BR112017002729B1 - Terapia de combinação kit para tratar um tumor sólido em um indivíduo, anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, uso e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

TERAPIA DE COMBINAÇÃO KIT PARA TRATAR UM TUMOR SÓLIDO EM UM INDIVÍDUO, ANTICORPO OU PORÇÃO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO, USO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se a terapias de combinação para tratar um tumor sólido em um indivíduo. As terapias de combinação compreendem (a) um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CD40, e (b) um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente não é um anticorpo anti-CD40 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. A invenção também se refere a kits e métodos para usar tais terapias.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a terapias de combinação para tratar um tumor sólido em um indivíduo, assim como a métodos para o uso das mesmas. As terapias de combinação compreendem (a) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 e (b) um agente imunoterápico adicional que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40. A invenção também se refere a um kit e métodos para usar as terapias de combinação da invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O câncer é uma causa principal de mortes prematuras no mundo desenvolvido. O objetivo da imunoterapia no câncer é preparar uma resposta imunológica eficaz pelo corpo contra um tumor, particularmente, um tumor sólido. Isso pode ser alcançado, por exemplo, interrompendo a tolerância contra o antígeno tumoral, aumentando as respostas imunológicas antitumorais e estimulando respostas de citocina locais no sítio do tumor. A célula efetora chave de uma resposta imunológica antitumoral duradoura é a célula T efetora específica para tumor ativada. A ativação incompleta das células T efetoras, por exemplo, por células dendríticas pode causar anergia de célula T que resulta em uma resposta antitumoral ineficaz, enquanto que a indução adequada por células dendríticas pode gerar uma expansão potente de células T efetoras ativadas, redirecionando a resposta imunológica para o tumor.

[0003] A molécula receptora de CD40 de superfície celular é um membro da superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNFR), e é um regulador chave nas respostas imunológicas tanto inatas quanto adaptativas. A mesma é expressa em células apresentadoras de antígeno humano, particularmente, células B, células dendríticas e macrófagos, assim como em células normais, tais como fibroblastos, células musculares lisas, células endoteliais e células epiteliais. Além disso, a mesma é expressa em uma ampla faixa de células tumorais, incluindo todos os linfomas B, 30 a 70% dos tumores sólidos, melanomas e carcinomas.

[0004] O ligante natural de CD40, designado como CD154 ou CD40L, é principalmente expresso em linfócitos T maduros. A sinalização mediada por CD40L ativa diversos eventos biológicos, incluindo a ativação de célula imunológica, proliferação e produção de citocinas e quimiocinas. Assim, a estimulação por meio do receptor de CD40 acentua as funções celulares e imunológicas. Seu papel nas respostas imunológicas mediadas por células é bem conhecido. Por exemplo, a ativação das células dendríticas por meio de estimulação por CD40 induz a ativação de células T efetoras. O tratamento com agonistas de CD40 pode fornecer, assim, os meios para redirecionar a resposta imunológica e expandir as células T efetoras direcionadas ao tumor.

[0005] Efeitos antitumorais foram relatados para alguns anticorpos anti-CD40, com diversos mecanismos tendo sido identificados. Um efeito indireto é observado para tumores negativos para CD40, envolvendo a ativação de células apresentadoras de antígeno, particularmente, atividade aumentada por linfócitos T citotóxicos específicos para tumor e células exterminadoras naturais (células NK). Mecanismos antitumorais tanto indiretos quanto diretos são observados para tumores positivos para CD40, em que o anticorpo de CD40 que se liga a células tumorais induz a apoptose celular. Esses mecanismos para atividade antitumoral podem ser complementados pela citotoxicidade celular mediada por anticorpo (ADCC). Entretanto, a administração de anticorpos anti-CD40 foi também associada a efeitos colaterais adversos, tais como a síndrome de liberação de citocina.

[0006] Consequentemente, permanece a necessidade de terapias contra câncer melhoradas, particularmente, anticorpos anti-CD40 adequados para o uso no tratamento de tumores sólidos e terapias de combinação dos mesmos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Um primeiro aspecto da invenção fornece uma terapia de combinação para o uso no tratamento de um tumor sólido em um indivíduo que se distingue pelo fato de que compreende (a) um anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente à CD40, e (b) um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente não é um anticorpo anti-CD40 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compete pela ligação à CD40 humana com um anticorpo que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8, e em que o agente imunoterápico adicional se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40.

[0008] Em uma modalidade, o tumor sólido é selecionado dentre os grupos que consistem em um adenoma, um blastoma, um carcinoma, um tumor desmoide, um tumor de célula redondo pequeno desmoplásico, um tumor endócrino, um tumor de célula germinativa, um linfoma, um sarcoma, um tumor de Wilms, um tumor pulmonar, um tumor de cólon, um tumor linfático, um tumor de mama e um melanoma. Por exemplo, o tumor sólido pode ser um melanoma, tal como um melanoma metastático.

[0009] Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compreende ou consiste em um anticorpo intacto.

[00010] Em uma modalidade alternativa, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compreende ou consiste em um fragmento de ligação a antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em: um fragmento Fv (tal como um fragmento Fv de cadeia única, ou um fragmento Fv ligado por dissulfeto), e um fragmento semelhante a Fab (tal como um fragmento Fab; um fragmento Fab’ ou um fragmento F(ab)2).

[00011] Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo é humana ou humanizada.

[00012] Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compreende pelo menos uma CDR selecionada dentre as SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5 e 6, ou uma sequência de CDR de ‘núcleo’ da mesma (consultar o Exemplo 1 abaixo para os detalhes de sequência).

[00013] Assim, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compreende as sequências de CDR de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3 e/ou SEQ ID NOs: 4, 5 e 6 ou uma sequência de CDR de ‘núcleo’ das mesmas.

[00014] Por exemplo, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e/ou a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8.

[00015] Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compreende a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e/ou a região variável de cadeia constante de SEQ ID NO: 12.

[00016] Assim, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compreende ou consiste na cadeia leve de SEQ ID NO: 7 mais a SEQ ID NO:11, e/ou a cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 mais a SEQ ID NO:12.

[00017] As terapias de combinação da invenção compreendem adicionalmente um agente imunoterápico adicional, eficaz no tratamento de câncer, que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40. Será apreciado que o benefício terapêutico do agente imunoterápico adicional pode ser mediado atenuando-se a função de uma molécula de ponto de verificação imunológico inibitória e/ou ativando a função de uma molécula de ponto de verificação imunológico estimulatório.

[00018] Em outra modalidade, o agente imunoterápico adicional é selecionado a partir dos grupos que consistem em: (a) um agente imunoterápico que liga PD-1; (b) um agente imunoterápico que liga CTLA-4; (c) um agente imunoterápico que liga OX40; e (d) um agente imunoterápico que liga CD137.

[00019] Assim, o agente imunoterápico adicional pode ser um inibidor de PD1, tal como um anticorpo anti-PD1, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com a capacidade de inibir a função de PD1 (por exemplo, Nivolumab, Pembrolizumab, Lambrolizumab, Pidilzumab e AMP-224). Alternativamente, o inibidor de PD1 pode compreender ou consistir em um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com a capacidade de inibir a função de PD1 (por exemplo, MEDI- 4736 e MPDL3280A).

[00020] Em outra modalidade, o agente imunoterápico adicional é um inibidor de CTLA-4, tal como um anticorpo anti-CTLA-4 ou porção de ligação a antígeno do mesmo.

[00021] Em uma modalidade adicional, o agente imunoterápico adicional ativa OX40, tal como um anticorpo anti-OX40 agonístico ou porção de ligação a antígeno do mesmo.

[00022] Em uma ainda outra modalidade, o agente imunoterápico adicional ativa CD137, tal como um anticorpo anti-CD137 agonístico ou porção de ligação a antígeno do mesmo.

[00023] Será apreciado por pessoas versadas na técnica que a presença dos dois agentes ativos (conforme detalhado acima) pode fornecer um benefício sinérgico ao tratamento de um tumor sólido em um indivíduo. “Sinérgico” inclui que o efeito terapêutico dos dois agentes em combinação (por exemplo, conforme determinado em referência à taxa de crescimento ou ao tamanho do tumor) é maior do que o efeito terapêutico aditivo dos dois agentes administrados sozinhos. Tal sinergismo pode ser identificado testando-se os agentes ativos, sozinhos e em combinação, em um modelo de linhagem de células relevante do tumor sólido.

[00024] Opcionalmente, a terapia de combinação compreende adicionalmente um terceiro agente imunoterápico com eficácia no tratamento contra câncer.

[00025] Por exemplo, a terapia de combinação pode compreender (a) um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente à CD40, (b) um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a PD1 ou PD-L1, e (c) um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CTLA-4.

[00026] Um segundo aspecto da invenção fornece um anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CD40 para uso em um método para tratar um tumor sólido, em que o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 compete pela ligação a CD40 humana com um anticorpo que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8, e em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 é para uso em combinação com um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente não é um anticorpo anti-CD40 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[00027] Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00028] Em uma modalidade, o agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00029] Um terceiro aspecto relacionado da invenção fornece o uso de um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CD40 na preparação de um medicamento para tratar um tumor sólido, em que o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 compete pela ligação a CD40 humana com um anticorpo que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8, e em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 é para uso em combinação com um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente não é um anticorpo anti-CD40 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[00030] Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00031] Em uma modalidade, o agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00032] Um quarto aspecto da invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende (a) um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente à CD40, e (b) um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente não é um anticorpo anti-CD40 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compete pela ligação a CD40 humana com um anticorpo que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8.

[00033] Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00034] Em uma modalidade, o agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00035] Um quinto aspecto da invenção fornece um kit para tratar um tumor sólido que compreende (a) um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente à CD40, e (b) um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente não é um anticorpo anti-CD40 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 compete pela ligação a CD40 humana com um anticorpo que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8.

[00036] Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00037] Em uma modalidade, o agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00038] Um sexto aspecto da invenção fornece um método para tratar um tumor sólido em um indivíduo, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de (a) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz e um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente à CD40, e (b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente não é um anticorpo anti-CD40 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente a CD40 compete pela ligação a CD40 humana com um anticorpo que compreende a região de variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8.

[00039] Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD40 é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00040] Em uma modalidade, o agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer é conforme discutido acima em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00041] Em uma modalidade adicional, as etapas (a) e (b) são executadas simultaneamente ou em que a etapa (b) é executada entre 24 horas e duas semanas após a etapa (a), entre 24 horas e uma semana após a etapa (a), entre 24 e 72 horas após a etapa (a) ou entre 24 e 48 horas após a etapa (a).

[00042] Em uma modalidade, a etapa (a) compreende a administração local do anticorpo ao sítio do tumor.

[00043] Em uma modalidade, pelo menos 30% da quantidade de anticorpo administrada na etapa (a) são retidos no sítio de tumor em quatro horas após a administração, de preferência, em que pelo menos 40% da dita quantidade são retidos no sítio de tumor em quatro horas após a administração.

[00044] Em uma modalidade, o agente terapêutico adicional da etapa (b) é formulado como uma composição adequada para administração sistêmica com pelo menos um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[00045] Em uma modalidade, a etapa (a) é conduzida em múltiplas ocasiões separadas e a etapa (b) é conduzida de modo que a exposição do indivíduo ao agente terapêutico adicional é contínua pela duração do método.

[00046] Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano.

[00047] Os inventores também mostraram surpreendentemente que determinados anticorpos anti-CD40 são retidos no sítio de um tumor sólido após a administração a um indivíduo. Assim, apenas uma pequena proporção do anticorpo escapa do sítio do tumor para a circulação vascular ou linfática do indivíduo.

[00048] Isso resulta em um tratamento altamente eficaz, assim como efeitos colaterais reduzidos, permitindo que uma dose mais baixa do anticorpo fosse usada. Essas vantagens são particularmente aparentes quando tal anticorpo é localmente administrado a um sítio do tumor em um indivíduo, mas podem também ser aparentes quando o anticorpo é sistemicamente administrado.

[00049] Entretanto, será apreciado por pessoas versadas na técnica que o anticorpo anti-CD40 pode também ser administrado ao indivíduo sistemicamente, por exemplo, por via intravenosa ou subcutânea.

[00050] Os inventores também mostraram surpreendentemente que a combinação da administração de um anticorpo anti-CD40 que é retido no sítio de tumor com a administração sistêmica a um indivíduo de um agente terapêutico adicional resulta em uma melhora no efeito do tratamento, em relação à administração do anticorpo anti-CD40 sozinho.

[00051] A invenção fornece, portanto, um método para tratar um tumor sólido em um indivíduo, sendo que o método compreende (a) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente à CD40 e que é retido no sítio do tumor após a administração e, opcionalmente, (b) administrar sistemicamente ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional. As etapas (a) e (b) podem ser executadas simultaneamente. Alternativamente, as etapas (a) e (b) podem ser executadas sequencialmente desde que a etapa (a) preceda a etapa (b). Na etapa (a), o anticorpo anti-CD40 é, de preferência, administrado localmente ao tumor.

[00052] A invenção também fornece um kit para tratar um tumor sólido em um indivíduo, sendo que o kit compreende (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente à CD40 e que é retido no sítio do tumor após a administração e, opcionalmente, (b) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional que é adequada para a administração sistêmica a um indivíduo. O anticorpo que se liga especificamente à CD40 é, de preferência, fornecido de uma forma adequada para a administração local a um tumor. BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[00053] SEQ ID NO: 1, 2 e 3 são as CDRs 1, 2 e 3, respectivamente, da cadeia leve do anticorpo G12 (definido em conformidade com a numeração IMGT).

[00054] SEQ ID NO: 4, 5 e 6 são as CDRs 1, 2 e 3, respectivamente, da cadeia pesada do anticorpo G12 (definido em conformidade com a numeração IMGT).

[00055] SEQ ID NO: 7 e 8 são as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve e da região variável de cadeia pesada, respectivamente, do anticorpo G12.

[00056] SEQ ID NO: 9 e 10 são as sequências de ácidos nucleicos da região variável de cadeia leve e da região variável de cadeia pesada, respectivamente, do anticorpo G12.

[00057] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia leve exemplificativa.

[00058] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada exemplificativa.

[00059] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos da CD40 humana.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00060] A Figura 1 mostra o nível de anticorpo detectável no soro de camundongos hCD40tg que possuem um tumor de células MB49 de câncer de bexiga negativo para hCD40, após a administração do anticorpo por via intratumoral (IT), peritumoral (PT) ou intravenosa (IV) a uma dose de 10 uMg.

[00061] A Figura 2 mostra o nível de anticorpo detectável em amostras sanguíneas de macacos cinomolgos após a administração do anticorpo nas doses indicadas por meio da via subcutânea ou intravenosa.

[00062] A Figura 3 mostra os resultados da análise de citometria de fluxo da expressão de CD40 humana de superfície celular por (A) células 5.G12.46 de clone B16.F10(hCD40+) e (B) células transfectadas por simulação.

[00063] A Figura 4A mostra taxas de sobrevivência de camundongos hCD40tg que possuem melanoma B16.F10(hCD40+) subcutâneo após o tratamento com o controle, ADC-1013 apenas, ou ADC-1013 com um anticorpo anti-PD-1 (“PD-1”).

[00064] A Figura 4B mostra o volume do tumor para cada grupo de tratamento no dia em que o primeiro camundongo foi sacrificado. Os gráficos mostram dados agrupados de dois experimentos individuais (n=16). Eficácia antitumoral significativa e sobrevivência aumentada foram demonstradas com o tratamento com ADC-1013. Eficácia antitumoral melhorada e sobrevivência melhorada foram observadas com o tratamento combinado com anti-PD-1 (* = p < 0,05, **= < 0,01, teste de classificação de Log para a sobrevivência e teste de Mann- Whitney para o volume de tumor).

[00065] A Figura 5A mostra os resultados de um ensaio para a ativação de células positivas para CD11c nos linfonodos de drenagem após diferentes modos de administração de um anticorpo anti-CD40 em um modelo de tumor de camundongo. Administração intratumoral (IT), administração intraperitoneal (IP). A ativação é indicada pelo nível de expressão de CD86, medido por intensidade fluorescente média (MFI).

[00066] A Figura 5B mostra os resultados de um ensaio para a ativação de células positivas para CD11b nos linfonodos de drenagem após diferentes modos de administração de um anticorpo anti-CD40 em um modelo de tumor de camundongo. Administração intratumoral (IT), administração intraperitoneal (IP). A ativação é indicada pelo nível de expressão de CD86, medido por intensidade fluorescente média (MFI).

[00067] Figura 6. Tumores B16.F10.hCD40+ foram inoculados em um flanco. Os tratamentos foram administrados nos dias 3, 6 e 9. ADC-1013 foi administrado intratumoralmente (100 μg por dose). Os anticorpos anti-PD-1, 250 Mg por dose (Clone RPM1-14, BioXcell), e anti-CTLA-4, 100 μg por dose (9D9, BioXcel), foram injetados intraperitonealmente. O volume do tumor no dia 14 é mostrado.

[00068] Figura 7. Tumores B16.F10 foram inoculados em um flanco. Os tratamentos foram administrados nos dias 3, 6 e 9. Os anticorpos ADC-1013, anti-CD137 (Lob 12.3) e anti-OX40 (CD86) e controles foram administrados intratumoralmente (100 μg por dose). O volume do tumor foi acompanhado ao longo do tempo.

[00069] Figura 8. Efeito antitumoral de ADC-1013 no tumor B16.F10.hCD40+ em comparação ao efeito antitumoral em tumores B16.F10 (tipo selvagem) após o tratamento com ADC- 1013 ou controle (intratumoral, 100 μg nos dias 3, 6 e 9).

