CN109311993B - Lag-3结合元件 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种结合到淋巴细胞活化基因3(LAG‑3)的特异性结合元件。所述特异性结合元件优选地包括LAG‑3抗原结合位点，所述LAG‑3抗原结合位点可以位于所述特异性结合元件的CH3结构域的两个或更多个结构环中。本发明的特异性结合元件可以用于例如癌症治疗。

Description

LAG-3结合元件
相关的申请
本案与2016年6月20日提交的US62/352470相关，其全部内容通过引用以其整体合并于此。
发明领域
本发明涉及结合淋巴细胞活化基因3(LAG-3)的特异性结合元件。所述特异性结合元件优选包括LAG-3抗原结合位点，所述LAG-3抗原结合位点可以位于所述特异性结合元件的CH3结构域的两个或更多个结构环中。本发明的特异性结合元件获得例如在癌症治疗中的应用。
发明背景
淋巴细胞活化基因-3(LAG-3；CD223)是Ig超家族的成员，与CD4在遗传上和结构上相关(虽然仅有20％的序列同一性)。如CD4一样，LAG-3结合主要组织相容性复合体II类(MHC II类，MHC class II)分子，但具有比CD4更高的亲和性(KD＝60nM)。LAG-3在活化的T细胞、NK细胞、浆细胞样树突细胞(pDCs)、B细胞、γδT细胞上表达，参与免疫抑制，特别是通过在一定百分比的调节性T细胞(Treg)上持续强表达(Liang et al，2008)。
LAG-3基因位于人的12号染色体上，邻近CD4基因，横跨8个外显子。有五种可选的转录产物，其中，两种产生蛋白质产物：全长的跨膜蛋白，以及选择性剪接的可溶单体形式。全长转录产物编码分子量为70kDa的525个氨基酸的蛋白质，并具有功能活性，而可溶形式看起来不结合MHC II类分子，它的功能是未知的。人的全长LAG-3蛋白与食蟹猴(cynomolgus monkey,Macaca fascicularis)的LAG-3具有93％的序列同一性，与家鼠(house mouse,Mus musculus)LAG-3具有70％的序列同一性。
LAG-3为具有四个细胞外的Ig样结构域(D1-D4)的跨膜蛋白，以及负责LAG-3信号转导的细胞质部分。胞质结构域(cytoplasmic domain)具有与LAG-3相关蛋白(LAG-3-associated protein,LAP)相关的EP(谷氨酸/脯氨酸)基序，以及被认为是T细胞功能的LAG-3调节所需的KIEELE基序。关于EP基序的作用的报道表明，它可能负责LAG-3向T细胞表面膜的输送(Bae et al，2014)，或可能在T细胞活化期间直接负责调节信号转导转录因子5(Signal transducers and activators of transcription，STAT5)的下游信号转导(Durham et al，2014)，或可能两者皆有。
LAG-3对T细胞的免疫抑制机制被认为由活化的T细胞上LAG-3的交联驱动，在T细胞活化期间产生降低的钙通量(calcium flux)和IL-2释放(Huard et al，1997)。在抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell,APCs)上，LAG-3正调节(positive regulation)T细胞结合MHC II类分子导致降低的IL-12分泌和CD86的下调(Liang et al，2008)，由不适当的激活导致T细胞的失效的“二级信号”，和/或通过APCs降低的抗原呈递。。LAG-3敲除的小鼠模型是可行的，仅有轻度淋巴增生(lympho-hyperproliferation)(Workman et al，2003)，表明LAG-3充当湿度的免疫“刹车(brake)”。
还已经提出LAG-3与II类MHC之间的这种抑制性相互作用发生在调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)与CD4阳性T细胞之间(Sega et al，2014)。调节性T细胞通过抑制性细胞因子(例如IL-10和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)的释放、炎症性新陈代谢的操纵(例如CD73分解代谢的腺苷)、调节APC成熟、或T细胞与效应T细胞之间的直接相互作用抑制免疫应答。人类中有证据表明MHC II类正调节性T细胞比MHCII类负调节性T细胞更具抑制性(Baecher-Allen et al，2006)，并通过与效应T细胞上表达的LAG-3的直接相互作用主动抑制免疫应答。虽然LAG-3负调节性T细胞可以抑制常规的T细胞增殖，LAG-3阴性CD4和CD8 T细胞却对Treg免疫抑制有抗性。这一过程被描述为通过称为胞啃作用(trogocytosis)的过程发生在人类T细胞之间(Sega et al，2014)，借此调节性T细胞不仅阻止APC成熟，还获得II类MHC以抑制致敏(primed)LAG-3阳性CD4 T细胞。
LAG-3表达也是重复的抗原刺激的标志物(marker)。在癌症中，T细胞通常采取“衰竭的(exhausted)”表型，包括免疫抑制剂(immune-suppressor)例如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白分子3(TIM-3)和LAG-3的表达(Wherry et al，2011)，其中细胞一般不能适当地增殖和分泌响应抗原的趋化因子。这些免疫抑制剂的抑制降低了免疫阈值，并(重新)允许T细胞的适当的抗癌反应。在临床前模型中，已经使用对抗LAG-3、CTLA-4和PD-1的拮抗剂(antagonist)抗体证实了这一点，其中观察到肿瘤负荷的降低。拮抗性抗体对LAG-3的抑制被认为重新激活了肿瘤微环境中的免疫应答，其中，在CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞上的LAG-3表达与衰竭的表型相关，调节性T细胞上的LAG-3表达与潜在的免疫抑制能力相关。阻断LAG-3的抗体提高了T效应细胞的增殖、细胞因子产生、和细胞毒性，并降低了调节性T细胞抑制物活性，引起肿瘤生长的减少。
在人类肿瘤中，在来自人肾细胞癌和其他肿瘤例如黑素瘤和淋巴瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)上发现增加的LAG-3表达(Demeure et al，2001；Wolchock et al，2013)。重要地，LAG-3也与有慢性病毒感染(Workman，2005)和癌症(Workman et al，2003)的患者的T细胞功能障碍紧密相关。LAG-3也被鉴定为多种人类癌症中肿瘤浸润性调节性T细胞的表面标志物(Camisachi et al.2010；Gandhi et al，2006)。针对人LAG-3的单克隆抗体处于临床开发中，以消除免疫抑制并潜在地增强癌症中的抗原呈递(实体和血液系统恶性肿瘤(solid and haematological malignancies))。
LAG-525和IMP-701(诺华公司(Novartis AG))是针对LAG-3的人抗体，已分别进入肾癌(肾细胞癌)；非小细胞肺癌(Non-Small cell Lung Cancer,NSCLC)；鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer)；结肠直肠癌症(Colorectal Cancer)；黑素瘤(melanoma)；胃癌(Gastric Cancer)和胃食管接点的腺癌(Adenocarcinoma of the GastroesophagealJunction)的II期和I期临床研究。
抗LAG-3抗体百时美施贵宝公司-986016(BMS-986016,Bristol-Myers SquibbCompany)目前处于卵巢癌(Ovarian Cancer)；NSCLC；结肠直肠癌症；宫颈癌(CervicalCancer)；黑素瘤；胃癌；膀胱癌(Bladder Cancer)；头颈癌鳞状细胞癌(Head And NeckCancer Squamous Cell Carcinoma)；(；肾细胞癌的NSCLC中的I期临床测试中，以及；复发性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；难治性慢性淋巴细胞性白血病(Chronic LymphocyticLeukemia,CLL)；黑素瘤；非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)；霍奇金淋巴瘤；弥散性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-Cell Lymphoma)；惰性淋巴瘤(Indolent Lymphoma)；套细胞淋巴瘤(Mantle Cell Lymphoma)；难治性多发性骨髓瘤(Refractory MultipleMyeloma)；和复发性多发性骨髓瘤(Relapsed Multiple Myeloma)的II期研究中，作为单一治疗或作为组合治疗的部分。
针对LAG-3的更多抗体也处于临床前的开发中。
然而，仅有少数抗LAG-3治疗当前处于临床测试中，都没有被批准用于治疗，因此仍然需要开发可以用于癌症治疗情况下的靶向LAG-3的其他分子。
发明内容
在广泛的筛选和亲和成熟程序之后，本发明人得以鉴定出在分子的CH3结构域中包含特异于LAG-3的结合位点的十种特异性结合元件。这些分子显示了对人和食蟹猴LAG-3都具有高亲和力。预期对人LAG-3的高亲和力在人类患者中的例如含有表达LAG-3的肿瘤浸润性淋巴细胞(tumour-infiltrating lymphocytes,TILs)的癌症的治疗是有益的，而预期对食蟹猴LAG-3的高亲和力在食蟹猴疾病模型中特异性结合元件的性质的评估是有用的，该对食蟹猴LAG-3的高亲和力与对人LAG-3的亲和力是可比较的。这一点的理由是，所获得的结果与在食蟹猴模型中测试对人和食蟹猴LAG-3的亲和力有更高变异性的分子相比，对于在人类患者中所述特异性结合元件的效果更有可能是预示性的。
在T细胞活化试验中，所述特异性结合元件还显示为具有高活性，预计对于在人类患者中通过增强LAG-3抑制的改进效力是有预示性的。
发明人还制备了结合鼠类LAG-3的特异性结合元件的替代性鼠类版本，显示了当所述特异性结合元件还包含针对第二肿瘤抗原的基于互补决定区(CDR)的抗原结合位点时，能够显著抑制同基因小鼠癌症模型中的肿瘤生长。基于肿瘤环境中小鼠LAG-3和人LAG-3的类似作用机制，期望在降低显示了肿瘤负荷效果的鼠类的研究转变为人类癌症患者中的临床治疗效益。基于这些数据，因此预期的是，所述特异性结合元件将获得在人类患者中治疗表达LAG-3的癌症的方法中的应用。
因而，本发明的第一个方面中提供了一种特异性结合元件，其结合淋巴细胞活化基因3，并包括位于所述特异性结合元件的CH3结构域中的LAG-3抗原结合位点。
所述LAG-3结合位点优选包括氨基酸序列WDEPWGED(SEQ ID NO：1)和PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)。所述氨基酸序列WDEPWGED优选位于所述特异性结合元件的CH3结构域的第一结构环中，所述氨基酸序列PYDRWVWPDE优选位于所述CH3结构域的第二结构环中。
例如，所述LAG-3抗原结合位点可以位于所述特异性结合元件的CH3结构域的结构环区域中，其中，所述结构环区优选包括两个或更多个结构环，其中，所述LAG-3结合位点优选包括氨基酸序列WDEPWGED(SEQ ID NO：1)和PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)。
作为进一步的示例，所述LAG-3抗原结合位点可以工程化到所述特异性结合元件的CH3结构域的所述两个或更多个结构环中，其中，所述LAG-3结合位点优选包括氨基酸序列WDEPWGED(SEQ ID NO：1)和PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)。
如上所述，所述LAG-3结合位点的序列优选位于所述特异性结合元件的CH3结构域的所述两个或更多个结构环中。在优选的实施方式中，所述LAG-3抗原结合位点包括处于CH3结构域的AB环中的SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列，以及处于CH3结构域的EF环中的SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列优选位于所述CH3结构域的残基11到18处；和/或SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列位于所述CH3结构域的残基92到101处；其中，所述氨基酸残基编号是根据免疫遗传学(ImMunoGeneTics,IMGT)编号方案。
所述特异性结合元件的所述LAG-3抗原结合位点还可以包括以下序列之一，优选在所述特异性结合元件的CH3结构域的CD环中：
(i)SNGQPENNY(SEQ ID NO：2、8和18)；
(ii)SNGQPEDNY(SEQ ID NO：13)；
(iii)SNGYPEIEF(SEQ ID NO：23)；
(iv)SNGIPEWNY(SEQ ID NO：28)；
(v)SNGYAEYNY(SEQ ID NO：33)；
(vi)SNGYKEENY(SEQ ID NO：38)；
(vii)SNGVPELNV(SEQ ID NO：43)；或
(viii)SNGYQEDNY(SEQ ID NO：48)。
优选地，所述特异性结合元件的所述LAG-3抗原结合位点还包括以下序列之一，优选在所述特异性结合元件的CH3结构域的CD环中：所述CH3结构域的CD环中的SEQ ID NO：2、28或38中列出的氨基酸序列。更优选地，所述特异性结合元件的所述LAG-3抗原结合位点还包括所述CH3结构域的CD环中的SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48中列出的氨基酸序列优选位于所述特异性结合元件的CH3结构域的残基43到78处，其中，所述残基根据所述IMGT编号方案编号。
所述LAG-3抗原结合位点的序列之外，所述特异性结合元件的CH3结构域的序列没有特别的限制。优选地，CH3结构域是人免疫球蛋白G结构域，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域，最优选人IgG1 CH3结构域。人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域的序列是本领域已知的。
在优选的实施方式中，所述特异性结合元件包括SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50中列出的CH3结构域，更优选SEQ ID NO：5、30或40中列出的CH3结构域，最优选SEQ ID NO：5中列出的CH3结构域。可选地，所述特异性结合元件可以包括CH3结构域，所述CH3结构域具有与SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50，优选SEQ ID NO：5、30或40，更优选SEQ ID NO：5至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。
所述特异性结合元件还可以包含CH2结构域。正如人lgG分子的情况一样，所述CH2结构域优选位于所述CH3结构域的N-末端。所述特异性结合元件的CH2结构域优选人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2结构域，更优选人IgG1的CH2结构域。人IgG结构域的序列是本领域已知的。在优选的实施方式中，所述特异性结合元件包括具有SEQ ID NO：53中列出的序列的IgG CH2结构域，或具有与SEQ ID NO：53有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列的CH2结构域。
在优选的实施方式中，所述特异性结合元件包括SEQ ID NO：6、7、11、12、16、17、21、22、26、27、31、32、36、37、41、42、46、47、51或52中列出的序列，或与SEQ ID NO：6、7、11、12、16、17、21、22、26、27、31、32、36、37、41、42、46、47、51或52中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。更优选地，所述特异性结合元件包括SEQ ID NO：6、7、31、32、41或42中列出的序列，或与SEQ ID NO：6、7、31、32、41或42中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。再更优选地，所述特异性结合元件包含SEQ ID NO：6或7中列出的序列，或与SEQ ID NO：6或7中列出的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。
优选地，所述特异性结合元件包括在所述CH2结构域的N-末端的免疫球蛋白绞链区(hinge region)或其部分。所述免疫球蛋白绞链区容许两个CH2-CH3结构域序列缔合并形成二聚体。优选地，所述绞链区或其部分是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4绞链区，或其部分。更优选地，所述绞链区或其部分是IgG1绞链区或其部分。所述人IgG1绞链区的序列在SEQID NO：57中示出。可以形成特异性结合元件的部分的适合的截短的绞链区在SEQ ID NO：58中示出。这一绞链区存在于实施例中测试的Fcab分子中，而全长绞链区存在于模拟的mAb2形式中。因而，特异性结合元件优选包括在所述CH2结构域的N-末端的免疫球蛋白绞链区或其部分，其中，所述绞链区具有SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58中列出的序列，或其中，所述铰链区具有与SEQ ID NO：57或58中列出的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。可选地，特异性结合元件可以包括在所述CH2结构域的N-末端的免疫球蛋白绞链区或其部分，其中，所述绞链区包含SEQ ID NO：57中列出的序列或其片段，其中，所述片段包含至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或更多个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个或至少十四个SEQ ID NO：57的氨基酸残基。
