ES2609359T3 - Inmunoglobulina citotóxica - Google Patents

Abstract

Anticuerpo modular citotóxico con un peso molecular de hasta 60 kD, que se une específicamente a Her2 humano con una afinidad de unión de Kd <10-8 M, donde el anticuerpo comprende un fragmento de cadena pesada de IgG1 humana que comprende un dominio CH2 y un dominio CH3 y donde el anticuerpo contiene un sitio de unión que se une específicamente a Her2 creado por ingeniería genética en una región bucle estructural del dominio CH3 y que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No.: 191, 241 y 370, donde la SEQ ID No.: 191 está contenida dentro del bucle AB, la SEQ ID No.: 241 está contenida dentro del bucle CD y la SEQ ID No.: 370 está contenida dentro del bucle EF de la región bucle estructural.

Description

Inmunoglobulina citotóxica

5 La invención se refiere a una inmunoglobulina citotóxica.

Los anticuerpos monoclonales se han usado ampliamente como agentes de unión terapéuticos. La estructura básica de los anticuerpos se explicará en el presente documento usando como ejemplo una inmunoglobulina IgG1 intacta.

10 Dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas se combinan para formar la molécula de anticuerpo con forma de Y. Cada una de las cadenas pesadas tiene cuatro dominios. Los dominios variables (VH) en el extremo amino son las puntas de la Y. A estos les siguen tres dominios constantes: CH1, CH2 y el dominio CH3 en el extremo carboxi, en la base del tallo de la Y. Un tramo corto, la zona de intercambio, conecta las regiones variable y constante de la cadena pesada. La bisagra conecta CH2 y CH3 (el fragmento Fc) con el resto del anticuerpo (los

15 fragmentos Fab). Mediante escisión proteolítica de la bisagra en una molécula de anticuerpo intacta se pueden producir un fragmento Fc y dos fragmentos Fab idénticos. Las cadenas ligeras están formadas por dos dominios, el variable (VL) y el constante (CL), separados por una zona de intercambio.

Los puentes disulfuro en la región de bisagra conectan las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las

20 cadenas pesadas mediante puentes disulfuro adicionales. Los restos de hidrato de carbono unidos por Asn están unidos en diferentes posiciones en los dominios constantes en función de la clase de inmunoglobulina. Para la IgG1, dos puentes disulfuro en la región de bisagra, entre los pares Cys235 y Cys238, unen las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las cadenas pesadas mediante dos puentes disulfuro adicionales, entre las Cys229 en los dominios CH1 y las Cys214 en los dominios CL. Los restos de hidrato de carbono están unidos a la Asn306 de cada

25 CH2 de modo que se genera un saliente pronunciado en el tallo de la Y.

Estas características tienen profundas consecuencias funcionales. Las regiones variables de las cadenas tanto pesadas como ligeras (VH) y (VL) residen en las "puntas" de la Y, en las que están colocadas para reaccionar con el

30 antígeno. Esta punta de la molécula es el lateral sobre el cual se localiza el extremo N de la secuencia de aminoácidos. El tallo de la Y se proyecta de un modo para mediar con eficacia en las funciones efectoras, tales como la activación del complemento y la interacción con los receptores Fc, o ADCC y ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 sobresalen para facilitar la interacción con las proteínas efectoras. El extremo C de la secuencia de aminoácidos se localiza en el lado opuesto de la punta, que puede denominarse "parte inferior" de la Y.

35 En los anticuerpos se encuentran dos tipos de cadenas ligeras, denominadas lambda (λ) y kappa (k). Una inmunoglobulina dada tiene cadenas k o cadenas λ, nunca una de cada. No se han encontrado diferencias funcionales entre los anticuerpos que tienen cadenas λ o k.

40 Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene una estructura similar de dos láminas beta empaquetadas fuertemente una contra otra en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura conservada se denomina el pliegue de la inmunoglobulina. El pliegue de la inmunoglobulina de los dominios constantes contiene una lámina de 3 hebras empaquetada contra una lámina de 4 hebras. El pliegue se estabiliza con puentes de hidrógeno entre las hebras beta de cada lámina, mediante enlaces hidrófobos entre los restos de las láminas opuestas en el interior y

45 mediante un puente disulfuro entre las láminas. La lámina de 3 hebras comprende hebras C, F y G, y la lámina de 4 hebras tiene hebras A B, E y D. Las letras A a G indican las posiciones secuenciales de las hebras beta a lo largo de la secuencia de aminoácidos del pliegue de inmunoglobulina.

El pliegue de los dominios variables tiene 9 hebras beta dispuestas en dos láminas de 4 y 5 hebras. La lámina de 5

50 hebras es estructuralmente homóloga a la lámina de 3 hebras de los dominios constantes, pero contiene las hebras adicionales C' y C''. El resto de las hebras (A, B, C, D, E, F, G) tienen la misma topología y una estructura similar a la de sus homólogos en los pliegues de inmunoglobulina del dominio constante. Un enlace disulfuro une las hebras B y F en láminas opuestas, como en los dominios constantes.

55 Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas contienen tres bucles hipervariables,

o regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las tres CDR de un dominio V (CDR1, CDR2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDR son bucles que conectan las hebras beta B-C, C’-C" y F-G del pliegue de inmunoglobulina. Los restos en las CDR varían de una molécula de inmunoglobulina a la siguiente, de modo que se confiere especificidad a cada anticuerpo.

60 Los dominios VL y VH en las puntas de las moléculas de anticuerpo están estrechamente empaquetados de modo que las 6 CDR (3 en cada dominio) colaboran en la construcción de una superficie (o cavidad) para la unión específica de antígeno. Por lo tanto, el sitio de unión al antígeno natural de un anticuerpo está compuesto por los bucles que conectan las hebras B-C, C’-C" y F-G del dominio variable de la cadena ligera y las hebras B-C, C’-C" y F-G del

65 dominio variable de la cadena pesada.

Los bucles que no son bucles CDR en una inmunoglobulina nativa o que no forman parte de la cavidad de unión a antígeno determinada por los bucles CDR y, opcionalmente, bucles adyacentes dentro de la región del bucle CDR, no tienen especificidad de unión a antígeno o de unión a epítopo, pero contribuyen al correcto plegamiento de la totalidad de la molécula de inmunoglobulina y/o su función efectora o de otro tipo y, por lo tanto, se denominan bucles

5 estructurales para los fines de la presente invención.

Ciertos documentos de la técnica anterior muestran que, hasta ahora, se ha usado el armazón de tipo inmunoglobulina con el fin de manipular el sitio de unión a antígeno existente, de modo que se introducen nuevas propiedades de unión. En la mayoría de los casos, las regiones CDR se han modificado mediante ingeniería para la unión al antígeno, en otras palabras, en el caso del pliegue de inmunoglobulina, solo el sitio de unión a antígeno natural se ha modificado con el fin de cambiar la afinidad o especificidad de unión. Existe una gran cantidad de bibliografía que describe diferentes formatos de dichas inmunoglobulinas manipuladas, con frecuencia expresadas en forma de fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o fragmentos Fab, expresados sobre la superficie de partículas de fagos o expresados de forma soluble en diversos sistemas de expresión procariotas o eucariotas.

15 El documento WO06/072620A1 describe un procedimiento de modificación por ingeniería de una inmunoglobulina que comprende una modificación en una región de bucle estructural para obtener nuevos sitios de unión a antígeno. Este procedimiento es ampliamente aplicable a las inmunoglobulinas y se puede usar para producir una biblioteca de inmunoglobulinas dirigidas a diversos antígenos. Se ha demostrado que una biblioteca de CH3 es útil para seleccionar agentes de unión específicos de un antígeno.

El documento WO08/003103A2 describe la selección (panning) de una biblioteca de CH3, CH1 o CL en un péptido sintético, que representa un mimotopo del antígeno CD20.

25 En la técnica se han propuesto varias bibliotecas de inmunoglobulina para obtener agentes de unión específicos de inmunoglobulinas. La técnica anterior, por lo general, hace referencia a la expresión monovalente monomérica de dominios de unión. El documento WO9209690A2 describe partículas de fagémido que muestran una única copia de una proteína de fusión sobre la superficie de la partícula. De este modo, se describió la obtención de agentes de unión de alta afinidad a partir de una biblioteca de partículas de fagémido, también denominados bacteriófagos. Se proporcionan vectores de expresión replicables que comprenden genes que codifican un polipéptido de unión y una proteína de la cubierta del fago, para formar una fusión génica que codifica una proteína de fusión, que es una proteína quimérica de una partícula de fagémido, la proteína de la cubierta del fago y el polipéptido de unión.

El documento US5223409 describe, en general, el procedimiento de fusión de un gen que codifica una proteína de

35 interés al dominio en el extremo N de la proteína de la cubierta III génica del fago filamentoso M13. La fusión génica se muta para formar una biblioteca de proteínas de fusión relacionadas estructuralmente que se expresan en cantidad baja sobre la superficie de una partícula de fagémido. Se usan selección y detección selectiva biológicas para identificar ligandos nuevos útiles como candidatos a fármacos.

Sin embargo, existen algunas limitaciones al uso de dicho "fago de fusión" o presentación en fago monovalente y las respectivas proteínas de fusión únicas. Muchos agentes biológicos están en la naturaleza en forma oligomérica. Para los fines de la presente invención, oligomérico significa dimérico, trimérico o incluso formas poliméricas superiores, de hasta 24 monómeros.

45 Se ha descrito que los fagos de fusión de acuerdo con la técnica anterior presentan proteínas de fusión monoméricas, principalmente porque se creía que los agentes de unión de afinidad más alta solo se podían seleccionar de una biblioteca si las partículas de fagémido presentaban proteínas de fusión sencillas. No obstante, las proteínas nativas a menudo se ensamblan como un dímero o incluso en un grado de oligomerización más alto. Para obtener presentación dimérica con una proteína de fusión sencilla, se han desarrollado algunas técnicas que implican codones de terminación condicionales localizados entre la proteína de la cubierta y el polipéptido de unión (Dall'Acqua et al. The Journal of Immunology, 2002, 169: 5171-5180). De este modo, se expresan monómeros solubles de los polipéptidos además de los fusionados al fago, y se permite de esta manera la formación de un dímero. Sin embargo, dichos codones de terminación requieren la propagación en células hospedadoras supresoras específicas que puedan traducir un codón de terminación en un aminoácido, para proporcionar una cantidad adecuada de proteínas de fusión

55 además de los polipéptidos de unión solubles.

Las proteínas de fusión de la técnica anterior implican, en algunos casos, secuencias enlazadoras para presentar polipéptidos de unión más grandes. Normalmente se usan secuencias enlazadoras de hasta 24 aminoácidos con fines convencionales de presentación de dominios variables de un anticuerpo. Véase, por ejemplo, el vector de expresión pCOMB3x (Hybrid. Hybridomics. Abr 2003;22(2):97-108. Development of functional human monoclonal single-chain variable fragment antibody against HIV-1 from human cervical B cells. Berry JD, Rutherford J, Silverman GJ, Kaul R, Elia M, Gobuty S, Fuller R, Plummer FA, Barbas CF).

Las inmunoglobulinas basadas en IgG1 de longitud completa se han usado ampliamente para tratar a los pacientes

65 que padecen tumores sólidos, en particular, los que sobreexpresan un receptor de la clase erbB. Entre estos receptores están e EGFR (Her1), Her2, Her2neu, Her3 y Her4.

Herceptin (trastuzumab, humAb4D5) es un producto basado en un anticuerpo monoclonal para usar en la terapia del cáncer de mama. El anticuerpo Herceptin es específico del epítopo 4D5 del dominio extracelular HER2 de her2neu (también denominado c- erbB-2 o MAC117).

5 El "dominio extracelular de HER2" O "DEC HER2" se refiere a un dominio de HER2 que está fuera de la célula, anclado a una membrana celular, o en circulación, incluyendo fragmentos del mismo. El dominio extracelular de HER2 puede comprender cuatro dominios: "Dominio I" (restos de aminoácido de aproximadamente 1-195 "Dominio II" (restos de aminoácido de aproximadamente 196-319), "Dominio III" (restos de aminoácido de aproximadamente 320-488) y "Dominio IV" (restos de aminoácido de aproximadamente 489-630) (numeración de restos sin péptido señal).

El “epítopo 4D5” es la región en el dominio extracelular de HER2 a la que se une el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) y el trastuzumab. Este epítopo está cerca del dominio transmembrana de HER2 y dentro del dominio IV de HER2. El epítopo 4D5 de HER2 abarca uno cualquiera o más restos en la región desde aproximadamente el resto 529 hasta

15 aproximadamente el resto 625, incluido el DEC de HER2, incluyendo la numeración de restos el péptido señal.

El EGFR es una glicoproteína monomérica grande (1.186 restos) con una única región transmembrana y un dominio tirosina quinasa citoplasmático flanqueado por regiones reguladoras no catalíticas. Los análisis de secuencia han mostrado que el ectodominio (restos 1-621) contiene cuatro subdominios denominados en el presente documento L1, CR1, L2 y CR2, en los que L y CR son acrónimos de grande (large) y rico en cisteína (CR), respectivamente. Los dominios L1 y L2 también se han denominado dominios I y III, respectivamente. Los dominios CR también se han denominado anteriormente dominios II y IV, o S1.1-S1.3 y S2.1-S2.3, en los que S es la abreviatura de pequeño (small).

25 Se han desarrollado mAb (anticuerpos monoclonales) contra el dominio externo del EGFR que rompen la unión del ligando al receptor y la posterior transducción de señales. Se han caracterizado tres anticuerpos de bloqueo específicos de EGFR con mayor detalle in vitro y en la actualidad se usan en estudios clínicos; estos son mAbC225 (ERBITUX/cetuximab), mAb425 (EMD72000) y el MAb humano ABX-EGF. C225 (Cetuximab/Erbitux) está aprobado por la FDA para el cáncer colorrectal metastásico y el mAb425 (EMD59000), cuya versión humanizada (EMD72000) está actualmente en ensayos clínicos de fase II, para diversos tumores sólidos que expresan EGFr. C225 se une a distintos epítopos en el dominio extracelular de EGFr. Se ha demostrado la unión independiente de ambos anticuerpos al receptor de tipo silvestre y al receptor mutante (EGFrVIII), que principalmente se expresa en células tumorales. Cetuximab interacciona exclusivamente con el dominio III de la región extracelular de EGFR (sEGFR), de modo que obstruye particularmente la región de unión al ligando sobre este dominio e impide estéricamente la dimerización del

35 receptor.

El receptor mutante del EGF de origen espontáneo se demostró por primera vez en el glioblastoma. Conocido como EGFRvIII, esta molécula representa una deleción de los exones 2 a 7 en el dominio extracelular del receptor del EGF. Esto elimina 273 aminoácidos y crea una nueva glicina en la unión de la fusión. El EGFRvIII (denominado según los casos 2-7 EGFR o delta EGFR) tiene una deleción en fase del dominio extracelular y se encuentra en numerosos tipos de tumores humanos.

El documento WO9720858A1 se refiere a anticuerpos anti-Her2 que inducen la apoptosis en células que expresan Her2. Por tanto, los anticuerpos monoclonales (mAb) que se unen a Her2 se generan inmunizando ratones con Her2

45 soluble purificado.

El documento WO06087637A2 se refiere a anticuerpos que reconocen Her2/neu y ejercen un efecto antiproliferativo sobre las células que expresan Her2/neu. Este documento describe un anticuerpo aislado o un fragmento, variante o derivado del mismo, en particular, el fragmento Fab humano y el fragmento scFv, capaces de unirse específicamente a Her2neu, aunque sin actividad citotóxica.

El documento WO01/01748 describes a una fusión de péptido:Fc capaz de unirse a HER2.

Algunas revelaciones de la técnica anterior se refieren a formatos de anticuerpo con potencial para inhibir el 55 crecimiento tumoral, en ausencia de actividades citotóxicas tales como ADCC.

Rovers et al. (Cancer Immunol. Immunother. (2007) 56:303-317 describen nanocuerpos anti-EGFR con potencial para inhibir el crecimiento de células tumorales.

El documento WO03/075840A2 desvela anticuerpos que se unen a KDR con una afinidad comparable o superior a la que muestran por el VEGF humano y que neutralizan la activación de KDR, entre ellos los Fab monovalentes que neutralizan la activación de KDR, de modo que inhiben la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Se han propuesto otros fragmentos de inmunoglobulina para terapia humana.

65 La solicitud de patente WO06036834A2 describe un péptido biológicamente activo incorporado como secuencia

interna en la región de bucle de un dominio Fc; la memoria descriptiva se refiere a una molécula cuya secuencia peptídica interna se puede añadir mediante inserción o sustitución de aminoácidos en el dominio Fc existente previamente. Un péptido de ejemplo está dirigido a p185HER2/neu.

5 Park et al Nat. Biotechnol. (2000) 18(2):194-8 han descrito péptidos dirigidos a Her2/neu. Aunque las afinidades de unión al péptido normalmente están en el límite inferior con una kD superior a 10-6 M, el mimético peptídico exocíclico anti-HER2/neu descrito ejerció una afinidad anormalmente alta (KD=300 nM).

El documento WO01/01748A2 describe compuestos peptídicos que se unen al producto génico erbB2 humano con afinidades de unión bajas. Se ensayó una proteína de fusión péptido de ejemplo-Fc dirigida a erbB2 en ensayos de unión competitiva, en los que se usaron como competidores una cantidad baja del mismo tipo de péptidos, obteniéndose como resultado un valor de CI50 bajo que, sin embargo, no sería indicativo de un valor de Kd o de CE50, como se determina en un ensayo de saturación.

15 El objetivo de la presente invención es proporcionar mejores productos de inmunoglobulinas que se unan a las superficies celulares.

El objetivo se logra con la materia sujeto conforme a lo reivindicado.

Sumario de la Invención

La presente invención es tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se refiere a un anticuerpo modular citotóxico con un peso molecular de hasta 60 kD, que se une

25 específicamente a una superficie celular diana con una afinidad de unión de Kd<108 M, preferentemente en el intervalo nanomolar o inferior. El anticuerpo modular de alta afinidad es, por tanto, de pequeño tamaño con la ventaja de una fácil penetración a través de una capa de células o tumor, para efectuar la lisis celular o la muerte celular en el sitio en el que se sobreexpresa la diana. Como alternativa, el anticuerpo modular puede tener una CI50<108 M, como se determina en un ensayo de unión de saturación.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención ejerce preferentemente al menos una de las actividades ADCC, ADCP, CDC o apoptótica.

La actividad citotóxica del anticuerpo modular de acuerdo con la invención está determinada, preferentemente, por sus 35 funciones efectoras, medidas mediante al menos una de las actividades ADCC, ADCP y CDC.

El anticuerpo modular puede ser un oligómero de dominios del anticuerpo modular, en particular un oligómero de dominios de inmunoglobulina, o un fragmento de una inmunoglobulina de longitud completa. El anticuerpo puede ser un dímero de Fc, o una cadena sencilla del mismo.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención contiene al menos un sitio de unión dentro de una región de bucle estructural. Por lo tanto, la unión a una diana o a un ligando funcional, tal como una molécula efectora, que en casos preferidos también es un ligando estructural, es posible incluso a través de una inmunoglobulina sin región CDR, o en un sitio además de una región CDR.

45 De acuerdo con una realización, el sitio de unión con especificidad por un ligando funcional o un ligando estructural puede estar dentro de la región de bucle CDR y el sitio de unión de la diana en la superficie celular localizado en una región bucle estructural.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención tiene propiedades de unión específicas para la unión. Los anticuerpos modulares preferidos de acuerdo con la invención se proporcionan para usarse en el tratamiento de pacientes que padecen un tumor sólido, expresando el tumor un receptor de la clase erbB, como se expone en las reivindicaciones.

55 Los anticuerpos modulares anti-Her2 pueden contener una secuencia de aminoácidos dentro del bucle EF de una región de bucle estructural, seleccionándose dicha secuencia del grupo que consiste en los números de SEQ. ID. Indicados en las tablas 4 y 5, que están opcionalmente contenidas en un bucle EF y/o AB y/o CD.

Aunque había una prolongada necesidad de anticuerpos altamente eficaces, pero de pequeño tamaño, por primera vez fue posible obtener un anticuerpo modular de este tipo de acuerdo con la invención, usando una biblioteca de dominios de anticuerpo modular, en particular una biblioteca de un oligómero de dominios de anticuerpo modular que se unen a un ligando efector. Determinados miembros de dicha biblioteca tienen ambas propiedades, la unión a la diana y la unión al ligando efector, como requisito previo para la citotoxicidad biológica o citolisis. También se prefiere que el formato de un armazón de anticuerpo modular no se modifique al producir variantes y bibliotecas de dicho

65 armazón, de manera que los miembros de la biblioteca sigan manteniendo el formato funcional como determina la unión a un ligando de armazón.

También se describe un método para producir un anticuerpo modular, que comprende las etapas de:

a. proporcionar una biblioteca de un oligómero de dominios de anticuerpo modular, 5 b. poner en contacto dicha biblioteca con dicha diana en presencia de un ligando efector,

c.

seleccionar un miembro de la biblioteca que tenga ambas propiedades,

(i)

afinidad por la unión a la diana de Kd<108 M o CI50<108 M, y

(ii)

actividad citotóxica, y

d.

fabricar una preparación del anticuerpo modular,

Los métodos de selección proporcionan la unión simultánea de ambos, la diana y el ligando efector, que supone una ventaja para una citolisis eficaz. La unión simultánea se determina, preferentemente, en un ensayo basado en células,

15 con diferenciación bidimensional, por ejemplo, en un sistema de FACS.

Los miembros de la biblioteca contienen una secuencia de anticuerpo aleatorizada, en la que el sitio de mutagénesis está dentro de la región de bucle estructural, que potencialmente incluye una secuencia terminal.

La biblioteca puede producirse de acuerdo con un diseño que proporciona la mutagénesis aparte de los sitios de unión que interaccionan con el ligando efector. Por lo tanto, preferentemente se usa una biblioteca de calidad elevada, como se determina mediante medidas de control de la calidad usando ensayos de unión a la molécula efectora o unión al ligando estructural.

25 El método puede comprender además la etapa de maduración de la afinidad para aumentar la afinidad de unión por la diana de la superficie celular. Esta maduración de la afinidad se realiza, preferentemente, mediante mutagénesis de una inmunoglobulina seleccionada que tiene una especificidad de unión determinada para unirse a la diana, sin producir reacciones cruzadas con las proteínas control, pero que sigue teniendo una afinidad media o baja. Preferentemente, también se mutageniza un miembro de la biblioteca que tiene una afinidad de unión con una CI50 o Kd<106 M para proporcionar un agente de unión de afinidad madurada o un conjunto de dichos agentes de unión, es decir, una biblioteca de agentes de unión de afinidad madurada con una afinidad mayor con una CI50 o Kd<107 M, preferentemente con una CI50 o Kd<108 M, o incluso en el intervalo nanomolar o inferior. En este caso, se prefiere que el anticuerpo modular de acuerdo con la invención siga siendo funcional con respecto a su efecto citotóxico.

35 También se desvela un método de preparación de un anticuerpo modular de acuerdo con la invención para tratar a un paciente que padece un tumor sólido, en el que el tumor expresa un receptor de la clase erbB.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención es, preferentemente, para usarse en el tratamiento de un paciente que padece un tumor sólido, en el que el tumor expresa un receptor de la clase erbB, como se expone en las reivindicaciones.

Figuras:

Figura 1:

45 Presentación esquemática de las PCR usadas para la producción de los fragmentos usados para ensamblar la biblioteca Fcab01. Los cebadores de la PCR están indicados por flechas con su respectiva orientación 5'-3', y las líneas verticales indican las posiciones aproximadas de los sitios de restricción introducidos que se usaron para el ensamblaje del gen mutado. Los sitios de restricción están contenidos en los cebadores para el ligamiento de los fragmentos de la PCR.

Figura 2:

Secuencia de aminoácidos y estructura secundaria de un dominio CH3 (IMGT, numeración). El esquema de

55 aleatorización se proporciona para las bibliotecas Fcab01 a Fcab06. Las posiciones aleatorizadas en el bucle AB y EF están marcadas con un círculo. X representa los 20 aminoácidos, z es solo Ala, Asp, Ser, Tyr.

Figura 3:

Estructura cristalina de un fragmento Fc de IgG1 (secuencia de aminoácidos)

Figura 4:

IgG humana que incluye modificaciones de aminoácidos aleatorizadas (secuencia de aminoácidos) 65 Figura 5:

Secuencia de aminoácidos de FcabRGD4L (secuencia de aminoácidos) Figura 6:

vector pHENFcabRGD4 (secuencia de nucleótidos)

Figura 7:

vector pHENFcabRGD4L (secuencia de nucleótidos)

Figura 8 (SEQ ID No. 15):

vector pYD1 dX (secuencia de nucleótidos)

Figura 9 (SEQ ID No. 16):

vector pYD1 dXFc (secuencia de nucleótidos)

Figura 10 (SEQ ID No. 17):

pYD1CH12 (secuencia de nucleótidos)

Figura 11 (SEQ ID No. 18):

Fcab01 (secuencia de nucleótidos)

Figura 12 (SEQ ID No. 19):

Fcab02 (secuencia de nucleótidos)

Figura 13 (SEQ ID No. 20):

Fcab03 (secuencia de nucleótidos)

Figura 14 (SEQ ID No. 21):

Fcab04 (secuencia de nucleótidos)

Figura 15 (SEQ ID No. 22):

Fcab05 (secuencia de nucleótidos)

Figura 16 (SEQ ID No. 23):

Fcab06 (secuencia de nucleótidos)

Figura 17 (SEQ ID No. 72):

vector pYD1 (secuencia de nucleótidos)

Figura 18 (SEQ ID No. 73):

vector pYD1 Nhe modificado (secuencia de nucleótidos)

Figura 19 (SEQ ID No. 74):

vector pYD1Ink (secuencia de nucleótidos)

Figura 20 (SEQ ID No. 75):

vector pYD1 mata (secuencia de nucleótidos)

Figura 21 (SEQ ID No. 76):

vector pYD1gal (secuencia de nucleótidos)

Figura 22 (SEQ ID No. 77):

4D5H (secuencia de nucleótidos) 5 Figura 23 (SEQ ID No. 78):

4D5L (secuencia de nucleótidos)

Figura 24 (SEQ ID No. 79):

vector pYD4D5hc (secuencia de nucleótidos)

Figura 25 (SEQ ID No. 80): 15 4D5hp (secuencia de aminoácidos)

Figura 26 (SEQ ID No. 81):

vector pYD4D5hl (secuencia de nucleótidos)

Figura 27 (SEQ ID No. 82):

4D5hp (secuencia de aminoácidos) 25 Figura 28 (SEQ ID No. 427):

plásmido pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt (secuencia de nucleótidos)

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Los términos específicos, como se usan a lo largo de la memoria descriptiva, tienen los significados siguientes.

35 El término "inmunoglobulina", como se usa de acuerdo con la presente invención, se define como polipéptidos o proteínas que pueden presentar propiedades de unión mono-, bi- o multiespecíficas, o mono-, bi- o multivalentes, preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres sitios de unión específicos para epítopos de, por ejemplo, antígenos, moléculas efectoras o proteínas de origen patógeno o de estructura humana, como autoantígenos que incluyen proteínas asociadas a células o séricas. El término inmunoglobulina, como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos funcionales de un anticuerpo, tales como Fc, Fab, scFv, dímeros monocatenarios de los dominios CH1/CL, Fv, dímeros como VH/VL, CH1/CL, CH2/CH2, CH3/CH3, u otros derivados o combinaciones de las inmunoglobulinas, tales como cadenas sencillas de pares de dominios de inmunoglobulina. La definición también incluye dominios de las cadenas pesadas y ligeras de la región variable (tales como dAb, Fd, VI, Vk,

45 Vh, VHH) y la región constante o dominios individuales de un anticuerpo intacto, tal como CH1, CH2, CH3, CH4, Cl y Ck, así como minidominios que consisten en al menos dos hebras beta de un dominio de inmunoglobulina conectado por un bucle estructural.

"Anticuerpos modulares", como se usan en el presente documento, se definen como moléculas de unión a antígeno, como anticuerpos humanos, compuestas por al menos un módulo polipeptídico o dominio proteico, preferentemente en la forma natural. La expresión "anticuerpos modulares" incluye moléculas de unión a antígeno que son inmunoglobulinas, proteínas similares a inmunoglobulinas u otras proteínas que exhiben formatos modulares y propiedades de unión a antígeno similares a las inmunoglobulinas o anticuerpos, que se pueden usar como armazones de unión a antígeno, preferentemente basados en proteínas humanas.

55 La expresión "molécula similar a inmunoglobulina", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteína de unión a antígeno, en particular a una proteína humana, que tiene una estructura de dominio que puede construirse de una forma modular. Las moléculas similares a inmunoglobulinas pueden ser receptores de linfocitos T (TCR) o partes solubles de los mismos, fibronectina, transferrina, CTLA-4, receptores antigénicos monocatenarios, por ejemplo los relacionados con los receptores de linfocitos T y anticuerpos, miméticos de anticuerpos, adnectinas, anticalinas, filómeros, proteínas de repetición tales como repeticiones de anquirina, avímeros, Versabodies™, moléculas basadas en la toxina del escorpión y otros armazones proteicos que no son anticuerpos con propiedades de unión a antígeno.

65 Las repeticiones de anquirina (AR), repeticiones de armadillo (ARM), repeticiones ricas en leucina (LRR) y repeticiones de tetratricopéptidos (TPR) son los miembros más importantes de la clase proteica de proteínas con repeticiones. Las

proteínas con repeticiones están compuestas por unidades estructurales homólogas (repeticiones) que se apilan para formar dominios alargados. La interacción de unión normalmente está mediada por varias repeticiones adyacentes, lo que conduce a superficies de interacción con la diana grandes.