[00070] Figura 9. ADC-1013 (30) foi administrado intratumoralmente nos dias 10, 13, 16 em camundongos hCD40tg- BalbC (F1) com tumores de linfoma estabelecidos (A20). O volume do tumor e a sobrevivência ao longo do tempo são apresentados na Figura.

[00071] Figura 10. ADC-1013 (100 μg) foi administrado intratumoralmente nos dias 4, 7 e 10 em camundongos hCD40tg com tumores estabelecidos (LLC-1). O volume do tumor ao longo do tempo é apresentado na Figura.

[00072] Figura 11. Efeito antitumoral em modelo de metástase de câncer de melanoma B16.F10. Camundongos hCD40tg com um tumor em cada flanco receberam 100 μg de ADC- 1013 peritumoralmente no tumor no flanco direito, nos dias 3, 6 e 9 após a inoculação do tumor. O volume do tumor ao longo do tempo tanto para o tumor injetado (tumor direito) quanto para o tumor não injetado (esquerdo) é exibido na Figura.

[00073] Figura 12. Volume do tumor no dia 16. ADC-1013 foi administrado por via intravenosa nos dias 3, 6 e 9 em camundongos hCD40tg com tumores de melanoma estabelecidos (B16.F10.hCD40+) 100 μg ( n=12).

[00074] A Figura 13 mostra um efeito antitumoral (medido pela sobrevivência ao longo do tempo) em tumores de linfoma A20 subcutâneos em camundongos BalbC. Os camundongos foram tratados com 9D9 (anticorpo anti-CTLA-4, BioXcel) peritumoralmente nos dias 5 e 8 e com agonista de TLR CpG (1668) intratumoralmente nos dias 5, 8 e 11.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00075] Deve ser entendido que diferentes aplicações dos métodos e terapias de combinação revelados podem ser adaptadas às necessidades específicas na técnica. Deve ser entendido também que a terminologia usada no presente documento tem o propósito de apenas descrever modalidades particulares da invenção e não é destinada a ser limitante.

[00076] Adicionalmente, conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “uma”, “um”, “o” e “a” incluem referências no plural a menos que o conteúdo claramente determine de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a “um anticorpo” inclui “anticorpos”, a referência a “um antígeno” inclui dois ou mais tais antígenos, a referência a “um indivíduo” inclui dois ou mais indivíduos e similares.

[00077] Um “polipeptídeo” é usado no presente documento em seu sentido mais amplo para se referir a um composto de dois ou mais aminoácidos de subunidade, análogos de aminoácido ou outros peptidomiméticos. O termo “polipeptídeo” inclui, assim, sequências curtas de peptídeos e também polipeptídeos e proteínas mais longas. Conforme usado no presente documento, o termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e os isômeros ópticos D ou L, e análogos de aminoácido e peptidomiméticos.

[00078] “Retido no sítio de um tumor sólido” inclui que o anticorpo anti-CD40 é liberado apenas lentamente da área do tumor. A retenção do anticorpo no sítio do tumor pode ser avaliada monitorando-se os níveis séricos do anticorpo após a administração (consultar Mangsbo et al., 2014, Clin. Cancer Res. 21 (5):1.115 a 1.126, cuja revelações são incorporadas ao presente documento a título de referência). Por exemplo, em uma modalidade, os níveis séricos de anti-CD40 quatro horas permitindo a injeção intratumoral de 30 μg do anticorpo (em 60 μl) são menores do que 1 μl/ml.

[00079] Por “quantidade terapeuticamente eficaz” de uma substância entende-se que uma determinada substância é administrada a um indivíduo que sofre de uma afecção, em uma quantidade suficiente para curar, aliviar ou interromper parcialmente a afecção ou um ou mais de seus sintomas. Tal tratamento terapêutico pode resultar em uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença ou um aumento na frequência ou duração de períodos livres de sintomas. As quantidades eficazes para um determinado propósito e um determinado agente dependerão da gravidade da doença ou lesão, assim como do peso e estado geral do indivíduo. Conforme usado no presente documento, o termo “indivíduo” inclui qualquer mamífero, de preferência, um ser humano.

[00080] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no presente documento, seja supra ou infra, são incorporados ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

MÉTODOS

[00081] A invenção fornece um método para tratar um tumor sólido em um indivíduo. O tumor é tipicamente maligno e pode ser metastático.

[00082] Os tumores sólidos são classicamente definidos pelo tecido a partir do qual os mesmos se originam, por exemplo, mama, cólon, etc. Entretanto, já que a imunoterapia atua no sistema imunológico e não no próprio tumor, a situação imunológica do tumor pode ser mais preditiva da resposta do que a origem do tumor. Nos estudos de suporte apresentados no presente documento, dois modelos diferentes em mais detalhes, um modelo de melanoma, B16.F10 (com e sem CD40 humana) e o modelo de tumor de bexiga MB49. Os dados apresentados nos Exemplos abaixo mostram que MB49 é mais imunogênico do que B16.F10. Entretanto, em ambos os modelos, um efeito antitumoral significativo é observado após o tratamento com um anticorpo anti-CD40 conforme descrito no presente documento. Assim, a invenção fornece um efeito antitumoral tanto em tumores imunogênicos (tais como MB49) quanto em modelos pouco imunogênicos (tais como B16.F10).

[00083] Assim, em uma modalidade da presente invenção, o tumor é imunogênico. Tais tumores são distinguidos pela infiltração de células imunológicas, tais como células T e células de origem mieloide. Foi demonstrado que a infiltração de células CD8 T, isto é, um perfil de tumor mais imunogênico, se correlaciona com um bom prognóstico após a terapia, por exemplo, em câncer de cólon, (Galon et al., 2014, J. Pathol. 232(2): 199 a 209).

[00084] Em uma modalidade alternativa da invenção, o tumor é não imunogênico ou pouco imunogênico. Os tumores pouco imunogênicos têm frequentemente expressão de MHCI baixa ou ausente e são distinguidos pelo número baixo de células imunológicas infiltrantes, tais como células T e células de origem mieloide (Lechner et al., 2013, J Immunotherapy 36(9):477 a 489).O tumor pode ser um adenoma, um adenocarcinoma, um blastoma, um carcinoma, um tumor desmoide, um tumor de célula redonda pequena desmoplásica, um tumor endócrino, um tumor de célula germinativa, um linfoma, um sarcoma, um tumor de Wilms, um tumor pulmonar, um tumor de cólon, um tumor linfático, um tumor de mama ou um melanoma.

[00085] Os tipos de blastoma incluem hepatblastoma, glioblastoma, neuroblastoma ou retinoblastoma. Os tipos de carcinoma incluem carcinoma colorretal ou carcinoma heptacelular, carcinomas pancreáticos, da próstata, gástricos, esofágicos, cervicais e de cabeça e pescoço e adenocarcinoma. Os tipos de sarcoma incluem sarcoma de Ewing, osteosarcoma, rabdomiossarcoma ou qualquer outro sarcoma de tecido mole. Os tipos de melanoma incluem Lentigo maligno, Melanoma lentigo maligno, Melanoma de espalhamento superficial, Melanoma acrolentiginoso, Melanoma da mucosa, Melanoma nodular, Melanoma polipoide, Melanoma desmoplásico, Melanoma amelanótico, Melanoma de tecido mole, Melanoma com pequenas células tipo nevo, Melanoma com características de um nevo de Spitz e Melanoma uveal. Os tipos de linfoma incluem Linfoma/leucemia de células T precursoras, Linfoma folicular, Linfoma difuso de células B grandes, Linfoma de células do manto, Linfoma/leucemia linfocítica crônica de células B, Linfoma MALT, Linfoma de Burkitt, Micose fungoide, Linfoma periférico de células T, Forma de esclerose nodular do linfoma de Hodgkin, Subtipo de celularidade mista do linfoma de Hodgkin. Os tipos de tumor de pulmão incluem tumores de câncer de pulmão de células não pequenas (adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células grandes) e carcinoma de pulmão de células pequenas.

[00086] Há uma incidência crescente de melanoma, e aproximadamente 200.000 novos casos são diagnosticados no mundo a cada ano. Ademais, melanoma é muito bem adequado para administração local na clínica desde que tanto os tumores primários quanto as metástases sejam frequentemente acessíveis de modo mais fácil. Assim, para o método da invenção, o tumor é, de preferência, um melanoma e é, de maior preferência, um melanoma metastático. O tumor pode ter sido classificado como metastático devido a um resultado de teste de alto teor de lactato desidrogenase. O tumor pode ter sido classificado como qualquer um dos seguintes Estágios, mas é, de preferência, estágio III ou IV.

[00087] Estágio 0: Melanoma in situ (Nível de Clark I), 99,9% de sobrevivência

[00088] Estágio I / II: Melanoma invasivo, 89 a 95% de sobrevivência

[00089] T1a: Espessura de tumor primário menor do que 1,0 mm, sem ulceração, e mitose < 1/mm2

[00090] T1b: Espessura de tumor primário menor do que 1,0 mm, com ulceração ou mitoses > 1/mm2

[00091] T2a: Espessura de tumor primário de 1,01 a 2,0 mm, sem ulceração

[00092] Estágio II: Melanoma de alto risco, 45 a 79% de sobrevivência

[00093] T2b: Espessura de tumor primário de 1,01 a 2,0 mm, com ulceração

[00094] T3a: Espessura de tumor primário de 2,01 a 4,0 mm, sem ulceração

[00095] T3b: Espessura de tumor primário de 2,01 a 4,0 mm, com ulceração

[00096] T4a: Espessura de tumor primário maior do que 4,0 mm, sem ulceração

[00097] T4b: Espessura de tumor primário maior do que 4,0 mm, com ulceração

[00098] Estágio III: Metástase regional, 24 a 70% de sobrevivência

[00099] N1: Linfonodo positivo único

[000100] N2: Dois a três linfonodos positivos ou metástase em transição/regional da pele

[000101] N3: Quatro linfonodos positivos ou um linfonodo e metástases em transição/regionais da pele

[000102] Estágio IV: Metástase distante, 7 a 19% de sobrevivência

[000103] M1a: Metástase distante da pele, LDH normal

[000104] M1b: Metástase dos pulmões, LDH normal

[000105] M1c: Outra metástase distante ou qualquer metástase distante com LDH elevado

[000106] O método da invenção compreende (a) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente à CD40 e que é retido no sítio do tumor após a administração e, opcionalmente, (b) administrar sistemicamente ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional. A retenção de um anticorpo em um sítio do tumor é descrita em mais detalhes abaixo. As etapas (a) e (b) podem ser executadas simultaneamente. Alternativamente, as etapas (a) e (b) podem ser executadas sequencialmente desde que a etapa (a) preceda a etapa (b). Na etapa (a), o anticorpo anti-CD40 é, de preferência, administrado localmente ao tumor.

[000107] O método da invenção tem diversas vantagens. Primeiro, como o anticorpo anti-CD40 é retido no sítio do tumor, o mesmo é altamente eficaz como um tratamento. Ademais, há exposição sistêmica reduzida a anticorpos anti-CD40, permitindo que uma dose mais baixa do anticorpo seja usada e resultando em menos efeitos colaterais. Quando a etapa (b) é executada, o efeito do tratamento é adicionalmente melhorado. A INVENÇÃO TAMBÉM FORNECE - um anticorpo que se liga especificamente à CD40 e que é retido no sítio do tumor após a administração para o uso em um método para tratar um tumor sólido em um indivíduo, sendo que o método compreende (a) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do dito anticorpo que se liga especificamente à CD40 e, opcionalmente, (b) administrar sistemicamente ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional. As etapas (a) e (b) podem ser executadas simultaneamente. Alternativamente, as etapas (a) e (b) podem ser executadas sequencialmente desde que a etapa (a) preceda a etapa (b). Na etapa (a), o dito anticorpo anti- CD40 é, de preferência, administrado localmente ao tumor. - uso de um anticorpo que se liga especificamente à CD40 e que é retido no sítio do tumor após a administração na fabricação de um medicamento para tratar um tumor sólido em um indivíduo, em que o dito tratamento compreende (a) administrar ao tumor uma quantidade terapeuticamente eficaz do dito anticorpo que se liga especificamente à CD40 e, opcionalmente, (b) administrar sistemicamente ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional. As etapas (a) e (b) podem ser executadas simultaneamente. Alternativamente, as etapas (a) e (b) podem ser executadas sequencialmente desde que a etapa (a) preceda a etapa (b). Na etapa (a), o dito anticorpo anti-CD40 é, de preferência, administrado localmente ao tumor. - um produto que contém (1) um anticorpo que se liga especificamente à CD40 e que é retido no sítio do tumor após a administração e, opcionalmente, (2) um agente terapêutico adicional para o uso simultâneo, separado ou sequencial em um método para tratar um tumor sólido em um indivíduo, sendo que o método compreende (a) administrar localmente ao tumor uma quantidade terapeuticamente eficaz do dito anticorpo que se liga especificamente à CD40 e, opcionalmente, (b) administrar sistemicamente ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional. As etapas (a) e (b) podem ser executadas simultaneamente. Alternativamente, as etapas (a) e (b) podem ser executadas sequencialmente desde que a etapa (a) preceda a etapa (b). Na etapa (a), o dito anticorpo anti- CD40 é, de preferência, administrado localmente ao tumor. TEMPORIZAÇÃO E ORDEM DAS ETAPAS (A) E (B)

[000108] As etapas (a) e (b) são, de preferência, executadas sequencialmente (isto é, em tempos diferentes), com a etapa (a) sendo executada antes da etapa (b).

[000109] As etapas (a) e (b) são, de preferência, separadas por um intervalo de modo que o efeito antitumoral combinado seja otimizado. Isso significa tipicamente que a etapa (b) é conduzida por um intervalo suficientemente longo após a etapa (a) em que pelo menos um efeito fisiológico da etapa (a) está no ou próximo ao seu nível de pico. Por exemplo, o anticorpo anti-CD40 estimulará tipicamente as células dendríticas, o que, por sua vez, leva à ativação de células T específicas para tumor. As células T ativadas começam a expressar níveis mais altos de moléculas de ponto de verificação de sistema imunológico (tal como PD-1) dentro de cerca de 24 horas de tratamento com anti-CD40. Essas moléculas de ponto de verificação de sistema imunológico podem regular negativamente a resposta antitumoral. O agente administrado na etapa (b) pode ser, assim, de preferência, um agente (tal como um anticorpo anti-PD1 ou anti-PDL1) que bloqueia ou inibe tal atividade de tal ponto de verificação de sistema imunológico. Quando o agente administrado na etapa (b) é tal agente, a etapa (b) é, de preferência, executada por um intervalo suficientemente longo após a etapa (a) de modo que o nível de expressão da molécula de ponto de verificação de sistema imunológico nas células no indivíduo ou o número de células no indivíduo que expressam a dita molécula de ponto de verificação de sistema imunológico seja elevado em relação ao dito nível ou número no indivíduo antes da etapa (a) ou em relação ao dito nível ou número em um indivíduo saudável. Nesse contexto, a etapa (b) é conduzida, de preferência, entre 24 horas e duas semanas após a etapa (a), entre 24 horas e uma semana após a etapa (a), entre 24 horas e 72 horas após a etapa (a) ou entre 24 horas e 48 horas após a etapa (a).

[000110] Alternativamente, a etapa (b) pode ser conduzida em um ponto de tempo após a etapa (a) em que o nível de expressão da molécula de ponto de verificação de sistema imunológico em uma célula do indivíduo ou o número de células no indivíduo que expressam a dita molécula de ponto de verificação de sistema imunológico é determinado como sendo elevado em relação ao dito nível ou número no indivíduo antes da etapa (a) ou em relação ao dito nível ou número em um indivíduo saudável.

[000111] O nível de expressão de uma molécula de ponto de verificação de sistema imunológico em uma célula de um indivíduo ou o número de células em um indivíduo que expressam tal molécula pode ser determinado por qualquer meio adequado, por exemplo, pela análise de citometria de fluxo de uma amostra retirada do indivíduo.

[000112] Alternativamente, pode ser preferencial executar etapas (a) e (b) simultaneamente (isto é, ao mesmo tempo) ou dentro de 24 horas de um para o outro, de modo que ambas as etapas possam ser executadas no mesmo dia ou durante a mesma visita a um centro de tratamento. Isso pode ser particularmente vantajoso quando o acesso a centros de tratamento é restrito. Nesse contexto, as etapas (a) e (b) podem ser executadas simultaneamente ou podem ser executadas com menos do que 24 horas de intervalo, menos do que 12 horas de intervalo, menos do que 10 horas de intervalo, menos do que 6 horas de intervalo, menos do que 4 horas de intervalo, menos do que 3 horas de intervalo ou menos do que 2 horas de intervalo.

