059 tem potencial para esgotar pDCs de rolamento de BDCA2 em virtude da sua região Fc de IgG1 funcional. Enquanto BIIB059 é capaz de atividade citotóxica em BDCA2 sobre-expressando as células que não se esperam que empobreçam in vivo devido à internalização rápida, contínua, completa ou quase completa do receptor após ligação a BIIB059.

Exemplo 31. Clonagem de um Homólogo de rato de BDCA2 e Ras- treiamento de ligação por meio de BIIB059

[364] Quando a sequência de cDNA de BDCA2 humano é sopra da contra sequências de rato na base de dados do NCBI, o homólogo mais próximo é o Clec4b2 de rato, descrito no Número de acesso da GenBank NM_001005896. Para determinar se a ligação hu24F4 H4/L1 C95A mAb era capaz de se ligar a um homólogo de rato de BDCA2 humano, foram clonados cDNAs e construídos vetores de expressão para Clec4b2 de rato e FcεRlY de rato. Os Clec4b2 de rato de comprimento total das sequências de proteínas compartilham somente 51,0% de identidade com BDCA2 humano. O alinhamento com lacunas de BDCA2 humano (superior) e Clec4b2 de rato (inferior) é mostrado abaixo:

[365] Clec4b2 de rato foi clonado por RT-PCR a partir de baço de rato de primeiro filamento de CDNA com iniciadores 5’ GAC CTT CTG ATA AAT TGC GGC CGC CAT GAT GCA GGA AAA AC 3' (SEQ ID NO: 83) (o qual adiciona o local Notl 5’ e a sequência Kozak imediatamente antes do iniciador metionina Clec4b2) e 5’ CCC ACA GCC ATG GAG GAC ATC AGG CTC ATA AGT ATA TTT CT 3' (SEQ ID NO: 84) (o qual adiciona o local 3’ BamHI imediatamente após o terminador Clec4b2). A 0,64 kb do produto de RT-PCR ter sido purificado e sub- clonado no vetor de clonagem pCR2.1TOPO de Invitrogen, produzindo o constructo de pCN815, cujo inserto foi sequenciado. A mutagênese dirigida ao local foi realizada em modelo pCN815 com os iniciadores 5’ CAG GAT TTC ATC AAC GGA ATC CTA GAC CGT ACT TGG G 3' (SEQ ID NO: 85) e o seu complemento inverso, para corrigir um erro de PCR, resultando no constructo pCN822, cuja deduzida sequência de proteína de Clec4b2 foi confirmada como sendo idêntica ao NM_001005896. Um vetor de expressão de mamífero para o Clec4b2 de rato do cDNA de comprimento completo foi construído através da ligação a 0,64 kb do fragmento NotI-BamHI de pCN822 com o vetor da estrutura principal de 1,89 kb do fragmento Xbal-Notl e 4,17 kb do fragmento BamHI-Xbal a partir do vetor de expressão pV90, para produzir o vetor de expressão pCN834, cuja sequência de inserção de cDNA foi confirmada.

[366] O cDNA de FcεRlY de rato é descrito no número de acesso do Genbank NM_001131001. A sequência da proteína de FcεRlY de rato compartilha 90,7% de identidade com FcεRIY humano: o alinhamento, com humano (superior) e de rato (inferior) é mostrado abaixo:

[367] O cDNA de FcεRlY de rato foi clonado por RT-PCR a partir de baço de rato do primeiro filamento de CDNA com iniciadores 5’ CCC AGC TCG GCA GCC CGC GGC CAT CGC GAT CAC AGC GGT 3' (SEQ ID NO: 87) (o qual adiciona o local NotI e a sequência de Kozak imediatamente antes do iniciador metionina FcεRlY) e 5’ CAC GAA GTG TTG TCC TAT TGG GGA GGT GGT TTC TC 3' (SEQ ID NO: 88) (o qual adiciona o local 3’ BamHI imediatamente após o terminador FcεRlY). 0,27 kb do produto de RT-PCR foi purificado e subclonado do vetor de clonagem Invitrogen pCR2.1TOPO, produzindo o constructo pCN816, cujo inserto foi sequenciado e confirmado para ser idêntico ao NM_001131001. 0,27 kb NotI-BamHI de pCN816 foi ligado ao vetor da estrutura principal 0,66 kb do fragmento BamHI-XhoI e 4,16 kb do fragmentos de Xhol-Notl de pBHS103, para construir o vetor de expressão de mamífero pCN844, cuja sequência de inserção de CDNA de FcεRIY de rato foi confirmada.

[368] Para determinar se a ligação de hu24F4 H4/L1 C95A mAb era capaz de se ligar à superfície de Clec4b2 de rato, 293E células foram cotransfectadas transientemente com um vetor de expressão EGFP repórter (pEAG1458) em ambos os vetores de BDCA2/FcεRIY humano (e pEAG2420 pEAG2413) quanto os vetores Clec4b2/FcεRIY de ratos (pCN834 e pCN844) a proporções molares 1: 1: 1. Aos 3 dias após a transfecção as células ter sido colhida e corada com a hu24F4 H4/L1 C95A mAb em uma titulação de diluição de FACS direta do ensaio de ligação, gerando as células EGFP positivas in vivo. Embora tenha sido observada ligação por hu24F4 à superfície BDCA2 humano de elevada afinidade, nenhuma ligação à superfície Clec4b2 de rato foi detectada. Isto indica que hu24F4 não tem reatividade cruzada para o homólogo de rato de BDCA2 humano mais próximo.

Exemplo 32. A administração de BIIB059 para Macacos cinomólo- gos Saudáveis resulta em perda de BDCA2 a partir da superfície celular plasmocitoide dendrítica, provavelmente através da Inter- nalização

[369] A fim de avaliar se os níveis de superfície de BDCA2 alte rada mediante a administração de BIIB059 de macacos cinomólogos, foram usados dois ensaios. O primeiro ensaio, o chamado método "direto", detecta a superfície BIIB059 ligada com um anticorpo secundário marcado com PE anti-humano. Idealmente, um anticorpo de bloqueio não cruzado a BDCA2 seria usado para detectar BDCA2 total; No entanto, um tal anticorpo não existe. Dessa maneira, no segundo ensaio, o chamado método "indireto", BDCA2 desocupado é detectado através da adição de BIIB059 conjugado com A647.

[370] Antes da administração de qualquer um dos artigos de teste, para cada macaco cinomólogo, a máxima intensidade de fluorescência média (IFM) por Ligação de BIIB059 ao pDCs foi fixada em 3 pontos de tempo diferentes (dias -3, -2 e -1, antes da injeção única de BIIB059). Em cada ponto de tempo, a titulação de BIIB059 não marcada (40 a 0,04 μg/mL concentração final) foi adicionada a alíquotas de sangue, e BIIB059 foi detectada usando um anticorpo secundário marcado com PE (método "direto"), ou BDCA2 livre avaliado com BIIB059 -A647 (método "indireto"). Os valores máximos foram tomados a partir dos valores no patamar em cada ensaio (Figuras 24 e 25). A avaliação dos valores revelou flutuação muito modesta na máxima de MFI para cada macaco cinomólogo, com maior variação entre os macacos ci- nomólogos, mostrando que a densidade de BDCA2 em pDCs em macaco cinomólogo é variável (tabela 2).Tabela 2. Resumo da EC50 média de ligação de BIIB059 à superfície celular em BDCA2 pDCs em sangue total dos macacos cinomólogos

[371] O sangue total foi elaborado a partir de doze macacos ci-nomólogos, uma vez por semana, três semanas no total. O sangue foi incubado com várias concentrações de BIIB059 de IgG1 humana (0,04 a 40 μg/mL, 6-ponto da curva, 1: 4 diluições). pDCs foram identificados por meio da citometria de fluxo como CD20-CD14-CD123 + HLA-DR +, e tratados com anti-IgG humana marcada com PE para detectar BIIB059 secundário ligado ao receptor BDCA2 em pDCs. MFI de PE foi calculado com software FlowJo, e curvas EC50foram geradas em software GraphPad Prism

[372] Após a administração do veículo, nenhum BIIB059 foi en contrado como esperado, e nenhuma alteração significativa nos níveis de BDCA2 foi encontrada como avaliado por meio da ligação de BIIB059-A647 (10 μg/mL) (Figura 26).