除了所述特异性结合元件的CH3结构域中的LAG-3抗原结合位点之外，所述特异性结合元件还可以包括一个或更多个附加的抗原结合位点以产生双特异性或多特异性分子。优选地，所述特异性结合元件包括基于CDR的抗原结合位点。自然产生(naturally-occurring)的免疫球蛋白分子中发现了基于CDR的抗原结合位点，它们的结构在本领域中是已知的。在特异性结合元件包含基于CDR的抗原结合位点之处，特异性结合元件优选为抗体分子。所述抗体分子没有特别地限制，只要它包括本文限定的CH3结构域和基于CDR的抗原结合位点。在优选的实施方式中，所述抗体分子是人免疫球蛋白G分子，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子，更优选人IgG1分子。人免疫球蛋白G分子的序列是本领域已知的，并且将如本文公开的CH3结构域或CH3结构域序列引入这样的分子中将不会给技术人员呈现任何困难。
在所述特异性结合元件包括一个或更多个基于CDR的抗原结合位点之处，所述基于CDR的抗原结合位点优选结合为免疫系统调节物(modulator)的分子。免疫系统调节物的示例包括免疫调节受体和免疫调节受体的配体。优选地，所述基于CDR的抗原结合位点结合免疫系统抑制剂或活化剂，最优选免疫系统抑制剂。优选的免疫系统抑制剂的示例为：细胞毒T-淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白含粘蛋白结构域-3(Tcell immunoglobulin and mucin-domaincontaining-3,TIM-3)、胞外-5’-核苷酸酶(CD73)和集落刺激因子1受体(Colonystimulating factor 1receptor,CSF-1R)。在某些实施方式中，所述基于CDR的抗原结合位点不是程序性细胞死亡蛋白-1(PD-L1)的结合位点。
所述特异性结合元件可以进一步与免疫系统调节物、细胞毒分子、放射性同位素或可检测标记。所述免疫系统调节物可以是细胞毒性分子是细胞因子。
本发明还提供了一种编码本发明的特异性结合元件或抗体分子的核酸，以及包含这样的核酸的载体。
还提供了一种包含本发明的核酸或载体的重组宿主细胞。这样的重组宿主细胞可以用于生产本发明的特异性结合元件。因而，还提供的是一种生产本发明的特异性结合元件或抗体分子的方法，所述方法包括在用于生产所述特异性结合元件或抗体分子的条件下培养所述重组宿主细胞。所述方法还可以包括分离和/或纯化所述特异性结合元件或抗体分子的步骤。
期望本发明的特异性结合元件和抗体应用于治疗应用，特别是人类中的治疗应用，例如癌症治疗。因而，还提供的是包括根据本发明的特异性结合元件或抗体分子、以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明还提供了本发明的特异性结合元件或抗体分子，其用于治疗患者的癌症的方法中。还提供的是治疗患者的癌症的方法，其中，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件或抗体分子。进一步提供的是根据本发明的特异性结合元件或抗体分子，其用于制造用于治疗患者的癌症的药物的用途。本文提及的患者优选为人类患者。所述治疗还可以包括向所述患者施用抗肿瘤疫苗和/或化学治疗剂(chemotherapeutic agent)。
本发明人已经示出了具有根据包括位于特异性结合元件的CH3结构域的LAG-3抗原结合位点的本发明的特异性结合元件的TIL与抗PD-L1抗体结合的治疗导致该TILs的LAG-3表达降低。期望LAG-3表达的降低减少LAG-3的抑制效果，从而允许该TIL克服衰竭。一旦该TILs变为活化的，所预期的是它们将能识别肿瘤表达的新抗原，并固定针对它的反应，从而降低肿瘤负荷。
因此，本发明的特异性结合元件可以与结合PD-L1的第二特异性结合元件例如结合PD-L1的抗体分子组合施用给患者。
因而，在进一步的方面中，本发明涉及一种本发明的特异性结合元件或抗体分子，其用于治疗患者的癌症的方法中，其中，所述方法包括向该患者施用本发明的所述特异性结合元件或抗体分子，以及结合PD-L1的第二特异性结合元件。
本发明还涉及一种结合PD-L1的特异性结合元件，其用于治疗患者的癌症的方法中，其中，所述方法包括向所述患者施用特异性结合元件以及本发明的特异性结合元件或抗体分子。
本发明还涉及一种治疗患者的癌症的方法，其中，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件或抗体分子，以及结合PD-L1的第二特异性结合元件。还提供的是根据本发明的特异性结合元件或抗体分子用于制造用于治疗患者的癌症的药物的用途，其中所述治疗包括向所述患者施用根据本发明的所述特异性结合元件或抗体分子，以及结合PD-L1的第二特异性结合元件。
本发明的特异性结合元件或抗体分子，以及结合PD-L1的特异性结合元件可以同时地、分离地或依序地施用给所述患者。
在这方面，本发明的特异性结合元件或抗体分子可以不包括用于第二抗原的基于CDR的抗原结合位点。因而本发明的特异性结合元件或抗体分子可以仅结合LAG-3。
结合PD-L1的特异性结合元件可以是抗体分子或其片段。结合PD-L1的抗体分子在本领域是已知的。所述抗体分子可以是人的或人源化的。所述抗体分子优选为单克隆抗体分子。抗体分子的示例为免疫球蛋白同型(immunoglobulin isotypes)，例如，免疫球蛋白G和它们的同型子类，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及其片段。所述结合PD-L1的特异性结合元件不包含LAG-3抗原结合位点。
附图的简要说明
附图1A示出了在第二次亲和成熟之后鉴定的九种Fcab FS18-7-32、FS18-7-33、FS18-7-36、FS18-7-58、FS18-7-62、FS18-7-65、FS18-7-78、FS18-7-88和FS18-7-95相对于亲本Fcab FS18-7-9的序列比对。这些Fcab的每一个与亲本Fcab FS18-7-9的序列的序列同一性在附图1B中显示。
附图2示出了替代抗小鼠LAG-3Fcab抑制了小鼠LAG-3，在DO11.10T细胞活化分析中导致mIL-2的释放。基准抗鼠LAG-3mAb C9B7W显示了mIL-2释放的增加，然而最大释放显著小于抗小鼠LAG-3Fcab的释放。在此实验中，WT Fcab没有显示活性。
附图3示出了，模拟mAb2格式的抗LAG-3Fcab FS18-7-9抑制食蟹猴LAG-3，在DO11.10 T细胞活化试验中导致mIL-2的释放。基准抗LAG-3mAb,25F7显示了mIL-2释放的提高，然而最大释放大约是模拟mAb2形式的Fcab的三分之二。
附图4示出了，与IgG对照治疗的小鼠相比，包含替代抗小鼠LAG-3Fcab、FS18-7-108-29和特异于鼠TIM-3、CD73、CSF-1R或CTLA-4的Fab区的mAb2分子能够显著地降低MC38同基因肿瘤模型中的肿瘤生长。
附图5示出了抗体治疗对T细胞LAG-3表达的作用。用FS18-29/4420，S1、FS18-29/4420和S1、或对照抗体4420治疗的CD8(A)、CD4(B)和FoxP3(C)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的LAG-3表达在肿瘤接种后的第19天和第23天显示，分别相应于最后一次mAb2/抗体给药后的第3天和第7天。在用FS18-29/4420和S1的组合治疗后在第23天LAG-3表达降低，而单独施用的FS18-29/4420或S1导致LAG-3的表达几乎没有降低。
详细说明
本发明涉及结合LAG-3的特异性结合元件。特别地，本发明的特异性结合元件包括位于所述特异性结合元件的恒定域中的LAG-3抗原结合位点。除非上下文另外需要，术语“LAG-3”可以指人LAG-3、鼠LAG-3和/或食蟹猴LAG-3。优选地，术语“LAG-3”是指人LAG-3。
术语“特异性结合元件”描述免疫球蛋白或其片段，其包括恒定域，优选CH3结构域，其包括LAG-3抗原结合位点。优选地，所述特异性结合元件包含CH2和CH3结构域，其中，所述CH2或CH3结构域，优选CH3结构域，包括LAG-3抗原结合位点。在优选的实施方式中，所述特异性结合元件还包括在所述CH2结构域的N-末端的免疫球蛋白绞链区或其部分。这样的分子也称为抗原结合Fc片段，或本文的FcabTM。所述特异性结合元件可以是部分地或完全地合成产生。如本文使用的，术语“特异性结合元件”因而包括片段，只要所述片段包含位于所述特异性结合元件的恒定域例如CH1、CH2或CH3结构域，优选CH3结构域中的LAG-3抗原结合位点。除非上下文另外需要，本文使用的术语“特异性结合元件”因而相当于“特异性结合元件或其片段”。
在优选的实施方式中，所述特异性结合元件是抗体分子。术语“抗体分子”涵盖抗体分子的片段，只要这样的片段包括恒定域，例如，CH1、CH2或CH3结构域，优选CH3结构域，该恒定域包括LAG-3抗原结合位点。所述抗体分子可以是人的或人源化的。所述抗体分子优选为单克隆抗体分子。抗体分子的示例是免疫球蛋白同型，例如，免疫球蛋白G和它们的同型子类，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及其片段。
可以采用单克隆的和其他抗体并使用重组DNA技术的技术来产生保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。这样的技术可能涉及将CDRs或可变区导入不同的免疫球蛋白。例如在EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400中描述了一个免疫球蛋白向另一个免疫球蛋白中的CDRs的导入。可以对相关的恒定域序列采用类似的技术，提供所述LAG-3抗原结合位点。可选地，产生特异性结合元件的杂交瘤或其他细胞可以经历遗传突变或其他改变，这可能或可能不改变所产生的抗体的结合特异性。
由于可以以许多方式修饰抗体，因此术语“特异性结合元件”应当被解释为覆盖抗体的抗体片段、衍生物、功能等效物和同源物，无论是天然的、完全合成的还是部分合成的。包括CH3结构域的抗体片段的示例是抗体的Fc片段。包含CDR序列和CH3结构域两者的抗体片段的示例是微抗体(minibody)，其包含连接到CH3结构域的单链抗体可变区基因片段(scFv)(Hu et al.(1996),Cancer Res.,56(13):3055-61)。(Hu et al.(1996),CancerRes.,56(13):3055-61)
本发明的特异性结合元件结合LAG-3。在这一场景下结合可以指特异性结合。术语“特异性”可以指该情况，其中所述特异性结合元件将不显示对它的特异性结合配体，此处是LAG-3，之外的分子的任何显著结合。术语“特异性”在所述特异性结合元件特异于特定的表位，例如LAG-3上的表位处也是可用的，在特异性结合元件将能够结合携带所述表位的各种抗原的情况下，该特定的表位被多种抗原所携带。LAG-3与它最紧密相关的蛋白质CD4享有40％的序列同一性。本发明人测试了包括SEQ ID NO：1到3中列出的氨基酸序列的S18-7-9Fcab对CD4的结合。FS18-7-9Fcab不显示与CD4结合，表明所述特异性结合元件特异性地结合LAG-3。因而，在优选的实施方式中，本发明的特异性结合元件的LAG-3结合位点不结合CD4，或不显示对CD4的任何显著结合。
本发明的特异性结合元件优选包括LAG-3抗原结合位点。所述LAG-3抗原结合位点位于所述特异性结合元件的恒定域中，例如，CH1、CH2、CH3或CH4结构域。优选地，所述LAG-3抗原结合位点位于所述特异性结合元件的CH3结构域中。所述LAG-3结合位点优选包括氨基酸序列WDEPWGED(SEQ ID NO：1)和PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)。这些序列存在于由如示例中描述的在广泛的筛选和表征程序之后的本发明所鉴定的所有前导抗LAG-3Fcab克隆(leadanti-LAG-3Fcab clones)中。
SEQ ID NOs：1和2中列出的氨基酸序列优选位于所述特异性结合元件的恒定域的结构环中。例如，在WO2006/072620和WO2009/132876中描述了将序列导入抗体恒定域的结构环区中来创建新的抗原结合位点。
抗体恒定域的结构环包括AB、CD和EF环。在CH3结构域中，AB、CD和EF环位于CH3结构域的残基11-18、43-78和92-101，其中所述氨基酸编号根据免疫遗传学(ImMunoGeneTics,IMGT)编号方案。SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列优选位于恒定域的AB环中。SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列优选位于恒定域的EF环中。更优选地，SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列位于CH3结构域的残基11到18处；和/或SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列位于CH3结构域的残基92到101处，其中所述氨基酸序列编号是根据IMGT编号方案。
另外，所述特异性结合元件优选包括在SEQ ID NO：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48中列出的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO：2、28或38中，再更优选SEQ ID NO：2。所述结构环优选为CD环，且所述恒定域优选为CH3结构域。SEQ ID NO：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48中列出的氨基酸序列优选位于CH3结构域的残基43到78处，其中，所述氨基酸编号根据IMGT编号方案。本发明的特异性结合元件还可以包括CH3结构域的位置36处的谷氨酸残基(E)和/或位置85.2处的酪氨酸残基(Y)(如附图1A所示)。特别地，包括SEQ ID NO：8中列出的CD结构环区的特异性结合元件优选还包含处在CH3结构域的位置36处的谷氨酸残基。类似地，包括SEQ ID NO：18中列出的CD结构环区的特异性结合元件优选还包括CH3结构域的位置85.2处的酪氨酸残基(Y)。
在优选的实施方式中，本发明的特异性结合元件包括CH3结构域，该CH3结构域包括、具有或由SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50中列出的序列组成，优选具有SEQ ID NO：5、30或40中列出的序列的CH3结构域，更优选具有SEQ ID NO：5中列出的序列的CH3结构域。
本发明的特异性结合元件可以包括CH3结构域，该CH3结构域包括、具有或由SEQID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50中列出的序列组成，其中该CH3结构域序列还包括处在SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50中显示的序列的紧邻C-末端的赖氨酸残基。因而，例如，本发明的特异性结合元件可以包括CH3结构域，该CH3结构域包含、具有或由SEQ ID NO：5中列出的序列组成，具有处在SEQ ID NO：5中显示的序列的C-末端的赖氨酸残基。这样的CH3结构域的序列则将是如下的：GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:135)。
此外，本发明的特异性结合元件可以包括免疫球蛋白G分子的CH2结构域，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的CH2结构域。优选地，本发明的特异性结合元件包含IgG1分子的CH2结构域。该CH2结构域可以具有SEQ ID NO：53中列出的序列。
所述特异性结合元件的CH2结构域可以包括突变(mutation)以降低或取消CH2结构域与一种或多种FcγR受体，例如Fcγc，、Fc，例如种或、Fc，例如种或、Fc，RIII的结合，和/或与补体(complement)的结合。人IgG结构域的CH2结构域通常结合Fcγ受体和补体，并且发明人假定与Fcγ受体的结合降低将减少抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)，并且与补体的结合降低将减少所述特异性结合元件的补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)的活性。降低或取消CH2结构域与一种或多种Fcγ受体和补体的结合的突变是已知的，包括Bruhns，et al.(2009)和Xu et al.(2000)中描述的“LALA突变”。因而，所述特异性结合元件可以包括CH2结构域，其中，CH2结构域包括该CH2结构域的位置4和5处的丙氨酸残基，其中，所述编号为根据IMGT编号方案。例如，所述特异性结合元件包括IgG1 CH2结构域，其包括、具有或由SEQ ID NO：54中列出的序列组成。
根据本发明的特异性结合元件可以包括第二抗原结合位点，优选基于CDR的抗原结合位点。术语“基于CDR的抗原结合位点”是指特异性结合元件可变区的抗原结合位点，其包含六个CDR的残基。所述第二抗原结合位点优选特异于肿瘤抗原。更优选地，该第二抗原结合位点可以结合是免疫系统调节物的分子，例如，免疫调节受体或免疫调节受体的配体。例如，该第二抗原结合位点可以结合是免疫系统抑制剂或活化剂的分子，优选免疫系统抑制剂。免疫系统抑制剂的示例包括细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白含粘蛋白结构域-3(TIM-3)和集落刺激因子1受体(CSF1R)。针对给定抗原例如肿瘤抗原的抗体分子、以及这样的抗体分子的CDR序列的测定在技术人员的能力范围之内，并且许多适合的技术在本领域是已知的。此外，针对各种免疫系统调节物包括CDR序列的抗体，在本领域是已知的。因而，技术人员在制备包括除了本文描述的LAG-3结合位点之外的用于第二抗原的基于CDR的抗原结合位点的特异性结合元件中将没有困难。
本发明的特异性结合元件还可以包括本文所公开的结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列的变体。可以通过序列改变、突变或筛选的方法来获得适合的变体。在优选的实施方式中，包括一种或多种变体序列的特异性结合元件保持了亲本特异性结合元件的一个或更多个功能特征，例如，对LAG-3的结合特异性和/或结合亲和力。例如，包括一种或多种变体序列的特异性结合元件优选结合具有与(亲本)特异性结合元件相同的或比(亲本)特异性结合元件更高的亲和力的LAG-3。所述亲本特异性结合元件是不包括被合并到所述变体特异性结合元件中的氨基酸取代、删除和/或插入的特异性结合元件。
