CN106164674A - 调节胃肠道疼痛的药物的选择 - Google Patents

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Abstract

本实施方案涉及有效减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的药物的选择。如果药物能够减少自发的和/或诱导的瞬时受体电位香草素1 (TRPV1)激活作用，则选择和鉴定所述药物。

Description

调节胃肠道疼痛的药物的选择
技术领域
本发明主要涉及胃肠道疼痛的调节且特别是涉及能够调节胃肠道疼痛的药物，如乳酸细菌的选择和这样的药物的用途。
背景
胃肠道疼痛是与胃肠道有关的许多病症、疾病和紊乱的症状。功能性腹痛，指经常性腹痛。绝大多数具有经常性腹痛的患者患有"功能性"或"非-器官性"疼痛，意指疼痛不是由身体异常引起的。各种运动障碍也与疼痛和便秘或腹泻有关。该术语被用来描述其中由于各种原因肠道没有适当地发育或失去了其协调肌肉活动的能力的各种疾病。
这样的疾病可能以多种方式表现，并包括但不限于以下那些：
● 腹胀
● 复发性梗阻
● 腹疝痛
● 便秘
● 胃食管返流疾病
● 难治性、复发性呕吐
● 腹泻
● 肠易激综合征(IBS)
● 炎性肠道疾病
● 大便失禁
● 婴儿腹疝痛
● 频繁复发性腹痛(FRAP)
● 反流
● 食物耐受不良
在广义上说，在食物和分泌物运输进入消化道的任何重大改变可被认为是一种肠道运动障碍，且这种类型的障碍往往与胃肠道疼痛有关。
需要胃和肠的适当协调运动以消化并沿着消化道推进肠道内容物。胃肠(GI)道的适当运动所必需的收缩和松弛的模式是复杂的并利用GI壁内的神经和肌肉。每一天，在任何时间，许多因素可影响GI运动，例如体育锻炼和情绪困扰。新生儿必须在GI道中发育复杂的运动系统。功能失调性胃肠运动常与GI疼痛有关。
衰老、痴呆、中风、帕金森氏病、脊柱损伤、分娩期间的直肠撕破、糖尿病、外科并发症和神经肌肉疾病，如重症肌无力，可引起与疼痛相关的运动障碍。
肠易激综合征(IBS)，一种肠道运动和GI疼痛的常见诊断疾病，几十年来一直被认为是结肠的疾病，但有关GI运动的研究已经证明，潜在的运动扰乱也可以发生在小肠。IBS可常常伴有GI疼痛，而TRPV1免疫反应性已被证明在IBS患者中显著增加(Akbar, Yiangou等, Gut 2008)。
便秘，往往与GI疼痛有关，是美国最常见的消化道疾病，但尽管它频繁出现，往往仍然未被识别，直至患者发生继发性疾病，如肛肠紊乱或憩室病。如前提及的，GI疼痛是便秘的一种常见症状。
便秘在怀孕期间是很常见的。由于较高水平的激素孕酮和可能作为产前维生素服用的额外的铁，通常移动食物通过肠道的肌肉收缩缓慢下降。这往往也伴有下腹疼痛。
便秘也与增加的年龄有关，并且所谓的“老化的肠道”通常特别是在年逾70的人群中和在长期护理机构中发现。
在肠道运动障碍年龄谱的另一端，因婴儿疝痛所致的持续或过度啼哭是婴儿期最烦恼的问题之一。这对于婴儿、父母和涉及的医疗保健专业人员而言，都是令人烦恼的。疝气疼痛往往突然开始和停止。
继发于假定的自主神经失衡的肠运动过强也已被提出为一个疝痛的病因。调节运动活性的许多机制在婴儿中是不成熟的。这些机制的不成熟可导致对喂养不耐受的脆弱性增加。因此，疝痛可能是婴儿亚群中的一种常见的临床表现，这些婴儿在运动调节的一个或多个方面具有成熟性功能异常并常常导致婴儿的GI疼痛。
肠运动障碍适用于往往与GI疼痛有关的异常的肠收缩，对于不同疾病有许多不同种类的治疗和建议，其中一些比许多其它治疗和建议更有效。
因此，存在解决各种运动障碍和疼痛性疾病的整体需要和特定问题，即如何最佳选择预防或减轻胃肠道疼痛的药物。
瞬时受体电位香草素1 (TRPV1)是在例如外周神经系统(PNS)、中枢神经系统(CNS)、呼吸系统和胃肠道中表达的Ca2+渗透阳离子通道。TRPV1被物理和化学刺激，例如温度、pH改变和辣椒碱激活，并对伤害性和热性炎症性疼痛的检测是至关重要的。在胃肠道中，TRPV1免疫反应性可例如在内脏感觉传入神经中被发现，且TRPV1细胞将例如胃疼痛的感觉传播到脑的更高级中心。TRPV1被认为涉及几种与疼痛感觉相关的胃肠病症，且TRPV1免疫反应性已表明在例如IBS中显著地增加(Akbar, Yiangou等, Gut 2008)。作为这样的一个实例，经诊断患有活动性炎性肠道疾病的患者证实在结肠神经纤维中的TRPV1免疫反应性大大增加(Wang, Miyares和Ahern, 2005 J. Physiol.)。
虽然TRPV1被认为是开发治疗不同形式疼痛的药物的潜在靶标，但该受体的广泛表达可导致不良事件，这限制了系统性TRPV1拮抗剂在治疗胃肠道疼痛中的使用。特别是，作为血管活性肽释放减少的结果，拮抗该受体可能潜在地导致心血管并发症。
发明简述
寻找适合于减轻或预防胃肠道疼痛的药物是一个总的目标。
提供一种选择有效减轻或预防胃肠道疼痛的药物，优选细菌菌株和更优选乳酸细菌的方法是一个特定的目标。
这些和其它目标通过如本文公开的实施方案得到满足。
实施方案的一个方面涉及一种选择有效减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的药物的方法。所述方法包括选择能够减少自发的和/或诱导的瞬时受体电位香草素1 (TRPV1)激活作用的药物。
实施方案的另一个方面涉及通过以上鉴定的方法选择的药物。
实施方案的一个进一步的方面涉及通过以上鉴定的选择方法可获得的、用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的药物。
实施方案的又一个方面涉及一种组合物，其包含通过以上鉴定的选择方法可获得的药物和至少一种另外的选自药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、食品、食物补充剂和另一种预防剂或治疗剂的组分。
实施方案的一个相关方面限定用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的如上定义的药物或如上定义的组合物。
实施方案的另一个相关方面限定通过以上鉴定的选择方法可获得的或如上定义的药物或如上定义的组合物在制备用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的药物、食物产品或食物补充剂产品中的用途。
实施方案的还一个方面涉及一种减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的方法。所述方法包括给予受试者有效量的通过以上鉴定的选择方法可获得的或如上定义的药物或如上定义的组合物。
