CN102083464A

CN102083464A - 细胞毒免疫球蛋白

Info

Publication number: CN102083464A
Application number: CN2009801259468A
Authority: CN
Inventors: 戈特弗里德·希姆勒; 格尔特·马德; 安东·鲍尔; 格尔达·雷德尔
Original assignee: STAR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHU
Current assignee: STAR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHU
Priority date: 2008-05-02
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2011-06-01
Anticipated expiration: 2029-03-03
Also published as: EP2274012A1; HUE031447T2; DK2274012T3; ES2683847T3; US8859738B2; US10125197B2; LT2630970T; DK2630970T3; CY1119508T1; HRP20140760T1; PL2630970T3; US20150166665A1; LT2698165T; CA2721614C; CA2721614A1; JP2011521905A; EP2630970B1; HUE039975T2; EP2698165B1; CN102083464B

Abstract

本发明涉及分子量最高达60kD的细胞毒模块抗体，其以Kd＜10^-8M的结合亲和力结合细胞表面的靶，本发明还涉及产生所述抗体的方法，以及所述抗体作为治疗剂的用途。

Description

细胞毒免疫球蛋白

本发明涉及细胞毒免疫球蛋白(cytotoxic immunoglobulin)。

单克隆抗体已广泛用作治疗性结合剂。基本的抗体结构在本文中以完整的IgG1免疫球蛋白为例来说明。

两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)组合，形成Y形抗体分子。每条重链有4个结构域。氨基末端可变区(VH)位于Y形的顶端。它们之后是三个恒定区：CH1，CH2，以及位于Y形的茎部底座的羧基端CH3。一条短链，即连接链(switch)，将重链可变区与恒定区相连。铰链将CH2和CH3(Fc片段)与抗体的其余部分(Fab片段)相连。对完整抗体分子的铰链区进行蛋白裂解，可以产生一个Fc和两个相同的Fab片段。轻链由可变区(VL)和恒定区(CL)这两个区组成，它们被一个连接链分隔。

铰链区中的二硫键将两条重链连接起来。轻链与重链通过另外的二硫键相连。根据免疫球蛋白类型的不同，在恒定区中不同位置附着有Asn-连接的糖模块(Carbohydrate moieties)。对于IgG1，铰链区中位于Cys235和Cys238之间的二硫键将两条重链串起来。轻链与重链通过CH1区的Cys229与CL区的Cys214之间的两个额外二硫键相连。糖模块与每个CH2中的Asn306相连，在Y形的茎区产生明显的凸出。

这些特征具有深远的功能性后果。重链和轻链两者的可变区(VH和VL)位于Y形″尖端″，它们在那里处于与抗原反应的位置。该分子的这种尖端是氨基酸序列N端所在。Y形的主干区以有效介导效应子功能的方式凸出，所述效应子功能诸如激活补体以及与Fc受体相互作用，或ADCC和ADCP。其CH2和CH3区凸出有利于与效应蛋白的相互作用。该氨基酸序列的C端位于与尖端相反的一侧，即Y形的″底部″。

抗体中发现两个型的轻链：lambda(λ)型和kappa(κ)型。一种具体的免疫球蛋白要么具有κ链，要么具有λ链，不会同时具有两种链。具有λ轻链的抗体与具有κ轻链的抗体之间未发现功能差异。

抗体分子的每个结构域具有相似的结构：两个beta片层彼此紧密靠近而反向平行堆积成beta柱体(barrel)。这一保守结构称为免疫球蛋白折叠。恒定区的免疫球蛋白折叠包含一个由3-链片层堆积在一个4-链片层上。该折叠的稳定是通过每个片层的beta链之间的氢键、通过内部的反向片层残基之间的疏水相互作用、以及通过这些片层之间的二硫键来实现。所述3-链片层包含C，F，和G链，所述4-链片层具有A，B，E，和D链。字母A-G表示这些beta链沿免疫球蛋白折叠的氨基酸序列的依次位置。

可变区的折叠结构具有9条β折叠链，排列成4条链和5条链的两组片层。5链片层在结构上与恒定区的3链片层类似，但包含额外的C′和C″链。其余链(A、B、C、D、E、F、G)与它们在恒定区免疫球蛋白折叠结构中的对应物具有相同的拓扑学和相似的结构。一个二硫键连接对立片层中的B和F链，与恒定区中的一样。

免疫球蛋白轻链和重链的可变区都包含三个高变环或互补决定区(CDR)。V区的三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)在β桶的一端簇集。这些CDR是连接免疫球蛋白折叠结构的β链B-C、C′-C″和F-G的环。这些CDR中的残基在不同免疫球蛋白分子中有不同，赋予抗体各自的抗原特异性。

抗体分子尖端的VL和VH结构域压紧，使得6个CDR(每个结构域3个)协作而构建供抗原特异性结合的表面(或空腔)。如此，抗体的天然抗原结合位点由连接轻链可变区的B-C、C′-C″和F-G链及重链可变区的B-C、C′-C″和F-G链的环构成。

抗体分子尖端的VL和VH区紧密推挤，使得6个CDR(每区3个)协作而构建出供抗原特异性结合的表面(或空腔)。如此一来，抗体的天然抗原结合位点由连接轻链可变区的B-C、C′-C″和F-G链及重链可变区的B-C、C′-C″和F-G链的多个环构成。

有些环并非天然免疫球蛋白中的CDR环、或者也不是由CDR环和可能还有CDR环区内邻接环决定的抗原结合口袋的一部分，这样的环不具有抗原结合或表位结合特异性，但有助于完整免疫球蛋白分子和/或其效应物或其它功能的正确折叠，因此为了本发明的目的被称为结构环。

现有技术文献显示，到目前为止免疫球蛋白样支架被用于操控已有的抗原结合位点，从而导入新的结合特性。在大多数情况下CDR区已经被改造用于抗原结合，换言之，就免疫球蛋白折叠来说，只有天然抗原结合位点被改造以便改变其结合亲和力或特异性。已有非常多的文献记载了不同形式的此类被操作过的免疫球蛋白，它们常常以单链Fv片段(scFv)或Fab片段的形式表达，或是展示在噬菌体颗粒的表面，或是在各种原核或真核表达系统中可溶性表达。

WO06/072620A1描述了一种改造免疫球蛋白的方法，其包括在结构环区的改造以获得新的抗原结合位点。该方法广泛适用于免疫球蛋白，可用于产生一系列靶向于不同抗原的免疫球蛋白。CH3文库已经被证明可用于选择抗原的特异性结合剂。

WO08/003103A2描述了在代表CD20抗原的模拟表位(mimotope)的合成肽上淘选CH3，CH1或CL文库。

多种免疫球蛋白文库已在本领域被提议用于获得特异性免疫球蛋白结合剂。现有技术总体上涉及结合结构域的单体单价展示。WO9209690A2描述了噬菌粒颗粒在其颗粒表面展示单拷贝的融合蛋白。从而描述了从噬菌粒颗粒(亦称为噬菌体)的文库获得高亲和力的结合剂。这提供了含编码结合多肽和噬菌体外壳蛋白的基因的可复制型表达载体，以形成编码融合蛋白的基因融合体，其是噬菌粒颗粒、噬菌体外壳蛋白和结合多肽的嵌合蛋白。

US5223409泛泛描述了将编码目的蛋白的基因与丝状噬菌体M13基因III外壳蛋白的N端结构域融合的方法。所述基因融合体经突变，形成结构相关、且在噬菌粒颗粒表面少量表达的融合蛋白的文库。生物学选择和筛选方法被用来鉴定可用作药物候选物的新配体。

但是，在使用这类“融合噬菌体”或单价噬菌体展示和使用相应单个融合蛋白方面存在一些限制。多个生物制品天然以低聚形式存在。对于本发明的目的来说，低聚表示二聚、三聚或甚至更高的多聚形式，直至24个单体。

现有技术的融合噬菌体被描述为展示单体融合蛋白，主要是因为，据信如果通过噬菌粒颗粒展示多个单体融合蛋白，最高亲和力的结合剂只能选自一种文库。但是天然蛋白经常组装为二聚体或甚至以更高的寡聚程度组装。为了获得具有单个融合蛋白的二聚展示，已经开发出一些技术，它们涉及位于外壳蛋白和结合多肽之间的条件终止密码子(Dall′Acqua et al.The Journal of Immunology，2002，169：5171-5180)。从而除了与噬菌体融合的多肽之外的那些多肽的可溶性单体被表达，由此启动二聚体的形成。但是，这类终止密码子需要在能将终止密码子翻译为氨基酸的特异性抑制者宿主细胞中增殖，以便提供合适量的除可溶性结合多肽之外的融合蛋白。

在一些情况下，现有技术的融合蛋白包括接头序列，以便展示更大的结合多肽。最多有24个氨基酸的接头序列常规用于展示抗体的可变区。参见例如，展示载体pCOMB3x(Hybrid.Hybridomics.2003 Apr；22(2)：97-108.Development of functional human monoclonal single-chain variable fragment antibody against HIV-1 from human cervical B cells.Berry JD，Rutherford J，Silverman GJ，Kaul R，Elia M，Gobuty S，Fuller R，Plummer FA，Barbas CF.)。

基于全长IgG1的免疫球蛋白已广泛用于治疗实体肿瘤患者，尤其过表达erbB类受体的那些。所述的受体例如EGFR(Her1)，Her2，Her2neu，Her3和Her4。

Herceptin(曲妥珠单抗(trastuzumab)，humAb4D5)是基于单克隆抗体、用于治疗乳腺癌的产品。Herceptin抗体特异于her2neu(也称c-erbB-2或MAC117)的HER2胞外区的4D5表位。

″HER2胞外区″或″HER2 ECD″是指位于细胞外侧的HER2区，包括其片段，它们或者锚着在细胞膜上，或者在血液循环中。HER2胞外区可包含4个区：″I区″(氨基酸残基约1-195)，″II区″(氨基酸残基约196-319)，″III区″(氨基酸残基约320-488)，和″IV区″(氨基酸残基约489-630)(不含信号肽时的残基编号)。

″4D5表位″是HER2胞外区中被4D5抗体(ATCC CRL 10463)和曲妥珠单抗结合的区。该表位靠近HER2跨膜区，位于HER2的第IV区内。HER2的4D5表位在大约残基529-625区域(包括HER2 ECD)跨越(encompasses)任意一或多个残基，是含有信号肽时的编号。

EGFR是大分子(1,186个残基)单体糖蛋白，有单个跨膜区，胞浆酪氨酸激酶区，侧翼为非催化调节区。序列分析显示，外功能区(ectodomain，残基1-621)包含4个亚区，在此称L1，CR1，L2和CR2，其中L和CR分别是大和Cys富集。The L1和L2区也分别称I区和III区。CR区以前称II区和IV区，或称S1.1-S1.3和S2.1-S2.3，其中的S是“小(small)”的缩写。

已开发出抗EGFR胞外区的单克隆抗体(Mab)，其破坏配体与受体的结合及随后的信号传导。三种EGFR-特异性阻断抗体已在体外试验中被非常详细地表征，目前已用于临床研究；它们是mAbC225(ERBITUX/西妥昔单抗(cetuximab))，mAb425(EMD72000)和人mAb ABX-EGF。C225(西妥昔单抗/Erbitux)已被FDA批准用于转移性结直肠癌，mAb425(EMD59000)的人源化形式是(EMD72000)，其目前已进入II期临床试验，用于多种表达EGFr的实体肿瘤。C225结合EGFr胞外区的明显(distinct)表位。已有证据表明，这两种抗体都与野生型受体独立地结合，也都与在肿瘤细胞中优势表达的突变受体(EGFrVIII)独立地结合。西妥昔单抗仅与EGFR胞外区的III区(sEGFR)发生相互作用，其与该结构域的配体结合区域部分地咬合，在空间上阻碍该受体二聚化。

自发突变的EGF受体首先在神经母细胞瘤中发现。现称为EGFRvIII的这种分子代表了EGF受体胞外区外显子2-7的缺失。这去掉了273个氨基酸，在融合连接处产生新的甘氨酸。EGFRvIII(也称de2-7EGFR或deltaEGFR)在胞外区有框内缺失(in-frame deletion)，在非常多种类型的人类肿瘤中都已发现。

WO9720858A1涉及诱导Her2表达细胞凋亡的抗Her2抗体。因此，与Her2结合的单克隆抗体(mAb)通过用纯化的可溶性Her2免疫小鼠来产生。

WO06087637A2涉及识别Her2/neu并对Her2/neu表达细胞发挥抗增生效应的抗体。该文献描述了能特异性结合Her2neu、但无细胞毒活性的分离的抗体或片段，变体或其衍生物，尤其人Fab片段，以及scFv片段。

一些现有技术文献涉及能在缺乏诸如ADCC等细胞毒活性的情况下抑制肿瘤生长的抗体形式。

Rovers等(Cancer Immunol.Immunother.(2007)56：303-317)描述了具有抑制肿瘤细胞生长的潜能的抗EGFR纳米抗体(nanobodies)。

WO03/075840A2描述了以相当于或高于人VEGF的亲和力结合KDR、并中和KDR的激活作用的抗体，其中的单价Fabs能中和KDR的激活作用，并因此抑制血管新生和肿瘤生长。

还有其它一些免疫球蛋白片段被提议用于人类的治疗。

专利申请WO06036834A2描述了作为内部序列掺入到Fc结构域环区之中的生物活性肽；其说明书描述了一种分子，其通过插入或替换先前存在于Fc结构域中的氨基酸，而添加了所述内部肽序列。一个肽实例靶向p185HER2/neu。

靶向Her2/neu的肽参见Park et al Nat.Biotechnol.(2000)18(2)：194-8。虽然肽结合亲和力常常很低，在kD值高于10^-6M的范围，但该文献所述的环外抗HER2/neu肽模拟物发挥出不一般的高亲和力(KD＝300nM)。

WO01/01748A2描述了以低水平结合亲和力与人erbB2基因产物结合的肽混合物。一例抗erbB2的肽-Fc融合蛋白在竞争结合试验中被测试，以少量相同类型的肽作为竞争剂，结果IC50值较低，但并不指示饱和试验中测出的Kd或EC50值。

本发明的目的是提供改进的与细胞表面结合的免疫球蛋白产物。

所述目的通过本文所述的主题来解决。

发明简述

本发明提供分子量最高达60kD的细胞毒模块抗体(cytotoxic modular antibody)，其以Kd＜10^-8M的结合亲和力(优选在纳摩尔范围或更低水平)结合细胞表面的靶。本发明的高亲和力模块抗体因此体积缩小，具有易于穿过细胞层或肿瘤、在目标被过表达的部位有效裂解细胞或使细胞死亡的优势。备选地，本发明的模块抗体优选IC50＜10^-8M，可在饱和结合试验中测出。

本发明的模块抗体优选发挥ADCC，ADCP，CDC或凋亡活性中的至少一种活性。

本发明模块抗体的细胞毒活性优选通过其效应子功能确定，即通过测定ADCC，ADCP，CDC或凋亡活性中的至少一种活性来确定。

优选的本发明模块抗体是模块抗体结构域的寡聚体，尤其免疫球蛋白结构域的寡聚体，或全长免疫球蛋白的片段。优选的抗体是选自VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，Fc加Fab的二聚体，或它们的单链。

本发明的模块抗体优选包含具有随机化抗体序列的结合位点和/或位于结构环区的至少一个结合位点，其总是要理解为潜在地包括可以对抗原结合作贡献的末端结构域序列。随机化抗体序列的位点可以位于CDR区或结构环区之中。因此，与靶结合、或与功能性配体如效应分子(优选支架配体)结合是可能的，即使免疫球蛋白不含CDR区，或者在CDR区以外的部位也是如此。

根据优选实施方案，细胞表面靶结合位点位于CDR区之中，特异于功能性配体或支架配体的结合位点位于结构环区之中。

根据另一优选实施方案，特异于功能性配体或支架配体的结合位点位于CDR区之中，细胞表面靶结合位点位于结构环区之中。

优选的本发明模块抗体具有与靶结合的特异性结合特性，所述靶是erbB类别的受体，如选自EGFR，Her2，Her2neu，HER3和HER4。优选的本发明模块抗体用于治疗实体肿瘤患者，所述肿瘤表达erbB类型的受体。

那些抗-Her2模块抗体特别优选在结构环区的EF环之中包含选自表4和表5的氨基酸序列，表4和表5的序列任选地包含在EF和/或AB和/或CD环之中。

虽然长期以来都需要高效的小分子抗体，但这是首次可以根据本发明，用模块抗体结构域的文库，尤其与效应配体结合的模块抗体结构域寡聚体的文库，获得这样的模块抗体。所述文库中选出的成员具有两种特性，靶结合特性和效应配体结合特性，这是生物学细胞毒性或胞解作用的前提。还优选模块抗体支架的形式不因产生所述支架的变体和文库而改变，因此文库成员仍保持功能性形式，可通过与支架配体的结合来确定。

本发明提供了产生权利要求1的模块抗体的方法，包括以下步骤：

a.提供模块抗体结构域寡聚体的库，

b.在有效应配体存在的条件下，将所述库与所述靶接触，

c.选出具有以下两项特性的库成员：

(i)靶结合亲和力为Kd＜10^-8M或IC50＜10^-8M，且

(ii)具有细胞毒活性，和

d.产生该模块抗体的制剂。

优选的筛选方法能选出同时对两者(靶和效应配体)的结合，这种同时结合有利于进行胞解。同时结合优选在能进行二维鉴别的基于细胞的试验(如FACS系统)中测定。

优选地，文库成员含有随机化抗体序列，其中的诱变位点任选在CDR区之中或在CDR区一侧，优选在结构环区之中，可能包括末端序列。

本发明方法中使用的文库优选根据以下设计产生，所述设计在与效应配体相互作用的结合位点之外提供诱变。因此，优选使用高质量文库(high quality library)，其通过利用效应分子结合试验或支架配体结合试验进行的质量控制测量法来确定。

本发明的优选方法还包括亲和力成熟步骤，以增加与细胞表面靶的结合亲和力。这种亲和力成熟优选通过对选定的免疫球蛋白的诱变来进行，所述选定的免疫球蛋白具有确定的与靶结合的结合特异性，不与对照蛋白发生交叉反应，但具有中度或低水平的亲和力。优选对结合亲和力为IC50或Kd＜10^-6M的文库成员进一步诱变，以提供亲和力成熟的结合剂或所述结合剂的群体，即具有较高亲和力的亲和力成熟结合剂的文库，所述较高亲和力是指IC50或Kd＜10^-7M、优选IC50或Kd＜10^-8M、或甚至在纳摩尔范围或更低范围。在本例中，优选本发明的模块抗体在其细胞毒效应方面仍然是具有功能的。

根据优选实施方案，本发明提供了制备本发明模块抗体的方法，用于治疗实体肿瘤患者，所述肿瘤表达erbB一类的受体。

本发明的模块抗体优选用于治疗实体肿瘤患者，所述肿瘤表达erbB一类的受体。

附图：

图1：产生装配文库Fcab01所用片段的PCR示意图。PCR引物按它们各自5’-3’的取向用箭头表示，垂直线表示为装配突变基因所引入的限制性位点的大概位置。所述限制性位点都包含在引物上，用于连接所述PCR片段。

