EA034757B1 - Антитела против антигена 2 дендритных клеток крови и их применение - Google Patents

Антитела против антигена 2 дендритных клеток крови и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA034757B1
EA034757B1 EA201591113A EA201591113A EA034757B1 EA 034757 B1 EA034757 B1 EA 034757B1 EA 201591113 A EA201591113 A EA 201591113A EA 201591113 A EA201591113 A EA 201591113A EA 034757 B1 EA034757 B1 EA 034757B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
seq
bdca2
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
EA201591113A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591113A1 (ru
Inventor
Джастин А. Каравелла
Эллен А. Гарбер
Даниа Мунир Рабах
Фредерик Р. Тэйлор
Original Assignee
Байоджен Ма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен Ма Инк. filed Critical Байоджен Ма Инк.
Publication of EA201591113A1 publication Critical patent/EA201591113A1/ru
Publication of EA034757B1 publication Critical patent/EA034757B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к антителу, которое связывается с BDCA2. Также описаны фармацевтическая композиция для лечения системной красной волчанки (СКВ), содержащая указанное антитело, и ее варианты. Кроме того, описаны способы применения и получения указанного антитела, а также нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, вектор экспрессии и клетка-хозяин.

Description

Уровень изобретения
Антиген 2 дендритных клеток крови (BDCA2) представляет собой лектин C-типа, экспрессируемый на плазмоцитоидных дендритных клетках человека (pDC) (Dzionek et al., J. Immunol., 165:60376046(2000)), специализированной популяции клеток, происходящих из костного мозга, которые секретируют интерфероны I типа (ИФН) в ответ на лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR). BDCA2 состоит из единственного внеклеточного домена распознавания углеводов (CRD), который относится к группе лектина C-типа II типа, расположенного на его C-конце в трансмембранной области, и из короткого цитоплазматического хвоста на его N-конце, который не несет сигнального мотива. BDCA2 передает внутриклеточные сигналы посредством ассоциированного трансмембранного адаптера FccRIy и индуцирует каскад сигналов, подобный B-клеточному рецептору (BCR).
Сущность изобретения
Изобретение основано, по меньшей мере отчасти, на идентификации и определении свойств антител, которые связываются с BDCA2. Такие антитела могут уменьшать или ингибировать секрецию воспалительных цитокинов и хемокинов. Антитела против BDCA2 по изобретению также способны истощать клетки pDC посредством антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-опосредованной цитотоксичности (CDC). Дополнительно антитела против BDCA2 по изобретению могут снижать уровни CD32a и/или CD62L на поверхности клеток pDC. Кроме того, антитела против BDCA2 по изобретению могут опосредовать интернализацию BDCA2 из клеточной поверхности pDC. По меньшей мере, этим обусловлена эффективность антител против BDCA2 по изобретению, для лечения или профилактики аутоиммунных и воспалительных заболеваний. В настоящем описании также показано, что антитела против BDCA2 по изобретению можно комбинировать с противомалярийным средством для улучшения эффектов.
В одном из аспектов изобретение относится к выделенному антителу, которое селективно связывается с эктодоменом BDCA2 человека (SEQ ID NO: 1) и конкурирует с BIIB059 за связывание с внеклеточным доменом BDCA2 человека.
Антитело против BDCA2 конкурирует с BIIB059 за связывание с BDCA2, если антитело против BDCA2 перед связыванием с BDCA2 полностью или частично ингибирует последующее связывание с BIIB059 в BDCA2. Например, антитело против BDCA2 конкурирует с BIIB059 за связывание с BDCA2, если антитело против BDCA2 перед связыванием с BDCA2 полностью ингибирует последующее связывание BIIB059 с BDCA2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против BDCA2 перед связыванием с BDCA2 вызывает ингибирование последующего связывания BIIB059 с BDCA2 по меньшей мере на 30, 50, 70, 80, 90, 95, 98 или на 99%.
В другом аспекте изобретение относится к выделенному антителу, которой селективно связывается с эктодоменом BDCA2 человека (SEQ ID NO: 1) и (i) ингибирует секрецию интерферонов I типа и/или интерферонов III типа в дополнение к другим цитокинам и хемокинам из плазмоцитоидных дендритных клеток; или (ii) индуцирует или усиливает истощение плазмоцитоидных дендритных клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления антитело против BDCA2 подавляет CD32a и/или CD62L на поверхности pDC. В некоторых вариантах осуществления антитело против BDCA2 опосредует интернализацию BDCA2 с клеточной поверхности pDC. В некоторых вариантах осуществления указанное антитело связывается с BDCA2 обезьян циномолгус (SEQ ID NO: 72) и с BDCA2 резусов (SEQ ID NO: 72). В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело ингибирует секрецию или продукцию интерферона I типа, интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухолей α (ФНО-α), интерферона III типа, макрофагального воспалительного белка-1 (MIP-1)-o/CCL3, MIP-1-3/CCL4, лиганда 5 хемокина (мотив C-C) (CCL5/RANTES) или белка-10, индуцируемого интерфероном γ (IP10/CXCL10).
В некоторых вариантах осуществления двух вышеуказанных аспектов выделенное антитело необязательно дополнительно содержит или состоит из одного, двух, трех, четырех, пяти или шести следующих признаков: EC50 (BDCA2 человека) составляет от 0,5 до 3 мкг/мл или от 4 до 10 нМ; EC50 (BDCA2 обезьян циномолгус) составляет от 0,5 до 3 мкг/мл или от 5 до 10 нМ; pI составляет от 7 до 7,5; не связывается с Clec4b2 крысы или связывается с Clec4b2 крысы с более низкой аффинностью связывания, чем с BDCA2 человека, макак резус или циномолгус; ингибирует продукцию или секрецию хемокинов, таких как (MIP-1)-o/CCL3, MIP-1-3/CCL4, CCL5/RANTES, IP10/CXCL10; имеет область, определяющую комплиментарность (CDR), а именно CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи, при этом CDR1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11; и вариабельная тяжелая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело имеет EC50 (BDCA2 человека), значение
- 1 034757 которой составляет 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5 нМ. В конкретном варианте осуществления EC50 (BDCA2 человека) выделенного антитела составляет 4,9 нМ. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело имеет EC50 (BDCA2 циномолгуса), значение которой составляет 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5,0 нМ. В конкретном варианте осуществления выделенное антитело имеет EC50 4,4 нМ (BDCA2 циномолгуса). В некоторых вариантах осуществления этого аспекта указанное антитело имеет константную область тяжелой цепи и легкой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи содержит домен CH1 и шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи содержит домен CH3. Если константная область тяжелой цепи включает замены, такие замены модифицируют свойства антитела (например, увеличивают или уменьшают одно или несколько из следующих свойств: связывание с Fcрецептором, гликозилирование антитела, число цистеиновых остатков, функцию эффекторных клеток или функцию комплемента). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой IgG антитело. В конкретных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 от 7 до 15 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 11 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 12 мкг/мл.
В другом аспекте изобретение относится к выделенному антителу, который селективно связывается с эктодоменом BDCA2 человека (SEQ ID NO: 1) и содержит CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи. CDR1 тяжелой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9). CDR2 тяжелой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10). CDR3 тяжелой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11).
В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело, специфично связывающееся с BDCA2 человека, имеет CDR1 тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9); CDR2 тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10); и CDR3 тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11). В других вариантах осуществления этого аспекта выделенное антитело имеет CDR1 тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9); CDR2 тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10); и CDR3 тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11). В других вариантах осуществления этого аспекта выделенное антитело содержит CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи. CDR1 легкой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5). CDR2 легкой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности AASTLES (SEQ ID NO: 6). CDR3 легкой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7). В некоторых вариантах осуществления CDR1 легкой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5); CDR2 легкой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности AASTLES (SEQ ID NO: 6); и CDR3 легкой цепи содержит или состоит из аминокислотной последовательности QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7). В других вариантах осуществления выделенное антитело имеет CDR1 тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9); CDR2 тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10); CDR3 тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11); CDR1 легкой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5); CDR2 легкой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности AASTLES (SEQ ID NO: 6); и CDR3 легкой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7).
В некоторых вариантах осуществления указанных выше аспектов антитело имеет константные области тяжелой цепи и легкой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи содержит домен CH1 и шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи содержит домен CH3. Если константная область тяжелой цепи включает замены, такие замены модифицируют свойства антитела (например, увеличивают или уменьшают одно или несколько из следующих свойств: связывание с Fc рецептором, гликозилирование антител, число цистеиновых остатков, функцию эффекторных клеток или функцию комплимента). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело IgG. В конкретных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 от 7 до 15
- 2 034757 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fcобласть человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 11 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 12 мкг/мл.
В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи содержит домен CH3. Если константная область тяжелой цепи включает замены, такие замены модифицируют свойства антитела (например, увеличивают или уменьшают одно или несколько следующих свойств: связывание с Fc рецептором, гликозилирование антитела, число цистеиновых остатков, функции эффекторных клеток или функции комплемента). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой IgG антитело. В конкретных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 от 7 до 15 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 11 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 12 мкг/мл.
В некоторых вариантах осуществления этого аспекта антитело содержит или состоит из домена VH, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотной последовательности домена VH BIIB059 (SEQ ID NO: 24). В других вариантах осуществления этого аспекта домен VH выделенного антитела идентичен аминокислотной последовательности домена VH BIIB059 (SEQ ID NO: 24). В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления этого аспекта антитело содержит или состоит из домена VL, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотной последовательности домена VL BIIB059 (SEQ ID NO: 23). В некоторых вариантах осуществления этого аспекта антитело содержит или состоит из домена VH, который идентичен аминокислотной последовательности домена VH BIIB059 (SEQ ID NO: 24). В конкретном варианте осуществления антитело содержит или состоит из тяжелой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и легкой цепи, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. Эти варианты осуществления относятся ко всем вышеуказанным аспектам и их вариантам. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело является одноцепочечным антителом. В других вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой поликлональное антитело, химерное антитело, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fab'фрагмент, Fsc-фрагмент, Fv-фрагмент, scFv, sc(Fv)2 или диатело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело имеет константную область тяжелой цепи IgG1.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к выделенной клетке, которая продуцирует какое-либо из вышеописанных антител.
В других вариантах осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей какое-либо из вышеописанных антител, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит какое-либо из вышеописанных антител или, созданных в виде композиции, которая содержит от 10 до 25 мМ цитрата, от 100 до 200 мМ хлорида натрия и имеет уровень pH 5,5-6,5. В некоторых вариантах фармацевтическая композиция дополнительно содержит Твин-80 (от 0,01 до 0,3%, например, 0,03%). В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит какое-либо из описанных выше антител, созданных в виде композиции, которая содержит 20 мМ цитрата натрия, 150 мМ хлорида натрия и имеет уровень pH 6,0.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения антитела против BDCA2. Способ включает получение клетки, содержащей тяжелую цепь и/или легкую цепь антитела BDCA2, инкубацию этой клетки в условиях, которые позволяют экспрессию антитела, и выделение антитела. Способ дополнительно содержит очистку антитела. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку CHO. В других вариантах осуществления клетка представляет собой клетку 293. В конкретном варианте осуществления антитело против BDCA2 представляет собой BIIB059. В одном из вариантов осуществления антитело против BDCA2 имеет тяжелую цепь и легкую цепь, при этом тяжелая цепь содержит или состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, и легкая цепь содержит или состоит из последовательности SEQ ID NO: 3. В другом варианте антитело против BDCA2 содержит или состоит из CDR1 VH, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, CDR2 VH, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и CDR3 VH, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В другом варианте осуществления антитело против BDCA2 содержит или состоит из CDR1 VH, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, CDR2 VH, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, CDR3 VH, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, CDR1 VL, содержащей или состоящей из аминокис- 3 034757 лотной последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 VL, содержащей или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и CDR3 VL, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивида. Способ включает введение нуждающемуся в этом индивиду эффективного количества любого из описанных в изобретении антител против BDCA2. В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание выбирают из группы, состоящей из системной красной волчанки (СКВ), кожной волчанки, дискоидной волчанки, волчаночного нефрита. В одном конкретном варианте осуществления воспалительным заболеванием является СКВ. В другом конкретном варианте осуществления воспалительным заболеванием является дискоидная волчанка. Еще в одном конкретном варианте осуществления воспалительным заболеванием является волчаночный нефрит. В другом конкретном варианте осуществления воспалительным заболеванием является кожная волчанка. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет генерализованую СКВ. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет СКВ умеренной степени тяжести. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет умеренную СКВ без тяжелого активного вовлечения ЦНС и/или тяжелого активного вовлечения почек. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет умеренную СКВ с тяжелым активным поражением ЦНС и/или тяжелым активным поражением почек. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет кожные проявления СКВ (например, скуловую или дискоидную сыпь). В некоторых вариантах осуществления индивид страдает тяжелой формой СКВ. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет тяжелую форму СКВ без серьезного активного поражения ЦНС и/или тяжелого активного поражения почек. В некоторых вариантах осуществления индивид страдает тяжелой формой СКВ с тяжелым активным поражением ЦНС и/или тяжелым активным поражением почек. Системная красная волчанки в средней или тяжелой форме являются стадиями развития этого заболевания (см., например, Руководство Guidelines for Referral and Management of Systemic Lupus Erythematosus in Adults, Arthritis & Rheumatism, 42(9): 1785-1795 (1999); Gladman, Prognosis and treatment of systemic lupus erythematosus, Curr. Opin. Rheumatol., 8:430-437 (1996); Kalunian et al., Definition, classification, activity and damage indices. В книге: Dubois' lupus eyrthematosus. 5th ed., Baltimore: Williams and Wilkins; стр. 19-30 (1997)).
В некоторых вариантах осуществления, в любом из относящихся к способам вышеуказанных аспектов, индивидом является человек. В некоторых вариантах осуществления, в любом из относящихся к способам вышеуказанных аспектов, антитело против BDCA2 вводят в комбинации по меньшей мере с одним из следующих средств: противомалярийное средство (например гидроксихлорохин), ингибитор сигнального пути TLR7, ингибитор сигнального пути TLR9 или кортикостероид. В конкретном варианте осуществления антитело против BDCA2 содержит области CDR тяжелой и легкой цепей BIIB059. В одном из вариантов осуществления антитело против BDCA2 содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 8, 10 и 11, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 5, 6 и 7, соответственно. В конкретном варианте осуществления антитело против BDCA2 представляет собой BIIB059.
В другом аспекте изобретение относится к комбинации, содержащей противомалярийное средство (например, гидроксихлорохин) и антитело против BDCA2. В конкретном варианте осуществления антитело против BDCA2 содержит области CDR тяжелых цепей SEQ ID NO: 24. В другом варианте антитело против BDCA2 содержит CDR легких цепей SEQ ID NO: 23. В конкретном варианте осуществления антитело против BDCA2 содержит области CDR тяжелых и легких цепей BIIB059. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против BDCA2 дополнительно содержит Fc-область, которая связывается с CD32a с EC50 по меньшей мере приблизительно от 7 до 15 мкг/мл (например 9, 10, 11, 12, 13, 14 мкг/мл). В конкретном варианте осуществления антитело против BDCA2 представляет собой BIIB059.
Если не указано иное, все технические и научные термины, как они используются в изобретении, имеют такие же значения, которые обычно понимаются рядовым специалистом в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. На практике или при тестировании настоящего изобретения могут быть использованы способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в изобретении, но при этом описанные ниже способы и материалы приведены в качестве примеров. Все указанные публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки включены в изобретение в качестве ссылки во всей их полноте. В случае противоречий приоритет остается за настоящей заявкой, включающей в себя определения. Материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 схематически изображает сигнальный путь BDCA2 в плазмоцитоидных дендритных клетках (см. Geijtenbeek et al., Nature Reviews Immunology, 9:465-479 (2009));
фиг. 2 представляет диаграмму, показывающую связывание вариантов hu24F4 Нх/L! с BDCA2 человека;
фиг. 3 - диаграмму, показывающую связывание вариантов hu24F4 Hx/L1 с BDCA2 обезьян циномолгус;
- 4 034757 фиг. 4 представляет собой схематическую карту плазмиды pJP009, которая кодирует легкую цепь анти-ВПСА2. Последовательность нуклеиновых кислот легкой цепи анти-BDCA2 находится под транскрипционным контролем промотора HCMV IE и последовательностей полиаденилирования hGH. Ген аминогликозид-фосфотрансферазы (устойчивости к неомицину) находится под транскрипционным контролем промотора фосфоглицеринкиназы мыши (muPGK) и последовательностей полиаденилирования. Остальные последовательности, включающие ген бета-лактамазы, предназначены для размножения и селекции в E.coli;
фиг. 5 - схематическую карту плазмиды pJP010, которая кодирует тяжелую цепь анти-BDCA2. Последовательность нуклеиновых кислот тяжелой цепи анти-BDCA2 находится под транскрипционным контролем промотора HCMV IE и последовательностей полиаденилирования роста человека hGH. Ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) находится под транскрипционным контролем промотора SV40E и последовательностей полиаденилирования. Остальные последовательности, включающие в себя ген беталактамазы, предназначены для размножения и селекции в E.coli;
фиг. 6 - линейную диаграмму, показывающую связывание BIIB059 на плазмоцитоидных дендритных клетках обезьяны циномолгус (A) и человека (B). Цельную кровь обезьяны циномолгус (A) или человека (B) инкубировали на льду с разными концентрациями антитела BIIB059, меченного красителем Alexa647 (кружки) или человеческим изотипом IgG (квадраты). Данные были получены с использованием устройства LSRII-4 для цветной сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS), и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism;
фиг. 7 - диаграмму, показывающую результаты анализа самоассоциации AlphaScreen. Обозначения: ромб - BIIB059, квадрат - 5c8 и треугольник - LT105;
фиг. 8 - диаграмму, показывающую результаты дифференциальной сканирующей флуорометрии по тестированию устойчивости BIIB059 в разных условиях. Эта диаграмма показывает данные при 150 мМ хлорида натрия и 250 мМ сахарозы в зависимости от уровня pH;
фиг. 9 - диаграмму, показывающую влияние перемешивания в течение продолжительного времени на аггрегацию. Аггрегацию подавляли путем добавления Твин 80;
фиг. 10 - диаграмму, показывающую прямое связывание AC144 с поверхностным BDCA2 человека и обезьяны циномолгус;
фиг. 11 - серию диаграмм, показывающих результаты гель-хроматографического анализа слитых белков Fc;
фиг. 12 - диаграмму, показывающую влияние кальция на связывание BIIB059 с BDCA2. Связывание BIIB059 с BDCA2 усиливается путем добавления кальция, что дает сигнал, который примерно в 2 раза выше по сравнению с ЭДТА;
фиг. 13 - диаграмму, показывающую результаты OCTET-связывания BIIB059 с эктодоменами BDCA2 человека и обезьяны циномолгус;
фиг. 14 - диаграмму, показывающую, что BIIB059 мощно ингибирует ИФНц мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), стимулированных агонистом TLR9. Каждый символ представляет показатель половины ингибирующей концентрации (IC50) из независимого эксперимента, вертикальные линии отображают стандартную ошибку средней величины (SEM);
фиг. 15 A-C - серию диаграмм, показывающих, что BIIB059 мощно ингибирует цитокины и хемокины цельной крови, стимулированной лигандом TLR9. фиг. 15A показывает ингибирование ИФНц с использованием гепаринизированной венозной крови здоровых доноров. фиг. 15B показывает ингибирование ИФНа с использованеим цельной крови двух больных СКВ (верхние диаграммы) по сравнению с результатами использования цельной крови 2 здоровых доноров (нижние диаграммы). фиг. 15C предоставляет ряд гистограмм, показывающих, что лечение BIIB059 приводит к ингибированию большого массива цитокинов и хемокинов;
фиг. 16 - гистограмму, показывающую, что BIIB059 ингибирует экспрессию интерферона I типа;
фиг. 17 включает две линейных диаграммы, показывающих, что лигирование BDCA2 с BIIB059 ингибирует TL·R9-индуцированную продукцию цитокинов в очищенных клетках pDC;
фиг. 18 представляет собой гистограмму, показывающую, что лигирование BDCA2 подавляет индукцию выработки ИФНа при СКВ в сыворотке крови, стимулированной плазмоцитоидными дендритными клетками;
фиг. 19A - диаграмму, показывающую интернализацию BDCA2 после лигирования с BIIB059. фиг. 19B представляет собой линейную диаграмму, показывающую, что интернализация не влияет на продукцию ИФНа, которая опосредована ингибированием BIIB059;
фиг. 20 - серию диаграмм, показывающих связывание BIIB059 с рецепторами Fcy;
фиг. 21 представляет результаты C1q ELISA, где показано связывание C1q человека с покрытым антителом в возрастающих концентрациях (от 0 до 15 мкг/мл);
фиг. 22A-D представляют собой серию диаграмм, показывающих, что BIIB059 опосредует уничтожение клеток посредством ADCC. В качестве мишени использовали клеточную линию CHO (клон 34.16.7 EAG2456 T1F2). Уровень экспрессии BDCA2 на поверхности клеток CHO определяли с помощью FACS с использованием APC-меченного анти-BDCA2 моноклонального антитела (МКА) (клон AC144,
- 5 034757
Miltenyi). В качестве эффекторных клеток использовали клетки-натуральные киллеры (НК-клетки). Оценку ADCC проводили с помощью набора для анализа цитотоксичности Vybrant (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. В анализе выявляют глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу Г-6-ФД поврежденных клеток, на основе Г -6-ФД-зависимого восстановления резазурина, который после возбуждения при 530 нм, излучает флуоресценцию при 590 нм. Анализ ADCC, представленный на фиг. 22A, проводили с использованием клеток CHO с высокой экспрессией BDCA2 (фиг. 22C), а в анализе ADCC, представленном на фиг. 22B, использовали клетки CHO с более низкой экспрессией BDCA2 (фиг. 22D);
фиг. 23 - диаграмму, показывающую, что BIIB059 опосредует уничтожение клеток посредством CDC. Клетки CHO (клон 34.16.7 EAG2456 T1F2) высевали в количестве 5*104 клеток в 96-луночные коллагеновые планшеты с черными лунками и инкубировали при 37°C в течение 48 ч. Затем планшеты промывали и инкубировали с комплементом кроличьей сыворотки и пропидиййодидом (PI) в течение 1 ч при 37°C в присутствии эффекторных компетентных анти-BDCA2 моноклональных антител (24F4S и BIIB059), моноклональных антител с дефицитом эффекторной функции (24F4S-Agly и 24F4A-Agly) или контрольного изотипа IgG1. Отрицательный контроль состоял из лунок, содержащих клетки CHO, комплемент кроличьей сыворотки и PI, при отсутствии антител;
фиг. 24 - серию диаграмм, используемых для определения EC50 при связывании BIIB059 (прямом связывании) и конкурентном связывании BIIB059-a647 (непрямом) на плазмоцитоидных дендритных клетках обезьян циномолгус. Перед инъекцией BIIB059 in vivo у двенадцати обезьян циномолгус забирали кровь один раз в неделю в течение всего трех недель. Применяли проточную цитометрию для определения EC50 при связывании BIIB059 с BDCA2 на поверхности клеток pDC (прямой способ), и определяли количество BDCA2 рецептора, доступного в присутствии BIIB059 (непрямой способ). Кровь инкубировали с шестикратным титрованием BIIB059 в диапазоне от 40 до 0,04 мкг/мл. Клетки pDC идентифицировали с помощью проточной цитометрии как CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, и обрабатывали или вторичным анти-человеческим IgG, меченным фикоэритрином (PE), или меченным BIIB059-a647, в концентрации 10 мкг/мл. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) PE (незакрашенные обозначения, графически на левой оси ординат) или A647 (закрашенные обозначения, графически на правой оси ординат) рассчитывали с помощью программного обеспечения FlowJo и графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (четырех-параметрическая кривая нелинейной регрессионной аппроксимации логарифмически преобразованных данных). В изобретении показаны репрезентативные диаграммы от четырех из двенадцати обезьян циномолгус;
фиг. 25 - репрезентативную диаграмму, показывающую плато связывания антитела против BDCA2 BIIB059 с BDCA2 на клеточной поверхности pDC в цельной крови обезьян циномолгус. Кровь инкубировали с шестикратным титрованием BIIB059 в диапазоне от 40 до 0,04 мкг/мл. Клетки pDC идентифицировали с помощью проточной цитометрии как CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, и обрабатывали вторичным анти-IgG человека, меченным фикоэритрином (PE). Определяли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) PE и рассчитывали процент максимального связывания, используя значение в точке 40 мкг/мл как 100%. Каждая строка представляет данные от одной отдельной обезьяны циномолгус, в общей сложности использовали двенадцать обезьян циномолгус, и полученные данные графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (четырех-параметрическая кривая нелинейной регрессионной аппроксимации логарифмически преобразованных данных). Окрашивание повторяли один раз в неделю всего в течение трех недель. Пунктирные линии показывают, что при концентрации BIIB059 10 мкг/мл связывание с рецептором BDCA2 было насыщенным у всех обезьян циномолгус;
фиг. 26A-C - окрашивания связанного BIIB059 и свободного BDCA2 у обезьян циномолгус, которым вводили носитель. фиг. 26A представляет собой серию гистограмм FACS, показывающих исходное окрашивание PE у обезьян циномолгус после введения носителя. Обезьянам циномолгус № 1, 4 и 12 делали однократную внутривенную (в/в) инъекцию контрольного носителя (цитрат натрия) в точке времени 0. Через 1 ч забирали цельную кровь и с помощью проточной цитометрии определяли pDC, как CD20CD14-CD123+HLA-DR+, после чего обрабатывали их античеловеческим IgG PE (незаштрихованные гистограммы) или FACS-буфером в качестве контроля PE-флуоресценции минус один (FMO) (заштрихованные гистограммы). Фиг. 26B представляет диаграмму PE-окрашивания pDC крови, полученной от трех обезьян циномолгус после введения носителя в указанные точки времени. Рассчитывали MFI от PE с помощью программного обеспечения FlowJo, и графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. фиг. 26C представляет диаграмму окрашивания A647 клеток pDC крови обезьян циномолгус после введения носителя в указанные точки времени. В образцы крови обезьян циномолгус после введения носителя в указанные точки времени добавляли BIIB059-A647 в количестве 10 мкг/мл, и анализировали клетки pDC на A647-окрашивание. Рассчитывали MFI от PE с помощью программного обеспечения FlowJo, и графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism;
фиг. 27A-C показывают, что связанные BIIB059 и рецептор BDCA2 становятся недоступными на поверхности клеток pDC обезьян циномолгус после однократного введения 10 мг/кг BIIB059. фиг. 27A представляет собой серию гистограмм FACS, показывающих окрашивание BIIB059 у обезьян циномолгус после введения 10 мг/кг BIIB059. Обезьянам циномолгус № 3, 8 и 10 делали однократную в/в инъек
- 6 034757 цию BIIB059 в дозе 10 мг/кг в точке времени 0. Через 1 ч проводили забор цельной крови и клетки pDC идентифицировали как CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, после чего их обрабатывали анти-человеческим IgG PE (незаштрихованные гистограммы) или FACS-буфером в качестве PE-FMO контроля (заштрихованные гистограммы). фиг. 27B представляет собой диаграмму PE-окрашивания клеток pDC крови, полученной от трех обезьян циномолгус после введения BIIB059 в указанные точки времени. Рассчитывали MFI от РЕ с помощью программного обеспечения FlowJo, и графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. фиг. 27C представляет диаграмму A647-окрашивания клеток pDC крови, полученной от трех обезьян циномолгус после введения BIIB059 в указанные точки времени. BIIB059-o647 в количестве 10 мкг/мл добавляли к крови, полученной от трех обезьян циномолгус после введения BIIB059 в каждой из указанных точек времени, и анализировали A647-окрашивание на клетках pDC. Рассчитывали MFI от PE с помощью программного обеспечения FlowJo, и графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism;
фиг. 28A-C показывают, что связанные BIIB059 и рецептор BDCA2 становятся недоступными на поверхности клеток pDC после однократного введения 1 мг/кг BIIB059 обезьянам циномолгус. Фиг. 28A представляет серию гистограмм FACS, показывающих окрашивание BIIB059 у обезьян циномолгус после введения 1 мг/кг BIIB059. Обезьянам циномолгус № 3, 8 и 10 делали однократную в/в инъекцию BIIB059 в дозе 1 мг/кг в точке времени 0. Через 1 ч проводили забор цельной крови, идентифицировали клетки pDC как CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, после чего их обрабатывали античеловеческим IgG PE (незаштрихованные гистограммы) или FACS-буфером в качестве PE-FMO контроля (заштрихованные гистограммы). Фиг. 28B представляет диаграмму РЕ-окрашивания клеток pDC крови, полученной от трех обезьян циномолгус после введения BIIB059 в указанные точки времени. Рассчитывали MFI от PE с помощью программного обеспечения FlowJo, и графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Фиг. 28C представляет диаграмму окрашивания A647 клеток pDC крови, полученной от обезьян циномолгус, которым вводили BIIB059 в указанные точки времени. BIIB059-o647 в количестве 10 мкг/мл добавляли в кровь, полученную от трех обезьян циномолгус после введения BIIB059 в каждой из указанных точек времени, и анализировали A647-окрашивание на клетках pDC. Рассчитывали MFI от PE с помощью программного обеспечения FlowJo, и графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism;
фиг. 29A-C показывают, что связанные BIIB059 и рецептор BDCA2 становятся недоступными на поверхности клеток pDC после однократного подкожного (п/к) введения дозы 0,2 мг/кг BIIB059 обезьянам циномолгус. Фиг. 29A представляет серию гистограмм FACS, показывающих окрашивание BIIB059 при п/к введении обезьянам циномолгус 0,2 мг/кг BIIB059. Обезьянам циномолгус № 4, 6 и 12 делали однократную подкожную инъекцию BIIB059 в дозе 0,2 мг/кг в точке времени 0. Через 1 ч проводили забор цельной крови, идентифицировали клетки pDC как CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, и обрабатывали их анти-человеческим IgG PE (незаштрихованные гистограммы) или FACS-буфером в качестве PE-FMO контроля (заштрихованные гистограммы). Фиг. 29B представляет диаграмму PE-окрашивания на клетках pDC крови, полученной от трех обезьян циномолгус после введения BIIB059 в указанные точки времени. Рассчитывали MFI от PE с помощью программного обеспечения FlowJo, и графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Фиг. 29C представляет диаграмму A647-окрашивания на клетках pDC крови, полученной от трех обезьян циномолгус после введения BIIB059 в указанные точки времени. BIIB059-A647 в количестве 10 мкг/мл добавляли в кровь, полученную от трех обезьян циномолгус после введения BIIB059 в каждой их указанных точек времени, и анализировали A647окрашивание на клетках pDC. Рассчитывали MFI от PE с помощью программного обеспечения FlowJo, и графически отображали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism;
фиг. 30 - серию диаграмм, показывающих наблюдаемые фармакокинетические/фармакодинамические (ФК/ФД) корреляции у обезьян циномолгус, которым в/в вводили BIIB059 в дозе 1 мг/кг, и у обезьян циномолгус, которым в/в вводили BIIB059 в дозе 10 мг/кг. В каждой диаграмме на этой фигуре концентрация сывороточного BIIB059 показана на левой оси ординат (незакрашенные обозначения), и плотность BDCA2-рецептора показана на правой оси ординат (закрашенные обозначения). Ускоренный клиренс был выявлен у обезьяны циномолгус № 5, вероятнее всего, по причине иммуногенности к BIIB059;
фиг. 31 - серию диаграмм, показывающих наблюдаемые ФК/ФД корреляции у обезьян циномолгус, которым вводили BIIB059 п/к в дозе 0,2 мг/кг. В каждой диаграмме на этой фигуре концентрация сывороточного BIIB059 показана на левой оси ординат (незакрашенные обозначения), и плотность BDCA2рецептора показана на правой оси ординат (закрашенные обозначения);
фиг. 32 - серию столбчатых гистограмм, показывающих результаты анализов ELISA или мультиплексных анализов для измерения концентрации воспалительных цитокинов и хемокинов, продуцируемых клетками pDC, которые обработаны CpG-A, CpG-A в присутствии анти-BDCA2, и CpG-A в присутствии контрольного изотипа. Каждый столбец представляет собой среднее значение и стандартное отклонение (SD) для дублированных лунок от репрезентативного здорового донора-человека из 5 испытуемых. Вертикальные линии обозначают SD;
фиг. 33 - серию столбчатых гистограмм, показывающих результаты анализов ELISA или мультип
- 7 034757 лексных анализов для измерения концентрации воспалительных цитокинов и хемокинов, продуцируемых клетками pDC, которые были обработаны иммунными комплексами Sm/RNP, иммунными комплексами Sm/RNP в присутствии анти-BDCA2 и иммунными комплексами Sm/RNP в присутствии контрольного изотипа. Каждый столбец представляет собой среднее значение и стандартное отклонение (SD) для дублированных лунок от репрезентативного здорового донора-человека из 5 испытуемых. Вертикальные линии обозначают SD;
фиг. 34 - серию столбчатых гистограмм, показывающих результаты анализов количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) для определения эффекта BIIB059 на транскрипцию подтипов ИФН I типа в клетках pDC, стимулированных иммунным комплексом (IC) Sm/RNP, у здоровых доноров. Каждый столбец представляет собой среднее относительное кратное изменение с повторами в четырех лунках от репрезентативного донора из 3 испытуемых (n=3), и вертикальные линии обозначают стандартное отклонение (SD);
фиг. 35A показывает BIIB059-опосредованное дозозависимое ингибирование ИФНа, индуцированное TLR9, посредством PBMC от одного репрезентативного здорового донора-человека из 18 испытуемых. Каждое обозначение представляет собой среднее и стандартное отклонение (SD) для дубликатов лунок. Фиг. 35B показывает BIIB059-опосредованное дозозависимое ингибирование ИФНц, индуцированное TLR9, посредством PBMC от одного репрезентативного больного СКВ из 11 испытуемых. Каждое обозначение представляет среднее и стандартное отклонение (SD) для дубликатов лунок. Фиг. 35C показывает IC50 для ингибирования с помощью BIIB059 TLR9-индуцированной продукции ИФНа посредством PBMC у здоровых доноров (ЗД) по сравнению с больными СКВ (СКВ). Каждое обозначение относится к отдельному донору, вертикальные линии обозначают SD;
фиг. 36A - BIIB059-опосредованное дозозависимое ингибирование TLR9-индуцированного ИФНа одного репрезентативного анализа цельной крови от 12 испытуемых. Каждое обозначение представляет собой среднее и стандартное отклонение (SD) для дубликатов лунок. Фиг. 36B показывает IC50 для ингибирования с помощью BIIB059 TLR9-индуцированной продукции ИФНа в анализах цельной крови по сравнению с анализами PBMC. Каждое обозначение относится к отдельному донору, вертикальные линии обозначают SD;
фиг. 37. PBMC от здоровых доноров-людей были стимулированы с помощью 1 мкМ лиганда TLR3 (Poly I:C) и обработаны BIIB059 в концентрациях в диапазоне от 10 мкг/мл до 0,5 нг/мл в общем анализируемом объеме 250 мкл на лунку в 96-луночном планшете. Планшеты инкубировали в течение ночи (18 часов) при температуре 37°C и 5% CO2. 200 мкл супернатанта собирали для оценки уровней ИФНа с помощью анализа ELISA. Каждое обозначение представляет средние уровни ИФНа, полученные при каждом условии обработки. Показаны данные от двух независимых доноров. Вертикальные линии обозначают стандартное отклонение (SD);
фиг. 38A показывает дозозависимую BIIB059-опосредованную интернализацию BDCA2 от репрезентативного здорового донора-человека. Кружки обозначают MFI при 2D6-окрашивании, и при разных дозах BIIB059. Треугольник обозначает MFI от 2D6 в присутствии контрольного изотипа (максимальное окрашивание). Ромб обозначает MFI контроля FMO (фоновое окрашивание). Фиг. 38B показывает значения EC50 от BIIB059-индуцированной интернализации BDCA2 на клетках pDC в анализах цельной крови у здоровых доноров-людей (закрашенные кружки; n=10 доноров). Среднее значение EC50 составляет 0,017±0,005 мкг/мл;
фиг. 39 представляет собой графическое изображение значений средней интенсивности флуоресценции (MFI) при 2D6-FITC окрашивании клеток pDC CD14-CD20-HLA-DR+CD123+, дающих сигнал выше порогового значения. Изотип (iso) демонстрирует максимальное окрашивание, FMO (контрольфлуоресценция минус один) состоит из коктейля FACS окрашивания минус 2D6-FITC, что представляет фоновое окрашивание. На этой фигуре показан репрезентативный эксперимент от 4 выполненных независимых экспериментов;
фиг. 40 - конфокальные изображения человеческих pDC, очищенных из периферической крови, и затем инкубированных с 10 мкг/мл BIIB059-AF647 (показано белым) при 4°C (слева) или при 37°C в 5% CO2 (справа) в течение 15 мин. Распределение клеток BIIB059 оценивали с помощью конфокальной микроскопии, и репрезентативное изображение показано для каждого условия;
фиг. 41 представляет собой графическое изображение эффекта интернализации BDCA2 на ингибирование продукции ИФНа. Эта фигура является репрезентативным изображением 3 независимых экспериментов;
фиг. 42 - графическое изображение, показывающее, что значения EC50 BIIB059-опосредованной интернализации BDCA2 коррелируют с показателями IC50 BIIB059-опосредованного ингибирования TLR9индуцированного ИФНа в анализах цельной крови (n=10). Значение R2 составляет 0,57;
фиг. 43A показывает результаты, выраженные в виде среднего и стандартного отклонения (SD) коэффициентов колокализации Мандерса для локализации TLR9 в компартменте LAMP1+. Фиг. 43B показывает результаты, выраженные в виде среднего отклонения и SD коэффициентов колокализации Мандерса для локализации BIIB059/BDCA2 в компартменте TLR9+. Фиг. 43C показывает результаты, выраженные в виде среднего отклонения и SD коэффициентов колокализации Мандерса для локализации
- 8 034757
BIIB059/BDCA2 в компартменте LAMP1+. Каждое обозначение представляет отдельную клетку; горизонтальные линии представляют среднее отклонение, вертикальные линии представляют SD;
фиг. 44A представляет собой гистограмму репрезентативного эксперимента с цельной кровью, обработанной 10 мкг/мл BIIB059 (заштрихованная гистограмма), 10 мкг/мл контрольного изотипа (пунктирная линия) или с цельной кровью, стимулированной лигандом TLR9, CpG-(сплошная линия). Фиг. 44B представляет собой графическое изображение эффекта обработки BIIB059 цельной крови, что вызывает шеддинг CD62L (закрашенные квадраты). Незакрашенный квадрат обозначает обработку изотипом (10 мкг/мл). Эта фигура является репрезентативной для 3 независимых экспериментов;
фиг. 45 - графическое изображение поверхностной экспрессии CD62L, анализированной с помощью проточной цитометрии. Экспрессию CD62L измеряли в присутствии BIIB059 единственного, и в присутствии GM6001 в возрастающих концентрациях (обозначено кружками). Незаштрихованный квадрат обозначает обработку изотипом в качестве контроля (10 мкг/мл). Перевернутый треугольник обозначает BIIB059, обработанные контрольным ДМСО. Эта фигура является репрезентативной для 2 независимых экспериментов;
фиг. 46A представляет собой графическое изображение BIIB059 и 24F4A-Agly-опосредованной дозозависимой интернализации BDCA2 на поверхности клеток pDC одного репрезентативного здорового донора-человека (n=5). Клетки pDC от здоровых доноров-людей выделяли с использованием технологии двухэтапного разделения магнитными шариками (набор MACS, Miltenyi Biotec). Клетки pDC обрабатывали BIIB059 в возрастающих концентрациях (обозначено кружками) или антителом 24F4-Agly в aгликозилированной форме (обозначено квадратами). Клетки также обрабатывали 10 мкг/мл контрольного изотипа (обозначено треугольником) и инкубировали в течение 16 ч при 37°C. Затем pDC окрашивали на поверхностную экспрессию BDCA2 и CD32. Фиг. 46B является гистограммой, показывающей уровни CD32 на выделенных pDC, которые были обработаны 10 мкл/мл BIIB059 (заштриховано) или контрольным изотипом (обозначено пунктиром) (n=5). Фиг. 46C является гистограммой, показывающей уровни CD32 на выделенных pDC, которые были обработаны a-гликозилированной формой 24F4-A в дозе 10 мкг/мл (заштриховано) или контрольным изотипом (обозначено пунктиром). Сплошная линия относится к неокрашенным клеткам (n=5). Фиг. 46D представляет собой графическое изображение BIIB059опосредованной дозозависимой понижающей модуляции CD32 на поверхности клеток pDC от одного репрезентативного здорового донора-человека (n=5). Фиг. 46E является гистограммой, показывающей уровни CD32 на выделенных pDC, обработанных в течение 1 ч при 4°C в присутствии 10 мкг/мл BIIB059 (заштриховано), a-гликозилированной формы (обозначено пунктиром) или контрольного изотипа (обозначено точками). После инкубации проводили оценку pDC на поверхностную экспрессию CD32. Сплошная черная линия относится к неокрашенным клеткам (n=3). Фиг. 46F является гистограммой, показывающей уровни CD32 на выделенных pDC, обработанных в течение 1 ч при 37°C в присутствии 10 мкг/мл BIIB059 (заштриховано), а-гликозилированной формы (обозначено пунктиром) или контрольного изотипа (обозначено точками). После инкубации проводили оценку pDC на поверхностную экспрессию CD32. Сплошная черная линия относится к неокрашенным клеткам (n=3);
