TWI565712B - 增進神經元生長的胜肽及其應用 - Google Patents

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Description

增進神經元生長的胜肽及其應用
本發明係關於增進神經元生長的胜肽，特別是可以增進神經突(neurite)生長的胜肽及其應用。
學習與記憶是人類及其他哺乳類動物不可或缺的能力。經由探索而獲得知識或經驗，再透過大腦儲存並統合後使心境及行為轉變，讓生物體足以藉此適應變化萬千的環境。記憶力退化主要原因為腦神經細胞持續退化或是死亡，使訊息無法順利的傳遞所導致。成年人的突觸具有可塑性，透過學習及環境的刺激可改變神經突的生長，加強突觸的化學訊息傳遞能力，進而形成記憶並鞏固之。因此，如果能促進腦部神經可塑性，理論上將可強化記憶的形成。許多神經滋養因子，如：腦源性神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、膠細胞源性神經滋養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factors, IGF)等，已經被證實可以促進神經細胞可塑性，進而改善記憶。然而，這類大分子蛋白，往往具有體內結構不穩定、半衰期短、不易通過血腦屏障等問題。由於胜肽藥物具有藥用劑量小、副作用低、易於進入細胞內等優點，因此具有開發優勢。
本發明於第一方面提供一種可以增進神經元生長之胜肽，包含下列胺基酸序列： (R1 )a -Asn-X1 -X2 -Pro-Gln-(R2 )b (SEQ ID NO: 3) 及其保守性修飾變異。在上述式中，R1 為一包含由1至約40個胺基酸的胺基酸序列，其中每個胺基酸係各自獨立地選自於由自然產生的胺基酸及胺基酸類似物所組成之群組。如同R1 ，在上述式中的R2 為一包含由1至約40個胺基酸的胺基酸序列，其中每個胺基酸係各自獨立地選自於由自然產生的胺基酸及胺基酸類似物所組成之群組。在上述式中的X1 ，係為選自於由非極性胺基酸所組成之群組的一個胺基酸。在上述式中的X2 ，係為選自於由自然產生的胺基酸及胺基酸類似物所組成之群組的一個胺基酸。在上述式中的指數a與b，係各自獨立選於且可等於0或1。
本發明於第二方面提供一種編碼任何上述的胜肽的多核苷酸。
本發明於第三方面提供一種藥學組合物，包含至少一個上述的胜肽以及一藥學上可接受之載劑。
本發明於第四方面提供一種增進神經元生長的方法，包含使一神經元細胞與一足夠增進神經元生長量的任何上述的胜肽接觸。
本發明於第五方面提供一種任何上述的胜肽在製備一種用以在一受試者體內改善與神經元細胞受損或退化有關之症狀的藥物的用途。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
應當理解的是，前述一般描述和下面的詳細描述都是示例性和說明性的，但並非用以限制本發明所請之權利。本發明的一個或多個實施例的某些細節闡述於以下說明中。從以下代表性實施例的非窮舉的列表中，亦從所附的權利要求中，本發明的其它特徵或優點將是顯而易見的。
本發明提供一種可以增進神經元生長的胜肽，包含下列胺基酸序列： (R1 )a -Asn-X1 -X2 -Pro-Gln-(R2 )b (SEQ ID NO: 3) 及其保守性修飾變異；其中，R1 為一包含由1至約40個胺基酸的胺基酸序列，其中每個胺基酸係各自獨立地選自於由自然產生的胺基酸及胺基酸類似物所組成之群組；R2 為一包含由1至約40個胺基酸的胺基酸序列，其中每個胺基酸係各自獨立地選自於由自然產生的胺基酸及胺基酸類似物所組成之群組；X1 係為選自於由非極性胺基酸所組成之群組的一個胺基酸；X2 ，係為選自於由自然產生的胺基酸及胺基酸類似物所組成之群組的一個胺基酸；a與b，係各自獨立選於且可等於0或1。
在一具體實施例中，該a與b各自等於0。在一具體實施例中，該胺基酸序列為NAIPQ (SEQ ID NO: 1)。在一具體實施例中，該胺基酸序列為NPSPQ (SEQ ID NO: 2)。在一具體實施例中，該胺基酸序列為NFEPQ (SEQ ID NO: 4)。在一具體實施例中，該胺基酸序列為NMYPQ (SEQ ID NO: 5)。在一具體實施例中，該胺基酸序列為NIKPQ (SEQ ID NO: 6)。在一具體實施例中，該胺基酸序列為NLMPQ (SEQ ID NO: 7)。在一具體實施例中，該胺基酸序列為NVAPQ (SEQ ID NO: 8)。在一具體實施例中，該胺基酸序列為NWLPQ (SEQ ID NO: 9)。然而，上述之胺基酸序列僅為示例性的，本發明所提供的可以增進神經元生長的胜肽並不限於SEQ ID NOs: 1, 2, 4-9所列的序列。例如，但不限於，當X1 為丙胺酸(Ala, A)時，X2 可為丙氨酸(Alanine)、胱胺酸(Cysteine)、天門冬胺酸(Aspartic acid)、麩胺酸(Glutamic acid)、苯丙胺酸(Phenylalanine)、甘胺酸(Glycine)、組胺酸(Histidine)、異白胺酸(Isoleucine)、離胺酸(Lysine)、白胺酸(Leucine)、甲硫胺酸(Methionine)、天冬醯胺(Asparagine)、脯胺酸(Proline)、穀胺醯胺(Glutamine)、精胺酸(Arginine)、絲胺酸(Serine)、蘇胺酸(Threonine)、纈胺酸 (Valine)、色胺酸(Tryptophan)、酪胺酸(Tyrosine)中的任一個。
本發明所提供之可以增進神經元生長的胜肽包含但不限於以胜肽合成儀(peptide synthesizer)合成由或以基因選殖方式而得。在一具體實施例中，該胜肽是以胜肽合成儀合成的，且不限於D-form或L-form的構型。本發明所提供的胜肽的胺基酸殘基可能是由天然存在的胺基酸或本領域中已知的非天然胺基酸，全L型或全D型，或其組合所組成。在另一實例中，該胜肽亦可以基因選殖的方式獲得。以基因選殖方式獲得該胜肽重組蛋白的方式可為，但不限於：將編碼任何上述的胜肽的多核苷酸選殖到重組核酸表現載體中，以形成含有編碼任何上述的胜肽的多核苷酸的重組核酸表現載體，再將該表現載體轉殖到生物表現宿主中，經蛋白質表現後而得到本發明所揭露的可以增進神經元生長的胜肽。
因此，本發明並提供一種編碼任何上述的胜肽的多核苷酸，及/或一種包含編碼任何上述的胜肽的多核苷酸的重組核酸表現載體，及/或一種包含具有編碼任何上述的胜肽的多核苷酸的重組核酸表現載體的宿主細胞。
該編碼本發明任何上述的胜肽的多核苷酸，是由本發明之可以增進神經元生長的胜肽的胺基酸序列衍生而來。將本發明之可以增進神經元生長的胜肽的胺基酸序列上的各個胺基酸置換為遺傳密碼表(genetic code table)所列之編碼該胺基酸的核苷酸序列(包含各種簡併密碼子(degenerate codons，或稱同義密碼子，synonymous codons)，即可得到本發明所提供之該核苷酸序列。例如，本發明之可以增進神經元生長的胜肽的胺基酸序列上的脯胺酸(Proline)可由CCA、CCC、CCG、CCT等核苷酸序列所編碼。
本發明進一步提供一種組合物，包含至少一個上述的可以增進神經元生長的胜肽以及一藥學上可接受之載劑。在一些具體實施例中，該組合包含一個以上的上述胜肽，例如，但不限於NAIPQ (SEQ ID NO: 1)、NPSPQ (SEQ ID NO: 2)、NFEPQ (SEQ ID NO: 4)、NMYPQ (SEQ ID NO: 5)、NIKPQ (SEQ ID NO: 6)、NLMPQ (SEQ ID NO: 7)、NVAPQ (SEQ ID NO: 8)、NWLPQ (SEQ ID NO: 9)其中之一個胜肽，或其組合物。在一些具體實施例中，該組合物含有，但不必要為，藥學有效量的上述胜肽。
在一些具體實施例中，本發明所提供的胜肽增進了神經元的生長，特別是軸突分枝數目與軸突長度的增加。當腦細胞要執行各種活動時(例如，學習、記憶、修復、再生)都需要形成新的突觸(synapse)。突觸形成(synaptogenesis)的過程為，突觸前神經元(presynaptic neuron)先形成軸突末端突出(axonal terminal boutons)，然後吸引突觸後神經元(postsynaptic neuron)形成樹突突起(dendritic protrusion)，兩者互相接觸形成突觸，使得神經細胞可以交流溝通(cross-talk), 形成新的連結(connectivity)，大腦發育及重塑(brain development and remodeling)才會發生，以執行各種活動。因此，要先刺激神經元的軸突生長，後續才會發生樹突分枝(dendritic arborization)，形成突觸以執行學習、記憶等活動。腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)便是藉由先刺激神經元細胞形成新的軸突生長(axonal neurite outgrowth)，才發生樹突分枝(dendritic arborization)，以促進神經元生長。當加入神經滋養因子受體的抑制劑時，就會抑制神經元軸突的生長，導致記憶無法被儲存。在一些具體實施例中，本發明所提供的胜肽顯著地增進了軸突的生長，其作用類似於腦源性神經滋養因子(BDNF)，係藉由增加軸突的生長以促進神經元生長。