图2：CH3结构域的氨基酸序列和二级结构(IMGT编号)。为文库Fcab01至Fcab06提供了随机化方案。AB环和EF环中的随机化位置用圆圈标示。X代表所有20种氨基酸，z仅指Ala，Asp，Ser，Tyr。

图3：IgG Fc片段的晶体结构(氨基酸序列)

图4：含随机化氨基酸修饰的人IgG1(氨基酸序列)

图5：FcabRGD4L的氨基酸序列(氨基酸序列)

图6：载体pHENFcabRGD4(核苷酸序列)

图7：载体pHENFcabRGD4L(核苷酸序列)

图8(SEQ ID NO：15)：载体pYD1dX(核苷酸序列)

图9(SEQ ID NO：16)：载体pYD1dXFc(核苷酸序列)

图10(SEQ ID NO：17)：载体pYD1CH12(核苷酸序列)

图11(SEQ ID NO：18)：Fcab01(核苷酸序列)

图12(SEQ ID NO：19)：Fcab02(核苷酸序列)

图13(SEQ ID NO：20)：Fcab03(核苷酸序列)

图14(SEQ ID NO：21)：Fcab04(核苷酸序列)

图15(SEQ ID NO：22)：Fcab05(核苷酸序列)

图16(SEQ ID NO：23)：Fcab06(核苷酸序列)

图17(SEQ ID NO：72)：载体pYD1(核苷酸序列)

图18(SEQ ID NO：73)：修饰的载体pYD1Nhe(核苷酸序列)

图19(SEQ ID NO：74)：载体pYD1lnk(核苷酸序列)

图20(SEQ ID NO：75)：载体pYD1mata(核苷酸序列)

图21(SEQ ID NO：76)：载体pYD1gal(核苷酸序列)

图22(SEQ ID NO：77)：4D5H(核苷酸序列)

图23(SEQ ID NO：78)：4D5L(核苷酸序列)

图24(SEQ ID NO：79)：载体pYD4D5hc(核苷酸序列)

图25(SEQ ID NO：80)：4D5hp(氨基酸序列)

图26(SEQ ID NO：81)：载体pYD4D5hl(核苷酸序列)

图27(SEQ ID NO：82)：4D5lp(氨基酸序列)

图28(SEQ ID NO：427)：质粒pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt(核苷酸序列)

发明详述

定义

说明书全文使用的专有术语具有下列含义。

本发明使用的术语“免疫球蛋白”被定义为可以显示单一或双重或多重特异性，或单价、二价或多价结合特性的多肽或蛋白，优选至少两个，更优选至少三个特异性结合位点，所述位点针对例如病原体来源的或具有人的结构的抗原、效应分子或蛋白(象包含细胞结合蛋白或血清蛋白的自身抗原)的表位。本发明使用的术语免疫球蛋白还包括，抗体的功能性片段，诸如Fc，Fab，scFv，CH1/CL结构域的单链二聚体，Fv，二聚体如VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，或免疫球蛋白的其它衍生物或组合，象成对免疫球蛋白区的单链。所述定义进一步包括，可变区重链和轻链的结构域(诸如dAb，Fd，Vl，Vk，Vh，VHH)，完整抗体的恒定区或个别结构域诸如CH1，CH2，CH3，CH4，Cl和Ck，以及由结构环连接的免疫球蛋白区至少两条beta链组成的小结构域。

本发明使用的“模块抗体”被定义为抗原结合分子，例如人抗体，由至少一个多肽组件或蛋白结构域组成，优选采用天然形式。术语“模块抗体”包括抗原结合分子，其是免疫球蛋白，免疫球蛋白样蛋白，或显示类似于免疫球蛋白或抗体的模块形式和抗原结合特性的其它蛋白，其可用作抗原结合支架，优选基于人蛋白。

本发明使用的术语“免疫球蛋白样分子”涉及任意抗原结合蛋白，尤其是人蛋白，其具有可以以模块方式组建的域结构。本发明优选使用的免疫球蛋白样分子是T细胞受体(TCR)或其可溶性部分，纤连蛋白，运铁蛋白，CTLA-4，单链抗原受体，例如与T细胞受体和抗体有关的那些，抗体模拟物，adnectins，anticalins，phylomers，重复蛋白诸如锚蛋白重复，avimers，Versabodies^TM，基于全蝎毒素(scorpio toxin)的分子，以及其它具有抗原结合特性的非抗体的蛋白支架。

锚蛋白重复(AR)，armadillo重复(ARM)，亮氨酸富集重复(LRR)和三角形四肽(tetratricopeptide)重复(TPR)蛋白是重复蛋白这一类的最重要成员。重复蛋白由同源结构单位(重复单位)组成，这些单位堆积形成延长的结构域。结合相互作用通常由数个相邻重复单位介导，导致大的靶相互作用表面。

Avimers包含A结构域，是在数个细胞表面受体中排成一列的多个结构域。该家族的结构域天然结合超过100种不同的已知靶，包括小分子，蛋白和病毒。截短分析显示，靶通常与多个A结构域接触，其中每个结构域独立地结合唯一表位。通过组合多个结合结构域来产生亲合力(avidity)，是增加亲和力和特异性的有效方法，这些受体在进化过程中已经利用了这一点。

Anticalins是源自脂笼蛋白(lipocalin)支架、具有指定的结合特性(主要是对于人源化抗体而言)的工程化人蛋白。脂笼蛋白包括160-180个氨基酸，与被4个环围绕的配体结合口袋一起形成锥状beta-桶蛋白。小分子疏水化合物是脂笼蛋白的天然配体，将该结合口袋中的残基随机化后，可以分离出具有新的化合物特异性的不同脂笼蛋白变体(亦称为“anticalins”)。

单链或单域抗原受体包含单个可变区，并且比骆驼单域抗体(camelid single domain antibodies)小20％。

Phylomers是源自生物多样化天然蛋白片段的肽。

应理解，术语“模块抗体”，“免疫球蛋白”，“免疫球蛋白样蛋白”还包括其衍生物。衍生物是本发明一种或更多种模块抗体的任意组合，和/或是融合蛋白，其中本发明模块抗体的任意结构域或迷你结构域(minodomain)可以在一种或多种其它蛋白(诸如其它的模块抗体，免疫球蛋白，配体，支架蛋白，酶，毒素等等)的任意位置融合。本发明模块抗体的衍生物还可以通过各种化学技术关联或结合其它物质来获得，所述技术诸如共价偶联，静电相互作用，双硫醚键等等。结合免疫球蛋白的其它物质可以是脂质，碳水化合物，核酸，有机和无机分子或其任意组合(例如PEG，前体药物或药物)。衍生物还包括具有相同的氨基酸序列但完全或部分从非天然的或化学修饰的氨基酸制备的抗体。术语衍生物还包括片段和功能等价物。优选的衍生物仍然是在靶结合和细胞毒活性两方面都具有功能的那些。

本发明的“结构环”或“非CDR环”应以下列方式理解：模块抗体，免疫球蛋白或免疫球蛋白样物质由具有所谓免疫球蛋白折叠的结构域组成。实质上，反平行beta片层由环连接形成紧凑的反平行beta桶。在可变区中，这些结构域的一些环对抗体的特异性(即通过抗体的天然结合位点结合抗原)具有实质上的贡献。这些环被称为CDR-环。CDR环位于CDR环区内，其在一些情况下还可以包括靠近CDR环的可变框架区(称为“VFR”)。已知VFR的一些环对抗体的抗原结合口袋(其通常主要由CDR环确定)有贡献。因此，那些VFR环被认为是CDR环区的一部分，不适合用于产生新的抗原结合位点。抗原结合口袋或CDR环区以外的环通常称为结构环或非-CDR-环。与CDR环区之中或靠近CDR环的那些VFR不同，可变区VFR的其它环被认为是结构环、且尤其适用于本发明。这些优选是与CDR环区相对，或位于免疫球蛋白可变区C端一侧的VFR的结构环。恒定区在结构环区之中具有结构环，例如，在抗体结构域C端一侧，或在N端一侧，甚至在抗体结构域的侧链之中。恒定区也称框架区的组成部分。

本发明使用的术语“抗原”或“靶”将特别包括能够被模块抗体的结合位点识别的所有抗原和靶分子。被本发明分子的靶向的特别优选抗原是以下抗原或分子，其已经被证明是或能够是免疫上或治疗上相关的，尤其是临床功效已经得到验证的那些。

本文使用的术语“靶”或“抗原”将尤其包括选自以下的分子：变应原，肿瘤相关抗原，自体抗原包括细胞表面受体，酶，Fc-受体，FcRn，HSA，IgG，白介素或细胞因子，补体系统的蛋白，转运蛋白，血清分子，细菌抗原，真菌抗原，原生动物抗原和病毒抗原，以及引起传染性海绵状脑炎(TSE)的分子，如感染性或非感染性朊病毒(prion)，和与炎性病症有关的标记物或分子如促炎因子，多发性硬化或阿尔茨海默尔病，或半抗原。

术语“细胞表面抗原”将包括能够被细胞表面的抗体结构和这类分子的片段识别的所有抗原。优选细胞表面抗原是以下抗原，其已经被证明是或能够是免疫或治疗上相关的，尤其是临床前或临床功效已经得到验证的那些。对于本发明的目的来说，调节细胞杀伤活性的那些细胞表面分子是特别适合的。当本发明的免疫球蛋白优选结合所述细胞表面分子中的至少两种时，免疫系统引起细胞裂解或细胞死亡，从而提供攻击人细胞的有效工具(means)。

抗原作为完整靶分子或这类分子的片段被识别，所述片段尤其是通称为表位的靶的子结构(substructure)。只要它们是免疫上相关的(即还可以被天然的或单克隆的抗体识别)，抗原子结构就被通称为“表位”(例如B细胞表位，T细胞表位)。根据本发明在本文使用的术语“表位”应尤其指，完全组成针对本发明模块抗体或免疫球蛋白结合位点的特异性结合伴侣或者是其一部分的分子结构。术语“表位”还可以指半抗原。化学上，表位可以由碳水化合物，肽，脂肪酸，有机物、生化物质或无机物或其衍生物及其任意组合组成。若表位是多肽，其通常包括至少3个氨基酸，优选8-50个氨基酸，更优选约10-20个氨基酸。在肽的长度方面没有关键上限，其可以包括几乎全长的蛋白多肽序列。表位可以是线性表位或构象性表位。线性表位由多肽链一级序列的单个片段组成。线性表位可以是连续或重叠的。构象性表位由因多肽折叠成三级结构而聚在一起的氨基酸组成，这些氨基酸在线性序列中彼此不必邻接。具体来说，表位是与诊断相关的分子的至少一部分，即样品中表位的有无，与患者的疾病或健康状态，或与生产中的加工状态，或与环境状况和食品状况，有定性或定量的关系。表位还可以是与治疗相关的分子的至少一部分，即可以被改变疾病进程的特异性结合结构域靶定的分子。

本文使用的术语“特异性结合(specifically binds或specific binding)”是指一种结合反应，其不同分子组成的群体中确定相关的(cognate)目标配体。因此，在指定条件(例如免疫分析条件)下，模块抗体结合其特定靶，而不以高水平结合样品中的其它分子。特异性结合表示，根据所选的靶的特性，高、中或低水平的结合亲和力或亲合力，结合是选择性的。当结合常数或结合动力学有至少10倍的差异，优选至少100倍的差异，更优选至少1000倍时，通常可以实现选择性结合。

术语“表达系统”是指核酸分子，其中包含所需编码序列和调控序列，它们可操作相连，使得被这些序列转化或转染的宿主能够产生所编码的蛋白。为了实现转化，表达系统可以包括在载体上；但相关DNA随后也可整合到宿主染色体中。备选地，表达系统可以用于体外转录/翻译。

免疫球蛋白氨基酸序列的所有编号是根据IMGT编号方案(IMGT，the international ImMunoGeneTics，Lefranc et al.，1999，Nucleic Acids Res.27：209-212)。

对于本发明的目的而言，术语“结合剂”或“配体”是指结合对的一员，尤其是有可能作为针对结合伴侣的结合结构域的结合多肽。结合伴侣的实例包括具有功能性相互作用的成对结合剂，如受体与配体结合，抗体与抗原或受体结合，药物与靶结合，以及酶与底物结合。

用于本发明目的的术语“融合蛋白”或“嵌合融合蛋白”应是指，由基因包，外表面结构的至少一部分(诸如外壳蛋白)，可选还有接头序列，以及结合剂组成的分子。融合蛋白由载体编码，所述载体有结合剂的基因和在基因包表面展示一个拷贝的结合剂的信息。

用于本发明目的的术语“细胞毒活性(cytotoxic或cytotoxic activity)”应是指，抗细胞抗原的任何特异性分子，它们与抗原结合后，激活补体途径或激活杀伤细胞，导致细胞裂解或触发凋亡。具体地，它是指效应细胞引起细胞毒T细胞或介导以下活性的细胞活化的活性，所述活性是，介导抗体依赖性细胞型细胞毒性(ADCC)，补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或细胞吞噬(ADCP)。它还指凋亡效应，由此触发程序性细胞死亡(PCD)。本发明的模块抗体因此杀伤被抗体包裹的靶细胞，可选地通过与效应细胞的Fc受体结合或通过诱导程序性细胞死亡来完成。

“支架”应是指，构建多肽的变体或所有组成成分时，用于支持多肽分子结构的天然或人工临时框架。它通常是维持亲代分子的三级结构或功能的多肽结构域的模块系统。示例性支架是模块抗体，其可以被诱变以在所述支架内产生变体，从而获得文库。

用于本发明目的的术语“支架配体”应是指，与模块抗体的支架或主链结合，从而确定所述模块抗体的分子结构或基本功能和特异性的配体。在优选情况下，支架配体是功能性配体，通过结合来介导生物功能，象效应配体一样。在备选实施方案中，支架配体是功能性配体，其是被CDR区或结构环区结合的特异性靶。相同的支架配体可以与模块抗体的多个变体结合，而与它们的靶特异性无关。通常，支架配体结合位点的存在提示变体被表达并且正确折叠。因此，支架配体与其结合位点的结合提供一种从多肽的所有组成成分预选(preselecting)、共选(coselecting)、鉴定和筛选功能性多肽的方法。设计模块抗体的变体使之保持对支架配体的结合特性，避免制备出无功能的变体，例如因引入基本上不能结合任意靶或效应配体的突变、折叠突变体或表达突变体所致。这类无功能的突变体有时由构建多肽所有组成成分时的常规随机化和变异步骤产生。提供与支架配体结合的功能性突变体允许本领域技术人员制备富含功能性、良好折叠和高表达的库成员的模块抗体文库。例如，所述支架可以是亲本Fab，且至少20％，优选至少30％，更优选至少40％的亲本Fab变体与所述亲本Fab的CDR-靶结合。

用于本发明目的的术语“效应配体”应是指，介导效应子功能的配体，象效应分子。示例性的效应配体是干扰免疫球蛋白的Fc受体或Fc受体样分子。Fc受体是在一些细胞(包括自然杀伤细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，和肥大细胞)表面发现的、负责免疫系统的保护功能的蛋白。其名称来源于其对称为Fc(可结晶的片段)的抗体部分的结合特异性。Fc受体结合那些与感染的细胞或侵入病原体粘附的抗体。它们的活性刺激吞噬细胞或细胞毒细胞，通过抗体介导的细胞吞噬作用(ADCP)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，破坏微生物或被感染的细胞。有数种不同类型的Fc受体，根据它们识别的抗体类型进行分类；例如，结合IgG(最常见的抗体类型)的那些被称为Fc-gamma受体(FcγR)，结合IgA的那些被称为Fc-alpha 受体(FcαR)，结合IgE的那些被称为Fc-epsilon受体(FcεR)。等同于效应配体、并因此包括在该定义中的是，识别模块抗体(诸如蛋白A)内相同或类似结合位点的任意替代配体。

所有FcγRs都属于免疫球蛋白超家族，是诱导吞噬已被调理(被包裹)的微生物时最重要的Fc受体。该家族包括数个成员；例如FcγRI(CD64)，FcγRIIA(CD32a)，FcγRIIB(CD32b)，FcγRIIIA(CD 16a)，FcγRIIIB(CD16b)；它们因为不同的分子结构而在抗体亲和力方面不同。例如，FcγRI对IgG的结合比FcγRII和FcγRIII更强，并具有由3个免疫球蛋白(Ig)-样结构域组成的胞外部分，比FcγRII和FcγRIII多一个结构域。这些特性允许FcγRI通过单个IgG分子(或单体)活化，而后两种Fcγ受体必须结合免疫复合物内的多个IgG分子才能被活化。

另一FcR在多种细胞类型中表达，与MHC I类分子结构相似。该受体还结合IgG，并与保护(preservation)该抗体有关。但是，因为该Fc受体还参与IgG从母体通过胎盘转移到胎儿或通过在乳汁中转移到吃母乳的婴儿，所以它被称为新生儿Fc受体(FcRn)。最近该受体已被显示参与IgG血清水平的自稳(homeostasis)。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是细胞介导的免疫力的一种机制，由此免疫系统的效应细胞主动裂解被特异性抗体结合的靶细胞。这是抗体作为体液免疫应答的一部分起限制和包含感染的作用的机制之一。典型的ADCC由自然杀伤(NK)细胞介导；单核细胞和嗜酸性粒细胞也可以介导ADCC。例如嗜酸性粒细胞可以通过ADCC杀伤一些被称为蠕虫(helminths)的寄生虫。ADCC属于获得性免疫应答的组成部分，因为其依赖于在先的抗体应答。

描述氨基酸时，术语“外源”应是指，新导入的氨基酸，它是天然的，但对修饰位点来说是外来的，或者它是天然氨基酸的替代物。对于抗原结合位点来说，“外源”表示该抗原结合位点不是该分子的特异性结合区天然形成的，而且，所述新修饰的结合位点结合的是外源结合伴侣，而不是该分子的天然结合伴侣。

本文使用的术语“可变结合区”有时称“CDR区”，是指具有能与抗原发生结合相互作用的差异化结构(varying structures)的分子。所述分子可以以其本来面目来使用，或掺入更大的蛋白中，由此形成这类蛋白的具有结合功能的特异性区域。所述差异化结构可以来源于结合蛋白(如免疫球蛋白或phylomers)的天然所有组成成分，或来源于合成的多样性，包括重复蛋白，avimers和anticalins。所述差异化结构还可以通过随机化技术产生，尤其是本文描述的那些。这些包括，经诱变的CDR或非CDR区，免疫球蛋白可变区或恒定区的环区。

