CN114981435A

CN114981435A - 用于治疗癌症的抗癌免疫治疗组合物

Info

Publication number: CN114981435A
Application number: CN202080093196.7A
Authority: CN
Inventors: 李仲桓; 李钟旭; 金镇羽
Original assignee: Interoligo Corp
Current assignee: Interoligo Corp
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2022-08-30
Also published as: JP2023509902A; WO2021132936A1; EP4083210A1; US20230055235A1; AU2020414184A1; KR20210084278A

Abstract

本发明涉及一种适体或其功能性片段，所述适体或其功能性片段包含SEQID NO:1、2、10或18的核酸序列，并且可以与PD‑L1特异性结合或者可以通过与PD‑L1特异性结合来抑制PD‑1与PD‑L1之间的相互作用。

Description

用于治疗癌症的抗癌免疫治疗组合物

技术领域

本发明涉及一种包含适体的免疫治疗组合物。

背景技术

癌症被认为是全世界主要的死亡原因之一。虽然通常使用手术切除和常规化疗，但是手术具有高复发率和副作用，而化疗涉及需要解决的临床问题。因此，需要开发新的用于治疗癌症患者的方法和手段，以增加患者的存活时间。

免疫化疗是最近备受关注的一种新的抗癌治疗方法，并且是一种激活人体免疫系统，使得免疫细胞攻击癌细胞以获得抗癌作用的疗法。目前，被批准在市场上可用的免疫抗癌治疗剂(“免疫化学治疗剂”)主要是免疫检查点抑制剂。T细胞作为人体免疫细胞之一，在癌细胞表面上表达的肿瘤特异性抗原的作用下被激活，并且具有识别、攻击和杀伤癌细胞的作用。癌细胞使用各种免疫检查点蛋白作为逃避这种T细胞攻击的机制。例如，癌细胞中表达的程序性死亡配体1(PD-L1)蛋白与T细胞中表达的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合，并且传递抑制信号以使T细胞失活，从而避免T细胞的攻击。免疫检查点抑制剂通过使用阻断各种类型的免疫检查点蛋白之间结合的方法抑制癌细胞的免疫逃避机制来激活T细胞，从而去除癌细胞。目前使用的免疫检查点抑制剂的靶包括CTLA-4、PD-1、PD-L1等，并且抑制以上抑制剂的信号转导的基于抗体的抗癌药物，诸如Yervoy、Optivo、Thycentric等，属于以上类别(Ott等人(2013)Clin Cancer Res.19:5300-5309)。

生物标记物是指客观上可用于区分包括癌症在内的疾病的病理状态或进展或预测治疗应答的蛋白质、DNA、RNA或代谢物。具体地，能够区分对于特定药物的应答者和非应答者并监测治疗作用的生物标记物的开发或诊断已成为将现在正在开发的新抗癌药物的成功或失败分开的一个非常重要的因素。这是因为预测患者的治疗作用已经成为一个非常重要的因素，不仅在科学方面，新的抗癌药物使用攻击癌症中的特定分子和生物学变化的方法，而且在经济方面，因为与现有的化疗相比药物价格过高。

在一些免疫检查点抑制剂的情况下，需要使用癌症患者的活组织通过免疫学方法进行检查癌症组织中靶蛋白的表达的伴随诊断。但是，已经指出了以上蛋白质的表达与其治疗作用之间的相关性不明确的问题。这可能是由于不同的原因，诸如用于伴随诊断的免疫学方法的敏感性和生物标记物的有效性。因此，对各种高灵敏度诊断方法的开发进行了大量研究，但尚未发现明显的结果(Havel等人(2019)Nat Rev Cancer 19:133-150)。

适体是具有单链寡核苷酸序列的分子，可以通过分子中的氢键具有特定三维结构，并且因此可以通过三维空间结构与靶标特异性结合。因为适体是靶特异性的，所以一些适体可以抑制靶物质的功能。此外，适体与靶结合，从而阻断细胞内信号转导途径。因此，适体作为用于特异性抑制靶的核酸药物已受到关注。

可以通过指数富集的配体系统进化(SELEX)来选择适体。适体可以通过形成特定三维结构与靶结合，并且具有高亲和力、高特异性和易合成性，以及无免疫原性或很少免疫原性的优点。因为一些适体不仅可以与靶物质结合，而且还抑制靶物质的功能，所以在疾病治疗方面可能存在各种应用。迄今为止，FDA已批准了培加他尼钠(pegaptanib sodium)作为年龄相关性黄斑变性的治疗剂，培加他尼钠是一种与VEGF特异性结合的核酸适体。此外，在肿瘤治疗领域，靶向VEGF、PDGF、核仁素等的适体已进入临床试验，用于癌症治疗的目的(Dunn等人(2017)Nat Rev Chem 1:76，Ng等人(2006)Nat Rev Drug Discovery 5:123-132)。

发明内容

[待本发明解决的问题]

本发明的一个目的是提供一种用于用免疫疗法治疗癌症的适体。

本发明的另一个目的是提供一种能够检测癌细胞的适体。

[用于解决问题的手段]

1.一种适体或其功能性片段，所述适体或其功能性片段能够与程序化死亡配体1(PD-L1)特异性结合或能够通过与PD-L1特异性结合来抑制程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)与PD-L1之间的相互作用，所述适体或其功能性片段包含SEQ ID NO:1、2、10或18的核酸序列。

2.根据条款1所述的适体或其功能性片段，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3至9和11至17中的任一个。

3.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含一种或多种适体或其功能性片段，所述适体或其功能性片段包含选自由SEQ ID NO:1、2、10和18组成的组的核酸序列。

4.根据条款3所述的药物组合物，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3至9和11至17中的任一个。

5.根据条款3所述的药物组合物，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3、4、5、6、7、9、11、12、14或16。

6.根据条款3所述的药物组合物，其中所述癌症是其中PD-L1过表达的癌症。

7.根据条款3所述的药物组合物，其中所述癌症是前列腺癌、胆囊癌、肝内胆道癌、胆道癌、口腔癌、咽癌、喉癌、舌癌、十二指肠癌、眼部肿瘤、纵隔癌、鼻窦癌(sinus cancer)、肾盂癌(renal pelvic cancer)、心脏癌(heart cancer)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期癌症、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌(renal pelvic carcinoma)、中枢神经系统(CNS)癌、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫大细胞淋巴瘤、祖代B淋巴母细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、蕈样肉芽肿、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、肝母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、腹膜癌、脑瘤、胸腺癌、T细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞性淋巴瘤。