例如，本发明的特异性结合元件可以包括结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列，其与本文公开的结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
在优选的实施方式中，本发明的特异性结合元件包含CH3结构域序列，该CH3结构域序列与SEQ ID NO：4、5或135中列出的CH3结构域序列具有至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
在进一步优选的实施方式中，本发明的特异性结合元件包括CH3和CH2结构域序列，该CH3和CH2结构域序列与SEQ ID NO：6或7中列出的CH2和CH3结构域序列具有至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。序列同一性通常参考算法平均积分点(GAP)来定义(Wisconsin GCG package,Accelerys Inc,San DiegoUSA)。GAP使用内德勒曼(Needleman)和翁施(Wunsch)算法来比对两个完整的序列，最大化匹配的数量并最小化缺口的数量。一般地，使用默认的参数，缺口创建罚分＝12，及缺口延伸罚分＝4。GAP的使用可以是优选的，但是可以使用其他算法，例如，贝尔实验室空时(BLAST)(其使用Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:405-410的方法)，同源比较(FASTA)(其使用Pearson and Lipman(1988)PNAS USA 85:2444-2448的方法)，或史密斯-华特曼(Smith-Waterman)算法(Smith and Waterman(1981)J.Mol Biol.147:195-197)，或上文Altschul etal.(1990)的TBLASTN程序，一般采用默认参数。特别地，可以使用位置特异性迭代-Blast(psi-Blast)算法(Nucl.Acids Res.(1997)25 3389-3402)。
本发明的特异性结合元件还可以包括结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列，其与本文公开的结构环、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列相比具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、删除、取代和/或插入)，优选20个改变或更少、15个改变或更少、10个改变或更少、5个改变或更少、4个改变或更少、3个改变或更少、2个改变或更少、或1个改变。特别地，可以在所述特异性结合元件的一个或多个框架区中进行改变。
在优选的实施方式中，本发明的特异性结合元件可以包括CH3结构域序列，其与SEQ ID NO：4、5或135中列出的CH3结构域序列相比具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、删除、取代和/或插入)，优选20个改变或更少、15个改变或更少、10个改变或更少、5个改变或更少、4个改变或更少、3个改变或更少、2个改变或更少、或1个改变。
在进一步优选的实施方式中，本发明的特异性结合元件包括CH3和CH2结构域序列，其与SEQ ID NO：6或7中列出的CH2和CH3结构域序列相比具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、删除、取代和/或插入)，优选20个改变或更少、15个改变或更少、10个改变或更少、5个改变或更少、4个改变或更少、3个改变或更少、2个改变或更少、或1个改变。
还期待的是一种特异性结合元件，其与本发明的特异性结合元件竞争结合LAG-3，或其结合与本发明的特异性结合元件相同的LAG-3上的表位，其中，该特异性结合元件优选包括位于所述特异性结合元件的CH3结构域中的LAG-3抗原结合位点。测定两种抗体对抗原的竞争的方法在本领域中是已知的。例如，可以使用生物大分子相互作用分析仪(BIAcore)测定两种抗体对抗原的结合的竞争。用于绘制两种抗体结合的表位的方法在本领域中同样地是已知的。
本发明的特异性结合元件优选地以1×10-9M的亲和力(KD)或更大的亲和力结合LAG-3。例如，本发明的特异性结合元件可以以8×10-10M的亲和力(KD)或更大的亲和力结合LAG-3。
可以通过例如表面等离子体共振(SPR)来测定特异性结合元件对同源抗原例如LAG-3的结合亲和力。可以通过流式细胞计(flow cytometry)来测定特异性结合元件对细胞表面表达的同源抗原例如LAG-3的结合亲和力。
Fcab具有比单克隆抗体更小的结合界面，因为Fcab的结合位点与两个位于极为贴近的结合位点形成相当紧致的抗体片段。相比之下，典型的mAb的Fab臂(Fab arms)被柔性铰链区(flexible hinge region)分隔。当与典型的mAb的抗原结合位点相比时，Fcab的两个抗原结合位点也在空间上相互靠近。基于这种更小的结合界面和减小的两个结合位点的柔性，令人惊讶的是，抗LAG-3Fcab能够以与单克隆抗体基准类似的亲和力和效价结合并抑制LAG-3。
本发明的特异性结合元件优选能够结合细胞的表面上表达的LAG-3。该细胞优选为癌细胞。
在所述特异性结合元件包含特异于第二抗原的例如基于CDR的抗原结合位点的第二抗原结合位点之处，特异性结合元件优选能够同时结合LAG-3和所述第二抗原。优选地，特异性结合元件能够同时地结合LAG-3和第二抗原，其中，所述LAG-3和所述第二抗原在单个细胞的表面，或在两个独立的细胞的表面上表达。
本发明的特异性结合元件可以结合人LAG-3、鼠LAG-3和/或食蟹猴LAG-3。优选地，本发明的特异性结合元件结合人LAG-3。
在一个实施方式中，本发明的特异性结合元件不是包括针对PD-L1的抗原结合位点，例如基于CDR的抗原结合位点的例如抗体分子的特异性结合元件。
在某些实施例中，本发明的特异性结合元件不是包括(i)针对PD-L1的基于CDR的抗原结合位点；和(ii)位于所述特异性结合元件的CH3结构域中的LAG-3抗原结合位点的特异性结合元件，例如，抗体分子。
在另一个实施例中，本发明的特异性结合元件不是结合PD-L1和LAG-3的特异性结合元件，例如，抗体分子，其中所述抗体分子包含：
(i)针对PD-L1的基于CDR的抗原结合位点；和
(ii)位于所述抗体分子的CH3结构域中的LAG-3抗原结合位点，其中，所述LAG-3结合位点包括氨基酸序列WDEPWGED(SEQ ID NO：1)和PYDRWVWPDE.(SEQ ID NO：3)，以及其中，所述氨基酸序列WDEPWGED位于所述CH3结构域的第一结构环中，所述氨基酸序列PYDRWVWPDE位于所述CH3结构域的第二结构环中。本发明的特异性结合元件可以缀合到治疗试剂或可检测标记。在这种情况下，所述特异性结合元件可以被称为缀合物(conjugate)。例如，所述特异性结合元件可以与免疫系统调节物、细胞毒分子、放射性同位素或可检测标记缀合。所述免疫系统调节物或细胞毒分子可以是细胞因子。所述可检测标记可以是放射性同位素，例如，非治疗性放射性同位素(non-therapeutic radioisotope)。
所述特异性结合元件可以通过肽键或接头(linker)的方式结合到治疗试剂或可检测标记，即，在包括所述治疗试剂或可检测标记以及所述特异性结合元件或其多肽链组件(polypeptide chain component)的融合多肽(fusion polypeptide)之内。缀合的其他方式包括化学缀合，特别是使用双功能试剂的交联(例如，采用双试剂TM(DOUBLE-REAGENTSTM)交联试剂选择指南(Cross-linking Reagents Selection Guide)，皮尔斯(Pierce))。
所述特异性结合元件和所述治疗试剂或可检测标记因而可以直接相互连接，例如，通过任何适合的化学键或通过接头，例如肽接头(peptide linker)。
所述肽接头可以是短的(2-20个，优选2-15个氨基酸的残基延伸)。肽接头序列的适合的示例在本领域中是已知的。可以使用一个或多个不同的接头。所述接头的长度可以是约5个氨基酸。
所述化学键可以是例如共价键或离子键。共价键的示例包括肽键(酰胺键(amidebonds))和二硫键。例如，所述特异性结合元件与治疗或诊断试剂可以共价连接。例如，通过肽键(酰胺键)。因而，所述特异性结合元件和治疗或诊断试剂可以作为单链多肽产生(分泌)。本发明还提供了编码本发明的抗体分子的分离核酸(isolated nucleic acids)。技术人员使用本领域公知的方法制备这样的核酸将没有困难。分离核酸可以用于表达本发明的特异性结合元件，例如，通过在细菌、酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞中的表达。优选的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵细胞(CHO)、人胚肾细胞(HEK)或小鼠骨髓瘤细胞(NS0)细胞。所述核酸一般将以用于表达的重组载体(recombinant vector)的形式提供。
例如，所述分离核酸可以包含SEQ ID NO：136、4、9、14、19、24、29、34、39、44或49中列出的序列，它们分别编码FS18-7-9(CHO密码子优化的核苷酸序列)、FS18-7-9(HEK293表达的核苷酸序列)、FS18-7-32、FS18-7-33、FS18-7-36、FS18-7-58、FS18-7-62、FS18-7-65、FS18-7-78、FS18-7-88和FS18-7-95的CH3结构域。
包含这样的核酸和载体的体外的宿主细胞是本发明的部分，它们用于表达本发明的特异性结合元件的用途也是本发明的部分，所述特异性结合元件随后可以从细胞培养物中纯化，可选地配制到药物组合物中。因而本发明进一步提供了生产本发明的特异性结合元件的方法，其包括在用于生产所述特异性结合元件的条件下培养本发明的重组宿主细胞。如上所述培养适合的宿主细胞的方法在本领域中是公知的。所述方法还可以包括分离和/或纯化所述特异性结合元件。所述方法还可以包括将所述特异性结合元件，可选地与下文描述的药学上可接受的赋形剂或其他物质一起配制到药物组合物中，。
已知LAG-3在免疫系统的细胞上表达。特别地，已知LAG-3在肿瘤环境内的衰竭的T细胞上，以及有限数量的癌细胞上表达。此外，本发明人已经示出了结合LAG-3的特异性结合元件的使用在同基因的小鼠癌症模型中抑制肿瘤生长是有效的。
因而，本发明的特异性结合元件可以用于患者的治疗癌症的方法中。所述患者优选为人类患者。
使用本发明的特异性结合元件治疗的癌症的细胞可以在，例如，它们的细胞表面表达LAG-3。在一个实施例中，待治疗的癌症的细胞可以已经确定，例如，在它们的细胞表面表达LAG-3。例如，B细胞淋巴瘤已经显示了在它们的细胞表面表达LAG-3。用于测定细胞表面的抗原表达的方法在本领域中是已知的，并包括例如流式细胞术。
下文的实施例3示出了本发明的特异性结合元件可以用于治疗小鼠中具有高水平LAG-3表达的免疫细胞例如表达LAG-3的TIL的肿瘤。因而，另外地或可选地，使用本发明的特异性结合元件治疗的癌症的肿瘤可以包含LAG-3表达免疫细胞。LAG-3表达免疫细胞，例如，LAG-3表达TIL，存在于许多癌症的肿瘤细胞之间。在一个实施方式中，使用本发明的特异性结合元件治疗的癌症的肿瘤已经确定含有LAG-3表达免疫细胞。确定肿瘤中或肿瘤的外周部中LAG-3表达免疫细胞存在的方法在本领域中是已知的。
使用本发明的特异性结合元件治疗的癌症可以选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、惰性非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、纤维肉瘤、肾细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、乳腺癌(breast cancer)、多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme)、肺癌(例如非小细胞肺癌)、头颈部癌症(例如头颈部鳞状细胞癌(head andneck squamous cell carcinoma))、胃癌(stomach cancer，gastric cancer)、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、外阴癌、睾丸癌(testicular cancer)、阴茎癌、白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病、骨髓性白血病(myeloid leukemia)、急性类淋巴细胞白血病(acutelymphoblastoid leukaemia)、或慢性类淋巴细胞白血病(chronic lymphoblastoidleukaemia))、多发性骨髓瘤、扁平细胞癌、睾丸癌、食道癌(esophageal cancer)(例如胃食管交界部腺癌(adenocarcinoma of the gastroesophageal junction))、卡波西氏(Kaposi’s)肉瘤和中枢神经系统(central nervous system,CNS)淋巴瘤、肝细胞癌、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、梅克尔(Merkel)细胞癌和间皮瘤(mesothelioma)。这些癌症的肿瘤已知或预计含有LAG-3表达免疫细胞，例如TIL。
使用抗LAG-3抗体治疗肾细胞癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、鼻咽癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胃癌(stomach cancer，gastric cancer)、食道癌(例如胃食管交界部腺癌)、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、头颈部癌症(例如头颈部鳞状细胞癌)、白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如弥散性大B细胞淋巴瘤、惰性非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤)和多发性骨髓瘤已经在临床试验中进行研究并显示了有前景的结果。因而，使用本发明的特异性结合元件治疗的癌症可以是肾细胞癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、鼻咽癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胃癌(stomach cancer，gastric cancer)、食道癌(例如胃食管的接点的腺癌)、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、头颈部癌症(例如头颈部鳞状细胞癌)、白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如弥散性大B细胞淋巴瘤、惰性非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤)或多发性骨髓瘤。
使用本发明的特异性结合元件以治疗的优选的癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、膀胱癌、头颈部癌症(例如，头颈部鳞状细胞癌)、弥散性大B细胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌和肝细胞癌。已知这些癌症的肿瘤包括LAG-3表达免疫细胞以及在它们的细胞表面表达PD-L1，或包含PD-L1表达免疫细胞。
在应用涉及特定类型的癌症之处，例如，乳腺癌，这是指相关组织的恶性转化，在这种情况下为乳腺组织。源自不同组织例如卵巢组织的恶性转化的癌症，可能在身体的其他位置例如乳腺引起转移性病变，但不因此是本文所指的乳腺癌，而是卵巢癌。
癌症可以为原发的或继发的癌症。因而，本发明的特异性结合元件可以供治疗患者的癌症的方法中使用，其中，所述癌症是原发肿瘤和/或肿瘤转移(tumour metastasis)。
本发明的特异性结合元件被设计用于患者、优选人类患者的治疗的方法中。特异性结合元件通常将以药物组合物的形式施用，所述药物组合物可以包含除了所述特异性结合元件之外的至少一种成分，例如，药学上可接受的赋形剂。例如，除了活性成分之外，本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。这样的材料应当是无毒的，并且不应干扰所述活性成分的效力。所述载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，其可以是注射，例如，静脉内的或皮下的。所述特异性结合元件可以静脉内地或皮下地施用。
液体药物组合物一般包含液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐溶液、葡萄糖或其他糖溶液或甘醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内注射或在患病位点(site of affliction)的注射，所述特异性结合元件或包含所述特异性结合元件的药物组合物优选为无热原的，并具有适合的pH值、等渗性和稳定性的肠外可接受水性溶液的形式。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗的运载体(isotonic vehicles)，例如氯化钠注射液、林格(Ringer’s)注射液、乳酸林格注射液来制备适合的溶液。根据需要可以采用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。制备药物制剂的许多方法是本领域技术人员已知的。参见，例如，Robinson ed.,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1978。
包括根据本发明的特异性结合元件的组合物可以单独或与其他治疗组合同时地、依序地、或作为与其他治疗试剂的组合制剂施用，取决于待治疗的状况。例如，本发明的特异性结合元件可以与现有的用于待治疗的疾病、例如上文所述癌症的治疗试剂组合施用。例如，本发明的特异性结合元件可以与第二抗癌治疗组合施用给患者，例如，化疗、抗肿瘤疫苗接种(anti-tumour vaccination)(也称为癌症免疫接种(cancer vaccination))、放疗、免疫治疗、溶瘤病毒(oncolytic virus)、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞治疗、或激素治疗。
