CN115282134B - 辣椒素在制备治疗脆性x染色体综合征的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辣椒素在制备治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的药物中的应用。试验证明，辣椒素的抗遗传性智力与认知功能障碍的性能和功效显著，毒副作用小、是一种安全、高效、疗效稳定的治疗脆性X染色体综合征的药物，适于工业化生产，易于推广。本发明为治疗脆性X染色体综合征及由于体内X染色体在遗传过程中因发生变化、突变所导致的相关疾病提供了一种新的药物来源，提供了辣椒素新的药用用途。

Description

辣椒素在制备治疗脆性X染色体综合征的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的药物的应用，特别涉及一种治疗脆性X染色体综合征的药物的应用，属于药物应用技术领域。

背景技术

脆性X染色体综合征(又称Martin-Bell综合征)是由于在人体内X染色体形成过程中脆性X智力低下基因(Fmr1)的突变所导致。在X染色体的一段DNA中，由于遗传的关系有时会发生改变，一种为完全改变，另一种为DNA过度甲基化。如果这两种改变的程度较小，那么患者在临床表现方面可以没有特殊的症状或者只有轻微的症状。反之，如果这两种改变的程度较大，就可能出现如下所述的脆性X综合征的种种症状，例如认知障碍、语言障碍等。

脆性X染色体综合征(Fragile X syndrome,FXS)不仅是一种常见的遗传性智力与认知功能障碍性疾病，而且是引起自闭症谱系障碍最常见的单基因缺陷性疾病，主要表现为智力障碍、社交互动障碍与认知障碍等，极大地影响了患者的行为能力与生活质量，迫切需要有效的临床治疗方案。

FXS疾病的发生主要是由于X染色体上脆性X智力低下基因(Fmr1)突变，从而导致脆性X智力低下蛋白(FMRP)的功能缺失所引起。尽管人们对脆性X染色体综合征的病因有着浓厚的研究兴趣，特别是它有可能成为解析自闭症成因的有效途径之一，但是该疾病背后的确切病因机制仍然未被阐明。

目前临床上仍然缺乏有效治疗FXS的方法，并且大多数针对FXS的治疗方法都是基于其特定的症状制定的，这也导致缺少足够的对照实验来证明这些方法的有效性，只有通过精神药理学干预与其他支持性策略相结合，包括言语治疗、感觉统合职业治疗、个性化教育计划和量身定制的行为干预，才能最大限度地发挥治疗效果。

如今兴奋剂是治疗FXS中最常见的药物，但这些药物的功效及其副作用也是因人而异，最常用的治疗药物是兴奋剂。虽然兴奋剂针对患有FXS的年幼男性的多动症、冲动和注意力不集中的症状有效，但患有FXS的成年男性对兴奋剂的反应却较低。

尽管现在已然开展系列针对促代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamatereceptor 5，mGluR5)糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)和γ－氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid，GABA)受体的药物研究，但是这种单一药物的治疗效果只在动物实验有明显结果，而在临床实验中效果并不明显。单一药物治疗的研究结果说明动物实验与临床试验之间存在差距，提示现有的单一药物的治疗策略未达到临床治疗的需求。另外还使用选择性血清素再摄取抑制剂(Selective serotonin reuptakeinhibitors，SSRIs)作为治疗与FXS相关的情绪障碍、焦虑和强迫行为的药物，该类药物在缓解社交焦虑、发脾气和攻击性方面等行为中具有疗效；此外，还使用抗精神病药物治疗FXS，但是抗精神病药物相关的副作用如体重增加、糖尿病、恶心、便秘和迟发性运动障碍等导致效果差。非典型抗精神病药也被用于治疗自伤、攻击性行为和自闭症，虽然非典型抗精神病药物阿立哌唑(aripiprazole)在情绪稳定、注意力和学习成绩方面有所改善，但其应在低剂量下使用，以避免高剂量引起的躁动，而且其产生的副作用也不容小觑。

FXS导致的智力障碍给患者及其家人带来了生理及心理的巨大痛苦，漫长的病程给家庭和社会带来了沉重的负担。通过精神药理学干预与其他支持性策略相结合，包括言语治疗、感觉统合职业治疗、个性化教育计划和量身定制的行为干预，才能最大限度地发挥治疗效果。

但是迄今为止，依然缺乏有效的治疗药物可以治愈或者缓解该疾病患者的主要不良症状。因此，探索脆性X染色体综合征的病因机制并开发新的治疗药物迫在眉睫。而且研究FMRP缺失后导致异常表达的基因和蛋白，并考察相关靶点异常表达对神经元在结构，形态和功能的具体影响，可以为综合治疗FXS寻找新的药物干预靶点提供积极的临床应用价值和深刻的社会意义。

辣椒中含量最多的是CAP(辣椒素，反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺)，CAP是辣椒中的主要活性成分，是一种小分子生物碱，对哺乳动物包括人类都有刺激性并可在口腔中产生灼烧感。

辣椒除了作为食品、食品添加剂之外，还被中医用以治疗胃寒、风湿等症。现代研究表明，辣椒碱具有消炎、镇痛、麻醉和戒毒等方面的功效，其镇痛作用与吗啡等同，但比吗啡更持久，对带状疱疹后遣神经痛、三叉神经痛、糖尿病神经痛、风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、秃发等有显著疗效。另外，辣椒碱还可抑制恶性肿瘤的发生，对治疗皮肤病、减肥等也有特殊功效。规模的基于人群的前瞻性研究——国家健康和营养检查调查(NHANES)III显示经常食用辣椒与较低的死亡率相关。意大利的一项研究报告称，每天食用辣椒可显着减少心脑血管相关死亡的发生率。辣椒中的主要活性成分CAP对治疗肥胖、糖尿病和心血管疾病具有积极作用，日常摄入辣椒素对机体多方面有益，在多种疾病的治疗方面具有积极的药理作用，包括肥胖、心血管和胃肠道疾病、癌症、血尿综合征以及皮肤病。另外流行性病学以及动物模型实验研究表明CAP可以减轻一些神经退行性疾病动物模型的行为缺陷，例如减少阿尔兹海默症以及亨廷顿氏疾病的异常的不自主运动和改善空间学习和记忆。

为了探索辣椒素对脆性X染色体综合征疾病的治疗作用及作用效果，发明人进行了体外海马新生神经元树突复杂度实验；体外海马新生神经元电生理功能作用和认知功能调控实验。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题，提供辣椒素治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的性能和功效，尤其是针对脆性X染色体综合征的药物中的新应用，提供辣椒素的新的药用用途。

为实现上述目的，本发明一方面提供辣椒素在制备治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的药物中的应用。

其中，所述遗传性智力与认知功能障碍性疾病为自闭症、脆性X染色体综合征或与相关神经发育障碍性疾病认知功能障碍，优选为脆性X染色体综合征。

特别是，所述药物由辣椒素和药学上可接受的载体组成。

所述辣椒素纯度≥60％，优选为超过90％，进一步优选为超过95％。

所述药学上可接受的载体通常被认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceuticalexcipients，第2版，由A.Wade和P.J.Weller编辑；American Pharmaceutical Association出版，Washington and The Pharmaceutical Press，London，1994)等工具书中找到。