5 Los avímeros contienen dominios A como cuerdas de múltiples dominios en diversos receptores de superficie celular. Los dominios de esta familia se unen de forma natural sobre 100 dianas conocidas diferentes, incluyendo moléculas pequeñas, proteínas y virus. El análisis del truncamiento ha mostrado que una diana normalmente se pone en contacto mediante múltiples dominios A con cada dominio de unión de forma independiente a un epítopo único. La avidez generada combinando múltiples dominios de unión es un potente abordaje para incrementar la afinidad y la especificidad, que estos receptores han explotado durante la evolución.

Las anticalinas son proteínas humanas modificadas que derivan del armazón de la lipocalina con propiedades de unión prescritas típicas de los anticuerpos humanizados. Las lipocalinas comprenden 160-180 aminoácidos y forman proteínas de barril beta, cónicas, con una cavidad de unión a ligando rodeada de cuatro bucles. Los ligandos naturales

15 de las lipocalinas son compuestos hidrófobos pequeños y se han podido aislar diferentes variantes de la lipocalina con nuevas especificidades del compuesto (también denominadas "anticalinas") después de aleatorizar los restos en esta cavidad de unión.

Los receptores antigénicos monocatenarios contienen un único dominio variable y son un 20 % más pequeños que los anticuerpos de dominio único de los camélidos.

Los filómeros son péptidos derivados de fragmentos proteicos naturales biodiversos.

Se entiende que la expresión "anticuerpo modular", "inmunoglobulina" y "proteínas similares a inmunoglobulina"

25 incluye también un derivado de los mismos. Un derivado es cualquier combinación de uno o más anticuerpos modulares de la invención y o una proteína de fusión en la que cualquier dominio o minidominio del anticuerpo modular de la invención se puede fusionar en cualquier posición de una o más de otras proteínas (tales como otros anticuerpos modulares, inmunoglobulinas, ligandos, proteínas armazón, enzimas, toxinas y similares). Un derivado del anticuerpo modular de la invención también se puede obtener mediante asociación o unión a otras sustancias mediante varias técnicas químicas, tales como acoplamiento covalente, interacción electrostática, puentes disulfuro etc. Las otras sustancias unidas a las inmunoglobulinas pueden ser lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas, o cualquier combinación de las mismas (p. ej., PEG, profármacos o fármacos). Un derivado también comprendería un anticuerpo con la misma secuencia de aminoácidos, pero formado completa o parcialmente por aminoácidos no naturales o modificados químicamente. El término derivado también incluye fragmentos y

35 equivalentes funcionales. Los derivados preferidos todavía son funcionales con respecto a la unión a la diana y a la actividad citotóxica.

Un "bucle estructural" o un "bucle no CDR", como se usa en el presente documento, debe entenderse del siguiente modo: los anticuerpos modulares, inmunoglobulinas o sustancias similares a inmunoglobulinas están formadas por dominios con un denominado pliegue de inmunoglobulina. En esencia, las láminas beta antiparalelas están conectadas por bucles para formar un barril beta antiparalelo comprimido. En la región variable, algunos de los bucles de los dominios contribuyen esencialmente a la especificidad del anticuerpo, es decir, la unión a un antígeno mediante el sitio de unión natural de un anticuerpo. Estos bucles se denominan bucles CDR. Los bucles CDR se localizan dentro de la región de bucle CDR que, en algunos casos, puede también incluir parte de la región marco variable 45 (denominada "VFR"), que está adyacente a los bucles CDR. Se sabe que algunos bucles de la VFR pueden contribuir a la cavidad de la unión a antígeno de un anticuerpo, que por lo general está determinada principalmente por los bucles CDR. Por lo tanto, dichos bucles VFR se consideran parte de la región bucle CDR, y no se usarían adecuadamente para modificar por ingeniería los nuevos sitios de unión a antígeno. Los bucles al lado de la cavidad de unión a antígeno o región de bucle CDR normalmente se denominan bucles estructurales o bucles no CDR. Al contrario que la VFR dentro de la región bucle CDR, o localizada cerca de los bucles CDR, otros bucles de la VFR de los dominios variables se considerarían bucles estructurales. Estos son, preferentemente, los bucles estructurales de la VFR localizada en oposición a la región de bucle CDR, o en el lado C-terminal de un dominio de inmunoglobulina variable. Los dominios constantes tienen bucles estructurales dentro de una región bucle estructural, por ejemplo, en el lado en C-terminal de un dominio de anticuerpo o en el lado N-terminal, incluso dentro de una cadena lateral de un dominio de

55 anticuerpo. Los dominios constantes también se denominan parte de la región marco.

El término "antígeno" o "diana", como se usa en el presente documento, incluirá, en particular, todos los antígenos y moléculas diana que pueden reconocerse por un sitio de unión de un anticuerpo modular. Son antígenos específicamente preferidos como dianas por la molécula, los antígenos o moléculas que ya se ha demostrado que son

o pueden ser inmunológica o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellos para los que se ha probado la eficacia clínica.

El término "diana" o "antígeno", como se usa en el presente documento, comprenderá, en particular, moléculas seleccionadas del grupo que consiste en alérgenos, antígenos asociados con tumores, autoantígenos que incluyen 65 receptores de la superficie celular, enzimas, receptores Fc, FcRn, HSA, IgG, interleucinas o citocinas, proteínas del sistema del complemento, proteínas transportadoras, moléculas séricas, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos,

antígenos protozoarios y antígenos virales, también moléculas responsables de la encefalitis espongiforme transmisible (EET), tales como priones, infecciosos o no, y marcadores o moléculas relacionadas con afecciones inflamatorias, tales como factores proinflamatorios, esclerosis múltiple o enfermedad de Alzheimer, o si no haptenos.

5 La expresión "antígenos de la superficie celular" incluirá todos los antígenos que pueden ser reconocidos por una estructura de anticuerpo sobre la superficie de una célula, y fragmentos de dichas moléculas. Los antígenos de la superficie celular preferidos son los antígenos que ya se ha demostrado que son o pueden ser inmunológica o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellos para los que se ha probado una eficacia clínica o preclínica. Los ejemplos incluyen moléculas de la superficie celular que participan en la actividad de la muerte celular. Tras la unión de la inmunoglobulina de acuerdo con la invención a, preferentemente, al menos dos de las moléculas de la superficie celular, el sistema inmunológico proporciona citolisis o muerte celular, por lo tanto, se puede proporcionar un medio potente para atacar a las células humanas.

El antígeno es reconocido como una molécula diana entera o como un fragmento de dicha molécula, especialmente

15 subestructuras de dianas, generalmente denominadas epítopos. Las subestructuras de los antígenos se denominan, por lo general, "epítopos" (p. ej., epítopos de linfocitos B, epítopos de linfocitos T), siempre que sean inmunológicamente relevantes, es decir son también reconocibles por anticuerpos naturales o monoclonales. El término "epítopo", como se usa en el presente documento, se referirá, en particular, a una estructura molecular que puede formar completamente una pareja de unión específica o ser parte de una pareja de unión específica a un sitio de unión de un anticuerpo modular o una inmunoglobulina. El término epítopo puede también hacer referencia a haptenos. Químicamente, un epítopo puede estar compuesto por un hidrato de carbono, un péptido, un ácido graso, una sustancia orgánica, bioquímica o inorgánica, o derivados de los mismos y cualquier combinación de los mismos. Si un epítopo es un polipéptido, normalmente incluirá al menos 3 aminoácidos, preferentemente de 8 a 50 aminoácidos y, más preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 aminoácidos en el péptido. No existe un límite superior crítico

25 de la longitud del péptido, la cual podría comprender casi toda la longitud de una secuencia polipeptídica de una proteína. Los epítopos pueden ser epítopos lineales o conformacionales. Un epítopo lineal está compuesto por un único segmento de una secuencia primaria de una cadena polipeptídica. Los epítopos lineales pueden ser contiguos o solapantes. Los epítopos conformacionales están compuestos por aminoácidos juntados plegando el polipéptido para formar una estructura terciaria y los aminoácidos no son necesariamente adyacentes entre sí en la secuencia lineal. De forma específica, los epítopos son, al menos, parte de moléculas relevantes en términos diagnósticos, es decir, la ausencia o presencia de un epítopo en una muestra se correlaciona de forma cualitativa o cuantitativa con una enfermedad o el estado de salud de un paciente o con un estado del proceso de fabricación o con el estado ambiental

o de alimentación. Los epítopos pueden ser también al menos parte de moléculas relevantes en términos terapéuticos,

es decir, moléculas que pueden establecerse como diana de un dominio de unión específica que cambia la evolución 35 de la enfermedad

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "se une específicamente" o "unión específica" se refiere a una reacción de unión que determina el ligando afín de interés en una población heterogénea de moléculas. Por lo tanto, en las condiciones indicadas (p. ej., condiciones de inmunoensayo), el anticuerpo modular se une a su diana concreta y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en una muestra. La unión específica significa que la unión es selectiva en términos de identidad de la diana, afinidad de unión o avidez alta, media o baja, según se seleccione. La unión selectiva normalmente se consigue si la constante de unión o la dinámica de unión presenta una diferencia de al menos 10 veces, preferentemente, la diferencia es de al menos 100 veces y, más preferentemente, de al menos 1.000 veces.

45 La expresión "sistema de expresión" se refiere a moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia de codificación deseada y secuencias control en unión operativa, de modo que los hospedadores transformados o transfectados con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Con el fin de efectuar la transformación, el sistema de expresión puede estar incluido en un vector, sin embargo, el ADN relevante puede también estar integrado en el cromosoma del hospedador. Como alternativa, se puede usar un sistema de expresión para la transcripción/traducción in vitro.

Toda la numeración de las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas es conforme al esquema de numeración de IMGT (IMGT, the international ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999) Nucleic Acids Res. 27) 209-212).

55 La expresión "agente de unión" o "ligando" se refiere a un miembro de un par de unión, en particular polipéptidos de unión que tienen el potencial de servir como dominio de unión para una pareja de unión. Los ejemplos de parejas de unión incluyen parejas de agentes de unión con interacciones funcionales, tales como receptores que se unen a ligandos, anticuerpos que se unen a antígenos o receptores, un fármaco que se une a una diana y enzimas que se unen a un sustrato.

La expresión "proteína de fusión" o "proteína de fusión quimérica" hará referencia a la molécula compuesta por un paquete genético, al menos parte de una estructura de la superficie externa, tal como una proteína de la cubierta, opcionalmente una secuencia enlazadora y un agente de unión. La proteína de fusión se codifica por un vector con el

65 gen del agente de unión e información para presentar una copia del agente de unión en la superficie del paquete genético.

El término "citotóxico" o "actividad citotóxica" se refiere a cualquier molécula específica dirigida contra antígenos naturales que, cuando se unen al antígeno, activa la vía del complemento o activa a las células asesinas, lo que tiene como resultado lisis celular o desencadena la apoptosis. En particular, se refiere a la actividad sobre células efectoras

5 que tienen como resultado la activación de los linfocitos T citotóxicos o células que median en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o la fagocitosis celular (ADCP). También se refiere a un efecto apoptótico, de modo que se desencadena la muerte celular programada (PCD). Por lo tanto, los anticuerpos modulares de acuerdo con la invención matan las células diana recubiertas con anticuerpo, opcionalmente mediante la unión a los receptores Fc de las células efectoras o mediante la inducción de la muerte celular programada.

"Armazón" hará referencia a una estructura temporal, natural o artificial, usada para soportar la estructura molecular de un polipéptido en la construcción de variantes o un repertorio del polipéptido. Normalmente, es un sistema modular de dominios polipeptídicos que mantiene la estructura terciaria o la función de la molécula parental. Son ejemplos de

15 armazones anticuerpos modulares que pueden mutagenizarse para producir variantes dentro de dicho armazón, para obtener una biblioteca.

La expresión "ligando estructural" significa un ligando que se une a un armazón o a la estructura de anticuerpos modulares, de modo que se determina la estructura molecular o la función primaria y la especificidad de dicho anticuerpo modular. En casos preferidos, el ligando estructural es un ligando funcional que media en una función biológica tras la unión, como un ligando efector. En una realización alternativa, el ligando estructural es un ligando funcional, que es una diana específica unida por la región CDR o región bucle estructural. El mismo ligando estructural se puede unir a muchas variantes de un anticuerpo modular con independencia de sus especificidades por la diana. En general, la presencia de un sitio de unión al ligando estructural indica que la variante se expresa y se pliega de forma 25 correcta. Por lo tanto, la unión del ligando estructural a su sitio de unión proporciona un método para preseleccionar, coseleccionar, caracterizar y detectar de forma selectiva polipéptidos funcionales de un repertorio de polipéptidos. El diseño de variantes de anticuerpos modulares que conservan la propiedad de unión a un ligando estructural evita la preparación de variantes que son no funcionales, por ejemplo, como resultado de la introducción de mutaciones, mutantes de plegamiento o mutantes de expresión que serían o son incapaces de unirse a sustancialmente cualquier diana o ligando efector. Dichos mutantes no funcionales en ocasiones se generan mediante la aleatorización normal y procedimientos de variación usados en la construcción de repertorios de polipéptidos. Proporcionar mutantes funcionales que se unen a un ligando estructural permite al experto en la materia preparar una biblioteca de anticuerpos modulares que está enriquecida en miembros de la biblioteca funcionales, bien plegados y altamente expresados. Por ejemplo, el armazón puede ser un Fab parental y al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30

35 %, más preferentemente al menos un 40 % de las variantes del Fab parental se unen a la diana de CDR de dicho Fab parental.

La expresión "ligando efector" significa un ligando que participa en las funciones efectoras, como una molécula efectora. Son ejemplos de ligandos efectores receptores Fc o moléculas similares a receptores Fc que interfieren con las inmunoglobulinas. Un receptor Fc es una proteína que se encuentra sobre la superficie de determinadas células, incluyendo las células asesinas naturales, macrófagos, neutrófilos y mastocitos, que contribuyen a las funciones protectoras del sistema inmunológico. Su nombre deriva de su especificidad de unión para una parte de un anticuerpo conocido como la región Fc (fragmento cristalizable). Los receptores Fc se unen a anticuerpos que están unidos a las células infectadas o patógenos invasores. Su actividad estimula las células fagocíticas o citotóxicas para destruir

45 microbios, o células infectadas por la fagocitosis celular mediada por anticuerpos (ADCP) o citotoxicidad mediada por las células dependientes de anticuerpos (ADCC). Existen varios tipos diferentes de receptores Fc, que se clasifican basándose en el tipo de anticuerpo que reconocen, por ejemplo, los que se unen a la clase más frecuente de anticuerpos, IgG, se denominan receptores Fc gamma (FcγR), los que se unen a IgA se denominan receptores Fc alfa (FcαR) y los que se unen a IgE se denominan receptores Fc épsilon (FcsR). Es un equivalente de un ligando efector y, por lo tanto, se incorpora en la definición, cualquier ligando sustituto que reconoce el mismo sitio de unión o uno similar dentro del anticuerpo modular, tal como la proteína A.

Todos los FcyR pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y son los receptores Fc más importantes para inducir la fagocitosis de los microbios opsonizados (recubiertos). Esta familia incluye varios miembros; por ejemplo,

55 FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32a), FcγRIIB (CD32b), FcγRIIIA (CD16a) y FcyRIIIB (CD16b); que difieren en sus afinidades de los anticuerpos debido a su diferente estructura molecular. Por ejemplo, FcγRI se une a IgG con más fuerza que FcγRII y FcγRIII, y tiene una porción extracelular compuesta por tres dominios de tipo inmunoglobulina (Ig), un dominio más que FcγRII y FcγRIII. Estas propiedades permiten la activación de FcγRI por una sola molécula de IgG (o monómero), mientras que los últimos dos receptores Fcy deben unirse a múltiples moléculas de IgG dentro del complejo inmunitario a activar.

Otro FcR se expresa en varios tipos celulares y tiene una estructura similar al MHC de clase I. Este receptor también se une a IgG y está implicado en la conservación de este anticuerpo. Sin embargo, dado que este receptor Fc también está implicado en la transferencia de la IgG de una madre a través de la placenta a su feto o en la leche al lactante, se

65 denomina receptor Fc neonato (FcRn). Recientemente, este receptor se ha implicado en la participación en la homeostasis de los niveles séricos de IgG.

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) es un mecanismo de inmunidad celular en el que una célula efectora del sistema inmunológico lisa de forma activa una célula diana que a la que se han unido anticuerpos específicos. Es uno de los mecanismos a través de los cuales los anticuerpos, como parte de la respuesta

5 inmunológica humoral, puede actuar para limitar y contener la infección. La ADCC clásica está mediada por las células asesinas naturales (NK); los monocitos y eosinófilos también pueden participar en la ADCC. Por ejemplo, los eosinófilos pueden matar determinados gusanos parasitarios conocidos como helmintos a través de la ADCC. La ADCC forma parte de la respuesta inmunológica adaptativa debido a su dependencia de una respuesta de anticuerpos anterior.

El término "extraño", en el contexto de aminoácidos, significará que los aminoácidos recién introducidos son de origen natural, pero extraños al sitio de modificación, o sustitutos de los aminoácidos de origen natural. "Extraño" con referencia a sitios de unión a antígeno significa que el sitio de unión a antígeno no está formado de forma natural por la región de unión específica del agente, y una pareja de unión extraña, pero no la pareja de unión natural del agente, se

15 une al sitio de unión recién modificado por ingeniería.

La expresión "región de unión variable", en ocasiones denominada "región CDR" como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas con estructuras variables capaces de producir interacciones de unión con antígenos. Dichas moléculas se pueden usar como tales o integrarse dentro de una proteína más grande, de modo que se forma una región específica de dicha proteína con la función de unión. Las estructuras variables pueden derivar de repertorios naturales de proteínas de unión tales como inmunoglobulinas o filómeros o diversidad sintética, incluyendo proteínas de repeticiones, avímeros y anticalinas. Las estructuras variables también se pueden producir mediante técnicas de aleatorización, en particular las descritas en el presente documento. Estas incluyen regiones CDR o no CDR mutagenizadas, y regiones bucle de dominios variables o dominios constantes de inmunoglobulinas.

25 Los agentes de unión modificados con diferentes modificaciones en sitios específicos se denominan "variantes". Las variantes de un armazón se agrupan, preferentemente, para formar bibliotecas de agentes de unión, que se pueden usar para seleccionar miembros de la biblioteca con funciones predeterminadas. De acuerdo con ello, una secuencia de anticuerpos preferentemente se aleatoriza, por ejemplo, a través de métodos de mutagénesis. De acuerdo con una realización preferida, una región bucle de un agente de unión, tal como la secuencia de anticuerpo parental que comprende las posiciones dentro de uno o más bucles o en un sitio terminal, que contribuye potencialmente a un sitio de unión, preferentemente se muta o modifica para producir bibliotecas, preferentemente mediante métodos de mutagénesis aleatoria, semialeatoria o, en particular, aleatoria dirigida, en particular para eliminar, intercambiar o introducir insertos generados aleatoriamente en bucles o una región bucle, preferentemente en la región bucle CDR o

35 en la región bucle estructural, que pueden incluir secuencias terminales, que se localizan en uno de los extremos de un dominio de anticuerpo o subestructura.

Como alternativa, se prefiere el uso de enfoques combinatorios. Se puede usar cualquiera de los métodos de mutagénesis conocidos, entre ellos la mutagénesis por casete. Estos métodos se pueden usar para realizar modificaciones de aminoácidos en las posiciones deseadas de la inmunoglobulina de la presente invención. En algunos casos, las posiciones se eligen de forma aleatoria, por ejemplo, con cualquiera de los posibles aminoácidos o una selección de aminoácidos preferidos para aleatorizar las secuencias bucle, o se realizan cambios de aminoácidos usando normas simples. Por ejemplo, todos los restos se pueden mutar, preferentemente, en aminoácidos específicos, tales como alanina, lo cual se conoce como escaneo de aminoácidos o de alanina. Dichos métodos se

45 pueden acoplar a enfoques de ingeniería más sofisticados que usan métodos de selección para detectar niveles mayores de diversidad de secuencia.

El anticuerpo modular citotóxico de acuerdo con la invención con un peso molecular inferior a 60 kDa o hasta 60 KDa tiene un tamaño pequeño en comparación con los anticuerpos de longitud completa. El tamaño preferido es de hasta 55 kDa. Los dominios sencillos de anticuerpos modulares normalmente tienen un tamaño molecular de 10-15 kDa, por lo tanto, una molécula basada en, o que consiste en, 4 dominios de anticuerpos modulares tendría un tamaño molecular de 40-60 kDa, dependiendo de la glicosilación o cualquier conjugación adicional de sustancias farmacológicamente activas, como toxinas o péptidos.

55 El formato preferido es un oligómero, compuesto de dominios de anticuerpos modulares, preferentemente hasta 4 dominios, más preferentemente 3 dominios, e incluso más preferentemente basado en 2 dominios, en el que el oligómero comprende, preferentemente, un heterodímero tal como Fab o un homodímero tal como Fc. Habitualmente se piensa que los formatos basados en la combinación de 5 dominios de anticuerpos modulares o más no ejercen las ventajas específicas de los fragmentos de anticuerpo de tamaño pequeño que son fáciles de expresar en varios sistemas de expresión y penetración de tejidos.

Es viable proporcionar un anticuerpo modular como un anticuerpo de dominio único. Sin embargo, los dominios de anticuerpo tienden a dimerizar tras la expresión, bien como un homodímero tal como un Fc, o un heterodímero tal como un Fab. Por lo tanto, la estructura dimérica se considera ventajosa para proporcionar una molécula estable. Los 65 dímeros preferidos de los dominios de inmunoglobulinas se seleccionan del grupo que consiste en dímeros de dominio único tales como VH/VL, CH1/CL (kappa o lambda), CH2/CH2 y CH3/CH3. Los dímeros u oligómeros de los dominios

de anticuerpo modular también se pueden proporcionar como moléculas monocatenarias o bicatenarias, en particular los que unen el extremo C de un dominio al extremo N de otro.

Las parejas de unión son agentes que se unen específicamente uno a otro, normalmente a través de las interacciones

5 no covalentes. Los ejemplos de parejas de unión incluyen parejas de agentes de unión con interacciones funcionales, tales como receptores que se unen a ligandos, anticuerpos que se unen a antígeno, un fármaco que se une a una diana y enzimas que se unen a un sustrato. Las parejas de unión han encontrado utilidad en muchas aplicaciones terapéuticas, diagnósticas, analíticas e industriales. Las parejas de unión más prominentes son anticuerpos o inmunoglobulinas, fragmentos o derivados de los mismos. En la mayoría de los casos, se requiere que la unión de dichos agentes de unión medie en un efecto o una función biológica, una "interacción funcional".

El anticuerpo modular citotóxico puede ser un agente de unión, que es una inmunoglobulina de origen humano o murino, y se puede usar para varios fines, en particular en composiciones farmacéuticas. Por supuesto, la inmunoglobulina modificada también puede ser una inmunoglobulina humanizada o quimérica.

15 El agente de unión, que es una inmunoglobulina humana, preferentemente se selecciona o deriva del grupo que consiste en IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. El agente de unión de inmunoglobulina murino se selecciona o deriva preferentemente del grupo que consiste en IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 e IgM.

Dicho agente de unión comprende, preferentemente, una cadena pesada y/o ligera o parte de las mismas. Una inmunoglobulina modificada puede comprender una cadena pesada y/o ligera, al menos un dominio variable y/o constante, o una parte del mismo que incluye un minidominio.

Un dominio constante es una unidad de pliegue de inmunoglobulina de la parte constante de una molécula de 25 inmunoglobulina, también denominada dominio de la región constante (p. ej., CH1, CH2, CH3, CH4, Ck, CI).

Un dominio variable es una unidad de pliegue de inmunoglobulina de la parte variable de una inmunoglobulina, también denominada dominio de la región variable (p. ej., Vh, Vk, VI, Vd).

Un ejemplo de anticuerpo modular puede consistir en un dominio constante seleccionado del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C, combinaciones, derivados o una parte de los mismos, incluido un minidominio, con al menos una región bucle, y se caracteriza porque dicha al menos una región bucle comprende al menos una modificación de aminoácidos que forma al menos una región bucle modificada, en el que dicha al menos una región bucle modificada se une específicamente a al menos un epítopo de un antígeno.

35 Otro anticuerpo modular puede consistir en un dominio variable de una cadena pesada o ligera, combinaciones, derivados o una parte de los mismos, incluido un minidominio, con al menos una región bucle, y se caracteriza porque dicha al menos una región bucle comprende al menos una modificación de aminoácidos que forma al menos una región bucle modificada, en el que dicha al menos una región bucle modificada se une específicamente a al menos un epítopo de un antígeno.

El anticuerpo modular puede comprender uno o más dominios (p. ej., al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, diez dominios). Si en el anticuerpo modular está presente más de un dominio, estos dominios pueden ser del mismo tipo o de varios tipos (p. ej., CH1-CH1-CH2, CH3-CH3, (CH2)2-(CH3)2, con o sin la región de bisagra). Por supuesto, 45 asimismo el orden de los dominios sencillos puede ser de cualquier tipo (p. ej., CH1-CH3-CH2, CH4-CH1-CH3-CH2).

En el presente documento se desvelan partes de anticuerpos, tales como partes de IgG, IgA, IgM, IgD, IgE y similares. Los anticuerpos modulares también pueden ser un fragmento de anticuerpo funcional tal como Fab, (Fab)2, scFv, Fv, Fc, Fcab™, un Fc de unión a antígeno o partes de los mismos, u otros derivados o combinaciones de las inmunoglobulinas, tales como minicuerpos, dominios de cadenas pesadas y ligeras de la región variable (tales como dAb, Fd, VL, incluyendo Vlambda y Vkappa, VH, VHH) así como minidominios que consisten en dos hebras beta de un dominio de inmunoglobulina conectados por al menos dos bucles estructurales, como dominios aislados o en el contexto de moléculas asociadas de forma natural. En el presente documento también se desvela el fragmento Fc de una molécula de anticuerpo, bien como fragmento Fc de unión a antígeno (Fcab™) mediante modificaciones de la

55 secuencia de aminoácidos o como conjugados o fusiones a receptores, péptidos u otros módulos de unión a antígeno, tales como scFv.

Los anticuerpos modulares se pueden usar como polipéptidos aislados o como moléculas de combinación, por ejemplo, mediante técnicas de recombinación, fusión o conjugación, con otros péptidos o polipéptidos. Los péptidos son, preferentemente, homólogos a las secuencias de los dominios de inmunoglobulina y, preferentemente, tienen una longitud de al menos 5 aminoácidos, más preferentemente una longitud de al menos 10 o incluso al menos 50 o 100 aminoácidos, y constituyen al menos parcialmente la región bucle del dominio de inmunoglobulina. Las características de unión preferidas se refieren a la unión, afinidad y avidez por el epítopo predefinidas.

65 El anticuerpo modular de acuerdo con la invención además se combina, posiblemente, con uno o más anticuerpos modulares modificados o con anticuerpos modulares sin modificar, o partes de los mismos, para obtener un anticuerpo

modular de combinación. Preferentemente, las combinaciones se obtienen mediante técnicas de recombinación, pero también mediante unión a través de adsorción, interacciones electrostáticas o similares, o incluso a través de la conjugación o unión química con o sin un enlazador. La secuencia enlazadora preferida es una secuencia enlazadora natural o una secuencia artificial funcionalmente adecuada.

5 En general, el anticuerpo modular de acuerdo con la invención se puede usar como bloque componente para combinar molecularmente otros anticuerpos modulares o sustancias o moléculas biológicamente activas. Se prefiere combinar molecularmente al menos un anticuerpo que se une a la pareja específica mediante las secuencias variables o no variables, como bucles estructurales, con al menos otra molécula de unión que puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, un receptor soluble, un ligando u otro dominio de anticuerpo, o un resto de unión del mismo. Otras combinaciones se refieren a moléculas proteicas, ácidos nucleicos, lípidos, moléculas orgánicas e hidratos de carbono.

Las moléculas modificadas por ingeniería de acuerdo con la presente invención serán útiles como moléculas

15 autónomas, así como proteínas o derivados de fusión, normalmente fusionadas antes o después de la modificación de un modo tal que forme parte de estructuras más grandes, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completo, o partes de las mismas. Por lo tanto, las inmunoglobulinas o proteínas de fusión también comprenden fragmentos Fc., fragmentos Fab, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios, en particular, fragmentos Fv monocatenarios, scFv bi-o multiespecíficos, diacuerpos, unicuerpos, multicuerpos, multivalentes o multímeros de dominios de inmunoglobulina, y otros. Será posible usar las proteínas modificadas por ingeniería para producir moléculas que son monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas, e incluso pueden portar más especificidades. Es posible controlar y preseleccionar la valencia de unión al mismo tiempo de acuerdo con los requisitos del uso planificado de dichas moléculas.

El anticuerpo modular ejerce opcionalmente una o más regiones de unión a antígenos, incluyendo el sitio de unión que

25 se une específicamente a la diana de la superficie celular y los sitios de unión que participan en la función efectora. Los sitios de unión a antígeno que se unen a uno o más antígenos pueden estar presentados por la región CDR o cualquier otra estructura de unión al receptor natural, o estar introducidos en una región bucle estructural de un dominio de anticuerpo, de una estructura de dominio variable o constante. Los antígenos que se usan para analizar las propiedades de unión de los sitios de unión pueden ser moléculas de origen natural o moléculas sintetizadas químicamente o moléculas recombinantes, bien en solución o en suspensión, por ejemplo, localizadas sobre o en partículas tales como fases sólidas, sobre o en células o sobre superficies virales. Se prefiere que la unión de una inmunoglobulina a un antígeno se determine cuando el antígeno todavía está adherido o unido a moléculas y estructuras en el contexto natural. De este modo, es posible identificar y obtener esas inmunoglobulinas modificadas que son más adecuadas para el fin del uso diagnóstico o terapéutico.

