CN108355135A - Notch信号通路抑制剂在制备治疗孤独症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了Notch信号通路抑制剂在制备治疗孤独症药物中的应用。本发明通过研究孤独症动物模型脑区发现VPA孤独症模型Notch信号通路活性增加，NICD和下游靶分子HES‑1蛋白表达增加；同时发现施用DAPT可以减少NICD和HES‑1蛋白表达，下调Notch信号通路活性，进而改善孤独症动物模型的重复呆板样行为、增加孤独症动物模型的社会交互能力，提高空间学习和记忆能力。可见Notch信号通路抑制剂可以减少孤独症模型鼠Notch信号通路活性，改善孤独症样行为学异常，为治疗孤独症药物的研发以及孤独症的临床治疗中提供了实验依据和理论依据，具有优异的临床治疗和药物研发价值。

Description

Notch信号通路抑制剂在制备治疗孤独症药物中的应用

技术领域

本发明涉及Notch信号通路抑制剂的新用途，具体地，涉及Notch信号通路抑制剂在制备孤独症治疗药物中的应用。

背景技术

孤独症有三大临床特征：语言发育延迟，社交行为障碍，行为呆板局限。目前孤独症的病因尚不清楚，普遍认为，其发生是由于遗传和环境因素共同作用导致孤独症的发生。孤独症发生过程中非遗传因素可能与干扰胚胎脑发育的正常的信号通路传导有关，而遗传因素可能是信号通路传导异常导致的基因突变所致。

Notch信号通路在神经系统发育过程中起着至关重要的作用，影响神经发育过程中的细胞分化、增殖与凋亡等多种程序。该通路由Notch受体、Notch配体、初级效应分子、靶基因构成。各物种间的Notch受体结构高度保守，均包括一个结合配体的胞外区和一个信号转导所需的胞内活性结构域(Notch Intracellular Domain，NICD)。Notch配体结合到受体的胞外区后，释放受体胞外部分。随后受体的胞内部分被早老素(PSEN)依赖的γ分泌酶(γ-secretase)切割，释放NICD入核。NICD转移至核内，与转录因子RBP-J结合，使其从转录抑制状态转为激活状态，启动靶基因转录。Notch信号的靶基因多为碱式螺旋-环-螺旋家族转录因子(bHLH)，在哺乳动物为Hes(Hair enhancer of split)等。

丙戊酸(Valproic Acid，VPA)作为一种环境因素，导致子代孤独症的发生，常用于建立孤独症动物模型。在孤独症发生过程中Notch信号通路是否参与其中呢？VPA孤独症模型的产生是否与调控个体发育的Notch信号通路传导障碍，从而导致孤独症的发生有关呢？用Notch信号通路抑制剂DAPT是否可以改善孤独症样的行为学异常，如重复呆板样行为、社会交互行为、学习记忆能力缺陷呢？现有技术并没有明确的报道。

发明内容

本发明的目的是提供Notch信号通路的异常与孤独症的发生相关，进一步提供Notch信号通路抑制剂在制备治疗孤独症药物中的应用。

本发明首先利用VPA建立孤独症大鼠模型，通过观察实验动物脑区的NICD和下游靶分子HES-1蛋白表达情况，发现VPA孤独症模型Notch信号通路活性增加，NICD和下游靶分子HES-1蛋白表达增加；同时发现施用DAPT可以减少NICD和HES-1蛋白表达，下调Notch信号通路活性，进而改善孤独症动物模型的重复呆板样行为、增加孤独症动物模型的社会交互能力，提高空间学习和记忆能力。可见本发明首次发现了Notch信号通路抑制剂可以减少孤独症模型鼠Notch信号通路活性，改善孤独症样行为学异常。

因此，本发明提供了Notch信号通路抑制剂在制备治疗孤独症药物中的用途。

本发明提供了Notch信号通路抑制剂在制备NICD和其下游靶分子HES-1蛋白表达增加引起的孤独症治疗药物中的用途。

本发明提供了Notch信号通路抑制剂在制备改善孤独症动物或人的重复呆板样行为的药物中的用途。

本发明提供了Notch信号通路抑制剂在制备增加孤独症动物或人的社会交互能力的药物中的用途。

本发明提供了Notch信号通路抑制剂在制备提高孤独症动物或人的空间学习能力的药物中的用途。

本发明提供了Notch信号通路抑制剂在制备提高孤独症动物或人的记忆能力的药物中的用途。

本发明所述Notch信号通路抑制剂选自DAPT、Compound E、MK0752、L-685，458、能抑制或阻碍Notch配体与受体结合的因子、能特异性抑制Notch的siRNA、能特异性抑制Notch的microRNA、能特异性抑制Notch的抗体，以及全身或局部转入、表达或失活编码Notch、其蛋白复合物组成因子，或其显性负相的DNA质粒。