фиг. 47A - графическое изображение уровней ИФНц из выделенных pDC, которые были обработаны BIIB059 в возрастающих концентрациях (квадраты), a-гликозилированной формой антитела 24F4-A в возрастающих концентрациях (кружки), или контрольным изотипом в количестве 10 мкг/мл (треугольники). Клетки pDC стимулировали в присутствии CpG-A (75 мкг/мл) или оставляли без стимуляции (перевернутый треугольник). Клетки pDC инкубировали в течение 16 ч при 37°C, собирали супернатанты и анализировали на ИФНц с помощью ELISA. Показан репрезентативный эксперимент из 2 выполненных анализов. Фиг. 47B представляет графическое изображение уровней ИФНа в выделенных pDC после их обработки BIIB059 в возрастающих концентрациях (квадраты), a-гликозилированной формой антитела 24F4-A в возрастающих концентрациях (кружки), контрольным изотипом в количестве 10 мкг/мл (треугольники) или анти-CD32 человеческим мАт (моноклональным антителом) в количестве 10 мкг/мл. Предварительно получали иммунные комплексы (IC) Sm/RNP путем смешивания SM-RNP из тимуса теленка и анти-RNP антител, очищенных из сыворотки больных СКВ, в течение 30 мин в бессывороточной среде. Выделенные клетки стимулировали иммунными комплексами или обрабатывали только антигеном (без стимуляции). Клетки инкубировали в течение 16 ч при 37°C, собирали супернатанты и анализировали на ИФНа с помощью ELISA. На фигуре показан репрезентативный анализ из 3 проведенных анализов. Каждое обозначение представляет собой среднее и стандартное отклонение (SD) для дубликатов лунок;
фиг. 48A - столбчатую гистограмму, показывающую экспрессию CD32 на выделенных pDC, которые обработали иммунными комплексами в присутствии 10 мкг/мл BIIB059, 24F4-A, анти-ОО32 мАт (клон AT10), гуманизированным анти-ОО40-антителом или контрольным изотипом. Клетки инкубировали в течение 16 ч при 37°C. pDC окрашивали на поверхностную экспрессию CD32 и CD40. Фиг. 48B представляет столбчатую гистограмму, на которой показаны уровни ИФНа, измеренные с помощью ELISA в супернатантах, собранных в A. Показано репрезентативное изображение (n=3). Фиг. 48C предствляет гистограмму, показывающую экспрессию CD40 на поверхности pDC. Пунктирная линия обозначает экспрессию CD40 на поверхности клеток. Заштрихованная гистограмма представляет уровни CD40
- 9 034757 на pDC после обработки анти-СП40-антителом. Сплошная линия относится к неокрашенным клеткам;
фиг. 49 показывает влияние гидроксихлорохина (HCQ) на потенциал BIIB059. Каждое обозначение представляет концентрации ИФНц, измеренные у отдельных здоровых доноров-людей, вертикальные линии обозначают SD. Клетки PBMC от здоровых доноров были обработаны BIIB059 единственным в разных концентрациях, HCQ единственным или комбинацией (BIIB059+ HCQ), при общем анализируемом объеме 250 мкг на лунку. Концентрации BIIB059 варьировались от 10 мкг/мл до 0,1 нг/мл. Концентрации HCQ варьировались от 10 мкМ до 156 нМ. Клетки PBMC в количестве 1*106 на лунку стимулировали 5 мкМ лиганда TLR7 (R848). Планшеты, содержащие PBMC, инкубировали в течение ночи (18 ч) при температуре 37°C и 5% CO2. Собирали 200 мкл супернатантов для оценки в анализе ИФНа ELISA (PBL InterferonSource);
фиг. 50 - влияние HCQ на потенциал BIIB059. Каждое обозначение представляет концентрации ИФНа, измеренные у репрезентативного донора из 2 тестированных здоровых доноров, вертикальные линии обозначают стандартное отклонение (SD). Клетки PBMC из гепаринизированной венозной крови здоровых доноров и больных СКВ выделяли путем прерывистого градиентного центрифугирования с Фиколлом, промывали в фосфатно-буферном растворе (ФБР) и ресуспендировали в полной культуральной среде (RPMI с 3% эмбриональной бычьей сывороткой-FBS). Клетки PBMC обрабатывали BIIB059 единственным в разных концентрациях, HCQ единственным или комбинацией (BIIB059+HCQ), при общем анализируемом объеме 250 мкл на лунку. Концентрации BIIB059 варьировались от 10 мкг/мл до 0,1 нг/мл. Концентрации HCQ варьировались от 10 мкМ до 156 нМ. Клетки PBMC в количестве 1χ106 на лунку стимулировали 1 мкМ лиганда TLR9 (CPG-A). Планшеты, содержащие PBMC, инкубировали в течение ночи (18 часов) при температуре 37°C и 5% CO2. Собирали 200 мкл супернатантов для оценки в анализе ИФНа ELISA (PBL InterferonSource);
фиг. 51 - распределение процентов циркулирующих pDC в цельной крови здоровой обезьяны циномолгус в оригинальном масштабе (схема слева) и в логарифмической шкале (схема справа). Цельную кровь забирали от двенадцати обезьян циномолгус один раз в неделю всего в течение четырех недель. Путем проточной цитометрией иднтифицировали клетки pDC как CD20-CD14-CD123-+HLA-DR+. Процент pDC от CD20-CD14-клеток рассчитывали с помощью программного обеспечения FlowJo. Диаграмму выполняли с использованием языка R для статистических расчетов;
фиг. 52 представляет собой графическое изображение процента циркулирующих pDC (по логарифмической шкале) в цельной крови здоровых обезьян циномолгус в разные точки времени перед внутривенной инъекцией BIIB059. В указанные точки времени проводили забор цельной крови, и путем проточной цитометрии определяли клетки pDC как CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. Процент клеток pDC рассчитывали с помощью программного обеспечения FlowJo и графически отображали с помощью программного обеспечения R;
фиг. 53 демонстрирует конечную подогнанную модель, соответствующую проценту циркулирующих pDC (по логарифмической шкале) в цельной крови здоровой обезьяны циномолгус в разные точки времени перед в/в инъекцией BIIB059. Линейная модель со смешанными эффектами для логарифмического значения (% pDC) в разные точки времени в качестве фиксированных факторов и обезьян циномолгус в качестве случайных отрезков, показывает отсутствие различий между соотношениями геометрических средних значений % pDC, измеряемых по недельным различиям (p-значение на основе F-теста для всех временных эффектов, равных нулю, составляет 0,67). Диаграмма и статистический анализ были рассчитаны с использованием языка R для статистических расчетов. Сплошная линия обозначает конечную подогнанную модель, которая включает только фиксированный отрезок и случайные отрезки для обезьян циномолгус. Был использован пакет Ime4 в языке R для соответствия линейной модели со смешанными эффектами;
фиг. 54 обозначает процент циркулирующих pDC по логарифмической шкале до и после в/в введения обезьянам циномолгус дозы цитрата натрия как носителя, BIIB059 в дозе 1 мг/кг или BIIB059 в дозе 10 мг/кг. Дозы вводили в точке времени 0 трем обезьянам циномолгус в каждой группе. В указанные точки времени забирали цельную кровь и способом проточной цитометрии идентифицировали клетки pDC как CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. Процент клеток pDC рассчитывали в программном обеспечении FlowJo и графически с помощью программного обеспечения R;
фиг. 55 - конечную подогнанную модель процентов циркулирующих pDC по логарифмической шкале до и после в/в введения обезьянам циномолгус дозы цитрата натрия как носителя, 1 и 10 мг/кг BIIB059. Использовали линейную модель со смешанными эффектами для логарифмических (% pDC) значений с фиксированными факторами для группы по дозе, значений времени 1, 6 ч и более 28 дней, и со случайным отрезком для обезьян циномолгус. Сплошная линия обозначает конечную подогнанную модель. Был использован пакет Ime4 в языке R для соответствия линейной модели со смешанными эффектами. Диаграмма и статистический анализ были рассчитаны с использованием языка R для статистических расчетов;
фиг. 56 показывает процент циркулирующих pDC после п/к введения обезьянам циномолгус BIIB059 в дозе 0,2 мг/кг. Обезьянам циномолгус № 4, 6 и 12 проводили однократную подкожную инъекцию BIIB059 в дозе 0,2 мг/кг в точке времени 0. Обезьяне циномолгус № 6 из этих трех обезьян в преды- 10 034757 дущем исследовании вводили BIIB059. Обезьянам циномолгус № 4 и 12 в предыдущем исследовании вводили носитель. В указанные моменты времени проводили забор цельной крови и способом проточной цитометрии идентифицировали pDC как CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. Процент клеток pDC рассчитывали в программном обеспечении FlowJo, и графически с помощью программного обеспечения R;
фиг. 57 обозначает конечную подогнанную модель процентов циркулирующих pDC по логарифмической шкале после п/к введения обезьянам циномолгус BIIB059 в дозе 0,2 мг/кг. Использовали линейную модель со смешанными эффектами для логарифмических (% pDC) значений с фиксированными эффектами для непрерывного времени и точки времени 1 ч, и со случайным отрезком для обезьян циномолгус. Сплошная линия обозначает конечную подогнанную модель. Был использован пакет Ime4 в языке R для соответствия линейной модели со смешанными эффектами. Диаграмма и статистический анализ были рассчитаны с использованием языка R для статистических расчетов;
фиг. 58 является схематическим представлением схемы ФК/ФД эксперимента с обезьянами циномолгус. Исследование с внутривенным (в/в) введением завершили девять обезьян циномолгус. У обезьян циномолгус брали кровь до и после внутривенного введения носителя, 1 мг/кг BIIB059 или 10 мг/кг BIIB059 в соответствии с показанной схемой забора крови. После завершения этого исследования 3 обезьяны циномолгус продолжили участие в исследовании с подкожным (п/к) введением дозы, в котором они получали однократную подкожную инъекцию 0,2 мг/кг BIIB059. Во время каждого забора крови проводили анализ цельной крови, при этом цельную кровь обезьян циномолгус разводили 1:4 полной средой RPMI 1640, стимулировали CpG-A до конечной концентрации 200 мкг/мл в 96-луночных круглодонных планшетах для тканевых культур, и инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 18-20 ч. В конце культивирования стимулированную цельную кровь центрифугировали для получения сыворотки. В биоанализе MxA клетки A549 стимулировали собранной сывороткой в течение 19-20 ч при 37°C и 5% CO2, чтобы индуцировать белок MxA. Через 20 ч клетки A549 подвергали лизису и проводили сэндвич-ELISA для определения концентраций белка MxA. Выполняли обратный расчет уровней ИФНц (Ед/мл) по стандартной кривой, полученной при обработке клеток A549 возрастающими дозами rИФHα;
фиг. 59 представляет собой графическое представление тенденции к снижению TLR9индуцированной продукции ИФНц у обезьян циномолгус, получавших однократную внутривенную дозу BIIB059, по сравнению со средними показателями перед введением. Цельную кровь обезьян циномолгус, получивших однократную внутривенную дозу носителя, 1 мг/кг BIIB059 или 10 мг/кг BIIB059, разводили 1:4 полной средой RPMI 1640, стимулировали CpG-A (2216) до конечной концентрации 200 мкг/мл в 96-луночных круглодонных планшетах для тканевых культур, и инкубировали при 37°C 5% CO2 в течение 18-20 ч. В конце культивирования стимулированную цельную кровь центрифугировали для получения сыворотки. Клетки A549 стимулировали собранной сывороткой в течение 18-20 ч при 37°C и 5% CO2 для индуцирования белка MxA. Через 20 ч клетки A549 подвергали лизису и проводили сэндвич-ELISA для определения концентраций белка MxA. Выполняли обратный расчет уровней ИФНа (Ед/мл) по стандартной кривой, полученной при обработке клеток A549 возрастающими дозами гИФНа. Среднюю концентрацию ИФНа перед забором крови рассчитывали для каждой обезьяны путем усреднения всех измерений ИФНа в точках времени перед забором крови (дни 21, 14, 7 и точке времени 0). Затем рассчитывали % ИФНа для каждой точки времени забора крови после введения BIIB059 до дня 14 путем деления концентрации ИФНа, установленной на тот момент, на средний показатель для этого животного перед забором крови, и умножения на 100. Получали усредненные значения для каждой группы введения. Диаграммы обозначают среднее значение ± стандартная ошибка среднего отклонения. Диаграмма и статистический анализ были рассчитаны с использованием программного обеспечения Excel и GraphPad 6.0 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния);
фиг. 60 - графическое изображение уменьшенной TLR9-индуцированной продукции ИФНа в анализе ex vivo цельной крови обезьян циномолгус, получавших внутривенно BIIB059. Цельную кровь обезьян циномолгус, получивших однократную внутривенную дозу носителя (верхняя диаграмма), 1 мг/кг BIIB059 (средняя диаграмма) или 10 мг/кг BIIB059 (нижняя диаграмма), разводили 1:4 полной средой RPMI 1640, стимулировали CPG-A (2216) до конечной концентрации 200 мкг/мл в 96-луночных круглодонных планшетах для тканевых культур и инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 18-20 ч. В конце культивирования стимулированную цельную кровь центрифуговали для получения сыворотки. Клетки A549 стимулировали собранной сывороткой в течение 19-20 ч при 37°C и 5% CO2, чтобы индуцировать белок MxA. Через 20 ч клетки A549 подвергали лизису и проводили сэндвич-ELISA для определения концентраций белка MxA. Выполняли обратный расчет уровней ИФНа (Ед/мл) по стандартной кривой, полученной при обработке клеток A549 возрастающими дозами гИФНз. Двусторонний дисперсионный анализ смешанных эффектов (ANOVA) был подобран для значений log10 рассчитанных концентраций ИФНа. Значения ИФНа выстраивали (по шкале log10) в зависимости от дня забора крови для каждого животного в каждой группе введения. Вертикальные линии обозначают дни забора крови, сгруппированные по принципу перед введением, после введения дозы до дня 31, и после введения дозы позднее дня 31. Забор крови в срок позднее дня 31 в данном анализе не производился. Оценки на основе модели геометрических средних значений ИФНа обозначены толстыми черными горизонтальными линиями в области каждой диаграммы, относящейся к показателям перед введением дозы и после введения. Расчеты
- 11 034757 диаграмм и статистический анализ проводили с использованием языка R для статистических расчетов; фиг. 61 - графическое изображение уменьшенной TLR9-индуцированной продукции ИФНа в анализе ex vivo цельной крови обезьян циномолгус после подкожного введения BIIB059. Цельную кровь от обезьян циномолгус, получивших однократную подкожную дозу 0,2 мг/кг BIIB05910, разводили 1:4 полной средой RPMI 1640, стимулировали CPG-A (2216) до конечной концентрации 200 мкг/мл в 96луночных круглодонных планшетах для тканевых культур и инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 19-20 ч. В конце культивирования стимулированную цельную кровь центрифуговали для получения сыворотки. Клетки A549 стимулировали собранной сывороткой в течение 19-20 часов при 37°C и 5% CO2, чтобы индуцировать белок MxA. Через 20 ч клетки A549 подвергали лизису и проводили сэндвич-ELISA для определения концентраций белка MxA. Выполняли обратный расчет уровней ИФНа (Ед/мл) по стандартной кривой, полученной при обработке клеток A549 возрастающими дозами гИФНа. Двусторонний дисперсионный анализ смешанных эффектов (ANOVA) был подобран для значений log10 рассчитанных концентраций ИФНа. Значения ИФНа выстраивали (по log10) в зависимости от дня забора крови для каждого животного в каждой группе введения. Вертикальные линии обозначают дни забора крови, сгруппированные по принципу перед введением, после введения дозы до дня 33, и после введения дозы позднее дня 33. Забор крови в срок позднее дня 33 в данном анализе не производился. Оценки на основе модели геометрических средних значений ИФНа обозначены толстыми черными горизонтальными линиями в области каждой диаграммы, относящейся к показателям перед введением дозы и после введения. Расчеты диаграмм и статистический анализ проводили с использованием языка R для статистических расчетов.
Подробное описание
BIIB059 является репрезентативным моноклональным антителом, которое специфично связывается с BDCA2 человека. Антитела против BDCA2 по изобретению ингибируют продукцию pDC и/или секрецию цитокинов и хемокинов. Кроме того, антитела против BDCA2 по изобретению могут понижающе регулировать уровни CD32a и/или CD62L на поверхности клеток pDC. Также антитела против BDCA2 по изобретению могут опосредовать интернализацию BDCA2 с поверхности клеток pDC. Дополнительно антитела против BDCA2 по изобретению можно использовать для истощения клеток pDC посредством ADCC или CDC, и их можно применять для лечения или профилактики иммунологических заболеваний, таких как воспалительные и аутоиммунные состояния. В настоящем изобретении также показано, что комбинация противомалярийного агента и антитела против BDCA2 по изобретению может дать улучшенные эффекты по сравнению с лечением каждым препаратом в отдельности. BDCA2 BDCA2 представляет собой лектин C-типа II типа, который специфично экспрессируется на клетках pDC. BDCA2 состоит из единственного внеклеточного домена распознавания углеводов (CRD) на его C-конце, трансмембранной области и короткого цитоплазматического хвоста на его N-конце, который не содержит сигнальный мотив. BDCA2 передает внутриклеточные сигналы посредством ассоциированного трансмембранного адаптора FccRIy (фиг. 1). Антитело-опосредованное лигирование BDCA2 приводит к рекрутингу селезеночной тирозинкиназы (SYK) в активирующий мотив на основе фосфорилированного иммунорецепторного тирозина (ITAM) в FccRIy. Активация Syk приводит к активации B-клеточного линкера (Blnk), тирозинкиназы Брутона (ВТК) и фосфолипазы Cy2 (PLCy2), что приводит к мобилизации Ca2 +.
Аминокислотная последовательность человеческого белка BDCA2 (номер доступа в Genbank NP_569708.1) показана ниже (трансмембранный домен выделен курсивом; эктодомен подчеркнут)
MVPEEEPQDR EKGLWWFQLK VWSMAVVSIL LLSVCFTVSS WPHNFMYSK
TVKRLSKLRE YQQYHPSLTC VMEGKDIEDW SCCPTPWTSF QSSCYFISTG
101 MOSWTKSOKN CSVMGADLW INTREEODFI IONLKRNSSY FLGLSDPGGR
151 RHWOWVDOTP YNENVTFWHS GEPNNLDERC AIINFRSSEE WGWNDIHCHV
201 PQKSICKMKK IYI* (SEQ ID N0:1)
Аминокислотная последовательность человеческого FceRIy (номер доступа в Genbank NP_004097.1) показана ниже
MIPAWLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV
RKAAITSYEK SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQ* (SEQ ID N0:2)
Ближайший гомолог крысиного BDCA2, крысиный Clec4b2 (номер доступа в Genbank NM_001005896), имеет только 51,0% идентичности с BDCA2 человека. В противоположность этому BDCA2 обезьян циномолгус и резус имеют 90,6% идентичности с BDCA2 человека. В дополнение, последовательность белка FceRIy обезьян циномолгус и резус, которые идентичны друг другу, имеет 98,9% идентичности с человеческим белком FceRIy.
Белки BDCA2 человека, обезьян циномолгус и резус могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения антител против BDCA2. Для создания человеческих антител против BDCA2 можно использовать человеческий белок BDCA2 в качестве иммуногена. Затем античеловеческие BDCA2 антитела можно подвергать скринингу для выявления антител, имеющих один или несколько признаков, описанных в настоящем изобретении (например, уменьшение продукции/секреции одного или нескольких
- 12 034757 интерферонов типа I или типа III, ИЛ-6, ФНО-α, MIP-Ια, MIP-Ιβ, CCL5 и IP10/CXCL10; истощение клеток pDC; конкурирование с BIIB059 за связывание с внеклеточным доменом BDCA2; селективное связывание с эктодоменом BDCA2 человека, обезьян циномолгус и резус, но при этом отсутствие связывания с
Clec4b2 крысы; ингибирование развития заболевания в модели псориатического ксенотрансплантата у человека).
Антитела против BDCA2.
Настоящее изобретение включает последовательности моноклонального антитела BIIB059, которое связывается с BDCA2 человека, обезьян циномолгус и резус, но не связывается с Clec4b2 крысы. BIIB059 не связывается или показывает незначительное связывание с BDCA2 от филогенетических видов нижеуказанных приматов.
BIIB059.
BIIB059 представляет собой гуманизированное IgG1 антитело, которое специфично распознает BDCA2 на поверхности плазмоцитоидных дендритных клеток. Оно было получено из мышиного антитела (24F4), которое связывается с BDCA2 следующим образом. Плазмиду, кодирующую полноразмерный человеческий BDCA2, вводили мышам с помощью генной пушки. Спленоциты из этой мыши были слиты с клетками миеломы, и полученная гибридома продуцировала антитела 24F4. С помощью генноинженерных технологий вставляли антитела 24F4 в каркас человеческого IgG1 дикого типа для поддержания полной эффекторной функции. Предсказанные аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей зрелого BIIB059 представлены ниже.
Области, определяющие комплементарность (CDR) 1, 2 и 3 вариабельной легкой цепи (VL) и вариабельной тяжелой цепи (VH), приведены в порядке от N-концу к C-концу зрелых последовательностей VL и VH, и обе из них подчеркнуты и выделены жирным шрифтом. Ниже приведены последовательности зрелой тяжелой цепи (SEQ ID NO: 4) и зрелой легкой цепи (SEQ ID NO: 3), составляющие антитело, которое называется BIIB059.
Легкая цепь (LC) зрелого BIIB059
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGKAPKL LIYAASTLES
IGVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQANEDPR TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID N0:3)
Тяжелая цепь (HC) зрелого BIIB059
DVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS TYTMSWVROA PGKGLEWVAT ISPGDSFGYY
YPDSVQGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCTRD IYYNYGAWFA YWGOGTLVTV
SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G (SEQ ID N0:4)
Вариабельная легкая цепь (VL) BIIB059 имеет следующую аминокислотную последовательность DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGKAPKL LIYAASTLES
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQANEDPR TFGQGTKVEI К (SEQ ID
NO :2 3)
Вариабельная тяжелая цепь (VH) BIIB059 имеет следующую аминокислотную последовательность
DVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS TYTMSWVROA PGKGLEWVAT ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCTRD IYYNYGAWFA YWGOGTLVTV SS (SEQ ID N0:24)
Аминокислотные последовательности областей CDR VL в BII059 перечислены ниже
VL CDR1: KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID N0:5);
VL CDR2: AASTLES (SEQ ID N0:6); и
VL CDR3: QQANEDPRT (SEQ ID N0:7).
Аминокислотные последовательности областей CDR VH в BII059 перечислены ниже
VH CDR1: TYTMS (SEQ ID N0:8) (CDR1 no Kabat) или
GFTFSTYTMS (SEQ ID N0:9) (расширенная no Chothia/AbM
CDR1);
VH CDR2: TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID N0:10);
VH CDR3: DIYY YGAWFAY (SEQ ID N0:11).
- 13 034757
Как указано выше, согласно расширенному определению по Chothia/AbM CDR область VH CDR1 на 5 аминокислот длиннее, чем по определению этой области CDR по Kabat. Пять дополнительных аминокислот VH CDR1 согласно расширенному определению по Chothia/AbM представляют собой GFTFS (SEQ ID NO: 12).
Антитела против BDCA2 по изобретению также могут содержать в BIIB059 альтернативные области CDR. Альтернативными CDR считаются CDR (CDR1, CDR2 и CDR3), которые определены в соответствии с любой одной из систем Chothia, AbYsis, расширенной Chothia/AbM CDR или контактных определений. Эти альтернативные CDR могут быть получены, например, с помощью базы данных AbYsis (www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi). Аминокислотные последовательности из альтернативных областей CDR 1, 2 и 3 из вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи BIIB059 сравниваются с областями CDR, определенными в соответствии с нумерацией по Kabat в таблице ниже
Домен Определение по Rabat Определение no Chothia от Abysis Расширенное определение по Chothia/AbM Контакт
VH CDR1 TYTMS (SEQ ID N0:8) GFTFSTY (SEQ ID NO :8 9) GFTFSTYTMS (SEQ ID N0:9) STYTMS (SEQ ID N0:90)
VH CDR2 TISPGDSFGYYYP DSVQG (SEQ ID NO :10) SPGDSFG (SEQ ID N0:91) TISPGDSFGYY (SEQ ID N0:92) WVATISPGDSF GYY (SEQ ID N0:93)
VH CDR3 DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO :11) DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO :11) DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO :11) TRDIYYNYGAW FA (SEQ ID N0:94)
VL CDR1 KASQSVDYDGDSY MN (SEQ ID N0:5) KASQSVDYDGDS YMN (SEQ ID N0:5) KASQSVDYDGDS YMN (SEQ ID N0:5) DYDGDSYMNWY (SEQ ID N0:95)
VL CDR2 AASTLES (SEQ ID N0:6) AASTLES (SEQ ID N0:6) AASTLES (SEQ ID N0:6) LLIYAASTLE (SEQ ID N0:96)
VL CDR3 QQANEDPRT (SEQ ID N0:7) QQANEDPRT (SEQ ID N0:7) QQANEDPRT (SEQ ID N0:7) QQANEDPR (SEQ ID N0:97)
Антитела против BDCA2 могут включать CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи в соответствии с определением по Kabat, определением по Chothia от Abysis, расширенным определением по Chothia/AbM CDR или контактным определением. Эти антитела обладают следующими свойствами (i) связываются с BDCA2 человека или обезьян циномолгус, но не показывают значительного связывания с BDCA2 от филогенетических видов нижеуказанных приматов; и/или (ii) ингибируют продукцию TLR7/TLR9-индуцированного интерферона I типа и продукцию других цитокинов или хемокинов посредством человеческих pDC; и/или (iii) опосредуют интернализацию BDCA2 с поверхности клеток pDC; и/или (iv) подавляют CD32a и/или CD62L на поверхности pDC; и/или (v) истощают клетки pDC in vitro посредством ADCC или CDC.
Антитела IgG человека представляют собой тетрамерные молекулы, содержащие две легкие цепи и две тяжелые цепи. Каждая легкая цепь BIIB059 ковалентно связана с тяжелой цепью посредством межцепочечной дисульфидной связи (LC Cys 218 - HC Cys 225), и тяжелые цепи спарены друг с другом с помощью двух межцепочечных дисульфидов (НС Cys 231-Cys 231 и Cys 234-Cys 234). Все остальные цистеины образуют внутримолекулярные дисульфиды, которые стабилизируют константные и вариабельные домены.
В некоторых вариантах осуществления антитела против BDCA2 включают константную область тяжелой цепи и легкой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи содержит домен CH1 и шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления констант- 14 034757 ная область тяжелой цепи содержит домен CH3. Если константная область тяжелой цепи включает замены, то такие замены модифицируют свойства антитела (например, увеличивают или уменьшают одно или несколько из следующих свойств: связывание с Fc-рецептором, гликозилирование антитела, число цистеиновых остатков, функцию эффекторных клеток или функцию комплемента). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой IgG антитело. В конкретных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с аффинностью от 7 до 15 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRII (CD32a) с EC50 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 11 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело включает Fc-область человека, которая связывается с FcyRIIa (CD32a) с EC50 12 мкг/мл. В табл. 1 приведен перечень свойств антитела BIIB059.
Таблица 1
Молекулярная масса (рассчитанная/фактическая дегликозилированная) 146348,2 Да/146352 Да
Молекулярная масса (дегликозилированная тяжелая цепь, предполагаемая/фактическая) 49425,8 Да/49424 Да
Молекулярная масса (легкая цепь, предполагаемая/ фактическая) 23764,3 Да/23765 Да
Молекулярная масса (SDS-PAGE) 150000 Да
Коэффициент экстинкции (1 мг/мл) 1,46 мл/мг/см при 280 нм
Максимальная абсорбция 275 нм
р! (рассчитанная) 7,26
р! (изоэлектическое фокусирование IEF) Основной компонент 7,01 Минорные компоненты 6, 90, 6, 81, 6, 78, 7,09
ЕС50 BDCA2 человека (FACS) 7 нМ
ЕС50 BDCA2 циномолгус (FACS) 7 нМ
Модуляция температуры в диференциальной сканирующей калориметрии (Tm - DSC) СН2: 72°С Fab: 68,6°С, 75, 9°С СНЗ: 85°С
Свободный SH 0,4/моль (1,1%)
Гликация 0,1 моль/моль BIIB059
N-связанное гликозилирование RRS1 G0 (69%) G1 (23,9%) G2 (2,2%) А-гликозилированные (1%)
Образец буфера для композиции 20 мМ цитрата натрия, 150 мМ NaCl, pH 6,0
Растворимость в буфере композиции >150 мг/мл
Агрегация (SEC) 0,2%
Агрегация (AUC) 0,3% (в основном димеры)
Т1/2 7,3 дня у крыс
Эндотоксин 0,05 EU/мг белка
- 15 034757
BIIB059 проявляет подходящие физико-химические свойства для терапевтического антитела. Это антитело показывает низкие уровни аггрегации. Каркас IgG1 дикого типа содержит в молекуле один Nсвязанный сайт гликозилирования и BIIB059 и связывается с Fc-рецепторами с аффинностью, которая типична для этого класса молекул. Расчетный индекс pI 7,26 является несколько низким для антитела. Исходя из гетерогенности заряда, выявленной у BIIB059, предполагается, что значительная часть BIIB059 содержит модификации. Такая гетерогенность заряда обусловлена, по меньшей мере частично, уровнем гликации примерно до 10%, который был определен в очищенных партиях BIIB059. Показатель сворачивания Tm для BIIB059 находится на нижнем конце типичных значений, наблюдаемых у антител, тогда как эти показатели для доменов CH2 и CH3 характерны для полностью гликозилированного мАт IgG1. На основании дифференциальной сканирующей флуориметрии и измерений вязкости можно создавать рецептуру BIIB059, например, с концентрацией 50 мг/мл, в 20 мМ цитрата натрия, 150 мМ NaCl, с уровнем pH 6,0. Это антитело может быть также приготовлено в более высоких концентрациях, например, от 150 до 300 мг/мл (например, 150, 200, 250, 300 мг/мл).
BIIB059 является полностью гуманизированным, Fc-функционально компетентным мАт IgG1, которое демонстрирует высокую аффинность к BDCA2 и связывается одинаково хорошо с нативным BDCA2 человека и BDCA2 обезьян циномолгус. BIIB059 является мощным ингибитором всех TLR9индуцированных интерферонов I типа, а также других цитокинов и хемокинов посредством клеток pDC. У здоровых доноров и больных СКВ антитело BIIB059 проявляет одинаковый потенциал ингибирования TLR9-индуцированного интерферона I типа посредством клеток pDC. BIIB059 посредством pDC специфично ингибирует TLR9-индуцированный ИФН типа I и не влияет на продукцию ИФН посредством других типов клеток, которая запускается другим TLR лигандом. BIIB059 вызывает быструю интернализацию BDCA2 с клеточной поверхности. При стимуляции BDCA2 колокализуются с TLR9 в эндосомальном/лизосомальном компартменте, который представляется необходимым для ингибирования сигнального пути TLR9. Было установлено, что BIIB059 вызывает шеддинг CD62L с поверхности человеческих pDC, что может повлиять на их возвращение в органы-мишени (хоуминг). В исследованиях in vitro антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) было показано, что BIIB059 может проявлять действие истощения клеток в клеточных линиях с гиперэкспрессией BDCA2. Однако тот факт, что BIIB059 вызывает быструю и полную интернализацию BDCA2 с поверхности клеток pDC, снижает вероятность эффекта BIIB059 в виде устойчивого истощения pDC in vivo. Комбинация BIIB059 и гидроксихлорохина (HCQ) вызывает эффект аддитивного ингибирования TLR7- и TLR9-индуцированной продукции ИФНц посредством PBMC у здоровых доноров. Эти данные подчеркивают потенциальный аддитивный терапевтический эффект при введении BIIB059 с противомалярийными соединениями, такими как HCQ.
Антитела, такие как BIIB059, можно создавать, например, путем подготовки и экспрессии синтетических генов, которые кодируют перечисленные аминокислотные последовательности, или путем мутации генов зародышевой линии человека, чтобы получить ген, который кодирует перечисленные аминокислотные последовательности. Кроме того, это антитело и другие антитела против BDCA2 могут быть получены, например, с использованием одного или нескольких из указанных ниже способов.
Способы получения антител против BDCA2.
Существует множество способов получения антител, в частности антител человека. Один способ, в качестве примера, включает скрининг библиотек экспрессии белка, например библиотек фаговых или рибосомных дисплеев. Способ фагового дисплея описан, например, в патенте US 5223409, Smith, Science, 228: 1315-1317 (1985), в патентах WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690, WO 90/02809. Способ дисплея Fab на фагах описан, например, в патентах США № 5658727, 5667988 и 5885793.
В дополнение к использованию дисплейных библиотек, можно задействовать другие способы для получения BDCA2-связывающего антитела. Например, можно использовать белок BDCA2 или его пептид в качестве антигена у животного нечеловеческого происхождения, например у грызунов, таких как мышь, хомяк или крыса. Дополнительно, клетки, трансфицированные кДНК, которая кодирует BDCA2, можно вводить животному нечеловеческого происхождения в качестве способа получения антител, которые эффективно связываются с белком BDCA2 клеточной поверхности.
В одном из вариантов осуществления животное, не являющееся человеком, включает по меньшей мере часть гена иммуноглобулина человека. Например, можно создать линию мышей с дефицитом продукции антитела мыши с большими фрагментами локусов человеческого Ig. С помощью технологии гибридомы можно получать и проводить селекцию антиген-специфичных моноклональных антител, полученных из генов с желаемой специфичностью. См., например, публикации XENOMOUSE™, Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994), патенты US 2003-0070185, WO 96/34096 и WO 96/33735.
В другом варианте осуществления моноклональное антитело получают из животного нечеловеческого происхождения, после чего его модифицируют, например проводят гуманизацию или деиммунизацию. В патенте US 5225539 автор Winter описывает в качестве примера способ трансплантации CDR, который может быть использован для получения гуманизированных антител по изобретению. Все или некоторые из областей CDR конкретного антитела человека могут быть заменены по меньшей мере ча- 16 034757 стью из нечеловеческого антитела. Для получения эффективного гуманизированного антитела, которое связывается с BDCA2, может потребоваться только замена областей CDR, необходимых для связывания, или замена связывающих детерминант таких CDR.
Гуманизированные антитела могут быть получены путем замены последовательностей вариабельной области Fv, которые непосредственно не вовлечены в связывание антигена, на эквивалентные последовательности из вариабельных областей Fv человека. Общие способы создания гуманизированных антител представлены в публикациях Morrison S.L., Science, 229: 1202-1207 (1985), Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986), и в патентах US 5585089, US 5693761, US 5693762, US 5859205 и US 6407213. Эти способы включают выделение, обработку и экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют все или часть вариабельных областей Fv иммуноглобулина, по меньшей мере из одной тяжелой или легкой цепи. Источники таких нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам в данной области техники и могут быть получены, например, из гибридомы, продуцирующей антитело против заранее определенной мишени, как описано выше, из генов иммуноглобулина зародышевой линии или из синтетических конструкций. Затем можно клонировать рекомбинантную ДНК, кодирующую гуманизированное антитело, в соответствующий вектор экспрессии.
Последовательности зародышевой линии человека раскрыты, например, в публикациях Tomlinson LA. et al., J. Mol. Biol., 227:776-798 (1992); Cook G.P. et al., Immunol. Today, 16: 237-242 (1995); Chothia D. et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992); и Tomlinson et al., EMBO J., 14:4628-4638 (1995). Каталог V Base представляет полный справочник вариабельных областей последовательности иммуноглобулина человека (составленный авторами Tomlinson L.A. et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Эти последовательности могут быть использованы в качестве источника последовательности человека, например, для каркасных областей и CDR. Также можно использовать консенсусные каркасные области человека, например, как описано в патенте США № 6300064.
BDCA2-связывающие антитела нечеловеческого происхождения также могут быть модифицированы путем специфичной делеции эпитопов человеческих T-клеток или способами деиммунизации, описанными в патентах WO 98/52976 и WO 00/34317. Коротко, можно проводить анализ вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела на пептиды, которые связываются с главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса II; эти пептиды представляют собой потенциальные T-клеточные эпитопы (как определено в WO 98/52976 и WO 00/34317). Для обнаружения потенциальных T-клеточных эпитопов можно применять подход компьютерного моделирования, называемый протягивание пептида, и, дополнительно, можно проводить поиск в базе человеческих пептидов, связывающихся с МНС класса II, для выявления мотивов, присутствующих в последовательностях VH и VL, как описано в патентах WO 98/52976 и WO 00/34317. Эти мотивы связываются с каким-либо из 18 основных DR аллотипов МНС класса II и таким образом представляют собой потенциальные T-клеточные эпитопы. Обнаруженные потенциальные T-клеточные эпитопы могут быть удалены путем замены небольшого числа аминокислотных остатков в вариабельных областях или предпочтительно путем единичных аминокислотных замен. Насколько это возможно, выполняют консервативные замены. Часто, но не исключительно, можно использовать аминокислоты, обычные для положении в человеческой последовательности зародышевой линии антитела. После идентификации деиммунизирующих изменений можно конструировать нуклеиновые кислоты, кодирующие VH и VL, с помощью мутагенеза или другими способами синтеза (например, путем синтеза de novo, замены кассеты и т.д.). Мутагенезированная вариабельная последовательность может быть слита, если это желательно, с человеческой константной областью, например, с константными областями человеческого IgG1 или каппа.
В некоторых случаях потенциальный T-клеточный эпитоп включает остатки, которые являются важными для функции антитела или предполагаются таковыми. Например, потенциальные T-клеточные эпитопы обычно смещены в сторону CDR. Дополнительно, потенциальные T-клеточные эпитопы могут встречаться в каркасных остатках, важных для структуры антитела и связывания антитела. Для изменений в целях удаления этих потенциальных эпитопов в некоторых случаях могут потребоваться более тщательные манипуляции, например получение и тестирование цепей с изменениями и без изменений. Где это возможно, потенциальные T-клеточные эпитопы, которые накладываются на области CDR, могут быть удалены путем замены за пределами CDR. В некоторых случаях изменение в CDR представляет собой единственный вариант, и таким образом варианты с такой заменой и без замены можно подвергать тестированию. В других случаях замещение, необходимое для удаления потенциального T-клеточного эпитопа, находится в положении остатка в пределах каркаса, что может иметь решающее значение для связывания антитела. В этих случаях проводят тестирование вариантов с такой заменой и без замены. Таким образом, в некоторых случаях разрабатывают несколько вариантов деиммунизированной вариабельной области тяжелой и легкой цепи и проводят тестирование разных комбинаций тяжелых/легких цепей для идентификации оптимального деиммунизированного антитела. Затем можно проводить отбор конечного деиммунизированного антитела с учетом аффинности связывания различных вариантов в комбинации со степенью деиммунизации, в частности, с количеством потенциальных T-клеточных эпитопов, оставшихся в вариабельной области. Деиммунизация может быть использована для модификации любого антитела, например, антитела, которое включает последовательность человеческого происхож- 17 034757 дения, например, синтетического антитела, мышиного антитела, отличного от нечеловеческого моноклонального антитела, или антитела, выделенного из библиотеки дисплеев.
Также можно использовать другие способы гуманизации антител. Например, другие способы могут учитывать трехмерную структуру антитела, каркасные положения, которые находятся в трехмерной близости к связывающим детерминантам, и иммуногенные пептидные последовательности. См., например, патенты WO 90/07861, патенты США № 5693762, 5693761, 5585089, 5530101 и 6407213, и публикацию Tempest et al. (1991) Biotechnology 9: 266-271. Еще один способ, называемый гуманирингом, описан, например, в патенте США 2005-008625.
Антитело может включать Fc-область человека, например Fc-область дикого типа или Fc-область, которая включает одну или несколько изменений. В одном из вариантов осуществления константная область является измененной, например мутантной, для модификации свойств антитела (например, для увеличения или уменьшения одного или нескольких из следующих свойств: связывание с Fcрецептором, гликозилирование антител, число цистеиновых остатков, функции эффекторных клеток или функции комплемента). Например, константная область IgG1 человека может подвергаться мутации в одном или нескольких остатках, например в одном или нескольких остатках 234 и 237 (на основе нумерации Kabat). Антитела могут нести мутации в области тяжелой цепи CH2, которые уменьшают или изменяют эффекторную функцию, например связывание Fc-рецептора и активацию комплемента. Например, антитела могут нести мутации, такие как мутации, описанные в патентах США № 5624821 и 5648260. Антитела могут также иметь мутации, которые стабилизируют дисульфидную связь между двумя тяжелыми цепями иммуноглобулина, такие как мутации в шарнирной области IgG4, как описано в области, к которой относится настоящее изобретение (например, Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 105-08). См. также, например, US 2005-0037000.
Созревание аффинности.
В одном из вариантов осуществления антитело против BDCA2 подвергается модификации, например путем мутагенеза, для получения пула модифицированных антител.
В отличие от областей CDR, в структуре каркасных областей (FR) можно делать более существенные изменения без неблагоприятного эффекта на свойства связывания антитела. Изменения в областях FR включают без ограничения гуманизацию каркаса нечеловеческого происхождения или конструирование определенных каркасных остатков, которые важны для контакта с антигеном или для стабилизации сайта связывания, например, для изменения класса или подкласса константной области, изменения специфичных аминокислотных остатков, которые могут изменять эффекторную функцию, такую как связывание с Fc-рецептором (Lund et al., J. Immun., 147:2657-62 (1991); Morgan et al., Immunology, 86:319-24 (1995)), или для изменения видов, из которых получают константную область.
В изобретении рассмотрены композиции, содержащие смесь из антитела против BDCA2, и одного или нескольких его кислотных вариантов, например, смесь, в которой количество кислотного варианта (вариантов) составляет менее чем приблизительно 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 или 1%. Также расматриваются композиции, содержащие антитело против BDCA2, содержащее по меньшей мере один сайт дезамидирования, при этом уровень pH композиции составляет от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5, таким образом, что, например, по меньшей мере приблизительно 90% антител против BDCA2 не деамидированы (т.е. менее чем приблизительно 10% антител являются деамидированными). В некоторых вариантах осуществления менее чем приблизительно 5, 3, 2 или 1% антител деамидированы. Уровень pH может составлять от 5,0 до 6,0, например, 5,5 или 6,0. В некоторых вариантах осуществления уровень pH композиции составляет 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 или 6,5.
Кислотный вариант является вариантом представляющего интерес полипептида, который имеет более высокую кислотность (например, определяемую с помощью катионообменной хроматографии), чем представляющий интерес полипептид. Примером кислотного варианта является деамидированный вариант.
Деамидированный вариант полипептидной молекулы представляет собой полипептид, в котором один или несколько остатков аспарагина из исходного полипептида был преобразован в аспартат, т.е. нейтральный амид боковой цепи был преобразован в остаток с общим кислотным характером.