本发明中所述的辣椒素在用于治疗脆性X染色体综合征时，可以单独使用，也可以通过含有辣椒素的药物组合物的形式使用。

本发明所述药物通过胃肠道给药或/和非胃肠道给药途径给药。

所述的非胃肠道给药途径选自注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药或腔道给药。

非胃肠道给药制剂选自注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂等；胃肠道给药制剂选自片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂等。

本发明提供以辣椒素为活性成分，用于治疗脆性X染色体综合征的药物和相应的药物剂型。

其中，所述药物以口服制剂、注射剂或局部给药制剂形式存在。

特别是，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂或溶液剂；所述注射剂包括注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂包括霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或贴剂。

其中，所述药物制剂是以所述辣椒素为有效活性成分，并包括了药剂学上可接受的其它载体组分。

药物中的载体包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如乳糖等；粘结剂，如预胶化淀粉、糊精等；甜味剂；抗氧化剂；防腐剂；矫味剂；香料等。

在制备口服制剂时可选用的载体可以是淀粉、糊精或环糊精及各种化学修饰环糊精、蔗糖、硬脂酸盐等常规制药辅料。在制备冻干粉针剂时可以通过无菌喷雾干燥、低温真空干燥、冷冻干燥等方法制备。各制剂的后期制备工艺及设备均属于制药领域的常规技术，本发明对此不作限定。

本发明中所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂形式存在，即药物制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂等形式，但不局限于以上形式。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点、好处：

1、本发明对已知化合物辣椒素发掘了新的药用价值，将其用于治疗脆性X染色体综合征，并可以制备成治疗脆性X染色体综合征的药物，为药食同源的辣椒的应用开拓了一个新的应用领域。

2、本发明使用辣椒素进行体外新生神经元树突复杂度试验，结果表明：Fmr1 KO小鼠的海马新生神经元相较于WT小鼠海马新生神经元的树突复杂度降低，树突长度减少、树突节点数和树突末端数量均减少。辣椒素干预后可以显著促进体外培养Fmr1 KO小鼠的海马新生神经元的树突复杂度，增加了树突长度、树突节点数和树突末端数量。

3、本发明使用辣椒素进行体外海马新生神经元电生理功能作用的研究，试验结果表明：Fmr1 KO小鼠的海马新生神经元相较于WT小鼠海马新生神经元平均放电频率、簇放电频率降低、神经网络簇放电频率及神经网络同步性指数均降低；辣椒素干预后可以显著增加Fmr1 KO小鼠的海马新生神经元平均放电频率、簇放电频率降低、神经网络簇放电频率及神经网络同步性指数，即CAP在一定程度上恢复了Fmr1 KO小鼠的海马新生神经元的神经网络发育障碍及电生理功能缺陷。

4、本发明对Fmr1基因缺陷型动物(Fmr1 KO小鼠)认知功能实验证明，辣椒素可以矫正Fmr1 KO小鼠的认知功能障碍与社交互动障碍；通过调控神经发生提高Fmr1 KO小鼠的空间记忆能力、改善Fmr1 KO小鼠的模式分离认知功能缺陷；通过调控成体神经发生提高Fmr1 KO小鼠的学习记忆能力；通过调控神经发生矫正并改善Fmr1 KO小鼠的社交互动障碍，即辣椒素可用于校正和治疗脆性X染色体综合征，改善由于在X染色体形成过程中脆性X智力低下基因(Fmr1)的突变所导致认知功能障碍与社交互动障碍。

5、本发明的辣椒素的药理作用强，用于治疗脆性X染色体综合征的功效显著，见效快、毒副作用小、安全性好，能够长期服用，具有良好的药用前景。

6、本发明的产品原料来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，且服量小，使用方便，因此易于推广。

附图说明

图1为体外培养P0天海马神经元的形态显微观察图；

图2A为原代海马神经元树突复杂性Sholl分析实验方案示意图；

图2B为原代海马神经元树突复杂性Sholl分析统计图；

图3A为原代海马新生神经元树突长度Sholl分析实验方案的示意图，为从胞体出发的树突，2代表树突1的分支。

图3B为原代海马新生神经元树突长度分析统计图；

图4A为原代海马新生神经元树突节点Sholl分析实验方案示意图，其中N为神经元树突节点；

图4B为原代海马新生神经元树突节点数量分析统计图；

图5A为原代海马新生神经元树突末端Sholl分析实验方案示意图，其中E为树突末端；

图5B为原代海马新生神经元树突末端数量分析统计图；

图6为采用MEA孔板体外培养小鼠原代海马新生神经元实验流程图；

图7原代海马新生神经元平均放电频率分析统计图

图8为原代海马新生神经元簇放电频率统计分析图；

图9A为原代海马新生神经元神经网络簇放电频率统计分析图；

图9B为原代海马新生神经元神经网络同步性指数的统计分析图；

图10A为小鼠新位置识别实验示意图；

图10B为小鼠新位置识别实验判别指数统计图；

图11A为小鼠模式分离实验示意图；

图11B为小鼠模式分离实验判别指数统计图；

图12A为小鼠新物体识别实验示意图；

图12B为小鼠新物体识别实验的判别指数统计图；

图13A为小鼠社交互动实验示意图；

图13B为小鼠社交互动实验判别指数统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1辣椒素对Fmr1 KO小鼠海马新生神经元树突复杂度作用的影响

体外原代培养新生神经元，第四天转染GFP质粒，并每天连续给药直到第七天，封片。Sholl分析结果表明，辣椒素可以显著促进体外Fmr1基因缺陷型(Fmr1 KO)新生神经元的树突成熟度，包括树突长度、树突节点数和树突末端数量等。

神经细胞胞浆向外伸出树枝状的突起叫树突，树突是从神经元发出的一至多个突起，起始部较粗，反复分支，逐渐变细，呈树枝状，树突外面的细胞膜上有许多受体，因此树突是神经元接受化学信使的部位，其它神经元轴突末端终于树突表面，形成突触。神经元的树突及其分支越多，则接受冲动的面积越大，即接受化学信使的突触越多。

一、实验材料

1、实验动物

雄性野生型(Wild-type，WT或Fmr1^+/y)小鼠，购自中国医学科学院医学实验动物研究所。

雌性Fmr1基因敲除(Knock out，KO)小鼠(Fmr1 KO或Fmr1^-/-)购自杰克逊实验室。

Fmr1基因敲除(Knock out，KO)，可以用Fmr1 KO代表，也可以用Fmr1^-/-(雌鼠)/Fmr1^-/y(雄鼠)。雄性野生型(Wild-type，WT)，可以用WT代表，也可以用Fmr1^+/+(雌鼠)/Fmr1^+/y(雄鼠)。

所有小鼠在天津中医药大学实验动物中心进行繁殖饲养，无特定病原体级(SPF级)动物饲养室，饲养温度为22-25℃，采用12小时照明/12小时黑暗的昼夜节律周期，小鼠可以自由摄取水和食物，通过天津中医药大学动物伦理委员会的批准和认可。小鼠生长到八周后达到成熟时，将雌鼠Het(Fmr1^-/+)与雄鼠WT按照1：2比例的合笼繁殖。选用P0天小鼠，取大脑海马进行神经元原代培养。

如前所述，脆性X染色体综合征的发生主要是由于X染色体上Fmr1基因突变，从而导致FMRP的功能缺失所引起。为了避免雌鼠生理周期及双条X染色体上Fmr1基因的不同表达对于生理机能的影响所导致的实验数据与结论偏差，本研究只选用成年野生型(WT)和Fmr1基因缺陷型雄鼠(Fmr1 KO)作为实验样本。

