ES2490192T3 - Inmunoglobulina citotóxica - Google Patents

Abstract

Anticuerpo modular citotóxico, que se une específicamente a una superficie celular diana con una afinidad de unión de kd<10-8 M, que es un Fc de unión a antígeno (Fcab) de una molécula de anticuerpo con función efectora, que es al menos una actividad de ADCC, ADCP y CDC con un sitio de unión a antígeno modificado en la región bucle de un dominio CH3 para unirse a dicha diana de la superficie celular, en donde la diana de la superficie celular es un receptor de la clase erbB.

Description

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DESCRIPCIÓN

Inmunoglobulina citotóxica

La invención se refiere a una inmunoglobulina citotóxica.

Los anticuerpos monoclonales se han usado ampliamente como agentes de unión terapéuticos. La estructura básica de los anticuerpos se explicará en el presente documento usando como ejemplo una inmunoglobulina IgG 1 intacta.

Dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos ligeras (L) idénticas se combinan para formar la molécula de anticuerpo con forma de Y. Cada una de las cadenas pesadas tiene cuatro dominios. Los dominios variables (VH) en el extremo amino son las puntas de la Y. A estos les siguen tres dominios constantes: CH1, CH2, y el CH3 en el extremo carboxi, y la base del tallo de la Y. Un tira corta, la zona de intercambio, conecta las regiones constantes y variables de la cadena pesada. La bisagra conecta CH2 y CH3 (el fragmento Fc) con el resto del anticuerpo (los fragmentos Fab). Un Fc y dos fragmentos Fab idénticos se pueden producir mediante escisión proteolítica de la bisagra en una molécula de anticuerpo intacta. Las cadenas ligeras están formadas por dos dominios, el variable (VL) y el constante (CL), separados por una zona de intercambio.

Los puentes disulfuro en la región bisagra conectan las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las cadenas pesadas mediante puentes disulfuro adicionales. Los restos de hidratos de carbono unidos por Asn están unidos en diferentes posiciones en los dominios constantes en función de la clase de inmunoglobulina. Para la IgG 1, dos puentes disulfuro en la región bisagra, entre los pares Cys235 y Cys238, unen las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las cadenas pesadas mediante dos puentes disulfuro adicionales, entre las Cys229 en los dominios CH1 y las Cys214 en los dominios CL. Los restos de hidratos de carbono están unidos a la Asn306 de cada CH2, de modo que se genera un saliente pronunciado en el tallo de la Y.

Estas características tienen profundas consecuencias funcionales. Las regiones variables de las cadenas tanto pesadas como ligeras (VH) y (VL) residen en las "puntas" de la Y, en las que están colocadas para reaccionar con el antígeno. Esta punta de la molécula es el lateral sobre el cual se localiza el extremo N de la secuencia de aminoácidos. El tallo de la Y se proyecta de un modo para mediar con eficacia en las funciones efectoras, tales como la activación del complemento y la interacción con los receptores Fc, o ADCC y ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 sobresalen para facilitar la interacción con las proteínas efectoras. El extremo C de la secuencia de aminoácidos se localiza en el lado opuesto de la punta, que puede denominarse "parte inferior " de la Y.

En los anticuerpos se encuentran dos tipos de cadenas ligeras, denominadas lambda (X) y kappa (k). are found in antibodies. Una inmunoglobulina dada tiene cadenas k o cadenas X, nunca una de cada. No se han hallado diferencias funcionales entre los anticuerpos que tienen cadenas X o k.

Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene una estructura similar de dos láminas beta empaquetadas fuertemente una contra otra en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura conservada se denomina el pliegue de la inmunoglobulina. El pliegue de la inmunoglobulina de los dominios constantes contiene una lámina de 3 hebras empaquetada contra una lámina de 4 hebras. El pliegue se estabiliza con puentes de hidrógeno entre las hebras beta de cada lámina, mediante enlaces hidrofóbicos entre los residuos de las láminas opuestas en el interior y mediante un puente disulfuro entre las láminas. La lámina de 3 hebras comprende hebras C, F y G, y la lámina de 4 hebras tiene hebras A B, E, y D. Las letras A a la G indican las posiciones secuenciales de las hebras beta a lo largo de la secuencia de aminoácidos del pliegue de inmunoglobulina.

El pliegue de los dominios variables tiene 9 hebras beta dispuestas en dos láminas de 4 y 5 hebras. La lámina de 5 hebras es estructuralmente homóloga a la lámina de 3 hebras de los dominios constantes, pero contiene las hebras adicionales C' y C''. El resto de las hebras (A, B, C, D, E, F G) tienen la misma topología y una estructura similar a la de sus homólogos en los pliegues de inmunoglobulina del dominio constante. Un puente disulfuro une las hebras B y F en láminas opuestas, como en los dominios constantes.

Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas contienen tres bucles hipervariables,

o regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las tres CDR de un dominio V (CDR1, CDR2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDR son bucles que conectan las hebras beta B-C, C'-C", Y F-G del pliegue de inmunoglobulina. Los residuos en las CDR varían de una molécula de inmunoglobulina a la siguiente, de modo que se confiere especificidad a cada anticuerpo.

Los dominios VL y VH en las puntas de las moléculas de anticuerpo están estrechamente empaquetados de modo que las 6 CDR (3 en cada dominio) colaboran en la construcción de una superficie (o cavidad) para la unión específica de antígeno. Por tanto, el sitio de unión al antígeno natural de un anticuerpo está compuesto por los bucles que conectan las hebras B-C. C'-C", y F-G del dominio variable de la cadena ligera y las hebras B-C C'-C", y F-G del dominio variable de la cadena pesada.

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Los bucles que no son bucles de CDT en una inmunoglobulina nativa o que no forman parte de la cavidad de unión a antígeno determinada por los bucles de CDR y, opcionalmente, bucles adyacentes dentro de la región del bucle de la CDR, no tienen especificidad de unión a antígeno o de unión a epítopo, pero contribuyen al correcto plegamiento de la totalidad de la molécula de inmunoglobulina y/o su función efectora o de otro tipo y, por tanto, se denominan bucles estructurales para los fines de la presente invención.

Documentos de la técnica anterior muestran que hasta ahora se ha usado el armazón de tipo inmunoglobulina con el fin de manipular el sitio de unión a antígeno existente, de modo que se introducen nuevas propiedades de unión. En la mayoría de los casos, las regiones CDR se han modificado mediante ingeniería para la unión al antígeno, en otras palabras, en el caso del pliegue de inmunoglobulina. solo el sitio de unión a antígeno natural se ha modificado con el fin de cambiar la afinidad o especificidad de unión. Existe una gran cantidad de bibliografía que describe diferentes formatos dichas inmunoglobulinas manipuladas, con frecuencia expresadas en forma de fragmentos Fc monocatenarios (scFv) o fragmentos Fab, bien expresados sobre la superficie de partículas de fagos o expresados de forma soluble en varios sistemas de expresión procariotas o eucariotas.

El documento W006/072620A1 describe un procedimiento de modificación por ingeniería de una inmunoglobulina que comprende una modificación en una región bucle estructural para obtener nuevos sitios de unión a antígeno. Este procedimiento es ampliamente aplicable a las inmunoglobulinas y se puede usar para producir una bibliotecas de inmunoglobulinas dirigidas a diversos antígenos. Se ha demostrado que una biblioteca de CH3 es útil para seleccionar ligantes específicos de un antígeno.

El documento WO08/003103A2 la adsorción de una biblioteca de CH3, CH1 o CL en un péptido sintético, que representa un mimotopo del antígeno CD20.

En la técnica se han propuesto varias bibliotecas de inmunoglobulina para obtener ligantes específicos de inmunoglobulinas. La técnica anterior hace referencia a la expresión monovalente monomérica de dominios de unión, por lo general, el documento WO9209690A2 describe partículas de fagemido que muestran una única copia de una proteína de fusión sobre la superficie de la partícula. De este modo, se describió la obtención de ligantes de alta afinidad a partir de una biblioteca de partículas de fagemido, también denominados bacteriófagos. Se proporcionan vectores de expresión replicable que comprenden genes que codifican un polipéptido de unión y una proteína de la cubierta del fago, para formar una fusión génica que codifica una proteína de fusión, que es una proteína quimérica de una partícula de fagemido, la proteína de la cubierta del fago y el polipéptido de unión.

El documento US5223409 describe en general el procedimiento de fusión de un gen que codifica una proteína de interés al dominio en el extremo N de la proteína de la cubierta III génica del fago filamentoso M13. La fusión génica se muta para formar una biblioteca de proteínas de fusión relacionadas estructuralmente que se expresan en cantidad baja sobre la superficie de una partícula de fagemido. Se usa selección y detección selectiva biológicas para identificar ligandos nuevos útiles como candidatos a fármacos.

Sin embargo, existen algunas limitaciones al uso de dicho "fago de fusión" o expresión en fago monovalente y las respectivas proteínas de fusión únicas. Muchos agentes biológicos están en la naturaleza en forma oligomérica. Para los fines de la presente invención, oligomérico significa dimérico, trimérico o incluso formas poliméricas más altas, de hasta 24 monómeros.

Se ha descrito que los fagos de fusión de acuerdo con la técnica anterior expresan proteínas de fusión monoméricas, principalmente porque se creía que los ligantes de afinidad más alta solo se podían seleccionar de una biblioteca si las partículas de fagemido expresan proteínas de fusión sencillas-No obstante, las proteínas nativas a menudo se ensamblan como un dímero o incluso en un grado de oligomerización más alto. Para obtener expresión dimérica con una proteína de fusión sencilla se han desarrollado algunas técnicas que implican codones de terminación condicionales localizados entre la proteína de la cubierta y el polipéptido de unión (Dall'Acqua et al. The Journal of Immunology, 2002, 169: 5171-5180). De este modo se expresan los monómeros solubles de los polipéptidos además de los fusionados al fago, y se permite la formación de un dímero. Sin embargo, dichos codones de terminación requieren la propagación en células huésped supresoras específicas que puedan traducir un codón de terminación a un aminoácido, para proporcionar una cantidad adecuada de proteínas de fusión además de los polipéptidos de unión solubles.

Las proteínas de fusión de la técnica anterior implican, en algunos casos, secuencias ligadoras para expresar polipéptidos de unión más grandes. Las secuencias ligadoras de hasta 24 aminoácidos normalmente se usan con fines convencionales de expresión de dominios variables de un anticuerpo. Véase, por ejemplo, el vector de expresión pCOMB3x (Hybrid. Hybridomics. 2003 Apr;22(2):97-108. Development of functional human monoclonal single-chain variable fragment antibody against HIV-1 from human cervical B cells. Berry JD, Rutherford J, Silverman GJ, Kaul R, Elia M, Gobuty S, Fuller R, Plummer FA, Barbas CF.)

Las inmunoglobulinas basadas en IgG 1 de longitud completa se han usado ampliamente para tratar a los pacientes que sufren tumores sólidos, en particular aquellos que sobreexpresan un receptor de la clase erbB. Entre estos receptores están e EGFR (Her1), Her2, Her2neu, Her3 y Her4.

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Herceptin (trastuzumab, humAb4D5) es un producto basado en un anticuerpos monoclonal para usar en la terapia del cáncer de mama. El anticuerpo Herceptin es específico del epítopo 4D5 del dominio extracelular HER2 de her2neu (también denominado c-erbB-2 o MAC117).

El "dominio extracelular HER2" O "DEC HER2" se refiere a un dominio de HER2 que está fuera de una célula. anclado a una membrana celular, o en circulación. incluyendo fragmentos de los mismos, El dominio extracelular de HER2 puede comprender cuatro dominios: "Dominio I" (residuos de aminoácidos de aproximadamente 1-195 "Dominio II" (residuos de aminoácidos de aproximadamente 196-319), "Dominio III" (residuos de aminoácidos de aproximadamente 320-488), y "Dominio IV" (residuos de aminoácidos de aproximadamente 489-630) (numeración de residuos sin péptido señal),

El epítopo 4D5 es la región en el dominio extracelular de HER2 al que se une el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) y el trastuzumab. Este epítopo está cerca del dominio transmembrana de HER2 y dentro del dominio IV de HER2. El epítopo 4D5 de HER2 abarca uno cualquiera o más residuos en la región de aproximadamente el residuo 529 a aproximadamente el residuo 625, incluido el DEC de HER2., incluyendo la numeración de residuos el péptido señal.

El EGFR es una glicoproteína monomérica grande (1.186 residuos) con una única región transmembrana y un dominio tirosina quinasa citoplasmático flanqueados por regiones reguladoras no catalíticas. Los análisis de secuencia han mostrado que el ectodominio (residuos 1-621) contiene cuatro subdominios denominados en el presente documento L1, CR1, L2 y CR2, en los que L y CR son acrónimos de grande (large) y rico en cisteína (CR), respectivamente. Los dominios L1 y L2 también se han denominado dominios I y III, respectivamente. Los dominios CR también se han denominado anteriormente dominios II y IV, o S1.1-S1.3 yS2.1-S2.3, en los que S es la abreviatura de pequeño (small).

Se han desarrollado AcMo frente al dominio externo del EGFR que rompen la unión al receptor y la posterior transducción de señal. Los anticuerpos de bloqueo específicos de EGFR se han caracterizado con mayor detalle in vitro y en la actualidad se usan en estudios clínicos; estos son mAbC225 (ERBITUX/cetuximab), mAb425 (EMD72000) y el AcMo humano ABX-EGF. C225 (Cetuximab/Erbitux) está aprobado por la FDA para el cáncer colorrectal metastásico y mAb425 (EMD59000), cuya versión humanizada (EMD72000) está actualmente en ensayos clínicos de fase II para varios tipos de tumores sólidos que expresan EGFr. C225 se une a distintos epítopos sobre el dominio extracelular de EGFr. Se ha demostrado la unión independiente de ambos anticuerpos al receptor silvestre y al receptor mutante (EGFrVIII), que principalmente se expresa en células tumorales. Cetuximab interacciona exclusivamente con el dominio III de la región extracelular de EGFR (sEGFR), de modo que obstruye particularmente la región de unión al ligando sobre este dominio e impide estéricamente la dimerización del receptor.

El receptor mutante del EGF de origen espontáneo se demostró por primera vez en el glioblastoma. Conocido como EGFRvIII, esta molécula representa una deleción de los exones 2 a 7 en el dominio extracelular del receptor del EGF. Esto elimina 273 aminoácidos y crea una nueva glicina en la unión de la fusión. El EGFRvIII (denominado de forma variable 2-7 EGFR o delta EGFR) tiene una deleción dentro del marco del dominio extracelular y se encuentra en numerosos tipos de tumores humanos.

El documento WO9720858A1 se refiere a anticuerpos anti-Her2 que inducen apoptosis en células que expresan Her2. Por tanto, los anticuerpos monoclonales (AcMo) que se unen a Her2 se generan inmunizando ratones con Her2 soluble purificado.

El documento WO06087637A2 se refiere a anticuerpos que reconocen Her2/neu y ejercen un efecto antiproliferativo sobre las células que expresan Her2/neu. Este documento describe un anticuerpo aislado o un fragmento, variante o derivado del mismo, en particular, el fragmento Fab humano, y el fragmento scFv, capaces de unirse específicamente a Her2neu, sin embargo, sin actividad citotóxica.

Algunas divulgaciones de la técnica anterior se refieren a formatos de anticuerpo con potencial para inhibir el crecimiento tumoral, en ausencia de actividades citotóxicas, tales como ADCC,

Rovers et al (Cancer Immunol. Immunother. (2007) 56:303-317 describen nanocuerpos anti-EGFR con potencial para inhibir el crecimiento de células tumorales.

El documento WO03/075840A2 divulga anticuerpos que se unen a KDR con una afinidad comparable o superior a la que muestran por el VEGF humano y que neutralizan la activación de KDR, entre ellos los Fab monovalentes que neutralizan la activación de KDR, de modo que inhiben la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Se han propuesto otros fragmentos de Inmunoglobulina para terapia humana.

La solicitud de patente WO06036834A2 describe un péptido biológicamente activo incorporado como secuencia interna en la región bucle de un dominio Fc; la memoria se refiere a una molécula de la cual la secuencia peptídica interna se puede añadir mediante inserción o sustitución de aminoácidos en el dominio Fc existente previamente, Un péptido de ejemplo está dirigido a p185HER2/neu.

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Los péptidos dirigidos a Her2/neu los han descrito Park et al Nat. Biotechnol. (2000) 18(2):194-8. Aunque las afinidades de unión al péptido normalmente están en el límite inferior con una kD superior a 10-6 M, el mimético peptídico exocíclico anti-HER2/neu ejerció una afinidad anormalmente alta (KD=300 nM).

El documento WO01/01748A2 describe compuestos peptídicos que se unen al producto génico erbB2 con afinidades de unión bajas. Una proteína de fusión péptido de ejemplo-Fc dirigida a erbB2 se analizó en ensayos de unión competitiva, en los que se usan como competidores una cantidad baja del mismo tipo de péptidos, lo que tiene como resultado un valor de CI50 bajo que, sin embargo, no sería indicativo de un valor de Kd o de CE50, como se determina en un ensayo de saturación.

Es objetivo de la presente invención proporcionar mejores productos de inmunoglobulinas que se unen a superficies celulares.

El objetivo se alcanza con la materia sujeto conforme a lo reivindicado.

Sumario de la invención

La presente invención es tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se describe un anticuerpo modular citotóxico con un peso molecular de hasta 60 kDa, que se une específicamente a una superficie celular diana con una afinidad de unión de Kd<10-8 M, preferentemente en el intervalo nanomolar o inferior. La elevada afinidad del anticuerpo modular es, por tanto, de pequeño tamaño con la ventaja de una fácil penetración a través de una capa de células o tumor, para efectuar la lisis celular o la muerte celular en el sitio en el que se sobreexpresa la diana. Como alternativa, el anticuerpo modular puede tener una CI50<10-8 M, como se determina en un ensayo de unión de saturación.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención ejerce al menos uno de ADCC, ADCP, o CDC.

La actividad citotóxica del anticuerpo modular de acuerdo con la invención está determinada, preferentemente, por sus funciones efectoras, medidas mediante al menos una de las actividades ADCC, ADCP y CDC.

Un anticuerpo modular puede ser un oligómero de dominios del anticuerpo modular, en particular un oligómero de dominios de inmunoglobulina, o un fragmento de una inmunoglobulina de longitud completa. El anticuerpo puede ser un dímero seleccionado del grupo que consiste en los dímeros de VH/VL, CH1/CL, CH2/CH2, CH3/CH3, Fc y Fab, o cadenas sencillas de los mismos.

Un anticuerpo modular puede contener un sitio de unión que tiene una secuencia de anticuerpo aleatorizada y/o al menos un sitio de unión dentro de una región bucle estructural, que siempre se entiende que incluye potencialmente una secuencia de dominio terminal que podría estar contribuyendo a la unión al antígeno. El sitio de la secuencia de anticuerpos aleatorizada puede estar dentro de la región CDR o de la región de bucle estructural. Por tanto, la unión a una diana o a un ligando funcional, tal como una molécula efectora, que puede ser un ligando estructural, es posible incluso a través de una inmunoglobulina sin región CDR, o un sitio además de una región CDR.

El sitio de unión diana en la superficie celular puede localizarse en la región CDR, y el sitio de unión con especificidad por un ligando funcional o un ligando estructural está dentro de la región bucle estructural.

Como alternativa, el sitio de unión con especificidad por un ligando funcional o un ligando estructural puede estar dentro de la región bucle CDR y el sitio de unión de la diana en la superficie celular localizado en una región bucle estructural.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención tiene propiedades de unión específicas para unirse a una diana. que es un receptor de la clase erbB, tal como el seleccionado del grupo que consiste en EGFR, Her2, Her2neu, HER3 y HER4. Los anticuerpos modulares preferidos de acuerdo con la invención se proporcionan para usar en el tratamiento de pacientes que sufren un tumor sólido, en los que el tumor expresa un receptor de la clase erbB,

Son particularmente preferidos los anticuerpos modulares anti-Her2 que contienen una secuencia de aminoácidos dentro de EF, el bucle de una región bucle estructural, en los que la secuencia se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID Nº como se indican en las tablas 4 y 5, que están opcionalmente contenidas en un bucle EF y/o AB y/o CD.

Aunque había una prolongada necesidad de anticuerpos altamente eficaces pero de de pequeño tamaño, por primera vez fue posible obtener dicho anticuerpo modular de acuerdo con la invención, usando una biblioteca de dominios de anticuerpo modular, en particular una biblioteca de un oligómero de dominios de anticuerpo modular que se unen a un ligando efector. Determinados miembros de dicha biblioteca tienen ambas propiedades. la unión a la diana y la unión al ligando efector, como requisito previo para citotoxicidad biológica o citolisis. También se prefiere que el formato de un armazón de anticuerpo modular no se modifique produciendo variantes y bibliotecas de dicho armazón, por tanto, los miembros de la biblioteca seguirían manteniendo el formato funcional como determina la unión a un ligando armazón.

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De acuerdo con la invención se proporciona adicionalmente un método de producir un anticuerpo modular de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

a.

proporcionar una biblioteca de un oligómero de dominios de anticuerpo modular,

b.

poner en contacto dicha biblioteca con dicha diana en presencia de un ligando efector,

c.

seleccionar un miembro de la biblioteca que tenga ambas propiedades,

(i) afinidad por la unión a la diana de Kd<10-8 M o CI50<10-8 M, y (iI) actividad citotóxica. y

d.

fabricar una preparación del anticuerpo modular, como se expone en las reivindicaciones.

Los métodos de selección preferidos proporcionan la unión simultánea de ambos, la diana y el ligando efector, que supone una ventaja para una citolisis eficaz. La unión simultánea se determina, preferentemente, en un ensayo basado en células, con diferenciación bidimensional, por ejemplo en un sistema de FACS.

Preferentemente, los miembros de la biblioteca contienen una secuencia de anticuerpo aleatorizada, en los que el sitio de mutagénesis está dentro de la región bucle estructural, que potencialmente incluye una secuencia terminal.

La biblioteca como se usa en el método de la invención se produce, preferentemente, de acuerdo con un diseño que proporciona mutagénesis además de sitios de unión que interaccionan con el ligando efector. Por tanto, preferentemente se usa una biblioteca de calidad elevada, como se determina mediante medidas de control de la calidad usando ensayos de unión a la molécula efectora o unión al ligando armazón.

El método preferido de acuerdo con la invención comprende además la etapa de maduración de la afinidad para aumentar la afinidad de unión por la diana en la superficie celular. Esta maduración de la afinidad se realiza, preferentemente, mediante mutagénesis de una inmunoglobulina seleccionada que tiene una especificidad de unión determinada para unirse a la diana. sin producir reacciones cruzadas con las proteínas control, aún teniendo una afinidad media o baja. Preferentemente, un miembro de la biblioteca que tiene una afinidad de unión con una CI50 o Kd<10-6 M también se mutageneiza para proporcionar un ligante de afinidad madurada o un conjunto de dichos ligante, es decir, una biblioteca de ligante de afinidad madurada con una afinidad mayor con una CI50 o Kd<10-7 M, preferentemente con una CI50 o Kd<10-8 M, o incluso en el intervalo nanomolar o inferior. En este caso, se prefiere que el anticuerpo modular de acuerdo con la invención siga siendo funcional con respecto a su efecto citotóxico.

También se divulga un método de preparación de un anticuerpo modular de acuerdo con la invención para tratar a un paciente que sufra un tumor sólido, en el que el tumor expresa un receptor de la clase erbB,

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención es, preferentemente, para usar en el tratamiento de un paciente que sufre un tumor sólido, en el que el tumor expresa un receptor de la clase erbB,

Figura:

Figura 1:

Presentación esquemática de las PCR usadas para la producción de los fragmentos usados para montar la biblioteca Fcab01. Los cebadores de la PCR están indicados por flechas con su respectiva orientación 5'-3', y las líneas verticales indican las posiciones aproximadas para los sitios de restricción introducidos que se usaron para el ensamblaje del gen mutado. Los sitios de restricción están contenidos en los cebadores para las uniones de los fragmentos de la PCR.

Figura 2:

Secuencia de aminoácidos y estructura secundaria de un dominio CH3 (IMGT, numeración). El esquema de aleatorización se proporciona para las bibliotecas Fcab01 a Fcab06. Las posiciones aleatorizadas en el bucle AB y EF están marcadas con un círculo. X representa los 20 aminoácidos, z es solo Ala Asp, Ser, Tyr.

Figura 3:

estructura cristalina de un fragmento Fc de IgG1 (secuencia de aminoácidos)

Figura 4:

IgG humana que incluye modificaciones de aminoácidos aleatorizadas (secuencia de aminoácidos)

Figura 5:

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secuencia de aminoácidos de FcabRGD4L (secuencia de aminoácidos) Figura 6:

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vector pHENFcabRGD4 (secuencia de nucleótidos) Figura 7: 10 vector pHENFcabRGD4L (secuencia de nucleótidos) Figura 8 (SEC ID Nº 15): vector pHENFcabRGD4L (secuencia de nucleótidos)

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Figura 9 (SEC ID Nº 16): vector pYD1dXFc (secuencia de nucleótidos) 20 Figura 10 (SEC ID Nº 17): pYD1CH12 (secuencia de nucleótidos) Figura 11 (SEC ID Nº 18):

25

Fcab01 (secuencia de nucleótidos)

Figura 12 (SEC ID Nº 19): 30 Fcab02 (secuencia de nucleótidos) Figura 13 (SEC ID Nº 20):

Fcab03 (secuencia de nucleótidos)

35

Figura 14 (SEC ID Nº 21): Fcab04 (secuencia de nucleótidos) 40 Figura 15 (SEC ID Nº 22): Fcab05 (secuencia de nucleótidos) Figura 16 (SEC ID Nº 23):

45

Fcab06 (secuencia de nucleótidos) Figura 17 (SEC ID Nº 72): 50 vector pYD1 (secuencia de nucleótidos) Figura 18 (SEC ID Nº 73): vector pYD1Nhe modificado (secuencia de nucleótidos)

55

Figura 19 (SEC ID Nº 74): vector pYD1Ink (secuencia de nucleótidos) 60 Figura 20 (SEC ID Nº 75): vector pYD1mata (secuencia de nucleótidos)

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Figura 21 (SEC ID Nº 76):

vector pYD1gal (secuencia de nucleótidos)

Figura 22 (SEC ID Nº 77):

4D5H (secuencia de nucleótidos)

Figura 23 (SEC ID Nº 78):

4D5L (secuencia de nucleótidos)

Figura 24 (SEC ID Nº 79):

vector pYD4D5hc (secuencia de nucleótidos)

Figura 25 (SEC ID Nº 80):

4D5hp (secuencia de aminoácidos)

Figura 26 (SEC ID Nº 81):

vector pYD4D5hl (secuencia de nucleótidos)

Figura 27 (SEC ID Nº 82):

4D5Ip (secuencia de aminoácidos)

Figura 28 (SEC ID Nº 427):

plásmido pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt (secuencia de nucleótidos)

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Los términos específicos como se usan a lo largo de la memoria tienen los significados siguientes.