Термин смесь, используемый в изобретении по отношению к композиции, содержащей антитело против BDCA2, означает присутствие как желаемого антитела против BDCA2, так и одного или нескольких его кислотных вариантов. Кислотные варианты могут содержать преимущественно деамидированное антитело против BDCA2, с незначительными количествами другого кислотного варианта (вариантов).
В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания (KD), скорость ассоциации (KD on) и/или скорость диссоциации (KD off) антитела, которое подверглось мутации с устранением дезамидирования, аналогична аффинности связывания антитела дикого типа, то есть, например, разница составляет менее чем приблизительно 5, 2, 1 раз (100%), 50, 30, 20, 10, 5, 3, 2 или 1%.
В некоторых вариантах осуществления антитело против BDCA2, или его низкомолекулярные антитела связываются с BDCA2 на клетках pDC, и посредством pDC ингибируют или уменьшают продукцию и/или секрецию интерферонов I типа или III типа, ИЛ-6, ФНО-α, MIP-1-o/CCL3, MIP-1-3/CCL4, CCL5/RANTES или IP10/CXCL10; и/или истощают клетки pDC посредством ADCC или CDC или апоп- 18 034757 тоза; и/или уменьшают степень тяжести симптомов при введении пациентам-людям или животным моделям, у которых имеется одно или несколько из следующих заболеваний: системная красная волчанка, кожная волчанка, дискоидная волчанка, волчаночный нефрит. В одном из вариантов осуществления антитело против BDCA2 тормозит развитие болезни в модели псориатического ксенотрансплантата у человека (Nestle et al., J. Exp. Med., 202 (1): 135-143. (2005)). Эти свойства антитела против BDCA2 могут быть измерены в соответствии со способами, описанными в разделе примеров, а также с помощью других способов, известных в данной области техники.
Биспецифичные антитела.
Биспецифичные антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью связывания, по меньшей мере, в отношении двух разных эпитопов. Приведенные в качестве примера биспецифичные антитела могут связываться с двумя разными эпитопами белка BDCA2. В других таких антителах может комбинироваться сайт связывания BDCA2 с сайтом связывания для другого белка. Биспецифичные антитела можно получать в виде полноразмерных антител или их низкомолекулярных форм (например, биспецифичные антитела F(ab')2, биспецифичные антитела sc(Fv)2, бивалентные биспецифичные антитела-диатела).
Общепринятое получение полноразмерных биспецифичных антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелой-легкой цепи иммуноглобулина, при этом эти две цепи обладают разной специфичностью (Millstein et al., Nature, 305: 537-539. (1983)). В другом подходе вариабельные домены антитела с желаемой специфичностью связывания сливают с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. ДНК, кодирующие слияния иммуноглобулиновой тяжелой цепи и, если это желательно, иммуноглобулиновой легкой цепи, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфицируют в подходящую клетку-хозяина. Это дает большую гибкость в подборе пропорций трех полипептидных фрагментов. Вместе с тем, можно вставлять кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один вектор экспрессии, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким результатам.
В соответствии с другим подходом, описанным в патенте США № 5731168, можно создавать поверхность раздела между парой молекул антител, чтобы максимизировать процент гетеродимеров, которые выделяют из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность раздела содержит по меньшей мере часть домена CH3. В этом способе одну или несколько небольших боковых аминокислотных цепей из поверхности раздела первой молекулы антитела заменяют несколько крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). На поверхности раздела второй молекулы антитела создаются компенсационные полости для большой боковой цепи (цепей) идентичного или сходного размера путем замены крупных боковых аминокислотных цепей на цепи меньшего размера (например, на аланин или треонин). Так создается механизм для увеличения образования гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.
Биспецифичные антитела включают сшитые или гетероконъюгированные антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Г етероконъюгированные антитела могут быть получены с использованием любых удобных способов сшивания.
Технология диатела обеспечивает альтернативный механизм получения фрагментов биспецифичных антител. Эти фрагменты содержат VH, соединенный с VL посредством линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи. Соответственно, домены VH и VL одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными VL и VH доменами другого фрагмента, тем самым образуя два антигенсвязывающих участка.
Поливалентные антитела.
Поливалентное антитело быстрее, чем бивалентное антитело может подвергаться интернализации (и/или катаболизироваться) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связываются антитела. Антитела по изобретению могут представлять собой поливалентные антитела с тремя или несколькими антигенсвязывающими участками (например, тетравалентные антитела), которые могут быть легко созданы посредством рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может содержать домен димеризации и три или несколько антигенсвязывающих участков. Приведенный в качестве примера домен димеризации содержит (или состоит из) Fcобласти или шарнирной области. Поливалентное антитело может содержать (или состоять из) от трех примерно до восьми (например, четыре) антигенсвязывающих участков. Поливалентное антитело дополнительно содержит по меньшей мере одну полипептидную цепь (например, по меньшей мере две полипептидные цепи), при этом полипептидная цепь (цепи) содержит два или несколько вариабельных доменов. Например, полипептидная цепь (цепи) может содержать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, Fc представляет собой полипептидную цепь Fc-области, X1 и X2 представляют собой аминокислоту или пептидный спейсер и n=0 или 1.
Конъюгированные антитела.
Антитела, раскрытые в изобретении, могут представлять собой конъюгированные антитела, которые связаны с различными молекулами, включающими макромолекулярные субстанции, такие как по- 19 034757 лимеры (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиэтиленимин (ПЭИ), модифицированный ПЭГ (ПЭИПЭГ), полиглутаминовая кислота (PGA), сополимеры (Л-(2-гидроксипропил)метакриламида (НРМА), гиалуроновая кислота, радиоактивные материалы (например, 90Y, 131I), флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, гаптены, ферменты, хелаты металлов, лекарства и токсины (например, калихеамицин, синегнойный экзотоксин, рицин (например, дегликозилированная цепь A рицина)).
В одном из вариантов осуществления для улучшения действия цитотоксических антител против BDCA2 и, следовательно, их терапевтической эффективности, антитела конъюгируют с высокотоксичными веществами, включающими радиоактивные изотопы и цитотоксические агенты. Эти конъюгаты могут селективно доставлять токсические агенты к месту мишени (т.е. в клетки, экспрессирующие антиген, который распознается антителом), не задействуя клетки, которые не распознаются антителом. Чтобы минимизировать токсичность, конъюгаты обычно делают на основе молекул с коротким периодом полувыведения из сыворотки крови (т.е. с использованием последовательностей мышей и изотипов IgG3 или IgG4).
В некоторых вариантах осуществления антитело против BDCA2 модифицируют с фрагментом, который улучшает его стабилизацию и/или удержание в циркуляторном русле, например в крови, сыворотке или в других тканях, например по меньшей мере в 1,5, 2, 5, 10 или 50 раз. Например, антитело против BDCA2 могут быть связаны (например, конъюгированы) с полимером, например, по существу, с неантигенным полимером, таким как полиалкиленоксид или полиэтиленоксид. Подходящие полимеры варьируются в основном в зависимости от веса. Можно использовать полимеры, имеющие среднечисловую молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 200 до приблизительно 35000 Да (или от приблизительно 1000 до приблизительно 15000 и от 2000 до приблизительно 12500 Да). Например, антитело против BDCA2 могут быть конъюгированы с водорастворимым полимером, например, с гидрофильным поливиниловым полимером, например с поливиниловым спиртом или поливинилпирролидоном. Примеры таких полимеров включают гомополимеры полиалкиленоксида, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоли, полиоксиэтилированные полиолы, их сополимеры и блок-сополимеры, при условии, что эти блок-сополимеры сохраняют растворимость в воде. Дополнительные эффективные полимеры включают полиоксиалкилены, такие как полиоксиэтилен, полиоксипропилен и блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, полиметакрилаты, карбомеры и разветвленные или неразветвленные полисахариды.
Вышеописанные конъюгированные антитела могут быть получены путем осуществления химических модификаций на описанных в изобретении антителах или их низкомолекулярных формах. Способы модификации антител хорошо известны в настоящей области (например, патенты США 5057313 и США 5156840).
Способы получения антител.
Антитела могут быть получены в бактериальных или эукариотических клетках. Некоторые антитела, например Fab, могут быть получены в бактериальных клетках, например, клетках E.coli. Антитела могут быть также получены в эукариотических клетках, таких как трансформированные клеточные линии (например, CHO, 293E, COS). Дополнительно, антитела (например, ScFv) могут быть экспрессированы в дрожжевой клетке, такой как клетки Pichia (см., например, Powers et al., J. Immunol. Methods. 251:123-35. (2001)), Hanseula или Saccharomyces. Для получения представляющего интерес антитела полинуклеотид, кодирующий антитело, конструируют, встраивают в вектор экспрессии, а затем экспрессируют в подходящих клетках-хозяевах. Для получения рекомбинантного вектора экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, выбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и восстановления антитела применяют стандартные технологии молекулярной биологии.
Если необходимо экспрессировать антитело в бактериальных клетках (например, E.coli), вектор экспрессии должен обладать свойствами, которые позволяют амплифицировать этот вектор в бактериальных клетках. Дополнительно, когда в качестве хозяина используются E.coli, такие как JM109, HB101, DH5o. или XL1-Blue, вектор должен иметь промотор, например, промотор LacZ (Ward et al., 341: 544-546 (1989), промотор araB (Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988)) или промотор T7, которые могут позволить эффективную экспрессию в E.coli. Примеры таких векторов включают, например, векторы M13серии, векторы pUC-серии, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-l (Pharmacia), QIAexpress system (QIAGEN), pEGFP и pET (при использовании этого вектора экспрессии хозяином предпочтительно является BL21, экспрессирующий T7 РНК-полимеразу). Вектор экспрессии может содержать сигнальную последовательность для секреции антитела. В качестве сигнальной последовательности для секреции антитела в целях продуцирования в периплазме E.coli можно использовать сигнальную последовательность pelB (Lei S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Для экспрессии в бактериях можно применять способы с хлоридом кальция или способы электропорации для введения вектора экспрессии в бактериальную клетку.
Если антитело предназначено для экспрессии в животных клетках, таких как клетки CHO, COS и NIH3T3, то экспрессионный вектор включает промотор, необходимый для экспрессии в этих клетках, например промотор SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), промотор MMLV-LTR, промотор EF1o. (Mizushima et al., Nucleic. Acids. Res. (1990) 18, 5322) или промотор CMV. В дополнение к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин или его домен, рекомбинантные экс- 20 034757 дрессирующие векторы могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и селективные маркерные гены. Селективный маркерный ген облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был встроен вектор (см., например, патенты США № 4399216, 4634665 и 5179017). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, для клетки-хозяина, в которую был встроен вектор. Примеры векторов с селектируемыми маркерами включают pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.
В одном из вариантов осуществления антитела продуцируют в клетках млекопитающих. В качестве примера клетки млекопитающих для экспрессии антитела включают клетки яичника китайского хомячка (CHO-клетки) (в том числе клетки CHO dhfr-, описанные авторами Urlaub and Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селектируемым маркером DHFR, например, согласно описанию в публикации Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), почечные эмбриональные клетки человека 293 (например, 293, 293E, 293T), клетки COS, клетки NIH3T3, лимфоцитарные клеточные линии, например клетки миеломы NS0 и клетки SP2, и клетки от трансгенного животного, например трансгенного млекопитающего. Например, клетка представляет собой эпителиальную клетку млекопитающего.
В примере системы для экспрессии антитела в клетки CHO dhfr- вводят рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий и тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела из антитела против BDCA2 (например, BIIB059) с помощью опосредованной фосфатом кальция трансфекции. В рекомбинантном векторе экспрессии каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела функционально связан с энхансерными/промоторными регуляторными элементами (например, полученными из SV40, цитомегаловируса, аденовируса и т.п., такими как CMV энхансерный/промоторный регуляторный элемент AdMLP или SV40 энхансерный/промоторный регуляторный элемент AdMLP) для запуска транскрипции генов на высоком уровне. Рекомбинантный вектор экспрессии также несет ген DHFR, позволяющий проводить селекцию клеток CHO, которые были трансфицированы вектором с селекцией/амплификацией с использованием метотрексата. После селекции трансформированные клетки-хозяева культивируют для экспрессии тяжелых и легких цепей антитела, и антитело выделяют из культуральной среды.
Антитела могут быть также получены с помощью трансгенного животного. Например, в патенте США № 5849992 описан способ экспрессии антитела в молочной железе трансгенного млекопитающего. Конструируют трансген, который включает специфичный к молоку промотор и нуклеиновые кислоты, кодирующие представляющее интерес антитело и сигнальную последовательность для секреции. Молоко, полученное от самок таких трансгенных млекопитающих, включает представляющее интерес антитело, которое секретируется в нем. Антитело может быть очищено от молока, или, для некоторых применений, используется непосредственно. Также описаны животные, содержащие одну или несколько нуклеиновых кислот по изобретению.
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть выделены изнутри или снаружи (например, из среды) клетки-хозяина, и очищены с получением, по существу, очищенных и однородных антител. Способы выделения и очистки, обычно используемые для очистки антител, могут применяться для выделения и очистки антител и не ограничены каким-либо конкретным способом. Антитела могут быть выделены и очищены путем соответствующего выбора и комбинирования способов, таких как колоночная хроматография, фильтрация, ультрафильтрация, высаливание, осаждение растворителем, экстракция растворителем, дистилляция, иммунопреципитации, электрофорез в SDS- полиакриламидном геле, изоэлектрофокусирование, диализ и рекристаллизация. Хроматография включает, например, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенной фазой и адсорбционную хроматографию (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Pres, 1996). Можно проводить хроматографию с использованием жидкой фазы, например высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и жидкостную экспресс-хроматографию белков (ЖЭХБ). Колонки, используемые для аффинной хроматографии, включают колонку белка A и колонку белка G. Примеры колонок с использованием колонки белка A включают Hyper D, POROS и Sepharose FF (GE Healthcare Biosciences). Настоящее изобретение также включает антитела с высокой степенью очистки, полученные с использованием указанных способов очистки.
Характеристика антител.
Свойства описанных в настоящем изобретении антител, относящиеся к связыванию с BDCA2, могут быть измерены с помощью любого стандартного способа, например, одного или нескольких из следующих способов: OCTET®, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), анализ BIACORE™, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), ИФА (иммуноферментный анализ), РИА (радиоиммуноанализ) и передача энергии посредством флуоресцентного резонанса (FRET).
Связывающее взаимодействие рассматриваемого белка (антитела против BDCA2) и мишени (например, BDCA2) можно проанализировать с помощью систем OCTET®. В этом способе используется один из нескольких вариантов инструментов (например, OCTET® QKe и QK), производимые компанией ForteBio, для определения белковых взаимодействий, специфичности связывания и картирования эпитопов. Системы OCTET® представляют легкий способ мониторинга связывания в режиме реального вре- 21 034757 мени путем измерения изменений в поляризованном свете, который проходит через специальный наконечник, а затем возвращается к датчику.
Связывающее взаимодействие рассматриваемого белка (антитела против BDCA2) и мишени (например, BDCA2) можно проанализировать с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Анализ SPR или анализ биомолекулярного взаимодействия (BIA) выявляет биоспецифичные взаимодействия в режиме реального времени, без выделения какого-либо из взаимодействующих элементов. Изменения массы на поверхности связывания (что является индикатором факта связывания) на матрице BIA вызывает изменения показателя преломления света вблизи поверхности (оптическое явление поверхностного плазмонного резонанса (SPR)). Изменения преломления генерируют детектируемый сигнал, которые измеряют как показатель реакций между биологическими молекулами в реальном времени. Способы с использованием SPR описаны, например, в патенте США № 5641640; в публикациях Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705, и в он-лайн ресурсах, предоставленных BIAcore International AB (Упсала, Швеция). Информацию, полученную в анализе SPR, можно использовать для точного и количественного измерения константы равновесной диссоциации (Kd) и кинетических параметров связывания биомолекулы с мишенью, в том числе Kon и Koff.
Эпитопы также можно непосредственно картировать путем оценки способности различных антител конкурировать друг с другом за связывание с BDCA2 человека, с помощью хроматографических способов (Pharmacia BIAtechnology Handbook, Epitope Mapping, раздел 6.3.2, (май 1994 года); также см. Johne et al. (1993) J. Immunol. Methods, 160: 191-198).
При проведении иммуноферментного анализа образец, содержащий антитело, например супернатант культуры антитело-продуцирующих клеток или очищенные антитела, добавляют в планшет, покрытый антигеном. Добавляют вторичное антитело, меченное ферментом, например щелочной фосфатазой, планшет инкубируют, после промывки добавляют ферментный субстрат, такой как р-нитрофенилфосфат, и измеряют коэффициент поглощения для оценки активности связывания антигена.
Дополнительно, общее руководство по оценке антител, например информацию об анализах вестерн-блоттинга и иммунопреципитации, можно найти в издании Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. By Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Press (1988)).
Антитела с измененной эффекторной функцией.
Взаимодействие антител и комплексов антитело-антиген с клетками иммунной системы запускает множество ответов, называемых в изобретении эффекторными функциями.
Иммуноопосредованные эффекторные функции включают два основных механизма: антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Оба механизма опосредуются константной областью иммуноглобулинового белка. Таким образом, Fc домен антитела является частью, которая определяет взаимодействие с иммунными эффекторными механизмами.
Антитела IgG активируют эффекторные пути иммунной системы путем связывания с членами семейства рецепторов Fcy клеточной поверхности и с C1q из системы комплемента. Лигирование эффекторных белков кластерными антителами запускает множество ответов, включающих высвобождение воспалительных цитокинов, регуляцию продукции антигена, эндоцитоз и гибель клеток. Для некоторых клинических применений эти ответы имеют решающее значение для эффективности моноклонального антитела. В других клинических применениях они вызывают нежелательные побочные эффекты, такие как воспаление и устранение антиген-несущих клеток. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к связывающимся с BDCA2 белкам, включающим антитела, с измененными, например, с увеличенными или уменьшенными эффекторными функциями.
Эффекторную функцию антитела против BDCA2 по настоящему изобретению можно определять с помощью одного из множества известных анализов. Эффекторная функция антитела против BDCA2 может быть увеличена или снижена по сравнению со вторым антителом против BDCA2. В некоторых вариантах осуществления вторым антителом против BDCA2 может быть любое антитело, которое специфично связывается с BDCA2. В других вариантах осуществления вторым BDCA2-специфичным антителом может быть любое из антител по изобретению, такое как BIIB059. В других вариантах осуществления, где рассматриваемое антитело против BDCA2 было модифицировано для увеличения или уменьшения эффекторной функции, второе антитело против BDCA2 может представлять собой немодифицированную или исходную версию антитела.
Эффекторные функции включают антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), в результате чего антитела связываются с Fc рецепторами на цитотоксических T-клетках, клетках-натуральных киллерах (НК), макрофагах, что приводит к гибели клеток, и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), которая вызывает гибель клеток, индуцированную посредством активации каскада комплемента (см. публикации Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997); Ward and Ghetie, Therapeutic. Immunol., 2:77-94 (1995); и Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)). Для этих эффекторных функций обычно необходимо, чтобы Fc-область была объединена со связывающим доменом (например, с вариабельным доменом антитела) и могла быть оценена с помощью стандартных
- 22 034757 анализов, которые известны в данной области техники (см., например, патенты WO 05/018572, WO
05/003175 и US 6242195).
Можно избежать эффекторных функций путем использования фрагментов антител, лишенных Fcдомена, таких как Fab, Fab'2 или одноцепочечного Fv. В качестве альтернативы, можно использовать антитело подтипа IgG4, которое связывается с FcyRI, но плохо связывается с C1q и FcyRII и RIII. Подтип IgG2 также проявляет уменьшенное связывание с Fc рецепторами, но сохраняет значительное связывание с аллотипом H131 из FcyRIIa и C1q. Таким образом, требуются дополнительные изменения в последовательности Fc для устранения связывания со всеми Fc рецепторами и с C1q.
Несколько эффекторных функций антитела, в том числе ADCC, опосредуются рецепторами Fc (FcR), которые связываются с Fc-областью антитела. Можно модулировать аффинность антитела для конкретного FcR, и, следовательно, эффекторную активность, опосредуемую этим антителом, путем изменения аминокислотной последовательности и/или путем посттрансляционных модификаций в Fcобласти и/или в константной области антитела.
Классификация FcR сделана по их специфичности для изотипов иммуноглобулинов: Fc рецепторы для IgG антител называются FcyR, для IgE они называются FcsR, для IgA они называются FCaR и так далее. Были определены три подкласса FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16). Существует два типа FcyRII и FcyRIII: FcyRIIa (CD32a) и FcyRIIB (CD32b); и FcyRIIIA (CD16a) и FcyRIIIB (CD16b). Поскольку каждый подкласс FcyR кодируется двумя или тремя генами, и альтернативный сплайсинг РНК дает в результате множество транскриптов, существует широкое разнообразие изоформ FcyR. Например, FcyRII (CD32) включает изоформы IIa, IIb1, IIb2, IIb3 и IIc.
Сайт связывания с FcyR на антителах человека и мыши уже был картирован на так называемой нижней шарнирной области, состоящей из остатков 233-239 (нумерация по индексу EU в соответствии со следующими публикациями: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), Woof et al., Molec. Immunol. 23:319-330 (1986); Duncan et al., Nature 332:563 (1988); Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483-1491 (1991); Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036-9040 (1991)). Среди остатков 233-239, остатки P238 и S239 входят в число тех, которые, возможно, являются вовлеченным в связывание. Другие ранее указанные области, возможно, участвующие в связывании с FcyR, представляют собой: G316-K338 (IgG человека) с человеческим FcyRI (Woof et al., Mol. Immunol., 23:319-330 (1986)); K274-R301 (IgG1 человека) с человеческим FcyRIII (Sarmay et al. Molec. Immunol. 2143-51 (1984)), и Y407-R416 (IgG человека) с человеческим FcyRIII (Gergely et al., Biochem. Soc. Trans. 12:739-743 (1984) и Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001), Lazar G.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 103:4005-4010(2006). Эти и другие участки или области аминокислотных остатков, участвующих в связывании с FcR, могут быть очевидными для специалиста после изучения кристаллических структур комплексов Ig-FcR (см., например, Sondermann et al. 2000 Nature 406(6793):267-73, и Sondermann et al. 2002 Biochem. Soc. Trans. 30(4):481-6). Соответственно, антитела против BDCA2 по настоящему изобретению включают модификации одного или нескольких из вышеуказанных остатков (для увеличения или уменьшения эффекторной функции, когда это необходимо).
Другой подход для изменения эффекторной функции моноклонального антитела включает мутации аминокислот на поверхности моноклонального антитела, которое вовлечено в эффекторные связывающие взаимодействия (Lund L. et al. (1991) J. Immunol. 147(8):2657-62; Shields R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9): 6591-604).
Способы повышения эффекторной функции антител хорошо известны в данной области техники (см., например, Kelley et al., Methods Mol. Biol., 901:277-93(2012); Natsume et al., Drug Des. Devel. Ther., 3:7-16 (2009), US 8188231, US 7960512). В одном из вариантов осуществления BDCA2 антитела имеют одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или больше аминокислотных замен в положениях, которые выбирают из группы, состоящей из
221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233,234,
235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246,247,
249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268,269,
270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282,283,
284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296,297,
298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318,320,
322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332,333,
334, 335, 336 и 337, где нумерация остатков в Fc-области соответвует индексу EU по Kabat. В некоторых вариантах осуществления антитела BDCA2 имеют одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или больше аминокислотных замен, выбираемых из группы, состоящей из
- 23 034757
D221K, D221Y, К222Е, K222Y, Т223Е
Т223К, Н224Е, H224Y, Т225Е, Т225К, T225W, Р227Е, P227G, Р227К
P227Y, Р228Е, P228G, Р228К, P228Y, Р230А, Р230Е, P230G, P230Y
А231Е, A231G, А231К, А231Р, A231Y, Р232Е, P232G, Р232К, P232Y.
Е233А, E233D, E233F, E233G, Е233Н, E233I, Е233К, E233L, Е233М
E233N, E233Q, E233R, E233S, Е233Т, E233V, E233W, E233Y, L234A.
L234D, L234E, L234F, L234G, L234H, L234I, L234K, L234M, L234N.
L234P, L234Q, L234R, L234S, L234T, L234V, L234W, L234Y, L235A.
L235D, L235E, L235F, L235G, L235H, L235I, L235K, L235M, L235N.
L235P, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, G2 3 6A.
G236D, G236E, G236F, G236H, G236I, G236K, G236L, G236M, G236N.
G236P, G236Q, G236R, G236S, G236T, G236V, G236W, G236Y, G237D.
G237E, G237F, G237H, G237I, G237K, G237L, G237M, G237N, G237P
G237Q, G237R, G237S, G237T, G237V, G237W, G237Y, P238D, Р238Е
P238F, P238G, Р238Н, P238I, Р238К, P238L, Р238М, P238N, P238Q.
P238R, P238S, Р238Т, P238V, P238W, P238Y, S239D, S239E, S239F.
S239G, S239H, S239I, S239K, S239L, S239M, S239N, S239P, S239Q
S239R, S239T, S239V, S239W, S239Y, V240A, V240I, V240M, V240T
F241D, F241E, F241L, F241R, F241S, F241W, F241Y, F243E, F243H.
F243L, F243Q, F243R, F243W, F243Y, Р244Н, Р2 4 5А, K246D, К2 4 6Е
К246Н, K246Y, P247G, P247V, D249H, D249Q, D249Y, R255E, R255Y.
Е258Н, E258S, E258Y, T260D, Т260Е, Т260Н, T260Y, V262A, V262E
V262F, V262I, V262T, V263A, V263I, V263M, V263T, V264A, V264D.
V264E, V264F, V264G, V264H, V264I, V264K, V264L, V264M, V264N.
V264P, V264Q, V264R, V264S, V264T, V264W, V264Y, D265F, D265G.
D265H, D265I, D265K, D265L, D265M, D265N, D265P, D265Q, D265R.
D265S, D265T, D265V, D265W, D265Y, V266A, V266I, V266M, V266T
S267D, S267E, S267F, S267H, S267I, S267K, S267L, S267M, S267N.
S267P, S267Q, S267R, S267T, S267V, S267W, S267Y, H268D, Н268Е
H268F, H268G, H268I, Н268К, H268L, Н268М, Н268Р, H268Q, H268R.
Н268Т, H268V, H268W, E269F, E269G, Е269Н, E269I, Е269К, E269L
Е269М, E269N, Е269Р, E269R, E269S, Е269Т, E269V, E269W, E269Y.
D270F, D270G, D270H, D270I, D270L, D270M, D270P, D270Q, D270R.
D270S, D270T, D270W, D270Y, Р271А, P271D, Р271Е, P271F, P271G.
Р271Н, P271I, Р271К, P271L, Р271М, P271N, P271Q, P271R, P271S
Р271Т, P271V, P271W, P271Y, E272D, E272F, E272G, Е272Н, E272I
Е272К, E272L, Е272М, Е272Р, E272R, E272S, Е272Т, E272V, E272W.
E272Y, V273I, K274D, К274Е, K274F, K274G, К274Н, K274I, K274L
К274М, K274N, К274Р, K274R, К274Т, K274V, K274W, K274Y, F275L
- 24 034757
F275W, N276D, N276E, N276F, N276G, N276H, N2761, N276L, N2 7 6M
N276P, N276R, N276S, N276T, N276V, N276W, N276Y, Y278D, Y278E
Y278G, Y278H, Y278I, Y278K, Y278L, Y278M, Y278N, Y278P, Y278Q
Y278R, Y278S, Y278T, Y278V, Y278W, D280G, D280K, D280L, D280P
D280W, G281D, G281E, G281K, G281N, G281P, G281Q, G281Y, V282E
V282G, V282K, V282P, V282Y, E283G, E283H, E283K, E283L, E283P
E283R, E283Y, V284D, V284E, V284L, V284N, V284Q, V284T, V284Y
H285D, Н285Е, Н285К, H285Q, H285W, H285Y, N286E, N286G, N286P
N286Y, K288D, К288Е, K288Y, K290D, K290H, K290L, K290N, K290W
P291D, Р291Е, P291G, Р291Н, P291I, P291Q, P291T, R292D, R292E
R292T, R292Y, E293F, E293G, E293H, E293I, E293L, E293M, E293N
Е293Р, E293R, E293S, Е293Т, E293V, E293W, E293Y, E294F, E294G
Е294Н, E294I, Е294К, E294L, E294M, E294P, E294R, E294S, E294T
E294V, E294W, E294Y, Q295D, Q295E, Q295F, Q295G, Q295H, Q295I
Q295M, Q295N, Q295P, Q295R, Q295S, Q295T, Q295V, Q295W, Q295Y
Y296A, Y296D, Y296E, Y296G, Y296H, Y296I, Y296K, Y296L, Y2 9 6M
Y296N, Y296Q, Y296R, Y296S, Y296T, Y296V, N297D, N297E, N297F
N297G, N297H, N2971, N297K, N297L, N297M, N297P, N297Q, N297R
N297S, N297T, N297V, N297W, N297Y, S298D, S298E, S298F, S298H
S298I, S298K, S298M, S298N, S298Q, S298R, S298T, S298W, S298Y
Т299А, T299D, Т299Е, T299F, T299G, T299H, T299I, T299K, T299L
Т299М, T299N, Т299Р, T299Q, T299R, T299S, T299V, T299W, T299Y
Y300A, Y300D, Y300E, Y300G, Y300H, Y300K, Y300M, Y300N, Y300P
Y300Q, Y300R, Y300S, Y300T, Y300V, Y300W, R301D, R301E, R301H
R301Y, V302I, V303D, V303E, V303Y, S304D, S304H, S304L, S304N
S304T, V305E, V305T, V305Y, W313F, K317E, K317Q, E318H, E318L
E318Q, E318R, E318Y, K320D, K320F, K320G, K320H, K320I, K320L
K320N, К320Р, K320S, К320Т, K320V, K320W, K320Y, K322D, K322F
K322G, К322Н, K322I, К322Р, K322S, K322T, K322V, K322W, K322Y
V323I, S324D, S324F, S324G, S324H, S324I, S324L, S324M, S324P
S324R, S324T, S324V, S324W, S324Y, N325A, N325D, N325E, N325F
N325G, N325H, N3251, N325K, N325L, N325M, N325P, N325Q, N325R
N325S, N325T, N325V, N325W, N325Y, K326I, K326L, K326P, K326T
A327D, А327Е, A327F, А327Н, A327I, A327K, A327L, A327M, A327N
А327Р, A327R, A327S, А327Т, A327V, A327W, A327Y, L328A, L328D
L328E, L328F, L328G, L328H, L328I, L328K, L328M, L328N, L328P
- 25 034757
L328Q, L328R, L328S, L328T, L328V, L328W, L328Y, P329D, Р329Е,
P329F, P329G, Р329Н, P329I, Р329К, P329L, Р329М, P329N, P329Q,
P329R, P329S, Р329Т, P329V, P329W, P329Y, АЗЗОЕ, АЗЗОЕ, A330G,
АЗЗОН, A330I, A330L, АЗЗОМ, A330N, АЗЗОР, A330R, A330S, АЗЗОТ,
A330V, A330W, A330Y, P331D, P331F, Р331Н, P331I, P331L, Р331М,
P331Q, P331R, Р331Т, P331V, P331W, P331Y, I332A, I332D, I332E,
I332F, I332H, I332K, I332L, I332M, I332N, I332P, I332Q, I332R,
I332S, I332T, I332V, I332W, I332Y, E333F, ЕЗЗЗН, E333I, E333L,
ЕЗЗЗМ, ЕЗЗЗР, ЕЗЗЗТ, E333Y, K334F, K334I, K334L, К334Р, К334Т,
T335D, T335F, T335G, Т335Н, T335I, T335L, Т335М, T335N, Т335Р,
T335R, T335S, T335V, T335W, T335Y, I336E, I336K, I336Y, S337E,
S337H и S337N,
где нумерация остатков в Fc Fc-области соответвует индексу EU по Kabat. В конкретном варианте осуществления BDCA2 антитела содержат одну, две или три из следующих мутаций: S239D, S239D/ I332E, S239D/I332E/A330L, S239D/I332E/G236A, S298A, A330L I332E, E333A и K334A.
Наличие олигосахаридов, конкретно N-связанного олигосахарида на аспарагине-297 в области CH2 IgG1, является важным для связывания с FcyR, а также с C1q. Уменьшение содержания фукозы в антителах улучшает эффекторную функцию (см., например, US 8163551). В некоторых вариантах осуществления BDCA2 антитела имеют сниженное фукозилирование и аминокислотные замены, которые повышают эффекторную функцию (например, одну, две или три из следующих мутаций S298A, E333A и K334A). Эффекторная функция также может быть достигнута путем получения и экспрессии антител против BDCA2 по изобретению, в присутствии ингибиторов альфа-маннозидазы I (например, кифунензина) в концентрации ингибитора приблизительно от 60 до 200 нг/мл (например, 60, 75, 100, 150 нг/мл). Антитела, экспрессируемые в присутствии ингибиторов альфа-маннозидазы I, содержат в основном гликаны олигоманнозного типа и обычно демонстрируют повышенную активность ADCC и аффинность к FcyRIIIA, но при этом уменьшенное связывание с C1q.
Антитела против BDCA2 по изобретению с повышенной эффекторной функцией включают антитела с повышенной аффинностью связывания с одним или несколькими рецепторами Fc (FcR) по сравнению с исходным или невариантным антителом против BDCA2. Соответственно, антитела против BDCA2 с повышенной аффинностью связывания с FcR включают антитела против BDCA2, которые проявляют аффинность связывания с одним или несколькими рецепторами Fc, увеличенную в 1,5, 2, 2,5, 3, 4 или 5 раз или выше по сравнению с исходным или невариантным антителом против BDCA2. В некоторых вариантах осуществления антитело против BDCA2 с повышенной эффекторной функцией связывается с FcR с аффинностью примерно в 10 раз выше, чем аффинность связывания исходного или невариантного антитела. В других вариантах осуществления антитело против BDCA2 с повышенной эффекторной функцией связывается с FcR с аффинностью приблизительно в 15 раз выше или приблизительно в 20 раз выше, чем аффинность связывания исходного или невариантного антитела. Рецептор FcR может представлять собой один или несколько из FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII, и их изоформ, и FcaR, FcpR, Fc5R и/или FcaR. В конкретных вариантах осуществления антитело против BDCA2 с повышенной эффекторной функцией проявляет аффинность связывания с FcyRIIa, которая ниже в 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5 раз или еще ниже.
Для снижения эффекторной функции можно использовать комбинации сегментов различных подтипов последовательностей (например, комбинации IgG2 и IgG4), чтобы достичь большего снижения связывания с рецепторами Fcy, чем каждый из этих подтипов по отдельности (Armour et al. Eur. J. Immunol., 29: 2613-1624 (1999); Mol. Immunol., 40: 585-593 (2003)). Дополнительно, можно удалять сайты Nгликозилирования в качестве способа снижения эффекторной функции. В данной области техники известно большое количество вариантов Fc с измененной и/или уменьшенной аффинностью для некоторых или всех подтипов рецепторов Fc (и, следовательно, для эффекторных функций). См., например, патенты US 2007/0224188, US 2007/0148171, US 2007/0048300, US 2007/0041966, US 2007/0009523, US 2007/ 0036799, US 2006/0275283, US 2006/0235208, US 2006/0193856, US 2006/0160996, US 2006/0134105, US 2006/0024298, US 2005/0244403, US 2005/0233382, US 2005/0215768, US 2005/0118174, US 2005/0054832, US 2004/0228856, US 2004/132101, US 2003/158389; см. также патенты US 7183387, 6737056, 6538124, 6528624, 6194551, 5624821, 5648260.
Антитела против BDCA2 по настоящему изобретению с пониженной эффекторной функцией включают антитела, связывающиеся с одним или несколькими Fc-рецепторами (FcR) с пониженной аффинностью по сравнению с исходным или невариантным антителом против BDCA2. Соответственно, антитела против BDCA2 с пониженной аффинностью связывания с FcR включают антитела против BDCA2, которые проявляют аффинность связывания с одним или несколькими рецепторами Fc, увеличенную в 1,5, 2,
- 26 034757
2,5, 3, 4 или 5 раз или выше по сравнению с исходным или невариантным антителом против BDCA2. В некоторых вариантах осуществления антитело против BDCA2 со сниженной эффекторной функцией связывается с FcR с аффинностью примерно в 10 раз ниже, чем аффинность связывания исходного или невариантного антитела. В других вариантах осуществления антитело против BDCA2 со сниженной эффекторной функцией связывается с FcR с аффинностью приблизительно в 15 раз ниже или приблизительно в 20 раз ниже, чем аффинность связывания исходного или невариантного антитела. Рецептор FcR может представлять собой один или несколько из FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII, и их изоформ, и FceR Fcp,R, FcdR и/или FcaR. В конкретных вариантах осуществления антитело против BDCA2 со сниженной эффекторной функцией проявляет аффинность связывания с FcyRIIa в 1,5, 2, 2,5, 3, 4, в 5 раз или еще ниже.
Механизмом CDC является связывание комплекса антитело-антиген с комплементом, что приводит к активации каскада комплемента и созданию комплекса мембранной атаки. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с их когнатным антигеном; таким образом, активация каскада комплемента частично регулируется аффинностью связывания иммуноглобулина с белком C1q. Чтобы активировать каскад комплемента, для C1q необходимо связываться по меньшей мере с двумя молекулами из IgG1, IgG2 или IgG3, но при этом только с одной молекулой IgM, прикрепленной к антигенной мишени (Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995) стр. 80). Для оценки активации комплемента можно выполнять анализ CDC, например, как описано авторами Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
Было высказано предположение, что в связывание с C1q вовлечены различные остатки молекулы IgG, включающие в себя остатки Glu318, Lys320 и Lys322 в домене CH2, аминокислотный остаток 331, расположенный, в свою очередь, в непосредственной близости от той же бета-цепи, остатки Lys235 и Gly237, расположенные в нижней шарнирной области, и остатки от 231 до 238, расположенные в Nконцевой области домена CH2 (см., например, Xu et al., J. Immunol. 150:152A (Abstract) (1993), WO94/29351; Tao et al., J. Exp. Med., 178:661-667 (1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol., 24:2542-47 (1994); Burton et al.; Nature, 288:338-344(1980); Duncan and Winter, Nature 332:738-40(1988); Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-4184 (2000; US 5648260, US 5624821).
Антитела против BDCA2 с улучшенным связыванием с C1q могут содержать аминокислотную замену в одном, двух, трех или четырех положениях аминокислот 326, 327, 333 и 334 Fc-области человеческого IgG, где нумерация остатков в Fc-области IgG соответствует индексу EU по Kabat. В одном из вариантов осуществления антитела против BDCA2 включают следующие аминокислотные замены: K326W/E333S, которые достоверно увеличивают связывание IgG1 антитела с C1q (Steurer W. et al., J. Immunol., 155(3):1165-74(1995)).
Антитела против BDCA2 со сниженным связыванием с C1q могут содержать аминокислотную замену в одном, двух, трех или четырех положениях аминокислот 270, 322, 329 и 331 Fc-области человеческого IgG, где нумерация остатков в Fc-области IgG соответствует индексу EU по Kabat. В качестве примера в IgG1, две мутации в COOH-концевой области Cffi-домена человеческого IgG1-K322A и Р329Л-не активируют путь CDC, и показывают в результате более чем 100-кратное снижение связывания с C1q (US 6242195).
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антитела против BDCA2 по настоящему изобретению проявляют увеличенное или уменьшенное связывание с белком комплемента по сравнению со вторым антителом против BDCA2. В некоторых вариантах осуществления антитело против BDCA2 по изобретению проявляет повышенное или сниженное связывание с C1q с коэффициентом приблизительно в 1,5 раза или больше, приблизительно в 2 раза или больше, приблизительно в 3 раза или больше, приблизительно в 4 раза или больше, приблизительно в 5 раз или больше, приблизительно в 6 раз или больше, приблизительно в 7 раз или больше, приблизительно в 8 раз или больше, приблизительно в 9 раз или больше, приблизительно в 10 раз или больше, или приблизительно в 15 раз или больше, по сравнению со вторым антителом против BDCA2.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько из этих остатков может быть модифицирован, замещен или удален, или один или несколько аминокислотных остатков могут быть вставлены таким образом, чтобы увеличить или уменьшить CDC активность антител против BDCA2, представленных в изобретении.
В некоторых других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам против BDCA2, которые проявляют пониженное связывание с одним или несколькими рецепторами FcR, но сохраняют свою способность связываться с комплементом (например, в той же степени, или, в некоторых вариантах осуществления, в меньшей степени, чем нативное, невариантное или исходное антитело против BDCA2).
Соответственно, антитела против BDCA2 по настоящему изобретению могут связываться и активировать комплемент, и в то же время проявлять уменьшенное связывание с Fc-рецептором, таким как, например, FcyRIIa (например, FcyRIIa, который экспрессируется на тромбоцитах). Такое антитело с уменьшенным или отсутствующим связыванием с FcyRIIa (например, с FcyRIIa, экспрессируемым на
- 27 034757 тромбоцитах), но которое может связываться C1q и активировать, по меньшей мере в некоторой степени, каскад комплемента, будет уменьшать риск тромбоэмболических осложнений при сохранении возможно желательных эффекторных функций. В альтернативных вариантах осуществления антитела против BDCA2 по настоящему изобретению проявляют уменьшенное связывание с одним или несколькими Fcрецепторами, но сохраняют свою способность связываться с одним или несколькими другими FcR. См., например, патенты US 2007-0009523, 2006-0194290, 2005-0233382, 2004-0228856 и 2004-0191244, в которых описаны различные модификации аминокислот, создающие антитела с уменьшенным связыванием с FcRI, FcRII и/или FcRIII, а также аминокислотные замены, которые приводят к увеличению связывания с одним FcR, но к снижению связывания с другим FcR.
Соответственно, эффекторные функции, охватывающие константную область антитела против BDCA2, можно модулировать путем изменения свойств константной области и, в частности, Fc-области. В некоторых вариантах осуществления антитело против BDCA2, имеющее увеличенную или уменьшенную эффекторную функцию, сравнивается со вторым антителом с эффекторной функцией, которое может представлять собой невариантное, нативное или исходное антитело, содержащее нативную константную область или Fc-область, которая опосредует эффекторную функцию.
