CN113476454B - Icg-001在制备治疗自闭症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供ICG‑001在制备用于治疗自闭症的药物中的应用。ICG‑001能够有效改善自闭症大鼠社交能力、减轻重复刻板和焦虑样行为、提高记忆功能，并且ICG‑001能够上调脑发育调节蛋白A蛋白的表达，并逆转自闭症大鼠海马树突棘密度和形态的改变，效果显著。

Description

ICG-001在制备治疗自闭症药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及ICG-001在制备治疗自闭症药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
自闭症，又称孤独症，是一组起病于婴幼儿时期的神经发育障碍性疾病，其主要临床症状包括社交障碍、重复刻板和认知缺陷等行为方式。社交障碍涉及在社交互动中的缺陷，眼光接触缺乏、继续对话的能力减弱以及日常互动技能受损。重复刻板包括强迫行为，对物品与众不同的依恋、对常规或礼节僵化地遵守、以及重复运动怪癖和自我刺激行为。认知缺陷包括语言异常。
自闭症的主要症状在患者婴幼儿时期表现明显，甚至使患者失去生活自理能力，给家庭造成巨大的经济负担和精神压力。据相关数据统计，美国自闭症发病率为14.7‰，中国儿童6-12岁自闭症发病率约为7‰，且发病率呈逐年上升趋势，高发病率使得自闭症成为最常见的发育残疾之一，成为不容忽视的儿童神经发育性疾病。
迄今为止，自闭症的发病机制尚不完全清楚，目前公认的病因是大脑结构或功能上出现病变。据美国疾病控制与预防中心发表的资料表明自闭症的病因有多种因素，其中包括环境与遗传因素。大多数科学家认同遗传基因的易感因素占据主导。因此，仍缺乏自闭症的特异性诊断和有效的治疗手段。目前，治疗的目标主要以减轻症状，提高患者的独立生活自理能力及改善生活质量为主，如应用行为分析疗法，但在改善或治疗自闭症方面的药物尚未有突破性进展。
发明内容
为了改善现有技术的不足，本发明提供了ICG-001在制备治疗自闭症的药物中的应用。
ICG-001，分子式C33H32N4O4，分子量为548.63，CAS号为780757-88-2，化学名称为：(6S,9aS)-N-benzyl-6-(4-hydroxybenzyl)-8-(naphthalen-1-ylmethyl)-4,7-dioxooctahydro-1H-pyr azino[1,2-a]pyrimidine-1-carboxamide，其结构式为：
ICG-001是小分子化合物，呈白色或类白色的粉末样试剂，易溶于二甲基亚砜(DMSO)。ICG-001是Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制物，通过抑制细胞核中β-catenin与CBP的相互作用，降低转录复合物的活性，从而抑制Wnt靶基因的表达。ICG-001被证实可抑制结直肠癌细胞的生长，且对结直肠癌细胞来源的异种移植瘤有明显的抑制作用，以及，在胃癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌和宫颈癌中，ICG-001均被证实可通过抑制β-catenin转录复合物CBP的活性发挥抗瘤功能。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了ICG-001在制备用于治疗自闭症或其症状的药物中的应用。
神经发育障碍是一组在发育期发病的病症。这些障碍典型地在儿童期显现，并且其特征在于发育缺陷，所述发育缺陷产生人格、社交、学业或职业功能损伤。残疾的范围从非常具体的学习缺陷或执行功能控制缺陷到社交能力或智力的全面损伤。在神经发育障碍中，自闭症已被定性为一种不同于精神病的婴幼儿问题。自闭症，又称孤独症，是一种较为严重的发育障碍性疾病。其中，疾病和有关健康问题的国际统计分类(第10次修订本)(ICD-10)和《精神障碍诊断与统计手册》(第5版)(DSM-5)中有针对儿童孤独症的诊断标准，在此将ICD-10和DSM-5中与此相关的内容通过引用并入本发明。症状的多变性和不同的诊断类别中对自闭症的描述使得自闭症的治疗难以具有统一性或者说治疗的出发点也往往具有多样性，因此，当提及治疗自闭症的药物时，药物之间往往缺乏关联和相似性，因为其极有可能涉及不同症状的治疗，比如仅能针对社交能力进行治疗或者仅能针对重复刻板行为进行治疗，再或者能够同时针对社交能力和重复刻板行为进行治疗等等。所以，鉴于自闭症的特殊性，其症状尤其是被诊断标准载明的症状本身具有被治疗的属性，可单独对其症状提供相应的制药用途。
在本发明的实施方式中，在本发明所述ICG-001在制备用于治疗自闭症或其症状的药物中的应用中，所述药物为能够改善社交能力、重复刻板行为、焦虑样行为三者中的至少一种的药物，所述至少一种包括只改善上述三种中的一种、或任意两种、或同时改善上述三种的情况。