在特异性位点具有不同修饰的修饰性结合剂被称作“变体”。支架的变体优选被归为一组，形成结合剂的文库，其可用于选出具有预定功能的文库成员。据此，抗体序列优选通过例如诱变方法进行随机化。根据优选的实施方案，结合剂的环区，诸如包含一个或多个环内位置、或位于末端位置、可能对结合位点有贡献的亲本抗体序列，优选被突变或修饰以产生文库，优选通过随机、半随机或尤其是通过定点随机诱变法，尤其是删除、交换或引入随机生成的插入序列至多个环中或环区域内，优选至CDR环区或结构环区，其可能包括末端序列，它们位于抗体域或结构的一个末端。

另外优选的是应用组合方法。可以使用任一种的已知诱变方法，其中包括盒诱变(cassette mutagenesis)。这些方法可用于在本发明免疫球蛋白的目标位置进行氨基酸修饰。在一些情况下，位置是随机选择的，例如利用任意可能的氨基酸或选出优选的氨基酸以将环序列随机化，或利用简化规则进行氨基酸变化。例如所有残基优选可以突变为特定氨基酸，诸如丙氨酸，这称为氨基酸扫描或丙氨酸扫描。这类方法可以伴随更复杂的工程化方法，后者使用选择法来筛选更高水平的序列多样性。

本发明的分子量小于60kD或最多为60kD的细胞毒模块抗体比全长抗体要小。优选的大小是最多55kD。模块抗体单个结构域通常具有10-15kD的分子大小，因此基于4个模块抗体结构域或由4个所述域组成的分子具有40-60kD的大小，这取决于糖基化或任何额外偶联的药理学活性物质，例如毒素或肽。

优选形式是由模块抗体结构域组成的寡聚体，优选最多4个结构域，更优选3个结构域，更优选基于2个结构域，所述寡聚体优选包含异二聚体如Fab，或同二聚体如Fc。基于5个模块抗体结构域或更多的组合的形式通常被认为不具有小型抗体片段的特别优势，即易于在各种表达系统中表达和穿透组织的优势。

提供本发明优选模块抗体作为单域抗体是可行的。但是，抗体结构域在表达时倾向于二聚化，成为同二聚体(例如Fc)或异二聚体(例如Fab)。二聚结构因此被认为是提供稳定分子的基础。优选的免疫球蛋白结构域二聚体选自单域二聚体，例如VH/VL，CH1/CL(kappa或lambda)，CH2/CH2和CH3/CH3。模块抗体结构域的二聚体或寡聚体还可以为单链或双链分子，尤其是将一个结构域的C端连结到另一结构域的N端的那些。

结合伴侣(binding partner)是通常通过非共价相互作用彼此特异性结合的试剂。结合伴侣的实例包括具有功能性相互作用的成对结合剂，诸如受体结合配体，抗体结合抗原，药物结合靶，酶结合底物。结合伴侣已在多个治疗、诊断、分析和工业用途中得到应用。最重要的结合对是抗体或免疫球蛋白，其片段或衍生物。在大多数情况下需要这类结合剂的结合来介导生物学效应或功能，即“功能性相互作用”。

根据本发明的具体实施方案，细胞毒模块抗体是结合剂，其是人或小鼠来源的免疫球蛋白，可用于各种目的，尤其是用于药物组合物。当然，修饰的免疫球蛋白也可以是人源化或嵌合的免疫球蛋白。

结合剂(为人免疫球蛋白)优选选自或源自IgA1，IgA2，IgD，IgE，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和IgM。小鼠免疫球蛋白结合剂优选选自或源自IgA，IgD，IgE，IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG2C，IgG3和IgM。

这类结合剂优选包括重链和/或轻链或其部分。本发明修饰的免疫球蛋白可以包括重链和/或轻链，至少一个可变区和/或恒定区，或其包括迷你结构域的部分。

恒定区是免疫球蛋白分子恒定部分的免疫球蛋白折叠单位，也称为恒定区的结构域(例如CH1，CH2，CH3，CH4，Ck，Cl)。

可变区是免疫球蛋白可变部分的免疫球蛋白折叠单位，也称为可变区的结构域(例如Vh，Vk，Vl，Vd)。

本发明的示例性模块抗体由选自具有至少一个环区的CH1，CH2，CH3，CH4，Igk-C，IgI-C，其组合、衍生物或包括迷你结构域的部分组成，其特征在于所述至少一个环区包括至少一个氨基酸修饰以形成至少一个修饰的环区，其中所述至少一个修饰的环区特异性结合抗原的至少一个表位。

本发明的另一模块抗体可以由具有至少一个环区的重链或轻链的可变区、其组合、衍生物或其包括迷你结构域的部分组成，其特征在于所述至少一个环区包括至少一个氨基酸修饰以形成至少一个修饰的环区，其中所述至少一个修饰的环区特异性结合抗原的至少一个表位。

本发明的模块抗体可以包括一个或更多个结构域(例如至少2，3，4，5，6，10个结构域)。如果模块抗体中存在不止一个结构域，则这些结构域可以是相同的类型或不同的类型(例如CH1-CH1-CH2，CH3-CH3，(CH2)₂-(CH3)₂，有或者没有铰链区)。当然单个结构域的排列顺序也可以是任意(例如CH1-CH3-CH2，CH4-CH1-CH3-CH2)。

本发明优选涉及抗体的部分，诸如IgG，IgA，IgM，IgD，IgE等等的部分。本发明的模块抗体也可以是功能性抗体片段诸如Fab，Fab2，scFv，Fv，Fc，Fcab^TM，抗原结合性Fc，或其部分，或免疫球蛋白的其它衍生物或组合诸如minibodies，可变区重链和轻链的结构域(诸如dAb，Fd，VL，包括Vlambda和Vkappa，VH，VHH)以及由至少两个结构环连接的免疫球蛋白区两条beta-链组成的迷你结构域，作为分离的结构域或在天然结合的分子的群体中。本发明的具体实施方案涉及抗体分子的Fc片段，作为通过修饰氨基酸序列而形成的抗原结合性Fc片段(Fcab^TM)，或作为受体、肽或其它抗原结合模块(诸如scFv)的偶联物或融合体。

模块抗体可以作为分离的多肽或组合分子使用，例如通过与其它肽或多肽重组、融合或偶联的技术。所述肽优选与免疫球蛋白结构域序列同源，优选至少5个氨基酸长，更优选至少10或甚至至少50或100个氨基酸长，并至少部分构成免疫球蛋白结构域的环区。优选的结合特征涉及预先确定的表位结合、亲和力和亲合力。

本发明的模块抗体还可进一步与一个或更多个修饰的模块抗体或未修饰的模块抗体或其部分组合以获得组合模块抗体。组合优选通过重组技术获得，还可以通过吸附、静电相互作用等等或通过有或没有接头的偶联或化学结合来获得。优选的接头序列是天然接头序列或功能上合适的人工序列。

通常本发明的模块抗体可以用做结构单元(building block)，以便与其它模块抗体或生物活性物质或分子在分子水平组合。优选将至少一个通过可变或非可变序列(例如结构环)与特定伴侣结合的抗体与至少一个其它结合分子(其可以是抗体，抗体片段，可溶性受体，配体或另一抗体结构域，或其结合模块)在分子水平组合。其它组合涉及蛋白性质的分子，核酸，脂质，有机分子和碳水化合物。

本发明的工程化分子可以作为独立的蛋白，以及融合蛋白或衍生物来用，最常见的是，在修饰之前或之后融合，以成为更大的结构(例如完整抗体分子或其部分)的部分。根据本发明制得的免疫球蛋白或融合蛋白因此也包含Fc片段，Fab片段，Fv片段，单链抗体，尤其单链Fv片段，双特异性或多特异性scFv，双价体(diabodies)，单价体(unibodies)，多价体(multibodies)，多价或多聚的免疫球蛋白结构域及其它。有可能利用工程化的蛋白产生单特异性、双特异性、三特异性和甚至同时载有更多特异性的分子。通过恩发明，还可根据这类分子的计划用途的要求同时控制和预选结合的效价。

根据本发明，模块抗体可选的具有针对抗原的一个或更多个结合区，包括特异性结合细胞表面靶的结合位点和介导效应子功能的结合位点。针对一个或更多个抗原的抗原结合位点可以由CDR区或任意其它天然受体结合结构呈现，或可以被导入可变区或恒定区结构的抗体结构域的结构环区。用于检测结合位点结合特性的抗原可以是天然存在的分子或化学合成的分子或重组分子，其可以位于溶液或悬浮液中，例如位于颗粒(诸如固相)上或颗粒(诸如固相)中，在细胞上或细胞中或病毒表面。优选免疫球蛋白与抗原的结合在该抗原仍然粘附或结合天然状态下的分子和结构时来测定。从而有可能鉴定和获得最适于诊断或治疗用途的那些修饰的免疫球蛋白。

模块抗体或免疫球蛋白结构域可以根据本发明进行修饰(本文术语免疫球蛋白和抗体可以互换使用)，所述修饰优选在免疫球蛋白结构域、或其末端序列(优选C-端序列)部分、和/或其包含环(CDR-环或非-CDR环)的环区部分进行，结构环是优选的修饰或诱变位点。根据具体实施方案，结构环区也包括末端序列，其负责抗原结合。在一些情况下，优选使用指定的经修饰的结构环或结构环区或其部分，作为用于结合或组合目的的分离的分子。

尤其优选本发明的模块抗体通过结构环和/或CDR环的至少一部分结合所述细胞表面靶。

在备选实施方案中，优选本发明的模块抗体通过结构环和/或CDR环的至少一部分结合所述效应配体，或这类效应配体的替代配体，例如蛋白A，从而介导效应子功能。

在优选实施方案中，结合剂利用其天然或修饰的结合结构，或新形成的结合位点，与相同抗原或不同抗原的至少两个这类表位(彼此相同或不同)特异性结合。

在结合剂的优选域结构中，优选修饰或随机化模块抗体的至少一个环区或末端区，导致一个或更多个核苷酸或氨基酸的取代、缺失和/或插入，优选点突变，或甚至全环的交换，更优选改变至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15，最多30个氨基酸。由此修饰的序列包括：未包含在环的保守区内的氨基酸，新导入的氨基酸(是天然存在的，但对改造位点来说是外源的)，或是天然氨基酸的取代。

但是，插入结合剂环区的氨基酸最大数目优选不超过30，优选25，更优选最多20个氨基酸。氨基酸的取代和插入优选通过本领域已知的和本专利申请公开的方法，使用所有可能的氨基酸或用于随机化目的筛选的优选氨基酸随机或半随机进行。

修饰位点可以位于特定的单个环或环区，尤其是结构环或结构环区。环区通常由至少两个，优选至少3个或至少4个彼此邻接的环组成，它们可能通过形成抗原结合位点或抗原结合口袋而负责结合抗原。优选一个或更多个修饰位点位于10个氨基酸的区域内，更优选位于20，30，40，50，60，70，80，90直至100个氨基酸内，尤其是结构区内，以形成使抗原可以空间上接近环区的表面或口袋。

在这方面，优选修饰在CH1、CH2、CH3和CH4的环区中进行，尤其是以下范围：氨基酸7-21，氨基酸25-39，氨基酸41-81，氨基酸83-85，氨基酸89-103和氨基酸106-117，或者在末端序列中，优选在与抗体结构域的C-端或N-端相距6个氨基酸的范围内。

在另一优选实施方案中，包括氨基酸92-98的结构环区的改造与包括氨基酸8-20的结构环区的改造组合。

上述鉴定的相应免疫球蛋白的氨基酸区包括待改造的环区。优选，包括氨基酸92-98的结构环区的改造与一个或更多个其它结构环中的改造组合。

在另一优选实施方案中，包括氨基酸92-98的结构环区的改造与包括氨基酸41-45.2的结构环区的改造组合。

最优选包括氨基酸92-98，氨基酸41-45.2和氨基酸8-20的各个结构环中的每一个包含至少一个氨基酸改造。

在另一优选实施方案中，包括氨基酸92-98，氨基酸41-45.2，和氨基酸8-20的各个结构环中的每一个包含至少一个氨基酸改造。

根据另一优选实施方案，位于CH3的15-17，29-34，41-45.2，84-85，92-100，和/或108-115位的氨基酸残基被改造。

优选人来源Igk-C和IgI-C的改造在环区的以下区域进行：氨基酸8-20，氨基酸26-36，氨基酸41-82，氨基酸83-88，氨基酸92-100，氨基酸107-124和氨基酸123-126，或者在末端序列中，优选在与抗体结构域的C-端或N-端相距6个氨基酸的范围内。

优选小鼠来源Igk-C和IgI-C的环区改造在以下区域的位置进行：氨基酸8-20，氨基酸26-36，氨基酸43-79，氨基酸83-85，氨基酸90-101，氨基酸108-116和氨基酸122-126。

根据本发明优选用作治疗剂的另一优选免疫球蛋白，由具有至少一个环区(优选结构环区)的重链、或轻链、或其包含迷你结构域的部分的可变区组成，其特征在于所述至少一个环区包括至少一个氨基酸修饰以形成至少一个修饰环区，其中所述至少一个修饰的环区形成如上所述的相关结合位点。

根据一个具体实施方案，本发明优选使用的免疫球蛋白可以包含位于可变区内的改造，所述可变区选自VH，Vkappa，Vlambda，VHH和其组合。更具体地，它们包含至少一个修饰，所述修饰位于氨基酸7-22，氨基酸39-55，氨基酸66-79，氨基酸77-89或氨基酸89-104内(其中结构域氨基酸位置的编号是IMGT编号)，或者位于末端序列中，优选在与抗体结构域的C-端或N-端相距6个氨基酸的范围内。

在一个具体实施方案中，本发明优选使用的免疫球蛋白的特征在于，人来源VH或Vkappa或Vlambda的环区包括位于氨基酸7-22，氨基酸43-51，氨基酸67-77，氨基酸77-88，和氨基酸89-104，最优选氨基酸12-17位，氨基酸45-50位，氨基酸68-77位，氨基酸79-88，和氨基酸92-99位内的至少一个修饰，其中结构域氨基酸位置的编号是IMGT编号。

作为可能选出用于修饰的人来源免疫球蛋白可变区的结构环区，优选位于以下区域：氨基酸8-20，氨基酸44-50，氨基酸67-76，氨基酸78-87，和氨基酸89-101，或者位于末端序列中，优选在与抗体结构域的C-端或N-端相距6个氨基酸的范围内。

根据优选实施方案，作为可能筛选用于改造目的的小鼠来源免疫球蛋白可变区的结构环区优选位于以下区域：氨基酸6-20，氨基酸43-52，氨基酸67-79，氨基酸79-87，和氨基酸91-100，或者在末端序列中，优选在与抗体结构域的C-端或N-端相距6个氨基酸的范围内。

根据本发明优选用作治疗剂的免疫球蛋白还可以是骆驼来源。骆驼抗体只包括一条重链，与由轻链和重链组成的正常抗体具有相同的抗原亲和力。因此骆驼抗体比例如人抗体小得多，这允许它们穿透严密的组织到达抗原，而更大的蛋白无法到达。此外，在临床重要化合物的设计、生产或应用中，骆驼的重链抗体比普通抗体具有优势：相对较简单，高亲和力和特异性以及到达活性位点并与其相互作用的潜力。

根据本发明另一优选实施方案，骆驼来源的模块抗体或免疫球蛋白的结构环区被改造，例如在VHH内，在氨基酸7-19，氨基酸43-55，氨基酸68-76，氨基酸80-87和氨基酸91-101的区域内，或者在末端序列中，优选在与抗体结构域的C-端或N-端相距6个氨基酸的范围内。

本发明优选的产生模块抗体的方法涉及，改造模块抗体(其特异性结合至少一个第一表位，并在结构环区内的至少两个位点或环的每一个中包含修饰)，并确定所述结构环区与至少一个第二表位的特异性结合，其中未改造的结构环区(非CDR区)不与所述至少一个第二表位特异性结合。因此，对第一抗原特异的抗体或抗原结合结构可以通过以下方式改进：添加抗第二抗原的另一效价或特异性(其特异性可以是相同的，针对不同表位或相同表位)，以增加效价或获得双特异性、寡特异性或多特异性分子。

另一方面优选使用包含与效应分子或免疫细胞相互作用的天然结构的模块抗体，优选与效应配体结合。所述天然结构保持不变或为了增强效应子功能而进行改造。针对例如Fc受体的结合位点被描述位于CH2和/或CH3结构域区，可以通过公知的技术进行诱变。

ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性，是通过具有识别结合抗体恒定区的Fc受体的细胞对抗体包被的靶细胞的杀伤。大部分ADCC由在其表面具有Fc受体FcgammaRIII或CD16的NK细胞介导。典型分析法使用靶细胞，例如Ramos细胞，在添加新分离的效应细胞前与系列稀释的抗体温育。然后将ADCC分析物进一步温育数小时，检测细胞毒活性％。通常靶∶效应物比例为约1∶16，但可以是1∶1直至1∶50。

补体依赖性细胞毒性(CDC)是一种杀伤细胞的机制，其中与靶细胞表面结合的抗体固定补体，导致组装膜攻击复合物，其在靶细胞膜上穿孔，导致随后细胞裂解。常规使用的CDC分析法按照ADCC测定法的相同步骤，但是，利用包含补体的血清代替效应细胞。

本发明模块抗体的细胞毒活性经ADCC或CDC分析法测定，当与对照相比细胞裂解百分比显著增加时，证明有细胞毒活性。与ADCC或CDC相关的细胞毒活性优选测量的是绝对百分比的增长，其优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％。

抗体依赖性细胞吞噬作用，即ADCP(有时称为ADPC)，通常与培养的人细胞的细胞裂解一起被研究。可以如下确定抗体介导的吞噬细胞(通常人单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞)的吞噬。可以将纯化的单核细胞与细胞因子一起培养以增强FcγRs的表达或诱导分化为巨噬细胞。然后用靶细胞进行ADCP和ADCC分析。测定吞噬作用，表示为通过流式细胞术检测的阳性细胞百分比。通过吞噬细胞对抗体-抗原复合物的显著摄取，证明阳性ADCP活性。与ADCP相关的细胞毒活性优选测量的是吞噬细胞摄取抗体-抗原复合物的绝对百分比，其优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％。

在典型分析法中，将PBMC或单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞，按照1×10⁵活细胞的浓度，重悬于96孔板的RF2培养基(添加2％FCS的RPMI 1640)中，100ml/孔。表达靶抗原(例如Her2/neu抗原)的相应靶细胞，以及SKBR3细胞，利用PKH2绿色荧光染料染色。随后将1×10⁴PKH2-标记的靶细胞和不同浓度(例如1-100μg/ml)的Her 2特异性(IgG1)抗体(或模块抗体)或小鼠IgG1同种型对照(或模块抗体对照)添加到PBMCs的孔中，在200ml的终体积中37℃温育24小时。温育后，利用EDTA-PBS收集PBMCs或单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞和靶细胞，将其转移到96孔V形底的板。将板离心并吸出上清。细胞用100ml偶联RPE的抗CD11b、抗CD14和人IgG的混合物复染，混合后在冰上温育60分钟。清洗细胞，并用2％甲醛-PBS固定。在最适门控条件下，利用例如FACS Calibur进行双色流式细胞分析。在FL-1通道(发射波长，530nm)中检测到PKH2标记的靶细胞(绿色)，在FL-2通道(发射波长，575nm)中检测到RPE标记的PBMC或单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞(红色)。剩余的靶细胞被定义为PKH2⁺/RPE^-双重标记的细胞(PKH2⁺/RPE^-)，它们被认为代表被PBMC或单核细胞或单核细胞来源的巨噬细胞吞噬的靶。利用下列等式计算靶细胞的吞噬：吞噬百分比＝100×[(双阳性百分比)/(双阳性百分比+剩余靶百分比)]。所有试验通常一式双份或一式三份，结果表示为平均值6SD。