El término "inmunoglobulina" como se usa de acuerdo con la presente invención se define como polipéptidos o proteínas que pueden exhibir propiedades mono o bi o multiespecíficas, o de unión mono bi o multivalentes, preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres sitios de unión específicos para epítopos de, por ejemplo, antígenos, moléculas efectoras o proteínas de origen patógeno o de estructura humana, como autoantígenos que incluyen proteínas asociadas a células o séricas. El término inmunoglobulina como se usa en el presente documento también incluye fragmentos funcionales de un anticuerpo, tales como Fc, Fab, scFv, dímeros monocatenarios de los dominios CH1/CL , Fv, dímeros como VH/VL, CH1/CL, CH2/CH2, CH3/CH3, u otros derivados

o combinaciones de las inmunoglobulinas, como cadenas sencillas de pares de dominios de inmunoglobulina. La definición también incluye dominios de las cadenas pesadas y ligeras de la región variable (tales como dAb, Fd, VI, Vk, Vh, VHH) y la región constante o dominios individuales de un anticuerpo intacto, tal como CH1, CH2, CH3, CH4, Cl y Ck, así como minidominios que consisten en al menos dos hebras beta de un dominios de inmunoglobulina conectado por un bucle estructural.

"Anticuerpos modulares" como se usan en el presente documento se definen como moléculas de unión a antígeno, como anticuerpos humanos, compuestas por al menos un módulo polipeptídico o dominio proteico, preferentemente en la forma natural. La expresión "anticuerpos modulares" incluye moléculas de unión a antígeno que son inmunoglobulinas, proteínas similares a inmunoglobulinas, u otras proteínas que exhiben formatos modulares y propiedades de unión a antígeno similares a las inmunoglobulinas o anticuerpos, que se pueden usar como armazones de unión a antígeno, preferentemente basados en proteínas humanas.

La expresión "molécula similar a inmunoglobulina" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier proteína de unión a antígeno, en particular a una proteína humana, que tiene una estructura de dominio que puede construirse de una forma modular. Las moléculas similares a inmunoglobulinas pueden ser receptores de linfocitos T (TCR) o partes solubles de los mismos, fibronectina, transferrina, CTLA-4, receptores antigénicos monocatenarios, por ejemplo los relacionados con los receptores de linfocitos T y anticuerpos, miméticos de anticuerpos, adnectinas, anticalinas, filómeros, proteínas de repetición tales como repeticiones de anquirina, avímeros, Versabodies™, moléculas basadas en la toxina del escorpión, y otros armazones proteicos que no son anticuerpos con propiedades de unión a antígeno.

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Las repeticiones de anquirina (AR), repeticiones de armadillo (ARM), repeticiones ricas en leucina (LRR) y repeticiones de tetratricopéptidos (TPR) son los miembros más importantes de la clase de proteínas de proteínas con repeticiones. Las proteínas con repeticiones están compuestas por unidades estructurales homólogas (repeticiones) que se apilan para formar dominios alargados. La interacción de unión normalmente está mediada por varias repeticiones adyacentes, lo que conduce a superficies de interacción con la diana grandes.

Los avímeros contienen dominios A como cuerdas de varios dominios en diversos receptores de superficie celular. Los dominios de esta familia se unen de forma natural sobre 100 dianas conocidas diferentes, incluyendo moléculas pequeñas, proteínas y virus. El análisis del truncamiento ha mostrado que una diana normalmente se pone en contacto mediante múltiples dominios A con cada dominio de unión de forma independiente a un epítopo único. La avidez generada combinando varios dominios de unión es un potente abordaje para incrementar la afinidad y la especificidad, que estos receptores han explotado durante la evolución.

Las anticalinas son proteínas humanas modificadas que derivan del armazón de la lipocalina con propiedades de unión prescritas típicas de los anticuerpos humanizados-Las lipocalinas comprenden 160-180 aminoácidos y forman proteínas del barril beta cónico con una cavidad de unión a ligando rodeada de cuatro bucles. Compuestos hidrófobos pequeños son los ligandos naturales de las lipocalinas y se han podido aislar diferentes variantes de la lipocalina con nuevas especificidades del compuesto (también denominadas "anticalinas" después de aleatorizar los residuos en esta cavidad de unión.

Los receptores antigénicos monocatenarios contienen un único dominio variable y son un 20 % más pequeños que los anticuerpos de dominio único de los camélidos.

Los filómeros son péptidos derivados de fragmentos proteicos naturales biodiversos.

Se entiende que la expresión "anticuerpo modular", "inmunoglobulina". "proteínas similares a inmunoglobulina" incluye también un derivado de los mismos. Un derivado es cualquier combinación de uno o más anticuerpos modulares de la invención y o una proteína de fusión en la que cualquier dominio o minidominio del anticuerpo modular de la invención se puede fusionar en cualquier posición de una o más de otras proteínas (tales como otros anticuerpos modulares, inmunoglobulinas, ligandos, proteínas armazón, enzimas, toxinas y similares). Un derivado del anticuerpo modular de la invención también se puede obtener mediante asociación o unión a otras sustancias mediante varias técnicas químicas, tales como acoplamiento covalente. interacción electrostática, puentes disulfuro etc. Las otras sustancias unidas a las inmunoglobulinas pueden ser lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas, o cualquier combinación de las mismas (p. ej., PEG, profármacos o fármacos). Un derivado también comprendía un anticuerpo con la misma secuencia de aminoácidos pero formado completa o parcialmente por aminoácidos no naturales o modificados químicamente. El término derivado también incluye fragmentos y equivalentes funcionales. Los derivados preferidos todavía son funcionales con respecto a la unión a la diana y a la actividad citotóxica.

Un "bucle estructural" o un "bucle no CDR", como se usa en el presente documento, debe entenderse del siguiente modo: anticuerpos modulares, inmunoglobulinas o sustancias similares a inmunoglobulinas están formadas por dominios con un denominado pliegue de inmunoglobulina. En esencia, las láminas beta antiparalelas están conectadas por bucles para formar un barril beta antiparalelo comprimido. En la región variable, algunos de los bucles de los dominios contribuyen esencialmente a la especificidad del anticuerpo, es decir, la unión a un antígeno mediante el sitio de unión natural de un anticuerpo. Estos bucles se denominan bucles CDR. Los bucles CDR se localizan dentro de la región bucle CDR, que pueden, en algunos casos, también incluir parte de la región marco variable (denominada "VFR"), que es adyacente a los bucles CDR. Se sabe que algunos bucles del VFR pueden contribuir a la cavidad de la unión a antígeno de un anticuerpo, que por lo general está determinada principalmente por los bucles CDR. Por tanto, dichos bucles VFR se consideran parte de la región bucle CDR, y no se usarían adecuadamente para modificar los nuevos sitios de unión a antígeno. Los bucles al lado de la cavidad de unión a antígeno o región bucle CDR, denominados bucles estructurales o bucles no CDR. Al contrario que el VFR dentro de la región bucle CDR, o localizado proximal a los bucles CDR, otros bucles del VFR de los dominios variables se considerarían bucles estructurales. Estos son, preferentemente, bucles estructurales. del VFR localizado en oposición a la región bucle CDR, o en el lado C-terminal de un dominios de inmunoglobulina variable. Los dominios constantes tienen bucles estructurales. dentro de una región bucle estructural, por ejemplo, en el lado en C-terminal de un dominio de anticuerpo

o en el lado N-terminal, incluso dentro de una cadena lateral de un dominio de anticuerpo. Los dominios constantes también se denominan parte de la región marco.

El término "antígeno" o "diana" como se usa en el presente documento incluirá, en particular, todos los antígenos y moléculas diana capaces de ser reconocidos por un sitio de unión de un anticuerpo modular. Antígenos específicamente preferidos como dianas por la molécula son los antígenos o moléculas que ya se ha demostrado que son o pueden ser inmunológica o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellos para los que se ha probado la eficacia clínica.

El término "diana" o "antígeno" como se usa en el presente documento comprenderá, en particular, moléculas seleccionadas del grupo que consiste en alérgenos, antígenos asociados con tumores, autoantígenos que incluyen

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receptores de la superficie c celular, enzimas, receptores Fc, FcRn, HSA, IgG, interleucinas o citocinas, proteínas del sistema del complemento, proteínas transportadoras, moléculas séricas, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y antígenos virales, también moléculas responsables de la encefalitis espongiforme transmisible (EET), tales como priones, infecciosos o no, y marcadores o moléculas relacionadas con afecciones inflamatorias, tales como factores proinflamatorios, esclerosis múltiple o enfermedad de Alzheimer, u otros haptenos.

La expresión "antígenos de la superficie celular" incluirá todos los antígenos capaces de ser reconocidos por una estructura de anticuerpo sobre la superficie de una célula, y fragmentos de dichas moléculas. Los antígenos de la superficie celular son los antígenos que ya se ha demostrado que son o pueden ser inmunológica o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellos para los que se ha probado una eficacia clínica o preclínica. Ejemplos incluyen moléculas de la superficie celular que participan en la actividad de la muerte celular. Tras la unión de la inmunoglobulina de acuerdo con la invención a, preferentemente, al menos dos de las moléculas de la superficie celular, el sistema inmunológico proporciona citolisis o muerte celular, por tanto, se puede proporcionar un medio potente para atacar a las células humanas.

El antígeno es reconocido como molécula diana entera o como un fragmento de dicha molécula, especialmente subestructuras de dianas, generalmente denominadas epítopos. Las subestructuras de los antígenos se denominan, por lo general, "epítopos" (p. ej., epítopos de linfocitos B, epítopos de linfocitos T), siempre que sean inmunológicamente relevantes, es decir son también reconocibles por anticuerpos naturales o monoclonales. El término "epítopo" como se usa en el presente documento se referirá, en particular, a una estructura molecular que puede formar completamente una pareja de unión específica o ser parte de una pareja de unión específica a un sitio de unión de un anticuerpo modular o una inmunoglobulina. El término epítopo puede también hacer referencia a haptenos. Químicamente, un epítopo puede estar compuesto por un hidrato de carbono, un péptido, un ácido graso, una sustancia orgánica, bioquímica o inorgánica, o derivados de los mismos y cualquier combinación de los mismos. Si un epítopo es un polipéptido, normalmente incluirá al menos 3 aminoácidos, preferentemente de 8 a 50 aminoácidos, y, más preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 aminoácidos en el péptido. No existe un límite superior crítico de la longitud del péptido, que pudiera comprometer a casi toda la longitud de una secuencia polipeptídica de una proteína. Los epítopos pueden ser epítopos lineales o conformacionales Un epítopo lineal está compuesto por un único segmento de una secuencia primaria de una cadena polipeptídica. Los epítopos lineales pueden ser contiguos o solapantes. Los epítopos conformacionales están compuestos por aminoácidos juntados plegando el polipéptido para formar una estructura terciaria y los aminoácidos no son necesariamente adyacentes entre si en la secuencia lineal. Específicamente, los epítopos son, al menos, parte de moléculas relevantes en términos diagnósticos, es decir, la ausencia o presencia de un epítopo en una muestra se correlaciona de forma cualitativa o cuantitativa con una enfermedad o el estado de salud de un paciente o con un estado del proceso de fabricación o con el estado ambiental

o de alimentación los epítopos pueden ser, al menos, parte de moléculas relevantes en términos terapéuticos, es decir, moléculas que pueden estar dirigidas por el dominio de unión específica que cambia la evolución de la enfermedad

Como se usa en el presente documento, la expresión "se une específicamente" o "unión específica" se refiere a una reacción de unión que determina el ligando afín de interés en una población heterogénea de moléculas. Por tanto, en las condiciones indicadas (p. ej., condiciones de inmunoensayo), el anticuerpo modular se une a su diana concreta y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en una muestra. La unión específica significa que la unión es selectiva en términos de identidad de la diana, afinidad de unión o avidez alta, media o baja, según se seleccione. La unión selectiva normalmente se consigue si la unión constante o la dinámica de unión es, al menos, 10 veces diferente, preferentemente, la diferencia es de al menos 100 veces. y, más preferentemente, al menos 1.000 veces.

La expresión "sistema de expresión" se refiere a moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia de codificación deseada y secuencias control en unión operable, de modo que los huéspedes transformados o transfectados con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Con el fin de efectuar la transformación, el sistema de expresión puede estar incluido en un vector, sin embargo, el ADN relevante puede también estar integrado en el cromosoma del huésped. Como alternativa, se puede usar un sistema de expresión para la transcripción/traducción in vitro.

Toda la numeración de las secuencia de aminoácidos de las inmunoglobulinas es conforme al esquema de numeración de IMGT (IMGT, the international ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212).

La expresión "agente de unión" o "ligando" se refiere a un miembro de un par de unión, en particular polipéptidos de unión que tienen el potencial de servir como dominio de unión para una pareja de unión. Ejemplos de parejas de unión incluyen parejas de agentes de unión con interacciones funcionales, tales como receptores que se unen a ligandos, anticuerpos que se unen a antígenos o receptores, un fármaco que se une a una diana, u y enzimas que se unen a un sustrato.

La expresión "proteínas de fusión" o "proteínas de fusión quimérica" deberá significar la molécula compuesta por un paquete genético, al menos parte de una estructura de superficie externa, tal como una proteína de la cubierta, opcionalmente una secuencia ligadora, y un agente de unión. La proteína de fusión está codificada por un vector con el gen del agente de unión e información para expresar una copia del agente de unión en la superficie del paquete

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genético.

El término "citotóxico" o "actividad citotóxica" se refiere a cualquier molécula específica dirigida contra antígenos naturales que, cuando se unen al antígeno, que activa la vía del complemento o activa a las células asesinas, lo que tiene como resultado lisis celular o desencadena apoptosis. En particular, se refiere a la actividad sobre las células efectoras que tienen como resultado la activación de los linfocitos T citotóxicos o células que median en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o la fagocitosis celular (ADCP). También se refiere a un efecto apoptótico, de modo que se desencadena la muerte celular programada (PCD). Por tanto, los anticuerpos modulares de acuerdo con la invención matan las células diana recubiertas con anticuerpo, opcionalmente mediante la unión a los receptores Fc de las células efectoras o mediante la inducción de la muerte celular programada.

"Armazón" significará un marco temporal, natural o artificial, usado para soportar la estructura molecular de un polipéptido en la construcción de variantes o un repertorio del polipéptido. Normalmente, es un sistema modular de dominios polipeptídicos que mantiene la estructura terciaria o la función de la molécula parental. Ejemplos de armazones son anticuerpos modulares, que pueden mutageneizarse para producir variantes dentro de dicho armazón, para obtener una biblioteca.

La expresión "ligando estructural" significa un ligando que se une a un armazón o a la estructura de anticuerpos modulares, de modo que se determina la estructura molecular o la función primaria y la especificidad de dicho anticuerpo modular. En casos preferidos, el ligando estructural es un ligando funcional, que media en una función biológica tras la unión, como un ligando efector. En una realización alternativa, el ligando estructural es un ligando funcional, que es una diana específica unida por la región CDR o región bucle estructural. El mismo ligando estructural se puede unir a muchas variantes de un anticuerpo modular con independencia de sus especificidades por la diana. Por lo general, la presencia de un sitio de unión al ligando estructural indica que la variante se expresa y se pliega de forma correcta. Por tanto, la unión del ligando estructural a su sitio de unión proporciona un método para preseleccionar, coseleccionar, caracterizar y detectar de forma selectiva polipéptidos funcionales de un repertorio de polipéptidos. El diseño de variantes de anticuerpos modulares que conservan la propiedad de unión a un ligando estructural evita la preparación de variantes que son no funcionales, por ejemplo, como resultado de la introducción de mutaciones, mutantes de plegamiento o mutantes de expresión que serían o son incapaces de unirse a sustancialmente cualquier diana o ligando efector. Dichos mutantes no funcionales en ocasiones se generan mediante la aleatorización normal y procedimientos de variación usados en la construcción de repertorios de polipéptidos. Proporcionar mutantes funcionales que se unen a un ligando estructural permite al experto en la técnica preparar una biblioteca de anticuerpos modulares que está enriquecida en miembros de la biblioteca funcionales, bien plegados y altamente expresados. Por ejemplo, el armazón puede ser un Fab parental y al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, más preferentemente al menos un 40 % de las variantes del Fab parental se unen a la CDR-diana de dicho Fab parental.

La expresión "ligando efector" significa un ligando que participa en las funciones efectoras, como una molécula efectora. Ejemplos de ligandos efectores son receptores Fc o moléculas similares a receptores Fc que interfieren en las inmunoglobulinas. Un receptor Fc es una proteína que se encuentra sobre la superficie de determinadas células, incluyendo las células asesinas naturales, macrófagos, neutrófilos, y mastocitos, que contribuyen a las funciones protectoras del sistema inmunológico. Su nombre deriva de su especificidad de unión para una parte de un anticuerpo conocido como la región Fc (fragmento cristalizable). Los receptores Fc se unen a los anticuerpos que están unidos a las células infectadas o patógenos invasores. Su actividad estimula las células fagocíticas o citotóxicas para destruir microbios, o células infectadas por la fagocitosis celular mediada por anticuerpos (ADCP) o citotoxicidad mediada por las células dependientes de anticuerpos (ADCC). Existen varios tipos diferentes de receptores Fc., que se clasifican basándose en el tipo de anticuerpos que reconocen, por ejemplo, los que se unen a la clase más frecuente de anticuerpos, IgG, se denominan receptores Fc.-gamma (FcyR), los que se unen a IgA se denominan receptores Fc-alfa (FcaR) y los que se unen a IgE se denominan receptores Fc-epsilon (FcsR). Equivalente a un ligando efector y, por tanto, incorporado en la definición es un ligando sustituto que reconoce el mismo sitio de unión o uno similar dentro del anticuerpo modular, tal como la proteína A.

Todos los FcyR pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y son los receptores Fc más importantes para inducir la fagocitosis de los microbios opsonizados (recubiertos). Esta familia incluye varios miembros; por ejemplo FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32a), FcyRIIB (CD32b), FcyRIIIA (CD16a), FcyRIIIB (CD16b); que difieren en sus afinidades de los anticuerpos debido a su estructura molecular diferente. Por ejemplo, FcyRI se une a IgG con más fuerza que FcyRII y FcyRI11, y tiene una porción extracelular compuesta por tres dominios de tipo inmunoglobulina (Ig), un dominio más que FcyRII y FcyRIII. Estas propiedades permiten la activación de FcyRI por una única molécula de IgG (o monómero), mientras que los últimos dos receptores Fcy deben unirse a múltiples moléculas de IgG dentro de un complejo inmunitario a activar.

Otro FcR se expresa en varios tipos celulares y tiene una estructura similar al MHC de clase I. Este receptor también se une a IgG y está implicado en la conservación de este anticuerpo. Sin embargo, dado que este receptor Fc también está implicado en la transferencia de la IgG de una madre a través de la placenta a su feto o en la leche al lactante, se denomina receptor Fc neonato (FcRn). Recientemente, este receptor se ha implicado en la participación en la

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homeostasis de los niveles séricos de IgG.

La citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) es un mecanismo de inmunidad celular en el que una célula efectora del sistema inmunológico lisa de forma activa una célula diana que a la que se han unido anticuerpos específicos. Es uno de los mecanismos a través de los cuales los anticuerpos, como parte de la respuesta inmunológica humoral, puede actuar para limitar y contener la infección. La ADCC clásica está mediada por las células asesinas naturales (NK); los monocitos y eosinófilos también pueden participar en la ADCC. Por ejemplo, los eosinófilos pueden matar determinados gusanos parasitarios conocidos como helmintos a través de la ADCC. La ADCC es parte de la respuesta inmunológica adaptativa debido a su dependencia de una respuesta de anticuerpos anterior.

El término "extraño" en el contexto de aminoácidos significará que los aminoácidos recién introducidos de origen natural, pero extraños del sitio de modificación, o sustitutos de los aminoácidos de origen natural.. "Extraño" con referencia a sitios de unión a antígeno significa que el sitio de unión a antígeno no está formado de forma natural mediante la región de unión específica del agente, y una pareja de unión extraña, pero no la pareja de unión natural del agente, se une al sitio de unión recién modificado por ingeniería.

La expresión "región de unión variable", en ocasiones denominada "región CDR" como se usa en el presente documento se refiere a las moléculas con estructuras variables capaces de producir interacciones de unión con antígenos. Dichas moléculas se pueden usar como tales o integrarse dentro de una proteína más grande, de modo que se forma una región específica de dicha proteína con la función de unión. Las estructuras variables pueden derivar de repertorios naturales de proteínas de unión, tales como inmunoglobulinas o filómeros o diversidad sintética, incluyendo proteínas de repeticiones, avímeros y anticalinas. Las estructuras variables también se pueden producir mediante técnicas de aleatorización, en particular las descritas en el presente documento. Estas incluyen regiones CDR o no CDR mutageneizadas, regiones bucle de dominios variables o dominios constantes de inmunoglobulinas.

Los agentes de unión modificados con diferentes modificaciones en sitios específicos se denominan "variantes". Las variantes de un armazón se agrupan, preferentemente, para formar bibliotecas de agentes de unión, que se pueden usar para seleccionar miembros de la biblioteca con funciones prefeterminadas. De acuerdo con ello, una secuencia de anticuerpos está, preferentemente, aleatorizada, por ejemplo métodos de mutagénesis. De acuerdo con una realización preferida, una región bucle de un agente de unión, tal como la secuencia de anticuerpo parental que comprende las posiciones dentro de uno o más bucles o en un sitio terminal, que contribuye potencialmente a un sitio de unión, preferentemente se muta o modifica para producir bibliotecas, preferentemente mediante métodos de mutagénesis aleatoria, semialeatoria o, en particular, aleatoria dirigida a sitio, en particular para eliminar, intercambiar

o introducir insertos generados aleatoriamente en bucles o una región bucle, preferentemente en la región bucle CDR

o en la región bucle estructural, que pueden incluir secuencias terminales, que se localizan en uno de los extremos de un dominio de anticuerpo o subestructura.

Como alternativa, se prefiere el uso de abordajes combinatorios. Se puede usar cualquiera de los métodos de mutagénesis conocidos, entre ellos la mutagénesis por casete. Estos métodos se pueden usar para realizar modificaciones de aminoácidos en las posiciones deseadas de la inmunoglobulina de la presente invención. En algunos casos, las posiciones se eligen de forma aleatoria, por ejemplo, con cualquiera de los posibles aminoácidos o una selección de aminoácidos preferidos para aleatorizar las secuencias bucle, o se realizan cambios de aminoácidos usando normas simples. Por ejemplo, todos los residuos se pueden mutar, preferentemente, en aminoácidos específicos, tales como alanina, denominado escaneo de aminoácidos o de alanina. Dichos métodos se pueden acoplar a abordajes de ingeniería más sofisticados que usan métodos de selección para detectar niveles mayores de diversidad de secuencia.

El anticuerpo modular citotóxico de acuerdo con la invención con un peso molecular inferior a 60 kDa o hasta 60 KDa tiene un tamaño pequeño en comparación con los anticuerpos de longitud completa. El tamaño preferido es de hasta 55 kDa. Los dominios sencillos de anticuerpos modulares normalmente tienen un tamaño molecular de 10-15 kDa, por tanto, una molécula basada en, o que consiste en, 4 dominios de anticuerpos modulares tendrían un tamaño molecular de 40-60 kDa, dependiendo de la glicosilación o cualquier conjugación adicional de sustancias farmacológicamente activas, como toxinas o péptidos.

El formato preferido es un oligómero, compuesto de dominios de anticuerpos modulares, preferentemente hasta 4 dominios, más preferentemente 3 dominios, e incluso más preferentemente, basado en 2 dominios, en el que el oligómero comprende, preferentemente, un heterodímero, tal como Fab, o un homodímero, tal como Fc. Habitualmente se piensa que los formatos basados en la combinación de 5 dominios de anticuerpos modulares o más no ejercen las ventajas específicas de los fragmentos de anticuerpo de tamaño pequeño, que son fáciles de expresar en varios sistemas de expresión y penetración de tejidos.

Es viable proporcionar un anticuerpo modular como un anticuerpo de dominio único. Sin embargo, los dominios de anticuerpo tienden a dimerizar tras la expresió, bien como homodímero, como un Fc, o un heterodímero, como un Fab. Por tanto, la estructura dimérica se considera ventajosa para proporcionar una molécula estable. Los dímeros preferidos de los dominios de inmunoglobulinas se seleccionan del grupo que consiste en dímeros de dominio único.,

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como VH/VL, CH1/CL (kappa o lambda), CH2/CH2 y CH3/CH3. Los dímeros u oligómeros de los dominios de anticuerpo modular también se pueden proporcionar como moléculas monocatenarias o bicatenarias. En particular, los que unen el extremo C de un dominio al extremo N de otro,

Las parejas de unión son agentes que se unen específicamente uno a otro, normalmente a través de las interacciones no covalentes. Ejemplos de parejas de unión incluyen parejas de agentes de unión con interacciones funcionales, tales como receptores que se unen a ligandos, anticuerpos que se unen a antígeno, un fármaco que se une a una diana, u y enzimas que se unen a un sustrato. Las parejas de unión han encontrado utilidad en muchas aplicaciones terapéuticas, diagnósticas, analíticas e industriales. Las parejas de unión más prominentes son anticuerpos o inmunoglobulinas, fragmentos o derivados de los mismos. En la mayoría de los casos, se requiere que la unión de dichos agentes de unión medie en un efecto o una función biológica, una "interacción funcional".

El anticuerpo modular citotóxico puede ser un agente de unión, que es una inmunoglobulina de origen humano o murino, o se puede usar para varios fines, en particular en composiciones farmacéuticas. Por supuesto, la inmunoglobulina modificada también puede ser una inmunoglobulina humanizada o quimérica.

El agente de unión, que es una inmunoglobulina humana, se selecciona, o deriva, preferentemente, del grupo que consiste en IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. El agente de unión murino se selecciona, o deriva, preferentemente, del grupo que consiste en, IgA IgD, IgE, IgG 1, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 e IgM.

Dicho agente de unión comprende, preferentemente, una cadena pesada y/o ligera o parte de las mismas. Una inmunoglobulina modificada puede comprender una cadena pesada y/o ligera, al menos un dominio variable y/o constante, o una parte del mismo que incluye un minidominio.

Un dominio constante es una unidad de pliegue de inmunoglobulina de la parte constante de una molécula de inmunoglobulina, también se denomina dominio de la región constante (p. ej., CH1, CH2, CH3, CH4, Ck, Cl).

Un dominio variable es una unidad de pliegue de inmunoglobulina de la parte variable de una inmunoglobulina, también se denomina dominio de la región variable (p. ej., Vh, Vk, Vl, Vd)

Un ejemplo de anticuerpo modular puede consistir en un dominio constante seleccionado del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C, combinaciones, derivados o una parte de los mismos, incluido un minidominio, con al menos una región bucle, y se caracteriza porque dicha al menos una región bucle comprende al menos una modificación de aminoácidos que forma al menos una región bucle modificada, en el que dicha al menos una región bucle modificada se une específicamente a al menos un epítopo de un antígeno.

Otro anticuerpo modular puede consistir en un dominio variable de una cadena pesada o ligera, combinaciones, derivados o una parte de los mismos, incluido un minidominio, con al menos una región bucle, y se caracteriza porque dicha al menos una región bucle comprende al menos una modificación de aminoácidos que forma al menos una región bucle modificada, en el que dicha al menos una región bucle modificada se une específicamente a al menos un epítopo de un antígeno.