Нативная последовательность Fc-области или константной области содержит аминокислотную последовательность, идентичную цепи аминокислотной последовательности Fc или константной области, встречающейся в природе. Предпочтительно, контрольная молекула, используемая для оценки относительной эффекторной функции, содержит тот же тип/подтип Fc-области, как и тестируемое или вариантное антитело. Вариантная или измененная Fc-область или константная область содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности области тяжелой цепи вследствие по меньшей мере одной аминокислотной модификации (такой как, например, посттрансляционная модификация, аминокислотная замена, инсерция или делеция). Соответственно, вариантная константная область может содержать одну или несколько аминокислотных замен, делеций или инсерций, которые вызывают изменение посттрансляционных модификаций, в том числе, например, изменение характера гликозилирования. Исходное антитело или Fc-область, например, представляет собой вариант с нормальной эффекторной функцией, который используется для конструирования константной области (т.е. Fc), имеющей измененную, например, увеличенную эффекторную функцию.
Антитела с измененной (например, увеличенной) эффекторной функцией (функциями) можно создавать генноинженерным способом или продуцировать антитела с вариантными константными областями, Fc-областями или областями тяжелых цепей. Можно использовать технологии рекомбинантной ДНК и/или условия культивирования клеток и экспрессии для получения антител с измененной функцией и/или активностью. Например, можно использовать технологии рекомбинантной ДНК для конструирования одной или нескольких аминокислотных замен, делеций или инсерций в областях (таких как, например, Fc или константные области), которые влияют на функцию антител, в том числе на эффекторные функции. Альтернативно, изменения в посттрансляционных модификациях, таких как, например, характеристики гликозилирования, могут быть достигнуты путем манипуляций с клеткой-хозяином и с условиями культивирования и экспрессии, при которых получают антитело.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антителу против BDCA2, содержащему одну или несколько последовательностей CDR тяжелой цепи, выбираемых из VH CDR1 из SEQ ID NO: 9, VH CDR2 из SEQ ID NO: 10 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 11; или одну или несколько альтернативных последовательностей CDR тяжелой цепи, выбираемых из VH CDR1 из SEQ ID NO: 8, VH CDR2 из SEQ ID NO: 10 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 11; или одну или несколько альтернативных последовательностей CDR тяжелой цепи, выбираемых из: VH CDR1 из SEQ ID NO: 89, VH CDR2 из SEQ ID NO: 91 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 11; или одну или несколько альтернативных последовательностей CDR тяжелой цепи, выбираемых из: VH CDR1 из SEQ ID NO: 9, VH CDR2 из SEQ ID NO: 92 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 11; или одну или несколько альтернативных последовательностей CDR тяжелой цепи, выбираемых из: VH CDR1 из SEQ ID NO: 90, VH CDR2 из SEQ ID NO: 93 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 94, при этом антитело дополнительно содержит вариантную Fc-область, которая обусловливает увеличенную или уменьшенную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Fc-областью. В других вариантах осуществления антитело против BDCA2 содержит по меньшей мере две области CDR (или альтернативные CDR), а в других вариантах осуществления антитело содержит все три последовательности CDR тяжелой цепи (или альтернативные CDR). Такие антитела против BDCA2 (i) ингибируют секрецию интерферонов типа I и/или интерферонов типа III в дополнение к другим цитокинам и хемокинам из плазмоцитоидных дендритных клеток; и/или (ii) индуцируют или усиливают истощение плазмоцитоидных дендритных клеток in vitro.
Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антителу против BDCA2, содержащему последовательности CDR легкой цепи CDR1 VL из SEQ ID NO: 5, CDR2 VL из SEQ ID NO: 6 и CDR3 VL из SEQ ID NO: 7, при этом антитело дополнительно содержит вариантную Fc-область, которая обусловливает повышение или снижение эффекторной функции по сравнению с нативной или исходной Fc-областью. Такие антитела против BDCA2: (i) ингибируют секрецию интерферонов типа I и/или интерферонов типа III в дополнение к другим цитокинам и хемокинам из плазмоцитоидных денд- 28 034757 ритных клеток; и/или (ii) индуцируют или усиливают истощение плазмоцитоидных дендритных клеток in vitro.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения, антитело против BDCA2 с повышенной или пониженной эффекторной функцией содержит все три последовательности CDR легкой цепи или альтернативные CDR легкой цепи из SEQ ID NO: 3 и содержит все три последовательности CDR тяжелой цепи или альтернативные CDR тяжелой цепи из SEQ ID NO: 4.
В других вариантах осуществления изобретение относится к антителу против BDCA2, содержащему последовательность VL, которая содержит SEQ ID NO: 23, при этом антитело дополнительно содержит вариантную Fc-область, которая обусловливает снижение эффекторной функции по сравнению с нативной или исходной Fc-областью. В других вариантах осуществления изобретение относится к антителу против BDCA2, содержащему последовательность VH, которая содержит SEQ ID NO: 24, при этом антитело дополнительно содержит вариантную Fc-область, которая обусловливает снижение эффекторной функции по сравнению с нативной или исходной Fc-областью.
Способы создания какого-либо из вышеуказанных вариантов антител против BDCA2, содержащих аминокислотные замены, хорошо известны в данной области техники. Эти способы включают без ограничения получение с помощью сайт-направленного (или олигонуклеотид-опосредованного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза полученной молекулы ДНК, кодирующей это антитело или по меньшей мере константную область этого антитела. Сайт-направленный мутагенез хорошо известен в данной области (см., например, Carter et al., Nucleic. Acids. Res., 13:4431-4443 (1985) и Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1987)). ПЦР-мутагенез также подходит для получения вариантов аминокислотной последовательности исходного полипептида. См. Higuchi, в руководстве PCR Protocols, стр. 177183 (Academic Press, 1990); и Vallette et al., Nuc. Acids. Res. 17:723-733 (1989). Кассетный мутагенез представляет собой другой способ получения вариантных последовательностей, который основан на методике, описанной Wells et al., Gene, 34: 315-323 (1985).
Антитела против BDCA2 с измененным гликозилированием.
Различные гликоформы могут глубоко влиять на свойства лекарства, в том числе на его фармакокинетику, фармакодинамику, взаимодействие с рецептором и специфичность нацеливания на ткани (Graddis et al., 2002, Curr. Pharm. Biotechnol. 3:285-297). В частности, олигосахаридная структура антител может влиять на свойства, относящиеся к устойчивости к протеазе, времени полувыведения из сыворотки антитела, опосредуемого рецептором FcRn, фагоцитозу и обратной связи антитела, в дополнение к эффекторным функциям антитела (например, к связыванию с комплексом комплемента С1, который индуцирует CDC, и к связыванию с рецепторами FcyR, которые отвечают за модулирование пути ADCC) (Nose and Wigzell, 1983; Leatherbarrow and Dwek, 1983; Leatherbarrow et al., 1985; Walker et al., 1989; Carter et al., 1992, PNAS, 89:4285-4289).
Соответственно, другие способы модуляции эффекторной функции антител включают изменение гликозилирования константной области антитела. Измененное гликозилирование включает, например, уменьшение или увеличение количества гликозилированных остатков, изменение характера или местоположения гликозилированных остатков, а также изменение структуры сахара (сахаров). Олигосахариды, обнаруживаемые в человеческих IgG, влияют на степень их эффекторной функции (Raju T.S., BioProcess International April 2003, 44-53); микрогетерогенность олигосахаридов человеческих IgG может влиять на биологические функции, такие как CDC и ADCC, связывание с различными Fc-рецепторами и связывание с белком C1q (Wright A. and Morrison S.L. TIBTECH 1997, 15 26-32; Shields et al. J. Biol. Chem. 2001 276(9):6591-604; Shields et al. J. Biol. Chem. 2002; 277(30): 26733-40; Shinkawa et al. J. Biol. Chem. 2003 278(5):3466-73; Umana et al. Nat. Biotechnol. 1999 Feb; 17(2):176-80). Например, способность IgG связываться с C1q и активировать каскад комплемента может зависеть от присутствия, отсутствия или модификации углеводной группы, расположенной между двумя доменами CH2 (который обычно заякорен на Asn297) (Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94(1995).
Сайты гликозилирования в Fc-содержащем полипептиде, например в антителе, таком как антитело IgG, можно идентифицировать с помощью стандартных методик. Идентификацию сайта гликозилирования можено осуществлять экспериментальным путем или на основе анализа последовательностей или данных моделирования. Были описаны консенсусные мотивы, т.е. аминокислотная последовательность, распознаваемая различными гликозилтрансферазами. Например, консенсусный мотив для N-связанного мотива гликозилирования часто представляет собой NXT или NXS, где X может быть любой аминокислотой, за исключением пролина. Также был описан ряд алгоритмов для обнаружения потенциального мотива гликозилирования. Соответственно, для идентификации потенциальных сайтов гликозилирования в пределах антитела или фрагмента, содержащего Fc-область, последовательность антитела исследуют, например, с помощью общедоступных баз данных, таких как веб-сайт, предоставленный Центром анализа биологических последовательностей (Center for Biological Sequence Analysis, см. ресурс NefNGlyc в отношении предполагаемых сайтов N-связанного гликозилирования и ресурс NetOGlyc в отношении предполгаемых сайтов O-связанного гликозилирования).
В исследованиях in vivo было подтверждено снижение эффекторной функции a-гликозилированных антител. Например, a-гликозилированные анти-CD8 антитела не в состоянии истощать мышиные клетки,
- 29 034757 несущие CD8 (Isaacs, 1992, J. Immunol., 148: 3062), и a-гликозилированные анти-СЭЗ антитела не индуцируют синдром высвобождения цитокинов у мышей или людей (Boyd 1995, см. выше; Friend, 1999,
Transplantation 68:1632). A-гликозилированные формы BDCA2-антитела также имеют сниженную эффекторную функцию.
Важно отметить, что в то время как удаление гликанов в домене CH2, вероятно, оказывает существенное влияние на эффекторную функцию, другие функциональные и физические свойства антитела остаются неизменными. В частности, было показано, что удаление гликанов не влияет или имеет очень незначительный эффект на период полувыведения из сыворотки и связывание с антигеном (Nose, 1983 supra; Tao, 1989 supra; Dorai, 1991 supra; Hand, 1992 supra; Hobbs, 1992 Mol. Immunol. 29:949).
Можно модифицировать или изменять антитела против BDCA2 по настоящему изобретению, чтобы вызвать увеличение или уменьшение эффекторной функции (функций) (по сравнению со вторым BDCA2-специфичным антителом). Способы изменения гликозилирования антител описаны, например, в патентах US 6350861 и 5714350 US, в WO 05/18572 и WO 05/03175; эти способы можно использовать для получения антител против BDCA2 по настоящему изобретению с измененным, уменьшенным гликозилированием или без гликозилирования.
Показания.
Антитела против BDCA2 по изобретению можно применять для лечения или предотвращения различных иммунологических нарушений, таких как воспалительные расстройства. Антитела против BDCA2 являются полезными для лечения или профилактики таких заболеваний по меньшей мере потому, что они нарушают функцию или истощают клетки pDC, и/или ингибируют воспалительные цитокины и хемокины, продуцируемые клетками pDC, и/или подавляют CD32a, и/или ингибируют стимуляцию иммунных комплексов посредством pDC, и/или подавляют или вызывают шеддинг CD62L. Антитела против BDCA2 по изобретению можно комбинировать с противомалярийным агентом (например, с HCQ) для улучшения терапевтического эффекта при лечении воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Антитела против BDCA2 можно использовать для снижения уровня цитокинов и хемокинов, таких как: интерфероны I типа, интерфероны III типа, ИЛ-6, ФНО-α, MIP-1-o/CCL3, MIP-1-3/CCL4, CCL5/RANTES или IP10/CXCL10. Интерфероны I типа составляют многочисленное семейство цитокинов, включающих 13 подтипов ИФНц, ИФН-β, -ε, -κ, -ω, -δ и -τ (Theofilopoulos, Annu. Rev. Immunol., 23:307-36 (2005)). Интерфероны типа III состоят из трех молекул ИФН-λ, называемых ИФН-/.1. ИФН-72 и ИФН-/.3 (называемых ИЛ-29, ИЛ-28А и ИЛ-28В соответственно). Антитела против BDCA2 по изобретению путем истощения и/или подавления функции pDC обеспечивают более надежный подход к лечению, чем методики лечения, пытающиеся снизить содержание специфичных подтипов ИФН с помощью нейтрализующих антител. Дополнительно, подход с pDC-ориентированным лечением антителами против BDCA2 является более селективным и потенциально безопаснее, чем глобальная блокада ответа ИФН. Например, антитела против BDCA2 по изобретению эффективно устраняют pDC-продуцируемые интерфероны типа I, сохраняя при этом другие источники ИФН, которые могут быть необходимы в случае вирусных инфекций.
Термин лечение относится к введению описанной в изобретении композиции в таком количестве, порядке и/или по схеме, которая эффективно улучшает состояние, симптом или параметр, связанный с заболеванием, или служит для профилактики прогрессирования или обострения заболевания (в том числе вторичного нарушения, вызванного заболеванием), как в статистически значимой степени, так и в такой степени, которую может выявить специалист в данной области техники.
Заболевания или состояния, которые можно лечить с помощью антитела против BDCA2 по изобретению, включают, например, системную красную волчанку (СКВ) (например, волчанку в средней и тяжелой степени тяжести), кожную волчанку, дискоидную волчанку, волчаночный нефрит.
СКВ представляет собой хроническое аутоиммунное заболевание, при котором множество органов повреждается иммунными комплексами и аутоантителами, связывающимися с тканями (см. Guidelines for Referral and Management of Systemic Lupus Erythematosus in Adults, Arthritis & Rheumatism, 42(9): 1785- 1795 (1999)). Аутоантитела присутствуют при СКВ и могут предшествовать развитию клинического заболевания (Arbuckle et al., N. Engl. J. Med., 349(16):1526-33 (2003)). Интернализация иммунных комплексов, содержащих аутоантитела, посредством Fc-рецепторов приводит к выработке интерферона I типа, что в свою очередь способствует снижению толерантности и закреплению порочного круга аутоиммунности (Means et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1062:242-51 (2005)). СКВ является гетерогенной в отношении своего клинического проявления, течения и прогноза заболевания и генетических факторов. Афроамериканцы имеют повышенный риск развития СКВ, которая часто проявляется в более тяжелой степени по сравнению с белыми пациентами. Ранее было выявлено, что недостаток комплемента является фактором риска для развития СКВ. Еще раньше было описано, что эта предрасположенность обусловлена генетическим полиморфизмом, связанным с сигнальным путем интерферона I типа. Например, антидвухцепочечная ДНК и анти-Ro аутоантитела связаны с определенным гаплотипом регуляторного фактора 5, фактора транскрипции интерферона (IRF5). Этот гаплотип также является прогностическим для высокого уровня ИФНа в сыворотке крови больных СКВ (Niewold et al., Ann. Rheum. Dis., 71(3):463-8 (2012)). Более высокие уровни ИФНа коррелируют с большей распространенностью полиорганного по- 30 034757 ражения у больных СКВ (Bengtsson et al., Lupus, 9(9):664-71 (2000)). Кроме того, заметным фактором при СКВ является так называемая интерфероновая подпись. Интерфероновая подпись представляет собой паттерн экспрессии мРНК индуцибельных генов интерферона. Подпись интерферона I типа выявляется более чем у половины больных СКВ и связана с более активным развитием заболевания (Baechler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(5):2610-5(2003)). В клиническую практику уже вошли моноклональные антитела ИФНа, и результаты 1 фазы клинических испытаний сифалимумаба и ронтализумаба показали дозозависимое снижение подписи ИФН типа I в цельной крови больных СКВ (McBride et al., Arthritis Rheum., 64(11): 3666-76 (2012); Yao et al., Arthritis Rheum., (6):1785-96(2009)). Были разработаны достоверные показатели для оценки активности заболевания и степени тяжести заболевания (например, средней степени, тяжелое) (см., например, Gladman, Prognosis and treatment of systemic lupus erythematosus, Curr. Opin. Rheumatol., 8:430-437(1996); Kalunian et al., Definition, classification, activity and damage indices. в книге: Dubois' lupus eyrthematosus. 5th ed., Baltimore: Williams and Wilkins; стр. 19-30(1997)).
Индивиду, который имеет риск возникновения вышеперечисленных болезней, у которого диагностирована или имеется одна из этих патологий, можно вводить антитела против BDCA2 в таком количестве и в течение такого времени, чтобы достичь общего терапевтического эффекта. Антитела против BDCA2 можно вводить как единственный препарат (монотерапия), так и в комбинации с другими агентами (комбинированная терапия). В одном из вариантов осуществления противомалярийное средство является средством для применения в комбинированной терапии с антителом против BDCA2, описанным в изобретении. В одном из вариантов осуществления средством для применения в комбинированной терапии с антителом против BDCA2, описанным в изобретении, является ингибитор сигнального пути TLR7 и/или TLR9. В другом варианте осуществления средством для применения в комбинированной терапии с антителом против BDCA2, описанным в изобретении, является кортикостероид. В некоторых вариантах осуществления агент для применения в комбинированной терапии с антителом против BDCA2, описанным в изобретении, предсталяет собой противомалярийный препарат и/или ингибитор киназы (например, ингибитор ВТК (например, ибрутиниб (PCI-32765), AVI-292, ONOo-WG-307), ингибитор JAK1, ингибитор JAK2, ингибитор JAK3, ингибитор Tyk2). В конкретном варианте осуществления агент для применения в комбинированной терапии с антителом против BDCA2, описанным в изобретении, представляет собой гидроксихлорохин. Количество и сроки введения при комбинированной терапии могут быть такими, которые обеспечивают, например, аддитивный или синергический терапевтический эффект.
Фармацевтические композиции.
Можно создавать рецептуру фармацевтической композиции антитела против BDCA2 по изобретению, для введения индивиду, например, для лечения расстройства, описанного в настоящем изобретении. Обычно фармацевтическая композиция включает фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в изобретении фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Композиция может включать фармацевтически приемлемую соль, например, кислотно-аддитивную соль или основноаддитивную соль (см., например, Berge S.M. et al., (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19).
Создание фармацевтических композиций представляет собой общепризнанную область техники, и дополнительно описано, например, в следующих руководствах: Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); и Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X).
Фармацевтические композиции могут иметь различные формы. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма может зависеть от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Обычно композиции для агентов по изобретению представлены в форме инъекционных и инфузионных растворов.
В одном из вариантов осуществления композиция антитела против BDCA2 по изобретению сделана с материалами-наполнителями, такими как хлорид натрия, цитрат натрия, двухосновный натрия фосфат гептагидрат, одноосновной натрия фосфат, Твин-80 и стабилизатор. Композицию можно делать, например, в буферном растворе при подходящей концентрации, и ее можно хранить при температуре от 2 до 8°C. В некоторых других вариантах осуществления уровень pH композиции находится в диапазоне приблизительно от 5,8 до 6,6 (например, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6).
Фармацевтические композиции могут также включать агенты, которые уменьшают аггрегацию антитела против BDCA2 при получении композиции. Примеры снижающих аггрегацию агентов включают одну или несколько аминокислот, выбираемых из группы, состоящей из метионина, аргинина, лизина, аспарагиновой кислоты, глицина и глутаминовой кислоты. Эти аминокислоты можно добавлять в композицию в концентрации от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 145 мМ (например, 0,5, 1, 2, 5, 10,
- 31 034757
25, 50, 100 мМ. Фармацевтические композиции могут также включать сахар (например, сахарозу, трегалозу, маннит, сорбит или ксилит) и/или модификатор тоничности (например, хлорид натрия, маннит или сорбит) и/или поверхностно-активное вещество (например, полисорбат-20 или полисорбат-80).
Такие композиции можно вводить парентеральным путем (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или внутримышечно). В одном из вариантов осуществления композиции антитела против BDCA2 вводят подкожно. В одном из вариантов осуществления композиции антитела против BDCA2 вводят внутривенно. Выражения парентеральное введение и вводят парентерально, как используется в изобретении, означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включают, без ограничения, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интратекальный, интракапсулярный, интраорбитальный, внутрисердечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, транстрахеальный, подкожный, подэпидермисный, внутрисуставной, субкапсулярный, субарахноидальный, интраспинальный, эпидуральный и внутригрудинный путь введения путем инъекции и инфузии.
Композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для стабильного хранения при высокой концентрации. Стерильные инъекционные растворы можно приготовить путем включения в них описанного в изобретении агента в необходимом количестве в подходящем растворителе, с одним ингредиентом или с комбинацией перечисленных выше ингредиентов, как это необходимо, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии делают путем включения описанного в изобретении агента в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием, в результате чего получают порошок из описанного в изобретении агента плюс какой-либо дополнительный желательный ингредиент из раствора, предварительно стерилизованного фильтрованием. Можно сохранять надлежащую текучесть раствора, например, с помощью использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть достигнута путем включения в композицию агента, который замедляет абсорбцию, например, моностеаратные соли и желатин.
В некоторых вариантах осуществления композицию антитела против BDCA2 можно делать с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, например в композиции с регулируемым высвобождением, включающей в себя имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, например этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Многие способы получения таких композиций запатентованы или общеизвестны. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978).
В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция содержит антитело против BDCA2 (например, BIIB059) в концентрации приблизительно от 0,5 до 300 мг/мл (например, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 мг/мл), с добавлением в рецептуру цитрата натрия, хлорида натрия и необязательно Твин-80 (0,01-0,1%, например, 0,03, 0,05 или 0,7%). Уровень pH композиции может быть в пределах от 5,5 до 7,5 (например, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2 6,3, 6,4 6,5, 6,6 6,7, 6,8, 6,9 7,0, 7,1, 7,3).
Введение.
Антитело против BDCA2 можно вводить индивиду, например, нуждающемуся в этом индивиду, например, индивиду-человека, различными способами. Для многих применений путем введения является один из следующих: внутривенная инъекция или инфузия (в/в), подкожная инъекция (п/к), внутрибрюшинная (в/б) или внутримышечная инъекция. Также можно применять внутрисуставную доставку. Также можно применять другие способы парентерального введения. Примеры таких путей введения включают внутриартериальные, интратекальные, интракапсулярные, внутриорбитальные, внутрисердечные, внутрикожные, транстрахеальные, субкутикулярные, внутрисуставные, субкапсулярные, субарахноидальные, спинальные, эпидуральные и внутригрудинные инъекции. В некоторых случаях введение может быть пероральным.
Путь введения и/или схему введения антитела также можно адаптировать для конкретного случая, например с помощью мониторинга индивида, например с помощью томографического исследования, например для визуализации опухоли.
Антитело можно вводить в виде фиксированной дозы или в дозировке мг/кг. Также можно выбирать дозу с тем, чтобы уменьшить или не допустить выработки антител против антитела против BDCA2. Схемы дозирования регулируют таким образом, чтобы обеспечить желаемую реакцию, например, терапевтический ответ или комбинаторной терапевтический эффект. В общем, дозы антитела против BDCA2 (и необязательно второго средством) можно использовать для обеспечения индивида этим средством в биодоступном количестве. Например, можно вводить дозы в диапазоне от 0,1 до 100 мг/кг, от 0,5 до 100 мг/кг, от 1 мг/кг до 100 мг/кг, от 0,5 до 20 мг/кг, от 0,1 до 10 мг/кг или от 1 до 10 мг/кг. Также можно применять другие дозы. В конкретных вариантах осуществления индивиду, нуждающемуся в лечении
- 32 034757 антителом против BDCA2, вводят антитело в дозе 2, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 35 или 40 мг/кг.
Композиция может содержать антитело против BDCA2 в количестве приблизительно от 1 до 100 мг/мл или приблизительно от 10 до 100 мг/мл, или приблизительно от 50 до 250 мг/мл, или приблизительно от 100 до 150 мг/мл, или приблизительно от 100 до 250 мг/мл.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против BDCA2 находятся в композиции преимущественно в мономерной форме, например, мономерная форма составляет по меньшей мере приблизительно 90, 92, 94, 96, 98, 98,5 или 99% композиции. Некоторые композиции антитела против BDCA2 могут содержать аггрегаты в количестве менее чем приблизительно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3 или 0,1%, что определяют, например, с помощью УФ при A280 нм. Некоторые композиции антитела против BDCA2 содержат менее чем приблизительно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 или 0,1% фрагментов, что определяют, например, с помощью УФ при A280 нм.
Дозированная лекарственная форма или фиксированная доза, как используется в изобретении, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для индивидов, получающих лечение; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное на получение желаемого терапевтического эффекта, в комбинации с необходимым фармацевтическим носителем и, возможно, в комбинации с другим агентом. Может назначаться введение единичной дозы или множественных доз. В качестве альтернативы, или в дополнение, антитело можно вводить путем непрерывной инфузии.
Дозу антитела против BDCA2 можно вводить, например, с периодическим интервалом в течение определенного периода времени (курс лечения), достаточного для введения по меньшей мере 2, 3, 5, 10 доз или больше, например, один раз в день или два раза в день, или приблизительно от одного до четырех раз в неделю, или предпочтительно один раз в неделю, один раз в две недели (каждые две недели), каждые три недели, каждый месяц, например, в течение приблизительно от 1 до 12 недель, предпочтительно от 2 до 8 недель, более предпочтительно приблизительно от 3 до 7 недель, и еще более предпочтительно приблизительно 4, 5 или 6 недель. Факторы, которые могут оказывать влияние на дозировку и время, необходимые для эффективного лечения индивида, включают, например, степень тяжести заболевания или расстройства, композицию, пути введения, предшествующие курсы лечения, общее состояние здоровья и/или возраст индивида, а также наличие других заболеваний. Кроме того, лечение индивида терапевтически эффективным количеством соединения может включать единственный вид лечения или, предпочтительно, может включать ряд лечебных мероприятий.
Если индивид имеет риск развития описанного в изобретении иммунологического заболевания, антитело можно вводить до полного наступления иммунологического заболевания, например, в качестве превентивной меры. Продолжительность такого профилактического лечения может быть однократное введение антитела, или лечение может быть продолжительным (например, в виде множественных доз). Например, индивид, с риском возникновения заболевания или с предрасположенностью к заболеванию, может получать лечение антителом в течение нескольких дней, недель, месяцев или даже лет, чтобы предотвратить возникновение или угрозу заболевания.
Фармацевтическая композиция может включать терапевтически эффективное количество средства по изобретению. Эти эффективные количества могут быть определены исходя из эффекта вводимого средства или комбинаторного эффекта агентов, если применяется более одного средства. Терапевтически эффективное количество средства может также варьироваться в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и вес индивидуума и от способности соединения вызывать желаемый ответ у индивидуума, например уменьшение интенсивности по меньшей мере одного параметра заболевания или облегчение по меньшей мере одного симптома заболевания. Терапевтически эффективным также является такое количество, при котором терапевтически полезные эффекты композиции превалируют над любыми токсическими или неблагоприятными эффектами.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против BDCA2 вводят подкожно в концентрации от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 300 мг/мл (например, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 мг/мл). В одном из вариантов осуществления антитело против BDCA2 вводят подкожно в концентрации 50 мг/мл. В другом варианте осуществления антитело против BDCA2 вводят внутривенно в концентрации от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 300 мг/мл. В конкретном варианте осуществления антитело против BDCA2 вводят внутривенно в концентрации 50 мг/мл.
Примеры
В целях лучшей иллюстрации изобретения приведены следующие примеры, которые не следует толковать как ограничение объема изобретения. В отношении указанных конкретных материалов они служат всего лишь для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения. Специалист в данной области техники может разработать эквивалентные способы или реагенты без осуществления изобретательской деятельности и без отступления от объема настоящего изобретения.
Пример 1. Клонирование тяжелой и легкой цепей мышиного антитела против BDCA2.
Гибридома 24F4 мыши (IgG1 каппа) была получена из линии Balb/c мышей, иммунизированных с помощью генной пушки плазмидой pEAG2456, экспрессирующим вектором млекопитающих, который ко-экспрессирует полноразмерный BDCA2 человека, и кДНК FceRIy (см. пример 17).
- 33 034757
Общую клеточную РНК из клеток мышиной гибридомы 24F4 получали с использованием мининабора Qiagen RNeasy согласно протоколу, рекомендованному производителем. кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, были клонированы с помощью РТ-ПЦР из общей клеточной РНК с использованием набора для синтеза кДНК GE Healthcare First Strand cDNA Synthesis согласно протоколу, рекомендованному производителем, с использованием случайных гексамеров для прайминга.
Для ПЦР-амплификации мышиных вариабельных доменов иммуноглобулина с интактными сигнальными последовательностями был использован коктейль из вырожденных прямых праймеров, которые гибридизуются с множеством сигнальных последовательностей семейства генов мышиного иммуноглобулина и единственного обратного праймера, специфичного для 5'-конца мышиного константного домена, как описано в Current Protocols in Immunology (Willey and Sons, 1999). Вариабельный домен тяжелой цепи 24F4 амплифицировали со следующими праймерами: 5' ACT AGT CGA CAT GRA CTT TGG GYT CAG CTT GRT TT 3' (R=A/G и Y=C/T) (SEQ ID NO: 25) и 5' AGG TCT AGA AYC ТСС АСА CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (R=A/G и Y=C/T) (SEQ ID NO: 26). Вариабельный домен легкой цепи 24F4 с ее сигнальной последовательностью амплифицировали со следующими праймерами: 5' ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT 3' (W=A/T и Y=C/T) (SEQ ID NO: 27) и 5' GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATG GA 3' (SEQ ID NO: 28).
Продукты ПЦР подвергали гель-очистке с использованием набора для экстракции гелей Qiagen Qiaquick согласно протоколу, рекомендованному производителем. Очищенные продукты ПЦР субклонировали в вектор Invitrogen pCR2.1TOPO, используя их комплект для клонирования TOPO согласно протоколу, рекомендованному производителем. Вставки из нескольких независимых субклонов секвенировали для установления консенсусной последовательности (из тяжелой цепи клона с наименованием pYL647 и из легкой цепи клона pYL651).
Вариации в последовательностях среди клонов согласуются с положениями вырождения в праймерах. Идентичность иммуноглобулина была подтверждена в анализе BLAST последовательностей вариабельных доменов. Выведенные зрелые N-концевые последовательности легкой и тяжелой цепи совпадают с аутентичными последовательностями цепей 24F4, полученными из данных деградации по Эдману. Для определения выведенных интактных массивов из гипотетических последовательностей, собранных путем добавления выведенных последовательностей константных доменов из клонированных кДНК тяжелой цепи и легкой цепи каппа из IgG1 Balb/c в выведенные зрелые последовательности вариабельных доменов, которые согласуются с массивами из полученных из гибридомы 24F4 очищенных последовательностей, использовали масс-спектроскопию.
Вариабельный домен (VH) тяжелой цепи мышиного 24F4 является членом мышиной подгруппы III (D). Ниже показана последовательность зрелой вариабельной области тяжелой цепи мышиного 24F4 с CDR H1, CDR H2 и CDR H3, которая подчеркнута, в следующем порядке
DVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT
ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNTL FLQMSSLKSE DTAMYYCTRD
101 IYYNYGAWFA YWGOGTLVTV SA (SEQ ID N0:29)
Вариабельный домен легкой цепи (VL) мышиного 24F4 является членом подгруппы III мышиной каппа. Последовательность зрелого вариабельного домена легкой цепи мышиного 24F4 CDR L1, CDR L2 и CDR L3, подчеркнутая в таком порядке, показана ниже
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL
LIYAASTLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCOQCNEDPR
101 TFGGGTKLEI К (SEQ ID N0:30)
Непарный цистеин присутствует в остатке 95 в CDR13 в VL последовательности мышиной 24F4, показанной выше (по номенклатуре Kabat этот Cys является остатком 91).
Пример 2. Химеризация мышиного антитела 24F4.
Использовали кДНК, кодирующую вариабельные домены мышиного 24F4, для создания векторов для экспрессии в мышиных-человеческих химерах (ch24F4), в которых вариабельные области mu24F4 были связаны с константными областями человеческого IgG1 и каппа.
Вариабельные домены были впервые сконструированы с помощью ПЦР для добавления 5' последовательности Козака и для введения человеческих последовательностей и новых сайтов рестрикции в сочленения FR4/константных доменов, для слияния с константными доменами человеческого иммуноглобулина. Последовательности вариабельной области кДНК в полученных плазмидах подтверждали путем секвенирования ДНК. Вариабельный домен тяжелой цепи в плазмиде pYL647 использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами 5' GAT CCG CGG CCG CAC CAT GGA CTT TGG GTT CAG CTT G 3' (SEQ ID NO: 31) (добавление сайта Notl и последовательности Козака) и 5' GAT GGG ССС TTG GTG GAA GCT GCA GAG АСА GTG АСС AGA G 3' (SEQ ID NO: 32) (добавление сайта Apal и последовательности CH1 человеческого IgG1 на сочленение FR4/константный домен), и проводили амплификацию 0,45 кб фрагмента, который очищали и субклонировали в клонирующий вектор Invitrogen pCRBluntllTOPO, создавая pYL668. Для конструирования химерной тяжелой цепи фрагмент 0,45 кб Notl-Apal из
- 34 034757 конструкции pYL668 вариабельного домена тяжелой цепи 24F4 и фрагмент 0,98 кб Apal-BamHI из pEAG1325 (плазмиды, содержащей подтвержденную последовательность кДНК константного домена тяжелой цепи hulgG1 (с генетически удаленным C-концевым остатком лизина IgG1) субклонировали в каркас вектора экспрессионного вектора pV90 (в котором экспрессия гетерологичного гена контролируется промотором CMV-IE и сигналом полиаденилирования человеческого гормона роста, и который несет селектируемый маркер dhfr, см. патент US 7494805), для получения вектора экспрессии pYL672. Последовательность кДНК тяжелой цепи в полученной плазмиде pYL672 была подтверждена секвенированием ДНК. Выведенная зрелая ch24F4-huIgG1 последовательность тяжелой цепи белка, кодируемого pYL672, показана ниже
1 DVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT
51 ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNTL FLQMSSLKSE DTAMYYCTRD
101 IYYNYGAWFA YWGQGTLVTV SAASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL
151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201 QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP
251 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
301 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
351 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
401 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
451 G (SEQ ID N0:33)
A-гликозилированная форма с низкой эффекторной функцией ch24F4 также была сконструирована путем субклонирования фрагмента 0,45 кб Notl-Apal из конструкции pYL668 вариабельного домена тяжелой цепи 24F4 и фрагмента 0,98 кб Apal-BamHI из pEAG2412 (плазмиды, содержащей подтвержденную последовательность кДНК константного домена гибридной тяжелой цепи S228P/N299Q huIgG4/IgG1 с генетически удаленнным C-концевым остатком лизина IgG1), субклонирована в каркас вектора экспрессионного вектора pV90, создавая плазмиду pYL670. Последовательность кДНК тяжелой цепи в полученной плазмиде pYL670 была подтверждена секвенированием ДНК. Выведенная зрелая последовательности белка гибридной тяжелой цепи agly ch24F4-huIgG4/GL, кодируемая pYL670, показана ниже
1 DVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT
51 ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNTL FLQMSSLKSE DTAMYYCTRD
101 IYYNYGAWFA YWGQGTLVTV SAASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL
151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK
251 DTLMISRTPE VTCVWDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFQS
301 TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV
351 YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG
(SEQ ID N0:34)
Вариабельный домен легкой каппа-цепи в плазмиде pYL651 использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами 5' GAT CCG CGG CCG CCA CCA TGG AGA CAG АСА САС ТСС TG 3' (SEQ ID NO: 35) (добавление сайта Notl 5' и последовательности Козака) и 5' CCA CCG TAC GTT TGA TTT CCA GCT TGG TGC 3' (SEQ ID NO: 36) (добавление сайта 3' BsiWl и человеческой каппа последовательности константной области в сочленении FR4/константный домен) путем амплификации фрагмента 0,4 кб, который очищали и субклонировали в клонирующий вектор Invitrogen pCRBluntllTOPO, получая pYL669. Последовательности кДНК вариабельной области в плазмиде pYL669 были подтверждены путем секвенирования ДНК. Для конструирования химерной легкой цепи фрагмент 0,4 кб Notl-BsiWI вариабельного домена легкой цепи из pYL669 и фрагмент 0,34 кб BsiWI-BamHI из плазмиды pEAG1572 (содержащий подтвержденную последовательность кДНК константного домена человеческой легкой каппа-цепи) субклонировали в каркас вектора pV100 (в котором экспрессия гетерологичного гена контролируется промотором CMV-IE и сигналом полиаденилирования человеческого гормона роста и который несет селективный маркер неомицина), с получением вектора экспрессии pYL671. Последовательность кДНК легкой цепи в полученной плазмиде pYL671 была подтверждена секвенированием ДНК. Выведенная зрелая последовательность белка ch24F4 человеческой легкой каппа цепи, которая кодируется pYL671, показана ниже
- 35 034757
1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL
51 LIYAASTLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQCNEDPR
101 TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID N0:37)
Векторы экспрессии (векторы pYL670 или pYL672 тяжелой цепи ch24F4 и вектор pYL671 легкой цепи ch24F4) котрансфицировали в клетки 293-EBNA, и трансфицированные клетки исследовали на секрецию антител и специфичность (клетки, трансфицированные пустым вектором и вектором молекулярно клонированного неродственного мАт служили в качестве контроля). Вестерн-блот анализ (разработанный с тяжелой и легкой цепью античеловеческого антитела) кондиционированной среды показал, что ch24F4-трансфицированные клетки синтезируют и эффективно секретируют тяжелые и легкие цепи. Анализ прямого FACS связывания с поверхностью BDCA2 человека подтвердил специфичность ch24F4. Показатель EC50 связывания обоих вариантов ch24F4 эквивалентен связыванию мышиного мАт 24F4 при прямом связывании с поверхностно экспрессируемым BDCA2 человека, что показано в анализе FACS с титрованием и разведением. Стабильные клеточные линии CHO, секретирующие ch24F4-huIgGl, мАт каппа и гибридное мАт каппа agly ch24F4-huIgG4/GL, были получены путем ко-трансфекции с pYL672/pYL671 и pYL670/pYL671 соответственно.
Пример 3. Удаление непарного остатка цистеина в CDRL3 химерного антитела 24F4.
Поскольку непарные цистеины в экспонированной CDR могут вызывать гетерогенность или нестабильность продукта, были сконструированы варианты ch24F4 C95S и C95T путем сайт-направленного мутагенеза с использованием плазмиды pYL671 экспрессионного вектора легкой цепи ch24F4 в качестве матрицы.
Сайт-направленный мутагенез проводили с использованием набора для мутагенеза QuikChange II фирмы Agilent согласно протоколу, рекомендованному производителем. Вариант C95S был сконструирован с использованием мутагенного праймера 5' GCA ACC TAT TAC TGT CAA CAA AGT AAT GAG GAT CCT CGG АС 3' (SEQ ID NO: 38) и его обратного комплемента, с встроенным новым сайтом HincII, и была получена плазмида pEAG2678. Вариант C95T был сконструирован с использованием мутагенного праймера 5' CAA CCT ATT ACT GTC AGC AAA CTA ATG AAG ATC CTC GGA CGT TCG 3' (SEQ ID NO: 39) и его обратного комплемента, с удалением сайта BamHl, и была получена плазмида pEAG2679. Мутантные плазмиды идентифицировали путем скрининга изменений вставленных сайтов рестрикции. Полноразмерные кДНК-последовательности легкой цепи в полученных плазмидах были подтверждены секвенированием ДНК. ch24F4 дикого типа и вариантные мАт C95S и C95T транзиторно экспрессировались в клетках 293E путем котрансфекции pYL672 и pYL671, pEAG2678 или pEAG2679. Кондиционированную среду собирали через 2 дня после трансфекции. Титры (анализированные с помощью OCTET наконечниками анти-человеческой Fc) обоих вариантов были сходны с титрами дикого типа ch24F4, и Вестерн-блот анализы с SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях показали отсутствие большой аггрегации или очевидного клипирования относительно мАт дикого типа ch24F4. Прямое связывание посредством FACS на поверхности BDCA2 указывает, что тогда, как очевидный показатель EC50 связывания у варианта C95S был эквивалентен этому показателю у дикого типа ch24F4, EC50 связывания варианта C95T был снижен в несколько раз. Кондиционированную среду, содержащую мАт ch24F4 и вариант C95, анализировали с помощью OCTET на связывание с эктодоменом BDCA2 человека. Антитела из кондиционированной среды из транзиторно трансфицированных клеток связывали с анти-человеческими Fc на наконечниках, затем мономерные huBDCA2 пропускали через наконечники OCTET для анализа связывания и диссоциации. Определенная с помощью OCTET кинетика связывания и диссоциации ch24F4 дикого типа и вариантного C95S была эквивалентной, тогда как скорость диссоциации вариантного C95T была выше, чем у дикого типа ch24F4. На основании этих результатов C95S были включены в CDRL3 легкой цепи гуманизированного 24F4.
Пример 4. Примеры тяжелых и легких цепей гуманизированного 24F4.
Примеры семи гуманизированных (hu) тяжелых цепей 24F4 (каркас huIGHV3-21*01/24F4 VH CDR) и соответствующие им ДНК-последовательности показаны ниже. Области CDR 1, 2 и 3 в каждой тяжелой цепи подчеркнуты в указанном порядке. Каркасные обратные мутации показаны строчным жирным шрифтом. Изменения в остатках CDR мышиного 24F4 показаны штриховкой в CDR последовательностях. Область CDR1 вариабельной тяжелой цепи (CDR H1) показана в соответствии с определением по Chothia, которое на 5 аминокислот длиннее, чем определение по Kabat; выделенные остатки в CDR H1 указывают на дополнительные 5 аминокислот (а именно, GFTFS (SEQ ID NO: 12)), которые образуют область CDR H1 по Chothia. Основная N-концевая аминокислота (т.е. глутаминовая кислота в вариантах H0, H1, H2, H3 и аспарагиновая кислота в вариантах H4, H5 и H6) из домена вариабельной области тяжелой цепи, могут связываться непосредственно с антигеном, и влиять на аффинность связывания. Скрытый остаток в положении 49 по Kabat может влиять на конформацию CDR2 тяжелой цепи (серин в вариантах H0, H1, H2, H3 и аланин в вариантах H4, H5 и H6). Остаток в положении 93 по Kabat может влиять
- 36 034757 на спаривание тяжелой и легкой цепи (аланин в вариантах H0, H1, H2, H3, и треонин в вариантах H4, H5 и H6. Аминокислотные остатки в областях CDR H1, H2 и H3, которые отличаются от мышиных CDR H1,
H2, H3 из 24F4, заштрихованы.