凋亡活性优选用确定染色的细胞或死亡细胞的标准方法来测量。为了测量坏死和凋亡，也可以应用细胞毒分析。这些试验可以是测量细胞膜通透性的放射性和非放射性试验，因为染色的细胞变得容易渗漏，或可以是测量线粒体代谢活性下降的比色试验；死细胞中的线粒体不能代谢染料，活细胞中的线粒体能。

也可以测定凋亡的早期指标，如细胞群体或单个细胞中的DNA片段化(其中凋亡的DNA断成不同长度的片段)，膜不对称性的改变(基于磷脂酰丝氨酸和膜联蛋白V的试验)，测量凋亡性caspases的活化，或测量线粒体释放细胞色素C和AIF到胞浆中的情况。

本发明的模块抗体优选的细胞毒活性相当于，在相应的回体(ex vivo)细胞裂解试验中测得的胞解活性的至少20％。

优选地，本发明的模块抗体的细胞毒活性是，在基于细胞的试验中，以EC50＜10^-8M，优选在纳摩尔范围或更低范围，介导细胞裂解或细胞杀伤的活性。

本发明模块抗体的效应子功能优选是生物学细胞毒活性，其通常不同于任意合成的细胞毒活性，例如通过可以与免疫球蛋白结构偶联的毒素带来的活性。毒素通常不活化效应分子和生物学防御机制。因此，本发明模块抗体优选的细胞毒活性是生物学细胞毒活性(通常是免疫刺激性)，导致有效的细胞裂解。

细胞毒活性进一步与简单的细胞抑制效应区分，在后者中，物质通过例如下列机制来抑制细胞生长：与生长因子受体结合，由此阻断生长因子的功能；或者抑制血管新生。细胞毒活性基本上被认为是主动攻击以杀灭细胞，因此导致细胞死亡或裂解，故而被认为是高效率地快速减少恶性细胞或被感染的细胞的数量的方法。与细胞毒化合物相比，细胞生长抑制剂不会马上杀死细胞，仅仅是减少细胞生长和增殖，因此被认为对于治疗目的而言作用较小。

本发明的模块抗体可以特异性结合任何种类的结合分子或结构，尤其是抗原，蛋白性质的分子，蛋白，肽，多肽，核酸，聚糖，碳水化合物，脂质，有机分子，尤其是小有机分子，无机分子，或其组合或融合物，包括PEG，前体药物或药物。本发明优选的模块抗体可以包括至少两个环或环区，从而每一环或环区可以特异性结合不同的分子或表位。

优选靶抗原选自细胞表面抗原，包括受体，尤其是选自erbB受体酪氨酸激酶(诸如EGFR，HER2，HER3和HER4，尤其是这类受体胞外结构域的那些表位，例如4D5表位)，TNF受体超家族的分子，诸如Apo-1受体，TNFR1，TNFR2，神经生长因子受体NGFR，CD40，T细胞表面分子，T细胞受体，T细胞抗原OX40，TACI受体，BCMA，Apo-3，DR4，DR5，DR6，诱饵受体，诸如DcR1，DcR2，CAR1，HVEM，GITR，ZTNFR-5，NTR-1，TNFL1但不限于这些分子，B细胞表面抗原，诸如CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，实体瘤或血液学癌细胞的抗原或标记物，淋巴瘤或白血病的细胞，其它血细胞包括血小板，但不限于这些分子。

根据另一优选实施方案，靶抗原选自由诸如上皮细胞，实体瘤细胞，被感染的细胞，血细胞，抗原呈递细胞和单核细胞等细胞呈递的抗原。由细胞表达或过表达的靶抗原是优选的靶，其选自肿瘤相关抗原，尤其是EpCAM，肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)，肿瘤相关抗原CA 125，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)，表达Lewis Y相关碳水化合物的肿瘤相关抗原，癌胚抗原(CEA)，CEACAM5，HMFG PEM，粘蛋白MUC1，MUC18和细胞角蛋白肿瘤相关抗原，细菌抗原，病毒抗原，变应原，变态反应相关分子IgE，cKIT和Fc-epsilon-受体1，Irp60，IL-5受体，CCR3，红细胞受体(CR1)，人血清白蛋白，小鼠血清白蛋白，大鼠血清白蛋白，Fc受体，例如新生儿Fc-gamma-受体FcRn，Fc-gamma-受体Fc-gamma RI，Fc-gamma-RII，Fc-gamma RIII，Fc-alpha-受体，Fc-epsilon-受体，荧光素，溶菌酶，toll样受体9，红细胞生成素，CD2，CD3，CD3E，CD4，CD11，CD11a，CD14，CD16，CD18，CD19，CD20，CD22，CD23，CD25，CD28，CD29，CD30，CD32，CD33(p67蛋白)，CD38，CD40，CD40L，CD52，CD54，CD56，CD64，CD80，CD147，GD3，IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R，IL-4，IL-5，IL-6，IL-6R，IL-8，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-23，LIF，OSM，干扰素alpha，干扰素beta，干扰素gamma；TNF-alpha，TNFbeta2，TNFalpha，TNFalphabeta，TNF-R1，TNF-RII，FasL，CD27L，CD30L，4-1BBL，TRAIL，RANKL，TWEAK，APRIL，BAFF，LIGHT，VEG1，OX40L，TRAIL受体-1，Al腺苷受体，淋巴细胞毒素Beta受体，TACI，BAFF-R，EPO；LFA-3，ICAM-1，ICAM-3，整联蛋白beta1，整联蛋白beta2，整联蛋白alpha4/beta7，整联蛋白alpha2，整联蛋白alpha3，整联蛋白alpha4，整联蛋白alpha5，整联蛋白alpha6，整联蛋白alphav，alphaVbeta3整联蛋白，FGFR-3，角质细胞生长因子，GM-CSF，M-CSF，RANKL，VLA-1，VLA-4，L-选择蛋白，抗-Id，E-选择蛋白，HLA，HLA-DR，CTLA-4，T细胞受体，B7-1，B7-2，VNR整联蛋白，TGFbeta1，TGFbeta2，eotaxinl，BLyS(B-淋巴细胞刺激剂)，补体C5，IgE，IgA，IgD，IgM，IgG，因子VII，CBL，NCA 90，EGFR(ErbB-1)，Her2/neu(ErbB-2)，Her3(ErbB-3)，Her4(ErbB4)，组织因子，VEGF，VEGFR，内皮缩血管肽(endothelin)受体，VLA-4，碳水化合物诸如血型抗原和相关碳水化合物，Galili-糖基化，胃泌素，胃泌素受体，肿瘤相关碳水化合物，半抗原NP-cap或NIP-cap，T细胞受体alpha/beta，E-选择蛋白，P-糖蛋白，MRP3，MRP5，谷胱甘肽-S-转移酶pi(多抗药性蛋白)，alpha-颗粒膜蛋白(GMP)140，地高辛，胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和睾丸PLAP样碱性磷酸酶，运铁蛋白受体，类肝素酶I，人心脏肌球蛋白，糖蛋白Ilb/IIIa(GPIIb/IIIa)，人巨细胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白，HIVgpl20，HCMV，呼吸道合胞病毒RSV F，RSVF Fgp，VNR整联蛋白，Hep Bgpl20，CMV，gpIIbIIIa，HIV IIIB gpl20 V3环，呼吸道合胞病毒(RSV)Fgp，单纯疱疹病毒(HSV)gD糖蛋白，HSV gB糖蛋白，HCMV gB包膜糖蛋白，产气荚膜梭菌毒素和其片段。

本发明优选的模块抗体以高亲和力结合所述靶抗原，特别是以高结合率和/或低解离率，或高的结合亲合力。通常，Kd＜10^-9M的结合剂被认为是高亲和力结合剂。根据本发明同样可以提供Kd低于10^-6直至10^-9M的中等亲和力结合剂，优选与亲和力成熟方法联用。

亲和力成熟是一种方法，用这种方法可以产生对抗原的亲和力增加的抗体。抗体发生结构变化(包括氨基酸诱变，或因免疫球蛋白基因节段发生体细胞突变所致)，导致产生抗原结合位点的变体，选出更大的亲和力。亲和力成熟的模块抗体可以显示比亲本抗体大几个对数级的亲和力。单个亲本抗体可以进行亲和力成熟。备选地，具有相似的靶抗原结合亲和力的模块抗体库也可以被看作要进行改变的亲本结构，以获得亲和力成熟的单个抗体或这类抗体的亲和力成熟库。

本发明模块抗体优选的亲和力成熟变体显示结合亲和力至少增加10倍，优选至少增加100倍。亲和力成熟可以在利用相应的亲代分子库进行筛选的过程中使用，所述筛选利用中等结合亲和力的模块抗体来获得具有Kd＜10^-8M的特异性靶结合性和/或IC50＜10^-8M功效的本发明模块抗体。可选的，结合功效或亲和力可以通过本发明模块抗体的亲和力成熟进一步增加，以获得与低于10^-9M的Kd或IC50对应的高值，优选低于10^-10M或甚至低于10^-11M，最优选在皮摩范围。

IC50亦称EC50或50％饱和浓度，是度量模块抗体结合功效的测量值。它是在平衡或饱和条件下，产生50％最大可能结合的结合剂摩尔浓度。拮抗剂的功效通常由其IC50值定义(此处理解为EC50值)。对于指定拮抗剂来说，这可以通过确定引发最大结合的半饱和水平所需拮抗剂浓度来计算。阐明IC50或EC50值有利于比较具有类似效应的抗体或抗体变体的功效，尤其当在饱和结合试验而非竞争试验中测定时。在这种情况中，它被当作浓度来考虑，其在体内(in vivo)测定胞浆浓度，以获得半最大(50％)效应。IC50或EC50越低，模块抗体的功效越高，抑制最大生物反应(例如效应子功能或细胞毒活性)所需的抗体浓度越低。抗体浓度更低还可能与更少的副作用有关。

抗体的亲和力通常以抗体浓度表征，在该浓度，半数抗原结合位点被占据，该浓度称为解离常数(Kd，或K_D)。

抗体的亲和力在饱和结合试验中测定时，通常与IC50很好地关联。拮抗剂对其结合位点的亲和力(Ki)，被理解为其结合受体的能力，这决定了结合的持续时间和相应激动剂的活性。利用亲和力成熟来增加亲和力的措施常常也增加结合功效，导致在相同的Kd值范围内，IC50值相应降低。

可以利用本领域公知的饱和结合试验测定IC50和Kd值。与竞争试验相反，饱和结合试验提供出不依赖于竞争剂浓度的值，因此是可比的值，其可能指示体内结合亲和力。

本发明的模块抗体优选与标记或报告分子偶联，所述标记或报告分子选自有机分子，酶标记，放射性标记，有色标记，荧光标记，生色标记，发光标记，半抗原，地高辛配基，生物素，金属复合物，金属，胶体金和其混合物。与标记或报告分子偶联的修饰型免疫球蛋白可以在例如分析系统或诊断方法中使用。

本发明的模块抗体可以与允许在例如结合试验(例如ELISA)和结合研究中简单地检测所述偶联物的其它分子偶联。

在优选实施方案中，抗体变体利用一种或多种基于细胞的试验或体内试验来筛选。为进行这类试验，通常外源添加纯化或未纯化的修饰型免疫球蛋白，使细胞暴露于一个个的免疫球蛋白或属于文库的免疫球蛋白群体。这些试验通常是，但不总是，基于免疫球蛋白的功能；即，抗体结合其靶并介导一些生化事件的能力，例如效应子功能，配体/受体结合抑制，凋亡，等等。这类试验常涉及，监测细胞对抗体的应答，例如细胞存活，细胞死亡，细胞形态学的变化，或转录活化诸如天然基因或报告基因的细胞表达。例如，这类试验可以测量抗体变体引发ADCC，ADCP，CDC或凋亡的能力。对于一些试验来说，除了靶细胞之外，可能需要添加其它细胞或组分，例如血清补体，或效应子细胞诸如外周血单核细胞(PBMCs)，NK细胞，巨噬细胞，等等。所述其它细胞可以来自任何生物，优选人，小鼠，大鼠，兔，和猴。模块抗体可以引起表达所述靶的一些细胞系的凋亡，或它们可以介导已经添加到试验中的免疫细胞对靶细胞的攻击。监测细胞死亡或活力的方法是本领域已知的，包括染料，免疫化学制品，细胞化学制品，和放射性试剂的使用。例如，caspase染色试验可能能检测凋亡，放射性底物或荧光染料诸如alamar blue的摄取或释放可能能监测细胞生长或活化。

在优选实施方案中，可以使用基于DELFIART EuTDA的细胞毒性试验(Perkin Elmer，MA)。备选地，死亡或损坏的靶细胞可通过测量一种或多种天然胞内成分例如乳酸脱氢酶的释放来监测。

转录活化也可以作为基于细胞的试验中分析功能的方法。在这种情况下，应答可以通过分析可能被上调的天然基因或免疫球蛋白来监测，例如可以检测一些白细胞介素的释放，或经由报告子构建体来获得结果。基于细胞的试验还可以涉及检测细胞的形态改变，作为对模块抗体的存在的应答。这类试验所用的细胞可以是原核或真核类型，本领域已知的多种细胞系都可以使用。备选地，基于细胞的筛选用已被编码变体的核酸转化或转染的细胞进行。也就是说，抗体变体不从外源添加给细胞。例如，在一个实施方案中，基于细胞的筛选利用细胞表面展示。可以使用能在细胞表面展示修饰的免疫球蛋白的融合伴侣(Wittrup，2001，Curr Opin Biotechnol，12：395-399)。

在优选实施方案中，模块抗体的免疫原性可利用一种或多种基于细胞的试验来确定。在优选实施方案中，使用回体T细胞活化试验定量免疫原性。在该方法中，来自匹配供体的抗原呈递细胞和初始化(naive)T细胞用目标肽或完整抗体攻击一次或多次。然后，T细胞活化可以用多种方法检测，例如通过监测细胞因子的生成，或检测氚化胸苷的摄取。在最优选实施方案中，干扰素gamma的生成用Elispot试验监测。

本发明模块抗体的生物学特性可以在细胞、组织和完整生物的实验中回体表征。本领域已知，药物常常在包括但不限于小鼠，大鼠，兔，狗，猫，猪，和猴等的动物体内测试，以便检测药物治疗疾病或疾病模型的功效，或检测药物的药代动力学，药效学，毒性和其它特性。所述动物可以被称为疾病模型。治疗剂经常在小鼠中检验，所述小鼠包括但不限于裸鼠，SCID小鼠，异种移植小鼠，和转基因小鼠(包括敲入(knockins)和敲出(knockouts))。这种实验可提供有价值的数据用于确定具有合适半衰期，效应物功能，凋亡活性，细胞毒或溶胞活性的用做治疗剂的抗体的潜力。任何生物，优选哺乳动物，可用于测试。例如，灵长类动物、猴因与人类遗传相似，可以作为合适的治疗模型，并因此可以用于测试本发明模块抗体的功效，毒性，药代动力学，药效学，半衰期，或其它特性。最终需要所述物质在人体中的试验来获批药物，因此这些实验当然也在考虑范围内。因此，本发明的模块抗体可以在人体中试验，以确定它们的治疗效力，毒性，免疫原性，药代动力学，和/或其它临床特性。尤其那些与单个细胞或细胞复合物通过至少两个结合基元结合(优选结合至少三个结构交联的靶细胞)的本发明模块抗体，被认为一旦进行细胞靶向和交联，就具有效应物活性或前凋亡或凋亡活性。多价结合提供了结合伴侣的相对较大结合(也称为交联)，这是凋亡和细胞死亡的先决条件。

本发明的模块抗体可用于广泛多种抗体产物。在一个实施方案中，本发明的模块抗体用于治疗或预防，例如作为主动或被动免疫疗法，用于制备、工业或分析用途，作为诊断剂、工业化合物或研究试剂，优选作为治疗剂。模块抗体可用于单克隆或多克隆的抗体组合物。在优选实施方案中，本发明的模块抗体用于捕获或杀伤载有靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在备选实施方案中，本发明的模块抗体用于阻断，拮抗，或刺激靶抗原，例如通过拮抗细胞因子或细胞因子受体来实现。

在另一优选实施方案中，本发明的模块抗体用于阻断，拮抗，或刺激生长因子或生长因子受体，从而介导对载有或需要靶抗原的靶细胞的杀伤。

在另一优选实施方案中，本发明的模块抗体用于阻断，拮抗，或刺激酶和酶的底物。

在优选实施方案中，给患者施用模块抗体以治疗特定病症。用于本发明目的的“患者”包括人和其它动物，优选哺乳动物，最优选人。本文“特定病症”表示可以通过施用含本发明修饰的免疫球蛋白的药物组合物而改善的病症。

在一个实施方案中，本发明的模块抗体是唯一给患者施用的治疗活性剂。备选地，本发明的模块抗体施用时组合了一种或多种其它治疗剂，包括但不限于细胞毒性剂，化疗剂，细胞因子，生长抑制剂，抗激素剂，激酶抑制剂，抗血管生成剂，心脏保护剂，或其它治疗剂。模块抗体可以与一种或多种其它治疗方案相伴施用。例如，本发明的模块抗体可以与化疗，放疗，或化疗加放疗一起给患者施用。在一个实施方案中，本发明的模块抗体可以与一种或多种抗体联合施用，后者包含或不含本发明的模块抗体。根据本发明的另一实施方案，本发明的模块抗体和一种或多种其它抗癌疗法被用于回体治疗癌细胞。本发明考虑，这种回体治疗可用于骨髓移植，尤其是自体骨髓移植。当然也考虑，本发明的抗体可与其它治疗技术诸如手术联合使用。

我们发现，多种其它治疗剂可与本发明的模块抗体一起施用。在一个实施方案中，所述模块抗体与抗血管生成剂一起施用，后者是阻断或在一定程度上干扰血管发育的化合物。抗血管生成因子可以是，例如，小分子或蛋白，例如抗体，Fc融合分子，或细胞因子，它们结合参与促进血管发生的生长因子或生长因子受体。本文优选的抗血管生成因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。在备选实施方案中，所述模块抗体与诱导或增强获得性免疫应答的治疗剂(例如靶向CTLA-4的抗体)一起施用。在备选实施方案中，修饰的免疫球蛋白与酪氨酸激酶抑制剂一起施用，后者是在一定程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在备选实施方案中，本发明的模块抗体与细胞因子一起施用。本文使用的“细胞因子”是，一个细胞群体作用于另一细胞而释放的作为细胞间介质的蛋白的总称，包括趋化因子。