此外，由於成年後哺乳類動物的腦中神經元細胞數目幾乎不會增加，神經元細胞只會不斷的退化、死亡，數量減少，因此成年或老年後需要靠增加神經突分枝(neurite arborization)才能維持或促進神經間的交流溝通。在一些具體實施例中，本發明所提供的胜肽藉由增加軸突的生長以促進神經突分枝，進而減少因老化或其他原因而造成的與神經元細胞受損或退化，並因此改善與神經元細胞受損或退化有關之症狀。
是以，本發明提供一種增進神經元生長的方法，包含使一神經元細胞與一足夠增進神經元生長量的任何上述的胜肽接觸。在一些具體實施例中，該神經元細胞為具有正常功能的神經元細胞。在一些具體實施例中，該神經元細胞為退化的神經元細胞。在一些具體實施例中，該神經元細胞為受損的神經元細胞。造成神經元細胞受損或退化的原因包括，但不限於，物理性傷害(如：機械損傷、挫傷、切斷)、化學性傷害(如：酒精、莨菪鹼氫氯酸鹽(scopolamine hydrochloride)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)、安非他命(Amphetamine)所造成的損害)、生物性傷害(如：腦缺氧所造成的損害)、老化或其組合。
因此，本發明並提供一種改善一受試者的記憶障礙的方法。本發明亦提供一種改善一受試者智能衰退的方法。在一些實施例中，該受試者的記憶障礙或智能衰退是由老化所引起。在一些實施例中，該受試者的記憶障礙或智能衰退是由機械損傷所引起。在一些實施例中，該受試者的記憶障礙或智能衰退是由化學藥劑所引起。在一些實施例中，該受試者的記憶障礙或智能衰退是由莨菪鹼氫氯酸鹽所引起。莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)是一種動物與人類的蕈毒鹼性受體拮抗劑(muscarinic receptor antagonist)，會造成學習與記憶的損傷，常用於建立認知功能減退及記憶障礙之動物模型。在一些實施例中，本發明使用由莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)誘導的記憶缺失動物模式來分析本發明揭露的胜肽對智能衰退的影響。
在一些實施例中，該受試者的記憶障礙或智能衰退是由1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)所引起。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)是1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)的一種神經毒素前驅物，其透過破壞在大腦黑質內的產生多巴胺的神經元而造成永久性帕金森氏症。在一些實施例中，本發明使用由MPTP誘導的帕金森氏症動物模式來分析本發明揭露的胜肽對該疾病的影響。
在一些實施例中，該受試者的記憶障礙或智能衰退是由自然老化或由右旋半乳糖(D-(+)-galactose)所引起。在正常情況下，右旋半乳糖為生理上可利用的養分，但攝取過量的右旋半乳糖會造成非酵素型的醣化作用(glycation)，使蛋白質或脂質分子在不受酶的控制下，附加上醣類分子。醣與蛋白質相互聚合並經過一系列的反應後，會產生不可還原之物質。而這些不可還原物質會與其他蛋白質連成大分子，使蛋白質代謝異常，形成高濃度的醣化終末產物(advanced glycation end product , AGEs)累積在細胞中產生大量活性氧物種(reactive oxygen species, ROS)，最後引起氧化壓力、神經炎症，使記憶及突觸傳導受阻礙，神經變性後導致記憶功能赤字。這種非酵素型的醣化作用是一種促進氧化性傷害及老化相關性疾病的途徑。無論是從生理或病理的情況上分析來看，投與右旋半乳糖的大鼠的老化情形會相當於16-24月齡的老化大鼠。在一些實施例中，本發明使用自然老化的動物模式來分析本發明揭露的胜肽對智能衰退的影響。在一些實施例中，本發明使用由右旋半乳糖誘導的老化動物模式來分析本發明揭露的胜肽對智能衰退的影響。
本發明並提供一種任何上述的胜肽在製備一種用以在一受試者體內改善與神經元細胞受損或老化有關之症狀的藥物的用途。於一些具體實施例中，該症狀包含，但不限於，記憶受損、智能衰退、運動協調能力受損、存活率下降、中樞神經系統病變、帕金森氏症、阿滋海默症、影響感覺神經元的疾病、皮質邊緣系統的疾病、與發育遲緩及學習障礙相關的病症、唐氏症、氧化壓力誘導的神經元死亡、因老化所產生的病症、因慢性酗酒所產生的病症、因藥物濫用所產生的病症、因局部創傷造成的病理改變，以及因治療藥物及治療的負面副作用所產生的病症。於一些具體實施例中，該症狀為記憶受損、智能衰退、運動協調能力受損、存活率下降、帕金森氏症及/或阿滋海默症。在一些具體實施例中，相較於負對照組，受試者施用本發明之胜肽一段時間後，上述症狀獲得了顯著地改善。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的技術人員所通常理解相同的含義。
如本文所用，冠詞「一」、「一個」以及「任何」是指一個或多於一個(即至少一個)的物品的文法物品。例如，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。
如本文所用，術語「核苷酸」意指包括含連接到糖磷酸鹽的氮鹼基的單體，該糖磷酸鹽包括糖，如核糖或2'-去氧核糖，連接到一個或多個磷酸基團。「多核苷酸」與「核酸」意指包括超過一個的核苷酸單體的聚合物，其中該單體通常被糖-磷酸主鏈的糖-磷酸鍵所連接。多核苷酸不必只包括一個類型的核苷酸單體。例如，包含一個給定的多核苷酸的核苷酸可以僅為核糖核苷酸，僅為2’-氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸和2’-去氧核糖核苷酸二者的組合。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如去氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，以及包含一種或多種非天然存在的單體的核酸類似物。多核苷酸可以被合成，例如，使用自動化DNA合成儀。術語「核酸」通常是指大的多核苷酸。將會理解的是，當核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)所表示，這還包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。術語「cDNA」意指一種與一mRNA互補或相同的DNA，不論是以單鏈或雙鏈形式，但在其中的“T”取代“U”。術語「重組核酸」意指具有非天然接合在一起的序列的多核苷酸或核酸。重組核酸可以存在於載體的形式。
如本文所用，術語「胺基酸」是指天然存在的與合成的胺基酸，以及胺基酸類似物與以類似於天然存在的胺基酸的方式作用的胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是那些由遺傳密碼所編碼的，以及後來被修飾的那些胺基酸，例如，羥脯氨酸、γ羧基麩胺酸，以及O-磷絲胺酸。針對本發明的目的，術語「胺基酸類似物」是指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構的化合物，亦即，一個與氫、羧基、氨基，以及一個R基團結合的碳，該R基團例如，高絲氨酸、正白胺酸、甲硫胺酸硫氧化物、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物具有修飾的R基團(例如正白胺酸)或修飾的胜肽骨架，但保留了與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。針對本發明的目的，術語「胺基酸模擬物」是指一種具有一個與胺基酸的一般化學結構不同的結構的化合物，但是，其以類似於天然存在的胺基酸的方式作用。
如本文所用，術語「非極性胺基酸」是指一具有疏水性的α胺基酸，其中該官能基團貼附於該α碳鏈(即在RCH(NH2)COOH的R)上。本發明之非極性胺基酸包含天然存在的與合成的非極性胺基酸，以及非極性胺基酸類似物與以類似於天然存在的非極性胺基酸的方式作用的非極性胺基酸模擬物；例如，但不限於，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲基胺酸、色氨酸、α-胺基丁酸。
如本文所用，術語「胜肽」是指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基是一個類似物或相應的天然存在的胺基酸的模擬物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物。