[373] Após a administração intravenosa (IV), a administração de BIIB059 em 10 mg/kg ou 1 mg/kg, nenhum BIIB059 foi detectado na superfície, mesmo tão cedo quanto uma hora após a injeção de BIIB059 (Figuras 27 e 28). Além disso, não houve nenhum BDCA2 livre como avaliado pela ausência de BIIB059-A647 através de 38 dias para todos os macacos cinomólogos tratados, com a exceção de macaco cinomólogo 5; as concentrações séricas neste macaco cinomólo- go caíram rapidamente no Dia 10, provavelmente devido a imunogeni- cidade desenvolvida contra BIIB059.

[374] Após a administração subcutânea de uma dose mais baixa de BIIB059 (0,2 mg/kg), BIIB059 brevemente foi observado na superfície de PDC (em 1 hora, desapareceu por 6 horas). Ao mesmo ponto de tempo (1 hora), algum BDCA2 livre foi observado (13%, 74%, 72% da linha de base IMF). Mais uma vez, nenhum fármaco foi detectada ao longo do resto do estudo, e nenhum receptor BDCA2 livre foi detectado até 14 dias após a injeção BIIB059 (Figura 29).

[375] Em todos os macacos cinomólogos, o reaparecimento de BDCA2 livre coincidiu com uma queda nos níveis séricos de fármacos inferiores a 1 ng/mL (figuras 30 e 31). Dessa maneira, 1 μg/mL parece ser a concentração mínima de BIIB059 necessário para mediar a in- ternalização de toda a superfície de BDCA2.

[376] A Tabela 3 resume a internalização de EC10, EC50, EC90 e do receptor BDCA2 em pDCs mediante a ligação com BIIB059 em sangue total de macaco cinomólogo. As curvas de EC10-50-90 foram geradas em software GraphPad Prism usando um ajuste de quatro parâmetros.

[377] Para resumir, os experimentos descritos neste exemplo mostram que: na administração IV in vivo de doses elevadas (10 e 1 mg/kg) BIIB059 conduziu ao desaparecimento rápido de ambos BDCA2 e fármaco ligado a partir da superfície da célula disponíveis, o que sugere a internalização do receptor. A administração subcutânea de uma dose baixa (0,2 mg/kg) de BIIB059 resultou em uma detecção muito transiente (a 1 h) de BIIB059 na superfície de PDC. Após 6 horas, nenhum BIIB059 era detectável na superfície celular de PDC. O reaparecimento de BDCA2 disponível na superfície celular ocorreu quando a exposição ao fármaco diminuiu abaixo de 1 μg/mL.

Exemplo 33: BIIB059 inibe os mediadores pró-inflamatórios, além de todos os tipos de IFN do tipo I

[378] A ligação a BDCA2 suprime a capacidade de PDC para produzir IFN do tipo I em resposta a ligantes de TLR (vide Figura 16). Para confirmar a atividade inibidora do mAb anti-BDCA2, BIIB059, pDCs purificados a partir de doadores humanos saudáveis foram estimulados com o ligante sintético TLR9, CpG-A, na presença de 10 μg/mL BIIB059 ou mAbs de controle do isotipo. Especificamente, pDCs de doadores saudáveis humanos foram isolados usando o procedimento de separação de contas magnéticas de duas etapas (kit MACS, Miltenyi Biotec). 5 x104 de pDCs/poço humanos purificados foram deixados sem tratamento (Media) ou foram estimulados com 1 um de TLR9 ligante (CPG-A) na presença de ou 10 μg/mL de BIIB059 (CpG- A + BIIB059) ou controle de isotipo (CpG-A + Iso). As placas contendo pDCs foram incubadas durante 18 horas a 37°C e os sobrenadantes colhidos para a utilização em ELISA ou ensaios multiplex para medir as concentrações de citocinas inflamatórias e quimiocinas. Estes experimentos mostraram que BIIB059 potentemente inibiu IFNa induzida por TLR9 e outras citocinas derivadas de pdc, tais como TNFa e IL-6, bem como quimiocinas induzidas po TLR-9, tais como CCL3, CCL4,CCL5 (Figura 32).

[379] A capacidade de BIIB059 para inibir a produção de IFNa e mediadores pró-inflamatórios após a estimulação com um ligante fisio- logicamente relevante, de complexos imunitários, também foi investigada. Especificamente, os complexos imunes (IC) de Sm/RNP foram pré-formados através da mistura de SM-RNP a partir de timo de vitelo e soros da forma purificada de anticorpos anti-RNP de pacientes com SLE, durante 1 h em meio isento de soro. pDCs de doadores saudáveis humanos foram isolados usando o procedimento de separação de contas magnéticas de duas etapas (kit MACS, Miltenyi Biotec). 5 pDCs x104/poço foram deixados sem tratamento (Media) ou foram estimulados com IC de Sm/RNP pré-formado na presença quer de 10 μg/mL de BIIB059 (IC + BIIB059) ou controle de isotipo (IC + Iso). As placas contendo pDCs foram incubadas durante 18 horas a 37°C e os sobre- nadantes colhidos para utilização em ELISA ou ensaios multiplex para medir as concentrações de citocinas inflamatórias e quimiocinas. Estes estudos mostraram que BIIB059 potentemente inibiu os complexos imunes de Sm/RNP induzidos por IFNa e de outras citoquinas derivadas de pDC, tais como TNFa e IL-6. BIIB059 também inibiu as quimio- cinas induzidas por meio dos complexos imunes de SM/RNP, tais como CCL3 e CCL4 (Figura 33).

Exemplo 34: BIIB059 inibe a transcrição induzida por IC de Sm/RNP de subtipos de IFN tipo I por pDCs humanos purificados

[380] Treze subtipos de IFNa e um único membro de IFNB exis tem em seres humanos. O efeito da BIIB059 na transcrição de subti- pos de IFN do tipo I em IC de Sm/RNP estimulada por pDCs de doadores humanos saudáveis foi avaliado por meio em ensaios de reação em cadeia da polimerase qualitativa (qPCR).

[381] Os complexos imunes (IC) de Sm/RNP foram pré-formados através da mistura de SM-RNP a partir de timo de vitelo e de anticor- pos anti-RNP purificados a partir de soros de pacientes com SLE, durante 30 minutos em meio isento de soro. pDCs de doadores saudáveis humanos foram isolados usando o procedimento de separação de contas magnéticas de duas etapas (kit MACS, Miltenyi Biotec). 7,5 x105 de pDCs/poço purificados humanos foram deixados sem tratamento (Media) ou foram estimulados com IC pré-formado de Sm/RNP na presença quer de 10 μg/mL de BIIB059 (IC + BIIB059) quanto controle de isotipo (IC + Iso). As placas contendo pDC foram incubadas durante 16 horas a 37°C e 5% de CO2. Ascélulas de pDC foram colhidas e o RNA foi isolado a partir de pDC para avaliação de reação qPCR.