在本发明的一些实施方式中，本发明采用以丙戊酸钠(VPA)诱导的大鼠自闭症模型进行测试，发现ICG-001在每日给药剂量为5mg/kg，每日1次，连续给药21天后，经三箱社交实验、自我捋毛实验、埋珠实验，药物组与模型组相比出现与社交鼠接触时间显著增加、社交指数显著增加、捋毛时间明显降低、埋珠数量明显降低的结果，并且该结果与阴性对照组结果相当，这表明自闭症大鼠社交能力、重复刻板行为和焦虑样行为在使用ICG-001后均有快速明显的改善。
在本发明的实施方式中，在本发明所述ICG-001在制备用于治疗自闭症或其症状的药物中的应用中，所述药物为改善认知能力的药物；其中，所述改善认知能力包括提升对物体尤其对新物体的识别能力。
在本发明的一些实施方式中，本发明采用以丙戊酸钠(VPA)诱导的大鼠自闭症模型，发现ICG-001在每日给药剂量为5mg/kg，每日1次，连续给药21天后，经旷场实验评估了实验大鼠自发性活动及对新环境的探索行为，进而评价了动物焦虑样行为，以及，进行了高架十字迷宫实验，结果经过ICG-001处理过的自闭症大鼠相较于模型组在中央区域停留时间明显延长，并且该结果与阴性对照组结果相当，表明ICG-001能够快速显著改善自闭症大鼠的焦虑样行为。
以及，在本发明的实施方式中，在本发明所述ICG-001在制备用于治疗自闭症或其症状的药物中的应用中，所述药物为改善空间记忆能力的药物。
在本发明的一些实施方式中，本发明采用以丙戊酸钠(VPA)诱导的大鼠自闭症模型，发现ICG-001在每日给药剂量为5mg/kg，每日1次，连续给药21天后，经Y-迷宫检测动物空间工作记忆能力，结果经过ICG-001处理过的自闭症大鼠自发交替轮转率显著增加，表明ICG-001能够快速显著改善自闭症大鼠的空间记忆能力。
以及，在本发明的实施方式中，本发明提供了ICG-001作为药物或试剂具有调节脑发育调节蛋白A的作用，具体表现为上调脑发育调节蛋白A的表达。因此，在ICG-001在制备用于治疗自闭症或其症状的药物中的应用中，所述药物为调节脑发育调节蛋白A的药物，尤其为上调脑发育调节蛋白A的表达的药物。
脑发育调节脑蛋白A(Developmentally regulated brain protein A，DrebrinA)存在于神经元胞质尤其是树突，是一种肌动蛋白结合蛋白，具有调节神经突触形态和突触传递等作用。目前的研究多集中于对蛋白本身的研究及检测，目前并未报道其与自闭症存在关联。
在本发明的一些实施方式中，本发明采用以丙戊酸钠(VPA)诱导的大鼠自闭症模型，发现ICG-001在每日给药剂量为5mg/kg，每日1次，连续给药21天后进行了免疫印迹实验，结果发现ICG-001处理过的自闭症大鼠海马Drebrin A蛋白表达上调。
以及，进一步地，在本发明的实施方式中，本发明提供了ICG-001作为药物或试剂具有改变树突棘密度和形态的作用。所述树突棘为海马CA1区锥体神经元树突棘，优选为顶树突棘。尤其是，ICG-001能够逆转自闭症树突棘密度和形态的改变。因此，在ICG-001在制备用于治疗自闭症或其症状的药物中的应用中，所述药物为逆转树突棘密度和形态的改变的药物。
树突棘存在以下4种形态：蘑菇型(Mushroom)、短粗型(Stubby)、瘦长型(Thin)和丝状伪足型(Branched)。其中，瘦长型与丝状伪足型被认为是不成熟状态，短粗型与蘑菇型为成熟型(Bian,W.J.,Miao,W.Y.,He,S.J.,Qiu,Z.,Yu,X.,2015.Coordinated SpinePruning and Maturation Mediated by Inter-Spine Competition for Cadherin/Catenin Complexes.Cell 162,808-822)。在本发明的一些实施方式中，本发明采用以丙戊酸钠(VPA)诱导的大鼠自闭症模型，分为生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA和VPA/ICG-001组，其中，ICG-001每日给药剂量为5mg/kg，每日1次，连续给药21天后进行高尔基染色实验，结果发现，VPA组海马CA1区锥体细胞顶树突棘为不成熟的瘦长型、且数量较少，而经过ICG-001处理过的自闭症大鼠海马CA1区锥体细胞蘑菇型顶树突棘增多和瘦长型顶树突棘减少(VPA/ICG-001组)，其形态与Control组、ICG-001对照组接近，表明ICG-001能够逆转自闭症大鼠树突棘密度和形态的改变。
本发明提供了ICG-001的新的用途，所述用途包含如上所述的药物的制药用途以及非制药用途，所述非制药用途包括但不限于用于基础科学实验研究，比如作为试剂应用。
因此，在本发明的第二方面，本发明提供了ICG-001作为试剂或处理剂在上调脑发育调节蛋白A的表达中的应用，以及ICG-001作为试剂或处理剂在研究树突棘密度和形态改变中的应用。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种用于治疗自闭症的药物组合物或药物制剂，其包含ICG-001；所述药物组合物或药物制剂为具有下述所列(1)至(6)中至少一种作用的药物：