优选地，所述Notch信号通路抑制剂为DAPT。

基于本发明的发现，含有Notch信号通路抑制剂的用于治疗孤独症的药物也属于本发明的保护范围。

进一步地，本发明提供了一种用于改善孤独症动物或人的重复呆板样行为的药物，或增加孤独症动物或人的社会交互能力的药物、或提高孤独症动物或人的空间学习能力、记忆能力的药物，所述药物含有Notch信号通路抑制剂。

本发明首次发现Notch信号通路的活化与孤独症的发生相关联，揭示了孤独症发生的可能机制，并发现Notch信号通路抑制剂可以减少孤独症模型鼠Notch信号通路活性，改善孤独症样行为学异常，Notch信号通路抑制剂可作为潜在的孤独症治疗药物，为孤独症治疗药物的研发以及孤独症的临床治疗提供了实验依据和理论依据，具有优异的临床治疗和药物研发价值。

附图说明

图1为NICD和HES-1蛋白在VPA孤独症和对照组前额叶皮质(PFC)、海马(HC)和小脑(CB)脑区的表达。与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图2为NICD和HES-1蛋白在VPA孤独症和VPA+DAPT组小脑(CB)脑区的表达。与VPA+DAPT组相比，***P<0.001。

图3为各组旷场实验中自发活动轨迹图。

图4为四组旷场实验中重复呆板样行为结果比较。与对照组相比，**P<0.01,***P<0.001；与VPA组相比，##P<0.01,###P<0.001。

图5为三箱实验中各组运动轨迹图。

图6为各组社会交互行为参数比较，A:与在空箱的时间相比，**P<0.01,***P<0.001；B：与在陌生鼠1所在箱的时间相比，**P<0.01,***P<0.001；C：与对照组相比，*P<0.05。

图7为各组定向航行实验图及潜伏期。

图8为各组大鼠水迷宫学习与记忆能力检测结果比较，与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；与VPA组相比，#P<0.05。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1VPA孤独症动物模型的建立

健康成年Wistar雄性(300～350g)及雌性(200～250g)大鼠，购自中国科学院(上海)实验动物部，饲养于新乡医学院人体解剖与组织胚胎学系专用动物房，给予充分的饲料和饮水。所有实验动物喂养及实验程序均严格遵照新乡医学院实验动物保护条款。

孤独症大鼠模型建立基本过程如下：成年雌性与雄性Wistar大鼠各数只，在周期性光照(7:00AM～7:00PM)、恒温25℃和恒湿55％条件下饲养数日，使之适应环境。然后，按雌:雄2:1合笼过夜。第二天早晨，检查到阴栓的雌鼠记为E1，然后分笼单独饲养。参照文献【Schneider T,Przewlocki R.Behavioral alterations in rats prenatally exposedto valproic acid:animal model of autism.Neuropsychopharmacology,2005,30(1):80-9.和Schneider T,Turczak J,Przewlocki R.Environmental enrichment reversesbehavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid:issues fora therapeutic approach in autism.Neuropsychopharmacology,2006,31(1):36-46.】的方法，将受孕母鼠随机分成两组，一组在E12.5天时给予母鼠腹腔注射(ip)600mg/kg的VPA，VPA粉末用0.85％的生理盐水(Normal saline，NS)配成250mg/ml的溶液，为模型组母鼠，另一组给以同等量的NS给予母鼠腹腔注射，为对照组母鼠。

仔鼠在出生后(Postnatal day，PND)23天断乳。模型组母鼠的子鼠随机分为两组，其中一组子鼠腹腔注射DAPT(10mg/kg)记为VPA与DAPT同时处理(VPA+DAPT组)，DAPT用玉米油配成溶液，连续注射10天，另一组子鼠注射同等量的NS(VPA组)。

对照组母鼠的子鼠随机分为两组，其中一组注射NS(对照组)，另一组注射DAPT(DAPT组)。

VPA、DAPT组、VPA+DAPT组和对照组分别取5-8只不等(对照组8只，DAPT组5只，VPA组7只，VPA+DAPT组6只)。进行实施例2-实施例5的实验研究。DAPT分子式为C₂₃H₂₆F₂N₂O₄。