2、培养细胞

WT和Fmr1 KO小鼠的海马新生神经元，于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

3、药品

辣椒素粉末，购自于MCE，纯度：99.8％，CAS No.:404-86-4。

4、主要试剂

5、主要仪器

正置显微镜，Carl Zeiss。

二、实验方法

1、试剂配制

1)LB培养基的配制：取10g NaCl、10g Tryptone(胰蛋白胨粉)、5g Yeast extract(酵母提取物)溶解于1L的超纯水中，并于高压灭菌后使用。

2)LB固体培养基的配制：取胰蛋白胨粉10g、酵母粉10g、NaCl 10g、琼脂粉10-20g，溶解于1L的超纯水中，进行高压灭菌。待培基液体冷却至50-60℃时，加入50mg/mL氨苄青霉素1mL，使其充分溶解，趁培基未凝固前，迅速分装于培养皿中(10mL/个)，待冷却凝固后，盖上培养皿盖子，倒置(以防水滴在固体培基上)，于4℃冰箱中保存备用。

3)葡萄糖溶液的配制：取18.0g葡萄糖溶解于近100mL的超纯水中，待完全溶解后定容于100mL，0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌后使用。

4)5M NaCl：称取292.5g NaCl，溶解于灭菌超纯水中，稀释到1L。

5)SOC(Super Optimal broth with Catabolite repression)培养基的配制：取20g Tryptone、5g Yeast extract、0.5g NaCl、0.186g KCl、12g MgSO4、0.95g MgCl₂溶解于近1L的超纯水中，调节pH至7.0，并定容于1L，进行高压灭菌，然后向其中加入试剂配制3)中配制的已除菌葡萄糖溶液20mL。

6)氨苄青霉素溶液的配制(50mg/mL)：称取2.5g氨苄青霉素置于50mL塑料离心管中，加入近50mL灭菌超纯水充分混合溶解之后，定容至50mL，0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装(1mL/管)后，置于-20℃保存。

7)4％多聚甲醛(PFA):取40g PFA粉末置于1L烧杯中，再加入1L PBS磷酸盐缓冲液，搅拌器搅拌，搅拌过程中再添加6mg NaOH，直至完全溶解，再用盐酸调pH值至7.0-7.4，冷却，分装，置于-20℃冰箱保存。

8)多聚赖氨酸的配制：将10×多聚赖氨酸按照1：9的稀释方式用灭菌的超纯水稀释成1×多聚赖氨酸，并用0.22μM的微孔滤膜进行过滤处菌，然后置于4℃进行保存。注意多聚赖氨酸可以循环使用，但再次使用时用过滤，若出现浑浊或者染菌应丢弃。

9)神经元相关培养基

①号培养基，取材培养基：DMEM-F12+1％青链霉素；

②号培养基，种板培养基：DMEM-F12+10％FBS+1％青链霉素；

③号培养基，4h换液-培养阶段培养基：NeuroGro+2％B27+1％青链霉素+0.5mM L-Glu；

消化液：胰蛋白酶-EDTA(0.25％)，含酚红，直接使用。

2、实验分组及给药

A组：WT+Veh，WT型P0天海马神经元+0.005％DMSO；

B组：KO+Veh，Fmr1 KO型P0天海马神经元+0.005％DMSO；

C组：WT+CAP，WT型P0天海马神经元+终浓度为0.1μM的CAP；

D组：KO+CAP，Fmr1 KO型P0天海马神经元+终浓度为0.1μM的CAP。

分别对两种WT与Fmr1 KO神经元细胞进行空白和给药处理，其中：空白处理(空白组)在培养基中加入0.005％DMSO，即WT+Veh组，WT型神经元细胞+0.005％DMSO；KO+Veh组，Fmr1 KO型神经元细胞+0.005％DMSO；给药处理(给药组)在培养基中加入终浓度为0.1μM的CAP，即WT+CAP组，WT型神经元细胞+终浓度为0.1μM的CAP；KO+CAP组，Fmr1 KO型神经元细胞+终浓度为0.1μM的CAP。

3、质粒转化

(1)将DH5α感受态大肠杆菌细胞及Rv-GFP质粒置于冰浴中。

(2)取1个1.5mL离心管，加入DH5α感受态细胞100μL；接着向各离心管内加入质粒Rv-GFP(1μL)，轻弹管体，使质粒与感受态细胞充分混匀；然后置于冰浴中静置30min。

(3)将离心管于42℃的水浴中放置60-90s，然后快速转移离心管于冰浴中2-3min，注意该过程不要摇动离心管。将Rv-GFP的质粒导入大肠杆菌体内，从而大量扩增。

(4)向另外的一个15mL离心管中加入900μL SOC培养基，再加入步骤3)中导入质粒的DH5α感受态细胞，混匀后置于37℃摇床振荡培养(180rpm，90min)，进行导入质粒的感受态细胞的培养。

(5)吸取步骤(4)中的混合液(100μL)，加入含氨苄青霉素(终浓度50μg/mL)的LB固体培养基上，并用无菌的接种环轻轻将细胞均匀涂开；然后倒置培养皿，37℃培养箱培养12-16h，即可观察到菌落。

(6)向已高压灭菌的1个250mL锥形瓶中加入含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基200mL，备用。

(7)用已高压灭菌的枪头挑取1个单个菌粒，加入到步骤(6)的锥形瓶中，于37℃下培养，200rpm，摇菌12-16h。

(8)剩余的摇菌后的菌液，进行离心(15min，4500rpm，4℃)，弃上清，留沉淀，将沉淀于-40℃保存，用于提取质粒。

4、质粒提取

采用高纯度质粒大提试剂盒，按照试剂盒的说明和实验方法并进行质粒提取，具体如下：

(1)将质粒提取试剂盒的溶液P1在使用前先加入RNaseA，混匀，于2-8℃保存。

(2)向步骤“3、质粒转化”中提取的留有菌体沉淀的离心管中加入步骤1)中的混合溶液，涡旋，悬浮细菌细胞沉淀。

(3)向离心管中加入质粒提取试剂盒的溶液P2，立即混匀，使菌体充分裂解，室温放置5min。

(4)向离心管中加入质粒提取试剂盒的溶液P4，立即充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀；接着于室温放置4-5min后，离心(7800rpm，15min)，使白色沉淀离心至管底；然后将全部溶液小心倒入过滤器CS1中(注意避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器)，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50mL的离心管中。

(5)向滤液中加入0.35倍滤液体积的异丙醇、1/2倍异丙醇体积的NaCl，上下颠倒充分混匀。

(6)温度4℃，转速7800rpm离心90min，轻轻倒掉上清液，将离心管倒置在吸水纸上。

(7)向离心管中加入70％乙醇充分漂洗沉淀；4℃，7800rpm，离心15min，轻轻倒掉上清液，将离心管倒置在吸水纸上，重复1-2次，充分漂洗沉淀。

(8)将离心管敞口室温放置30min，使乙醇充分挥发，加入DEPC水涡旋混匀，提取得到RV-GFP质粒。

用DNA微量测定仪检测RV-GFP质粒的浓度与纯度，测定结果如下：

质粒浓度：5789.9ng/微升 A260/280＝1.953 A260/A230＝2.110

提取的质粒做好标记(日期，质粒种类，浓度)，于-20℃冰箱保存，备用。

5、细胞培养

5-1、将直径为14mm细胞爬片放入24孔板中，加入适量体积(200-300微升)的1×多聚赖氨酸包被液，进行包被(8h以上)，于实验前回收包被液，并用灭菌超纯水洗涤爬片2-3次；