[382] Este experimento mostrou que o tratamento com BIIB059 inibiu o nível de transcrição de todos os subtipos de IFN do tipo I testados (Figura 34).

Exemplo 35: BIIB059 inibe a produção de IFNa induzida por TLR9 por PBMC humano de doadores saudáveis e pacientes com SLE

[383] pDCs são os principais produtores de IFN em resposta à estimulação de TLR7 e TLR9. pDCs podem produzir mil vezes mais IFN do que qualquer outro tipo de célula. Este experimento investiga se BIIB059 poderia inibir a produção de IFN-TLR9 induzida em culturas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) sem a necessidade de isolamento de pDC. PBMC de doadores humanos saudáveis ou pacientes com SLE foram estimuladoas com 1 ou 5 μM do ligante de TLR9 (CpG-A) e tratadas com concentrações de BIIB059 variando de 10 ng/mL a 2 ng/mL em um volume total de ensaio de 250 μL/bem. As placas foram incubadas durante a noite (18 horas) a 37°C e 5% de CO2. Os sobrenadantes foram recolhidos para avaliação em ensaios de ELISA de IFNa.

[384] Este experimento mostrou que BIIB059 inibiu a produção de IFNa induzida por TLR9 por PBMC de doadores saudáveis com um IC50 médio de 0,04 +/- 0,05 ng/mL (Figura 35A e 35C). BIIB059 apresentou potência semelhante à da inibição da produção de IFNa induzida por TLR9 de PBMC de pacientes com SLE com um IC50 média de 0,03 +/- 0,01 ng/mL (Figura 35B e 35C).

Exemplo 36: BIIB059 inibe a produção de IFNa em sangue total estimulado com TLR9 Ligante

[385] A atividade de BIIB059 também foi avaliada em ensaios de sangue total (WBA). O sangue total de doadores humanos saudáveis foi estimulado com TLR9 ligante na presença de concentrações crescentes de BIIB059 e o IC50 de inibição foi calculado para cada um dos doadores. Especificamente, o sangue total de doadores humanos saudáveis foi incubado com concentrações crescentes de BIIB059 variando de 10 ng/mL a 2 ng/mL ou de controle do isotipo, em um volume total de ensaio de 200 μL /poço. CpG-A foi adicionado a 75μg/mL (quadrado aberto), o qual foi determinado como sendo óptimo para a estimulação da produção de IFNa em sangue total. As placas foram incubadas durante 18 horas a 37°C e os sobrenadantes recolhidos para uso em ensaios de ELISA de IFNa (PBL InterferonaSource).

[386] BIIB059 mostrou uma inibição dose-dependente da produção de IFNa induzida por TLR9 em ensaios de sangue total e exibiu IC50 semelhante ao observado com culturas de PBMC (Figura 36).

Exemplo 37: BIIB059 não inibe a produção de IFNa induzida por TLR3 de PBMC humano a partir de doadores humanos saudáveis

[387] Este experimento foi realizado para determinar se outros tipos celulares desencadeados com diferentes ligantes de TLR ainda são capazes de produzir IFN do tipo I mesmo na presença de BIIB059. TLR3 não é expresso em pDCs e, por conseguinte, o TLR3 ligante não induz a produção de IFN por pDCs. As PBMC de doadores saudáveis humanos foram estimuladas com poli: IC, que é um ligante de TLR3 que pode potencialmente induzir IFN do tipo I predominantemente por meio dos monócitos. Especificamente, PBMC de doadores humanos saudáveis foram estimuladas com 1 uM do ligante de TLR3 (poli I: C) e tratada com concentrações de BIIB059 que variam de 10 μg/mL a 0,5 ng/mL em um volume total de ensaio de 250 μL/poço em uma placa de 96 poços. As placas foram incubadas durante a noite (18 horas) a 37°C e 5% de CO2. 200 μL dos sobrenadantes foram recolhidos para avaliação dos níveis de IFNa por ELISA. Como mostrado na Figura 37, BIIB059 não causa impacto na produção de IFNa induzida por TLR3 por PBMC a partir de doadores humanos saudáveis.

[388] Para resumir, os Exemplos 33 a 37 mostram que BIIB059 pode inibir potentemente a interferona do tipo I estimulada por TLR-9 por meio de pDCs purificados, culturas de PBMC e sangue total. BIIB059 é igualmente potente na inibição interferona do tipo I induzida por TLR9 em pDCs de doadores humanos saudáveis e de pacientes com SLE. Além da inibição de IFN do tipo I, BIIB059 pode inibir a produção de outras citocinas e quimiocinas derivadas de PDC. BIIB059 inibe especificamente interferona do tipo I induzida por TLR9 em pDCs e não tem impacto sobre a produção de IFN por meio de outros tipos celulares acionados com um ligante TLR diferente. Portanto, os dados in vitro proporcionados na presente invenção apoiam a atividade farmacológica e a potência de BIIB059 em adição à sua especificidade para IFN do tipo I induzida por TLR7/9 de pDCs.

Exemplo 38: BIIB059 medeia Internalização de BDCA2 de pDCs humanos

[389] Para determinar se BIIB059 induz a internalização de BDCA2, o sangue total humano a partir de 10 doadores humanos saudáveis foi incubado com concentrações crescentes de BIIB059 a 37°C durante 16 horas. O BDCA2 da superfície de células remanescente foi detectado usando um bloqueio não cruzado anti-BDCA2 mAb (clone 2D6) marcado com FITC.

[390] Especificamente, o sangue total a partir de 10 doadores humanos saudáveis foi incubado com concentrações crescentes de BIIB059 ou 10 μg/mL de anticorpo de controle de isotipo durante 16 horas a 37°C e CO2 a 5 % e, em seguida, incubado durante 30 minutos a 4°C com um bloqueio não cruzado anti-BDCA2 mAb (clone 2D6) marcado com FITC e anti-HLA-DR, anti-CD123, anti-CD14 e anti- CD20. O sangue total foi, em seguida, incubado durante 30 minutos a 4°C com 50 μL de uma solução de coloração, que incluiu os seguintes mAbs: bloqueio não cruzado anti-BDCA2 mAb (clone 2D6) marcado com FITC, anti- CD123, anti-CD14 e anti-CD20. Os glóbulos vermelhos (hemácias) foram lisados usando tampão 1X lise/correção (BD Bioscience).

[391] Como mostrado na Figura 38, BIIB059 levou a uma dimi nuição dependente da dose na intensidade de coloração 2D6 marcado com FITC, com uma média de EC50 de 0,017 ± 0,005 μg/mL

Exemplo 39: BDCA2 é rapidamente internalizado mediante a ligação com BIIB059

[392] Para determinar os cinéticos de internalização BDCA2 in duzida por BIIB059, o sangue total humano foi incubado com diferentes concentrações de BIIB059 a 37°C durante vários períodos. Especi-ficamente, o sangue total foi tratado com 10, 1, 0,1 ou 0,01 μg/mL de BIIB059 ou um anticorpo de controle de isotipo (10 μg/mL) a 37°C durante os períodos indicados. O sangue total foi, em seguida, incubado durante 30 minutos a 4°C com 50 μL de uma solução de coloração, que incluiu os seguintes mAbs: bloqueio não cruzado anti-BDCA2 mAb (clone 2D6) marcado com FITC e anti-HLA-DR, anti- CD123, anti- CD14 e anti-CD20. Os glóbulos vermelhos (hemácias) foram lisados e fixos usando tampão 1X Lise/correção (BD Bioscience). Como mostrado na Figura 39, após incubação com BIIB059 a 1 μg/mL a intensidade de coloração de 2D6 marcado com FITC diminuiu rapidamente atin- gindo os níveis de base dentro de uma hora de incubação. A incubação com uma concentração dez vezes inferior a BIIB059 (0,1 μg/mL) atrasou a internalização de BDCA2 por 2 horas. Estes dados mostram que a taxa de internalização de BDCA2 é dependente da dose de BIIB059.