Вариант H0
EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAASGFTFSTYTMSWVROAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS
VKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ
ID N0:40)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC
AAGGGACTGGAGTGGGTCTCTGCTATTAGTGGTAGCGGAGGTAGTACATACTATGCAGACAGT
GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATGAAC AGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCTCGAGATATCTACTATAATTACGGA
GCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID N0:41) (pYL742)
Вариант H1
EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVS TIS PGDS FGYYPDS
VKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ
ID N0:42)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC
AAGGGACTGGAGTGGGTCTCTACCATTAGTCCAGGAGACAGTTTCGGATACTATCCAGACAGT
GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATGAAC
AGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCTCGAGATATTTACTATAATTACGGA
GCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID N0:43) (pYL743)
Вариант H2
EVQLVE S GGGLVKPGGS LRL S CAAS GFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVS TISPGDSSTIYYAD
SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID N0:44)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC
AAGGGACTGGAGTGGGTCTCTACCATTAGTCCAGGAGACAGTAGCACTATCTACTATGCAGAC
AGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATG
AACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCCGAGATATTTACTATAATTAC GGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID
N0:45) (pYL744)
Вариант H3
- 37 034757
EVQLVE S GGGLVKPGGS LRL S CAAS GFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVS TIS PGDS FGYYYPD
SVQGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID N0:46)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC
AAGGGACTGGAGTGGGTCTCTACCATTAGTCCAGGAGACAGTTTCGGCTACTACTATCCAGAC
AGTGTGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATG
AACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCCGAGATATTTACTATAATTAC
GGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID
N0:47) (pYL745)
Вариант H4 dVQLVE S GGGLVKPGGSLRLSCAASGFYFSTYTMSWVROAPGKGLEWVaTISPGDSFGYYYPD
SVQGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCtRDIYYNYGAWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID N0:24)
GACGTCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC
AAGGGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTCCAGGAGACAGTTTCGGCTACTACTATCCAGAC
AGTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATG
AACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCCGAGATATTTACTATAATTAC
GGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID
N0:48) (pYL746)
Вариант H5 dVQLVqS GGGLVKPGGS LRLS CAASGFTFSTYTMSWVROAPGKGLEWVaTIS PGDS FGYYYPD
SVQGRFTISRDNAKNSLYLOMNrLRAEDTAVYYCtRDIYYNYGAWFAYWGrGTLVTVSS (SEQ ID N0:49)
GACGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC
AAGGGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTCCAGGAGACAGTTTCGGCTACTACTATCCAGAC
AGTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATG
AACAGGCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCCGAGATATTTACTATAATTAC
GGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCAGAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID
N0:50) (pYL747)
Вариант H6 dVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAASGFTFSTYTMSWVROAPGKGLEWVaTISqGnnyGYsYPD
SVkGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCtRDIYYNYGAWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID N0:52)
GACGTCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGC
AAGGGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGCGGAAATAACTACGGCTACTCCTATCCAGAC
AGTGTCAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAATGCCAAGAACAGTCTGTACCTGCAAATG
AACTCCCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCCGAGATATTTACTATAATTAC
GGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID
N0:53) (pYL748)
Выравнивание аминокислотных последовательностей версий от H0 до H6 показано ниже
- 38 034757
HO EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVSAIS-GSGGSTY
Hl EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISPGDSFG-Y
H2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISPGDSSTIY
H3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISPGDSFGYY
H4 DVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVATISPGDSFGYY
H5 DVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVATISPGDSFGYY
H6 DVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGNNYGYS .**** .******************************************. . _ .
HO YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:40)
Hl YPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:42)
H2 YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:44)
H3 YPDSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:46)
H4 YPDSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:24)
H5 YPDSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNRLRAEDTAVYYCTRDIYYNYGAWFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID N0:49)
H6 YPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:52)
Ниже показаны примеры трех гуманизированных легких цепей 24F4 (каркас huIGKV1-13*02/24F4 VL CDR) и соответствующие им последовательности ДНК. Области CDR 1, 2 и 3 в каждой легкой цепи подчеркнуты в указанном порядке. Выделен остаток Ser91 (в соответствии с нумерацией по Kabat), который был заменен на Cys91 во всех легких цепях. Основная N-концевая аминокислота (т.е. аланин в варианте L0 и аспарагиновая кислота в вариантах L1 и L2) домена вариабельной легкой цепи может связываться непосредственно с антигеном и влияет на аффинность связывания. Каркасные обратные мутации показаны строчным жирным шрифтом. Первый вариант (L0) содержит наименьшее количество обратных мутации и третий вариант (L2) содержит большинство обратных мутаций (т.е. является наименее гуманизированным).
Вариант L0
AlQLTQS PS SLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLESGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCOQSNEDPRTFGOGTKVEIK (SEQ ID N0:54)
GCTATTCAGCTGACCCAATCTCCATCCTCTTTGTCCGCCTCTGTGGGGGACAGGGTCACCATC
ACCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAACAG
AAACCAGGGAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTACGCTGCATCCACTCTCGAGTCTGGGGTCCCA
TCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACAATCAGCTCACTCCAGCCA
GAGGATTTCGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGCAACGAGGATCCTCGGACGTTCGGTCAGGGC
ACCAAAGTGGAAATCAAG (SEQ ID N0:55) (pYL729)
Вариант L1 diQLTQS PS SLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLESGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOQSNEDPRTFGOGTKVEIK (SEQ ID N0:56)
GACATTCAGCTGACCCAATCTCCATCCTCTTTGTCCGCCTCTGTGGGGGACAGGGTCACCATC
ACCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAACAG
AAACCAGGGAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTACGCTGCATCCACTCTCGAGTCTGGGGTCCCA
TCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACAATCAGCTCACTCCAGCCA
GAGGATTTCGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGCAACGAGGATCCTCGGACGTTCGGTCAGGGC
ACCAAAGTGGAAATCAAG (SEQ ID N0:57) (pYL730)
Вариант L2
- 39 034757 dlOLTOSPSSLSvSVGDRaTIsCKASQSVDYDGDSYMNWYOOKPGKAPKLLIYAASTLESGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSvOPEDFATYYCOQSNEDPRTFGOGTKVEIK (SEQ ID N0:58)
GACATTCAGCTGACCCAATCTCCATCCTCTTTGTCCGTCTCTGTGGGGGACAGGGCAACCATC
TCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAACAG AAACCAGGGAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTACGCTGCATCCACTCTTGAGTCTGGGGTCCCA
TCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACAATCAGCTCAGTGCAGCCA
GAGGATTTCGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGCAACGAGGATCCTCGGACGTTCGGTCAGGGC
ACCAAAGTGGAAATCAAG (SEQ ID N0:59) (pYL731)
Выравнивание аминокислотных последовательностей вариантов от L0 до L2 показано ниже
LO AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLES
LI DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLES
L2 DIQLTQSPSSLSVSVGDRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLES
LO GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID N0:54)
LI GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID N0:56)
L2 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQSNEDPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID N0:58)
Гуманизированные аминокислотные последовательности VH и VL, указанные выше, не содержат каких-либо потенциальных N-связанных сайтов гликозилирования или Asn-Gly сайтов деамидирования. В последовательности зародышевой линии в обоих доменах VH и VL наблюдаются метионины, которые не экспонированы на поверхность, таким образом, предполагается, что риск окисления метионина будет минимальным.
Растворимость белков может коррелировать с показателем pI. Индексы pI созданных конструкций были рассчитаны с использованием показателей рК аминокислот авторами Bjellqvist et al. (Electrophoresis, 14:1023-31 (1993); Electrophoresis, 15:529-39(1994)). Показанные ниже значения были рассчитаны с использованием человеческих тяжелых цепей IgG1. Каждое из гуманизированных антител имеет pI значительно выше 7, и следовательно, ожидается, что эти антитела будут иметь значительный положительный заряд при нейтральном уровне рН. Каждая запись в таблице является вычисленным значением pI полного комбинированного антитела, суммарный заряд показан в круглых скобках
Молекула Расчетное р! (суммарный заряд)
Химерная 24F4 6,94 (-2)
Гуманизированная H4L1 7,26 (0)
Пример 5. Связывание Hx/L1 с BDCA2.
Все возможные варианты (21 вариант) тяжелой и легкой цепи hu24F4 (как описано в примере 4) и ch24F4 были транзиторно экспрессированы в клетках 293E путем котрансфекции плазмид тяжелой цепи и легкой цепи. Все варианты hu24F4 были собраны и секретированы, с титрами, превышающими титры ch24F4 (что определяли по количеству мАт в кондиционированной среде путем OCTET-связывания с наконечниками с анти-человеческими Fc). Вестерн-блоттинг с анализами SDS-PAGE с невосстанавливающими условиями, выполненными с химерными и гуманизированными моноклональными антителами 24F4, не показал большой аггрегации или очевидного клипирования по отношению к ch24F4.
Кондиционированную среду анализировали с помощью прямого связывания FACS на стабильно трансфицированных DG44 клетках CHO, которые коэкспрессировали полноразмерные кДНК BDCA2 и FcsRIy (человека или обезьяны циномолгус), подходящими векторами экспрессии были человеческий BDCA2/Fc8RIy:pEAG2456, циномолгусный BDCA2/Fc8RIy:pEAG2668). При прямом связывании с поверхностным BDCA2 человека или обезьяны циномолгус наблюдалась полная утрата связывания у вариантов H0, H1 и H2 hu24F4, значительная потеря аффинности связывания наблюдалась у варианта H3 hu24F4, хорошее сохранение аффинности выявлено в обоих вариантах H4 и H5 hu24F4, и умеренная потеря связывания выявлена в вариантах H6 hu24F4 (фиг. 2 и 3). На основании титра и очевидных значений EC50 в анализе прямого связывания FACS были определены H4/L1 и H5/L1 как лучшие варианты hu24F4.
Кондиционированную среду, содержащую ch24F4 и все вариантные мАт hu24F4, анализировали с помощью OCTET на связывание с эктодоменом BDCA2 человека. Был изготовлен эктодомен мономерного huBDCA2 путем протеолитического расщепления из очищенного слитого белка muIgG2a FChuBDCA2 (соответствующая плазмида: pEAG2423). Антитела из кондиционированной среды от транзиторно трансфицированных клеток связывали с наконечниками с античеловеческими Fc, a затем моно- 40 034757 мерный huBDCA2 пропускали через OCTET-наконечники для анализа связывания и диссоциации. Серии
H4 и H5 вариантов hu24F4 показали лучшую аффинность к huBDCA2
Название образца Аффинность связывания KD (М) Скорость ассоциации kon (1/МС) Скорость диссоциации kdis (VC)
H6/L0 5,00Е-09 2,73Е+05 1,37Е-03
H0/L1 9,50Е-11 1,00Е+05 9,50Е-06
H1/L1 5,ОЗЕ-11 1,00Е+05 5,03Е-06
H2/L1 3,35Е-11 1,00Е+05 3,35Е-06
H3/L1 1,ЗОЕ-08 4,52Е+05 5,86Е-03
H4/L1 7,44Е-10 5,49Е+05 4,08Е-04
ch24F4 2,17Е-09 1,61Е+06 3,49Е-03
Контроль 5С8 2,51Е-14 1,00Е+05 2,51Е-09
Пример 6. Повышение аффинности hu24F4.
Чтобы изучить возможность повышения аффинности hu24F4 путем замещения в положении CDR L3 версии L1 24F4 непарного цистеина (C95S в векторе экспрессии pYL740 легкой цепи hu24F4), был сконструирован ряд вариантов версии L1 путем сайт-направленного мутагенеза. Обратную мутацию в непарном цистеине, т.е. в S95C, конструировали с помощью сайт-направленного мутагенеза, продуцирующего плазмиду pYL749. Варианты S95T, S95A и S95V были сконструированы путем сайтнаправленного мутагенеза, продуцирующего плазмиды pYL750, pYL751 и pYL752, соответственно. Полноразмерные кДНК-последовательности легкой цепи в полученных плазмидах были подтверждены секвенированием ДНК. Вариантные C95 моноклональные антитела hu24F4 были транзиторно экспрессированы в клетках 293E путем котрансфекции pYL746 тяжелой цепи hu24F4 H4 или pYL747 тяжелой цепи hu24F4 H5 с hu24F4 L1 вариантами легких цепей из плазмид C95S pYL740, S95C pYL749, S95T pYL750, S95A pYL751 или S95V pYL752. Кондиционированную среду собирали через 2 дня после трансфекции. Титры (анализированные с помощью OCTET с наконечниками с анти-человеческими Fc) всех вариантов были сходными, и вестерн-блоттинг SDS-PAGE с невосстанавливающими условиями не показал большой аггрегации или очевидного клиппинга. Кондиционированную среду, содержащую вариантные мАт C95, анализировали способом OCTET на связывание с эктодоменом BDCA2 человека. Антитела из кондиционированной среды от транзиторно трансфицированных клеток связывали с наконечниками с античеловеческими Fc, затем мономерный huBDCA2 пропускали через наконечники OCTET для анализа связывания и диссоциации. Варианты C95A имели самую низкую скорость диссоциации.
Название образца Аффинность связывания KD (М) Скорость ассоциации kon (1/Мс) Скорость диссоциации kdis (1/с)
24F4-H4/L1 (YL740/YL746) 5,48Е-10 7,27Е+05 3,98Е-04
H4-L1-S95C (YL749/YL746) 2,89Е-10 9,67Е+05 2,79Е-04
H4-L1-C95T (YL750/YL746) 3,92Е-10 9,44Е+05 3,70Е-04
H4-L1-C95A (YL751/YL746) 2,61Е-10 8,84Е+05 2,ЗОЕ-04
H4-L1-C95V (YL752/YL746) 3,23Е-10 9,ЗЗЕ+05 3,01Е-04
На основании этих результатов были созданы стабильные клеточные линии CHO для C95T и C95A вариантов hu24F4 H4/L1 и вариантов C95T и C95A H5/L1, которые имели самую низкую скорость диссоциации. Анализы связывания OCTET повторяли для очищенных моноклональных hu 24F4. В качестве
- 41 034757 ведущего кандидата выбрали C95A вариант hu 24F4 H4/L1. Последовательности плазмид pYL746 (тяжелой цепи hu 24F4 Н4) и pYL751 (легкой цепи hu 24F4 L1) были использованы для перекодирования и конструирования экспрессирующих векторов для создания продуцирующей клеточной линии CHO.
Выведенная зрелая аминокислотная последовательность легкой цепи hu24F4 L1 C95A, кодируемая pYL751, показана ниже (CDR L1, CDR L2 и CDR L3 подчеркнуты)
1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGKAPKL
51 LIYAASTLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQANEDPR
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID N0:3)
Выведенная зрелая аминокислотная последовательность тяжелой цепи hu24F4 H4-hulgG1, кодируемая pYL746, показана ниже (CDR H1, CDR H2 и CDR H3 подчеркнуты)
1 DVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS TYTMSWVRQA PGKGLEWVAT
51 ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCTRD
101 IYYNYGAWFA .YWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL
151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201 QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP
251 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
301 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
351 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
401 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
451 G (SEQ ID 1 JO:4)
Антитело, состоящее из зрелой тяжелой цепи (SEQ ID NO: 4) и зрелой легкой цепи (SEQ ID NO: 3), показанных выше, называется BIIB059.
Пример 7. Перекодирование генов тяжелой и легкой цепи.
Для потенциального улучшения экспрессии были перекодированы гены нуклеотидной последовательности легкой и тяжелой цепи без изменения аминокислотной последовательности. Ниже показана модифицированная последовательность ДНК гена легкой цепи анти-BDCA2. Аминокислоты 1-240 содержат последовательность легкой цепи. Аминокислоты 1-22 (нуклеотиды обозначены строчным шрифтом) содержат сигнальный пептид нативной легкой цепи. Зрелый N-конец начинается с аминокислоты 23 (D)
- 42 034757 atg gac atg agg gtc ccc get cag etc etg ggg etc ett etg etc tgg etc cct gga gca ega tgt
1>MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC
GAC ATT CAG CTG ACC CAA TCT CCA ТСС TCT TTG TCC GCC TCT GTG GGG GAC AGG GTC ACC АТС ACC
23> D I Q L Т Q s P S S L S A s V G D R V T I T
133 TGC AAG GCC AGC САА AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAT CAA CAG AAA CCA
45> С К А S 0 S V D Y D G D S Y M N W Y Q Q К P
193 GGG AAG GCT ссс ААА СТС CTC АТС TAC GCT GCA TCC ACT CTC GAG TCT GGG GTC CCA TCC AGG TTT
67> G К А Р К L L I Y A A S T L E S G V P s R F
265 AGT GGC AGT GGG ТСТ GGG АСА GAC TTC ACC CTC АСА АТС AGC TCA CTC CAG CCA GAG GAT TTC GCA
89> S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A
331 АСС ТАТ ТАС TGT САА CAA GCC AAC GAA GAT CCT CGG ACC TTC GGT CAG GGC ACC AAA GTG GAA АТС
111> Т Y Y С 0 A N E D P R T F G Q G T К V E I
397 AAG CGG ACC GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC АТС TTC CCT CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA
133> К R T V A A P S V F I F P P S D E Q L К S G
463 ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTG CAG TGG AAG GTG
155> T A S V V C L L N N F Y P R E A К V Q W К V
529 GAT AAC GCC CTC CAA TCT GGC AAC TCC CAG GAG AGT GTC АСА GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC
177> D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S К D S T
595 TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACC CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC
199> Y S L S S T L T L S К A D Y E К H К V Y A C
661 GAA ID N0:60) GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCT CCC GTC АСА AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TGA (SEQ
221> E V T H Q G L S S P V T К S F N R G E C * (SEQ
ID N0:61)
Модифицированная последовательность ДНК гена тяжелой цепи анти-ВВСА2 показана ниже. Аминокислоты 1-470 содержат последовательность тяжелой цепи. Аминокислоты 1-19 (нуклеотиды обозначены строчным шрифтом) содержат сигнальный пептид нативной тяжелой цепи. Зрелый N-конец начинается с аминокислоты 20 (D)
- 43 034757
1 atg ggt tgg w age s etc L ate I ttg L etc L ttc F Ctt L gtc V get A gtt V get A ace T egg R gtc V etg L tee s GAC D GTC V CAG Q
1> M G
67 CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC CTG GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGC GCA GCC TCT
23> L V E s G G G L V К P G G s L R L s C A A S
133 GGA TTC ACT TTC AGT ACC TAT ACC ATG TCT TGG GTT CGC CAA GCA CCT GGC AAG GGA CTG GAG TGG
45> G F T F S T Y T M S w V R Q A P G К G L E W
199 GTC GCA ACC ATT AGT CCA GGA GAC AGT TTC GGC TAC TAC TAT CCA GAC AGT GTC CAG GGC CGA TTC
67> V A T I S P G D S F G Y Y Y P D S V 0 G R F
265 ACC АТС TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC AGT CTG TAC CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGG GCA GAG GAC
89> T I S R D N A К N S L Y L Q M N S L R A E D
331 АСА GCC GTG TAT TAC TGT ACC CGA GAT ATT TAC TAT AAT TAC GGA GCC TGG TTT GCT TAC TGG GGC
111> T A V Y Y C T R D I Y Y N Y G A W F A Y W G
397 CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC
133> Q G T L V TV
463 ТСС TCC AAG AGC ACC TCTGGG
155> S S К S T SG
529 CCC GTG ACC GTG TCC TGGAAC
177> P V T V S WN
595 CAA TCC TCA GGA СТС TACTCC
199> Q S S G L YS
661 ACC TAC АТС TGC AAC GTGAAT
221> T Y I C N VN
727 TCT TGT GAC AAG ACT CACАСА
243> S C D К T ΗT
793 TTC СТС TTC CCC CCA AAACCC
265> F L F P P КP
TCT AGC GCT TCC ACC AAGGGC
S S A S T КG
GGC АСА GCT GCC CTG GGCTGC
G T A A L GC
TCA GGC GCC CTG ACC AGCGGC
S G A L T SG
CTC TCC AGC GTG GTG ACCGTG
L S S V V TV
CAC AAG CCC AGC AAC ACCAAG
H К P S N TК
TGC CCA CCT TGC CCA GCACCT
С P P С P AP
AAG GAC ACC CTC ATG АТСTCC
К D T L Μ IS
CCA TCC GTC TTC CCC CTG GCA CCC
PSVFPLAP
CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA
LVKDYFPE
GTG CAC ACC TTC CCC GCT GTC CTG
VHTFPAVL
CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG
PSSSLGTQ
GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA
VDKKVEPK
GAA CTC CTG GGG GGA CCT TCA GTC
ELLGGPSV
CGG ACC CCT GAG GTC АСА TGC GTG
RTPEVTCV
- 44 034757
859 GTG GTG GAC GTG AGC САС GAA GAC ССТ GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAT GTT GAC GGC GTG GAG GTC
287> V V D V Ξ Н Е D Р Е V К F N W Y V D G V E V
925 CAT ААТ GCC AAG АСА AAG ССТ CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACC TAC CGG GTG GTC AGC GTC CTC
309> Н N А К Т К Р R Е Е Q Y N S T Y R V V S V L
991 АСС GTC CTG САС САА GAC TGG CTG ААТ GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC
331 = Т V L Н Q D W L· N G К E Y К C К V s N К A L
1057 ССА GCC ССС АТС GAG ААА АСС АТС ТСС ААА GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC
353 = Р А Р I Е К т I Ξ К A К G Q P R E P Q V Y T
112 3 CTG ССС ССА ТСС CGG GAT GAG CTG АСС AAG AAC CAA GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC
375 = L Р Р S R D Е L Т К N Q V Ξ L T C L V К G F
1189 ТАТ ССС AGC GAC АТС GCC GTG GAG TGG GAG AGC ΆΑΤ GGG CAG CCT GAG AAC AAC TAC AAG ACC АСА
397= Y Р S D I А V Е W Е S N G Q P E N N Y К T T
1255 ССТ ССС GTG TTG GAC ТСС GAC GGC ТСС ТТС TTC CTC TAC TCC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG
419> Р Р V L D S D G S F F L Ύ Ξ К L T V D К S R
1321 TGG CAG CAG GGG ААС GTC ТТС ТСА TGC ТСС GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACC CAG
441> W <2 <2 G N V F S С Ξ V M H E A L H N H Y T <2
1387 AAG AGC СТС ТСС CTG тст ССС GGT TGA (SEQ ID NO: i 62)
463> К S L S L S Р G * (SEQ ID NO: i 63)
Пример 8. Кассеты и векторы экспрессии.
Гены тяжелой цепи и гены легкой цепи вырезали и лигировали в отдельные экспрессирующие векторы. Каждый ген находится под транскрипционным контролем немедленно-раннего промотора человеческого цитомегаловируса и последовательности гена полиаденилирования человеческого гормона роста.
Плазмида, экспрессирующая легкую цепь, pJP009, также содержит кассету экспрессии для гена неомицин-фосфотрансферазы (neo), и содержит ранний промотор мышиной фосфоглицераткиназы (muPGK) и последовательность полиаденилирования muPGK (фиг. 4).
Плазмида, экспрессирующая тяжелую цепь, pJP010, также содержит кассету экспрессии для гена dhfr, который был использован в качестве селектируемого и амплифицируемого с метотрексатом маркера. Ключевые свойства плазмид pJP009 и pJP010 приведены ниже.
Название плазмиды Промото ры Сигнальные пептиды Зрелая полипептидная цепь Полиаден илирован не Селектируемые маркеры
pJP009 hCMV IE muPGK Нативный человеческий подгруппа I каппа Легкая цепь 218 аминокислот hGH muPGK неомицинфосфотрансфера за: (G418) беталактамаза: (ампициллин)
pJPOlO hCMV IE SV40E Синтетическая последовательност ь сигнального пептида Тяжелая цепь 451 аминокислота hGH SV40E DHFR: (альфануклеозиды) бета-лактамаза: (ампициллин)
Сокращения: немедленно-ранний цитомегаловирус человека (hCMV IE), ранний обезьяний вирус
- 45 034757 (SV40E), мышиная фосфоглицераткиназа (muPGK), человеческий гормон роста (hGH), ген неомицинфосфотрансферазы (G418 resistance), ген дигидрофолатредуктазы (dhfr), бактериальный ген устойчивости к ампициллину (бета-лактамаза).
Полная нуклеотидная последовательность плазмиды pJP009 показана ниже. Три открытые рамки считывания представляют собой легкую цепь 24F4, неомицин-фосфотрансферазу и бета-лактамазу
TTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTA
CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACT
185 TTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGA
277 CGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCA
369 TCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATT
461 GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAG
553 GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATA
645 GAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTAT
737 AGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTTATAGGT
829 GATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACA
921 TGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGT
- 46 034757
1013 CTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAAT
1105 CTCGGGTACGTGTTCCGGAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGA
1197 CTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGGGATCCGCCACC ATG GAC ATG AGG GTC CCC > M D M R V P
1281 GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTT CTG CTC TGG CTC CCT GGA GCA CGA TGT GAC ATT CAG CTG ACC CAA TCT
> A Q L L G L L L L W L P G A R C D I Q L T Q Ξ
1350 CCA TCC TCT TTG TCC GCC TCT GTG GGG GAC AGG GTC ACC АТС ACC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT
> P Ξ Ξ L Ξ A Ξ V G D R V T I T C К A Ξ Q Ξ V D
1419 TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGG AAG GCT CCC AAA CTC CTC АТС TAC
> Y D G D S Y M N W Y Q Q К P G К A P К L L I Y
1488 GCT GCA TCC ACT CTC GAG TCT GGG GTC CCA TCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG АСА GAC TTC ACC
> A A Ξ T L E Ξ G V P Ξ R F Ξ G S G Ξ G T D F T
1557 CTC АСА АТС AGC TCA CTC CAG CCA GAG GAT TTC GCA ACC TAT TAC TGT CAA CAA GCC AAC GAA GAT CCT
> L T I S S L Q P Ξ D F A T Y Y C Q Q A N E D P
1626 CGG ACC TTC GGT CAG GGC ACC AAA GTG GAA АТС AAG CGG ACC GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC АТС TTC
> R T F G Q G T К V E I К R T V A A P Ξ V F I F
1695 CCT CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC
> P P s D E Q L К s G T A Ξ V V C L L N N F Y P
1764 AGA GAG GCC AAA GTG CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCT GGC AAC TCC CAG GAG AGT GTC АСА
> R E A К V Q W К V D N A L Q Ξ G N Ξ Q E Ξ V T
1833 GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACC CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG
> E Q D S К D Ξ T Y Ξ L Ξ Ξ T L T L Ξ К A D Y Ξ
1902 AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCT CCC GTC АСА AAG AGC TTC AAC
> К H К V Y A C E V T H Q G L S Ξ P V T К S F N
1971 AGG GGA GAG TGT TGA GGATCCCTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA > R G E C · (SEQ ID N0:64)
058 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTTTGACTAGGTGTCCTTGTATAATATTATGGGGTGGAGGCGGGTGGT 2150 ATGGAGCAAGGGGCAGGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTTCAGGGTCTATTGGGAACCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACGATCTTGGCTCG 2242 CTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGTCTCCCGAATAGTTGGGATTCCAGGCATGCACGACCAGGCTCAGCTAA 2334 TTTTTGTATTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGTCTGGTCTCCATCTCCTGACCTCAGGTAATCCGCCCGCCTCGGCCTCC 2426 CAAATTGCTGGGATTACAGGTATGAGCCACTGGGCCCTTCCCTGTCCTGTGATTTTAAAATAATTATACCAGCAGAAGGACGTCCAGACACA 2518 GCATGGGCTACCTGGCCATGCCCAGCCAGTTGGACATTTGAGTTGTTTGCTTGGCACTGTCCTCTCATGAATTCCTGCAGGATTCGAGGGCC 2610 CCTGCAGGTCAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTA 2702 CACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTA 2794 CTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTG
- 47 034757
886 CAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAG
2978 GCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCA
3070 CGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCAATATGGGATCGGCCATTGAACA >MGSAIEQ
3162 AGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCG >DGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDA
3254 CCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCG >A V F R L Ξ A Q G R P V L F V К T D L Ξ G A L N E L Q D E A A
3346 CGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGA >RLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGE
43 8 AGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTG >VPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTL
53 0 ATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGAT >DPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDD
3622 CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGACCCA >LDEEHQGLAPAELFARLKARMPDGDDLVVTH
3714 TGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATC >GDACLPNIMVENGRFEGFIDCGRLGVADRY
3806 AGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCC >QDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAP
3898 GATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGGGGATCGATCCGCTGTAAGTCTGCAGAAATTGATGATCTATTA >DEQRIAFYRLLDEFF · (SEQ ID N0:65)
990 AACAATAAAGATGTCCACTAAAATGGAAGTTTTTCCTGTCATACTTTGTTAAGAAGGGTGAGAACAGAGTACCTACATTTTGAATGGAAGGA
082 TTGGAGCTACGGGGGTGGGGGTGGGGTGGGATTAGATAAATGCCTGCTCTTTACTGAAGGCTCTTTACTATTGCTTTATGATJXATGTTTCAT 4174 AGTTGGATATCATAATTTAAACAAGCAAAACCAAATTAAGGGCCAGCTCATTCCTCCCACTCATGATCTATAGATCTATAGATCTCTCGTGG 4266 GATCATTGTTTTTCTCTTGATTCCCACTTTGTGGTTCTAAGTACTGTGGTTTCCAAATGTGTCAGTTTCATAGCCTGAAGAACGAGATCAGC 4358 AGCCTCTGTTCCACATACACTTCATTCTCAGTATTGTTTTGCCAAGTTCTAATTCCATCAGAAGCTGACTCTAGATCTGGATCGATGAATTC 4450 GGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCA 4542 TAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGAC 4634 CGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGG 4726 TTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATA 4818 CATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCG >MSIQHFR
4910 TGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGT >VALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQ
- 48 034757
002 TGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGC >LGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMS
094 ACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGA >TFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQND
5186 CTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATA >LVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSD
78 ACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTT >N T A A N L L L T T I G G P К E L T A F L Η N M G D Η V T R L
70 GATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACT >DRWEP ELNEAI PNDERDTTMPVAMATTLRKL
5462 ATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGG >LTGELLTLA£RQQLIDWMEADKVAGPLLR£
5554 CCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAG >A L P A G W F I A D К Ξ G A G E R G Ξ R G I I A A L G P D G К
5646 CCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGAT >PSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLI
73 8 TAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGA > К H W · (SEQ ID N0:66)
83 0 TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCT
5922 TGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACC
6014 AACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGA
6106 ACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGAC
6198 TCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGA
6290 ACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAA
6382 CAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTT
6474 TTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA
6566 CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCG
6658 AGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGG
750 CACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTT
842 TATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC (SEQ ID NO:67)
Полная нуклеотидная последовательность плазмиды pJP010 (фиг. 5) показана ниже. Три открытые рамки считывания представляют собой тяжелую цепь 24F4, мышиную дигидрофолатредуктазу и беталактамазу
- 49 034757
TTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTA
CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACT
185 TTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGA
277 CGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCA
369 TCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATT
461 GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAG
553 GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATA
645 GAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTAT
737 AGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTTATAGGT
9 GATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACA
921 TGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGT 1013 CTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAAT 1105 CTCGGGTACGTGTTCCGGAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGA 1197 CTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGGGATCCGCCACC ATG GGT TGG AGC CTC АТС
1281 TTG CTC TTC CTT GTC GCT GTT GCT ACC CGG GTC CTG TCC GAC GTC CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC >LLFLVAVATRVLSDVQLVESGGG
50 CTG GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGC GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT ACC TAT ACC > L V К PG
1419 ATG TCT TGG GTTCGC > M S W VR
1488 TTC GGC TAC TACTAT > F G Y YY
1557 CTG TAC CTG CAA ATG > L Y L QM
1626 TAT AAT TAC GGA GCC > Y N Y GA
1695 AAG GGC CCA TCCGTC > К G P SV
G S L R LS
CAA GCA CCT GGC AAGGGA
Q A P G КG
CCA GAC AGT GTC CAGGGC
P D S V QG
AAC AGT CTG AGG GCAGAG
N S L R AE
TGG TTT GCT TAC TGGGGC
W F A Y WG
TTC CCC CTG GCA CCCTCC
F P L A PS
C A A S GF
CTG GAG TGG GTC GCAACC
L E W V AT
CGA TTC ACC АТС TCCAGA
R F Τ I ΞR
GAC АСА GCC GTG TATTAC
D T A V YY
CAA GGG ACT CTG GTCACT
Q G T L VT
TCC AAG AGC ACC TCTGGG
S К S T SG
T F S Τ YT
ATT AGT CCA GGA GACAGT
I S P G DS
GAC AAT GCC AAG AACAGT
D N A К NS
TGT ACC CGA GAT ATTTAC
С T R D IY
GTC TCT AGC GCT TCCACC
V S S A ΞT
GGC АСА GCT GCC CTGGGC
G T A A LG
1764 TGC CTG GTC > C LV
1833 GTG CAC ACC > V HT
1902 TCC AGC AGC > Ξ ΞΞ
1971 AAG AAA GTT > К КV
AAG GAC TAC TTC
К D YF
TTC CCC GCT GTC
F P AV
TTG GGC ACC CAG
L G TQ
GAG CCC AAA TCT
E P КS
CCC GAA CCC GTG
P E P V
CTG CAA TCC TCA
L Q S S
ACC TAC АТС TGC
T Y I C
TGT GAC AAG ACT
C D К T
ACC GTG TCC TGG
T V sw
GGA CTC TAC TCC
G L YS
AAC GTG AAT CAC
Ν V NH
CAC АСА TGC CCA
H T CP
AAC TCA GGC GCC
N S GA
CTC TCC AGC GTG
L S SV
AAG CCC AGC AAC
К P SN
CCT TGC CCA GCA
P С PA
CTG ACC AGC GGC
L Τ Ξ G GTG ACC GTG CCC
V T V P ACC AAG GTG GAC
T К V D CCT GAA CTC CTG
PELL
- 50 034757
2040 GGG GGA CCT TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG АТС TCC CGG ACC CCT GAG
> G G P Ξ V F L F P P К P К D T L M I Ξ R T P Ξ
2109 GTC АСА TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAT GTT GAC GGC
> V T C V V V D V S H E D P E V К F N W Y V D G
2178 GTG GAG GTC CAT AAT GCC AAG АСА AAG CCT CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACC TAC CGG GTG GTC AGC
> V E V H N A К T К P R E E Q Y N Ξ T Y R V V S
2247 GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAA GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC
> V L T V L H Q D W L N G К E Y К C К V Ξ N К A
2316 CTC CCA GCC CCC АТС GAG AAA ACC АТС TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC
> L P A P I E К T I S К A К G Q P R E P Q V Y T
2385 CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAA GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT
> L P P s R D E L T К N Q V Ξ L T C L V К G F Y
2454 CCC AGC GAC АТС GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCT GAG AAC AAC TAC AAG ACC АСА CCT CCC
> P Ξ D I A V E W E S N G Q P E N N Y К T T P P
2523 GTG TTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC TCC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG
> V L D s D G Ξ F F L Y Ξ К L T V D К Ξ R W Q Q
2592 GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACC CAG AAG AGC CTC TCC
> G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q К S L s
2661 CTG TCT CCC GGT TGA GGATCCCTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA > L Ξ P G · (SEQ ID N0:68 )
2748 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTTTGACTAGGTGTCCTTGTATAATATTATGGGGTGGAGGCGGGTGGT
2840 ATGGAGCAAGGGGCAGGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTTCAGGGTCTATTGGGAACCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACGATCTTGGCTCG
2932 CTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGTCTCCCGAATAGTTGGGATTCCAGGCATGCACGACCAGGCTCAGCTAA
3024 TTTTTGTATTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGTCTGGTCTCCATCTCCTGACCTCAGGTAATCCGCCCGCCTCGGCCTCC
3116 CAAATTGCTGGGATTACAGGTATGAGCCACTGGGCCCTTCCCTGTCCTGTGATTTTAAAATAATTATACCAGCAGAAGGACGTCCAGACACA
3208 GCATGGGCTACCTGGCCATGCCCAGCCAGTTGGACATTTGAGTTGTTTGCTTGGCACTGTCCTCTCATGAATTCGTCGACAGATCTGCGCAG
3 00 CACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGG
3392 TGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTC
4 84 CCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGC
3576 CCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG
3668 TAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGATTCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTC
760 GTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGC
3852 GTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGC
944 TAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAA >MVRPLNC IVAVSQNMGI GKN
- 51 034757
4036 CGGAGACCTACCCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGG >GDLPWPPLRNEFKYFQRMTTT£SVEGKQNL
412 8 TGATTATGGGTAGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAA >V I M G R К T W F S I P E К N R P L К D R I N I V L Ξ R E L К
22 0 GAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACAT >EPPRGAHFLAKSLDDALRLIEQPELASKVDM
312 GGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAAT >VWIVGGSSVYQEAMNQPGHLRLFVTRIMQE
04 TTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAA >FESDTFFPEIDLGKYKLLPEYPGVLSEVQEE
4 96 AAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAACTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCGG >KGIKYKFEVYEKKD· (SEQ ID N0:69)
588 CCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTG
4680 TGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGG
4772 AGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTGTCGACGAATTCACTGGCCGTCGTTTTA
4864 CAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGC
4956 CCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTT
5048 CACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCC
5140 TGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACC
5232 GAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT
5324 TTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATG
5416 CTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTT >MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVF
508 TGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTA >AHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSG
5600 AGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGAC >K I L E Ξ F R P E E R F P Μ Μ Ξ T F К V L L C G A V L S R I D
5692 GCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGG >AGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDG
784 CATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGG >MTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPK
5876 AGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAG >ELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDE
5968 CGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAAT >RDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLI
- 52 034757
060 AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTG >DWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAG
6152 AGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACT >ERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQAT 6244 ATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTA >MDERNRQ IAE IGASL I К H W · (SEQ ID N0:70 )
6336 GATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTT
642 8 CGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAA
52 0 AAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACC
6612 AAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTAC
704 CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACG
796 GGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCC
888 CGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATC
980 TTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC
072 AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTAT
7164 TACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATAC
56 GCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCA
734 8 ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA 7440 ATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC (SEQ ID N0:71)
Пример 9. Конструирование клеточной линии.
Использовали в качестве клетки-хозяина клеточную линию клеток яичника китайского хомячка с дефицитом дигидрофолатредуктазы (dhfr) CHO-DG44. Перед использованием провели тестирование банка клеток-хозяев DG44 с отрицательным результатом на наличие посторонних агентов. Клеткихозяева DG44 (CCB-00-05-01) были использованы для конструирования клеточных линий, экспрессирующих анти-BDCA2.
Плазмиды pJP009 и pJP010, экспрессирующие перекодированную легкую цепь и тяжелую цепь анtu-BDCA2, соответственно, были трансфицированы в клетки-хозяина этой линии путем электропорации. Селекцию трансфицированных клеток, экспрессирующих dhfr, проводили с использованием среды с дефицитом G нуклеозидов. После селекции в среде аМЕМ с дефицитом нуклеозидов, описанной выше, трансфицированный пул обогащали высокоэкспрессирующими клеточными линиями, используя комбинацию сортировки клеток с активацией флуоресценции и инструмент Genetix Clonepix FL (CER-00-0903). Клеточные колонии, выделенные на ClonePix FL, собирали из полутвердой среды в 96-луночные планшеты. В отдельных лунках клетки размножали и оценивали их продуктивность. Клеточная линия, которая показала самый высокий титр в анализе при встряхивании во флаконе с подпиткой (# 49), переводили в Research Animal Fermentation для роста в 10-литровом биореакторе в целях получения материала для определения его свойств.
После исходного скрининга клеточной линии были выбраны самые высокопродуцирующие клеточные линии для амплификации. Клеточные линии с максимальной продуктивностью подвергали амплификации с метотрексатом (МТХ). Амплифицированные пулы субклонировали с помощью ограниченного разведения в теоретической плотности 0,5 клеток на лунку в 384-луночных планшетах. Получали изображения от отдельных лунок 384-луночных планшетов с помощью прибора Cellavista (Innovatis) на наличие единичной клетки на лунку и подтверждали клоны.
Были выбраны лучшие четыре амплифицированные клональные клеточные линии для анализа пропорционального уменьшения при встряхивании флакона с подпиткой и анализа качества продукта. Из этих топ-4 клеточных линий был создан предварительные мастер-банки клеток (Pre-MCB), которые оценивали в биореакторах. Был выбран один ведущий субклон на основе производительности биореактора и анализа качества продукта. Флакон Pre-MCB лидирующей клеточной линии был переведен в производство для создания мастер - банка клеток.
Пример 10. Посттрансляционные модификации антитела против BDCA2, BIIB059.
a) Окисление.
- 53 034757
Эндо-Lys C пептидное картирование антитела против BDCA2 BIIB059 показало, что Met-257, Met433 и Trp-163 тяжелой цепи являются сайтами, восприимчивыми к окислению. Уровни варьировались в диапазоне от 4 до 7%. Экспериментальные данные указывают на то, что в основном окисление связано с приготовлением образца.
b) Дезамидирование.
Эндо-Lys C пептидное картирование антитела против BDCA2 BIIB059 показало, что примерно 2,5% каждого из Asn-389, Asn-394 и Asn-395 в тяжелой цепи было деамидировано (комбинированное дезамидирование и образование сукцинимида), и примерно 2,5% из Asn-320 в тяжелой цепи было деамидировано (в форме сукцинимида). Общее количество сукцинимидных форм для Asp-32 и Asp-34 в легкой цепи составляло примерно 3%. Комбинированная изомеризация Asp-32 и Asp-34 в легкой цепи составляла примерно 5%. Подобно окислению, некоторые из этих модификаций могут быть связаны с приготовлением образца.
c) Г ликация.
Гликация представляет собой неферментативную модификацию, вызванную реакцией аминогрупп на белки с глюкозой, являющиеся компонентом культуральной среды. Гликация обычно обнаруживается в белках, и ее уровень широко варьируется в зависимости от условий культивирования клеток. В антителе BIIB059 уровень гликации, измеренный с помощью интактного масс-анализа нередуцированного белка, составлял примерно 10%. Анализ пептидного картирования показал примерно 0,46% гликации на Lys-107 в легкой цепи, примерно 0,28% на Lys-103 в легкой цепи и примерно 0,2% на Lys-295 в тяжелой цепи.
d) O-связанное гликозилирование.