35 El anticuerpo modular o los dominios de inmunoglobulina pueden modificarse (como se usa en el presente documento, los términos inmunoglobulina y anticuerpo son intercambiables), efectuándose dichas modificaciones preferentemente en dominios de inmunoglobulina o partes de los mismos que son secuencias terminales, preferentemente una secuencia C-terminal, y/o parte de una región bucle que contiene un bucle, bien un bucle CDR o un bucle no CDR, siendo los bucles estructurales los sitios preferidos de modificaciones o mutagénesis. De acuerdo con una realización específica, la región bucle estructural también incluye una secuencia terminal, que contribuye a la unión al antígeno. En algunos casos, es preferible usar un bucle estructural modificado definido o una región bucle estructural, o partes de los mismos, como moléculas aisladas para fines de unión o combinación.

45 El anticuerpo modular puede unirse a dicha diana de la superficie celular mediante al menos parte de un bucle estructural y/o un bucle CDR.

Como alternativa, el anticuerpo modular puede unirse a dicho ligando efector, o un ligando sustituto para dicho ligando efector, como la proteína A, a través de al menos parte de un bucle estructural y/o bucle CDR, mediando de este modo en la función efectora.

En una realización preferida, el agente de unión se une a su estructura de unión nativa o modificada o sitio de unión recién formado, específicamente a al menos dos de estos epítopos que son idénticos o difieren entre sí, bien del mismo antígeno o de diferentes antígenos.

55 En una estructura de dominio preferida de un agente de unión, se prefiere modificar o aleatorizar el anticuerpo modular dentro de al menos una región bucle o región terminal, obteniéndose como resultado una sustitución, deleción y/o inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, preferentemente una mutación puntual, o incluso el intercambio de bucles enteros, más preferentemente el cambio de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, hasta 30 aminoácidos. De este modo, la secuencia modificada comprende aminoácidos no incluidos en las regiones conservadas de los bucles, siendo los aminoácidos recién introducidos de origen natural, pero extraños al sitio de modificación, o sustitutos de los aminoácidos de origen natural.

Sin embargo, el número máximo de aminoácidos insertados en una región bucle de un agente de unión puede,

65 preferentemente, no superar el número 30, preferentemente 25, más preferentemente 20 aminoácidos como máximo. La sustitución y la inserción de los aminoácidos se produce, preferentemente, de forma aleatoria o semialeatoria

usando todos los posibles aminoácidos o una selección de aminoácidos preferidos para fines de aleatorización, mediante métodos conocidos en la técnica y como se desvela en la presente solicitud de patente.

El sitio de modificación puede estar en un bucle único específico o una región bucle, en particular, un bucle estructural

5 o una región bucle estructural. Una región bucle normalmente está compuesta por al menos dos, preferentemente al menos 3 o al menos 4 bucles que son adyacentes entre sí, y que pueden contribuir a la unión de un antígeno a través de la formación de un sitio de unión a antígeno o cavidad de unión a antígeno. Se prefiere que dichos uno o más sitios de modificación se localicen dentro del área de 10 aminoácidos, más preferentemente en 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 hasta 100 aminoácidos, en particular dentro de una región estructural para formar una superficie o cavidad en la que el antígeno puede acceder estéricamente a las regiones bucle.

A este respecto, las modificaciones preferidas se someten a ingeniería en las regiones bucle de CH1, CH2, CH3 y CH4, en particular en el intervalo de los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25 a 39, los aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 89 a 103 y los aminoácidos 106 a 117, o dentro de las secuencias terminales,

15 preferentemente dentro de 6 aminoácidos desde los extremos C o N del dominio de anticuerpo modular.

En otra realización preferida, una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 92 a 98 se combina con una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 8 a 20.

Las regiones de los aminoácidos identificados anteriormente de las respectivas inmunoglobulinas comprenden regiones bucle a modificar. Preferentemente, una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 92 a 98 se combina con una modificación en uno o más de los otros bucles estructurales.

En una realización preferida, una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 92 a 98 25 se combina con una modificación en la región bucle estructural que comprende los aminoácidos 41 a 45,2.

Lo más preferentemente, cada uno de los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 92 a 98, los aminoácidos 41 a 45,2 y los aminoácidos 8 a 20, contiene al menos una modificación de aminoácido.

En otra realización preferida, cada uno de los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 92 a 98, los aminoácidos 41 a 45,2, y los aminoácidos 8 a 20, contiene al menos una modificación de aminoácido.

De acuerdo con otra realización preferida, los restos de aminoácido en el área de las posiciones 15 a 17, 29 a 34, 41 a 45,2, 84 a 85, 92 a 100 y/o de 108 a 115 de CH3 están modificados.

35 Las modificaciones preferidas de Igk-C e Igl-C de origen humano se modifican por ingeniería en las regiones bucle en al área de los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 26 a 36, los aminoácidos 41 a 82, los aminoácidos 83 a 88, los aminoácidos 92 a 100, los aminoácidos 107 a 124 y los aminoácidos 123 a 126, o dentro de las secuencias terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos desde los extremos C o N del dominio de anticuerpo.

Las modificaciones preferidas de las regiones bucle de Igk-C e Igl-C de origen murino se modifican por ingeniería en los sitios en el área de los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 26 a 36, los aminoácidos 43 a 79, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 90 a 101, los aminoácidos 108 a 116 y los aminoácidos 122 a 126.

45 Otra inmunoglobulina que se puede usar como agente terapéutico consiste en un dominio variable de una cadena pesada o ligera, o una parte del mismo que incluye un minidominio, con al menos una región bucle, preferentemente una región bucle estructural, y se caracteriza porque dicha al menos una región bucle comprende al menos una modificación de aminoácidos que forma al menos una región bucle modificada, en el que dicho al menos una región bucle modificada forma un sitio de unión relevante como se ha descrito en lo que antecede.

De acuerdo con una realización específica, la inmunoglobulina puede contener una modificación dentro del dominio variable, que se selecciona del grupo de VH, Vkappa, Vlambda, VHH y combinaciones de los mismos. Más específicamente, comprende al menos una modificación dentro de los aminoácidos 7 a 22, los aminoácidos 39 a 55, los aminoácidos 66 a 79, los aminoácidos 77 a 89 y los aminoácidos 89 a 104, en los que la numeración de la posición

55 de los aminoácidos de los dominios es la del IMGT o dentro de las secuencias terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos de los extremos C o N del dominio de anticuerpo.

La inmunoglobulina se puede caracterizar por que las regiones bucle de VH o Vkappa o Vlambda de origen humano comprenden al menos una modificación dentro de los aminoácidos 7 a 22, los aminoácidos 43 a 51, los aminoácidos 67 a 77, los aminoácidos 77 a 88, y los aminoácidos 89 a 104, aún más preferentemente las posiciones de aminoácidos 12 a 17, las posiciones de aminoácidos 45 a 50, las posiciones de aminoácidos 68 a 77, los aminoácidos 79 a 88, y las posiciones de aminoácidos 92 a 99, en los que la numeración de la posición de los aminoácidos de los dominios es la del IMGT.

65 Las regiones bucles estructurales del dominio variable de la inmunoglobulina de origen humano, como posibles seleccionadas para fines de modificación, se localizan, preferentemente, en el área de los aminoácidos 8 a 20, los

aminoácidos 44 a 50, los aminoácidos 67 a 76, los aminoácidos 78 a 87, y los aminoácidos 89 a 101, o dentro de las secuencias terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos de los extremos C o N del dominio de anticuerpo.

De acuerdo con una realización preferida, las regiones bucle estructurales del dominio variable de la inmunoglobulina

5 de origen murino como posibles seleccionadas para fines de modificación se localizan, preferentemente, en el área de los aminoácidos 6 a 20, los aminoácidos 43 a 52, los aminoácidos 67 a 79, los aminoácidos 79 a 87, y los aminoácidos 91 a 100, o dentro de las secuencias terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos de los extremos C o N del dominio de anticuerpo modular.

La inmunoglobulina usada como agente terapéutico también puede ser de origen camélido. Los anticuerpos de camélidos comprenden únicamente una cadena pesada y tienen la misma afinidad por el antígeno que los anticuerpos normales que consisten en cadenas ligeras y pesadas. En consecuencia, los anticuerpos de camélidos son mucho más pequeños que, por ejemplo, los anticuerpos humanos, lo cual les permite penetrar en los tejidos densos para alcanzar el antígeno, donde las proteínas más grandes no pueden. Además de la simplicidad comparativa, la elevada

15 afinidad y especificidad y el potencial para alcanzar e interaccionar con los sitios activos, los anticuerpos de cadena pesada de camélidos presentan ventajas sobre los anticuerpos habituales en el diseño, producción y aplicación de los compuestos clínicamente valiosos.

Las regiones bucles estructurales de un anticuerpo modular o una inmunoglobulina de origen camélido se pueden modificar, por ejemplo, dentro de una VHH en la región de los aminoácidos 7 a 19, los aminoácidos 43 a 55, los aminoácidos 68 a 76, los aminoácidos 80 a 87 y los aminoácidos 91 a 101, o dentro de las secuencias terminales, preferentemente dentro de 6 aminoácidos desde los extremos C o N del dominio de anticuerpo.

El método preferido de producir un anticuerpo modular se refiere a la modificación por ingeniería de un anticuerpo

25 modular que se une específicamente a al menos un primer epítopo, que comprende modificaciones en cada uno de al menos dos sitios o bucles dentro de una región bucle estructural, y determinar la unión específica de dicha región bucle estructural a al menos un segundo epítopo, en el que la región bucle estructural sin modificar (región no CDR) no se une específicamente a dicho al menos un segundo epítopo. Por lo tanto, un anticuerpo o estructura de unión a antígeno para un primer antígeno se puede mejorar añadiendo otra valencia o especificidad contra un segundo antígeno, donde la especificidad puede ser idéntica, ya sea frente a diferentes epítopos o frente al mismo epítopo, para aumentar la valencia o para obtener moléculas oligo- o multiespecíficas.

Por otro lado, se prefiere hacer uso de los anticuerpos modulares que contienen estructuras nativas que interaccionan con moléculas efectoras o células inmunitarias, preferentemente para unirse a un ligando efector. Dichas estructuras

35 nativas permanecen sin modificar o se modulan para conseguir una función efectora incrementada. Se ha descrito que los sitios de unión para, por ejemplo, receptores Fc, se localizan en una región de dominio CH2 y/o H3 y pueden mutagenizarse mediante técnicas bien conocidas.

La ADCC, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, es la destrucción de células diana recubiertas por anticuerpos por células con receptores Fc que reconocen la región constante del anticuerpo unido. La mayor parte de la ADCC está mediada por las células NK que tienen el receptor Fc FcgammaRIII o CD16 sobre su superficie. Los ensayos típicos usan células diana, tales como células Ramos, incubadas con anticuerpos diluidos en serie antes de la adición de células efectoras recién aisladas. El ensayo ADCC se incuba después durante varias horas y se detecta el % de citotoxicidad. Normalmente, la proporción diana:efectores es de aproximadamente 1:16 pero puede ser de 1:1 a

45 1:50.

La citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) es un mecanismo de matar células en el que el anticuerpo unido a la superficie de la célula diana fija el complemento, lo que tiene como resultado un ensamblaje del complejo de ataque a la membrana que perfora orificios en la membrana de la célula diana, lo cual tiene como resultado la lisis celular posterior. El ensayo CDC de uso habitual sigue el mismo procedimiento que para la determinación de ADCC, sin embargo, conteniendo el complemento suero en lugar de células efectoras.

Se ha probado la actividad citotóxica determinada mediante ADCC y CDC para un anticuerpo modular de acuerdo con la invención, si existe un incremento significativo en el porcentaje de citolisis en comparación con un control. La

55 actividad citotóxica relacionada con la ADCC o CDC se mide, preferentemente, como el incremento de porcentaje absoluto, que es, preferentemente, superior al 5 %, más preferentemente superior al 10 %, e incluso más preferentemente superior al 20 %.

La fagocitosis celular dependiente de anticuerpos, ADCP, en ocasiones denominada ADPC, normalmente se investiga junto con la citolisis de células humanas cultivadas. La fagocitosis por los fagocitos, normalmente monocitos humanos

o macrófagos derivados de monocitos, mediada por un anticuerpo, se puede determinar del siguiente modo. Los monocitos purificados se pueden cultivar con citocinas para potenciar la expresión de los FcyR o para inducir la diferenciación en macrófagos. Los ensayos de ADCP y ADCC se realizan después con las células diana. La fagocitosis se determina como el porcentaje de células positivas medidas mediante citometría de flujo. La actividad de

65 ADCP positiva se demuestra con una captación significativa del complejo anticuerpo-antígeno mediante los fagocitos. La actividad citotóxica relacionada con la ADCP se mide, preferentemente, como el porcentaje absoluto de la

captación del complejo antígeno-anticuerpo mediante los fagocitos, que es, preferentemente, superior al 5 %, más preferentemente superior al 10 % e incluso más preferentemente superior al 20 %.

En un ensayo típico, los PBMC o monocitos o macrófagos derivados de monocitos se suspenden en medio RF2 (RPMI

5 1640 suplementado con 2 % de FCS) en placas de 96 pocillos a una concentración de 1 x 105 células viables en 100 ml/pocillo. Las células diana adecuadas, que expresan el antígeno diana, por ejemplo, antígeno Her2/neu y células SKBR3, se tiñen con colorante fluorescente verde PKH2. Después, 1 x 104 células diana marcadas con PKH2 y un anticuerpo (IgG1) específico de Her2 (o anticuerpo modular) o isotipo de IgG1 de ratón como control (o anticuerpo modular de control) se añaden al pocillo de PBMC a concentraciones diferentes (p. ej., 1-100 mg/ml) y se incuban en

10 un volumen final de 200 ml a 37 ºC durante 24 horas. Tras la incubación, los PBMC o monocitos o macrófagos derivados de monocitos y las células diana se recogen con EDTA-PBS y se transfieren a placas de 96 pocillos de fondo en V. Las placas se centrifugan y se aspira el sobrenadante. Las células se contratiñen con una mezcla de 100 ml de anti-CD11 b, anti-CD14 e IgG humana conjugados con RPE, se mezclan y se incuban durante 60 minutos en hielo. Las células se lavan y se fijan con 2 % de formaldehído-PBS. Se realiza un análisis citométrico de flujo con dos colores con,

15 por ejemplo, FACS Calibur en acotamiento óptimo. Las células diana marcadas con PKH2 (verde) se detectan en el canal FL-1 (longitud de onda de emisión, 530 nm) y los PBMC o monocitos marcados con RPE o macrófagos derivados de monocitos (rojo) se detectan en el canal FL-2 (longitud de onda de emisión, 575 nm). Las células diana residuales se definen como células que son células marcadas doblemente PKH2+/RPE(PKH2+/RPE) y se considera que representan la fagocitosis de las dianas por PBMC o monocitos o macrófagos derivados de monocitos. La

20 fagocitosis de las células diana se calcula con la ecuación siguiente: porcentaje de fagocitosis = 100x [(porcentaje de dobles positivas)/(porcentaje de dobles positivas + porcentaje de dianas residuales)]. Todas las pruebas normalmente se realizan por duplicado o por triplicado y los resultados se expresan como la media 6 SD.

La actividad apoptótica se mide, preferentemente, usando métodos estándar de determinación de las células

25 moribundas o muertas. Con el fin de medir la necrosis y la apoptosis, se pueden usar ensayos de citotoxicidad. Estos ensayos pueden ser ensayos radiactivos y no radiactivos que miden incrementos en la permeabilidad de la membrana plasmática, ya que las células moribundas presentan fugas, o ensayos colorimétricos que miden la reducción de la actividad metabólica de las mitocondrias; las mitocondrias en las células muertas no pueden metabolizar los colorantes, mientras que las mitocondrias de las células vivas sí pueden.

30 También se pueden medir indicadores tempranos de la apoptosis, tales como la fragmentación del ADN en poblaciones de células o en células individuales, en los que el ADN apoptótico se rompe en piezas de diferente longitud, las alteraciones en la asimetría de la membrana (ensayos basados en fosfatidil serina y anexina V), medición de la activación de las caspasas apoptóticas o medición de la liberación del citocromo C y AIF en el citoplasma por las

35 mitocondrias.

La actividad citotóxica preferida del anticuerpo modular de acuerdo con la invención constituye al menos el 20 % de la citolisis, medida en un respectivo ensayo de lisis celular ex vivo.

40 Preferentemente, la actividad citotóxica del anticuerpo modular de acuerdo con la invención es mediar en la lisis celular

o en la muerte celular en un ensayo basado en células con una CE50<108 M, preferentemente en el intervalo nanomolar o inferior.

La función efectora del anticuerpo modular de acuerdo con la invención es, preferentemente, una actividad citotóxica

45 biológica, que normalmente difiere de cualquier actividad citotóxica sintética, por ejemplo, como se proporciona mediante una toxina que puede estar conjugada a una estructura de inmunoglobulina. Las toxinas normalmente no activan las moléculas efectoras y el mecanismo de defensa biológica. Por lo tanto, la actividad citotóxica preferida de los anticuerpos modulares de acuerdo con la invención es una actividad citotóxica biológica, que normalmente es inmunoestimulante, lo que conduce a una citolisis eficaz.

50 La actividad citotóxica se diferencia además del simple efecto de inhibición celular en que una sustancia está inhibiendo el crecimiento celular, por ejemplo, uniéndose al receptor de un factor de crecimiento, de modo que se bloquea la función del factor de crecimiento, o inhibiendo la angiogénesis. La citotoxicidad se considera esencialmente un ataque activo para matar células, lo que conduce a la muerte o lisis celular y, por lo tanto, se considera una forma

55 altamente eficiente para reducir inmediatamente el número de células malignas o infectadas. En comparación con los compuestos citotóxicos, los inhibidores del crecimiento celular no matan las células inmediatamente, sino que únicamente reducen el crecimiento y la proliferación celular, por lo que se consideran menos activos para fines terapéuticos.

60 El anticuerpo modular puede unirse específicamente a cualquier tipo de moléculas o estructuras de unión, en particular a antígenos, moléculas proteicas, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, carbohidratos, lípidos, moléculas orgánicas, en particular moléculas orgánicas pequeñas, moléculas anorgánicas, o combinaciones o fusiones de los mismos, incluyendo PEG, profármacos o fármacos. El anticuerpo modular puede comprender al menos dos bucles o regiones bucle en las que cada uno de los bucles o regiones bucle puede unirse específicamente a

65 diferentes moléculas o epítopos.

Preferentemente, el antígeno diana se selecciona de antígenos de la superficie celular, incluyendo receptores, en particular del grupo que consiste en las tirosinas quinasas receptoras de erbB (tales como EGFR, HER2, HER3 y HER4, en particular los epítopos de los dominios extracelulares de dichos receptores, p. ej.., el epítopo 4D5), moléculas de la superfamilia del receptor del TNF, tales como el receptor de Apo-1, TNFR1, TNFR2, el receptor del

5 factor de crecimiento nervioso NGFR, CD40, moléculas de la superficie de los linfocitos T, receptores de linfocitos T, antígeno OX40 de los linfocitos T, receptor TACI, BCMA, Apo-3, DR4, DR5, DR6, receptores señuelo tales como DcR1, DcR2, CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, pero no se limitan a estas moléculas, antígenos de la superficie de los linfocitos B, tales como CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, antígenos o marcadores de tumores sólidos o células cancerosas hematológicas, células de linfoma o leucemia, otras células sanguíneas, incluyendo plaquetas, pero no se limitan a estas moléculas.

De acuerdo con una realización preferida adicional, el antígeno diana se selecciona de los antígenos presentados por las células, como células epiteliales, células de tumores sólidos, células infectadas células sanguíneas, células presentadoras de antígeno y células mononucleares. Dichos antígenos diana expresados y sobreexpresados por las 15 células están preferentemente dirigidos y que se seleccionan del grupo que consiste en antígenos asociados a tumores, en particular EpCAM, glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), antígeno asociado a tumores CA 125, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno asociado con el melanoma de peso molecular alto (HMW-MAA), antígeno asociado a tumores que expresa hidratos de carbono relacionados con cuerpos de Lewy, antígeno carcinoembrionario (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, MUC1 de mucina, MUC18 y antígeno asociado con tumores de citoqueratina, antígenos bacterianos, antígenos víricos, alérgenos, moléculas de IgE relacionadas con la alergia, cKIT y receptor de Fc-épsilon, IRp60, receptor de IL-5, CCR3, receptor de glóbulos rojos (CR1), seroalbúmina humana, seroalbúmina de ratón, seroalbúmina de rata, receptores Fc, receptor FcRn-Fc gamma nenonatal, receptores Fc-gamma, Fc-gamma RI, Fc-gamma-RII, Fc-gamma RIII, receptores Fc-alfa, Fc épsilon, fluoresceína, lisozima, receptor 9 de tipo toll, eritropoyetina, CD2, CD3, CD3, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, 25 CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (proteína p67), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD64, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL15, IL-17, IL-18, IL-23, LIF, OSM, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, TNF alfa, TNFbeta2, TNFalfa, TNF alfa beta, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1 BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, receptor 1 de TRAIL, receptor A1 de adenosina, receptor beta de linfotoxinas, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, integrina beta1, integrina beta1, integrina alfa-4/beta 7, integrina alfa 2, integrina alfa 3, integrina alfa 4, integrina alfa 5, integrina alfa 6, integrina alfa v, integrina alfa V beta 3, FGFR-3, Factor de crecimiento de queratinocitos, GM-CSF, M-CSF, RANKL, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-Id, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de linfocitos T B7-1, B7-2, integrina VNR, TGF beta 1, TGF beta 2, eotaxinl, BLyS (estimulador de los linfocitos B), complemento C5, IgE, IgA, IgD, IgM, IgG, factor VII, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), factor tisular,

35 VEGF, VEGFR, receptor de la endotelina, VLA-4, hidratos de carbono, tales como los antígenos del grupo sanguíneo e hidratos de carbono relacionados, glicosilación de Galili, Gastrina, receptores de la gastrina, hidratos de carbono asociados con tumores, protección NP o protección NIP de hapteno, receptor alfa/beta de linfocitos T, E-selectina, P-glicoproteína, MRP3, MRP5, glutatión-S-transferasa pi (proteínas de resistencia a múltiples fármacos), proteína de la membrana de gránulos alfa (GMP) 140, digoxina, fosfatasa alcalina de la placenta (PLAP) y fosfatasa alcalina de tipo PLAP testicular, receptor de la transferrina, Heparanasa I, miosina cardíaca humana, Glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), glicoproteína de la cubierta de gH del citomegalovirus humano (HCMV), gp120 del VIH, HCMV, virus sincitial respiratorio, RSVF, Fgp del RSVF, integrina VNR, gp120 de Hep B, CMV, gpIIbIIIa, bucle V3 de gp120 de HIV IIIB, Fgp del virus sincitial respiratorio (RSV), glicoproteína gD del virus del herpes simple (VHS) glicoproteína gB del VHS, glicoproteína de la cubierta gB del HCMV, toxina de Clostridium perfringens y fragmentos de la misma.

45 Los anticuerpos modulares se pueden unir a dicho antígeno diana con una afinidad elevada, en particular con una constante de asociación alta y/o de disociación baja, o una avidez alta por la unión. Normalmente, se considera que un ligante tiene una afinidad elevada con una Kd<109 M. Se pueden preparar agentes de unión de afinidad media con una Kd inferior a 106 hasta 109, preferentemente junto con un proceso de maduración de la afinidad.

La maduración de la afinidad es el proceso por el cual se producen anticuerpos con una mayor afinidad por el antígeno. Con cambios estructurales de un anticuerpo, incluyendo mutagénesis de aminoácidos o como consecuencia de la mutación somática en los segmentos génicos de la inmunoglobulina, se producen variantes de un sitio de unión a un antígeno y se seleccionan las afinidades mayores. Los anticuerpos modulares de afinidad madurada pueden exhibir

55 una afinidad mayor que un anticuerpo parental. Los anticuerpos parentales individuales se pueden someter a maduración de la afinidad. Como alternativa, conjuntos de anticuerpos modulares con una afinidad de unión similar al antígeno diana se pueden considerar estructuras parentales que varían para obtener anticuerpos individuales de afinidad madurada o conjuntos de dichos anticuerpos con afinidad madurada.

La variante de afinidad madurada preferida de un anticuerpo modular exhibe al menos un incremento por 10 en la afinidad de la unión, preferentemente un aumento de al menos 100 veces. La maduración de la afinidad se puede usar en el transcurso de las campañas de selección que usan las respectivas bibliotecas de moléculas parentales, bien con anticuerpos modulares con una afinidad de unión media para obtener el anticuerpo modular de la invención que tiene la propiedad de unión a la diana específica de una afinidad de unión Kd<108 M y, opcionalmente, una potencia de 65 CI50<108 M. Como alternativa, la potencia de unión o afinidad se puede aumentar todavía más mediante la maduración de la afinidad del anticuerpo modular de acuerdo con la invención para obtener los elevados valores

correspondientes a una Kd o CI50 inferior a 109 M, preferentemente menor de 1010 M o incluso menor de 1011 M, lo más preferido, en el intervalo picomolar.

La CI50, también denominada CE50 o concentración de saturación al 50 %, es una medida de la potencia de unión de

5 un anticuerpo modular. Es la concentración molar de un ligante, que produce el 50 % de la unión máxima posible en el equilibrio o en saturación. La potencia de un ligante suele estar definida por su CI50 (en el presente documento se entiende como un valor de CE50). Esto se puede calcular para un ligante dado determinando la concentración de ligante necesaria para provocar la mitad de la saturación de la unión máxima. Determinar un valor de CI50 o CE50 es útil para comparar la potencia de los anticuerpos o variantes de anticuerpos con eficacias similares, en particular, cuando se determina en ensayos de unión de saturación, no en ensayos competitivos.

En este caso, se considera la concentración que determina la concentración en plasma para obtener un efecto semimáximo (50 %) in vivo. Cuanto menor es la CI50 o la CE50, mayor es la potencia del anticuerpo modular y menor es la concentración del anticuerpo necesaria para inhibir la respuesta biológica máxima, tal como la función efectora o

15 la actividad citotóxica, Las concentraciones más bajas de anticuerpos también se pueden asociar con menores efectos secundarios.

La afinidad de unión de un anticuerpo normalmente se caracteriza en términos de la concentración del anticuerpo a la cual están ocupados la mitad de los sitios de unión a antígeno, conocida como la constante de disociación (Kd, o Kd).

Normalmente, la afinidad de un anticuerpo se correlaciona bien con la CI50, cuando se determina en un ensayo de unión de saturación. La afinidad de un antagonista por su sitio de unión (Ki) se entiende como su capacidad para unirse a un receptor, que determina la duración de la unión y la respectiva actividad agonista. Las medidas para aumentar la afinidad mediante maduración de la afinidad normalmente también aumentan la potencia de la unión, lo que tiene

25 como resultado la correspondiente reducción de los valores de CI50 en el mismo intervalo de los valores de Kd.

Los valores de CI50 y Kd se pueden determinar usando los ensayos de unión de saturación bien conocidos en la técnica. Al contrario que los ensayos de competición, los ensayos de unión de saturación proporcionan un valor independiente de la concentración de un competidor y, por lo tanto, un valor comparable que puede ser indicativo de la afinidad de unión in vivo.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención se conjuga, preferentemente, con una molécula marcadora o indicadora seleccionada del grupo que consiste en moléculas orgánicas, marcadores enzimáticos, marcadores radiactivos, marcadores coloreados, marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, marcadores

35 luminiscentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complejos metálicos, metales, oro coloidal y mezclas de los mismos. Se pueden usar inmunoglobulinas modificadas conjugadas con moléculas marcadoras o indicadoras, por ejemplo, en sistemas de ensayo o métodos diagnósticos.

El anticuerpo modular de acuerdo con la invención se puede conjugar con otras moléculas que permiten la simple detección de dicho conjugado en, por ejemplo, ensayos de unión (p. ej., ELISA) y estudios de unión.

En una realización preferida, las variantes de anticuerpo se someten a detección selectiva usando uno o más ensayos basados en células o in vivo. Para dichos ensayos, las inmunoglobulinas modificadas purificadas o sin purificar normalmente se añaden exógenamente de un modo tal que las células se exponen a inmunoglobulinas individuales o 45 conjuntos de inmunoglobulinas que pertenecen a una biblioteca. Estos ensayos normalmente se basan, aunque no siempre, en la función de la inmunoglobulina; es decir, la capacidad del anticuerpo para unirse a su diana y participar en algún acontecimiento bioquímico, por ejemplo, función efectora, inhibición de la unión ligando/receptor, apoptosis, y similares. Dichos ensayos a menudo implican monitorización de la respuesta de las células al anticuerpo, por ejemplo, la supervivencia celular, la muerte celular, cambio en la morfología celular, o activación transcripcional, tal como expresión celular de un gen natural o gen indicador. Por ejemplo, dichos ensayos pueden medir la capacidad de las variantes de anticuerpos para producir ADCC, ADCP, CDC o actividad apoptótica. Para algunos ensayos, puede ser necesario añadir células o componentes adicionales, es decir además de las células diana, por ejemplo, complemento sérico, o células efectoras tales como monocitos de sangre periférica (PBMC), células NK, macrófagos, y similares. Dichas células adicionales pueden proceder de cualquier organismo, preferentemente seres humanos, ratones, rata,

55 conejo y monos. Los anticuerpos modulares pueden producir apoptosis de determinadas líneas celulares que expresan la diana o pueden mediar en el ataque sobre las células diana por células inmunitarias que se han añadido al ensayo. Los métodos para monitorizar la muerte celular o la viabilidad celular son conocidos en la técnica e incluyen el uso de colorantes, reactivos inmunoquímicos, citoquímicos, y radiactivos. Por ejemplo, los ensayos de tinción de la caspasa pueden permitir medir la apoptosis, y la captación o liberación de sustratos radiactivos o colorantes fluorescentes, tales como azul alamar, pueden permitir la monitorización del crecimiento activación celular.