本实施方案提供可用来选择或鉴定药物，特别是细菌菌株，如乳酸细菌的有效的技术，所述药物可用来减轻或预防患有引起胃肠道疼痛的障碍或疾病或与胃肠道疼痛有关的障碍或疾病的受试者，优选人类受试者的胃肠道疼痛。
附图简述
实施方案，与其另外的目的和优点一起，通过参考与附图结合在一起的以下描述，可最好地得到理解，其中：
图1显示在加入1x108 DSM 17938单位(cfu)/ml (A)、1x109 cfu/ml DSM 17938 (B)、稀释的DSM 17938条件培养物(1:5) (C)、1x109 cfu/ml γ-辐照的DSM 17938 (D)和稀释的单独培养基(1:5) (E)后的肠系膜多单位自发放电(mesenteric multiunitspontaneous firing) (Wilcoxon检验)。
图2显示DSM 17938对脊髓传入神经自发放电速率的影响。A) 当1x109 cfu/mlDSM 17938被添加到管腔中时，多单位放电速率降低(Wilcoxon检验)。B) 左小图，脊髓单-单位放电被DSM 17938减少(Wilcoxon检验)。C) 上小图，加入DSM 17938之前和之后的自发多单位放电的代表性痕迹；下小图，在上面的痕迹中由“o”标记的时间点发生的一个单一单位的叠加波形。
图3显示，DSM 17938通过加入辣椒碱至浆膜液中拮抗脊髓纤维的兴奋性应答。A)从113个脊髓各自的单一单位绘制辣椒碱剂量-反应曲线图(●)并用一个三参数逻辑方程拟合，EC50= 200 nM。Max= 238 ± 27 %；对于另外116个纤维，辣椒碱的剂量-反应曲线图在1x109 cfu/ml DSM 17938的存在下另外绘制(■)并用相同的逻辑方程拟合，对此EC50= 500nM和Max= 129 ± 17 % (对于EC50和Max的差异分别为P = 0.7和P= 0.004，额外的平方和F检验(extra sum-of-squares F test))。B) 具有均数和SEMs的概括散点图显示在1x109cfu/ml DSM的不存在或存在下，单一单位应答如何随着辣椒碱的剂量增加而变化。(n )表示每个组的单一单位的比例。
图4显示，DSM 17938或TRPV1拮抗剂减少在脊髓单一单位中由扩张引起的兴奋性应答。A) 分散图显示，加入1x109 DSM 17938至管腔降低通过提高腔内压力至48 hPa引发的脊髓单一单位放电速率的增加。B) 加入10μM的TRPV1拮抗剂6-碘代降二氢辣椒碱至管腔模拟加入DSM 17938的作用(Wilcoxon检验)。
图5显示，DSM 17938减少辣椒碱-诱导的背根神经节神经元胞体中的Ca2+升高。A)1μM辣椒碱诱导DRG神经元Ca2+进入的增加，其被被管腔内DSM 17938造成剂量-依赖性减少且不受1x109 cfu/ml JB-1的影响。B) 概括图显示，由辣椒碱诱导的最大Ca2+荧光(F)对基线Ca2+荧光(F0)的比率(F/F0)如何随着17938浓度或JB-1变化。(P 值，Bonferroni's多重比较检验)。
图6显示，用DSM 17938喂食9天减轻胃胀诱发的心动过缓。A) 由40和60 mmHg胃胀诱导的静息心率的百分比降低的总结值(P 值，未配对t检验)。B) 概括图显示静息心率如何随时间的推移响应于60 mmHg胃胀而变化(P = 0.01，双向ANOVA检验)。
图7显示，DSM 17938诱导的辣椒碱对脊髓传入神经的兴奋性作用降低通过DSM17938条件培养物模拟。概括图显示由1μM辣椒碱在对照条件、用DSM 17938条件培养物(1:5)或用1x109 cfu/ml DSM 17938诱导的单-单位脊髓纤维的放电频率增加(P=0.02，单向ANOVA检验；事后P值，Holm-Sidak’s多重比较检验)。
详细描述
为促进对本发明的理解，一些术语定义如下。
"胃肠道疼痛"，也称为GI疼痛，表示受试者的胃肠系统的疼痛。这样的胃肠道疼痛往往典型地由胃肠系统的各种疾病和障碍引起或与它们有关，即是它们的症状或疾病成分。胃肠道疼痛包括胃肠系统的一般性疼痛，往往表示本领域的一般性胃肠道疼痛、与肠运动障碍有关的疼痛、源自炎性肠道疾病和肠易激综合征的疼痛、胃痛、一般性腹痛、内脏痛，功能性腹痛、频繁的经常性腹痛和其它功能性胃肠障碍的疼痛。
“功能性腹痛”指经常性腹痛。绝大多数具有经常性腹痛的患者具有"功能性"或"非-器官性"疼痛，意味着疼痛不是由身体异常引起。
"肠运动障碍"被用来描述各种障碍，其中肠道由于各种原因没有适当地发育或失去了其协调肌肉活动的能力。这样的障碍可以多种方式表现，并包括但不限于以下那些：
● 腹胀
● 复发性梗阻
● 腹疝痛
● 便秘
● 胃食管返流疾病
● 难治性、复发性呕吐
● 腹泻
● 肠易激综合征(IBS)
● 炎性肠道疾病
● 大便失禁
● 婴儿腹疝痛,
● 频繁复发性腹痛(FRAP)
● 反流
● 食物耐受不良
在广义上说，在食物和分泌物运输进入消化道的任何重大改变可被认为是一种肠道运动障碍，且这往往与胃肠道疼痛有关。
“胃痛”是一个用来描述上腹部疼痛或不适的集合术语。
在一实施方案中，胃痛的原因选自非-溃疡性消化不良、消化性溃疡、胃食管返流疾病和胃炎，例如由它们组成。
在一特定的实施方案中，胃痛的原因是非-溃疡消化不良和/或胃炎。
如本文所用的，术语“放电频率”被用来测量感觉神经至脑的棘波串(spiketrains)。
如本文所用的，术语“腔内峰压” (PPr)是基于腔内压力记录，其中腔内压力变化在肠段的纵向轴线的中点测定。分析压力信号并鉴定和测量腔内峰压(PPr)。
如本文所用的，术语“迁移运动复合频率” (MMC频率)通过计数时空地图中暗MC波段的数量来计算。
如本文所用的，术语“迁移运动复合速度” (MMC速度)从迁移运动复合物产生的时空地图中每个波段的斜率测定。
如本文所用的，术语“药物”被用来指任何物质或材料，包括全细胞；微生物；条件培养物；源自这样一种条件培养物的蛋白质、肽、酶和/或分子；从全细胞或微生物分泌或衍生的蛋白质、肽、酶和/或分子；或其它可用来调节哺乳动物的胃肠系统的胃肠道疼痛的生物学或化学材料。优选的药物的实例有细菌菌株，例如益生菌菌株，和特别是乳酸菌菌株。优选的药物的另一个实例是来自细菌菌株，例如益生菌菌株，和特别是乳酸菌菌株的条件培养物。
条件培养物，有时也称为条件培养基，是细胞已在其中培养一段时间的一种培养物(培养基)。在培养基中培养的细胞通过释放或分泌各种成分或分子，如蛋白质、肽、酶、细胞因子、趋化因子、化学物等“调整”培养物。