药物组合物也包括在内，其中本发明的模块抗体与一种或多种治疗活性剂一起配制。通过将具有所需纯度的所述免疫球蛋白与可选的可药用载体、赋形剂或稳定剂混合，形成冻干配制剂或水溶液的形式，可以制得用于保存的本发明模块抗体的稳定配制剂。用于体内施用的配制剂优选是无菌的。这可通过滤过除菌膜或其它方法轻易地实现。本文公开的模块抗体和其它治疗活性剂还可以配制为免疫脂质体，和/或包裹在微胶囊中。

含本发明模块抗体的药物组合物，优选无菌水溶液，可以通过多种方式施用，包括但不限于，口服，皮下，静脉内，鼻内，光内(intraotically)，经皮肤，粘膜，表面局部(topically)(如，凝胶，油膏剂(salve)，洗剂，霜剂，等等)，腹腔内，肌肉，肺内(例如，购自Aradigm的AERx ^TM可吸入技术，或购自Inhale Therapeutics的Inhance^TM肺递送系统)，阴道，肠胃外，直肠，或眼内。

本发明优选的方法涉及对模块抗体通过诱变进行修饰，以获得新的结合位点。优选的诱变涉及随机化技术，其中，肽或多肽的氨基酸序列在至少一个位置被突变，由此获得随机化序列，其介导抗原结合。例如，特异性抗体序列被随机修饰，以获得编码免疫球蛋白、免疫球蛋白结构域或其部分的核酸分子，其包含至少一个核苷酸重复单元，优选在结构环编码区内或在末端区域内，具有序列5′-NNS-3′，5′-NNN-3′，5′-NNB-3′或5′-NNK-3′。在一些实施方案中，修饰的核酸包含选自以下的核苷酸密码子：TMT，WMT，BMT，RMC，RMG，MRT，SRC，KMT，RST，YMT，MKC，RSA，RRC，NNK，NNN，NNS或其任意组合(根据IUPAC进行编码)。

核酸分子的修饰可以是，向大核酸节段中引入合成的寡核苷酸，或从头合成(de novo)完整核酸分子。核酸的合成可以用三核苷酸结构单元进行，其在编码氨基酸子集时，减少无义序列组合的数目(例如Yanez et al.Nucleic Acids Res.(2004)32：e158；Virnekas et al.Nucleic Acids Res.(1994)22：5600-5607)。

本发明另一重要方面是，每个潜在的结合结构域与编码它的具体DNA或RNA分子保持物理结合，而且，融合蛋白在基因包的表面寡聚，以呈递天然的功能性寡聚结构的结合多肽。一旦鉴定出成功结合的结构域，可以很容易地获得基因用于表达、重组或进一步的工程化目的。这种结合采取的形式是“复制型基因包”，诸如病毒、细胞或孢子，它们复制并表达编码结合结构域的基因，然后将结合结构域输送到其外表面。另一形式是体外复制型基因包，诸如将编码RNA与翻译出的蛋白相连的核糖体。在核糖体展示中，遗传物质通过聚合酶的酶促扩增进行复制。

载有识别靶分子的结合剂的那些细胞或病毒核酸被分离和，必要时，被扩增。基因包优选是M13噬菌体，且所述蛋白包括M13基因III蛋白的外表面运输信号。

用于融合蛋白的优选表达系统是非抑制者宿主细胞，其对终止密码子(诸如琥珀终止密码子)敏感，并因此终止翻译。在缺乏这类终止密码子时，优选使用这类非抑制者宿主细胞，优选大肠杆菌。在存在这类终止密码子时，将使用抑制者宿主细胞。

优选在本发明的方法中，基因包的载体或质粒受转录调控元件的严密控制，培养条件经过调整以使得那些在颗粒表面展示少于两个拷贝的融合蛋白的载体或噬菌粒颗粒的量或数低于约20％。更优选，那些展示少于两个拷贝的融合蛋白的载体或噬菌粒颗粒的量，是那些展示一个或多个拷贝的融合蛋白的颗粒的量的10％以下。最优选所述量低于1％。

本发明优选使用的表达载体优选能表达结合多肽，且可以如下产生：首先，引入多个编码不同结合序列的多核苷酸，以合成结合多肽的基因文库。可以合成合适量的多个多核苷酸，将它们以可操作的组合方式连接至载体中，通过载体扩增来表达所述结合多肽的融合蛋白。备选地，可通过聚合酶链式反应扩增多个多核苷酸，以获得足够的材料用于表达。但是，这只在结合多肽由大的多核苷酸序列(例如200个以上的碱基对，或有时300个以上的碱基对)编码的情况下才是有利的。因此，优选形成多样性合成文库，使得可以从所述多样性文库选出至少一种能产生具有所需预选功能和结合性(诸如特异性)的结合多肽的表达载体。

随机改造的核酸分子可以包括上述鉴定的重复单位，其编码所有已知天然存在的氨基酸或其子集。包含修饰序列的那些文库(其中特定氨基酸子集被用于修饰目的)被称为“集中型”文库。这类文库的成员在修饰位置具有这类子集的氨基酸的概率增加，比正常高至少两倍，优选高至少3倍或甚至至少4倍。这类文库还具有受限或更少数目的文库成员，使得文库成员的实际数目达到文库成员的理论数目。一些情况下，集中型文库的文库成员数目是理论数目的10³倍以上，优选不低于10²倍，最优选不低于10倍。

本发明的文库通常包含至少10个融合蛋白或潜在结合剂或支架蛋白变体，优选至少100个，更优选至少1000个，更优选至少10⁴个，更优选至少10⁵个，更优选至少10⁶个，更优选至少10⁷个，更优选至少10⁸个，更优选至少10⁹个，更优选至少10¹⁰个，更优选至少10¹¹个，最多10¹²个，在体外展示方法，如核糖体展示方法中，甚至更高的数目也是可达到的。

在制备编码随机化文库的基因方面存在多种选择。有可能通过完全合成的方法产生DNA，其中的序列被分成重叠的片段，它们随后被制成合成的寡核苷酸。将这些寡核苷酸混合在一起，先加热到约100℃，再缓慢冷却到室温，从而彼此退火。在该退火步骤后，合成组装的基因可以被直接克隆，或在克隆前先通过PCR扩增。

备选地，可以用其它定点诱变的方法产生文库插入物，诸如Kunkel法(Kunkel TA.Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci USA.1985 Jan；82(2)：488-92)或DpnI法(Weiner MP，Costa GL，Schoettlin W，Cline J，Mathur E，Bauer JC.Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by the polymerase chain reaction.Gene.1994 Dec 30；151(1-2)：119-23.)。

对于各种目的来说，将沉默突变导入编码文库插入物的序列中是有利的。例如，可以导入限制性酶切位点，这有利于所述序列多个部分的克隆或模块交换。导入沉默突变的另一实例是“标记”文库的能力，这意味着在所选位置给予它们特定的密码子，允许它们(或从它们衍生的所选克隆)在例如后续多个步骤期间被识别，在这些步骤中，例如具有不同特征的不同文库可以混合在一起，用做淘选过程中的混合物。

本发明还提供一种产生与靶结合的模块抗体结构域的寡聚体的方法，包括以下步骤：

-提供按本发明方法制备的模块抗体结构域的寡聚体的文库

-在有支架配体存在的条件下，将所述文库与所述靶接触

-选出在有支架配体存在的条件下与所述靶结合的文库成员，和

-生产所述功能性寡聚体的制品。

支架配体可以选自效应分子、FcRn、蛋白A、蛋白G、蛋白L和CDR靶。举例来说，效应分子可以选自CD64，CD32，CD16，Fc受体。

寡聚体可以是选自VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，Fc和Fab的二聚体，或其单链。

本发明的方法可以提供含至少10²个独立克隆的文库，所述独立克隆表达模块抗体结构域或其变体的功能性寡聚体。本发明还提供预选的独立克隆的群体，其是例如亲和力成熟的，所述群体优选含至少10个，更优选至少100个，更优选至少1000个，更优选至少10000个，还更优选至少100000个独立克隆。这些含有预选的群体的文库是选出本发明的高亲和力模块抗体的优选来源。

本发明使用的文库优选包含至少10²个文库成员，更优选至少10³个，更优选至少10⁴个，更优选至少10⁵个，更优选至少10⁶个文库成员，更优选至少10⁷个，更优选至少10⁸个，更优选至少10⁹个，更优选至少10¹⁰个，更优选至少10¹¹个，最多10¹²个文库成员，它们优选源自亲代分子(指功能性模块抗体，被当作了含至少一种特定功能或结合模块的支架)，和其衍生物，以便在所述亲本模块的原始功能性结合区以外造出新的结合位点。

通常本发明的文库还包含由诱变或随机化技术产生的模块抗体的变体。这些变体包括无活性或无功能的抗体。因此，优选用合适的试验筛选任意这类文库以确定功能性效应。本发明优选的文库包含至少10²个模块抗体的变体，更优选至少10³个，更优选至少10⁴个，更优选至少10⁵个，更优选至少10⁶个，更优选至少10⁷个，更优选至少10⁸个，更优选至少10⁹个，更优选至少10¹⁰个，更优选至少10¹¹个，最多10¹²个变体或更多，以提供抗体的高度多样化多成员库，用于筛选最适合的结合剂。任何这类合成文库都可以用本文公开的诱变方法产生。

优选的文库是酵母文库，酵母宿主细胞在细胞表面显示具有生物活性的寡聚体。酵母宿主细胞优选选自糖酵母属(Saccharomyces)，毕赤酵母属(Pichia)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，裂殖酵母属(Schizisaccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，耶罗威亚酵母属(Yarrowia)和假丝酵母属(Candida)。最优选，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

本发明还提供含至少10²个独立克隆的高质量文库，所述克隆是模块抗体结构域或其变体的功能性二聚体的独立克隆，或提供优化的或预选的克隆(如亲和力成熟克隆)的群体，所述群体含至少10个与靶结合并与支架配体结合的独立克隆。靶可以是与经受氨基酸变异的亲代分子结合的配体。亲代分子可以是功能性寡聚体，尤其是功能性Fc或功能性Fab或其部分。

文库可以包含与靶结合并与支架配体结合的模块抗体结构域的功能性二聚体，且至少20％，优选至少30％，更优选至少40％的功能性二聚体与CD64结合。这对于包含CH2结构域的模块抗体如Fc支架是尤其优选的。

备选地，文库可以包含与靶结合并与支架配体结合的模块抗体结构域的功能性二聚体，且至少20％，优选至少30％，更优选至少40％的功能性二聚体与蛋白A结合。这对于包含CH2和CH3结构域的模块抗体如Fc支架是尤其优选的。

备选地，文库可以包含与靶结合并与支架配体结合的模块抗体结构域的功能性二聚体，且至少20％，优选至少30％，更优选至少40％的功能性二聚体与相同的CDR靶结合。这对于包含可变区的模块抗体，如对单个CDR靶具有特异性的Fab支架，是尤其优选的。

本领域公知，有多种展示和选择技术可用于鉴定和分离具有某些结合特征和亲和力的蛋白，包括，例如，展示技术，诸如细胞的和非细胞的展示技术，尤其是移动展示系统。在众多细胞系统中，可以使用噬菌体展示，病毒展示，酵母或其它真核细胞展示，诸如哺乳动物或昆虫细胞展示。移动系统涉及可溶形式的展示系统，诸如体外展示系统，其中包括核糖体展示、mRNA展示或核酸展示。

用于产生和筛选抗体变体的方法是本领域公知的。抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法参见Antibody Engineering，编辑Duebel & Kontermann，Springer-Verlag，Heidelberg，2001；Hayhurst & Georgiou，2001，Curr Opin Chem Biol 5：683-689；Maynard & Georgiou，2000，Annu Rev Biomed Eng 2：339-76。

本发明的文库可以被设计为专用文库(dedicated library)，其包含至少50％的特异性形式，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，或主要由特异性抗体形式组成的那些。特异性抗体形式是优选，使得本发明优选的文库选自VH文库，VHH文库，Vkappa文库，Vlambda文库，Fab文库，CH1/CL文库，Fc文库和CH3文库。以包含超过一个抗体结构域的混合分子内容物为特征的文库(诸如IgG文库或Fc文库)是特别优选的。其它优选的文库是，含T细胞受体(形成T细胞受体文库)的那些文库。进一步优选的文库是表位文库，其中融合蛋白包括具有表位变体的分子，也使得能筛选具有相似结合能力、但功能不同的竞争性分子。实例是TNFalpha文库，其中TNFalpha融合蛋白的三聚体由单个基因包展示。

以上描述参照下列实施例将更全面的理解。但是，这类实施例仅仅是代表实施本发明一种或多种实施方案的方法，不应被理解为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：构建非集中的Fcab文库(Fcab01)并在噬菌体表面展示

IgG1 Fc片段的晶体结构在Brookhaven Database的登录号为1OQO.pdb，用该结构辅助设计所述Fcab文库。

用作构建Fcab文库的基础是SEQ ID No.1所示序列。在该序列中，第一个氨基酸对应于人IgG1的Glu 216(EU编号，依据IMGT数据库(http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/H u_IGHCallgenes.html；lookup 2007 06 25)，它是人IgG1铰链区恒定重链(E)PKSCDKTHTCPPCP)的第一个残基)。SEQ ID No.1的倒数第二个残基对应于人IgG1的Gly 446(EU编号；IMGT：人IgG1CH3结构域第129位残基)。

详细分析了1oqo.pdb的结构，并目测观察了形成连接beta链的环的残基之后，决定将连接beta链E-F的环上的残基144，145和146、以及连接beta链SEQ ID No.1的环上的残基198，199，200，203和204随机化。除了这些突变的残基，另有5个残基插入到SEQ ID No.1的第198位残基处。在SEQ ID No.2中，给出了文库Fcab01的文库插入节段的序列，所有随机化的残基位置、以及5个插入的残基都用字母X表示。

通过用简并引物进行一系列PCR、再连接这些PCR产生，产生所述工程化改造的基因。为便于连接，编码SEQ ID No.1的核苷酸序列中一些密码子在不改变氨基酸序列的情况下被修饰(沉默突变)，以产生限制性位点。为了将克隆载体pHEN1(Nucleic Acids Res.1991 Aug 11；19(15)：4133-7.Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage：methodologies for displaying antibody(Fab)heavy and light chains.Hoogenboom HR，Griffiths AD，Johnson KS，Chiswell DJ，Hudson P，Winter G.)与pelB分泌信号插入在一个读码框内，在pelB分泌信号3’附近用到了NcoI限制性位点。为了进行残基随机化，选用密码子NNS(IUPAC编码，其中S表示核苷酸C和G)，其编码所有20个天然氨基酸，但弃用3个终止密码子中的2个。其它密码子例如NNB(B表示核苷酸T，C和G)也可以采用。经改造的核苷酸序列见SEQ ID No.3。该序列也包括用于克隆到噬菌体展示载体pHEN1中的限制性位点，即5’端的NcoI位点和3’端的位点。

用于装配突变的CH3结构域的PCR引物序列见SEQ ID No.4至SEQ ID No.9。

SEQ ID No.4(PCR引物EPKSNCO)

ccatggccgagcccaaatcttgtgacaaaactc

SEQ ID No.5(PCR引物CH3LSAC)

agtcgagctcgtcacgggatgggggcaggg

SEQ ID No.6(PCR引物CH3CSAC)

gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctgg

SEQ ID No.7(PCR引物CH3CHIN)

tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagccg

SEQ ID No.8(PCR引物CH3RHIN)

tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsaggtggnnsnnsgggaacgtcttctcatgctccg

SEQ ID No.9(PCR引物CH3RNOT)

agttgcggccgctttacccggagacagggagag

图1图示用于装配突变的基因的PCR片段，及其所用的的引物。

用人单克隆抗体3D6(Felgenhauer M，Kohl J，Rüker F.Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H-and L-chains of a人mono-clonal antibody specific to HIV-1-gp41.Nucleic Acids Res.1990 Aug 25；18(16)：4927.)重链cDNA作模板进行PCR反应。3种PCR产物分别用SacI和/或HindIII消化，连接在一起。该连接产物进一步用NcoI和NotI消化，连接到用于表面展示的已先用NcoI和NotI消化的噬菌粒载体pHEN1中。然后，将该连接产物经电穿孔转化到大肠杆菌(E.coli)中。多个选出的克隆通过限制性和DNA测序进行监控，发现它们包含预计的插入序列，包括正确插入的随机化序列。下列噬菌体制备步骤按照标准程序进行。简言之，连接混合物通过电穿孔转化到大肠杆菌TG1细胞中。随后，用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞中挽救噬菌体颗粒。然后，用PEG/NaCl，经两个步骤，从培养上清中沉淀出噬菌体颗粒，将其溶于水，用于通过淘选法进行选择，或贮存在-80℃。

实施例2：构建集中型Fcab文库(Fcab02)并进行噬菌体展示

按实施例1所述制得Fcab文库，其中的随机化文库位置都彻底随机化，即它们都由诸如NNS，NNB，NNK，NNN等密码子编码，或采用其它密码子。

为清楚起见，诸如N，B，S或K等字母的含义由IUPAC核苷酸模糊码定义，见下表：

表1.IUPAC核苷酸模糊码(nucleotide ambiguity code)

------------------------------------------------

符号含义核苷酸

------------------------------------------------

A A 腺苷酸

C C 胞嘧啶

G G 鸟苷酸

T T 胸腺嘧啶

U U 尿苷酸

M A或C

R A或G

W A或T

S C或G

Y C或T

K G或T

V A或C或G

H A或C或T

D A或G或T

B C或G或T

X G或A或T或C

N G或A或T或C

来源：Nomenclature for incompletely specified bases in nucleic acid sequences：recommendations 1984.A Cornish-Bowden，Nucleic Acids Res.1985 May 10；13(9)：3021-3030。

上述密码子被设计为，使所有20种氨基酸都由它们编码。优选从可能的氨基酸中进一步选子集。实例参见文献(Fellouse FA，Li B，Compaan DM，Peden AA，Hymowitz SG，Sidhu SS.Molecular recognition by a binary code.J Mol Biol.2005 May 20；348(5)：1153-62.Epub 2005 Apr 1.；Fellouse FA，Wiesmann C，Sidhu SS.Synthetic antibodies from a four-amino-acid code：a dominant role for tyrosine in antigen recognition.Proc Natl Acad Sci USA.2004 Aug 24；101(34)：12467-72.Epub 2004 Aug 11.)。允许例如只有4种不同氨基酸类型的集中文库可以通过，例如利用密码子KMT来构建，该密码子编码氨基酸Ser，Tyr，Ala和Asp。