如本文所用，術語「保守性修飾變異」適用於胺基酸與核酸序列。針對特定核酸序列，保守性修飾變異是指那些編碼相同或基本相同的胺基酸序列的核酸，或其中該核酸不編碼胺基酸序列時，是指基本相同的序列。具體而言，簡並密碼子的取代可透過產生序列來實現，該序列其中的一個或多個所選的(或所有的)密碼子的第三位置被以混合的鹼基及/或去氧肌苷殘基所取代。由於遺傳密碼的簡並性，大量功能相同的核酸編碼任何給定蛋白質。例如，密碼子GCA，GCC，GCG和GCU都編碼丙胺酸。因此，在編碼為丙胺酸的每個位置上，該密碼子可改變成任何所述的相應密碼子而不改變所編碼的多胜肽。這樣的核酸變異為「沉默變異」，是保守性修飾變異的一種。本文中編碼一胜肽的每個核酸序列還描述了該核酸的每種可能的沉默變異。本發明所屬技術領域之技藝者將認識到，核酸中的每個密碼子(除了AUG，其通常是甲硫胺酸的唯一密碼子，以及TGG，其通常是色胺酸的唯一密碼子之外)可以被修飾以產生功能相同的分子。因此，編碼一胜肽的一個核酸的每個沉默變異都隱含在每個所述的序列中。
如本文所用，術語「載體」意指通過一核酸可以被引入宿主細胞，以轉型該宿主細胞，並促進該核酸的表達的手段。載體可包含一給定的標的核苷酸序列以及一調節序列。載體可被用於表達該給定核苷酸序列或維持該給定的核苷酸序列，以複製它，操縱它，改變它，截斷它，擴展它，及/或在不同的位置之間轉移它(例如，在不同的生物體或宿主細胞或其組合之間)。
如本文所用，術語「宿主細胞」是指單細胞的原核或真核生物，包括但不限於：放線菌，古細菌，細菌和酵母菌。宿主細胞還可以是單細胞，包括但不限於培養細胞-來自高階生物如植物和動物，包括但不限於脊椎動物，如哺乳動物和無脊椎動物如昆蟲。
如本文所用，術語「與神經元細胞受損或退化有關之症狀」是指包含導致神經元細胞死亡及/或尚不致死的神經病變的症狀，包括，例如： 中樞神經系統病變，包括影響基底神經節的退化性疾病(例如：杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's disease)、威爾森氏症(Wilson's disease)、紋狀體黑質變性(striatonigral degeneration)、皮質基底神經節退化(corticobasal ganglionic degeneration))、妥瑞氏症(Tourette's syndrome)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、進行性核上眼神經麻痺症(progressive supranuclear palsy)、進行性延髓麻痺症(progressive bulbar palsy)、遺傳痙攣性截癱(hereditary spastic paraplegia)、脊髓性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy)、肌萎縮脊椎側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)，及其變體、齒狀核紅核蒼白球丘腦底核萎縮(dentatorubral-pallidoluysian atrophy)、橄欖體橋腦小腦萎縮(olivopontocerebellar atrophy)、副腫瘤性小腦變性(paraneoplastic cerebellar degeneration)，和多巴胺毒性(dopamine toxicity)； 影響感覺神經元的疾病，例如弗裏德賴希共濟失調(Friedreich's ataxia)、糖尿病，周圍神經病變(peripheral neuropathy)、視網膜神經元退化(retinal neuronal degeneration)； 皮質邊緣系統的疾病，例如，大腦類澱粉血管病變(cerebral amyloid angiopathy)、皮克氏萎縮症(Pick's atrophy)、雷特氏症候群(Retts syndrome)； 涉及神經系統及/或腦幹的神經退化性病變，包括阿滋海默症(Alzheimer's disease)、愛滋病相關的失智症(AIDS-related dementia)、童年期腦脊髓病變(Leigh's disease)、擴散性路易體症(diffuse Lewy body disease)、癲癇、多系統萎縮(multiple system atrophy)、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、溶酶體儲積病(lysosomal storage disorders)，如褐脂素儲積病(lipofuscinosis)，唐氏症後期退化階段(late-degenerative stages of Down's syndrome)、幼兒海綿狀腦病(阿爾珀斯病)(Alper's disease)、中樞神經系統退化所造成的暈眩； 與發育遲緩及學習障礙相關的病症、唐氏症，以及氧化壓力誘導的神經元死亡； 因老化、慢性酗酒或藥物濫用所產生的病症，包括，例如，因酗酒造成的在藍斑核、小腦、膽鹼能基底前腦內的神經元的退化、因老化造成的小腦神經元與皮層神經元的退化而導致的認知與運動損傷、因長期安非他命濫用造成的基底神經節的神經元的退化而導致的運動損傷； 因局部創傷造成的病理改變，例如：中風、局部缺血、血管供血不足、缺氧缺血性腦病變、高血糖、低血糖、閉鎖式頭部外傷(closed head trauma)、或直接外傷；以及 因治療藥物及治療的負面副作用所產生的病症(例如，回應N-甲基-D-天門冬胺酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)類的麩胺酸受體的拮抗劑的抗痙攣劑量而造成的扣帶皮質與內嗅皮質的退化)。
如本文所用，術語「藥學組合物」是指任何製劑，其中本發明的胜肽可以被配製、存儲、保存、改變、給藥，或其組合。如下所述，該製劑可以包括它們的任何藥學上可接受的稀釋劑、佐劑、緩衝劑、賦形劑、載體或組合。在一般情況下，該製劑的組成分係基於給藥的方式和途徑，以及標準藥學實行而被選擇的。如本文所用，術語「藥學上可接受之載劑」是指任何物質或其組合與本發明的胜肽可以是物理或化學的混合、溶解、懸浮，或以其它方式組合以產生本發明的藥學組合物。
如本文所用，術語「藥學有效量」意指能夠或足以維持或產生所期望的生理結果，包括但不限於，治療、減輕、消除、基本上防止或預防，或其組合，疾病、病症，或其組合。藥學有效量可以包括依序地或同時地施用一個或多個劑量。本發明技術領域的技術人員將知道調節本發明的劑量，以考慮到各種類型的製劑，包括但不限於緩釋製劑。如本文所用，術語「預防」意指能基本上防止或預防疾病、病症，或其組合的任何方面的組合物。如本文所用，術語「治療的」意指能夠治療、減少、停止進展、減緩進展、有利地改變、消除，或其組合，疾病、病症的任何方面，或其組合。
如本文所用，術語「受試者」意指任何施與針對本發明的個體。受試者可以是，例如，哺乳動物。受試者可以是人或獸醫動物，不考慮性別、年齡，或他們的任意組合，並且包括胎兒。受試者可以選擇性地受特定疾病、病症或其組合的影響，或具有風險，或其組合。
適用於本發明給藥的製劑可包括，可能在本領域技術人員公知的其他事情之中：水性和非水性溶液、抗氧化劑、抑菌劑、緩衝液、影響等滲性的溶質、防腐劑、增溶劑、穩定劑、懸浮劑、增稠劑，或其組合。
此外或在替代方案中，適用於本發明給藥的製劑可以包括，可能在本領域技術人員公知的其他事情之中：凝膠、PEG如PEG 400、丙二醇、鹽水、香囊；、水、本領域中已知的其他適當的液體，或其組合。
此外或在替代方案中，適用於本發明給藥的製劑可以包括，可能在本領域技術人員公知的其他事情之中：黏合劑、緩衝劑、磷酸鈣、纖維素、膠體，如膠體二氧化矽、著色劑、稀釋劑、崩解劑、染料、填料、調味劑、明膠、乳糖、硬脂酸鎂、甘露醇、微晶明膠、潤濕劑、石蠟烴、錠劑、聚乙二醇、防腐劑、山梨糖醇、澱粉，如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉，或其組合，硬脂酸、蔗糖、滑石、甘油三酯，或其組合。
此外或在替代方案中，適用於本發明給藥的製劑可以包括，可能在本領域技術人員公知的其他事情之中：醇，如苯甲醇或乙醇、苯扎氯銨、緩衝劑如磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑，或其組合，羧甲基纖維素或微晶纖維素、膽固醇、葡萄糖、果汁，如柚子汁，牛奶、磷脂如卵磷脂，油如植物油、魚油、或礦物油，或其組合；本領域中已知的其它藥學上相容的載體；或其組合。
此外或在替代方案中，適用於本發明給藥的製劑可以包括，可能在本領域技術人員公知的其他事情之中：可生物降解，例如聚乳酸-聚乙二醇酸(PLGA)聚合物，其它實體的降解產物可以迅速地從一個生物系統，或其組合被清除。
本發明的製劑可以單位劑量形式，多劑量形式，或其組合方式來施用。它們可以被包裝在單位劑量容器中、多劑量容器，或其組合。本發明可能存在於安瓿、小膠囊、膠囊、顆粒、含片、粉劑、片劑、小瓶、乳劑，包括但不限於阿拉伯膠乳劑、懸浮液，或其組合。
本發明通過下列的實施例進一步說明，其提供了用於示範而非限制的目的。本領域中的技術人員應，在根據本公開內容的，應當理解，許多變化可以在所公開的特定具體實施例中產生，且仍然獲得相同或類似的結果而不脫離本發明的精神和範圍。
實施例
實施例一 C5 胜 肽、 C6 胜肽、 P1 胜肽、 P2 胜肽、 P3 胜肽、 P4 胜肽、 P5 胜肽、 P6 胜肽對神經元生長的影響