5-2、准备好高压灭菌的器械，包括镊子培养皿等。

5-3、将①号培养基分装至分别标记编号的培养皿、EP管中，并于冰上预冷；

5-4、取出P0天(0-24h内新出生的小鼠)小鼠，酒精消毒3min后取小鼠尾巴组织保存至1.5mL的EP管中；再用一把细剪刀，剪下小鼠头部，其中：雄性WT和Fmr1 KO小鼠，分为4组。WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP。每组为三只小鼠，即n＝3，四组共12只小鼠，具体分组如表1所示，其中DMSO浓度为0.005％；CAP终浓度为0.1μM。

表1神经元细胞实验分组

5-5、首先使用镊子切除脑干，然后再将全脑从中间分成左右两个半球，海马的位置在半球的腹内侧，全程在体视镜下操作，使用显微镊子将脑膜剥落，然后再将两侧的海马进行剥离。

5-6、将大脑迅速放入到①号培养基中，分离海马，并将大脑两侧海马转移到对应编号的EP管，于细胞操作间内将海马剪成小段1-2mm³的小块，分别收集至15mL离心管中，加入300μL消化液(GIBCO,25200056)，然后于37℃含有5％CO₂培养箱孵育5min。

5-7、孵育后离心(1500r/1min)，去除上清液；再向各15mL离心管内加入2mL②号培养基，轻轻吹打至无组织块，然后将细胞悬液过40μm筛网，收集细胞悬液于新的15ml离心管内，使得上述细胞呈单个细胞状态，再继续吹打均匀，并按照每孔接种(3-5)×10⁵个细胞的接种量加入到含有经过包被处理的细胞爬片的24孔板中，进行种板处理，细胞种板时，每孔中培养基体积为1mL，在细胞孵箱中培养4h。

5-8、种板处理4h后，将24孔板内每孔的培养基更换为③号培养基；其中种板处理当天为第0天，此后每隔一天进行半量换液，即半量更换③号培养基，种板第4天进行转染及按照表1进行的给药处理，种板第7天进行固定处理。

6、细胞转染及给药处理

(1)准备工作：

高压灭菌实验所需材料(不同规格的枪头，1.5mL EP管等，因为是在细胞房操作需要无菌环境)，超净台内照射紫外灭菌，保证无菌操作；将③号培养基放到室温，备用；

配制转染试剂(按照24孔板中一个孔的试剂用量配制)：灭菌超纯水：17.5μL；步骤“4、质粒提取”获得的RV-GFP质粒：1μg；2M CaCl₂：2.5μL；2×HEBS：25μL。

(2)于种板第4天，在转染前1h将孔板内培养基更换为新的③号培养基；

(3)分别向12支EP管(1.5mL)内加入转染试剂，即每支EP管内依次加入质粒(1μg)，水(17.5μL)，2×HEBS(25μL)，混匀后，再滴加CaCl₂溶液(2.5μL)，混匀后室温静置10min；制得DNA-CaCl₂-HBS混合体系；

(4)将步骤(3)制备的DNA-CaCl₂-HBS混合体系分别滴加至种板后的24孔板的每个孔内，然后将24孔板放在细胞孵箱中培养1h。

(5)1h后，将24孔板放到超净工作台中，使用PBS缓冲液(常温)冲洗细胞(两次，洗去沉淀，减少细胞死亡)；

(6)按照分组更换③号培养基，空白组：每孔加入1mL③号培养基+0.005％DMSO；给药组：每孔加入1mL③号培养基+辣椒素(终浓度为0.1μM)。

(7)然后将24孔板放回细胞孵箱中培养生长，即进行神经元培养。

7、神经元的固定、封片与计量

(1)神经元培养到第七天后，将24孔板从细胞培养间取出，每孔吸出0.5mL培养基，再向每孔中加入4％多聚甲醛(0.5mL)，常温放置，固定20min后将孔中所有液体全部吸出，再向每孔中加入1mL的4％多聚甲醛，常温放置固定15min；然后吸走孔中液体，并用PBS洗涤,5min/次，共三次；

(2)取一个普通的载玻片(长)，在其上两个不同的位置上分别滴加15μL(通常为10-20μL)的抗荧光淬灭剂，然后将步骤(1)中固定并洗涤后的附有神经元的细胞爬片从24孔板中取出，有细胞的一面朝下，固定在载玻片上，然后于正置显微镜下观察，计量tracing(实时描绘)；其中：显微镜荧光调到绿色通道，随机选取表达绿色荧光的神经元，计量树突长度，树突节点，树突末端等。

使用正置显微镜下荧光场观察GFP⁺的神经元细胞形态变化，如图1；分析CAP对WT或Fmr1 KO小鼠海马新生神经元的树突复杂度的影响，使用体视学分析系统对GFP⁺的新生神经元进行实时描绘，并用神经形态学分析系统量化神经元形态结构，即对GFP⁺的新生神经元树突长度、树突节点数、树突末端个数的量化进行分析，分析结果如图3B、4B、5B。

8、结果分析

采用GrapaPad Prism软件进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)或SPSS统计分析软件进行多变量方差分析(MAnova)进行阈值分析，数据处理结果以Mean±SEM表示，当P<0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。

8A)辣椒素对WT和Fmr1 KO小鼠海马新生神经元细胞形态的影响

新生神经元细胞形态的显微镜观察结果如图1，其中A、B、C、D分别为：A.WT+VehGFP⁺新生神经元代表性图像。B.Fmr1 KO GFP⁺新生神经元代表性图像。C.给予CAP处理的WT组GFP⁺新生神经元代表性图像。D.给予CAP处理的Fmr1 KO组GFP⁺新生神经元代表性图像。(比例尺，50μm)。

实验结果表明，CAP对Fmr1 KO小鼠海马新生神经元树突复杂度有改善作用：CAP可以显著促进体外Fmr1基因缺陷型新生神经元的树突复杂度，包括树突长度、树突节点数和树突末端数量等。(每组至少3只不同动物的至少20-35个GFP⁺的神经元)。

在体外培养的神经元中，通过使用磷酸钙转染法对神经元细胞进行转染，在培养过程中加入CAP进行药物干预。使用神经体视学分析方法对表达绿色GFP荧光的神经元进行形态分析，Fmr1 KO小鼠海马新生神经元相比WT小鼠的，在形态上存在明显差异，即Fmr1 KO小鼠海马新生神经元树突复杂性网络复杂性低于WT小鼠的。

8B)辣椒素对WT和Fmr1 KO小鼠海马新生神经元复杂度的影响

采用Sholl分析方法对WT和Fmr1 KO小鼠的海马新生神经元复杂度进行考察，Sholl分析实验方案示意图如图2A所示，即以神经元胞体为圆心(不包括胞体)开始画一系列同心圆，得到随离胞体距离变化的神经元突起交点(Intersections)个数，以此来反映神经元的复杂性。通过计算与每个圆相交的分支数，得出对不同区域的神经元树突和轴突的分支模式，从而定量表征被成像神经元形态特征，分析结果如图2B。