El anticuerpo modular puede comprender uno o más dominios (p. ej., al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, diez dominios). Si en el anticuerpo modular hay presente más de un dominio, estos dominios pueden ser del mismo tipo o de varios tipos (p. ej., CH1-CH1-CH2, CH3-CH3, (CH2)2-(CH3)2, con o sin la región bisagra). Por supuesto, asimismo, el orden de los dominios sencillos puede ser de cualquier tipo (p. ej., CH1-CH3-CH2, CH4-CH1-CH3-CH2).

En el presente documento se divulgan partes de anticuerpos, tales como partes de IgG, IgA, IgM, IgD, IgE y similares. Los anticuerpos modulares también puede ser un fragmento de anticuerpo funcional , tal como Fab, Fab2, scFv, Fv, Fc, Fcab™, un Fc de unión a antígeno, o partes de los mismos, u otros derivados o combinaciones de las inmunoglobulinas, tales como minicuerpos, dominios de cadenas pesadas y ligeras de la región variable (tales como dAb, Fd, VL, incluyendo Vlambda y Vkappa, VH, VHH) así como minidominios que consisten en dos hebras beta de un dominio de inmunoglobulina conectados por al menos dos bucles estructurales, como dominios aislados o en el contexto de moléculas asociadas de forma natural. En el presente documento también se divulga el fragmento Fc de una molécula de anticuerpo, bien como fragmento Fc de unión a antígeno (Fcab™) mediante modificaciones de la secuencia de aminoácidos o como conjugados o fusiones a receptores, péptidos u otros módulos de unión a antígeno, tales como scFv.

Los anticuerpos modulares se pueden usar como polipéptidos aislados o como moléculas de combinación, por ejemplo mediante técnicas de recombinación, fusión o conjugación, con otros péptidos o polipéptidos. Los péptidos son, preferentemente, homólogos a las secuencias de los dominios de inmunoglobulina, y, preferentemente, tienen una longitud de al menos 5 aminoácidos, más preferentemente, una longitud de al menos 10 o incluso al menos 50 o 100 aminoácidos, y constituyen al menos parcialmente la región bucle del dominio de inmunoglobulina. Las características de unión preferidas se refieren a la unión, afinidad y avidez por el epítopo predefinidas.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención se combina, posiblemente, con uno o más anticuerpos modulares

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modificados o con anticuerpos modulares sin modificar, o partes de los mismos, para obtener un anticuerpo modular de combinación. Preferentemente, las combinaciones obtenidas mediante técnicas de recombinación, pero también mediante unión a través de adsorción, interacciones electrostáticas o similares. o incluso a través de la conjugación o unión química con o sin un ligador. La secuencia ligadora preferida es una secuencia ligadora natural o una secuencia artificial funcionalmente adecuada.

En general, el anticuerpo modular de acuerdo con la invención se puede usar como bloque componente para combinar molecularmente otros anticuerpos modulares o sustancias o moléculas biológicamente activas. Se prefiere combinar molecularmente al menos un anticuerpo que se une a la pareja específica mediante las secuencias variables o no variables, como bloques estructurales, con al menos otra molécula de unión que puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, un receptor soluble, un ligando u otro dominio de anticuerpo, o un resto de unión del mismo. Otras combinaciones se refieren a moléculas proteináceas, ácidos nucleicos, lípidos, moléculas orgánicas e hidratos de carbono.

Las moléculas modificadas por ingeniería de acuerdo con la presente invención serán útiles como moléculas autónomas, así como proteínas o derivados de fusión, lo más normalmente fusionados antes o después de la modificación de un modo tal que forme parte de estructuras más grandes, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completo, o partes de los mismos. Por tanto, las inmunoglobulinas o proteínas de fusión también comprenden fragmentos Fc., fragmentos Fab, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena única, en particular fragmentos Fv monocatenarios, scFv bi o multiespecíficos, diacuerpos, unicuerpos, multicuerpos, multivalentes o multímeros de dominios de inmunoglobulina y otros. Será posible usar las proteínas modificadas por ingeniería para producir moléculas que son monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas, e incluso pueden portar más especificidades. Es posible controlar y preseleccionar la valencia de unión al mismo tiempo de acuerdo con los requisitos del uso planificado de dichas moléculas.

El anticuerpo modular ejerce opcionalmente una o más regiones de unión a antígenos, incluyendo el sitio de unión que se une específicamente a la diana de la superficie celular y los sitios de unión que participan en la función efectora. Los sitios de unión a antígeno a uno o más antígenos pueden estar presentados por la región CDR o cualquier otra estructura de unión al receptor natural, o introducir en una región bucle estructural de un dominio de anticuerpo,, de una estructura de dominio variable o constante. Los antígenos como se usan para analizar las propiedades de unión de los sitios de unión pueden ser moléculas de origen natural o moléculas sintetizadas químicamente o moléculas recombinantes, bien en solución o en suspensión, por ejemplo localizados sobre o en partículas tales como fases sólidas, sobre o en las células o sobre las superficies virales. Se prefiere que la unión de una inmunoglobulina a un antígeno se determina cuando el antígeno todavía está adherido o unido a moléculas y estructuras en el contexto natural. De este modo, es posible identificar y obtener las inmunoglobulinas modificadas que son más adecuadas para el fin del uso diagnóstico o terapéutico.

El anticuerpo modular o los dominios de inmunoglobulina pueden modificarse (como se usa en el presente documento, los términos inmunoglobulina y anticuerpo son intercambiables), modificaciones que preferentemente se efectúan en dominios de inmunoglobulina o partes de los mismos que están en secuencias terminales, preferentemente una secuencia C-terminal, y/o parte de una región bucle, que contiene un bucle, bien un bucle CDR o un bucle no CDR, siendo los bucles estructurales, los sitios preferidos de modificaciones o mutagénesis. De acuerdo con una realización específica, la región bucle estructural también incluye una secuencia terminal, que contribuye a la unión a antígeno. En algunos casos, es preferible usar un bucle estructural modificado definido o una región bucle estructural, o partes de los mismos, como moléculas aisladas para fines de unión o combinación.

El anticuerpo modular puede unirse a dicha diana de la superficie celular mediante al menos parte de un bucle estructural y/o un bucle CDR.

Como alternativa, el anticuerpo modular puede unirse a dicho ligando efector, o un ligando sustituto para dicho ligando efector, como la proteína A. a través de al menos parte de un bucle estructural y/o bucle CDR, de modo que media en la función efectora.

En una realización preferida, el agente de unión se une a su estructura de unión nativa o modificada o sitio de unión recién formado, específicamente a al menos dos de estos epítopos que son idénticos o difieren entre sí, bien del mismo antígeno o de diferentes antígenos.

En una estructura de dominio preferida de un agente de unión, se prefiere modificar o aleatorizar el anticuerpo modular dentro de al menos una región bucle o región terminal, que tiene como resultado una sustitución, deleción y/o inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, preferentemente una mutación puntual, o incluso el intercambio de bucles enteros, más preferentemente el cambio de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, hasta 30 aminoácidos: De este modo, la secuencia modificada comprende aminoácidos no incluidos en las regiones conservadas de los bucles, siendo los aminoácidos recién introducidos de origen natural, pero extraños del sitio de modificación, o sustitutos de los aminoácidos de origen natural.

Sin embargo, el número máximo de aminoácidos insertados en una región bucle de un agente de unión puede,

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preferentemente, no superar el número 30, preferentemente 25, más preferentemente 20 aminoácidos como máximo. La sustitución y la inserción de los aminoácidos se produce, preferentemente, de forma aleatoria o semialeatoria usando todos los posibles aminoácidos o una selección de aminoácidos preferidos para fines de aleatorización, mediante métodos conocidos en la técnica y como se divulgan en la presente solicitud de patente.

El sitio de modificación puede estar en un bucle único específico o una región bucle, en particular, un bucle estructural

o una región bucle estructural. Una región bucle normalmente está compuesta por al menos dos, preferentemente al menos 3 o al menos 4 bucles que son adyacentes entre sí, y que pueden contribuir a la unión de un antígeno a través de la formación de un sitios de unión a antígeno o cavidad de unión a antígeno. Se prefiere que uno o más sitios de modificación se localicen dentro del área de 10 aminoácidos, más preferentemente en 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 hasta 100 aminoácidos, en particular dentro de una región estructural para formar una superficie o cavidad en la que el antígeno puede acceder estéricamente a las regiones bucle.

A este respecto, las modificaciones preferidas se someten a ingeniería en las regiones bucle de CH1, CH2, CH3 y CH4, en particular en el intervalo de los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25 a 39, los aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 89 a 103 y los aminoácidos 106 a 117, o dentro de las secuencia terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos de los extremos C o N del dominios de anticuerpo modular.

En otra realización preferida, una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 92 a 98 se combina con una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 8 a 20.

Las regiones de los aminoácidos identificados anteriormente de las respectivas inmunoglobulinas comprenden regiones bucle a modificar. Preferentemente, una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 92 a 98 se combina con una modificación en uno o más de los otros bucles estructurales.

En otra realización preferida, una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 92 a 98 se combina con una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 41 a 45,2.

Lo más preferentemente, cada uno de los bucle que comprende los aminoácidos 92 a 98, los aminoácidos 41 a 45,2 y los aminoácidos 8 a 20 contienen al menos una modificación de aminoácido.

En otra realización preferida, cada uno de los bucles estructurales que comprende los aminoácidos 92 a 98, los aminoácidos 41 a 45,2, y los aminoácidos 8 a 20 contienen al menos una modificación de aminoácido.

De acuerdo con otra realización preferida, los residuos de aminoácidos en el área de las posiciones 15 a 17, 29 a 34, 41 a 45,2, 84 a 85, 92 a 100, y/o de 108 a 115 de CH3 están modificados.

Las modificaciones preferidas de Igk-C and Igl-C de origen humano se modifican por ingeniería en las regiones bucle en al área de los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 26 a 36, los aminoácidos 41 a 82, los aminoácidos 83 a 88, los aminoácidos 92 a 100, los aminoácidos 107 a 124 y los aminoácidos 123 a 126, o dentro de las secuencia terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos de los extremos C o N del dominios de anticuerpo modular.

Las modificaciones preferidas de las regiones bucle de Igk-C e Igl-C de origen murino se modifican por ingeniería en los sitios en el área de los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 26 a 36, los aminoácidos 43 a 79, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 90 a 101, los aminoácidos 108 a 116 y los aminoácidos 122 a 126,

Otra inmunoglobulina que se puede usar como agente terapéutico consiste en un dominio variable de una cadena pesada o ligera, o una parte del mismo que incluye un minidominio. con al menos una región bucle, preferentemente una región bucle estructural, y se caracteriza porque dicha al menos una región bucle comprende al menos una modificación de aminoácidos que forma al menos una región bucle modificada, en el que dicho al menos una región bucle modificada forma un sitio de unión relevante como se ha descrito en lo que antecede.

De acuerdo con una realización específica, la inmunoglobulina puede contener una modificación dentro del dominio variable, que se selecciona del grupo de VH, Vkappa, Vlambda, VHH y combinaciones de los mismos. Más específicamente, comprenden al menos una modificación dentro de los aminoácidos 7 a 22, los aminoácidos 39 a 55, los aminoácidos 66 a 79, los aminoácidos 77 a 89 y los aminoácidos 89 a 104, en los que la numeración de la posición de los aminoácidos de los dominios es la del IMGT o dentro de las secuencia terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos de los extremos C o N del dominios de anticuerpo modular.

La inmunoglobulina se puede caracterizar por que las regiones bucle de VH o Vkappa o Vlambda de origen humano comprenden al menos una modificación dentro de los aminoácidos 7 a 22, los aminoácidos 43 a 51, los aminoácidos 67 a 77, los aminoácidos 77 a 88, y los aminoácidos 89 a 104, lo más preferentemente las posiciones de aminoácidos 12 a 17, las posiciones de aminoácidos 45 a 50, las posiciones de aminoácidos 68 a 77, los aminoácidos 79 a 88, y las posiciones de aminoácidos 92 a 99, en los que la numeración de la posición de los aminoácidos de los dominios es la del IMGT. Las regiones bucles estructurales. del dominio variable de la inmunoglobulina de origen humano, como posibles

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seleccionadas para fines de modificación se localizan, preferentemente, en el área de los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 44 a 50, los aminoácidos 67 a 76, los aminoácidos 78 a 87, y los aminoácidos 89 a 101, o dentro de las secuencia terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos de los extremos C o N del dominios de anticuerpo modular.

De acuerdo con una realización preferida, las regiones bucle estructurales del dominio variable de la inmunoglobulina de origen murino como posibles seleccionadas para fines de modificación se localizan, preferentemente, en el área de los aminoácidos 6 a 20. los aminoácidos 43 a 52, los aminoácidos 67 a 79, los aminoácidos 79 a 87, y los aminoácidos 91 a 100, o dentro de las secuencia terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos de los extremos C o N del dominios de anticuerpo modular.

La inmunoglobulina usada como agente terapéutico también pueden ser de origen camélido. Los anticuerpos de camélidos comprenden únicamente una cadena pesada y tienen la misma afinidad por antígeno que los anticuerpos normales, que consisten en las cadenas ligeras y pesadas. En consecuencia, los anticuerpos de camélidos son mucho más pequeños que, (p. ej., anticuerpos humanos, que les permite penetrar en los tejidos densos para alcanzar el antígeno, donde las proteínas más grandes no pueden. Además, la simplicidad comparativa, la elevada afinidad y especificidad y el potencial para alcanzar e interaccionar con los sitios activos, los anticuerpos de cadena pesada de camélidos presentan ventajas sobre los anticuerpos habituales en el diseño, producción y aplicación de los compuestos clínicamente valiosos.

Las regiones bucles estructurales. de un anticuerpo modular o una inmunoglobulina de origen camélido se pueden modificar, por ejemplo en una VHH en la región de los aminoácidos 7 a 19, los aminoácidos 43 a 55, los aminoácidos 68 a 76, los aminoácidos 80 a 87 y los aminoácidos 91 a 101, o dentro de las secuencia terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos de los extremos C o N del dominios de anticuerpo modular.

El método preferido de producir un anticuerpo modular se refiere a la modificación por ingeniería de un anticuerpo modular que se une específicamente a al menos un primer epítopo, que comprende modificaciones en cada uno de al menos dos sitios o bucles dentro de una región bucle estructural, y determinar la unión específica de dicha región bucle estructural a al menos un segundo epítopo, en el que la región bucle estructural sin modificar (región no CDR) no se une específicamente a dicho al menos un segundo epítopo. Por tanto, un anticuerpo o estructura de unión a antígeno para un primer antígeno se puede mejorar añadiendo otra valencia o especificidad contra un segundo antígeno, en la que la especificidad puede ser idéntica, ya sea frente a diferentes epítopos o frente al mismo epítopo, para aumentar la valencia o para obtener moléculas bi, oligo o multiespecíficas.

Por otro lado, se prefiere hacer uso de los anticuerpos modulares que contienen estructuras nativas que interaccionan con moléculas efectoras o células inmunitarias, preferentemente para unirse a un ligando efector. Dichas estructuras nativas permanecen sin modificar o se modulan para una función efectora incrementada. Se ha descrito que los sitios de unión para, por ejemplo, receptores Fc., se localizan en una región de dominio CH2 y/o H3 y pueden mutageneizarse mediante técnicas bien conocidas-

La ADCC, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, es la muerte de las células diana recubiertas por anticuerpos por las células con receptores Fc que reconocen la región constante del anticuerpo unido. La mayoría de la ADCC está mediada por las células NK que tienen el receptor Fc FcgammaRIII o CD16 sobre su superficie. Los ensayos típicos usan células diana como células de Ramo, se incuban con anticuerpos diluidos en serie antes de la adición de células efectoras recién aisladas. El ensayo ADCC se incuba después durante varias horas y se detecta el % de citotoxicidad. Normalmente, la diana: proporción de efectoras es de aproximadamente 1:!6 pero puede ser de 1:1 a 1:50

La citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) es un mecanismo de matar células, en el que el anticuerpo unido a la superficie de la célula diana fija el complemento, l lo que tiene como resultado un ensamblaje del complejo de ataca a la membrana que perfora orificios en la membrana de la célula diana resultante en la lisis celular posterior. El ensayo CDC de uso habitual sigue el mismo procedimiento que para la determinación de ADCC, sin embargo, conteniendo el complemento suero en lugar de células efectoras.

La actividad citotóxica determinada mediante ADCC y CDC se ha probado para un anticuerpo modular de acuerdo con la invención, si existe un incremento significativo en el porcentaje de la citolisis en comparación con un control. La actividad citotóxica relacionada con la ADCC o CDC se mide, preferentemente, como el incremento del porcentaje absoluto, que es, preferentemente, superior al 5 %, más preferentemente, superior al 10 %, incluso más preferentemente superior al 20 %.

La fagocitosis celular dependiente de anticuerpos, ADCP, en ocasiones denominada ADPC, normalmente se investiga junto con la citolisis de células humanas cultivadas. La fagocitosis por los fagocitos, normalmente monocitos humanos

o macrófagos derivados de monocitos, mediada por un anticuerpo, se puede determinar del siguiente modo. Los monocitos purificados se pueden cultivar con citocinas para potenciar la expresión de los FcyR o para inducir la diferenciación en macrófagos. Los ensayos de ADCP y ADCC se realizan después con las células diana. La fagocitosis se determina como el porcentaje de células positivas medidas mediante citometría de flujo. La actividad de

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ADCP positiva se demuestra con una captación significativa del complejo anticuerpo-antígeno mediante los fagocitos. La actividad citotóxica relacionada con la ADCP se mide, preferentemente, como el porcentaje absoluto de la captación del complejo antígeno-anticuerpo mediante los fagocitos, que es, preferentemente, superior al 5 %, más preferentemente, superior al 10 %, incluso más preferentemente superior al 20 %.

En un ensayo típico, los PBMC o monocitos o macrófagos derivados de monocitos se suspenden en medio RF2 (RPMI 1640 suplementado con 2 % de FCS) en placas de 96 pocillos a una concentración de 1 x 105 células viables en 100 ml/pocillo. Las células diana adecuadas, que expresan el antígeno diana, por ejemplo antígeno Her2/neu y células SKBR3, se tiñen con colorante fluorescente verde PKH2. Después, 1 x 104 células diana marcadas con PKH2 y un anticuerpo (IgG1) específico de Her2 (o anticuerpo modular) o isotipo de IgG1 de ratón como control (o anticuerpo modular control) se añaden al pocillo de los PBMC a concentraciones diferentes (p. ej.,1-100 mg/ml) y se incuban en un volumen final de 200 ml a 37ºC durante 24 horas. Tras la incubació,. los PBMC o monocitos o macrófagos derivados de monocitos y las células diana se recogen con EDTA-PBS y se transfieren a placas de 96 pocillos de fondo en V. Las placas se centrifugan y se aspira el sobrenadante. Las células se somenten a contratinción con una mezcla de 100 ml de anti-CD11b, anti-CD14, e IgG humana conjugados con RPE, se mezclan y se incuban durante 60 minutos en hielo. Las células se lavan y se fijan con 2 % de formaldehído-PBS. Se realiza un análisis citométrico de flujo con dos colores con, por ejemplo, con FACS Calibur en acotamiento óptimo. Las células diana marcadas con PKH2 (verde) se detectan en el canal FL-1 (longitud de onda de emisión, 530 nm) y PBMC o monocitos marcados con RPE o macrófagos derivados de monocitos (rojo) se detectan en el canal FL-2 (longitud de onda de emisión, 575 nm). Las células diana residuales se definen como células que son células marcadas con PKH2+/RPE-Dual (PKH2+/RPE-) que se considera que representan la fagocitosis de las dianas por las PBMC o los monocitos o macrófagos derivados de monocitos. La fagocitosis de las células diana se calcula con la ecuación siguiente; porcentaje de fagocitosis = 100x [(porcentaje de dobles positivas)/(porcentaje de dobles positivas + porcentaje de dianas residuales)]. Todas las pruebas normalmente se realizan por duplicado o por triplicado y los resultados se expresan como la media 6 SD.

La actividad apoptótica se mide, preferentemente, usando métodos estándar de determinación de las células moribundas o muertas. Con el fin de medir la necrosis y la apoptosis, se pueden usar ensayos de citotoxidad. Estos ensayos pueden ser ensayos radioactivos y no radioactivos que miden incrementos en la permeabilidad de la membrana plasmática, ya que las células moribundas presentan fugas o los ensayos colorimétricos que miden la reducción de la actividad metabólica de las mitocondrias; las mitocondrias en las células muertas no pueden metabolizar los colorantes, mientras que las mitocondrias de las células vivas sí pueden.

También se pueden medir indicadores tempranos de la apoptosis, tal como la fragmentación del ADN en poblaciones de células o en células individuales, en los que el ADN apoptótico se rompe en piezas de diferente longitud, las alteraciones en la asimetría de la membrana (ensayos basados en fosfatidil serina y anexina V), medición de la activación de las caspasas apoptóticas o medición de la liberación del citocromo C y AIF en el citoplasma por las mitocondrias.

La actividad citotóxica preferida del anticuerpo modular de acuerdo con la invención constituye al menos el 20 % de la citolisis, medida en un respectivo ensayo de lisis celular ex vivo.

Preferentemente, la actividad citotóxica del anticuerpo modular de acuerdo con la invención es mediar en la lisis celular

o en la muerte celular en un ensayo basado en células con una CE50<10-8 M, preferentemente en el intervalo nanomolar o inferior.

La función efectora del anticuerpo modular de acuerdo con la invención es preferentemente, una actividad citotóxica biológica, que normalmente difiere de cualquier actividad citotóxica sintética, por ejemplo,como se proporciona mediante una toxina que puede estar conjugada a una estructura de inmunoglobulina. Las toxinas normalmente no activan las moléculas efectoras y el mecanismo de defensa biológica. Por tanto, la actividad citotóxica de los anticuerpos modulares de acuerdo con la invención es, una actividad citotóxica biológica, que normalmente es inmunoestimulante, lo que conduce a una citolisis eficaz.

La actividad citotóxica se diferencia además del simple efecto de inhibición celular en que una sustancia está inhibiendo el crecimiento celular, por ejemplo uniéndose al receptor de un factor de crecimiento, de modo que se bloquea la función del factor de crecimiento, o inhibiendo la angiogénesis. La citotoxicidad se considera esencialmente como un ataque activo para matar células, lo que conduce a la muerte o lisis celular, y, por tanto, se considera una forma altamente eficiente para reducir inmediatamente el número de células malignas o infectadas. En comparación con los compuestos citotóxicos, los inhibidores del crecimiento celular no matan las células inmediatamente, sino que únicamente reducen el crecimiento y la proliferación celular, por lo que se consideran menos activos para fines terapéuticos.

El anticuerpo modular puede unirse específicamente a cualquier tipo de moléculas o estructuras de unión. en particular a antígenos, moléculas proteináceas, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, hidratos de carbono, lípidos, moléculas orgánicas, en particular moléculas orgánicas pequeñas, moléculas anorgánicas, o combinaciones o fusiones de los mismos, incluyendo PEG, profármacos o fármacos. El anticuerpo modular puede comprender al menos dos bucles o regiones bucle en las que cada uno de los bucles o regiones bucle pueden unirse

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específicamente a diferentes moléculas o epítopos.

Preferentemente, el antígeno diana se selecciona de antígenos de superficie celular, incluyendo receptores, en particular del grupo que consiste en las tirosinas quinasas receptoras de erbB (tales como EGFR, HER2, HER3 y HER4, en particular los epítopos de los dominios extracelulares de dichos receptores, p. ej.., el epítopo 4D5), moléculas de la superfamilia del receptor del TNF, tal como el receptor de Apo-1, TNFR1, TNFR2, el receptor del factor de crecimiento neural NGFR, CD40, moléculas de la superficie de los linfocitos T, receptores de linfocitos T, antígeno OX40 de los linfocitos T, receptor TACI, BCMA, Apo-3, DR4, DR5, DR6, receptores señuelo, tales como DcR1, DcR2, CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, pero no se limitan a estas moléculas, antígenos de la superficie de los linfocitos B, tales como CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, antígenos o marcadores de tumores sólidos o células cancerosas hematológicas, células de linfoma o leucemia, otras células sanguíneas, incluyendo plaquetas, pero no se limitan a estas moléculas.

De acuerdo con una realización preferida adicional, el antígeno diana se selecciona de los antígenos presentados por las células, como células epiteliales, células de tumores sólidos, células infectadas células sanguíneas, células presentadoras de antígeno y células mononucleares. Dichos antígenos diana expresados y sobrexpresados por las células están, preferentemente, dirigidos, que se seleccionan del grupo que consiste en antígenos asociados a tumores, en particular EpCAM, glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), antígeno asociados a tumores CA 125, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno asociado con el melanoma de peso molecular alto (HMW-MAA), antígeno asociado a tumores que expresa hidratos de carbono relacionados con cuerpos de Lewy, antígeno carcinoembrionario (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, MUC1 de mucina, MUC18 y antígeno asociado con tumores de citoqueratina, antígenos bacterianos, antígenos víricos, alérgenos, moléculas de IgE relacionadas con la alergia. cKIT y receptor de Fc-epsilon, IRp60, receptor de IL-5, CCR3, receptor de glóbulos rojos (CR1), seroalbúmina humana, seroalbúmina se ratón, seroalbúmina se rata, receptores Fc., receptor FcRn-Fc gamma nenonatal, receptores Fc-gamma--Fc-gamma RI, Fc-gamma-RII, Fc-gamma RIII, receptores Fc-alga, receptores Fc-epsilon, fluoresceína, lisozima, receptor 9 de tipo toll, eritropoyetina, CD2, CD3, CD3, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (proteína p67), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD64, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, LIF, OSM, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, TNF alfa, TNFbeta2, TNF alfa, TNF alfa beta, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1 BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, receptor 1 de TRAIL, receptor A1 de adenosina, receptor beta de linfotoxinas, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, integrina beta1, integrina beta1, integrina alfa-4/beta 7, integrina alfa 2, integrina alfa 3, integrina alfa 4, integrina alfa 5, integrina alfa 6, integrina alfa v, integrina alfa V beta 3, FGFR-3, Factor de crecimiento de queratinocitos, GM-CSF, M-CSF, RANKL, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-Id, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de linfocitos T B7-1, B7-2, integrina VNR, TGF beta 1, TGF beta 2, eotaxina 1, BLyS (estimulador de los linfocitos B), complemento C5. IgE, IgA, IgD, IgM, IgG, factor VII, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), factor tisular, VEGF, VEGFR, receptor de la endotelina, VLA-4, hidratos de carbono. tales como los antígenos del grupo sanguíneo e hidratos de carbono. relacionados. Galili-Glicosilación, Gastrina, receptores de la gastrina, hidratos de carbono asociados con tumores, protección NP o protección NIP de hapteno, receptor alfa/beta de linfocitos T, E-selectina, P-glicoproteína, MRP3, MRP5, glutatión-S-transferasa o (proteínas de resistencia a múltiples fármacos), proteína de la membrana de gránulos alfa (GMP), 140 digoxina, fosfatasa alcalina de la placenta (PLAP) y fosfatasa alcalina de tipo PLAP testicular, receptor de la transferrina, Heparanasa I, miosina cardíaca humana, glicoproteína 11 b/111 a (GPIIb/IIIa), glicoproteína de la cubierta de gH del citomegalovirus humano (HCMV), gp120 del VIH, HCMV, virus sincitial respiratorio, RSVF, Fgp del RSVF, integrina VNR, gp120 de Hep B, CMV, gpIIbIIIa, bucle V3 de gp120 de HIV IIIB, Fgp del virus sincitial respiratorio (RSV), glicoproteína gD del virus del herpes simple (VHS) glicoproteína gB del VHS, glicoproteína de la cubierta gB delHCMV, toxina de Clostridium perfringens y fragmentos de la misma.