8.根据条款3所述的药物组合物，其中小分子、核酸、蛋白质和放射性同位素中的至少一种与所述适体或其功能性片段中的5'-末端、3'-末端或其两者结合。

9.一种用于检测癌细胞的组合物，其包含至少一种适体或其功能性片段，所述适体或其功能性片段包含选自由SEQ ID NO:1、2、10和18组成的组的核酸序列。

10.根据条款9所述的用于检测的组合物，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3至9和11至17中的任一个。

11.根据条款9所述的组合物，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3、4、5、6、7、9、11、12、14或16。

12.根据条款9所述的组合物，其中所述癌细胞是其中PD-L1过表达的细胞。

13.根据条款9所述的组合物，其中所述癌症是前列腺癌、胆囊癌、肝内胆道癌、胆道癌、口腔癌、咽癌、喉癌、舌癌、十二指肠癌、眼部肿瘤、纵隔癌、鼻窦癌、肾盂癌、心脏癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期癌症、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)癌、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫大细胞淋巴瘤、祖代B淋巴母细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、蕈样肉芽肿、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、肝母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、腹膜癌、脑瘤、胸腺癌、T细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞性淋巴瘤。

14.根据条款9所述的组合物，其中荧光标记、拉曼散射标记、酶标记、红外标记和放射性标记中的至少一种与所述适体或其功能性片段中的5'-末端、3'-末端或其两者结合。

[有利作用]

包含根据本发明的适体的组合物可以治疗癌症、减轻癌症症状或预防癌症。

包含根据本发明的适体的组合物可以检测癌细胞，特别是其中PD-L1过表达的癌细胞。

附图说明

图1示出了根据本发明的一个实施方案测量适体与靶蛋白的结合力的结果。

图2示出了根据本发明的一个实施方案确认适体的PD-1/PD-L1结合抑制活性和抗PD-L1抗体的PD-1/PD-L1结合抑制活性的结果。

图3示出了根据本发明的一个实施方案确认适体的PD-1/PD-L1结合抑制活性的结果。

图4示出了根据本发明的另一个实施方案确认适体的PD-1/PD-L1结合抑制活性的结果。

图5示出了根据本发明的一个实施方案确认适体的PD-1/PD-L1结合抑制活性和抗PD-L1抗体的PD-1/PD-L1结合抑制活性的结果。

图6示出了根据本发明的另一个实施方案的适体的PD-1/PD-L1结合抑制活性和抗PD-L1抗体的PD-1/PD-L1结合抑制活性。

具体实施方式

在下文中，将参考附图更全面地描述本发明，其中仅示出了本发明的一些实施方案，而不是全部实施方案。实际上，本发明可以按照许多不同形式加以实施，并且不应被解释为只局限于本文所阐述的实施方案。如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非另外明确指示，否则单数表达也包括复数表达。

适体是单链寡核苷酸(ssDNA、RNA、修饰的DNA或修饰的RNA)。这种适体具有特定三维结构，并且对靶物质表现出高结合力和高特异性。虽然这些特征与由蛋白质构成的抗体的那些功能相似，但据报道，与抗体相比，适体在施用于身体时表现出较低的免疫原性。此外，与生物产生的抗体不同，化学合成的适体易于在体外进行修饰，并且使生产批次之间的差异最小化，这反过来与抗体相比有利于药物开发和大规模生产。另一方面，因为适体比抗体具有更高的稳定性，所以它们在制造产品过程中具有易于保存的优点。

因为这种适体与靶特异性结合，所以一些适体可以通过与靶物质结合来抑制靶物质的功能或阻断细胞的信号转导。具体地，在肿瘤治疗中，靶向VEGF、PDGF或核仁素的适体被纳入临床研究管线，这反映了核酸适体在肿瘤疗法中的期望。

具体地，根据本发明的适体可以包含SEQ ID NO:1、2、10或18的核酸序列，其可以与程序性死亡配体1(PD-L1)特异性结合或可以与PD-L1特异性结合并抑制程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)与PD-L1之间的相互作用，并且可以是SEQ ID NO:1、2、10或18的功能性片段。

在本发明中，功能性片段是指其中适体亲本与靶物质的结合能力被增强或维持的片段，或其中实质上具有与靶物质的结合能力的5'-末端和/或3'-末端部分缺失的片段。例如，当存在与PD-L1结合并且具有74mer、73mer至20mer长度的适体亲本时，5'-末端和/或3'-末端缺失并具有与PD-L1的结合能力的适体被称为功能性片段。

可以通过常规筛选方法、即指数富集的配体系统进化(SELEX)来选择适体。虽然SELEX方法是核酸适体的筛选方法，但在实践中筛选有用的适体在本领域中仍然存在困难，并且有效治疗特定癌症的商业上可获得的基于适体的药物尚未获批上市。

以下将描述用于筛选适体的典型SELEX方法。然而，本领域技术人员可以基于本领域已知的知识和技术来添加、修改或删除每个步骤并使用它们。

制备单链DNA文库，使得40至60个连续随机序列通常位于单链DNA的中心部分中，并且生物素可以与5'-末端结合。通过将其与非靶标结合来制备阴性选择。更具体地，可以通过将单链DNA文库置于其中包含非靶标的反应槽中来将单链DNA文库与非靶标混合。此时，非靶标可以是例如血浆中丰富的蛋白质，但不限于此。可以使用具有与在非肿瘤组织中表达的靶蛋白相似结构的蛋白质。在单链文库与非靶标之间的结合反应过程中，结合了对非靶标具有特异性的单链DNA文库的单链DNA序列。在此实施方案中，结合反应进行例如1分钟至60分钟或约30分钟。

此后，将非靶标固定在磁珠上以分离不与非靶标结合的单链DNA序列。更具体地，通过洗涤制备的能够结合组氨酸标签的磁珠与非靶蛋白和单链DNA文库的混合物反应。结合反应进行例如1分钟至60分钟或约15分钟。不与非靶蛋白结合的单链DNA序列可以通过将上清液分离来分离，因为它们保持不与磁珠结合。

通过将不与非靶标结合(“不与非靶标结合”)的单链DNA与靶标结合来进行阳性选择。更具体地，将不与非靶蛋白质结合的单链DNA序列置于含有靶蛋白的反应槽中，接着将其混合。在单链DNA序列与靶蛋白反应过程中，对靶蛋白具有特异性的单链DNA序列与靶蛋白结合。在此实施方案中，结合反应进行例如1分钟至60分钟或约30分钟。