预期的是，本发明的特异性结合元件可以作为抗癌治疗例如化疗、抗肿瘤疫苗接种或放疗中的佐剂。不希望受到理论的限制，与用化疗、抗肿瘤免疫接种或放疗单独实现的相比，被认为作为化疗、抗肿瘤疫苗接种或放疗的部分向患者施用特异性结合元件将触发针对癌症相关抗原LAG-3的更大的免疫应答。例如，抗LAG-3治疗在小鼠中治疗中基于病毒的病理方面已经显示了良好的效果(Blackburn SD,et al.,2009,Nature Immunology 10(1):29-37)。
因而治疗患者的癌症的方法可以包括向所述患者施用治疗有效量的与化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗试剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素治疗的试剂组合的根据本发明的特异性结合元件。所述化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素治疗的试剂优选为用于讨论中的癌症的化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素治疗的试剂，即，已经显示在治疗讨论中的癌症中有效的化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素治疗的试剂。已经显示对讨论中的癌症有效的适合的化学治疗剂、抗肿瘤疫苗、放射性核素、免疫治疗剂、溶瘤病毒、CAR-T细胞或用于激素治疗的试剂的选择完全在有执业医生的能力范围之内。
例如，在该方法包括与化学治疗剂组合向患者施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合元件之处，所述化学治疗剂可以选自以下组成的组：紫杉烷(taxanes)、细胞毒抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、B_RAF酶抑制剂、烷化剂、铂类似物(platinum analogs)、核苷类似物(nucleoside analogs)、沙利度胺衍生物(thalidomide derivatives)、抗肿瘤化学治疗剂及其他。紫杉烷包括多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)和白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)；细胞毒抗生素包括放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、蒽环类(anthracyclines)、多柔比星(doxorubicin)和戊柔比星(valrubicin)；酪氨酸激酶抑制剂包括埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、西替尼(axitinib)、PLX3397、伊马替尼(Imatinib)、可比替尼(cobemitinib)和曲美替尼(trametinib)；PARP抑制剂包括皮拉帕尼(piraparib)；B-Raf酶抑制剂包括威罗菲尼(vemurafenib)和达拉菲尼(dabrafenib)；烷化剂包括达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、替莫唑胺(temozolomide)；铂类似物包括顺羧酸铂(carboplatin)、顺氯氨铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)；核苷类似物包括吉西他滨(gemcitabine)和阿扎胞苷(azacitidine)；抗肿瘤药包括氟达拉滨(fludarabine)。适用于本发明的其他化学治疗剂包括甲氨蝶呤(methotrexate)、黛菲替尼(defactinib)、恩替诺特(entinostat)、培美曲塞(pemetrexed)、卡培他滨(capecitabine)、艾日布林(eribulin)、伊立替康(irinotecan)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和长春碱(vinblastine)。
用于癌症的治疗的疫苗接种策略已经在临床中实现并在科学文献内详细讨论(例如Rosenberg,S.2000Development of Cancer Vaccines)。这主要涉及通过使用那些细胞作为免疫接种方法，使用或不使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)促进免疫系统响应自体或异源癌细胞表达的各种细胞标志物，。GM-CSF激起抗原呈递中的强反应，并且在与所述策略一起采用时特别有用。
施用可以是“治疗有效量”，这足以显示对患者的益处。这样的益处可以至少是至少一种症状的改善。因而特定疾病的“治疗”是指至少一种症状的改善。施用的实际用量、施用的速率和时程将取决于要治疗的疾病的性质和严重度、治疗的具体患者、个体患者的临床状况、失调的原因、组合物的递送位点、特异性结合元件的类型、施用的方法、施用的安排、以及医师已知的其他因素。治疗的处方，例如，剂量的判定等，在全科医师和其他医师的责任能力之内，并且可以取决于治疗的疾病的症状和/或发展的严重度。特异性结合元件的适当的剂量在本领域中是公知的(Ledermann et al.(1991)Int.J.Cancer 47:659-664；和Bagshawe et al.(1991)Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922)。根据施用的特异性结合元件的情况，可以使用本文或医师手册(Physician'sDesk Reference,2003)中指明的具体剂量。特异性结合元件的治疗有效量或适合的剂量可以通过比较它的体外活性和动物模型中的体内活性来确定。将小鼠和其他测试动物中的有效剂量外推至人类的方法是已知的。确切的剂量将取决于许多因素，包括要治疗的区域的大小和位置，以及所述特异性结合元件的确切性质。听从医师的处理，治疗可以每日地、每周两次地、每周或每月间隔地重复。可以在手术之前和/或之后给予治疗，可以在外科治疗的解剖位置直接施用或施加。
包括以下实验例的本公开内容所给出的本发明的进一步的方面和实施方式对于本领域技术人员而言将是明显的。
本说明书中提及的所有文献通过引用以其整体合并在本文中。
本文中使用的“和/或”被视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开内容，正如每一个在本文中单独列出一样。
除非上下文另有指示，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方式，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方式。
现在将通过实施例并参考上文描述的附图来说明本发明的某些方面和实施方式。
实施例
实施例1-Fcab分子的选择和表征
1.1抗人LAG-3Fcab的初始选择和亲和成熟
1.1.1初始选择
展示人IgG1的CH3结构域(IMGT编号1.4-130)的初始噬菌体文库(
Figure GDA0003751856120000261
phagelibraries)使用重组Fc-标签化的人LAG-3(LAG-3Fc)抗原(R&D systems，2319-L3-050)进行选择，所述CH3结构域在AB(残基14-18)和EF(残基92-101)环内随机化。使用蛋白A(LifeTechnologies，10002D)或蛋白G(Life Technologies，10004D)珠子(beads)上捕获的抗原对文库进行三轮选择。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选输出结果，阳性结合者进行亚克隆(sub-cloned)，并使用易选毕赤酵母表达试剂盒(EasySelect Pichia Expression Kit)(Life Technologies，K1740-01)在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中表达为可溶Fcab(含有截短的铰链)。然后在Biacore 3000(GE Healthcare)上筛选Fcab与重组人LAG-3Fc结合。简单地，使用胺偶联(GE Healthcare，BR-1000-50)将LAG-3Fc(R&D systems,2319-L3-050)以7200U的密度偶联在CM5芯片(chip)(GE Healthcare，BR-100012)上。Fcab在HBS-P(GE Healthcare，BR100368)缓冲液中稀释，并以250nM、500nM和1000nM注射3分钟，然后容许在缓冲液中解离5分钟。使用BIAevaluation 3.2软件分析参考减去的数据(LAG-3Fc流动池2-空白流动池)以鉴定结合。然后测试Fcab对HEK细胞表达的人LAG-3的结合(LAG-3克隆到pcDNA5FRT载体[Life Technologies，V6010-20]中[方法参见章节1.4.5])。简单地，在含有10％胎牛血清(FBS)(Life Technologies，10270-1-6)、100μ0/ml潮霉素(Hygromycin)B(Melford Laboratories Ltd,Z2475)、15μg/mL杀稻瘟菌素(Blasticidin)(Melford Laboratories Ltd,B1105)和1μg/1mL脱氧土霉素(Doxycyclin)(Sigma，D9891)的细胞培养基(DMEM)中生长的、过量表达人LAG-3的HEK 293细胞使用细胞解离缓冲液(Life Technologies,13151-014)从组织培养烧瓶上剥离，并且以2×105个细胞/孔(well)接种在V形底96孔平板中。Fcab与细胞在5μM细胞在100μl体积中4℃下孵育1小时。洗涤平板，二抗(抗人Fc-488，Jackson ImmunoResearch，109-546-098)在磷酸盐缓冲液(PBS)中以1:1000稀释，并向细胞中添加100μl，在4℃下孵育30分钟。洗涤平板，并且细胞在含有1μg/mL苯基吲哚(DAPI)(Biotium,40043)的100μl PBS中重悬浮。在DB流式细胞仪[FACSCanto]II细胞计(BD Biosciences)上读取该平板，使用FlowJoX分析数据。然后Fcab通过使用脂质体(lipofectamine)(Life Technologies，11668-019)转染到Flp-In T-Rex 293细胞(LifeTechnologies，R780-07)中，在哺乳动物细胞中表达。测试LAG-3结合Fcab对A375细胞(美国型培养菌种集[ATCC]，CRL-1619)上人II类MHC与重组LAG-3Fc(使用实施例1.6中的方法)的结合的抑制。从三轮噬菌体选择中鉴定出54个独特的Fcab序列，通过BIAcore分析确定这些Fcab中的12个结合LAG-3Fc，和/或结合表达LAG-3的细胞。所选Fcab中的三个还能够抑制LAG-3与II类MHC的相互作用，选择用于亲和成熟。这三个Fcab称为FS18-3、FS18-7和FS18-21。
1.1.2亲和成熟
首次亲和成熟
通过对使用上述的初始选择过程鉴定的三个Fcab的每一个的AB环中的五个残基(残基14-18)，以及EF环中的五个(残基92-94和97-98)或八个(残基92-94和97-101)残基进行随机化构建六个噬菌体展示亲和成熟文库。
使用重组人LAG-3Fc(R&D systems,2319-L3-050)和表达人LAG-3的HEK细胞(如上所述)选择所述亲和成熟文库。通过噬菌体ELISA筛选输出，阳性结合者进行亚克隆，在HEKExpi293细胞中表达为可溶Fcab(含有截短的铰链)(Fcab克隆到蛋白质截短试验5[pTT5]载体[National Research Council of Canada]中，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒[Life Technologies，A14524]转染到Expi293F细胞[Life technologies，A14527]中)。然后筛选HEK表达的可溶Fcab以结合细胞表达的人LAG-3、结合细胞表达的食蟹猴LAG-3(实施例1.4.3的方法)，以及阻断II类MHC结合重组LAG-3Fc的能力(实施例1.6中的方法)。进一步测试阻断性Fcab以确定它们是否能够在T细胞活化分析中逆转LAG-3诱导的IL-2分泌抑制(实施例2.1中的方法)。使用这些筛选方法从六个亲和成熟文库中鉴定出61个独特的抗LAG-3Fcab。来自FS18-7系的亲和成熟的Fcab显示了具有与食蟹猴LAG-3的最高水平的交叉反应性。选择具有与食蟹猴FAG-3Fc的最强结合以及T细胞活性试验中活性最高的Fcab的来自该谱系的三个Fcab(称为FS18-7-7、FS18-7-9和FS18-7-11)进一步地亲和力成熟。这三个Fcab还显示为阻断LAG-3Fc与表达II类MHC的细胞的相互作用。
第二次亲和成熟
来自第一次亲和成熟的三个Fcab(FS18-7-7、FS18-7-9和FS18-7-11)的库(pool)用于创建进一步地亲和成熟文库。CD环很难使用来自ELLA Biotech的随机化引物随机化。CD环中的部分氨基酸位置(残基45.1-78)使用除半胱氨酸之外的、氨基酸的等摩尔分布随机化。还在整个CH3结构域序列上进行易错PCR以引入可能增强结合的其他突变。
在噬菌体中产生亲和成熟文库，并执行针对生物素化重组LAG-3avi-Fc(BPSBioscience，71147)和HEK hLAG-3的选择，以及通过噬菌体ELISA筛选以结合重组LAG-3Fc(R&D systems,2319-L3-050)。86个独特的Fcab(含有截短的铰链)在HEK293F细胞中表达。还如上所述筛选选定的Fcab在T细胞活化试验中的活性。在第二次亲和成熟期间，在T细胞活化分析中鉴定的具有最高活性的九个Fcab(FS18-7-32；FS18-7-33；FS18-7-36；FS18-7-58；FS18-7-62；FS18-7-65；FS18-7-78；FS18-7-88和FS18-7-95)以及亲本Fcab克隆FS18-7-9然后进一步如下表征。这九个Fcab与亲本Fcab克隆FS18-7-9的序列比对在附图1A中显示。附图1B详述了九个Fcab克隆的每一个与亲本Fcab克隆FS18-7-9的序列同一性百分比。源自另两个亲本Fcab克隆FS18-7-7和FS18-7-11的亲和成熟的Fcab不是像来自FS18-7-9的亲和成熟的Fcab那么有前景的候选物，因此没有进一步继续。
1.2特异于小鼠LAG-3的替代Fcab的选择
使用上述的初始选择方案选出的Fcab FS18-7用于产生噬菌体文库以针对小鼠LAG-3进行选择。执行两轮亲和成熟，并且显示了高亲和力、特异性结合小鼠LAG-3的Fcab克隆FS18-7-108-29和FS18-7-108-35在亲和成熟后被选出。确认了FS18-7-108-29和FS18-7-108-35在T细胞活化试验中抑制小鼠LAG-3的能力。使用八位组(Octet)(Forteo Bio)的表位绘图显示抗小鼠LAG-3Fcab与抗人LAG-3Fcab(在如上述第二次亲和成熟后选出的)竞争结合人LAG-3。抗人LAG-3和抗小鼠LAG-3Fcab之间存在4到8个残基的差异。因而预期的是，抗小鼠LAG-3Fcab代表了抗人LAG-3Fcab在小鼠中的结合与功能的适合的替代物。
1.3模拟mAb2的构建和表达
制备包含上文1.1和1.2中鉴定的前导抗人LAG-3和抗小鼠LAG-3Fcab的“模拟”mAb2，以容许mAb2形式中的这些Fcab的表征。从抗LAG-3Fcab和抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体4420(详情参见SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：85)(Bedzyk，W.D.，etal.1989and Bedzyk，W.D.，et al.1990)制备这些模拟mAb2。在重链的CH2结构域中具有(SEQ ID NO：63、65、67、69、71、73、75、77、79和81)和不具有(SEQ ID NO：64、66、68、70、72、74、76、78、80和82)LALA突变下制备模拟mAb2(详见下文章节1.5)，并且该模拟mAb2还包括抗FITC mAb 4420(SEQ ID NO：85)的轻链。通过HEK293-6E细胞中的瞬时表达产生模拟mAb2，使用mAb Select SuRe蛋白A柱纯化。
1.4Fcab对LAG-3的结合亲和力
1.4.1通过表面等离子共振(SPR)测定的Fcab对人LAG-3的亲和力
使用BIAcore T200(GE Healthcare)测量模拟mAb2形式中的抗人LAG-3Fcab对人LAG-3的亲和力。CM5传感器芯片(GE Healthcare，BR1005-30)的流动池4上固定人LAG-3-Fc(R&D Systems，2319-L3-050)，并且使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare，BR-1000-50)将流动池3用缓冲液固定用于参考。LAG-3-Fc在pH为5的乙酸钠(ForteoBio,18-1069)中稀释到5μg/ml，以10μl/分钟的流动速度注射12秒，随后通过注射乙醇胺420秒将表面钝化。固定水平是158RU。模拟mAb2(或对照抗人LAG-3mAb，25F7)在HBS-P缓冲液(GE Healthcare，BR-1003-68)中以自4μg/ml起的2倍稀释度系列进行稀释。对照mAb/模拟mAb2以30μl/分钟以240秒的缔合时间、30μl/分钟的300秒解离时间注射。使用25mM NaOH对表面以100μl/分钟再生30秒。数据减去双重参考并使用BIAevaluation 3.2软件分析以计算动力学常数。模拟mAb2形式中的Fcab具有0.8-1.1nM范围内的人LAG-3的亲和力(表1)，其类似于基准抗人LAG-3mAb25F7的亲和力。这是令人惊讶的，因为Fcab具有比单克隆抗体更小的结合界面，由于Fcab的结合位点形成相对紧致的抗体片段，其中两个结合位点紧密接近。相比之下，典型的mAb的Fab臂被柔性的铰链区分隔。基于这种更小的结合界面和Fc区中两个结合位点的相关降低的柔性，出乎意料的是，抗LAG-3Fcab能够以与基准抗体25F7类似的亲和力和效价结合并抑制LAG-3。
表1：模拟mAb2形式的LAG-3特异性Fcab对人LAG-3的结合亲和力
Figure GDA0003751856120000311
1.4.2SPR测定的特异于小鼠LAG-3的替代Fcab对小鼠LAG-3的结合亲和力