(1)改善社交能力；
(2)改善重复刻板行为；
(3)改善焦虑样行为；
(4)改善认知能力；
(5)调节脑发育调节蛋白A，尤其指上调脑发育调节蛋白A的表达；
(6)改变海马CA1区锥体神经元树突棘的密度和形态。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种用于上调脑发育调节蛋白A的表达和/或改变树突棘密度和形态(逆转不良改变)的试剂盒，其包含ICG-001。
在本发明的实施方式中，对于用于制药来说，组合物可以被包括在一种合适的剂型中，比如一种口服或是注射剂型。这种剂型形式可以包括其他的添加剂或在相关工艺中常用的赋形剂。如果用于非制药用途，组合物可以是任何一种便于引入到生物系统或体外系统的形式，并不限于溶液或是悬浊液等。
以及，在本发明的第五方面，本发明提供了ICG-001在治疗自闭症或其症状的方法，该方法包括向受试者施与有效剂量的ICG-001或包含ICG-001的组合物。
在本发明的实施方式中，本发明提供了一种有效的给药剂量和给药方式，在以大鼠为实验对象的研究中，ICG-001以溶液形式给药，动物每日给药剂量为5mg/kg，每日1次，连续给药21天，给药方式为注射给药。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了化合物ICG-001在自闭症方面的应用，丙戊酸钠(VPA)诱导的大鼠自闭症模型中，连续腹腔注射ICG-001后21天，三箱社交行为实验结果表明IICG-001处理组与社交鼠接触的时间与社交指数(preference score)增加；埋珠行为实验结果表明处理组埋珠数量减少；捋毛行为实验结果表明ICG-001处理组捋毛时间减少；旷场实验结果表明ICG-001处理组在中央区域停留时间增加；高架十字迷宫实验结果表明ICG-001处理组在开臂停留的时间百分比增加；Y迷宫结果表明ICG-001处理组自发交替轮转率增加；新奇物体识别实验结果表明ICG-001处理组新奇物体识别指数增加；免疫印迹实验结果表明ICG-001处理组海马Drebrin A表达上调；高尔基染色实验结果表明ICG-001处理组海马CA1区锥体细胞顶树突棘密度增加、蘑菇型顶树突棘增加和瘦长型顶树突棘减少。动物实验结果表明ICG-001能够有效改善自闭症大鼠社交能力、减轻重复刻板和焦虑样行为、提高记忆功能，伴随有海马上调Drebrin A蛋白表达和树突棘形态改变，充分说明了ICG-001在自闭症治疗中的良好药用前景。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1为三箱社交实验中每组大鼠与社交鼠接触时间结果对比图；其中，Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。***p<0.001对比于生理盐水对照组；###p<0.001对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，与社交鼠接触时间无统计学差异。
图2为三箱社交实验中每组大鼠的社交指数结果对比图；其中，Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。*p<0.05对比于生理盐水对照组；##p<0.01对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，社交指数无统计学差异。
图3为捋毛实验中每组大鼠的捋毛时间结果对比图；其中，Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。***p<0.001对比于生理盐水对照组；###p<0.001对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，捋毛时间无统计学差异。
图4为埋珠实验中每组大鼠的埋珠数量结果对比图；其中，Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。***p<0.001对比于生理盐水对照组；###p<0.001对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，埋珠数量无统计学差异。
图5为旷场实验中每组大鼠在中央区域停留时间结果对比图；其中，Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。***p<0.001对比于生理盐水对照组；###p<0.001对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，在中央区停留时间无统计学差异。