[000113] Em qualquer uma das modalidades acima, a etapa (a) pode ser conduzida em múltiplas ocorrências após a primeira ocorrência. Isto é, o indivíduo pode receber uma série de doses do anticorpo anti-CD40. Essas doses são administradas de modo que o indivíduo tenha apenas exposição intermitente ao anticorpo anti-CD40, de preferência, de modo que as células imunes do indivíduo não se tornem esgotadas e/ou que o indivíduo não sofra de taquifilaxia ao anticorpo anti-CD40. Com a detecção de qualquer um desses sintomas, a próxima administração do anticorpo anti-CD40 pode ser atrasada ou cancelada. Se múltiplas doses de anti-CD40 forem administradas, a etapa (b) é, de preferência, conduzida de maneira que, após a iniciação da etapa (b), permita a exposição contínua do indivíduo ao agente terapêutico adicional pela duração do método, incluindo durante qualquer segunda ocorrência e ocorrências adicionais da etapa (a). Isso pode ser particularmente apropriado quando o agente adicional é um agente (tal como um anticorpo anti-PD1 ou anti-PDL1) que bloqueia ou inibe tal atividade de um ponto de verificação de sistema imunológico. O bloqueio de receptor contínuo pode ser particularmente importante para os efeitos terapêuticos de tais agentes. ETAPA (A)

[000114] A etapa (a) do método refere-se à administração sistêmica ou local de um anticorpo anti-CD40 a um indivíduo que tem um tumor sólido. A administração local ao sítio do tumor é preferencial e inclui a administração peritumoral, juxtatumoral, intratumoral, intralesional, perilesional, intracraniana e intravesical por qualquer meio adequado, tal como injeção. A administração local pode também incluir inalação e infusão intracavitária, dependendo do sítio do tumor.

[000115] Uma proporção alta do anticorpo anti-CD40 será retida no sítio do tumor in vivo, isto é, dentro do microambiente do tumor, por um período estendido de tempo após a administração do dito anticorpo. Isto é, o anticorpo exibe vazamento reduzido do sítio do tumor na circulação vascular ou linfática, particularmente, quando administrado localmente ao sítio do tumor. De preferência, pelo menos 30% de uma dose de anticorpo administrada a um tumor em conformidade com o método é retida no sítio do tumor em quatro horas após a administração, de maior preferência, pelo menos 40% da dose é retida em quatro horas após a administração e, de preferência máxima, pelo menos 50% da dose é retida no sítio do tumor em quatro horas após a administração.

[000116] A retenção de anticorpo em um microambiente de tumor pode ser estudada injetando-se o anticorpo em tumores em modelos murinos e medindo os níveis séricos do anticorpo ao longo do tempo após a administração. Alternativamente, a distribuição de um anticorpo pode ser medida com o uso de anticorpos radioidentificados injetados em tumores em modelos murinos. As técnicas adequadas são descritas nos Exemplos.

[000117] O pH em um microambiente do tumor in vivo é significativamente mais ácido do que este de tecidos saudáveis. As faixas para tumores são relatadas como cerca de pH 6,5 a 7,2 ou 6,6 a 7,0, em comparação a 7,2 a 7,4 para tecidos saudáveis. Essa acidez é principalmente devido à glicólise anaeróbica em regiões de tumor submetidas à hipoxia de curto prazo ou longo prazo como um resultado da vasculatura insuficientemente organizada com fluxo sanguíneo caótico diminuído e glicólise aeróbica (o efeito de Warburg), uma propriedade fenotípica de câncer comum em que as trajetórias metabólicas glicolíticas são usadas mesmo na presença de oxigênio. Dada essa acidez, um anticorpo anti- CD40 usado no método da invenção pode, de preferência, ter um alto ponto isoelétrico porque isso leva à retenção aprimorada no microambiente do tumor em relação a um anticorpo similar com um ponto isoelétrico mais baixo.

[000118] O ponto isoelétrico de um anticorpo pode ser determinado por qualquer método adequado. O mesmo pode ser determinado in vitro, por exemplo, por métodos eletroforéticos. Alternativamente, o ponto isoelétrico pode ser calculado a partir de princípios básicos. Nesse caso, o ponto isoelétrico resultante é tipicamente referido como um ponto isoelétrico teórico. Inúmeros programas de software existem para o cálculo in silico do ponto isoelétrico teórico, por exemplo, GP-MAW (versão 9.2, junto à Lighthouse Data). Um anticorpo anti-CD40 usado no método da invenção tem, de preferência, um ponto isoelétrico teórico (pi) de 9,0 ou mais, de preferência, 9,1 ou mais, de maior preferência, 9,2 ou mais ou 9,25 ou mais, de preferência máxima, 9,3 ou mais. ETAPA (B)

[000119] A etapa (b) do método refere-se à administração sistêmica de um agente terapêutico adicional a um indivíduo. A administração sistêmica de qualquer agente descrito no presente documento (incluindo o anticorpo anti- CD40 da etapa (a)) significa a administração ao sistema circulatório do indivíduo, incluindo o sistema vascular e/ou linfático. Tal administração pode ser por qualquer via adequada, mas é tipicamente parenteral.

[000120] A frase “administração parenteral” conforme usado no presente documento significa os modos de administração diferentes da administração entérica e tópica e é tipicamente alcançada por injeção, infusão ou implantação. As vias adequadas incluem intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal, intracerebral, intratecal, intraóssea ou outras vias de administração parenterais. ANTICORPOS GERAL

[000121] O termo “anticorpo” conforme referido no presente documento inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação a antígeno (isto é, “porção de ligação a antígeno”) ou cadeias únicas do mesmo. Um anticorpo refere-se a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto ou uma porção de ligação a antígeno da mesma. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões VH e VL podem ser, ainda, subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDR), interspersas com regiões que são mais conservadas, chamadas de regiões de arcabouço (FR). As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a fatores ou tecidos hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complementar clássico.

[000122] As cadeias pesadas podem ser qualquer isótipo, incluindo IgG (subtipos lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4), IgA (subtipos lgA1 e lgA2), IgM e IgE.

[000123] As cadeias leves incluem cadeias kappa e cadeias lambda.

[000124] São de relevância particular anticorpos e seus fragmentos de ligação a antígeno que foram “isolados” de modo a existirem em um meio físico distinto deste em que os mesmos podem ocorrer em natureza ou que foram modificados de modo a se diferirem de um anticorpo de ocorrência natural na sequência de aminoácidos. Um anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. O anticorpo pode ser produzido por qualquer método adequado. Por exemplo, os métodos adequados para produzir anticorpos monoclonais são revelados em “Monoclonal Antibodies; A manual of techniques”, H Zola (CRC Press, 1988) e em “Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application”, SGR Hurrell (CRC Press, 1982). Técnicas recombinantes podem também ser usadas.

[000125] O termo “porção de ligação a antígeno” ou “fragmento de ligação a antígeno” de um anticorpo refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno, tal como CD40. Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo “porção de ligação a antígeno” de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fab’, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento dAb e uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Anticorpos de cadeia única tal como scFv e anticorpos de cadeia pesada tal como VHH e anticorpos de camelo também devem ser abrangidos pelo termo “porção de ligação a antígeno” de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo podem ser obtidos com o uso de técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica, e os fragmentos podem ser triados quanto à utilidade da mesma forma que os anticorpos intactos.

[000126] Um anticorpo para o uso nos métodos da invenção pode ser um anticorpo humano. O termo “anticorpo humano”, conforme usado no presente documento, pretende incluir anticorpos que têm regiões variáveis em que tanto as regiões de arcabouço quanto CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Ademais, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica para sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, conforme usado no presente documento, não pretende incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, tais como um camundongo, foram enxertadas em sequências de arcabouço humanas - tais anticorpos são tipicamente referidos como quiméricos ou humanizados.

[000127] Um anticorpo humano para o uso nos métodos da invenção é tipicamente um anticorpo monoclonal humano. Tal anticorpo monoclonal humano pode ser produzido por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, que tem um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humanos fundidos a uma célula imortalizada. Anticorpos humanos podem também ser preparados pela imunização in vitro de linfócitos humanos seguida pela transformação dos linfócitos com vírus Epstein- Barr. O termo “derivados de anticorpo humano” refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, por exemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.

[000128] Um anticorpo para o uso nos métodos da invenção pode ser, alternativamente, um anticorpo humanizado.

[000129] O termo “humanizada” refere-se a uma molécula de anticorpo, preparada geralmente com o uso de técnicas recombinantes, que tem um sítio de ligação a antígeno derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana e uma estrutura de imunoglobulina remanescente com base na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. O sítio de ligação de antígeno pode compreender ou domínios variáveis de anticorpo não humano completos fundidos a domínios constantes humanos ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de tais domínios variáveis enxertados a regiões de arcabouço humanas apropriadas de domínios variáveis humanos. Os resíduos de arcabouço de tais moléculas humanizadas podem ser do tipo selvagem (por exemplo, completamente humanos) ou os mesmos podem ser modificados para conter uma ou mais substituições de aminoácidos não encontradas no anticorpo humano cuja sequência serviu como base para a humanização. A humanização diminui ou elimina a probabilidade de que uma região constante da molécula atuará como um imunógeno em indivíduos humanos, mas a possibilidade de uma resposta imunológica à região variável estranha permanece (LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A) 86:4.220 a 4.224). Outra abordagem foca não apenas em fornecer regiões constantes derivadas de humano, mas modificar as regiões variáveis assim como a reformar as mesmas o mais proximamente possível à forma humana. Sabe-se que as regiões variáveis de ambas as cadeias leves e pesadas contêm três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que variam em resposta aos antígenos em questão e determinam a capacidade de ligação, flanqueadas por quatro regiões de arcabouço (FRs) que são relativamente conservadas em uma dada espécie, e que fornecem putativamente uma armação para as CDRs. Quando anticorpos não humanos são preparados em relação a um antígeno particular, as regiões variáveis podem ser “reformadas” ou “humanizadas” por enxerto de CDRs derivadas de anticorpo não humano nas FRs presentes no anticorpo humano a ser modificado. A aplicação dessa abordagem a vários anticorpos foi relatada por Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851 a 856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323 a 327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity”, Science 239: 1.534 a 1.536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation”, Protein Engineering 4:773 a 3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity”, Human Antibodies Hybridoma 2: 124 a 134; Gorman, S. D. er al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody”, Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A) 88:4.181 a 4.185; Tempest, P.R. er al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo”, Bio/Technology 9:266 a 271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A) 88:2.869 a 2.873; Carter, P. ef al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A) 89:4.285 a 4.289; e Co, M.S. ef al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen”, J. Immunol. 148: 1.149 a 1.154. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas as seis CDRs dos anticorpos de camundongo). Em outras modalidades, os anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco, seis) que são alteradas em relação ao anticorpo original, que são também chamadas de uma ou mais CDRs “derivadas de” uma ou mais CDRs do anticorpo original. A capacidade de humanizar um antígeno é bem conhecida (consulte, por exemplo, as Patentes n° US 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.859.205; 6.407.213; 6.881.557).

[000130] Qualquer anticorpo referido no presente documento pode ser fornecido de forma isolada ou pode ser opcionalmente fornecido (direta ou indiretamente) a outra porção química. A outra porção química pode ser uma molécula terapêutica, tal como uma porção citotóxica ou um fármaco. A molécula terapêutica pode ser diretamente ligada, por exemplo, por conjugação química, a um anticorpo da invenção. Os métodos para conjugar moléculas a um anticorpo são conhecidos na técnica. Por exemplo, a conjugação de carbodi- imida (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151 a 159) pode ser usada para conjugar uma variedade de agentes, incluindo doxorrubicina, a anticorpos ou peptídeos. A carbodi-imida solúvel em água, 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC) é particularmente útil para conjugar uma porção química funcional a uma porção química de ligação.

[000131] Outros métodos para conjugar uma porção química a anticorpos podem também ser usados. Por exemplo, a oxidação de periodato de sódio seguida por alquilação redutiva de regentes apropriados pode ser usada, assim como a reticulação de glutaraldeído. Entretanto, é reconhecido que, independentemente de qual método de produção um conjugado da invenção é selecionado, uma determinação deve ser feita de que o anticorpo mantém sua capacidade de direcionamento e de que a porção química funcional mantém sua função relevante.

[000132] Uma porção química citotóxica pode ser direta e/ou indiretamente citotóxica. Por “diretamente citotóxica” entende-se que a porção química é uma que é, por si própria, citotóxica. Por “indiretamente citotóxica” entende-se que a porção química é uma que, embora a própria não seja citotóxica, pode incluir citotoxicidade, por exemplo, por sua ação em uma molécula adicional ou por uma ação adicional na mesma. A porção química citotóxica pode ser citotóxica apenas quando intracelular e não é, de preferência, citotóxica quando extracelular.

[000133] De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é ligado a uma porção química citotóxica que é um agente quimioterápico diretamente citotóxico. Opcionalmente, a porção química citotóxica é um polipeptídeo diretamente citotóxico. Os agentes quimioterápicos citotóxicos são bem conhecidos na técnica.

[000134] Os agentes quimioterápicos citotóxicos, tais como agentes anticâncer, incluem: agentes alquilantes incluindo mostardas de nitrogênio, tais como mecloretamina (HN2), ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano (L-sarcolisina) e clorambucila; etileniminas e metilmelaminas, tais como hexametilmelamina, tiotepa; sulfonatos de alquila, tais como bussulfano; nitrosoureias, tais como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU) e estreptozocina (estreptozotocina); e triazenos, tais como decarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazol-carboxamida); Antimetabólitos incluindo análogos de ácido fólico tais como metotrexato (ametopterina); análogos de pirimidina, tais como fluorouracila (5-fluorouracila; 5-FU), floxuridina (fluorodeoxiuridina; FUdR) e citarabina (citosina arabinosídeo); e análogos de purina e inibidores relacionados, tais como mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) e pentostatina (2’- deoxicoformicina). Produtos naturais incluindo alcaloides da vinca, tais como vimblastina (VLB) e vincristina; epipodofilotoxinas, tais como etoposido e teniposido; antibióticos, tais como dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) e mitomicina (mitomicina C); enzimas, tais como L-asparaginase; e modificadores de resposta biológica, tais como alfenomas de interferon. Agentes diversos incluindo complexos de coordenação da platina tais como cisplatina (cis-DDP) e carboplatina; antracenodiona tais como mitoxantrona e antraciclina; ureia substituída tal como hidroxiureia; derivado de metil hidrazina tal como procarbazina (N-metil- hidrazina, MIH); e supressor adrenocortical, tais como mitotano (o,p’-DDD) e aminoglutetimida; taxol e análogos/derivados; e agonistas/antagonistas de hormônio, tais como flutamida e tamoxifeno.

[000135] A porção química citotóxica pode ser uma porção química citotóxica de peptídeo ou polipeptídeo que leva à morte celular. As porções químicas citotóxicas de peptídeo e polipeptídeo são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, ricina, abrina, exotoxina de Pseudomonas, fator de tecido e similares. Os métodos para ligar as mesmas a porções químicas de direcionamento tais como anticorpos são também conhecidos na técnica. Outras proteínas de inativação de ribossoma são descritas como agentes citotóxicos no documento WO 96/06641. A exotoxina de Pseudomonas pode também ser usada como o polipeptídeo citotóxico. Determinadas citocinas, tais como TNFα e IL-2, podem também ser úteis como agentes citotóxicos.

[000136] Determinados átomos radioativos podem também ser citotóxicos se entregues em doses suficientes. Assim, a porção química citotóxica pode compreender um átomo radioativo que, em uso, entrega uma quantidade suficiente de radioatividade ao sítio alvo de modo a ser citotóxico. Os átomos radioativos adequados incluem fósforo-32, iodo-125, iodo-131, índio-111, rênio-186, rênio-188 ou ítrio-90 ou qualquer outro isótopo que emita energia suficiente para destruir células vizinhas, organelas ou ácido nucleico. De preferência, os isótopos e a densidade de átomos radioativos nos agentes da invenção são tais que uma dose maior do que 4.000 cGy (de preferência, pelo menos 6.000, 8.000 ou 10.000 cGy) é entregue ao sítio alvo e, de preferência, às células no sítio alvo e suas organelas, particularmente, o núcleo.

[000137] O átomo radioativo pode ser ligado ao anticorpo, fragmento de ligação a antígeno, variante, fusão ou derivado do mesmo de modos conhecidos. Por exemplo, EDTA ou outro agente quelante pode ser ligado à porção química de ligação e usado para ligar 1111n ou 90Y. Os resíduos de tirosina podem ser diretamente identificados com 1251 ou 1311.

[000138] A porção química citotóxica pode ser um polipeptídeo indiretamente citotóxico adequado. O polipeptídeo indiretamente citotóxico pode ser um polipeptídeo que tem atividade enzimática e pode converter um pró-fármaco não tóxico e/ou relativamente não tóxico em um fármaco citotóxico. Com anticorpos, esse tipo de sistema é frequentemente referido como ADEPT (Terapia de Pró-fármaco de Enzima Direcionada a Anticorpo). O sistema exige que o anticorpo localize a porção enzimática ao sítio desejado no corpo do paciente e, após permitir um tempo para a enzima se localizar no sítio, administrar um pró-fármaco que é um substrato para a enzima, sendo que o produto final da catálise é um composto citotóxico. O objetivo da abordagem é maximizar a concentração do fármaco no sítio desejado e minimizar a concentração do fármaco em tecidos normais. A porção química citotóxica pode ter a capacidade de converter um pró-fármaco não citotóxico em um fármaco citotóxico.

[000139] A enzima e o pró-fármaco do sistema que usa uma enzima direcionada conforme descrito no presente documento pode ser qualquer um daqueles anteriormente propostos. A substância citotóxica pode ser qualquer fármaco anticâncer existente tal como um agente alquilante; um agente que intercala no DNA; um agente que inibe quaisquer enzimas chave tais como di-hidrofolato redutase, timidina sintetase, ribonucleotídeo redutase, nucleosídeo quinases ou topoisomerase; ou um agente que efetua morte celular interagindo com qualquer outro constituinte celular. O etoposido é um exemplo de um inibidor de topoisomerase.

[000140] Os sistemas de pró-fármaco relatados incluem aqueles listados na Tabela 1.