使用Biacore 3000(GE Healthcare)测量特异于小鼠LAG-3的替代Fcab对小鼠LAG-3的亲和力。使用胺偶联(胺偶联试剂盒，GE Healthcare，BR-1000-50)将在10mM pH为5.0的乙酸钠(ForteBio，18-1069)中稀释的mLAG-3Fc(R&D Systems,3328-L3-050)直接包被在CM5芯片(GE Healthcare，BR-1000-12)上。用小鼠Fc(SinoBiological，51094-MNAH)包被流动池1，以及mLAG-3Fc以950RU包被流动池2。Fcab在HBS-P缓冲液(GE Healthcare，BR-1003-68)中稀释，并且以不同浓度(自100nM起的四倍稀释度)以20μl/分钟注射3分钟，然后容许该Fcab在缓冲液中解离12分钟。通过以30μ0。分钟注射10mM pH为2.5的甘氨酸30秒来再生芯片。数据减去双重参考，使用BIAevaluation 3.2软件分析以计算动力学常数。以单位数纳摩尔亲和力结合小鼠LAG-3的被测替代Fcab在表2中列出。
表2：替代LAG-3特异性Fcab对小鼠LAG-3的结合亲和力(KD)
特异于小鼠LAG-3的替代Fcab 亲和力K<sub>D</sub>(nM)
FS18-7-108-29 1.5
FS18-7-108-35 2.1
1.4.3通过流式细胞术测定的Fcab对细胞上表达的人LAG-3的结合亲和力
产生过量表达LAG-3的细胞系
使用伦蒂-X慢病毒包装系统(Lenti-X HTX Packaging System)(Clontech,Cat.No 631249)，使用慢病毒转导方法产生过量表达人、食蟹猴或小鼠LAG-3的DO11.10细胞(National Jewish Health)。含有小鼠LAG-3cDNA(SEQ ID NO：96)、人LAG-3cDNA(SEQ IDNO：95)或食蟹猴LAG-3cDNA(SEQ ID NO：97)的伦蒂-X表达载体(pLVX)(Clontech，Cat.No631253)使用伦蒂-X慢病毒包装组合共转染到Lenti-X 293T细胞系(Clontech，Cat.No632180)中来产生病毒。用伦蒂-X慢病毒包装系统产生的慢病毒载体转导DO11.10细胞系。
模拟mAb2形式中的抗人LAG-3Fcab对表达人LAG-3的细胞(用人LAG-3转染的DO11.10细胞系)的亲和力使用流式细胞术进行测量。mAb2和对照mAb稀释物(2×终浓度)在1×杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)(Gibco，14190-094)中一式三份制备。在PBS+2％牛血清蛋白(BSA)(Sigma，A7906)中制备DO11.10:LAG-3细胞悬浮液，以4×106个细胞/ml的50μl/孔接种到V形底96孔平板(Costar，3897)中。将50μl的mAb2或对照mAb(抗人LAG-3mAb，25F7)稀释物添加到含有细胞的反应孔中(最终体积100μl)，并在4℃孵育1小时。洗涤平板，然后添加100μl/孔的在PBS+2％BSA中1:1000稀释的二抗(抗人Fc-488抗体，JacksonImmunoResearch，109-546-098)，并在暗处在4℃下孵育30分钟。洗涤平板，并在含有1mg/ml的DAPI(Biotium，40043)的PBS中重悬浮。使用坎托II(Canto II)流式细胞计(BDBiosciences)读取平板。排除死细胞，测量FITC通道(488nm/530/30)中的荧光。在绘制医学图表(GraphPad Prism)软件中使用log(激动剂)vs response拟合数据。所有测试的模拟mAb2形式的Fcab和基准抗人LAG-3mAb,25F7以类似的亲和力(EC50)结合人LAG-3，在1.2-2.1nM的范围内，如表3所示。
表3：流式细胞术测定的、模拟mAb2形式的抗人LAG-3Fcab对表达人LAG-3的DO11.10细胞的结合亲和力
Figure GDA0003751856120000331
1.4.4通过流式细胞术测定的Fcab对细胞上表达的食蟹猴LAG-3的结合亲和力
使用流式细胞术测量模拟mAb2形式的抗人LAG-3Fcab对表达食蟹猴LAG-3的细胞(用食蟹猴LAG-3转染的DO11.10细胞系)的亲和力。mAb2和对照mAb稀释物(2×终浓度)在1×DPBS(Gibco，14190-094)中一式三份制备。在PBS+2％BSA(Sigma,A7906)中制备DO11.10:LAG-3细胞悬浮液，以4×106个细胞/ml的50μl/孔接种到V形底96孔平板(Costar,3897)中。50μl的mAb2或对照mAb(抗人LAG-3mAb，25F7)稀释物添加到含有细胞的反应孔中(最终体积100μl)，在4℃孵育1小时。洗涤平板，然后添加100μl/孔的在PBS+2％BSA中1:1000稀释的二抗(抗人Fc-488抗体，Jackson ImmunoResearch，109-546-098)，在暗处在4℃下孵育30分钟。洗涤平板，并在含有1mg/ml的DAPI(Biotium,40043)的PBS中重悬浮。使用Canto II流式细胞计(BD Biosciences)读取平板。排除死细胞，并测量FITC通道(488nm/530/30)中的荧光。在GraphPad Prism软件中使用log(激动剂)vs response拟合数据。模拟mAb2形式的测试的Fcab以0.5-0.6nM的亲和力结合食蟹猴LAG-3表明，在食蟹猴中的毒物学研究预计对人类中所见的效果是预示性的(参见表4)。基准抗人LAG-3mAb,25F7，以15倍的更弱的亲和力(EC50)结合食蟹猴LAG-3(表4)。
表4：通过流式细胞术，抗LAG-3Fcab对表达食蟹猴LAG-3的DO11.10细胞的结合亲和力
Figure GDA0003751856120000341
1.4.5通过流式细胞术测定的，替代抗小鼠LAG-3Fcab和抗人LAG-3Fcab对细胞上表达的小鼠LAG-3的结合亲和力
产生过量表达mLAG-3的HEK细胞
使用核酸内切酶(KpnI)(纽英伦[NEB]，R0142)和NotI(NEB，R0146)限制性酶切，将小鼠LAG-3序列(SEQ ID NO：96)亚克隆到pcDNA5FRT载体(Life Technologies，V6010-20)中。然后使用脂质体(Lipofectamine)2000(Life Technologies，11668-019)将载体转化到四环素诱导性启动子(Flp-In T-REx)293HEK细胞系(Life Technologies，R780-07)中。转化的Flp-In T-REx 293细胞在含有10％FBS(，10270-1-6)、100μg/mL潮霉素B(MelfordLaboratories Ltd,Z2475)、15μg/ml杀稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd,B1105)的DMEM(Life Technologies,61965-026)中生长3-4周，直到显现稳定转化的细胞的集落。这些集落在存在1μg/ml的细胞脱氧土霉素(Sigma,D9891)的情况下扩增，使用PE结合的抗小鼠LAG-3(克隆C9B7W，BD Biosciences，552380)测试小鼠LAG-3表达。
使用流式细胞术测量替代抗小鼠LAG-3Fcab(含有截短的铰链)对细胞表达的小鼠LAG-3的亲和力。在含有10％FBS(Life Technologies,10270-1-6)、100μg/ml潮霉素B(Melford Laboratories Ltd,Z2475)、15μg/ml杀稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd,B1105)和1μg/ml盐酸强力霉素(Sigma,D9891)的DMEM中生长的、表达mLAG-3的HEK细胞使用细胞解离缓冲液(Life Technologies,13151-014)从组织培养烧瓶上剥离，以2×105个细胞/孔接种在V形底96孔平板(Costar,3897)中。平板在4℃下在1500rpm离心3分钟来沉淀细胞。Fcab(或对照mAb)的稀释系列与细胞在100μl体积中在4℃下孵育1小时。洗涤平板，且二抗(用于Fcab的抗人Fc-488，Jackson ImmunoResearch，109-546-098，或用于C9B7W的抗大鼠IgG(H+L)、荧光基团488(Alexa Fluor 488)结合物，ThermoFisher，A-11006)在PBS中1:1000稀释，并将100μl在4℃下向细胞中添加30分钟(平板保持在暗处)。随后洗涤平板，且细胞重悬浮在含有1μg/ml DAPI(Biotium，40043)的100μl PBS中。使用Canto II流式细胞计(BD Biosciences)读取平板。排除死细胞，测量FITC通道(488nm/530/30)中的荧光。在GraphPad Prism软件中使用log(激动剂)vs response拟合数据。所测试的Fcab以相似的亲和力结合小鼠LAG-3(参见表5)。基准LAG-3mAb C9B7W(2B Scientific，BE0174-50MG)以比Fcab弱17倍的亲和力(EC50)结合小鼠LAG-3(表5)。
表5：通过流式细胞术，替代抗小鼠LAG-3Fcab对表达小鼠LAG-3的HEK细胞的结合亲和力
Figure GDA0003751856120000351
使用流式细胞术测量模拟mAb2形式的抗人LAG-3Fcab FS18-7-9对细胞表达的小鼠LAG-3的亲和力。在含有10％FBS(Life Technologies，10270-1-6)、100μg/ml潮霉素B(Melford Laboratories Ltd,Z2475)、15μg/ml杀稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd,B1105)和1μg/ml脱氧土霉素(Sigma,D9891)的DMEM中生长的、表达mLAG-3的HEK细胞使用细胞解离缓冲液(Life Technologies，13151-014)从组织培养烧瓶上剥离。通过在4℃下1500rpm离心3分钟沉淀细胞来采集细胞，重悬浮在1×DPBS中，然后以1.2×105个细胞/孔的30μ0接种到V形底96孔平板(Costar,3897)中。添加1:1体积的mAb2(或对照mAb)稀释物系列，与细胞在4℃下孵育1小时。洗涤平板，二抗(抗人Fc-488，Jackson ImmunoResearch，109-546-098)在PBS中1:1000稀释，并将60μl在4℃下向细胞中添加30分钟(平板保持在暗处)。随后洗涤平板，细胞重悬浮在含有1μg/ml DAPI(Biotium，40043)的60μl PBS中。使用Canto II流式细胞计(BD Biosciences)读取平板。排除死细胞，测量FITC通道(488nm/530/30)中的荧光。在GraphPad Prism软件中使用log(激动剂)vs response拟合数据。
与替代抗小鼠LAG-3Fcab FS18-7-9-108的2.6nM的EC50相比，模拟mAb2形式的抗人LAG-3Fcab FS18-7-9以19nM的EC50结合小鼠LAG-3(表6)。人mAb,25F7不显示任何可检测的对小鼠LAG-3的结合，表明了人LAG-3Fcab、FS18-7-9具有与25F7不同的LAG-3上的结合表位。
表6：通过流式细胞术，人抗LAG-3Fcab FS18-7-9对表达小鼠LAG-3的HEK细胞的结合亲和力
Figure GDA0003751856120000361
1.5Fcab对Fc受体的结合亲和力
已知在人IgG1的CH2结构域中的LALA突变的导入减少Fc低受体结合(Bruhns，P.,et al.(2009)and Xu,D.et al.(2000))。使用BIAcore确认LALA突变降低了Fcab(模拟mAb2形式)对Fcγ受体的结合亲和力。使用模拟mAb2形式的Fcab在Biacore T200仪(GEHealthcare)上执行人FcγR结合试验。(R&D Systems,1257-FC,1330-CD,1875-CD,4325-FC)使用胺偶联(胺偶联试剂盒，GE Healthcare，BR-1000-50)将人FcγRs固定在S系列CM5芯片(GE Healthcare,BR-1005-30)上至表面密度为Fc为RI 370RU，FcγRIII(高亲和力人FcγR)264RU，Fc4 RU和Fc4 RU(低亲和力人Fc亲和)500RU。对于每个固定的几篇，流动池保持空白用于背景扣除。使用浓度为5μg/ml的pH为5的乙酸钠(ForteBio,18-1069)固定Fc度0度1，并且在15秒周期中以10μ0期分钟的流动速度注射，直到达到需要的固定水平。
对于高亲和力的Fc高亲和和Fc高亲和力的，200和力的，直的mAb或模拟mAb2以30和力分钟的流动速度流经芯片3分钟，随后解离5分钟。运行缓冲液(running buffer)是HBS-P(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％v/v表面活性剂P20，GE Healthcare，BR-1003-68)对于低亲和力的Fc于低亲和力和Fc于低亲和力，模拟mAb2的浓度提高到500高g/ml。
阳性对照是野生型IgG1同种型mAb，其与对照LALA IgG1 mAb和对不相关靶点的单克隆IgG2和IgG4同种型mAbs比较。通过以100μ00分钟的流动速度注射10mM氢氧化钠(VWR，28244.262)30分钟来再生流动池。通过双重参考空白流动池(没有固定的Fc来再)并减去来自测试mAb2的缓冲循环，使用BiaEvaluation软件版本3.2RC1进行数据分析。结果在表7中显示。
表7：通过SPR，模拟mAb2形式的抗人LAG-3Fcab(如上文详述的包含LALA突变)与人Fcγ受体的结合反应
Figure GDA0003751856120000371
与没有LALA突变的对照抗体(模拟mAb IgG)相比，测试的所有模拟mAb2(都包含上文阐述的LALA突变)显示了对测试的Fcγ受体显著降低的结合，表明LALA突变降低了这些模拟mAb2的Fcb受体结合，因而预计降低mAb2的ADCC活性。
1.6阻断II类MHC与LAG-3的结合
通过测量LAG-3Fc与表达人II类MHC的黑素瘤细胞系的A375细胞的结合研究了Fcab(含有截短的铰链；SEQ ID NO：58)阻断重组人或小鼠LAG-3Fc与人II类MHC之间的相互作用的能力。使用细胞解离缓冲液(Life Technologies，13151-014)将在含有10％FBS(Life Technologies,10270-106)的DMEM(Life Technologies，61965-026)中生长的A375(ATCC,CRL-1619)细胞从细胞培养烧瓶上剥离，并以2×105个细胞/孔接种到V形底96孔平板(Costar,3897)中。平板在4℃下在1500rpm离心3分钟来沉淀细胞。相关浓度的Fcab或对照mAb在含有10％FBS的100μl DMEM中与1μg/ml的LAG-3Fc(人LAG-3-Fc R&D Systems，2319-L3-050或小鼠LAG-3Fc R&D Systems，3328-L3-050)在4℃下孵育1小时。LAG-3/Fcab混合物添加到A375细胞，并在4℃下孵育1小时。洗涤细胞。二抗(Alexa Fluor 488结合的山羊抗人Fc F(ab')2，Jackson Immunoresearch，109-546-098或山羊抗小鼠IgG(H+L)488结合物，Life Technologies，A-1101)以1:1000在PBS稀释，并将100μl在4℃下向细胞中添加30分钟(平板保持在暗处)。在PBS中洗涤细胞一次，重悬浮在100μl PBS+1μ0/ml DAPI(Biotium,40043)中。平板在DB FACSCanto II细胞计(BD Biosciences)上读取，使用FlowJo软件分析数据。
两种抗小鼠LAG-3Fcab都能抑制人II类MHC与小鼠LAG-3的相互作用，而对照抗小鼠LAG-3mAb(C9B7W,2B Scientific,BE0174-50MG)不能(参见表8)。
表8：替代抗小鼠LAG-3Fcab抑制小鼠LAG-3与II类MHC的结合
Figure GDA0003751856120000381
测试的抗人LAG-3Fcab也能以与对照抗人LAG-3mAb(25F7)相似的效价抑制人II类MHC与人LAG-3的相互作用。
表9：抗人LAG-3Fcab抑制人LAG-3与II类MHC的结合
Figure GDA0003751856120000382
实施例2-DO11.10 T细胞活化分析中Fcab分子的活性
2.1人LAG-3DO11.10T细胞活化分析中前导Fcab的活性
在基于DO11.10的T细胞活化分析中测试含有LALA突变的前导Fcab(具有截短的铰链；SEQ ID NO：58)的面板。
细胞培养基和肽：
·DO11.10细胞培养基：DMEM(Gibco，61965-026)10％FBS(Gibco，10270-106)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)，1μg/ml嘌呤霉素(Gibco，A11138-03)
·实验培养基：没有嘌呤霉素的完全DO11.10培养基
·A20细胞培养基：RPMI(Gibco，61870-010)10％FBS(Gibco，10270-106)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)
·OVA肽(MW＝1773.9Da)：H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH(Pepscan)
细胞：
·DO11.10 hLAG-3：用慢病毒载体转导以过量表达人LAG-3(如上述)的DO11.10 T细胞
·A20：表达II类MHC的BALB/c B细胞淋巴瘤(ATCC，TIB-208)
在200-2实验培养基中制备Fcab或基准mAb的稀释物。Fcab与4×105个/ml的DO11.10 LAG-3细胞在实验培养基中1:1(170μl+170μl)混合，并在37℃、5％CO2下温育1小时。2×105个A20细胞/ml实验培养基与1μM OVA肽温育30分钟。360μl的A20细胞+OVA混合物添加到360μl的DO11.10 LAG-3细胞/Fcab混合物中。然后将细胞在深孔平板中混合，并以200μl混合物/孔在96-圆底平板中培养。一式三份地进行分析。细胞在37℃、5％CO2下温育24小时。采集上清液，并根据厂家的说明书用小鼠IL-2ELISA试剂盒(eBioscience，88-7024-88或R&D systems，SM2000)进行分析。使用带有BioTek Gen5软件的平板读取器在450nm下读取平板。从450nm的光吸收值中减去570nm的光吸收值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数逻辑曲线拟合(BioTek Gen5软件)。在GraphPad Prism中，将鼠白介素-2(mouse interleukin-2,mIL-2)的浓度相对于Fcab或基准mAb的log浓度作图，并使用log(agonist)vs response方程将产生的曲线拟合。结果在表10中显示。