Los anticuerpos modulares se pueden unir a dicho antígeno diana con una afinidad elevada, en particular con una constante de asociación alta y/o dedisociación baja, o una avidez alta por la unión. Normalmente, se considera que un ligante tiene una afinidad elevada con una Kd<10-9 M. Se pueden preparar ligantes de afinidad media con una Kd inferior a 10-6 hasta 10-9, preferentemente junto con un proceso de maduración de la afinidad.

La maduración de la afinidad es el proceso por el cual se producen anticuerpos con una mayor afinidad por el antígeno. Con cambios estructurales de una anticuerpo, incluyendo mutagénesis de aminoácidos o como consecuencia de la mutación somática en los segmentos génicos de la inmunoglobulina, se producen variantes de un sitio de unión a un antígeno y se seleccionan las afinidades mayores. Los anticuerpos modulares de afinidad madurada pueden exhibir una afinidad mayor que un anticuerpo parental. Los anticuerpos parentales únicos se pueden someter a maduración de la afinidad. Como alternativa, conjuntos de anticuerpos modulares con una afinidad de unión similar al antígeno diana se pueden considerar estructuras parentales que varían para obtener anticuerpos únicos de afinidad madurada

o conjuntos de dichos anticuerpos con afinidad madurada.

La variante de afinidad madurada preferida de un anticuerpo modular exhibe al menos un incremento por 10 en la afinidad de la unión, preferentemente un incremento de al menos 100 veces. La maduración de la afinidad se puede usar en el curso de las campañas de selección que usan las respectivas bibliotecas de moléculas parentales, bien con anticuerpos modulares con una afinidad de unión media para obtener el anticuerpo modular de la invención que tiene

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la propiedad de unión a la diana específica de una afinidad de unión Kd<10-8 M y, opcionalmente, una potencia de CI50<10-8 M. Como alternativa, la potencia de unión o afinidad se puede aumentar todavía más mediante la maduración de la afinidad del anticuerpo modular de acuerdo con la invención para obtener los elevados valores correspondientes a una Kd o CIC50 inferior a 10-9 M, preferentemente inferior a 10-10 M o incluso inferior a 10-11 M, lo más preferido, en el intervalo picomolar,

La CI50, también denominada CE50 o concentración de saturación al 50 %, es una medida de la potencia de unión de un anticuerpo modular. Es la concentración molar de un ligante, que produce el 50 % de la unión máxima posible en el equilibrio en en saturación. La potencia de un ligante suele estar definida por su CI50 (en el presente documento se entiende como un valor de CE50). Esto se puede calcular para un ligante dado determinando la concentración de ligante necesaria para provocar la mitad de la saturación de la unión máxima. Determinar un valor de CI50 o CE50 es útil para comparar la potencia de los anticuerpos o variantes de anticuerpos con eficacias similares,, en particular, cuando se determina en ensayos de unión de saturación, no en ensayos competitivos. En este caso, se considera como la concentración que determina la concentración en plasma para obtener un efecto semimáximo (50 %) in vivo. Cuando menor es la CI50 o la CE50 mayor es la potencia del anticuerpo modular, y cuando menor es la concentración del anticuerpo necesaria para inhibir la respuesta biológica máxima igual es la función efectora o la actividad citotóxica, Las concentraciones más bajas de anticuerpos también se pueden asociad con menores efectos secundarios.

La afinidad de uniión de un anticuerpo normalmente se caracteriza en términos de la concentración del anticuerpo a la cual están ocupados la mitad de los sitios de unión a antígeno, conocida como la constante de disociación (Kd, o Kd).

Normalmente, la afinidad de una anticuerpo se correlaciona bien con la CI50, cuando se determina en un ensayo de unión de saturación. La afinidad de un antagonista por su sitio de unión (Ki) se entiende como su capacidad para unirse a un receptor, que determina la duración de la unión y la respectiva actividad agonista. Las medidas para aumentar la afinidad mediante maduración de la afinidad normalmente también aumenta la potencia de la unión, lo que tiene como resultado la correspondiente reducción de los valores de CI50 en el mismo intervalo de los valores de Kd.

Los valores de CI50 y Kd se pueden determinar usando los ensayos de unión de saturación bien conocidos en la técnica. Al contrario que los ensayos de competición, los ensayos de unión de saturación proporcionan un valor independiente de la concentración de un competidor, por tanto, un valor comparable que puede ser indicativo de la afinidad de unión in vivo.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención se conjuga, preferentemente, con una molécula marcadora o indicadora, seleccionada del grupo que consiste en moléculas orgánicas, marcadores enzimáticos, marcadores radioactivos, marcadores coloreados, marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, marcadores luminiscentes, haptenos, digoxigenina. biotina, complejos metálicos, metales, oro coloidal y mezclas de los mismos. Se pueden usar inmunoglobulinas modificadas conjugadas con moléculas marcadoras o indicadoras, por ejemplo, en sistemas de ensayo o métodos diagnósticos.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención se puede conjugar con otras moléculas que permiten la simple detección de dicho conjugado en, por ejemplo, ensayos de unión (p. ej., ELISA) y estudios de unión.

En una realización preferida, las variantes de anticuerpo se someten a detección selectiva usando uno o más ensayos basados en células o in vivo. Para dichos ensayos, las inmunoglobulinas modificadas purificadas o sin purificar normalmente se añaden exógenamente de un modo tal que las células se exponen a inmunoglobulinas individuales o conjuntos de inmunoglobulinas que pertenecen a una biblioteca. Estos ensayos normalmente se basan, aunque no siempre, en la función de la inmunoglobulina, es decir, la capacidad del anticuerpo para unirse a su diana y participar en algún acontecimientos bioquímico, por ejemplo, función efectora, inhibición de la unión ligando/receptor, apoptosis, y similares. Dichos ensayos a menudo implican monitorización de la respuesta de las células al anticuerpo, por ejemplo la supervivencia celular, muerte celular, cambio en la morfología celular, o activación transcripcional, tal como expresión celular de un gen natural o gen indicador. Por ejemplo, dichos ensayos pueden medir la capacidad de las variantes de anticuerpos para producir ADCC, ADCP, CDC o actividad apoptótica. Para algunos ensayos, puede ser necesario añadir células o componentes adicionales, es decir además de las células diana, por ejemplo, complemento sérico, o células efectoras tales como monocitos de sangre periférica (PBMC), células NK, macrófagos, y similares. Dichas células adicionales pueden proceder de cualquier organismo, preferentemente seres humanos, ratones, ratas, conejos, y monos. Los anticuerpos modulares pueden producir apoptosis de determinadas líneas celulares que expresan la diana o pueden mediar en el ataque sobre las células diana por células inmunitarias que se han añadido al ensayo. Los métodos para monitorizar la muerte celular o la viabilidad celular son conocidos en la técnica e incluyen el uso de colorantes, reactivos inmunoquímicos, citoquímicos y radioactivos. Por ejemplo, los ensayos de tinción de la caspasa pueden permitir medir la apoptosis y la captación o liberación de sustratos radioactivos o colorantes fluorescentes, tales como azul alamar, pueden permitir la monitorización del crecimiento activación celular.

En una realización preferida, se puede usar el ensayo de citotoxidad basado en DELFIART EuTDA (Perkin Elmer, MA). Como alternativa, las células muertas o dañadas se pueden monitorizar midiendo la liberación de uno o más componentes intracelulares naturales, por ejemplo lactato deshidrogenasa. La activación de la transcripción también puede servir como método para analizar la función en ensayos basados en

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células. En este caso, la respuesta se puede monitorizar analizando los genes naturales o inmunoglobulinas que pueden regularse por aumento, por ejemplo, se puede medir la liberación de determinadas interleucinas. o, como alternativa, la lectura se puede realizar a través de una construcción indicadora. Los ensayos basados en células también pueden implicar la medida de cambios morfológicos de las células como respuesta a la presencia de anticuerpos modulares. Tipos de células para dichos ensayos pueden ser células procariotas o eucariotas, y se pueden usar diversas líneas celulares conocidas en la técnica. Como alternativa, la detección selectiva basada en células se realiza usando células que se han transformado o transfectado con ácidos nucleicos que codifican las variantes. Es decir, las variantes de anticuerpos no se añaden exógenamente a las células. Por ejemplo, en una realización, la detección selectiva basada en células usa expresión en superficie celular. Se puede usar una pareja de fusión que permita expresar inmunoglobulinas modificadas sobre la superficie celular (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399).

En una realización preferida, la inmunogeneicidad de los anticuerpos modulares se puede determinar experimentalmente usando uno o más ensayos basados en células. En una realización preferida, se usan ensayos de activación ex vivo de linfocitos T para cuantificar experimentalmente la inmunogeneicidad. En este método, las células presentadoras de antígeno y los linfocitos T nativos de donantes equivalentes se exponen a un péptido o a un anticuerpo entero de interés una o más veces. Después, la activación de los linfocitos T se puede detectar usando una serie de métodos, por ejemplo mediante monitorización de la producción de citocinas o midiendo la captación de timidina tritiada. En la realización más preferida, la producción de interferón gamma se monitoriza usando ensayos ELISPOT.

Las propiedades biológicas del anticuerpo modular de acuerdo con la invención se pueden caracterizar in vivo en experimentos con tejido celular y organismos enteros. Como se conoce en la técnica, los fármacos a menudo se analizan in vivo en animales, incluyendo, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos, y monos, con el fin de medir la eficacia de un fármaco para el tratamiento contra una enfermedad o modelo de enfermedad, o para medir la farmacocinética de un fármaco, la farmacodinamia, la toxicidad, y otras propiedades. Se puede hacer referencia a los animales como modelos de enfermedad. A menudo, los agentes terapéuticos se prueban en ratones, incluyendo, entre otros, ratones atímicos, ratones SCID, ratones con xenoinjertos, y ratones transgénicos (incluyendo activados e inactiivados). Dicha experimentación puede proporcionar datos significativos para la determinación del potencial del anticuerpo a usar como agente terapéutico con la semivida adecuada, función efectora, actividad apoptótica, actividad citotóxica o citolítica adecuadas. Cualquier organismo, preferentemente mamíferos, se puede usar para las pruebas. Por ejemplo, debido a su similitud genética con los seres humanos, los primates, monos, pueden ser modelos terapéuticos adecuados y por tanto, se pueden usar para probar la eficacia, la toxicidad, la farmacocinética, la farmacodinamia, la semivida, u otra propiedad del anticuerpo modular de acuerdo con la invención. Las pruebas de las sustancias en seres humanos son necesarias, en última instancia, para la aprobación de los fármacos y, por tanto, por supuesto, se contemplan estos experimentos. Por consiguiente, los anticuerpos modulares de la presente invención se pueden analizar en seres humanos para determinar su eficacia terapéutica, toxicidad, Inmunogenicidad, farmacocinética, y/u otras propiedades clínicas. Especialmente, los anticuerpos modulares que se unen a células únicas o a un complejo celular a través de al menos dos motivos de unión, preferentemente la unión de al menos tres estructuras con reticulación con las células diana, s se considerarían eficaces en la actividad efectora o la actividad preapoptótica o apoptótica tras la reticulación y dirección celular. La unión multivalente proporciona una asociación relativamente grande de las parejas de unión, también denominado reticulación, que es un requisito previo para la apoptosis y la muerte celular.

El anticuerpo modular de la presente invención puede encontrar uso en una amplia gama de productos de anticuerpos. En una realización, el anticuerpo modular de la presente invención se usa para terapia o profilaxis, por ejemplo como inmunoterapia activa o pasiva, para uso preparativo, industrial o analítico, como compuesto diagnóstico, industrial o reactivo de investigación, preferentemente un agente terapéutico. El anticuerpo modular puede encontrar uso en una composición de anticuerpo que es monoclonal o policlonal. En una realización preferida, los anticuerpos modulares de la presente invención se usan para capturar o matar células diana que portan el antígeno diana, por ejemplo, células cancerosas, En una realización alternativa, los anticuerpos modulares de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar el antígeno diana, por ejemplo, antagonizando una citocina o receptor de citocinas.

En una realización preferida alternativa, los anticuerpos modulares de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar los factores de crecimiento o receptores de factores de crecimiento y, de este modo, mediar en la muerte de las células diana portadoras o que necesitan el antígeno diana.

En una realización preferida alternativa, los anticuerpos modulares de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar enzimas y sustratos de enzimas.

En una realización preferida, un anticuerpo modular se administra a un paciente para tratar un trastorno específico. Un "paciente",para los fines de la presente invención, incluye seres humanos y otros animales, preferentemente mamíferos y, lo más preferentemente, seres humanos. Por "trastorno específico" se quiere decir, en el presente documento, un trastorno que se puede mejorar mediante la administración de una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina modificada de la presente invención. En una realización, un anticuerpo modular de acuerdo con la presente invención es el único agente terapéuticamente

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activo administrado a un paciente. Como alternativa, el anticuerpo modular de acuerdo con la presente invención se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos, incluyendo, entre otros, agentes citotóxicos,, agentes quimioterapéuticos, citocinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes antihormonales, inhibidores de la quinasa, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores, u otros agentes terapéuticos. El anticuerpo modular se puede administrar de forma concomitante con uno o más de otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, un anticuerpo modular de la presente invención se puede administrar al paciente junto con quimioterapia, terapia de radiación, o ambos, quimioterapia o terapia de radiación. En una realización, el anticuerpo modular de acuerdo con la presente invención se puede administrar en combinación con uno o más anticuerpos, que pueden o no comprender un anticuerpo modular de la presente invención. De acuerdo con otra forma de realización de la invención, el anticuerpo modular de la presente invención y una o más terapias anticancerosas se usan para tratar las células cancerosas ex vivo. Se contempla que dicho tratamiento ex vivo puede ser útil en el transplante de médula ósea y, en particular, transplante autólogo de médula ósea. Por supuesto, se contempla que los anticuerpos de la invención se puedan usar en combinación con otras técnicas terapéuticas más, tales como cirugía.

Otros diversos agentes terapéuticos pueden encontrar uso para la administración con el anticuerpo modular de la presente invención. En una realización, el anticuerpo modular se administra con un agente antiangiogénico, que es un compuesto que bloquea, o interfiere en algún grado, el desarrollo de vasos sanguíneos. El factor antiangiogénico puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo un anticuerpo, una molécula de fusión Fc.

o citocina, que se une a un factor de crecimiento o receptor de factor de crecimiento implicado en la estimulación de la angiogénesis. El factor antiangiogénico preferido en el presente documento es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), En realizaciones alternativas, el anticuerpo modular se administra con un agente terapéutico que induce o potencia la respuesta inmunológica adaptativa, por ejemplo, un anticuerpo dirigido a CTLA-4. En una realización alternativa, la inmunoglobulina modificada se administra con un inhibidor de la tirosina quinasa, que es una molécula que inhibe en cierta medida la actividad tirosina quinasa de una tirosina quinasa, En una realización alternativa, el anticuerpo modular de la presente invención se administra con una citocina. Por "citocina", como se usa en el presente documento, se quiere decir un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa en otra célula como mediadores intercelulares, incluyendo quimiocinas.

Se contemplan composiciones farmacéuticas en las que los anticuerpos modulares de la presente invención y uno o más agentes terapéuticamente activos se formulan. Las formulaciones estables de los anticuerpos modulares de la presente invención se preparan para almacenar mezclando dicha inmunoglobulina que tiene el grado deseado de pureza con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizantes, en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son, preferentemente, estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles u otros métodos. El anticuerpo modular y otros agentes terapéuticamente activos divulgados en el presente documento también se pueden formular como inmunoliposomas y/o atrapados en microcápsulas.

La administración de la composición farmacéutica que comprenden un anticuerpo modular de la presente invención. preferentemente en forma de una solución acuosa estéril, puede realizarse de varios modos, incluyendo, entre otras, las vías oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, mucosa, tópica (p. ej., geles, salvas, lociones, cremas, etc.), Intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar (p. ej., tecnología de inhalación AERx™ disponible en el mercado en Aradigm, o sistema de liberación pulmonar Inhance™ disponible en el mercado en Inhale Therapeutics), vaginal, parenteral, rectal, o intraocular.

Los anticuerpos modulares se pueden modificar mediante un método de mutagénesis para obtener un nuevo sitio de unión. La mutagénesis preferida se refiere a técnicas de aleatorización, en las que la secuencia de aminoácidos de un péptido o polipéptido está mutada al menos en una posición, por tanto, se obtiene una secuencia aleatorizada, que participa en la unión a antígeno. Por ejemplo, las secuencias de anticuerpo específicas se modifican de forma aleatoria para obtener una molécula de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina, dominios de inmunoglobulina o parte del mismo, que comprende al menos una unidad de repetición de nucleótidos, preferentemente dentro de una región de codificación de bucle estructural o dentro de una región terminal, que tiene la secuencia 5'-NNS-3',, 5'-NNN-3', 5'-NNB-3' o 5'-NNK-3'. En algunas realizaciones, el ácido nucleico modificado comprende codones seleccionados del grupo de TMT, WMT, BMT, RMC, RMG, MRT, SRC, KMT, RST, YMT, MKC, RSA, RRC, NNK, NNN, NNS o cualquier combinación de los mismos (la codificación es conforme a la IUPAC).

La modificación de la molécula de ácido nucleico puede realizarse introduciendo oligonucleótidos sintéticos en un segmento más grande de ácido nucleico o mediante la síntesis de novo de una molécula de ácido nucleico completa. La síntesis de ácido nucleico se puede realizar con bloques componentes de tres nucleótidos que reducirían el número de combinaciones de secuencias sin sentido si se va a codificar un subconjunto de aminoácidos (p. ej.,Yanez et al. Nucleic Acids Res. (2004) 32:e158; Virnekas et al. Nucleic Acids Res. (1994) 22:5600-5607).

Cada potencial dominio de unión puede permanecer físicamente asociado a la molécula de ADN o de ARN completa que lo codifica, y, además, las proteínas de fusión oligomerizan en la superficie de un paquete genético. para presentar el polipéptido de unión en la estructura oligomérica nativa y funcional. Una vez que se han identificado dominios de unión satisfactorios, se puede obtener fácilmente el gen para expresión, recombinación o fines de ingeniería adicionales. La forma que toma dicha asociación es un "paquete genético replicable", tal como un virus, célula o

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espora que se replica y expresa el gen que codifica el dominio de unión, y transporta el dominio de unión a su superficie externa. Otra forma es un paquete genético, replicable in vitro, tal como ribosomas que unen el ARN de codificación con la proteína traducida. En la expresión en ribosomas, el material genético se replica mediante amplificación enzimática con polimerasas.

Dichas células o virus de ácido nucleico portador de los agentes de unión que reconocen la molécula diana están aisladas y, en caso necesario, amplificadas. El paquete genético, es, preferentemente, en fago M14, y la proteína incluye la señal de transporte a la superficie externa de la proteína génica III del M13.

El sistema de expresión preferido para las proteínas de fusión es una célula huésped no supresora, que sería sensible a un codón de terminación, tal como un codón de terminación ámbar, y, por tanto, se detendría la traducción. En ausencia de dicho codón de terminación, dichas células huésped no supresoras, preferentemente E. coli. En presencia de dicho codón de terminación, se usarían células huésped supresoras.

Preferentemente, en el método, el vector o plásmido del paquete genético está bajo el control estrecho del elemento regulador de la transcripción, y las condiciones de cultivo se ajustan de forma que la cantidad o el número de partículas de vector o fagemido que muestran menos de dos copias de la proteínas de fusión sobre la superficie de la partícula es inferior a aproximadamente un 20 %. Más preferentemente, la cantidad de partículas de vector o fagemido que muestran menos de dos copias de la proteína de fusión es inferior al 10 % de la cantidad de partículas que muestran una o más copias de la proteína de fusión. Lo más preferentemente, la cantidad es inferior al 1 %.

El vector de expresión puede ser capaz de expresar un polipéptido de unión, y se puede producir del siguiente modo: En primer lugar se sintetiza una biblioteca génica de polipéptidos de unión introduciendo una pluralidad de polinucleótidos que codifican diferentes secuencias de unión. La pluralidad de polinucleótidos pueden sintetizarse en una cantidad adecuada para unirse en combinación operable en un vector que se puede propagar para expresar una proteína de fusión de dicho polipéptido de unión, Como alternativa, la pluralidad de oligonucleótidos también se puede amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa para obtener suficiente material para expresión. Sin embargo, esto solo sería ventajoso si el polipéptido de unión estuviera codificado por una secuencia de polinucleótidos grande, por ejemplo, mayor de 200 pares de bases o, en ocasiones, mayor de 300 pares de bases. Por tanto, preferentemente se forma una biblioteca sintética diversa, lista para seleccionar de dicha biblioteca diversa al menos un vectores de expresión capaz de producir polipéptidos de unión que tienen la función preseleccionada deseada y la propiedad de unión, tal como especificidad.

La molécula de ácido nucleico modificada aleatoriamente puede comprender las unidades de repetición identificadas anteriormente, que codifican todos los aminoácidos de origen natural o un subconjunto de los mismos. Dichas bibliotecas que contienen secuencias modificadas en las que un subconjunto específico de aminoácidos se usa para fines de modificación se denominan biblioteca "centradas", El miembro de dichas bibliotecas tiene una probabilidad mayor de un aminoácido de dicho subconjunto en la posición modificada, que es al menos dos veces mayor de lo normal, preferentemente al menos 3 veces o incluso al menos 4 veces mayor. Dichas bibliotecas también tienen un número limitado o menor de miembros de la biblioteca, de modo que el número de miembros reales de la biblioteca alcanza el número de miembros teóricos de la biblioteca. En algunos casos, el número de miembros de la biblioteca de una biblioteca centrada no es inferior a 103 veces el número teórico, preferentemente no inferior a 102 veces, lo más preferentemente no inferior a 10 veces,

Normalmente, las bibliotecas comprenden al menos 10 proteínas de fusión o potenciales agentes de unión o variantes de proteínas estructurales, preferentemente al menos 100, más preferentemente al menos 1.000, más preferentemente al menos 104, más preferentemente al menos 105, más preferentemente al menos 106, más preferentemente al menos 107, más preferentemente al menos 108, más preferentemente al menos 109, más preferentemente al menos 1010, más preferentemente al menos 1011, hasta 1012, en los casos de métodos de expresión in vitro, tal como expresión en ribosomas, incluso un número más alto es viable.

Se dispone de varias alternativas para la fabricación del gen que codifica la biblioteca aleatorizada. Es posible producir el ADN mediante un abordaje completamente sintético, en el que la secuencia se divide en fragmentos solapantes que después se preparan como oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos se mezclan, y se hibridan entre sí calentando primero hasta aproximadamente 100 ºC y, después, enfriando lentamente hasta la temperatura ambiente. Después de esta etapa de hibridación. el gen ensamblado sintéticamente se puede clonar directamente o se puede amplificar mediante PCR antes de la clonación.

Como alternativa, se pueden usar otros métodos para la mutagénesis dirigida a sitio para la generación del inserto de la biblioteca, tal como el método de Kunkel (Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 Jan;82(2):488-92) o el método de DpnI (Weiner MP, Costa GL, Schoettlin W, Cline J, Mathur E, Bauer JC. Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by the polymerase chain reaction. Gen. 1994 Dec 30;151(1-2):119-23.).

Para varios fines, puede ser ventajoso introducir mutaciones silentes en la secuencia que codifica el inserto de la biblioteca. Por ejemplo, se pueden introducir sitios de restricción que facilitan la clonación o el intercambio modular de

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partes de la secuencia. Otro ejemplo para la introducción de mutaciones silentes es la capacidad para "marcar" bibliotecas. que significa darles un codón específico en una posición seleccionada, lo que les permite (o a los clones seleccionados derivados de los mismos), por ejemplo, ser reconocidos durante las siguientes etapas, en las que, por ejemplo, diferentes bibliotecas con diferentes características se pueden mezclar y usar como mezcla en el procedimiento de adsorción.

Asimismo, se divulga un método para producir un oligómero de dominios de anticuerpo modular que se unen a una diana, que comprende las etapas de:

-proporcionar una biblioteca de oligómeros de los dominios de anticuerpo modular producidos de acuerdo con el

método tal como se ha descrito -poner en contacto dicha biblioteca con dicha diana en presencia de un ligando estructural, -seleccionar un miembro de la biblioteca que se une a dicha diana en presencia de un ligando estructural, y -fabricar una preparación del oligómero funcional.

El ligando estructural se puede seleccionar del grupo que consiste en una molécula efectora, FcRn, Proteína A, Proteína G, Proteína L y diana en CDR. Como ejemplo, la molécula efectora se puede seleccionar del grupo que consiste en CCD64, CD32, CD16, receptores Fc.,

Los oligómeros pueden ser dímeros seleccionados del grupo de VH/VL, CH1/CL, CH2/CH2, CH3/CH3, Fc y Fab, o cadenas sencillas de los mismos.

El método puede proporcionar una biblioteca que contiene al menos 102 clones independientes que expresan oligómeros funcionales de dominios de anticuerpo modular o variantes de los mismos.. También se proporciona un conjunto de clones independientes preseleccionados, que, por ejemplo, tiene afinidad madurada, en el que el conjunto comprende, preferentemente, al menos 10, más preferentemente al menos 100, más preferentemente al menos 1000, más preferentemente al menos 10000, incluso más preferentemente más de 100.000 clones independientes. Dichas bibliotecas, que contienen los conjuntos preseleccionados son fuentes preferidas para seleccionar los anticuerpos modulares de alta afinidad.

Las bibliotecas como se usan de acuerdo con la invención comprenden, preferentemente, al menos 102 miembros de la biblioteca, más preferentemente al menos 103, más preferentemente al menos 104, más preferentemente al menos 105, más preferentemente al menos 106 miembros de la biblioteca, más preferentemente al menos 107, más preferentemente al menos 108, más preferentemente al menos 109, más preferentemente al menos 1010, más preferentemente al menos 1011, hasta 1012 miembros de una biblioteca, derivados preferentemente de una molécula parental, que es un anticuerpo modular funcional como un armazón que contiene al menos una función específica o resto de unión. y derivados de los mismos para modificar un nuevo sitio de unión aparte del original, la región de unión funcional de dicho resto parental.

Normalmente, las bibliotecas contienen además variantes del anticuerpo modular, resultante de la mutagénesis o técnicas de aleatorización. Estas variantes incluyen anticuerpos inactivos o no funcionales. Por tanto, se prefiere que dichas bibliotecas se sometan a detección selectiva con el ensayo adecuado para determinar el efecto funcional. Bibliotecas preferidas comprenden al menos 102 variantes de anticuerpos modulares, más preferentemente al menos 103, más preferentemente al menos 104, más preferentemente al menos 105, más preferentemente al menos 106, más preferentemente al menos 107, más preferentemente al menos 108, más preferentemente al menos 109, más preferentemente al menos 1010, más preferentemente al menos 1011, hasta 1012 variantes o más para proporcionar un repertorio muy diverso de anticuerpos para seleccionar los mejores ligantes adecuados. Cualquiera de estas bibliotecas sintéticas se puede generar usando métodos de mutagénesis como se divulga en el presente documento.