Не было выявлено O-связанное гликозилирование BIIB059.
e) Другие модификации (например, гидроксилизин и т.д.) Анализы показали, что <1% тяжелой цепи антитела BIIB059 находится в a-гликозилированной форме. В анализе не выявлено замен Asn на Ser, и в антителе не было обнаружено неизвестных модификации или мутаций на уровне >1%.
Пример 11. Прямое связывание BIIB059 с клеточной поверхноствю плазмоцитоидных дендритных клеток.
Анализ цельной крови способом проточной цитометрии был разработан для оценки связывания BIIB059 с BDCA2 на плазмоцитоидных дендритных клеток (pDC) человека или обезьян циномолгус. Периферическую кровь обезьян циномолгус (Toxikon, Inc, Bedford, MA) или человеческую периферическую кровь (Biogen Idec) собирали в пробирки для образцов с гепарином-натрием и оставляли при комнатной температуре. Коктейль антител для FACS-окрашивания в целях выявления клеток pDC добавляли в каждую аликвоту всей крови, включающей в себя антитела CD20, CD14, CD123 и HLA-DR. Меченое Alexa647 антитело BIIB059 (Biogen Idec, Lot # 17073-057) или меченый Alexa647 контрольный изотип hlgG добавляли в окрашивающий коктейль FACS в концентрации от 0 до 40 мкг/мл. Кровь инкубировали на льду в условиях защиты от света, в течение 30 мин. Через 30 мин каждую аликвоту цельной крови 500 мкл (циномолгус) или 100 мкл (человека) обрабатывали буфером IX Easy Lyse (Leinco Technologies) в количестве 10 мл (для крови циномолгусов) или 2 мл (для крови человека) которые инкубировали при 37°C в течение не менее одного часа. После инкубации в течение 10-15 мин при комнатной температуре образцы центрифугировали при 1400 об/мин в течение 5 мин. Супернатант декантировали, оставляя только осадок лейкоцитов (WBC). Каждый осадок WBC промывали 5 мл FACS буфера (1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) + 0,002% NaAzide + 1 мМ CaCl2 + 1 мМ MgCl2 в ФБР) и центрифугировали при 1400 об/мин в течение 5 мин. Супернатант декантировали, каждый осадок WBC ресуспендировали в 200 мкл FACS буфера и переносили в 96-луночный круглодонный планшет (Fisher Scientific). Планшет центрифугировали при 1400 об/мин в течение 5 мин. Супернатант вытряхивали из планшета, и каждый осадок WBC промывали 200 мкл FACS буфера. Планшет центрифугировали при 1400 об/мин в течение 5 мин, затем супернатант вытряхивали из планшета. После промывания (как описано выше), лейкоциты ресуспендировали в 200 мкл 1% параформальдегида (PFA) в ФБР и фиксировали при 4°C в течение ночи в защищенном от света месте.
Непосредственно перед анализом проточной цитометрии лейкоциты фильтровали с использованием фильтровального нейлонового сетчатого планшета калибром 60 мкм (Millipore). Затем каждый осадок переносили в новый 96-луночный круглодонный планшет и центрифугировали при 1400 об/мин в течение 5 мин. Каждый осадок лейкоцитов ресуспендировали в 250 буфера FACS и измеряли интенсивность флуоресценции на устойстве LSRII для 4-цветной FACS. Одноцветную компенсацию получали с помощью набора компенсационных частиц антимышиного Ig (Compensation Particle beads set, BD Biosciences). Анализ проводили с использованием программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism. Связывание BIIB059 с клетками обезьян циномолгус и человеческими клетками было одинаковым при значении EC50 1-2 мкг/мл (7-13 нМ) (фиг. 6).
Пример 12. Оценка самоассоциации BIIB059.
AlphaScreen анализ представляет собой гомогенный тест близости с использованием глутатионовых донорных и акцепторных шариков (Perkin Elmer) для связывания человеческого FcRIIa (CD32a) GST. В эту смесь добавляли различные концентрации антител, предназначенных для тестирования. Поскольку
- 54 034757 связывание антитела с FcRIIa является одновалентным, единственным способом генерирования сигнала является наличие и у донорных и у акцепторных шариков связанного антитела, которое затем ассоциируется, таким образом, что шарики локализуются в пределах 200 нм, тем самым создается возможность продуцировать синглетный кислород и, следовательно, происходит эмиссия света. Уровень эмиссии, обнаруживаемой с помощью оборудования Envision (Perkin Elmer), пропорционален степени самоассоциации.
Фиг. 7 показывает результаты AlphaScreen для BIIB059 по сравнению с 5с8 (отрицательный контроль) и LT105 (положительный контроль с сильной самоассоциацией).
Пример 13. Оценка неспецифичного связывания BIIB059.
Хроматография перекрестного взаимодействия (CIC) представляет собой высокопропускной способ для предварительной оценки липкости кандидатов мАт (Jacobs et al., Pharm Res., 27(1):65-71(2010)). В этом способе массу из человеческих поликлональных IgG химически соединяли с NHS-активированной хроматографической смолой. После этого сравнивали время удерживания BIIB059 на недериватизированной и IgG-дериватизированной колонках с контрольной группой мАт с хорошими показателями и мАт с плохими показателями. С помощью этого способа у BIIB059 не было выявлено каких-либо признаков неспецифичного связывания, что свидетельствует о его низких значениях времени удерживания и K'.
Данные CIC, показывающие растворимость и неспецифичное связывание
Антитело Растворимость Rt-тест Rt-холостая проба К'
5С8 хорошая 9,3 9,46 -0,017
Hu H0/L0 плохая 14,1 10,4 0,356
Li33 плохая 10,8 9,2 0,174
Г ерцептин хорошая 9,5 9,4 0,011
15F3 H4/L1 (1-3) хорошая 9,3 9,2 0,011
24F4 H4/L1 (1-5) хорошая 9,3 9,1 0,022
16А8 хорошая 9,1 9 0,011
<— более высокие показателем <— более низкая растворимость значения К' может быть
Пример 14. Оценка стабильности BIIB059.
Дифференциальную сканирующую флюометрию применяли для тестирования стабильности BIIB059 в диапазоне условий, связанных с буфером для исходной исследовательской композиции. Разворачивание белка контролировали с помощью системы ПЦР в реальном времени Mx3005p (Agilent Technologies) в 96-луночном формате с использованием 10 мкг белка в 50 мкл ФБР (pH 7,0) с добавлением оранжевого флуорофора Sypro в конечной концентрации 10X (исходя из стокового указания 1000X от Invitrogen). Образцы нагревали на 1°С в минуту от 25 до 95°С с измерением интенсивности флуоресценции по три раза на каждый 1°С. Выстраивали диаграмму интенсивности флуоресценции в зависимости от температуры. Из этих кривых получали значение Tm, вводя отрицательное производное (-R'(T) в программу Mx3005p) и выбирая локальные минимумы из диаграмм производных. Использовали базовый буфер 20 мМ цитрата натрия, уровень pH варьировался от 5,0 до 7,5, и концентрации NaCl и сахарозы варьировались от 50 до 250 мМ.
Стабильность была сходной при использовании буфера во всех указанных диапазонах. Фиг. 8 показывает данные при 150 мМ NaCl и 250 мМ сахарозы в зависимости от уровня рН. В качестве исследовательской композиции по сахарозе выбрали 20 мМ цитрата натрия, 150 мМ NaCl, pH 6,0 из-за трудности достижения высокой концентрации сахарозы при использовании исследовательских центрифужных кон центраторов.
Пример 15. Оценка стабильности BIIB059 при встряхивании.
Раствор мАт BIIB059 в объеме 0,2 мл в 1 мг/мл 20 мМ цитрата натрия, pH 6,0, 150 мМ NaCl, подвергали реципрокному встряхиванию при комнатной температуре в 2 мл стеклянных флаконах (Waters, WAT270946C) с использованием титровального планшетного шейкера модели 4626 (Lab-Line Instruments, Titer Plate Shaker) при 600 оборотов в минуту. Аггрегацию оценивали путем мониторинга увели
- 55 034757 чения мутности при 320 нм с использованием спектрофотометра Beckman DU640. Обнаружено, что BIIB059 проявляет аггрегацию в зависимости от времени. Обычно антитела человеческого IgG1 дикого типа не подвержены аггрегации в таких условиях встряхивания. Как показано на фиг. 9, аггрегация полностью подавлялась путем добавления 0,03% Твин 80, обычного наполнителя для композиции. Аггрегация, индуцируемая встряхиванием, иногда может сильно зависеть от уровня pH. A-гликозилированные IgG4/IgG1 показывали более быструю и более обширную аггрегацию, чем BIIB059. Аггрегация aгликозилированных IgG4/IgG1 также подавляется путем добавления Твин 80.
Пример 16. Оценка вязкости BIIB059.
Стабильность и вязкость образцов BIIB059 измеряли при высоких концентрациях 150 мг/мл и больше, чтобы способствовать потенциальной разработке продукта для подкожного введения.
Растворы BIIB059 центрифугировали в пробирках ультраконцентратора для ограничения полученных объемов и концентраций, что определяли УФ-сканированием. Стабильность определяли с помощью эксклюзионной хроматографии после хранения при 2-8°C в течение одной и двух недель. Концентрации белка, превышающие 200 мг/мл, легко достигались при небольших количествах белка в буфере 20 мМ цитрата, pH 6, 150 мМ NaCl, и аггрегация оставалась низкой (0,68%) после двух недель хранения при температуре 2-8°C. Вязкость измеряли с использованием прибора Viscopro2000 (Cambridge Viscosity). Вязкость при 150 мг/мл составляла только 8 сП в цитратно-солевом буфере. Эти результаты показывают, что возможно получение высококонцентрированной композиции BIIB059.
Пример 17. Клонирование гена BDCA2 человека.
Полноразмерную человеческую кДНК BDCA2 (huBDCA2) субклонировали в клонирующий вектор Invitrogen pCR4TOPO от Open Biosystems: эта плазмида имеет обозначение pEAG2367. Секвенирование ДНК подтверждало, что эта кДНК была идентична полноразмерной кДНК BDCA2 человека в референсбанке Genbank под номером доступа NM 130441. Ниже показана полноразмерная открытая рамка считывания HuBDCA2, кодируемая pEAG2420, в которой подчеркнут TM-HMM-предсказанный трансмембранный домен
MVPEEEPQDR EKGLWWFQLK VWSMAWSIL LLSVCFTVSS WPHNFMYSK
TVKRLSKLRE YQQYHPSLTC VMEGKDIEDW SCCPTPWTSF QSSCYFISTG
101 MQSWTKSQKN CSVMGADLW INTREEQDFI IQNLKRNSSY FLGLSDPGGR
151 RHWQWVDQTP YNENVTFWHS GEPNNLDERC AIINFRSSEE WGWNDIHCHV
201 PQKSICKMKK IYI* (SEQ ID N0:1)
Ниже показана полноразмерная открытая рамка считывания HuFccRIy, кодируемая pEAG2413, которая идентична эталонной последовательности под номером в Genbank NP 004097
MIPAWLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV
RKAAITSYEK SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQ* (SEQ ID N0:2)
Вектор экспрессии CHO, коэкспрессирующий кДНК и BDCA2 человека и FccRIy в тандемных транскрипционных единицах, был сконструирован путем субклонирования фрагмента SpeI 2,11 кб из pEAG2413 в линеаризованный фосфатизированный векторный каркас SpeI 6,71 кб из pEAG2420, в результате чего получен унивектор, обозначенный как pEAG2456. Человеческие кДНК BDCA2 и FccRIy в pEAG2420 имели подтвержденные последовательности. Стабильная клеточная линия CHO, стабильно коэкспрессирующая кДНК BDCA2 и FccRIy, была получена путем трансфекции с PEAG2456.
Пример 18. Клонирование гена BDCA2 обезьян циномолгус и резус.
Выведенная открытая рамка считывания BDCA2 обезьян, кодируемая pEAG2384 и одной из форм SNP, выявленной в pEAG2383, показана ниже. Эта форма SNP ниже обозначена как форма E73 SNP из BDCA2 обезьян циномолгус. У резусов выявлена единственная последовательность, идентичная форме E73 SNP из BDCA2 циномолгусов
MVPEEEPQDR EKGVWWFQLK VWSVAWSIL LLCVCFTVSS VASHNFMYSK
TVKRLSKLQE YQQYYPSLTC VMEGKDMEDW SCCPTPWTSF QSSCYFISTV
101 MQSWTKSQNN CSVMGADLW INTKEEQDFI TQNLKINSAY FLGLSDPKGW
151 RHWQWVDQTP YNKNVTFWHS GEPNSPDERC AIINFRSEEW GWNDVHCHVP
201 QKSICKMKKI YI* (SEQ ID N0:72)
Во второй форме SNP из BDCA2 обезьян циномолгус выделенный выше остаток 73 (GAA=Glu, E) представляет собой лизин (AAA=Lys, K). Вторая форма SNP называется формой K73 SNP из BDCA2 обезьян циномолгус. В человеческом BDCA2 остатком 73 является глутаминовая кислота. Ниже представлено содержащее пробелы выравнивание последовательностей BDCA2 человека (показано сверху) и обезьян (показано снизу), которые имеют 90,6% идентичности. Потенциальные N-связанные сайты гликозилирования заштрихованы. В обезьяньем BDCA2 не хватает одного потенциального сайта Nгликозилирования, который присутствует у человека (NSS в 137-139 в человеческих последовательностях по сравнению с NSA обезьян)
- 56 034757
MVPEEEPQDREKGLWWFQLKVWSMAVVSILLLSVCFTVSSWPHNFMYSK 50
ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ-ΙΙΙΙΙΙΙΙΙ'ΙΙΙΙΙΙΙΙ Illlllll lllllll
MVPEEEPQDREKGVWWFQLKVWSVAVVSILLLCVCFTVSSVASHNFMYSK 50
TVKRLSKLREYQQYHPSLTCVMEGKDIEDWSCCPTPWTSFQSSCYFISTG 100
I 111111 I1111 1: 11 11 11111 ll-lllllll 111111 1111 I 1111
TVKRLSKLQEYQQYYPSLTCVMEGKDMEDWSCCPTPWTSFQSSCYFISTV 100
101 MQSWTKSQKNCaVMGADLWINTREEQDFIIQNLKRiWSYFLGLSDPGGR 150
I 111111 I 1111 11 11 11 1111:111111 Illi II -1 1111 I 11 I
101 MQSWTKSQNRQSVMGADLVVINTKEEQDFITQNLKINSAYFLGLSDPKGW 150
151 RHWQWVDQTPYNEOiFWHSGEPNNLDERCAIINFRSSEEWGWNDIHCHV 20 0
151 RHWQWVDQTPYNKe|FWHSGEPNSPDERCAIINFR. SEE77GWNDVHCHV 199
201 PQKSICKMKKIYI* 214 (SEQ ID N0:1) lllllll ИНН I
200 PQKSICKMKKIYI* 213 (SEQ ID N0:72)
Ниже показана консенсусная открытая рамка считывания FceRIy обезьян циномолгус
MIPAWLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV
RKAAIASYEK SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQ (SEQ ID N0:73)
Последовательность кДНК FceRIy обезьян циномолгус идеально совпадает с предсказанной последовательностью кДНК резусов (исходя из короткого считывания генома), описанной в GenBank, номер доступа XM 001115585, и последовательностью обезьян циномолгус, депонированной учеными Genentech в GenBank, номер AF485816. Последовательность белка FceRIy обезьян циномолгус имеет 98,9% идентичности с человеческим белком FceRIy, И отличается только единственной консервативной заменой. Ниже представлено выравнивание между человеческой (сверху) и последовательностью обезьян циномолгус (снизу) FceRIy
MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV 50
IIIlllllllllllllllllll II 11 11 11 11111111 11111111111 I
MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV 50
RKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ* 87 (SEQ ID N0:2)
III II Hill lllllllllll II II II II lllllll
RKAAIASYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ* 87 (SEQ ID N0:73)
Вектор экспрессии CHO, коэкспрессирующий кДНК формы E73 SNP из BDCA2 обезьян циномолгус и кДНК FceRIy в тандемных транскрипционных единицах, был сконструирован путем суб клонирования фрагмента SpeI 2,11 кб из pCN652 в линеаризованный фосфатизированный векторный каркас SpeI 6,72 кб из pCN654, в результате чего получен унивектор, обозначенный как pEAG2668. кДНК BDCA2 и FceRIy обезьян циномолгус в pEAG2668 имели нодтвержденные последовательности. Стабильная клеточная линия CHO, стабильно коэкспрессирующая кДНК BDCA2 и FceRIy, была получена путем трансфекции с pEAG2668.
Пример 19. Перекрестная реактивность между BDCA2 человека и обезьян циномолгус.
Чтобы определить, имеет ли E73/K73 SNP BDCA2 обезьян циномолгус влияние на анти-BDCA2 связывание, клетки 293E котрансфицировали векторами экспрессии, несущими репортер усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) (pEAG1458) и кДНК BDCA2 и FceRIy (человеческие BDCA2: pEAG2420 и FceRIy: pEAG2413; E73 BDCA2 обезьян циномолгус: pCN652 или K73 BDCA2: pCN656 и FceRIy циномолгус: pCN652) в молярных соотношениях 1:1:1. Через 3 дня после трансфекции клетки собирали и окрашивали PE-конъюгированным анти-BDCA2 человека Miltenyi AC144 мАт (Miltenyi Biotec, номер в каталоге 130-090-511) с помощью прямого связывания с титрованием и разведением FACS, со стробированием на зеленые EGFP-положительные клетки. На фиг. 10 показано прямое связывание AC144 с поверхностными BDCA2 человека и обезьян циномолгус.
Кажущиеся значения EC50 являются, по существу, эквивалентными для человеческих BDCA2 и обеих форм E73 и K73 SNP из BDCA2 обезьян циномолгус. Учитывая этот результат, были получены стабильные трансфектанты CHO для поверхностного полноразмерного BDCA2 с использованием вектора экспрессии pEAG2456 BDCA2 человека/FceRIy и вектора экспрессии pEAG2668 из E73 SNP BDCA2/ FceRIy обезьян циномолгус. Эти линии были использованы для сортировки перекрестно-реактивных антител против BDCA2 человека/обезьян циномолгус.
Пример 20. Слитые Fc конструкции эктодоменов BDCA2 человека и обезьян циномолгус.
Были разработаны пять слитых Fc конструкций человеческих и циномолгусных BDCA2 ECD. В трех из этих конструкций BDCA2 был присоединен посредством линкерной последовательности G4S к C-концу шарнирной и Fc-области человеческого IgG1. В двух из этих конструкций линкер G4S был заменен на сайт расщепления TEV протеазой ENLYFQC.
BDCA2 представляет собой мембранный белок типа II (C-конец находится за пределами клетки),
- 57 034757 конструирование растворимых слитых белков Fc включает добавление C-концевого эктодомена BDCA2 (остатки 45-213 для BDCA2 человека) к C-концу сконструированных Fc из IgG, при этом секреция запускалась мышиной внутри-рамочной сигнальной каппа последовательностью легкой цепи. Конструкцию pEAG2367 полноразмерного huBDCA2 использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами 5' CAG TGT CTG TTT CAC TCC CGG GGG TGG CGG TGG TAG CAA TTT TAT GTA TAG C 3' (SEQ ID NO: 74) (для добавления 5' Xmal (Pro-Gly) и немедленно-ранним линкером Gly4Ser перед 5'-концом эктодомена huBDCA2), и 5' CCA GGG AGA ATA GGA TCC TTA TAT GTA GAT CTT 3' (SEQ ID NO: 75) (для добавления сайта 3' BamHI сразу после терминаторной huBDCA2). ПЦР-продукт 0,56 кб очищали и субклонировали в клонирующий вектор pCRBluntllTOPO Invitrogen, получая pEAG2417, в котором вставленная кДНК последовательность была подтверждена. Фрагмент 0,53 кб Xmal-BamHI из pEAG2417 и фрагмент 0,75 кб Notl-Xmal из pEAG1397 (несущий сконструированные hulgG1 Fc, секреция которых запускалась внутри-рамочной сконструированной мышиной сигнальной каппа последовательностью легкой цепи) лигировали с каркасными векторными фрагментами 1,89 кб BamHI-Xbal и 4,17 кб Xbal-Notl из вектора экспрессии pV90, с получением вектора экспрессии pEAG2421 слитого белка hulgGI FchuBDCA2, в котором вставленная кДНК последовательность была подтверждена. Выведенная открытая рамка считывания, кодируемая pEAG2421, показана ниже
MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PKSSDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK
PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
101 NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
151 QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
201 VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG
251 GGGGSNFMYS KTVKRLSKLR EYQQYHPSLT CVMEGKDIED WSCCPTPWTS
301 FQSSCYFIST GMQSWTKSQK NCSVMGADLV VINTREEQDF IIQNLKRNSS
351 YFLGLSDPGG RRHWQWVDQT PYNENVTFWH SGEPNNLDER CAIINFRSSE
401 EWGWNDIHCH VPQKSICKMK KIYI*(SEQ ID N0:76)
Сигнальная последовательность легкой цепи каппа: остатки 1-19, показаны выше (курсивом); человеческая Fc IgG1: остатки 20-250, см. выше;
G4S линкер: остатки 251-255, см. выше (выделено жирным шрифтом);
эктодомен huBDCA2: остатки 256-424, см. выше (подчеркнуто).
Для конструирования вектора экспрессии для слитого белка muIgG2a Fc-huBDCA2, фрагмент 0,53 кб Xmal-BamHI из pEAG2417 и фрагмент 0,75 кб Notl-Xmal из pEAG1442 (несущий сконструированные мышиные IgG2a Fc, секреция которых запускается внутрирамочными сконструированными мышиными сигнальными каппа последовательностями легкой цепи) лигировали с векторными каркасными фрагментами 1,89 кб BamHI-Xbal и 4,17 кб Xbal-Notl из вектора экспрессии pV90, с получением pEAG2423, для которого вставленная кДНК последовательность была подтверждена. Выведенная открытая рамка считывания, кодируемая pEAG242 3, показана ниже
MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PRGPTIKPSP PCKCPAPNLL GGPSVFIFPP
KIKDVLMISL SPIVTCVWD VSEDDPDVQI SWFVNNVEVH TAQTQTHRED
101 YNSTLRWSA LPIQHQDWMS GKEFKCKVNN KDLPAPIERT ISKPKGSVRA
151 PQVYVLPPPE EEMTKKQVTL TCMVTDFMPE DIYVEWTNNG KTELNYKNTE
201 PVLDSDGSYF MYSKLRVEKK NWVERNSYSC SWHEGLHNH HTTKSFSRTP
251 GGGGGSNFMY SKTVKRLSKL REYQQYHPSL TCVMEGKDIE DWSCCPTPWT
301 SFQSSCYFIS TGMQSWTKSQ KNCSVMGADL WINTREEQD FIIQNLKRNS
351 SYFLGLSDPG GRRHWQWVDQ TPYNENVTFW HSGEPNNLDE RCAIINFRSS
401 EEWGWNDIHC HVPQKSICKM KKIYI* (SEQ ID N0:77)
Сигнальная последовательность легкой цепи каппа: остатки 1-19, показаны выше (курсивом); мышиная Fc IgG1: остатки 20-251, см. выше;
G4S линкер: остатки 252-256, см. выше (выделено жирным шрифтом);
эктодомен huBDCA2: остатки 257-425, см. выше (подчеркнуто).
Стабильные клеточные линии CHO, продуцирующие слитые белки Fc-huBDCA2, получали путем трансфекции с векторами экспрессии pEAG2421 и pEAG2423. Эти слитые белки использовали в анализах связывания ELISA и OCTET для сортировки антител при скрининге кандидатов.
Для конструирования BDCA2 обезьян циномолгус (cyno-BDCA2) в целях получения слитого белка Fc, полноразмерные E73 SNP варианты из cyno-BDCA2 в конструкции pCN648 подвергали сайтнаправленному мутагенезу с праймерами 5' CTC TGT GTC TGT ТТС ACT CCC GGG GGT GGC GGT GGT AGC AAT TTT ATG TAT AGC 3' (SEQ ID NO: 78) и его обратным комплементом, для добавления
- 58 034757 линкера 5' Xmal (Pro-Gly) и Gly4Ser непосредственно перед 5'-концом эктодомена huBDCA2, с получением конструкции pEAG2675, для которой вставленная кДНК последовательность была подтверждена. Для конструирования вектора экспрессии для слитого белка muIgG2a Fc-cyno BDCA2, фрагмент 0,53 кб Xmal-BamHI из pEAG2675 и фрагмент 0,75 кб Notl-Xmal из pEAG1442 (несущий сконструированные мышиные IgG2a Fc, секреция которых запускается внутрирамочными сконструированными мышиными сигнальными каппа последовательностями легкой цепи) лигировали с векторными каркасными фрагментами 1,89 кб BamHI-XbaI и 4,17 кб Xbal-Notl из вектора экспрессии pV90, с получением pEAG2677, для которого вставленная кДНК последовательность была подтверждена. Выведенная открытая рамка считывания, кодируемая pEAG2677, показана ниже
1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PRGPTIKPSP PCKCPAPNLL GGPSVFIFPP
51 KIKDVLMISL SPIVTCVWD VSEDDPDVQI SWFVNNVEVH TAQTQTHRED
101 YNSTLRWSA LPIQHQDWMS GKEFKCKVNN KDLPAPIERT ISKPKGSVRA
151 PQVYVLPPPE EEMTKKQVTL TCMVTDFMPE DIYVEWTNNG KTELNYKNTE
201 PVLDSDGSYF MYSKLRVEKK NWVERNSYSC SWHEGLHNH HTTKSFSRTP
251 GGGGGSNFMY SKTVKRLSKL· OEYOOYYPSL TCVMEGKDME DWSCCPTPWT
301 SFQSSCYFIS tvmoswtkso NNCSVMGADL WINTKEEQD FITONLKINS
351 AYFLGLSDPK GWRHWQWVDQ TPYNKNVTFW HSGEPNSPDE RCAIINFRSE
401 EWGWNDVHCH VPQKSICKMK KIYI* (SEQ ID N0:79)
Сигнальная последовательность легкой цепи каппа: остатки 1-19, показаны выше (курсивом); мышиная Fc IgG2: остатки 20-251, см. выше;
G4S линкер: остатки 252-256, см. выше (выделено жирным шрифтом); эктодомен cynoBDCA2: остатки 257-425, см. выше (подчеркнуто).
Стабильная клеточная линия CHO, продуцирующая слитый белок Fc-cynoBDCA2, была получена путем трансфекции с вектором экспрессии pEAG2677.
Слитые белки muIgG2a FC-BDCA2 подвергались ограниченному протеолизу для выделения мономерных белков эктодомена BDCA2. Для более легкого выделения рекомбинантного растворимого эктодомена BDCA2 были сконструированы новые гибридные конструкции Fc, в которые был вставлен сайт расщепления протеазой TEV между C-концом Fc и N-концом эктодомена BDCA2. Были созданы сингены, несущие эктодомены BDCA2 человека или обезьян циномолгус, с сайтом 5' XmaI (Pro-Gly) для слияния с C-концом Fc, с последующим внутрирамочным сайтом TEV расщепления (ENLYFQG), слитым с остатком 45 из последовательности BDCA2, и с 3' сайтом BamHI после терминатора BDCA2, и эти сингены были получены от GeneWiz в виде вставки Xmal-BamHI в их собственный pUC57-амп. клонирующий вектор. Были подтверждены последовательности вставок в созданных конструкциях кДНК XmalBamHI TEV-BDCA2 эктодомена, pEAG2917 (человеческой) и pEAG2918 (обезьян циномолгус). Для конструирования экспрессирующих векторов CHO на основе pV90-IRES-dhfr для слитых белков Fc-hulgGlTEV-BDCA2, фрагмент 0,75 кб Notl-Xmal из pEAG1397 и фрагменты 0,54 кб Xmal-BamHI из pEAG2917 или из pEAG2918 субклонировали в векторный каркасный фрагмент 5,4 кб Bglll-Notl из pXJC194, с получением pEAG2937 (Fc-huBDCA2) или pEAG2938 (Fc-обезьян циномолгус BDCA2). Вставленные последовательности кДНК в pEAG2937 и pEAG2938 были подтверждены. Стабильные клеточные линии CHO были получены путем трансфекции с pEAG2937 и pEAG2938. Выведенная открытая рамка считывания слитого белка huFc-TEV-huBDCA2, кодируемого pEAG2937, показана ниже
1 MKLPVRLLVL MFWLPASSSP PKSSDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK
51 PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
101 NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
151 QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
201 VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG
251 ENLYFOGNFM YSKTVKRLSK LREYOOYHPS LTCVMEGKDI EDWSCCPTPW
301 TSFQSSCYFI STGMOSWTKS OKNCSVMGAD LWINTREEO DFIIONLKRN
351 SSYFLGLSDP GGRRHWOWVD QTPYNENVTF WHSGEPNNLD ERCAIINFRS
401 SEEWGWNDIH CHVPQKSICK MKKIYI* (SEQ ID N0:80)
Сигнальная последовательность легкой цепи каппа: остатки 1-19, показаны выше (курсивом); человеческая Fc IgG1: остатки 20-250, см. выше;
сайт расщепления TEV: остатки 251-257, см. выше (выделено жирным шрифтом); эктодомен huBDCA2: остатки 258-426, см. выше (подчеркнуто).
Выведенная открытая рамка считывания гибридного белка huFc-TEV-cyno BDCA2, кодируемого pEAG2938, показана ниже
- 59 034757
1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PKSSDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK
51 PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
101 NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
151 QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
201 VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG
251 ENLYFOGNFM YSKTVKRLSK LQEYOOYYPS LTCVMEGKDM EDWSCCPTPW
301 TSFQSSCYFI STVMOSWTKS ONNCSVMGAD LVVINTKEEO DFITONLKIN
351 SAYFLGLSDP KGWRHWQWVD OTPYNKNVTF WHSGEPNSPD ERCAIINFRS
401 EEWGWNDVHC HVPQKSICKM KKIYI* (SEC ) ID N0:81)
Сигнальная последовательность легкой цепи каппа: остатки 1-19, показаны выше (курсивом); человеческая Fc IgG1: остатки 20-250, см. выше;
сайт расщепления TEV: остатки 251-257, см. выше (выделено жирным шрифтом); эктодомен huBDCA2: остатки 258-425, см. выше (подчеркнуто).
Пример 21. Связывание BIIB059 со слитыми белками BDCA2-FC.
Способность BIIB059 связываться с huBDCA2-Fc в растворе оценивали с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) (фиг. 11). При раздельном анализе BIIB059 (верхнее изображение) и huBDCA2 (среднее изображение) элюировали в виде отдельных острых пиков с молекулярными массами примерно 150 кДа. При анализе смеси BIIB059 и huBDCA2-Fc (нижнее изображение) наблюдается смещение молекулярных масс BIIB059 и huBDCA2-Fc в сторону увеличения больше 550 кДа, что подтверждается их элюированием на более ранних положениях на хроматограмме. Гетерогенность пиков элюирования предположительно вызвана тем фактом, что каждый из BIIIB059 и BDCA2-FC содержит 2 сайта связывания и, следовательно, образуется большое количество комплексов BIIB059 и BDCA2 с различными параметрами стехиометрии.
Связывание cynoBDCA2 ECD с BIIB059 также оценивали в анализе SEC, и это связывание также вызывало количественный сдвиг к комплексам с более высокой молекулярной массой.
Пример 22. Кальций усиливает связывание BIIB059 с BDCA2.
Было исследовано связывание BIIB059 с BDCA2 человека, слитым с мышиной Fc (huBDCA2-muFc) в присутствии кальция или ЭДТА в анализе связывания OCTET. Белок huBDCA2-muFc захватывался на биосенсоре с анти-мышиным Fc с последующей ассоциацией BIIB059 и стадией диссоциации. Все стадии проходили в 50 мМ HEPES, pH 7, 100 мМ NaCl, 1 мг/мл БСА, 0,02% Твин 20 и 0,001% азида, содержащей или 10 мМ CaCl2 или 10 мМ ЭДТА.
Фиг. 12 показывает, что BIIB059 связывание усиливается путем добавления кальция по отношению к ЭДТА, что приводит к получению сигнала, который примерно в 2 раза выше. Кальций оказывал эффект и на скорость ассоциации и на скорость диссоциации.
Пример 23. Измерение связывания.
Анализ OCTET применяли для мониторинга связывания BIIB059 со слитым белком FC-BDCA2 и BDCA2 ECD. Фиг. 13 показывает OCTET-эксперимент, в котором BIIB059 помещали на наконечники OCTET с античеловеческими Fc в концентрации 20 мкг/мл. Для стадии ассоциации BDCA2 ECD человека и обезьян циномолгус добавляли в концентрации 2 мкг/мл. Для этого эксперимента использовали буфер 50 мМ HEPES, pH 7, 100 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, 1 мг/мл БСА, 0,02% Твин-20 и 0,001% азида. В этих условиях связывание BIIB059 с BDCA2 ECD человека и обезьян циномолгус было сопоставимым.
Пример 24. Анализ PBMC для определения значения IC50 для BIIB059 при ингибировании TLR9 индуцированной продукции ИФНц.
Было показано, что лигирование BDCA2 активирует BCR-подобный сигнальный каскад, который мощно подавляет способность клеток pDC продуцировать интерфероны I типа и другие цитокины в ответ на TLR лиганды (Cao W. et al., PLoS Biol., 5 (10):e248 (2007)). Ингибирование TLR9-индуцированной продукции ИФНа посредством РВМС использовали в качестве первичного клеточного анализа для скрининга.
Клетки РВМС из гепаринизированной венозной крови здоровых доноров выделяли центрифугированием с прерывистым градиентом над Фиколлом, промывали в ФБР и ресуспендировали в полной культуральной среде (RPMI с 3% FBS). Высевали 1*106 клеток на лунку и стимулировали 10 мкг/мл TLR9лиганда (CpG-A ODN 2216) в присутствии доз BIIB059 и 24F4A-Agly (Fc-урезанная версия BIIB059), или контрольного изотипа мАт в диапазоне от 10 мкг/мл до 1 мкг/мл в общем анализируемом объеме 200 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение ночи (18 ч) при 37°C, затем собирали супернатанты для оценки в анализе ИФНа ELISA (PBL InterferonSource). Анализы проводили в соответствии с протоколом производителя. Анализировали титрование BIIB059 и 24F4A agly для определения IC50 при ингибировании TLR9-индуцированной продукции ИФНа. В общей сложности в двенадцати независимых экспериментах были получены средние значения IC50 0,001 мкг/мл для BIIB059. A-гликозилированное мАт обладало меньшей мощностью, со средним IC50 0,007 мкг/мл (фиг. 14).
Также исследовали способность анти-BDCA2 мАт ингибировать продукцию ИФНа после стимуля
- 60 034757 ции физиологически соответствующим лигандом, а именно, сывороткой от пациентов с СКВ. Считается, что СКВ-сыворотка индуцирует ИФН I типа посредством комплексов анти-ДНК аутоантител и иммуностимулирующих гипометилированных ДНК, которые стимулируют TLR9. Клетки PBMC стимулировали сывороткой больного СКВ (предоставленной Dr. Gregg Silverman, NYU) и использовали в конечном разведении 1/5. Антитело 24F4S H4/L1C95S, которое отличается от BIIB059 одним аминокислотным остатком, полностью устраняет продукцию ИФНц из клеток pDC, стимулированных сывороткой СКВ (фиг. 18).
Пример 25. TLR9-индуцированная продукция ИФНц в цельной крови.
Активность BIIB059 также оценивали в анализе цельной крови по TLR9-индуцированной продукции ИФНа.
Цельную кровь брали из гепаринизированной венозной крови здоровых доноров. Дозы BIIB059 и 24F4A-agly варьировались от 10 до 1 мкг/мл в общем анализируемом объеме 200 мкл на лунку. Добавляли CpG-A в количестве 200 мкг/мл, которое было определено как оптимальное для стимуляции продукции ИФНа в цельной крови. Планшеты инкубировали в течение 18 ч при 37°C, затем собирали супернатанты для использования в анализах ELISA ИФНа (PBL InterferonSource). Анализы проводили в соответствии с протоколом производителя. На фиг. 15A показан репрезентативный эксперимент из 6 выполненных независимых экспериментов. Ингибирующий потенциал BIIB059 в анализе TLR9-индуцированной продукции ИФНа в цельной крови был аналогичен активностью, выявленной в анализах PBMC. В дополнение к ингибированию цитокинов, продуцируемых pDC (ИФНа, ИЛ-6), обработка с помощью BIIB059 также приводила к ингибированию большого массива цитокинов и хемокинов (фиг. 15C).
Следующий эксперимент проводили для определения возможности BIIB059 ингибировать TLR9индуцированную продукцию ИФНа в цельной крови от больных СКВ аналогично тесту на здоровых добровольцах. С этой целью цельную кровь от 2 больных СКВ или от 2 здоровых доноров стимулировали 200 мкг/мл CpGA в присутствии 10 мкг/мл BIIB059, после чего оценивали продукцию ИФНа с помощью ELISA. В частности, цельная кровь от 2 больных СКВ или от 2 здоровых доноров была предоставлена Bioreclamation LLC с доставкой течение ночи. После получения кровь обрабатывали 10 мкг/мл BIIB059 или контрольным изотипом, стимулировали 200 мкг/мл CpG-A и высевали в 96-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 18 ч при 37°C и собирали супернатанты для использования в анализах ELISA ИФНа (PBL InterferonSource). Анализы проводили в соответствии с протоколом производителя.
Как показано на фиг. 15B, BIIB059 показывает одинаковую эффективность в цельной крови от больных СКВ по сравнению тестом на здоровых добровольцах.
Пример 26. Оценка BIIB059-опосредованного ингибирования интерферонов I типа.
Ингибирующее действие BIIB059 также подтверждали с помощью очищенных клеток pDC, стимулированных или синтетическими агонистами TLR (CPG-A), или более физиологичным стимулом (СКВсыворотка). Также определяли ингибирующий эффект перекрестного связывания BDCA2 на другие цитокины (ИЛ-6), продуцируемые клетками pDC. Активность BIIB059 подтверждали с помощью различных подходов, таких как качественная полимеразная цепная реакция и ELISA.
a) Q-ПЦР.
В организме человека существует тринадцать подтипов ИФНа и единственный член ИФН[4 Стимуляция агонистами TLR9 вызывает усиление активности большинства интерферонов типа I (Ito T. et al., Blood, 107 (6): 2423-31 (2006)). Ингибирование генов отдельного ИФН I типа оценивали с помощью анализов качественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).
Клетки pDC очищали с использованием технологии двухэтапного разделения магнитными шариками (набор MACS, Miltenyi Biotec). Клетки pDC в количестве 5*104 на лунку стимулировали 5 мкМ CpGA в отсутствие BIIB059 или в присутствии BIIB059 в возрастающих концентрациях, или 10 мкг/мл контрольного изотипа. Общий анализируемый объем составлял 200 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение 18 ч при 37°C, затем РНК экстрагировали из клеток с использованием ресредства Тризол (корпорация Invitrogen) и дополнительно очищали с помощью колонки RNeasy Mini (Qiagen Sciences). Все праймеры и зонды были приобретены в компании Applied Biosystems Inc. Относительное количество транскриптов определяли для каждого образца путем сравнения со стандартной кривой олигонуклеотидов с использованием программного обеспечения детекции последовательностей (Sequence Detection Software, Applied Biosystems Inc.) и стандартизировали по контролю (GAPDH).
Обработка с помощью BIIB059 ингибировала транскрипцию всех тестируемых интерферонов I типа, таким образом, были воспроизведены предыдущие данные с использованием клона AC144 антитела против BDCA2 (Cao W. et al., PLoS Biol, 5(10):e248 (2007)).
b) ELISA.
Эффект BIIB059 на ингибирование цитокинов посредством pDC проверяли на белковом уровне с помощью ELISA. Клетки pDC в количестве 5*104 на лунку стимулировали 5 мкМ CpG-A в отсутствие BIIB059 или в присутствии BIIB059 в возрастающих концентрациях, или 10 мкг/мл контрольного изотипа. На фиг. 17 показано количество секретируемого ИФНа и ИЛ-6, измеренное у репрезентативного донора из трех тестируемых здоровых доноров.
Лигирование BDCA2 с BIIB059 мощно индуцирует продукцию ИФНа и значительно снижает про- 61 034757 дукцию ИЛ-6, индуцированную стимуляцией CpG-A.
Пример 27. BIIB059-опосредованная интернализация рецепторов.
Было показано, что лигирование BDCA2 с анти-BDCA2 мАт (клон AC144, Miltenyi) быстро индуцирует интернализацию рецепторов (Dzionek A. et al., J. Immunol., 165(11):6037-46 (2000)). Следующий эксперимент был направлен на определение кинетики BIIB059-опосредованной интернализации BDCA2.
Человеческую цельную кровь обрабатывали BIIB059 в концентрации 10, 1, 0,1 или 0,01 мкг/мл или контрольным изотипом (10 мкг/мл) при 37°C в течение указанного времени, а затем инкубировали в течение 30 мин при 4°C с FITC-меченным не-перекрестным блокирующим анти-BDCA2 мАт (клон 2D6), анти-HLADR, анти-CD123, анти-ОЭ14 и анти-CD20. Эритроциты лизировали буфером IX Easy-lyse (BD Bioscience) и оставшиеся клетки фиксировали. На фиг. 19A показаны значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) при 2D6-FITC окрашивании клеток pDC CD14-CD20-HLA-DR+CD123+, дающих сигнал выше порогового значения. FMO (контрольная флуоресценция минус один) состояла из коктейля FACS окрашивания минус 2D6-FITC. Данные на этой фигуре отражают репрезентативный эксперимент из 3 выполненных независимых экспериментов.
Как показано на фиг. 19A, при инкубации с BIIB059 1 мкг/мл, интенсивность FITC-меченого 2D6окрашивания быстро снижалась, достигая исходного уровня в течение одного часа инкубации при 37°C. Десятикратное снижение концентрации BIIB059 (0,1 мкг/мл) влияло на кинетику эндоцитоза, задерживая его на 2 ч. Это показывает, что интернализация BDCA2 при связывании с BIIB059 проходит с дозозависимой кинетикой.