表10：DO11.10 T细胞活化分析中抗人LAG-3Fcab的EC50值
Figure GDA0003751856120000401
人前导Fcab在T细胞活化分析中显示了显著的活性，效价在1-2nM的范围内。与基准抗人LAG-3mAb 25F7相比，这些Fcab具有稍微改进的效价。T细胞活化分析中改进的效价预计通过LAG-3的增强的抑制而对人类患者中改进的效力是具有预测性的。
2.2替代抗小鼠LAG-3Fcab在小鼠LAG-3DO11.10 T细胞活化分析中的活性
在基于DO11.10的T细胞活化分析中测试含有LALA突变的替代抗小鼠LAG-3Fcab(具有截短的铰链；SEQ ID NO：58)。
细胞培养基和肽：
·DO11.10细胞培养基：DMEM(Gibco，61965-026)10％FBS(Gibco，10270-106)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)，1μg/ml嘌呤霉素(Gibco，A11138-03)
·实验培养基：没有嘌呤霉素的完全DO11.10培养基
·A20细胞培养基：RPMI(Gibco，61870-010)10％FBS(Gibco，10270-106)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)
·OVA肽(MW＝1773.9Da):H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH(Pepscan)
细胞：
·DO11.10 mLAG-3:用慢病毒载体转导以过量表达小鼠LAG-3(如上述)的DO11.10T细胞
·A20：表达II类MHC的BALB/c B细胞淋巴瘤(ATCC，TIB-208)
在200μl实验培养基中制备Fcab或基准mAb的稀释物。Fcab与4×105个/ml的DO11.10 LAG-3细胞在实验培养基中1:1(170μl+170μl)混合，在37℃、5％CO2下温育1小时。2×105个A20细胞/ml实验培养基与1μM OVA肽温育30分钟。360μl的A20细胞+OVA混合物添加到360μl的DO11.10 LAG-3细胞/Fcab混合物中。然后将细胞在深孔平板中混合，以200μl混合物/孔在96-圆底平板中培养。一式三份地对筛选进行分析。细胞在37℃、5％CO2下温育24小时。采集上清液，根据厂家的说明书用小鼠IL-2ELISA试剂盒(eBioscience，88-7024-88或R&D systems，SM2000)进行分析。使用带有BioTek Gen5软件的平板读取器在450nm下读取平板。从450nm的光吸收值中减去570nm的光吸收值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数逻辑曲线拟合(BioTek Gen5软件)。在GraphPad Prism中，将mIL-2的浓度相对于Fcab或基准mAb的log浓度作图，并使用log(agonist)vs response方程将产生的曲线拟合。结果在表11和附图2中显示。
表11：DO11.10 T细胞活化分析中替代抗LAG-3Fcab的EC50值和最大IL-2释放
Figure GDA0003751856120000411
小鼠替代抗小鼠LAG-3Fcab在T细胞活化分析中显示了显著的活性，效价在2nM的范围内。根据改进的EC50和高4倍的IL-2释放的最大活化明显的是，替代抗小鼠LAG-3Fcab具有比基准抗小鼠LAG-3抗体更高的效价。这些Fcab的改进的效价和最大活化预计通过LAG-3的改进的抑制，在鼠效力研究中产生相比基准的改进的活性。
2.3模拟mAb2形式的FS18-7-9在食蟹猴LAG-3DO11.10 T细胞活化分析中的活性
在基于食蟹猴LAG-3DO11.10的T细胞活化分析中，以包含上文描述的LALA突变的模拟mAb2形式，对前导Fcab之一的FS18-7-9进行测试。
细胞培养基和肽：
·DO11.10细胞培养基：DMEM(Gibco，61965-026)10％FBS(Gibco，10270-106)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)，1μg/ml嘌呤霉素(Gibco，A11138-03)
·实验培养基：没有嘌呤霉素的完全DO11.10培养基
·A20细胞培养基：DMEM(Gibco，61965-026)10％FBS(Gibco，10270-106)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)，1μg/ml嘌呤霉素(Gibco，A11138-03)
·OVA肽(MW＝1773.9Da)：H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH(Pepscan)
细胞：
·DO11.10 cynoLAG-3：用慢病毒载体转导以过量表达食蟹猴LAG-3(如上述)的DO11.10 T细胞
·LK 35.2PLVX：用空的慢病毒(pLVX)载体转导的B细胞杂交瘤；
在实验培养基中制备模拟mAb2形式的FS18-7-9Fcab(FS18-7-9/4420LALA)或基准mAb的稀释物。DO11.10细胞(0.3×106个细胞/ml)以1:1的比例与3×终浓度的抗体混合。抗体和细胞在37℃、5％CO2下温育1小时。LK 35.2细胞在3×105个细胞/ml实验培养基中与1.5μM的OVA肽温育30分钟。70μl的LK 35.2细胞+OVA添加到140μl的DO11.10/抗体中。细胞在37℃、5％CO2下温育24小时。采集上清液，并根据厂家的说明书用小鼠IL-2ELISA试剂盒(eBioscience，88-7024-88或R&D systems，SM2000)进行分析。使用带有BioTek Gen5软件的平板读取器在450nm下读取平板。从450nm的光吸收值中减去570nm的光吸收值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数逻辑曲线拟合(BioTek Gen5软件)。在GraphPad Prism中，将mIL-2的浓度相对于模拟mAb2形式的Fcab或基准mAb的log浓度作图，并使用log(agonist)vs response方程将产生的曲线拟合。结果在表12和附图3中显示。
表12：食蟹猴DO11.10 T细胞活化分析中抗LAG-3Fcab的EC50值和最大IL-2释放
Figure GDA0003751856120000431
模拟mAb2形式的FS18-7-9Fcab在T细胞活化分析中显示了显著的活性，效价为5.6nM。具体地，根据改进的EC50和更高的IL-2释放的最大活化明显的是，模拟mAb2形式的FS18-7-9Fcab比基准抗人LAG-3抗体具有对食蟹猴LAG-3的更高的效价。与基准相比，如使用T细胞活化分析所测定的，模拟mAb2形式的Fcab对人和食蟹猴LAG-3的EC50和最大活化是更为相似的(在T细胞活化分析中，基准对食蟹猴LAG-3具有比Fcab更低的EC50，但对人LAG-3具有相似的EC50)。因而预期的是，使用例如模拟mAb2形式的Fcab的食蟹猴的研究结果，对于人类患者的应答将是更有预测性的。例如，如果更高的效价引起更高的毒性，则预期在食蟹猴模型中进行测试时会看到这一点，而在食蟹猴中具有比在人类中更低的效价的分子将不会在人类患者中进行实验之前看到这一点。
实施例3-mAb2形式的Fcab的体内抗肿瘤效力
3.1用于小鼠体内测试的mAb2的制备
制备包含替代抗小鼠LAG-3Fcab FS18-7-108-29的mAb2分子。该mAb2分子包含特异于鼠CD73(TY11.8)、鼠TIM-3(RMT3-23)、鼠CSF-1R(AFS98)或鼠CLTA-4(9D9)的Fab区，使用MC38同基因小鼠肿瘤生长模型测试该mAb2分子的体内抗肿瘤活性。Fab序列的来源如下：
大鼠抗小鼠TIM-3抗体
克隆名称-RMT3-23
参考文献-Nakayama,M et.al,2009
小鼠抗小鼠CTLA-4抗体
克隆名称-9D9
参考文献-专利申请US 2011/0044953 A1
大鼠抗小鼠CSF-1R抗体
克隆名称-AFS98
参考文献-Sudo T,et al 1995
大鼠抗小鼠CD73抗体
克隆名称-TY11.8
参考文献-Yamashita,Y.et al 1998
为了产生用于体内实验的对照抗体，将来自上述各来源的可变重链区连接到人IgG1(G1m17)恒定区，将来自上述各来源的可变轻链区经由人kappa J-区1(除9D9中使用小鼠kappa J-区1之外)连接到人恒定区(Km1)。通过用FS18-7-108-29取代上文描述的重整构建体的CH3结构域，产生用于体内研究的mAb2。
3.2MC38同基因肿瘤模型中mAb2的活性
这项实验中使用MC38同基因肿瘤模型，因为已知MC38肿瘤是高度免疫原性的，引起肿瘤环境和肿瘤外周部中免疫细胞上提高的LAG-3表达。
年龄8-10周、每个重量20-25g的C57BL/6雌性小鼠(Charles River)在研究开始之前休息一周。所有动物进行微芯片化并给予唯一的标识符。每组10只小鼠。首先扩增、保存MC38结肠癌细胞系(S.Rosenberg，NIH)，然后通过IDEXX Bioresearch使用IMPACT I方案对MC38结肠癌细胞系进行病原体预筛选，并显示其是不含病原体的。
从-150℃存储中解冻MC38细胞并添加到T175组织培养烧瓶中具有10％FCS(Gibco，10270-106)的20ml DMEM(Gibco，61965-026)中。每只动物接受左肋皮下注射的2×106个细胞。肿瘤细胞接种后的7-8天，将此时没有肿瘤的小鼠从研究中去除。在注射之前24小时之内，通过SEC-HPLC分布分析所有mAb2分子和对照抗体，并检查混杂物。
mAb2分子和对照抗体以PBS中10mg/kg的终浓度注射到小鼠中。在肿瘤接种后的第8、11和14天，各小鼠通过腹膜内(IP)注射接受mAb2或对照抗体混合物。对肿瘤进行精确测量，在所讨论的当天进行任何药物给药，并对小鼠进行密切观察以用于试验的剩余部分。使用卡尺进行肿瘤体积测量，以便确定肿瘤的最长轴和最短轴。使用以下公式计算肿瘤体积：
L×(S2)/2
其中L＝最长轴；S＝最短轴
在第25天当肿瘤负荷被认为接近限制时停止试验。
如附图4所示，与用IgG对照处理的小鼠相比，所有测试的mAb2分子显示了显著的肿瘤生长抑制。研究显示，在具有完整功能的免疫系统的小鼠中，LAG-3的抑制与TIM-3、CSF-1R、CTLA-4或CD73的抑制相结合导致了肿瘤生长的降低，推测是通过增加的免疫系统的活性。同基因小鼠模型被接受作为用于测试抑制治疗靶点的抗肿瘤效果的合适的鼠系统，已经广泛用于验证人类治疗剂的开发。已经显示，CTLA-4抑制引起淋巴结中增加的T细胞引发。一旦被引发，T细胞迁移到肿瘤微环境，在此PD-1/PD-L1轴线的阻断增强了被引发的T细胞的活化，引起抗CTLA-4和抗PD-1/PD-L1结合的协同抗肿瘤效果。这反映在临床中PD-1和CTLA-4结合的增加的效力上。据推测，LAG-3/CTLA-4mAb2在同基因MC38肿瘤模型中引起的强烈肿瘤抑制是通过类似的协同作用；CTLA-4的抑制增加T细胞引发，LAG-3的抑制增加肿瘤部位的T细胞活化。LAG-3和TIM-3的双重抑制的更温和的效果可归因于LAG-3和TIM-3以类似的作用方式抑制衰竭的T细胞。这些是PD-1在T细胞上后表达的二级信号。在PD-1抑制仍然保持时，抑制TIM-3和LAG-3仅能实现轻微的结果。
巨噬细胞在维持免疫抑制性肿瘤环境中是关键的。由于对巨噬细胞分化的抑制和存活信号的消除，CSF-1R的靶向引起肿瘤相关的巨噬细胞的降低。据推测，LAG-3/CSF-1RmAb2在同基因MC38肿瘤模型中引起的强烈肿瘤抑制是通过由肿瘤环境中巨噬细胞诱导的免疫抑制的释放所引起的协同作用，其允许LAG-3抗体增加肿瘤部位的T细胞活化。CSF-1R和检查点抑制剂的结合已经在临床中进行了评估，这将有助于了解CSF-1R与LAG-3抑制相结合的可行性。CD73的阻断也引起巨噬细胞的抑制，然而CD73/LAG-3mAb2的中度肿瘤抑制效果表明，抗CD73可能是效力较低的巨噬细胞抑制剂。由于这些替代抗小鼠LAG-3Fcab在序列上与抗人Fcab的序列紧密相关(来源于相同的亲本抗人LAG-3Fcab)，尽管在人和小鼠LAG-3之间有同源性差异，但是它们都结合LAG-3(分别为小鼠和人的)的非常相似的表位。因此，可预期的是，在用包含替代抗小鼠LAG-3Fcab的mAb2的治疗之后在小鼠中观察到的结果，对于用包含抗人LAG-3Fcab的mAb2的对人类患者的治疗是具有预测性的。
实施例5：Fcab治疗对T细胞LAG-3表达的影响
测试了称为FS18-29/4420的含有LALA突变的LAG-3/模拟mAb2FS18-7-108-29/4420(SEQ ID NO：132和85)、含有LALA突变的基准PD-L1 mAb S1(SEQ ID NO：122和119)以及FS18-29/4420和S1的结合对TIL LAG-3表达的影响。
在植入的当天，在对数生长期期间(汇合度-75％)收获培养的MC38.0VA细胞，并以1×107个细胞/mL的浓度重悬浮在PBS中。通过首先用异氟烷麻醉每只动物、然后将1×106个MC38.OVA细胞(0.1mL悬浮液)皮下植入到各测试动物的左肋中，来启动肿瘤。肿瘤细胞植入后的十一天，使用确定性随机化方法将动物随机分入五组，个体肿瘤体积为32到62.5mm3。在肿瘤接种后第12、14和16天以10mg/kg的抗体或mAb2对动物给药，并在肿瘤接种后第19和23天从每组的3只动物中采集肿瘤。使用GentleMACSTM分离器离解肿瘤与细胞，随后通过70μ0细胞过滤器筛分以获得单细胞悬浮液。将96孔板上的1×106个细胞/孔重悬于具有1:3000的活力染色和Fc阻断(抗CD16/32抗体)的FACS缓冲液中。使用包括针对CD43、CD8a、CD4、FoxP3和LAG-3的标记抗体的Master Mix对用于FACS分析的细胞进行染色。对于FoxP3细胞内染色，在用FoxP3抗体染色之前将细胞固定并透性化(permeabilized)。样品在Canto II流式细胞仪上运行，使用补偿矩阵并计算至少500,000个事件。
在这个实验中，在已经施用了第三剂抗体/模拟mAb2的之后，当观察到对照和非对照治疗之间肿瘤的生长方的分离时但在可能扭曲结果的肿瘤大小之间存在很大差异之前，检查TIL的LAG-3表达。在这个时间点上，发现在用FS18-29/4420和S1的结合治疗的动物中TIL上的LAG-3表达显著降低。具体地，如附图5所示，在用FS18-29/4420和S1的结合治疗之后到第23天，CD8、CD4和FoxP3肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的LAG-3表达降低，而用单独施用的FS18-29/4420或S1的治疗对TIL上的LAG-3表达没有影响。
这些结果显示，LAG-3和PD-L1的双重抑制是TIL降低LAG-3表达所需的，因为在用针对LAG-3或PD-L1的单一试剂治疗的动物中没有见到这种现象。不希望受理论的限制，认为双重抗LAG-3和抗PD-L1治疗引起TIL上LAG-3表达的降低，从而降低了LAG-3的抑制效果并使TIL克服衰竭。一旦TIL被激活，预期它们将能识别由肿瘤所表达的新抗原，并对其产生应答，从而降低肿瘤负担。
序列表
Fcab FS18-7-9环区的氨基酸序列
FS18-7-9AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-9CD环-SNGQPENNY(SEQ ID NO：2)
FS18-7-9EF环-PYDRVWWPDE(SEQ ID NO：3)
FcabFS18-7-9CH3结构域的核苷酸序列(SEQID NO：4)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS18-7-9 CH3结构域的CHO密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：136)
GGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCTGGGATGAGCCCTGGGGCGAGGATGTGTCTCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGCCCTACGACAGATGGGTGTGGCCCGACGAGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC
Fcab FS18-7-9 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)
Figure GDA0003751856120000481
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-9CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
没有LALA突变的FcabFS18-7-9CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS18-7-32环区的氨基酸序列
FS18-7-32AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-32CD环-SNGQPENNY(SEQ ID NO：8)
FS18-7-32EF环-PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)
Fcab FS18-7-32 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAAATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS18-7-32 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)
Figure GDA0003751856120000491
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-32CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)
Figure GDA0003751856120000492
没有LALA突变的Fcab FS18-7-32CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)
Figure GDA0003751856120000501
Fcab FS18-7-33环区的氨基酸序列
FS18-7-33AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-33CD环-SNGQPEDNY(SEQ ID NO：13)