此后，洗涤固定在磁珠上的靶标以去除对靶标具有低结合亲和力或不与靶标结合的单链DNA序列。更具体地，将磁珠添加到诱导靶蛋白与单链DNA序列结合的混合物中，接着使用靶蛋白的标签将靶蛋白固定到磁珠上。将洗涤缓冲液注入反应槽中以洗涤固定有靶蛋白的磁珠。在洗涤步骤过程中，可以去除不与靶蛋白结合的单链DNA序列，因为与靶蛋白结合的单链DNA序列仍然保持与磁珠结合。在一个实施方案中，洗涤步骤可以根据需要进行一次或多次。

通过加热与单链DNA序列结合的靶标或通过用氢氧化钠溶液处理来分离单链DNA序列。在一个实施方案中，加热温度可以是例如92℃、95℃或98℃，但不限于此。氢氧化钠处理中的浓度可以选自1mM与30mM之间的浓度。因为分离的单链DNA序列对靶蛋白具有特异性，所以它可以被称为对靶蛋白具有特异性的适体。

将分离的单链DNA序列经受扩增。在一个实施方案中，用于扩增分离的单链DNA的方法可以是例如PCR，其可以使用分离的单链DNA序列作为模板并使用5'-引物或3'-引物来进行。

在一个实施方案中，可以多次选择通过以上方法获得的PCR产物。更具体地，将获得的PCR产物用作单链DNA文库用于下一步的选择，并且重复以上步骤以选择对靶蛋白具有更高特异性的单链DNA序列。将选择过程重复数次之后，将获得的PCR产物经受克隆，接着进行DNA序列分析，以便获取对靶蛋白具有高特异性的适体。

以下将描述根据本发明的另一个实施方案的SELEX方法。然而，本领域技术人员可以基于本领域已知的知识和技术来添加、修改或删除方法的每个步骤并且然后使用它们。

制备单链DNA文库，使得40至60个连续随机序列可以定位在单链DNA的中心。通过将文库与非靶患病组织切片结合来进行阴性选择。更具体地，通过将单链DNA文库置于其中包含非靶患病组织切片的反应槽中来将单链DNA文库与非靶患病组织切片混合。在这种情况下，非靶患病组织切片可以是例如正常组织切片，但不限于此。非肿瘤组织切片也能够用作非靶患病组织切片。在单链文库与非靶患病组织切片之间的结合反应过程中，对非靶患病组织切片具有特异性的单链DNA文库的单链DNA序列可以与非靶患病组织切片结合。在此实施方案中，结合反应进行例如1分钟至60分钟或约30分钟。

此后，洗涤非靶患病组织切片以分离不与非靶患病组织切片结合的单链DNA序列。更具体地，将洗涤缓冲液注入反应槽中以洗涤非靶患病组织切片。在洗涤步骤过程中，可以分离不与非靶患病组织切片结合的单链DNA序列，因为与非靶患病组织切片结合的单链DNA序列仍然保持与非靶患病组织切片结合。

通过将不与非靶患病组织切片结合的单链DNA与靶患病组织组合来进行阳性选择。更具体地，将不与非靶患病组织切片结合的单链DNA序列引入包含靶患病组织切片的反应槽中，接着将不与非靶患病组织切片结合的单链DNA序列与靶患病组织切片结合。在单链DNA序列与靶患病组织切片的反应过程中，对靶患病组织切片具有特异性的单链DNA序列可以与靶患病组织切片结合。在此实施方案中，结合反应进行例如1分钟至60分钟或约30分钟。

此后，洗涤靶患病组织切片以去除对靶患病组织切片具有低结合亲和力或不与靶患病组织切片结合的单链DNA序列。更具体地，将洗涤缓冲液注入反应槽中以洗涤靶患病组织切片。在洗涤步骤过程中，可以去除不与靶患病组织切片结合的单链DNA序列，因为与靶患病组织切片结合的单链DNA序列仍然保持与靶患病组织切片结合。在一个实施方案中，洗涤步骤可以根据需要进行一次或多次。

通过加热与单链DNA序列结合的靶患病组织切片，单链DNA序列被分离。在一个实施方案中，加热温度可以是例如92℃、95℃或98℃，但不限于此。因为分离的单链DNA序列对靶患病组织切片具有特异性，所以它可以被称为对靶疾病具有特异性的适体。

如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指磷酸酯或其任何磷酸酯类似物或衍生物、诸如以下的硫代磷酸酯和硫代酯的聚合形式：核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)；或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸腺嘧啶、脱氧胞苷或核酸衍生物；“DNA分子”)，呈单链形式或双链螺旋。在本文中，核酸衍生物可以是5-(N-苄基甲酰胺)-2’脱氧尿苷(Bz-dU)或5-(N-(1-萘基甲基)甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(Nap-dU)，并且可以是本领域已知的或具有在其中适体活性不被抑制的范围内的通过本领域技术人员修饰的形式。术语“核酸分子”和具体地DNA或RNA分子仅是指分子的一级和二级结构，并且不限于任何特定三级形式。因此，所述术语尤其包括线形或环状DNA分子(例如，限制性酶片段)、质粒、超螺旋DNA和作为染色体所见的双链DNA。当讨论特定双链DNA分子的结构时，本文中的序列可以根据仅在5'至3’方向上沿未转录的DNA链(即，具有与mRNA匹配的序列的链)呈现序列的一般方案进行描述。

寡核苷酸可以用例如诸如生物素或Cy3的标记与其共价连接的生物素-核苷酸或Cy3-核苷酸标记。标记的寡核苷酸可以用作探针以检测靶标的存在。寡核苷酸(其中的一种或全部可以被标记)可以用作PCR引物，用于克隆全长核酸或其片段、用于DNA测序或检测核酸的存在。寡核苷酸也可以用于与DNA分子形成三螺旋。一般而言，寡核苷酸是合成制备的，并且优选在核酸合成仪中制备。因此，可以使用非天然存在的磷酸酯类似物键，诸如硫酯键来制备寡核苷酸。

如本文所用，术语“抗癌”和“癌症预防或治疗”包括预防或治疗癌症的任何作用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”意指通过施用本发明的适体改善或有益地改变癌症症状的任何作用，并且术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指减少动物中一种或多种疾病的发生。以上所述的预防可以是完全的，例如，可以在受试者中实现症状完全不存在。预防也可以是部分的，使得受试者中症状的发生少于没有本发明时可能出现的症状发生。

如本文所用，术语“聚合酶链式反应”缩写为“PCR”，并且是指用于酶促扩增特定核酸序列的体外方法。PCR可以包括一系列重复的温度循环，每个循环由三个步骤组成：模板核酸变性以将靶分子的链分离；退火以将单链PCR寡核苷酸引物与模板核酸结合；和通过DNA聚合酶延伸结合的引物。PCR提供用于检测靶分子的存在的手段和用于确定在定量或半定量条件下可用的核酸中靶分子的相对量的手段。