Следующий эксперимент проводили для определения возможного влияния BIIB059опосредованной интернализации рецептора на ингибирование ИФН. Цельную кровь собирали из гепаринизированной венозной крови здоровых доноров и предварительно инкубировали с BIIB059 (для осуществления интернализации рецепторов) или с изотипом в течение указанного времени. В каждой точке времени после предварительной инкубации проводили провокацию клеток введением 200 мкг/мл CPGA, и инкубировали в течение дополнительных 18 ч при 37°C. Супернатанты собирали для использования в анализах ИФНи ELISA (PBL InterferonSource). Анализы проводили в соответствии с протоколом производителя.
Фиг. 19B показывает репрезентативный эксперимент из 3 выполненных независимых экспериментов. Как показано на фиг. 19B, через 9 ч предварительная инкубация с BIIB059 перед стимуляцией - в соответствии с максимальной интернализацией - не влияет на ингибирование ИФН, и предполагается наличие потенциальной связи между эндоцитозом BDCA2 и ингибированием TLR9. Для проверки этой гипотезы были использованы анти-BDCA2 моноклональные антитела, которые не могли опосредовать ингибирование ИФН и продемонстрировали отсутствие интернализации. Дополнительно, авторы показали, что бивалентное связывание было необходимо для анти-BDCA2-опосредованного ингибирования ИФН. Фактически, Fab-фрагмент не вызывал интернализацию или ингибирование ИФН. Полученные данные в совокупности указывают на возможность того, что для BDCA2-опосредованного ингибирования TLR9 необходим эндоцитоз и локализация в эндосомальных компартментах, содержащих TLR9. Эту гипотезу можно проверить с помощью живой визуализации для отслеживания интернализации BDCA2 и перемещения в клетку после лигирования BIIB059.
Пример 28. Эффекторная функция антитела.
Домен Fc BIIB059 является полностью гликозилированным человеческим IgG1 и компетентным для связывания и с клеточными рецепторами Fcy и с комплементом, и для индукции клеточных ответов эффекторных иммунных клеток, как посредством антиген-зависимой цитотоксичности (ADCC), так и комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Для того чтобы подтвердить связывание BIIB059 с Fcрецепторами, проводили измерение относительных показателей аффинности связывания с использованием гомогенного анализа с усиленной люминесцентной близостью (ALPHA) по методике Perkin Elmer (фиг. 20). Анализ проводили в конкурентном формате, при котором серийные разведения тестовых антител инкубировали со слитыми белками рецептор-GST и анти-GST акцепторными шарикам в течение ночи при 4°C в 96-луночном планшете. Стрептавидиновые донорные шарики и биотинилированный IgG1 дикого типа также инкубировали в течение ночи при 4°C в отдельной пробирке и затем на следующий день добавляли в планшет для анализа. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч при осторожном встряхивании, затем считывали в ридере Envision (Perkin Elmer). Чтобы определить относительные значения аффинности связывания, полученные данные наносили на 4-параметрическую кривую аппроксимации, используя программное обеспечение GraphPad Prism для вычисления значений IC50. Были рассчитаны IC50 значения для BIIB059 FcyR1: 0,03 мкг/мл, FcyR11a: 11 мкг/мл, FcyR11b: 17 мкг/мл и FcyR111a: 3 мкг/мл. Эти значения сопоставимы со значениями, которые выявлены и для других человеческих IgG1 антител в этом тесте. Были также определены значения IC50 для версии 24F4 с низкой эффекторной функцией G4P/G1 agly, используемой в исследованиях с обезьянами циномолгус. Как и предполагалось, не было обнаружено связывание с FcyR11a, FcyR11b и FcyR111a, а связывание с FcyR1 было снижено в 100 раз. Антитело 5c8 в каркасах IgG1 дикого типа и G4P/G1 agly было включено в анализы в целях сравнения.
Пример 29. Фиксация комплемента.
- 62 034757
Было показано, что покрытие антителами мишеней опосредует мощные механизмы уничтожения посредством ADCC или CDC. Эти эффекторные функции антител опосредуются Fc-областью антитела.
Этот эксперимент был направлен на определение способности BIIB059 к рекрутингу комплемента путем тестирования его связывание с C1q способом ELISA.
Анализ связывания с C1q проводили в 96-луночном планшете ELISA с использованием планшетов Maxisorb ELISA. Тестируемые антитела наносили сериями в 3-кратном разведении в ФБР, начиная с 15 мкг/мл, выдерживали в течение ночи при 2-8°C, затем лунки промывали ФБР, 0,05% Твин 20 и блокировали 200 мкл 0,1М фосфата натрия, pH 7,2, 0,1М NaCl, 0,1% желатина, 0,05% Твин 20. Затем добавляли 50 мкл на лунку 2 мкг/мл человеческого C1q от Complement Technology (A099), разведенного в блокирующем/разбавляющем буфере, и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После аспирации и промывки, как описано выше, добавляли 50 мкл на лунку куриного IgY против человеческого C1q (коммерческая продукция Aves Labs, Inc., с использованием человеческого C1q, C0660 от Sigma), разведенного в 8000 раз в блокирующем/разбавляющем буфере. После инкубации в течение 1,5 ч при комнатной температуре лунки аспирировали и промывали, как описано выше. Ослиный F(ab')2 антикуриный IgY конъюгат пероксидазы хрена (Jackson ImmunoResearch 703-030-155) разбавляли до 5000 раз в блокирующем/разбляющем буфере, после чего добавляли в концентрации 50 мкл на лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После аспирации и промывки, как описано выше, добавляли 100 мкл субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) (420 мкМ ТМБ, 0,004% H2O2 в 0,1М буфере ацетат натрия/лимонная кислота, pH 4,9) и инкубировали в течение 2 мин до прекращения реакции путем добавления 100 мкл 2н. серной кислоты. Оптическую плотность считывали при 450 нм на оборудовании PRO SoftMax и использовали программное обеспечение SoftMax для определения относительной аффинности связывания (C-значение) с подбором 4 параметров.
Фиг. 21 показывает, что хотя BIIB059 способны связываться C1q, 24F4A IgG4.P/IgG1 agly, по существу, лишены связывания с C1q.
Пример 30. Исследование истощения клеток.
BIIB059 мощно подавляет продукцию ИФН I типа и ИЛ-6 после лигирования с BDCA2. В дополнение к агонистическому действию, были проведены следующие эксперименты для оценки возможности BIIB059 истощать клетки pDC, несущие BDCA2, посредством своей функциональной Fc-области. Для исследования цитотоксического потенциала BIIB059 была протестирована его активность в анализах ADCC и CDC.
a) Анализ ADCC.
ADCC представляет собой механизм, посредством которого эффекторные клетки иммунной системы активно лизируют клетки-мишени, к поверхностным рецепторам которых были присоединены антитела (фиг. 22).
В качестве мишени использовали клеточную линию CHO (клон 34.16.7 EAG2456 T1F2). Уровень экспрессии BDCA2 на поверхности клеток CHO определяли с помощью FACS с использованием APCмеченых анти-BDCA2 мАт (клон AC144, Miltenyi). Клетки НК были использованы в качестве эффекторных клеток, которые были выделены из цельной крови с помощью негативной селекции с использованием обогащенного коктейля человеческих НК-клеток RosetteSep™ (Human NK Cell Enrichment Cocktail (Stem Cells Technologies)). После 20-минутной инкубации с этим коктейлем при комнатной температуре НК-клетки выделяли центрифугированием в прерывистом градиенте над Фиколлом. Клетки CHO и человеческие НК-клетки высевали в соотношении 5:1 (НК:CHO) в присутствии эффекторных компетентных анти-BDCA2 моноклональных антител (24F4S и BIIB059), Fc-урезанных мАт (24F4S-Agly и 24F4A-Agly) или контрольного изотипа IgG1, и инкубировали в течение 4 ч при 37°C. Отрицательный контроль состоял из лунок, содержащих клетки CHO и НК без антител. Клетки НК и клетки CHO, лизированные с Tx-100, использовали для определения максимального уничтожения. ADCC оценивали с использованием набора для анализа цитотоксичности Vybrant (Invitrogen), следуя инструкциям производителя. В анализе были обнаружены Г-6-ФД из поврежденных клеток, на основании Г -6-ФД-зависимой редукции резазурина, который излучает флуоресценцию при 590 нм при возбуждении при 530 нм. Анализ ADCC, показанный на фиг. 22, часть А, проводили с использованием клеток CHO с высокой экспрессией BDCA2 (часть C) и в анализе ADCC согласно фиг. 22, часть В использовали клетки CHO с более низкой экспрессией BDCA2 (часть D).
24F4S вызывали 100% гибель клеток CHO, несущих BDCA2, подобно лизированию тритоном X. Как и предполагалось, a-гликозилированная версия мАт (24F4S-agly) не вызывает ADCC (фиг. 22A). При сравнении с 24F4S, BIIB059 обладает идентичной активностью ADCC (фиг. 22B). Следует отметить, что эффективность уничтожения коррелирует с уровнем экспрессии BDCA2 на клетках CHO (фиг. 22C и 22D).
b) Анализ CDC.
При комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) C1q связывается с антителом, запуская каскад комплемента и вызывает лизис клеток (фиг. 23). Как показано в разделе примера 29, BIIB059 может эффективно связываться с компонентом комплемента C1q. Этот эксперимент проводили для подтверждения возможности BIIB059 опосредовать CDC.
Стабильно трансфицированные клетки CHO-BDCA2/FceRIy (клон 34.16.7 EAG2456 T1F2) высевали
- 63 034757 в количестве 5 104 клеток в 96-луночные коллагеновые черные планшеты, и инкубировали при 37°C в течение 48 ч. Затем планшеты промывали и инкубировали с комплементом кроличьей сыворотки и пропидийиодидом (PI) в присутствии эффекторных компетентных анти-BDCA2 моноклональных антител (24F4S и BIIB059), моноклональных антител с дефицитом эффекторной функции (24F4S-agly и 24F4Aagly) или контрольным изотипом IgG1 в течение 1 ч при 37°C. Отрицательный контроль состоял из лунок без антител, содержащих клетки CHO, комплемент кроличьей сыворотки и PI. Клетки НК и клетки CHO, лизированные с T-100x, были использованы для определения максимального уничтожения. Планшеты считывали с помощью планшетного ридера Cytoflour Fluorescence (Ex530/em645). Анти-BDCA2 мАт (BIIB059 и 24F4S) вызывали гибель клеток посредством CDC аналогично лизированию Тритоном. Как и предполагалось, эффекторно-дефицитные a-гликозилированные моноклональные антитела (24F4Sagly и 24F4A-agly) не опосредовали CDC (фиг. 23). BIIB059 обладает потенциалом истощения клеток pDC, несущих BDCA2, благодаря своей функциональной Fc-области IgG1. В то время как BIIB059 способны проявлять цитотоксическую активность в клетках со сверхэкспрессией BDCA2, предполагается, что они не способны к истощению клеток in vivo по причине быстрой, стабильной и почти полной интернализации рецепторов после лигирования BIIB059.
Пример 31. Клонирование крысиного гомолога BDCA2 и скрининг на его связывание BIIB059.
Когда человеческую последовательность кДНК BDCA2 исследовали с помощью BLAST против крысиных последовательностей в базе данных NCBI, было установлено, что ближайшим гомологом являются крысиные Clec4b2, описанные в GenBank под номером NM_001005896. Чтобы определить способность лидерного hu24F4H4/Ll C95A мАт связываться с гомологом крысы BDCA2 человека, клонировали кДНК и конструировали векторы экспрессии для крысиного Clec4b2 и крысиного FccRIy. Полноразмерные крысиные последовательности белка Clec4b2 имеют только 51,0% идентичности с человеческими BDCA2. Ниже показано содержащее пробелы выравнивание последовательностей BDCA2 человека (сверху) и крысиного Clec4b2 (снизу)
MVPEEEPQDREKGLWWFQLKVWSMAWSILLLSVCFTVSSVVPHNFMYSK 5 0
I- I- II II I I :· I I Ц:|-1111 II -I II : II I
MMQEKLPQG . . KGGCW. TLRLWSAAVISMLLjLSTCFIMSCVVTYQFMMEK 47
TVKRLSKLREYQQYHPSLTCVMEGKDIED..WSCCPTPWTSFQSSCYFIS 98 : 11 Ι·Ι I- · II = 1 = Hill I I I III
PNRRLSEL...HTYNSNFTCCSDGTMVSGKVWSCCPKDWKPFGSHCYFTT 94
TGMQSWTKSQKNCSVMGADLVVINTREEQDFIIQNLKRNSSYFLGLSDPG 148
-I -I·· II III Ι·Ι Ι···ΙΙ Illi I II Illi
DFVANWNESKEKCSHMGAHLLVIHSQEEQDFINGILDTRWGYFTGLSDQ. 143
149 GRRHWQWVDQTPYNENVTFWHSGEPNNLDERCAIINFRSSEEWGWNDIHC 198
I- 111 = 1 IIII Il-Ill II Illi 1 = 1 II 11111= I
144 GQNQWQWIDQTPYNESVTFWHEDEPNNDYEKCVEINHHKDIGWGWNDVVC 193
199 HVPQKSICKMKKIYI 213 (SEQ ID N0:1)
1111--1111=
194 SSEHKSICQVKKIYL 208 (SEQ ID NO: 82)
Крысиные Clec4b2 клонировали с помощью РТ-ПЦР из первой цепи кДНК крысиной селезенки с праймерами 5' GAC CTT CTG AAT ATA TGC GGC CGC CAT GAT GCA GGA AAA AC 3' (SEQ ID NO: 83) (при этом добавляется сайт 5' NotI и последовательность Козака непосредственно перед инициатором метионином Clec4b2), и 5' CCC ACA GCC ATG GAG GAC AGG ATC CTC ATA AGT ATA TTT TC 3' (SEQ ID NO: 84) (при этом добавляется сайт 3' BamHI непосредственно после терминатора Clec4b2). Продукт РТ-ПЦР 0,64 кб очищали и субклонировали в клонирующий вектор pCR2.1T0P0 Invitrogen, получая конструкцию pCN815, в которой вставки подвергали секвенированию. Выполняли сайтнаправленный мутагенез на матрице pCN815 с праймерами 5' CAG GAT TTC ATC AAC GGA ATC CTA GAC ACT CGT TGG G 3' (SEQ ID NO: 85) и их обратным комплементом, для исправления ошибки ПЦР,
- 64 034757 в результате чего получали конструкцию pCN822, для которой было подтверждено, что выведенная последовательность Clec4b2 белка идентична последовательности NM 001005896. Был сконструирован вектор экспрессии млекопитающих для полноразмерной кДНК крысиного Clec4b2 путем лигирования фрагмента 0,64 кб Notl-BamHI из pCN822 с векторными каркасными фрагментами 1,89 кб BamHI-Xbal и 4,17 кб Xbal-Notl из вектора экспрессии pV90, для получения экспрессионного вектора pCN834, в котором последовательность вставленной кДНК была подтверждена.
Крысиные кДНК FcaRIy описаны в GenBank, номер доступа NM_001131001. Последовательность белка крысиного FcaRIy имеет 90,7% идентичности с человеческим FcaRIy: выравнивание с человеческой (сверху) и крысиной последовательностью (снизу) показано ниже
MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV 50
I И1|:| III II НИ II II III II II II II II II II II II II III II I
MIPAVILFLLLLVEEAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV 50
RKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ 86 (SEQ ID NO: 2)
III I I Illi 11 11 I -11 I I I I I 11 11 I I 11 11
RKADIASREKSDAVYTGLNTRNQETYETLKHEKPPQ 86 (SEQ ID N0:86)
Крысиные кДНК FcaRIy клонировали с помощью РТ-ПЦР из первой цепи кДНКкрысиной селезенки с праймерами 5' CCC AGC GCT GCA GCC CGC GGC CGC CAT GAT CCC AGC GGT 3' (SEQ ID NO: 87) (при этом добавляется сайт Notl и последовательность Козака непосредственно перед инициатором метионином FcaRIy) и 5' GAA CAC GTG TTG GGA TCC TAT TGG GGT GGT TTC ТС 3' (SEQ ID NO: 88) (при этом добавляется сайт 3' BamHI сразу после терминатора FcaRIy). Продукт РТ-ПЦР 0,27 кб очищали и субклонировали в клонирующий вектор pCR2.1T0P0 Invitrogen, получая конструкцию pCN816, в которой вставки секвенировали и подтверждали ее идентичность по отношению к NM 001131001. Фрагмент 0,27 кб Notl-BamHl из pCN816 лигировали в векторные каркасные фрагменты 0,66 кб BamHl-Xhol и 4,16 кб Xhol-Notl из pBHS103, для конструирования экспрессионного вектора млекопитающих pCN844, в котором была подтверждена вставка крысиной Кднк последовательности FcaRIy.
Для определения способности лидерного hu24F4H4/L1 C95A мАт связываться с поверхностным Clec4b2 крысы, клетки 293E транзиторно котрансфицировали с экспрессионным вектором репортера EGFP (pEAG1458) и либо с векторами BDCA2 человека/FcεRIy (pEAG2420 и pEAG2413), либо с векторами крысиного Clec4b2/FcaRIy (pCN834 и pCN844) в молярных соотношениях 1:1:1. Через 3 дня после трансфекции клетки собирали и окрашивали лидерным hu24F4H4/Ll C95A мАт в прямом анализе связывания FACS с титрованием в разведении, при стробировании на живых EGFP-позитивных клетках. Была отмечена высокая аффинность связывания hu24F4 с поверхностным BDCA2 человека, но при этом не обнаружено связывание с поверхностным Clec4b2 крысы. Это указывает на отсутствие у hu24F4 перекрестной реактивности к ближайшему крысиному гомологу BDCA2 человека.
Пример 32. Введение BIIB059 здоровым обезьянам циномолгус приводит к потере BDCA2 с поверхности плазмоцитоидных дендритных клеток, вероятно, посредством интернационализации.
Для оценки возможных изменений уровня поверхностных BDCA2 при введении BIIB059 обезьянам циномолгус применяли два анализа. В первом анализе, который представлял собой так называемый прямой способ, было обнаружено поверхностное связывание BIIB059 с античеловеческим PE-меченым вторичным антителом. В идеале, для обнаружения общего BDCA2 можно было бы использовать неперекрестно блокирующее антитело к BDCA2; однако, такие антитела не существуют. Таким образом, во втором анализе с помощью так называемого непрямого способа выполняли обнаружение незанятых BDCA2 путем добавления BIIB059, конъюгированного с A647.
Перед введением любых тестируемых агентов для каждой обезьяны циномолгус была установлена максимальная средняя интенсивность флуоресценции (MFI) для связывания BIIB059 с pDC в 3 различных точках времени (за 3, за 2 и за одну неделю перед однократной инъекцией BIIB059). В каждой точке времени титры немеченого BIIB059 (от 40 до 0,04 мкг/мл в конечной концентрации) добавляли в аликвоты крови, и проводили обнаружение BIIB059 с использованием PE-меченого вторичного антитела (прямой способ), или проводили оценку свободных BDCA2 с BIIB059-A647 (непрямой способ). Максимальные значения были взяты из значений на плато в каждом анализе (фиг. 24 и 25). Оценка значений показала очень небольшое колебание максимальной MFI для каждой обезьяны циномолгус, и более выкокую вариабельность между обезьянами циномолгус, что указывает на вариабельность плотности BDCA2 на клетках pDC у обезьян циномолгус (табл. 2).
Цельную кровь забирали от двенадцати обезьян циномолгус, один раз в неделю в течение всего трех недель. Кровь инкубировали с различными концентрациями BIIB059 человеческого IgG1 (от 0,04 до 40 мкг/мл, кривая с 6 точками, 1:4-кратные разведения). Клетки pDC идентифицировали с помощью про- 65 034757 точной цитометрии, как CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, и обрабатывали античеловеческим IgG PEмеченым вторичным антителом для обнаружения BIIB059, связанного с рецептором BDCA2 на клетках pDC. Значение MFI от PE рассчитывали с программным обеспечением FlowJo, кривые EC50 были получены в программном обеспечении GraphPad Prism.
Таблица 2. Результаты среднего EC50 значения связывания BIIB059 с BDCA2 клеточной поверхности на pDC в цельной крови обезьян циномолгус
Доноры-обезьяны циномолгус ЕС50 (мкг/мл)
1 0, 81
2 1
3 0, 95
4 1,7
5 0,71
6 1,3
7 1,1
8 1,2
9 1,4
10 1,2
11 1,4
12 1, 6
Среднее значение 1,2
SD 0,3
* среднее значение из 2-3 экспериментов.
После введения носителя, как и ожидалось, BIIB059 не были обнаружены и не выявлено каких-либо существенных изменений в уровнях BDCA2, что было оценено по связыванию с BIIB059-tt647 (10 мкг/мл) (фиг. 26).
После внутривенного (в/в) введения BIIB059 в обеих дозах 10 и 1 мг/кг не было обнаружено BIIB059 на поверхности, даже сразу через 1 ч после инъекции BIIB059 (фиг. 27 и 28). Кроме того, не было выявлено свободных BDCA2, что оценивали по отсутствию BIIB059-A647 через 38 дней у всех получавших лечение обезьян циномолгус, за исключением обезьяны № 5; концентрация в сыворотке крови у этой обезьяны циномолгус быстро упала на день 10, скорее всего, по причине иммуногенности, выработанной против BIIB059.
После подкожного введения более низкой дозы BIIB059 (0,2 мг/кг) было выявлено присутствие BIIB059 на поверхности pDC в течение короткого периода (в течение 1 ч, исчезли через 6 ч). В той же точке времени (1 ч) наблюдалось некоторое количество свободных BDCA2 (13, 74, 72% от исходного уровня MFI). Аналогично, лекарство не было обнаружено во всей остальной части исследования, и не был выявлен ни один свободный рецептор BDCA2 до дня 14 после инъекции BIIB059 (фиг. 29).
У всех обезьян циномолгус появление свободного BDCA2 совпадает с падением уровня лекарства в сыворотке ниже 1 мкг/мл (фиг. 30 и 31). Таким образом, 1 мкг/мл предположительно является минимальной концентрацией BIIB059, необходимой для опосредования интернационализации всех поверхностных BDCA2.
В табл. 3 приведены значения EC50, EC50 и EC90 интернализации рецептора BDCA2 на клетках pDC после лигирования с BIIB059 в цельной крови обезьян циномолгус. Кривые EC10-50-90 были получены в программном обеспечении GraphPad Prism с использованием четырех-параметрического подбора.
- 66 034757
Таблица 3
Обезьяны циномолгус Путь введения Доза (мг/кг) ЕС10 (мкг/кг) ес50 (мкг/кг) ес90 (мкг/кг)
5 в/в 1 0, 003 0, 087 0,370
6 в/в 1 0, 022 0, 025 0, 055
7 в/в 1 0, 014 0, 090 0,580
3 в/в 10 0, 100 0, 150 0,220
8 в/в 10 0, 095 0,370 1,455
10 в/в 10 0, 114 0, 126 0,265
4 п/к 0,2 0, 078 0, 088 0, 100
6 п/к 0,2 0, 040 0, 046 0, 054
12 п/к 0,2 0, 114 0, 121 0, 129
Среднее значение 0, 064 0, 123 0,359
Стандартное отклонение 0, 045 0, 101 0,445
Таким образом, эксперименты, описанные в этом примере, показывают, что: внутривенное введение BIIB059 in vivo в высоких дозах (10 и 1 мг/кг) приводит к быстрому исчезновению с клеточной поверхности как доступных BDCA2, так и связанного лекарства, что предполагает интернализацию рецептора. Подкожное введение низкой дозы (0,2 мг/кг) BIIB059 приводит к очень кратковременному (в течение 1 ч) обнаружению BIIB059 на поверхности pDC. После 6 ч не было обнаружено BIIB059 на поверхности клеток pDC. Повторное появление доступных BDCA2 на клеточной поверхности происходит при снижении лекарственного воздействия ниже 1 мкг/мл.
Пример 33. BIIB059 ингибирует провоспалительные медиаторы в дополнение ко всем видам ИФН I типа.
Лигирование BDCA2 подавляет способность клеток pDC продуцировать интерфероны I типа в ответ на TLR лиганды (фиг. 16). Для подтверждения ингибирующей активности анти-BDCA2 мАт, BIIB059, очищенные клетки pDC от здоровых доноров были стимулированы синтетическим TLR9лигандом, CpG-A, в присутствии 10 мкг/мл моноклональных антител BIIB059 или контрольного изотипа. Конкретно, клетки pDC от здоровых доноров-людей были выделены с использованием двухэтапного разделения магнитными шариками (набор MACS, Miltenyi Biotec). Очищенные человеческие клетки pDC в количестве 5*104 на лунку оставляли без обработки (среда) или стимулировали 1 мкМ TLR9-лигандом (CPG-A) в присутствии или 10 мкг/мл BIIB059 (CpG-A+BIIB059) или контрольного изотипа (CpGA+изотип). Планшеты, содержащие pDC, инкубировали в течение 18 ч при 37°C, и собирали супернатанты для использования в анализах ELISA или мультиплексных анализах для измерения концентрации воспалительных цитокинов и хемокинов. Эти эксперименты показали, что BIIB059 мощно ингибирует TLR9-индуцированные ИФНа и другие цитокины, продуцируемые pDC, такие как ФНОа и ИЛ-6, а также TLR-9 индуцированные хемокины, такие как CCL3, CCL4, CCL5 (фиг. 32).
Также исследовали способность BIIB059 ингибировать продукцию ИФНа и провоспалительных медиаторов после стимуляции физиологически соответствующим лигандом-иммунными комплексами. В частности, иммунные комплексы (IC) Sm/RNP предварительно получали путем смешивания SM-RNP из тимуса теленка и анти-RNP антител, очищенных из сыворотки больных СКВ в течение 1 ч в бессывороточной среде. Клетки pDC от здоровых доноров-людей были выделены с использованием разделения магнитными шариками (набор MACS, Miltenyi Biotec). Клетки pDC в количестве 5*104 на лунку оставляли без обработки (среда) или стимулировали предварительно сформированными иммунными комплексами Sm/RNP в присутствии или 10 мкг/мл BIIB059 (IC+BIIB059) или контрольного изотипа (IC+изотип). Планшеты, содержащие pDC, инкубировали в течение 18 ч при 37°C, и собирали супернатанты для использования в анализах ELISA или мультиплексных анализах для измерения концентрации воспалительных цитокинов и хемокинов. Эти исследования показали, что BIIB059 может ингибировать индуцированные иммунными комплексами SM/RNP ИФНа и другие pDC-продуцируемые цитокины, такие как ФНОа и ИЛ-6. BIIB059 также ингибирует хемокины, индуцированные иммунными комплексами Sm/RNP, такие как CCL3 и CCL4 (фиг. 33).
Пример 34. BIIB059 ингибирует Sm/RNP IC-индуцированную транскрипцию подтипов ИФН I типа посредством очищенных человеческих pDC.
- 67 034757
В организме человека существует тринадцать подтипов ИФНа и единственный член ΗΦΗβ. Эффект
BIIB059 на транскрипцию подтипов ИФН I типа в стимулированных Sm/RNP IC клетках pDC от здоровых доноров-людей оценивали в анализах качественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).
Иммунные комплексы Sm/RNP (IC) были предварительно созданы путем смешивания SM-RNP из тимуса теленка и анти-RNP антител, выделенных из сыворотки больных СКВ в течение 30 мин в среде без сыворотки. Клетки pDC от здоровых доноров-людей выделяли с использованием двухэтапного разделения магнитными шариками (набор MACS, Miltenyi Biotec). Очищенные человеческие клетки pDC в количестве 7,5*105 на лунку оставляли без обработки (среда) или стимулировали предварительно сформированными иммунными комплексами Sm/RNP в присутствии или 10 мкг/мл BIIB059 (IC+BIIB059) или контрольного изотипа (IC+изотип). Планшеты, содержащие pDC, инкубировали в течение 16 ч при 37°C и 5% CO2. Собирали клетки pDC и выделяли РНК из pDC для оценки в реакции кПЦР.
Этот эксперимент показал, что обработка с BIIB059 ингибирует уровень транскрипции всех протестированных подтипов ИФН I типа (фиг. 34).
Пример 35. BIIB059 ингибирует TLR9-индуцированную продукцию ИФНа посредством человеческих РВМС от здоровых доноров и больных СКВ.
Клетки pDC играют основную роль в продукции интерферона в ответ на стимуляцию TLR7 и TLR9. Клетки pDC могут продуцировать в тысячу раз больше интерферона, чем какой-либо другой тип клеток. В этом эксперименте исследовали возможность BIIB059 ингибировать TLR9-индуцированную продукцию ИФНа в культурах мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) без необходимости выделения pDC. Клетки PBMC от здоровых доноров и больных СКВ стимулировали 1 или 5 мкМ лиганда TLR9 (CpG-A) и обрабатывали BIIB059 в концентрациях от 10 мкг/мл до 2 нг/мл в общем анализируемом объеме 250 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение ночи (18 ч) при температуре 37°C и 5% CO2. Затем собирали супернатанты для оценки в анализах ИФНа ELISA.
Этот эксперимент показал, что BIIB059 ингибирует TLR9-индуцированную продукцию ИФНа посредством PBMC от здоровых доноров со средним значением IC50 0,04±0,05 мкг/мл (фиг. 35A и 35C). BIIB059 показали одинаковую эффективность в ингибировании TLR9-индуцированной продукции ИФНа посредством РВМС от больных СКВ со средним значением IC50 0,03±0,01 мкг/мл (фиг. 35B и 35C).
Пример 36. BIIB059 ингибирует продукцию ИФНа в цельной крови, стимулированной TLR9 ли гандом.
Активность BIIB059 также оценивали в анализах цельной крови (WBA). Цельную кровь от здоровых доноров стимулировали TLR9 лигандом в присутствии BIIB059 в возрастающих концентрациях и рассчитывали значение IC50 ингибирования для каждого отдельного донора. Конкретно, цельную кровь от здоровых доноров инкубировали с BIIB059 в возрастающих концентрациях в диапазоне от 10 мкг/мл до 2 нг/мл или с контрольным изотипом, в общем анализируемом объеме 200 мкл на лунку. Добавляли CpG-A в количестве 75 мкг/мл (незакрашенные квадраты), которое определяли как оптимальное количество для стимуляции продукции ИФНа в цельной крови. Планшеты инкубировали в течение 18 ч при 37°C и собирали супернатанты для использования в анализах ELISA ИФНа (PBL InterferonSource).
Было выявлено, что BIIB059 дозозависимым образом ингибирует TLR9-индуцированную продукцию ИФНа в анализах цельной крови и показывает значения IC50, аналогичные значениям, которое наблюдалось в культурах РВМС (фиг. 36).
Пример 37. BIIB059 не ингибирует TLR3-индуцированную продукцию ИФНа посредством человеческих РВМС от здоровых доноров-людей.
Этот эксперимент проводили для определения возможности других типов клеток, запускаемых с различными лигандами TLR, продуцировать ИФН I типа даже в присутствии BIIB059. TLR3 не экспрессируется в клетках pDC и, следовательно, TLR3 лиганд не индуцирует продукцию ИФН посредством pDC. Клетки РВМС от здоровых доноров-людей стимулировали poly:IC, который является лигандом TLR3, способным мощно индуцировать ИФН I типа в основном посредством моноцитов. Конкретно, РВМС от здоровых доноров были стимулированы 1 мкМ лиганда TLR3 (poly:IC) и обработаны BIIB059 в концентрации от 10 мкг/мл до 0,5 нг/мл в общем анализируемом объеме 250 мкл на лунку в 96-луночном планшете. Планшеты инкубировали в течение ночи (18 ч) при температуре 37°C и 5% CO2. 200 мкл супернатантов собирали для оценки уровней ИФНа в анализе ELISA. Как показано на фиг. 37, BIIB059 не влияет на TLR3-индуцированную продукцию ИФНа посредством РВМС от здоровых доноров-людей.
Таким образом, примеры 33-37 показывают, что BIIB059 может эффективно ингибировать TLR9стимулированную продукцию интерферона I типа посредством очищенных pDC, РВМС и культур цельной крови. BIIB059 одинаково мощно ингибирует TLR9-индуцированную продукцию интерферона I типа посредством pDC от здоровых доноров и больных СКВ. В дополнение к ингибированию ИФН I типа, BIIB059 может ингибировать продукцию других цитокинов и хемокинов, продуцируемых pDC. BIIB059 специфично ингибирует TLR9-индуцированные интерфероны I типа посредством pDC и не влияет на продукцию ИФН посредством других типов клеток, запускаемых другим TLR лигандом. Таким образом, данные in vitro, представленные в изобретении, подтверждают фармакологическую активность и потенциал BIIB059 в дополнение к его специфичности к TLR7/9-индуцированным ИФН I типа посредством pDC.
Пример 38. BIIB059 опосредует интернализацию BDCA2 на человеческих pDC.
- 68 034757
Для определения способности BIIB059 индуцировать интернализацию BDCA2 человеческую цельную кровь от 10 здоровых доноров инкубировали с BIIB059 в возрастающих концентрациях при 37°C в течение 16 ч. Остальная часть BDCA2 клеточной поверхности была выявлена с помощью FITC-меченого неперекрестно блокирующего анти-BDCA2 мАт (клон 2D6).
Конкретно, цельную кровь от 10 здоровых доноров-людей инкубировали с BIIB059 в возрастающих концентрациях или с 10 мкг/мл контрольного изотипа антитела в течение 16 ч при 37°C и 5% CO2, и затем инкубировали в течение 30 мин при 4°C с FITC-меченным неперекрестно блокирующим антиBDCA2 мАт (клон 2D6), анти-HLA-DR, affrH-CD123, анти-CD14 и анти-CD20. Затем цельную кровь инкубировали в течение 30 мин при 4°C с 50 мкл окрашивающего раствора, который включал в себя следующие мАт: FITC-меченое неперекрестно блокирующее анти-BDCA2 мАт (клон 2D6), анти-HLA-DR, анти-CD123, amu-CDM и анти-CD20. Эритроциты лизировали с помощью IX лизирующего/подгоночного буфера (IX lyse/fit Buffer, BD Bioscience).
Как показано на фиг. 38, BIIB059 вызывают дозозависимое снижение интенсивности FITCмеченого окрашивания 2D6 со средним значением EC50 0,017±0,005 мкг/мл.
Пример 39. BDCA2 быстро интернализуются после лигирования с BIIB059.
Для определения кинетики BIIB059-индуцировaнной интернализации BDCA2 цельную кровь человека инкубировали с BIIB059 в разных концентрациях при 37°C в течение разных периодов времени. Конкретно, цельную кровь обрабатывали BIIB059 в концентрации 10, 1, 0,1 или 0,01 мкг/мл или контрольным изотипом антитела (10 мкг/мл) при 37°C в течение указанных периодов. Цельную кровь инкубировали в течение 30 мин при 4°C с 50 мкл окрашивающего раствора, который включал в себя следующие мАт: FITC-меченое неперекрестно блокирующее amH-BDCAZ мАт (клон 2D6), анти-HLA-DR, антиCD123, анти-ОПК и aнти-CD20. Эритроциты лизировали и фиксировали при помощи IX Lyse/fit буфера (BD Bioscience). Как показано на фиг. 39, при инкубации с BIIB059 в концентрации 1 мкг/мл интенсивность FITC-меченого окрашивания 2D6 быстро снижалась, достигая исходного уровня в течение одного часа инкубации. Инкубация с BIIB059 в концентрации в десять раз ниже (0,1 мкг/мл) задеривала интернализацию BDCA2 на 2 ч. Эти данные показывают, что скорость интернализации BDCA2 зависит от дозы BIIB059.
Пример 40. BIIB059 индуцирует интернализацию BDCA2 в человеческих плазмоцитоидных дендритных клетках.
Для визуализации интернализации BDCA2 после лигирования с BIIB059 очищенные pDC инкубировали с A647-мечеными BIIB059 и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Как и ожидалось, BDCA2 локализовались на клеточной поверхности pDC при 4°C. После короткой инкубации при 37°C BDCA2 отчетливо обнаруживались внутри клеток (фиг. 40).
Пример 41. Интернационализация не изменяет BIIB059-опосредовaнное ингибирование продукции ИФНа.
В этом эксперименте исследовали, изменяет ли интернализация BDCA2 способность BIIB059 ингибировать TLR9-индуцировaнную продукцию ИФНа посредством pDC. Клетки предварительно инкубировали с BIIB059 при 37°C в течение разных периодов времени, соответствующих максимальной интернализации BDCA2, и затем стимулировали TLR9 лигандом в течение дополнительных 18 ч. Конкретно, цельную кровь собирали из гепаринизированной венозной крови здоровых доноров и предварительно инкубировали с BIIB059 или контрольным изотипом антитела в течение указанных периодов времени. В каждой точке времени после предварительной инкубации клетки стимулировали TLR9 лигандом в количестве 200 мкл/мл (CpG-A) и инкубировали в течение дополнительных 18 ч при 37°C. Супернатанты собирали для использования в анализах ИФНа ELISA (PBL InterferonSource). Как показано на фиг. 41, предварительная инкубация с BIIB059 (до 9 ч) не изменяет способность BIIB059 ингибировать TLR9индуцированную продукцию ИФНа в анализах цельной крови здоровых доноров-людей. Эти данные позволяют предположить, что интернализация BDCA2 может быть необходимой для ингибирования сигнального пути TLR9.
Пример 42. EC50 BIIB059-опосредовaнной BDCA2 интернализации на pDC коррелирует с IC50 BIIB059-опосредовaнного ингибирования TLR9 -индуцированных ИФНа посредством pDC в анализах цельной крови.
Для дальнейшего изучения связи между интернализацией BDCA2 и ингибированием сигнального пути TLR9 у 10 здоровых доноров-людей сравнивали мощность BIIB059-опосредовaнной интернализации BDCA2 на клетках pDC и ингибирование TLR-опосредованной продукции ИФНа посредством pDC.
Для оценки BIIB059-опосредовaнной BDCA2 интернализации цельную кровь инкубировали с BIIB059 в течение 16 ч. Собирали и лизировали цельную кровь, затем экспрессию BDCA2 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием FITC-конъюгированного не-перекрестно блокирующего антитела 2D6. Чтобы оценить BIIB059-опосредовaнное ингибирование TL·R9-индуцировaнных ИФНа посредством pDC, цельную кровь инкубировали с BIIB059 в возрастающих концентрациях в течение 16 ч в присутствии лиганда TLR9. Супернатанты собирали и оценивали с помощью ИФНа ELISA. Значение EC50 BIIB059-опосредовaнной интернализации BDCA2 составляет 0,02 мкг/мл. Значение IC50 BIIB059-опосредовaнного ингибирования TLR9-индуцировaнных ИФНа составляет 0,07 мкг/мл. Корре- 69 034757 ляция между значениями EC50 В11В059-опосредованной интернализации BDCA2 и IC50 BIIB059опосредованного ингибирования ИФНц была выявлена путем расчета квадрата значения R=0,57 (фиг. 42).
Пример 43. Активация TLR9 индуцирует колокализацию BDCA2 с TLR9 и с лизосомальным маркером LAMP1.
Для проверки гипотезы, что для BIIB059-опосредованного ингибирования TLR9 требуется интернализация и локализация BDCA2 в эндосомальных/лизосомальных компартментах, содержащих TLR9, выполняли конфокальную микроскопию для отслеживания внутриклеточного распределения BDCA2 после лигирования с BIIB059. Очищенные человеческие pDC культивировали в течение 7 дней и инкубировали с A647-мечеными BIIB059 в течение 15 мин при 37°C. Во время последних 10 мин инкубации клетки обрабатывали 1 мкМ TLR9 лиганда CpG-A или оставляли без обработки. Клетки окрашивали флуоресцентно мечеными антителами на TLR9 и поздний эндосомальный/лизосомальный маркер, Lamp1, и анализировали с помощью конфокальной микроскопии.
Наблюдали рекрутинг TLR9 в поздний эндосомальный/лизосомальный компартмент после стимуляции TLR9 лигандом, о чем свидетельствует повышенная колокализация TLR9 с Lamp1 (фиг. 43). Стимуляция TLR9 также значительно повышала фракцию BDCA2, колокализующихся с TLR9 и Lamp1. Эти результаты показывают, что BIIB059, находящиеся в связи с BDCA2, преимущественно локализуются во внутриклеточных компартментах, где присутствует активированный TLR9.
В общем, примеры 38-43 показывают, что BIIB059, гуманизированное моноклональное антитело против BDCA2, вступает в контакт с BDCA2 и вызывает его интернализацию. При стимуляции BDCA2 колокализуются с TLR9 в эндосомальном/лизосомальном компартменте, где они опосредуют ингибирование сигнального пути TLR9. Эти данные позволяют предположить, что интернализация BDCA2 является необходимым этапом для опосредования ингибирования TLR9-индуцированных провоспалительных медиаторов посредством pDC.
Пример 44. Влияние BIIB059 на уровень CD62L.
Циркулирующие клетки pDC на высоком уровне экспрессируют CD62L (L-селектин) и возвращаются в лимфоидную ткань, содержащую венулы с высоким эндотелием (HEV). Лигандом для CD62L является PNAd, который конститутивно экспрессируется на HEV и опосредует хоуминг экспрессирующих CD62L клеток в организованную лимфоидную ткань. Было установлено, что PNAd экспрессируется эндотелиальными клетками кожи при кожных поражениях при системной красной волчанке. Благодаря тому, что pDC экспрессируют CD62L, они могут рекрутироваться в воспаленные периферические ткани, экспрессирующие PNAd.
Для определения влияния BIIB059 на экспрессию CD62L на поверхности человеческих pDC цельную кровь обрабатывали BIIB059 в разных концентрациях в течение 1 ч при 37°C без стимуляции. Конкретно, цельную кровь от здоровых доноров обрабатывали BIIB059 в возрастающих концентрациях в течение 1 ч при 37°C и 5% CO2. Значение MFI от CD62L устанавливали стробированием клеток pDC, что определяли по CD14-, CD20-, HLA-DR+ и CD123+.
BIIB059 вызывает дозозависимое уменьшение экспрессии CD62L на поверхности человеческих pDC, что определяли с помощью проточной цитометрии (фиг. 44). Стимуляция клеток pDC TLRлигандом не влияет на экспрессию CD62L (фиг. 44A).
Пример 45. Обработка РВМС с GM6001 ингибирует BIIB059-опосредованный шеддинг CD62L с поверхности человеческих pDC.