Exemplo 40: BIIB059 induz a Internalização de BDCA2 em células dendríticas de plasmocitoides Humanas

[393] Para visualizar a internalização de BDCA2 após a ligação com BIIB059, pDCs purificados foram incubados com BIIB059 marcado com A647 e analisados por meio da microscopia confocal. Como esperado, BDCA2 foi localizado na superfície de células de pDCs a 4°C. Após um curto período de incubação a 37°C, BDCA2 foi claramente detectado no interior das células (Figura 40).

Exemplo 41: Internalização não altera a inibição mediada por BIIB059 da produção de IFN-α

[394] Este experimento investigou se a internalização de BDCA2 altera a capacidade de BIIB059 para inibir a produção de IFN induzida por TLR9 em pDCs. As células foram pré-incubadas com BIIB059 a 37°C durante vários períodos correspondentes da internalização máxima BDCA2 e depois estimuladas com ligante TLR9 durante mais 18 horas. Especificamente, o sangue total foi colhido a partir de sangue venoso heparinizado de doadores saudáveis e pré-incubado com anticorpo de controle ou BIIB059 isótopo para a duração indicada. Em cada ponto de tempo após a pré-incubação, as células foram estimuladas com 200 ng/mL de ligante de TLR9 (CpG-A) e incubadas durante mais 18 horas a 37°C. Os sobrenadantes foram recolhidos para uso em ensaios de ELISA de IFNa (PBL InterferonaSource). Como mostrado na Figura 41, a pré-incubação com BIIB059 (até 9 horas) não alterou a capacidade de BIIB059 para inibir a produção de IFNa induzida por TLR9 em ensaios de sangue total de doadores humanos sau- dáveis. Estes dados sugerem que A internalização de BDCA2 pode ser necessária para a inibição da sinalização de TLR9.

Exemplo 42: EC50 de internalização de BDCA2 mediada por BIIB059 em PDCs se correlaciona com o IC50 de Inibição mediada por BIIB059 de IFNa induzida por TLR9 em pDCs nos ensaios de sangue total

[395] Para explorar melhor a relação entre a internalização de BDCA2 e a inibição da sinalização de TLR9, a potência de internaliza- ção de BDCA2 mediada por BIIB059 em pDCs e a inibição da produção de IFNa mediada pelos TLR em pDCs foi comparada em 10 doadores humanos saudáveis.

[396] Para avaliar a internalização de BDCA2 mediada por BIIB059, o sangue total foi incubado com BIIB059 durante 16 horas. O sangue total foi, em seguida, recolhido, lisado e a expressão BDCA2 foi avaliada por meio da citometria de fluxo usando o anticorpo de bloqueio não cruzado 2D6 conjugado com FITC. Para avaliar a inibição mediada por BIIB059 de IFNa induzida por TLR9 em pDCs, o sangue total foi incubado com concentrações crescentes de BIIB059 durante 16 horas na presença de um ligante de TLR9. Os sobrenadantes foram colhidos e avaliados por ELISA de IFNa. EC50 da internalização de BDCA2 mediada por BIIB059 foi de 0,02 μg/mL. O IC50 de inibição mediada por BIIB059 de IFNa induzida por TLR9 foi de 0,07 μg/mL. Uma correlação entre o EC50 de internalização de BDCA2 mediada por BIIB059 e o IC50 de inibição de BIIB059 de IFNa foi observada com um valor quadrado R de 0,57 (Figura 42).

Exemplo 43: a ativação de TLR9 induz a colocalização de BDCA2 com TLR9 e com o marcador LAMP1 Lisossomal

[397] Para testar a hipótese de que a inibição de TLR9 mediada por BIIB059 requer a internalização e localização de BDCA2 em com-partimentos endossomais/lisossomais contendo TLR9, a microscopia confocal foi usada para seguir a distribuição intracelular de BDCA2 após a Ligação de BIIB059. pDCs humanos purificados foram cultivados durante 7 dias e incubados com BIIB059 marcado com A647 durante 15 min a 37°C. Durante os últimos 10 min de incubação, as células foram tratadas com 1 uM do ligante de TLR9 CpG-A, ou deixadas sem tratamento. As células foram coradas com anticorpos marcados com fluorescência para TLR9 e o marcador endossomal/lisossomal tardio, marcador LAMP1, e analisadas por meio da microscopia confocal.

[398] TLR9 foi recrutado para um compartimento endosso- mal/lisossomal tardio após a estimulação com ligante TLR9, tal como evidenciado por meio de um aumento da colocalização de TLR9 com LAMP1 (Figura 43). A estimulação TLR9 também aumentou significati-vamente a fração de colocalização de BDCA2 com TLR9 e LAMP1. Estes resultados sugerem que BIIB059, quando ligado a BDCA2, de preferência localiza para os compartimentos intracelulares onde TLR9 ativado está presente.

[399] Em suma, os Exemplos 38 a 43 mostram que BIIB059, um anticorpo monoclonal humanizado contra BDCA2, engata BDCA2 e leva a sua internalização. Após a estimulação, BDCA2 co-localiza-se com TLR9 no compartimento endossomal/lisossomal, onde medeia a inibição da sinalização de TLR9. Estes dados sugerem que a internali- zação de BDCA2 é uma etapa necessária para mediar a inibição de mediadores pró-inflamatórias induzidos por TLR9 por meio de pDCs. Exemplo 44: Efeito de BIIB059 sobre os níveis de CD62L

[400] pDCs circulantes expressam os níveis elevados de CD62L (L-selectina) e abrigam as vênulas endoteliais altas (VHE) moleculares contendo tecido linfoide. PNAd é um ligante para CD62L que é consti-tutivamente expresso em HEV e medeia o abrigo de células CD62L que expressam o tecido linfoide organizado. PNAd foi encontrado para ser expresso por meio das células endoteliais em lesões dérmicas lúpus eritematoso cutâneas. Em virtude de sua expressão CD62L, os pDCs poderiam ser recrutados para os tecidos periféricos inflamados que expressam PNAD.

[401] Para determinar se BIIB059 apresenta impactos em relação à expressão de CD62L na superfície de pDCs humanos, o sangue total foi tratado com concentrações variadas de BIIB059 durante 1 hora a 37°C, sem estimulação. Especificamente, o sangue total de doadores humanos saudáveis foi tratado com concentrações crescentes de BIIB059 durante 1 hora a 37°C e 5% de CO2. O MFI de CD62L foi determinado por meio do enganjamento em pDCs como definido por CD14-, CD20-, HLA-DR + e CD123 +.

[402] BIIB059 causou uma diminuição dependente da dose, na expressão de CD62L na superfície de pDCs humanos conforme avaliado por meio da citometria de fluxo (Figura 44). A estimulação de pDCs com TLR ligante não impactou a expressão de CD62L (Figura 44A).

Exemplo 45: Tratamento de PBMC com GM6001 Inibe o derramamento de CD62L Mediada por BIIB059 a partir da superfície de pDCs humanos

[403] As metaloproteinases são conhecidas por induzir o derra mamento de CD62L a partir da superfície de células imunitárias. Para investigar se as metaloproteinases estão envolvidas na diminuição de superfície de CD62L mediada por BIIB059, as PBMC foram preparadas a partir de doadores humanos saudáveis e pré-tratados com o GM6001 (um inibidor de metaloproteinase) durante 30 minutos a 37°C e CO2 a 5 %, seguido por meio da adição de 10 μg/mL de BIIB059 durante 1 hora. A expressão de superfície de CD62L foi ensaiada por meio da citometria de fluxo. GM6001 inibiu a baixa modulação de CD62L mediada por BIIB059 de uma forma dependente da dose (Figu- ra 45). Estes dados sugerem que BIIB059 induz o derramamento de CD62L de uma maneira dependente da metaloproteinase.