FS18-7-33EF环-PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)
Fcab FS18-7-33 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)
Figure GDA0003751856120000502
Fcab FS18-7-33 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)
Figure GDA0003751856120000503
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-33CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)
Figure GDA0003751856120000504
没有LALA突变的Fcab FS18-7-33 CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)
Figure GDA0003751856120000505
Fcab FS18-7-36环区的氨基酸序列
FS18-7-36AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-36CD环-SNGQPENNY(SEQ ID NO：18)
FS18-7-36EF环-PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)
Fcab FS18-7-36 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)
Figure GDA0003751856120000511
Fcab FS18-7-36 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
Figure GDA0003751856120000512
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-36CH2和CH3结构域的CH2+CH3的氨基酸 序列(SEQ ID NO：21)
Figure GDA0003751856120000513
没有LALA突变的Fcab FS18-7-36CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)
Figure GDA0003751856120000514
Fcab FS18-7-58环区的氨基酸序列
FS18-7-58AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-58CD环-SNGYPEIEF(SEQ ID NO：23)
FS18-7-58EF环-PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)
FS18-7-58 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)
Figure GDA0003751856120000515
FS18-7-58 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)
Figure GDA0003751856120000521
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-58CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)
Figure GDA0003751856120000522
没有LALA突变的Fcab FS18-7-58CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)
Figure GDA0003751856120000523
Fcab FS18-7-62环区的氨基酸序列
FS18-7-62AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-62CD环-SNGIPEWNY(SEQ ID NO：28)
FS18-7-62EF环-PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)
FS18-7-62 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)
Figure GDA0003751856120000524
FS18-7-62 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)
Figure GDA0003751856120000525
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-62CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)
Figure GDA0003751856120000526
没有LALA突变的Fcab FS18-7-62CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)
Figure GDA0003751856120000531
Fcab FS18-7-65环区的氨基酸序列
FS18-7-65AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-65CD环-SNGYAEYNY(SEQ ID NO：33)
FS18-7-65EF环-PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)
FS18-7-65 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：34)
Figure GDA0003751856120000532
FS18-7-65 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)
Figure GDA0003751856120000533
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-65CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)
Figure GDA0003751856120000534
没有LALA突变的Fcab FS18-7-65 CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)
Figure GDA0003751856120000535
Fcab FS18-7-78环区的氨基酸序列
FS18-7-78AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-78CD环-SNGYKEENY(SEQ ID NO：38)
FS18-7-78EF环-PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)
FS18-7-78 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：39)
Figure GDA0003751856120000541
FS18-7-78 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：40)
Figure GDA0003751856120000542
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-78CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：41)
Figure GDA0003751856120000543
没有LALA突变的Fcab FS18-7-78 CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQID NO：42)
Figure GDA0003751856120000544
Fcab FS18-7-88环区的氨基酸序列
FS18-7-88AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-88CD环-SNGVPELNV(SEQ ID NO：43)
FS18-7-88EF环-PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)
FS18-7-88 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：44)
Figure GDA0003751856120000545
FS18-7-88 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)
Figure GDA0003751856120000551
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-88CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)
Figure GDA0003751856120000552
没有LALA突变的Fcab FS18-7-88CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)
Figure GDA0003751856120000553
Fcab FS18-7-95环区的氨基酸序列
FS18-7-95AB环-WDEPWGED(SEQ ID NO：1)
FS18-7-95CD环-SNGYQEDNY(SEQ ID NO：48)
FS18-7-95EF环-PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)
FS18-7-95 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：49)
Figure GDA0003751856120000554
FS18-7-95 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)
Figure GDA0003751856120000555
包含LALA突变(下划线的)的Fcab FS18-7-95CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)
Figure GDA0003751856120000561
没有LALA突变的FcabFS18-7-95CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)
Figure GDA0003751856120000562
野生型人IgG1 CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)
Figure GDA0003751856120000563
包含"LALA突变"(下划线的)的人IgG1CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)
Figure GDA0003751856120000564
没有LALA突变的“野生型”Fcab CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQID NO：55)
Figure GDA0003751856120000565
包含LALA突变(下划线的)的“野生型”Fcab CH2和CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)
Figure GDA0003751856120000566
人IgG1铰链区的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)
Figure GDA0003751856120000567
人IgG1截短的铰链区的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)
Figure GDA0003751856120000568
包含LALA突变(下划线的)的抗小鼠LAG-3Fcab FS18-7-108-29的氨基酸序列(SEQ ID NO：59)
CH3结构域以斜体字显示。CH3结构域的AB、CD和EF环以粗体和下划线显示。
Figure GDA0003751856120000571
没有LALA突变的抗小鼠LAG-3 Fcab FS18-7-108-29的氨基酸序列(SEQ ID NO： 60)
CH3结构域以斜体字显示。CH3结构域的AB、CD和EF环以粗体和下划线显示。
Figure GDA0003751856120000572
包含LALA突变(下划线的)的抗小鼠LAG-3 Fcab FS18-7-108-35的氨基酸序列 (SEQ ID NO：61)
CH3结构域以斜体字显示。AB、CD和EF环区以粗体和下划线显示。
Figure GDA0003751856120000573
没有LALA突变的抗小鼠LAG-3Fcab FS18-7-108-35的氨基酸序列(SEQ ID NO：62)
CH3结构域以斜体字显示。AB、CD和EF环区以粗体和下划线显示。
Figure GDA0003751856120000574
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-9/4420的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：63)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000581
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-9/4420的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：64)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000582
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-32/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：65)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000583
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-32的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：66)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000591
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-33/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：67)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000592
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-33/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：68)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000593
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-36/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：69)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000601
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2FS18-7-36/4420的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：70)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000602
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-58/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：71)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000603
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-58/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：72)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000611
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-62/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：73)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000612
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-62/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：74)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000613
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-65/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：75)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000621