[000141] As enzimas adequadas para formar parte de uma porção enzimática incluem: exopeptidases, tais como carboxipeptidases G, G1 e G2 (para pró-fármacos de mostarda glutamilados), carboxipeptidases A e B (para pró-fármacos à base de MTX) e aminopeptidases (para pró-fármacos de 2-α- aminocil MTC); endopeptidases, tais como, por exemplo, trombolisina (para pró-fármacos de trombina); hidrolases, tais como fosfatases (por exemplo, fosfatase alcalina) ou sulfatases (por exemplo, sulfatases de arila) (para pró- fármacos fosfilados ou sulfatados); amidases, tais como penicilina amidases e arilacil amidase; lactamases, tais como β-lactamases; glicosidases, tais como β-glucuronidase (para pró-fármacos de β-glucuronomida antraciclinas), α- galactosidase (para amigdalina) e β-galactosidase (para β- galactose antraciclina); deaminases, tais como citosina deaminase (para 5FC); quinases, tais como uroquinase e timidina quinase (para ganciclovir); redutases, tais como nitrorredutase (para CB1954 e análogos), azorredutase (para mostardas de azobenzeno) e DT-diaforase (para CB1954); oxidases, tais como glicose oxidase (para glicose), xantina oxidase (para xantina) e lactoperoxidase; DL-racemases, anticorpos catalíticos e ciclodextrinas.

[000142] De preferência, o pró-fármaco é relativamente não tóxico em comparação ao fármaco citotóxico. Tipicamente, o mesmo tem menos do que 10% da toxicidade, de preferência, menos do que 1% da toxicidade conforme medido em um teste de toxicidade in vitro adequado.

[000143] É provável que a porção química que tem a capacidade de converter um pró-fármaco em um fármaco citotóxico seja ativa no isolamento do resto do agente da invenção, mas é necessário apenas que a mesma seja ativa quando (a) a mesma está em combinação com o resto do agente da invenção e (b) o agente da invenção é ligado, adjacente ou internalizado nas células alvo.

[000144] Quando cada porção química é um polipeptídeo, as duas porções podem ser ligadas em conjunto por meio de quaisquer meios convencionais de reticulação de polipeptídeos. Por exemplo, o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno pode ser enriquecido com grupos tiol e a porção química adicional reagida com um agente bifuncional que tem a capacidade de reagir com esses grupos tiol, por exemplo, o éster de N-hidroxissuccinimida de ácido iodoacético (NHIA) ou N-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato (SPDP). As ligações de amida e tioéter, por exemplo, alcançadas com éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, são geralmente mais estáveis in vivo do que ligações de dissulfeto.

[000145] A porção química citotóxica pode ser um radiossensibilizador. Radiossensibilizadores incluem fluoropirimidinas, análogos de timidina, hidroxiureia, gemcitabina, fludarabina, nicotinamida, pirimidinas halogenadas, 3-aminobenzamida, 3-aminobenzodiamida, etanixadol, pimonidazol e misonidazol. Também, a entrega de genes a células pode radiossensibilizar as mesmas, por exemplo, a entrega do gene p53 ou ciclina D. A porção química adicional pode ser uma que se torna citotóxica ou libera uma porção química citotóxica, mediante a irradiação. Por exemplo, o isótopo de boro-10, quando apropriadamente irradiado, libera partículas que são citotóxicas. Similarmente, a porção química citotóxica pode ser uma que é útil na terapia fotodinâmica tal como fotofrina. ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA CD40

[000146] As terapias de combinação e métodos da invenção utilizam um anticorpo que se liga imunoespecificamente à CD40, isto é, um “anticorpo anti- CD40”. Em uma modalidade, o dito anticorpo é retido no sítio do tumor após a administração a um indivíduo (consultar a discussão sob a etapa (a) acima)). O anticorpo, de preferência, se liga especificamente à CD40, isto é, o mesmo se liga à CD40, mas não se liga ou se liga com uma afinidade menor (por exemplo, uma afinidade 10 vezes menor) a outras moléculas. A não ser que especificado de outro modo, o termo CD40 conforme usado no presente documento refere-se à CD40 humana. A sequência de CD40 humana é definida na SEQ ID NO: 13. Um anticorpo anti-CD40 da presente invenção pode ter alguma afinidade de ligação para CD40 de outros mamíferos, por exemplo, CD40 primata ou murina. O anticorpo, de preferência, se liga à CD40 humana quando localizado na superfície de uma célula.

[000147] Particularmente, os anticorpos anti-CD40 usados nas terapias de combinação da invenção competem para se ligar à CD40 humana com um ‘anticorpo de referência’ que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 (opcionalmente em conjunto com as regiões constantes leve e pesada de SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente). Tal inibição de ligação competitiva pode ser determinada com o uso de ensaios e métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, com o uso de chips BIAcore com CD40 humana imobilizada e incubação na presença do anticorpo de referência, com e sem um anticorpo polipeptídeo a ser testado. Alternativamente, uma abordagem de mapeamento em pares pode ser usada, em que o anticorpo de referência é imobilizado para a superfície do chip BIAcore, CD40 humana é ligada ao anticorpo imobilizado e, então, um segundo anticorpo é testado quanto à capacidade de ligação simultânea à CD40 humana (consultar ‘BIAcore Assay Handbook’, GE Healthcare Life Sciences, 29-0194-00 AA 05/2012; cujas revelações são incorporadas ao presente documento a título de referência).

[000148] Os anticorpos anti-CD40 exemplificativos são revelados no documento WO 2013/034904 por Alligator Bioscience AB (cujas revelações são incorporadas ao presente documento a título de referência).

[000149] O anticorpo, de preferência, tem a capacidade de se ligar à CD40 em seu estado nativo e, particularmente, à CD40 localizada na superfície de uma célula. De preferência, um anticorpo se ligará especificamente à CD40. Isto é, um anticorpo usado nos métodos da invenção irá, de preferência, se ligar à CD40 com maior afinidade de ligação do que este que se liga a outra molécula.

[000150] Por “localizada na superfície de uma célula” entende-se que CD40 é associada à célula de modo que uma ou mais regiões da CD40 estejam presentes na face externa da superfície celular. Por exemplo, a CD40 pode ser inserida na membrana plasmática das células (isto é, orientada como uma proteína de transmembrana) com uma ou mais regiões apresentadas na superfície extracelular. Isso pode ocorrer no curso da expressão de CD40 pela célula. Assim, em uma modalidade, “localizada na superfície de uma célula” pode significar “expressa na superfície de uma célula”. Alternativamente, CD40 pode estar fora da célula com interações covalentes e/ou iônicas localizando a mesma em uma região específica da superfície celular.

[000151] Um anticorpo anti-CD40 usado nas terapias de combinação e métodos da invenção pode induzir e/ou acentuar a lise mediada por ADCC de uma célula que expressa CD40 e/ou acentuar a apoptose de uma célula que expressa CD40. A célula é tipicamente uma célula tumoral. Por “acentuar” entende-se que o número de células lisadas ou que sofreram apoptose aumenta na presença de um anticorpo da invenção, em relação ao número de células lisadas ou que sofreram apoptose na presença de uma substância de controle apropriada. Os métodos para determinar o nível de apoptose ou lise mediada por ADCC em uma amostra de células são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio de liberação de cromo-51, ensaio de liberação de európio ou ensaio de liberação de enxofre-35 pode ser usado. Em tais ensaios, uma linhagem de células alvo anteriormente identificada que expressa o antígeno (nesse caso, CD40) é incubada com um anticorpo a ser testado. Após a lavagem, células efetoras (tipicamente expressando CD16 de receptor Fc) são coincubadas com as células alvo identificado com anticorpo. A lise de célula alvo é subsequentemente medida pela liberação da identificação intracelular por um contador de cintilação ou espectrofotometria.

[000152] De preferência, o anticorpo, fragmento de ligação a antígeno, compreende uma região de anticorpo Fc. Será apreciado por uma pessoa versada que a porção de Fc pode ser de um anticorpo IgG ou de uma classe diferente de anticorpo (tal como, IgM, IgA, IgD ou IgE). Por exemplo, a região Fc pode ser de um anticorpo lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. Vantajosamente, entretanto, a região Fc é de um anticorpo lgG1.

[000153] A região Fc pode ser de ocorrência natural (por exemplo, parte de um anticorpo endogenamente produzido) ou pode ser artificial (por exemplo, compreendendo uma ou mais mutações pontuais em relação a uma região Fc de ocorrência natural). As regiões Fc com mutações pontuais que melhoram sua capacidade de ligar FcR podem ser vantajosas, por exemplo, alterando-se a meia-vida sérica ou melhoram a ligação a receptores Fey (FcyR) envolvidos em ADCC e CDC. Particularmente, as mutações que acentuam a ligação a FcyRIIB, por exemplo, S267E (Strohl et al., 2009, Curr Opin Biotechnol, 20:685 a 691) podem ser vantajosos para a invenção dado o vínculo entre a ligação de FcyRIIB e a atividade funcional de anticorpos CD40 (Li et al., 20 1, Science, 333: 1.030 a 1.034).

[000154] Como uma alternativa à identificação com radioisótopos exigida em tais ensaios, podem ser usados métodos em que a lise é detectada medindo-se a liberação de enzimas naturalmente presentes nas células alvo. Isso pode ser alcançado pela detecção (por exemplo, detecção bioluminescente) dos produtos de uma reação catalisada por enzima. Nenhuma identificação anterior das células é exigida em tal ensaio. Uma enzima celular típica detectada com tal ensaio é GAPDH.

[000155] Um anticorpo anti-CD40 usado nas terapias de combinação e métodos da invenção pode modular a atividade de uma célula que expressa CD40, em que a dita modulação é um aumento ou uma diminuição na atividade da dita célula. A célula é tipicamente uma célula dendrítica ou uma célula B.

[000156] APCs especializadas, tais como células dendríticas, são ativadas quando a sinalização por meio de CD40 ocorre, o que aciona diversos eventos biológicos, incluindo ativação de célula imune, proliferação e produção de citocinas e quimiocinas. Os métodos para determinar a ativação de células dendríticas associada à CD40 são conhecidos na técnica (discutida, por exemplo, em Schonbeck et al., 2001, Cell Mol Life Sci., 58:40 a 43; van Kooten et al., 2000, J. Leuk., Biol., 67: 2 a 17) e são descritos adicionalmente abaixo.

[000157] A estimulação de células B humanas com CD40L recombinante ou anticorpos anti-CD40 induz a regulação ascendente de marcadores de superfície, tais como CD23, CD30, CD80, CD86, Fas e MHC II, secreção de citocinas solúveis, por exemplo, IL-6, TNF-Y e TNF-α, e agregação homeotípica. Os métodos para determinar ativação de células B relacionada à CD40 são conhecidos na técnica (discutida, por exemplo, em Schonbeck et al., 2001, supra) e são descritos adicionalmente abaixo.

[000158] Os métodos e os ensaios para determinar a capacidade de um anticorpo de modular a atividade de células dendríticas e células B são conhecidos na técnica. Por exemplo, a ativação de células dendríticas pode ser avaliada medindo-se o nível de marcadores de superfície celular, tais como CD86 e CD80, e/ou medindo-se a secreção induzida por anticorpo anti-CD40 de IFNy de células T, em que um aumento em qualquer um desses parâmetros indica ativação aumentada e uma diminuição representa ativação diminuída. Similarmente, a capacidade de um anticorpo de modular a atividade de células B pode ser avaliada medindo-se o nível de marcadores de superfície celular (tal como CD86) e/ou medindo-se a proliferação de células B induzida por anticorpo anti-CD40 (consultar o Exemplo 3 abaixo), em que um aumento em qualquer um desses parâmetros indica ativação aumentada e uma diminuição representa ativação diminuída.

[000159] De preferência, um anticorpo anti-CD40 usado nas terapias de combinação e métodos da invenção que aumenta a ativação de células dendríticas ou células B tem um potencial para ativação de células dendríticas e células B. A ativação celular pode ser tipicamente medida como um nível de EC50 em um ensaio que envolve incubar células dendríticas ou B com o estimulador de teste e, então, detectar a proliferação celular como a medida de ativação.

[000160] Os termos “atividade de ligação” e “afinidade de ligação” se destinam a referir-se à tendência de uma molécula de anticorpo de ligar-se ou não se ligar a um alvo. A afinidade de ligação pode ser quantificada determinando-se a constante de dissociação (Kd) para um anticorpo e seu alvo. Similarmente, a especificidade de ligação de um anticorpo a seu alvo pode ser definida em termos das constantes de dissociação comparativas (Kd) do anticorpo para seu alvo em comparação à constante de dissociação em relação ao anticorpo e outra molécula não alvo.

[000161] Tipicamente, a Kd para o anticorpo em relação ao alvo será 2 vezes, de preferência, 5 vezes, mais preferencialmente 10 vezes menor que a Kd em relação a outra molécula não alvo, tal como material não relacionado ou material acompanhante no ambiente. Mais preferencialmente, a Kd será 50 vezes menos, ainda mais preferencialmente, 100 vezes menor e, ainda mais preferencialmente, 200 vezes menor.

[000162] O valor dessa constante de dissociação pode ser determinado diretamente por métodos bem conhecidos e pode ser computado ainda para misturas complexas por métodos, tais como aqueles, por exemplo, apresentados em Caceci et al. (Byte 9:340 a 362, 1984). Por exemplo, a Kd pode ser estabelecida com o uso de um ensaio de ligação de filtro de nitrocelulose de filtro duplo, tal como aquele revelado por Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Outros ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação de ligantes, tais como anticorpos, direcionados para alvos são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots, RIAs e análise de citometria de fluxo. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) do anticorpo pode ser avaliada por ensaios padrão conhecidos na técnica, tal como por análise de sistema Biacore™.

[000163] Um ensaio de ligação competitiva pode ser conduzido em que a ligação do anticorpo ao alvo é comparada à ligação do alvo por outro ligante conhecido desse alvo, tal como outro anticorpo. A concentração em que 50% de inibição ocorre é conhecida como a Ki. Sob condições ideais, a Ki é equivalente a Kd. O valor de Ki nunca será menor que a Kd, assim, a medição de Ki pode ser convenientemente substituída para fornecer um limite superior para Kd.

[000164] Um anticorpo anti-CD40 usado nas terapias de combinação e métodos da invenção tem, de preferência, capacidade de ligação a seu alvo com uma afinidade que é pelo menos duas vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou maior que sua afinidade para ligação a outra molécula não alvo.

[000165] Um anticorpo usado nas terapias de combinação e métodos da invenção exibirá tipicamente a capacidade de: (i) ligar-se especificamente a CD40 humana quando localizado na superfície de uma célula; e/ou (ii) acentuar a lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de uma célula que expressa CD40; e/ou (iii) acentuar a apoptose de uma célula que expressa CD40; e/ou (iv) modular a atividade de uma célula que expressa CD40, em que a dita modulação é um aumento ou uma diminuição na atividade da dita célula.

[000166] O anticorpo pode ser ou pode compreender uma variante ou um fragmento de um dos anticorpos anti-CD40 específicos revelados no presente documento, contanto que a dita variante ou fragmento retenha a especificidade para CD40 e pelo menos uma de suas características funcionais (i) a (iv).

[000167] Um fragmento é, de preferência, uma porção de ligação a antígeno de um dito anticorpo. Um fragmento pode ser produzido por truncamento, por exemplo, por remoção de um ou mais aminoácidos das extremidades N e/ou C-terminais de um polipeptídeo. Até 10, até 20, até 30, até 40 ou mais aminoácidos podem ser removidos do N e/ou C- terminal dessa forma. Os fragmentos podem ser também gerados por uma ou mais deleções internas.

[000168] Uma variante pode compreender uma ou mais substituições, deleções ou adições em relação às sequências de um anticorpo antib-CD40 específico no presente documento. Uma variante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, até 10, até 20, até 30 ou mais substituições e/ou deleções de aminoácidos das sequências específicas reveladas no presente documento. As variantes de “deleção” podem compreender a deleção de aminoácidos individuais, a deleção de grupos pequenos de aminoácidos, tais como 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, ou a deleção de regiões de aminoácido maiores, tais como a deleção de domínios de aminoácido específicos ou outros recursos. As variantes de “substituição”, de preferência, envolvem a substituição de um ou mais aminoácidos pelo menos número de aminoácidos e a produção de substituições de aminoácidos. Por exemplo, um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido alternativo que tem propriedades similares, por exemplo, outro aminoácido básico, outro aminoácido ácido, outro aminoácido neutro, outro aminoácido carregado, outro aminoácido hidrofílico, outro aminoácido hidrofóbico, outro aminoácido polar, outro aminoácido aromático ou outro aminoácido alifático.

[000169] Algumas propriedades dos 20 aminoácidos principais que podem ser usados para selecionar substituintes adequados são da seguinte forma:

[000170] As “variantes” preferenciais incluem aquelas em que, em vez do aminoácido de ocorrência natural, o aminoácido que aparece na sequência é um análogo estrutural do mesmo. Os aminoácidos usados nas sequências podem também ser derivados ou modificados, por exemplo, identificados, desde que a função do anticorpo não seja afetada de modo significativamente adverso.

[000171] As variantes podem ser preparadas durante a síntese do anticorpo ou por modificação pós-produção, ou quando o anticorpo está na forma recombinante com o uso das técnicas conhecidas de mutagênese sítio-dirigida, mutagênese aleatória ou clivagem enzimática e/ou ligação de ácidos nucleicos.