开始接受的是，肠道微生物作为所谓的微生物组群-肠-脑轴(microbiome-gut-brain axis)的部分发信号至脑。然而，有关肠道微生物组群在神经系统的发育或功能中的作用几乎不知道。目前几乎很少知道关于从肠道传递到中枢神经系统的神经信号的定量性质。
单一感觉神经元，包括迷走神经纤维中的那些，代表连续的物理刺激作为编码刺激的性质和强度的图案化的棘波串。除此之外，刺激可以由束中的活性纤维数确定的群体代码表示。经由初级传入神经到达大脑的所有信息必须以神经元棘波串的语言编码。因此，知道感觉棘波串如何受到各种药物，如共生物、益生菌株和不同物质的影响，使得人们能够通过它们对初级传入放电以及以各种方式可干预这种信号传导系统(特别是通过调节TRPV1激活作用)的新的药物和其它化合物的影响，鉴定新的有益肠道微生物和它们的活性分子。
本文实施方案的方法被用来选择用于经抑制信号传导通过TRPV1受体减轻或预防胃肠道疼痛的药物。所述实施方案的方法可由此用来评价可潜在地有效预防胃肠道疼痛和/或有效减轻、抑制或治疗胃肠道疼痛的药物。因此，该方法可用来鉴定能够调节与外周(肠)和/或中枢神经系统有关的胃肠道疼痛的有效药物。
因此，所述实施方案的一个方面涉及一种选择有效于，即用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的药物的方法。所述方法包括选择能够减少自发的和/或诱导的瞬时受体电位香草素1 (TRPV1)激活作用的药物。
从而实施方案基于使用作为选择工具的TRPV1信号传导途径，在患有涉及或引起这样的胃肠道疼痛的疾病或障碍和可表现出胃肠道疼痛疾病或障碍的受试者中，鉴定有效调节，特别是预防或减轻，如抑制或治疗胃肠道疼痛的药物。
该实施方案的方法通常在体外或离体进行，如本文进一步公开的。然而，当给予受试者时，药物优选地能够在受试者中减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用。
所述实施方案的方法因此可用来发现用于不同的胃肠道疼痛障碍和疾病中减轻或预防胃肠道疼痛的合适药物。选择药物以有益的方式影响受试者的TRPV1激活作用，以调节，即优选地预防、减轻或治疗胃肠道疼痛。
在一实施方案中，用通过该方法选择的药物来预防或治疗的与胃肠道疼痛有关的障碍或疾病是胃肠道疼痛障碍或疾病。
在一实施方案中，胃肠道疼痛是胃痛。
在一实施方案中，胃肠道疼痛是内脏疼痛。
在一实施方案中，胃肠道疼痛可存在于患有疝痛的受试者中。
在一实施方案中，胃肠道疼痛可存在于患有肠易激综合征(IBS)的受试者中。
在一实施方案中，胃肠道疼痛可存在于患有便秘的受试者中。胃肠道疼痛可存在于患有如前定义的肠运动障碍的受试者中。
因此，在一实施方案中，受试者患有与胃肠道疼痛有关的肠道运动障碍。
所述实施方案的方法基于意外的发现，即包括与不同的病症和障碍如运动障碍有关的疼痛(并表现为中枢或外周)的胃肠道疼痛，与TRPV1激活作用有关联，其可通过以前未知的药物，如乳酸细菌调节。
一类胃肠道疼痛是由腹部内脏(器官)的伤害感受器激活作用引起的内脏疼痛。内脏结构对膨胀(拉伸)、局部缺血和炎症是高度敏感的，但对通常引起疼痛的其它刺激是相对不敏感的。内脏痛是弥漫性的，很难定位，而且经常涉及远端结构，通常为浅表结构。其可伴有症状如恶心、呕吐、生命体征的变化以及情感表现。疼痛可被描述为令人作呕的、深入的、挤压的，和隐隐的。不同的结构损伤或生化异常只能解释一部分患者的这种类型的疼痛。这些疾病有时被分组为胃肠神经肌肉疾病(GINMD)。人们也可经历内脏疼痛，往往在性质上是非常强烈的，没有对于这样的症状的结构、生物化学或组织病理学(histolopathologic)理由的任何证据。
伤害感受器是通过对特定的伤害感受性神经元(Aδ或C)发送动作电位对潜在的破坏性刺激作出反应的感觉受体，所述神经元再将刺激传递到脊髓前外侧束(加上一个小的迷走神经突起)，然后传递到丘脑，和前脑包括岛叶和扣带回皮质(cingulate cortices)。起源于肠道病理学的疼痛感知的关键是经由在肠系膜传入神经束中传播的外部初级传入纤维，从肠道到中枢神经系统的疼痛信息的激活作用。
该方法可用来筛选药物，以选择具有所需特性，例如降低TRPV1激活作用，用于减轻或预防胃肠道疼痛的药物。在该方法中待测的参数，即自发的和/或诱导的TRPV1激活作用，可以不同的模型和系统监测和确定。使用这种信息，可获得用来限定特定药物具有的对在胃肠道疼痛中的疼痛信号传导的详细的和潜在细微影响的概况。
可以该方法测定的其它参数包括一般的疼痛信号传导、神经放电活动，例如肠系膜神经束分析，和可能使用胃肠道疼痛的不同体内模型。
在一实施方案中，TRPV1激活作用在表达TRPV1的细胞，如背根神经节(DRG)神经元、CaCo2细胞或另一个标准人肠上皮细胞系中测定。可测量自发的TRPV1激活作用和通过例如辣椒碱、pH改变或温度诱导后TRPV1激活作用二者。一般来说，表达TRPV1的任何细胞或组织可被用来测量依据实施方案的TRPV1激活作用。
因此，在一实施方案中，该方法包括使表达TRPV1的细胞与待测的药物接触。该方法也包括随后，即在细胞与待测的药物接触后，测定细胞中的自发的和/或诱导的TRPV1激活作用。该方法还包括比较测定的自发的和/或诱导的TRPV1激活作用与对照TRPV1激活作用。在这个实施方案中，该方法还包括选择待测的药物作为有效减轻或预防胃肠道疼痛的药物，如果测定的自发的和/或诱导的TRPV1激活作用低于对照TRPV1激活作用的话。
对照TPRV1激活作用可依据各个实施方案确定。例如，TRPV1激活作用可从具有激活水平的TRPV1表达细胞预先限定和确定，该水平代表对应于例如基本上无胃肠道疼痛的正常或基线激活作用。
然而，测定对照TRPV1激活作用的优选的实施方案是使用TRPV1表达细胞作为内部对照。因此，在一实施方案中，该方法包括在细胞与待测的药物接触之前，测定细胞中的自发的和/或诱导的TRPV1激活作用。该方法也包括在细胞与待测的药物接触之前，基于在细胞中测定的自发的和/或诱导的TRPV1激活作用，测定对照TRPV1激活作用。
在该途径中，自发的和/或诱导的TRPV1激活作用测量因而优选地进行两次：在细胞与待测的药物接触之前和在细胞与待测的药物接触之后。
或者，自发的和/或诱导的TRPV1激活作用测量可以两次平行的实验进行：一次用待测的药物接触细胞的实验和一次细胞不与所述药物接触的对照实验。用于这两次实验的细胞则具有相同的类型，如都是DRG神经元、CaCo2细胞或另一个标准人肠上皮细胞系。自发的和/或诱导的TRPV1激活作用在两个实验中测定，然后彼此比较。
用于该方法的细胞可以是任何表达TRPV1的细胞，包括，但不限于离体制剂、表达TRPV1的细胞系，如表达TRPV1的人肠上皮细胞系，和表达TRPV1的原代细胞。