按照与实施例1相同的方式、但用NNS密码子替代KMT密码子，构建了另一Fcab文库，命名为Fcab02。

因此，为了描述集中文库Fcab02，这时的字母“X”在SEQ ID No.2中指代“S，Y，A和D”(Ser，Tyr，Ala and Asp)。

实施例3：构建噬菌体表面展示文库，其在文库插入序列(结合伴侣)和 p3之间有额外的氨基酸序列

为了研究所展示的蛋白中潜在结合位点的可接近性，进行结合试验：将噬菌体悬液与抗-myc mAb 9E10包被的微滴板(或免疫管)反应。洗后，结合的噬菌体用抗M13-酶偶联物检测。作为对照，不展示所述蛋白融合物的辅助噬菌体、以及myc-标签与所述板反应。其它对照是，噬菌体与未包被的板反应，以及噬菌体与识别噬菌体上的p3-融合伴侣的抗血清反应。

理想的情况是，展示p3融合蛋白的噬菌体的抗myc反应性应当给出非常清楚的ELISA读数，而辅助噬菌体与抗myc-mAb的反应不应高于背景(未包被的板)。CH3二聚体通过与作为锚(anchor)的蛋白III结合而在M13噬菌体表面展示的结构是这样的，每个CH3利用具有不同长度和组成的接头锚定到蛋白III。因此，CH3二聚体优选通过两个锚来展示。

接头优化：

当被展示的分子的潜在结合位点在空间上靠近噬菌体颗粒时，位于被展示的蛋白与基因包锚定蛋白(在丝状噬菌体情况下，例如p3，p8，pX，pIX，pVII)之间的接头是尤其重要的。在利用了由多个CDR环形成的可变区和抗原结合位点、并将库成员展示为p3的氨基端融合物的抗体文库中，潜在的抗原结合位点指向背离噬菌体颗粒的方向。因此，库成员和噬菌体外壳蛋白之间的接头结构不太重要。但是改造免疫球蛋白区的底部环和进行噬菌体展示可能是一种低效步骤，降低抗原结合克隆的产率或甚至排斥它。改变库成员蛋白与其融合伴侣之间位于表面的接头可以解决或可能至少减少该问题。

为了选择(在长度和柔性以及稳定性方面)最佳的接头序列，可以制备接头文库，在其中将复制型基因包表面的锚定蛋白与因空间原因而出了名地很难选择的已知结合蛋白融合。

这种序列文库可以在长度和氨基酸含量方面不同。

在接头文库中选择最佳接头的方法取决于用途，但基本上应当是在某一方法学中选出希望具有的所有特性的方法。针对难于选择的抗原进行的富集可以产生允许库成员容易地接近该抗原的接头序列。在蛋白酶溶液中或其它苛刻条件下进行温育，或者在蛋白水解条件下(例如用老龄的微生物培养物)通过宿主细胞进行频繁传代，可以是合适的选择稳定展示接头的方法。

接头文库可通过任何公知的文库技术产生。合成的接头序列长度可以为10-500个氨基酸不等。备选的，接头可以是已知具有柔性的完整蛋白。

接头优化Fcab01：

举例来说，可以使用文库Fcab01(如实施例1所述)。首先，利用NcoI和NotI限制性酶切位点将该文库克隆入噬菌粒展示载体pHEN1。当采用这种方式克隆时，18个氨基酸残基位于Fcab01文库插入物的C端氨基酸残基与噬菌体M13 p3的N端氨基酸残基之间。该连接区的序列是SEQ ID No.10SPGKAAAEQKLISEEDLNGAATVES，解释如下：前4个残基SPGK是Fcab01文库插入物的4个C端残基，然后是氨基酸序列AAA(其是由NotI限制性酶切位点编码的氨基酸残基)，然后是序列EQKLISEEDL(其是myc表位)，然后是NGAA，其后是琥珀终止密码子，该终止密码子在大肠杆菌的琥珀抑制者菌株诸如TG1中被翻译为谷氨酰胺(Q)。SEQ ID No.10的C端4个残基TVES是存在于载体pHEN1中的噬菌体M13p3的N端4个残基。

为了构建噬菌体来展示Fcab插入物、且使Fcab(结合伴侣)与噬菌体(基因包)之间的距离加大，将5个额外残基插入Fcab插入物FcabRGD4的C端，在紧接NotI克隆位点的上游，产生克隆FcabRGD4L。FcabRGD4是一种Fcab，其在CH3结构域的EF环中插入了能与整联蛋白结合的RGD基元，并且在ELISA中结合αvβ3-整联蛋白。作为长度增加的接头序列，使用氨基酸序列EGGGS，其在噬菌体M13p3序列中出现8次。所得的FcabRGD4L氨基酸序列在克隆入pHEN1后表达为SEQ ID No.11(图5)。在SEQ ID No.11中(图5)，氨基酸残基198-204代表RGD基元，氨基酸残基237是Fcab插入物的C端残基，残基238-242代表插入的接头序列(与未修饰的pHEN1不同)，其后是myc标签、琥珀终止密码子和p3序列。

为了克隆构建体，利用PCR引物EPKSNCO(SEQ ID No.4)和CH3rlink actagcggccgcagagccaccaccctccttacccggagacagggagag(SEQ ID No.13)从pHENFcabRGD4(SEQ ID No.12)扩增FcabRGD4序列，并通过NcoI和NotI限制性酶切位点将其克隆入载体pHEN1。所得载体pHENFcabRGD4L(SEQ ID No.14/图7)在核苷酸位置3057-3071处具有额外的接头序列。

将两种噬菌粒载体pHENFcabRGD4和pHENFcabRGD4L转化入大肠杆菌TG1。随后，利用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞挽救噬菌体颗粒。然后用PEG/NaCl按照2步法从培养上清中沉淀出噬菌体颗粒，将其溶于水中，用于ELISA。

如下进行噬菌体ELISA：

噬菌体悬液与αvβ3-整联蛋白包被的微滴板(或免疫管)反应。清洗后，利用抗M13酶偶联物检测结合的噬菌体。作为对照，辅助噬菌体(其不展示蛋白融合体和myc-标签)与这些板、以及表面载有wtFcab的噬菌体颗粒反应。其它对照是，噬菌体与未包被的板反应，以及噬菌体与识别噬菌体上的Fcab融合伴侣的抗血清反应。与pHENFcabRGD4上的具有原始接头的噬菌体颗粒相比，来自pHENFcabRGD4L的具有加长接头的噬菌体颗粒更容易与αvβ3-整联蛋白反应，从而在ELISA中产生更强的信号。

噬菌体筛选是可以进行的，其中将具有wtFcab的噬菌体颗粒与少量载有FcabRGD4或FcabRGD4L的噬菌体颗粒混合。在数轮(通常3-5轮)淘选后，优先选出展示FcabRGD4L的噬菌体。

实施例4：Fcab^TM文库设计

Fcab文库的设计(见图2)：考虑对抗体CH3恒定区的非CDR环中的氨基酸位置进行随机化。尤其考虑环A-B、C-D和E-F，因为它们都位于结构域的一侧。对具体位置进行随机化的一些设计标准在本文描述。

频繁参与抗原抗体相互作用的氨基酸在本文中被描述为包括在集中型文库中。

具有受限的氨基酸应用的文库已经被证明足以产生实质上抗任何抗原的结合剂(Sidhu & Fellhouse，NATURE CHEMICAL BIOLOGY VOLUME 2 page 682ff.；Koide et al PNAS，volume 104 p6632-6637)。这类受限(或集中型)文库的优点是，它们完全可以用当前的技术手段来实现。理想的是，氨基酸应用反映出配体受体结合的天然氨基酸应用情况。但是，即使只利用2种氨基酸(酪氨酸和丝氨酸)的文库据报道也得到较好的筛选结果(在抗不同结合剂的结合剂的频率、以及在亲和力方面)。

环的柔性(loop flexibility)：

支架蛋白可能需要一些环结构以便总体上维持天然结构。在随机化位置的一侧或双侧构建一些序列，有可能促进环中多个氨基酸位置的随机化，甚至使环延长。这些序列可以是柔性的序列，以便允许弥补这类位置中一些文库序列的任何张力。

表2：集中型和非集中型Fcab^TM文库实例

Fcab01文库在以上实施例中描述。集中型文库设计Fcab02、Fcab04和Fcab06的序列空间被大约10e9的实际细菌文库大小覆盖。与此相反，完全随机化的文库Fcab01、Fcab03和Fcab05事实上远远未能被充分代表。

设计酵母中的环随机化

与上述关于Fcab文库设计和在细菌中产生所述文库的实施例相似，产生酵母文库。如表3所示，产生了修饰的AB环、CD环和EF环的各种不同组合。本实施例修饰的AB环是从氨基酸358到362(wt序列“LTKNQ”)，CD环是从氨基酸384到388(wt序列“NGQPE”)，EF环是从413到419(wt序列“DKSRWQQ”)。

如前文所述，“X”代表彻底随机化，“Z”代表集中的设计。被插入的、不出现在wt Fc支架中的氨基酸在表3中用括号表示。对于那些未修饰环的文库，各自的野生型序列在表中用单字母氨基酸代码表示。由于在大多数的这些文库中，理论上的组合个数远远超过实验的克隆数，因此，在最后一栏显示的是独立的酵母克隆的产生量。

表3：集中型和非集中型Fcab^TM文库实例，它们具有AB环、CD环和EF环的突变和插入

实施例5：通过同源重组来克隆酵母展示文库

载体

用载体pYD1(Invitrogen)作为基础载体。该载体如下修饰，以除去XhoI位点：pYD1用XhoI切割，再用DNA聚合酶的Klenow片段处理，然后重新连接。所得序列在pYD1dX(SEQ ID No.15/图8)中给出。pYD1dX在位置921/925包含唯一的BamHI限制性酶切位点，在位置963/967包含唯一的NotI限制性酶切位点。它被这两种限制性内切酶打开。从编码人IgG1单克隆抗体重链的cDNA通过PCR制备编码人IgG1 CH1-铰链-CH2-CH3的插入物。在该插入物中，利用标准方法引入点突变，以将CH1结构域的C端半胱氨酸残基突变为丝氨酸。PCR扩增该插入物，所用的引物将BamHI和Not限制性酶切位点分别连接到两个末端。然后用这些限制性酶切位点将插入物克隆入pYD1dX，得到展示载体pYD1dXFc(SEQ Id No.16/图9)。CH1结构域C端的突变密码子(Cys突变为Ser)是位于pYD1DxFc序列中的位置1233-1235。该插入物的终止密码子是在位置1917/1919。

该载体被用作在酵母表面展示人CH1-铰链-CH2-CH3的阳性对照，还被用做构建载体pYD1CH12的起点(见下文)。

文库的克隆

CH3结构域的结构环中引入了突变的那些文库，在酵母中通过同源重组(缺口修补)进行克隆。为此，制备不包含CH3结构域的受体载体：pYD1dXFc用XhoI切割(1603/1607位)并用NotI切割(1921/1925位)，通过制备型凝胶电泳来制备大的片段，然后用DNA聚合酶的Klenow片段处理，再重新连接。该方法重建了唯一的XhoI位点(1603/1607位)，并得到载体PYD1CH12(SEQ ID No.17/图10)。pYD1CH12随后用XhoI切割，并被用做酵母中进行缺口修补时的受体载体。

备选地，对于表3所列文库，构建另一种受体载体，其仅包含铰链区、CH1区和CH2区，但缺乏CH1区。在该载体中，通过用BamH1切割(位置：921/926)并用Xho1切割(位置：1603/1608)，除去CH1结构域。取而代之的是，我们导入了经PCR产生的片段，其包含铰链区、CH2结构域和相应的限制酶位点。所得质粒是pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt(SEQ ID No.428)。下一步，我们用Xho1(1309/1314)和Not1(1626/1633)进行消化，除去后一种质粒中的CH3结构域，代之以两个依次的标签：V5标签，后随His6标签。该序列通过从pYD1载体进行PCR扩增并用Xho1和Not1限制酶位点进行克隆而得到。最终的质粒是pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt(SEQ ID No.427)，用作文库受体载体。pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt编码始于铰链区、止于CH3结构域起点的人IgG1片段。它包含唯一的BamHI(921/926)、Xho1(1309/1314)和NotI限制性位点(1422/1429)。后两种酶用于通过同源重组引入CH3文库。载体pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt作为在酵母表面展示人铰链-CH2-CH3的阳性对照，pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt作为构建表3所列文库的起点。

作为pYD1dXFc中插入物的来源，使用Fcab文库Fcab01(SEQ ID No.18)，Fcab02(SEQ ID No.19)，Fcab03(SEQ ID No.20)，Fcab04(SEQ ID No.21)，Fcab05(SEQ ID No.22)和Fcab06(SEQ ID No.23)。这些文库通过标准DNA合成法制备，它们在人IgG1 CH3结构域的AB环(残基359和361之间(EU编号))以及EF环(残基413和419之间(EU编号))中包含随机化残基以及插入的残基。从该合成的DNA出发，通过PCR扩增用于在酵母中进行缺口修补的插入物，所用PCR引物对是：

gapch35

caacaaggccctgcctgcccccatcgagaagaccatctccaaggccaagggccagcctcgagaaccacaggtftacaccctgccc(SEQ ID No.24)和

gapfcs3

gagaccgaggagagggttagggataggcttaccttcgaagggccctctagactcgatcgagcggccgctcatttacccggagacagggagagctc ttc(SEQ ID No.25)。

将100μg经XhoI切割的载体pYD1CH12和100μg插入物混合，然后根据下列方案(其按100的系数放大以转化所需量的细胞和DNA)使用醋酸锂法转化糖酵母菌株EBY100(Invitrogen)。简言之，对于1μg载体DNA和1μg插入DNA的单次转化来说，用一个酵母菌落接种10ml YPD(2％蛋白胨，2％葡萄糖(D-葡萄糖))，30℃振摇过夜。测定过夜培养物的OD600，用50ml YPD将所述培养物稀释到OD600为0.4，再培养2-4小时。细胞在2500rpm沉淀，将其重悬于40ml 1X TE(10mM Tris，pH 7.5，1mM EDTA)中。细胞再在2500rpm沉淀，重悬于2ml 1M LiAc/0.5X TE中，然后室温温育10分钟。将1μg载体DNA、1μg插入物和100μg变性剪切的鲑精DNA(2mg/ml)与100μl酵母悬液混合。添加700μl 1M LiAc/40％PEG-3350/1XTE，将其与酵母/DNA悬液混合，然后在30℃温育30分钟。添加88μlDMSO并混合，将混合物在42℃温育7分钟，然后在微量离心机中离心10秒。然后去除上清，将细胞沉淀重悬于1ml 1X TE中，再次沉淀。然后将沉淀重悬于50-100μl TE中，铺在含亮氨酸的基本葡萄糖平板上(10g/l酵母氮碱(yeast nitrogen base)，20g/l葡萄糖，0.1g/l亮氨酸，15g/l琼脂)。平板在30℃温育2-4天后，出现单菌落，随后收集单菌落。

作为载体pYD1dX_dCH1dCH3中插入物的来源，使用表3所列的Fcab文库。这些文库通过标准DNA合成法制备，它们在人IgG1 CH3结构域的AB环、CD环、以及EF环中包含随机化残基以及插入的残基。从该合成的DNA出发，用寡核苷酸YCH3.25rec.back个YCH3.25rec.opt.for(列在下文中)，通过PCR扩增用于在酵母中进行缺口修补的插入物。基本的转化混合物包含2μg经XhoI切割的pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt和1μg插入DNA，将它们混合后，用醋酸锂法转化到糖酵母菌株EBY100(Invitrogen)中，该方法可以按100的系数放大以得到所需量的转化子。简言之，对于2μg载体DNA和1μg插入DNA的单次转化来说，用一个酵母菌落接种10ml YPD(2％蛋白胨，2％葡萄糖(D-葡萄糖))，30℃振摇过夜。测定过夜培养物的OD600，用50ml YPD将所述培养物稀释到OD600为0.3，再培养6小时或达到OD600为2.5。细胞在2500rpm沉淀，洗两次：先用25mL蒸馏水洗，再用100mM LiAc洗；最后重悬于500μl 100mM LiAc中。将2μg载体DNA、1μg插入物和100μg变性剪切的鲑精DNA(2mg/ml)与50μl所述酵母在含PEG3500(33％w/v)和100mM LiAc的溶液中混合，最终体积为360μL。充分匀浆后，将酵母在30℃放置30分钟，然后在42℃放置45分钟。弃去上清，将细胞沉淀重悬于YPD中，在30℃放置60-90分钟以使细胞恢复。再将沉淀在选择培养基(培养板和/或液体，见下文)中30℃保温2天。根据在培养板上长成菌落的单细胞的数量确定该文库的多样性，所述板是在恢复期之后迅速制备并接种得到的。

引物列表：

a)CH3seqs/2(SEQ ID No.429)：5’-AAGGAGTACAAGTGCAAGG-3’

b)反向引物：

CDmut_back(SEQ ID No.430)：5’-GCT CTC CCA CTC CAC G-3’

EFmut_back(SEQ ID No.431)：5’-CAC GGT GAG CTT GCT GTA GAG-3’

ABMUT5/2_back(SEQ ID No.432)：5’-CTCATCCCGGGATGGG-3’

c)正向引物(X＝用于随机化的氨基酸的三核苷酸合成)

CDmut5cod_for(SEQ ID No.433)：

5’-GTG GAG TGG GAG AGC X X X X X AAC AAC TAC AAG ACC ACG-3’

EFMUT7cod_for(SEQ ID No.434)：

5’-AGC AAG CTC ACC GTG X X X X X X X GGG AAC GTC TTC TCA TGC-3’

EFMUT3+2_for(SEQ ID No.435)：

5’-AGC AAG CTC ACC GTG X X X AGG TGG X X GGG AAC GTC TTC TCA TGC-3’

ABMUT5(wt)_for(SEQ ID No.436)：

5’-CCA TCC CGG GAT GAG X X X X X GTC AGC CTG ACC TGC CTG G-3’

d)CH3seqAS(SEQ ID No.437)：5’-TAGAATCGAGACCGAGG-3’

e)YCH3.25rec.opt.for(SEQ ID No.438)：5’-A CCA TCT CCA AGG CCA AGG-3’

f)Ych3.25rec.back(SEQ ID No.439)：5’-AAG GGC CCT CTA GAC TCG-3’