[404] Em suma, os Exemplos 44 e 45 mostram que BIIB059 di minui a expressão de CD62L na superfície de pDCs humanos. A baixa modulação de CD62L mediada por BIIB059 é inibida por meio do inibidor da metaloproteinase (GM6001) indicando que BIIB059 induz o derramamento de CD62L a partir da superfície de pDCs humanos, devido, pelo menos em parte, da ativação das metaloproteinases. Por conseguinte, é esperado que o tratamento com BIIB059 venha a reduzir ou impedir o tráfico de pDCs aos órgãos alvo em SLE.

Exemplo 46: Impacto da região Fc de BIIB059 na Produção de IFN Mediada por meio do imunocomplexo por Células Dendríticas plasmocitoides

[405] O receptor gama Fc IIA (CD32A) é uma proteína de super fície celular que se liga a IgG com baixa afinidade. As células dendríti- cas plasmocitoides humanas expressam exclusivamente o receptor gama Fc IIA, CD32A. A estimulação dos pDCs com complexos imunes demonstrou ser dependente de CD32. Os complexos imunes são internalizados por CD32 e estimulam TLR7/9 endosomal para induzir a produção de IFN por pDCs.

[406] Para determinar o efeito de BIIB059 na superfície de ex pressão de CD32A, os pDCs isolados foram tratados com concentrações crescentes de BIIB059 ou a forma do anticorpo aglicosilada, 24F4-A, e incubados durante 16 horas a 37°C. Os pDCs foram então corados com FITC BDCA2 e anti-CD32 (clone AT10) marcados com PE e a expressão de superfície de CD32 e BDCA2 foi avaliada por meio da citometria de fluxo. BIIB059 e a versão agli, 24F4-A, foram igualmente potentes na sua capacidade para induzir a internalização de BDCA2 (Figura 46A). Apenas BIIB059 foi capaz de induzir a baixo modulação de CD32 na superfície celular de pDCs, como indicado pe- la diminuição dependente da dose na intensidade fluorescente média (IFM) de CD32 (Figura 46 BD). O tratamento com controle isotipo de efetor competente não teve efeito sobre os níveis de superfície CD32 (Figura 46). Estes dados indicam que a baixa modulação dos níveis de CD32A na superfície de pDCs mediados por BIIB059 é específica para a ligação da região Fc de BIIB059.

[407] Para assegurar que a ligação da região Fc de BIIB059 não se limite a mascarar o epítopo de CD32 reconhecido pelo anti-CD32 mAb marcado com FITC, os pDCs foram tratados com 10 μg/mL de BIIB059 durante 1 hora a 4°C ou 37°C e em seguida corados com anticorpo anti-CD32. Como mostrado na Figura 46E, o tratamento com BIIB059 a 4°C não diminuiu o IMF de CD32, indicando que o tratamento com BIIB059 não interfere com a ligação do anticorpo anti-CD32 mAb. O fato de baixa modulação de CD32A ter ocorrido apenas após incubação a 37°C com BIIB059 sugere que CD32A poderia ser perdida a partir da superfície celular de pDCs.

[408] Para determinar se a baixa modulação de CD32A por BIIB059 tem um impacto biológico, os pDCs foram incubados na presença de concentrações crescentes de BIIB059 ou na forma aglicosi- lada, 24F4A-Agly, e estimulados com complexos imunes ou o ligante sintético (TLR9 CPG- A). Como esperado, BIIB059 e 24F4A-Agly eram indistinguíveis na sua capacidade para inibir a IFNa induzida por CPG- A por pDCs, que é independente de CD32 (Figura 47A). Houve uma clara separação em potência entre BIIB059 e 24F4A-agly quando os pDCs foram estimulados com complexos imunes. BIIB059 inibiu o complexo imune induzido por IFNa com um IC50 de 0,04 em comparação com um IC50 de 1,4 μg/mL por 24F4A-Agly. (Figura 47B). Estes dados indicam que BIIB059 apresente baixa modulação de CD32A em virtude do seu Fc funcional e, por conseguinte, inibe a estimulação de pDCs por meio dos complexos imunes.

[409] Para confirmar que a baixa modulação de CD32A era única para BIIB059, foi investigado o efeito de um anticorpo anti-CD40 hu-manizado totalmente sobre os níveis de CD32 e produção de IFNa mediada por imunocomplexo em pDCs. CD40 é uma proteína da superfície celular expressa em pDCs. Um anticorpo anti-CD40 com um Fc totalmente funcional possui a capacidade de envolver de CD40 e CD32 de se ligar na superfície de pDCs. O tratamento com mAb anti- CD40 não tinha efeito da expressão de superfície CD32 e qualquer efeito significativo sobre a produção de IFNa mediada por imunocom- plexo em pDCs (Figura 48A e B). A ligação do anti CD40mAb foi confirmada por meio da demonstração de engajamento de CD40 máximo em células anti-CD40 tratadas (Figura 48C).

[410] Como mostrado anteriormente, a ligação de BDCA2 com BIIB059 ou a forma aglicosilada 24F4A-Agly leva a internalização do receptor e a inibição da IFNa induzida por TLR9 em pDCs. Neste estudo, os presentes inventores mostraram que BIIB059 provoca a modulação de CD32A em pDCs e a inibição produção de IFNa mediada por imunocomplexo em pDCs de uma forma dependente de Fc. A baixa modulação de CD32A desencadeada por BIIB059 não resulta de apenas qualquer anticorpo com uma Fc funcional que se pode ligar a uma molécula de superfície celular expressa em pDCs. Este estudo destaca o potencial terapêutico de um anti-BDCA2 mAb efetor competente, que pode umedecer as respostas de pDCs através das suas regiões Fab'2 e Fc levando a um aumento da eficácia.

Exemplo 47: Interação de BIIB059 com hidroxicloroquina (HCQ)

[411] Os antimaláricos, tais como a hidroxicloroquina (HCQ), têm sido usados no tratamento de SLE. pDCs de pacientes com SLE tratados com HCQ têm prejudicado a capacidade de produzir IFN por estimulação com ligantes TLR7 e TLR9. Uma vez que ambos BIIB059 e HCQ impactam IFNa induzida por TLR7/9 em pDCs, foi investigado se o efeito de BIIB059 e HCQ poderia ser redundante.

[412] Para resolver esta questão, PBMC humanos foram prepa rados a partir de sangue de doadores saudáveis e estimulados com ligantes TLR7 ou TLR9 na presença de concentrações variáveis de BIIB059 sozinho, HCQ sozinho, ou em combinação de BIIB059 com HCQ. Os sobrenadantes foram colhidos após 18 horas e ensaiados para IFNa por ELISA. A adição de HCQ aumentou a potência de BIIB059 e conduziu a um efeito inibitório aditivo na produção IFNa induzida por TLR7 e TLR9 por PBMC a partir de doadores humanos saudáveis. Estes dados demonstram que a atividade de BIIB059 e HCQ não são redundantes e destaca o benefício terapêutico adicional de BIIB059 quando administrado com compostos antimaláricos tais como HCQ.

Exemplo 48: Efeito de BIIB059 em pDCs Expressando BDCA2 In Vivo

[413] O objetivo deste estudo foi determinar se a administração de BIIB059 para macacos cinomólogos medeia o esgotamento dos pDCs no sangue periférico.