Preferentemente, la biblioteca es una biblioteca de levaduras y la célula huésped de levadura exhibe en la superficie los oligómeros con la actividad biológica. La célula huésped de levadura se selecciona, preferentemente, de los géneros Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizisaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia y Candida. Lo más preferido, la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae.

También se divulga una biblioteca de alta calidad que contiene al menos 102 clones independientes de dímeros funcionales de dominios de anticuerpo modular o variantes de los mismos, o los conjuntos de clones optimizados o preseleccionados, por ejemplo los clones de afinidad madurada, en los que los conjuntos contienen al menos 10 clones independientes que se unen a una diana y a un ligando estructural. La diana puede ser un ligando que se une a una molécula parental sujeto a a variación de aminoácidos. La molécula parental puede ser un oligómero funcional, en particular un Fc funcional o un Fab funcional, o partes de los mismos.

La biblioteca puede contener dímeros funcionales de dominios de anticuerpo modular que se unen a una diana y a un ligando estructural, y al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, más preferido al menos un 40 % de los dímeros funcionales se unen a CD64. Esto es particularmente preferido con un anticuerpo modular que contiene dominios CH2, tal como un armazón Fc.

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Como alternativa, la biblioteca puede contener dímeros funcionales de dominios de anticuerpo modular que se unen a una diana y a un ligando estructural, y al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, más preferido, al menos un 40 % de los dímeros funcionales se unen a la proteína A. Esto es particularmente preferido con un anticuerpo modular que contiene los dominios CH2 y CH3, tal como un armazón Fc.

Como alternativa, la biblioteca puede contener dímeros funcionales de dominios de anticuerpo modular que se unen a una diana y a un ligando estructural, y al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, más preferido al menos un 40 % de los dímeros funcionales se unen a la misma diana de CDR. Esto es particularmente preferido con los anticuerpos modulares que contienen una región variable, tal como un armazón Fab con especificidad por una única diana de CDR.

Como se conoce en la técnica, existen varias tecnologías de expresión y selección que se pueden usar para la identificación y aislamiento de proteínas con determinadas características y afinidades de unión. incluyendo, por ejemplo, tecnologías de expresión, tales como celulares y no celulares, en particular sistema de expresión movilizados. Entre los sistemas celulares, se pueden usar expresión en fagos, expresión en virus, expresión en levaduras o en otras células eucariotas, tales como expresión en células de mamífero o de insectos. Los sistemas movilizados están relacionados con los sistemas de expresión en la forma soluble, tales como sistemas de expresión in vitro, entre ellos la expresión en ribosomas, expresión de ARNm o expresión de ácido nucleico.

Los métodos para la producción y detección selectiva de las variantes de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Métodos generales para la biología molecular de los anticuerpos, expresión, purificación, y detección selectiva se describe en Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; y Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

Una biblioteca se puede diseñar como biblioteca exclusiva que contiene al menos un 50 % de formatos específicos, preferentemente al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, o los que consisten principalmente en formatos de anticuerpo específicos. Se prefieren los formatos de anticuerpo específicos, de modo que la biblioteca preferida se seleccione del grupo que consiste en una biblioteca de VH, biblioteca de VHH, biblioteca de Vkappa, biblioteca de Vlambda, biblioteca de Fab, una biblioteca de CH1/CL, una biblioteca de Fc y una biblioteca de CH3. Las bibliotecas caracterizadas por el contenido de moléculas compuestas que contienen más de un dominio de anticuerpo, tal como una biblioteca de IgG o biblioteca de Fc son especialmente preferidas. Otras bibliotecas preferidas son las que contienen receptores de linfocitos T, que forman bibliotecas de receptores de linfocitos T.. Otras bibliotecas preferidas son bibliotecas de epítopos, en las que la proteína de fusión comprende una molécula con una variante de un epítopo, que también permite la selección de moléculas competitivas que tienen una función de unión similar pero una funcionalidad diferente. Un ejemplo es una biblioteca de TNF alfa, en la que trímeros de la proteína de fusión de TNF alfa se expresan mediante un único paquete genético.

La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los ejemplos siguientes. Dichos ejemplos son, sin embargo, meramente representativos de los métodos de la práctica de una o más realizaciones de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de la biblioteca de Fcab no centrada (Fcab01) y expresión en superficie de fagos

La estructura cristalina de un fragmento Fc de IgG1, publicada en la base de datos de Brookhaven como la entrada 1OQO.pdb, se usó para ayudar en el diseño de la biblioteca de Fcab.

La secuencia que se usó como base para la construcción de la biblioteca de Fcab se proporciona en la SEC ID Nº 1 (Figura 3). En esta secuencia, el primer aminoácido corresponde a Glu 216 de IgG1 humana (numeración de la UE: de acuerdo con la base de daros de la IMGT (http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHC allgenes.html; lookup 2007 06 25), Es el primer residuo de la región bisagra de la IgG1 humana, que se proporciona como: (E)PKSCDKTHTCPPCP) de la región bisagra de la región constante de la cadena pesada de la IgG1) El segundo-último residuo de la SEC ID Nº 1 (Figura 3) corresponde a Gly 446 de la IgG1 humana (numeración de la UE: IMGT: número de residuo 129 del dominii CH3 de la IgG1 humana).

Después del detallado análisis de la estructura de 1oqo.pdb y mediante inspección visual de los residuos que forman los bucles que conectan las hebras beta, se decidió aleatorizar los residuos 144 145 y 146, que forman parte del bucle que conecta la hebra beta A-B. así como 198, 199, 200, 203 y 204, que forman parte del bucle que conecta la hebra beta E-F de la SEC ID Nº 1 (FIGURA 3). Además de los residuos mutados, se insertaron 5 residuos en el número de residuo 198 de la SEC ID Nº 1 (Figura 3). En la SEC ID Nº (Figura 4), se proporciona la secuencia del inserto de la biblioteca de la biblioteca Fcab01 en la que todas las posiciones de los residuos aleatorizados así como los 5 residuos insertados se designnan con la letra X.

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El gen modificado por ingeniería se produjo mediante una serie de reacciones de PCR usando cebadores degenerados seguido de ligación de los productos de la PCR resultantes. Para facilitar la unión, algunos de los codones de la secuencia de nucleótidos que codifica la SEC ID Nº 1 (Figura 3) se modificaron para producir sitios de restricción sin cambiar las secuencias de aminoácidos (mutaciones silentes). Para la inserción en el vector de clonación pHEN1 (Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11; 19(15):4133-7. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.) en marco con la señal de secreción peIB, se usó el sitio de restricción NcoI cerca del extremo 3' de la señal de secreción peIB. Para los residuos aleatorizados, se eligió el codón NNS (código IUPAC, en el que S significa los nucleótidos C y G) que codifica los 20 aminoácidos de origen natural, pero evita 2 de 3 codones de terminación. Otros codones tales como, por ejemplo, el NNB (en el que B significa los nucleótidos T, C y G) también se pueden usar. La secuencia modificada se proporciona como una secuencia de nucleótidos en la SEC ID Nº 3 (Figura 5). Esta secuencia también incluye los sitios de restricción usados para clonar en el vector de expresión en fagemido pHEN1, es decir, un sitio NcoI en el extremo 5' y un sitio NotI en el extremo 3'.

Las secuencias de los cebadores para PCR usados para ensamblar el dominio CH3 mutado se proporcionan en la SEC ID Nº 4 a SEC ID Nº 9. SEC ID Nº.4 (cebador para PCR EPKSNCO) ccatggccgagcccaaatcttgtgacaaaactc SEC ID Nº.4 (cebador para PCR CH3LSAC) agtcgagctcgtcacgggatgggggcaggg SEC ID Nº 6 (cebador para PCR CH3CSAC) gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctgg SEC ID Nº 7 (cebador para PCR CH3CHIN) tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagccg SEC ID Nº 8 (cebador para PCR CH3RHIN) tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsaggtggnnsnnsgggaacgtcttctcatgctccg SEC ID Nº 9 (cebador para PCR CH3RNOT) agttgcggccgctttacccggagacagggagag

La Figura 1 muestra una presentación esquemática de los fragmentos de PCR generados para el ensamblaje del gen mutado y los cebadores usados.

Se usó ADNc de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 3D6 (Felgenhauer M, Kohl J, Ruker F. Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of Hand L-chains of a human mono-clonal antibody specific to HIV-1-gp41. Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18(16):4927.) como molde para las reacciones de la PCR. Los 3 productos de la PCR se digirieron con Sacl y/oHindIII respectivamente y se unieron-El producto de la unión se digirió adicionalmente con Ncol y Notl y se ligó en el vector fagemido de expresión en superficie pHEN1, que se habían digerido previamente con Ncol y Notl, El producto de la unión se transformó después en E. coli mediante electroporación. Una serie de clones seleccionados se controló mediante análisis de restricción y mediante secuenciación de ADN y se halló que contenían el inserto según lo planeado, incluyendo las secuencias aleatorizadas correctamente insertadas. Para las etapas siguientes de la preparación de fagos se siguieron protocolos estándar. En resumen, la mezcla de la unión se transformó después en células TG1 de E. coli mediante electroporación. Posteriormente, las partículas de fago se rescataron de las células TG1 de E. coli con el fago colaborador M13-KO7. Después, las partículas de fago se precipitaron del sobrenadante del cultivo con PEG/NaCl en dos etapas, se disolvieron en agua y se usaron para la selección mediante adsorción o, como alternativa, se almacenaron a -80ºC

Ejemplo 2: Construcción de la biblioteca de Fcab centrada (Fcab02) y expresión en superficie de fagos

Como se describe en el Ejemplo 1, se preparó una biblioteca de Fcab en la que las posiciones aleatorizadas de la biblioteca están completamente aleatorizadas, es decir, están codificadas por un codón, tal como NNS NNB, NNK, NNN u otros.

Por claridad, el significado de letras tales como N, B, S o K se define en el código de ambigüedad de nucleótidos de la IUPAC, que se proporciona en la tabla siguiente:

Tabla 1. Código de ambigüedad de nucleótidos de la IUPAC

Símbolo

Significado Ácido nucleico

A

A

Adenina

C

C

Citosina

G

G

Guanina

T

T

Timina

U

U

Uracilo

M

A o C

R

A o G

W

A o T

S

C o G

Y

C o T

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K

G o T

V

A o C o G

H

A o C o T

D

A o G o T

B

C o G o T

X

G o A o T o C

N

G o A o T o C

Fuente: Nomenclature for incompletely specified bases in nucleic acid sequences: recommendations 1984. A Cornish-Bowden, Nucleic Acids Res. 1985 May 10; 13(9): 3021-3030.

Estos codones indicados anteriormente están diseñados de un modo tal que los 20 aminoácidos están codificados por ellos. Puede ser preferible elegir subconjuntos de los posibles aminoácidos. Se pueden encontrar ejemplos en la bibliografía (Fellouse FA, Li B, Compaan DM, Peden AA, Hymowitz SG, Sidhu SS. Molecular recognition by a binary code. J Mol Biol. 2005 May 20;348(5):1153-62. Epub 2005 Apr 1.; Fellouse FA, Wiesmann C, Sidhu SS. Synthetic antibodies from a four-amino-acid code: a dominant role for tyrosine in antigen recognition. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Aug 24; 101 (34):12467-72. Epub 2004 Aug 11.). Las bibliotecas centradas que, por ejemplo, permiten que sólo se puedan construir 4 tipos de aminoácidos diferentes, por ejemplo usando el codón KMT, que codifica los aminoácidos Ser, Tyr, Ala y Asp.

Una biblioteca Fcab centrada, designada Fcab02, se ha construido del mismo modo que se describe en el ejemplo 1 a excepción de que los codones NNS se sustituyeron por los codones KMT.

Por tanto, la letra "X" en la SEC ID Nº 2 (Figura 4) ahora significa "S, Y, A y D" (Ser, Tyr, Ala y Asp) con el fin de describir la biblioteca Fcab02 centrada

Ejemplo 3: Construcción de una biblioteca de expresión en superficie de fagos con residuos de aminoácidos adicionales entre el inserto de la biblioteca (pareja de unión) y p3

Con el fin de investigar la accesibilidad del potencial sitio de unión de la proteína expresada se realiza un ensayo de unión: la suspensión de fagos se hace reaccionar con microplacas (o inmunotubos) revestidas con AcMo anti-myc 9E10. Después de lavar, los fagos unidos se detectan con el conjugado anti-M13-enzima. Como control, el fago colaborador, que no expresa la proteína de fusión y el marcador myc, se hace reaccionar con las placas. Otros controles son la reacción de los fagos con placas no revestidas y la reacción de los fagos con antisuero que reconoce la pareja de fusión--p3 de los fagos.

Idealmente, la reactividad anti-myc de los fagos que expresan la proteína de fusión-p3 deberá dar lecturas en ELISA muy claras, mientras que las reacciones de fagos colaboradores al anti-myc-mAb no deberán estar por encima del valor de fondo (placas no revestidas). La estructura de un dímero de CH3 expresado en la superficie de un fago M13 a través de la unión a la proteína III como anclaje es tal que cada CH3 está anclado a la proteína III usando varias longitudes de ligadores y composiciones. Por tanto, el dímero CH3 se expresa, preferentemente, mediante dos anclas.

Optimización del ligador:

El ligador entre la proteína que se va a expresar y la proteína ancla del paquete genético (en el caso del fago filamentoso, por ejemplo, p3), p8, pX, pIX, pVII) es especialmente importante si el potencial sitio de unión de la molécula expresada está en las proximidades espaciales de la partícula de fago. En las bibliotecas de anticuerpos que usan dominios vriables y los sitios de unión a antígeno formados por los bucles CDR y expresan los miembros de la biblioteca como fusión en el amino-terminal con p3, el potencial sitio de unión a antígeno es alejado de la partícula de fago, Por tanto, la estructura del ligador entre miembros de la biblioteca y la proteína de la cubierta del fago no es importante. La modificación por ingeniería de los bucles de la arte inferior de los dominios de inmunoglobulina y la realización de expresión en fagos puede, no obstante, ser un proceso ineficiente y disminuye los rendimientos de los clones de unión a antígeno o, incluso, impedirlo. La variación del ligador entre una proteína miembros de la biblioteca y su pareja de fusión sobre la superficie puede resolver o puede al menos reducir este problema.

Con el fin de seleccionar secuencias de ligadores óptimas (en términos de longitud y flexibilidad, así como de estabilidad), se puede preparar una biblioteca de ligadores en la que la proteína de ancla en la superficie del paquete genético replicable se fusiona con una proteína de unión conocida que es, por motivos estéricos, considerablemente difícil de seleccionar.

Esta biblioteca de secuencias se puede modificar en longitud y contenido en aminoácidos.

Los métodos de selección de la biblioteca de ligadores para los ligadores óptimos dependen de la aplicación, pero básicamente debe ser para seleccionar todas las propiedades que se desea tener en determinada metodología. El enriquecimiento contra un antígeno difícil de seleccionar puede producir secuencias ligadoras que permiten a los miembros de la biblioteca de un buen acceso a los antígenos. La incubación en las soluciones de proteasas o en otras

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condiciones adversas o pases frecuentes a través de células huésped en condiciones proteolíticas (por ejemplo, antiguos cultivos microbianos) puede ser una selección adecuada de los ligadores de expresión estables

Una biblioteca de ligadores se puede producir mediante cualquier tecnología de biblioteca bien conocida. Las longitudes de secuencia ligadora sintética pueden variar entre 10-500 aminoácidos. Como alternativa, el ligador puede ser proteínas completas que se sabe que son de naturaleza flexible.

Optimización del ligador Fcab01:

Como ejemplo, se puede usar la biblioteca Fcab01 (como se describe en el ejemplo 1) . Originalmente, esta biblioteca se clona en el vector pHEN1 de expresión en fagemidos usando los sitios de restricción NcoI y NotI. Cuando se clonan de esta manera, 18 residuos de aminoácidos están en entre el residuo de aminoácido en C-terminal del inserto de la biblioteca Fcab01 y el residuo de aminoácido N-terminal del fago M13 p3. La secuencia de esta región de unión se proporciona en la SEC ID N º 10 SPGKAAAEQKLISEEDLNGAATVES -como se explica del siguiente modo: los primeros 4 residuos, SPGK, son los 4 residuos en C-terminal del inserto de la biblioteca Fcab01, seguido de la secuencia de aminoácidos AAA, que son los residuos de aminoácidos codificados por el sitio de restricción NotI , seguido por la secuencia EQKLISEEDL que es el epítopo myc, seguido de NGAA, tras lo cual existe un codón de terminación ámbar, que se traduce en glutamina (Q) en las cepas supresores ámbar de E. coli, tal como TG1. Los 4 residuos en C-terminal de la SEC ID Nº 10, TVES, son los 4 residuos en N-terminal del fago M13 p3 como están presentes en el vector pHEN1.

Con el fin de construir un fago que expresa un inserto de Fcab con un aumento de la distancia entre el Fcab (la pareja de unión) y el cuerpo del fago (el paquete genético), se insertaron 5 residuos adicionales se insertan en el extremo C-terminal del inserto de Fcab rFcabRGD4, directamente cadena arriba del sitio de clonación NotI, lo que resulta en el clon FcabRGD4L. FcabRGD4 es un Fcab que tiene un motivo de unión a integrina RGD insertado en el bucle EF del dominio CH3 y que se une a avß3-integrina en el ELISA. Como una secuencia ligadora de mayor longitud, se usó la secuencia de aminoácidos EGGGS, que aparece 8 veces en la secuencia del fago M13 p3. La secuencia de aminoácidos resultante de FcabRGD4L tal como se expresa después de la clonación en pHEN1 se da en la SEQ ID N º 11 (Figura 5). En la SEC ID Nº 11 (Figura 5), los residuos de aminoácidos 198-204 representan el motivo RGD, el residuo de aminoácido 237 es el residuo en C-terminal de la pieza de inserción Fcab, los residuos 238-242 representan la secuencia ligadora insertada (que es la diferencia con el pHEN1 no modificado), seguido del marcador myc, el codón de terminación ámbar y la secuencia p3.

Para la clonación de la construcción la secuencia de FcabRGD4 se amplificó a partir de pHENFcabRGD4 (SEC ID N º 12) usando los cebadores de PCR EPKSNCO (SEC ID N º 4) y CH3rlink actagcggccgcagagccaccaccctccttacccggagacagggagag (SEC ID N º 13) y se clonó a través de los sitios de restricción NcoI y NotI en el vector pHEN1. El vector resultante, pHENFcabRGD4L (SEC ID N º 14 / Figura 7), tiene la secuencia ligadora adicional en las posiciones de nucleótidos 3.057 a 3.071.

Los dos vectores fagemidos, pHENFcabRGD4 y pHENFcabRGD4L se transformaron en TG1 de E. coli. Posteriormente, las partículas de fago se rescataron de las células TG1 de E. coli con el fago colaborador M13-KO7. Después, las partículas de fago se precipitaron del sobrenadante del cultivo con PEG/NaCl en dos etapas, se disolvieron en agua y se usaron para el ELISA.

El ELISA del fago se realizó del siguiente modo:

La suspensión de fagos se hace reaccionar con microplacas revestidas con avß3-integrina (o inmunotubos). Después de lavar, los fagos unidos se detectan con el conjugado anti-M13-enzima. Como controles el fago colaborador, que no expresa la proteína de fusión y el marcador myc, se hace reaccionar con las placas así como las partículas de fago portadoras de wtFcab sobre su superficie, Otros controles son la reacción de los fagos con placas no revestidas y la reacción de los fagos con antisuero que reconoce la pareja de fusión-Fcab de los fagos. Las partículas de fago con el ligador de mayor longitud resultante de pHENFcabRGD4L reaccionan más fácilmente con avß3-integrina que las partículas de fago con el ligador original, tal como figura en pHENFcabRGD4, y, por lo tanto, dar una señal más fuerte en ELISA.

Se pueden realizar selecciones de fagos en las que las partículas de fago con wtFcab se mezclan con pequeñas cantidades de partículas de fago que llevan FcabRGD4 o FcabRGD4L. Después de varias (normalmente 3-5) rondas de adsorción se seleccionan, preferentemente, los fagos que expresan FcabRGD4L.

Ejemplo 4: Diseño de la biblioteca Fcab™

El diseño de Bibliotecas Fcab (ilustrado en la Figura 2): posiciones de aminoácidos en no los bucles no CR de los dominios constantes CH3 de los anticuerpos se consideran para la aleatorización. Especialmente los bucles AB, CD y EF se considera como que están en un lado del dominio. Algunos de los criterios de diseño para la aleatorización en una posición determinada se describen en el presente documento.

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Los aminoácidos involucrados con frecuencia en interacciones anticuerpo-antígeno se describen en el presente documento para su inclusión en una biblioteca centrada.

Las bibliotecas con uso restringido de aminoácidos se ha demostrado que son suficientes para generar ligantes contra virtualmente cualquier antígeno (Sidhu y Fellhouse, NATURE CHEMICAL BIOLOGY VOLUME 2 page 682ff.; Koide et al PNAS, volumen 104 p6632-6637). La ventaja de tales bibliotecas restringidas (o centradas) es que pueden abarcarse completamente por las tecnologías actuales.I Idealmente, el uso de aminoácidos refleja una utilización de aminoácidos naturales de la unión a los receptores de ligandos Sin embargo, se ha notificado que incluso las bibliotecas que utilizan sólo 2 aminoácidos (tirosina y serina) para obtener buenos resultados de la selección (en términos de frecuencia de los ligadores contra ligadores diferentes y en términos de afinidad).

Flexibilidad del bucle:

La proteína estructural puede requerir ciertas estructuras de bucle con el fin de mantener la estructura natural global. .La aleatorización de muchas posiciones de los aminoácidos en los bucles e incluso el alargamiento de los bucles se puede facilitar generando determinadas secuencias en uno o en ambos lados de las posiciones aleatorizadas. Estas secuencias pueden ser secuencias flexibles con el fin de permitir la compensación por cualquier tensión con determinadas secuencias de la biblioteca en dicha posición.

Tabla 2: Ejemplos de bibliotecas Fcab™, centradas y no centradas

nº de posiciones aleatorizadas

Diversidad teórica a nivel de aminoácidps Número de clones bacterianos independientes

Fcab01

13 8,2x1016 0,6x109

Fcab02

13, centrada 6,7x107 0,6x109

Fcab03

13 8,2x1016 1,0x109

Fcab04

13, centrada 6,7x107 0,8x109

Fcab05

15 1,3x1018 0,8x109

Fcab06

15, centrada 1,3x109 1,0x109

La biblioteca Fcab01 se describe en los ejemplos anteriores. El espacio de la secuencia de los diseños de la biblioteca centrada Fcab02, Fcab04 y Fcab06 están cubiertos por los tamaños reales de las bibliotecas bacterianas de aproximadamente 10e9. Por el contrario, las bibliotecas completamente aleatorias Fcab01, Fcab03 y Fcab05 en realidad están insuficientemente representadas.

Diseño de aleatorización de bucle en levaduras

De manera similar a los ejemplos mencionados anteriormente para el diseño de la biblioteca Fcab y la generación de la biblioteca en bacterias, se generaron bibliotecas de levaduras. Como se muestra en la tabla 3 se generaron varias combinaciones de bucles AB modificados, bucles CD y bucles EF. El bucle AB modificado en este ejemplo varía del aminoácido 358 a 362 (secuencia wt "LTKNQ"), el bucle CD modificado del aminoácido 384 a 388 (secuencia wt "LTKNQ"), y el bucle EF de 413 a 419 (secuencia wt "DKSRWQQ").

Como se ha mencionado anteriormente, "X" representa una aleatorización completa, y "Z" para un diseño centrado. Aminoácidos que se insertaron y no están presentes en el armazón de Fc silvestre, se escriben entre paréntesis en la tabla 3. Para dichas bibliotecas, en las que no se modificaron los bucles, el código de aminoácidos de una letra de la respectiva secuencia wt se cita en la tabla. Como el número de combinaciones teóricas excede en la mayoría de estas bibliotecas el número experimental de los clones, el número de clones de levadura independientes generados se muestra en la última columna.

Tabla 3: Ejemplos de bibliotecas Fcab™, centradas y no centradas, con mutaciones e inserciones en el bucle AB, el bucle CD y el bucle EF.

Nombre de la

Clones

tamaño teórico

Bucle AB Bucle CD Bucle EF

biblioteca

independientes

Fcab05

2,0x1022 ZXXXZ NGQPE (XXXXX)XXXRWXX 2,2x104

Fcab05sABCD

7,5x1031 XXXXX XXXXX (XXXXX)XXXRWXX 1,1x106

Fcab05sCD

6,8x1029 ZXXXZ XXXXX (XXXXX)XXXRWXX 8,6x106

Fcab05sAB

1,3x1024 XXXXX NGQPE (XXXXX)XXXRWXX 53x107

Fcab07

3,4x1010 LTKNQ NGQPE XXXXXXX 5,3x107

Fcab07AB

1,2x1018 XXXXX NGQPE XXXXXXX 4,8x106

Fcab07ABb

1,2x1018 XXXXX NGQPE XXXXXXX 1,3x107

Fcab07b

3,4x1010 LTKNQ NGQPE XXXXXXX 37x107

Fcab07CD

1,2x1018 LTKNQ XXXPE XXXXXXX 1,9x107

Fcab07CDAB

3,9x1025 XXXXX XXXPE XXXXXXX 1,7x107

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Fcab08 3,4x107 XXXXX NGQPE DKSRWQQ 8,5x106 Fcab08EF 1,2x1018 XXXXX NGQPE XXXXXXX 22x107

Ejemplo 5: Clonación de bibliotecas de expresión en levadura mediante vector de recombinación homóloga

El pYD1 (Invitrogen) se utiliza como el vector básico. El vector se modifica de la siguiente manera, con el fin de eliminar un sitio XhoI: pYD1 se escinde con XhoI, s se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y se vuelve a ligar. La secuencia resultante se da en pYD1dX (SEC ID N º 15 / Figura 8). pYD1dX contiene un sitio de restricción BamHI único en la posición 921/925 y un sitio de restricción NotI único en la posición 963/967. Se abre con estas dos enzimas de restricción. Un inserto que codifica CH1-bisagra-CH2-CH3 de la IgG1 humana se prepara mediante PCR a partir de ADNc que codifica la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal IgG1 humana. En este inserto se introduce una mutación puntual usando procedimientos estándar para mutar el residuo de cisteína en C-terminal del dominio CH1 a una serina. El inserto se amplifica usando cebadores de PCR que se unen a un sitio de restricción BamHI y Not en ambos extremos respectivamente. Estos sitios de restricción se utilizan después para clonar el inserto en pYD1dX para producir el vector de expresión pYD1dXFc (SEC ID N º 16 / Figura 9).

El codón mutado en el extremo C-terminal del dominio CH1 (Cys a Ser) está en las posiciones 1233 a 1235 en la secuencia de pYD1 DxFc. El codón de terminación del inserto está en la posición 1917/1919.