其中WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP组在等距离下距离胞体交点数最小值均值-最大值均值分别是[2.35，6.31]；[1.12，3.72]；[1.92，6.09]；[1.92，5.73]。实验结果表明Fmr1 KO小鼠的新生神经元比WT小鼠新生神经元的复杂性低，辣椒素可以显著增加Fmr1 KO小鼠新生神经元的树突复杂性。

8C)辣椒素对WT和Fmr1 KO小鼠新生海马新生神经元树突长度的影响

对海马新生神经元树突长度采用Sholl分析方法进行，Sholl分析方法鉴定海马新生神经元树突长度的示意图如图3A；海马新生神经元树突长度统计分析结果如图3B。

WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP组的树突长度依次为：1231.34μm；566.35μm；1326.32μm；1417.97μm；实验结果表明Fmr1 KO小鼠的新生神经元的树突长度与WT小鼠新生神经元树突长度相比较短，辣椒素可以显著提高Fmr1 KO小鼠新生神经元的树突长度；即辣椒素可以增加Fmr1 KO小鼠海马新生神经元树突长度。

8D))辣椒素对WT和Fmr1 KO小鼠新生神经元树突节点数量的影响

对海马新生神经元树突节点采用Sholl分析方法进行，Sholl分析方法鉴定海马新生神经元树突节点的示意图如图4A；海马新生神经元树突节点数量的统计分析结果如图4B。

WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP组的树突节点数平均个数依次为：4.63；1.50；4.91；5.00；实验结果表明Fmr1 KO小鼠的新生神经元比WT小鼠具有更少的树突节点数量，辣椒素给药干预后提高Fmr1 KO小鼠新生神经元的树突节点数量。即辣椒素可以显著增加Fmr1 KO小鼠海马新生神经元树突节点数量。

8E)辣椒素对WT和Fmr1 KO小鼠新生神经元树突末端数量的影响

对海马新生神经元树突末端采用Sholl分析方法进行，Sholl分析方法鉴定海马新生神经元树突末端的示意图如图5A；海马新生神经元树突末端数量的统计分析结果如图5B。

WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP组的树突末端的平均个数依次为：4.63；1.50；4.91；5.00；实验结果表明Fmr1 KO小鼠的新生神经元比WT小鼠具有更少的树突末端数量，辣椒素给药干预后提高了Fmr1 KO小鼠新生神经元的树突末端数量。即CAP可以增加Fmr1KO小鼠海马新生神经元的树突末端数量。

试验例2辣椒素对海马新生神经元电生理功能作用的研究

离体电生理功能性研究近年来用来评估神经元功能性的重要手段。神经元的自发放电过程其实就是神经元信息传递的过程，神经网络信息传递利用动作电位进行。一般神经元的自发放电(Spontaneous Firing)、簇放电(Bursting)的频率以及幅度被认为是评价神经元活动的指标，平均放电频率(Mean Fairing Rate)的高低表示电信号的强弱，神经元的簇放电频率(Burst Frequency)也同样反映神经元节律性放电的强弱。对应地，神经系统也在时刻进行着信息传递，且其信息传递表现出多样的节律形式。单个神经元的动作电位会被传递到神经网络中邻近的神经元，出现的连续传递，当多个电极同时检测到神经元的节律性簇放电，则就出现了神经网络簇放电(Network Burst)。社会和情绪神经科学中，神经同步(Neural synchrony)指多个神经元的时空神经波动之间的相似程度。这种神经网络的同步性活动被证实是脑认知功能和记忆的基础。以往的研究表明FXS模型的神经元以及神经网络放电异常，这是造成FXS神经网络信息传递障碍的主要原因。因此，恢复神经元正常放电以及神经网络信息传递是必要的。

如图6，本试例在体外培养海马神经元，通过微电极阵列来记录神经网络形成过程中神经元以及神经系统的自发放电情况。同时进行了给药处理，以此来反映CAP对神经元功能性放电以及神经网络发育的影响。

以原代培养新生神经元为基础，采用微电极阵列离体细胞电生理检测定量分析方法，在微电极阵列Multi-well microelectrode array(Maestro Edge Axion，MEA，美国)中高密度培养单只野生型WT或Fmr1 KO小鼠海马神经元，测定或观察平均放电频率、簇放电频率、神经网络簇放电频率及神经网络同步性指数。辣椒素可以显著提高体外Fmr1 KO小鼠的新生神经元的电生理功能，包括平均放电频率和神经网络爆发频率等指标。

一、实验材料

1、实验动物

与试验例1中实验动物相同

2、培养细胞

WT和Fmr1 KO小鼠的海马新生神经元，于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

3、药品

辣椒素粉末，购自于MCE，纯度：99.8％，CAS No.:404-86-4。

4、主要试剂、设备

4A、主要设备

Bioelectronic Systems(生物电子系统，Axion)

Multi-well microelectrode array(MEA)plates；微电极阵列(MEA)

5、神经元相关培养基：

①号培养基，取材培养基：DMEM-F12+1％青链霉素；

②号培养基，种板培养基：DMEM-F12+10％FBS+1％青链霉素；

③号培养基，4h换液-培养阶段培养基：NeuroGro+2％B27+1％青链霉素+0.5mM L-Glu；

消化液：胰蛋白酶-EDTA(0.25％)，含酚红，直接使用。

二、实验方法

微电极阵列Multi-well microelectrode array(Maestro Edge Axion，MEA，美国)中高密度培养海马神经元中使用MEA培养板(Cyto-View MEA24-White)，其由24个孔组成，每个孔包含16个嵌入的金电极阵列。

1、实验分组

A组：WT+Veh，WT型P0天海马神经元+0.005％DMSO；

B组：KO+Veh，Fmr1 KO型P0天海马神经元+0.005％DMSO；

C组：WT+CAP，WT型P0天海马神经元+终浓度为0.1μM的CAP；

D组：KO+CAP，Fmr1 KO型P0天海马神经元+终浓度为0.1μM的CAP。

分别对两种WT与Fmr1 KO神经元细胞进行空白和给药处理，其中：空白处理(空白组)在培养基中加入0.005％DMSO，即WT+Veh组，WT型神经元细胞+0.005％DMSO；KO+Veh组，Fmr1 KO型神经元细胞+0.005％DMSO；给药处理(给药组)在培养基中加入终浓度为0.1μM的CAP，即WT+CAP组，WT型神经元细胞+终浓度为0.1μM的CAP；KO+CAP组，Fmr1 KO型神经元细胞+终浓度为0.1μM的CAP。

2、原代新生神经元细胞培养

2A)首先在MEA培养板(24个孔板)记录电极的表面加入包被液1×多聚赖氨酸(300μL)，于孵箱储存，进行包被处理(8h以上即可)，于实验前回收包被液，并用灭菌超纯水洗涤2-3次；

2B)除了按照每孔接种1×10⁵个的接种量加入到经过包被处理的含有包被玻片的24孔板中，进行种板处理，且细胞种板时，每孔中培养基体积为500μL②号培养基，在细胞孵箱中培养1h；在37℃含有5％CO₂培养箱中孵育1h后，将②号培养基全部更换成③号培养基之外，其余与试验例1的步骤(5)相同。

2C)神经元培养到第四天，开始根据“1、实验分组”的分组情况进行给药，即WT+Veh、KO+Veh组：吸走每孔中原500μL③号培养基，重新加入新的500μL③号培养基+0.005％DMSO；WT+CAP、KO+CAP组：吸走每孔中原500μL③号培养基，重新加入新的500μL③号培养基+辣椒素(辣椒素终浓度为0.1μM)。