实施例2VPA孤独症模型Notch信号通路活性变化

采用Western blot方法测定VPA组前额叶皮质(PFC)、海马(HC)、小脑(CB)三个脑区NICD(Notch受体胞内段，NICD)和HES-1蛋白的表达情况。用蛋白裂解液提取大鼠前额叶皮质、海马、小脑组织总蛋白质，用BCA法测定样品的蛋白浓度。加入5×loading buffer后，100℃加热变性3min。进行12％SDS-PAGE，将蛋白质转移到PVDF膜上，5％牛血清白蛋白TBST摇床常温封闭2h。加Ⅰ抗，4℃摇床过夜；加Ⅱ抗和GAPDH摇床常温1h，化学发光试剂显色，然后将PVDF膜置于Bio-rad的显影机上，获取反应条带的数字图并将条带进行灰度测定，以目的蛋白和内参照GAPDH蛋白的灰度比值代表目的蛋白的相对表达量。结果显示，VPA组上述三个脑区NICD明显高于对照组，差异有统计学意义(图1A-F)。紧接着检测了Notch信号通路的下游靶分子HES-1的蛋白表达情况。结果显示，与对照组相比，VPA组HES-1蛋白表达均上调，差异有统计学意义(图1A-F)。

实施例3Notch信号通路抑制剂DAPT处理失活了Notch信号通路活性

为进一步确定Notch信号通路在孤独症发生中的作用，接下来采用Notch信号通路的抑制剂DAPT进行干预。DAPT通过抑制γ-分泌酶使Notch受体胞内段(Notchintracellular domain，NICD)水解和释放，导致游离NICD减少，NICD对下游通路的激活减少，从而发挥效应。

Western blot结果显示，两组CB组织的NICD蛋白表达有显著差异，其中VPA+DAPT组低于VPA组，差异有统计学意义(图2)。两组CB组织的HES-1蛋白表达有显著差异，VPA+DAPT组低于VPA组，差异有统计学意义(图2)。

实施例4DAPT处理对VPA孤独症动物模型重复呆板样行为影响

为了检测各组大鼠子代鼠的重复呆板样行为，本实施例进行了旷场实验。运动轨迹显示，对照组和DAPT组主要在周边区域活动，在中央区域活动较少，而VPA组在周边区和中央区活动均较多，表现出抗焦虑性，而VPA+DAPT组与VPA组相比，情况明显改善(图3)。同时，检测了大鼠理毛次数和站立次数。统计结果显示，与对照组相比，VPA组理毛次数增加；与VPA组相比，VPA+DAPT组理毛次数减少，与对照组相比，并无统计学差异。站立次数各组虽然与理毛次数变化趋势一致，但均无统计学差异(图4的A图)。另外，本实施例检测了大鼠理毛时间。与对照组相比，VPA组理毛行为时间增加(图4的B图)。而与VPA组相比，VPA+DAPT组理毛行为时间减少，与对照组相比并无统计学差异(图4的B图)。各组大鼠在旷场实验中跨越的距离均无统计学差异(图4的C图)。

实施例5DAPT处理减少了VPA孤独症模型大鼠社会交互行为

运用动物社会交互行为测试DAPT对实施例1建立的孤独症模型鼠社交行为的影响。实验进行20分钟：在左边格子的箱子中放入1只对于实验鼠陌生的大鼠(陌生鼠1)，录像观察10min，随之在右边格子的箱子放入同样对于实验鼠陌生的大鼠(陌生鼠2)，但陌生鼠1不取出，录像观察10min。记录进入空箱与陌生鼠1所在箱的时间及实验大鼠进入陌生鼠1与陌生鼠2的时间。各组在三箱社交实验的轨迹显示，对照组对新鲜事物比较感兴趣，DAPT组与其情况一样；而VPA组在各箱表现出无偏好，VPA+DAPT组则表现为对新鲜事物比较感兴趣(图5)。统计结果显示，对照组进入到陌生鼠1所在箱的时间高于在空箱的时间，差别有统计学意义；在VPA组，在陌生鼠1所在箱及空箱的时间没有统计学差异；VPA+DAPT组，在陌生鼠1所在箱的时间高于其在空箱的时间，差别具有统计学意义(图6的A图)。另外，在VPA+DAPT组，在陌生鼠2所在箱的时间高于其在陌生鼠1所在箱的时间，差别有显著的统计学意义(图6的B图)；在VPA组，在陌生鼠2所在箱的时间与在陌生鼠1所在箱的时间没有统计学差异(图6的B图)。对照组进入到陌生鼠2所在箱的时间高于在陌生鼠1所在箱的时间，差别有统计学意义(图6的B图)。同时我们监测了三箱实验中各组大鼠行走的距离。结果显示，与对照组相比，VPA组行走的距离减少(图6的C图)。