本发明涉及一种药物组合物，其包含有效量的一种或多种与PD-L1特异性结合的适体，并且任选地与药学上可接受的载体、赋形剂或添加剂组合。

本发明的药物组合物中包含的适体或其功能性片段可以进一步在5'-末端、3'-末端或其两者处与小分子、核酸、蛋白质和放射性同位素中的至少一种结合。

小分子、核酸、蛋白质和放射性同位素可以直接与适体或其功能性片段中的5'-末端、3'-末端或其两者结合，或者可以通过接头结合。

基于适体或其功能性片段与靶标的特异性结合，小分子、核酸、蛋白质和放射性同位素中的至少一种与其结合的适体或其功能性片段可以表现出癌症治疗作用。

例如，基于适体或其功能性片段与PD-L1的特异性结合，小分子、核酸、蛋白质和放射性同位素与其结合的适体或其功能性片段可以表现出对于其中PD-L1过表达的癌症的治疗作用。

可以与适体或其功能性片段结合的小分子、核酸、蛋白质和放射性同位素不受限制，只要它们通过与适体或其功能性片段结合而表现出优异的癌症治疗作用即可。

可以与适体或其功能性片段结合的小分子、核酸、蛋白质和放射性同位素可以是用于治疗其中PD-L1过表达的癌症的已知物质。

作为小分子，可以使用抗癌药物技术领域中常用的那些。例如，小分子可以选自紫杉醇、一甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(MMAF)、阿糖胞苷、吉西他滨、美登素、美登素(mertansine)、卡奇霉素(calicheamicin)、多柔比星、倍癌霉素、吡咯并苯二氮卓(PBD)、7-乙基-10-羟基-喜树碱、微管溶素类似物(tubulysinanalog)、5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶、放线菌素D及其衍生物，但不限于此。

核酸可以选自例如mRNA、siRNA、shRNA、miRNA和其他适体。

蛋白质可以选自例如治疗性抗体或其片段，诸如阿仑单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗。

放射性同位素可以选自例如³²P、⁶⁷Cu、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、^99mTc、⁹⁹MO、¹¹¹In、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁸Au、²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra和²²⁵Ac，但是它们不限于此。

当与其他活性成分组合使用时，根据本发明的药物组合物可以单独配制以便同时或按时间间隔施用，或者可以配制为单一组合物。

本发明的组合物可以每天一次、每天两次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每7天一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每2个月一次、每6个月一次或每年一次施用，但给药间隔可根据患者需要调整。对于更长的给药间隔，可以使用缓释制剂。

本发明的组合物可以用于治疗癌症。在本发明的一个实施方案中，根据本发明的组合物可以施用超过2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年或15年的时间段。此外，在一个实施方案中，本发明的组合物可以在患者的一生中施用。在本发明的一个实施方案中，可以通过监测患者疾病的进展来适当地调整组合物的剂量。本领域技术人员将能够基于有待治疗的患者的状况或严重程度、有待应用的方案、有待使用的药物的药代动力学特征以及接受本发明的组合物的患者来确定组合物的药学有效量。

可以进行切除手术操作以去除肿瘤，并且本发明的组合物可以在切除之前或之后施用。在一些实施方案中，根据本发明的组合物可以在切除之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周或更长的时间段之前施用；或在切除之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15周或更长的时间段之后施用。

本发明的药物组合物可以以各种剂型施用。在本发明的一个实施方案中，包含本发明的适体的药物组合物可以配制成适用于口服、直肠、肠胃外、鼻腔或经皮施用，或通过吸入或栓剂施用的形式。

施用方法不特别限定于此，但是可以使用任何口服或肠胃外施用方法，或者全身施用或局部施用也是可能的。然而，全身施用是更优选的，并且肠胃外施用是最优选的。向患者体内施用优选是静脉内的。

本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法来配制。例如，如果需要，它可以以用水或其他药学上可接受的液体制成的无菌溶液的形式或悬浮液的注射形式肠胃外使用。例如，在与药学上可接受的载体或介质，特别是无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂等的希望组合中，通常，组合物可以混合并配制成在制药工业实践领域普遍认可的制药实践所需的单位剂型。在以上制剂中，有效量的活性成分是在指定的范围内可以获得适当剂量的有效量。

此外，注射用无菌组合物可以根据常规制剂实践使用赋形剂诸如注射用蒸馏水来开处方。注射用水溶液的实例可以包括生理盐水、含有葡萄糖和其他佐剂诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的等渗溶液。因此，以上水性注射溶液可以与合适的溶解助剂组合使用，例如醇，特别是乙醇、多元醇诸如丙二醇、聚乙二醇，非离子表面活性剂诸如聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50等。油性液体的实例可以包括芝麻油和大豆油，并且可以与苯甲酸苄酯和苯甲醇组合使用作为溶解助剂。

注射制剂可以通过例如静脉内注射、动脉内注射、选择性动脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射、瘤内注射、心室内注射、脑内注射、髓内注射等施用，但优选使用静脉内注射。

此外，本发明的组合物还可以与缓冲液诸如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液、安抚剂诸如盐酸普鲁卡因、稳定剂诸如苯甲醇或苯酚和/或抗氧化剂组合。所制备的注射溶液通常填充在适当的安瓿中。

悬浮液和乳液可以含有例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为载体。用于肌肉内注射的悬浮液或溶液可以与活性化合物一起包含药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇诸如丙二醇，以及如果需要的话，合适量的盐酸利多卡因。

根据本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是在施用本发明的适体时使用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类载体已获得国家监管机构的批准或在众所周知的药典中列出，可用于动物，更具体地，用于人类。如上所述的药物载体可以呈液体形式，诸如水或油，其中油包括石油、动物、植物或合成衍生的油，具体地，对应于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药学上可接受的载体包括盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。当施用于患者时，本发明的化合物和药学上可接受的载体优选是无菌的。盐溶液、液体右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用作可注射溶液。合适的药物载体还可以含有添加剂，诸如葡萄糖、乳糖、蔗糖、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、乙二醇、水和乙醇。本发明的组合物可以根据需要含有少量的润湿剂、乳化剂和/或pH缓冲剂。本发明的组合物可以具有溶液、乳液、缓释制剂或其他适合使用的制剂形式。

根据本发明的活性成分可以包含在药学上可接受的载体或稀释剂中，其量足以将药学有效量递送至患者，以便在治疗靶疾病时不引起副作用或严重毒性。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。这些可以呈明胶胶囊或压缩片剂的形式。对于口服治疗施用，活性物质或其前体可以与赋形剂组合以片剂、口服片剂或胶囊的形式使用。可以包含药学上可接受的粘合剂和/或佐剂作为组合物的一部分。