给药时间自神经元培养的第4天开始到第13天结束，期间每隔一天进行一次③号培养基半量换液，即吸走250μL旧③号培养基加入250μL新③号培养基并给药，空白组中每孔中保持0.005％DMSO，给药组中每孔中保持辣椒素终浓度为0.1μM即可。

2D)神经元培养到第13天后，利用Axion MEA系统，记录神经元自发放电以及神经网络簇放电等，即将MEA平板置入多孔MEA记录系统(Maestro Edge)中，在37℃含有5％CO₂培养箱中孵育一段时间，等待5min的平衡，待神经元稳定后，使用Axion MEA系统的Neural模块Neural Metric Tool系统上记录一段时间(5-10min)内的神经元的自发放电活动。

2E)将记录神经元的自发放电活动导入到Axion分析系统(AxIS Navigator)，生成平均放电频率(Mean Fairing Rate)，簇放电频率(Burst Frequency)神经网络簇放电(Network Burst)，神经同步(Neural synchrony)等多种指标，以便后续数据分析。

三、实验结果

数据采用GrapaPad Prism软件进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，数据处理结果以Mean±SEM表示，当P<0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。

(1)辣椒素对Fmr1 KO小鼠海马新生神经元自发放电频率的影响

原代海马新生神经元平均放电频率统计分析结果如图7。

WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP组的平均自发放电频率依次为：4.74Hz；1.25Hz；4.09Hz；3.83Hz；实验结果表明Fmr1 KO小鼠的新生神经元的平均放电频率显著低于WT组小鼠的平均放电频率，WT+Veh；WT+CAP组小鼠原代海马神经元平均放电频率显著高于KO+Veh组小鼠原代海马神经元平均放电频率，而给药组KO+CAP组小鼠原代海马神经元平均放电频率显著高于KO+Veh组，CAP显著提高Fmr1 KO小鼠新生神经元的平均放电频率，且达到与WT+Veh相类似水平。

(2)辣椒素对Fmr1 KO小鼠海马新生神经元簇放电的影响

神经元单个的动作电位会触发自发放电，在神经系统发育过程中，神经元也会出现在短时间内连续、高频的放电行为，这种行为称之为神经元簇放电(Bursting)，也称之为神经元“爆发”，这种放电行为的异常会产生不同的功能障碍。本实验通过多个电极同时记录来评估CAP对WT和Fmr1 KO小鼠海马新生神经元簇放电的影响。

原代海马新生神经元簇放电频率统计分析结果如图8。

CAP对WT和Fmr1 KO小鼠的海马神经元簇放电频率的检测结果如图8，其中图8为培养在24孔(4×4微电极阵列)MEA板上的空白处理组和CAP处理组的海马神经元电信号簇放电频率数据统计图。

WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP组的神经元簇放电频率依次为：0.28Hz；0.04Hz；0.23Hz；0.30Hz。由检测结果可知，Fmr1 KO小鼠的新生神经元比WT小鼠具有更低的簇放电频率，而给药组，给予辣椒素后，KO+CAP组小鼠新生神经元的簇放电频率显著增加，达到与WT+Veh组相类似的神经元族放电频率，表明辣椒素可显著提高Fmr1 KO小鼠新生神经元的簇放电频率。

(3)辣椒素对神经网络发育的影响

神经元群落中神经元之间的突触连接可能导致同步的动作电位，称为网络“爆发”(Network Burst)，这是由井内所有16个电极同时检测到的“爆发”。神经元同步性(Synchrony)是一个0到1之间的数值结果，当群落中所有神经元都以非同步的形式激发时，神经元同步性检测结果为0，当所有这些神经元都同步激发时，神经元同步性检测结果为1。神经网络爆发频率的高低和神经网络同步性指数代表了神经网络的复杂和成熟程度。

为了研究CAP是否会影响神经网络的功能性成熟，本试验使用MEA板培养WT与Fmr1KO小鼠的海马新生神经元，并允许其自发形成神经网络。并采用MEA记录系统记录WT+Veh、KO+Veh、WT+CAP、KO+CAP四组神经网络发育成熟时期的神经网络相关数据。

CAP对WT和Fmr1 KO小鼠的海马新生神经元神经网络簇放电频率统计分析结果如图9A；以及神经元神经网络同步性检测统计分析结果如图9B。

WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP组的神经元网络簇放电频率依次为：0.41Hz；0.11Hz；0.32Hz；0.31Hz(图9A)。由检测结果可知，Fmr1 KO小鼠的新生神经元的神经网络簇放电频率显著低于WT小鼠神经元的神经网络簇放电频率，而给药组给予辣椒素后，可以显著提高Fmr1 KO小鼠新生神经元的神经网络簇放电频率，Fmr1 KO小鼠的新生神经元在给予辣椒素后，神经网络簇放电频率达到与WT+Veh类似水平。

WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP组的神经网络同步性指数依次为：0.61；0.14；0.74；0.78(图9B)。由检测结果可知：与WT+Veh相比，KO+Veh的神经网络同步性指数降低，即Fmr1 KO小鼠的新生神经元比WT小鼠的新生神经元具有更低的同步性指数；给予CAP处理的WT组的神经网络同步性指数与WT+Veh相比，没有显著性差异；与KO+Veh相比，给予CAP处理的Fmr1 KO组的神经网络同步性指数明显增加，即辣椒素处理后可以显著提高Fmr1 KO小鼠新生神经元的同步性指数，神经网络同步性指数达到与WT+Veh类似水平。

这表明CAP在一定程度上恢复了Fmr1 KO小鼠神经元神经网络同步性指数降低。即CAP在一定程度上改善了FMRP缺失造成的神经网络发育障碍。

神经元单个的动作电位会触发自发放电，通过对神经元放电的考察，可以评估神经系统信息传递功能的好坏。已有研究表明Fmr1 KO小鼠的神经元自发放电减少，但目前缺乏有效途径治疗或改善这种病理现象。本研究结果表明辣椒素可以显著提高体外Fmr1 KO小鼠海马新生神经元的电生理功能，包括平均放电频率、神经网络爆发频率神经网络簇放电以及神经网络同步等指标。这表明，CAP可能是治疗FXS的潜在可开发的单体药物。

试验例3认知功能调控试验

采用动物认知功能检测方法证明，辣椒素可以矫正Fmr1基因缺陷型小鼠(Fmr1KO)的认知功能障碍与社交互动障碍。为了进一步研究辣椒素对认知障碍的改善作用是否通过促进成体神经发生发挥功能，本发明使用神经发生特异性阻断剂替莫唑胺(temozolomide，TMZ)进行干预。结果表明，替莫唑胺可以阻断辣椒素对Fmr1基因缺陷型小鼠(Fmr1 KO)认知功能障碍的治疗作用。该研究结果表明，辣椒素可以通过调控神经发生治疗脆性X染色质综合征小鼠的认知功能障碍。

一、新位置识别实验

新位置识别实验是用于检测小鼠空间记忆能力的经典行为学。为了探索辣椒素是否能够矫正脆性X染色体综合征模型小鼠的空间记忆能力，使用腹腔注射辣椒素的方式对小鼠进行给药干预后，进行新位置识别实验测试。为了进一步研究辣椒素对空间记忆的改善作用是否通过促进成体神经发生发挥功能，使用神经发生特异性阻断剂替莫唑胺(temozolomide，TMZ)提前阻断神经发生，并与辣椒素联合给药，之后进行新位置识别实验测试。