[414] Quatro pré-BIIB059 de dosagem de sangramentos foram coletados em intervalos semanais a partir de doze macacos cinomólo- gos para estabelecer uma frequência pDC de linha de base para cada animal (Tabela 3).Tabela 3. Sumário das frequências médias circulantes de PDC no sangue total dos macacos cinomólogos saudáveis.

[415] O sangue total foi elaborado a partir de doze macacos ci- nomólogos uma vez por semana para quatro semanas totais. Os pDCs foram identificados por meio da citometria de fluxo como CD20-CD14- CD123 + HLA-DR +. pDC como uma porcentagem de células CD20CD14- foi calculada com o software FlowJo.

[416] Em todas as análises estatísticas, as frequências pDCs foram logaritcamente transformadas para reduzir a assimetria (Figura 51). A distribuição original de frequências pDCs no painel esquerdo da Figura 51 foi severamente desviada para direita. No entanto, depois de uma transformação logarítmica, a distribuição das frequências pDCs transformadas (Figura 51, painel da direita) seguiram aproximadamente uma distribuição normal. Estes dados transformados em logaritmos foram usados para todos os métodos de análise estatística. A Figura 52 mostra os níveis de pDC em escala logarítmica para cada macaco cinomólogo ao longo de quatro pontos de tempo antes da injeção IV. Usando um modelo linear de efeitos mistos com quatro pontos no tempo como fatores fixos e interceptamentos aleatórios para os maca- coscinos, concluiu-se que as médias geométricas de porcentagens PDCs para todos os macacos foram iguais ao longo dos 4 pontos de tempo pré-dose (Figura 53, p-valor para o tempo com base em um F- teste: 0,67). Esta análise indicou que a média geométrica da porcentagem de pDCs circulante foi relativamente estável ao longo do tempo para macacos Cinomólogos.

[417] Nove destes doze macacos cinomólogos foram divididos em 3 grupos (3/grupo), e randomizados para incluir a representação igual de densidade BDCA2 e porcentagem de pDC em cada grupo. Os macacos cinomólogos receberam uma única injeção intravenosa de qualquer veículo (citrato de sódio), 10 mg/kg BIIB059, ou 1 mg/kg BIIB059. A citometria de fluxo foi usada para identificar os pDCs circulantes no sangue total como CD20-CD14-CD123 + HLA-DR +, e a frequência de PDC (em escala log) em cada ponto de tempo foi representada graficamente no software R (Figura 54). Um modelo linear de efeitos mistos equipado para fazer as frequências logarítmicas (PDC) usando interceptamentos aleatórios para macacos cinomólogos e efeitos fixos para o período de grupo da dose e do tempo: 1 hora, 6 horas, 1 a 27 dias, e superior a 28 dias. Para avaliar se pDC mudou entre os diferentes grupos de dose em diferentes períodos de tempo, um modelo preliminar também incluiu os termos de interação para grupo de dose e diferentes períodos de tempo. O valor-p com base no F-teste para testar todos os termos de interação igual a 0 é de 0,81, o que indica que não há nenhuma diferença para as alterações pDC entre os dife-rentes grupos de dose. Dessa maneira, o modelo final ajustado apenas incluía os efeitos estatisticamente significativos para o período de tempo e fatores grupo de dose (Tabela 4).Tabela 4. Estimativas do modelo equipado para os pontos de tempo após uma única injeção BIIB059 intravenosa ou veículo.

[418] As estimativas para os efeitos fixos usando um modelo li near de efeitos mistos usando os interceptamentos aleatórios para macacos cinomólogos e os fatores fixos para grupo de dose e níveis de tempo de 1 hora, 6 horas, e superior a 28 dias, a porcentagem circundante de pDC em escala logarítmica antes e depois da dose IV de veículo de citrato de sódio, BIIB059 a 1 mg/kg, ou BIIB059 a 10 mg/kg em macacos cinomólogos.

[419] As estimativas dos parâmetros para os fatores fixos foram exponenciadas, a fim de interpretá-las como as relações de frequências pDC nestes períodos de tempo em comparação com a dosagem pré-BIIB059. No geral, a proporção era significativamente menor do que quando se comparada as frequências pDC em 1 hora após a injeção IV de pré dose de frequências pDC (95% CI: 0,43 a 0,77, valor p: 0,0003). A proporção era significativamente maior do que uma comparação das frequências pDC às 6 horas após a injeção IV das frequências pDC pré-dose (95% CI: 1,18-2,12, valor de p: 0,003). A proporção não foi significativamente diferente de uma comparação quando as frequências de PDC no período de 1 a 28 dias após a injeção IV das frequências pDC pré-dose. A proporção era significativamente menor do que quando se comparada as frequências pDC depois de 28 dias após a injeção IV das frequências pDC pré-dose (95% CI: 0,55-0,70, valor de p: < 0,0001). O modelo final equipado foi representado graficamente na Figura 55. Os resultados revelaram que houve uma signi- ficante depleção in vivo de pDCs em macacos cinomólogos circulantes em uma hora, um aumento significativo de pDCs circulantes em 6 horas e uma depleção significativa de pDCs circulantes após 28 dias após a injeção IV, mas as alterações em porcentagem ao longo do tempo pDC foram as mesmas para todos os grupos de tratamento.

[420] Além disso, após a conclusão dos pontos de tempo do es tudo IV, estes três macacos cinomólogos (4, 6, e 12) receberam uma dose subcutânea única de BIIB059 a 0,2 mg/kg, para avaliar o efeito de uma dose mais baixa de frequências circulantes pDC. A frequência pDC (logaritmo na escala) em cada ponto de tempo foi representada graficamente no software R (Figura 56). Um modelo linear de efeitos mistos equipados, usando o tempo contínuo e tempo a 1 hora como fatores fixos e macacos cinomólogos interceptados como aleatórios. Os resultados são mostrados na Tabela 5.Tabela 5. Estimativas do modelo equipado para os pontos de tempo após uma única injeção subcutânea de BIIB059.

[421] As estimativas para os efeitos fixos usando um modelo de efeitos mistos lineares usando o tempo contínuo e tempo a 1 hora como fatores fixos e macacos cinomólogos interceptados como aleatórios para porcentagem circulante de pDC em escala logarítmica, antes e após uma única injeção subcutânea de BIIB059 0,2 mg/kg em macacos cinomólogo

[422] Semelhante aos resultados anteriores, observou-se uma depleção significativa in vivo de pDCs em macacos cinomólogos circu-lantes em 1 hora após as injecções IV (IC 95 %: 0,34 a 0,55, valor de p < 0,0001), mas a média geométrica de % PDC para o três macacos cinomólogos aumentou de forma constante ao longo do tempo aumentado (IC 95%: 1,00 a 1,03 vezes de mudança por dia, valor-p < 0,0001). O modelo ajustado foi plotada na Figura 57.

[423] Em conclusão, estes dados mostram que BIIB059 não me deia uma depleção sustentada de pDCs no sangue de macacos cino- mólogos quando administrado nas doses testadas. Ou seja, provavelmente devido à internalização de BDCA2.

Exemplo 49: A administração de BIIB059 a macacos cinomólogos resulta na inibição da Produção de IFNa induzida por TLR9 em Ensaio de Sangue Total Ex Vivo

[424] O objetivo deste estudo foi determinar se BIIB059, quando administrado aos macacos cinomólogos in vivo, poderia alterar a produção de IFNa em resposta à estimulação de TLR9 em um ensaio ex vivo de sangue total (WBA).