[000172] De preferência, os anticorpos variantes têm uma sequência de aminoácidos que tem mais do que 60% ou mais do que 70%, por exemplo, 75 ou 80%, de preferência, mais do que 85%, por exemplo, mais do que 90 ou 95% de identidade de aminoácidos ao domínio de VL ou VH de um anticorpo revelado no presente documento. Esse nível de identidade de aminoácidos pode ser visto através do comprimento completo da sequência SEQ ID NO relevante ou através de uma parte da sequência, tal como através de 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 ou mais aminoácidos, dependendo do tamanho do polipeptídeo de comprimento completo.

[000173] Em conexão com as sequências de aminoácidos, “identidade de sequência” refere-se às sequências que têm o valor estabelecido quando avaliadas com o uso de ClustalW (Thompson et al., 1994, supra) com os seguintes parâmetros:

[000174] Parâmetros de alinhamento de pares de sequências - Método: exato, Matriz: PAM, penalidade por lacuna aberta: 10,00, penalidade por extensão da lacuna: 0,10.

[000175] Múltiplos parâmetros de alinhamento - Matriz: PAM, penalidade por lacuna aberta: 10,00, % de identidade por atraso: 30, Penalizar lacunas de extremidade: ligado, distância de separação de lacuna: 0, Matriz negativa: não, penalidade por extensão da lacuna: 0,20, penalidades por lacuna específica por resíduo: ligado, penalidade por lacuna hidrofílica: ligado, resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR. A identidade de sequência em um resíduo particular destina-se a incluir resíduos idênticos que foram simplesmente derivados.

[000176] Um anticorpo anti-CD40 para uso nas terapias de combinação e métodos da invenção pode ligar-se ao mesmo epítopo que um anticorpo específico, conforme revelado no presente documento, visto que tal anticorpo provavelmente imita a ação do anticorpo revelado. Se um anticorpo se liga ou não ao mesmo epítopo que outro anticorpo pode ser determinado por métodos de rotina. Por exemplo, a ligação de cada anticorpo a um alvo pode ser com o uso de um ensaio de ligação competitiva. Os métodos para executar ensaios de ligação competitiva são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, podem envolver colocar em contato um anticorpo e uma molécula alvo sob condições sob as quais o anticorpo pode se ligar à molécula alvo. O complexo anticorpo/alvo pode ser, então, colocado em contato com um segundo anticorpo (teste) e a extensão em que o anticorpo de teste tem capacidade de deslocar o primeiro anticorpo dos complexos de anticorpo/alvo pode ser avaliada. Tal avaliação pode usar qualquer técnica adequada, incluindo, por exemplo, Ressonância de Plásmon de Superfície, ELISA ou citometria de fluxo. A capacidade de um anticorpo de teste de inibir a ligação de um primeiro anticorpo ao alvo demonstra que o anticorpo de teste pode competir com o dito primeiro anticorpo pela ligação ao alvo e, assim, o anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo ou região no alvo como o primeiro anticorpo, e pode, portanto, imitar a ação do primeiro anticorpo.

[000177] Um anticorpo anti-CD40 usado nas terapias de combinação e métodos da invenção pode ser um anticorpo que compreende uma, duas ou todas as três das sequências de CDR de SEQ ID NOs: 1 a 3 e/ou uma, duas ou todas as três sequências de CDR de SEQ ID NOs: 4 a 6. O anticorpo pode compreender todas as seis sequências de CDR de SEQ ID NOs: 1 a 6.

[000178] O anticorpo pode compreender a sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e/ou a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8.

[000179] O anticorpo pode ser, ou pode se ligar ao mesmo epítopo que, um anticorpo que compreende a sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8. Adicionalmente, o anticorpo pode compreender a sequência de região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e/ou a sequência de região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 12.

[000180] O anticorpo anti-CD40 ou qualquer variante ou fragmento do mesmo usado nas terapias de combinação e métodos da invenção, de preferência, tem um ponto isoelétrico teórico (pi) de 9,0 ou acima, de preferência, 9,1 ou acima, mais preferencialmente, 9,2 ou acima ou 9,25 ou acima, com máxima preferência, 9,3 ou acima.

TERAPIAS DE COMBINAÇÃO

[000181] A invenção fornece uma terapia de combinação para uso no tratamento de um tumor sólido em um indivíduo que compreende (a) um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CD40, e (b) um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente não é um anticorpo anti-CD40 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 compete pela ligação a CD40 humana com um anticorpo que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e em que o agente imunoterápico adicional especificamente se liga a uma molécula de ponto de verificação imunológico.

[000182] Os termos “terapia de combinação” ou “tratamento combinado” ou “em combinação”, conforme usados no presente documento, denotam qualquer forma de tratamento concomitante ou paralelo com pelo menos dois agentes terapêuticos distintos.

[000183] De acordo com determinadas modalidades, o anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e o agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 são administrados simultaneamente, na mesma composição ou em composições separadas. De acordo com outras modalidades, o anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e o agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 são administrados sequencialmente, isto é, o anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é administrado antes ou após a administração do agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40. Em algumas modalidades, a administração do anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e do agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 é concomitante, isto é, o período de administração do anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e aquele do agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 se sobrepõem um ao outro. Em algumas modalidades, a administração do anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e do agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 é não concomitante. Por exemplo, em algumas modalidades, a administração do anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é terminada antes de o agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 ser administrado. Em algumas modalidades, a administração de agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 é terminada antes de o anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ser administrado.

[000184] De acordo com determinadas modalidades típicas, o anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e o agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 são administrados dentro de uma única composição terapêutica. De acordo com algumas modalidades, a composição terapêutica compreende, ainda, diluentes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

[000185] O componente adicional das terapias de combinação da invenção é um agente imunoterápico com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente não é um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[000186] O termo “agente imunoterápico” destina-se a incluir qualquer molécula, peptídeo, anticorpo ou outro agente que possa estimular um sistema imunológico do hospedeiro para gerar uma resposta imunológica a um tumor ou câncer no indivíduo. Vários agentes imunoterápicos são úteis nas composições e métodos descritos no presente documento. Em uma modalidade, o agente imunoterápico é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[000187] O termo “resposta imunológica” inclui resposta imunológica mediada por células T e/ou mediada por células B. As respostas imunológicas exemplificativas incluem respostas de células T, por exemplo, produção de citocina e citotoxicidade celular. Adicionalmente, o termo resposta imunológica inclui respostas imunológicas que são indiretamente efetuadas por ativação de células T, por exemplo, produção de anticorpos (respostas humorais) e ativação de células responsivas à citocina, por exemplo, macrófagos.

[000188] O termo “molécula de ponto de verificação imunológico” destina-se a incluir um grupo de proteínas na superfície celular de células imunológicas, tais como células T CD4+ e/ou CD8+, células dendríticas, células NK e macrófagos, mas também determinadas células tumorais, que modulam respostas imunológicas. Será percebido pelas pessoas versadas na técnica que uma proteína de ponto de verificação imunológico pode ser inibidora, por exemplo, CTLA-4 e PD-1, ou estimulante, por exemplo, OX40 e CD137. A molécula de ponto de verificação imunológico exemplificativa inclui, sem limitação, PD-1, CTLA-4, OX40 (CD134), CD137, VISTA, B7-H2, B7- H3, PD-L 1, B7-H4, B7-H6, 2B4, ICOS, HVEM, PD- L2, CD160, gp49B, PIR-B, receptores da família KIR, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, BTLA, SIRPalpha (CD47), CD48, 2B4 (CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT e A2aR. Em uma modalidade preferencial, a molécula de ponto de verificação imunológico é PD-1, CTLA-4, OX40 (CD134) ou CD137.

[000189] O bloqueio ou a neutralização de uma ou mais moléculas de ponto de verificação imunológico inibidoras pode bloquear ou neutralizar, de outro modo, a sinalização inibidora para, assim, regular de modo crescente uma resposta imunológica a fim de tratar de modo mais eficaz o câncer. Os agentes exemplificativos úteis para bloquear pontos de verificação imunológicos inibidores incluem anticorpos, moléculas pequenas, peptídeos, peptidomiméticos, ligantes naturais e derivados de ligantes naturais, que podem ligar e/ou inativar ou inibir proteínas de ponto de verificação imunológico inibidoras, ou fragmentos das mesmas; assim como interferência de RNA, antissenso, aptâmeros de ácido nucleico, etc. que regulam de modo decrescente a expressão e/ou a atividade de ácidos nucleicos de ponto de verificação imunológico inibidores, ou fragmentos dos mesmos. Os agentes exemplificativos para regular de modo crescente uma resposta imunológica incluem anticorpos contra uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico inibidoras que bloqueiam a interação entre as proteínas e seu receptor (ou receptores) natural; uma forma de não ativação de uma ou mais proteínas inibidoras de ponto de verificação imunológico (por exemplo, um polipeptídeo negativo dominante): moléculas ou peptídeos pequenos que bloqueiam a interação entre uma ou mais proteínas inibidoras de ponto de verificação imunológico e seu receptor (ou receptores) natural; proteínas de fusão (por exemplo, a porção extracelular de uma proteína de inibição de ponto de verificação imunológico fundidas à porção Fc de um anticorpo ou imunoglobulina) que se ligam a seu receptor (ou receptores) natural; moléculas de ácido nucleico que bloqueia a transcrição ou a tradução de ácido nucleico de ponto de verificação imunológico inibidor; e similares. Tais agentes podem bloquear diretamente a interação entre o um ou mais pontos de verificação imunológicos inibidores e seu receptor (ou receptores) natural (por exemplo, anticorpos) para impedir a sinalização inibidora e regular de modo crescente uma resposta imunológica. Alternativamente, os agentes podem bloquear indiretamente a interação entre uma ou mais proteínas inibidoras de ponto de verificação imunológico e seu receptor (ou receptores) natural para impedir a sinalização inibidora e regular de modo crescente uma resposta imunológica. Por exemplo, uma versão solúvel de um ligante proteico de ponto de verificação imunológico, tal como um domínio extracelular estabilizado, pode ligar-se a seu receptor para reduzir indiretamente a concentração eficaz do receptor para ligação a um ligante adequado. Em uma modalidade, os anticorpos anti-PD-1, os anticorpos anti-PD-L1 e os anticorpos anti-CTLA-4, sozinhos ou em combinação, são usados para inibir inibidores de ponto de verificação imunológico.

[000190] Assim, em uma modalidade, o agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 é um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga e inibe a função de uma molécula de ponto de verificação imunológico inibidora.

[000191] A ativação de uma ou mais moléculas de ponto de verificação imunológico estimulantes pode regular de modo crescente uma resposta imunológica a fim de tratar de modo mais eficaz o câncer. Os agentes exemplificativos úteis para ativar pontos de verificação imunológicos estimulantes incluem anticorpos, moléculas pequenas, peptídeos, peptidomiméticos, ligantes naturais e derivados de ligantes naturais, que podem ativar proteínas estimulantes de ponto de verificação imunológico, ou fragmentos dos mesmos; assim como interferência de RNA, antissenso, aptâmeros de ácido nucleico, etc. que podem acentuar os ácidos nucleicos de ponto de verificação imunológico, ou fragmentos dos mesmos. Os agentes exemplificativos para regular de modo crescente uma resposta imunológica incluem uma versão solúvel de um ligante proteico estimulante de ponto de verificação imunológico, ou tal ligante fundido a um Fc ou um domínio que facilite uma multimerização do ligante. Em uma modalidade, anticorpos anti-CD137 e anti-OX40, sozinhos ou em combinação, são usados para ativar inibidores de ponto de verificação imunológico estimulantes.

[000192] Assim, em uma modalidade alternativa, o agente imunoterápico que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imunológico diferente de CD40 é um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga e ativa a função de uma molécula de ponto de verificação imunológico estimulante.

[000193] Os exemplos preferenciais de moléculas de ponto de verificação incluem PD1, que serve como um regulador negativo de ativação de células T quando engatados a seus ligantes PD-L1 ou PD-L2. PD-L1 em particular é expresso por muitos tumores sólidos, incluindo melanoma. Esses tumores podem, portanto, regular de modo decrescente efeitos antitumorais mediados imunologicamente através da ativação dos receptores de PD-1 inibidores em células T. Bloqueando-se a interação entre PD1 e PD-L1, um ponto de verificação da resposta imunológica pode ser removido, levando a respostas de célula T antitumorais aumentadas. Essa interação pode ser bloqueada por um anticorpo específico para PD1 ou PD-L1 ou qualquer outro agente adequado. Tais anticorpos e agentes podem ser, de modo geral, referidos como inibidores de PD1. Os inibidores de PD1 são particularmente preferenciais como o agente terapêutico adicional na etapa (b) do método da invenção.

[000194] Os anticorpos anti-PD1 incluem Nivolumab, Pembrolizumab, Lambrolizumab, Pidilzumab e AMP-224. Os anticorpos anti-PD-L1 incluem MEDI-4736 e MPDL3280A.

[000195] A combinação de um inibidor sistêmico de PD1 e um anticorpo local anti-CD40 não é apenas atrativa devido à expressão de PD-L1 por tumores. Tal combinação poderia ser também benéfica na modulação do ambiente imunossupressor geral, afetando as células T reguladoras e células supressoras derivadas de mieloide (MSDCs). Por exemplo, agonistas de CD40, tal como o anticorpo anti-CD40 usado no método da invenção, modulará o tumor positivo para CD40 associado a 2 macrófagos e MSDCs, enquanto o inibidor de PD1 modulará as células T reguladoras e MSDCs. Além disso, conforme explicado acima (consultar discussão em relação à temporização das etapas (a) e (b)), relatou-se que a ligação de CD40 por anticorpos ativa e amadurece células dendríticas que, mediante maturação, regularão de modo crescente PD-L 1 e 2, fornecendo análise racional adicional para combinar os dois tratamentos. Ademais, agonistas de CD40, tal como o anticorpo anti-CD40, usados no método da invenção regularão de modo crescente indiretamente PD-1 em células T e PD-L1 em tumores e células infiltrantes de tumor. Portanto, o tratamento de tumor sólido (tal como melanoma) com uma combinação de um inibidor de PD1 sistêmico e um anticorpo anti-CD40 que é retido no sítio de tumor poderia ter efeitos pleiotrópicos tanto por ativação do sistema imunológico como por supressão dos sinais contra-reguladores.

[000196] Outro exemplo de molécula de ponto de verificação é o receptor de células T CTLA-4, que serve como um regulador negativo de ativação de células T. Normalmente, o mesmo é regulado de modo crescente na superfície de células T após a ativação inicial. Os ligantes do receptor de CTLA-4 são as proteínas B7 (B7-1 e B7-2), que são expressas por células apresentadoras de antígeno. O receptor correspondente responsável pela regulação crescente de ativação de células T é CD28, que compete pela ligação às proteínas B7 com CTLA-4. Assim, bloqueando-se a interação de CTLA-4 com as proteínas B7, mas não a interação de CD28 com as proteínas B7, um dos pontos de verificação normais da resposta imunológica pode ser removido, levando a respostas de célula T antitumorais aumentadas. O bloqueio da interação de CTLA-4 com as proteínas B7 pode ser atingido com um anticorpo anti-CTLA-4 ou outro agente adequado. Os anticorpos anti-CTLA-4 incluem ipilumumab, tremelimumab, ou qualquer um dos anticorpos revelados no documento PCT/EP2014/063442. Outras moléculas incluem polipeptídeos ou polipeptídeos CD86 mutantes solúveis.

[000197] Assim, o agente terapêutico adicional pode ser, de preferência, um anticorpo ou diferente do agente que se liga especificamente a pelo menos um dentre PD1, PD-L1 ou CTLA-4.

[000198] O agente terapêutico adicional é, de preferência máxima, um inibidor de PD1, tal como um anticorpo anti-PD1 ou anti-PD-L1, selecionado dentre Nivolumab, Pembrolizumab, Lamborlizumab, Pdilizumab, MEDI-4736 e MPDL3280A.

[000199] Nos casos em que o agente terapêutico adicional é um anticorpo ou molécula biespecífica que compreende um anticorpo, será entendido que todas as considerações gerais apresentadas acima em relação às definições de anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos, conjugação opcional a porções químicas terapêuticas adicionais, etc, também se aplicam a um anticorpo que é o agente terapêutico adicional. Similarmente, será entendido que as definições de especificidade/afinidade alvo e os métodos para determinar a especificidade/afinidade apresentados acima para anticorpos anti-CD40 serão aplicados igualmente a um anticorpo que é o agente terapêutico adicional, exceto pelo fato de que o alvo específico do agente será lido no lugar de CD40. As variantes e os fragmentos de um anticorpo que é o agente terapêutico adicional podem ser também definidos da mesma forma que as variantes e os fragmentos de anticorpos anti-CD40.

KITS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[000200] A invenção também fornece um kit para tratar um tumor sólido em um indivíduo, em que o kit compreende uma terapia de combinação, conforme definido acima. Por exemplo, o kit pode compreender (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a CD40 e que é retida no sítio de tumor após a administração e, opcionalmente, (b) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional que é adequado para administração sistêmica a um indivíduo. O anticorpo que se liga especificamente à CD40 é, de preferência, fornecido de uma forma adequada para a administração local a um sítio de tumor.

[000201] Os kits da invenção podem compreender, adicionalmente, um ou mais outros reagentes ou instrumentos que possibilitam qualquer uma das modalidades mencionadas acima a serem executadas. Tais reagentes ou instrumentos incluem um ou mais dos seguintes: tampão (ou tampões) adequado (soluções aquosas) e meios para administrar o anticorpo anti-CD40 e/ou o agente terapêutico adicional (tal como um vaso ou um instrumento que compreende uma agulha).