片剂、丸剂、胶囊、口服片剂等可以含有：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如藻酸或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。当单位剂型是胶囊时，除了本文讨论的材料之外，它还可以含有液体载体，诸如脂肪酸油。此外，单位剂型可以含有各种其他物质，诸如糖或虫胶，以便改变剂型的物理特性。

适用于本发明的口服剂型可以包括含有所需活性成分的胶囊或片剂；粉末或颗粒；在水相或非水液相中的悬浮液；水包油液体乳液或油包水乳液；或丸剂。

片剂可以通过压缩或模制，任选地与一种或多种佐剂一起来制备。压缩片剂可以通过在合适的机器中压缩粉末或颗粒形式的活性成分来制备，并且任选地可以与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在合适的装置中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状材料的混合物来形成。此外，片剂可以任选地被包衣和配制以允许活性成分的缓慢递送。

本发明的活性成分可以呈酏剂、分散体、糖浆剂、威化饼(wafer)和口香糖的形式施用。除了活性成分之外，糖浆还可以含有甜味剂诸如蔗糖或果糖、防腐剂、染料和调味料。

对于眼用、肠胃外、内皮、皮下或局部应用，溶液或悬浮液可以被配制用于输注，同时包括：无菌水，诸如水、盐水、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和滋补剂，诸如盐或右旋糖。

在一个实施方案中，所述组合物可以用载体制备以防止活性成分从身体迅速清除，诸如缓释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解和生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、去端胶原蛋白(atelocollagen)、聚原酸酯、聚乳酸和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。用于制造此类制剂的方法是本领域技术人员熟知的。

本领域普通技术人员，即本领域技术人员将理解，除片剂以外的制剂也可以用于缓慢或以受控速率释放活性成分。此类制剂可以是例如胶囊、颗粒和胶囊锭，但不限于此。

脂质体悬浮液也是药学上可接受的载体。这可以根据本领域已知的任何常规方法来制备。

可能使用根据本发明的适体治疗的癌症可以包括前列腺癌、胆囊癌、肝内胆道癌、胆道癌、口腔癌、咽癌、喉癌、舌癌、十二指肠癌、眼部肿瘤、纵隔癌、鼻窦癌、肾盂癌、心脏癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期癌症、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)癌、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、免疫大细胞淋巴瘤、祖代B淋巴母细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、蕈样肉芽肿、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、肝母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、腹膜癌、脑瘤、胸腺癌、T细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞性淋巴瘤以及以上癌症的任何组合。本发明还可用于治疗转移性癌症。

本发明的一个实施方案提供了一种用于检测其中PD-L1过表达的癌细胞的组合物。所述组合物可以包含一种或多种适体或其功能性片段，其包含选自由SEQ ID NO:1、2、10和18组成的组的至少一种核酸序列。

适体或其功能性片段还可以包含连接至例如5'-末端、3'-末端或两者的检测标记，以便检测其中PD-L1过表达的癌细胞。本文使用的检测标记可以包括例如荧光标记、拉曼散射标记、酶标记、红外标记或放射性标记。

即，选自诸如荧光标记、拉曼散射标记、酶标记、红外标记和放射性标记的检测标记中的至少一种可以另外与适体或其功能性片段中的5'-末端、3'-末端或其两者结合。

检测标记可以直接与适体或其功能性片段中的5'-末端、3'-末端或其两者结合，或者可以通过接头结合。

基于适体或其功能性片段与靶标的特异性结合，检测标记与其结合的适体或其功能性片段可以表现出优异的靶检测作用。

例如，基于适体或其功能性片段与PD-L1的特异性结合，检测标记与其结合的适体或其功能性片段可以有效地检测其中PD-L1过表达的癌细胞。

在荧光标记中，可以使用本领域常用的一种荧光标记。荧光标记可以包括但不限于可以通过可商购获得的寡核苷酸固相合成服务引入的荧光团，例如绿色荧光素蛋白(GFP)、荧光蛋白、异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素-氨基己基、荧光素衍生物、AlexaFluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor647、Alexa Fluor 750、罗丹明(Rhodamine)、6-羧基四甲基罗丹明、藻红蛋白(PE)、藻青蛋白(PC)、PC5、PC7、Cy颜料、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克萨斯红(TexasRed)、别藻蓝蛋白(APC)、氨基甲基香豆素乙酸酯(AMCA)、Marina Blue、瀑布蓝(Cascade Blue)、瀑布黄(Cascade Yellow)、太平洋蓝(Pacific Blue)、SPRD、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、R110、mC1B、CellTracker颜料、CFSE、JC-1、PKH、DCFH-DA、DHR、FDA、钙黄绿素(Calcein AM)、硝基苯并噁二唑(NBD)基团、二甲基氨基磺酰基苯并噁二唑基团、吖啶(Acd)、丹磺酰基(Dns)、7-二甲基氨基香豆素-4-乙酸(DMACA)、5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸(EDANS)、萘、蒽、原卟啉9等。

此外，可以在荧光材料的附近额外组合吸收由荧光材料发射的荧光能量的淬灭剂(淬灭材料)。在此实施方案中，可以通过在检测反应过程中将荧光材料与淬灭剂分离来检测荧光。

本文所用的酶标记的实例可以是β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。此外，作为发光底物，可以使用鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精等作为标记剂。

拉曼散射标记可以在荧光标记的适体中的5'-末端、3'-末端或其两者处使用具有与金属表面结合能力的取代基。例如，细胞识别通过引入但不限于硫醇(SH)基团、烷基氨基基团、芳族氨基基团或羧基基团并将它们吸附到例如金纳米颗粒的表面上，以便检测从适体吸附的金属颗粒发射的拉曼散射光来进行。在这种情况下，虽然没有具体限制，但金、银、铜、铁、硅、量子点等可以用作金属纳米颗粒。

放射性标记可以使用能够与5'-末端或3'-末端结合的放射性同位素，或者呈适体的互补序列的形式。例如，可以引入¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹¹¹In、^99mTc、³²P、³⁵S、¹⁸F、⁶⁷Ga或²⁰¹Tl，但不限于此。基于与靶标的特异性结合的放射性标记适体表现出优异的灵敏度，并且可以用作分子成像装置的放射性药物产品。

实施例

实施例1.适体的制备

1.1 PD-L1特异性适体的选择

使用指数富集的配体系统进化(SELEX)方法，从中心部分中具有40个连续随机核苷酸序列并且在两端处分别具有5’引物和3’引物结合位点的核酸文库中选择对PD-L1蛋白具有特异性的适体：