1材料与方法

1.1材料：

一个正方形的场：A物体，B物体，面巾纸，75％的酒精，两个计时器。

1.2实验动物、药物：

7-8周龄Fmr1 KO和WT小鼠，6周龄Fmr1 KO和WT小鼠。

辣椒素(capsaicine；CAP)粉末，购自于MCE，纯度：99.8％，CAS No.:404-86-4。

替莫唑胺(Temozolomide；TMZ),购自selleck公司，CAS No.85622-93-1。

2实验分组及给药

2.1实验分组：WT+Veh：WT小鼠腹腔注射生理盐水；KO+Veh：Fmr1 KO小鼠腹腔注射生理盐水；WT+CAP：WT小鼠腹腔注射辣椒素；KO+CAP：Fmr1 KO小鼠腹腔注射辣椒素；WT+AS/TMZ：WT小鼠腹腔注射替莫唑胺及辣椒素；KO+CAP/TMZ：Fmr1 KO小鼠腹腔注射替莫唑胺及辣椒素，共6组，每组8-13只(即n＝8-13)。

2.2给药方式：

①：WT+Veh,KO+Veh组：7-8周龄Fmr1 KO和WT小鼠每天腹腔注射一次生理盐水，连续注射14天。

②：WT+CAP,KO+CAP组：7-8周龄Fmr1 KO和WT小鼠每天腹腔注射一次辣椒素，连续注射14天，给药剂量为1mg/kg。

③：WT+CAP/TMZ，KO+CAP/TMZ组：6周龄的Fmr1 KO和WT小鼠在第6周，第7周，第8周和第9周的前三天每天腹腔注射一次替莫唑胺(TMZ)，在第9周每天腹腔注射一次辣椒素(CAP)，连续注射7天，CAP的给药剂量为1mg/kg。

3实验方法

该测试是通过评估啮齿类动物根据空间线索识别熟悉物体新位置的能力来测量它们的空间记忆能力。

首先，实验动物被带到行为学测试实验室，适应至少1个小时。在训练阶段，每只动物被单独放置在一个正方形场地中，两个完全相同的物体被放置在与一面贴有彩色墙纸距离相同的位置上，允许小鼠自由探索6min，该训练过程重复3次。在测试阶段，其中一个已经熟悉的物体的位置被移动到了另一个新的位置上。记录6min内，实验动物对新旧两个不同位置物体的探索时间。一个正常的动物，应该花更多的时间在探索新位置的物体上。判别标准是根据识别新位置物体所花费的时间百分比与识别原位置物体所花费的时间之间的差异来计算的。在测试阶段，对物体的探测定义为动物的鼻子距离物体1cm之内的任何探索行为，包括头部方向、攀爬、嗅探等。判别指数的计算方法为：判别指数＝(新位置物体识别时间/总识别时间×100)-(原位置物体识别时间/总识别时间×100)。

新位置识别实验示意图如图10A，每只小鼠测试结束后，需要用75％的酒精将场擦拭干净，以消除同类气味干扰对下一只实验小鼠测试行为的影响。

4实验结果

数据采用GrapaPad Prism软件进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，数据处理结果以Mean±SEM表示，当P<0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。

WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP；WT+CAP/TMZ；KO+CAP/TMZ组的判别指数依次为：43.34％；-34.60％；40.54％；31.85％；-24.08％；-21.83％。小鼠对旧物体新位置识别实验统计结果如图10B所示。

由实验结果可知：WT小鼠更倾向于探索新物体，而Fmr1 KO小鼠更倾向于探索旧物体，这说明Fmr1 KO小鼠的空间记忆能力有缺陷，辣椒素给药后可以矫正这种缺陷，而TMZ可以阻断辣椒素对Fmr1 KO小鼠的空间记忆改善作用。说明辣椒素可以通过调控神经发生改善Fmr1KO小鼠的空间记忆。

二、模式分离实验

模式分离实验是一种高级的探索小鼠区分类似事件能力的方式。本实验将探讨辣椒素能否通过促进神经发生矫正脆性X染色体综合征模型小鼠的模式分离缺陷。

1材料与方法

1.1材料：一个正方形旷场；物体A(2个)；物体B(2个)，物体A与物体B不相同；面巾纸；75％的酒精；两个计时器。

1.2实验动物、药物：与“一、新位置识别实验”的实验动物、药物相同

2实验分组及给药

2.1实验分组：WT+Veh：WT小鼠腹腔注射生理盐水；KO+Veh：Fmr1 KO小鼠腹腔注射生理盐水；WT+CAP：WT小鼠腹腔注射辣椒素；KO+CAP：Fmr1 KO小鼠腹腔注射辣椒素；WT+AS/TMZ：WT小鼠腹腔注射替莫唑胺及辣椒素；KO+CAP/TMZ：Fmr1 KO小鼠腹腔注射替莫唑胺及辣椒素，共6组，每组8-13只(即n＝8-13)。

2.2给药方式：与“一、新位置识别实验”的药物给药方式相同

3实验步骤

如图11A，在训练期间，将已编好号的小鼠放置于空场中训练一段时间,随后被单独放置在第一个正方形场地中，有特定的地板图案和两个相同的物体(A物体)，并被允许探索10min。30分钟后，同一只动物被放置在第二个正方形场地中，与第一个实验不同的地板模式和两个完全不同的另一套物体(B物体)，并被允许探索10min。

实验时随机取两次训练壁纸中的一种当作背景，并于测试时的相同位置分别放置一个A物体和一个B物体，并采用录像机录制每只小鼠在该场景下对A物体和B物体的互动情况，测试时间为10min，之后利用计时器对小鼠的互动情况进行计数分析，在测试阶段，对物体的探测定义为动物的鼻子距离物体1cm之内的任何探索行为，包括头部方向、攀爬、嗅探等。

每只小鼠测试结束后用纯净水清洁，以免影响实验结果。根据公式计算判别指数，判别指数＝(新物体探测时间/总探测时间)-(旧物体探测时间/总探测时间)×100％，判断小鼠对新、旧物体的偏好。

4实验结果

数据采用GrapaPad Prism软件进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，数据处理结果以Mean±SEM表示，当P<0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。

WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP；WT+CAP/TMZ；KO+CAP/TMZ组的判别指数依次为：21.87％；-19.81％；32.90％；19.38％；-12.95％；-27.83％。小鼠模式分离实验结果统计图如图11B所示。

实验结果表明WT小鼠更倾向于探索新物体，而Fmr1 KO与WT小鼠表现相反，说明Fmr1KO小鼠的模式分离有缺陷，辣椒素给药后可以矫正这种缺陷。而TMZ可以阻断辣椒素对Fmr1KO小鼠的模式分离改善作用。说明辣椒素可以通过调控神经发生改善Fmr1 KO小鼠的模式分离缺陷。

由上述实验可知：辣椒素可以通过调控成体神经发生改善脆性X染色体综合征模型小鼠的模式分离缺陷。

三新物体识别实验

这项测试是基于啮齿动物的自然倾向，即喜欢探索新奇的物体而不是熟悉的物体。本实验检测的是小鼠的新物体识别能力，用于探索辣椒素能否通过调控成体神经发生矫正脆性X染色体综合征模型小鼠的学习、记忆障碍。