1. 胜肽的製備
以合成儀合成D-form及L-form的C5、C6、P1、P2、P3、P4、P5、P6胜肽(Neogene Biomedicals公司，台北市，台灣)。將合成的C5胜肽(SEQ ID NO: 1)、C6胜肽(SEQ ID NO: 2)、P1胜肽(SEQ ID NO: 4)、P2胜肽(SEQ ID NO: 5)、P3胜肽(SEQ ID NO: 6)、P4胜肽(SEQ ID NO: 7)、P5胜肽(SEQ ID NO: 8)、P6胜肽(SEQ ID NO: 9)分別溶解於DMSO及PBS中。
2. 細胞培養
為了培養胚胎初代海馬迴神經元，自國家實驗動物中心(台北市，台灣)購買懷孕的Sprague-Dawley (SD)大鼠。來自SD大鼠(懷孕19天，E19)胚胎的海馬迴組織係以酵素分離，且將其種植於塗覆有聚離胺酸(poly-L-lysine)的小圓玻片上，培養於含有5%胎牛血清、5%馬血清，以及50 ng/mL胰島素轉鐵蛋白硒酸鹽(insulin-transferrin-selenite，Sigma-Aldrich公司，聖路易市，密蘇里州，美國)的最低基本培養基(minimal essential medium，MEM)中。之後將培養基置換為含有0.5 mM麩醯胺酸(glutamine)與12.5 mM麩胺酸(glutamate)的2% B27-neurobasal培養基(Invitrogen公司，卡爾斯巴市，加州，美國)。於37°C、5%CO2 下培養胚胎初代海馬迴神經元以待進一步試驗。
3. 神經元生長試驗
胚胎初代海馬迴神經元於體外培養第3天時(daysin vitro 3，DIV3)，以10-9 M、10-12 M、10-15 M濃度的C5胜肽(L-form)或C6胜肽(L-form)、各10-9 M濃度的P1、P2、P3、P4、P5、P6胜肽(L-form)、10-9 M濃度的C5胜肽(D-form)以及10-12 濃度的C6胜肽(D-form)分別處理該初代海馬迴神經元3天，接著進行免疫細胞化學分析。負對照組中的胚胎初代海馬迴神經元則加入PBS。每個處理條件進行3重複。
4. 免疫細胞化學分析
以4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定上述培養的初代海馬迴神經元，並以0.1% Triton X-100在室溫(RT)下進行穿透。在室溫下分別加入兔抗-Tau蛋白的初級抗體(軸突的選擇性標記，Millipore公司，麻州，美國)與小鼠抗-MAP2蛋白的初級抗體(微小管結合蛋白-2，樹突的選擇性標記，Millipore公司，麻州，美國)作用1小時。清洗後，將細胞以Alexa Fluor® 488山羊抗-兔次級抗體(綠色螢光，Abcam公司，英國)與Alexa Fluor® 594山羊抗-小鼠次級抗體(紅色螢光，Abcam公司，英國)在室溫下培養1小時。接著以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) DNA染劑(藍色螢光，Vector Laboratories公司，美國)對細胞核進行染色。以蓋玻片封片後，使用Axio Observer D1顯微鏡(Zeiss公司，Jena，德國)觀察影像，並以ImageJ軟體(Inage Processing and Analysis in Java, National Institutes of Health, USA)分析影像。長於10 µm的神經突出物被定義為神經突(neurites)。
5. 統計分析
試驗數據以單因子變異數分析法(one-way analysis of variance，ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
6. 結果
C5 胜 肽、 C6 胜肽、 P1 胜肽、 P2 胜肽、 P3 胜肽、 P4 胜肽、 P5 胜肽或 P6 胜肽會促進神經突的增長與分枝。 免疫細胞化學分析的結果分別如圖1與圖2所示。如圖1A至圖1I所示，相較於負對照組(圖1A)， 10-9 M、10-12 M、10-15 M濃度的C5胜肽(L-form)(圖1B至圖1D)與C6胜肽(L-form)(圖1F至圖1H)皆會促進神經突的生長。此外，自然界胺基酸以L-form形式存在，而改以合成的D-form的C5胜肽(10-9 M)與C6胜肽(10-12 M)處理初代神經元亦可促進神經突生長，且效果與L-form的C5胜肽及L-form的C6胜肽差不多(分別如圖1E及1I所示)。此外，如圖2A至圖2G所示，相較於負對照組(圖2A)，10-9 M濃度的P1胜肽、P2胜肽、P3胜肽、P4胜肽、P5胜肽或P6胜肽皆會促進神經突的生長(分別如圖2B至圖2G所示)。
此外，計算軸突各級分枝的數目並且測量各級分枝的長度，統計結果如圖3B至圖3E所示。細胞本體出來的軸突，稱為一級分枝；由一級分枝再分出去成為二級分枝；由二級分枝分出去算三級分枝，以此類推(如圖3A所示)。長於10 mm之軸突才列入計算。
以C5胜肽及C6胜肽處理初代海馬迴神經元後，軸突各層分枝的長度計算結果如圖3B所示。相對於未處理的負對照組的軸突一級分枝長度，C5胜肽(10-9 M)與C6胜肽(10-9 M)皆增加了海馬迴神經細胞的軸突一級分枝的長度，且皆具有顯著差異(p ＜ 0.01)。另外，軸突各層分枝的數目如圖3C所示。C5胜肽(10-9 M)與C6胜肽(10-9 M)兩者皆會促進軸突形成分枝。相對於未處理的負對照組的軸突三級分枝的數目(0.7枝三級分枝)，C5胜肽與C6胜肽皆增加了軸突之第三級分枝的數目(分別為3枝三級分枝與4.9枝三級分枝)，且具有顯著差異(p ＜ 0.01)。相對於未處理的負對照組的軸突二級分枝的數目(4.3枝二級分枝)，C6胜肽增加了軸突之第二級分枝的數目(6.5枝二級分枝)，且具有顯著差異(p ＜ 0.01)。
以P1至P6胜肽處理初代海馬迴神經元後，軸突各層分枝的長度計算結果如圖3D所示。相對於未處理的負對照組的軸突一級分枝及二級分枝長度，P1至P6胜肽(10-9 M)全部都可以增加海馬迴神經細胞的軸突一級分枝及二級分枝的長度，且皆具有顯著差異(p ＜ 0.01或p ＜ 0.05)。此外，相對於未處理的負對照組的軸突三級分枝長度，P6胜肽(10-9 M)可以增加海馬迴神經細胞的軸突三級分枝的長度，且具有顯著差異(p ＜ 0.05)。另外，軸突各層分枝的數目如圖3E所示。相對於未處理的負對照組的軸突二級分枝的數目(2.5枝二級分枝)，P6胜肽增加了軸突二級分枝的數目(4.2枝二級分枝)，且具有顯著差異(p ＜ 0.01)。
實施例二 C5 胜 肽與 C6 胜肽對初代神經元的神經毒性分析
1. 試驗物質
C5胜肽、C6胜肽以及胚胎初代海馬迴神經元取得之方法同實施例一。
2. 細胞處理
胚胎初代海馬迴神經元於體外培養第1天時(1 DIV)，分別以10-3 M、10-6 M、10-9 M、10-12 M濃度的C5胜肽或C6胜肽處理該胚胎初代海馬迴神經元24小時，接著進行MTT分析測量細胞存活率。
3. 細胞存活率分析
以MTT (3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑鎓溴化物，3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide)分析法評估細胞存活率。待測細胞於37 °C下與0.5 mg/mL MTT試劑(Sigma-Aldrich公司，美國)共同培養1小時。使用ELISA盤測讀儀(SpectraMax M2 Microplate Readers, Molecular Devices公司，森尼威爾市，加州，美國)測量波長570 nm與630 nm的吸光值以定量MTT甲瓚(formazan)產物。
4. 統計分析
試驗數據以單因子變異數分析法(one-way analysis of variance，ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
5. 結果
C5 胜 肽與 C6 胜肽對初代神經元不具神經毒性。 MTT分析結果如圖4所示。分別以10-3 M、10-6 M、10-9 M、10-12 M濃度的C5胜肽或C6胜肽處理初代皮質神經元24小時。結果顯示，相對於未處理的負對照組，不論是C5胜肽或C6胜肽，皆不影響胚胎初代海馬迴神經元的存活率(p ＞ 0.05)。
實施例三 C5 胜 肽與 C6 胜肽對初代海馬迴神經元再生的影響
1. 試驗物質
C5胜肽、C6胜肽以及胚胎初代海馬迴神經元取得之方法同實施例一。
2. 刮痕損傷試驗
以刮痕損傷試驗分析C5胜肽與C6胜肽對神經元再生的影響。胚胎初代海馬迴神經元於體外培養5天後，進行刮痕損傷試驗。以微量滴管在細胞培養盤上畫出一道刮痕以損傷培養的胚胎初代海馬迴神經元，接著加入含有10-9 M C5胜肽或10-9 M C6胜肽的培養基培養被刮傷的胚胎初代海馬迴神經元72小時。接著進行免疫螢光染色。
3. 免疫細胞化學分析