[000202] O anticorpo anti-CD40 e o agente terapêutico adicional usados nos métodos da invenção ou fornecidos nos kits da invenção podem ser, cada um, fornecidos como uma composição farmacêutica separada formulada juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. Conforme usado no presente documento, “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis e são também compatíveis com as vias exigidas de administração.

[000203] Assim, o carreador para o anticorpo anti- CD40 e o agente terapêutico adicional podem ser adequados para administração sistêmica, o que, conforme definido acima, significa a administração no sistema circulatório do indivíduo, incluindo o sistema vascular e/ou linfático. Tal administração pode ser por qualquer via adequada, mas é tipicamente parenteral. A frase “administração parenteral”, conforme usado no presente documento, significa modos de administração diferentes de administração entérica e tópica e é tipicamente atingida por injeção, infusão ou implantação. As vias adequadas incluem vias intravenosas, intramusculares, intradérmicas, intraperitoneais, subcutâneas, espinhais ou outras vias parenterais de administração.

[000204] No entanto, o carreador para o anticorpo anti-CD40 é, de preferência, adequado para administração local, que, conforme definido acima, inclui administração peritumoral, justatumoral, intratumoral, intralesional, perilesional, intracraniana e intravesicular por quaisquer meios adequados, tais como injeção. A administração local pode também incluir infusão e inalação intracavidade, dependendo do sítio do tumor.

[000205] Dependendo da via de administração, o anticorpo e/ou o agente podem ser revestidos em um material para proteger o anticorpo contra a ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar ou desnaturar o anticorpo e/ou o agente. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis compreendem carreadores ou diluentes aquosos. Os exemplos de carreadores aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, água tamponada e solução salina. Os exemplos de outros carreadores incluem etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tal como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, com o uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido, no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição.

[000206] Será percebido pelas pessoas versadas na técnica que os componentes de anticorpo das terapias de combinação da presente invenção são fornecidos na forma de uma ou mais composições farmacêuticas, em que cada uma contém uma quantidade terapeuticamente eficaz do componente (ou componentes) de anticorpo juntamente com um carreador diluente, excipiente ou tampão farmaceuticamente aceitável.

[000207] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade eficaz" ou "terapeuticamente eficaz", conforme usado no presente documento, se refere àquela quantidade que fornece um efeito terapêutico para uma dada afecção e um dado regime de administração. Essa é uma quantidade predeterminada de anticorpo ativo calculada para produzir um efeito terapêutico desejado em associação com o aditivo e o diluente exigido, isto é, um carreador ou um veículo de administração. Adicionalmente, a mesma é destinada a significar uma quantidade suficiente para reduzir ou impedir um déficit clinicamente significativo na atividade, na função e na resposta do hospedeiro. Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para causar uma melhora em uma afecção significativamente clínica em um hospedeiro. Conforme é percebido pelas pessoas versadas na técnica, a quantidade de um composto pode variar dependendo de sua atividade específica. As quantidades de dosagem adequadas podem conter uma quantidade predeterminada de composição ativa calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação ao diluente exigido. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada pelo trabalhador médico ou veterinário de habilidade comum com base nas características do paciente, tais como idade, peso, sexo, afecção, complicações, outras doenças, etc., conforme é bem conhecido na técnica.

[000208] Uma composição farmacêutica pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Essas composições podem conter também adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de micro-organismos pode ser garantida tanto por procedimentos de esterilização, supra, como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol ácido sórbico e similares. Pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Adicionalmente, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser produzida pela inclusão de agentes que atrasam a absorção, tal como monoestearato de alumínio e gelatina.

[000209] As composições farmacêuticas tipicamente precisam ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, uma microemulsão, um lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se o agente ativo (por exemplo, anticorpo) na quantidade exigida em um solvente adequado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme exigido, seguido por microfiltração por esterilização. Em geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do agente ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que rende um pó do ingrediente ativo mais qualquer agente desejado adicional de uma solução anteriormente filtrada estéril do mesmo. As composições farmacêuticas podem compreender ingredientes ativos adicionais assim como aqueles mencionados acima.

[000210] Os tampões, os diluentes, os carreadores e os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos na técnica (consultar Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edição, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) e handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edição, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000), cujas revelações estão incorporadas ao presente documento a título de referência).

[000211] O termo “tampão” destina-se a incluir uma solução aquosa que contém uma mistura de ácido e base com o propósito de estabilizar o pH. Os exemplos de tampões são Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazolático, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO e TES.

[000212] O termo “diluente” destina-se a incluir uma solução aquosa ou não aquosa com o propósito de diluir o agente na preparação farmacêutica. O diluente pode ser um ou mais dentre solução fisiológica, água, polietileno glicol, propileno glicol, etanol ou óleos (tais como óleo de cártamo, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de gergelim).

[000213] O termo “adjuvante” destina-se a incluir qualquer composto adicionado à formulação para aumentar o efeito biológico do agente da invenção. O adjuvante pode ser um ou mais dentre zinco, cobre ou sais de prata com ânions diferentes, por exemplo, mas sem limitação, fluoreto, cloreto, brometo, iodeto, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato e acetatos de composição de acila diferente. O adjuvante também pode ser polímeros catiônicos, tais como éteres de celulose catiônicos, ésteres de celulose catiônicos, ácido hialurônico desacetilado, quitosana, dendrímeros catiônicos, polímeros sintéticos catiônicos, tais como polivinil imidazol) e polipeptídeos catiônicos, tais como poliistidina, polilisina, poliarginina e peptídeos que contêm esses aminoácidos.

[000214] O excipiente pode ser um ou mais dentre carboidratos, polímeros, lipídios e minerais. Os exemplos de carboidratos incluem lactose, glicose, sacarose, manitol e ciclodextrinas, os quais são adicionados à composição, por exemplo, para facilitar liofilização. Exemplos de polímeros são amido, éteres de celulose, celulose carboximetilcelulose, hidroxipropilmetil celulose, hidroxietil celulose, etilidroxietil celulose, alginatos, carragenas, ácido hialurônico e derivados dos mesmos, ácido poliacrílico, polissulfonato, óxido de polietilenoglicol/polietileno, copolímeros de óxido de polietilenoxido/polipropileno, álcool polivinílico/poliacetato de grau diferente de hidrólise e polivinilpirrolidona, todos de peso molecular diferente, os quais são adicionados à composição, por exemplo, para controle de viscosidade, para alcançar bioadesão ou para proteger o lipídio de degradação química e proteolítica. Exemplos de lipídios são ácidos graxos, fosfolipídios, mono, di e triglicerídeos, ceramidas, esfingolipídios e glicolípidos, todos de comprimentos e saturações de cadeia de acila diferentes, lecitina de ovo, lecitina de soja, lecitina de ovo e de soja hidrogenada, os quais são adicionados à composição por motivos semelhantes àqueles para polímeros. Os exemplos de minerais são talco, óxido de magnésio, óxido de zinco e óxido de titânio, os quais são adicionados à composição para obter benefícios, tais como redução de acumulação de líquido ou propriedades de pigmento vantajosas.

[000215] Os agentes à base de anticorpo ativo da invenção podem ser formulados em qualquer tipo de composição farmacêutica conhecida na técnica para ser adequada para a entrega dos mesmos.

[000216] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção podem ser na forma de um lipossoma, em que o agente é combinado, além de outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis, com agentes anfifáticos, tais como lipídios, os quais existem em formas agregadas como micelas, monocamadas insolúveis e cristais líquidos. Os lipídios adequados para formulação lipossomal incluem, sem limitação, monoglicerídeos, diglicerídeos, sulfetos, lisolecitina, fosfolipídios, saponina, ácidos biliares e semelhantes. Os lipídios adequados também incluem os lipídios acima modificados por poli(etileno glicol) no grupo principal polar para prolongar o tempo de circulação de corrente sanguínea. A preparação de tais formulações lipossomais pode ser encontrada, por exemplo, no documento no US 4.235.871, cujas revelações estão incorporadas ao presente documento a título de referência.

[000217] As composições farmacêuticas da invenção também podem estar na forma de microesferas biodegradáveis. Os poliésteres alifáticos, tais como poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímeros de PLA e PGA (PLGA) ou poli(carprolactona) (PCL) e polianidridos foram amplamente usados como polímeros biodegradáveis na produção de microesferas. As preparações de tais microesferas podem ser encontradas no documento no US 5.851.451 e no Documento no EP 0 213 303, cujas revelações estão incorporadas ao presente documento a título de referência.

[000218] Em uma modalidade adicional, as composições farmacêuticas da invenção são fornecidas na forma de nanopartículas, por exemplo, à base de ácido glutâmico poligama. Os detalhes da preparação e do uso de tais nanopartículas podem ser encontrados no documento WO 2011/128642, cujas revelações estão incorporadas ao presente documento a título de referência. Será percebido pelas pessoas versadas na técnica que um ou mais dos componentes ativos das terapias de combinação da presente invenção podem ser formulados em nanopartículas separadas ou ambos os componentes ativos podem ser formulados nas mesmas nanopartículas.

[000219] Em uma modalidade adicional, as composições farmacêuticas da invenção são fornecidas na forma de géis poliméricos, em que os polímeros, tais como amido, éteres de celulose, celulose carboximetilcelulose, hidroxipropilmetil celulose, hidroxietil celulose, etilidroxietil celulose, alginatos, carragenas, ácido hialurônico e derivados dos mesmos, ácido poliacrílico, polivinil imidazol, polissulfonato, óxido de polietilenoglicol/polietileno, copolímeros de óxido de polietilenoxido/polipropileno, álcool polivinílico/polivinilacetato de grau diferente de hidrólise e polivinilpirrolidona são usadas para espessamento da solução que contém o agente. Os polímeros também podem compreender gelatina ou colágeno.

[000220] Alternativamente, os agentes podem ser simplesmente dissolvidos em solução fisiológica, água, polietileno glicol, propileno glicol, etanol ou óleos (tais como óleo de cártamo, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de gergelim), goma tragacanto e/ou diversos tampões.

[000221] Será percebido que as composições farmacêuticas da invenção podem incluir íons e um pH definido para potenciação de ação do agente ativo. Adicionalmente, as composições podem ser submetidas a operações farmacêuticas convencionais, tais como esterilização, e/ou podem conter adjuvantes convencionais, tais como conservantes, estabilizadores, agentes de umedecimento, emulsificações, tampões, cargas, etc.

[000222] As composições farmacêuticas, de acordo com a invenção, podem ser administradas através de qualquer via adequada conhecida pelas pessoas versadas na técnica. Desse modo, as vias de administração possíveis incluem parenteral (intravenosa, subcutânea e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, parenteral, vaginal e retal. A administração a partir de implantes também é possível.

[000223] Vantajosamente, a composição farmacêutica é adequada para a administração em ou próximo ao sítio de um tumor, por exemplo, por via intratumoral ou peritumoral.

[000224] É preferencial que a composição farmacêutica seja adequada para administração parenteral. Os métodos para formular um anticorpo em uma composição farmacêutica serão bem conhecidos por aqueles versados nas técnicas de medicina e farmácia. As composições preferenciais são descritas nos Exemplos anexos.

[000225] A terapia de combinação da invenção pode ser entregue com o uso de um sistema de entrega de fármaco de liberação prolongada injetável. Esses são projetados especificamente para reduzir a frequência de injeções. Um exemplo de tal sistema é Nutropin Depot que encapsula o hormônio do crescimento humano recombinante (rhGH) em microesferas biodegradáveis que, uma vez injetadas, liberam rhGH lentamente durante um período prolongado. De preferência, a entrega é realizada por via intramuscular (i.m.) e/ou por via subcutânea (s.c.) e/ou por via intravenosa (i.v.).

[000226] A terapia de combinação da invenção pode ser administrada por um dispositivo implantado cirurgicamente que libera o fármaco diretamente ao sítio exigido. Por exemplo, Vitrasert libera ganciclovir diretamente nos olhos para tratar retinite CMV. A aplicação direta desse agente tóxico ao sítio de doença atinge terapia eficaz sem os efeitos colaterais sistêmicos significativos do fármaco.

[000227] Os sistemas de terapia por eletroporação (EPT) podem ser também empregados para a administração da terapia de combinação da invenção. Um dispositivo que entrega um campo elétrico pulsado a células aumenta a permeabilidade das membranas celulares ao fármaco, resultando em uma acentuação significativa de entrega de fármaco intracelular.

[000228] A terapia de combinação da invenção pode ser também entregue por eletroincorporação (El). A El ocorre quando partículas pequenas de até 30 micra de diâmetro na superfície da pele experimentam pulsos elétricos idênticos ou similares àqueles usados em eletroporação. Em El, essas partículas são direcionadas através do estrato córneo e para as camadas mais profundas da pele. As partículas podem ser carregadas ou revestidas com fármacos ou genes ou podem simplesmente atuar como “balas” que geram poros na pele através dos quais os fármacos podem entrar.

[000229] Uma terapia de combinação alternativa da invenção é o sistema injetável ReGel que é termossensível. Abaixo da temperatura corporal, ReGel é um líquido injetável, enquanto à temperatura corporal forma imediatamente um reservatório de gel que erode lentamente e dissolve em polímeros biodegradáveis, seguros e conhecidos. A substância ativa é entregue ao longo do tempo conforme os biopolímeros dissolvem.

[000230] A terapia de combinação da invenção pode ser também entregue por via oral. O processo emprega um processo natural para absorção oral de vitamina B12 e/ou vitamina D no corpo para coentregar proteínas e peptídeos. Por serem carregados pelo sistema de absorção de vitamina B12 e/ou vitamina D, os agentes, os medicamentos e as composições farmacêuticas da invenção podem se mover através da parede intestinal. Os complexos são sintetizados entre análogos de vitamina B12 e/ou análogos de vitamina D e o fármaco que retém tanto a afinidade significativa para fator intrínseco (IF) na porção de vitamina B12/porção de vitamina D do complexo como a bioatividade significativa da substância ativa do complexo.

[000231] A terapia de combinação da invenção pode ser introduzida a células por “peptídeos de Tróia”. Esses são uma classe de polipeptídeos chamada de penetratinas, que tem propriedades de translocação e tem capacidade de carrear compostos hidrofílicos através da membrana plasmática. Esse sistema permite o direcionamento direto de oligopeptídeos ao citoplasma e núcleo e pode ser de tipo não celular específico e altamente eficaz. Consultar Derossi et al. (1998), Trends Cell Biol. 8, 84 a 87.

[000232] De preferência, a terapia de combinação da invenção é uma dosagem unitária contendo uma dose ou unidade diária, uma subdose diária ou uma fração adequada da mesma do ingrediente ativo.

[000233] A terapia de combinação da invenção será normalmente administrada por via oral ou por qualquer via parenteral, na forma de uma composição farmacêutica que compreende o ingrediente ativo, opcionalmente, na forma de um sal de adição de ácido, ou base, orgânico ou inorgânico não tóxico, em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável. Dependendo do distúrbio e do paciente a ser tratado, assim como da via de administração, as composições podem ser administradas em doses variáveis.

[000234] Em terapia humana, a terapia de combinação da invenção pode ser administrada sozinha, mas será, de modo geral, administrada em mistura por adição com um excipiente, diluente ou carreador farmacêutico adequado, selecionado em relação à via de administração destinada e prática farmacêutica padrão.

[000235] Por exemplo, a terapia de combinação da invenção pode ser administrada por via oral, por via bucal ou por via subligual na forma de tabletes, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes flavorizantes ou corantes, para aplicações de liberação imediata, retardada ou controlada. Os agentes, os medicamentos e as composições farmacêuticas da invenção podem ser também administrados por meio de injeção intracavernosa.

[000236] Tais tabletes podem conter excipientes, tais como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina, desintegrantes, tais como amido (de preferência, amido de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódica e determinados silicatos complexos e ligantes de granulação, tais como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia. Adicionalmente, agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco, podem estar incluídos.

[000237] Composições sólidas de um tipo similar podem ser também empregadas como cargas em cápsulas de gelatina. Os excipientes preferenciais nesse aspecto incluem lactose, amido, celulose, açúcar de leite ou polietileno glicóis com alto peso molecular. Para suspensões e/ou elixires aquosas, os agentes, os medicamentos e as composições farmacêuticas da invenção podem ser combinados com vários agentes adoçantes e flavorizantes, matéria corante ou corantes, com agentes de emulsificação e/ou suspensão e com diluentes, tais como água, etanol, propileno glicol e glicerina e combinações dos mesmos.

[000238] A terapia de combinação da invenção pode ser administrada por via parental, por exemplo, por via intravenosa, por via intra-arterial, por via intraperitoneal, por via intratecal, por via intraventricular, por via intrasternal, por via intracraniana, por via intramuscular ou por via subcutânea, ou pode ser administrada por técnicas de infusão. As mesmas são mais bem usadas na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou glicose suficiente para tornar a solução isotônica com sangue. As soluções aquosas devem ser adequadamente tamponadas (de preferência para um pH de 3 a 9), se necessário. A preparação de formulações parenterais adequadas sob afecções estéreis é prontamente realizada por técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica.

[000239] As composições farmacêuticas e os medicamentos adequados para administração parenteral incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que rendem a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes de espessamento. As composições farmacêuticas e os medicamentos podem ser representados em recipientes de dose única ou de múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizadas) que exige apenas a adição do carreador líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. As soluções e as suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e tabletes do tipo descrito anteriormente.