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-65/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：76)
Figure GDA0003751856120000622
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-78/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：77)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000623
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-78/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：78)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000631
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-88/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：79)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000632
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-88/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：80)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000633
包含LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-95/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：81)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000641
没有LALA突变的抗人LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-95/4420的重链的氨基酸序列 (SEQ ID NO：82)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000642
包含LALA突变的抗FITC mAb 4420的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：83)
CDR的位置是下划线的。LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000643
没有LALA突变的抗FITC mAb 4420的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：84)
CDR的位置是下划线的。
Figure GDA0003751856120000651
抗FITC mAb 4420轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：85)
CDR的位置是下划线的。
Figure GDA0003751856120000652
带有LALA突变的抗小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-108-29/S1的重链的氨基酸序 列(SEQ ID NO：86)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000653
没有LALA突变的抗小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-108-29/S1的重链的氨基酸序 列(SEQ ID NO：87)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000654
带有LALA突变的抗小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-108-35/S1的重链的氨基酸序 列(SEQ ID NO：88)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000661
没有LALA突变的抗小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-108-35/S1的重链的氨基酸序 列(SEQ ID NO：89)
CDR的位置是下划线的，AB、CD和EF环序列是粗体和下划线的。
Figure GDA0003751856120000662
带有LALA突变的抗小鼠PD-L1 mAb S1重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：90)
CDR的位置是下划线的。LALA突变的位置是粗体的。
Figure GDA0003751856120000663
没有LALA突变的抗小鼠PD-L1 mAb S1重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：91)
CDR的位置是下划线的。
Figure GDA0003751856120000671
抗小鼠PD-L1 mAb S1轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：92)
CDR的位置是下划线的。
Figure GDA0003751856120000672
抗人LAG-3 mAb 25F7重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：93)
CDR的位置是下划线的。
Figure GDA0003751856120000673
抗人LAG-3 mAb 25F7轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：94)
CDR的位置是下划线的。
Figure GDA0003751856120000674
人LAG-3的氨基酸序列(SEQ ID NO：95)
Figure GDA0003751856120000681
小鼠LAG-3的氨基酸序列(SEQ ID NO：96)
Figure GDA0003751856120000682
食蟹猴LAG-3的氨基酸序列(SEQ ID NO：97)
Figure GDA0003751856120000683
参考文献
本说明书中提及的所有文献通过引用以其整体合并在本文中。
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Claims (50)

1.一种结合到淋巴细胞活化基因3(LAG-3)的特异性结合元件，所述特异性结合元件包括位于所述特异性结合元件的CH3结构域中的LAG-3抗原结合位点，其中所述LAG-3结合位点包括氨基酸序列WDEPWGED(SEQ ID NO：1)和PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)，且其中所述氨基酸序列WDEPWGED位于所述CH3结构域的AB环中，且所述氨基酸序列PYDRWVWPDE位于所述CH3结构域的EF环中。
2.根据权利要求1所述的特异性结合元件，其中：
(i)SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列位于所述CH3结构域的残基11到18；和/或
(ii)SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列位于所述CH3结构域的残基92到101；
其中所述氨基酸残基根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案编号。
3.根据权利要求1所述的特异性结合元件，其中所述LAG-3抗原结合位点还包括以下序列之一：
(i)SNGQPENNY(SEQ ID NO：2、8和18)；
(ii)SNGQPEDNY(SEQ ID NO：13)；
(iii)SNGYPEIEF(SEQ ID NO：23)；
(iv)SNGIPEWNY(SEQ ID NO：28)；
(v)SNGYAEYNY(SEQ ID NO：33)；
(vi)SNGYKEENY(SEQ ID NO：38)；
(vii)SNGVPELNV(SEQ ID NO：43)；或
(viii)SNGYQEDNY(SEQ ID NO：48)。
4.根据权利要求3所述的特异性结合元件，其中所述LAG-3抗原结合位点包括处于所述CH3结构域的CD环中的SEQ ID NO：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48中列出的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的特异性结合元件，其中所述LAG-3抗原结合位点包括处于所述CH3结构域的CD环中的SEQ ID NO：2、28或38中列出的氨基酸序列。
6.根据权利要求3所述的特异性结合元件，其中所述LAG-3抗原结合位点包括处于所述CH3结构域的CD环中的SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列。
7.根据权利要求3所述的特异性结合元件，其中SEQ ID NO：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48中列出的氨基酸序列位于所述特异性结合元件的CH3结构域的残基43到78，其中所述残基根据IMGT编号方案编号。
8.根据权利要求1所述的特异性结合元件，其中所述CH3结构域是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域。
9.根据权利要求8所述的特异性结合元件，其中所述CH3结构域是人IgG1 CH3结构域。
10.根据权利要求1所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件包括SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50中列出的CH3结构域。
11.根据权利要求10的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件包括SEQ ID NO：5、30或40中列出的CH3结构域。
12.根据权利要求11的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件包括SEQ ID NO：5中列出的CH3结构域。
13.根据权利要求1所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件还包括CH2结构域。
14.根据权利要求13所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2结构域。
15.根据权利要求14所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件包括人IgG1的CH2结构域。
16.根据权利要求15所述的特异性结合元件，其中所述CH2结构域具有SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54中列出的序列。
17.根据权利要求1所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件包括SEQ ID NO：6、7、11、12、16、17、21、22、26、27、31、32、36、37、41、42、46、47、51或52中列出的序列。
18.根据权利要求17所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件包括SEQ IDNO：6、7、31、32、41或42中列出的序列。
19.根据权利要求18所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件包括SEQ IDNO：6或7中列出的序列。
20.根据权利要求10-19中任一项所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件的所述CH3结构域序列包括处在SEQ ID NO:5、10、15、20、25、30、35、40、45或50中显示的序列的紧邻C-末端的赖氨酸残基(K)。
21.根据权利要求19所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件包括SEQ IDNO:135中列出的CH3结构域。
22.根据权利要求1所述的特异性结合元件，其还包括处在所述CH2结构域的N-末端的免疫球蛋白铰链区或其部分。
23.根据权利要求22所述的特异性结合元件，其中所述铰链区或其部分是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区或其部分。
24.根据权利要求23所述的特异性结合元件，其中所述铰链区或其部分是人IgG1铰链区或其部分。
25.根据权利要求24所述的特异性结合元件，其中所述铰链区或其部分具有SEQ IDNO：57或SEQ ID NO：58中列出的序列。
26.根据权利要求1所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件还包括第二抗原结合位点。
27.根据权利要求26所述的特异性结合元件，其中所述第二抗原结合位点是基于CDR的抗原结合位点。
28.根据权利要求26所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件是抗体分子。
29.根据权利要求28所述的特异性结合元件，其中所述抗体分子是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子。
30.根据权利要求29所述的特异性结合元件，其中所述抗体分子是人IgG1分子。
31.根据权利要求28到30中任一项所述的特异性结合元件，其中所述抗体分子的所述基于CDR的抗原结合位点结合至作为免疫系统调节物的分子。
32.根据权利要求31所述的特异性结合元件，其中所述免疫系统调节物是免疫调节受体或免疫调节受体的配体。
33.根据权利要求31所述的特异性结合元件，其中所述基于CDR的抗原结合位点特异于作为免疫系统抑制物或激活物的分子。
34.根据权利要求33所述的特异性结合元件，其中所述基于CDR的抗原结合位点特异于作为免疫系统抑制物的分子。
35.根据权利要求31所述的特异性结合元件，其中所述基于CDR的抗原结合位点特异于选自由以下组成的组的抗原：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、含T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)、CD73和集落刺激因子1受体(CSF1R)。
36.根据权利要求1、和28到30中任一项所述所述的特异性结合元件，其中所述特异性结合元件或所述抗体分子缀合至免疫系统调节物、细胞毒性分子、放射性同位素或可检测标记。
37.根据权利要求36所述的特异性结合元件，其中所述免疫系统调节物或所述细胞毒性分子是细胞因子。
38.一种抗体分子，所述抗体分子结合至免疫系统调节物和淋巴细胞活化基因3(LAG-3)，其中所述抗体分子包括：
(i)针对免疫系统调节物的基于CDR的抗原结合位点；以及
(ii)位于所述抗体分子的CH3结构域中的LAG-3抗原结合位点，其中所述LAG-3抗原结合位点包括氨基酸序列WDEPWGED(SEQ ID NO：1)、SNGQPENNY(SEQ ID NO:2)和PYDRWVWPDE(SEQ ID NO：3)，其中，所述氨基酸序列WDEPWGED位于所述CH3结构域的AB环中，所述氨基酸序列SNGQPENNY位于所述CH3结构域的CD环中，且所述氨基酸序列PYDRWVWPDE位于所述CH3结构域的EF环中。
39.根据权利要求38所述的抗体分子，其中所述CH3结构域具有SEQ ID NO:135中列出的序列。
40.根据权利要求38或39所述的抗体分子，其中所述基于CDR的抗原结合位点结合至CTLA-4、TIM-3、CD73或CSF-1R。
41.一种核酸，其编码根据权利要求1到37中任一项所述的特异性结合元件、或根据权利要求38到40中任一项所述的抗体分子。
42.一种载体，其包括根据权利要求41所述的核酸。
43.一种重组宿主细胞，其包括根据权利要求41所述的核酸或根据权利要求42所述的载体。
44.一种生产根据权利要求1到37中任一项所述的特异性结合元件、或根据权利要求38到40中任一项所述的抗体分子的方法，所述方法包括在用于所述特异性结合元件或所述抗体分子的生产的条件下培养根据权利要求43所述的重组宿主细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其还包括分离和/或纯化所述特异性结合元件或所述抗体分子。
46.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到37中任一项所述的特异性结合元件、或根据权利要求38到40中任一项所述的抗体分子，以及药学可接受赋形剂。
47.根据权利要求1到37中任一项所述的特异性结合元件、或根据权利要求38到40中任一项所述的抗体分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
48.或根据权利要求47所述的用途，其中所述癌症选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、纤维肉瘤、肾细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、乳腺癌、多形性胶质母细胞瘤、肺癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、外阴癌、睾丸癌、阴茎癌、白血病、多发性骨髓瘤、鳞状细胞癌、睾丸癌、食道癌、卡波西氏肉瘤和中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、肝细胞癌、鼻咽癌、默克尔细胞癌和间皮瘤。
49.根据权利要求47或48所述的用途，其中所述治疗还包括向所述患者施用抗肿瘤疫苗。
50.根据权利要求47或48所述的用途，其中所述治疗还包括向所述患者施用化学治疗剂。
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