免疫細胞化學分析方法同實施例一。初代海馬迴神經元以兔抗-Tau蛋白的初級抗體(軸突的選擇性標記，Millipore公司)作用後，再以Alexa Fluor® 488山羊抗-兔次級抗體(綠色螢光，Abcam公司)染色。接著以DAPI DNA染劑(藍色螢光，Vector Laboratories公司)對細胞核進行染色。使用Axio Observer D1顯微鏡(Zeiss公司)觀察影像，並以ImageJ軟體(Inage Processing and Analysis in Java, National Institutes of Health, USA)分析影像。
4. 統計分析
試驗數據以單因子變異數分析法(one-way analysis of variance，ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
5. 結果
C5 胜 肽與 C6 胜肽促進神經元軸突的再生 。刮痕損傷分析的結果如圖5所示。相較於處理PBS的負對照組只有少數的軸突長出跨越刮痕的邊界(如圖5A所示)，處理C5胜肽與C6胜肽的被刮傷的初代皮質神經元具有較多且較長的軸突長出，並跨越刮痕的邊界(如圖5B、5C所示)。該結果顯示，C5胜肽與C6胜肽兩者皆可促進受損的神經元長出新的軸突。
實施例四 C5 胜 肽與 C6 胜肽對空間學習與記憶形成的影響 – 大鼠水迷宮試驗
1. 試驗動物
成熟雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠(300-400克)係購自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center，台灣)。大鼠係飼養於國立宜蘭大學動物實驗中心；每2隻大鼠1籠，於控制溫度(22 - 24°C)與濕度(50% - 60%)、12小時光週期/12小時暗週期、飼料與水可隨意取得的環境下飼養。在任何實驗進行前，所有動物皆有一週時間適應環境。所有的實驗流程皆遵守美國國家衛生研究院(National Institutes of Health, NIH)出版的實驗動物照護與使用指南(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，NIH出版號8023，1978年修改)，且由已經接受過國家實驗動物中心適當訓練的人員進行實驗。所有的實驗皆由宜蘭大學動物實驗道德委員會所許可。
2. 試驗藥物
C5胜肽、C6胜肽取得之方法同實施例一。
3. 藥物處理
將25隻未做過試驗的成熟雄性SD大鼠隨機分為5組，每組5隻，各組大鼠分別以腹腔注射低劑量C5胜肽(54 µg/kg)、高劑量C5胜肽(270 µg/kg)、低劑量C6胜肽(5.4 µg/kg)、高劑量C6胜肽(27 µg/kg)、0.5% (v/v) DMSO/PBS (負對照組)，每隻大鼠注射體積為1 µL/g體重，自行為試驗開始前14天開始對各組大鼠進行注射，每天注射1次，並持續在試驗期間進行注射。
4. 水迷宮學習模式
取直徑183 cm的塑膠圓形筒作為水池 (水溫25 ± 2 °C)，一圓形平台係放置於水池邊緣的特定位置，且位於水面下。添加無毒染劑到水池中，使水變混濁。特殊的視覺線索係設置在水池牆上。針對空間學習，試驗動物每天接受3次試驗，訓練程序持續4天，且共有12項試驗分別進行。大鼠被放置在以隨機順序等間距圍繞水池圓周的不同起始點，試驗大鼠有60秒鐘可在泳池游泳，若一大鼠無法發現該平台，其會被引導至該平台，且允許其停留在該平台上20秒鐘。將每隻動物到達該平台所花費的時間記錄作為脫逃時間(escape latency)。在試驗第5天時進行60秒鐘的探索試驗(probe trial)以測試其記憶的能力，將大鼠放置於移走平台的水池內，且記錄其在每個象限(象限1、2、3、4)中花費的時間，在目標象限(第4象限)內停留時間越久代表記憶越好。最終，大鼠需接受可見平台學習。可見平台學習是指將一標幟安裝於該平台上，且將該平台升起至水面上，紀錄大鼠找尋到平台的時間。此外，水池內不添加染劑，因此該動物可以從水中看見該平台的位置。
5. 統計分析
試驗數據以二因子變異數分析法(The data were analyzed with two-way ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
6. 結果
C5 胜 肽及 C6 胜肽皆可提升大鼠的空間學習能力與記憶。 圖6顯示每組大鼠每天在水迷宮學習的平均逃脫時間。與負對照組大鼠相較，接受C5胜肽(54 µg/kg、270 µg/kg)與C6胜肽(5.4 µg/kg、27 µg/kg)注射的大鼠較快找到隱藏的平台[F(4,20)=15.168,p ＜0.01]。此結果表示C5胜肽及C6胜肽可提升大鼠的空間學習能力與記憶。
實施例五 C5 胜 肽與 C6 胜肽對於由莨菪鹼氫氯酸鹽誘發的空間學習與記憶障礙的影響 – 大鼠水迷宮試驗
1. 試驗動物
動物來源與照護同實施例四。
2. 試驗藥物
C5胜肽、C6胜肽取得之方法同實施例一。莨菪鹼氫氯酸鹽(scopolamine hydrochloride，Sco)係購自Sigma-Aldrich公司(聖路易市，密蘇里州，美國)。將Sco溶解於生理食鹽水中至終濃度為1.5 mg/mL備用。
3. 藥物處理
將大鼠隨機分為對照組、莨菪鹼氫氯酸鹽處理組(Sco)、C5+Sco處理組以及C6+Sco處理組。於行為試驗開始前先每天注射載劑(對照組及莨菪鹼氫氯酸鹽處理組)、C5胜肽(54 µg/kg/day)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)，連續注射14天，接著再對各組大鼠分別以腹腔注射載劑(對照組)、載劑加上莨菪鹼氫氯酸鹽(1.5 mg/kg/day)(scopolamine處理組)、C5胜肽(54 µg/kg/day)加上Sco (1.5 mg/kg/day) (C5+Sco處理組)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)加上Sco (1.5 mg/kg/day) (C6+Sco處理組)，連續注射7天，行為實驗開始後，在實驗期間也持續注射。每隻大鼠注射體積為1 µL/g體重，於每天上午行為試驗開始前30分鐘注射莨菪鹼氫氯酸鹽，載劑、C5胜肽或C6胜肽於前一天下午5時進行注射。
4. 水迷宮學習模式
方法同實施例四。
5. 統計分析
試驗數據以二因子變異數分析法(two-way ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
6. 結果
C5 胜 肽及 C6 胜肽皆可改善由 Sco 引起的空間學習及記憶的損傷。 本實施例使用由莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)誘導的記憶缺失動物模式來分析C5胜肽與C6胜肽對老化與智能衰退的影響。圖7顯示每組大鼠每天在水迷宮學習的平均逃脫時間。注射莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)的大鼠需要較長的逃脫時間去找到隱藏的平台(F3,20 = 10.36,P ＜ 0.01)。與注射莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)的大鼠相較，C5+Sco組與C6+Sco組的大鼠自試驗第3天起，找到隱藏平台的時間顯著減少(q = 6.58 and 6.77, bothP ＜ 0.01)，甚至比未處理莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)的大鼠更快找到隱藏的平台。此結果表示C5胜肽及C6胜肽改善了由莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)引起的記憶障礙大鼠的空間學習能力。
實施例六 C5 胜 肽與 C6 胜肽對於由莨菪鹼氫氯酸鹽誘發的記憶障礙的影響 – 大鼠抑制性迴避試驗
1. 試驗動物
動物來源與照護同實施例四。
2. 試驗藥物
C5胜肽、C6胜肽取得之方法同實施例一。莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)的取得與製備同實施例五。
3. 藥物處理
大鼠的藥物處理方法同實施例五。
4. 抑制性迴避學習任務
該裝置包含一個由拉門分隔的槽形小徑，以隔開一安全的明箱與一暗箱。將一產生電流的電擊器連接到該黑暗隔間的地板上(UGO Basile公司，Comerio VA，義大利)。於上午8時至下午6時記錄該行為試驗，包含訓練與測試程序。在該試驗之前，大鼠先置於一暗室中1小時，以適應該環境。在訓練期間，大鼠被放置於該明箱中遠離該拉門的最遠端。當大鼠轉身時進入暗箱後，關上拉門之後，給予1 mA/s足部電擊兩次。然後將該大鼠移出該小徑並返回其籠中。在訓練後不同時間點(1天與7天後)給予停留測試(retention test)。停留測試除了未接受電擊之外，其他方式皆相同。當該大鼠進入暗箱時，或經過600秒鐘後大鼠仍未進入暗箱時，終止該測試。將未進入該暗箱且達到600秒鐘上限的大鼠移出該小徑，並指定為具有良好記憶的大鼠。被置於暗箱中直接接受足部電擊(1 mA/s持續2秒鐘)的動物則指定為僅有足部電擊的對照組。
5. 統計分析