Известно, что металлопротеиназы индуцируют шеддинг CD62L с поверхности иммунных клеток. Чтобы исследовать участие металлопротеиназ в BIIB059-опосредованном уменьшении количества поверхностных CD62L, от здоровых доноров получали клетки РВМС и предварительно их обрабатывали с GM6001 (ингибитором металлопротеиназы) в течение 30 мин при 37°C и 5% CO2, с последующим добавлением 10 мкг/мл BIIB059 в течение 1 ч. Поверхностную экспрессию CD62L анализировали способом проточной цитометрии. GM6001 ингибирует BIIB059-опосредованную понижающую модуляцию CD62L в зависимости от дозы (фиг. 45). Эти данные позволяют предположить, что BIIB059 индуцирует шеддинг CD62L зависимым от металлопротеиназы образом.
В целом, примеры 44 и 45 показывают, что BIIB059 уменьшает экспрессию CD62L на поверхности человеческих pDC. BIIB059-опосредованная понижающая модуляция CD62L ингибируется ингибитором металлопротеиназы (GM6001), указывая на то, что BIIB059 индуцирует шеддинг CD62L с поверхности человеческих pDC посредством, по меньшей мере, частичной активации металлопротеиназы. Поэтому предполагается, что обработка с BIIB059 будет уменьшать или предотвращать перемещение клеток pDC в органы-мишени при СКВ.
Пример 46. Влияние Fc-области BIIB059 на опосредуемую иммунным комплексом продукцию интерферона посредством плазмоцитоидных дендритных клеток Fc-гамма-рецептор IIA (CD32a) представляет собой белок клеточной поверхности, который связывается с IgG с низкой аффинностью. Человеческие плазмоцитоидные дендритные клетки эксклюзивно экспрессируют Fc-гамма-рецептор IIA-CD32a. Было показано, что стимуляция клеток pDC иммунными комплексами зависит от CD32. Иммунные комплексы интернализируются CD32 и стимулируют эндосомальные TLR7/9, чтобы индуцировать продукцию ИФН посредством pDC.
- 70 034757
Для определения влияния BIIB059 на поверхностную экспрессию CD32a выделенью клетки pDC обрабатывали с BIIB059 в возрастающих концентрациях или a-гликозилированной формой антитела 24F4-A, и инкубировали в течение 16 ч при 37°C. Затем клетки pDC окрашивали FITC-меченым BDCA2 и PE-меченым анти-CD32 (клон AT10), и оценивали поверхностную экспрессию BDCA2 и CD32 с помощью проточной цитометрии. BIIB059 и agly вариант 24F4 обладали одинаковым потенциалом в своей способности индуцировать интернализацию BDCA2 (фиг. 46A). Только BIIB059 были способны индуцировать понижающую модуляцию CD32 на клеточной поверхности pDC, что определяли по дозозависимому уменьшению в CD32 средней интенсивности флуоресценции (MFI) (фиг. 46B-D). Обработка контрольным эффекторным компетентным изотипом не имела какого-либо эффекта на уровень поверхностных CD32 (фиг. 46). Эти данные показывают, что BIIB059-опосредованная понижающая модуляция уровней CD32a на поверхности клеток pDC является специфичной для связывания Fc-области BIIB059.
Чтобы гарантировать, что связывание с Fc-областью BIIB059 не просто маскирует эпитоп CD32, распознаваемый FITC-меченным анти-CD32 мАт, клетки pDC обрабатывали 10 мкг/мл BIIB059 в течение 1 ч при 4°C или 37°C, а затем окрашивали мечеными анти-CD32. Как показано на фиг. 46E, обработка с BIIB059 при 4°C не уменьшает значение MFI в CD32, указывая, что обработка с BIIB059 не препятствует связыванию меченого анти-CD32 мАт. Тот факт, что понижающая модуляция CD32a происходит только после инкубации с BIIB059 при 37°C, показывает, что CD32a могут исчезать с клеточной поверхности pDC.
Чтобы определить, имеет ли биологическое значение понижающая модуляция CD32a посредством BIIB059, клетки pDC инкубировали в присутствии BIIB059 в возрастающих концентрациях или в присутствии гликозилированной формы 24F4A-Agly и стимулировали или иммунными комплексами, или синтетическим лигандом TLR9 (CPG-A). Как и предполагалось, BIIB059 и 24F4A-Agly были неотличимы в своей способности ингибировать CPG-A-индуцированную продукцию ИФНа посредством pDC, которая не зависит от CD32 (фиг. 47A). Выявлено четкое разделение по потенциалу между BIIB059 и 24F4AAgly при стимуляции клеток pDC иммунными комплексами. BIIB059 ингибирует ИФНа, индуцированные иммунными комплексами при значении IC50=0,04, по сравнению с IC50 при 24F4A-Agly=1,4 мкг/мл. (фиг. 47B). Эти данные показывают, что BIIB059 вызывает понижающую модуляцию CD32a благодаря своей функциональной Fc-области и, следовательно, ингибирует стимуляцию клеток pDC посредством иммунных комплексов.
Чтобы подтвердить, что понижающая модуляция CD32a является уникальной для BIIB059, авторы исследовали эффект полностью гуманизированного анти-CD40-антитела на уровни CD32 и опосредуемой иммунным комплексом продукции ИФНа посредством pDC. CD40 представляет собой белок клеточной поверхности, экспрессируемый на клетках pDC. Анти-CD40-антитело с полностью функциональной Fc обладает способностью вступать в контакт с CD40 и связываться с CD32 на поверхности клеток pDC. Обработка с анти-CD40 мАт не влияет на поверхностную экспрессию CD32 и не оказывает существенного влияния на продукцию ИФНа из pDC, стимулированных иммунным комплексом (фиг. 48A и B). Связывание анти-ОО40 мАт было подтверждено путем демонстрации максимального захвата CD40 в клетки, обработанные анти-CD40 (фиг. 48C).
Как было показано ранее, лигирование BDCA2 с BIIB059 или a-гликозилированной формой 24F4Aagly приводит к интернализации рецепторов и ингибированию TLR9-индуцированных ИФНа посредством pDC. В этом исследовании авторы показали, что BIIB059 вызывает понижающую модуляцию CD32a на клетках pDC и ингибирование стимулированной иммунным комплексом продукции ИФНа посредством pDC Fc-зависимым образом. Понижающая модуляция CD32a, запускаемая BIIB059, не является результатом любого антитела с функциональной Fc-областью, которое способно связываться с молекулой клеточной поверхности, экспрессируемой на pDC. Это исследование подчеркивает новый терапевтический потенциал эффекторных компетентных анти-BDCA2 мАт, которые могут ослаблять ответы pDC посредством обеих его областей Fab'2 и Fc, что ведет к повышению эффективности.
Пример 47. Взаимодействие BIIB059 с гидроксихлорохином (HCQ).
Для лечения системной красной волчанки применяются противомалярийные агенты, такие как гидроксихлорохин (HCQ). В клетках pDC от больных СКВ, получавших HCQ, уменьшается способность продуцировать ИФНа при стимуляции TLR7 и TLR9 лигандами. Поскольку и BIIB059 и HCQ действуют на TLR7/9-индуцированные ИФНа в клетках pDC, было исследовано, может ли быть избыточным эффект BIIB059 и HCQ.
Для решения этого вопроса человеческие клетки РВМС получали из крови здоровых доноров и стимулировали их TLR7 или TLR9 лигандами в присутствии только BIIB059 в разных концентрациях, только HCQ, или в присутствии BIIB059 в комбинации с HCQ. Супернатанты собирали через 18 ч и анализировали на ИФНа способом ELISA. Добавление HCQ повышало потенциал BIIB059 и вызывало аддитивный ингибирующий эффект на TLR7- и TLR9-индуцируемую продукцию ИФНа посредством РВМС от здоровых доноров-людей. Эти данные показывают, что активность BIIB059 и HCQ не является избыточной и подчеркивают дополнительное терапевтическое преимущество BIIB059 при его введении с противомалярийными соединениями, такими как HCQ.
Пример 48. Эффект BIIB059 на BDCA2-экспрессирующие pDC in vivo.
- 71 034757
Целью данного исследования было определить, опосредует ли введение BIIB059 обезьянам циномолгус истощение клеток pDC в периферической крови.
Четыре образца крови после предварительного введения BIIB059 получали с недельными интервалами от двенадцати обезьян циномолгус для установления исходного уровня pDC для каждого животного (табл. 3).
Цельную кровь брали у двенадцати обезьян циномолгус один раз в неделю всего в течение четырех недель. Клетки pDC идентифицировали с помощью проточной цитометрии, как CD20-CD14CD123+HLA-DR+. Содержание pDC как процент CD20-CD14-клеток рассчитывали с помощью программного обеспечения FlowJo.
Таблица 3. Результаты среднего содержания циркулирующих pDC в цельной крови здоровых обезьян циномолгус
Процент циркулирующих pDC
Доноры обезьяны циномолгус 073112 080712 081312 082013 Среднее значение SD
1 0,26 0,2 0, 15 0,16 0, 19 0, 05
2 0,2 0, 15 0, 15 0,21 0, 18 0, 03
3 0, 11 0, 06 0, 11 0, 19 0, 12 0, 05
4 0, 12 0, 11 0, 14 0,31 0, 17 0, 09
5 0, 19 0,2 0,31 0,40 0,28 0, 10
6 0,32 0,57 0,35 0,39 0,41 0, 11
7 0, 15 0, 19 0,21 0,16 0, 18 0, 03
8 0, 12 0, 13 0, 1 0,16 0, 13 0, 03
9 0, 08 0, 12 0, 1 0, 11 0, 10 0, 02
10 0,16 0, 15 0,28 0,22 0,20 0, 06
11 0, 06 0, 07 0, 04 0, 07 0, 06 0, 01
12 0, 1 0, 05 0, 07 0,16 0, 10 0, 05
Среднее значение 0,16 0, 17 0, 17 0,21 0, 18
SD 0,08 0, 14 0, 10 0, 10 0, 09
Во всех статистических анализах выполняли логарифмическое преобразование частоты pDC для уменьшения асимметрии (фиг. 51). Исходное распределение частоты pDC в левой части фиг. 51 было значительно смещено вправо. Тем не менее, после логарифмического преобразования распределение преобразованных частот pDC (фиг. 51, правая часть) приблизительно соответствовала нормальному распределению. Эти данные логарифмического преобразования были использованы для всех способов статистических анализов.
Фиг. 52 представляет уровни pDC в логарифмической шкале для каждой обезьяны циномолгус в четырех точках времени перед внутривенной инъекцией. Используя линейную модель со смешанными эффектами с четырьмя точками времени в качестве фиксированных факторов и со случайными отрезками для обезьян циномолгус, авторы пришли к выводу, что средние геометрические значения процентов pDC для всех обезьян были эквивалентными на протяжении 4 точек времени перед введением дозы (фиг. 53, p-значение для времени на основе F-теста=0,67). Этот анализ показал, что среднее геометрическое значение процента циркулирующих pDC у обезьян циномолгус было относительно стабильным на протяжении времени.
Девять из этих двенадцати обезьян циномолгус были разделены на 3 группы (по 3 животных на группу), и рандомизированы, чтобы включать равную репрезентативность показателей плотности BDCA2 и процентов pDC в каждой группе. Обезьяны циномолгус получали однократную внутривенную инъекцию носителя (цитрат натрия), или 10 мг/кг BIIB059, или 1 мг/кг BIIB059. Проточную цитометрию использовали для идентификации циркулирующих pDC в цельной крови как CD20-CD14-CD123+HLADR+, а частота pDC (на лог-шкале) в каждой точке времени была графически отображена с помощью
- 72 034757 программного обеспечения R (фиг. 54). Линейная модель со смешанными эффектами была подогнана по логарифму частоты (pDC), с использованием случайных отрезков для обезьян циномолгус и фиксированных эффектов в отношении группы введения и периода времени: 1, 6 ч, от 1 до 27 дней и более 28 дней. Предварительная модель для оценки вероятных изменений pDC среди разных групп введения в разные периоды времени также включала в себя условия взаимодействия для группы введения и разных периодов времени. Р-значение на основе F-теста для тестирования всех условий взаимодействия, равных 0, составляет 0,81, что указывает на отсутствие какой-либо разницы для изменения pDC среди разных групп введения. Следовательно, конечная подогнанная модель включает только статистически значимые эффекты для факторов периода времени и группы введения (табл. 4).
Оценивали фиксированные эффекты с помощью линейной модели со смешанными эффектами с использованием случайных отрезков для обезьян циномолгус и фиксированных факторов для группы введения и периодов времени 1, 6 ч и более 28 дней, для определения процентов циркулирующих pDC на логарифмической шкале до и после в/в введения обезьянам циномолгус носителя цитрата натрия, BIIB059 в дозе 1 мг/кг или BIIB059 в дозе 10 мг/кг.
Таблица 4. Оценка в подогнанной модели для точек времени после однократной внутривенной инъекции BIIB059 или носителя
Оцениваемый эффект Экспонента (оценки эффекта) (% соотношение pDC) 95% доверительный интервал Р
Время: 1 час по сравнению с другими -0,56 0,57 0,43-0,77 0,0003
Время: 6 часов по сравнению с другими 0,46 1,58 1,18-2,13 0, 003
Время: >28 дней по сравнению с другими -0,48 0, 62 0,55-0,70 <0,0001
Группа: BIIB059 1 мг/кг по сравнению с носителем 0,49 1, 64 1,20-2,25 0, 01
Группа: BIIB059 10 мг/кг по сравнению с носителем 0, 09 1, 09 0,79 to 1,50 0, 84
Экспоненцирование оценок параметров для основных факторов выполняли для их интерпретации как отношения частот pDC в указанные периоды времени по сравнению с показателями перед введением BIIB059. В целом, соотношение было значительно меньше, чем при сравнении частоты pDC через 1 ч после в/в инъекции с показателями частоты pDC перед введением (95% доверительный интервал: 0,430,77, p-значение: 0,0003). Соотношение было значительно больше, чем при сравнении частоты pDC через 6 ч после в/в инъекции с частотой pDC перед введением (95% доверительный интервал: 1,18-2,12, pзначение: 0,003). Соотношения существенно не отличались друг от друга при сравнении частоты pDC в период от 1 до 28 дня после в/в инъекции с частотой pDC перед введением. Соотношение было значительно меньше, чем соотношение при сравнении частоты pDC через 28 дней после внутривенной инъекции с частотой pDC перед введением (95% доверительный интервал: 0,55-0,70, p-значение: 0,0001). Конечная подогнанная модель показана на фиг. 55. Результаты показали, что имеется значительное истощение циркулирующих pDC in vivo у обезьян циномолгус в точке времени 1 ч, значительное увеличение циркулирующих pDC в точке времени 6 ч и значительное истощение циркулирующих pDC через 28 дней после внутривенной инъекции, но изменения в процентах pDC на протяжении времени были одинаковыми во всех группах введения.
Дополнительно, после завершения в/в исследования в зависимости от времени три из этих обезьян циномолгус (4, 6 и 12) получили однократную подкожную дозу BIIB059 0,2 мг/кг для оценки эффекта более низкой дозы на частоту циркулирующих pDC. Частота pDC (на лог-шкале) в каждой точке времени была графически отображена с помощью программного обеспечения R (фиг. 56). Линейная модель со смешанными эффектами была подогнана с использованием непрерывного времени и времени 1 ч в качестве фиксированных факторов и обезьян циномолгус в качестве случайных отрезков. Результаты показаны в табл. 5.
Оценивали фиксированные эффекты с помощью линейной модели со смешанными эффектами с использованием с использованием непрерывного времени и времени 1 ч в качестве фиксированных факторов и обезьян циномолгус в качестве случайных отрезков, для определения процентов циркулирующих pDC на логарифмической шкале до и после однократного подкожного введения обезьянам циномолгус BIIB059 в дозе 0,2 мг/кг.
- 73 034757
Таблица 5. Оценка в подогнанной модели для точек времени после однократной подкожной инъекции BIIB059
Оцениваемый эффект Экспонента (оценки эффекта) (% соотношение pDC) 95% доверительный интервал В
Время (непрерывное) 0, 01 1,01 1,00-1,02 <0,0001
Время: 1 час по сравнению с другими -0,78 0,46 0,34-0,65 <0,0001
Как и в предыдущих результатах, авторы наблюдали значительное истощение in vivo циркулирующих pDC у обезьян циномолгус через 1 ч после в/в инъекции (95% доверительный интервал: 0,34-0,55, pзначение 0,0001), но среднее геометрическое значение % pDC для трех обезьян циномолгус постоянно увеличивалось с увеличением времени (95% доверительный интервал: 1,00-1,03-кратное изменение за 1 день, значение p=0,0001). Подогнанная модель показана на фиг. 57.
В заключение, эти данные показывают, что BIIB059 не опосредует устойчивое истощение клеток pDC в крови обезьян циномолгус при введении в тестируемых дозах. Вероятно, это обусловлено интернационализацией BDCA2.
Пример 49. Введение BIIB059 обезьянам циномолгус вызывает ингибирование ^К9-индуцированной продукции ИФНа в цельной крови ex vivo.
Целью исследования было определение возможности BIIB059 при введении обезьянам циномолгус in vivo изменять продукцию ИФНа в ответ на ^К9-стимуляцию ex vivo в анализе цельной крови (WBA).
Внутривенный и подкожный путь введения были оценены в отношении их способности влиять на индукцию ИФНа, которую измеряли с помощью биоанализа MxA в соответствии с планом эксперимента, описанным в фиг. 58. Лиганд TLR9 (CpG-A) индуцировал измеримые количества ИФНа в культурах цельной крови во всех точках времени и у всех обезьян циномолгус, при этом ИФНа не выявлен в контрольных ФБР-обработанных культурах (данные не показаны).
Для обезьян циномолгус из группы внутривенного введения показатели ИФНа после лечения были рассчитаны в процентах от средних значений перед введением для каждого животного. Данные от образцов крови после 14-го дня были исключены из анализа, поскольку анализ цельной крови не проводили в группе введения 10 мг/кг BIIB059 после этой точки времени. Наблюдалась тенденция к снижению % ИФНа по сравнению со средними значениями перед введением в течение нескольких дней после введения препарата BIIB059 в группах введения дозы 1 мг/кг и дозы 10 мг/кг по сравнению с группой введения носителя (фиг. 59)
Более всесторонний анализ данных проводили с помощью двухстороннего дисперсионного анализа со смешанными эффектами (ANOVA) для оценки средних значений ИФНа и различий после введения по сравнении с различиями перед введением для каждой группы в исследовании в/в введения. Данные в течение первых 24 ч после введения были исключены по причине выявленного снижения в периферической крови процента плазмоцитоидных дендритных клеток. Данные от образцов крови после 31-го дня после введения были исключены из анализа по причине возвращения экспрессии BDCA2, которая наблюдается в указанной точке времени. В группе введения носителя среднее геометрическое значение ИФНа составляло 362 единиц/мл (Ед/мл) перед введением дозы и 314 Ед/мл после введения дозы; в группе введения 1 мг/кг среднее геометрическое значение составляло 399 Ед/мл перед введением дозы, и 237 Ед/мл после введения дозы; в группе введения 10 мг/кг среднее геометрическое значение ИФНа составляло 211 Ед/мл перед введением дозы и 102 Ед/мл после введения дозы (фиг. 4). Различия после введения - перед введением в среднем log10 в отношении ИФНа составляли -0,061 (p=0,511) в группе введения носителя, -0,226 (p=0,016) в группе 1 мг/кг, и -0,317 (p=0,004) в группе 10 мг/кг. После преобразования анти-logW эти результаты показали, что в группе носителя 10л(-0,061)=87% (95% доверительный интервал: 57% 133%) от концентрации ИФНа при сравнении после введения и перед введением; в группе 1 мг/кг было 10л(-0,226)=59% (95% доверительный интервал: 39-91%) от концентрации ИФН при сравнении после введения и перед введением; и в группе 10 мг/кг было 10л(-0,317)=48% (95% доверительный интервал: 29-79%) от концентрации ИФН при сравнении после введения и перед введением (фиг. 60).
Для когорты обезьян циномолгус с подкожным введением использовали односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) со случайными эффектами для оценки средних значений ИФНа и различий после введения по сравнении с различиями перед введением для всей группы. Данные в течение первых 24 ч после введения были исключены по причине выявленного снижения в периферической крови процента плазмоцитоидных дендритных клеток. Данные от образцов крови после 33-го дня после введения были исключены из анализа по причине возвращения экспрессии BDCA2, которая наблюдается в указанной точке времени. В группе подкожного введения среднее геометрическое значение ИФНа составляло 1243 Ед/мл перед введением и 812 Ед/мл после введения, что давало соотношение после введения - перед введением 65%. Оценка различий после введения - перед введением в среднем log10 составляла -0,185
- 74 034757 (p=0,059), которая после анти-loglO преобразования соответствовала 10Л(-0,185)=65% от среднего геометрического значения перед введением; 95% доверительный интервал этого эффекта составляет 41102% (фиг. 61).
Поскольку в этом эксперименте было задействовано лишь небольшое количество обезьян циномолгус, установленная для каждой обезьяны концентрация ИФНа значительно влияет на результаты в этой группе. Пропорция вариации из-за различий у животных в ходе внутривенного исследования составила 69% от общей вариабельности, а остальная часть в основном обусловлена различиями между точками времени у каждой обезьяны циномолгус (26%), и небольшая часть (меньше 6%) обусловлена вариацией источников анализа. Разница между обезьянами циномолгус значительно больше, чем вариации между точками времени у каждой из обезьян циномолгус, и предполагается, что добавление обезьян циномолгус в этом эксперименте, в отличие от увеличения точек времени забора крови, улучшит проведение исследования. Пропорция вариации из-за различий между обезьянами циномолгус в исследовании подкожного введения составляла 45% от общей изменчивости, остальная часть в основном была обусловлена различиями между точками времени у каждой из обезьян циномолгус, и незначительная часть (меньше 2%) была обусловлена вариацией источников анализа.
Вариабельность, наблюдаемая у всех обезьян циномолгус и у каждой обезьяны циномолгус, может быть связана с рядом факторов, включающих колебания физиологических состояний у обезьян циномолгус, клеточный состав крови, молекулярный состав клетки и точность функционального анализа.
Несмотря на наличие некоторых колебаний процентных показателей плазмоцитоидных дендритных клеток у каждого животного на протяжении времени % клеток pDC в крови не зависит от лечения с BIIB059 (см. RSch-2013-046) и не проявляет устойчивую корреляцию с продукцией ИФНа. Дополнительно, быстрая и устойчивая потеря BDCA2 с клеточной поверхности наблюдается на клетках pDC после в/в и п/к введения BIIB059, что предполагает высокий уровень занятости рецепторов (см. RSch-2013043). С учетом высокого уровня изменчивости в реактивности клеток pDC от обезьян циномолгус на TLR9-стимуляцию выявлена тенденция к смягчению ответов ИФНа после внутривенного и подкожного введения BIIB059, с наибольшим снижением в группе в/в введения 10 мг/кг, далее следует группа п/к введения 0,2 мг/кг, и затем группа в/в введения 1 мг/кг.
В заключение, BIIB059 при введении in vivo обезьянам циномолгус проявляют тенденцию к ингибированию TLR9-индуцированной продукции ИФН в анализах цельной крови ex vivo.
Другие варианты осуществления.
Несмотря на то что изобретение описано в комбинации с его подробным описанием, вышеизложенное описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

Claims (24)

1. Выделенное антитело, которое связывается с антигеном 2 дендритных клеток крови (BDCA2) человека (SEQ ID NO: 1), которое содержит:
(i) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий определяющие комплементарность области (CDR) VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, причем
VH-CDR1 содержит аминокислотную последовательность GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9);
VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10);
VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11);
(ii) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDR VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, причем
VL-CDR1 содержит аминокислотную последовательность KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5);
VL-CDR2 содержит аминокислотную последовательность AASTLES (SEQ ID NO: 6); и
VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7).
2. Антитело по п.1, в котором домен VH:
(i) по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24; или (ii) идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24.
3. Антитело по п.1 или 2, которое содержит тяжелую цепь, и тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
4. Антитело по любому из пп.1-3, в котором домен VL:
(i) по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23;
(ii) идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23.
5. Антитело п.1 или 4, которое содержит легкую цепь, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
6. Антитело по п.1, в котором домен VH по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 и домен VL по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотной по
- 75 034757 следовательности SEQ ID NO: 23.
7. Антитело по п.1, в котором домен VH идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 и домен VL идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23.
8. Антитело по п.1, которое содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
9. Антитело по любому из пп.1-7, которое представляет собой:
(a) гуманизированное антитело;
(b) моноклональное антитело;
(c) химерное антитело;
(d) антитело, которое имеет константные области тяжелой цепи IgG1; или (e) антитело, которое имеет константные области тяжелой цепи IgG1 и константные области легкой цепи каппа человека.
10. Фармацевтическая композиция для лечения системной красной волчанки, содержащая антитело по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.
11. Фармацевтическая композиция по п.10, причем системная красная волчанка связана с волчаночным нефритом.
12. Фармацевтическая композиция по п.10, причем системная красная волчанка связана с дискоидной волчанкой.
13. Фармацевтическая композиция по любому из пп.10-12, которая дополнительно содержит противомалярийный агент.
14. Фармацевтическая композиция по п.13, причем противомалярийный агент представляет собой гидроксихлорохин.
15. Способ лечения системной красной волчанки у человека, нуждающегося в лечении, который включает введение человеку эффективного количества антитела по любому из пп.1-9.
16. Способ по п.15, причем системная красная волчанка связана с волчаночным нефритом.
17. Способ по п.15, причем системная красная волчанка связана с дискоидной волчанкой.
18. Способ по любому из пп.15-17, дополнительно включающий введение противомалярийного агента.
19. Способ по п.18, где противомалярийный агент представляет собой гидроксихлорохин.
20. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая:
(i) антитело по любому из пп.1-9;
(ii) вариабельную область тяжелой цепи антитела по п. 1 или 2;
(iii) вариабельную область легкой цепи антитела по п.1 или 4;
(iv) тяжелую цепь антитела по п.3; или (v) легкую цепь антитела по п.8.
21. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.20.
22. Выделенная клетка-хозяин, которая продуцирует антитело по любому из пп.1-9, содержащая вектор экспрессии по п.21.
23. Способ получения анти-BDCA2 антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.22 для экспрессии анти-BDCA2 антитела.
24. Способ по п.23, дополнительно включающий выделение анти-BDCA2 антитела.
EA201591113A 2012-12-10 2013-12-10 Антитела против антигена 2 дендритных клеток крови и их применение EA034757B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261735362P 2012-12-10 2012-12-10
US201361763270P 2013-02-11 2013-02-11
PCT/US2013/074208 WO2014093396A1 (en) 2012-12-10 2013-12-10 Anti-blood dendritic cell antigen 2 antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591113A1 EA201591113A1 (ru) 2015-09-30
EA034757B1 true EA034757B1 (ru) 2020-03-17

Family

ID=49883267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591113A EA034757B1 (ru) 2012-12-10 2013-12-10 Антитела против антигена 2 дендритных клеток крови и их применение

Country Status (25)

Country Link
US (3) US9902775B2 (ru)
EP (2) EP3686218A1 (ru)
JP (4) JP6490591B2 (ru)
KR (2) KR20150094658A (ru)
CN (2) CN111961134B (ru)
AU (1) AU2013359419B2 (ru)
BR (1) BR122020023058B1 (ru)
CA (1) CA2893375A1 (ru)
CY (1) CY1122956T1 (ru)
DK (1) DK2928923T3 (ru)
EA (1) EA034757B1 (ru)
ES (1) ES2780398T3 (ru)
HR (1) HRP20200174T1 (ru)
HU (1) HUE047874T2 (ru)
IL (2) IL238804B (ru)
LT (1) LT2928923T (ru)
MX (1) MX363407B (ru)
NZ (1) NZ708033A (ru)
PL (1) PL2928923T3 (ru)
PT (1) PT2928923T (ru)
RS (1) RS60084B1 (ru)
SI (1) SI2928923T1 (ru)
SM (1) SMT202000193T1 (ru)
WO (1) WO2014093396A1 (ru)
ZA (1) ZA201503881B (ru)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2968561B1 (fr) † 2010-12-13 2013-08-09 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un anticorps dirige contre une proteine membranaire
WO2015095143A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Depletion of plasmacytoid dendritic cells
CN114292331A (zh) * 2013-12-24 2022-04-08 安斯泰来制药株式会社 抗人bdca-2抗体、其生产方法、多核苷酸、表达载体、宿主细胞及医药组合物
FR3034420A1 (fr) 2015-03-31 2016-10-07 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-cd303
FR3045386B1 (fr) 2015-12-16 2018-02-02 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Nouvelle utilisation d'un anticorps dirige contre une proteine membranaire
CN109475623B (zh) * 2016-04-28 2023-05-26 比奥根Ma公司 用于临床使用抗血树突细胞抗原2抗体的药物组合物和给药方案
CN110129300B (zh) * 2016-06-02 2021-08-03 天津科技大学 一种磷脂酶d
US11634495B2 (en) 2017-04-07 2023-04-25 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Methods of activating CD32b/c comprising administering an antibody that binds BDCA-2 (CD303)
EP3785029A1 (en) * 2018-04-27 2021-03-03 Advaxis, Inc. Compositions and methods for evaluating potency of listeria-based immunotherapeutics
KR102848349B1 (ko) * 2018-06-04 2025-08-21 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 감소된 효과기 기능을 갖는 항-ｖｌａ-4 항체
CA3118892A1 (en) * 2018-11-08 2020-05-14 Orionis Biosciences, Inc. Modulation of dendritic cell lineages
MX2022001604A (es) * 2019-08-05 2022-07-19 Capella Bioscience Ltd Anticuerpos anti bdca-2.
AU2021391803A1 (en) * 2020-12-03 2023-07-06 Biogen Ma Inc. Methods of treating cutaneous lupus erythematosus and systemic lupus erythematosus
EP4263609A1 (en) * 2020-12-17 2023-10-25 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-hla-g antibodies and use thereof
CN113484512B (zh) * 2021-06-01 2023-06-27 中国农业科学院油料作物研究所 黄曲霉毒素风险预警智能感知卡及其应用
TW202400652A (zh) * 2022-05-25 2024-01-01 大陸商映恩生物製藥（蘇州）有限公司 抗ｂｄｃａ２抗體及其用途
WO2024010118A1 (ko) * 2022-07-07 2024-01-11 주식회사 유틸렉스 항 bdca-2 항체 및 이의 용도
AU2023416592A1 (en) * 2022-12-28 2025-07-17 Duality Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Anti-bdca2 antibody-drug conjugate and use thereof
WO2024230774A1 (en) * 2023-05-10 2024-11-14 Inmagene Biopharmaceuticals (Hangzhou) Co., Ltd. Bdca2-targeting antibodies and uses thereof
CN119119267A (zh) * 2023-06-12 2024-12-13 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗bdca2抗体
WO2025051083A1 (zh) * 2023-09-05 2025-03-13 上海宏成药业有限公司 抗bdca-2特异性抗体及其用途
WO2025091023A1 (en) * 2023-10-27 2025-05-01 Northwestern University Engineered cell transfected by all-in-one vector for therapeutic agents production and delivery and applications thereof
CN120098124A (zh) * 2023-12-05 2025-06-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗bdca-2抗体及其制备方法和应用
CN118667008A (zh) * 2024-05-24 2024-09-20 深圳科兴药业有限公司 靶向bdca2的抗体或其抗原结合片段及其应用
CN118638234B (zh) * 2024-07-04 2025-10-14 杭州博之锐生物制药有限公司 抗bdca2抗体及其制备方法和应用
WO2026008012A1 (zh) * 2024-07-04 2026-01-08 杭州博之锐生物制药有限公司 抗bdca2抗体及其用途
CN119591712B (zh) * 2024-11-27 2025-11-21 纽迈生物科技(苏州)有限公司 靶向人类浆细胞样树突状细胞的单克隆抗体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001036487A2 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Miltenyi Biotec Inc. Antigen-binding fragments specific for dendritic cells, compositions and methods of use thereof antigens recognized thereby and cells obtained thereby

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US5156840A (en) 1982-03-09 1992-10-20 Cytogen Corporation Amine-containing porphyrin derivatives
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP1541682A3 (en) 1988-09-02 2005-07-06 Dyax Corp. Generation and selection of recombinant varied binding proteins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5370901A (en) 1991-02-15 1994-12-06 Bracco International B.V. Compositions for increasing the image contrast in diagnostic investigations of the digestive tract of patients
DE69233769D1 (de) 1991-03-01 2009-09-24 Dyax Corp Chimäres Protein mit Mikroprotein mit zwei oder mehr Disulfidbindungen und Ausgestaltungen davon
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
SE9201984D0 (sv) 1992-06-29 1992-06-29 Pharmacia Biosensor Ab Improvement in optical assays
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6201671B1 (en) 1998-12-04 2001-03-13 International Business Machines Corporation Seed layer for a nickel oxide pinning layer for increasing the magnetoresistance of a spin valve sensor
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US7030228B1 (en) * 1999-11-15 2006-04-18 Miltenyi Biotec Gmbh Antigen-binding fragments specific for dendritic cells, compositions and methods of use thereof antigens recognized thereby and cells obtained thereby
US20070148171A1 (en) 2002-09-27 2007-06-28 Xencor, Inc. Optimized anti-CD30 antibodies
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
AU2003254019A1 (en) * 2002-07-18 2004-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods to select dendritic cells from a heterogeneous cell population
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20050008625A1 (en) 2003-02-13 2005-01-13 Kalobios, Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
CA2515481A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Biogen Idec Ma Inc. An expression cassette and vector for transient or stable expression of exogenous molecules
KR20120090094A (ko) 2003-06-13 2012-08-16 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 아글리코실 항-ｃｄ154(ｃｄ40 리간드) 항체 및 이의 용도
NZ545776A (en) 2003-08-22 2009-05-31 Biogen Idec Inc Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
US20060134105A1 (en) 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
WO2005035557A2 (en) * 2003-10-14 2005-04-21 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth, Near Dublin Adenylate cyclase in the treatment and/or prophylaxis of immune-medicated disease
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
US7276585B2 (en) 2004-03-24 2007-10-02 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
CN101001872A (zh) * 2004-04-16 2007-07-18 宏观基因有限公司 FcγRIIB－特异性抗体及其使用方法
CA2566473A1 (en) * 2004-05-17 2005-12-08 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Uses of bispecific antibody (biab) coated dendritic cells pulsed with antigens
ES2426817T3 (es) 2004-08-04 2013-10-25 Mentrik Biotech, Llc Regiones Fc variantes
CA2618681C (en) 2005-08-10 2015-10-27 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant fc regions and methods of using same
JP2010519313A (ja) * 2007-02-23 2010-06-03 ベイラー リサーチ インスティテュート Ｃｌｅｃ−６を介したヒト抗原提示細胞の活性化
US8282964B2 (en) * 2007-10-27 2012-10-09 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Ex-vivo treatment of peripheral plasmacytoid dendritic cells with IFN-lambda
ES2458541T5 (en) 2008-05-02 2025-08-04 Seagen Inc Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
KR20110096536A (ko) * 2008-10-31 2011-08-30 애보트 바이오테라퓨틱스 코포레이션 희귀 림프종의 치료를 위한 항ｃｓ1 항체의 용도
AR075989A1 (es) 2009-04-10 2011-05-11 Lilly Co Eli Anticuerpo dkk -1 (dickkopf-1) humano disenado por ingenieria
TWI412375B (zh) 2009-08-28 2013-10-21 Roche Glycart Ag 人類化抗ｃｄｃｐ１抗體
FR2968561B1 (fr) * 2010-12-13 2013-08-09 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un anticorps dirige contre une proteine membranaire

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001036487A2 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Miltenyi Biotec Inc. Antigen-binding fragments specific for dendritic cells, compositions and methods of use thereof antigens recognized thereby and cells obtained thereby

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOMBERG S. ET AL: "Expression of the markers BDCA-2 and BDCA-4 and production of interferon-alpha by plasmacytoid dendritic cells in systemic lupus erythematosus.", ARTHRITIS & RHEUMATISM, WILEY INTERSCIENCE, US, vol. 48, no. 9, 1 September 2003 (2003-09-01), US, pages 2524 - 32, XP002991721, ISSN: 0004-3591, DOI: 10.1002/art.11225 *
DZIONEK A, ET AL.: "BDCA-2, BDCA-3, AND BDCA-4: THREE MARKERS FOR DISTINCT SUBSETS OF DENDRITIC CELLS IN HUMAN PERIPHERAL BLOOD", IMMUNOLOGY, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD., GB, vol. 165, no. 11, 1 December 2000 (2000-12-01), GB, pages 6037 - 6046, XP000986292, ISSN: 0019-2805 *
DZIONEK A, ET AL: "BDCA-2, a novel plasmacytoid dendritic cell-specific type II C-type lectin, mediates antigen capture and is a potent inhibitor of interferon alpha/beta induction", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US, vol. 194, no. 12, 17 December 2001 (2001-12-17), US, pages 1823 - 1834, XP002277387, ISSN: 0022-1007, DOI: 10.1084/jem.194.12.1823 *
JAHN, P.S. ; ZANKER, K.S. ; SCHMITZ, J. ; DZIONEK, A.: "BDCA-2 signaling inhibits TLR-9-agonist-induced plasmacytoid dendritic cell activation and antigen presentation", CELLULAR IMMUNOLOGY., ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, CA., US, vol. 265, no. 1, 1 January 2010 (2010-01-01), US, pages 15 - 22, XP027236570, ISSN: 0008-8749 *
NESTLE F.O., ET AL: "Plasmocytoid predendritic cells initiate psoriasis through interferon-alpha production", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US, vol. 202, no. 1, 4 July 2005 (2005-07-04), US, pages 135 - 143, XP002364226, ISSN: 0022-1007, DOI: 10.1084/jem.20050500 *
RIBOLDI, E. ; DANIELE, R. ; CASSATELLA, M.A. ; SOZZANI, S. ; BOSISIO, D.: "Engagement of BDCA-2 blocks TRAIL-mediated cytotoxic activity of plasmacytoid dendritic cells", IMMUNOBIOLOGY, URBAN UND FISCHER VERLAG, DE, vol. 214, no. 9-10, 1 September 2009 (2009-09-01), DE, pages 868 - 876, XP026467210, ISSN: 0171-2985, DOI: 10.1016/j.imbio.2009.06.016 *
WEI CAO, LI ZHANG, DAVID B. ROSEN, LAURA BOVER, GOKURAN WATANABE, MUSHENG BAO, LEWIS L. LANIER, YONG-JUN LIU: "BDCA2/FcɛRIγ Complex Signals through a Novel BCR-Like Pathway in Human Plasmacytoid Dendritic Cells", PLOS BIOLOGY, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, vol. 100, no. 10, 1 January 2007 (2007-01-01), pages 183, XP055105679, ISSN: 10916490, DOI: 1091-6490(2003)100[0183:IHIIHT]2.0.CO;2 *
WU, P. ; WU, J. ; LIU, S. ; HAN, X. ; LU, J. ; SHI, Y. ; WANG, J. ; LU, L. ; CAO, X.: "TLR9/TLR7-triggered downregulation of BDCA2 expression on human plasmacytoid dendritic cells from healthy individuals and lupus patients", CLINICAL IMMUNOLOGY, ACADEMIC PRESS,, US, vol. 129, no. 1, 1 October 2008 (2008-10-01), US, pages 40 - 48, XP025408487, ISSN: 1521-6616, DOI: 10.1016/j.clim.2008.06.004 *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201503881B (en) 2018-11-28
WO2014093396A1 (en) 2014-06-19
CN105452295B (zh) 2020-06-12
PL2928923T3 (pl) 2020-11-16
JP2021130677A (ja) 2021-09-09
JP2019146567A (ja) 2019-09-05
US9902775B2 (en) 2018-02-27
BR112015012942A2 (pt) 2017-09-12
KR20150094658A (ko) 2015-08-19
DK2928923T3 (da) 2020-02-17
RS60084B1 (sr) 2020-05-29
MX2015007034A (es) 2016-02-11
PT2928923T (pt) 2020-03-27
KR20200130468A (ko) 2020-11-18
IL238804A0 (en) 2015-06-30
NZ708033A (en) 2020-03-27
HK1216027A1 (en) 2016-10-07
EP2928923A1 (en) 2015-10-14
US20250304700A1 (en) 2025-10-02
IL238804B (en) 2021-08-31
HRP20200174T1 (hr) 2020-05-29
SI2928923T1 (sl) 2020-03-31
CA2893375A1 (en) 2014-06-19
KR102344907B1 (ko) 2021-12-28
AU2013359419B2 (en) 2018-03-15
CN111961134B (zh) 2024-04-05
US20180362652A1 (en) 2018-12-20
AU2013359419A1 (en) 2015-06-04
JP2024045253A (ja) 2024-04-02
BR122020023058B1 (pt) 2023-12-05
EP3686218A1 (en) 2020-07-29
ES2780398T3 (es) 2020-08-25
EP2928923B1 (en) 2020-01-22
HUE047874T2 (hu) 2020-05-28
LT2928923T (lt) 2020-02-25
US20150299325A1 (en) 2015-10-22
EA201591113A1 (ru) 2015-09-30
JP2016505556A (ja) 2016-02-25
JP6889741B2 (ja) 2021-06-18
CN111961134A (zh) 2020-11-20
CN105452295A (zh) 2016-03-30
JP6490591B2 (ja) 2019-03-27
MX363407B (es) 2019-03-22
CY1122956T1 (el) 2021-10-29
IL285475A (en) 2021-09-30
SMT202000193T1 (it) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250304700A1 (en) Anti-blood dendritic cell antigen 2 antibodies and uses thereof
US9751942B2 (en) Anti-LAMP5 antibody and utilization thereof
KR20150128796A (ko) 항-알파 v 베타 5개 항체를 이용한 급성 신장 손상의 치료 및 예방
US20230007977A1 (en) Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof
CA2959772A1 (en) Humanized anti-alpha v beta 5 antibodies and uses thereof
HK40031865A (en) Anti-blood dendritic cell antigen 2 antibodies and uses thereof
US20230406961A1 (en) Target-cell restricted, costimulatory, bispecific and bivalent anti-cd28 antibodies
HK1216027B (en) Anti-blood dendritic cell antigen 2 antibodies and uses thereof
BR112015012942B1 (pt) Anticorpos isolados, fragmentos de ligação a antígenos isolados, seus usos, célula isolada, e composição farmacêutica