测定的自发的和/或诱导的TRPV1激活作用和对照TRPV1激活作用可一般表示为各自的参数值或度量，包括表示自发的和/或诱导的TRPV1激活作用水平的值。
在一实施方案中，原代细胞例如背根神经节(DRG)神经元被用来分析TRPV1激活作用。
在另一个实施方案中，表达TRPV1的细胞系如CaCo2或另一个标准人肠上皮细胞系被用来分析TRPV1激活作用。
在其它实施方案中，可市售获得的表达TRPV1的细胞系被用来分析TRPV1激活作用，见例如来自Chantest的分类号CT6105。
用户报告基因细胞，也表示为本领域的报告基因细胞，也可能用来监测和测量TRPV1表达和/或自发的和/或诱导的TRPV1激活作用。
几种不同的方法可用来研究TRPV1激活作用，包括，但不限于使用例如通过例如辣椒碱诱导的钙流入的功能性分析和/或其通过药物在表达TRPV1的细胞中的预防作用和自发的和/或通过例如辣椒碱诱导的肠系膜神经束的放电频率。在另一个实施方案中，使用实时PCR机器的温度门控离子通道活性的功能性评价，如在Reubish, Emerling等.,BioTechniques 2009所述，可用来分析TRPV1激活作用。在另一个实施方案中，用于TRPV1通道的报告基因小鼠可被用来研究TRPV1激活作用。各种体内范例也可用来分析对本发明的疼痛的影响。这些方法包括例如胃胀和对心率的影响(见实施例3)和结肠直肠膨胀模型。
因此，在一实施方案中，该方法包括测定由辣椒碱或另一个能够诱导TRPV1激活作用的物质，例如辣椒碱类似物或其它能够激活TRPV1的物质诱导的在细胞中的Ca2+流入。同样，使细胞暴露于选择的物理条件可被用来诱导TRPV1激活作用，包括改变pH或温度。因此，使细胞暴露于酸性pH、碱性pH和/或热(升高的温度，典型地高于约42℃)可诱导TRPV1激活作用。在这个实施方案中，在表达TRPV1的细胞中的Ca2+流入由此被用作代表TRPV1激活作用的参数。减少TRPV1激活作用，和特别是减少pH-诱导的、热-诱导的和/或辣椒碱-诱导的TRPV1激活作用，可被测定为减少Ca2+流入。在另一个实施方案中，该方法包括测定细胞的温度门控离子通道活性。在这个实施方案中，在表达TRPV1的细胞中的温度门控离子通道活性被用作代表TRPV1激活作用的参数。温度门控离子通道活性可以是自发的或诱导的，如通过升高的温度诱导的。减少TRPV1激活作用然后可测定为细胞的温度门控离子通道活性的减少。
在一实施方案中，TRPV1激活作用使用肠系膜传入神经束实验测定。因此，另一个可被测定的参数是自发的和/或例如通过辣椒碱、pH改变或热诱导的肠系膜传入神经束的放电频率。这种技术可被用来确定由待测的不同药物诱导的肠系膜神经纤维的兴奋性变化。在一实施方案中，切除有或没有含神经束的肠系膜神经丛(arcade)的胃肠段，得到由用于离体神经束记录的脊髓和迷走神经纤维二者组成的段(见实施例1)。
在一些实施方案中，胃肠道的区域特异性具有重要性。用于本发明的肠系膜神经分析方法的适宜段优选地包括适宜的神经束，以便能够测量肠系膜传入神经放电。这可方便地由具有具有连接的肠系膜组织的胃肠段提供(见实施例1)。因此，这个实施方案便利地在得自适宜的实验动物的离体段上，例如在小鼠胃肠段(例如小鼠结肠或空肠段)上进行。进行药物对小肠对比大肠作用的比较的能力可能是有利的，特别是取决于待治疗的肠运动障碍和临床阶段及其症状，区域特异性的、例如对小肠或大肠的任一个有特异性的治疗可能是有益的。
在一实施方案中，对肠道的特异性和选择性部分分析传入性肠系膜神经脊髓通信量。已令人惊奇地发现，不同的药物，如乳酸菌，可影响或调节一部分胃肠道疼痛信号传导系统，但不影响或调节另一部分GI-道，所述影响或调节经由不同的神经途径如迷走神经或通过背根神经节(对于内脏疼痛)。
因此，在一实施方案中，该方法包括用待测的药物接触具有连接的肠系膜组织的离体胃肠段。该方法也包括在离体胃肠道段与待测的药物接触后，测定离体胃肠道段的自发的和/或诱导的肠系膜传入放电。该方法还包括比较自发的和/或诱导的测量的肠系膜传入放电与对照肠系膜传入放电。在这个实施方案中，该方法还包括选择待测的药物作为有效减轻或预防胃肠道疼痛的药物，如果测定的自发的和/或诱导的肠系膜传入放电低于对照肠系膜传入放电的话。
对照肠系膜传入放电可如在前述中所讨论的，使用离体胃肠段作为内部对照测定。在这样的情况下，该方法包括在离体胃肠道段与待测的药物接触前，测定离体胃肠道段的自发的和/或诱导的肠系膜传入放电。该方法也包括在离体胃肠道段与待测的药物接触前，基于在离体胃肠道段测定的自发的和/或诱导的肠系膜传入放电，测定对照肠系膜传入放电。
或者，可进行两次平行的实验。在它们之一中，使离体胃肠段与待测的药物接触，而在另一实验，对照实验中，离体胃肠段不与药物接触。自发的和/或诱导的肠系膜传入放电以两个实验测定并彼此比较。
分析以上这些参数的一个或多个将产生一种选择有效减轻或预防胃肠道疼痛的药物的方法。
在一特定的实施方案中，离体胃肠道段选自离体结肠或空肠段。在这样的情况下，该方法包括使具有连接的肠系膜组织的离体结肠或空肠段与待测的药物接触。
分析自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的适宜的方法和设备的实例在实施例和附图中描述。
因此，在优选的方法中，提出的分析将给出有关自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的数据。分析这些参数的一个或多个将导致一种选择有效减轻和/或预防胃肠道疼痛的药物的优选方法。
所述实施方案的方法因此可通过使用本文的模型，用来寻找适合于治疗、预防和/或减轻胃肠道疼痛的药物。
提出的方法将使用不同的模型，提供有关自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的数据。分析这种参数将导致一种选择有效减轻或预防胃肠道疼痛的药物的方法。
在一实施方案中，该方法分析药物对TRPV1激活作用(自发的和/或由例如辣椒碱、pH改变和/或热诱导的及其由药物预防的)的影响，因此可用作胃肠道疼痛信号传导，即无论是否药物可能具有对胃肠道疼痛，例如内脏疼痛的作用的读出。自发的或诱导的(例如通过辣椒碱、pH变化和/或热) TRPV1活性的增加或没有显著的影响是可能分别导致胃肠道疼痛增加，或对胃肠道疼痛没有显著作用的药物的指示，而自发的和/或诱导的(例如通过辣椒碱、pH变化和/或热) TRPV1活性的下降是将减轻胃肠道疼痛的药物的指示。因此优选的药物是导致自发的和/或(例如由辣椒碱)诱导的TRPV1活性下降的那些。