En una realización preferida, se puede usar el ensayo de citotoxicidad basado en DELFIART EuTDA (Perkin Elmer, MA). Como alternativa, las células muertas o dañadas se pueden monitorizar midiendo la liberación de uno o más componentes intracelulares naturales, por ejemplo, lactato deshidrogenasa.

65 La activación de la transcripción también puede servir como método para analizar la función en ensayos basados en

células. En este caso, la respuesta se puede monitorizar analizando los genes naturales o inmunoglobulinas que pueden regularse por aumento, por ejemplo, se puede medir la liberación de determinadas interleucinas o, como alternativa, la lectura se puede realizar a través de una construcción indicadora. Los ensayos basados en células también pueden implicar la medida de cambios morfológicos de las células como respuesta a la presencia de

5 anticuerpos modulares. Los tipos de células para dichos ensayos pueden ser células procariotas o eucariotas, y se puede usar diversas líneas celulares conocidas en la técnica. Como alternativa, la detección selectiva basada en células se realiza usando células que se han transformado o transfectado con ácidos nucleicos que codifican las variantes. Esto es, las variantes de anticuerpos no se añaden exógenamente a las células. Por ejemplo, en una realización, la detección selectiva basada en células usa expresión en superficie celular. Se puede usar una pareja de fusión que permita expresar inmunoglobulinas modificadas sobre la superficie celular (Witrrup, 2001) Curr Opin Biotechnol, 12:395-399).

En una realización preferida, la inmunogenicidad de los anticuerpos modulares se puede determinar experimentalmente usando uno o más ensayos basados en células. En una realización preferida, se usan ensayos de

15 activación ex vivo de linfocitos T para cuantificar experimentalmente la inmunogenicidad. En este método, las células presentadoras de antígeno y los linfocitos T nativos de donantes equivalentes se exponen a un péptido o a un anticuerpo entero de interés una o más veces. Después, la activación de los linfocitos T se puede detectar usando una serie de métodos, por ejemplo, mediante monitorización de la producción de citocinas o midiendo la captación de timidina tritiada. En la realización más preferida, la producción de interferón gamma se monitoriza usando ensayos ELISPOT.

Las propiedades biológicas del anticuerpo modular de acuerdo con la invención se pueden caracterizar in vivo en experimentos con tejido, y organismos enteros. Como se conoce en la técnica, los fármacos a menudo se analizan in vivo en animales, incluyendo, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, con el fin de medir la 25 eficacia de un fármaco para el tratamiento contra una enfermedad o modelo de enfermedad, o medir la farmacocinética, la farmacodinámica, la toxicidad, y otras propiedades de un fármaco. Se puede hacer referencia a los animales como modelos de enfermedad. A menudo, los agentes terapéuticos se prueban en ratones, incluyendo, entre otros, ratones atímicos, ratones SCID, ratones con xenoinjertos y ratones transgénicos (incluyendo activados e inactivados). Dicha experimentación puede proporcionar datos significativos para la determinación del potencial del anticuerpo a usar como agente terapéutico con la semivida adecuada, función efectora, actividad apoptótica y actividad citotóxica o citolítica adecuadas. Cualquier organismo, preferentemente mamíferos, se puede usar para las pruebas. Por ejemplo, debido a su similitud genética con los seres humanos, primates, los monos pueden ser modelos terapéuticos adecuados y, por lo tanto, se pueden usar para probar la eficacia y la toxicidad, la farmacocinética, la farmacodinámica, la semivida, u otra propiedad del anticuerpo modular de acuerdo con la invención. Las pruebas de

35 las sustancias en seres humanos son necesarias, en última instancia, para la aprobación de los fármacos y, por lo tanto, por supuesto, se contemplan estos experimentos. Por consiguiente, los anticuerpos modulares de la presente invención se pueden analizar en seres humanos para determinar su eficacia terapéutica, de la toxicidad, la inmunogenicidad, la farmacocinética, y/u otras propiedades clínicas. Especialmente, los anticuerpos modulares que se unen a células únicas o a un complejo celular a través de al menos dos motivos de unión, preferentemente la unión de al menos tres estructuras con reticulación con las células diana, se considerarían eficaces en la actividad efectora o la actividad preapoptótica o apoptótica tras la reticulación y dirección celular. La unión multivalente proporciona una asociación relativamente grande de las parejas de unión, también denominada reticulación, que es un requisito previo para la apoptosis y la muerte celular.

45 El anticuerpo modular de la presente invención puede encontrar uso en una amplia gama de productos de anticuerpos. En una realización, el anticuerpo modular de la presente invención se usa para terapia o profilaxis, por ejemplo, como inmunoterapia activa o pasiva, para uso preparativo, industrial o analítico, como compuesto diagnóstico, industrial o reactivo de investigación, preferentemente como un agente terapéutico. El anticuerpo modular puede encontrar uso en una composición de anticuerpo que es monoclonal o policlonal. En una realización preferida, los anticuerpos modulares de la presente invención se usan para capturar o matar células diana que portan el antígeno diana, por ejemplo, células cancerosas. En una realización alternativa, los anticuerpos modulares de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar el antígeno diana, por ejemplo, antagonizando una citocina o receptor de citocinas.

55 En una realización preferida alternativa, los anticuerpos modulares de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar los factores de crecimiento o receptores de factores de crecimiento y, de este modo, mediar en la muerte de las células diana portadoras o que necesitan el antígeno diana.

En una realización preferida alternativa, los anticuerpos modulares de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar enzimas y sustratos de enzimas.

En una realización preferida, un anticuerpo modular se administra a un paciente para tratar un trastorno específico. Un "paciente", para los fines de la presente invención, incluye seres humanos y otros animales, preferentemente mamíferos y, lo más preferentemente, seres humanos. Por "trastorno específico" se quiere decir, en el presente

65 documento, un trastorno que se puede mejorar mediante la administración de una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina modificada de la presente invención.

En una realización, un anticuerpo modular de acuerdo con la presente invención es el único agente terapéuticamente activo administrado a un paciente. Como alternativa, el anticuerpo modular de acuerdo con la presente invención se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos, incluyendo, entre otros, agentes citotóxicos, agentes 5 quimioterapéuticos, citocinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes antihormonales, inhibidores de la quinasa, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores, u otros agentes terapéuticos. El anticuerpo modular se puede administrar de forma concomitante con uno o más de otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, un anticuerpo modular de la presente invención se puede administrar al paciente junto con quimioterapia, radioterapia, o tanto quimioterapia como radioterapia. En una realización, el anticuerpo modular de acuerdo con la presente invención se puede administrar en combinación con uno o más anticuerpos, que pueden o no comprender un anticuerpo modular de la presente invención. De acuerdo con otra forma de realización de la invención, el anticuerpo modular de la presente invención y una o más terapias anticancerosas se usan para tratar las células cancerosas ex vivo. Se contempla que dicho tratamiento ex vivo puede ser útil en el trasplante de médula ósea y, en particular, trasplante autólogo de médula ósea. Por supuesto, se contempla que los anticuerpos de la invención se puedan usar en combinación con otras

15 técnicas terapéuticas más, tales como cirugía.

Otros diversos agentes terapéuticos pueden encontrar uso para la administración con el anticuerpo modular de la presente invención. En una realización, el anticuerpo modular se administra con un agente antiangiogénico, que es un compuesto que bloquea, o interfiere en algún grado con el desarrollo de vasos sanguíneos. El factor antiangiogénico puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo, un anticuerpo, una molécula de fusión Fc

o citocina, que se une a un factor de crecimiento o receptor de factor de crecimiento implicado en la estimulación de la angiogénesis. El factor antiangiogénico preferido en el presente documento es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En una realización alternativa, el anticuerpo modular se administra con un agente terapéutico que induce o potencia la respuesta inmunológica adaptativa, por ejemplo, un anticuerpo dirigido a

25 CTLA-4. En una realización alternativa, la inmunoglobulina modificada se administra con un inhibidor de la tirosina quinasa, que es una molécula que inhibe en cierta medida la actividad tirosina quinasa de una tirosina quinasa. En una realización alternativa, el anticuerpo modular de la presente invención se administra con una citocina. Por "citocina", como se usa en el presente documento, se quiere decir un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa en otra célula como mediadores intercelulares, incluyendo quimiocinas.

Se contemplan composiciones farmacéuticas en las que se formulan los anticuerpos modulares de la presente invención y uno o más agentes terapéuticamente activos. Las formulaciones estables de los anticuerpos modulares de la presente invención se preparan para almacenar mezclando dicha inmunoglobulina que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales, en forma de

35 formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son, preferentemente, estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles u otros métodos. El anticuerpo modular y otros agentes terapéuticamente activos desvelados en el presente documento también se pueden formular como inmunoliposomas y/o encerrarse en microcápsulas.

La administración de la composición farmacéutica que comprende un anticuerpo modular de la presente invención, preferentemente en forma de una solución acuosa estéril, puede realizarse de varios modos, incluyendo, pero sin limitación, las vías oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, mucosal, tópica (p. ej., geles, ungüentos, lociones, cremas, etc.), intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar (p. ej., tecnología de inhalación AERx™ disponible en el mercado en Aradigm, o sistema de liberación pulmonar Inhance™ disponible en el mercado

45 en Inhale Therapeutics), vaginal, parenteral, rectal, o intraocular.

Los anticuerpos modulares se pueden modificar mediante un método de mutagénesis para obtener un nuevo sitio de unión. La mutagénesis preferida se refiere a técnicas de aleatorización, en las que la secuencia de aminoácidos de un péptido o polipéptido está mutada al menos en una posición, por tanto, se obtiene una secuencia aleatorizada, que participa en la unión a antígeno. Por ejemplo, las secuencias de anticuerpo específicas se modifican de forma aleatoria para obtener una molécula de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina, dominios de inmunoglobulina o parte del mismo, que comprende al menos una unidad de repetición de nucleótidos, preferentemente dentro de una región de codificación de bucle estructural o dentro de una región terminal, que tiene la secuencia 5'-NNS-3', 5'-NNN-3', 5’NNB-3’ o 5’NNK-3’. En algunas realizaciones, el ácido nucleico modificado comprende codones de nucleótidos

55 seleccionados del grupo de TMT, WMT, BMT, RMC, RMG, MRT, SRC, KMT, RST, YMT, MKC, RSA, RRC, NNK, NNN, NNS o cualquier combinación de los mismos (la codificación es conforme a la IUPAC).

La modificación de la molécula de ácido nucleico puede realizarse introduciendo oligonucleótidos sintéticos en un segmento más grande de ácido nucleico o mediante la síntesis de novo de una molécula de ácido nucleico completa. La síntesis de ácido nucleico se puede realizar con bloques componentes de tres nucleótidos que reducirían el número de combinaciones de secuencias sin sentido si se va a codificar un subconjunto de aminoácidos (p. ej., Yanez et al. Nucleic Acids Res. (2004) 32:e158; Virnekas et al. Nucleic Acids Res. (1994) 22:5600-5607).

Cada dominio de unión potencial puede permanecer físicamente asociado a la molécula de ADN o de ARN completa

65 que lo codifica y, además, las proteínas de fusión oligomerizan en la superficie de un paquete genético para presentar el polipéptido de unión en la estructura oligomérica nativa y funcional. Una vez que se han identificado dominios de

unión satisfactorios, se puede obtener fácilmente el gen para fines de expresión, recombinación o ingeniería adicionales. La forma que toma dicha asociación es un "paquete genético replicable", tal como un virus, célula o espora que se replica y expresa el gen que codifica el dominio de unión, y transporta el dominio de unión a su superficie externa. Otra forma es un paquete genético replicable in vitro, tal como ribosomas que unen el ARN de

5 codificación con la proteína traducida. En la expresión en ribosomas, el material genético se replica mediante amplificación enzimática con polimerasas.

Esas células o virus de ácido nucleico portadores de los agentes de unión que reconocen la molécula diana están aisladas y, en caso necesario, amplificadas. El paquete genético es, preferentemente, el fago M14, y la proteína

10 incluye la señal de transporte a la superficie externa de la proteína génica III del M13.

El sistema de expresión preferido para las proteínas de fusión es una célula hospedadora no supresora, que sería sensible a un codón de terminación, tal como un codón de terminación ámbar y, por lo tanto, se detendría la traducción. En ausencia de dicho codón de terminación, se usan dichas células hospedadoras no supresoras, preferentemente E.

15 coli. En presencia de dicho codón de terminación, se usarían células hospedadoras supresoras.

Preferentemente, en el método, el vector o plásmido del paquete genético está bajo el control estrecho del elemento regulador de la transcripción, y las condiciones de cultivo se ajustan de forma que la cantidad o el número de partículas de vector o fagémido que muestran menos de dos copias de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula es

20 inferior a aproximadamente un 20 %. Más preferentemente, la cantidad de partículas de vector o fagémido que muestran menos de dos copias de la proteína de fusión es inferior al 10 % de la cantidad de partículas que muestran una o más copias de la proteína de fusión. Lo más preferentemente, la cantidad es inferior al 1 %.

El vector de expresión puede ser capaz de expresar un polipéptido de unión, y se puede producir del siguiente modo:

25 En primer lugar, se sintetiza una biblioteca génica de polipéptidos de unión introduciendo una pluralidad de polinucleótidos que codifican diferentes secuencias de unión. La pluralidad de polinucleótidos puede sintetizarse en una cantidad adecuada para unirse en combinación operable en un vector que se puede propagar para expresar una proteína de fusión de dicho polipéptido de unión. Como alternativa, la pluralidad de oligonucleótidos también se puede amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa para obtener suficiente material para expresión. Sin

30 embargo, esto solo sería ventajoso si el polipéptido de unión estuviera codificado por una secuencia de polinucleótidos grande, por ejemplo, mayor de 200 pares de bases o, en ocasiones, mayor de 300 pares de bases. Por lo tanto, preferentemente se forma una biblioteca sintética diversa, lista para seleccionar de dicha biblioteca diversa al menos un vector de expresión capaz de producir polipéptidos de unión que tienen la función y la propiedad de unión preseleccionada deseada, tal como especificidad.

35 La molécula de ácido nucleico modificada aleatoriamente puede comprender las unidades de repetición identificadas anteriormente, que codifican todos los aminoácidos de origen natural o un subconjunto de los mismos. Dichas bibliotecas que contienen secuencias modificadas en las que un subconjunto específico de aminoácidos se usa para fines de modificación se denominan bibliotecas "centradas". El miembro de dichas bibliotecas tiene una probabilidad

40 mayor de ser un aminoácido de dicho subconjunto en la posición modificada, que es al menos dos veces mayor de lo normal, preferentemente al menos 3 veces o incluso al menos 4 veces mayor. Dichas bibliotecas también tienen un número limitado o menor de miembros de la biblioteca, de modo que el número de miembros reales de la biblioteca alcanza el número de miembros teóricos de la biblioteca. En algunos casos, el número de miembros de biblioteca de una biblioteca objetivo no es inferior a 103 veces el número teórico, preferentemente, no inferior a 102 veces y, aún más

45 preferentemente, no inferior a 10 veces.

Normalmente, las bibliotecas comprenden al menos 10 proteínas de fusión o potenciales agentes de unión o variantes de proteínas estructurales, preferentemente al menos 100, más preferentemente al menos 1.000, más preferentemente al menos 104 , más preferentemente al menos 105 , más preferentemente al menos 106 , más

50 preferentemente al menos 107 , más preferentemente al menos 108 , más preferentemente al menos 109 , más preferentemente al menos 1010, más preferentemente al menos 1011, hasta 1012, en los casos de métodos de expresión in vitro, tal como expresión en ribosomas, es viable incluso un número más alto.

Se dispone de varias alternativas para la fabricación del gen que codifica la biblioteca aleatorizada. Es posible producir

55 el ADN mediante un enfoque completamente sintético, en el que la secuencia se divide en fragmentos solapantes que después se preparan como oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos se mezclan, y se hibridan entre sí calentando primero hasta aproximadamente 100 ºC y, después, enfriando lentamente hasta la temperatura ambiente. Después de esta etapa de hibridación, el gen ensamblado sintéticamente se puede clonar directamente o se puede amplificar mediante PCR antes de la clonación.

60 Como alternativa, se pueden usar otros métodos para la mutagénesis dirigida para la generación del inserto de la biblioteca, tal como el método de Kunkel (Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. Ene 1985; 82(2):488-92) o el método de DpnI (Weiner MP, Costa GL, Schoettlin W, Cline J, Mathur E, Bauer JC. Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by the polymerase chain reaction.

65 Gen. 30 de diciembre de 2005; 151(1-2):119-23).

Con varios fines, puede ser ventajoso introducir mutaciones silenciosas en la secuencia que codifica el inserto de la biblioteca. Por ejemplo, se pueden introducir sitios de restricción que facilitan la clonación o el intercambio modular de partes de la secuencia. Otro ejemplo para la introducción de mutaciones silenciosas es la capacidad para "marcar" bibliotecas, que significa darles un codón específico en una posición seleccionada, lo que les permite (o a los clones seleccionados derivados de los mismos), por ejemplo, ser reconocidos durante las siguientes etapas, en las que, por ejemplo, diferentes bibliotecas con diferentes características se pueden mezclar y usar como mezcla en el procedimiento de selección (panning).

Asimismo, se desvela un método para producir un oligómero de dominios de anticuerpo modular que se unen a una diana, que comprende las etapas de:

-

proporcionar una biblioteca de oligómeros de los dominios de anticuerpo modular producidos de acuerdo con el método tal como se ha descrito

-

poner en contacto dicha biblioteca con dicha diana en presencia de un ligando estructural,

-

seleccionar un miembro de la biblioteca que se una a dicha diana en presencia de un ligando estructural, y

-

fabricar una preparación del oligómero funcional.

El ligando estructural se puede seleccionar del grupo que consiste en una molécula efectora, FcRn, Proteína A, Proteína G, Proteína L y diana en CDR. Como un ejemplo, la molécula efectora se puede seleccionar del grupo que consiste en CD64, CD32, CD16 y receptores Fc.

Los oligómeros pueden ser dímeros seleccionados del grupo de VH/VL, CH1/CL, CH2/CH2, CH3/CH3, Fc y Fab, o cadenas sencillas de los mismos.

El método puede proporcionar una biblioteca que contiene al menos 102 clones independientes que expresan oligómeros funcionales de dominios de anticuerpo modular o variantes de los mismos. También se proporciona un conjunto de clones independientes preseleccionados que, por ejemplo, tiene afinidad madurada, comprendiendo el conjunto, preferentemente, al menos 10, más preferentemente al menos 100, más preferentemente al menos 1000, más preferentemente al menos 10000, incluso más preferentemente más de 100.000 clones independientes. Dichas bibliotecas, que contienen los conjuntos preseleccionados, son fuentes preferidas para seleccionar los anticuerpos modulares de alta afinidad.

Las bibliotecas como se usan de acuerdo con la invención comprenden, preferentemente, al menos 102 miembros de la biblioteca, más preferentemente, al menos 103, más preferentemente, al menos 104, más preferentemente, al menos 105 , más preferentemente al menos 106 miembros de la biblioteca, más preferentemente, al menos 107 , más preferentemente, al menos 108, más preferentemente, al menos 109, más preferentemente, al menos 1010, más preferentemente, al menos 1011, hasta 1012 miembros de una biblioteca, derivados preferentemente de una molécula parental, que es un anticuerpo modular funcional como un armazón que contiene al menos una función específica o resto de unión, y derivados de los mismos para obtener por ingeniería un nuevo sitio de unión aparte del original, la región de unión funcional de dicho resto parental.

Normalmente, las bibliotecas contienen además variantes del anticuerpo modular, resultantes de la mutagénesis o técnicas de aleatorización. Estas variantes incluyen anticuerpos inactivos o no funcionales. Por lo tanto, se prefiere que dichas bibliotecas se sometan a detección selectiva con el ensayo adecuado para determinar el efecto funcional. Las bibliotecas preferidas comprenden al menos 102 variantes de anticuerpos modulares, más preferentemente, al menos 103, más preferentemente, al menos 104, más preferentemente, al menos 105, más preferentemente, al menos 106, más preferentemente, al menos 107, más preferentemente, al menos 108, más preferentemente, al menos 109 , más preferentemente, al menos 1010 , más preferentemente, al menos 1011 , hasta 1012 variantes o más para proporcionar un repertorio muy diverso de anticuerpos para seleccionar los mejores agentes de unión adecuados. Cualquiera de estas bibliotecas sintéticas se puede generar usando métodos de mutagénesis como se desvela en el presente documento.

Preferentemente, la biblioteca es una biblioteca de levaduras y la célula hospedadora de levadura exhibe en la superficie los oligómeros con la actividad biológica. La célula hospedadora de levadura se selecciona, preferentemente, de los géneros Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizisaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia y Candida. Lo más preferido, la célula hospedadora es Saccharomyces cerevisiae.

También se desvela una biblioteca de alta calidad que contiene al menos 102 clones independientes de dímeros funcionales de dominios de anticuerpo modular o variantes de los mismos, o los conjuntos de clones optimizados o preseleccionados, por ejemplo, los clones de afinidad madurada, conteniendo los conjuntos al menos 10 clones independientes que se unen a una diana y a un ligando estructural. La diana puede ser un ligando que se une a una molécula parental objeto de una variación de aminoácidos. La molécula parental puede ser un oligómero funcional, en particular un Fc funcional o un Fab funcional, o partes de los mismos.

La biblioteca puede contener dímeros funcionales de dominios de anticuerpo modular que se unen a una diana y a un ligando estructural, y al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, más preferentemente al menos un 40 %

de los dímeros funcionales se unen a CD64. Esto es particularmente preferido con un anticuerpo modular que contiene dominios CH2, tal como un armazón Fc.

Como alternativa, la biblioteca puede contener dímeros funcionales de dominios de anticuerpo modular que se unen a

5 una diana y a un ligando estructural, y al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, más preferentemente, al menos un 40 % de los dímeros funcionales se unen a la proteína A. Esto es particularmente preferido con un anticuerpo modular que contiene los dominios CH2 y CH3, tal como un armazón Fc.

Como alternativa, la biblioteca puede contener dímeros funcionales de dominios de anticuerpo modular que se unen a una diana y a un ligando estructural, y al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, más preferentemente al menos un 40 % de los dímeros funcionales se unen a la misma diana de CDR. Esto es particularmente preferido con los anticuerpos modulares que contienen una región variable, tal como un armazón Fab con especificidad por una única diana de CDR.

15 Como es bien conocido en la técnica, existen varias tecnologías de expresión y selección que se pueden usar para la identificación y aislamiento de proteínas con determinadas características y afinidades de unión, incluyendo, por ejemplo, tecnologías de expresión tales como celulares y no celulares, en particular sistemas de expresión movilizados. Entre los sistemas celulares se pueden usar expresión en fagos, expresión en virus, expresión en levaduras o en otras células eucariotas, tales como expresión en células de mamífero o de insectos. Los sistemas movilizados están relacionados con los sistemas de expresión en la forma soluble, tales como sistemas de expresión in vitro, entre ellos la expresión en ribosomas, expresión de ARNm o expresión de ácido nucleico.

Los métodos para la producción y detección selectiva de las variantes de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Se describen métodos generales para la biología molecular de los anticuerpos, la expresión, la purificación y la

25 detección selectiva en Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001) y Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

Una biblioteca se puede diseñar como biblioteca exclusiva que contiene al menos un 50 % de formatos específicos, preferentemente al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, o los que consisten principalmente en formatos de anticuerpo específicos. Se prefieren los formatos de anticuerpo específicos, de modo que la biblioteca preferida se seleccione del grupo que consiste en una biblioteca de VH, biblioteca de VHH, biblioteca de Vkappa, biblioteca de Vlambda, biblioteca de Fab, una biblioteca de CH1/CL, una biblioteca de Fc y una biblioteca de CH3. Se prefieren especialmente las bibliotecas

35 caracterizadas por el contenido de moléculas compuestas que contienen más de un dominio de anticuerpo, tal como una biblioteca de IgG o biblioteca de Fc. Otras bibliotecas preferidas son las que contienen receptores de linfocitos T, que forman bibliotecas de receptores de linfocitos T. Otras bibliotecas preferidas son bibliotecas de epítopos, en las que la proteína de fusión comprende una molécula con una variante de un epítopo, que también permite la selección de moléculas competitivas que tienen una función de unión similar pero una funcionalidad diferente. Un ejemplo es una biblioteca de TNF alfa, en la que trímeros de la proteína de fusión de TNF alfa se expresan mediante un único paquete genético.

La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los ejemplos siguientes. Dichos ejemplos son, sin embargo, meramente representativos de los métodos de la práctica de una o más realizaciones de la presente

45 invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de la biblioteca de Fcab no centrada (Fcab01) y expresión en superficie de fagos

La estructura cristalina de un fragmento Fc de IgG1, publicada en la base de datos de Brookhaven como la entrada 1OQO.pdb, se usó para ayudar en el diseño de la biblioteca de Fcab.

La secuencia que se usó como base para la construcción de la biblioteca de Fcab se proporciona en la SEQ ID No. 1

55 (Figura 3). En esta secuencia, el primer aminoácido corresponde a Glu 216 de IgG1 humana (numeración de la UE: de acuerdo con la base de datos de la IMGT (http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHC allgenes.html; lookup 2007 06 25), es el primer resto de la región de bisagra de la IgG1 humana, que se proporciona como: (E)PKSCDKTHTCPPCP) de la región de bisagra de la cadena constante pesada de la IgG1 humana). El penúltimo resto de la SEQ ID No. 1 (Figura 3) corresponde a Gly 446 de la IgG1 humana (numeración de la UE: IMGT: número de resto 129 del dominio CH3 de la IgG1 humana).

Después del detallado análisis de la estructura de 1oqo.pdb y mediante inspección visual de los restos que forman los bucles que conectan las hebras beta, se decidió aleatorizar los restos 144, 145 y 146, que forman parte del bucle que 65 conecta la hebra beta A-B, así como 198, 199, 200, 203 y 204, que forman parte del bucle que conecta la hebra beta E-F de la SEQ ID No. 1 (FIGURA 3). Además de los restos mutados, se insertaron 5 restos en el número de resto 198

de la SEQ ID No. 1 (Figura 3). En la SEQ ID No. 2 (Figura 4), se proporciona la secuencia del inserto de la biblioteca de la biblioteca Fcab01 en la que todas las posiciones de los restos aleatorizados, así como los 5 restos insertados se designan con la letra X.

5 El gen modificado por ingeniería se produjo mediante una serie de reacciones de PCR usando cebadores degenerados seguido de ligación de los productos de la PCR resultantes. Para facilitar la unión, algunos de los codones de la secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID No. 1 (Figura 3) se modificaron para producir sitios de restricción sin cambiar las secuencias de aminoácidos (mutaciones silenciosas). Para la inserción en el vector de clonación pHEN1 (Nucleic Acids Res. 11 Ago 1991; 19(15):4133-7. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.) en marco con la señal de secreción peIB, se usó el sitio de restricción NcoI cerca del extremo 3' de la señal de secreción peIB. Para los restos aleatorizados, se eligió el codón NNS (código IUPAC, en el que S significa los nucleótidos C y G) que codifica los 20 aminoácidos de origen natural, pero evita 2 de 3 codones de terminación. También se pueden usar otros codones tales como, por ejemplo, el NNB (en el que B

15 significa los nucleótidos T, C y G) también se pueden usar. La secuencia modificada por ingeniería se proporciona como una secuencia de nucleótidos en la SEQ ID No. 3 (Figura 5). Esta secuencia también incluye los sitios de restricción usados para clonar en el vector de expresión en fagémido pHEN1, es decir, un sitio NcoI en el extremo 5' y un sitio NotI en el extremo 3'.

Las secuencias de los cebadores para PCR usados para ensamblar el dominio CH3 mutado se proporcionan en la SEQ ID No. 4 a SEQ ID No.9.

SEQ ID No. 4 (cebador para PCR EPKSNCO)

ccatggccgagcccaaatcttgtgacaaaactc

25 SEQ ID No. 4 (cebador para PCR CH3LSAC) agtcgagctcgtcacgggatgggggcaggg SEQ ID No. 6 (cebador para PCR CH3CSAC) gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctgg SEQ ID No. 7 (cebador para PCR CH3CHIN) tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagccg SEQ ID No. 8 (cebador para PCR CH3RHIN) tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsaggtggnnsnnsgggaacgtcttctcatgctccg SEQ ID No. 9 (cebador para PCR CH3RNOT) agttgcggccgctttacccggagacagggagag agttgcggccgctttacccggagacagggagag

35 La Figura 1 muestra una presentación esquemática de los fragmentos de PCR generados para el ensamblaje del gen mutado y los cebadores usados.

Se usó ADNc de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 3D6 (Felgenhauer M, Kohl J, Ruker F. Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of Hand L-chains of a human mono-clonal antibody specific to HIV-1- gp41. Nucleic Acids Res. 25 Ago 1990;18(16):4927) como molde para las reacciones de la PCR. Los 3 productos de la PCR se digirieron con Sacl y/o HindIII respectivamente y se unieron entre sí. El producto de la unión se digirió adicionalmente con Ncol y Notl y se ligó en el vector fagémido de expresión en superficie pHEN1, que se había digerido previamente con Ncol y Notl. El producto de la ligación se utilizó después para transformar E. coli

45 mediante electroporación. Una serie de clones seleccionados se controló mediante análisis de restricción y mediante secuenciación de ADN y se halló que contenían el inserto según lo planeado, incluyendo las secuencias aleatorizadas correctamente insertadas. Para las etapas siguientes de la preparación de fagos se siguieron protocolos estándar. En resumen, la mezcla de la unión se utilizó después para transformar células TG1 de E. coli mediante electroporación. Posteriormente, las partículas de fago se rescataron de las células TG1 de E. coli con el fago colaborador M13-KO7. Después, las partículas de fago se precipitaron del sobrenadante del cultivo con PEG/NaCl en dos etapas, se disolvieron en agua y se usaron para la selección mediante adsorción o, como alternativa, se almacenaron a -80 ºC

Ejemplo 2: Construcción de la biblioteca de Fcab centrada (Fcab02) y expresión en superficie de fagos

55 Como se describe en el Ejemplo 1, se preparó una biblioteca de Fcab en la que las posiciones aleatorizadas de la biblioteca están completamente aleatorizadas, es decir, están codificadas por un codón, tal como NNS NNB, NNK, NNN u otros.