試驗數據以單因子變異數分析法(one-way ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
6. 結果
C5 胜 肽及 C6 胜肽皆可改善由 Sco 引起的記憶障礙。 將大鼠隨機分為對照組、scopolamine處理組(Sco)、C5+Sco處理組以及C6+Sco處理組。於行為試驗開始前先每天注射C5胜肽(54 µg/kg/day)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)、0.5% DMSO/鹽水(負對照組)，連續注射14天，接著再對各組大鼠分別以腹腔注射Sco (1.5 mg/kg/day)、C5胜肽(54 µg/kg/day)加上Sco (1.5 mg/kg/day) (C5+Sco組)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)加上Sco (1.5 mg/kg/day) (C6+Sco組)、0.5% DMSO/鹽水(負對照組)，連續注射7天，行為實驗開始後，在實驗期間也持續注射。每隻大鼠注射體積為1 µL/g體重，於每天上午行為試驗開始前30分鐘注射Sco，C5胜肽或C6胜肽於前一天下午5時進行注射。如圖8所示，在尚未受到足部電擊訓練前，所有組別的大鼠自明箱進入暗箱所花費的時間大致相同(p ＞ 0.05)。在足部電擊後7天，Sco處理組的大鼠在明箱中停留的時間較短(q = 4.14,P ＜ 0.05)(在第7天時比較對照組與Sco處理組)。在足部電擊後7天，(C5+Sco)處理組大鼠在明箱中停留的時間較長(q = 4.84,P ＜ 0.05) (在第7天時比較Sco處理組與(C5+Sco)處理組)。在足部電擊後7天，(C6+Sco)處理組大鼠在明箱中停留的時間較長(q = 4.84,P ＜ 0.05) (在第7天時比較Sco處理組與(C6+Sco)處理組)。此結果表示C5胜肽及C6胜肽改善了由Sco引起記憶障礙的大鼠在被動單向抑制性迴避試驗中的表現。
實施例七 C5 胜 肽與 C6 胜肽對於由莨菪鹼氫氯酸鹽誘發的記憶障礙的影響 – 大鼠被動迴避平台試驗
1. 試驗動物
動物來源與照護同實施例四。
2. 試驗藥物
C5胜肽、C6胜肽取得之方法同實施例一。莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)的取得與製備同實施例五。
3. 藥物處理
大鼠的藥物處理方法同實施例五。
4. 被動迴避平台試驗(跳台法)
在受訓前24小時，先讓動物熟悉測試用具。隔天將大鼠置於一架高的平台上，該平台係設置在被動迴避試驗箱的地板中心，並記錄大鼠跳下平台的時間。在該試驗的第3天時，當大鼠跳下平台時通過網格地板立刻受到輕微的電擊(3V，持續3秒鐘，直流電)，然後回到其籠子內。隔天(24小時保留間隔)大鼠再度被放置在該平台上，且不給予電擊。記錄大鼠跳下平台的潛伏時間。若該大鼠停留在該平台5分鐘，則該大鼠得到300秒鐘的最高分。
5. 統計分析
試驗數據以單因子變異數分析法(one-way ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
6. 結果
C5 胜 肽及 C6 胜肽皆可改善由莨菪鹼氫氯酸鹽 (Sco) 引起的記憶障礙。 大鼠隨機分為對照組、莨菪鹼氫氯酸鹽處理組(Sco)、C5+Sco處理組以及C6+Sco處理組。於行為試驗開始前先每天注射載劑(對照組及莨菪鹼氫氯酸鹽處理組)、C5胜肽(54 µg/kg/day)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)，連續注射14天，接著再對各組大鼠分別以腹腔注射載劑(對照組)、載劑加上莨菪鹼氫氯酸鹽(1.5 mg/kg/day)(莨菪鹼氫氯酸鹽處理組)、C5胜肽(54 µg/kg/day)加上Sco (1.5 mg/kg/day) (C5+Sco處理組)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)加上Sco (1.5 mg/kg/day) (C6+Sco處理組)，連續注射7天，行為實驗開始後，在實驗期間也持續注射。每隻大鼠注射體積為1 µL/g體重，於每天上午行為試驗開始前30分鐘注射莨菪鹼氫氯酸鹽，載劑、C5胜肽或C6胜肽於前一天下午5時進行注射。如圖9A所示，在受到足部電擊前，所有組別的大鼠跳下平台所花費的時間大致相同(p ＞ 0.05)。如圖9B及圖9C所示，在足部電擊後1天，莨菪鹼氫氯酸鹽處理組(Sco)的大鼠在平台上停留的時間較短，且跳下的次數顯著較多(q = 4.4,P ＜ 0.05)(在第1天時比較對照組與Sco處理組)。在足部電擊後1天，相較於莨菪鹼氫氯酸鹽處理組(Sco)，(C5+Sco)處理組以及(C6+Sco)處理組的大鼠在平台上停留的時間皆較長，且跳下的次數顯著較少(C5+Sco)處理組以及(C6+Sco)處理組的q 值皆為 4.4,P ＜ 0.05)。此結果表示C5胜肽及C6胜肽改善了由莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)引起記憶障礙的大鼠在被動迴避平台試驗中的表現。
實施例八 C5 胜 肽與 C6 胜肽對於由莨菪鹼氫氯酸鹽誘發的新穎物體辨識與記憶障礙的影響 – 大鼠新穎物體識別學習
1. 試驗動物
動物來源與照護同實施例四。
2. 試驗藥物
C5胜肽、C6胜肽取得之方法同實施例一。莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)的取得與製備同實實施例五。
3. 藥物處理
大鼠的藥物處理方法同實施例五。
4. 新穎物體識別學習
在熟悉期間，允許大鼠在一個開放場地的箱子(90 ´ 70 ´ 60 cm)中探索2個相同的物體5分鐘。用來判斷探索的標準是該大鼠與該物體之間的距離少於1.5 cm，或是該大鼠直接接觸該物體。3小時，8小時及24小時後，在給予停留測試(retention test)期間，將該大鼠放回相同的箱子中，但其中一個熟悉的物體已被置換為一個尺寸大約相同的新穎物體。記錄每隻大鼠在5分鐘期間內用於探索該2物體的時間。而被置於一個沒有任何物體之開放場地的箱子內的大鼠則被指定為非訓練組。
5. 統計分析
試驗數據以二因子變異數分析法(two-way ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
6. 結果
C5 胜 肽及 C6 胜肽皆可改善由莨菪鹼氫氯酸鹽 (Sco) 引起的記憶障礙。 在新穎物體識別試驗中，將大鼠隨機分為對照組、莨菪鹼氫氯酸鹽處理組(Sco)、C5+Sco處理組以及C6+Sco處理組。於行為試驗開始前先每天注射載劑(對照組及莨菪鹼氫氯酸鹽處理組)、C5胜肽(54 µg/kg/day)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)，連續注射14天，接著再對各組大鼠分別以腹腔注射載劑(對照組)、載劑加上莨菪鹼氫氯酸鹽 (1.5 mg/kg/day)(莨菪鹼氫氯酸鹽處理組)、C5胜肽(54 µg/kg/day)加上Sco (1.5 mg/kg/day) (C5+Sco處理組)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)加上莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco) (1.5 mg/kg/day) (C6+Sco處理組)，連續注射7天，行為實驗開始後，在實驗期間也持續注射。每隻大鼠注射體積為1 µL/g體重，於每天上午行為試驗開始前30分鐘注射莨菪鹼氫氯酸鹽，載劑、C5胜肽或C6胜肽於前一天下午5時進行注射。如圖10所示，在識別訓練期間，試驗動物對於左邊物體(LO)或右邊物體(RO)皆無偏好(所有的p ＞ 0.05)。將右邊物體(RO)以新穎物體(NO)置換後3、8、24小時，對照組、(C5+Sco)處理組、(C6+Sco)處理組大鼠顯現出對新穎物體(NO)的偏好(q = 3.87,P ＜ 0.05;q = 3.57,P ＜ 0.05)。注射Sco的大鼠在探索新穎物體(NO)所花費的時間則與探索原來的右邊物體(RO)所花費的時間無差異(p ＞ 0.05)。此結果表示C5胜肽及C6胜肽改善了由莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)引起記憶障礙的大鼠在新穎物體識別學習中的表現。
實施例九 C5 胜 肽與 C6 胜肽對老化大鼠的空間學習與記憶形成的影響 – 大鼠水迷宮試驗
1. 試驗動物
動物來源與照護同實施例四。
2. 試驗藥物
C5胜肽、C6胜肽取得之方法同實施例一。
3. 藥物處理
在藥物處理前，將12個月大的大鼠隨機分為4組，並接受水迷宮訓練。接著，各組大鼠分別以腹腔注射PBS (負對照組)、C5胜肽(54 µg/kg/day)以及C6胜肽(5.4 µg/kg/day)(各組N = 6)。注射體積為1 µL/g體重。每天注射一次，持續注射6個月。
4. 水迷宮學習模式
方法同實施例四。
5. 統計分析