在另一个实施方案中，该方法通过分析自发的和/或(例如通过辣椒碱、pH变化和/或热)诱导的肠系膜传入神经放电(疼痛信号传导)，分析药物对TRPV1活性的影响，因此可用作用于胃肠道疼痛，即是否药物可能具有对胃肠道疼痛，例如内脏疼痛的作用的读出。对传入神经放电的增加或没有显著的影响是可能分别导致胃肠道疼痛增加，或对胃肠道疼痛没有显著作用的药物的指示，而传入神经放电的下降是将减轻胃肠道疼痛的药物的指示。因此优选的药物是导致传入神经放电减少，例如传入神经束的自发的和/或诱导的放电频率下降的那些。
以任何适宜的方式，将待测的药物加入到用于TRPV1活性分析的选择的系统中。为分析药物对疼痛信号传导的影响，所述方法便利地在药物的存在和不存在下进行。例如，方法步骤在应用药物之前和之后进行。因此，在这样的方法中，将药物的效果与适宜的对照品比较，例如将在测试药物的存在下的结果与在测试药物的不存在下的结果比较，例如单用缓冲剂的结果与缓冲剂加药物的结果比较。
本发明人已经令人惊奇地发现，某些乳酸菌菌株，例如DSM 17938，可减少不同的离体和体外模型的TRPV1激活作用(见实施例1和2)。因此，在优选的实施方案中，所述药物是细菌菌株，更优选乳酸菌。因此，所述实施方案的方法可有利地用来测试各种乳酸菌，以鉴定和选择一个或多个有效减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的乳酸菌菌株，如通过按照能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的方法确定的。
所述实施方案的另一个方面是通过所述实施方案的方法选择，即通过选择方法获得的药物。
一种优选的药物是微生物，更优选细菌菌株，优选乳酸菌，包括其部分或代谢物。
另一个优选的药物是来自这样的微生物的条件培养物。
所述实施方案的一个相关方面定义通过实施方案的选择方法获得的、用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的药物。
在一特定的实施方案中，药物通过所述实施方案的能够减少自发的和/或诱导的RPTV1激活作用的选择方法获得，用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛。
在一实施方案中，为减轻或预防胃肠道疼痛，将选择优选地发挥降低疼痛信号传导的作用的药物，如通过监测药物对自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的影响所评价的。这样一种药物将优选地用于减少或降低DRG神经元，或其它TRPV1-表达的细胞或组织的TRPV1激活作用。优选地，所述药物将使用不同的体外系统或模型包括，但不限于如前讨论的表达TRPV1受体的原代细胞和细胞系，发挥降低自发的和/或诱导的(例如通过辣椒碱、pH变化和/或热) TRPV1活性的作用。
在一实施方案中，将选择优选地用来减少或降低肠系膜传入神经束的TRPV1激活作用的药物。药物将起着减少自发的和/或(例如通过辣椒碱、pH变化和/或热)诱导的肠系膜传入神经束的放电频率的作用。
从以上清楚地知道，所述实施方案的方法也可用来选择或鉴定不适合于治疗胃肠道疼痛的药物，例如对减少疼痛信号传导不具有有益作用的药物。特别是对该参数不显示出作用的那些药物不太可能适合于减轻或预防胃肠道疼痛。此外，具有增加疼痛信号传导的作用的(如通过自发的和/或诱导的TRPV1活性的增加所测定的)那些药物不太可能适合于减轻或预防胃肠道疼痛。
所述实施方案的进一步的方面涉及一种包含通过实施方案的方法选择的药物和至少一种另外的组分的组合物。因此至少一种另外的组分优选地选自药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、食品、食物补充剂和另一种预防剂或治疗剂。
因此，一个实施方案涉及一种包含通过所述实施方案的选择方法获得的药物和至少一种另外的组分的组合物，所述组分选自药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、食品、食物补充剂和另一种预防剂或治疗剂，用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛。
至少一种另外的组分可以与依据实施方案选择的药物一起给予或可分开给予。此外，至少一种另外的组分可在与依据实施方案选择的药物的相同时间或在不同的时间点给予。合适的给药方案和时间选择可通过技术人员根据提及的另外组分容易地确定。
在一实施方案中，至少一种另外的组分是任何适宜的营养成分，例如食物或食物补充剂。
在一实施方案中，另一种预防剂或治疗剂可以是任何另外的药物，其可用于预防或减轻，如治疗所提及的胃肠道疼痛。
在另一个实施方案中，另一种预防剂或治疗剂是能够影响胃肠运动和/或混合的药物。另一种预防剂或治疗剂则优选地能够调节(增加或减轻，取决于待治疗的病症，如本领域已知的和以下描述的)胃肠运动和/或混合。
在一个进一步的实施方案中，所述实施方案的药物可具有双重功能，即具有对胃肠道疼痛和胃肠运动和/或混合的双重功能。
依据本实施方案选择的、具有有效减轻或预防胃肠道疼痛的目的的药物也可经受另一个或另外的、具有测定药物在调节胃肠道运动和/或混合中是否是额外有效的目的的分析或选择方法。这样一种药物对用来预防或治疗例如运动障碍可能是有意义的，因为它解决了胃肠道疼痛和运动改变二者的结合。分析运动和/或混合的方式是本领域已知的。要分析的参数包括，但不限于，MMC频率、MMC速度、管腔内压力如PPr和其它功能性模型。
在运动分析中，经药物诱导的胃肠运动的变化可例如被检测为运动模式或收缩幅度的变化。一些药物将没有任何作用。可增加胃肠运动，例如通过增加MMC频率和/或MMC速度和/或管腔内压力如PPr的药物将可能用于治疗与胃肠道疼痛有关的障碍如便秘和疝痛，其中增加沿消化管的推进运动将是有利的。
或者，如果例如，要治疗的肠运动障碍是其中需要增加转运材料通过肠的时间的障碍，例如涉及快速通道转运的障碍，如IBS或腹泻，则提及的药物除了其对胃肠道疼痛调节的作用外，还将例如通过降低MMC频率或MMC速度或管腔内压力，例如PPr，降低胃肠运动。优选的药物将降低至少MMC速度。优选的药物将降低这些参数的两个或更多个，例如将降低MMC速度和MMC频率或将降低MMC频率和管腔内压力(例如PPr)或将降低MMC速度和管腔内压力(例如PPr)。最优选的药物将降低所有这些参数，例如将降低MMC频率、MMC速度和管腔内压力(例如PPr)。运动分析可在来自小肠或大肠(例如对于小肠的空肠段或对于大肠的结肠段)的适宜的胃肠段上评价。在一些实施方案中，使用大肠(例如结肠)段是优选的。