Por claridad, el significado de letras tales como N, B, S o K se define en el código de ambigüedad de nucleótidos de la IUPAC, que se proporciona en la tabla siguiente:

Tabla 1. Código de ambigüedad de nucleótidos de la IUPAC

Símbolo Significado Ácido nucleico

A A Adenina C C Citosina

G G Guanina T T Timina U U Uracilo M A oC R A oG W A oT S CoG Y CoT K GoT V A oCoG H A oCoT D A oGoT B CoGoT X GoA oToC N GoA oToC

Fuente: Nomenclature for incompletely specified bases in nucleic acid sequences: recommendations 1984. A Cornish-Bowden, Nucleic Acids Res. 10 May 1985; 13(9): 3021-3030.

5 Estos codones indicados anteriormente están diseñados de un modo tal que los 20 aminoácidos están codificados por ellos. Puede ser preferible elegir subconjuntos de los posibles aminoácidos. Se pueden encontrar ejemplos en la bibliografía (Fellouse FA, Li B, Compaan DM, Peden AA, Hymowitz SG, Sidhu SS. Molecular recognition by a binary code. J Mol Biol. 20 May 2005:348(5): 1153-62., Epub 1 Abr 2005.; Fellouse FA, Wiesmann C, Sidhu SS. Synthetic antibodies from a four-amino-acid code: a dominant role for tyrosine in antigen recognition. Proc Natl Acad Sci USA. 24

10 Ago 2004; 101 (34):12467-72. Epub 11 Ago 2004). Se pueden construir bibliotecas centradas que, por ejemplo, permiten solo 4 tipos de aminoácidos diferentes, por ejemplo, usando el codón KMT, que codifica los aminoácidos Ser, Tyr, Ala y Asp.

Una biblioteca Fcab centrada, designada Fcab02, se ha construido del mismo modo que se describe en el ejemplo 1 a 15 excepción de que los codones NNS se sustituyeron por los codones KMT.

Por lo tanto, la letra "X" en la SEQ ID No. 2 (Figura 4) ahora significa "S, Y, A y D" (Ser, Tyr, Ala y Asp) con el fin de describir la biblioteca Fcab02 centrada

20 Ejemplo 3: Construcción de una biblioteca de expresión en superficie de fagos con restos de aminoácidos adicionales entre el inserto de la biblioteca (pareja de unión) y p3

Con el fin de investigar la accesibilidad del potencial sitio de unión de la proteína expresada, se realiza un ensayo de unión: la suspensión de fagos se hace reaccionar con microplacas (o inmunotubos) revestidas con mAb anti-myc

25 9E10. Después de lavar, los fagos unidos se detectan con el conjugado anti-M13-enzima. Como control, el fago colaborador, que no expresa la proteína de fusión y el marcador myc, se hace reaccionar con las placas. Otros controles son la reacción de los fagos con placas no revestidas y la reacción de los fagos con antisuero que reconoce la pareja de fusión-p3 de los fagos.

30 Idealmente, la reactividad anti-myc de los fagos que expresan la proteína de fusión-p3 deberá dar lecturas en ELISA muy claras, mientras que las reacciones de fagos colaboradores al anti-myc-mAb no deberán estar por encima del valor de fondo (placas no revestidas). La estructura de un dímero de CH3 expresado en la superficie de un fago M13 a través de la unión a la proteína III como anclaje es tal que cada CH3 está anclado a la proteína III usando varias longitudes de enlazadores y composiciones. Por lo tanto, el dímero CH3 se expresa, preferentemente, mediante dos

35 anclas.

Optimización del enlazador:

El enlazador entre la proteína que se va a expresar y la proteína de anclaje del paquete genético (en el caso del fago

40 filamentoso, por ejemplo, p3, p8, pX, pIX, pVII) es especialmente importante si el potencial sitio de unión de la molécula expresada está en las proximidades espaciales de la partícula de fago. En bibliotecas de anticuerpo que utilizan dominios variables y sitios de unión a antígeno formados por bucles CDR y expresan los miembros de la biblioteca como fusión amino-terminal con p3, el potencial sitio de unión a antígeno está alejado de la partícula de fago. Por lo tanto, la estructura del enlazador entre miembros de la biblioteca y la proteína de la cubierta del fago no es importante.

45 La modificación por ingeniería de los bucles de la parte inferior de los dominios de inmunoglobulina y la realización de expresión en fagos puede, no obstante, ser un proceso ineficiente y disminuye los rendimientos de los clones de unión a antígeno o, incluso, lo impide. La variación del enlazador entre una proteína miembros de la biblioteca y su pareja de fusión sobre la superficie puede resolver o puede al menos reducir este problema.

50 Con el fin de seleccionar secuencias de enlazadores óptimas (en términos de longitud y flexibilidad, así como de estabilidad), se puede preparar una biblioteca de enlazadores en la que la proteína de anclaje en la superficie del

paquete genético replicable se fusiona con una proteína de unión conocida que es, por motivos estéricos, considerablemente difícil de seleccionar.

Esta biblioteca de secuencias se puede modificar en longitud y contenido de aminoácidos.

5 Los métodos de selección de la biblioteca de enlazadores para los enlazadores óptimos dependen de la aplicación, pero básicamente deben ser para seleccionar todas las propiedades que se desea tener en determinada metodología. El enriquecimiento contra un antígeno difícil de seleccionar puede producir secuencias enlazadoras que permiten a los miembros de la biblioteca un buen acceso al antígeno. La incubación en soluciones de proteasas o en otras condiciones adversas o los pases frecuentes a través de células hospedadoras en condiciones proteolíticas (por ejemplo, antiguos cultivos microbianos) puede ser una selección adecuada de los enlazadores de expresión estables.

Una biblioteca de enlazadores se puede producir mediante cualquier tecnología de biblioteca bien conocida. Las longitudes de la secuencia enlazadora sintética pueden variar entre 10-500 aminoácidos. Como alternativa, el

15 enlazador puede ser proteínas completas que se sabe que son de naturaleza flexible.

Optimización del enlazador Fcab01:

Como un ejemplo, se puede usar la biblioteca Fcab01 (como se describe en el ejemplo 1). Originalmente, esta biblioteca se clona en el vector pHEN1 de expresión en fagémidos usando los sitios de restricción NcoI y NotI. Cuando se clonan de esta manera, 18 restos de aminoácidos están entre el resto de aminoácido C-terminal del inserto de la biblioteca Fcab01 y el resto de aminoácido N-terminal del fago M13 p3. La secuencia de esta región de unión se proporciona en la SEQ ID No. 10 SPGKAAAEQKLISEEDLNGAATVES -como se explica del siguiente modo: los primeros 4 restos, SPGK, son los 4 restos en C-terminal del inserto de la biblioteca Fcab01, seguidos de la secuencia 25 de aminoácidos AAA, que son los restos de aminoácidos codificados por el sitio de restricción NotI, seguido por la secuencia EQKLISEEDL, que es el epítopo myc, seguido de NGAA, tras lo cual existe un codón de terminación ámbar, que se traduce en glutamina (Q) en las cepas supresores ámbar de E. coli, tales como TG1. Los 4 restos C-terminales de la SEQ ID No. 10, TVES, son los 4 restos en N-terminal del fago M13 p3 que están presentes en el vector pHEN1.

Con el fin de construir un fago que expresa un inserto de Fcab con un aumento de la distancia entre el Fcab (la pareja de unión) y el cuerpo del fago (el paquete genético), se insertaron 5 restos adicionales en el extremo C-terminal del inserto de Fcab rFcabRGD4, directamente cadena arriba del sitio de clonación NotI, lo que dio como resultado el clon FcabRGD4L. FcabRGD4 es un Fcab que tiene un motivo RGD de unión a integrina insertado en el bucle EF del dominio CH3 y que se une a αvß3-integrina en el ELISA. Como una secuencia enlazadora de mayor longitud, se usó la

35 secuencia de aminoácidos EGGGS, que aparece 8 veces en la secuencia del fago M13 p3. La secuencia de aminoácidos resultante de FcabRGD4L tal como se expresa después de la clonación en pHEN1 se da en la SEQ ID N º 11 (Figura 5). En la SEQ ID No. 11 (Figura 5), los restos de aminoácidos 198-204 representan el motivo RGD, el resto de aminoácido 237 es el resto C-terminal de la pieza de inserción Fcab, los restos 238-242 representan la secuencia enlazadora insertada (que es la diferencia con el pHEN1 no modificado), seguido del marcador myc, el codón de terminación ámbar y la secuencia p3.

Para la clonación de la construcción, la secuencia de FcabRGD4 se amplificó a partir de pHENFcabRGD4 (SEQ ID No. 12) usando los cebadores de PCR EPKSNCO (SEQ ID No. 4) y CH3rlink actagcggccgcagagccaccaccctccttacccggagacagggagag (SEQ ID No. 13) y se clonó a través de los sitios de restricción

45 NcoI y NotI en el vector pHEN1. El vector resultante, pHENFcabRGD4L (SEQ ID No. 14 / Figura 7), tiene la secuencia enlazadora adicional en las posiciones de nucleótidos 3.057 a 3.071.

Los dos vectores fagémidos, pHENFcabRGD4 y pHENFcabRGD4L se utilizaron para transformar TG1 de E. coli. Posteriormente, las partículas de fago se rescataron de las células TG1 de E. coli con el fago colaborador M13-KO7. Después, las partículas de fago se precipitaron del sobrenadante del cultivo con PEG/NaCl en dos etapas, se disolvieron en agua y se usaron para el ELISA.

El ELISA del fago se realizó del siguiente modo:

55 La suspensión de fagos se hace reaccionar con microplacas (o inmunotubos) revestidos con αvß3-integrina. Después de lavar, los fagos unidos se detectan con el conjugado anti-M13-enzima. Como controles, el fago colaborador, que no expresa la proteína de fusión y el marcador myc, se hace reaccionar con las placas, así como las partículas de fago portadoras de wtFcab sobre su superficie. Otros controles son la reacción de los fagos con placas no revestidas y la reacción de los fagos con antisuero que reconoce la pareja de fusión-Fcab de los fagos. Las partículas de fago con el enlazador de mayor longitud resultante de pHENFcabRGD4L reaccionan más fácilmente con αvß3-integrina que las partículas de fago con el enlazador original, tal como figura en pHENFcabRGD4, y, por lo tanto, dan una señal más fuerte en ELISA.

Se pueden realizar selecciones de fagos en las que las partículas de fago con wtFcab se mezclan con pequeñas

65 cantidades de partículas de fago que llevan FcabRGD4 o FcabRGD4L. Después de varias (normalmente 3-5) rondas de adsorción se seleccionan, preferentemente, los fagos que expresan FcabRGD4L.

Ejemplo 4: Diseño de la biblioteca Fcab™

Diseño de Bibliotecas Fcab (ilustrado en la Figura 2): para la aleatorización se consideran posiciones de aminoácidos

5 que no están en los bucles CDR de los dominios constantes CH3 de los anticuerpos. Especialmente se consideran los bucles A-B, C-D y E-F ya que están en un lado del dominio. En el presente documento se describen algunos de los criterios de diseño para la aleatorización en una posición determinada.

Los aminoácidos involucrados con frecuencia en interacciones anticuerpo-antígeno se describen en el presente 10 documento para su inclusión en una biblioteca centrada.

Se ha demostrado que las bibliotecas con uso restringido de aminoácidos son suficientes para generar agentes de unión contra virtualmente cualquier antígeno (Sidhu y Fellhouse, NATURE CHEMICAL BIOLOGY VOLUME 2 página 682ff.; Koide et al PNAS, volumen 104 p6632-6637). La ventaja de tales bibliotecas restringidas (o centradas) es que

15 pueden abarcarse completamente por las tecnologías actuales. Idealmente, el uso de aminoácidos refleja una utilización de aminoácidos naturales de la unión a los receptores de ligandos. Sin embargo, se ha notificado que incluso las bibliotecas que utilizan solo 2 aminoácidos (tirosina y serina) producen buenos resultados de la selección (en términos de frecuencia de los enlazadores contra enlazadores diferentes y en términos de afinidad).

20 Flexibilidad del bucle:

La proteína estructural puede requerir ciertas estructuras de bucle con el fin de mantener la estructura natural global. La aleatorización de muchas posiciones de los aminoácidos en los bucles e incluso el alargamiento de los bucles se puede facilitar generando determinadas secuencias en uno o en ambos lados de las posiciones aleatorizadas. Estas

25 secuencias pueden ser secuencias flexibles con el fin de permitir la compensación por cualquier tensión con determinadas secuencias de la biblioteca en dicha posición.

Tabla 2: Ejemplos de bibliotecas Fcab™, centradas y no centradas

nº de aleatorizadas

posiciones Diversidad teórica a nivel aminoácidos de Número de clones bacterianos independientes

Fcab01

13 8,2x1016 0,6x109

Fcab02

13, centrada 6,7x10' 0,6x109

Fcab03

13 8,2x1016 1,0x109

Fcab04

13, centrada 6,7x10' 0,8x109

Fcab05

15 1,3x1018 0,8x109

Fcab06

15, centrada 1,3x109 1,0x109

30 La biblioteca Fcab01 se describe en los ejemplos anteriores. El espacio de la secuencia de los diseños de la biblioteca centrada Fcab02, Fcab04 y Fcab06 están cubiertos por los tamaños reales de las bibliotecas bacterianas de aproximadamente 10e9. Por el contrario, las bibliotecas completamente aleatorias Fcab01, Fcab03 y Fcab05 en realidad están insuficientemente representadas.

35 Diseño de aleatorización de bucle en levaduras

De manera similar a los ejemplos mencionados anteriormente para el diseño de la biblioteca Fcab y la generación de la biblioteca en bacterias, se generaron bibliotecas de levaduras. Tal como se muestra en la Tabla 3, se generaron varias combinaciones de bucles AB modificados, bucles CD y bucles EF. El bucle AB modificado en este ejemplo varía del

40 aminoácido 358 a 362 (secuencia wt "LTKNQ"), el bucle CD modificado del aminoácido 384 a 388 (secuencia wt "LTKNQ") y el bucle EF de 413 a 419 (secuencia wt "DKSRWQQ").

Como se ha mencionado anteriormente, "X" representa una aleatorización completa y "Z" un diseño centrado. Los aminoácidos que se insertaron y no están presentes en el armazón de Fc silvestre se escriben entre paréntesis en la

45 tabla 3. Para las bibliotecas en las que no se modificaron los bucles, el código de aminoácidos de una letra de la respectiva secuencia wt se cita en la tabla. Como el número de combinaciones teóricas excede en la mayoría de estas bibliotecas el número experimental de los clones, el número de clones de levadura independientes generados se muestra en la última columna.

50 Tabla 3: Ejemplos de bibliotecas Fcab™, centradas y no centradas, con mutaciones e inserciones en el bucle AB, el bucle CD y el bucle EF.

Nombre de la

biblioteca tamaño teórico Bucle AB Bucle CD Bucle EF Clones independientes

Fcab05 2,0x1022 ZXXXZ NGQPE (XXXXX)XXXRWXX 2,2x104 Fcab05sABCD 7,5x1031 XXXXX XXXXX (XXXXX)XXXRWXX 1,1x106 Fcab05sCD 6,8x1029 ZXXXZ XXXXX (XXXXX)XXXRWXX 8,6x106 Fcab05sAB 1,3x1024 XXXXX NGQPE (XXXXX)XXXRWXX 5,3x107 Fcab07 3,4x1010 LTKNQ NGQPE XXXXXXX 5,3x107 Fcab07AB 1,2x1018 XXXXX NGQPE XXXXXXX 4,8x106 Fcab07ABb 1,2x1018 XXXXX NGQPE XXXXXXX 1,3x107 Fcab07b 3,4x1010 LTKNQ NGQPE XXXXXXX 3,7x107 Fcab07CD 1,2x1018 LTKNQ XXXPE XXXXXXX 1,9x107 Fcab07CDAB 3,9x1025 XXXXX XXXPE XXXXXXX 1,7x107 Fcab08 3,4x107 XXXXX NGQPE DKSRWQQ 8,5x106 Fcab08EF 1,2x1018 XXXXX NGQPE XXXXXXX 2,2x107

Ejemplo 5: Clonación de bibliotecas de expresión en levadura mediante vector de recombinación homóloga

5 El pYD1 (Invitrogen) se utiliza como el vector básico. El vector se modifica de la siguiente manera, con el fin de eliminar un sitio XhoI: pYD1 se escinde con XhoI, se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y se vuelve a ligar. La secuencia resultante se da en pYD1dX (SEQ ID No. 15 / Figura 8). pYD1dX contiene un sitio de restricción BamHI único en la posición 921/925 y un sitio de restricción NotI único en la posición 963/967. Se abre con estas dos enzimas de restricción. Un inserto que codifica CH1-bisagra-CH2-CH3 de la IgG1 humana se prepara mediante PCR a partir de

10 ADNc que codifica la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal IgG1 humana. En este inserto se introduce una mutación puntual usando procedimientos estándar para mutar el resto de cisteína en C-terminal del dominio CH1 a una serina. El inserto se amplifica usando cebadores de PCR que se unen a un sitio de restricción BamHI y Not en ambos extremos respectivamente. Estos sitios de restricción se utilizan después para clonar el inserto en pYD1dX para producir el vector de expresión pYD1dXFc (SEQ ID No. 16 / Figura 9). El codón mutado en el extremo C-terminal del

15 dominio CH1 (Cys a Ser) está en las posiciones 1233 a 1235 en la secuencia de pYD1 DxFc. El codón de terminación del inserto está en la posición 1917/1919.

Este vector se utiliza como un control positivo para la expresión de CH1-bisagra-CH2-CH3 humano sobre la superficie de la levadura y como punto de partida para la construcción del vector pYD1CH12 vector (ver más adelante).

20 Clonación de las bibliotecas

La clonación de las bibliotecas en las que las mutaciones se introducen en los bucles estructurales de los dominios CH3 se realiza en la levadura mediante recombinación homóloga (reparación de huecos). Con este fin, se prepara un

25 vector receptor que carece del dominio CH3: se escinde el pYD1dXFc con XhoI (posición 1603/1607) y NotI (posición 1921/1925), el fragmento grande se prepara mediante electroforesis en gel preparativa, se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y se vuelve a ligar. Este procedimiento reconstituye un sitio XhoI único (posición 1603/1607) y el vector dado pYD1 CH12 (SEQ ID No. 17 / Figura 10). Posteriormente, pYD1CH12 se escinde con XhoI y se utiliza como vector receptor para la reparación de huecos en la levadura.

30 Como alternativa, para las bibliotecas indicadas en la Tabla 3 se construyó un vector receptor diferente, que comprendía solo la región de bisagra, los dominios CH1 y CH2, pero sin el dominio CH1. En este vector, el dominio CH1 se eliminó cortando con BamH1 (posición: 921/926) y Xho1 (posición: 1603/1608). Sin embargo, los autores introdujeron un fragmento producido mediante PCR que comprende la región de bisagra, el dominio CH2 y los

35 correspondientes sitios de enzimas de restricción. El plásmido resultante es pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt (SEQ ID No. 428 / Figura 29). En una etapa adicional, los autores eliminaron el dominio CH3 del último plásmido digiriendo con Xho1 (1309/1314) y Not1 (1626/1633) y se sustituyó por dos marcadores secuenciales: el marcador V5 seguida del marcador His6. Se obtuvo esta secuencia mediante amplificación por PCR a partir del vector pYD1 y se clonó utilizando los sitios de enzimas de restricción Xho1 y Not1. El plásmido final, pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt (SEQ ID

40 No. 427 / Figura 28), se utilizó como el vector receptor biblioteca. El pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt codifica para un fragmento de la IgG1 humana que empieza en la región de bisagra y termina en el comienzo de dominio CH3. Contiene un único sitio de restricción BamHI (921/926), Xho1 (1309/1314) y NotI (1422/1429). Estos 2 últimos se usan para la introducción de las bibliotecas CH3 mediante recombinación de homóloga. El vector pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt se utiliza como control positivo para la expresión de bisagra-CH2-CH3 humano sobre la superficie de la levadura y

45 pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt como punto de partida para la construcción de las bibliotecas enumeradas en la Tabla

3.

Como fuente del inserto para pYD1dXFc, se usan las bibliotecas de Fcab Fcab01 (SEQ ID No.18), Fcab02 (SEQ ID No.19), Fcab03 (SEQ ID No. 20), Fcab04 (SEQ ID No. 21), Fcab05 (SEQ ID No. 22) y Fcab06 (SEQ ID No. 23). Estas 50 bibliotecas se preparan mediante síntesis de ADN estándar y contienen restos aleatorizados, así como restos insertados en el bucle AB (entre los restos 359 y 361 (numeración de la UE)), así como en el bucle EF (entre los restos 413 y 419 (numeración de la UE)) del dominio CH3 de la IgG1 humana. A partir de este ADN sintético, el inserto para

la reparación de huecos en la levadura se amplifica mediante PCR usando el par de cebadores para PCR

gapch35

5 caacaaggccctgcctgcccccatcgagaagaccatctccaaggccaagggccagcctcgagaaccacaggtgtac accctgccc (SEQ ID No.24) y

gapfcs3

10 gagaccgaggagagggttagggataggcttaccttcgaagggccctctagactcgatcgagcggccgctcatttaccc ggagacagggagagctc ttc (SEQ ID No.25).

Se mezclan 100 µg del vector pYD1CH12 escindido con XhoI y 100 µg del inserto y se utilizan para transformar la cepa EBY100 de Saccharomyces (Invitrogen) utilizando el procedimiento de acetato de litio de acuerdo con el siguiente 15 protocolo, que se mejora con un factor de 100 para transformar la cantidad requerida de células y de ADN. En resumen, para una única transformación de 1 µg de ADN del vector y 1 µg de ADN del inserto, se inoculan 10 ml de YPD (2 % de peptona, 2 % de dextrosa (D-glucosa)) con una colonia de levaduras y se agita durante la noche a 30 ºC. Se determina la DO600 del cultivo durante la noche y el cultivo se diluye hasta una DO600 de 0,4 en 50 ml de YPD y se deja crecer durante 2-4 horas adicionales. Las células se sedimentan a 2.500 rpm y se resuspenden en 40 ml de 1X TE 20 (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM). Las células se sedimentan de nuevo a 2.500 rpm y se resuspenden en 2 ml de LiAc/0,5X TE 1 M seguido de incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se mezclan 1 µg de ADN del vector, 1 µg de inserto y 100 µg de ADN de esperma de salmón sometido a cizalla y desnaturalizado (2 mg/ml) con 100 µl de la suspensión de levadura. Se añaden 700 µl de LiAc 1 M/40 % PEG3350/1X TE y se mezcla con la suspensión de levadura/ADN, seguido de incubación a 30 ºC durante 30 minutos. Se añaden 88 µl de DMSO, se mezclan y la 25 mezcla se incuba a 42°C durante 7 minutos, seguido de centrifugación en una microcentrífuga durante 10 segundos. Después se retira el sobrenadante, el sedimento celular se resuspende en 1 ml de 1X TE y se vuelve a sedimentar. Después el sedimento se resuspende en 50-100 µl de TE y se cultiva en placas mínimas de dextrosa que contienen leucina (10 g/l de base de nitrógeno de levadura, 20 g/l de dextrosa, 0,1 g/l de leucina, 15 g/l de agar). Tras la incubación de las placas a 30 ºC durante un periodo de 2 a 4 días, aparecieron colonias individuales que se

30 recolectaron después.

Como fuente del inserto para el vector pYD1dX_dCH1dCH3, se usaron las bibliotecas Fcab enumeradas en la Tabla 3. Estas bibliotecas se preparan mediante síntesis de ADN estándar y contienen restos aleatorizados, así como restos insertados en el bucle AB, y el bucle CD, así como en el bucle EF del dominio CH3 de la IgG1 humana (véase la Tabla 35 3). A partir de este ADN sintético, el inserto para la reparación de huecos en la levadura se amplifica mediante PCR utilizando los oligos YCH3.25rec.back y YCH3.25rec.opt.for (los cebadores utilizados se enumeran a continuación). La mezcla de transformación básica comprende 2 µg de pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt escindido con XhoI y 1 µg de ADN de inserto, que se mezclan y se utilizan para transformar la cepa de Saccharomyces EBY100 (Invitrogen) usando el procedimiento con acetato de litio, que se mejora con un factor de 100 para obtener la cantidad requerida de 40 transformantes. En resumen, para una única transformación de 2 µg de ADN del vector y 1 µg de ADN del inserto, se inoculan 10 ml de YPD (2 % de peptona, 2 % de dextrosa (D-glucosa)) con una colonia de levaduras y se agita durante la noche a 30 ºC. Se determina la DO600 del cultivo durante la noche y el cultivo se diluye hasta una DO600 de 0,3 en 50 ml de YPD y se dejan crecer durante 6 horas adicionales o DO600 de 2,5. Las células se sedimentan a 2500 rpm, se lavan dos veces: primero con 25 ml de agua destilada y después con LiAc 100 mM; y, por último, se resuspenden en 45 500 ul de LiAc 100 mM. Se mezclan 2 µg de ADN del vector, 1 µg del inserto y 100 µg de ADN de esperma de salmón sometido a cizalla y desnaturalizado (2 mg/ml) con 50 µl de la levadura en una solución que contiene PEG3500 (33 % p/v) y LiAc 100 mM en un volumen final de 360 µl. Después de una buena homogeneización, las levaduras se mantienen a 30 ºC durante 30 minutos y, después, a 42 ºC durante 45 minutos. Después se retira el sobrenadante y el sedimento celular se resuspende en YPD y se deja que las células se recuperen durante otros 60-90 minutos a 30 ºC.

50 Después, el sedimento se incuba en medio selectivo (placas y/o líquido, véase más adelante) a 30 ºC durante 2 días. La diversidad de la biblioteca se determina mediante el número de células individuales cultivadas hasta colonias en placas que se han preparado e inoculado inmediatamente después del período de recuperación.

Lista de cebadores

55 a) CH3seqs/2 (SEQ ID No. 429): 5'-AAGGAGTACAAGTGCAAGG-3' b) cebadores inversos:

CDmut_back (SEQ ID No. 430): 5'-GCT CTC CCA CTC CAC G-3'

60 EFmut_back (SEQ ID No. 430): 5'-CAC GGT GAG CTT GCT GTA GAG-3' ABMUT5/2_back (SEQ ID No. 432): 5'-CTCATCCCGGGATGGG-3'

c) cebadores directos (X=trinucleótidos - síntesis para aminoácidos aleatorios)

65 CDmut5cod_for (SEQ ID No.433):

5'-GTG GAG TGG GAG AGC X X X X X AAC AAC TAC AAG ACC ACG-3'

EFMUT7cod_for (SEQ ID No.434):

5 5'AGC AAG CTC ACC GTG X X X X X X X GGG AAC GTC TTC TCA TGC-3'

EFMUT3+2_for (SEQ ID No.435):

5’AGC AAG CTC ACC GTG XXX AGG TGG X X GGG AAC GTC TTC TCA TGC-3’ 10 ABMUT5 (wt)_for (SEQ ID No.436):

5'-CCA TCC CGG GAT GAG X X X X X GTC AGC CTG ACC TGC CTG G-3'

15 d) CH3seqAS (SEQ ID No. 437): 5'-TAGAATCGAGACCGAGG-3' e) YCH3.25rec.opt.for (SEQ ID No. 438): 5'-A CCA TCT CCA AGG CCA AGG-3' f) Ych3.25rec.back (SEQ ID No. 439): 5'-AAG GGC CCT CTA GAC TCG-3'

Inducción del cultivo

20 Las bibliotecas de levaduras recolectadas (bibliotecas y Fcab) se inoculan en 10 ml de medio SD-CAA (10 g/l de base de nitrógeno para levaduras, 10 g/l de casaminoácidos y 20 g/l de dextrosa, 0,1 g/l de leucina, 9,67 g/l de NaH2PO4·2H2O y 10,19 g/l deNa2HPO4·7H2O) y se cultivan en un agitador a 250 rpm a 28 ºC durante 6-8 horas. La DO600 del cultivo se determina y el cultivo de diluye hasta una DO600 de 0,2 y se cultiva en las mismas condiciones

25 hasta alcanzar una DO600 DE 1-2. Las células se recolectan mediante centrifugación (3.000 rpm/5 min/4º C) y se resuspenden en medio de inducción SG/R-CAA (10 g/l de base de nitrógeno de levadura, 10 g/l de casaminoácidos y 20 g/l de galactosa, 10 g/l de rafinosa, 0,1 g/l de leucina, 9,67 g/l de NaH2PO4·2H2O y 10,19 g/l de Na2HPO4·7H2O). Los cultivos se inducen mediante incubación durante 2 días en un agitador a 250 rpm a 20 ºC y después se analizan y clasifican. Como alternativa, los cultivos se inducen mediante incubación durante 1 día en un agitador a 250 rpm a 37

30 ºC y después se analizan y clasifican.