Este vector se utiliza como un control positivo para la expresión de CH1-bisagra-CH2-CH3 humano sobre la superficie de la levadura y como punto de partida para la construcción del vector pYD1CH12 vector (ver más adelante).

Clonación de las bibliotecas

La clonación de las bibliotecas en las que las mutaciones se introducen en los bucles estructurales de los dominios CH3 se realiza en la levadura mediante recombinación homóloga (reparación de huecos). Con este fin, se prepara un vector recepto que carece del dominio CH3: se escinde el pYD1dXFc con XhoI (posición 1603/1607) y NotI (posición 1921/1925), el fragmento grande se prepara mediante electroforesis en gel preparativa, se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y se vuelve a ligar. Este procedimiento reconstituye un sitio XhoI único (posición 1603/1607) y el vector dado pYD1 CH12 (SEC ID N º 17 / Figura 10). Posteriormente, pYD1CH12 se escinde con XhoI y se utiliza como vector receptor para la reparación de huecos en la levadura.

Como alternativa, para las bibliotecas indicadas en la Tabla 3 se construyó un vector receptor diferente, que comprendía sólo la región bisagra, los dominios CH1 y CH2,, pero sin el dominio CH1. En este vector, el dominio CH1 se eliminó cortando con BamH1 (posición: 921/926) y Xho1 (posición: 1603/1608). En su lugar, los autores introdujeron un fragmento producido mediante PCR que comprende la región bisagra, el dominio CH2 y los correspondientes sitios de enzimas de restricción. El plásmido resultante es pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt (SEC ID N º 428 / Figura 29). En una etapa adicional, los autores eliminaron el dominio CH3 del último plásmido digiriendo con Xho1 (1309/1314) y Not1 (1626/1633) y se sustituyó por dos marcadores secuenciales: el marcador V5 seguida del marcador His6 Se obtuvo esta secuencia mediante amplificación por PCR a partir del vector pYD1 y se clonó utilizando los sitios de enzimas de restricción Xho1 y Not1. El plásmido final, pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt (SEC ID Nº 427 / Figura 28), se utilizó como el vector receptor biblioteca. El pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt codifica para un fragmento de la IgG1 humana a partir de la región bisagra y terminando en el comienzo de dominio CH3. Contiene un único sitio de restricción BamHI (921/926), Xho1 (1309/1314) y NotI (1422/1429). Estos 2 últimos se usan para la introducción de las bibliotecas CH3 mediante recombinación de homóloga. El vector pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt se utiliza como un control positivo para la expresión de bisagra-CH2-CH3 humano sobre la superficie de la levadura y pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt como punto de partida para la construcción de las bibliotecas enumeradas en la Tabla 3.

Como fuente del inserto para pYD1dXFc, se usan las bibliotecas de Fcab Fcab01 (SEC ID Nº18), Fcab02 (SEC ID Nº19), Fcab03 (SEC ID Nº 20), Fcab04 (SEC ID Nº 21), Fcab05 (SEC ID Nº.22) y Fcab06 (SEC ID Nº.23) . Estas bibliotecas se preparan mediante síntesis de ADN estándar y contienen restos aleatorizados, así como residuos insertados en el bucle AB (entre los residuos 359 y 361 (numeración de la UE)), así como en el bucle EF (entre los residuos 413 y 419 (numeración EU) ) del dominio CH3 de la IgG1 humana. A partir de este ADN sintético, el inserto ara la reparación de huecos en la levadura se amplifica mediante PCR usando el par de cebadores para PCR

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100 mg del vector pYD1CH12 escindido con XhoI y 100 mg del inserto se mezclan y se transforman en la cepa EBY100 de Saccharomyces (Invitrogen) utilizando el procedimiento de acetato de litio de acuerdo con el siguiente 5 protocolo, que se mejora con un factor de 100 para transformar la cantidad requerida de células y de ADN. En resumen, para una única transformación de 1 μg de ADN del vector y 1μg de ADN del inserto se inoculan 10 ml de YPD (2 %de peptona, 2 % de dextrosa (D-glucosa)) con una colonia de levaduras y se agita durante la noche a 30ºC. La DO600 del cultivo durante la noche se determina y el cultivo se diluye hasta una DO600 de 0,4 en 50 ml de YPD y se cultivan durante 2--4 horas adicionales. Las células se sedimentan a 2.500 rpm y se resuspenden en 40 ml de 1X TE 10 (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM). Las células se sedimentan de nuevo a 2.500 rpm y se resuspenden en 2 ml de LiAc/0,5X TE 1M seguido de incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. 1 ug de ADN del vector, 1 ug del inserto y ug de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado (2 mg/ml) se mezclan con ul de la suspensión de levadura. Se añaden 700 ul de LiAc 1M/40 % PEG-3350/1X TE y se mezclan con la suspensión de levadura/ADN, seguido de incubación a 30 ºC durante 30 minutos. Se añaden 88 ul de DMSO, se mezclan y la mezcla se incuba a

15 42°C durante 7 minutos, seguido de centrifugación en una microcentrífufa durante 10 segundos. Después se retira el sobrenadante, el sedimento celular se resuspende en 1 ml de 2X TE y se vuelve a sedimentar. El sedimento se resuspende después en 500-100 ul de TE y se siembra en placas con dextrosa mínima que contiene leucina (10 g/l de base de nitrógeno para levadura, 20 g/I de dextrosa, 0.1 g/l de leucina, 15 g/I de agar). Tras la incubación de las placas a 30 ºC durante de 2 a 4 días, aparecieron colonias únicas que se recolectaron después.

20 Como fuente del inserto para el vector pYD1dX_dCH1dCH3, se usaron las bibliotecas Fcab enumeradas en la Tabla 3. Estas bibliotecas se preparan mediante síntesis de ADN estándar y contienen residuos aleatorizados así como residuos insertados en el bucle AB, y el bucle CD, así como en el bucle EF del dominio CH3 de la IgG1 humana (véase la Tabla 3). A partir de este ADN sintético, el inserto para la reparación de huecos en la levadura se amplifica mediante

25 PCR utilizando los oligos YCH3.25rec.back y YCH3.25rec.opt.for (los cebadores utilizados se enumeran a continuación). La mezcla de transformación básica comprende 2 ug de pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt escindido con XhoI y 1 ug del ADN del inserto, que se mezclan y transforman en la cepa de Saccharomyces EBY100 (Invitrogen) usando el procedimiento con acetato de litio, que se mejora con un factor de 100 para obtener la cantidad requerida de transformantes. En resumen, para una única transformación de 1 μg de ADN del vector y 1μg de ADN del inserto se

30 inoculan 10 ml de YPD (2 %de peptona, 2 % de dextrosa (D-glucosa)) con una colonia de levaduras y se agita durante la noche a 30ºC. La DO600 del cultivo durante la noche se determina y el cultivo se diluye hasta una DO600 de 0,3 en 50 ml de YPD y se cultivan durante 6 horas adicionales o DO600 de 2,5. Las células se sedimentan a 2500 rpm, se lavan dos veces: primero con 25 ml de agua destilada y después con LiAc 100 mM; y, por último, se resuspenden en 500 ul de LiAc 100 mM. 2 ug de ADN del vector, 1 ug del inserto y 100 ug de ADN de esperma de salmón cortado

35 desnaturalizado (2 mg/ml) se mezclan con 50 ul de la levadura en una solución que contiene PEG3500 (33 %p/v) y LiAc100mM en un volumen final de 360 ul. Después de una buena homogeneización, las levaduras se mantienen a 30ºC durante 30 minutos y, después, a 42 ºC durante 45 minutos. Después, se retira el sobrenadante y el sedimento celular se resuspende en YPD y se deja que las células se recuperen durante otros 60-90 minutos a 30ºC. Después, el sedimento se incuba en medio selectivo (placas y/o líquido, véase más adelante) a 30ºC durante 2 días. La diversidad

40 de la biblioteca se determina mediante el número de células individuales cultivadas hasta colonias en placas que se han preparado e inoculado inmediatamente después del período de recuperación.

Lista de cebadores

45 a) CH3seqs/2 (SEC ID Nº 429): 5'-AAGGAGTACAAGTGCAAGG-3' b) cebadores inversos:

CDmut_back (SEC ID Nº 430): 5'-GCT CTC CCA CTC CAC G-3' CDmut_back (SEC ID Nº 430): 5'-CAC GGT GAG CTT GCT GTA GAG-3'

50 ABMUT5/2_back (SEC ID Nº 432): 5'-CTCATCCCGGGATGGG-3'

c) cebadores directos (X= trinucleótido, síntesis de aminoácidos aleatorizados) CDmut5cod_for (SEC ID Nº 433):

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5'-GTG GAG TGG GAG AGC X X X X X AAC AAC TAC AAG ACC ACG-3' EFMUT7cod_for (SEC ID Nº 434): 5'-AGC AAG CTC ACC GTG X X X X X X X GGG AAC GTC TTC TCA TGC-3' EFMUT3+2_for (SEC ID Nº 435): 5'-AGC AAG CTC ACC GTG X X X AGG TGG X X GGG AAC GTC TTC TCA TGC-3' ABMUT5 (wt)_for (SEC ID Nº 436): 5'-CCA TCC CGG GAT GAG X X X X X GTC AGC CTG ACC TGC CTG G-3'

d) CH3seqAS (SEC ID Nº 437): 5'-TAGAATCGAGACCGAGG-3'

e)YCH3.25rec.opt.for (SEC ID Nº 438): 5'-A CCA TCT CCA AGG CCA AGG-3'

f)Ych3.25rec.back (SEC ID Nº 439): 5'-AAG GGC CCT CTA GAC TCG-3'

Cultivo -Inducción

Las bibliotecas de levaduras recolectadas (bibliotecas y Fcab ) se inoculan en 10 ml de medio SD-CAA (10 g/l de base de nitrógeno para levaduras, 10 g/l de aminoácidos, y 20 g/l de dextrosa. 0,1 g/l de leucina, 9,67 g/l de NaH2PO42H2O y 10,19 g/l deNa2HPO47H2O) y se cultivan en un agitador a 250 rpm a 28 ºC durante 6.8 horas. La DO600 del cultivo se determina y el cultivo de diluye hasta una DO600 de 0,2 y se cultiva en las mismas condiciones hasta alcanzar una do600 DE 1-2. Las células se recolectan mediante centrifugacíón (3.000 rpm /5 min/ 4º C) y se resuspenden en medio de inducción SG/R-CAA (10 g/l de base de nitrógeno de levadura. 10 g/l de casa aminoácidos, y 20 g/l de galactosa, 10 g/l de rafinosa, 0,1 g/l de leucina, 9,67 g/l de NaH2PO42H2O y 10,19 g/l de Na2HPO47H2O). Los cultivos se inducen mediante incubación durante 2 días en un agitador a 250 rpm a 20ºC y después se analizan y clasifican. Como alternativa, los cultivos se inducen mediante incubación durante 1 día en un agitador a 250 rpm a 37ºC y después se analizan y clasifican.

Control de calidad de las bibliotecas yFcab

Las bibliotecas yFcab se analizan para determinar su nivel de expresión y la calidad de los Fcab expresados dos días después de la inducción con medio SD-CAA. El nivel de expresión se analiza usando antisuero anti-IgG-Fc humano policlonal (Sigma). Con este fin, 0.5x10e6 células de la biblioteca se diluyen en 1 ml de tampón de tinción (SB), que comprende OBS con 2 % de BSA. Las células se sedimentan y se tiñen con 100 ul de SB que contiene antisuero antiIgG-Fc-PE humano diluido a 1/2000 (Sigma) durante 30 minutos en hielo, se lavan dos veces con SB y después se analizan en el FACS. En general, 70-80 % de todas las células en cada biblioteca expresan Fcab sobre su superficie celular. Para analizar el plegamiento correcto de Fcab, se realiza tinción con proteína A. De nuevo, 0,5x10e6 células de la biblioteca se diluyen en 1 ml de tampón de tinción SB, las células se sedimentan y tiñen con 100 ul de SB que contiene 1 ug/ml de Prot-A-FITC (Fluka) durante 30 minutos con hielo, se lavan dos veces con SB y después se analizan en el FACS. Por lo general, las bibliotecas yFcab como se ha descrito anteriormente muestran 40 % de células positivas a la proteína A.

Con el fin de analizar si los Fcab se expresan como dímeros sobre la superficie de las células se realiza una tinción con CD64 humano. 5x10e5 células se sedimentan y se tiñen 30 minutos eh huelo con 5o ul de SB que contiene 1 ug/ml de cd64 (R&D Systemns). Después de una etapa de lavado, las células se resuspenden en 50 ul de SB que contiene 1 ug/ml de Penta His Alexa Fluor 488 (QIAgen) y se incuban otros 30 minutos en hielo. Las células se lavan y se resuspenden en 200 ul de SB helado para análisis con FACS Como control, las células se incuban con equivalente de Penta His Alexa Fluor 488, sin preincubación con CD64. Tras la incubación, las células se lavan una vez con SB helado y se analizan en el FACS, Por lo general, > 50 % de todas las células en cada biblioteca expresan Fcab diméricos sobre su superficie celular.

Biotinilación del antígeno (Her2)

El antígeno recombinante, por ejemplo Her2 (Bendermedsystems) se realizó con el sistema EZ de Pierce de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, el antígeno se dializa contra PBS, se diluye a 1 mg/ml en PBS y se mezcla con sulfo-LC-LC-biotina 10mM (EZ link, Pierce). que se disolvió previamente en agua. La proporción final entre antígeno y biotina es 1:3 y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, la mezcla se "dializa" contra PBS usando columnas Vivaspin MWCO3000 (Sartorius) (5x8', 4.000 rpm). Por último, la concentración del antígeno biotinilado (Her2) se analiza mediante HPLC y los alícuotas se almacenan a -20ºC.

La calidad del antígeno biotinilado se analiza mediante LISA. En primer lugar, las placas se revisten con un anticuerpo anti-HEer2 (p. ej., Herceptin) a 10 ug/ml en PSB, 100 ul/pocillo durante la noche a 4ºC. después, la placa se lava 3 veces con tampón de lavado (WB)(PBS + 0,05 % de Tween20) y se bloquea mediante tampón de bloqueo ( BB) (PBS

+ 2 % BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces con WB, se añaden diferentes concentraciones de Her2-biotina en 100 ul/pocillo de BB durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de lavado 3 veces con WB. Por último, la placa se incuba con 1-25.000 de estreptavidina-HRP (GE healthcare) en BB durante 1 hora a temperatura ambiente y se lava 3 veces con WB. El color se desarrolla añadiendo 100 ul/pocillo del sustrato TMB (Sigma) tras aproximadamente 10 minutos, la reacción se detiene añadiendo 100 ul/pocillo de 30 % de H2SO4. Los resultados se analizan con un lector de ELISA a 450-630 nm.

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Ejemplo 6: Producción de Fcab específicos de antígeno (Her2) Selección de Fcab específicas de antígeno (Her2) usando FACS

Primera ronda de selección

Dos días antes de la clasificación con FACS, una biblioteca de levaduras que contiene 2,5 x10e 8 clones de Fcab se induce con medio SG/R-CAA para expresar los Fcab sobre la superficie celular como se ha descrito anteriormente. Tras dos días, la cantidad de células que cubren, por ejemplo, 19 veces la biblioteca (= 2,5 x10e9), se incuba durante 30 minutos en hielo con antígeno biotinilado 500 nM (Her2) en 2 ml de SB Después, las células se lavan una vez con SB frío y después se incuban durante 30 minutos en hielo con estreptavidina-PE (de R&D systems) diluido a 1: 100 en SB. Las células se lavan dos veces con SB frío helado hasta una concentración final de 1x10e9 células / ml. Las tinciones control con 5x10e6 células / ml en 100 ul se realizan sólo estreptavidina-PE, en ausencia de antígeno. Tanto la biblioteca completa como las tinciones control se analizan por ejemplo, un FACS ARIA de BD. Para configurar las puertas para la clasificación se utilizan las células control. Primero. se establece una puerta SSC FSC (G1) para identificar células de levadura sanas del gráfico del área de FSC frente a la anchira de FSC de G1 y solo se seleccionan las células que no se agregan en una nueva puerta (G2). Las células en G2 se analizan después para determinar la reactividad con estreptavidina--PE usando FSC frente a FL-2 (canal de PE). G3 se establece para inducir un 01, % de células positivas (falsas). Posteriormente, al menos 5x10e8 células teñidas (dos veces el tamaño de la biblioteca, idealmente más) se analizan con los parámetros como se ha indicado anteriormente y las células en G3 se clasifican en un tubo que contiene 2-3 ml de medio SD-CAA. Aproximadamente 5x10e5 células (Conjunto 1) se recogen en la primera ronda de selección y se propagan durante de 1 a 2 días, tras lo cual, las células se pueden almacenar a .80ºC y los alícuotas se pueden inducir para expresar los Fcab como se ha descrito anteriormente. Tras dos días más puede tener lugar la siguiente ronda de selección.

Segunda ronda de selección:

El conjunto 1 seleccionado en la ronda 1 se induce para expresar el Fcab sobre su superficie como se ha descrito anteriormente. Al menos 5x10e6 células (que comprenden múltiples copias del conjunto 1) se incuban durante 30 minutos en hielo con antígeno biotinilado 500 nM (Her2) en 1 ml de SB, Después, las células se lavan una vez con SB frío y después se incuban durante 30 minutos en hielo con estreptavidina-PE (de R&D systems) diluido a 1:100 en SB junto con 2 ug/ml de proteína A-FITC (Fluka). A continuación, las células se lavan dos veces con SB frío helado hasta una concentración final de 2x10e9 células / ml. Además, se realizan tinciones control en las que 5x10e6 células/ml del Conjunto 1 en 100 ul se incuban con una mezcla de proteína A y estreptavidina-PE como se ha indicado anteriormente, pero sin la incubación con el antígeno (Her2). Además, 5x10e5 células en 100 ul de un clon de levadura que expresa el fragmento Fc no aleatorizado de Fcab wt) se tiñen con Prot A -FITC como se ha descrito en lo que antecede en ausencia de estreptavidina-PE. Las células que expresan Fcab-wt se analizan en, por ejemplo, FACS ARIA de BD para configurar las puertas para la clasificación. Primero. se establece una puerta SSC FSC (G1) para identificar células de levadura sanas, del gráfico del área de FSC frente a la anchura de FSC de G1 y solo se seleccionan las células que no se agregan en una nueva puerta (G2). Las células en G2 se analizan después para determinar la expresión de la proteína A usando FSC frente a FL-1 (FITC). G3 se configura para cubrir las células positivas a la proteína A (50-60 % de la puerta parental) y G4 se configura para cubrir las células débilmente positivas a prot A (20-30 % de células parentales). G3+G4 incluirán aproximadamente el 70-80 % de todas las células en G2. Ahora, el conjunto de células teñidas para estreptavidina-PE en presencia de Prot A-FITC se usan para establecer el resto de las puertas de clasificación. Primero se comprueban G1 y G2 con el conjunto de células y, si es necesario, se ajustan. El conjunto de células tendrá menos episodios en G3 y, quizá también en G4, lo que indica que no todas las células del conjunto 1 expresan Fcab que se pliega como Fcab-wt. Usando el conjunto de células teñidas control, se prepara una nueva puerta para G3 y para G4. Las nuevas puertas se configuran en el gráfico de FSC y FL-2 (PE). Se prepara una puerta (G5) que incluye 0,1 % de células positivas a estreptavidina (falsas) en G3 y lo mismo se realiza para las células en G4, que da lugar a G6 En la siguiente etapa, al menos 5x10e6 células teñidas para HER2-biotina + estreptavidina-PE y Prot A-FITC se clasifican mediante FACS-ARIA. Las células se recogen de G5 (conjunto 2,1 y G6 (conjunto 2.2) en tubos separados que contienen 2-3 ml de medio de cultivo para levaduras. Cabe esperar entre 10 y 1000 clones de ambas puertas. Ambos conjuntos nuevos se propagan durante 1 o 2 días y se almacenan a -80 ºC. Las células de 2,1 y 2.2 se pueden usar para dirigir clasificación adicional en una tercera ronda o se pueden someter (preferentemente después de mezclar los dos clones de nuevo) a una ronda de aleatorización adicional del bucle AB (maduración de la afinidad) antes de clasificar adicionalmente en el FACS.

Maduración de la afinidad para clones/conjuntos determinados

Para la maduración de la afinidad. se introduce diversidad en determinados clones o en conjuntos de clones seleccionados, preferentemente solo en un bucle, aquí, el bucle AB. Con este fin, se efectuó una PCR con un cebador que contenía codones degenerados en las posiciones 359, 360 y 361 (numeración de la UE (cebador Abmut, gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbn-nbcaggtcagcctgacctgcc tggtcaaag, SEC ID Nº 26), o, como alternativa, se efectuó una PCR con un cebador que contenía codones degenerados en las posiciones 358, 359,

360.361 y 362 (numeración de la UE (cebador Abmut2LR, gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtca aag, SEC ID Nº 27).

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El segundo cebador usado en estas PCR es gapfcs3 en ambos casos. Con el fin de crear secuencias flanqueantes para una reparación de huecos eficiente en levaduras, los productos de la PCR resultantes se amplificaron adicionalmente con el par de cebadores gapch35 y gapfsc3 y después se transformaron en la cepa EBY100 de Saccharomyces cerevisiae mediante transformación con acetato de litio junto con pYD1CH12 digerido con ChoI como se ha descrito en lo que antecede. Como cebadores alternativos, para la aleatorización de los residuos descritos en el bucle AB, los cebadores tales como Abmut1L (gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcctggtca aag, SEC ID Nº 28) o Abmut1R (gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtca aag, SEC ID Nº 29) también se usaron. De forma análoga, los residuos en el bucle EF se aleatorizaron mediante aleatorización total.

Como alternativa, la aleatorización se realizó usando oligonucleótidos enriquecidos como cebadores sobre el clon individual y-Her.C2.P4.2-9. En este caso, los oligos se diseñaron de un modo similar a lo mencionado anteriormente para la aleatorización completa de los respectivos bucles. no obstante, la parte aleatorizada contenía 70 % de la base original en la primera y segunda posición del codón y 10 % de cada uno de los otros 3 nucleótidos. La tercera posición contenía un 70 % de la base original y 30 % de la base de acuerdo con el codón NNK y NNS.

El cebador Abmut tuvo como resultado 8.000 nuevas variantes (Conjunto 2.3) de cada clon y el cebador Abmut2LR conducen a 3x10e6 nuevas variantes (Conjunto 2.4) tras la aleatorización completa. Por tanto, los conjuntos 2.3 y 2.4 tuvieron como resultado nuevas bibliotecas de aproximadamente 10e8 individuos, ya que el material de partida (Conjunto 2.1 +2.2) ya contenía aproximadamente 10-1.000 clones.

Tercera ronda de selección

En los conjuntos de afinidad madurada 2.3 y 2.4 y, en caso necesario, el conjunto 2.1( solo se prefieren las células positivas a Prot A) se indujo la expresión de Fcab en su superficie celular como se ha descrito en lo que antecede y, después, se clasifican como se ha descrito para la "Segunda ronda de selección". con la excepción de que lo conjuntos

2.3 y 2.4 son mucho más grandes y, por tanto, los volúmenes de tinción para los conjuntos son iguales a los de la tinción de las bibliotecas descrita en la "Primera ronda de selección". En la tercera ronda de selección, solo las células positivas para Her2/positivas para Prot A se clasificaron. Los conjuntos derivados de estas selecciones contenían normalmente > 20 % de células positivas para Her2/para Prot A. En caso contrario, se realizaron una cuarta y una quinta ronda de selección (o incluso más) de Her2 junto con o también sin proteína A. Por ejemplo, la maduración de la afinidad del clon H242-9Q dio un incremento en la afinidad de unión de CE50= 155nM a 18,9 nM (clon H10-03-6 clone)

Análisis de los clones:

Los clones individuales de los conjuntos que contienen las células Her2/Prot (se prefiere >20 %) se prepararon sembrando los conjuntos en placas de agar con medio SD-CAAo mediante transferencia de las células únicas (=clones) directamente desde el FACS ARIA a placas sin generar un conjunto. Se dejan cultivar los clones y se transfieren a cultivos líquidos y se almacenan a -80ºC. Los alícuotas de los clones se indujeron después para expresar Fcab sobre su superficie celular como se ha descrito en lo que antecede y se someten a detección selectiva para una serie de parámetros en el FACS. Estos parámetros fueron: un intervalo de respuesta a la dosis del antígeno usado para la selección (Her2) con y sin la presencia de Prot A-FITC. Tinción de CD64 como se ha descrito en lo que antecede. Además, el uso de protocolos de tinción similares se realizó la detección selectiva de una serie de antígenos biotinilados irrelevantes para identificar los Fcab sin reacciones cruzadas.

Se observó que, tras varias rondas de selección de células positivas para antígeno (Her2) + Prot A, un gran porcentaje de clones muestran > 25 % de positividad al antígeno (Her2) cuando se tiñen con el antígeno (Her2) 500 nM y > 70 % de positividad a la proteína A cuando se tiñen con 2 ug/ml de Prot A-FITC. En la mayoría de los casos, estos clones también mostraron > 50 % de unión a CD64. Por tanto, esto refleja los niveles de tinción con Prot A y CD64 de los fragmentos Fc no aleatorizados (Fcab wt) expresados en levaduras.

Los clones seleccionados como se ha descrito en lo que antecede con características como se ha descrito en lo que antecede se produjeron como moléculas solubles. Esto se realizó principalmente mediante transfección transitoria, pero también mediante transfección estable del ADN de Fcab en las nuevas células huésped. Con este fin, el ADN de clones de levaduras individuales se aisló usando procedimientos estándar. El ADN de codificación relevante para el dominio CH3 completo O sólo la parte del dominio CH3 que se asignó al azar en la biblioteca se amplificó mediante PCR y se transfirió a un vector de expresión nuevo que contiene la parte que falta de la Fcab y un promotor adecuado y uno de más marcadores de selección, tales como G418, lo que permite la selección de células transfectadas de un conjunto de células no transfectadas. El nuevo vector se transfectó después transitoriamente en una nueva célula huésped, tales como células HEK293 o CHO. Se dejó que las células huésped se recuperaran y se cultivaron posteriormente durante un máximo de 10 días. El sobrenadante de los cultivos que contiene el Fcab soluble se utilizó para su análisis adicional después de la purificación sobre Prot A. Las líneas celulares estables también se pueden realizar por procedimientos estándar.