所述实施方案的进一步的方面涉及通过实施方案的方法选择的药物或如上定义的组合物，其用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛。
所述实施方案的一个相关方面定义通过实施方案的方法选择的，例如通过依据实施方案的选择方法可获得的药物，或如上定义的组合物在制备用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的药物、食物产品或食物补充剂产品中的用途。
所述实施方案的另一个相关方面定义一种减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的方法。该方法包括给予受试者有效量的通过所述实施方案的方法选择的，例如通过依据实施方案的选择方法可获得的药物，或如上定义的组合物。
在这些方面的一实施方案中，所述药物是细菌菌株，优选乳酸菌菌株和更优选路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株，如能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的菌株，优选地能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的乳酸菌菌株和更优选能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的路氏乳杆菌菌株。
在这些方面的一个实施方案中，所述药物优选地为路氏乳杆菌DSM 17938。在其它实施方案中，所述药物是另一种乳酸菌菌株，即药物是并非路氏乳杆菌DSM 17938的乳酸菌菌株，优选并非路氏乳杆菌DSM 17938的路氏乳杆菌菌株。
在这些方面的一个实施方案中，所述药物是一种来自细菌菌株，优选地来自乳酸菌菌株和更优选地来自路氏乳杆菌菌株的条件培养物，如来自能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的细菌菌株、优选地来自能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的乳酸菌菌株和更优选来自能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的路氏乳杆菌菌株的条件培养物。
在一实施方案中，所述药物是来自乳酸菌菌株，优选来自路氏乳杆菌DSM 17938或并非路氏乳杆菌DSM 17938的路氏乳杆菌菌株的条件培养物。用于这样的条件培养物的培养基可以是适合于本领域已知的培养乳酸菌菌株的任何培养基。在一实施方案中，MRS (deMan, Rogosa & Sharpe)培养基被用作生产来自乳酸菌菌株，优选来自路氏乳杆菌DSM17938的条件培养物的起始原料。在本发明的一个实施方案中，来自乳酸菌菌株、优选来自路氏乳杆菌DSM 17938的条件培养物，在被引入组合物或用作组合物之前被冷冻干燥。
在另一个实施方案中，来自乳酸菌菌株，优选来自路氏乳杆菌DSM 17938的条件培养物的一个或多个组分，被分离并作为纯化的和/或富含的组分，以合适的组合物形式给予受试者。这样的组分的实例包括优选地从乳酸菌菌株分泌到培养基中的蛋白质、肽、酶和其它分子。也从乳酸菌菌株直接提取的这样的组分可依据实施方案使用。
药物或组合物的适宜的给药模式和制剂，根据疾病的部位选择。优选的给药模式是口服，然而，同样对于一些治疗而言，静脉注射或肌肉注射将是适宜的。
药物或组合物的适宜的剂量可容易地由技术人员根据待治疗的障碍，给药模式和有关的制剂选择或确定。
在一个实施方案中，TRPV1受体被局部调节，例如通过采用经口给予的、可选择性地在具有胃肠道疼痛的受试者的GI道中调节TRPV1激活作用的乳酸细菌而被局部调节，从而最大限度地减少在所述受试者中的任何不利影响。相信这种优选的给予药物，特别是通过实施方案的方法选择的乳酸菌菌株的途径，将主要在局部，即在胃肠系统内影响TRPV1激活作用。因此，药物将具有预防或减轻胃肠道疼痛的有益作用，同时使在胃肠系统外的任何不需要的TRPV1调节最小化。
在本文描述的本实施方案的方法和用途中，术语"增加"、"降低"、"减少"等，指水平的可测量的变化，优选水平的显著变化，更优选统计学意义的显著变化，优选具有≤0.05的概率值。
优选的受试者是哺乳动物，更优选是人。
当待治疗的与胃肠道疼痛有关的肠运动障碍是便秘时，则优选的受试者是老年患者或孕妇。老年患者通常被理解为是年龄70或70以上的患者。
当待治疗的与胃肠道疼痛有关的肠运动障碍是疝痛时，优选这是婴儿疝痛。
依据所述实施方案的方法选择的所述药物，优选乳酸菌菌株的用途包括减轻、预防或缓解相关障碍或障碍的症状(例如可导致疾病症状的调节)。其障碍或症状的这样的减轻、预防或缓解可通过任何适宜的分析法测定。
实施方案的一个目的是寻找药物，如乳酸菌，包括其部分或代谢物，如存在于条件培养基中或从条件培养基中提取，其在例如特异性运动障碍和/或其它胃肠道疼痛障碍/疾病中，通过使用本文的基于药物对自发的和/或诱导的TRPV1活性的作用，适合于治疗、减轻、预防或调节胃肠道疼痛。
在一实施方案中，目的是选择益生菌菌株，如乳酸菌菌株，其可有效预防或减轻与人(特别是老年受试者或孕妇)的便秘有关的胃肠道疼痛。
在一实施方案中，目的是选择药物，例如乳酸菌菌株，其可有效预防或减轻与婴儿疝痛有关的胃肠道疼痛。
在一实施方案中，目的是选择药物，例如乳酸菌菌株，其可有效治疗、预防或减轻肠易激综合征(IBS)的胃肠道疼痛症状。
以下是实施方案的一些实施例，其并不意味着限制本文实施方案的用途，而是显示出本发明可如何应用的详细的实践实施例。实施例1涉及显示DSM 17938抑制肠系膜神经放电频率的肠系膜神经束实验。实施例2显示，DSM 17938阻断DRG原代培养物中辣椒碱-诱导的钙流入。实施例3证实DSM 17938抑制由胃胀诱导的心率减慢。
实施例
实施例1
肠系膜神经束实验
细胞外记录
成年雄性Swiss Webster小鼠(20-30 g)得自Charles River Laboratories(Wilmington, MA)。通过颈椎脱位处死小鼠。所有随后的程序都是离体的。