图6为高架十字迷宫实验中每组大鼠在开臂停留时间百分比对比图；其中，Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。***p<0.001对比于生理盐水对照组；##p<0.01对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，在开臂停留时间无统计学差异。
图7为Y迷宫实验中每组大鼠自发交替轮转率对比图；其中，Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。***p<0.001对比于生理盐水对照组；###p<0.001对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，自发交替轮转率无统计学差异。
图8为新奇物体识别实验中每组大鼠新奇物体识别指数对比图；其中，Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。**p<0.01对比于生理盐水对照组；##p<0.01对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，新奇物体识别指数无统计学差异。
图9为免疫印迹实验中每组大鼠的海马Drebrin A蛋白表达水平；其中，Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。***p<0.001对比于生理盐水对照组；###p<0.001对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，Drebrin A蛋白表达无统计学差异。
图10为高尔基染色实验中每组大鼠海马顶树突棘密度和形态。Control:生理盐水对照组；ICG-001:ICG-001对照组；VPA:孤独症模型组；VPA/ICG-001:ICG-001处理组。其中，A：四组大鼠典型的CA1锥体细胞顶树突棘。B:四组大鼠树突棘密度。***p<0.001对比于生理盐水对照组；###p<0.001对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，树突棘密度无统计学差异。C:四组大鼠树突棘形态变化。Mushroom：蘑菇型；Stubby：短粗型；Thin：瘦长型；Branched：丝状伪足。在蘑菇型树突棘中，**p<0.01对比于生理盐水对照组；#p<0.05对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，无统计学差异。在瘦长型树突棘中，*p<0.05对比于生理盐水对照组；#p<0.05对比于孤独症模型组。NS:ICG-001处理组与生理盐水组相比，无统计学差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
1.1ICG-001溶液配制
将ICG-001溶解于10％的二甲基亚砜(DMSO)，配置成浓度为5mg/ml的ICG-001溶液。
1.2动物分组和给药方法
构建自闭症模型大鼠。构建方法：两月龄Wistar大鼠雌雄比例1:1配种。随机分为两组，一组雌鼠怀孕12.5天腹腔注射600mg/kg VPA，另一组雌鼠怀孕12.5天腹腔注射等量0.9％生理盐水。
大鼠出生第7天，注射VPA的新生雄性大鼠随机分为两组，分别为VPA和ICG-001处理组。注射生理盐水的新生大鼠随机分为两组，分别为生理盐水对照和ICG-001对照组。其中，生理盐水对照组和VPA组大鼠腹腔注射生理盐水(5mg/kg)，每日一次，共21天。ICG-001对照和ICG-001处理组大鼠分别腹腔注射5mg/kg ICG-001，每日一次，连续注射21天。每组大鼠为10只。
大鼠出生第43-49天，分别进行三箱社交、埋珠、自我捋毛、旷场、高架十字迷宫、Y迷宫和新奇物体识别行为学实验。
行为学实验结束后，每组大鼠各取5只分别做免疫印迹实验和高尔基染色。
1.3行为实验
1.3.1三箱社交实验：检测动物社交行为
透明塑料箱(60cm×40cm×22cm)分为左、中、右三个部分。将大鼠放入中间箱适应5min，记录10min大鼠进入装有社交鼠的腔室(“Social”腔室)或空腔室(“Non-social”腔室)的持续时间(time)，使用行为分析软件ANY-maze software(Stoelting Co.Wood Dale,IL,USA)分析上述参数，并运用[(Duration social)-(Duration non-social)]/[(Duration social)+(Duration non-social)]为社交指数衡量其社交能力，社交指数越高，表示大鼠的社交能力越好。实验结果如表1-2、图1-2所示。
表1各组社交鼠接触时间结果(单位：秒，s)
表2各组社交指数结果
图1为生理盐水(Control)对照组、ICG-001对照组、VPA和ICG-001处理组(VPA/ICG-001)与社交鼠接触时间对比图。图2为生理盐水(Control)组、ICG-001对照组、VPA和ICG-001处理组(VPA/ICG-001)的社交指数对比图。