試驗數據以二因子變異數分析法(two-way ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
6. 結果
C5 胜 肽及 C6 胜肽皆可改善由老化引起的記憶障礙。 在藥物處理前，將12個月大的大鼠隨機分為4組，並接受水迷宮訓練，結果如圖11A所示，各組平均逃脫的時間相似，且隨著訓練的天數增加，大鼠逃脫水迷宮的時間減少。以藥物處理6個月後，再對18個月齡的老化大鼠進行水迷宮試驗，結果如圖11B所示。與負對照組大鼠相較，接受C5胜肽(54 µg/kg)與C6胜肽(5.4 µg/kg)注射的大鼠較快找到隱藏的平台，且在試驗第一天即具有顯著差異(p ＜0.01)。此結果表示C5胜肽及C6胜肽可改善由老化引起的空間學習能力的衰退以及記憶的損傷。
此外，從十二月齡開始每隔兩個月(12月齡、14月齡、16月齡、18月齡、20月齡及22月齡)記錄一次大鼠存活率。老化大鼠的存活率結果如圖12所示。相較於負對照組的老化大鼠，施用C5胜肽的老化大鼠具有較高的存活率；而施用C6胜肽的老化大鼠到22月齡時，存活率高達100%。此結果表示，C5胜肽及C6胜肽可延長大鼠之壽命。
實施例十 C6 胜 肽對於由 1- 甲基 -4- 苯基 -1,2,3,6- 四氫吡啶 (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP) 誘導的帕金森氏症小鼠的影響
1. 試驗動物
動物來源與照護同實施例四。
2. 試驗藥物
C6胜肽取得之方法同實施例一。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)係購自Sigma-Aldrich公司(聖路易市，密蘇里州，美國)，並溶於DMSO中。
3. 藥物處理
使用五週齡雄性C57BL/6小鼠，分為負對照組(PBS)、MPTP處理組(30 mg/kg)，以及C6胜肽(10.7 μg/kg) + MPTP組。依照小鼠每天的體重換算注射量後進行腹腔注射，預先注射C6胜肽持續三週後，同時注射MPTP與C6胜肽持續一週後，再進行滾筒跑步機試驗。
4. 滾筒跑步機試驗
以滾筒跑步機來測試小鼠的運動協調能力。先讓小鼠在跑步機上以固定速度2 rpm適應2分鐘後，開始加速(5分鐘內會加到最高速)到20 rpm持續15分鐘，並記錄時間內小鼠自跑步機上掉落的時間。
5. 統計分析
試驗數據以單因子變異數分析法(one-way ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
6. 結果
C6 胜 肽可以改善由 MPTP 誘導產生帕金森氏症的小鼠的運動協調能力。 本實施例使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)來誘導小鼠產生帕金森氏症，並以此模式小鼠來分析C6胜肽對帕金森氏症的影響。圖13顯示每組小鼠在滾筒跑步機上停留的時間，停留越久表示其運動協調能力越好。注射PBS的負對照組在滾筒跑步機上停留的時間平均為778.5秒，MPTP處理組的帕金森氏症小鼠的停留時間平均為159.8秒，而C6胜肽+ MPTP組小鼠的停留時間則平均為261秒。各組相較於負對照組皆有顯著差異(q = 24.12, 23.42, 20.18,p ＜0.01)。而相較於MPTP處理組，C6胜肽+ MPTP組小鼠停留在滾筒跑步機上的時間較久，並且具有顯著差異(q = 4.19, 3.45,p ＜0.05)。此結果表示C6胜肽改善了由MPTP誘導產生帕金森氏症的小鼠的運動協調能力。
實施例十一 C5 胜 肽與 C6 胜肽對於由右旋半乳糖誘發的老化大鼠的空間學習與記憶的影響 – 大鼠水迷宮試驗
1. 試驗動物
動物來源與照護同實施例四。
2. 試驗藥物
C5胜肽、C6胜肽取得之方法同實施例一。右旋半乳糖(D-(+)-galactose)係購自Sigma-Aldrich公司(聖路易市，密蘇里州，美國)，並且被溶解於0.9% NaCl溶液中備用。
3. 藥物處理
將七週齡大鼠隨機分為對照組(0.9% NaCl)、右旋半乳糖處理組、C5+右旋半乳糖處理組以及C6+右旋半乳糖處理組。於行為試驗開始前先每天注射0.9% NaCl載劑(對照組及右旋半乳糖處理組)、C5胜肽(54 µg/kg/day)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)，連續注射7天，接著再對各組大鼠分別以腹腔注射載劑(對照組)、載劑加上右旋半乳糖(150 mg/kg/day)(右旋半乳糖處理組)、C5胜肽(54 µg/kg/day)加上右旋半乳糖(150 mg/kg/day) (C5+右旋半乳糖處理組)、C6胜肽(5.4 µg/kg/day)加上右旋半乳糖(150 mg/kg/day) (C6+右旋半乳糖處理組)，連續注射9週後，再進行水迷宮及跳台實驗。每隻大鼠注射體積為1 µL/g體重。
4. 水迷宮學習模式
方法同實施例四。
5. 統計分析
試驗數據以二因子變異數分析法(two-way ANOVA)分析，接著以事後Newman-Keuls多重比較檢定來分析。
6. 結果
C5 胜 肽及 C6 胜肽皆可改善由半乳糖誘導的老化大鼠的空間學習及記憶的能力。 圖14所示為每組大鼠每天在水迷宮學習的平均逃脫時間。注射右旋半乳糖的大鼠需要較長的逃脫時間去找到隱藏的平台(平均53.06秒)。與注射右旋半乳糖的大鼠相較，C5+右旋半乳糖組與C6+右旋半乳糖組的大鼠自試驗第2天起，找到隱藏平台的時間顯著減少(q=5.34,4.37,p<0.01)，但與對照組相比則無統計上的顯著差異(p>0.05)。此結果表示C5胜肽及C6胜肽改善了由右旋半乳糖誘導的老化大鼠的空間學習能力。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例的具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明的專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為的等效實施或變更，均應包含於本案的專利範圍中。
前面的概述，以及本發明以下的詳細描述，在結合附圖一起閱讀時將可以被更好地理解。為了說明本發明的目的，所附圖式示出了一些，但不是所有的，可替代的具體實施例。然而，應該理解的是，本發明並不限於所示的精確安排和手段。這些圖式，其被併入並構成說明書的一部分，有助於解釋本發明的原理。
圖1A至圖1I所示為C5胜肽(SEQ ID NO: 1)及C6胜肽(SEQ ID NO: 2)對初代海馬迴神經突(neurites)生長的影響。分別以PBS (負對照組)(圖1A)、C5胜肽(10-9 , 10-12 , 10-15 M)(圖1B至圖1D)、C6胜肽(10-9 , 10-12 , 10-15 M)(圖1F至圖1H)、D-form C5胜肽(10-9 M)(圖1E)，以及D-form C6胜肽(10-12 M)(圖1I)處理初代海馬迴神經元(於體外培養第3天，DIV3)連續3天，接著以抗-Tau抗體(軸突標記，綠色螢光)、抗MAP-2抗體(樹突標記，紅色螢光)以及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) DNA螢光染劑(藍色)於DIV6進行免疫染色。比例尺長度：50 µm。
圖2A至圖2G所示為P1胜肽(SEQ ID NO: 4)、P2胜肽(SEQ ID NO: 5)、P3胜肽(SEQ ID NO: 6)、P4胜肽(SEQ ID NO: 7)、P5胜肽(SEQ ID NO: 8)，以及P6胜肽(SEQ ID NO: 9)對初代海馬迴神經突(neurites)生長的影響。分別以PBS (負對照組)(圖2A)、10-9 M P1胜肽(圖2B)、10-9 M P2胜肽(圖2C)、10-9 M P3胜肽(圖2D)、10-9 M P4胜肽(圖2E)、10-9 M P5胜肽(圖2F)，以及10-9 M P6胜肽(圖2G)處理初代海馬迴神經元(於分化第3天，DIV3) 3天，接著以抗-Tau抗體(軸突標記，綠色螢光)、抗MAP-2抗體(樹突標記，紅色螢光)以及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) DNA螢光染劑(藍色)進行免疫染色。比例尺長度：50 µm。
圖3A至圖3E所示為以本發明一些示例性的胜肽處理後，初代海馬迴神經軸突的分枝數目及長度的統計結果。神經元分枝示意圖如圖3A所示。以C5胜肽(10-12 M)或C6胜肽(10-12 M)處理初代海馬迴神經元(於分化第3天，DIV3) 3天，接著以抗-Tau (綠色)抗體、抗-MAP2 (紅色)抗體以及DAPI DNA螢光染劑(藍色)進行免疫染色並計算軸突分枝數目(結果如圖3C所示)及軸突長度(結果如圖3B所示)。另外，以P1胜肽(10-9 M)、P2胜肽(10-9 M)、P3胜肽(10-9 M)、P4胜肽(10-9 M)、P5胜肽(10-9 M)或P6胜肽(10-9 M)處理初代海馬迴神經元(於分化第3天，DIV3) 3天，接著以抗-Tau (綠色)抗體、抗-MAP2 (紅色)抗體以及DAPI DNA螢光染劑(藍色)進行免疫染色並計算軸突分枝數目(結果如圖3E所示)及軸突長度(結果如圖3D所示)。以Image J軟體及單因子變異數分析(One-way ANOVA)並接著以Newman-Keuls比較檢定分析數據。數據為mean ± SEM。相較於對照組，**表示p ＜ 0.01。