培养-诱导

将收获的酵母文库(yFcab文库)接种至10ml SD-CAA培养基(10g/l酵母氮碱，10g/l酪蛋白氨基酸，和20g/l葡萄糖，0.1g/l亮氨酸，9.67g/lNaH₂PO₄-2H₂O和10.19g/l Na₂HPO₄·7H₂O)，在250rpm的摇床上28℃培养6-8小时。测定培养物的OD600，将培养物稀释到OD600为0.2，然后在相同条件下培养直至OD600达到1-2。离心(3000rpm/5分钟/4℃)收获细胞，将其重悬于诱导培养基SG/R-CAA(10g/l酵母氮碱，10g/l酪蛋白氨基酸，和20g/l半乳糖，10g/l棉子糖，0.1g/l亮氨酸，9.67g/l Na₂HPO₄-2H₂O和10.19g/l Na₂HPO₄·7H₂O)。培养物通过在250rpm的摇床上20℃温育2天来诱导，随后进行分析和分选。备选地，培养物通过在250rpm的摇床上37℃温育1天来诱导，随后进行分析和分选。

yFcab文库的质量控制

用SD-CAA培养基诱导两天后，检测yFcab文库的表达水平和表达的Fcab′s的质量。表达水平用多克隆抗人IgG-Fc抗血清(Sigma)检测。为此，将0.5×10e6个文库细胞稀释于1ml染色缓冲液(SB)中，所述染色缓冲液包括含2％BSA的PBS。将细胞沉淀，然后用包含1/2000稀释的抗人IgG-Fc-PE抗血清(Sigma)的100μl SB在冰上染色30分钟，用SB清洗两次，随后在FACS中进行分析。总体上每个文库中所有细胞的70％-80％在其细胞表面表达Fcabs。为了验证Fcabs的正确折叠，进行蛋白A染色。还是将0.5×10e6个文库细胞稀释于1ml染色缓冲液SB中，将细胞沉淀，用包含1μg/ml Prot-A-FITC(Fluka)的100μl SB在冰上染色30’，用SB清洗两次，随后在FACS中进行分析。总体上，如上所述的yFcab文库显示≥40％的ProtA(蛋白A)阳性细胞。

为了检验Fcabs是否在细胞表面表达为二聚体，进行人CD64染色。将5×10e5个细胞沉淀，用含1μg/ml CD64(R&D Systemns)的50μl SB在冰上染色30min。清洗后，将细胞重悬于含1μg/ml Penta His Alexa Fluor 488(QIAgen)的50μl SB中，在冰上再保温30’。将细胞洗过之后，重悬于200μl冰冷的SB，进行FACS分析。作为对照，将细胞与等量的Penta His Alexa Fluor 488一起保温，但事先不与CD64一起保温。温育后，细胞用冰冷的SB洗一次，然后在FACS中进行分析。总体上，每个文库中所有细胞的＞50％在其细胞表面表达二聚化的Fcabs。

抗原(Her2)的生物素化

重组抗原例如Her2(Bendermedsystems)用Pierce的EZ link system按照说明书来制备。简言之，将所述抗原用PBS透析，然后用PBS稀释到1mg/ml，再与预先溶于水的10mM硫代-LC-LC-生物素(EZ link，Pierce)混合。抗原与生物素的最终比例是1∶3，将混合物在室温温育30’。然后利用Vivaspin MWCO3000(Sartorius)柱将混合物用PBS“透析”(5×8′，4000rpm)。最后通过HPLC检测生物素化抗原(Her2)的浓度，将其等分保存于-20℃。

生物素化抗原的质量用ELISA检测。平板先用10μg/ml抗-Her2抗体(例如Herceptin)的PBS溶液(100μl/孔)4℃包被过夜，之后平板用清洗缓冲液(WB)(PBS+0.05％Tween20)洗3次，用封闭缓冲液(BB)(PBS+2％BSA)室温封闭1小时。用WB洗3次后，添加不同浓度的Her2-生物素，100μl/孔BB，室温1小时，然后用WB洗3次。最后，平板与1∶25000链霉亲和素-HRP(GE healthcare)的BB溶液室温温育1小时，用WB洗3次。添加100μl/孔的底物TMB(Sigma)来显色，约10分钟后，添加100μl/孔的30％H₂SO₄终止反应。结果用ELISA读数器在450-630nm进行分析。

实施例6：抗原特异性(Her2)Fcabs的产生

用FACS筛选抗原特异性(Her2)Fcabs

第一轮筛选：

在FACSorting前两天，如上述用SG/R-CAA培养基诱导含2.5×10e8个独立Fcab克隆的酵母文库，以在它们的细胞表面表达Fcabs。两天后，将例如10倍文库量(＝2.5×10e9)的细胞与500nM生物素化抗原(Her2)的2mlSB溶液在冰上温育30’。然后将细胞用冷的SB洗一次，随后与用SB按1∶100稀释的链霉亲和素-PE(来自R&D systems)在冰上温育30’。细胞用冰冷的SB洗两次，然后稀释到终浓度1×10e9个细胞/ml。对照染色是，在100μl中，只用链霉亲和素-PE而不用抗原5×10e6个细胞/ml进行染色。在例如来自BD的FACS ARIA中分析完整文库和对照染色。为了设置分选的门通条件(gate)，使用所述对照细胞。首先设置FSC/SSC门(G1)来鉴定健康的酵母细胞，从G1制作FSC-宽度对FSC-面积的曲线，在新的门(G2)中只选择非聚集细胞。G2中的细胞随后用FSC相对于(versus)FL-2(PE通道)分析其与链霉亲和素-PE的反应性。G3被设置为包括0.1％的(假)阳性细胞。随后，至少5×10e8个被染色的细胞(比文库规模大两倍，越大越好)用上述设置进行分析，将G3中的细胞分选至含2-3ml SD-CAA培养基的管中。第一轮筛选收获到约5×10e5个细胞(库1)，使它们增殖1-2天，然后将细胞保存在-80℃，可以取等分试样，如上述诱导Fcabs表达。再过两天后，进行下一轮筛选。

第二轮筛选：

第1轮筛出的库1如上述诱导Fcab在其表面表达。将至少5×10e6个细胞(含多个库1拷贝)与500nM生物素化抗原(Her2)的1ml SB溶液在冰上温育30’。然后将细胞用冷的SB洗一次，再与用SB按1∶100稀释的链霉亲和素-PE(来自R&D systems)、以及2μg/ml蛋白A-FITC(Fluka)一起，在冰上温育30分钟。接着，细胞用冰冷的SB洗两次，稀释至终浓度约2×10e6个细胞/ml。此外，进行对照染色，其中，100μl 5×10e6个细胞/ml的库1与Prot A(蛋白A)和链霉亲和素-PE的混合物如上述温育，但不与抗原(Her2)温育。此外，在没有链霉亲和素-PE的情况下，将100μl表达Fcab wt非随机化Fc片段的酵母克隆的5×10e5个细胞如上述用Prot A-FITC染色。表达Fcab-wt的细胞在例如BD的FACS ARIA中分析，以便为分选而设门。先设置FSC/SSC门(G1)来鉴定健康的酵母细胞，从G1制作FSC-宽度相对于FSC-面积的曲线，在新的门(G2)中只选择非聚集细胞。G2中的细胞随后用FSC相对于FL-1(FITC)来分析蛋白A的表达。G3被设置为囊括Prot A强阳性细胞(亲本门的50-60％)，G4被设置为囊括Prot A弱阳性细胞(亲本细胞的20-30％)。G3+G4将包括G2中所有细胞的大概70-80％。现在，用不存在Prot A-FITC时被链霉亲和素-PE染色的库细胞来设置其余的分选门。首先用库细胞检查G1和G2，在必要时进行调整。库细胞在G3中具有较少的事件，可能在G4中也如此，提示不是所有库1中的细胞表达被折叠为Fcab-wt的Fcabs。使用对照染色的库细胞，为了G3和G4准备新的门。所述新的门在曲线FSC和FL-2(PE)中设置。制得门(G5)，其包括G3中0.1％的链霉亲和素(假)阳性细胞，对G4中的细胞进行相同处理，得到G6。在下一步中，至少5×10e6个进行Her2-生物素+链霉亲和素-PE和Prot A-FITC染色的细胞通过FACS-ARIA来分选。在包含2-3ml酵母培养基的不同管中收集G5(库2.1)和G6(库2.2)的细胞。预期两个门中都有10到1000个克隆。使两个新库增殖1或2天，保存于-80℃。来自2.1和2.2的细胞可用于指导第3轮的进一步分选，或者它们可以(优选在将两个克隆再次混合后)经历AB环的另一轮随机化(亲和力成熟)，然后在FACS中被进一步分选。

所选克隆/库的亲和力成熟

为进行亲和力成熟，向所选克隆或所选克隆的库中引入多样性，优选仅在一个环中引入，本文是AB环。为此进行PCR，引物是，在第359、360和361位(EU编号)包含简并密码子的引物(引物Abmut，gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcctggtcaaag，SEQ ID No.26)，或者是，在第358、359、360、361和362位(EU编号)包含简并密码子的引物(引物Abmut2LR，gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnn bnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtcaaag，SEQ ID No.27)。

在两种情况，这些PCR中所用的第二引物是gapfcs3。为了产生侧翼序列以便在酵母中进行有效缺口修补，将所得PCR产物用引物对gapch35和gapfsc3进一步扩增，然后与经XhoI切割的pYD1CH12一起，如上述用醋酸锂法转化至酿酒酵母菌株EBY100中。作为AB环中所述残基随机化时用的备选引物，还可以使用引物诸如Abmut1L(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbcaggtcagectgacctgcctggtcaaag，SEQ ID No.28)或Abmut1R(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtcaaag，SEQ ID No.29)。采用类似的方式，可以通过总体随机化(total randomization)，将EF环中的残基随机化。

备选随机化用带刺寡核苷酸(spiked oligonucleotides)作为引物对单个的克隆y-Her.C2.P4.2-9进行。在本例中，所述寡核苷酸的设计与前文对各个环完整随机化所述的设计类似，但随机化的部分在密码子的第一和第二位置包含70％的原始碱基，另外3种核苷酸每种10％。第三个位置含70％的原始碱基，30％的依据NNK或NNS密码子的碱基。

通过完全随机化，Abmut引物为每个克隆产生8000个新变体(库2.3)，Abmut2LR引物导致3×10e6个新变体(库2.4)。因此，库2.3和2.4均产生大约10e8个个体的新文库，因为起始原料(库2.1+2.2)已经包含大约10-1000个克隆。

第三轮筛选

亲和力成熟库2.3和2.4以及必要时库2.1(优选只有Prot A阳性细胞)按上述诱导Fcabs在其细胞表面表达，随后按照“第二轮筛选”的描述进行分选，例外的是库2.3和2.4是更大的，因此这些库的染色体积等于在“第一轮筛选”中描述的文库染色体积。在第三轮筛选中，只有Her2阳性/Prot A阳性细胞被分选出。从这些选择过程选出的库大都包含＞20％的Her2/Prot A阳性细胞。若不然，针对Her2+Prot A、或仅针对Her2进行第四和第五(或甚至更多)轮筛选。例如，H242-9Q克隆的亲和力成熟使得结合亲和力从EC50＝155nM增至18.9nM(H10-03-6克隆)。

克隆分析：

从含Her2/Prot A细胞(优选＞20％)的库的制备单个的克隆，方法是，将所述库铺于含SD-CAA培养基的琼脂平板上，或不产生库而将直接来自FACS ARIA的单个细胞(＝克隆)点样在平板上。使这些克隆生长，再将其转移到液体培养物中，保存于-80℃。随后，取这些克隆的等分试样，如上述诱导Fcabs在其细胞表面表达，在FACS中筛选多个参数。这些参数是：在有和无上述Prot A-FITC、CD64染色的情况下，用于筛选的抗原(Her2)的剂量应答范围。此外，用类似的染色方案，筛出多个无关的生物素化抗原，来鉴定非交叉反应性Fcabs。

观察到，在数轮筛选抗原(Her2)+Prot A阳性细胞后，这些克隆中有较大百分比例当用500nM抗原(Her2)染色时显示＞25％的抗原(Her2)阳性，当用2μg/ml Prot A-FITC染色时显示＞70％的Prot A阳性。在大多数情况下，这些克隆还显示＞50％的CD64结合。因此，这反映了表达在酵母中的非随机化Fc片段(Fcab wt)的Prot A和CD64染色水平。

将如上述选出的具有上述特征的克隆制成可溶性分子。这主要通过Fcab DNA瞬时转染至新的宿主细胞来实现，但也通过Fcab DNA稳定转染至新的宿主细胞来实现。为此，使用标准方法从单个酵母克隆分离DNA。通过PCR扩增相关DNA(编码完整CH3结构域，或只是CH3结构域的已在文库中被随机化的部分)，将其转移至新表达载体，所述载体包含Fcab缺失部分(missing part)和合适的启动子以及多种筛选标记之一如G418(允许从未转染细胞群体中筛选出转染细胞)。然后将所述新载体瞬时转染至新的宿主细胞如HEK293或CHO中。使宿主细胞恢复，然后培养最多10天。含可溶性Fcab的培养上清经Prot A纯化后用于进一步的测试。稳定的细胞系也可用标准方法制备。

表4.经过库扩增、并经过亲和力成熟之后，从原始文库选出的Her2结合型酵母克隆的序列：参考SEQ ID No.1(图3)(CD环：AA169ffNGQPE)的编号

克隆的名称	AB环AA143ff	EF环AA198ff
			Fcab wt	LTKNQ	-----DKSRWQQ
y-Her.C2-P3.1-1	LDNSQ(SEQ ID No.30)	IRSSVGSRRWWS(SEQ ID No.51)
			y-Her.C2-P3.1-3	YEGSS(SEQ ID No.31)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.52)
y-Her.C2-P3.1-5	YMSAD(SEQ ID No.32)	SRRDSSLLRWAH(SEQ ID No.53)
			y-Her.C2-P3.1-6	YRRGD(SEQ ID No.33)	APGSKGYRRWAL(SEQ ID No.54)
y-Her.C2-P3.1-8	LMSRQ(SEQ ID No.34)	DKPFWGTSRWSR(SEQ ID No.55)
			y-Her.C2-P3.1-16	LHLAQ(SEQ ID No.35)	SINDLINHRWPY(SEQ ID No.56)
y-Her.C2-P3.1-18	YLSKD(SEQ ID No.36)	MWGSRDYWRWSH(SEQ ID No.57)

y-Her.C2-P3.2-3	YRSGS(SEQ ID No.37)	NSGSAMMVRWAH(SEQ ID No.58)
			y-Her.C2-P3.2-9	LRDGQ(SEQ ID No.38)	QRSRLSRQRWWR(SEQ ID No.59)
y-Her.C2.P4.2-1	YSANT(SEQ ID No.39)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
			y-Her.C2.P4.2-3	YASNT(SEQ ID No.40)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
y-Her.C2.P4.2-4	YSDGD(SEQ ID No.41)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
			y-Her.C2.P4.2-5	YSGGS(SEQ ID No.42)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
y-Her.C2.P4.2-6	YGRDS(SEQ ID No.43)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
			y-Her.C2.P4.2-8	YAGGT(SEQ ID No.44)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
y-Her.C2.P4.2-10	YSSDS(SEQ ID No.45)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
			y-Her.C2.P4.2-12	YHSGS(SEQ ID No.46)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
y-Her.C2.P4.2-15	YLTNS(SEQ ID No.47)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
			y-Her.C2.P4.2-18	YGSEE(SEQ ID No.48)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
y-Her.C2.P4.2-19	YRSGE(SEQ ID No.49)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
			y-Her.C2.P4.2-20	YGTDD(SEQ ID No.50)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
y-Her.C2.P4.2-9	YLHGD(SEQ ID No.161)	ARYSPRMLRWAH(SEQ ID No.60)
			HAF1311A1	YLHGD(SEQ ID No.161)	VSRYSMTMWRWAH(SEQ ID No.61)
HAF1311A10	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRYSRSMMRWAH(SEQ ID No.62)
			HAF1311A11	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRYSQMMWRWAH(SEQ ID No.63)
HAF1311A12	YLHGD(SEQ ID No.161)	ITRYSRQMLRWAH(SEQ ID No.64)
			HAF1311A2	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRYSALMWRWAH(SEQ ID No.65)
HAF1311A3	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSEAMWKWGH(SEQ ID No.66)

HAF1311A4	YLHGD(SEQ ID No.161)	VGRYSQRMWRWAH(SEQ ID No.67)
			HAF1311A5	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPTMWRWAH(SEQ ID No.68)
HAF1311A6	YLHGD(SEQ ID No.161)	VGRHSPTMWKWAH(SEQ ID No.69)
			HAF1311A7	YLHGD(SEQ ID No.161)	LGRWSPKMWRWAH(SEQ ID No.70)
HAF1311A8	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARWSPSMMRWAH(SEQ ID No.71)
			HAF1311A9	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARNSPSMWRWAH(SEQ ID No.83)
HAF1311B1	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARWSPSMVRWAH(SEQ ID No.84)
			HAF1311B10	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARKNHRKWRRTH(SEQ ID No.85)
HAF1311B11	YLHGD(SEQ ID No.161)	VSRYSPTMWQWAH(SEQ ID No.86)
			HAF1311B12	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSLSMWRWAH(SEQ ID No.87)
HAF1311B2	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSQTMWRWAH(SEQ ID No.88)
			HAF1311B3	YLHGD(SEQ ID No.161)	MPRFSPSMWRWAH(SEQ ID No.89)
HAF1311B4	YLHGD(SEQ ID No.161)	VTRYSQSMWRWAH(SEQ ID No.90)
			HAF1311B5	YLHGD(SEQ ID No.161)	IERYSTRMWSWAH(SEQ ID No.91)
HAF1311B6	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSPEMWHWAH(SEQ ID No.92)
			HAF1311B7	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARGSPSMWSWGH(SEQ ID No.93)
HAF1311B8	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSQTMWHWAH(SEQ ID No.94)
			HAF1311B9	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARYSPGMWRWAH(SEQ ID No.95)
HAF1311C1	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRFSPTMWKWAH(SEQ ID No.96)
			HAF1311C10	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRWSRTMLRWAH(SEQ ID No.97)
HAF1311C11	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRYSPRMWRWAH(SEQ ID No.98)

HAF1311C2	YLHGD(SEQ ID No.161)	IARHSKSMWSWAH(SEQ ID No.99)
			HAF13112C3	YLHGD(SEQ ID No.161)	MPRWSKSLSGWAH(SEQ ID No.100)
HAF1311C5	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYTPSMWRWAH(SEQ ID No.101)
			HAF1311C7	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARNSLTMWRWAH(SEQ ID No.102)
HAF1311C8	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPSMWKWAH(SEQ ID No.103)
			HAF1311C9	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARFSPSMWRWAH(SEQ ID No.104)
HAF1311D2	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARWSPSLSRWAH(SEQ ID No.105)
			HAF1311D3	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPSMWRWAH(SEQ ID No.106)
HAF1311D4	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRSSLTMWKWAH(SEQ ID No.107)
			HAF1311D5	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRHSTRMWKWAH(SEQ ID No.108)
HAF1311D6	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRHSRRMWRWAH(SEQ ID No.109)
			HAF1311D7	YLHGD(SEQ ID No.161)	VTRYSPSMWRWAH(SEQ ID No.110)
HAF1311E10	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRHSRRMWRWAH(SEQ ID No.109)
			HAF1311E2	YLHGD(SEQ ID No.161)	MPRWSKSLSGWAH(SEQ ID No.100)
HAF1311E3	YLHGD(SEQ ID No.161)	VTRHSSSMWRWAH(SEQ ID No.111)
			HAF1311E4	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSRSMKKWAH(SEQ ID No.112)
HAF1311E5	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARGSTTMWRWGH(SEQ ID No.113)
			HAF1311E6	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARSSPEMWRWAH(SEQ ID No.114)
HAF1311E7	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSTGMWNWAH(SEQ ID No.115)
			HAF1311E8	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRYSQRMWRWAH(SEQ ID No.116)
HAF1311E9	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRNSPRMWRWAH(SEQ ID No.117)