Control de calidad de las bibliotecas yFcab

Las bibliotecas yFcab se analizan para determinar su nivel de expresión y la calidad de los Fcab expresados dos días

35 después de la inducción con medio SD-CAA. El nivel de expresión se analiza usando antisuero anti-IgG-Fc humano policlonal (Sigma). Con este fin, se diluyen 0,5x10e6 células de la biblioteca en 1 ml de tampón de tinción (SB), que comprende PBS con 2 % de BSA. Las células se sedimentan y se tiñen con 100 µl de SB que contiene antisuero anti-IgG-Fc-PE humano diluido a 1/2000 (Sigma) durante 30 minutos en hielo, se lavan dos veces con SB y después se analizan en el FACS. En general, el 70-80 % de todas las células en cada biblioteca expresan Fcab sobre su superficie

40 celular. Para analizar el plegamiento correcto de Fcab, se realiza tinción con proteína A. De nuevo, 0,5x10e6 células de la biblioteca se diluyen en 1 ml de tampón de tinción SB, las células se sedimentan y se tiñen con 100 µl de SB que contiene 1 µg/ml de ProtA-FITC (Fluka) durante 30 minutos en hielo, se lavan dos veces con SB y después se analizan en el FACS. En general, las bibliotecas yFcab como se ha descrito anteriormente muestran ≥ 40 % de células positivas a la proteína A.

45 Con el fin de analizar si los Fcab se expresan como dímeros sobre la superficie de las células, se realiza una tinción con CD64 humano. Se sedimentan 5x10e5 células y se tiñen durante 30 min en hielo con 50 µl de SB que contiene 1 µg/ml de CD64 (R&D Systems). Después de una etapa de lavado, las células se resuspenden en 50 µl de SB que contiene 1 µg/ml de Penta His Alexa Fluor 488 (QIAgen) y se incuban otros 30 minutos en hielo. Las células se lavan y

50 se resuspenden en 200 µl de SB enfriado con hielo para el análisis FACS. Como control, las células se incuban con equivalente de Penta His Alexa Fluor 488, sin preincubación con CD64. Tras la incubación, las células se lavan una vez con SB enfriado con hielo y se analizan en el FACS, En general, > 50 % de todas las células en cada biblioteca expresan Fcab diméricos sobre su superficie celular.

55 Biotinilación del antígeno (Her2)

El antígeno recombinante, por ejemplo, Her2 (Bendermed systems) se realizó con el sistema EZ-link de Pierce de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, el antígeno se dializa contra PBS, se diluye a 1 mg/ml en PBS y se mezcla con sulfo-LC-LC-biotina 10 mM (EZ link, Pierce), que previamente se había disuelto en agua. La

60 proporción final entre antígeno y biotina es 1:3 y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, la mezcla se "dializa" contra PBS usando columnas Vivaspin MWCO3000 (Sartorius) (5x8', 4.000 rpm). Por último, la concentración del antígeno biotinilado (Her2) se analiza mediante HPLC y se almacenan alícuotas a -20 ºC.

La calidad del antígeno biotinilado se analiza mediante ELISA. En primer lugar, las placas se recubren con un

65 anticuerpo anti-Her2 (por ejemplo, Herceptin) a 10 µg/ml en PBS, 100 µl/pocillo durante una noche a 4°C, después, la placa se lava 3 veces con tampón de lavado (WB) (PBS + 0,05 % de Tween20) y se bloquea mediante tampón de

bloqueo (BB) (PBS + 2 % BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces con WB, se añaden diferentes concentraciones de Her2-biotina en 100 µl/pocillo de BB durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de lavado 3 veces con WB. Por último, la placa se incuba con 1-25.000 de estreptavidina-HRP (GE healthcare) en BB durante 1 hora a temperatura ambiente y se lava 3 veces con WB. Se desarrolla color añadiendo 100 µl/pocillo del

5 sustrato TMB (Sigma) y después de -10 minutos, la reacción se detiene añadiendo 100 µl/pocillo de H2SO4 al 30 %. Los resultados se analizan con un lector de ELISA a 450-630 nm.

Ejemplo 6: Producción de Fcab específicos de antígeno

10 Selección de Fcab específicos de antígeno usando FACS

Primera ronda de selección:

Dos días antes de la clasificación con FACS, una biblioteca de levaduras que contiene 2,5 x10e8 clones de Fcab se

15 induce con medio SG/R-CAA para expresar los Fcab sobre la superficie celular como se ha descrito anteriormente. Tras dos días, la cantidad de células que cubren, por ejemplo, 10 veces la biblioteca (= 2,5 x10e9) se incuba durante 30 minutos en hielo con antígeno biotinilado 500 nM (Her2) en 2 ml de SB. Después, las células se lavan una vez con SB frío y después se incuban durante 30 minutos en hielo con estreptavidina-PE (de R&D systems) diluido a 1:100 en SB. Las células se lavan dos veces con SB enfriado con hielo hasta una concentración final de 1x10e9 células/ml. Se

20 realizan tinciones de control con 5x10e6 células/ml en 100 µl solo con estreptavidina-PE, en ausencia de antígeno. Tanto la biblioteca completa como las tinciones control se analizan, por ejemplo, en un FACS ARIA de BD. Para configurar las puertas para la clasificación se utilizan las células control. Primero, se establece una puerta FSC/SSC (G1) para identificar células de levadura sanas del gráfico del área de FSC frente a la anchura de FSC de G1 y solo se seleccionan las células que no se agregan en una nueva puerta (G2). Las células en G2 se analizan después para

25 determinar la reactividad con estreptavidina-PE usando FSC frente a FL-2 (canal de PE). G3 se establece para incluir un 0,1 % de células positivas (falsas). Posteriormente, al menos 5x10e8 células teñidas (dos veces el tamaño de la biblioteca, idealmente más) se analizan con los parámetros como se ha indicado anteriormente y las células en G3 se clasifican en un tubo que contiene 2-3 ml de medio SD-CAA. Aproximadamente 5x10e5 células (Conjunto 1) se recogen en la primera ronda de selección y se propagan durante de 1 a 2 días, tras lo cual, las células se pueden

30 almacenar a -80 ºC y los alícuotas se pueden inducir para expresar los Fcab como se ha descrito anteriormente. Tras dos días más, puede tener lugar la siguiente ronda de selección.

Segunda ronda de selección:

35 El conjunto 1 seleccionado en la ronda 1 se induce para expresar el Fcab sobre su superficie como se ha descrito anteriormente. Al menos 5x10e6 células (que comprenden múltiples copias del conjunto 1) se incuban durante 30 minutos en hielo con antígeno biotinilado 500 nM (Her2) en 1 ml de SB, Después, las células se lavan una vez con SB frío y después se incuban durante 30 minutos en hielo con estreptavidina-PE (de R&D systems) diluido a 1:100 en SB junto con 2 µg/ml de proteína A-FITC (Fluka). A continuación, las células se lavan dos veces con SB enfriado con hielo

40 hasta una concentración final de aproximadamente 2x10e6 células/ml. Además, se realizan tinciones control en las que 5x10e6 células/ml del Conjunto 1 en 100 µl se incuban con una mezcla de proteína A y estreptavidina-PE como se ha indicado anteriormente, pero sin la incubación con el antígeno (Her2). Además, 5x10e5 células en 100 µl de un clon de levadura que expresa el fragmento Fc no aleatorizado de Fcab wt) se tiñen con Prot A-FITC como se ha descrito en lo que antecede en ausencia de estreptavidina-PE. Las células que expresan Fcab-wt se analizan en, por ejemplo,

45 FACS ARIA de BD para configurar las puertas para la clasificación. Primero, se establece una puerta SSC FSC (G1) para identificar células de levadura sanas, del gráfico del área de FSC frente a la anchura de FSC de G1 y solo se seleccionan las células que no se agregan en una nueva puerta (G2). Las células en G2 se analizan después para determinar la expresión de la proteína A usando FSC frente a FL-1 (FITC). G3 se configura para cubrir las células fuertemente positivas a la proteína A (50-60 % de la puerta parental) y G4 se configura para cubrir las células

50 débilmente positivas a proteína A (20-30 % de células parentales). G3+G4 incluirán aproximadamente el 70-80 % de todas las células en G2. Ahora, el conjunto de células teñidas para estreptavidina-PE en presencia de Prot A-FITC se usan para establecer el resto de las puertas de clasificación. Primero se comprueban G1 y G2 con el conjunto de células y, si es necesario, se ajustan. El conjunto de células tendrá menos episodios en G3 y, quizá también en G4, lo que indica que no todas las células del conjunto 1 expresan Fcab que se pliega como Fcab-wt. Usando el conjunto de

55 células teñidas control, se prepara una nueva puerta para G3 y para G4. Las nuevas puertas se configuran en el gráfico de FSC y FL-2 (PE). Se prepara una puerta (G5) que incluye 0,1 % de células positivas a estreptavidina (falsas) en G3 y lo mismo se realiza para las células en G4, que da lugar a G6. En la siguiente etapa, al menos 5x10e6 células teñidas para her2-biotina + estreptavidina-PE y Prot A-FITC se clasifican mediante FACS-ARIA. Las células se recogen de G5 (conjunto 2.1 y G6 (conjunto 2.2) en tubos separados que contienen 2-3 ml de medio de cultivo para

60 levaduras. Cabe esperar entre 10 y 1000 clones de ambas puertas. Ambos conjuntos nuevos se propagan durante 1 o 2 días y se almacenan a -80 ºC. Las células de 2.1 y 2.2 se pueden usar para dirigir una clasificación adicional en una tercera ronda o se pueden someter (preferentemente después de mezclar los dos clones de nuevo) a una ronda de aleatorización adicional del bucle AB (maduración de la afinidad) antes de clasificarse adicionalmente en el FACS.

65 Maduración de la afinidad para clones/conjuntos determinados

Para la maduración de la afinidad, se introduce diversidad en determinados clones o en conjuntos de clones seleccionados, preferentemente solo en un bucle, en este caso el bucle AB. Con este fin, se efectuó una PCR con un cebador que contenía codones degenerados en las posiciones 359, 360 y 361 (numeración de la UE (cebador Abmut, gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcc tggtcaaag, SEQ ID No. 26), o, como

5 alternativa, se efectuó una PCR con un cebador que contenía codones degenerados en las posiciones 358, 359, 360, 361 y 362 (numeración de la UE (cebador Abmut2LR, gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtca aag, SEQ ID No. 27).

El segundo cebador usado en estas PCR es gapfcs3 en ambos casos. Con el fin de crear secuencias flanqueantes para una reparación de huecos eficiente en levaduras, los productos de la PCR resultantes se amplificaron adicionalmente con el par de cebadores gapch35 y gapfsc3 y después se utilizaron para transformar la cepa EBY100 de Saccharomyces cerevisiae mediante transformación con acetato de litio junto con pYD1CH12 escindido con ChoI como se ha descrito en lo que antecede. Como cebadores alternativos, para la aleatorización de los restos descritos en el bucle AB, también se usaron cebadores tales como Abmut1L

15 (gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcctggtca aag, SEQ ID No. 28) o Abmut1R (gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtca aag, SEQ ID No. 29). De forma análoga, los restos en el bucle EF se aleatorizaron mediante aleatorización total.

Como alternativa, la aleatorización se realizó usando oligonucleótidos enriquecidos como cebadores sobre el clon individual y-Her.C2.P4.2-9. En este caso, los oligos se diseñaron de un modo similar a lo mencionado anteriormente para la aleatorización completa de los respectivos bucles, no obstante, la parte aleatorizada contenía 70 % de la base original en la primera y segunda posición del codón y 10 % de cada uno de los otros 3 nucleótidos. La tercera posición contenía un 70 % de la base original y 30 % de la base de acuerdo con el codón NNK o NNS.

25 El cebador Abmut tuvo como resultado 8.000 nuevas variantes (Conjunto 2.3) de cada clon y el cebador Abmut2LR condujo a 3x10e6 nuevas variantes (Conjunto 2.4) tras la aleatorización completa. Por lo tanto, los conjuntos 2.3 y 2.4 tuvieron como resultado nuevas bibliotecas de aproximadamente 10e8 individuos, ya que el material de partida (Conjunto 2.1+2.2) ya contenía aproximadamente 10-1.000 clones.

Tercera ronda de selección

En los conjuntos de afinidad madurada 2.3 y 2.4 y, en caso necesario, el conjunto 2.1 (solo se prefieren las células positivas a Prot A) se indujo la expresión de Fcab en su superficie celular como se ha descrito en lo que antecede y, después, se clasificaron como se ha descrito para la "Segunda ronda de selección", con la excepción de que los 35 conjuntos 2.3 y 2.4 son mucho más grandes y, por lo tanto, los volúmenes de tinción para los conjuntos son iguales a los de la tinción de las bibliotecas descrita en la "Primera ronda de selección". En la tercera ronda de selección, solo se clasificaron las células positivas para Her2/positivas para Prot A. Los conjuntos derivados de estas selecciones contenían normalmente > 20 % de células positivas para Her2/Prot A. En caso contrario, se realizaron una cuarta y una quinta rondas de selección (o incluso más) de Her2 junto con o también sin proteína A. Por ejemplo, la maduración de la afinidad del clon H242-9Q dio un incremento en la afinidad de unión de CE50 = 155 nM a 18,9 nM (clon H10-03-6).

Análisis de los clones:

Los clones individuales de los conjuntos que contienen las células Her2/Prot (se prefiere >20 %) se prepararon

45 sembrando los conjuntos en placas de agar con medio SD-CAA o mediante transferencia de las células únicas (=clones) directamente desde el FACS ARIA a placas sin generar un conjunto. Se dejan crecer los clones y se transfieren a cultivos líquidos y se almacenan a -80 ºC. Las alícuotas de los clones se indujeron después para expresar Fcab sobre su superficie celular como se ha descrito en lo que antecede y se sometieron a detección selectiva para una serie de parámetros en el FACS. Estos parámetros fueron: un intervalo de respuesta a la dosis del antígeno usado para la selección (Her2) con y sin la presencia de Prot A-FITC. Tinción de CD64 como se ha descrito en lo que antecede. Además, usando protocolos de tinción similares, se realizó la detección selectiva de una serie de antígenos biotinilados irrelevantes para identificar los Fcab sin reacciones cruzadas.

Se observó que, tras varias rondas de selección de células positivas para antígeno (Her2) + Prot A, un gran porcentaje

55 de clones muestran > 25 % de positividad al antígeno (Her2) cuando se tiñen con el antígeno (Her2) 500 nM y > 70 % de positividad a la proteína A cuando se tiñen con 2 µg/ml de Prot A-FITC. En la mayoría de los casos, estos clones también mostraron > 50 % de unión a CD64. Por tanto, esto refleja los niveles de tinción con Prot A y CD64 de los fragmentos Fc no aleatorizados (Fcab wt) expresados en levaduras.

Los clones seleccionados como se ha descrito en lo que antecede con características como se ha descrito en lo que antecede se produjeron como moléculas solubles. Esto se realizó principalmente mediante transfección transitoria, pero también mediante transfección estable del ADN de Fcab en las nuevas células hospedadoras. Con este fin, el ADN de clones de levaduras individuales se aisló usando procedimientos estándar. El ADN relevante que codificaba el dominio CH3 completo o solo la parte del dominio CH3 que se aleatorizó en la biblioteca se amplificó mediante PCR y 65 se transfirió a un vector de expresión nuevo que contenía la parte que falta de Fcab y un promotor adecuado y uno de más marcadores de selección, tales como G418, lo que permite la selección de células transfectadas de un conjunto

de células no transfectadas. El nuevo vector se transfectó después transitoriamente en una nueva célula hospedadora, tal como células HEK293 o CHO. Se dejó que las células hospedadoras se recuperaran y se cultivaron posteriormente durante un máximo de 10 días. El sobrenadante de los cultivos que contiene el Fcab soluble se utilizó para su análisis adicional después de la purificación sobre Prot A. Las líneas celulares estables también se pueden realizar por 5 procedimientos estándar.

Tabla 4. Secuencias de clones de levaduras de unión a Her2 seleccionados de bibliotecas iniciales, tras la expansión del conjunto y tras la maduración de la afinidad: con referencia a la numeración de la SEQ ID No. 1 (Figura) (bucle CD); AA169ff NGQPE) 10

Nombre del clon

Bucle AB AA143ff Bucle EF AA198ff

Fcab wt

LTKNQ -—DKSRWQQ

y-Her.C2-P3.1-1

LDNSQ (SEQ ID No. 30) IRSSVGSRRWWS (SEQ ID No. 51)

y-Her.C2-P3.1-3

YEGSS (SEQ ID No. 31) IRSSVGSRRWWS (SEQ ID No. 51)

y-Her.C2-P3.1-5

YMSAD (SEQ ID No. 32) SRRDSSLLRWAH (SEQ ID No. 53)

y-Her.C2-P3.1-6

YRRGD (SEQ ID No. 33) APGSKGYRRWAL (SEQ ID No. 54)

y-Her.C2-P3.1-8

LMSRQ (SEQ ID No. 34) DKPFWGTSRWSR (SEQ ID No. 55)

y-Her.C2-P3.1-16

LHLAQ (SEQ ID No. 35) SINDLINHRWPY (SEQ ID No. 56)

y-Her.C2-P3.1-18

YLSKD (SEQ ID No. 36) MWGSRDYWRWSH (SEQ ID No. 57)

y-Her.C2-P3.2-3

YRSGS (SEQ ID No. 37) NSGSAMMVRWAH (SEQ ID No. 58)

y-Her.C2-P3.2-9

LRDGQ (SEQ ID No. 38) QRSRLSRQRWWR (SEQ ID No. 59)

y-Her.C2.P4.2-1

YSANT (SEQ ID No. 39) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-3

YASNT (SEQ ID No. 40) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-4

YSDGD (SEQ ID No. 41) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-5

YSGGS (SEQ ID No. 42) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-6

YGRDS (SEQ ID No. 43) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-8

YAGGT (SEQ ID No. 44) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-10

YSSDS (SEQ ID No. 45) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-12

YHSGS (SEQ ID No. 46) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-15

YLTNS (SEQ ID No. 47) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-18

YGSEE (SEQ ID No. 48) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-19

YRSGE (SEQ ID No. 49) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-20

YGTDD (SEQ ID No. 50) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

y-Her.C2.P4.2-9

YLHGD (SEQ ID No. 161) ARYSPRMLRWAH (SEQ ID No. 60)

HAF1311A1

YLHGD (SEQ ID No. 161) VSRYSMTMWRWAH (SEQ ID No. 61)

HAF1311A10

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRYSRSMMRWAH (SEQ ID No. 62)

HAF1311A11

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRYSQMMWRWAH (SEQ ID No. 63)

HAF1311A12

YLHGD (SEQ ID No. 161) ITRYSRQMLRWAH (SEQ ID No. 64)

HAF1311A2

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRYSALMWRWAH (SEQ ID No. 65)

HAF1311A3

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSEAMWKWGH (SEQ ID No. 66)

HAF1311A4

YLHGD (SEQ ID No. 161) VGRYSQRMWRWAH (SEQ ID No. 67)

HAF1311A5

YLHGD (SEQ ID No. 161) IRSSVGSRRWWS (SEQ ID No. 51)

HAF1311A6

YLHGD (SEQ ID No. 161) VGRHSPTMWKWAH (SEQ ID No. 69)

HAF1311A7

YLHGD (SEQ ID No. 161) LGRWSPKMWRWAH (SEQ ID No. 70)

HAF1311A8

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARWSPSMMRWAH (SEQ ID No. 71)

HAF1311A9

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARNSPSMWRWAH (SEQ ID No. 83)

HAF1311B1

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARWSPSMVRWAH (SEQ ID No. 84)

HAF1311B10

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARKNHRKWRRTH (SEQ ID No. 85)

HAF1311B11

YLHGD (SEQ ID No. 161) VSRYSPTMWQWAH (SEQ ID No. 86)

HAF1311B12

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSLSMWRWAH (SEQ ID No. 87)

HAF1311B2

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSQTMWRWAH (SEQ ID No. 88)

HAF1311B3

YLHGD (SEQ ID No. 161) MPRFSPSMWRWAH (SEQ ID No. 89)

HAF1311B4

YLHGD (SEQ ID No. 161) VTRYSQSMWRWAH (SEQ ID No. 90)

HAF1311B5

YLHGD (SEQ ID No. 161) IERYSTRMWSWAH (SEQ ID No. 91)

HAF1311B6

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSPEMWHWAH (SEQ ID No. 92)

HAF1311B7

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARGSPSMWSWGH (SEQ ID No. 93)

HAF1311B8

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSQTMWHWAH (SEQ ID No. 94)

HAF1311B9

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARYSPGMWRWAH (SEQ ID No. 95)

HAF1311C1

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRFSPTMWKWAH (SEQ ID No. 96)

HAF1311C10

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRWSRTMLRWAH (SEQ ID No. 97)

HAF1311C11

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRYSPRMWRWAH (SEQ ID No. 98)

HAF1311C2

YLHGD (SEQ ID No. 161) IARHSKSMWSWAH (SEQ ID No. 99)

HAF13112C3

YLHGD (SEQ ID No. 161) MPRWSKSLSGWAH (SEQ ID No. 100)

HAF1311C5

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYTPSMWRWAH (SEQ ID No. 101)

HAF1311C7

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARNSLTMWRWAH (SEQ ID No. 102)

HAF1311C8

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSPSMWKWAH (SEQ ID No. 103)

HAF1311C9

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARFSPSMWRWAH (SEQ ID No. 104)

HAF1311D2

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARWSPSLSRWAH (SEQ ID No. 105)

HAF1311D3

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSPSMWRWAH (SEQ ID No. 106)

HAF1311D4

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRSSLTMWKWAH (SEQ ID No. 107)

HAF1311D5

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRHSTRMWKWAH (SEQ ID No. 108)

HAF1311D6

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRHSRRMWRWAH (SEQ ID No. 109)

HAF1311D7

YLHGD (SEQ ID No. 161) VTRYSPSMWRWAH (SEQ ID No. 110)

HAF1311E10

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRHSRRMWRWAH (SEQ ID No. 109)

HAF1311 E2

YLHGD (SEQ ID No. 161) MPRWSKSLSGWAH (SEQ ID No. 100)

HAF1311 E3

YLHGD (SEQ ID No. 161) VTRHSSSMWRWAH (SEQ ID No. 111)

HAF1311 E4

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSRSMKKWAH (SEQ ID No. 112)

HAF1311 E5

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARGSTTMWRWGH (SEQ ID No. 113)

HAF1311 E6

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARSSPEMWRWAH (SEQ ID No. 114)

HAF1311 E7

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSTGMWNWAH (SEQ ID No. 115)

HAF1311 E8

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRYSQRMWRWAH (SEQ ID No. 116)

HAF1311 E9

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRNSPRMWRWAH (SEQ ID No. 117)

HAF1312F1

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARWSPSMSRWAH (SEQ ID No. 118)

HAF1312G12

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARWSPSMKSWAH (SEQ ID No. 119)

HAF1312F11

YLHGD (SEQ ID No. 161) LPRYSTKMKRWAH (SEQ ID No. 120)

HAF1312F7

YLHGD (SEQ ID No. 161) IRSSVGSRRWWS (SEQ ID No. 51)

HAF1312F3

YLHGD (SEQ ID No. 161) IPRWSQQMSRWAH (SEQ ID No. 122)

HAF1312F5

YLHGD (SEQ ID No. 161) VGRWTPSMWRWAH (SEQ ID No. 123)

HAF1312G10

YLHGD (SEQ ID No. 161) VKRSSPSMWRWAH (SEQ ID No. 124)

HAF1312G2

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARFSPSMWRWAH (SEQ ID No. 104)

HAF1312G1

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARYSPGMWNWAH (SEQ ID No. 125)

HAF1312G9

YLHGD (SEQ ID No. 161) IARYSPNMWNWAH (SEQ ID No. 126)

HAF1312G8

YLHGD (SEQ ID No. 161) IARYSPSMWRWAH (SEQ ID No. 127)

HAF1312F12

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARFSPSMLKWAH (SEQ ID No. 128)

HAF1312F2

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSKSMLKWAH (SEQ ID No. 129)

HAF1312F10

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSRTMWRWGH (SEQ ID No. 130)

HAF1312G7

YLHGD (SEQ ID No. 161) IARHSREMLRWAH (SEQ ID No. 131)

HAF1312F8

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSSTMSRWAH (SEQ ID No. 132)

HAF1321A1

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRYSQRMWRWAH (SEQ ID No. 116)

HAF1321B11

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRYSQMMWRWAH (SEQ ID No. 63)

HAF1321A2

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRYSPRMWRWAH (SEQ ID No. 98)

HAF1321A10

YLHGD (SEQ ID No. 161) IPRWSQQMSRWAH (SEQ ID No. 122)

HAF1321A4

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRHSLKKLQRKH (SEQ ID No. 133)

HAF1321B10

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSLSMWRWAH (SEQ ID No. 87)

HAF1321A5

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSPSMWNWAH (SEQ ID No. 134)

HAF1321B1

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSPTMWKWAH (SEQ ID No. 148)

HAF1321A11

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARFSPSMWRWAH (SEQ ID No. 104)

HAF1321B5

YLHGD (SEQ ID No. 161) VSRFSPSMWRWAH (SEQ ID No. 149)

HAF1321B2

YLHGD (SEQ ID No. 161) VGRWTPSMWRWAH (SEQ ID No. 123)

HAF1321B6

YLHGD (SEQ ID No. 161) IARYSPSMWRWAH (SEQ ID No. 127)

HAF1321 B7

YLHGD (SEQ ID No. 161) IARYSPSMWRWAH (SEQ ID No. 127)

HAF1321B9

YLHGD (SEQ ID No. 161) IPRYTPSMWRWAH (SEQ ID No. 150)

HAF1322C10

YLHGD (SEQ ID No. 161) IPRWSQQMSRWAH (SEQ ID No. 122)

HAF1322C11

YLHGD (SEQ ID No. 161) VPRYSTLMWRWAH (SEQ ID No. 151)

HAF1322C7

YLHGD (SEQ ID No. 161) LPRHSRRMWRWAH (SEQ ID No. 152)

HAF1322C6

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARWSPSMLRWAH (SEQ ID No. 153)

HAF1322C3

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSLSMWRWAH (SEQ ID No. 87)

HAF1322C4

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSPAMWRWAH (SEQ ID No. 154)

HAF1322C8

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARSSPSMWRWAH (SEQ ID No. 147)

H10-03-6

YLYGD (SEQ ID No. 162) VPRHSARMWRWAH (SEQ ID No. 155)

H 10-03-6 R

YLYGD (SEQ ID No. 162) VPRHSARMWRWAH (SEQ ID No. 155)

H 1 0-03-6Y

YLYGD (SEQ ID No. 162) VPRYSARMWRWAH (SEQ ID No. 156)

ABEFs0101

YLSAD (SEQ ID No. 163) VARYSPSMWRWGH (SEQ ID No. 135)

ABS01 01 G

YLSAD (SEQ ID No. 163) VARYSPSMWRWAH (SEQ ID No. 106)

ABS0101P

YLSAD (SEQ ID No. 163) VPRYSASMWRWGH (SEQ ID No. 136)

ABS0101PG

YLSAD (SEQ ID No. 163) VPRYSASMWRWAH (SEQ ID No. 137)

EF3-1

YLHGD (SEQ ID No. 161) LPRYSPGMWRWAH (SEQ ID No. 138)

EF3-2

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSPSMWNWAH (SEQ ID No. 134)

EF3-3

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSPSMWRWGH (SEQ ID No. 135)

EF3-4

YLHGD (SEQ ID No. 161) IPRWSQQMSRWAH (SEQ ID No. 122)

EF3-6

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSQTMSRWAH (SEQ ID No. 139)

EF3-7

YLHGD (SEQ ID No. 161) IARYSPSMWRWAH (SEQ ID No. 127)

EF3-8

YLHGD (SEQ ID No. 161) VAGYRPRRSGSSH (SEQ ID No. 140)

EF3-9

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARHSANMLRWAH (SEQ ID No. 141)

EF3-13

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSPSMWSWAH (SEQ ID No. 142)

EF3-14

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYTPSMWRWAH (SEQ ID No. 101)

EF3-15

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARWSPSMFRWAH (SEQ ID No. 143)

EF3-16

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARWSPSMKSWAH (SEQ ID No. 119)

EF3-17

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARHSRTMWRWGH (SEQ ID No. 130)

EF3-18

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARWSPSMSRWAH (SEQ ID No. 118)

EF3-20

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARWSPSMLRWAH (SEQ ID No. 144)

EF10-01

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARSSPTMWRWAH (SEQ ID No. 145)

EF10-02

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSPSMWRWAH (SEQ ID No. 106)

EF10-03

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARWSPSMMRWAH (SEQ ID No. 71)

EF10-04

YLHGD (SEQ ID No. 161) VTRWSPTMWRWAH (SEQ ID No. 146)

EF10-07

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARNSPSMWRWAH (SEQ ID No. 83)

EF10-08

YLHGD (SEQ ID No. 161) LARWSPSLSRWAH (SEQ ID No. 105)

EF10-09

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARSSPSMWRWAH (SEQ ID No. 147)

EF10-10

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSPRMWRWAH (SEQ ID No. 157)

EF10-13

YLHGD (SEQ ID No. 161) VARYSRKMSSWGH (SEQ ID No. 158)

EF10-14

YLHGD (SEQ ID No. 161) LASYSPSMWRWGH (SEQ ID No. 159)

EF10-15

YLHGD (SEQ ID No. 161) IRSSVGSRRWWS (SEQ ID No. 51)

Tabla 5. Secuencias de clones de levaduras de unión a Her2 seleccionados de bibliotecas iniciales, tras la expansión del conjunto y tras la maduración de la afinidad: con referencia a la numeración de la SEQ ID No. 1 (Figura 3)

Nombre del clon

Bucle AB AA143ff Bucle CD AA169ff Bucle EF AA198ff

H542-M3C8

LSLPC (SEQ ID No. 164) ISGPE (SEQ ID No. 240) PQTPPSQ (SEQ ID No. 340)

H541-M2D7

REGGR (SEQ ID No. 165) NGQPE (SEQ ID No. 241) DKPFWGTSRWSR (SEQ ID No. 55)

H541-M2E11

LTKNQ (SEQ ID No. 166) DGRPE (SEQ ID No. 242) DKPFWGTSRWSR (SEQ ID No. 55)