1实验材料

1.1材料：一个正方形旷场；物体A；物体B；面巾纸。75％的酒精；两个计时器。

1.2实验动物、药物：与“一、新位置识别实验”的实验动物、药物相同

2实验分组及给药

2.1实验分组：WT+Veh：WT小鼠腹腔注射生理盐水；KO+Veh：Fmr1 KO小鼠腹腔注射生理盐水；WT+CAP：WT小鼠腹腔注射辣椒素；KO+CAP：Fmr1 KO小鼠腹腔注射辣椒素；WT+AS/TMZ：WT小鼠腹腔注射替莫唑胺及辣椒素；KO+CAP/TMZ：Fmr1 KO小鼠腹腔注射替莫唑胺及辣椒素，共6组，每组8-12只(即n＝8-12)。

2.2给药方式：与“一、新位置识别实验”的药物给药方式相同

3实验步骤

该测试是以啮齿类动物优先探索陌生物体而非熟悉物体的特点来测量它们的新物体识别能力。新物体识别是记忆任务的一种形式，它不依赖于空间提示。在这个任务中，动物被训练来识别特定对象。

如图12A，首先，实验动物被带到行为学测试实验室，适应至少1个小时。在训练阶段，每只动物单独放置在一个走廊长度相同的L型场地中，两个完全相同的物体被放置在两侧走廊尽头，并被允许探索10min。在测试阶段，其中一个已经熟悉的物体被替换成一个新物体，记录10min内，实验动物对新旧两个不同物体的探索时间。一个正常的动物，应该花更多的时间在探索陌生物体上。判别标准是根据识别陌生物体所花费的时间百分比与识别熟悉物体所花费的时间之间的差异来计算的。在测试阶段，对物体的探测定义为动物的鼻子距离物体1cm之内的任何探索行为，包括头部方向、攀爬、嗅探等。判别指数的计算方法为：判别指数＝(陌生物体识别时间/总识别时间×100)-(熟悉物体识别时间/总识别时间×100)。

每只小鼠测试结束后用纯净水将场景进行清洁以免影响后续小鼠实验结果。

4实验结果

数据采用GrapaPad Prism软件进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，数据处理结果以Mean±SEM表示，当P<0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。

小鼠新物体识别实验的结果统计如图12B所示。WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP；WT+CAP/TMZ；KO+CAP/TMZ组的判别指数依次为：25.02％；-19.48％；23.03％；26.50％；-13.08％；-25.64％。

实验结果表明：WT小鼠更倾向于探索新物体，而Fmr1 KO与WT小鼠表现相反，这说明Fmr1 KO小鼠的学习记忆能力有缺陷，辣椒素给药后可以矫正这种缺陷。而TMZ可以阻断辣椒素对Fmr1 KO小鼠的学习记忆改善作用。

由上述实验可知：辣椒素可以通过调控成体神经发生改善脆性X染色体综合征模型小鼠的记忆力。

四、社交互动实验

社交互动障碍是自闭症患者最显著的表现形式之一。本实验使用了三箱交互社交行为学测试实验来检测辣椒素是否可以通过调控神经发生矫正脆性X染色体综合征模型小鼠的社交行为缺陷。

1实验材料

1.1材料:长方形的操作箱，金属笼子；两只小鼠；面巾纸；75％的酒精；两个计时器。

1.2实验动物、药物：与“一、新位置识别实验”的实验动物、药物相同

2实验分组及给药

2.1实验分组：WT+Veh：WT小鼠腹腔注射生理盐水；KO+Veh：Fmr1 KO小鼠腹腔注射生理盐水；WT+CAP：WT小鼠腹腔注射辣椒素；KO+CAP：Fmr1 KO小鼠腹腔注射辣椒素；WT+AS/TMZ：WT小鼠腹腔注射替莫唑胺及辣椒素；KO+CAP/TMZ：Fmr1 KO小鼠腹腔注射替莫唑胺及辣椒素，共6组，每组8-11只(即n＝8-11)。

2.2给药方式：与“一、新位置识别实验”的药物给药方式相同

3实验步骤

该测试是以啮齿类动物天生喜群居、对新物件具有探索倾向的特点来检测它们的社交行为变化。社会行为测试装置为三室箱，分隔墙由黑色有机玻璃制成，里面有直径7cm的小圆门，动物可以在三箱中自由活动。

如图13A，首先，实验动物被带到行为学测试实验室，适应至少1个小时。该实验包括三个阶段:习惯化、社会交往测试和社会新颖性识别。在测试阶段，实验动物第一次被置于中间箱，并允许自由探索左中右三室10min；接下来，一只陌生动物放置在左室侧的钢丝笼中，右室侧钢丝笼中放入玩具，在社会交往测试中，记录10min内，实验动物对玩具和陌生动物的探索时间。在社会新颖性识别测试中，之前曾经互动过的动物保持不变(左室侧)，右室侧内的玩具被置换成一只新的陌生动物(右室侧)，记录10min内，实验动物对熟悉动物(左室侧，来自于之前的社会交往阶段)和陌生动物(右室侧，新置换动物)的探索时间。判别标准是根据识别陌生动物所花费的时间百分比与识别玩具(或者识别熟悉动物)所花费的时间之间的差异来计算的。在测试阶段，对物体或者另一只动物的探测定义为动物的鼻子距离物体钢丝笼或另一只动物钢丝笼1厘米之内的任何探索行为，包括头部方向、攀爬、嗅探等。判别指数的计算方法为：判别指数＝(陌生动物识别时间/总识别时间×100)-(玩具或者熟悉动物识别时间/总识别时间×100)。

每只小鼠测试结束后用纯净水将场景进行清洁以免影响后续小鼠实验结果。

4实验结果

数据采用GrapaPad Prism软件进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，数据处理结果以Mean±SEM表示，当P<0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义。

小鼠社交互动实验的结果统计如图13B所示。WT+Veh；KO+Veh；WT+CAP；KO+CAP；WT+CAP/TMZ；KO+CAP/TMZ组的判别指数依次为：38.03％；-39.34％；37.49％；46.24％；-15.69％；-21.52％。

实验结果表明：WT小鼠更倾向于与新的小鼠互动，而Fmr1 KO小鼠更倾向于与旧的小鼠互动，这说明Fmr1 KO小鼠的社交能力有缺陷，辣椒素给药后可以矫正这种缺陷。而TMZ可以阻断辣椒素对Fmr1 KO小鼠的社交互动改善作用。由此得出结论，辣椒素可以通过调控神经发生矫正脆性X染色体综合征模型小鼠的社交互动障碍，辣椒素可以通过调控神经发生矫正脆性X染色体综合征模型小鼠的社交缺陷。

本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种辣椒素在制备治疗遗传性智力与认知功能障碍性疾病的药物中的应用，其中所述遗传性智力与认知功能障碍性疾病为脆性X染色体综合征。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述药物由辣椒素和药学上可接受的载体组成。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物是通过胃肠道给药或/和非胃肠道给药途径给药。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物以口服制剂、注射剂或局部给药制剂形式存在。

5.如权利要求4所述的应用，其特征是，所述口服制剂选自片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂或溶液剂；所述注射剂选自注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂选自霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或贴剂。

6.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述辣椒素的纯度超过60％。

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