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Tabla 4: Secuencias de clones de levaduras de unión a Her2 seleccionados de bibliotecas iniciales, tras la expansión del conjunto y tras la maduración de la afinidad: con referencia a la numeración de la SEC ID Nº 1 (Figura ) (bucle CD); AA169ff NGQPE)

Nombre del clon

Bucle AB AA143ff Bucle EF AA198ff

Fcab wt

LTKNQ DKSRWQQ

y-Her.C2-P3.1-1

LDNSQ (SEC ID Nº 30) IRSSVGSRRWWS (SEC ID Nº 51)

y-Her.C2-P3.1-3

YEGSS (SEC ID Nº 31) IRSSVGSRRWWS (SEC ID Nº 51)

y-Her.C2-P3.1-5

YMSAD (SEC ID Nº 32) SRRDSSLLRWAH (SEC ID Nº 53)

y-Her.C2-P3.1-6

YRRGD (SEC ID Nº 33) APGSKGYRRWAL (SEC ID Nº 54)

y-Her.C2-P3.1-8

LMSRQ (SEC ID Nº 34) DKPFWGTSRWSR (SEC ID Nº 55)

y-Her.C2-P3.1-16

LHLAQ (SEC ID Nº 35) SINDLINHRWPY (SEC ID Nº 56)

y-Her.C2-P3.1-18

YLSKD (SEC ID Nº 36) MWGSRDYWRWSH (SEC ID Nº 57)

y-Her.C2-P3.2-3

YRSGS (SEC ID Nº 37) NSGSAMMVRWAH (SEC ID Nº 58)

y-Her.C2-P3.2-9

LRDGQ (SEC ID Nº 38) QRSRLSRQRWWR (SEC ID Nº 59)

y-Her.C2.P4.2-1

YSANT (SEC ID Nº 39) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-3

YASNT (SEC ID Nº 40) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-4

YSDGD (SEC ID Nº 41) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-5

YSGGS (SEC ID Nº 42) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-6

YGRDS (SEC ID Nº 43) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-8

YAGGT (SEC ID Nº 44) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-10

YSSDS (SEC ID Nº 45) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-12

YHSGS (SEC ID Nº 46) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-15

YLTNS (SEC ID Nº 47) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-18

YGSEE (SEC ID Nº 48) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-19

YRSGE (SEC ID Nº 49) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-20

YGTDD (SEC ID Nº 50) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

y-Her.C2.P4.2-9

YLHGD (SEC ID Nº 161) ARYSPRMLRWAH (SEC ID Nº 60)

HAF1311A1

YLHGD (SEC ID Nº 161) VSRYSMTMWRWAH (SEC ID Nº 61)

HAF1311A10

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRYSRSMMRWAH (SEC ID Nº 62)

HAF1311A11

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRYSQMMWRWAH (SEC ID Nº 63)

HAF1311A12

YLHGD (SEC ID Nº 161) ITRYSRQMLRWAH (SEC ID Nº 64)

HAF1311A2

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRYSALMWRWAH (SEC ID Nº 65)

HAF1311A3

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSEAMWKWGH (SEC ID Nº 66)

HAF1311A4

YLHGD (SEC ID Nº 161) VGRYSQRMWRWAH (SEC ID Nº 67)

HAF1311A5

YLHGD (SEC ID Nº 161) IRSSVGSRRWWS (SEC ID Nº 51)

HAF1311A6

YLHGD (SEC ID Nº 161) VGRHSPTMWKWAH (SEC ID Nº 69)

HAF1311A7

YLHGD (SEC ID Nº 161) LGRWSPKMWRWAH (SEC ID Nº 70)

HAF1311A8

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARWSPSMMRWAH (SEC ID Nº 71)

HAF1311A9

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARNSPSMWRWAH (SEC ID Nº 83)

HAF1311B1

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARWSPSMVRWAH (SEC ID Nº 84)

HAF1311B10

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARKNHRKWRRTH (SEC ID Nº 85)

HAF1311B11

YLHGD (SEC ID Nº 161) VSRYSPTMWQWAH (SEC ID Nº 86)

HAF1311B12

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSLSMWRWAH (SEC ID Nº 87)

HAF1311 B2

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSQTMWRWAH (SEC ID Nº 88)

HAF1311 B3

YLHGD (SEC ID Nº 161) MPRFSPSMWRWAH (SEC ID Nº 89)

HAF1311B4

YLHGD (SEC ID Nº 161) VTRYSQSMWRWAH (SEC ID Nº 90)

HAF1311B5

YLHGD (SEC ID Nº 161) IERYSTRMWSWAH (SEC ID Nº 91)

HAF1311B6

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSPEMWHWAH (SEC ID Nº 92)

HAF1311B7

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARGSPSMWSWGH (SEC ID Nº 93)

HAF1311B8

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSQTMWHWAH (SEC ID Nº 94)

HAF1311B9

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARYSPGMWRWAH (SEC ID Nº 95)

HAF1311C1

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRFSPTMWKWAH (SEC ID Nº 96)

HAF1311C10

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRWSRTMLRWAH (SEC ID Nº 97)

E09737920

06-08-2014 E09737920

HAF1311C11

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRYSPRMWRWAH (SEC ID Nº 98)

HAF1311C2

YLHGD (SEC ID Nº 161) IARHSKSMWSWAH (SEC ID Nº 99)

HAF13112C3

YLHGD (SEC ID Nº 161) MPRWSKSLSGWAH (SEC ID Nº 100)

HAF1311C5

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYTPSMWRWAH (SEC ID Nº 101)

HAF1311C7

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARNSLTMWRWAH (SEC ID Nº 102)

HAF1311C8

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSPSMWKWAH (SEC ID Nº 103)

HAF1311C9

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARFSPSMWRWAH (SEC ID Nº 104)

HAF1311D2

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARWSPSLSRWAH (SEC ID Nº 105)

HAF1311D3

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSPSMWRWAH (SEC ID Nº 106)

HAF1311D4

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRSSLTMWKWAH (SEC ID Nº 107)

HAF1311D5

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRHSTRMWKWAH (SEC ID Nº 108)

HAF1311D6

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRHSRRMWRWAH (SEC ID Nº 109)

HAF1311D7

YLHGD (SEC ID Nº 161) VTRYSPSMWRWAH (SEC ID Nº 110)

HAF1311E10

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRHSRRMWRWAH (SEC ID Nº 109)

HAF1311 E2

YLHGD (SEC ID Nº 161) MPRWSKSLSGWAH (SEC ID Nº 100)

HAF1311 E3

YLHGD (SEC ID Nº 161) VTRHSSSMWRWAH (SEC ID Nº 111)

HAF1311 E4

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSRSMKKWAH (SEC ID Nº 112)

HAF1311 E5

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARGSTTMWRWGH (SEC ID Nº 113)

HAF1311E6

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARSSPEMWRWAH (SEC ID Nº 114)

HAF1311E7

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSTGMWNWAH (SEC ID Nº 115)

HAF1311 E8

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRYSQRMWRWAH (SEC ID Nº 116)

HAF1311 E9

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRNSPRMWRWAH (SEC ID Nº 117)

HAF1312F1

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARWSPSMSRWAH (SEC ID Nº 118)

HAF1312G12

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARWSPSMKSWAH (SEC ID Nº 119)

HAF1312F11

YLHGD (SEC ID Nº 161) LPRYSTKMKRWAH (SEC ID Nº 120)

HAF1312F7

YLHGD (SEC ID Nº 161) IRSSVGSRRWWS (SEC ID Nº 51)

HAF1312F3

YLHGD (SEC ID Nº 161) IPRWSQQMSRWAH (SEC ID Nº 122)

HAF1312F5

YLHGD (SEC ID Nº 161) VGRWTPSMWRWAH (SEC ID Nº 123)

HAF1312G10

YLHGD (SEC ID Nº 161) VKRSSPSMWRWAH (SEC ID Nº 124)

HAF1312G2

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARFSPSMWRWAH (SEC ID Nº 104)

HAF1312G1

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARYSPGMWNWAH (SEC ID Nº 125)

HAF1312G9

YLHGD (SEC ID Nº 161) IARYSPNMWNWAH (SEC ID Nº 126)

HAF1312G8

YLHGD (SEC ID Nº 161) IARYSPSMWRWAH (SEC ID Nº 127)

HAF1312F12

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARFSPSMLKWAH (SEC ID Nº 128)

HAF1312F2

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSKSMLKWAH (SEC ID Nº 129)

HAF1312F10

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSRTMWRWGH (SEC ID Nº 130)

HAF1312G7

YLHGD (SEC ID Nº 161) IARHSREMLRWAH (SEC ID Nº 131)

HAF1312F8

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSSTMSRWAH (SEC ID Nº 132)

HAF1321A1

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRYSQRMWRWAH (SEC ID Nº 116)

HAF1321B11

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRYSQMMWRWAH (SEC ID Nº 63)

HAF1321A2

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRYSPRMWRWAH (SEC ID Nº 98)

HAF1321A10

YLHGD (SEC ID Nº 161) IPRWSQQMSRWAH (SEC ID Nº 122)

HAF1321A4

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRHSLKKLQRKH (SEC ID Nº 133)

HAF1321 B10

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSLSMWRWAH (SEC ID Nº 87)

HAF1321A5

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSPSMWNWAH (SEC ID Nº 134)

HAF1321B1

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSPTMWKWAH (SEC ID Nº 148)

HAF1321A11

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARFSPSMWRWAH (SEC ID Nº 104)

HAF1321B5

YLHGD (SEC ID Nº 161) VSRFSPSMWRWAH (SEC ID Nº 149)

HAF1321B2

YLHGD (SEC ID Nº 161) VGRWTPSMWRWAH (SEC ID Nº 123)

HAF1321B6

YLHGD (SEC ID Nº 161) IARYSPSMWRWAH (SEC ID Nº 127)

HAF1321B7

YLHGD (SEC ID Nº 161) IARYSPSMWRWAH (SEC ID Nº 127)

HAF1321B9

YLHGD (SEC ID Nº 161) IPRYTPSMWRWAH (SEC ID Nº 150)

HAF1322C10

YLHGD (SEC ID Nº 161) IPRWSQQMSRWAH (SEC ID Nº 122)

06-08-2014

HAF1322C11

YLHGD (SEC ID Nº 161) VPRYSTLMWRWAH (SEC ID Nº 151)

HAF1322C7

YLHGD (SEC ID Nº 161) LPRHSRRMWRWAH (SEC ID Nº 152)

HAF1322C6

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARWSPSMLRWAH (SEC ID Nº 153)

HAF1322C3

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSLSMWRWAH (SEC ID Nº 87)

HAF1322C4

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSPAMWRWAH (SEC ID Nº 154)

HAF1322C8

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARSSPSMWRWAH (SEC ID Nº 147)

H10-03-6

YLYGD (SEC ID Nº 162) VPRHSARMWRWAH (SEC ID Nº 155)

H10-03-6R

YLYGD (SEC ID Nº 162) VPRHSARMWRWAH (SEC ID Nº 155)

H10-03-6Y

YLYGD (SEC ID Nº 162) VPRYSARMWRWAH (SEC ID Nº 156)

ABEFs0101

YLSAD (SEC ID Nº 163) VARYSPSMWRWGH (SEC ID Nº 135)

ABS0101G

YLSAD (SEC ID Nº 163) VARYSPSMWRWAH (SEC ID Nº 106)

ABS0101P

YLSAD (SEC ID Nº 163) VPRYSASMWRWGH (SEC ID Nº 136)

ABS0101PG

YLSAD (SEC ID Nº 163) VPRYSASMWRWAH (SEC ID Nº 137)

EF3-1

YLHGD (SEC ID Nº 161) LPRYSPGMWRWAH (SEC ID Nº 138)

EF3-2

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSPSMWNWAH (SEC ID Nº 134)

EF3-3

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSPSMWRWGH (SEC ID Nº 135)

EF3-4

YLHGD (SEC ID Nº 161) IPRWSQQMSRWAH (SEC ID Nº 122)

EF3-6

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSQTMSRWAH (SEC ID Nº 139)

EF3-7

YLHGD (SEC ID Nº 161) IARYSPSMWRWAH (SEC ID Nº 127)

EF3-8

YLHGD (SEC ID Nº 161) VAGYRPRRSGSSH (SEC ID Nº 140)

EF3-9

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARHSANMLRWAH (SEC ID Nº 141)

EF3-13

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSPSMWSWAH (SEC ID Nº 142)

EF3-14

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYTPSMWRWAH (SEC ID Nº 101)

EF3-15

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARWSPSMFRWAH (SEC ID Nº 143)

EF3-16

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARWSPSMKSWAH (SEC ID Nº 119)

EF3-17

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARHSRTMWRWGH (SEC ID Nº 130)

EF3-18

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARWSPSMSRWAH (SEC ID Nº 118)

EF3-20

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARWSPSMLRWAH (SEC ID Nº 144)

EF10-01

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARSSPTMWRWAH (SEC ID Nº 145)

EF10-02

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSPSMWRWAH (SEC ID Nº 106)

E-F10-03

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARWSPSMMRWAH (SEC ID Nº 71)

EF10-04

YLHGD (SEC ID Nº 161) VTRWSPTMWRWAH (SEC ID Nº 146)

EF10-07

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARNSPSMWRWAH (SEC ID Nº 83)

EF10-08

YLHGD (SEC ID Nº 161) LARWSPSLSRWAH (SEC ID Nº 105)

EF10-09

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARSSPSMWRWAH (SEC ID Nº 147)

EF10-10

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSPRMWRWAH (SEC ID Nº 157)

EF10-13

YLHGD (SEC ID Nº 161) VARYSRKMSSWGH (SEC ID Nº 158)

EF10-14

YLHGD (SEC ID Nº 161) LASYSPSMWRWGH (SEC ID Nº 159)

EF10-15

YLHGD (SEC ID Nº 161) IRSSVGSRRWWS (SEC ID Nº 51)

Tabla 5: Secuencias de clones de levaduras de unión a Her2 seleccionados de bibliotecas iniciales, tras la expansión del conjunto y tras la maduración de la afinidad: con referencia a la numeración de la SEC ID Nº 1 (Figura 3)

Nombre del clon

Bucle AB AA143ff Bucle CD AA169ff Bucle EF AA198ff

H542-M3C8

LSLPC (SEC ID Nº 164) ISGPE (SEC ID Nº 240) PQTPPSQ (SEC ID Nº 340)

H541-M2D7

REGGR (SEC ID Nº 165) NGQPE (SEC ID Nº 241) DKPFWGTSRWSR (SEC ID Nº 55)

H541-M2E11

LTKNQ (SEC ID Nº 166) DGRPE (SEC ID Nº 242) DKPFWGTSRWSR (SEC ID Nº 55)

H541-M2D12

TKAFY (SEC ID Nº 167) NGQPE (SEC ID Nº 241) PPSPPRT (SEC ID Nº 341)

H541-M2H10

TKGL_ (SEC ID Nº 172) NGQPE (SEC ID Nº 241) PPSPPRT (SEC ID Nº 341)

H541-M2H8

TKAFY (SEC ID Nº 167) NGQPE (SEC ID Nº 241) PPSPPRT (SEC ID Nº 341)

H542-M3A10

WWLFG (SEC ID Nº 168) NGQPE (SEC ID Nº 241) PWVRWMQ (SEC ID Nº 342)

H542-M3F10

I KKKK (SEC ID Nº 169) NGQPE (SEC ID Nº 241) SRARWRH (SEC ID Nº 343)

H542-M3D5

KWNKK (SEC ID Nº 170) NGQPE (SEC ID Nº 241) SRSRWRG (SEC ID Nº 344)

E09737920

06-08-2014 E09737920

H542-M4A4

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PRWKM (SEC ID Nº 345)

H542-M3G11

YKTKD (SEQ ID No-173) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRYNPRMVRWAH (SEC ID Nº 346)

H542-M3D9

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PQSRWYN (SEC ID Nº 347)

H542-M3F7

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PWSRWRL (SEC ID Nº 348)

H542-M4B12

RKEKK (SEC ID Nº 174) NGQPE (SEC ID Nº 241) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H542-M3D11

WWVGG (SEC ID Nº 175) DAGPE (SEC ID Nº 243) PWVRWMQ (SEC ID Nº 342)

H542-M3A4

WWRGG (SEC ID Nº 176) NGQPE (SEC ID Nº 241) PWVRWLQ (SEC ID Nº 350)

H542-M3B8

WWRGG (SEC ID Nº 176) NGQPE (SEC ID Nº 241) PWVRWMQ (SEC ID Nº 342)

H542-M3C4

YGHKY (SEC ID Nº 177) NKQNH (SEC ID Nº 244) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H542-M4D4

TKKET (SEC ID Nº 178) NGQPE (SEC ID Nº 241) ELEGEEQ (SEC ID Nº 351)

H542-M3A7

TGGNK (SEC ID Nº 179) NMGPE (SEC ID Nº 245) NRSRWQQ (SEC ID Nº 352)

H542-M3C12

LTKNQ (SEC ID Nº 166) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKLKQ (SEC ID Nº 353)

H542-M3E10

LTKNQ (SEC ID Nº 166) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKQLKK (SEC ID Nº 354)

H542-M3E6

LDGDQ (SEC ID Nº 180) NGQPE (SEC ID Nº 241) QQKKRKKKK (SEC ID Nº 355)

H542-M4E9

FIPHN (SEC ID Nº 181) DCGPE (SEC ID Nº 246) PPPLCAP (SEC ID Nº 356)

H542-M4D8

KKKGK (SEC ID Nº 182) NGQPE (SEC ID Nº 241) SLNRWKR (SEC ID Nº 357)

H542-M4H8

KKKGK (SEC ID Nº 182) NGQPE (SEC ID Nº 241) SLNRWKR (SEC ID Nº 357)

H542-M4B11

LTKNQ (SEC ID Nº 166) NGQPE (SEC ID Nº 241) KNKKKRK (SEC ID Nº 358)

H542-M4C10

LTKNQ (SEC ID Nº 166) MDGPE (SEC ID Nº 247) KKKKIKK (SEC ID Nº 359)

H542-M4F11

LTKNQ (SEC ID Nº 166) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKMKK (SEC ID Nº 360)

H542-M4C8

LTKNQ (SEC ID Nº 166) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H542-M4G2

KNKKK (SEC ID Nº 183) NGQPE (SEC ID Nº 241) REREWRK (SEC ID Nº 362)

H542-M4C7

TKKET (SEC ID Nº 178) NGQPE (SEC ID Nº 241) ELEGEEQ (SEQ ID No-351)

H561G3M1B8

KKKNN (SEC ID Nº 184) YPEKH (SEC ID Nº 248) DKSRWQQ (SEC ID Nº 363)

H542-M4D10

TKKET (SEC ID Nº 178) NGQPE (SEC ID Nº 241) ELEGEEQ (SEC ID Nº 351)

H542-M4B3

KKKKR (SEC ID Nº 185) NGQPE (SEC ID Nº 241) PLRLPPM (SEC ID Nº 364)

H542-M4A6

YGHKY (SEC ID Nº 177) NKQNH (SEC ID Nº 244) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H561G3M1C6

LKKKT (SEC ID Nº 186) NGQPE (SEC ID Nº 241) PRSNWYGNRWRR (SEC ID Nº 365)

H542-M4C1

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PQSRWYN (SEC ID Nº 347)

H542-M4F4

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PWSRWRL (SEC ID Nº 348)

H561G3M1E1

TKGRW (SEC ID Nº 187) NGAPQ (SEC ID Nº 249) SRARWRH (SEC ID Nº 343)

H542-M4F6

LSLPC (SEC ID Nº 164) ISGPE (SEC ID Nº 240) PQTPPSQ (SEC ID Nº 340)

H561G3M1A1

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) TPGNLAL (SEC ID Nº 366)

H561G3M1A10

KKKNK (SEC ID Nº 188) NGQPE (SEC ID Nº 241) SREDFRA (SEC ID Nº 367)

H561G3M1A9

KHAET (SEC ID Nº 189) NGQPE (SEC ID Nº 241) LVSISVG (SEC ID Nº 368)

H561G3M1B10

-KKKK (SEC ID Nº 190) DYGPM (SEC ID Nº 250) PSRRWRE (SEC ID Nº 369)

H561G3M1G4

FFTYW (SEC ID Nº 191) NGQPE (SEC ID Nº 241) DRRRWTA (SEC ID Nº 370)

H561G3M1B9

EGKRK (SEC ID Nº 192) NGQPE (SEC ID Nº 241) SRARWRH (SEC ID Nº 343)

H561G3M1C1

RHGGW (SEC ID Nº 193) NGQPE (SEC ID Nº 241) DLQDKKY (SEC ID Nº 371)

H561G3M1C2

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) ISVPPDE (SEC ID Nº 372)

H561G3M1H8

-KSGY (SEC ID Nº 194) RKKKE (SEC ID Nº 251) SRARWRH (SEC ID Nº 343)

H561G3M1C8

AKEGG (SEC ID Nº 195) NGQPE (SEC ID Nº 241) TGPDITV (SEC ID Nº 373)

H561G3M1D1

KYWMA (SEC ID Nº 196) NGQPE (SEC ID Nº 241) IVLSGFR (SEC ID Nº 374)

H561G3M1D5

KKKNK (SEC ID Nº 188) DAGPE (SEC ID Nº 243) MGIHNIN (SEC ID Nº 375)

H564G11M2F4

LTKNQ (SEC ID Nº 166) NGQPE (SEC ID Nº 241) MKQDEMA (SEC ID Nº 376)

H561G3M1E2

FFTYW (SEC ID Nº 191) NGQPE (SEC ID Nº 241) DRRRWTA (SEC ID Nº 370)

H561G3M1E6

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PQWRLQW (SEC ID Nº 377)

H561G3M1E7

KKKNK (SEC ID Nº 188) NGQPE (SEC ID Nº 241) HRRLVAR (SEC ID Nº 378)

H561G3M1F10

QLRNK (SEC ID Nº 197) NGQPE (SEC ID Nº 241) KQNLRRK (SEC ID Nº 379)

H561G3M1F2

QRGRM (SEC ID Nº 198) KGGRE (SEC ID Nº 252) SRARWRH (SEC ID Nº 343)

H561G3M1G1

QRGRM (SEC ID Nº 198) KGGRE (SEC ID Nº 252) S RARWRH (SEC ID Nº 343)

06-08-2014 E09737920

H564G11M2F12

KNHNT (SEC ID Nº 199) NGQPE (SEC ID Nº 241) SRSRLHGNRWRR (SEC ID Nº 380)

H561G3M1H3

KKKKK (SEC ID Nº 171) GNWQP (SEC ID Nº 253) NRERWRR (SEC ID Nº 381)

H561G3M1H7

MSENE (SEC ID Nº 200) NGQPE (SEC ID Nº 241) TWVRWMQ (SEC ID Nº 382)

H564G11M2G2

KKKNK (SEC ID Nº 188) TTGPY (SEC ID Nº 254) PWSRWRL (SEC ID Nº 348)

H564G11M2A10

KKKNK (SEC ID Nº 188) NGQPE (SEC ID Nº 241) PHWQWKW (SEC ID Nº 383)

H564G11M2A4

YGHKY (SEC ID Nº 177) DMNQP (SEC ID Nº 255) SKKKLRK (SEC ID Nº 384)

H564G11M2A5

YGHKY (SEC ID Nº 177) KWPMF (SEC ID Nº 256) PWKRLRK (SEC ID Nº 385)

H564G11M2A9

WWMDY (SEC ID Nº 201) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H564G11M2B1

YGHKY (SEC ID Nº 177) HDQRH (SEC ID Nº 257) TQKRWRS (SEC ID Nº 386)

H564G11M2B12

MKKNK (SEC ID Nº 202) LGMYM (SEC ID Nº 258) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H564G11M2B3

YGHKY (SEC ID Nº 177) N KM FT (SEC ID Nº 259) NRKHLRA (SEC ID Nº 387)

H564G11M2B4

EYFRH (SEC ID Nº 203) NGQPE (SEC ID Nº 241) TRRRWTR (SEC ID Nº 388)

H564G11M2B5

KKKNK (SEC ID Nº 188) NGQPE (SEC ID Nº 241) DHRRINR (SEC ID Nº 389)

H564G11M2B7

FDMRD (SEC ID Nº 204) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H564G11M2C1

MKKPY (SEC ID Nº 205) LGYPE (SEC ID Nº 260) KKKKYHK (SEC ID Nº 390)

H564G11M2C11

KKKNN (SEC ID Nº 184) HGYQL (SEC ID Nº 261) PWVRWMQ (SEC ID Nº 342)

H564G11M2C3

YGHKY (SEC ID Nº 177) NVFIE (SEC ID Nº 262) QKKKLKK (SEC ID Nº 391)

H564G11M2C7

FEMPY (SEC ID Nº 206) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H564G11M2C9

YGHKY (SEC ID Nº 177) NRGWH (SEC ID Nº 263) PQKKLRK (SEC ID Nº 392)

H564G11M2D1

KKKNH (SEC ID Nº 207) PFTLK (SEC ID Nº 264) DKRGIRK (SEC ID Nº 393)

H564G11M2D10

FFTYW (SEC ID Nº 191) NGQPE (SEC ID Nº 241) DRRRWTA (SEC ID Nº 370)

H564G11M2D4

-KKKK (SEC ID Nº 190) DYGPM (SEC ID Nº 250) PSRRWRE (SEC ID Nº 369)

H564G11M2D9

YGHKY (SEC ID Nº 177) STTRV (SEC ID Nº 265) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H564G11M2E10

KKKNH (SEC ID Nº 207) WDQHQ (SEC ID Nº 266) EKKRWKE (SEC ID Nº 394)

H564G11M2E11

-KKKK (SEC ID Nº 190) DYGPM (SEC ID Nº 250) TSRRWRE (SEC ID Nº 395)

H564G11M2E3

YGHKY (SEC ID Nº 177) SGWMM (SEC ID Nº 267) KKEKLRK (SEC ID Nº 396)

H564G11M2E8

YGHKY (SEC ID Nº 177) WRKMT (SEC ID Nº 268) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H564G11M2H10

YGHKY (SEC ID Nº 177) FPKKY (SEC ID Nº 269) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H564G11M2F2

MWEPS (SEC ID Nº 208) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKLKK (SEC ID Nº 397)

H564G11M2F5

LRGST (SEC ID Nº 209) SPYFV (SEC ID Nº 270) KKKKIMK (SEC ID Nº 398)

H564G11M2F6

KKKKK (SEC ID Nº 171) I RGTS (SEC ID Nº 271) DQTRWRR (SEC ID Nº 399)

H564G11M2F7

DSYMI (SEC ID Nº 210) NGQPE (SEC ID Nº 241) TWVRWMQ (SEC ID Nº 382)

H564G11M2F9

YGHKY (SEC ID Nº 177) QVPGW (SEC ID Nº 272) KKKEIKK (SEC ID Nº 400)

H564G11M2G4

YGHKY (SEC ID Nº 177) DLPYQ (SEC ID Nº 273) KKNKLKK (SEC ID Nº 401)

H564G11M2G6

YGHKY (SEC ID Nº 177) PRSHW (SEC ID Nº 274) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H564G11M2G7

KKKNK (SEC ID Nº 188) LYGHA (SEC ID Nº 275) NRERWRR (SEC ID Nº 381)

H564G11M2G9

KKKNK (SEC ID Nº 188) NGQPE (SEC ID Nº 241) PWWQFRQ (SEC ID Nº 402)

H564G11M2H2

YGHKY (SEC ID Nº 177) APYVH (SEC ID Nº 276) KKKEIKK (SEC ID Nº 400)

H564G11M2H3

MEQHS (SEC ID Nº 211) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H564G11M2H4

YGHKY (SEC ID Nº 177) RTGQK (SEC ID Nº 277) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H564G11M2H8

YGHKY (SEC ID Nº 177) PTYWY (SEC ID Nº 278) NRKHLRA (SEC ID Nº 387)