[000240] A terapia de combinação da invenção pode ser também administrada por via intranasal ou por inalação e é conveniente entregue na forma de um inalador de pó seco ou uma apresentação de aspersão de aerossol de um recipiente pressurizado, bomba, aspersão ou nebulizador com o uso de um propulsor adequado, por exemplo diclorodifluorometane, trichlorofluorometano, diclorotetrafluoro-etano, um hidrofluoroalcano, tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 ou 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo-se uma válvula para entregar uma quantidade medida. O recipiente pressurizado, a bomba, a aspersão ou o nebulizador pode conter uma solução ou uma suspensão do agente ativo, por exemplo, com o uso de uma mistura de etanol e do propulsor como o solvente, o qual pode conter adicionalmente um lubrificante, por exemplo trioleato de sorbitano. As cápsulas e os cartuchos (produzidos, por exemplo, a partir de gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura de pó de um agente da invenção e uma base de pó adequada, tais como lactose ou amido.

[000241] Alternativamente, a terapia de combinação da invenção pode ser administrada na forma de um supositório ou pessário, ou pode ser aplicada por via tópica na forma de uma loção, uma solução, um creme, um gel, uma pomada ou um pó de polvilhamento. Os agentes, os medicamentos e as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por via transdérmica, por exemplo, com o uso de um emplastro cutâneo. Os mesmos podem ser também administrados pela via ocular, particularmente, para tratar doenças dos olhos.

[000242] Para uso oftálmico, a terapia de combinação da invenção pode ser formulada como suspensões micronizadas em isotônico, pH ajustado, solução salina estéril ou, de preferência, como soluções em isotônico, pH ajustado, solução, opcionalmente, em combinação com um conservante, tal como um cloreto de benzilalcônio. Alternativamente, a mesma pode ser formulada em uma pomada, tal como petrolato.

[000243] Para aplicação por via tópica à pele, a terapia de combinação da invenção pode ser formulada como uma pomada adequada contendo o agente ativo suspenso ou dissolvido em, por exemplo, uma mistura com um ou mais dos seguintes: óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, agente de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, a mesma pode ser formulada como uma loção ou creme adequado, suspensa ou dissolvida em, por exemplo, uma mistura de um ou mais dos seguintes: óleo mineral, monoestearato de sorbitano, um polietileno glicol, parafina líquida, polissorbato 60, cera de ésteres de cetila, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.

[000244] As formulações adequadas para administração tópica na boca incluem pastilhas que compreendem o ingrediente ativo em uma base flavorizada e acácia ou tragacanto; as pastilhas que compreendem o ingrediente ativo em uma base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia; e enxaguantes bucais que compreendem o ingrediente ativo em carreador líquido adequado.

[000245] De modo geral, em seres humanos, a administração local da terapia de combinação da invenção em ou próximo ao sítio de um tumor é a via preferencial, em particular administração intratumoral ou peritumoral.

[000246] Para uso veterinário, a terapia de combinação da invenção é administrada como uma formulação adequadamente aceitável em conformidade com a prática veterinária normal e o cirurgião veterinário determinará o regime de dosagem e a via de administração que serão mais adequados para um animal particular.

[000247] As modalidades da invenção incluem, porém, sem limitação, as seguintes: A. Um método para tratar um tumor sólido em um indivíduo, em que o método compreende (a) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CD40 e que é retida no sítio de tumor após a administração, e, opcionalmente, (b) administrar sistemicamente ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional. B. O método, de acordo com a Modalidade A, em que o agente terapêutico adicional da etapa (b) é um agente imunoterápico para o tratamento de câncer que não é um anticorpo anti-CD40. C. O método, de acordo com a Modalidade b, em que o dito agente imunoterápico é um inibidor de PD1, opcionalmente, em que o dito inibidor de PD1 é um anticorpo anti-PD1 ou anti-PD-L1. D. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o tumor sólido é um adenoma, um blastoma, um carcinoma, um tumor desmoide, um tumor de célula redonda pequena desmoplásico, um tumor endócrino, um tumor de célula germinativa, um linfoma, um sarcoma, um tumor de Wilms, um tumor pulmonar, um tumor de cólon, um tumor linfático, um tumor de mama ou um melanoma. E. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o tumor sólido é um melanoma, de preferência, um melanoma metastático. F. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o anticorpo da etapa (a) compreende pelo menos uma CDR selecionada dentre as SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5 e 6. G. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o anticorpo da etapa (a) compreende as sequências de CDR de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3 e/ou SEQ ID NOs: 4, 5 e 6. H. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o anticorpo da etapa (a) compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e/ou a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8. I. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o anticorpo da etapa (a) compreende a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e/ou a região variável de cadeia constante de SEQ ID NO: 12. J. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o anticorpo da etapa (a) compete pela inibição a CD40 humana com um anticorpo que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8. K. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que as etapas (a) e (b) são executadas simultaneamente ou em que a etapa (b) é executada entre 24 horas e duas semanas após a etapa (a), entre 24 horas e uma semana após a etapa (a), entre 24 e 72 horas após a etapa (a) ou entre 24 e 48 horas após a etapa (a). L. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a etapa (a) compreende a administração local do anticorpo ao sítio de tumor, opcionalmente, em que o anticorpo é formulado como uma composição adequada para administração local com pelo menos um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável e/ou o anticorpo é conjugado a uma porção química terapêutica adicional. M. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que pelo menos 30% da quantidade de anticorpo administrada na etapa (a) são retidos no sítio de tumor em quatro horas após a administração, de preferência, em que pelo menos 40% da dita quantidade são retidos no sítio de tumor em quatro horas após a administração. N. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o agente terapêutico adicional da etapa (b) é formulado como uma composição adequada para administração sistêmica com pelo menos um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável. O. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a etapa (a) é conduzida em múltiplas ocasiões separadas e a etapa (b) é conduzida de modo que a exposição do indivíduo ao agente terapêutico adicional é contínua pela duração do método. P. O método, de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o indivíduo é um ser humano. Q. Um kit para tratar um tumor sólido em um indivíduo, em que o kit compreende (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a CD40 e que é retida no sítio de tumor após a administração e, opcionalmente, (b) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico adicional que é adequado para administração sistêmica a um indivíduo. R. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CD40 e que tem capacidade de ser retido no sítio de tumor após a administração, para uso no tratamento de um tumor sólido em um indivíduo. S. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a Modalidade R, para uso em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, em que o agente terapêutico adicional (ou agentes terapêuticos adicionais) não é um anticorpo anti-CD40. T. Um anticorpo, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a Modalidade S, em que o dito agente terapêutico adicional é um tratamento de câncer selecionado a partir do grupo que consiste em um radioterápico convencional, um inibidor de trajetória (tal como um inibidor de tirosina quinase ou um inibidor de Serina/treonina quinase), uma citocina (tal como IL-2, IL-12, IL-15 ou IL-21), um agente quimioterápico e um agente imunoterápico. U. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a Modalidade S ou T, para uso em combinação com um ou mais dos seguintes agentes terapêuticos adicionais: (i) um agente imunoterápico anti-PD1; (ii) um agente imunoterápico anti-CTLA-4; (iii) um agente imunoterápico anti-OX40; e/ou (iv) um agente imunoterápico anti-CD137. V. Um anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a Modalidade T ou U, em que o dito agente imunoterápico é um inibidor de PD1, opcionalmente, em que o dito inibidor de PD1 é um anticorpo anti-PD1 ou anti-PD-L1. W. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades R a V, em que o tumor sólido é um adenoma, um blastoma, um carcinoma, um tumor desmoide, um tumor de célula redondo pequeno desmoplásico, um tumor endócrino, um tumor de célula germinativa, um linfoma, um sarcoma, um tumor de Wilms, um tumor pulmonar, um tumor de cólon, um tumor linfático, um tumor de mama ou um melanoma. X. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades R a W, em que o tumor sólido é um melanoma, de preferência, um melanoma metastático. Y. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades R a X, que compreende pelo menos uma CDR selecionado dentre as SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Z. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades R a Y, que compreende as sequências de CDR das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3 e/ou SEQ ID NOs: 4, 5 e 6. AA. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades R a Z, que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e/ou a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8. BB. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades R a AA, que compreende a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e/ou a região variável de cadeia constante de SEQ ID NO: 12 CC. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades R a BB, em que o anticorpo, ou a porção de ligação a antígeno do mesmo, compete pela ligação a CD40 humana com um anticorpo que compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8. DD. Um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades R a CC, em que o anticorpo é formulado como uma composição adequada para administração local com pelo menos um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável e/ou o anticorpo é conjugado a uma porção química terapêutica adicional. EE. Uma composição de terapia de combinação que compreende um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das Modalidades R a DD, e um ou mais agentes terapêuticos adicionais, em que o agente terapêutico adicional (ou agentes terapêuticos adicionais) não é um anticorpo anti-CD40. FF. Uma composição de terapia de combinação, de acordo com a Modalidade EE, em que o dito agente terapêutico adicional é um tratamento de câncer selecionado a partir do grupo que consiste em um radioterápico convencional, um inibidor de trajetória (tal como um inibidor de tirosina quinase ou um inibidor de Serina/treonina quinase), uma citocina (tal como IL-2, IL-12, IL-15 ou IL- 21), um agente quimioterápico e um agente imunoterápico. GG. Uma composição de terapia de combinação, de acordo com as Modalidades EE ou FF, que compreende: (i) um agente imunoterápico anti-PD1; (ii) um agente imunoterápico anti-CTLA-4; (iii) um agente imunoterápico anti-OX40; e/ou (iv) um agente imunoterápico anti-CD137. HH. Uma composição de terapia de combinação, de acordo com qualquer uma das Modalidades EE a GG, em que o dito agente imunoterápico é um inibidor de PD1, opcionalmente, em que o dito inibidor de PD1 é um anticorpo anti-PD1 ou anti-PD-L1. II. Uso de um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das Modalidades R a DD, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor sólido em um indivíduo.

[000248] A presente invenção é, ainda, ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como adicionalmente limitantes. O conteúdo de todas as figuras e todas as referências, as patentes e pedidos de patente publicados citados por todo este pedido está expressamente incorporado no presente documento a título de referência. EXEMPLOS EXEMPLO 1 - INFORMAÇÕES DE SEQUÊNCIA CLONE G12 DE ANTICORPO ANTI-CD40 (ANTICORPO ADC- 1013)

[000249] (a) sequências de CDR (definido de acordo com a numeração IMGT, com sequências de CDR nucleares sublinhadas nas mesmas) VLCDR1: CTGSSSNIGAGYNVY [SEQ ID NO:1] VLCDR2: GNINRPS [SEQ ID NO:2] VLCDR3: CAAWDKSISGLV [SEQ ID NO:3] VHCDR1: GFTFSTYGMH [SEQ ID NO:4] VHCDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [SEQ ID NO:5] VHCDR3: CARILRGGSGMDL [SEQ ID NO:6]

[000250] (b) Sequências de região variável

[000251] Sequência de aminoácidos de cadeia leve variável (VL) - SEQ ID NO:7 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYNVYWYQQLPGTAPKLLIYGNINR PSGVPDRFSGSKSGTSASIAISGLRSEDEADYYCAAWDKSISGLVFGGGTKLTVLG

[000252] Sequência de aminoácidos de cadeia pesada variável (VH) - SEQ ID NO:8 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWLSYISGG SSYIFYADSVRGRFTISRDNSENALYLQMNSLRAEDTAVYYCARILRGGSGMDLWG QGTLVTVSS

[000253] Sequência de nucleotídeos de cadeia leve variável (VL) - SEQ ID NO:9 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGG TCACCATCTCTTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCGGGTTACAATGTA TACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAA CATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCA CCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTAT TACTGTGCAGCATGGGATAAGAGCATTTCTGGTCTGGTTTTCGGCGGAGGAAC CAAGCTGACGGTCCTAGGT

[000254] Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada variável (VH) - SEQ ID NO: 10. GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATGGCATGCACT IGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCATATATTAGTGG TGGTAGTAGTTACATTTTCTACGCAGACTCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTC CAGAGACAACTCCGAGAACGCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG AGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATATTAAGAGGCGGGAGCGGTATG GACCTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA

[000255] (c) Sequências de aminoácidos de região constante exemplificativas

[000256] Região C2 de cadeia leve lambda de lg humana (NCBI AAA59107.1) - SEQ ID NO:11 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

[000257] Região constante de cadeia pesada gama-1 de humana (Uniprot P01857.1) - SEQ ID NO: 12. ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[000258] Sequência de CD40 humana - SEQ ID NO: 13.

[000259] >gi|117606560|gb|ABK41937.1| molécula de CD40, membro 5 da superfamília de receptor para TNF [Homo sapiens] EXEMPLO 2 - BIODISPONIBILIDADE APÓS ADMINISTRAÇÃO LOCAL OU SISTÊMICA

[000260] Estudos pré-clínicos foram realizados em macaco cynomolgus e camundongos, a fim de estudar a biodisponibilidade de ADC-1013 após administração peritumoral, intratumoral ou intravenosa.

MATERIAL E MÉTODOS

[000261] A farmacocinética de avaliada em um modelo de camundongo transgênico positivo para CD40 humana inoculado com células de câncer de bexiga negativas para CD40 humana, MB49. ADC-1013 foi injetado por via intratumoral (IT), por via peritumoral (PT) ou por via intravenosa (IV) a uma dose de 100 μg, e soro foi coletado no pré-tratamento e 4 e 24 h após o tratamento. O perfil farmacocinético (Figura 1) indica que a exposição sistêmica de ADC-1013 em 4 horas após a administração ser reduzida 100 a 1.000 vezes após a administração IT ou PT em comparação a IV.

[000262] Os macacos cynomolgus foram expostos a ADC-1013 por meio da via subcutânea e intravenosa. A administração subcutânea aqui é análoga à administração local a um melanoma.

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000263] Amostras de sangue foram coletadas de todos os animais para análise toxicocinética nos seguintes pontos no tempo: Na pré-dose e em 15 minutos e 2, 6, 24, 48, 72, 96 e 168 horas após a dose e níveis de ADC1013 medidos (Figura 2). A biodisponibilidade de ADC1013 após a administração subcutânea, com base na área sob a curva (AUC) média (AUC-96) foi calculada. A AUC-96 para administração subcutânea vs intravenosa estava na faixa entre 28 a 42%, indicando 28% a 42% de biodisponibilidade sistêmica.

[000264] Essas observações foram aplicadas na decisão de níveis de dose de combinações administradas de anticorpos imunoterápicos no modelo de camundongo B16.F10, conforme revelado no Exemplo 3.

EXEMPLO 3 - MODELO DE MELANOMA MURINO IN VIVO

[000265] B16.F10 é a linhagem de células tumorais que é mais frequentemente usada como um modelo para melanoma em modelos de camundongo pré-clínicos (Grosso 2013 Cancer Immunity Review). A linhagem de células de melanoma B16.F10 de camundongo compara-se bem a melanomas humanos devido ao fato de que expressa MHC em níveis baixos e é considerada como sendo pouco imunogênica (Lechner J immunother 2013). Níveis de MHC baixos podem estar, por exemplo, associados à ativação de células T insuficiente, possivelmente tornando tais tumores difíceis de tratar com imunoterapia. A fim de aumentar a relevância translacional de B16.F10, a linhagem de células foi transfectada com CD40 humana. A linhagem transfectada (referida como B16.F10(hCD40+) foi usada para esses experimentos.

MATERIAL E MÉTODOS

[000266] A linhagem de células de melanoma B16.F10 foi obtida a partir da Coleção Americana de Células-Tipo (ATCC). A linhagem que expressa hCD40 B16.F10(hCD40+) foi obtida transfectando-se B16.F10 com vetor linearizado contendo CD40 humana e com o uso de Lipofectamine (Invitrogen). O vetor continha elementos que conferem resistência à neomicina. As células transfectadas foram cultivadas em DMEM (contendo 4,5 g/l de glicose, Ultraglutamina I e piruvato de sódio), 10% de FCS, Hepes e 1 mg/ml de G418 para selecionar transfectantes estáveis. Os clones positivos para CD40 foram selecionados com o uso de biotina de CD40 e microesferas magnéticas (Miltenyi). Um único clone com expressão de hCD40 verificada, medida por citometria de fluxo, foi selecionado (clone 5.G12.46).

[000267] O B16.F10(hCD40+), proliferando em fase logarítmica, foi injetado por via subcutânea no dia 0 (D0) no flanco direito de camundongo transgênico para hCD40 (hCD40Tg) em um volume de 100 μl. O número inoculado médio de células foi 0,1 x 106 por camundongo. O crescimento do tumor foi medido com um calibre digital em comprimento, largura e altura do qual o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). Os tratamentos foram administrados nos dias 3, 6 e 9. ADC-1013 foi administrado por via intratumoral (20 μl, 100 μg por dose) e anti-PD-1 (Clone RPM1-14, BioXcell) por via intraperitoneal (100 μl, 250 μg por dose).

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000268] A linhagem de células B16.F10(hCD40+) de melanoma transfectada exibiu expressão substancial de CD40 humana, conforme mostrado na Figura 3A. Os efeitos antitumorais de ADC-1013 foram determinados em camundongos hCD40tg que possuem melanoma B16.F10(hCD40+) subcutâneo por sobrevivência (Figura 4A) e volume de tumor no dia em que o primeiro camundongo foi sacrificado (Figura 4B). ADC-1013 exibiu diminuição significativa de crescimento tumoral medido por tempo de sobrevivência aumentado e volume de tumor diminuído. A eficácia antitumoral foi aumentada tratando-se os animais com uma combinação de ADC-1013 e um anticorpo anti-PD-1.