由图1可知，经ICG-001处理过的自闭症大鼠即VPA大鼠在给药后，表现出与社交鼠接触时间显著增加，且接触时间与对照组基本无差别，表明用药后自闭症大鼠社交能力在使用ICG-001后有快速明显的改善。
由图2可知，经ICG-001处理过的自闭症大鼠在给药后，表现出社交指数显著增加，且社交指数与对照组基本无差别，也印证了ICG-001药物在治疗自闭症大鼠上的有效性。
1.3.2自我捋毛实验：检测动物重复刻板行为
先将大鼠放入旷场场箱内适应环境10min，而后观察15min大鼠用爪或嘴梳理面部、四肢、周身和尾部的累积时间。结果如表3、图3所示。
表3各组捋毛时间结果(单位：秒，s)
图3为捋毛实验中，生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA与VPA-ICG-001组的捋毛时间对比图。由结果可知，经过ICG-001处理过的自闭症大鼠捋毛时间明显降低，且捋毛时间与对照组基本无异，表明自闭症大鼠的重复刻板行为得到了改善。
1.3.3埋珠实验：检测大鼠重复刻板行为
在45cm×25cm×18cm大小的箱体底部平铺5cm厚木屑垫料，在鼠笼里面放入20个玻璃珠(直径14mm)，分5排，每排4个，规律分布。将大鼠放入箱体，摄像记录30min内大鼠埋玻璃珠的数量(被埋体积大于2/3)。结果如表4、图4所示。
表4各组埋珠数量结果(单位：个)
图4为生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA与VPA/ICG-001大鼠的埋珠数量对比图。
由图4可知，经过ICG-001处理过的自闭症大鼠埋珠数量明显降低，且埋珠数量与对照组基本无异，表明经ICG-001用药后，自闭症大鼠的重复刻板行为得到了改善。
1.3.4旷场实验：评估实验大鼠自发性活动及对新环境的探索行为，进而评价动物焦虑样行为
实验装置为100cm×100cm×45cm方形灰色树脂盒。实验开始时，将大鼠放入旷场反应箱内底面中心，记录大鼠15min在中央区域停留时间。结果如表5、图5所示。
表5各组大鼠在中央区域停留时间(单位：秒，s)
图5为旷场实验中，生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA与VPA/ICG-001大鼠在中央区域停留时间对比图。
由图5可知，经过ICG-001处理过的自闭症大鼠在中央区域停留时间明显延长，且与对照组基本相当，表明自闭症大鼠的焦虑样行为得到了显著改善。
1.3.5高架十字迷宫：评价大鼠焦虑样行为
高架十字迷宫实验装置由2个交叉的张开的双臂和2个封闭的双臂组成。四臂交叉的中间位置定义为中心区域。将大鼠从中央区域面朝开放臂放入，记录10min大鼠在开臂停留时间百分比。结果如表6、图6所示。
表6各组大鼠在开臂停留时间百分比结果(％)
图6为高架十字迷宫实验中，生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA与VPA/ICG-001大鼠在开臂停留时间百分比对比图。
由图6可知，经过ICG-001处理过的自闭症大鼠在开臂停留时间百分比显著延长，且与对照组基本相当，表明自闭症大鼠的焦虑样行为得到了显著改善。
1.3.6Y-迷宫：检测动物空间工作记忆能力
由A、B和C三个等长的支臂组成，将大鼠放入A臂末端，让其自由出入三个臂，记录8min每只动物进入三个臂的顺序，计算进入三个臂总次数N(number of arm entries)及自由交替反应率，以连续进入三个不同臂为一次正确自发交替反应(successivealternation)。
自由交替反应率(％)＝number of successive alternation/(N-2)×100％。
结果如表7、图7所示。
表7各组大鼠自发交替轮转率结果(％)
图7为Y迷宫实验中，生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA和VPA/ICG-001大鼠自发交替轮转率对比图。
由图7可知，经过ICG-001处理过的自闭症大鼠自发交替轮转率显著增加，且与对照组基本相当，表明自闭症大鼠的空间记忆能力得到了显著改善。
1.4高尔基染色和免疫印迹实验
1.4.1新奇物体识别实验：检测动物记忆能力
实验分为训练期和物体识别期。第一阶段为完全相同的两个物体放在测试盒的两端，将大鼠放在测试盒的中间，10min后，移出大鼠。间隔1h，将其中的一个物体换成另一个物体，即新物体，将大鼠再次放入测试盒5min，进行物体识别测试。运用辨别指数检测动物探索两个物体时间与对新奇物体的社交。辨别指数＝(N-F)/(N+F)，“N”表示动物对新物体的探索时间，“F”表示动物对熟悉物体的探索时间。结果如表8、图8所示。
表8各组大鼠新奇物体识别指数
图8为新奇物体识别实验中，生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA与VPA/ICG-001大鼠新奇物体识别指数对比图。