1.1.1用于SELEX的含有修饰核酸的文库的构建

首先，通过使用自动DNA合成仪[生物素-GGCTGGTGGTGTGGCTG-N(40)-CAGGCAGACGGTCACTC(SEQ ID NO:20)]在5’引物结合位点前连接生物素来合成单链核酸文库模板，并且在PAGE纯化后，用于实验(Trilink,USA)。

为了构建包含修饰核酸5-(N-苄基甲酰胺)-2′脱氧尿苷(Bz-dU)或5-(N-(1-萘基甲基)甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(Nap-dU)的核酸文库，将文库模板固定在树脂上，所述树脂用与文库模板的生物素结合的链霉亲和素蛋白进行表面修饰。具体地，将文库模板和500μL树脂(Thermo Scientific,USA)混合在5M NaCl溶液中，并且在室温下反应1小时以进行固定。向用NaCl洗涤的树脂添加20μM 5’引物(GAGTGACCGTCTGCCTG(SEQ ID NO:21))、0.5mM dNTP(ATP、GTP、CTP、Nap-dUTP或Bz-dUTP)、0.25U/μL KOD XL DNA聚合酶、120mM Tris-HClpH7.8、1X KOD缓冲液和0.1mg/ml BSA，接着在70℃下酶促反应2小时以制备含有修饰核酸的双链DNA。然后，使用20mM NaOH将双链DNA变性以分离树脂和ssDNA，用80mM HCl溶液中和，使用Amicon ultra-15(Merck Millipore,USA)浓缩并用UV分光光度计定量，最终构建含有修饰核酸的单链文库。

1.1.2对免疫抗癌靶蛋白具有特异性的适体的选择

作为SELEX的靶蛋白，在实验中使用了重组蛋白中含有组氨酸标签(6xHis-tag)(R&D,USA)的蛋白质。将靶蛋白用钴进行表面修饰，并使用Dynabead(Thermo Scientific,USA)固定在珠上，Dynabead是与蛋白质的His标签结合的磁珠。具体地，将溶解在选择缓冲液(40mM HEPES、102mM NaCl、5mM KCl)中的靶蛋白和20μg磁珠在热混合器(Thermomixer；Eppendorf,德国)中在25℃和1200rpm下反应30分钟，然后使用外部磁体用选择缓冲液洗涤以制备固定在珠上的产物。

将合成的含有修饰核酸的文库置于选择缓冲液中，并且在反应10秒的同时将温度从95℃逐渐降低至37℃，以便诱导核酸文库的三级结构的形成。对于阴性选择，将蛋白质竞争缓冲液(10μM凝血酶原、10μM酪蛋白、0.1％(w/v)白蛋白)与以上反应溶液混合，并且然后添加到20μg磁珠中，接着使用热混合器在37℃和1200rpm下使其反应10分钟。此后，将上清液转移至固定有靶蛋白的Dynabead，接着进行适体选择。具体地，将阴性选择之后的修饰核酸文库与固定靶蛋白的磁珠在热混合器中在37℃和1200rpm下反应1小时。用选择缓冲液洗涤DNA和靶蛋白-磁珠复合物5次之后，添加2mM NaOH溶液以回收与靶蛋白合并的DNA池，接着使用8mM HCl溶液进行中和。

为了在下一轮SELEX中使用与靶蛋白合并的DNA池，使用QPCR(定量PCR，CFX实时PCR检测系统；Biorad，USA)对其进行扩增。将在SELEX方法中回收的DNA池与QPCR缓冲液[(5'引物(GAGTGACCGTCTGCCTG(SEQ ID NO:21))、3'引物(生物素-GGCTGGTGGTGTGGCTG(SEQID NO:22))、1X KOD缓冲液、KOD XL酶、1mM dNTP]混合，并且然后在96℃的条件下持续15秒，在55℃的条件下持续10秒并且在68℃的条件下持续30分钟来进行一个循环，接着在96℃下持续15秒并且在72℃下持续1分钟来重复30个循环，以便使用与靶蛋白合并的DNA池的扩增制备双链寡DNA。

将通过QPCR形成的双链寡DNA与25μl链霉亲和素Myone磁珠(Thermo Scientific,USA)在室温下混合10分钟并固定。然后，添加20mM NaOH溶液以去除反义链，接着以与构建含有修饰核酸的文库相同的方式使用酶合成含有修饰核酸的DNA池，并且然后下一轮中使用相同的方式。以上SELEX轮次总计进行8次。

1.1.3 SLEX DNA池的结合亲和力(Kd)的测量

为了确定靶蛋白与经受SELEX轮次的DNA池之间的结合力(即，结合亲和力)，进行了过滤器结合测定。首先，使用α-³²P ATP(Perkin almeo,USA)和TdT(末端脱氧核苷酸转移酶；New England Bio Labs,USA)标记第6轮和第8轮DNA池的末端。在0.25μLα-³²P ATP、0.25μL TdT和NEB缓冲液4的条件下，将通过SELEX方法获得的1μM寡DNA在37℃下反应30分钟之后，将反应产物在70℃下处理10分钟以使TdT酶失活。使用Micro spin G50柱(GEHealthcare,USA)纯化标记的寡DNA池，并且然后将20,000cpm的DNA池添加到100μL选择缓冲液中，并以0.1℃/秒从95℃缓慢冷却至37℃。使用选择缓冲液连续稀释靶蛋白之后，添加30μL加热和冷却的标记寡DNA池，并在37℃下反应30分钟。在尼龙膜(GE Healthcare,USA)上点样2μL包含标记的寡DNA和靶蛋白的混合物之后，添加5.5μL zorbax树脂(Agilent,USA)。然后，将制备的产物放入预先用50μL选择缓冲液润湿的Durapore过滤器(Millipore,USA)中，并且真空去除溶液，接着用100μL选择缓冲液洗涤膜过滤器。将过滤板暴露于图像板16小时之后，用FLA-5100(Fujifilm,日本)对图像进行量化。表1示出了获得的靶蛋白与SELEX DNA池之间的结合亲和力。结合亲和力是通过Sigmaplot 11分析软件(SystatSoftware,USA)通过过滤器结合测定获得的值估算的，并且表1中的Bmax表示结合的适体与输入相比的比率，而Kd(解离常数)指示亲和力。

[表1]

	Bz lib	6R Bz	8R Bz	Nap lib	6R Nap	8R Nap
							Bmax	0.02	0.00	0.30	0.09	0.25	0.14
Kd	0.71	3.53	1.61	0.64	3.08	0.74