H564G11M2H9

KKKKH (SEC ID Nº 212) EGMEI (SEC ID Nº 279) PSRRWRE (SEC ID Nº 369)

H565_G12C1

LKKKT (SEC ID Nº 186) NGQPE (SEC ID Nº 241) PRSNWYGNRWRR (SEC ID Nº 365)

H565_G12D5

KKKKK (SEC ID Nº 171) PVVGA (SEC ID Nº 280) DQSKLSSLRWKK (SEC ID Nº 403)

H565_G12E4

KKKKK (SEC ID Nº 171) PLMVD (SEC ID Nº 281) DQSKLSSLRWKK (SEC ID Nº 403)

H565_G12A1

KKKNH (SEC ID Nº 207) KYGSQ (SEC ID Nº 282) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12C4

KKKNH (SEC ID Nº 207) RWNNQ (SEC ID Nº 283) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12F1

KKKNH (SEC ID Nº 207) VYKQD (SEC ID Nº 284) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12A10

KKKNH (SEC ID Nº 207) NQMKF (SEC ID Nº 285) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12A8

KKKNH (SEC ID Nº 207) NHQHT (SEC ID Nº 286) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

06-08-2014 E09737920

H565_G12A4

KKKNH (SEC ID Nº 207) KRFVD (SEC ID Nº 287) PNEKLKK (SEC ID Nº 404)

H565_G12B2

KKKNH (SEC ID Nº 207) HHEPL (SEC ID Nº 288) PLSRWKR (SEC ID Nº 405)

H565_G12F4

KKKNH (SEC ID Nº 207) PKMPY (SEC ID Nº 289) NRKHLRA (SEC ID Nº 387)

H565_G12H5

KKKNH (SEC ID Nº 207) PKDHE (SEC ID Nº 290) ARSRWRK (SEC ID Nº 408)

H565_G12G6

LTKNQ (SEC ID Nº 166) AKGSI (SEC ID Nº 291) PKKRLRR (SEC ID Nº 409)

H565_G12A5

YGHKY (SEC ID Nº 177) EDPEM (SEC ID Nº 292) KNKKRKK (SEC ID Nº 410)

H565_G12E9

YGHKY (SEC ID Nº 177) EFDHQ (SEC ID Nº 293) KNKKRKK (SEC ID Nº 410)

H565_G12F8

YGHKY (SEC ID Nº 177) NEKQD (SEC ID Nº 294) NTKKLKK (SEC ID Nº 411)

H565_G12D2

YGHKY (SEC ID Nº 177) APHYY (SEC ID Nº 295) NRKRIRK (SEC ID Nº 412)

H565_G12F7

YGHKY (SEC ID Nº 177) PQLHL (SEC ID Nº 296) SRKRFRS (SEC ID Nº 413)

H565_G12G2

YGHKY (SEC ID Nº 177) NWRAE (SEC ID Nº 297) ARSRWRK (SEC ID Nº 408)

H565_G12H11

YGHKY (SEC ID Nº 177) NNQYK (SEC ID Nº 298) PFRRWVK (SEC ID Nº 414)

H565_G12A7

YGHKY (SEC ID Nº 177) -RSIH (SEC ID Nº 299) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12A9

YGHKY (SEC ID Nº 177) RDRIM (SEC ID Nº 300) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12B3

YGHKY (SEC ID Nº 177) YGKGH (SEC ID Nº 301) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12B5

YGHKY (SEC ID Nº 177) GKGGK (SEC ID Nº 302) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12E3

YGHKY (SEC ID Nº 177) RHIGK (SEC ID Nº 303) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12E12

YGHKY (SEC ID Nº 177) QYTYH (SEC ID Nº 304) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12B1

YGHKY (SEC ID Nº 177) LHSHV (SEC ID Nº 305) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12B11

YGHKY (SEC ID Nº 177) STTRV (SEC ID Nº 265) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12D1

YGHKY (SEC ID Nº 177) ARDKR (SEC ID Nº 306) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12E2

YGHKY (SEC ID Nº 177) EHKKT (SEC ID Nº 307) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12C5

KKKKK (SEC ID Nº 171) MDEVP (SEC ID Nº 308) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12C7

-KKKK (SEC ID Nº 190) QDWQR (SEC ID Nº 309) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12G1

-KKKK (SEC ID Nº 190) PSDRE (SEC ID Nº 310) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12G8

NKKKK (SEC ID Nº 213) QNTRW (SEC ID Nº 311) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12C9

-KKKK (SEC ID Nº 190) DEGLH (SEC ID Nº 312) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H565_G12A11

IMNDW (SEC ID Nº 214) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H565_G12D10

WTNGD (SEC ID Nº 215) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H565_G12F6

WWHDM (SEC ID Nº 216) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H565_G12B4

WENPH (SEC ID Nº 217) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H565_G12H2

LYHEH (SEC ID Nº 218) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H565_G12H8

GGDQH (SEC ID Nº 219) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H565_G12C12

IYVPY (SEC ID Nº 220) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H565_G12G10

FEMPY (SEC ID Nº 206) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H565_G12C2

VVTSQ (SEC ID Nº 221) NGQPE (SEC ID Nº 241) KRKKLKK (SEC ID Nº 361)

H565_G12B6

WWNSK (SEC ID Nº 222) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKQLKK (SEC ID Nº 354)

H565_G12A12

MTGPG (SEC ID Nº 223) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKIKK (SEC ID Nº 359)

H565_G12D7

MWEPS (SEC ID Nº 208) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKLKK (SEC ID Nº 397)

H565_G12F3

DTYHD (SEC ID Nº 224) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKLKK (SEC ID Nº 397)

H565_G12F5

QDEKT (SEC ID Nº 225) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKIKK (SEC ID Nº 359)

H565_G12B12

GDHRI (SEC ID Nº 226) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKLKQ (SEC ID Nº 353)

H565_G12D8

RNSNS (SEC ID Nº 227) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKLKQ (SEC ID Nº 353)

H565_G12D9

RENTM (SEC ID Nº 228) NGQPE (SEC ID Nº 241) NKKKKKK (SEC ID Nº 415)

H565_G12H9

VNDKM (SEC ID Nº 229) NGQPE (SEC ID Nº 241) SKKKLRK (SEC ID Nº 384)

H565_G12E1

RKKDE (SEC ID Nº 230) WPNME (SEC ID Nº 313) KKKKLKK (SEC ID Nº 397)

H565_G12E8

SNSGY (SEC ID Nº 231) MDGPE (SEC ID Nº 247) KKKKIKK (SEC ID Nº 359)

H565_G12G7

FEYRH (SEC ID Nº 232) NGQPE (SEC ID Nº 241) PKKRLRR (SEC ID Nº 409)

H565_G12E5

QRGRM (SEC ID Nº 198) KGGRE (SEC ID Nº 252) SRARWRH (SEC ID Nº 343)

H565_G12A2

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) NGKRLHS (SEC ID Nº 416)

H565_G12C8

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PKWLWHQ (SEC ID Nº 417)

H565_G12E7

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PWWKHHV (SEC ID Nº 418)

H565_G12F12

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PNWKYQW (SEC ID Nº 419)

06-08-2014

H565_G12F10

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) PQRKVAP (SEC ID Nº 420)

H565_G12G9

RKKKK (SEC ID Nº 233) NGQPE (SEC ID Nº 241) PWYKVLM (SEC ID Nº 421)

H565_G12H10

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) DRKWWTF (SEC ID Nº 422)

H565_G12A3

KKKKK (SEC ID Nº 171) MTGRV (SEC ID Nº 314) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H565_G12B8

KKKKK (SEC ID Nº 171) GKYNI (SEC ID Nº 315) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H565_G12H4

KKKKK (SEC ID Nº 171) NAYLL (SEC ID Nº 316) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H565_G12C10

KKKKK (SEC ID Nº 171) NGQPE (SEC ID Nº 241) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H565_G12C6

KKKKK (SEC ID Nº 171) AQYNV (SEC ID Nº 317) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H565_G12G11

KKKKK (SEC ID Nº 171) LYGHA (SEC ID Nº 275) NRERWRR (SEC ID Nº 381)

H565_G12G5

KKKKK (SEC ID Nº 171) LYGHA (SEC ID Nº 275) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H565_G12A6

KKKKK (SEC ID Nº 171) NQVMT (SEC ID Nº 318) PSRRWRE (SEC ID Nº 369)

H565_G12E6

KKKKK (SEC ID Nº 171) VVHDT (SEC ID Nº 319) PRHEWVM (SEC ID Nº 423)

H565_G12B10

KKKKK (SEC ID Nº 171) NIWHQ (SEC ID Nº 320) DKSRWQQ (SEC ID Nº 363)

H565_G12H6

KKKKK (SEC ID Nº 171) QWGNM (SEC ID Nº 321) DKSRWQQ (SEC ID Nº 363)

H565_G12D12

KKKKK (SEC ID Nº 171) MHVKS (SEC ID Nº 322) PWSRWMQ (SEC ID Nº 424)

H565_G12B9

-KKKK (SEC ID Nº 190) EYTVV (SEC ID Nº 323) PLSRWKR (SEC ID Nº 405)

H565_G12E11

-KKKK (SEC ID Nº 190) GPYQD (SEC ID Nº 324) PLSRWKR (SEC ID Nº 405)

H565_G12F9

KKKKK (SEC ID Nº 171) QGVLE (SEC ID Nº 325) TQNQIKK (SEC ID Nº 406)

H571A1

KKKKK (SEC ID Nº 171) LYGHA (SEC ID Nº 275) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H571C10

KKKKK (SEC ID Nº 171) QQPGV (SEC ID Nº 326) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H571E6

KKKKK (SEC ID Nº 171) NQVRG (SEC ID Nº 327) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H571D10

KKKKK (SEC ID Nº 171) VPHVL (SEC ID Nº 328) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H571 D4

KKKKK (SEC ID Nº 171) DGRKQ (SEC ID Nº 329) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H571C3

KKKKK (SEC ID Nº 171) NASFE (SEC ID Nº 330) DRERWRR (SEC ID Nº 407)

H571A3

LTKNQ (SEC ID Nº 166) KKRVV (SEC ID Nº 331) SRARWLH (SEC ID Nº 425)

H571D7

YGHKY (SEC ID Nº 177) KGIKK (SEC ID Nº 332) SRARWLH (SEC ID Nº 425)

H571B1

QRGRM (SEC ID Nº 198) KGGRE (SEC ID Nº 252) SRARWLH (SEC ID Nº 425)

H571B9

TKGRW (SEC ID Nº 187) NGAPQ (SEC ID Nº 249) SRARWLH (SEC ID Nº 425)

H571E5

EGKRK (SEC ID Nº 192) NGQPE (SEC ID Nº 241) SRARWLH (SEC ID Nº 425)

H571A5

YGHKY (SEC ID Nº 177) YRRGD (SEC ID Nº 33) PKKRLRR (SEC ID Nº 409)

H571A9

YGHKY (SEC ID Nº 177) PMGKY (SEC ID Nº 334) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H571C9

YGHKY (SEC ID Nº 177) FPKKY (SEC ID Nº 269) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H571B3

YGHKY (SEC ID Nº 177) RHIGK (SEC ID Nº 303) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H571D9

YGNSY (SEC ID Nº 234) RGIAK (SEC ID Nº 335) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H571C2

KKKNK (SEC ID Nº 188) LWGGM (SEC ID Nº 336) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H571C5

KKKNH (SEC ID Nº 207) NAHYI (SEC ID Nº 337) PQKRWRS (SEC ID Nº 349)

H571B11

RNRKK (SEC ID Nº 235) SGTRL (SEC ID Nº 338) PSRRWRE (SEC ID Nº 369)

H571A6

WDHGS (SEC ID Nº 236) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKIKK (SEC ID Nº 359)

H571F3

FAKRT (SEC ID Nº 237) NGQPE (SEC ID Nº 241) KKKKLKQ (SEC ID Nº 353)

H571E12

SMDKV (SEC ID Nº 238) YRRGD (SEC ID Nº 33) DKSRWQQ (SEC ID Nº 363)

H571A7

FFTYW (SEC ID Nº 191) NGQPE (SEC ID Nº 241) DRRRWTA (SEC ID Nº 370)

H571D12

EYFRH (SEC ID Nº 203) NGQPE (SEC ID Nº 241) TRRRWTR (SEC ID Nº 388)

H571D6

RHQDR (SEC ID Nº 239) NGQPE (SEC ID Nº 241) NRSRLHGNRWRR (SEC ID Nº 426)

H571A2

LKKKT (SEC ID Nº 186) NGQPE (SEC ID Nº 241) PRSNWYGNRWRR (SEC ID Nº 365)

Expresión y purificación de clones específicos de antígeno en células de mamíferos:

Clones seleccionados como se ha descrito en lo que antecede con características como se ha descrito en lo que antecede se clonan en un vector de expresión en mamíferos tales como pCEP4 (Invitrogen). ADN plasmídico altamente purificado (Qiagen) se usó para transfectar transitoriamente células libres HEK293 con reactivo Freestyle™ MAX según las recomendaciones del fabricante (Invitrogen). El día 5 después de la transfección, los sobrenadantes se limpian de residuos celulares mediante centrifugación y filtración a través de un filtro de 0,2uM Stericup (Millipore). Como alternativa, las células libres HEK293 o células CHO con plásmidos de expresión que contienen genes para la

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resistencia a antibióticos, tales como neomicina o puromicina. Las células transfectadas se cultivan en presencia de los antibióticos dando lugar a una supervivencia específica de clones de células que expresan de forma estable el gen de resistencia a antibióticos junto con el fragmento Fc específico de antígeno. Estos transfectantes estables segregan constantemente la proteína de interés durante períodos de tiempo largos. Los Fcab específicas de antígeno se purificaron a partir de los sobrenadantes celulares mediante cromatografía de inmunoafinidad de la proteína A. Las Fcab unidas se eluyen de la proteína A lavando la columna con tampón glicina (pH=2,9-4,0), seguido de diálisis frente a PBS (pH = 6,8). La pureza de los Fcab se determina mediante análisis de SDS-PAGE no reductor y los potenciales agregados se detectan mediante HPLC de exclusión por tamaño usando una columna Zorbax GF250 y PBS como tampón de carrera.

Caracterización estructural de Fcab:

La unión a receptores Fc y la proteína A se utilizó para estimar la integridad estructural global de las Fcab purificados. La asociación con el receptor neonatal de Fc (FcRn) se midió mediante la adición de 10 μg/ml Fcab a un chip de Biacore CM5 acoplado a 5.000 unidades de respuesta (UR) del FcRn humano recombinante a pH = 6,0. La disociación de Fcab del FcRn se analizó a pH = 7,4. Estos experimentos demostraron una interacción dependiente del pH de los Fcab específicos de Her2 con FcRn con características de unión muy similares a las del Fcab silvestre. La unión de Fcab al receptor CD64 de Fc de alta afinidad se midió utilizando un chip de Biacore CM5 revestido con 3000 UR de Proteína A, s seguido de la adición de una solución Fcab 10 μg/ml. Finalmente, se añadió CD64 soluble humana en 5 μg/ml. Las curvas de unión resultantes eran indistinguibles de las obtenidos con el Fcab tipo silvestre. La interacción de Fcab recombinantes (10 μg/ml) con Proteína A también se midió mediante SPR usando una chip de Biacore CM5 recubierto con proteína A (3.000 UR). De nuevo, las afinidades eran salvajes comparables a las obtenidas con el Fcab silvestre.

Unión específica de antígeno para Fcab:

La potencia y especificidad de los Fcab específicos de Her2 para unirse a Her-2 se evaluó por ELISA. El Her-2 humano soluble (Bender Med Systems, Austria) se recubrió con plástico a 2 μg/ml. Después de lavar y bloquear los sitios de unión no específica, se añadieron concentraciones crecientes de Fcab. Para detectar los Fcab unidos a Her2 se añadieron anticuerpos monoclonales específicos del dominio CH2 que se conjugaron con peroxidasa de rábano (Serotec). Los resultados demuestran que algunos Fcab específicos de Ger2 podían interaccionar con su diana en el límite bajo nanomolar (Tabla 6). Esta interacción fue específica, ya que la unión a otros miembros de la familia Her (He1, Her3 y Her4) fue >100 veces más débil según el ELISA. No se detectó unión a antígenos Her2 no relacionados.

Tabla 6: Afinidades de unión de Fcab específicos de Her2 en ELISA:

clon de Fcab

CE50 [nM] ELISA de Her 2 CE50 [nM] de unión celular SKBR3

y-Her.C2.P4.2-3

463 nr

y-Her.C2.P4.2-4

370 nr

H561G3M1G4

263 nr

y-Her.C2.P4.2-19

93 nr

ABEFs0101

16,1 5,2

H 10-03-6

4,8 10,3

EF3-17

4,7 1,3

y-Her.C2.P4.2-9

4,3 nr

H10-03-6R

2,6 11,1

nr= no realizado.

La unión al antígeno también se determinó mediante SPR Chips Biacore CM5 se recubrieron con diferentes cantidades de Her-2 soluble humano, seguido de la adición de concentraciones crecientes de Fcab. La afinidad (Kd) de los Fcab se calculó a partir de las curvas de unión resultantes tras ajustar usando el software BiaEval. En estas condiciones experimentales, Los Fcab específicos de Her-2 H561 G3M1 G4 y H10-03-6 se unieron a Her-2 con valores de Kd de 7,55nM y 8,6nM, respectivamente. La unión a antígeno también se evaluó mediante FACAS usando líneas celulares de cáncer de mama humano que sobreexpresan Her-2 SKBR3 y Calu-3. 1x105 células se incubaron con concentraciones crecientes de Fcab durante 60 minutos en hielo. Después, los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante centrifugación y lavado. Los Fcab unidos a las células se detectaron por incubación con anticuerpos específicos anti-Fc humanos conjugados con ficoeritrina (Sigma) durante 60 minutos en hielo. Después de lavar las células, se midió la intensidad de la fluorescencia en la superficie celular en un instrumento FACS Calibur (Beckton Dickinson). Todas las bandas de Fcab específicos de Ger2 se unieron a las células SKBR3 y Calu-3 pero sólo mínimamente a las células MDA-MB468 que no expresan Her-2, lo que confirma la débil reactividad cruzada observada en el ELISA. Las afinidades aparentes (CE50) de los Fcab específicos de Her2 sobre las células SKBR3 se enumeran en la Tabla 6.

15

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65

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Función efectora de Fcab específicos de antígeno (ADCC):

Con el fin de determinar si los Fcab específicos de Her2 median las funciones efectoras de Fc, se realizan ensayos de ADCC. En estos tipos de ensayos, los anticuerpos se unen a las células diana y se marcan para apoptosis en virtud de la unión a los receptores Fc sobre las células efectoras, tales como células asesinas naturales (NK). Las células SKBR3 (células diana) que están marcadas con el colorante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) se incuban con concentraciones crecientes de Fcab específicos de Her2 durante 20 minutos a 37 ° C. Las células NK sin tocar se aislaron a partir de sangre humana de donantes sanos por agotamiento negativo en un dispositivo de AutoMACS usando esferas magnéticas de MACS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech). Las células NK purificadas se mezclan con las células SKBR3 opsonizadas en una proporción de

5:01 y se incuban durante 4 horas a 37 ° C. Después, se añade el colorante actinomicina 7-amino de fluorescencia (7-AAD), que tiñe específicamente las células apoptóticas. Las células apoptóticas SKBR3 se enumeran en el FACS como células dobles positivas.a 7-AAD/CSFE. Los Fcab específicos de Her2 H10-03-6 y ABEFs0101 demostraron ser potentes mediadores de la muerte de las células SKBR3, con valores de CD50 de 1,1 nM y 1,0 nM, respectivamente. El mecanismo de la inducción de apoptosis es dependiente de la presencia de células NK que demuestra que los Fcab específicos de Her2 poseen funcionalidad de ADCC..

Ejemplo 7: Expresión en levaduras de Fab 4D5

Para la expresión de un fragmento fab en levaduras, El vector de expresión en levadura pYD1 (Invitrogen) (SEC ID N 72 / Figura 17) se modifica como sigue:

Se introduce un sitio de restricción NheI mediante mutagénesis dirigida al sitio en la posición 581/586 para producir el vector modificado pYD1 Nhe (SEC ID N º 73 / Figura 18). Este vector se restringe con NheI y PmeI, para producir 3 fragmentos. El fragmento más grande es el esqueleto del vector restante, en el que se inserta un ligador oligonucleótido sintético para producir el vector de pYD1lnk (SEC ID N º 74 / Figura 19). Un casete que incluye la región de terminación de la transcripción MATα es luego amplificada por PCR a partir del vector pYD1 y se clona en pYD1lnk a través de BamHI y PstI de restricción y ligación. El vector resultante es pYD1mata (SEC ID N º 75 / Figura 20). Un casete que contiene el promotor GAL1, el gen que codifica para AGA2 y un ligador sintético con sitios de clonación NotI y SfiI se amplifica por PCR a partir de pYD1 y se clona en pYD1mata a través de la restricción EcoRI y PacI para producir el vector pYD1gal (SEQ.ID N º 76 / Figura 21).

Como un ejemplo para un Fab que se muestra en la levadura los genes que codifican para VH-CH1 y VL-CL, respectivamente, del anticuerpo 4D5 (Herceptin) se hacen sintéticamente (secuencias 4D5H (SEC ID N º 77 / Figura 22) y 4D5L (SEC ID N º 78 / Figura 23)).

4D5H está flanqueada por los sitios de restricción SfiI y NotI, y se clona en el vector pYD1gal para producir el vector pYD4D5hc (SEC ID N º 79 / Figura 24). En este vector, el N-terminal de 4D5H se fusiona con el extremo C-terminal de AGA2, y en el extremo C-terminal de 4D5H, un marcador de hexahistidina está unido, seguido por el codón de terminación. La secuencia de aminoácidos de VH-CH1 de 4D5 se da en 4D5hp (SEC ID No.80 / Figura 25).

4D5 está flanqueado por los sitio de restricción Ncol y Ascl . y se clona en el vector pYD1gal para producir el vector pYD4D5hc (SEC ID N º 79 / Figura 26). 4D5L está precedida por una señal de secreción de AGA2, y lleva un codón de terminación después del residuo de cisteína C-terminal del dominio CL. La secuencia de aminoácidos de VL-CL de 4D5 se da en 4D5lp (SEC ID No.82 / Figura 27).

Para la expresión de Fab 4D5, el vector pYD4D5hl se transforma en la cepa de levadura EBY100 (Invitrogen), s se seleccionan los transformantes en medio mínimo sin triptófano, y la expresión de la proteína recombinante se induce por crecimiento en un medio que contiene galactosa de acuerdo con protocolos estándar (Invitrogen ).

Ejemplo 8: Construcción de una biblioteca con restos aleatorizados en los bucles estructurales del dominio CL de 4D5 Fab

Como primer paso en la construcción de la biblioteca de presentación en levadura, l el dominio CL silvestre (kappa C) se corta del vector de expresión pYD4D5hl (SEC ID N º 81) con las enzimas de restricción BsiWI y AscI. Se prepara un gen sintético que codifica dominios kappa C humanos flanqueados por BsiWI y AscI (en el contexto de acuerdo con pYD4D5hl) en el que se introducen mutaciones e inserciones aleatorias, respectivamente, en los bucles AB y EF. En este ejemplo en particular, la inserción de los codones NNB 3. 4 o 5, se realiza entre los aminoácidos 16 y 17 del dominio C kappa humano, una posición de residuo 92 , 93, 94, 95, 97, 98 y99 está sustituidos por los codones NNB. (IMGT, numeración, (véase la Figura 2). Un codón NNB contiene los 4 nucleótidos en las posiciones 1 y 2 y C-G y T en la posición 3. Por tanto, NNB codifica los 20 aminoácidos de origen natural.

La biblioteca se prepara y se selecciona siguiendo procedimientos convencionales.

Como ligando estructural se usa epítopos 4D5 y Her2neu diana de CR. Dichos miembros de la biblioteca se seleccionan para la producción de un anticuerpo modular citotóxico que tiene un sitio de unión modificado por

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ingeniería en el dominio CL, que es una unión específica a una molécula efectora, tal como un receptor Fc gamma. TEl Fab resultante se analiza para determinar su (i) unión a Her2neu con una Kd<10-8 M y una CI50<10-8 M, y (ii) la función efectora, usando un ensayo de CDC y/o ADCC.

Claims (15)

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   REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo modular citotóxico, que se une específicamente a una superficie celular diana con una afinidad de unión de kd<10-8 M, que es un Fc de unión a antígeno (Fcab) de una molécula de anticuerpo con función efectora, que es al

   5 menos una actividad de ADCC, ADCP y CDC con un sitio de unión a antígeno modificado en la región bucle de un dominio CH3 para unirse a dicha diana de la superficie celular, en donde la diana de la superficie celular es un receptor de la clase erbB.

   2 Anticuerpo modular de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene actividad ADCC. 10

2. 3.

   Anticuerpo modular de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho sitio de unión a antígeno comprende una secuencia de anticuerpo aleatorizada.

3. 4.

   Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho sitio de unión a

   15 antígeno se localiza en el intervalo de los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25 a 39, los aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 89 a 103 y los aminoácidos 106 a 117, en donde la numeración es conforme al esquema de numeración de IMGT.
4. 5. Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un Fc de IgG1. 20

5. 6.

   Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha diana se selecciona del grupo que consiste en EGFR Her2, Her2neu, HER3 y HER4.

6. 7.

   Anticuerpo modular de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho sitio de unión a antígeno se une

   25 específicamente a Her2 y contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los números de SEC ID como se indican en las Tablas 4 y 5, contenido en un bucle EF y/o AB y/o CD.
7. 8. Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se puede obtener de una

   biblioteca de un oligómero de dominios de anticuerpo modular que se unen a un ligando efector. 30

8. 9.

   Molécula de combinación que comprende un anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 con otros péptidos o polipéptidos.

9. 10.

   Anticuerpo modular de combinación que comprende un anticuerpo modular de acuerdo con cualquiera de las

   35 reivindicaciones 1 a 8, que además está combinado con uno o más anticuerpos modulares modificados o con anticuerpos modulares no modificados o partes de los mismos.
10. 11. Anticuerpo modular de combinación de acuerdo con la reivindicación 10, que es una molécula de anticuerpo

    completa. 40
11. 12. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo modular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,
12. 13. Método de producción de un anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que 45 comprende las etapas de:

    a.

    proporcionar una biblioteca de Fcab

    b.

    poner en contacto dicha biblioteca con dicha diana en presencia de un ligando efector,

    c.

    seleccionar un miembro de la biblioteca que tenga ambas propiedades, 50

    (i)

    afinidad por la unión a la diana de kd<10-8 M o CI50<10-8 M, y

    (ii)

    actividad ADCC, ADCP y CDC, y

    d.

    fabricar una preparación del anticuerpo modular, 55

13. 14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la biblioteca contiene miembros que tienen una secuencia de anticuerpo aleatorizada.
14. 15. Método de acuerdo con las reivindicaciones 13 o 14, que además comprende la etapa de maduración de la afinidad 60 de dicho miembro de la biblioteca.
15. 16. Anticuerpo modular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para usar en el tratamiento de un paciente que sufra un tumor sólido, en donde el tumor expresa un receptor de la clase erbB,

    44