H541-M2D12

TKAFY (SEQ ID No. 167) NGQPE (SEQ ID No. 241) PPSPPRT (SEQ ID No. 341)

H541-M2H10

TKGL_ (SEQ ID No. 172) NGQPE (SEQ ID No. 241) PPSPPRT (SEQ ID No. 341)

H541-M2H8

TKAFY (SEQ ID No. 167) NGQPE (SEQ ID No. 241) PPSPPRT (SEQ ID No. 341)

H542-M3A10

WWLFG (SEQ ID No. 168) NGQPE (SEQ ID No. 241) PWVRW MQ (SEQ ID No.342)

H542-M3F10

IKKKK (SEQ ID No.169) NGQPE (SEQ ID No. 241) SRARWRH (SEQ ID No. 343)

H542-M3D5

KWNKK (SEQ ID No. 170) NGQPE (SEQ ID No. 241) SRSRWRG (SEQ ID No. 344)

H542-M4A4

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PRWKM (SEQ ID No. 345)

H542-M3G11

YKTKD (SEQ ID No-173) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRYNPRMVRWAH (SEQ ID No. 346)

H542-M3D9

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PQSRWYN (SEQ ID No. 347)

H542-M3F7

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PWSRWRL (SEQ ID No. 348)

H542-M4B 12

RKEKK (SEQ ID No. 174) NGQPE (SEQ ID No. 241) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H542-M3D11

WWVGG (SEQ ID No. 175) DAGPE (SEQ ID No. 243) PWVRWMQ (SEQ ID No. 342)

H542-M3A4

WWRGG (SEQ ID No. 176) NGQPE (SEQ ID No. 241) PWVRWLQ (SEQ ID No. 350)

H542-M3B8

WWRGG (SEQ ID No. 176) NGQPE (SEQ ID No. 241) PWVRW MQ (SEQ ID No.342)

H542-M3C4

YGHKY (SEQ ID No. 177) NKQNH (SEQ ID No. 244) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H542-M4D4

TKKET (SEQ ID No. 178) NGQPE (SEQ ID No. 241) ELEGEEQ (SEQ ID No. 351)

H542-M3A7

TGGNK (SEQ ID No. 179) NMGPE (SEQ ID No. 245) NRSRWQQ (SEQ ID No. 352)

H542-M3C12

LTKNQ (SEQ ID No. 166) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKLKQ (SEQ ID No. 353)

H542-M3E10

LTKNQ (SEQ ID No. 166) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKQLKK (SEQ ID No. 354)

H542-M3E6

LDGDQ (SEQ ID No. 180) NGQPE (SEQ ID No. 241) QQKKRKKKK (SEQ ID No. 355)

H542-M4E9

FIPHN (SEQ ID No. 181) DCGPE (SEQ ID No. 246) PPPLCAP (SEQ ID No. 356)

H542-M4D8

KKKGK (SEQ ID No. 182) NGQPE (SEQ ID No. 241) SLNRWKR (SEQ ID No. 357)

H542-M4H8

KKKGK (SEQ ID No. 182) NGQPE (SEQ ID No. 241) SLNRWKR (SEQ ID No. 357)

H542-M4B11

LTKNQ (SEQ ID No. 166) NGQPE (SEQ ID No. 241) KNKKKRK (SEQ ID No. 358)

H542-M4C10

LTKNQ (SEQ ID No. 166) MDGPE (SEQ ID No. 247) KKKKIKK (SEQ ID No. 359)

H542-M4F11

LTKNQ (SEQ ID No. 166) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKMKK (SEQ ID No. 360)

H542-M4C8

LTKNQ (SEQ ID No. 166) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H542-M4G2

KNKKK (SEQ ID No. 183) NGQPE (SEQ ID No. 241) REREWRK (SEQ ID No. 362)

H542-M4C7

TKKET (SEQ ID No. 178) NGQPE (SEQ ID No. 241) ELEGEEQ (SEQ ID No. 351)

H561 G3M1 B8

KKKNN (SEQ ID No. 184) YPEKH (SEQ ID No. 248) DKSRWQQ (SEQ ID No. 363)

H542-M4D10

TKKET (SEQ ID No. 178) NGQPE (SEQ ID No. 241) ELEGEEQ (SEQ ID No. 351)

H542-M4B3

KKKKR (SEQ ID No. 185) NGQPE (SEQ ID No. 241) PLRLPPM (SEQ ID No. 364)

H542-M4A6

YGHKY (SEQ ID No. 177) NKQNH (SEQ ID No. 244) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H561 G3M1 C6

LKKKT (SEQ ID No. 186) NGQPE (SEQ ID No. 241) PRSNWYGNRWRR (SEQ ID No. 365)

H542-M4C1

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PQSRWYN (SEQ ID No. 347)

H542-M4F4

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PWSRWRL (SEQ ID No. 348)

H561G3M1E1

TKGRW (SEQ ID No. 187) NGAPQ (SEQ ID No. 249) SRARWRH (SEQ ID No. 343)

H542-M4F6

LSLPC (SEQ ID No. 164) ISGPE (SEQ ID No. 240) PQTPPSQ (SEQ ID No. 340)

H561G3M1A1

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) TPGNLAL (SEQ ID No. 366)

H561G3M1A10

KKKNK (SEQ ID No. 188) NGQPE (SEQ ID No. 241) SREDFRA (SEQ ID No. 367)

H561G3M1A9

KHAET (SEQ ID No. 189) NGQPE (SEQ ID No. 241) LVSISVG (SEQ ID No. 368)

H561G3M1B10

-KKKK (SEQ ID No. 190) DYGPM (SEQ ID No. 250) PSRRWRE (SEQ ID No. 369)

H561 G3M1 G4

FFTYW (SEQ ID No. 191) NGQPE (SEQ ID No. 241) DRRRWTA (SEQ ID No. 370)

H561 G3M1 B9

EGKRK (SEQ ID No. 192) NGQPE (SEQ ID No. 241) SRARWRH (SEQ ID No. 343)

H561 G3M1 Cl

RHGGW (SEQ ID No. 193) NGQPE (SEQ ID No. 241) DLQDKKY (SEQ ID No. 371)

H561 G3M1 C2

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) ISVPPDE (SEQ ID No. 372)

H561 G3M1 H8

-KSGY (SEQ ID No. 194) RKKKE (SEQ ID No. 251) SRARWRH (SEQ ID No. 343)

H561 G3M1 C8

AKEGG (SEQ ID No. 195) NGQPE (SEQ ID No. 241) TGPDITV (SEQ ID No. 373)

H561G3M1D1

KYWMA (SEQ ID No. 196) NGQPE (SEQ ID No. 241) IVLSGFR (SEQ ID No. 374)

H561G3M1D5

KKKNK (SEQ ID No. 188) DAGPE (SEQ ID No. 243) MGIHNIN (SEQ ID No. 375)

H564G11 M2F4

LTKNQ (SEQ ID No. 166) NGQPE (SEQ ID No. 241) MKQDEMA (SEQ ID No. 376)

H561 G3M1 E2

FFTYW (SEQ ID No. 191) NGQPE (SEQ ID No. 241) DRRRWTA (SEQ ID No. 370)

H561 G3M1 E6

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PQW RLQW (SEQ ID No.377)

H561 G3M1 E7

KKKNK (SEQ ID No. 188) NGQPE (SEQ ID No. 241) HRRLVAR (SEQ ID No. 378)

H561G3M1F10

QLRNK (SEQ ID No. 197) NGQPE (SEQ ID No. 241) KQNLRRK (SEQ ID No. 379)

H561 G3M1 F2

QRGRM (SEQ ID No. 198) KGGRE (SEQ ID No. 252) SRARWRH (SEQ ID No. 343)

H561G3M1G1

QRGRM (SEQ ID No. 198) KGGRE (SEQ ID No. 252) SRARWRH (SEQ ID No. 343)

H564G11 M2F12

KNHNT (SEQ ID No. 199) NGQPE (SEQ ID No. 241) SRSRLHGNRWRR (SEQ ID No. 380)

H561 G3M1 H3

KKKKK (SEQ ID No. 171) GNWQP (SEQ ID No. 253) NRERWRR (SEQ ID No. 381)

H561 G3M1 H7

MSENE (SEQ ID No. 200) NGQPE (SEQ ID No. 241) TWVRW MQ (SEQ ID No.382)

H564G11 M2G2

KKKNK (SEQ ID No. 188) TTGPY (SEQ ID No. 254) PWSRWRL (SEQ ID No. 348)

H564G11M2A10

KKKNK (SEQ ID No. 188) NGQPE (SEQ ID No. 241) PHWQWKW (SEQ ID No. 383)

H564G11 M2A4

YGHKY (SEQ ID No. 177) DMNQP (SEQ ID No. 255) SKKKLRK (SEQ ID No. 384)

H564G11 M2A5

YGHKY (SEQ ID No. 177) KWPMF (SEQ ID No. 256) PWKRLRK (SEQ ID No. 385)

H564G11 M2A9

WWMDY (SEQ ID No. 201) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H564G11 M2B1

YGHKY (SEQ ID No. 177) HDQRH (SEQ ID No. 257) TQKRWRS (SEQ ID No. 386)

H564G11 M2B12

MKKNK (SEQ ID No. 202) LGMYM (SEQ ID No. 258) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H564G11 M2B3

YGHKY (SEQ ID No. 177) NKMFT (SEQ ID No.259) NRKHLRA (SEQ ID No. 387)

H564G11 M2B4

EYFRH (SEQ ID No. 203) NGQPE (SEQ ID No. 241) TRRRWTR (SEQ ID No. 388)

H564G11 M2B5

KKKNK (SEQ ID No. 188) NGQPE (SEQ ID No. 241) DHRRINR (SEQ ID No. 389)

H564G11 M2B7

FDMRD (SEQ ID No. 204) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H564G11 M2C1

MKKPY (SEQ ID No. 205) LGYPE (SEQ ID No. 260) KKKKYHK (SEQ ID No. 390)

H564G11 M2C11

KKKNN (SEQ ID No. 184) HGYQL (SEQ ID No. 261) PWVRW MQ (SEQ ID No.342)

H564G11 M2C3

YGHKY (SEQ ID No. 177) NVFIE (SEQ ID No. 262) QKKKLKK (SEQ ID No. 391)

H564G11 M2C7

FEMPY (SEQ ID No. 206) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H564G11 M2C9

YGHKY (SEQ ID No. 177) NRGWH (SEQ ID No. 263) PQKKLRK (SEQ ID No. 392)

H564G11 M2D1

KKKNH (SEQ ID No. 207) PFTLK (SEQ ID No. 264) DKRGIRK (SEQ ID No. 393)

H564G11M2D10

FFTYW (SEQ ID No. 191) NGQPE (SEQ ID No. 241) DRRRWTA (SEQ ID No. 370)

H564G11 M2D4

-KKKK (SEQ ID No. 190) DYGPM (SEQ ID No. 250) PSRRWRE (SEQ ID No. 369)

H564G11 M2D9

YGHKY (SEQ ID No. 177) STTRV (SEQ ID No. 265) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H564G11M2E10

KKKNH (SEQ ID No. 207) WDQHQ (SEQ ID No. 266) EKKRWKE (SEQ ID No. 394)

H564G11 M2E11

-KKKK (SEQ ID No. 190) DYGPM (SEQ ID No. 250) TSRRWRE (SEQ ID No. 395)

H564G11 M2E3

YGHKY (SEQ ID No. 177) SGWMM (SEQ ID No. 267) KKEKLRK (SEQ ID No. 396)

H564G11 M2E8

YGHKY (SEQ ID No. 177) WRKMT (SEQ ID No. 268) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H564G11M2H10

YGHKY (SEQ ID No. 177) FPKKY (SEQ ID No. 269) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H564G11 M2F2

MWEPS (SEQ ID No. 208) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKLKK (SEQ ID No. 397)

H564G11 M2F5

LRGST (SEQ ID No. 209) SPYFV (SEQ ID No. 270) KKKKIMK (SEQ ID No. 398)

H564G11 M2F6

KKKKK (SEQ ID No. 171) IRGTS (SEQ ID No.271) DQTRWRR (SEQ ID No. 399)

H564G11 M2F7

DSYMI (SEQ ID No. 210) NGQPE (SEQ ID No. 241) TWVRWMQ (SEQ ID No. 382)

H564G11 M2F9

YGHKY (SEQ ID No. 177) QVPGW (SEQ ID No. 272) KKKEIKK (SEQ ID No. 400)

H564G11 M2G4

YGHKY (SEQ ID No. 177) DLPYQ (SEQ ID No. 273) KKNKLKK (SEQ ID No. 401)

H564G11 M2G6

YGHKY (SEQ ID No. 177) PRSHW (SEQ ID No. 274) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H564G11 M2G7

KKKNK (SEQ ID No. 188) LYGHA (SEQ ID No. 275) NRERWRR (SEQ ID No. 381)

H564G11 M2G9

KKKNK (SEQ ID No. 188) NGQPE (SEQ ID No. 241) PWWQFRQ (SEQ ID No. 402)

H564G11 M2H2

YGHKY (SEQ ID No. 177) APYVH (SEQ ID No. 276) KKKEIKK (SEQ ID No. 400)

H564G11 M2H3

MEQHS (SEQ ID No. 211) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H564G11 M2H4

YGHKY (SEQ ID No. 177) RTGQK (SEQ ID No. 277) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H564G11 M2H8

YGHKY (SEQ ID No. 177) PTYWY (SEQ ID No. 278) NRKHLRA (SEQ ID No. 387)

H564G11 M2H9

KKKKH (SEQ ID No. 212) EGMEI (SEQ ID No. 279) PSRRWRE (SEQ ID No. 369)

H565_G12C1

LKKKT (SEQ ID No. 186) NGQPE (SEQ ID No. 241) PRSNWYGNRWRR (SEQ ID No. 365)

H565_G12D5

KKKKK (SEQ ID No. 171) PWGA (SEQ ID No.280) DQSKLSSLRWKK (SEQ ID No. 403)

H565_G12E4

KKKKK (SEQ ID No. 171) PLMVD (SEQ ID No. 281) DQSKLSSLRWKK (SEQ ID No. 403)

H565_G12A1

KKKNH (SEQ ID No. 207) KYGSQ (SEQ ID No. 282) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12C4

KKKNH (SEQ ID No. 207) RWNNQ (SEQ ID No. 283) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12F1

KKKNH (SEQ ID No. 207) VYKQD (SEQ ID No. 284) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565 G12A10

KKKNH (SEQ ID No. 207) NQMKF (SEQ ID No. 285) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12A8

KKKNH (SEQ ID No. 207) NHQHT (SEQ ID No. 286) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12A4

KKKNH (SEQ ID No. 207) KRFVD (SEQ ID No. 287) PNEKLKK (SEQ ID No. 404)

H565_G12B2

KKKNH (SEQ ID No. 207) HHEPL (SEQ ID No. 288) PLSRWKR (SEQ ID No. 405)

H565_G12F4

KKKNH (SEQ ID No. 207) PKMPY (SEQ ID No. 289) NRKHLRA (SEQ ID No. 387)

H565_G12H5

KKKNH (SEQ ID No. 207) PKDHE (SEQ ID No. 290) ARSRWRK (SEQ ID No. 408)

H565_G12G6

LTKNQ (SEQ ID No. 166) AKGSI (SEQ ID No. 291) PKKRLRR (SEQ ID No. 409)

H565_G12A5

YGHKY (SEQ ID No. 177) EDPEM (SEQ ID No. 292) KNKKRKK (SEQ ID No. 410)

H565_G12E9

YGHKY (SEQ ID No. 177) EFDHQ (SEQ ID No. 293) KNKKRKK (SEQ ID No. 410)

H565_G12F8

YGHKY (SEQ ID No. 177) NEKQD (SEQ ID No. 294) NTKKLKK (SEQ ID No. 411)

H565_G12D2

YGHKY (SEQ ID No. 177) APHYY (SEQ ID No. 295) NRKRIRK (SEQ ID No. 412)

H565_G12F7

YGHKY (SEQ ID No. 177) PQLHL (SEQ ID No. 296) SRKRFRS (SEQ ID No. 413)

H565_G12G2

YGHKY (SEQ ID No. 177) NWRAE (SEQ ID No. 297) ARSRWRK (SEQ ID No. 408)

H565_G12H11

YGHKY (SEQ ID No. 177) NNQYK (SEQ ID No. 298) PFRRWVK (SEQ ID No. 414)

H565_G12A7

YGHKY (SEQ ID No. 177) -RSIH (SEQ ID No. 299) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12A9

YGHKY (SEQ ID No. 177) RDRIM (SEQ ID No. 300) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12B3

YGHKY (SEQ ID No. 177) YGKGH (SEQ ID No. 301) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12B5

YGHKY (SEQ ID No. 177) GKGGK (SEQ ID No. 302) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12E3

YGHKY (SEQ ID No. 177) RHIGK (SEQ ID No. 303) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12E12

YGHKY (SEQ ID No. 177) QYTYH (SEQ ID No. 304) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12B1

YGHKY (SEQ ID No. 177) LHSHV (SEQ ID No. 305) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12B11

YGHKY (SEQ ID No. 177) STTRV (SEQ ID No. 265) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12D1

YGHKY (SEQ ID No. 177) ARDKR (SEQ ID No. 306) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12E2

YGHKY (SEQ ID No. 177) EHKKT (SEQ ID No. 307) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12C5

KKKKK (SEQ ID No. 171) MDEVP (SEQ ID No. 308) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12C7

-KKKK (SEQ ID No. 190) QDWQR (SEQ ID No. 309) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12G1

-KKKK (SEQ ID No. 190) PSDRE (SEQ ID No. 310) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12G8

NKKKK (SEQ ID No. 213) QNTRW (SEQ ID No. 311) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12C9

-KKKK (SEQ ID No. 190) DEGLH (SEQ ID No. 312) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H565_G12A11

IMNDW (SEQ ID No. 214) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H565_G12D10

WTNGD (SEQ ID No. 215) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H565_G12F6

WWHDM (SEQ ID No. 216) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H565_G12B4

WENPH (SEQ ID No. 217) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H565_G12H2

LYHEH (SEQ ID No. 218) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H565_G12H8

GGDQH (SEQ ID No. 219) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H565_G12C12

IYVPY (SEQ ID No. 220) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H565_G12G10

FEMPY (SEQ ID No. 206) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H565_G12C2

VVTSQ (SEQ ID No. 221) NGQPE (SEQ ID No. 241) KRKKLKK (SEQ ID No. 361)

H565_G12B6

WWNSK (SEQ ID No. 222) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKQLKK (SEQ ID No. 354)

H565_G12A12

MTGPG (SEQ ID No. 223) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKIKK (SEQ ID No. 359)

H565_G12D7

MWEPS (SEQ ID No. 208) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKLKK (SEQ ID No. 397)

H565_G12F3

DTYHD (SEQ ID No. 224) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKLKK (SEQ ID No. 397)

H565_G12F5

QDEKT (SEQ ID No. 225) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKIKK (SEQ ID No. 359)

H565_G12B12

GDHRI (SEQ ID No. 226) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKLKQ (SEQ ID No. 353)

H565_G12D8

RNSNS (SEQ ID No. 227) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKLKQ (SEQ ID No. 353)

H565_G12D9

RENTM (SEQ ID No. 228) NGQPE (SEQ ID No. 241) NKKKKKK (SEQ ID No. 415)

H565_G12H9

VNDKM (SEQ ID No. 229) NGQPE (SEQ ID No. 241) SKKKLRK (SEQ ID No. 384)

H565_G12E1

RKKDE (SEQ ID No. 230) WPNME (SEQ ID No. 313) KKKKLKK (SEQ ID No. 397)

H565_G12E8

SNSGY (SEQ ID No. 231) MDGPE (SEQ ID No. 247) KKKKIKK (SEQ ID No. 359)

H565_G12G7

FEYRH (SEQ ID No. 232) NGQPE (SEQ ID No. 241) PKKRLRR (SEQ ID No. 409)

H565_G12E5

QRGRM (SEQ ID No. 198) KGGRE (SEQ ID No. 252) SRARWRH (SEQ ID No. 343)

H565_G12A2

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) NGKRLHS (SEQ ID No. 416)

H565_G12C8

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PKWLWHQ (SEQ ID No. 417)

H565_G12E7

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PWWKHHV (SEQ ID No. 418)

H565_G12F12

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PNWKYQW (SEQ ID No. 419)

H565_G12F10

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) PQRKVAP (SEQ ID No. 420)

H565_G12G9

RKKKK (SEQ ID No. 233) NGQPE (SEQ ID No. 241) PWYKVLM (SEQ ID No. 421)

H565_G12H10

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) DRKWWTF (SEQ ID No. 422)

H565_G12A3

KKKKK (SEQ ID No. 171) MTGRV (SEQ ID No. 314) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H565_G12B8

KKKKK (SEQ ID No. 171) GKYNI (SEQ ID No. 315) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H565_G12H4

KKKKK (SEQ ID No. 171) NAYLL (SEQ ID No. 316) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H565_G12C10

KKKKK (SEQ ID No. 171) NGQPE (SEQ ID No. 241) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H565_G12C6

KKKKK (SEQ ID No. 171) AQYNV (SEQ ID No. 317) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H565_G12G11

KKKKK (SEQ ID No. 171) LYGHA (SEQ ID No. 275) NRERWRR (SEQ ID No. 381)

H565_G12G5

KKKKK (SEQ ID No. 171) LYGHA (SEQ ID No. 275) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H565_G12A6

KKKKK (SEQ ID No. 171) NQVMT (SEQ ID No. 318) PSRRWRE (SEQ ID No. 369)

H565_G12E6

KKKKK (SEQ ID No. 171) VVHDT (SEQ ID No. 319) PRHEWVM (SEQ ID No. 423)

H565_G12B10

KKKKK (SEQ ID No. 171) NIWHQ (SEQ ID No. 320) DKSRWQQ (SEQ ID No. 363)

H565_G12H6

KKKKK (SEQ ID No. 171) QWGNM (SEQ ID No. 321) DKSRWQQ (SEQ ID No. 363)

H565_G12D12

KKKKK (SEQ ID No. 171) MHVKS (SEQ ID No. 322) PWSRWMQ (SEQ ID No. 424)

H565_G12B9

-KKKK (SEQ ID No. 190) EYTVV (SEQ ID No. 323) PLSRWKR (SEQ ID No. 405)

H565_G12E11

-KKKK (SEQ ID No. 190) GPYQD (SEQ ID No. 324) PLSRWKR (SEQ ID No. 405)

H565_G12F9

KKKKK (SEQ ID No. 171) QGVLE (SEQ ID No. 325) TQNQIKK (SEQ ID No. 406)

H571A1

KKKKK (SEQ ID No. 171) LYGHA (SEQ ID No. 275) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H571C10

KKKKK (SEQ ID No. 171) QQPGV (SEQ ID No. 326) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H571 E6

KKKKK (SEQ ID No. 171) NQVRG (SEQ ID No. 327) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H571D10

KKKKK (SEQ ID No. 171) VPHVL (SEQ ID No. 328) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H571D4

KKKKK (SEQ ID No. 171) DGRKQ (SEQ ID No. 329) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H571 C3

KKKKK (SEQ ID No. 171) NASFE (SEQ ID No. 330) DRERWRR (SEQ ID No. 407)

H571A3

LTKNQ (SEQ ID No. 166) KKRVV (SEQ ID No. 331) SRARWLH (SEQ ID No. 425)

H571D7

YGHKY (SEQ ID No. 177) KGIKK (SEQ ID No. 332) SRARWLH (SEQ ID No. 425)

H571B1

QRGRM (SEQ ID No. 198) KGGRE (SEQ ID No. 252) SRARWLH (SEQ ID No. 425)

H571 B9

TKGRW (SEQ ID No. 187) NGAPQ (SEQ ID No. 249) SRARWLH (SEQ ID No. 425)

H571 E5

EGKRK (SEQ ID No. 192) NGQPE (SEQ ID No. 241) SRARWLH (SEQ ID No. 425)

H571A5

YGHKY (SEQ ID No. 177) YRRGD (SEQ ID No. 33) PKKRLRR (SEQ ID No. 409)

H571A9

YGHKY (SEQ ID No. 177) PMGKY (SEQ ID No. 334) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H571 C9

YGHKY (SEQ ID No. 177) FPKKY (SEQ ID No. 269) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H571 B3

YGHKY (SEQ ID No. 177) RHIGK (SEQ ID No. 303) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H571D9

YGNSY (SEQ ID No. 234) RGIAK (SEQ ID No. 335) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H571 C2

KKKNK (SEQ ID No. 188) LWGGM (SEQ ID No. 336) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H571 C5

KKKNH (SEQ ID No. 207) NAHYI (SEQ ID No. 337) PQKRWRS (SEQ ID No. 349)

H571B11

RNRKK (SEQ ID No. 235) SGTRL (SEQ ID No. 338) PSRRWRE (SEQ ID No. 369)

H571A6

WDHGS (SEQ ID No. 236) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKIKK (SEQ ID No. 359)

H571 F3

FAKRT (SEQ ID No. 237) NGQPE (SEQ ID No. 241) KKKKLKQ (SEQ ID No. 353)

H571E12

SMDKV (SEQ ID No. 238) YRRGD (SEQ ID No. 33) DKSRWQQ (SEQ ID No. 363)

H571A7

FFTYW (SEQ ID No. 191) NGQPE (SEQ ID No. 241) DRRRWTA (SEQ ID No. 370)

H571D12

EYFRH (SEQ ID No. 203) NGQPE (SEQ ID No. 241) TRRRWTR (SEQ ID No. 388)

H571D6

RHQDR (SEQ ID No. 239) NGQPE (SEQ ID No. 241) NRSRLHGNRWRR (SEQ ID No. 426)

H571A2

LKKKT (SEQ ID No. 186) NGQPE (SEQ ID No. 241) PRSNWYGNRWRR (SEQ ID No. 365)

Expresión y purificación de clones específicos de antígeno en células de mamíferos:

Clones seleccionados como se ha descrito en lo que antecede con características como se ha descrito en lo que antecede se clonan en un vector de expresión en mamíferos tal como pCEP4 (Invitrogen). Se usa ADN plasmídico altamente purificado (Qiagen) para transfectar transitoriamente células libres HEK293 con reactivo Freestyle™ MAX

según las recomendaciones del fabricante (Invitrogen). El día 5 después de la transfección, los sobrenadantes se limpian de restos celulares mediante centrifugación y filtración a través de un filtro de 0,2 µM Stericup (Millipore). Como alternativa, las células libres HEK293 o células CHO se transfectan con plásmidos de expresión que contienen genes para la resistencia a antibióticos, tales como neomicina o puromicina. Las células transfectadas se cultivan en 5 presencia de los antibióticos dando lugar a una supervivencia específica de clones de células que expresan de forma estable el gen de resistencia a antibióticos junto con el fragmento Fc específico de antígeno. Estos transfectantes estables segregan constantemente la proteína de interés durante períodos de tiempo largos. Los Fcab específicos de antígeno se purificaron a partir de los sobrenadantes celulares mediante cromatografía de inmunoafinidad de la proteína A. Los Fcab unidos se eluyen de la proteína A lavando la columna con tampón glicina (pH=2,9-4,0), seguido

10 de diálisis frente a PBS (pH = 6,8). La pureza de los Fcab se determina mediante análisis de SDS-PAGE no reductor y los potenciales agregados se detectan mediante HPLC de exclusión por tamaño usando una columna Zorbax GF250 y PBS como tampón de carrera.

Caracterización estructural de Fcab:

15 Se usó la unión a receptores Fc y la proteína A para estimar la integridad estructural global de los Fcab purificados. La asociación con el receptor neonatal de Fc (FcRn) se midió mediante la adición de 10 µg/ml de Fcab a un chip de Biacore CM5 acoplado a 5.000 unidades de respuesta (UR) del FcRn humano recombinante a pH = 6,0. La disociación de Fcab del FcRn se analizó a pH = 7,4. Estos experimentos demostraron una interacción dependiente del pH de los

20 Fcab específicos de Her2 con FcRn con características de unión muy similares a las del Fcab silvestre. La unión de Fcab al receptor CD64 de Fc de alta afinidad se midió utilizando un chip de Biacore CM5 revestido con 3000 UR de Proteína A, seguido de la adición de una solución de Fcab 10 µg/ml. Finalmente, se añadió CD64 humano soluble a 5 µg/ml. Las curvas de unión resultantes eran indistinguibles de las obtenidas con el Fcab tipo silvestre. La interacción de Fcab recombinantes (10 µg/ml) con Proteína A también se midió mediante SPR usando un chip de Biacore CM5

25 recubierto con proteína A (3.000 UR). De nuevo, las afinidades eran comparables a las obtenidas con el Fcab silvestre.

Unión específica de antígeno para Fcab:

La potencia y especificidad de los Fcab específicos de Her2 para unirse a Her-2 se evaluó por ELISA. El Her-2 humano

30 soluble (Bender Med Systems, Austria) se recubrió con plástico a 2 µg/ml. Después de lavar y bloquear los sitios de unión no específica, se añadieron concentraciones crecientes de Fcab. Para detectar los Fcab unidos a Her2, se añadieron anticuerpos monoclonales específicos del dominio CH2 anti-Fc que se conjugaron con peroxidasa de rábano picante (Serotec). Los resultados demostraron que algunos Fcab específicos de Her-2 podían interaccionar con su diana en el límite bajo nanomolar (Tabla 6). Esta interacción fue específica, ya que la unión a otros miembros de

35 la familia Her (Her1, Her3 y Her4) fue >100 veces más débil según el ELISA. No se detectó unión a antígenos Her-2 no relacionados.