除了使用含有修饰核酸Bz-dU的文库进行的第6轮SELEX以外，在所有三个样品中都观察到了强结合亲和力。

1.1.4 SLEX DNA池的碱基序列分析

在使用5’引物(5’引物GAGTGACCGTCTGCCTG(SEQ ID NO:21))和3'引物(GGCTGGTGGTGTGGCTG(SEQ ID NO:22))对通过PCR确认结合亲和力的SELEX轮次DNA池中修饰核酸的第8轮样品进行扩增之后，使用TOPO TA克隆试剂盒(Thermo Scientific,USA)克隆扩增产物并转化到大肠杆菌TOP10细胞。在检查是否使用RCA试剂盒(Engnomics,韩国)插入了从琼脂培养基上生长的单个菌落克隆的PCR产物之后，使用其中插入了单个序列的克隆的RCA样品通过BigDye终止子循环测序试剂盒(Thermo Scientific,USA)和毛细管电泳进行核苷酸序列分析(Solgent,韩国)。最终，通过SELEX确认了浓缩DNA池中存在的50个DNA分子序列。

1.1.5克隆适体的生物合成和结合亲和力的测量

将已经分析的50个核苷酸序列再次使用Multalin网站进行分析，并且选择了表达频率最高的5个适体序列(表2，克隆序列)。对于五个选择的适体，使用用于核苷酸序列分析的双链DNA作为模板以及5’引物(GAGTGACCGTCTGCCTG(SEQ ID NO:21))和生物素结合的3’引物(生物素-GGCTGGTGGTGTGGCTG(SEQ ID NO:22))，以与以上所述的DNA池结合亲和力测量方法相同的方式生物合成每个适体，接着测量与靶蛋白的结合亲和力(图1)。由此，选择了在四个序列中表现出0.18至1.36nM的解离常数(Kd)的具有优异结合力的适体(表3)。

[表2]

[表3]

1.1.6适体的合成：使用五个克隆序列(表2)合成含有修饰核酸Bz-dU的适体。使用MerMade 12(Bioautomation,USA)通过通用自动DNA合成方法合成适体。合成的适体在HPLC纯化之后用于实验。

1.1.7适体的PD-1/PD-L1结合抑制的测量

通过进行基于细胞的测试来确定合成适体的PD-1/PD-L1结合的抑制。

使用以下试剂盒进行在细胞水平的PD-1/PD-L1结合的抑制。基于细胞的PD-1/PD-L1结合抑制测试(Promega,USA)是一种基于荧光素酶报告子的测定方法，其中将具有PD-1和荧光素酶基因表达的Jurkat效应细胞以及具有TCR激活蛋白和PD-L1表达的CHO-K1细胞混合在一起，接着用抑制剂(适体或中和抗体)处理和培养混合物。在这种情况下，测试细胞期的PD-1/PD-L1结合抑制活性。此系统是一种基于细胞的抑制活性测量方法，其被设计来随着抑制活性的增加而增加荧光信号，并且使用可商购获得的PD-L1中和抗体作为阳性对照。

首先，使用克隆序列合成的五个适体的抑制活性如图2所示。作为测量基于细胞的抑制活性的结果，在五个合成的适体中，除了PL029以外，在四个适体中确认了PL-1/PD-L1结合抑制。

1.2 PD-L1特异性适体功能性片段

1.2.1 PD-L1特异性适体功能性片段的制备

使用PL001(74mer)的序列制备功能性片段，PL001是实施例1.1中确认表现出PD-1/PD-L1结合抑制活性的适体。通过减少PL001适体两端的长度，选择在最小长度下显示与克隆序列相似或更好的抑制活性的适体。分别通过切割PL001的5'-末端和3'-末端生成50mer、46mer、45mer、40mer和24mer长度的适体(PL016、PL017、PL018、PL019、PL020和PL009；表4)。

[表4]

1.2.2适体的PD-1/PD-L1结合抑制的测量

通过进行基于纯化蛋白的测试来确定合成片段适体的PD-1/PD-L1结合抑制。通过基于辣根过氧化物酶(HRP)的ELISA方法进行基于纯化蛋白的PD-1/PD-L1结合抑制测试(BPS,USA)。首先，将根据产品手册纯化的PD-L1蛋白固定在96孔板上，并且然后每个孔用Immuno缓冲液1洗涤总计3次，以去除未结合的PD-L1蛋白。针对每个实验浓度在选择缓冲液中制备适体，并且以0.1℃/秒从95℃缓慢冷却至37℃。将5μL适体添加到固定PD-L1蛋白的孔中，接着再次将20μL根据对应说明书制备的生物素结合PD-1蛋白添加到每个孔中。将每个孔用Immuno缓冲液1洗涤3次之后，添加100μL根据对应说明书在封闭缓冲液中稀释的链霉亲和素-HRP，接着进行反应1小时。在将100μL HRP底物混合物添加到去除上清液的孔中之后，使用光度计测量荧光强度以确定PD-1/PD-L1结合的抑制。使用线上工具(https:// www.aatbio.com/tools/ic50-calculator)计算IC₅₀(50％抑制浓度)。

[表5]

作为检查合成的亲本适体PL001和6个片段适体中的每一个的结合亲和力的结果，确认了克隆序列PL001表现出优异的抑制活性，如表5和图3所示。此外，此克隆序列的片段PL016、PL017和PL009显示与亲本适体相似或改善的抑制活性。

1.3 PD-L1特异性适体功能性片段

1.3.1 PD-L1特异性适体功能性片段的制备

为了在长度更短的片段中筛选具有更好的PD-1/PD-L1结合抑制活性的适体，另外使用PL001(74mer)的序列制备功能性片段，PL001是实施例1.1中确认表现出PD-1/PD-L1结合抑制活性的适体。通过分别切割PL001的5'-末端和3'-末端，生成34mer、29mer、23mer和22mer适体(分别为PL003、PL004、PL021和PL022；表6)。

[表6]

1.3.2适体的PD-1/PD-L1结合抑制的测量：以与实施例1.2.2相同的方式测量实施例1.3.1的表6中所述的适体PD-1/PD-L1结合抑制活性。

[表7]

因此，如表7和图4所示，确认了PL003和PL004表现出比亲本适体PL001更优异的抑制活性。

1.4 PD-L1特异性适体功能性片段

1.4.1 PD-L1特异性适体功能性片段的制备

为了筛选多种具有优异的PD-1/PD-L1结合抑制活性的适体，通过分别将实施例1.1的PL002的5'-末端和3'-末端切割来制备适体PL005、PL006、PL007和PL008(表8)。