HAF1312F1	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARWSPSMSRWAH(SEQ ID No.118)
			HAF1312G12	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARWSPSMKSWAH(SEQ ID No.119)
HAF1312F11	YLHGD(SEQ ID No.161)	LPRYSTKMKRWAH(SEQ ID No.120)
			HAF1312F7	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARYSGRMKRWAH(SEQ ID No.121)
HAF1312F3	YLHGD(SEQ ID No.161)	IPRWSQQMSRWAH(SEQ ID No.122)
			HAF1312F5	YLHGD(SEQ ID No.161)	VGRWTPSMWRWAH(SEQ ID No.123)
HAF1312G10	YLHGD(SEQ ID No.161)	VKRSSPSMWRWAH(SEQ ID No.124)
			HAF1312G2	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARFSPSMWRWAH(SEQ ID No.104)
HAF1312G1	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARYSPGMWNWAH(SEQ ID No.125)
			HAF1312G9	YLHGD(SEQ ID No.161)	IARYSPNMWNWAH(SEQ ID No.126)
HAF1312G8	YLHGD(SEQ ID No.161)	IARYSPSMWRWAH(SEQ ID No.127)
			HAF1312F12	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARFSPSMLKWAH(SEQ ID No.128)
HAF1312F2	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSKSMLKWAH(SEQ ID No.129)
			HAF1312F10	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSRTMWRWGH(SEQ ID No.130)
HAF1312G7	YLHGD(SEQ ID No.161)	IARHSREMLRWAH(SEQ ID No.131)
			HAF1312F8	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSSTMSRWAH(SEQ ID No.132)
HAF1321A1	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRYSQRMWRWAH(SEQ ID No.116)
			HAF1321B11	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRYSQMMWRWAH(SEQ ID No.63)
HAF1321A2	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRYSPRMWRWAH(SEQ ID No.98)
			HAF1321A10	YLHGD(SEQ ID No.161)	IPRWSQQMSRWAH(SEQ ID No.122)
HAF1321A4	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRHSLKKLQRKH(SEQ ID No.133)

HAF1321B10	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSLSMWRWAH(SEQ ID No.87)
			HAF1321A5	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPSMWNWAH(SEQ ID No.134)
HAF1321B1	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPTMWKWAH(SEQ ID No.148)
			HAF1321A11	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARFSPSMWRWAH(SEQ ID No.104)
HAF1321B5	YLHGD(SEQ ID No.161)	VSRFSPSMWRWAH(SEQ ID No.149)
			HAF1321B2	YLHGD(SEQ ID No.161)	VGRWTPSMWRWAH(SEQ ID No.123)
HAF1321B6	YLHGD(SEQ ID No.161)	IARYSPSMWRWAH(SEQ ID No.127)
			HAF1321B7	YLHGD(SEQ ID No.161)	IARYSPSMWRWAH(SEQ ID No.127)
HAF1321B9	YLHGD(SEQ ID No.161)	IPRYTPSMWRWAH(SEQ ID No.150)
			HAF1322C10	YLHGD(SEQ ID No.161)	IPRWSQQMSRWAH(SEQ ID No.122)
HAF1322C11	YLHGD(SEQ ID No.161)	VPRYSTLMWRWAH(SEQ ID No.151)
			HAF1322C7	YLHGD(SEQ ID No.161)	LPRHSRRMWRWAH(SEQ ID No.152)
HAF1322C6	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARWSPSMLRWAH(SEQ ID No.153)
			HAF1322C3	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSLSMWRWAH(SEQ ID No.87)
HAF1322C4	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSPAMWRWAH(SEQ ID No.154)
			HAF1322C8	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARSSPSMWRWAH(SEQ ID No.147)
H10-03-6	YLYGD(SEQ ID No.162)	VPRHSARMWRWAH(SEQ ID No.155)
			H10-03-6R	YLYGD(SEQ ID No.162)	VPRHSARMWRWAH(SEQ ID No.155)
H10-03-6Y	YLYGD(SEQ ID No.162)	VPRYSARMWRWAH(SEQ ID No.156)
			ABEFs0101	YLSAD(SEQ ID No.163)	VARYSPSMWRWGH(SEQ ID No.135)
ABS0101G	YLSAD(SEQ ID No.163)	VARYSPSMWRWAH(SEQ ID No.106)

ABS0101P	YLSAD(SEQ ID No.163)	VPRYSASMWRWGH(SEQ ID No.136)
			ABS0101PG	YLSAD(SEQ ID No.163)	VPRYSASMWRWAH(SEQ ID No.137)
EF3-1	YLHGD(SEQ ID No.161)	LPRYSPGMWRWAH(SEQ ID No.138)
			EF3-2	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPSMWNWAH(SEQ ID No.134)
EF3-3	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPSMWRWGH(SEQ ID No.135)
			EF3-4	YLHGD(SEQ ID No.161)	IPRWSQQMSRWAH(SEQ ID No.122)
EF3-6	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSQTMSRWAH(SEQ ID No.139)
			EF3-7	YLHGD(SEQ ID No.161)	IARYSPSMWRWAH(SEQ ID No.127)
EF3-8	YLHGD(SEQ ID No.161)	VAGYRPRRSGSSH(SEQ ID No.140)
			EF3-9	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARHSANMLRWAH(SEQ ID No.141)
EF3-13	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSPSMWSWAH(SEQ ID No.142)
			EF3-14	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYTPSMWRWAH(SEQ ID No.101)
EF3-15	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARWSPSMFRWAH(SEQ ID No.143)
			EF3-16	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARWSPSMKSWAH(SEQ ID No.119)
EF3-17	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARHSRTMWRWGH(SEQ ID No.130)
			EF3-18	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARWSPSMSRWAH(SEQ ID No.118)
EF3-20	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARWSPSMLRWAH(SEQ ID No.144)
			EF10-01	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARSSPTMWRWAH(SEQ ID No.145)
EF10-02	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPSMWRWAH(SEQ ID No.106)
			EF10-03	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARWSPSMMRWAH(SEQ ID No.71)
EF10-04	YLHGD(SEQ ID No.161)	VTRWSPTMWRWAH(SEQ ID No.146)

EF10-07	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARNSPSMWRWAH(SEQ ID No.83)
			EF10-08	YLHGD(SEQ ID No.161)	LARWSPSLSRWAH(SEQ ID No.105)
EF10-09	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARSSPSMWRWAH(SEQ ID No.147)
			EF10-10	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPRMWRWAH(SEQ ID No.157)
EF10-13	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSRKMSSWGH(SEQ ID No.158)
			EF10-14	YLHGD(SEQ ID No.161)	LASYSPSMWRWGH(SEQ ID No.159)
EF10-15	YLHGD(SEQ ID No.161)	VARYSPTMKRWAH(SEQ ID No.160)

表5.经过库扩增、并经过亲和力成熟之后，从原始文库选出的Her2结合型酵母克隆的序列：参考SEQ ID No.1(图3)的编号

表达并纯化哺乳动物细胞中的抗原特异性克隆：

将如上述选出的具有上述特征的克隆子再克隆到哺乳动物表达载体如pCEP4(Invitrogen)中。用高度纯化的质粒DNA(Qiagen)瞬时转染HEK293freestyle细胞，Freestyle^TM MAX Reagent(Invitrogen)按说明书来用。转染后第5天，通过离心以及滤过0.2μM Stericup filter(Millipore)，使细胞上清与细胞碎片彻底分离。备选地，HEK293 freestyle细胞或CHO细胞用含抗生素(如新霉素或嘌呤霉素)抗性基因的表达质粒转染。被转染的细胞在有所述抗生素存在的条件下培养，仅有稳定表达抗生素抗性基因和抗原特异性Fc片段的细胞克隆存活。这种稳定的转染子长期持续分泌目标蛋白。用蛋白A免疫-亲和力层析，从细胞上清纯化出抗原特异性Fcabs。结合的Fcabs通过用甘氨酸缓冲液(pH＝2.9-4.0)洗柱、接着对PBS(pH＝6.8)透析，而从蛋白A上洗脱。Fcabs的纯度用非还原SDS-PAGE确定，潜在的聚集物用大小排阻HPLC来检测，所述层析是在Zorbax GF250柱上、以PBS作为过柱缓冲液来进行。

鉴定Fcabs的结构：

利用与Fc受体和蛋白A的结合来评估纯化的Fcabs的总体结构完整性。与新生儿Fc受体(FcRn)的结合如下测量：在pH＝6.0，将10μg/ml Fcab添加至Biacore CM5芯片，该芯片偶联了5000个反应单元(response units，RU)的重组人FcRn。Fcab从FcRn上解离的情况在pH＝7.4检测。这些实验表明，Her-2特异性Fcabs与FcRn的pH依赖性相互作用具有与野生型Fcab非常类似的结合特性。Fcabs与高亲和力Fc受体CD64的结合，用包被了3000RU蛋白A的Biacore CM5芯片、随后添加10μg/ml Fcab溶液来测量。最后添加5μg/ml可溶性人CD64。所得结合曲线与野生型Fcab的无法区分。重组Fcabs(10μg/ml)与蛋白A的相互作用也用蛋白A包被的Biacore CM5芯片(3000RU)经SPR来测量。同样，所得亲和力与野生型Fcab的相当。

Fcabs的抗原特异性结合：

Her-2特异性Fcabs结合Her-2的潜力和特异性用ELISA评估。用2μg/ml可溶性人Her-2(Bender Med Systems，Austria)包被塑料。清洗，并封闭非特异性结合位点后，添加递增浓度的Fcabs。为检测Her-2结合的Fcabs，添加与辣根过氧化物酶偶联的抗Fc CH2结构域特异性单克隆抗体(Serotec)。结果表明，有一些Her-2特异性Fcabs可以在低纳摩尔范围与其靶相互作用(表6)。该相互作用是特异性的，因为与Her家族其它成员(Her1，Her3和Her4)的结合根据ELISA判定要弱100倍以上。未检测到对Her-2无关抗原的结合。

表6：Her-2特异性Fcabs在ELISA中的结合亲和力：

Fcab克隆	Her-2ELISA EC₅₀[nM]	SKBR3细胞结合EC₅₀[nM]
			y-Her.C2.P4.2-3	463	nd
y-Her.C2.P4.2-4	370	nd
			H561G3M1G4	263	nd
y-Her.C2.P4.2-19	93	nd
			ABEFs0101	16.1	5.2
H10-03-6	4.8	10.3
			EF3-17	4.7	1.3
y-Her.C2.P4.2-9	4.3	nd
			H10-03-6R	2.6	11.1

nd＝未做。

还通过SPR测定抗原结合。Biacore CM5芯片用不同量的可溶性人Her-2包被，然后添加递增浓度的Fcabs。所得结合曲线用BiaEval软件调适后，计算Fcabs的亲和力(K_D)。在这些实验条件下，Her-2特异性FcabsH561G3M1G4和H10-03-6分别以7.5nM和8.6nM的K_D值结合Her-2。抗原结合也用过表达Her-2的人乳腺癌细胞系SKBR3和Calu-3通过FACS进行评估。1x10⁵细胞与递增浓度的Fcabs一起，在冰上保温60分钟。然后，通过离心和清洗，除去未结合的抗体。与细胞结合的Fcabs通过与偶联了藻红蛋白(Sigma)的抗人Fc特异性抗体在冰上保温60分钟来检测。清洗细胞后，细胞表面的荧光强度在FACS Calibur仪器(Beckton Dickinson)中测量。所有测试的Her-2特异性Fcabs都与SKBR3和Calu-3细胞结合，但与不表达Her-2的MDA-MB468细胞仅有最低结合，这证实了在ELISA中观察到的弱抗原交叉反应性。Her-2特异性Fcabs对SKBR3细胞的表观亲和力(EC₅₀)列于表6中。

抗原特异性Fcabs的效应子功能(ADCC)：

为确定Her-2特异性Fcabs是否介导Fc效应子功能，进行了ADCC试验。在这些类型的试验中，通过效应细胞(如自然杀伤(NK)细胞)表面Fc受体的结合，使抗体与靶细胞结合，并指示靶细胞的凋亡。SKBR3细胞(靶细胞)与递增浓度的Her-2特异性Fcabs在37℃保温20分钟，所述细胞标记有荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluorescein succinimidyl ester，CFSE)。在AutoMACS装置中，按说明书使用MACS磁珠(Miltenyi Biotech)，通过阴性耗竭(negative depletion)，从健康人供血者的血液分离NK细胞。纯化的NK细胞与经过调理的SKBR3细胞以5∶1混合，37℃保温4小时。之后，添加荧光染料7-氨基放线菌素(7-AAD)，其专门染色凋亡细胞。凋亡的SKBR3细胞在FACS中被列为7-AAD/CSFE双阳性细胞。Her-2特异性FcabsH10-03-6和ABEFs0101被证明是杀灭SKBR3细胞的强效介导者(potent mediator)，EC₅₀值分别为1.1nM和1.0nM。凋亡诱导机制有赖于NK细胞的存在，这说明，Her-2特异性Fcabs具有ADCC功能。

实施例7：对4D5Fab的酵母展示

为了在酵母中展示Fab片段，如下改造酵母展示载体pYD1(Invitrogen)(SEQ ID No.72/图17)：

在581/586位通过定点诱变引入Nhel限制性位点，产生修饰的载体pYDINhe(SEQ ID No.73/图18)。该载体用NheI和PmeI限制性消化，得到3个片段。最大的片段是剩余的载体主链，向其中插入合成的寡核苷酸接头，得到载体pYD1lnk(SEQ ID No.74/图19)。然后，含MATα转录终止区的表达盒通过PCR从载体pYD1扩增，将其通过BamHI和Pstl限制性消化和连接而克隆入pYD1lnk。所得载体是pYD1mata(SEQ ID No.75/图20)。含GAL1启动子、Aga2编码基因、以及带NotI和SfiI克隆位点的合成接头的表达盒通过PCR从pYD1扩增，经EcoRI和PacI限制性消化而克隆入pYD1mata，得到载体pYD1gal(SEQ ID No.76/图21)。

作为在酵母中展示的Fab的实例，合成分别编码抗体4D5(Herceptin)的VH-CH1和VL-CL的基因：序列4D5H(SEQ ID No.77/图22)和4D5L(SEQ ID No.78/图23)。

4D5H侧翼为SfiI和NotI限制性酶切位点，将其克隆入载体pYD1gal，得到载体pYD4D5hc(SEQ ID No.79/图24)。在该载体中，将4D5H的N端融合到Aga2的C端，并在4D5H的C端连接六聚组氨酸标签，后面是终止密码子。4D5的VH-CH1氨基酸序列在4D5hp(SEQ ID No.80/图25)中给出。

4D5L侧翼为NcoI和Ascl限制性位点，将其克隆入载体pYD4D5hc，得到载体pYD4D5hl(SEQ ID No.81/图26)。4D5L在其前面有一个Aga2分泌信号，并在CL结构域的C端半胱氨酸残基之后有终止密码子。4D5的VL-CL氨基酸序列在4D5lp(SEQ ID No.82/图27)中给出。

为了展示4D5 Fab，将载体pYD4D5hl转化入酵母菌株EBY100(Invitrogen)，在不含色氨酸的基本培养基上筛选转化体，然后按照标准步骤(Invitrogen)，通过在含半乳糖的培养基上生长，来诱导重组蛋白的表达。

实施例8：构建在4D5 Fab CL结构域的结构环中有随机化残基的文库

作为酵母展示文库构建的第一步，利用限制酶BsiWI和AscI从展示载体pYD4D5hl(SEQ ID NO：81)中切出野生型CL(C kappa)结构域。制备侧翼为BsiWI和AscI位点(在根据pYD4D5hl的环境中)的编码人C kappa结构域的合成基因，其中在AB和EF环中分别引入随机突变和插入。在该具体例中，在人C kappa结构域的16和17位氨基酸之间插入3，4或5个NNB密码子，将第92，93，94，95，97，98和99位残基用NNB密码子取代(IMGT编号，参见图2)。NNB密码子在位置1和2处包含全部4种核苷酸，在位置3处包含C、G和T。因此，NNB编码全部20种天然编码的氨基酸。

文库按照标准方法进行制备和筛选。

作为支架配体，使用CDR靶Her2neu和4D5表位。筛选文库成员用于产生本发明的细胞毒模块抗体，它们在CL结构域中加入了结合位点，所述位点特异性结合效应分子，如Fcgamma受体。对所得Fab进行以下测试：(i)以Kd＜10^-8M和IC50＜10^-8M进行Her2neu结合，和(ii)用CDC和/或ADCC分析效应子功能。

Claims

1.细胞毒模块抗体，分子量最高达60kD，以Kd＜10^-8M的结合亲和力特异性结合细胞表面的靶。

2.权利要求1的模块抗体，具有ADCC，ADCP，CDC或凋亡活性中的至少一种活性。

3.权利要求1或2的模块抗体，包含具有随机化抗体序列的结合位点。

4.权利要求1-3之一的模块抗体，包含具有结构环区域的结合位点。

5.权利要求1-4之一的模块抗体，是模块抗体结构域的寡聚体。

6.权利要求1-5之一的模块抗体，是选自VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，Fc和Fab的二聚体，或它们的单链。

7.权利要求1-6之一的模块抗体，其中所述靶是erbB类型的受体。

8.权利要求7的模块抗体，其中所述靶选自EGFR，Her2，Her2neu，HER3和HER4。

9.权利要求8的模块抗体，包含特异性结合Her2的结合位点，并包含选自表4和表5所示序列编号的氨基酸序列。

10.权利要求1-9之一的模块抗体，从与效应配体结合的模块抗体结构域寡聚体的库获得。

11.产生权利要求1-10之一的模块抗体的方法，包括以下步骤：

a)提供模块抗体结构域寡聚体的库，

b)在有效应配体存在的条件下，将所述库与所述靶接触，

c)选出具有以下两项特性的库成员：

i)靶结合亲和力为Kd＜10^-8M或IC50＜10^-8M，且

ii)具有细胞毒活性，和

d)产生该模块抗体的制剂。

12.权利要求11的方法，其中所述库包含具有随机化抗体序列的成员。

13.权利要求11或12的方法，还包含使所述库成员发生亲和力成熟的步骤。

14.制备权利要求1-10之一的模块抗体用于治疗实体肿瘤患者的方法，所述肿瘤表达erbB类型的受体。

15.权利要求1-10之一的模块抗体，是用于治疗实体肿瘤患者的模块抗体，所述肿瘤表达erbB类型的受体。