[425] As rotas de dosagem intravenosas e subcutâneas foram avaliadas quanto à sua capacidade de influenciar a indução de IFNa, que foi medida usando o bioensaio MxA de acordo com o plano experimental descrito na Figura 58. TLR9 ligante (CpG-A) induziu quantidades mensuráveis de IFNa em culturas de sangue total através de todos os pontos de tempo e em todos os macacos cinomólogos, enquanto nenhuma IFNa foi detectada em culturas de controle tratados com PBS (dados não mostrados).

[426] Para os macacos cinomólogos dosados por via intravenosa, os valores de IFNa pós-tratamento foram calculados como porcentagens da média de pré-dose para cada animal. Os dados para os san- gramentos após 14 dias foram excluídos da análise uma vez que o ensaio de sangue total não foi realizado para o grupo de 10 mg/kg BIIB059 após este ponto no tempo. Uma significativa tendência reduzida da % de IFNa em relação à pré-dose foi observada em vários dias após a administração do fármaco em 1 mg/kg e/Kg de BIIB059 de grupos de dosagem de 10 mg em comparação com o grupo veículo (Figura 59).

[427] Uma análise mais abrangente dos dados foi realizada por meio de duas vias de análise de efeitos mistos de variância (ANOVA) para estimar a média de IFNa e as diferenças pré e pós para cada grupo de dose no estudo IV. Os dados durante as primeiras 24 horas após a dosagem foram excluídos devido a uma diminuição observada das porcentagens no sangue periférico de células dendríticas plasmo- citoides. Os dados para sangramentos após dia 31 após a dose foram excluídos da análise devido ao retorno de expressão BDCA2 observada neste momento. Para o grupo de veículo administrado, a média geométrica da IFNa foi de 362 unidades/mL (U/mL) pré-dose, e 314 U/mL após a dose; para a 1 mg/kg de grupo doseado, a média geométrica foi de 399 U/mL de pré-dose, e 237 U/mL pós-dose e; para 10 mg/kg de grupo, a média geométrica do IFNa foi de 211 U/mL de pré- dose, e 102 U/mL de pós-dose (Figura 4). As diferenças pré e pós das médias log10 IFNa foram -0,061 (p = 0,511) para o grupo do veículo, - 0,226 (p = 0,016) para 1 mg/kg de grupo, e -0,317 (p = 0,004) para 10 mg/kg de grupo. Após a transformação anti-log10, estes resultados revelaram que o grupo de veículo tinha 10 A (- 0,061) = 87% (95% CI: 57% -133%) da concentração de IFNa após a dose em comparação com a pré-dose; 1 mg/kg de grupo tinha 10 A (- 0,226) = 59% (95% CI: 39% -91%) da concentração de IFN após a dose em comparação com a pré-dose; e 10 mg/kg de grupo tinha 10 A (- 0,317) = 48% (IC de 95%: 29% -79%) da pós-dose de concentração de IFN em comparação com a pré-dose (Figura 60).

[428] Para o macaco cinomólogo coorte doseados subcutanea- mente, uma análise unidirecional de variância (ANOVA) com efeitos aleatórios foi usada para estimar a média de IFNa e as diferenças pré e pós para todo o grupo. Os dados durante as primeiras 24 horas após a dosagem foram excluídos devido a uma diminuição observada nas porcentagens do sangue periférico de células dendríticas plasmocitoi- des. Os dados para os sangramentos após 33 dias pós-dose foram excluídos da análise devido à recuperação de expressão de BDCA2 observada nesta altura. Para o grupo doseado subcutaneamente, a média geométrica de IFNa foi de 1243 U/mL de pré-dose e 812 U/mL, pós- dose, obtendo-se uma proporção pós/pré dose de 65 %. A diferença pós-pré-dose em meio log10 foi estimada em - 0,185 (p = 0,059), que, após transformação anti-log10, corresponde a 10 A (0,185) = 65% da média geométrica pré-dose; 95 % de CI deste efeito é de 41% a 102% (Figura 61).

[429] Como foi usado apenas um pequeno número de macacos cinomólogos no experimento, a concentração de IFNa determinada para cada macaco influencia fortemente os resultados para esse grupo. A proporção da variação devido às diferenças de animais no estudo intravenoso foi de 69 % da variabilidade total, com o restante sendo principalmente devido às diferenças entre os pontos de tempo dentro do macaco cinomólogo (26%), e uma pequena quantidade (< 6%) devido a fontes de ensaio de variação. A variação entre os macacos ci- nomólogos é muito maior do que a variação entre os pontos de tempo dentro dos macacos cinomólogo, o que sugere que a adição de macacos cinomólogos para este experimento, em oposição a outros pontos no tempo de hemorragia seria melhor para o estudo. A proporção da variação devido às diferenças de macaco cinomólogo no estudo subcutâneo foi de 45% da variabilidade total, com o restante sendo principalmente devido às diferenças entre os pontos de tempo dentro do macaco cinomólogo, e uma quantidade insignificante (< 2%), devido a fontes de ensaio de variação.

[430] A variabilidade observada entre os macacos cinomólogos e os macacos cinomólogos dentro pode ser devido a um número de fatores, incluindo as variações nas condições fisiológicas dos macacos cinomólogos, a composição celular do sangue, a composição molecular da célula, e precisão do ensaio funcional.

[431] Embora tenha havido alguma flutuação nas porcentagens de células dendríticas plasmocitoides em cada animal ao longo do tempo, a % de pDCs no sangue não foi afetada por meio do tratamento com BIIB059 (Vide Rsch-2013-046) e não mostrou correlação consistente com a produção de IFN. Além disso, uma perda rápida e sustentada de BDCA2 da superfície celular foi observada em pDCs seguintes à administração IV e SC de BIIB059, sugerindo elevado nível de ocupação dos receptores (vide Rsch-2013-043).Tendo em conta o nível elevado de variabilidade na capacidade de resposta de pDCs de macacos cinomólogos para estimulação TLR9, houve uma tendência no sentido das respostas de IFNa umedecidas, após a administração intravenosa e subcutânea de BIIB059, com a maior redução na 10 mg/kg do grupo doseado IV, seguindo-se a 0,2 mg/kg do grupo dosea- do SC e, em seguida, 1 mg/kg do grupo doseado IV.

[432] Em conclusão, BIIB059 quando administrado in vivo para macacos cinomólogos, mostrou uma tendência para a produção de IFN induzida por TLR9 inibida em um WBA ex vivo.