[表8]

4.2适体的PD-1/PD-L1结合抑制的测量：以与实施例1.2.2中所述相同的方式，测量实施例1.4.1的表8中所述的适体的PD-1/PD-L1结合抑制活性(图5)。可商购获得的PD-L1中和抗体用作此测试的阳性对照。

因此，如表9和图5所示，确认了PL007表现出比亲本适体PL002更好的抑制活性，而PL006和PL005具有次高的PD-1/PD-L1结合抑制活性。

[表9]

以与实施例1.1.7相同的方式使用基于细胞的系统测试实施例1.4.1的表8中所述的四个适体功能性片段(PL005、PL006、PL007和PL008)的抑制活性，从而获得图6的结果。在相对更长的PL005和PL006中确认了抑制活性。具体地，在PL005的情况下，50nM处理组显示出相似的抑制活性，其与用作阳性对照的PD-L1抗体没有统计学差异。更短的PL007在纯化蛋白系统中具有最低的IC₅₀值，但在基于细胞的系统中显示出相对较弱的抑制活性。

以下表10示出了本发明中所述的适体序列。

[表10]

例如，出于权利要求解释的目的，以下列出的权利要求不应以任何方式比其字面语言更窄地解释，并且因此，基于说明书的示例性实施方案不应被理解为权利要求。因此，应理解，本发明已经通过说明的方式进行描述，但不限制权利要求的范围。因此，本发明仅由以下权利要求限制。本申请中引用的所有公布、发表的专利、专利申请、书籍和期刊文章各自通过引用以其整体并入本文。

<110> 因特欧力多公司

<120> 用于治疗癌症的抗癌免疫治疗组合物

<130> 20OP09012PCT

<150> KR 10-2019-0176287

<151> 2019-12-27

<160> 22

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PL001

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(74)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 1

gagtgaccgt ctgcctgang aaaagnnnnn ganngnaccn nagngcacnc aacagngcag 60

ccacaccacc agcc 74

<210> 2

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL002

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(73)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 2

gagtgaccgt ctgcctgngn angccgcacg ancgcccnan nnngcgagnn nacncacagc 60

cacaccacca gcc 73

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL003

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(34)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 3

gcctgangaa aagnnnnnga nngnaccnna gngc 34

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL004

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(29)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 4

angaaaagnn nnnganngna ccnnagngc 29

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL005

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(49)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 5

gcctgngnan gccgcacgan cgcccnannn ngcgagnnna cncacagcc 49

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL006

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(39)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 6

ngnangccgc acgancgccc nannnngcga gnnnacnca 39

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL007

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(33)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 7

angccgcacg ancgcccnan nnngcgagnn nac 33

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL008

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(27)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 8

ccgcacganc gcccnannnn gcgagnn 27

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL009

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(24)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 9

aagnnnnnga nngnaccnna gngc 24

<210> 10

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL010

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(74)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 10

gagtgaccgt ctgcctgnna agcggcnaag nnnnnganng naccnnagng cccnnaccag 60

ccacaccacc agcc 74

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL016

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(50)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 11

gcctgangaa aagnnnnnga nngnaccnna gngcacncaa cagngcagcc 50

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL017

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(46)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 12

gcctgangaa aagnnnnnga nngnaccnna gngcacncaa cagngc 46

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL018

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(45)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 13

angaaaagnn nnnganngna ccnnagngca cncaacagng cagcc 45

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL019

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(40)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 14

angaaaagnn nnnganngna ccnnagngca cncaacagng 40

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL020

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(24)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 15

nnganngnac cnnagngcac ncaa 24

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL021

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(23)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 16

aagnnnnnga nngnaccnna gng 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL022

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(22)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 17

agnnnnngan ngnaccnnag ng 22

<210> 18

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL028

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(74)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 18

gagtgaccgt ctgcctgngn angccgcacg ancgcccnan nnngcgagnn naacngacag 60

ccacaccacc agcc 74

<210> 19

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PL029

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(74)

<223> n是5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷

<400> 19

gagtgaccgt ctgcctgcca nnnccngcnn gcncnnccnc cnnnannnnn caccnnncag 60

ccacaccacc agcc 74

<210> 20

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板序列

<220>

<221> 变化

<222> (17)..(56)

<223> n是g、a、c或t

<400> 20

ggctggtggt gtggctgnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnncag 60

gcagacggtc actc 74

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'引物

<400> 21

gagtgaccgt ctgcctg 17

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'引物

<400> 22

ggctggtggt gtggctg 17

Claims

1.一种适体或其功能性片段，所述适体或其功能性片段能够与程序化死亡配体1(PD-L1)特异性结合或能够通过与PD-L1特异性结合来抑制程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)与PD-L1之间的相互作用，所述适体或其功能性片段包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的适体或其功能性片段，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:17中的任一个。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3至SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:17中的任一个。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16。

6.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述癌症是其中PD-L1过表达的癌症。

7.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述癌症是前列腺癌、胆囊癌、肝内胆道癌、胆道癌、口腔癌、咽癌、喉癌、舌癌、十二指肠癌、眼部肿瘤、纵隔癌、鼻窦癌、肾盂癌、心脏癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期癌症、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)癌、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫大细胞淋巴瘤、祖代B淋巴母细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、蕈样肉芽肿、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、肝母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、腹膜癌、脑瘤、胸腺癌、T细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞性淋巴瘤。

8.根据权利要求3所述的药物组合物，其中小分子、核酸、蛋白质和放射性同位素中的至少一种与所述适体或其功能性片段中的5'-末端、3'-末端或其两者结合。

9.一种用于检测癌细胞的组合物，其包含至少一种适体或其功能性片段，所述适体或其功能性片段包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:18组成的组的核酸序列。

10.根据权利要求9所述的用于检测的组合物，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:17中的任一个。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述功能性片段是SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:14或SEQ ID NO:16。

12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述癌细胞是其中PD-L1过表达的细胞。

13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述癌症是前列腺癌、胆囊癌、肝内胆道癌、胆道癌、口腔癌、咽癌、喉癌、舌癌、十二指肠癌、眼部肿瘤、纵隔癌、鼻窦癌、肾盂癌、心脏癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期癌症、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)癌、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫大细胞淋巴瘤、祖代B淋巴母细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、蕈样肉芽肿、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、肝母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、腹膜癌、脑瘤、胸腺癌、T细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞性淋巴瘤。

14.根据权利要求9所述的组合物，其中荧光标记、拉曼散射标记、酶标记、红外标记和放射性标记中的至少一种与所述适体或其功能性片段中的5'-末端、3'-末端或其两者结合。