由图8可知，经过ICG-001处理过的自闭症大鼠新奇物体识别指数明显上升，也印证了药物对于改善提升认知能力的有效性
1.4.2免疫印迹实验
分离大鼠海马组织，加入RIPA裂解液充分裂解，提取总蛋白，95℃变性5min，1000rpm/min离心。取上清，运用凝胶电泳分离目的蛋白，PVDF转膜，脱脂牛奶封闭，孵育一抗(兔抗Drebrin A单克隆抗体，1:1000)，4℃摇床过夜。孵育二抗(辣根过氧化酶标记的羊抗兔/鼠的IgG，1:1000)，室温2h。运用超氧化酶ECL发光试剂盒进行显影曝光。以GAPDH为内参，使用Image J对免疫印迹条带进行灰度分析。结果如表9、图9所示。
表9各组大鼠海马Drebrin A表达水平变化(％control)
图9为免疫印迹实验中，生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA与VPA/ICG-001组大鼠海马Drebrin A表达水平变化对比图。
由图9可知，经过ICG-001处理过的自闭症大鼠海马Drebrin A蛋白表达上调，这表明ICG-001能够逆转自闭症大鼠海马Drebrin A蛋白的降低。
1.4.3高尔基染色实验：检测神经元树突棘密度和形态
遵循FD快速高尔基染色试剂盒(PK401)中文说明书，按照等体积制备A和B混合液，避光室温保存24h后使用。颈椎脱臼处死大鼠，冰上取出大脑组织，立即放入避光处理的A和B混合液中。24h后，更换A和B混合液，室温避光14天。更换C液，避光室温保存3天。将脑组织取出来，运用冰冻切片机进行切片，每片厚度为100μm。双蒸水冲洗2次，每次4min。分别用50％、75％、95％梯度乙醇各脱水1次，无水乙醇脱水4次，二甲苯透明3次，中性树胶封片。
选取大鼠海马CA1区锥体神经元顶树突处于距胞体100μm以外的二级分支，运用德国蔡司显微镜进行Z-stack照相，记录四组大鼠树突棘形态(丝状伪足、瘦长型、短粗型和蘑菇型)，每只动物选择3-4个神经元。此外，运用MetaMorph统计树突棘密度，每个大鼠海马CA1区锥体神经元意挑选一段长50μm的树突，人工数该段树突上树突棘个数，计算树突棘密度，单位为个/μm。结果如表10-11以及图10所示。
表10各组大鼠海马CA1区顶树突棘密度变化结果(单位：个/μm)
表11-1各组大鼠海马CA1区顶树突棘(丝状伪足型)形态变化结果(％)
表11-2各组大鼠海马CA1区顶树突棘(瘦长型)形态变化结果(％)
/>
表11-3各组大鼠海马CA1区顶树突棘(短粗型)形态变化结果(％)
/>
表11-4各组大鼠海马CA1区顶树突棘(蘑菇型)形态变化结果(％)
/>
图10A为高尔基染色实验中，生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA和VPA/ICG-001组大鼠典型的海马CA1区锥体细胞顶树突棘。
图10B为生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA与VPA/ICG-001组大鼠海马CA1区顶树突棘密度变化。
图10C为生理盐水(Control)、ICG-001对照、VPA与VPA-ICG-001组大鼠海马CA1区顶树突棘形态变化。
由图10A和10B可知，经过ICG-001处理过的自闭症大鼠海马CA1区锥体细胞顶树突棘密度增加。标尺为20μm。由图10C可知，经过ICG-001处理过的自闭症大鼠海马CA1区锥体细胞蘑菇型顶树突棘增多和瘦长型顶树突棘减少，这表明ICG-001药物能够逆转自闭症大鼠树突棘密度和形态的改变。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.ICG-001在制备用于治疗自闭症的药物中的应用。
2.ICG-001在制备用于改善自闭症的症状的药物中的应用，其特征在于，所述改善自闭症的症状为改善社交能力、改善重复刻板行为、改善焦虑样行为、改善认知能力或改善空间记忆能力。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善认知能力包括提升对物体的识别能力。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为调节脑发育调节蛋白A的药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为上调脑发育调节蛋白A的表达的药物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为逆转树突棘密度和形态改变的药物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述树突棘为海马CA1区锥体神经元树突棘。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述树突棘为顶树突棘。
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