从刚处死的动物取出具有连接的肠系膜组织的远端空肠段(~2.5 cm)并放在Sylgard-包被的陪替氏培养皿中，所述培养皿填充有用卡波金(carbogen) (95 % O2 - 5% CO2)鼓泡通入的Krebs缓冲剂(单位mM)：118 NaCl、4.8 KCl、25 NaHCO3、1.0 NaH2PO4、1.2MgSO4、11.1葡萄糖和2.5 CaCl2。每段的口和肛门两端插入塑料管并排空。将组织固定于Sylgard，并暴露肠系膜神经束。将陪替氏培养皿放在倒置显微镜的镜台上并用氧处理的Krebs或含有添加剂的Krebs，以0.5-1 ml/min重力灌注腔(Perez-Burgos A., Wang B等.,American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304: G211-20)。用预热(34℃)的Krebs，以3-5 ml/min分别灌注浆膜室。神经束被轻轻地吸到连接到膜片钳电极夹持器的玻璃吸管中(CV-7B；Molecular Devices, Sunnyvale, CA)，和细胞外神经记录使用多夹具700B放大器和Digidata 1440A信号转换器(MolecularDevices)进行。电信号以0.1-2 kHz带通滤波，在20 kHz采样，并存储在运行pClamp 10软件的个人计算机上(Molecular Devices)。重复扩张段通过提高腔内压力在2 hPa以上制得。将48 hPa的恒重力压头应用于灌注腔的Krebs中并将通过关闭流出管1 min升高压力至最多3个连续的拉伸。允许所述段在各拉伸之间放松9 min。组成性多单位电活动(Constitutive multiunit electrical activity)在腔内正压的不存在下记录。
迷走神经切断术
膈下迷走神经切断术如前所述进行(van der Kleij H, O’Mahony C等. Americanjournal of physiology Regulatory, integrative and comparative physiology2008; 295: R1131-7)。使动物恢复10-14天，然后收获空肠和肠系膜组织用于电生理实验。在3只动物中进行假迷走神经切断术。手术后，每日测量小鼠的体重和一般健康状况。发明人发现没有证据显示在迷走神经切断的或者假-处理的动物中，手术后1周的体重增加有显著差异(数据未显示)。在每次实验后通过记录对缩胆囊肽(CCK)的浆膜应用的反应，测试所有的迷走神经切断的小鼠的手术完整性。当CCK不增加肠系膜神经放电速率时，迷走神经切断术才被认为是有效的(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal ofphysiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304:G211-20)。
药物和细菌
DSM 17938由BioGaia AB (Stockholm, Sweden)捐赠，而鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosu) JB-1得自McMaster大学的Brian-BodyInstitute (安大略，加拿大)的储备液。所有的程序都像以前报道的那样(Kunze WA, MaoYK等., Journal of cellular and molecular medicine 2009; 13: 2261-70, Ma X,Mao YK等., American journal of physiology Gastrointestinal and liverphysiology 2009; 296: G868-75, Wang B, Mao YK, FASEB杂志：美国实验协会联合会的官方出版物(FASEB journal: official publication of the Federation of AmericanSocieties for Experimental Biology) 2010;24:4078-88)。细菌数经光学测定，并检查在生长培养基琼脂平板平铺后的生存能力。从冷冻的储备液解冻细菌，以2000 rpm离心15min，并使颗粒悬浮在Krebs中，再次离心并重悬浮。使用前，用Krebs将细菌稀释至工作浓度。缩胆囊肽(25-33)硫酸盐(CCK)从AnaSpec (Fremont, CA)获得；尼卡地平、辣椒碱和6-碘代降二氢辣椒碱从Sigma-Aldrich获得，和ω-芋螺毒素GVIA (ω-Cg-GVIA)和ω-芋螺毒素MVIIC (ω-Cg-MVIIC)从Alomone Labs (Jerusalem, Israel)获得。使6-碘代降二氢辣椒碱和CCK溶于DMSO；使辣椒碱溶于乙醇以制备原液等分液。在实验当天，使等分液在Krebs中稀释至具有最终DMSO和乙醇浓度分别为≤ 0.01 %和≤ 0.1 %的工作浓度。
离线数据分析
使用Clampfit 10.2 (Molecular Devices)和Origin 8.5 (Northampton, MA)软件测量多-和单-单位自发的放电频率。多-和单-单位棘波记录通常被用来测定通过使肠道暴露于不同的刺激或药物诱导的肠系膜神经纤维放电速率的变化(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology2013; 304: G211-20)。多单位记录中的棘波的时间使用Clampfit峰值检测模块确定，和平均放电频率从棘波间的间隔计算。单-单位通过利用Clampfit的穗形模板检测工具的穗形匹配(计算机波形分析)，从多单位信号提取。运行模板检测算法后，单-单位棘波辨别总是通过目测检查，而弃去未匹配的棘波事件(<0.2 %) (Perez-Burgos A., Wang B等.,American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304: G211-20)。
统计学
数据表示为均数±SE，而N 指从多单位记录记录的空肠段总数，和n 指从多单位记录提取的单一纤维活动数。发明人从各多单位记录提取最多6个单-单位。Wilcoxon或未配对t检验分别用于配对或未配对数据比较；合适时，采用单-向和双向ANOVA与Bonferroni’s事后检验比较多组。因为自发活动的大的变化可在多单位神经系统活动中的一个准备和另一个之间发生，进行治疗记录前后比较的配对，其中每一个神经束用作其自身对照，以保证在各治疗或药物剂量中的显著变化。对以上基线频率对比辣椒碱浓度(在细菌的存在或不存在下)放电增加的百分率作图并用逻辑的剂量-反应方程[Y = 底 + (顶 – 底/1 +10LogEC50-X )]拟合。描述逻辑拟合的参数使用额外的平方和F检验进行比较。所有的统计学检验使用Prism软件5.0 (GraphPad software, San Diego, CA)进行。