Tabla 6: Afinidades de unión de Fcab específicos de Her-2 en ELISA:

clon de Fcab

CE50 [nM] ELISA de Her-2 CE50 [nM] de unión a células SKBR3

y-Her.C2.P4.2-3

463 nr

y-Her.C2.P4.2-4

370 nr

H561G3M1G4

263 nr

y-Her.C2.P4.2-19

93 nr

ABEFs0101

16,1 5,2

H10-03-6

4,8 10,3

EF3-17

4,7 1,3

y-Her.C2.P4.2-9

4,3 nr

H10-03-6R

2,6 11,1

nr= no realizado

40 La unión al antígeno también se determinó mediante SPR. Se recubrieron chips Biacore CM5 con diferentes cantidades de Her-2 soluble humano, seguido de la adición de concentraciones crecientes de Fcab. La afinidad (Kd) de los Fcab se calculó a partir de las curvas de unión resultantes tras ajustar usando el software BiaEval. En estas condiciones experimentales. Los Fcab específicos de Her-2 H561G3M1G4 y H10-03-6 se unieron a Her-2 con valores

45 deKd de 7,55nM y 8,6nM, respectivamente. También se evaluó la unión al antígeno por FACS usando las líneas celulares de cáncer de mama humano que sobreexpresan Her-2, SKBR3 y Calu-3. Se incubaron 1x105 células con concentraciones crecientes de Fcab durante 60 minutos en hielo. Después, los anticuerpos no unidos se eliminaron

mediante centrifugación y lavado. Los Fcab unidos a las células se detectaron por incubación con anticuerpos específicos anti-Fc humanos conjugados con ficoeritrina (Sigma) durante 60 minutos en hielo. Después de lavar las células, se midió la intensidad de la fluorescencia en la superficie celular en un instrumento FACS Calibur (Beckton Dickinson). Todas las bandas de Fcab específicos de Her-2 se unieron a las células SKBR3 y Calu-3, pero solo

5 mínimamente a las células MDA-MB468 que no expresan Her-2, lo que confirma la débil reactividad cruzada observada en el ELISA. Las afinidades aparentes (CE50) de los Fcab específicos de Her-2 sobre las células SKBR3 se enumeran en la Tabla 6.

Función efectora de Fcab específicos de antígeno (ADCC):

Con el fin de determinar si los Fcab específicos de Her-2 median las funciones efectoras de Fc, se realizan ensayos de ADCC. En estos tipos de ensayos, los anticuerpos se unen a las células diana y las marcan para apoptosis gracias a la unión a los receptores Fc sobre las células efectoras, tales como células asesinas naturales (NK). Las células SKBR3 (células diana) que están marcadas con el colorante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) se

15 incuban con concentraciones crecientes de Fcab específicos de Her-2 durante 20 minutos a 37 ° C. Las células NK sin tocar se aíslan a partir de sangre humana de donantes sanos por agotamiento negativo en un dispositivo de AutoMACS usando esferas magnéticas de MACS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech). Las células NK purificadas se mezclan con las células SKBR3 opsonizadas en una proporción de 5:1 y se incuban durante 4 horas a 37 ° C. Después, se añade el colorante de fluorescencia 7-amino actinomicina (7-AAD), que tiñe específicamente las células apoptóticas. Las células apoptóticas SKBR3 se enumeran en el FACS como células dobles positivas a 7-AAD/CSFE. Los Fcab específicos de Her-2 H10-03-6 y ABEFs0101 demostraron ser potentes mediadores de la muerte de las células SKBR3, con valores de CD50 de 1,1 nM y 1,0 nM, respectivamente. El mecanismo de la inducción de apoptosis es dependiente de la presencia de células NK que demuestra que los Fcab específicos de Her-2 poseen funcionalidad de ADCC.

25 Ejemplo 7: Expresión en levaduras de Fab 4D5

Para la expresión de un fragmento Fab en levaduras, el vector de expresión en levadura pYD1 (Invitrogen) (SEQ ID No. 72 / Figura 17) se modifica como sigue:

Se introduce un sitio de restricción NheI mediante mutagénesis dirigida en la posición 581/586 para producir el vector modificado pYD1 Nhe (SEQ ID No. 73 / Figura 18). Este vector se restringe con NheI y PmeI, para producir 3 fragmentos. El fragmento más grande es el esqueleto del vector restante, en el que se inserta un enlazador oligonucleótido sintético para producir el vector pYD1lnk (SEQ ID No. 74 / Figura 19). Posteriormente, se amplifica

35 por PCR un casete que incluye la región de terminación de la transcripción MATα a partir del vector pYD1 y se clona en pYD1lnk a través de BamHI y PstI de restricción y ligación. El vector resultante es pYD1 mata (SEQ ID No.75 / Figura 20). Un casete que contiene el promotor GAL1, el gen que codifica AGA2 y un enlazador sintético con sitios de clonación NotI y SfiI se amplifica por PCR a partir de pYD1 y se clona en pYD1mata a través de la restricción EcoRI y PacI para producir el vector pYD1gal (SEQ.ID N º 76 / Figura 21).

Como un ejemplo para un Fab que se muestra en la levadura, los genes que codifican VH-CH1 y VL-CL, respectivamente, del anticuerpo 4D5 (Herceptin) se hacen sintéticamente (secuencias 4D5H (SEQ ID No. 77 / Figura 22) y 4D5L (SEQ ID No. 78 / Figura 23)).

45 4D5H está flanqueado por los sitios de restricción SfiI y NotI, y se clona en el vector pYD1gal para producir el vector pYD4D5hc (SEQ ID No. 79 / Figura 24). En este vector, el extremo N-terminal de 4D5H se fusiona con el extremo C-terminal de AGA2, y en el extremo C-terminal de 4D5H está unido un marcador de hexahistidina, seguido por el codón de terminación. La secuencia de aminoácidos de VH-CH1 de 4D5 se da en 4D5hp (SEC ID No. 80/Figura 25).

4D5H está flanqueado por los sitios de restricción Ncol y Ascl y se clona en el vector pYD1gal para producir el vector pYD4D5hc (SEQ ID No. 79 / Figura 26). 4D5L está precedido por una señal de secreción de AGA2, y lleva un codón de terminación después del resto de cisteína C-terminal del dominio CL. La secuencia de aminoácidos de VL-CL de 4D5 se da en 4D5lp (SEC ID No.82 / Figura 27).

55 Para la expresión de Fab 4D5, el vector pYD4D5hl se utiliza para transformar la cepa de levadura EBY100 (Invitrogen), se seleccionan los transformantes en medio mínimo sin triptófano, y la expresión de la proteína recombinante se induce por crecimiento en un medio que contiene galactosa de acuerdo con protocolos estándar (Invitrogen).

Ejemplo 8: Construcción de una biblioteca con restos aleatorizados en los bucles estructurales del dominio CL de 4D5 Fab

Como primer paso en la construcción de la biblioteca de presentación en levadura, el dominio CL silvestre (kappa C) se corta del vector de expresión pYD4D5hl (SEQ ID No. 81) con las enzimas de restricción BsiWI y AscI. Se prepara un gen sintético que codifica dominios kappa C humanos flanqueados por BsiWI y AscI (en el contexto de acuerdo con 65 pYD4D5hl) en el que se introducen mutaciones e inserciones aleatorias, respectivamente, en los bucles AB y EF. En este ejemplo en particular, la inserción de 3, 4 o 5 codones NNB se realiza entre los aminoácidos 16 y 17 del dominio

C kappa humano, y las posiciones de los restos 92, 93, 94, 95, 97, 98 y 99 se reemplazan por los codones NNB. (numeración IMGT, véase la Figura 2). Un codón NNB contiene los 4 nucleótidos en las posiciones 1 y 2 y C, G y T en la posición 3. Por tanto, NNB codifica los 20 aminoácidos de origen natural.

5 La biblioteca se prepara y se selecciona siguiendo procedimientos convencionales.

Como ligando estructural se usan epítopos 4D5 y Her2neu diana de CDR. Dichos miembros de la biblioteca se seleccionan para la producción de un anticuerpo modular citotóxico que tiene un sitio de unión modificado por ingeniería en el dominio CL, que es una unión específica a una molécula efectora, tal como un receptor Fc gamma. El

10 Fab resultante se analiza para determinar su (i) unión a Her2neu con una Kd<108 M y una CI50<108 M, y (ii) la función efectora, usando un ensayo de CDC y/o ADCC.

LISTADO DE SECUENCIAS

15 <110> F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H.

<120> Inmunoglobulina citotóxica

<130> SMW/CP6896989 20

<140> EP

<141>

<140> EP 09737920.0 25 <141>

<150> EP 08450068.5

<151> 30 <160> 439

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 35 <211> 232

<212> PRT

<213> ser humano

<400> 1 40

<210> 2

<211> 237

<212> PRT

<213> artificial

<220> 5 <223> IgG humana que incluye modificaciones de aminoácidos aleatorizadas

<220>

<221> misc_feature

<222>

(144)..(146) 10 <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature

<222>

(198)..(205) 15 <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature

<222>

(208)..(209) 20 <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 2

<210> 3

<211> 728 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia de ADN para la clonación de la IgG modificada (secuencia modificada por ingeniería) 10

<220>

<221> misc_feature

<222> (438)..(439)

<223>n es a,c,g o t 15

<220>

<221> misc_feature

<222> (441)..(442)

<223>n es a,c,g o t

<220>

5 <221> misc_feature

<222> (444)..(445)

<223>n es a,c,g o t

<220>

10 <221> misc_feature

<222> (600)..(601)

<223>n es a,c,g o t

<220>

15 <221> misc_feature

<222> (603)..(604)

<223>n es a,c,g o t

<220>

20 <221> misc_feature

<222> (606)..(607)

<223>n es a,c,g o t

<220>

25 <221> misc_feature

<222> (609)..(610)

<223>n es a,c,g o t

<220>

30 <221> misc_feature

<222> (612)..(613)

<223>n es a,c,g o t

<220>

35 <221> misc_feature

<222> (615)..(616)

<223>n es a,c,g o t

<220>

40 <221> misc_feature

<222> (618)..(619)

<223>n es a,c,g o t

<220>

45 <221> misc_feature

<222> (621)..(622)

<223>n es a,c,g o t

<220>

50 <221> misc_feature

<222> (630)..(631)

<223>n es a,c,g o t

<220>

55 <221> misc_feature

<222> (633)..(634)

<223>n es a,c,g o t

<400> 3 60

5

<210> 4 <211> 33 <212> ADN <213> artificial

10

<220> <223> Cebador para PCR EPKSNCO <400> 4 ccatggccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctc 33

15

<210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> artificial

20

<220> <223> Cebador para PCR CH3LSAC

<400> 5 agtcgagctc gtcacgggat gggggcaggg

30

25

<210> 6 <211> 41 <212> ADN <213> artificial

30

<220> <223> Cebador para PCR CH3CSAC

35

<220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n es a, c, g o t

40

<220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n es a, c, g o t

5

<220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n es a, c, g o t

<400> 6 gtacgagctc nnsnnsnnsc aagtcagcct gacctgcctg g

41

15

<210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Cebador para PCR CH3CHIN

<400> 7 tgccaagctt gctgtagagg aagaaggagc cg

32

25

<210> 8 <211> 59 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador para PCR CH3RHIN

<220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n es a, c, g o t

35

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n es a, c, g o t

<220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n es a, c, g o t

45

<220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n es a, c, g o t

<220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n es a, c, g o t

55

<400> 8 tgccaagctt accgtgnnsn nsnnsaggtg gnnsnnsggg aacgtcttct catgctccg 59

<210> 9 <211> 33 <212> ADN <213> artificial

65

<220> <223> Cebador para PCR CH3RNOT <400> 9

agttgcggcc gctttacccg gagacaggga gag

33

5

<210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> artificial

10

<220> <223> Región de unión <400> 10

15 <210> 11

<211> 662

<212> PRT

<213> artificial

20 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de FcabRGD4L

<400> 11

<210> 12

<211> 5200 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector pHENFcabRGD4 10

<400> 12

5

<210> 13 <211> 48 <212> ADN <213> artificial

10

<220> <223> CH3rlink <400> 13 actagcggcc gcagagccac caccctcctt acccggagac agggagag 48

15

<210> 14 <211> 5215 <212> ADN <213> artificial

20

<220> <223> vector pHENFcabRGD4L

<400> 14

<210> 15

<211> 5013 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> vector pYD1dX 10

<400> 15

<210> 16

<211> 5971 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> vector pYD1dXFc 10

<400> 16

<210> 17

<211> 5657 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> pYD1CH12 10

<400> 17

<210> 18

<211> 738

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Fcab01

<220>

<221> misc_feature

<222> (449)..(450)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (452)..(453)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (455)..(456)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (611)..(612)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (614)..(615)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (617)..(618)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (620)..(621)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (623)..(624)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (626)..(627)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (629)..(630)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (632)..(633)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (641)..(642)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (644)..(645)

<223>n es a,c,g o t

<400> 18

<210> 19

<211> 738 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Fcab02 10

<400> 19

15 <210> 20

<211> 750

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Fcab03

<220>

<221> misc_feature

<222> (449)..(450)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (452)..(453)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (455)..(456)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (617)..(618)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (620)..(621)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (623)..(624)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (626)..(627)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (629)..(630)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (632)..(633)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (635)..(636)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (638)..(639)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (653)..(654)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (656)..(657)

<223>n es a,c,g o t

<400> 20

10

<210> 21

<211> 750

<212> ADN

<213> artificial

15

<220>

<223> Fcab04

<400> 21

20

<210> 22

<211> 738

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Fcab05

<220>

<221> misc_feature

<222> (449)..(450)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (452)..(453)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (455)..(456)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (611)..(612)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (614)..(615)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (617)..(618)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (620)..(621)

<223>n es a,c,g o t

<220>

5 <221> misc_feature

<222> (623)..(624)

<223>n es a,c,g o t

<220>

10 <221> misc_feature

<222> (626)..(627)

<223>n es a,c,g o t

<220>

15 <221> misc_feature

<222> (629)..(630)

<223>n es a,c,g o t

20 <220>

<221> misc_feature

<222> (632)..(633)

<223>n es a,c,g o t

25 <220>

<221> misc_feature

<222> (641)..(642)

<223>n es a,c,g o t

30 <220>

<221> misc_feature

<222> (644)..(645)

<223>n es a,c,g o t

35 <400> 22

<210> 23

<211> 738

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Fcab06

<400> 23

<210> 24 10 <211> 85

<212> ADN

<213> artificial

<220> 15 <223> Cebador para PCR gapch35

<400> 24

20

<210> 25

<211> 99

<212> ADN

<213> artificial

25

<220>

<223> Cebador para PCR gapfcs3

<400> 25

30

<210> 26

<211> 79

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Cebador Abmut

5 <220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(44)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(47)

<223>n es a,c,g o t

15 <220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(50)

<223>n es a,c,g o t

<400> 26

<210> 27 25 <211> 79

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Cebador Abmut2LR

<220>

<221> misc_feature

<222>

(40)..(41) 35 <223>nesa,c,got

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(44)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222>

(46)..(47) 45 <223>nesa,c,got

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(50)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

55 <222> (52)..(53)

<223>n es a,c,g o t

<400> 27

<210> 28

<211> 79

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Cebador Abmut1L

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(41)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(44)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(47)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(50)

<223>n es a,c,g o t

<400> 28

<210> 29

<211> 79

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Cebador Abmut1R

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(44)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(47)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(50)

<223>n es a,c,g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (52)..(53)

<223>n es a,c,g o t

<400> 29 <210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 30

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 31

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 32

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 33

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 34

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 35

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 36

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 37

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 38

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 39

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 40

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 41

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 42

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 43 <210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 44

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 45

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 46

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 47

<210> 48

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 48

<210> 49

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 49

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 50

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 51

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 52

<210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 53

<210> 54

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 54

<210> 55

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 55

<210> 56

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 56

<210> 57

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 57 <210> 58

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 58

<210> 59

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 59

<210> 60

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 60

<210> 61

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 61

<210> 62

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 62

<210> 63

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 63

<210> 64

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 64

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 65

<210> 66

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 66 <210> 67

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 67

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 68

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 69

<210> 70

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 70

<210> 71

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 71

<212> ADN

<213> artificial

<220> 10 <223> vector pYD1

<400> 72

<210> 73

<211> 5009 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> vector modificado pYD1Nhe 10

<400> 73

<210> 74

<211> 4605 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector pYD1lnk 10

<400> 74

<210> 75

<211> 4886 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector pYD1mata 10

<400> 75

<210> 76

<211> 5801 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector pYD1gal 10

<400> 76

<210> 77

<211> 692 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> 4D5H 10

<400> 77

15 <210> 78

<211> 661

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> 4D5L

<400> 78

10

<210> 79

<211> 6468

<212> ADN

<213> artificial

15

<220>

<223> Vector pYD4D5hc

<400> 79

20

<210> 80

<211> 223 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 4D5hp 10

<400> 80 <210> 81

<211> 7100 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Vector pYD4D5hl 10

<400> 81

<210> 82

<211> 214 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 4D51p 10

<400> 82

<210> 83

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 83

<210> 84

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 84

<210> 85

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 85

<210> 86

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 86

<210> 87

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 87

<210> 88

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 88

<210> 89

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 89

<210> 90

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 90

<210> 91

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 91 <210> 92

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 92

<210> 93

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 93

<210> 94

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 94

<210> 95

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 95

<210> 96

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 96

<210> 97

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 97

<210> 98

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 98

<210> 99

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 99

<210> 100

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 100

<210> 101

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 101

<210> 102

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 102

<210> 103

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 103

<210> 104

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 104

<210> 105

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 105 <210> 106

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 106

<210> 107

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 107

<210> 108

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 108

<210> 109

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 109

<210> 110

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 110

<210> 111

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 111

<210> 112

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 112

<210> 113

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 113

<210> 114

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 114

<210> 115

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 115

<210> 116

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 116

<210> 117

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 117

<210> 118

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 118

<210> 119

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 119 <210> 120

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 120

<210> 121

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 121

<210> 122

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 122

<210> 123

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 123

<210> 124

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 124

<210> 125

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 125

<210> 126

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 126

<210> 127

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 127

<210> 128

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 128

<210> 129

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 129

<210> 130

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 130

<210> 131

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 131

<210> 132

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 132

<210> 133

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 133 <210> 134

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 134

<210> 135

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 135

<210> 136

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 136

<210> 137

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 137

<210> 138

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 138

<210> 139

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 139

<210> 140

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 140

<210> 141

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 141

<210> 142

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 142

<210> 143

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 143

<210> 144

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 144

<210> 145

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 145

<210> 146

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 146

<210> 147

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 147 <210> 148

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 148

<210> 149

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 149

<210> 150

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 150

<210> 151

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 151

<210> 152

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 152

<210> 153

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 153

<210> 154

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 154

<210> 155

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 155

<210> 156

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 156

<210> 157

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 157

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<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 158

<210> 159

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 159

<210> 160

<211> 13

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 160

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 162

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<211> 5

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<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 165

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 166

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 167

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 168

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 169

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 170 <210> 171

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 171

<210> 172

<211> 4

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 172

<210> 173

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 173

<210> 174

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 174

<210> 175

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 175

5

<210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> artificial

<220> <223> Secuencia bucle AB AA143ff

15

<400> 176

<210> 177

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 177

<210> 178

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

35 <220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 178

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 179

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 180

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 181

<210> 182

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 182

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 183

<210> 184

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 184 <210> 185

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 185

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 186

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 187

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<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 188

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<213> artificial

<220>

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<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

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<213> artificial

<220>

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<213> artificial

<220>

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 196

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 197

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 198 <210> 199

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 199

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 200

<210> 201

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 201

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 202

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 203

<210> 204

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 204

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 205

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 206

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 207

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 208

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 209

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<213> artificial

<220>

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 212 <210> 213

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 213

<210> 214

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 214

<210> 215

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 215

<210> 216

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 216

<210> 217

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 217

<210> 218

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 218

<210> 219

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 219

<210> 220

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 220

<210> 221

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 221 <210> 222

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 222

<210> 223

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 223

<210> 224

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 224

<210> 225

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 225

<210> 226

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 226

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 227

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 228

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 229

<210> 230

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 230

<210> 231

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 231

<210> 232

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 233

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 234

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 235 <210> 236

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 236

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 237

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

<400> 238

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle AB AA143ff

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 240

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 242

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 243

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 244 <210> 245

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 245

<210> 246

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 246

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 247

<210> 248

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 248

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 249

<210> 250

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 250

<210> 251

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 251

<210> 252

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 252

<210> 253

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 253

<210> 254

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 254

<210> 255

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 255

<210> 256

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 256

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 258 <210> 259

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 260

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 261

<210> 262

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 262

<210> 263

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 263

<210> 264

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 264

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<213> artificial

<220>

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<400> 265

<210> 266

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 266

<210> 267

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 267 <210> 268

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 268

<210> 269

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 269

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 270

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 271

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 272

<210> 273

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 273

<210> 274

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 274

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<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 275

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<211> 5

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<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 276

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 278

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<213> artificial

<220>

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<400> 279

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<213> artificial

<220>

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<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 281 <210> 282

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 283

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 284

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<213> artificial

<220>

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<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<213> artificial

<220>

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<400> 287

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 288

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 289

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 292

<210> 293

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 293

<210> 294

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 294

<210> 295

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 295

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 296

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 297

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 298

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<211> 4

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA170ff

<400> 299

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 300

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 301

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 302

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 303

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 304 <210> 305

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 305

<210> 306

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 306

<210> 307

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 307

<210> 308

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 308

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 310

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<400> 311

<210> 312

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 312

<210> 313

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 313

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 314

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 315

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 316

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 317

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<210> 320

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 321

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<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 322

<210> 323

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 324

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 325

<210> 326

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 326

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<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 327

<210> 328

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 328

<210> 329

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 329

<210> 330

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 330

<210> 331

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 331

<210> 332

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 332 <210> 333

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 333

<210> 334

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 334

<210> 335

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 335

<210> 336

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 336

<210> 337

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 337

<210> 338

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 338

<210> 339

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle CD AA169ff

<400> 339

<210> 340

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 340

<210> 341

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 341

<210> 342

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 342

<210> 343

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 343

<210> 344

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 344

<210> 345

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 345

<210> 346

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 346 <210> 347

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 347

<210> 348

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 348

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<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 349

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<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 350

<210> 351

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 351 <210> 352

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 352

<210> 353

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 353

<210> 354

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 354

<210> 355

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 355

<210> 356

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 356

<210> 357

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 357

<210> 358

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 358

<210> 359

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 359

<210> 360

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 360

<210> 361

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 361

<210> 362

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 362

<210> 363

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 363

<210> 364

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 364

<210> 365

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 365 <210> 366

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 366

<210> 367

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 367

<210> 368

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 368

<210> 369

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 369

<210> 370

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 370

<210> 371

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 371

<210> 372

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 372

<210> 373

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 373

<210> 374

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 374 <210> 375

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 375

<210> 376

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 376

<210> 377

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 377

<210> 378

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 378

<210> 379

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 379

<210> 380

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 380

<210> 381

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 381

<210> 382

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 382

<210> 383

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 383

<210> 384

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 384

<210> 385

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 385

<210> 386

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 386

<210> 387

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 387

<210> 388

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 388 <210> 389

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 389

<210> 390

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 390

<210> 391

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 391

<210> 392

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 392

<210> 393

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 393

<210> 394

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 394

<210> 395

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 395

<210> 396

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 396

<210> 397

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 397 <210> 398

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 398

<210> 399

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 399

<210> 400

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 400

<210> 401

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 401

<210> 402

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 402

<210> 403

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 403

<210> 404

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 404

<210> 405

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 405

<210> 406

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 406

<210> 407

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 407

<210> 408

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 408

<210> 409

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 409

<210> 410

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 410

<210> 411

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 411 <210> 412

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 412

<210> 413

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 413

<210> 414

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 414

<210> 415

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 415

<210> 416

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 416

<210> 417

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 417

<210> 418

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 418

<210> 419

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 419

<210> 420

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 420

<210> 421

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 421

<210> 422

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 422

<210> 423

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 423

<210> 424

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 424

<210> 425

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff

<400> 425

<210> 426

<211> 12 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia bucle EF AA198ff 10

<400> 426

15 <210> 427

<211> 5473

<212> ADN

<213> artificial

20 <220>

<223> plásmido pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt

<400> 427

<210> 428

<211> 5677 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> PYD1dX_dCH1_Fcab_wt 10

<400> 428

<210> 429

<211> 19 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Cebador CH3seqs/2 10

<400> 429

aaggagtaca agtgcaagg

19

<210> 430 <211> 16 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador CDmut_back

<400> 430 gctctcccac tccacg

16

<210> 431 <211> 21 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador EFmut_back

<400> 431 cacggtgagc ttgctgtaga g

21

<210> 432 <211> 16 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador ABMUT5/2_back

<400> 432 ctcatcccgg gatggg

16

<210> 433 <211> 48 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador CDmut5cod_for

<220> <221> misc_feature <222> (16)..(30) <223> n es a, c, g o t

<400> 433 gtggagtggg agagcnnnnn nnnnnnnnnn aacaactaca agaccacg

48

<210> 434 <211> 54 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador EFMUT7cod_for

<220> <221> misc_feature <222> (16)..(36) <223> n es a, c, g o t

<400> 434 agcaagctca ccgtgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnggga acgtcttctc atgc

54

<210> 435 <211> 54 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador EFMUT3+2_for

<220> <221> misc_feature <222> (16)..(24) <223> n es a, c, g o t

<220> <221> misc_feature <222> (31)..(36) <223> n es a, c, g o t

<400> 435 agcaagctca ccgtgnnnnn nnnnaggtgg nnnnnnggga acgtcttctc atgc

54

<210> 436 <211> 49 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador ABMUT5 (wt)_for

<220> <221> misc_feature <222> (16)..(30) <223> n es a, c, g o t

<400> 436 ccatcccggg atgagnnnnn nnnnnnnnnn gtcagcctga cctgcctgg

49

<210> 437 <211> 17 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador CH3seqAS

<400> 437 tagaatcgag accgagg

17

<210> 438 <211> 19 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> Cebador YCH3.25rec.opt.for

<400> 438 accatctcca aggccaagg

19

<210> 439 <211> 18 <212> ADN <213> artificial

<220>

<223> Cebador Ych3.25rec.back

<400> 439 aagggccctc tagactcg 18

5 1

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Anticuerpo modular citotóxico con un peso molecular de hasta 60 kD, que se une específicamente a Her2 humano con una afinidad de unión de Kd <108 M, donde el anticuerpo comprende un fragmento de cadena pesada de IgG1 humana que comprende un dominio CH2 y un dominio CH3 y donde el anticuerpo contiene un sitio de unión que se une específicamente a Her2 creado por ingeniería genética en una región bucle estructural del dominio CH3 y que contiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No.: 191, 241 y 370, donde la SEQ ID No.: 191 está contenida dentro del bucle AB, la SEQ ID No.: 241 está contenida dentro del bucle CD y la SEQ ID No.: 370 está contenida dentro del bucle EF de la región bucle estructural.

2. 2.

   Anticuerpo modular de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene al menos una de citotoxicidad mediada por célula y dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o actividad apoptótica.

3. 3.

   Anticuerpo modular de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene actividad apoptótica.

4. 4.

   Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo es un Fc de unión a antígeno.

5. 5.

   Anticuerpo modular de la reivindicación 4, donde dicho anticuerpo es un Fc de unión a antígeno de IgG1.

6. 6.

   Anticuerpo modular de combinación que comprende un anticuerpo modular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además está combinado con uno o más anticuerpos modulares modificados o con anticuerpos modulares no modificados o partes de los mismos.

7. 7.

   Anticuerpo modular de combinación de acuerdo con la reivindicación 6, que es una molécula de anticuerpo completo.

8. 8.

   Un anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el anticuerpo modular es una proteína de fusión en la que un dominio del anticuerpo modular está fusionado a una o más proteínas distintas.

9. 9.

   Un anticuerpo modular de acuerdo con la reivindicación 8, donde la proteína fusionada al anticuerpo modular se selecciona del grupo que consiste en otros anticuerpos modulares, inmunoglobulinas, ligandos, proteínas armazón, enzimas y toxinas.

10. 10.

    Anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en terapia.

11. 11.

    Anticuerpo modular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para uso en el tratamiento de un paciente que padece un tumor sólido, tumor que expresa un receptor de la clase erbB, donde el receptor es Her2.

12. 12.

    Anticuerpo modular para uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, donde el anticuerpo modular se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos distintos.

13. 13.

    Anticuerpo modular para uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, donde el anticuerpo modular se administra concomitantemente con uno o más regímenes terapéuticos distintos.

14. 14.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

15. 15.

    Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende un anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales.

16. 16.

    Una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 14 o 15, donde la composición farmacéutica comprende además un vehículo, un excipiente o un estabilizante farmacéuticamente aceptables.

17. 17.

    Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la composición farmacéutica es una formulación liofilizada o una solución acuosa.

18. 18.

    Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la composición farmacéutica es para administración oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, mucosal, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, parenteral, rectal o intraocular.

19. 19.

    Una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia que codifica un anticuerpo modular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y secuencias de control en unión operativa, donde los hospedadores transformados o transfectados con dichas secuencias son capaces de producir el anticuerpo modular codificado.

20. 20.

    Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19.

    FIGURAS:

    Figura 1:

    Figura 2:

    Figura 3 (SEQ ID No.1): Estructura cristalina de un fragmento Fc de IgG1

    Figura 4 (SEQ ID No.2): IgG humana que incluye modificaciones de aminoácidos aleatorizadas

    Figura 5 (SEQ ID No.11 ): Secuencia de aminoácidos de FcabRGD4L

    Figura 6 (SEQ ID No.12): Vector pHENFcabRGD4

    Figura 7 (SEQ ID No.14): vector pHENFcabRGD4L

    Figura 8 (SEQ ID No.15): Vector pYD1dX

    Figura 9 (SEQ ID No.16): vector pYD1dXFc

    Figura 15 (SEQ ID No.22): Fcab05

    Figura 23 SEQ ID No.78 : 4D5L

    Figura 28 SEQ ID No.427 : plásmido pYD1dX dCH1dCH3 Fcab wt