EXEMPLO 4 - MODELO DE CÂNCER DE BEXIGA MURINO IN VIVO MATERIAL E MÉTODOS

[000269] As células de câncer de bexiga MB49 foram usadas para iniciar tumores em camundongos hCD40Tg fêmeas com 8 semanas de vida. No dia 0, 0,25 x 106 células tumorais foram inoculadas por via subcutânea no flanco direito do camundongo. No dia 14, os camundongos foram injetados por via intratumoral ou por via intraperitoneal com um anticorpo anti-CD40 de teste (total de 1 ug e 30 ug de anticorpo por camundongo ou PBS; 4 camundongos por grupo). No dia 16, 40 camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. Os nódulos linfáticos de drenagem de tumor foram coletados em meios completos e dois tumores ou nódulos linfáticos de cada grupo experimental foram agrupados juntos. O tecido coletado foi homogeneizado enzimática ou mecanicamente com o uso de Liberase TL (Roche) e filtros de rede de náilon (100 μm; Fischer Scientific). As membranas foram lavadas por completo com meios RPMI contendo 3 a 10 mM de EDTA e 0,1% de soro fetal de bezerro para preparar suspensão de células únicas. As células isoladas foram lavadas em PBS contendo 0,5% albumina sérica bovina, e a ligação a Fc não específica foi bloqueada tratando-se as células com anti-CD16/32 de camundongo (BD Bioscience).

[000270] Os níveis de expressão de CD86 (como um marcador para ativação) foram analisados separadamente em células positivas para CD11 c e células positivas para CD11 b por citometria de fluxo. CD11 c é um marcador para células dendríticas. CD11 b é expresso em monócitos, macrófagos e subconjuntos de células dendríticas. As células foram manchadas com a cepa fixável viva/morta FVS450 (BD Bioscience) e anticorpos específicos para CD11 c-PE, CD1 b- PECy7 e CD86-APC (BD Bioscience) diluídos a 1:100. Após o manchamento, todas as células foram fixadas em paraformaldeído fixado com o uso de Cellfix (BD Bioscience). O manchamento para cada amostra foi medido e calculado como CD86 (amostra)-FMO(amostra) e apresentado como % de células positivas menos controle de PBS. As células manchadas foram analisadas com o uso de software de análise FACS Verse (Becton Dickinson) e FlowJo vX. Os resultados são mostrados nas Figuras 5A (células CD11 c) e 5B (células CD11 b).

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000271] Os dados na Figura 5A mostram que o tratamento com anticorpo anti-CD40 aumentou a ativação de células dendríticas medida por expressão de CD86 no tumor. Os dados na Figura 5B mostram que o tratamento com anticorpo anti-CD40 aumentou a ativação de células positivas para CD11b medida por expressão de CD86 no tumor. De modo geral, uma ativação mais forte é obtida após o tratamento intratumoral (IT) em comparação ao tratamento intraperitoneal (IP). O tratamento com uma dose baixa de 1 g dado por via intratumoral (IT) gerou uma ativação inesperadamente alta de células dendríticas.

EXEMPLO 5 - EFEITO IN VIVO DE TERAPIA DE COMBINAÇÃO I MATERIAL E MÉTODOS

[000272] A linhagem de células tumorais B16.F10(hCD40+), proliferando em fase logarítmica, foi injetado por via subcutânea no dia 0 (D0) no flanco direito de camundongo transgênico para hCD40 (hCD40Tg) em um volume de 100 μl. O número de células inoculadas foi 0,1 x 106 por camundongo. O crescimento do tumor foi medido com um calibre digital em comprimento, largura e altura do qual o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). Os tratamentos foram administrados nos dias 3, 6 e 9. ADC-1013 foi administrado por via intratumoral (100 μg por dose) . Os anticorpos anti-PD1, 250 Mg por dose (Clone RPM1-14, BioXcell), e anti-CTLA-4, 100 pg por dose (9D9, BioXcel), foram injetados por via intraperitoneal. O volume de tumor no dia 14 é mostrado na Figura 6.

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000273] Foi mostrado que o tratamento com um anticorpo direcionado a PD-1 em combinação com um anticorpo direcionado a CTLA-4 pode conferir efeitos aditivos em testes clínicos (Wolchok et al New Eng J Med, 2013). Nesse exemplo, são revelados dados pré-clínicos que sugerem que a adição de tratamento com ADC-1013 à combinação CTLA-4/PD-1 poderia aumentar ainda mais os efeitos terapêuticos em pacientes com melanoma. O efeito antitumoral medido por uma diminuição em volume de tumor no dia 14 foi significativamente melhor para CTLA-4, PD-1 e ADC-1013 em comparação com CTLA-4 e PD-1 sozinhos (Figura 6).

[000274] Em um ambiente clínico, o anticorpo CTLA- 4 poderia ser qualquer um dentre ipilimumab, tremelimumab ou outros anticorpos de direcionamento a CTLA-4. O anticorpo de direcionamento a PD-1 poderia ser um anticorpo que se liga a PD-1 humano, tal como nivolumab ou pembrolizumab ou outros. O mesmo poderia ser também um anticorpo que se liga aos ligantes de PD-1, tais como anticorpos direcionados a PD-L1 e PD-L2, tal como durvalumab e avelumab.

EXEMPLO 6 - EFEITO IN VIVO DE TERAPIA DE COMBINAÇÃO II MATERIAL E MÉTODOS

[000275] A linhagem de células tumorais B16.F10, proliferando em fase logarítmica, foi injetado por via subcutânea no dia 0 (D0) no flanco direito de camundongo transgênico para hCD40 (hCD40Tg) em um volume de 100 μl. O número de células inoculadas foi 0,1 x 106 por camundongo. O crescimento do tumor foi medido com um calibre digital em comprimento, largura e altura do qual o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). Os tratamentos foram administrados nos dias 3, 6 e 9. Os anticorpos ADC1013, anti- CD137 (clone Lob 12.3) e anti-OX40 (CD86) e controles foram administrados por via intratumoral (100 μg por dose). O volume foi seguido ao longo do tempo conforme mostrado na Figura 7

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000276] O tratamento com ADC-1013 gerou uma resposta antitumoral significativa em comparação ao controle. O efeito antitumoral foi maior que o efeito antitumoral obtido com anticorpos direcionados a CD137 e OX40 (Figura 7). A combinação de ADC-1013 e OX40 resultou, assim como a combinação de ADC-103 com CD137 resultou em efeito antitumoral mais forte em comparação com as monoterapias. Isso indica que combinar CD40 e CD137 ou combinar CD40 e OX40 terá benefícios clínicos.

EXEMPLO 7- EFEITO DE ADC-1013 EM MELANOMA DE B16 DO TIPO SELVAGEM EM CAMUNDONGOS MATERIAL E MÉTODOS

[000277] Células B16.F10.hCD40+ ou células B16.F10 (wt) (1 x 105) foram inoculadas por via subcutânea, e os camundongos foram tratados por via intratumoral com ADC-1013 no dia 3, 6 e 9 (100 μg por dose).

[000278] Os camundongos usados para esse estudo foram camundongos hCD40tg.

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000279] ADC-1013 gera efeitos antitumorais significativos também em tumores B16.F10. O efeito antitumoral obtido em tumores B16.F10 (wt) e B16.F10.hCD40+ foi similar (Figura 8). Isso não descarta que a indução direta de ADCC exerce um papel no tratamento de melanoma positivo para CD40 humana. Pode ser que haja outras diferenças qualitativas nos tumores positivos para hCD40, tal como infiltração de célula imune mais baixa. Ademais, os níveis de CD40 humana nos tumores B16 foram baixos, conforme medido ex vivo em amostras de tumor.

EXEMPLO 8 - EFEITO DE ADC-1013 EM MODELO DE LINFOMA (A20) MATERIAL E MÉTODOS

[000280] A linhagem de células de linfoma A20, proliferação em fase logarítmica, foi injetada por via subcutânea no dia 0 (D0) no flanco direito de camundongos hCD40tg-BalbC (F1) em um volume de 100 μl. Os camundongos hCD40tg-BalbC (F1) foram gerados cruzando-se camundongos hCD40tg com camundongos BalbC. O número de células inoculadas foi 5 x 106 por camundongo. O crescimento do tumor foi medido com um calibre digital em comprimento, largura e altura do qual o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). ADC-1013 (30 μg por dose) foi administrado por via peritumoral no dia 10, 13 e 16 em camundongos com tumores de linfoma estabelecidos (A20).

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000281] O tratamento com ADC-1013 resulta em um efeito antitumoral significativo no modelo de linfoma A20 (Figura 9). Esse modelo é negativo para hCD40 e, assim, o efeito antitumoral demonstrado aqui é somente causado pela ativação das células imunes por ADC-1013.

EXEMPLO 9 - EFEITO DE ADC-1013 EM MODELO DE CÂNCER PULMONAR (LLC-1) MATERIAL E MÉTODOS

[000282] A linhagem de células de câncer pulmonar (LLC-1) que prolifera em fase logarítmica foi injetada por via subcutânea no dia 0 (D0) no flanco direito de camundongos hCD40tg em um volume de 100 μl. O número de células inoculadas foi 0,25 x 106 por camundongo. O crescimento do tumor foi medido com um calibre digital em comprimento, largura e altura do qual o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). ADC-1013 (100 μg) foi administrado por via peritumoral nos dias 4, 7 e 10 em camundongos hCD40tg com tumores estabelecidos (LLC-1).

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000283] O tratamento com ADC-1013 resulta em um efeito antitumoral significativo (p < 0,05, teste t de Mann Whitney com um lado) no modelo de câncer pulmonar (Figura 10). Esse modelo é negativo para hCD40 e, assim, o efeito antitumoral demonstrado aqui é somente causado pela ativação das células imunes por ADC-1013.

EXEMPLO 10 - EFEITO DISTAL DE ADMINISTRAÇÃO LOCAL DE ADC-1013

[000284] Material e métodos A linhagem de células tumorais B16.F10, que prolifera em fase logarítmica, foi injetada por via subcutânea no dia 0 (DO) no flanco direito e no flanco esquerdo de camundongo transgênico hCD40 (hCD40Tg) em um volume de 100 μl. O número de células inoculadas foi 0,1 x 106 por camundongo. O crescimento do tumor foi medido com um calibre digital em comprimento, largura e altura do qual o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). Os tratamentos foram administrados nos dias 3, 6 e 9. ADC-1013 e os controles foram administrados por via intratumoral (100 μg por dose) no tumor no flanco direito. O volume de tumor de tumores tanto injetados como não injetados foi acompanhado ao longo do tempo conforme mostrado na Figura 11.

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000285] O tratamento intratumoral local também gerou efeitos antitumorais no tumor não injetado distal. Os níveis de ADC-1013 livre após o tratamento de doses de 100 μg estão bem abaixo do EC50 para ADC-1013 m ensaios in vitro, sugerindo que o efeito antitumoral sobre o tumor não injetado em parte depende da migração de células imunes que são ativadas na área de tumor injetado, ao tumor não injetado.

[000286] Isso sugere que ADC-1013 injetado em um tumor pode ter efeitos antitumorais significativos em outros tumores não injetados (por exemplo, metástases).

EXEMPLO 11 - EFEITO DE ADMINISTRAÇÃO SISTÊMICA (IV) DE ADC-1013 MATERIAL E MÉTODOS

[000287] A linhagem de células tumorais B16.F10(hCD40+), proliferando em fase logarítmica, foi injetado por via subcutânea no dia 0 (D0) no flanco direito de camundongo transgênico para hCD40 (hCD40Tg) em um volume de 100 μl. O número de células inoculadas foi 0,1 x 106 por camundongo. O crescimento do tumor foi medido com um calibre digital em comprimento, largura e altura do qual o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). Os tratamentos foram administrados nos dias 3, 6 e 9. ADC-1013 foi administrado por via intravenosa (100 μg por dose).

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000288] A administração intravenosa sistêmica de ADC-1013 resultou em um efeito inibidor acentuado sobre o crescimento do tumor (Figura 12).

EXEMPLO 12 - EFEITO IN VIVO DE TERAPIA DE COMBINAÇÃO III

[000289] Material e métodos. Os camundongos BalbC fêmeas foram inoculados por via subcutânea com 5 x 106 células de linfoma A20. Os camundongos foram tratados com 9D9 (anticorpo anti-CTLA-4, BioXcel) por via peritumoral nos dias 5 e 8 e com agonista de TLR CpG (1668) por via intratumoral nos dias 5, 8 e 11. A sobrevivência foi acompanhada ao longo do tempo.

RESULTADOS E CONCLUSÕES

[000290] O anticorpo 9D9 direciona o receptor de ponto de verificação CTLA-4 e CpG se liga a receptor 9 semelhante a Toll. TLRs são proteína transmembranares, expressas em células apresentadoras de antígeno, tais como células dendríticas. A ligação de TLR9 com CpG induz a ativação de células dendríticas. Os resultados são mostrados na Figura 13.

[000291] O efeito antitumoral da combinação de tratamentos direcionada a TLR9 e CTLA4 não resulta em um efeito antitumoral aumentado em comparação ao tratamento com CpG sozinho. Os dados, assim, mostram que uma combinação de um tratamento que ativa células dendríticas em combinação com um inibidor de ponto de verificação que nem sempre resulta em efeitos antitumorais aumentados.

[000292] Consequentemente, a eficácia das terapias de combinação da presente invenção não poderia ser prevista ou razoavelmente esperada.

Claims (12)

1. TERAPIA DE COMBINAÇÃO KIT PARA TRATAR UM TUMOR SÓLIDO EM UM INDIVÍDUO, caracterizada por compreender (a) um anticorpo ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CD40, e (b) um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se li ga especificamente a CD40 compreende VL CDR1: CTGSSSNIGAGYNVY [SEQ ID NO:1]; VL CDR2: GNINRPS [SEQ ID NO:2]; VL CDR3: CAAWDKSISGLV [SEQ ID NO:3]; VH CDR1: GFTFSTYGMH [SEQ ID NO:4]; VH CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [SEQ ID NO:5]; e VH CDR3: CARILRGGSGMDL [SEQ ID NO:6] e em que o agente imunoterápico adicional é um anticorpo anti-PD-1 que bloqueia a interação entre PD1 e PD- L1.

2. TERAPIA DE COMBINAÇÃO KIT, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo tumor sólido ser selecionado dentre os grupos que consistem em um adenoma, um blastoma, um carcinoma, um tumor desmoide, um tumor de célula redonda pequena desmopolástica, um tumor endócrino, um tumor de célula germinativa, um linfoma, um sarcoma, um tumor de Wilms, um tumor pulmonar, um tumor de cólon, um tumor linfático, um tumor de mama e um melanoma.

3. TERAPIA DE COMBINAÇÃO KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 compreenderem ou consistirem em um anticorpo intacto.

4. TERAPIA DE COMBINAÇÃO KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 compreenderem ou consistirem em um fragmento de ligação a antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em: um fragmento Fv e um fragmento semelhante a Fab.

5. TERAPIA DE COMBINAÇÃO KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo serem humano ou humanizado.

6. TERAPIA DE COMBINAÇÃO KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 compreenderem (a) a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e/ou a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8; (b) a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e/ou a região variável de cadeia constante de SEQ ID NO: 12; ou (c) a cadeia leve de SEQ ID NO: 7 mais a SEQ ID NO:11, e/ou a cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 mais a SEQ ID NO:12.

7. TERAPIA DE COMBINAÇÃO KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo anticorpo anti-PD-1 ser selecionado a partir do grupo que consiste em Nivolumab, Pembrolizumab, Lambrolizumab, Pidilizumab e AMP- 224.

8. ANTICORPO OU PORÇÃO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO, caracterizado se ligar especificamente a CD40 para tratar um tumor sólido, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se li ga especificamente a CD40 compreende VL CDR1: CTGSSSNIGAGYNVY [SEQ ID NO:1]; VL CDR2: GNINRPS [SEQ ID NO:2]; VL CDR3: CAAWDKSISGLV [SEQ ID NO:3]; VH CDR1: GFTFSTYGMH [SEQ ID NO:4]; VH CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [SEQ ID NO:5]; e VH CDR3: CARILRGGSGMDL [SEQ ID NO:6] e em que o anticorpo ou a porção de l igação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 é formulado para ser usado em combinação com um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente é um anticorpo anti-PD-1 que bloqueia a interação entre PD1 e PD-L1.

9. USO, caracterizado por ser um anticorpo ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CD40 na preparação de um medicamento para tratar um tumor sólido, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 compreende sequências de CDR de cadeia leve de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3 e sequências de CDR de cadeia pesada de SEQ ID NOs: 4, 5 e 6 e em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 é formulado para ser usado em combinação com um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente é um anticorpo anti-PD-1 que bloqueia a interação entre PD1 e PD-L1.

10. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender (a) um anticorpo ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CD40, e (b) um agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer, em que o agente é um anticorpo anti-PD-1 que bloqueia a interação entre PD1 e PD-L1, em que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40 compreende VL CDR1: CTGSSSNIGAGYNVY [SEQ ID NO:1]; VL CDR2: GNINRPS [SEQ ID NO:2]; VL CDR3: CAAWDKSISGLV [SEQ ID NO:3]; VH CDR1: GFTFSTYGMH [SEQ ID NO:4]; VH CDR2: GKGLEWLSYISGGSSYIFYADSVRGR [SEQ ID NO:5]; e VH CDR3: CARILRGGSGMDL [SEQ ID NO:6].

11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo serem conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 6.

12. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11 caracterizada pelo agente imunoterápico adicional com eficácia no tratamento de câncer ser conforme definido na reivindicação 7.