实施例6DAPT处理对VPA孤独症模型大鼠学习记忆能力影响

水迷宫对啮齿类动物来说是一件非常有挑战的任务，需要许多非常复杂的记忆过程。参照文献的方法(Zhang Y，Sun Y，Wang F，et al.Downregulating the canonicalWnt/beta-catenin signaling pathway attenuates the susceptibility to autism-like phenotypes by decreasing oxidative stress[J].Neurochem Res，2012，37(7):1409-1419.)，VPA组、VPA+DAPT组和对照组行水迷宫试验，来检测大鼠空间学习记忆能力的变化。水迷宫，测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。在定位航行试验训练过程中发现，VPA组大鼠寻找平台表现为搜索平台的无目的性和随机性，而对照组和VPA+DAPT组动物的搜索行为具有一定的倾向性和目的性，有的动物根据记忆直接游向平台(图7的A图)。与对照组相比，VPA找到平台的潜伏期较长，而VPA+DAPT组与对照组相比，找到平台的潜伏期并没有差别(图7的B图)。在空间探索试验中，分析300s穿越靶象限的时间发现，VPA组低于对照组，VPA+DAPT组高于VPA组，与对照组相比并无统计学差异(图8的A图)；对进靶象限的次数进行统计发现，VPA+DAPT组比VPA组增多，差异有统计学意义；VPA组与对照组相比，进靶象限的次数明显减少，差异有非常显著的统计学意义；VPA+DAPT组与对照组相比，穿越平台次数并没有差别(图8的B图)。各组在靶象限游走的路程并无统计学差异(图8的C图)。另外，VPA+DAPT组与VPA组相比，进入平台的次数增加，差异有统计学意义；VPA组与对照组相比，进入平台的次数减少；VPA+DAPT组与对照组相比，进入平台的次数并无统计学差异(图8的D图)。对第一次进入平台区的时间进行统计发现，VPA组长于对照组，而VPA+DAPT组与VPA组，VPA+DAPT组与对照组均无统计学差异(图8的E图)。在平台区持续的时间各组并无统计学差异(图8的F图)。我们还检测了三组大鼠的游泳距离。结果显示，VPA组高于对照组，VPA+DAPT组与对照组相比并没有统计学差异(图8的G图)。

结果显示，VPA孤独症模型存在Notch信号通路活性增加，基于Notch信号通路关键信号分子NICD和下游靶分子HES-1蛋白表达增加；但是通过Notch信号通路抑制剂DAPT干预发现，DAPT可以减少NICD和HES-1蛋白表达，从而下调Notch信号通路活性。旷场实验结果显示，VPA孤独症动物模型的重复呆板样行为在VPA+DAPT组得到明显改善，表现为理毛次数和理毛时间均减少。三箱社会交互实验结果表明，VPA模型组大鼠社会交互能力障碍、缺乏对新鲜事物的偏好性；与VPA组相比，VPA+DAPT组对新鲜事物充满好奇，社会交互能力增加。Morris水迷宫结果显示，与VPA组相比，VPA+DAPT组空间学习和记忆能力增加，表现为在靶象限的时间和次数均增加，同时进平台次数增加。这些结果说明：Notch信号通路活性增加了孤独症易感性，而DAPT可以减少孤独症模型鼠Notch信号通路活性，改善社交障碍、重复呆板样性行为、学习记忆能力障碍等孤独症样行为学异常，为DAPT在孤独症的临床治疗中提供了实验依据和理论依据。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.Notch信号通路抑制剂在制备治疗孤独症药物中的用途。

2.Notch信号通路抑制剂在制备NICD和其下游靶分子HES-1蛋白表达增加引起的孤独症治疗药物中的用途。

3.Notch信号通路抑制剂在制备改善孤独症动物或人的重复呆板样行为的药物中的用途。

4.Notch信号通路抑制剂在制备增加孤独症动物或人的社会交互能力的药物中的用途。

5.Notch信号通路抑制剂在制备提高孤独症动物或人的空间学习能力的药物中的用途。

6.Notch信号通路抑制剂在制备提高孤独症动物或人的记忆能力的药物中的用途。

7.根据权利要求1-6任一所述的用途，其特征在于，所述Notch信号通路抑制剂选自DAPT、Compound E、MK0752、L-685，458、能抑制或阻碍Notch配体与受体结合的因子、能特异性抑制Notch的siRNA、能特异性抑制Notch的microRNA、能特异性抑制Notch的抗体，以及全身或局部转入、表达或失活编码Notch、其蛋白复合物组成因子，或其显性负相的DNA质粒。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述Notch信号通路抑制剂为DAPT。

9.一种用于治疗孤独症的药物，其特征在于，含有Notch信号通路抑制剂。

10.一种用于改善孤独症动物或人的重复呆板样行为、或增加孤独症动物或人的社会交互能力、或提高孤独症动物或人的空间学习能力、记忆能力的药物，其特征在于，所述药物含有Notch信号通路抑制剂。