OUTRAS MODALIDADES

[433] Embora a presente invenção tenha sido descrita em con junção com a sua descrição detalhada, a descrição anterior destina-se a ilustrar e não limitar o âmbito da presente invenção, que é definido pelo âmbito das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do âmbito das reivindicações seguintes. TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES FORMULÁRIO INTERNACIONAL RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL EMITIDO POR FORÇA DA REGRA 7.3 E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE EMITIDA POR FORÇA DA REGRA 10.2 A American Type Culture Collection (ATCC®) recebeu seu depósito de sementes/linhagem(s)/cepa(s) em associação com o depósito de um pedido de patente para patente. A informação a seguir é fornecida para satisfazer os requisitos do Registro de Patentes. Para: Xiangyang Tan Biogen Idec Inc. 14 Cambridge center Cambridge, Ma 02142 Depositado em Nome de: Biogen Idec Inc. Data de Recebimento de sementes/linhagem(s) pela ATCC®: 15 de Janeiro de 2013 Referência de Identificação pelo Depositante: Designação de Depósito de Patente da ATCC®: Quantidade Recebida: Murine hybridoma BDCA2-1P24F4.1.1.1 PTA-13450 25 vias A ATCC® entende que: 1. O depósito destas sementes/cepa(s) não concede à ATCC uma licença, expressa ou subentendida, para infringir a patente e a nossa liberação destas sementes/cepa(s) para outros não concede aos mesmos uma licença, expressa ou subentendida, para infringir a patente. 2. Se o depósito precisar expirar ou ser destruído durante o prazo efetivo da patente, deve ser de sua responsabilidade substituí-lo com material viável: Também deve ser de sua responsabilidade fornecer uma quantidade suficiente para distribuição durante o prazo de depósito. A ATCC® distribuirá e manterá o material durante 30 anos ou 5 anos após o requerimento mais recente pelo depósito, seja qual for mais longo. Os Estados Unidos da América e muitos outros países são signatários do Tratado de Budapeste. Antes da concessão de uma Patente U.S., a ATCC® concorda em pagar uma taxa de servi- ço única, em não distribuir estas sementes/cepa(s) ou qualquer informação que se relaciona às mesmas ou ao seu depósito exceto quando instruído pelo depositante ou registro de patente relevante. Após concessões de patente relevantes somos responsáveis por liberar as sementes/cepa(s) e estas se tornarão disponíveis para distribuição para o público sem quaisquer restrições. Nós lhe informaremos as solicitações para as sementes/cepa(s) durante 30 anos a partir da data de depósito. O depósito foi testado em 4 de fevereiro de 2013 e até tal data, as sementes/cepa(s) eram viáveis Autoridade Depositante Internacional: American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA Sue Pizarro on 6 de Fevereiro de 2013 Depositante de Patente na ATCC® Cc: Jack Brennan Date Ref. Protocolo ou Case No: TAMC:006UN/A

Claims (25)

1. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que: se liga ao antígeno de célula dendrítica sanguínea 2 humano (BDCA2) (SEQ ID NO: 1); em que o anticorpo compreende um domínio variável da ca-deia pesada (VH) compreendendo regiões determinantes de complemen-taridade (CDR)1, VH CDR2, e VH CDR3 da cadeia pesada, em que: a VH CDR1 consiste na sequência de aminoácidos GFT- FSTYTMS (SEQ ID NO: 9); a VH CDR2 consiste na sequência de aminoácidos TIS- PGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10); e a VH CDR3 consiste na sequência de aminoácidos DIY- YNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11); e em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 da cadeia leve, em que: a VL CDR1 consiste na sequência de aminoácidos KAS- QSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5); a VL CDR2 consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6); e a VL CDR3 consiste na sequência de aminoácidos QQA- NEDPRT (SEQ ID NO: 7).

2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o domínio VH é: idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24.

3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 4.

4. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio VL é: idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23.

5. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o domínio VH é idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e o domínio VL é idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

6. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, e em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

7. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é: (a) um anticorpo humanizado; (b) um anticorpo quimérico; ou (c) um anticorpo que tem uma região constante da cadeia pesada de IgG1.

8. Fragmento de ligação ao antígeno isolado, caracterizado pelo fato de que se liga ao antígeno de célula dendrítica sanguínea 2 humano (BDCA2) (SEQ ID NO: 1), em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) compreendendo regiões determinantes de complementaridade (CDR)1, VH CDR2, e VH CDR3 da cadeia pesada, em que: a VH CDR1 consiste na sequência de aminoácidos GFT- FSTYTMS (SEQ ID NO: 9); a VH CDR2 consiste na sequência de aminoácidos TIS- PGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10); e a VH CDR3 consiste na sequência de aminoácidos DIY- YNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11); e em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 da cadeia leve, em que: a VL CDR1 consiste na sequência de aminoácidos KAS- QSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5); a VL CDR2 consiste na sequência de aminoácidos AASTLES (SEQ ID NO: 6); e a VL CDR3 consiste na sequência de aminoácidos QQA- NEDPRT (SEQ ID NO: 7).

9. Fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o domínio VH é: idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24.

10. Fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o domínio VL é: idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23.

11. Fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o domínio VH é idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e o domínio VL é idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

12. Fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é: (a) um anticorpo de cadeia simples; (b) um fragmento Fab; (c) um fragmento F (ab’)2; (d) um fragmento Fab'; (e) um fragmento Fsc; (f) um fragmento Fv; (g) um scFv; (h) um sc(Fv) 2; ou (i) um diacorpo.

13. Célula isolada, caracterizada pelo fato de que produz o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou o fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 12, sendo que a célula é uma célula bacteriana, uma célula de levedura, ou um hibridoma.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato deque compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 7, ou o fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 12 e um veículo farmaceu- ticamente aceitável.

15. Compostição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 7 ou o fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 12, formulado em uma composição compreendendo 10 a 25 mM de citrato, 100 a 200 mM de cloreto de sódio, e um pH de 5,5 a 6,5.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que compreende ainda 0,01 a 0,3 % de Tween-80.

17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente selecionado do grupo consistindo em um fármaco antimalárico, um inibidor de quinase, um fármaco anti- reumático modificador da doença, um inibidor da sinalização TLR7, um inibidor da sinalização TLR9, um glucocorticoide, um inibidor da fosfo- diesterase, um antagonista da endotelina, uma estatina, um inibidor da ECA, um bloqueador de canal de cálcio, e combinações do mesmo.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o agente é um fármaco antima- lárico que é selecionado do grupo consistindo em hidroxicloroquina, amodiaquina, pirimetamina, proguanil, sulfonamidas, mefloquina, atovaquona, primaquina, artemisinina, halofantrina, doxiciclina, e clin- damicina.

19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o agente é um inibidor de qui- nase que é selecionado do grupo consistindo em um inibidor da BTK, um inibidor da JAK1, um inibidor da JAK2, um inibidor da JAK3, e um inibidor de TyK2.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o agente é um fármaco anti- reumático modificador da doença que é selecionado do grupo consistindo em metotrexato, micofenolato mofetil, azatioprina, ciclofosfamida, sulfasalazina, e leflunomida.

21. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou de um fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratar um distúrbio inflamatório em um indivíduo humano em necessidade.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é lúpus eritematoso sistêmico, lúpus eritematoso sistêmico moderado, lúpus eritematoso sistêmico severo, lúpus discoide, nefrite de lúpus, artrite reumatoide, doença in-flamatória do intestino, esclerose sistêmica (esclerodermia), morfeia, psoríase, diabetes do tipo I, dermatomiosite, polimiosite, lúpus moderado a grave com sistema nervoso central ativo (CNS) e/ou envolvimento renal e lúpus moderado a grave sem sistema nervoso central ativo (CNS) e/ou envolvimento renal.

23. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou de um fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma doença autoimune em um indivíduo com essa necessidade.

24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um agente se-lecionado do grupo consistindo em um fármaco antimalárico, um inibidor de quinase, um fármaco anti-reumático modificador da doença, um inibidor da sinalização TLR7, um inibidor da sinalização TLR9, um glu- cocorticoide, um inibidor da fosfodiesterase, um antagonista da endo- telina, uma estatina, um inibidor da ECA, um bloqueador de canal de cálcio, e combinações do mesmo.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o o agente é um fármaco antimalárico que é selecionado do grupo consistindo em hidroxicloroquina, amodiaquina, pirime- tamina, proguanil, sulfonamidas, mefloquina, atovaquona, primaquina, artemisinina, halofantrina, doxiciclina, e clindamicina, e/ou o agente é um inibidor de quinase que é selecionado do grupo consistindo em um inibidor da BTK, um inibidor da JAK1, um inibidor da JAK2, um inibidor da JAK3, e um inibidor de TyK2, e/ou o agente é um fármaco anti-reumático modificador da doença que é selecionado do grupo consistindo em metotrexato, micofe- nolato mofetil, azatioprina, ciclofosfamida, sulfasalazina, e leflunomida.