圖4所示為以MTT分析法評估不同濃度的C5胜肽(10-12 M, 10-9 M, 10-6 M, 10-3 M)及C6胜肽(10-12 M, 10-9 M, 10-6 M, 10-3 M)對初代海馬迴神經元存活率的影響。該數據所示為mean ± SEM，每組3重複。
圖5所示為C5胜肽與C6胜肽對神經元軸突再生的影響。初代海馬迴神經元於體外培養第5天時(DIV5)以刮痕損傷處理後，分別以PBS (圖5A)、C5胜肽(10-9 M) (圖5B)、C6胜肽(10-9 M) (圖5C)處理被刮傷的初代海馬迴神經元96小時，接著以抗-Tau抗體(軸突標記，綠色螢光) 以及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) DNA螢光染劑(藍色)進行免疫染色。比例尺長度：100 µm。
圖6所示為以水迷宮試驗分析C5胜肽與C6胜肽對空間學習與記憶形成的影響。SD大鼠隨機被分為對照組、C5低劑量(54 µg/kg)組、C5高劑量(270 µg/kg)組、C6低劑量(5.4 µg/kg)組、C6高劑量(27 µg/kg)組。記錄每組大鼠每天學習的平均逃脫時間(秒)。以二因子重複量數變異數分析(Two-way ANOVA)並接著以Newman-Keuls比較檢定分析數據。該數據為mean ± SEM。相較於對照組，**表示p ＜ 0.01。
圖7所示為C5胜肽與C6胜肽對於由莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)誘發記憶障礙的大鼠在水迷宮裡記憶形成的影響。大鼠隨機分為對照組、注射莨菪鹼氫氯酸鹽組(Sco)、注射C5胜肽+Sco組以及注射C6胜肽+Sco組，並接受水迷宮訓練。記錄每天學習的平均逃脫時間(秒)。以二因子變異數分析(Two-way ANOVA)並接著以Newman-Keuls比較檢定分析數據。該數據為mean ± SEM。相較於對照組，*表示p ＜ 0.05；**表示p ＜ 0.01。
圖8所示為C5胜肽與C6胜肽對於由莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)引起的記憶障礙的大鼠在被動單向抑制性迴避學習的影響。大鼠隨機分為對照組、注射莨菪鹼氫氯酸鹽組(Sco)、C5胜肽(54 µg/kg) +Sco處理組以及C6胜肽(5.4 µg/kg) +Sco處理組，並接受被動單向抑制性迴避學習試驗。在給予足部電擊前，各組大鼠在明箱的停留時間並無差異。記錄給予足部電擊1天與7天之後在明箱中的停留時間。以單因子變異數分析(One-way ANOVA)並接著以Newman-Keuls比較檢定分析數據。該數據為mean ± SEM。相較於對照組，*表示p ＜ 0.05；**表示p ＜ 0.01。
圖9A至圖9C所示為C5胜肽與C6胜肽對於由莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)引起的記憶障礙的大鼠在被動迴避平台記憶的影響。大鼠隨機分為對照組、注射莨菪鹼氫氯酸鹽組(Sco)、C5+Sco處理組以及C6+Sco處理組，並接受被動迴避平台記憶試驗。圖9A所示為在給予足部電擊前，各組大鼠在平台上的停留時間並無差異。圖9B所示為給予足部電擊後1天，大鼠在平台上的停留時間。圖9C所示為給予足部電擊後1天，大鼠跳下平台的錯誤次數。以單因子變異數分析(One-way ANOVA)並接著以Newman-Keuls比較檢定分析數據。該數據為mean ± SEM。**表示p ＜ 0.01。
圖10所示為C5胜肽與C6胜肽對於由莨菪鹼氫氯酸鹽(Sco)引起的記憶障礙的大鼠在新穎物體識別試驗的影響。大鼠隨機分為對照組、注射莨菪鹼氫氯酸鹽組(Sco)、注射C5+Sco組以及注射C6+Sco組，並接受新穎物體識別試驗。記錄大鼠在右邊物體(RO)被置換為新穎物體前、3小時後、8小時後與24小時後，花費在探索左邊物體(LO)、右邊物體(RO)與新穎物體(NO)的停留時間(秒)。以二因子變異數分析(Two-way ANOVA)並接著以Newman-Keuls比較檢定分析數據。該數據為mean ± SEM。*表示p ＜ 0.05；**表示p ＜ 0.01。
圖11A與圖11B所示為C5胜肽與C6胜肽對於由老化誘發記憶障礙的大鼠在水迷宮裡記憶形成的影響。大鼠隨機被分為對照組、C5組、以及C6組，並接受水迷宮訓練。圖11A所示為給藥前每組大鼠每天學習的平均逃脫時間(秒)。圖11B所示為給藥6個月後，每組大鼠每天學習的平均逃脫時間(秒)。以二因子變異數分析(Two-way ANOVA)並接著以Newman-Keuls比較檢定分析數據。該數據為mean ± SEM。相較於對照組，*表示p ＜ 0.05；**表示p ＜ 0.01。
圖12所示為C5胜肽與C6胜肽對於由老化大鼠的存活率的影響。各組原始隻數皆為6隻，從12月齡開始每隔兩個月記錄一次(12月齡、14月齡、16月齡、18月齡、20月齡及22月齡)。結果資料以各組存活隻數表示。
圖13所示為C6胜肽對於由1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)誘導的帕金森氏症大鼠的影響。
圖14所示為C5胜肽與C6胜肽對於由右旋半乳糖誘導的老化大鼠在水迷宮裡記憶形成的影響。大鼠隨機分為對照組、右旋半乳糖處理組、注射C5胜肽+右旋半乳糖處理以及注射C6胜肽+右旋半乳糖處理，並接受水迷宮訓練。記錄每天學習的平均逃脫時間(秒)。以二因子變異數分析(Two-way ANOVA)並接著以Newman-Keuls比較檢定分析數據。該數據為mean ± SEM。相較於對照組，**表示p ＜ 0.01。
<110> 福又達生物科技股份有限公司
<120> 增進神經元生長的胜肽及其應用
<130> P15-0187
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<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 增進神經元生長的胜肽
<400> 7
<210> 8
<211> 5
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<210> 9
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<213> 人工序列
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<223> 增進神經元生長的胜肽
<400> 9

Claims (9)

  1. 一種增進神經元生長之胜肽，由下列胺基酸序列所組成：Asn-X1-X2-Pro-Gln (SEQ ID NO：3)；其中，X1，係為選自於由非極性胺基酸所組成之群組的一個胺基酸；以及X2，係為選自於由自然產生的胺基酸及胺基酸類似物所組成之群組的一個胺基酸；其中該胜肽具有增進神經元生長的活性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，包含至少下列之一序列：NAIPQ(SEQ ID NO：1)、NPSPQ(SEQ ID NO：2)、NFEPQ(SEQ ID NO：4)、NMYPQ(SEQ ID NO：5)、NIKPQ(SEQ ID NO：6)、NLMPQ(SEQ ID NO：7)、NVAPQ(SEQ ID NO：8)，以及NWLPQ(SEQ ID NO：9)。
  3. 一種編碼如申請專利範圍第1項所述之胜肽的多核苷酸。
  4. 一種藥學組合物，包含如申請專利範圍第1項所述之胜肽以及一藥學上可接受之載劑。
  5. 一種如申請專利範圍第1項所述之胜肽在製備增進神經元生長之藥物的用途。
  6. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該神經元係為正常或受損或退化的神經元。
  7. 一種如申請專利範圍第1項所述之胜肽在製備一種用以在一受試者體內改善與神經元細胞受損或退化有關之症狀的藥物的用途。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該症狀係選自於下列所組成之群組：記憶受損、智能衰退、運動協調能力受損、存活率下降、中樞神經系統病變、帕金森氏症、阿滋海默症、影響感覺神經元的疾病、皮質邊緣系統的疾病、與發育遲緩及學習障礙相關的病症、唐氏症、氧化壓力誘導的神經元死亡、因老化所產生的病症、因慢性酗酒所產生的病症、因藥物濫用所產生的病症、因局部創傷造成的病理改變，以及因治療藥物及治療的負面副作用所產生的病症。
  9. 一種如申請專利範圍第1項所述之胜肽在製備一種用以促進健康個體記憶或學習能力的組合物的用途。
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