DSM 17938对肠系膜神经自发的放电频率的影响
内腔DSM 17938影响肠系膜神经的自发性多单位放电(Perez-Burgos A., Wang B等.,American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304: G211-20)。1x109 cfu/ml管腔内DSM 17938引起自发的多单位放电频率降低22 %，即从36.3 ± 8.4降至28.2 ± 7.2 Hz (N = 7, P = 0.02, 图1A)；DSM 17938在1x108 cfu/ml时自发性放电变化19 %，即从21.6 ± 5.1降至17.6 ± 6 Hz (N = 6, P = 0.09, 图1B)。DSM 17938条件培养物(1:5)也降低自发性放电37 %，即从22.6 ± 4.2降至14.17 ±2.4 Hz (N= 7, P= 0.03, 图1C)。然而，γ–辐照的杀死的DSM 17938或肉汤单独并没有降低传入兴奋性：分别从17.84 ± 5.3至18.25 ± 4.1 Hz (N= 6, P= 0.84)，和从20.48 ±1.6至21.49 ± 2.8 Hz (N= 6, P= 0.10) (图1D-E)。
迷走神经切断术和肌肉麻痹不抑制由DSM 17938减少的肠系膜神经自发放电
发明人研究了DSM 17938 1x109 cfu/ml对自发性放电的影响是否被之前的迷走神经切断术废止。为控制DSM 17938对平滑肌细胞的可能的直接作用，发明人在此和在所有的自发性放电的后续实验中加入L-型Ca2+通道阻断剂尼卡地平(3μM)，其抑制肌肉收缩。因此，在迷走神经切断术和加入尼卡地平后，DSM 17938减少多单位放电频率达18 %，即从16.72 ±1.9降至13.77 ± 1.9 Hz (N = 17, P = 0.001, 图2A, 2C)。然后就单-单位放电速率分析来自迷走神经切断的动物和麻痹的肌肉的数据。DSM 17938减少单-单位放电频率达19%，即从0.36 ± 0.05降至0.29 ± 0.03 Hz (n = 30, P = 0.02, 图2B, 2C)；在这些纤维中，大多数(20/30)显示出36 %频率的降低，即从0.42 ± 0.06降至0.27 ± 0.04 Hz (P <0.0001)，但较小部分的剩余纤维增加它们的放电速率达29 %，即从0.24 ± 0.04增加至0.31 ± 0.06 Hz (n = 10/30, P = 0.006)。
DSM 17938通过TRPV1受体的不可克服的部分拮抗作用，减少脊髓单-单位放电频率和对辣椒碱的应答
发明人检验DSM 17938是否可在从先前迷走神经切断的小鼠取出的组织中，修改辣椒碱-诱导的对单-单位激发的放电频率增加。应用于浆膜室的辣椒碱以剂量依赖的方式增加自发的多-和单-单位放电速率，伴有~60秒的起始潜伏期。鉴于TRPV1辣椒碱敏感的受体脱敏，和激动剂的后续应用可能会引起减少的作用，发明人检查各空肠段对一系列辣椒碱剂量(100 nM-100μM)的应答。发明人在腔内应用DSM 17938 1x109 cfu/ml (对于每条曲线N=25，5段/每一浓度；对每一段分析~6个脊髓单-单位)之前20 min这样做或不在之前20 min这样做。对放电频率对比辣椒碱浓度或辣椒碱加DSM 17938浓度的百分比增加作图并用形式Y =底 + (顶-底)/(1+10LogEC50-X)的3-参数逻辑方程拟合。对于单独辣椒碱的EC50是200nM，与之对比的是在DSM 17938的存在下，对于辣椒碱的EC50是500 nM (P = 0.71)。用辣椒碱获得的最大应答(顶)是238.4 ± 27.5 %，而与之对比的是用辣椒碱加DSM 17938获得的应答是129 ± 17 % (P = 0.004, 图3A)。与以前的报告一致，一些脊髓纤维不被辣椒碱激发。发明人检验了辣椒碱是否直接激发脊髓纤维，或激发是否取决于从肠神经元至神经节内脊髓末梢的壁内突触传递。在通过加入各500 nM的Ca2+阻断剂ω-Cg-GVIA和ω-Cg-MVIIC，阻断壁内突触传递后，发明人将1μM辣椒碱加入浆膜室。壁内突触阻断没有减少辣椒碱-诱导的激发，其在芋螺毒素的不存在下是187.5 ± 42.9 % (n = 17)，而在它们的存在下是219.1 ± 72.6 (n = 12) (P = 0.947, 图3B)。发明人得出结论是DSM 17938对脊髓传入神经的作用不涉及壁内的突触传递。
含DSM 17938细菌释放产物的DSM 17938条件培养物的效果减少辣椒碱对脊髓纤维的作用
发明人检验了DSM 17938细菌产物是否构成对肠系膜传入神经的TRPV1拮抗作用的基础。鉴于DSM 17938-诱导的减少自发放电频率的百分比在有和没有前述迷走神经切断术的情况下是非常类似的(分别为18 %对比22 %)，在肠系膜传入神经中的DSM 17938靶主要是脊髓纤维；然后，发明人应用1 μM辣椒碱于非-迷走神经切断的肠系膜纤维，其接收先前的DSM 17938条件培养物的腔内应用20 min。DSM 17938条件培养物(1:5)抑制辣椒碱-诱导的对肠系膜单一纤维的放电频率增加(%)，即从187.5 ± 43 % (对照组，N= 17)至74.89 ±22 % (N= 14)，并类似于用1×109 cfu/ml DSM 17938处理的、在脊髓纤维上由辣椒碱诱导的百分比增加(80.29 ± 22 %, N= 17) (P= 0.02, 单向ANOVA检验；图7)。
DSM 17938或TRPV1拮抗作用减少膨胀-诱导的放电
在使肌肉收缩的尼卡地平的不存在下，发明人记录了被认为是伤害感受器的纤维的多-和单-单位放电频率(Grundy D, Gut 2004; 53 Suppl 2: ii5-8)。发明人检验了DSM17938是否可减少通过提高腔内压力至伤害感受强度48 hPa (36 mmHg)诱导的它们的兴奋性应答(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiologyGastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20)。这些纤维对肠道膨胀的首次反应通常高于随后膨胀获得的反应，但对至多3次另外的膨胀维持稳定(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiology Gastrointestinal andliver physiology 2013; 304: G211-20)。因此，发明人使用3个连续膨胀的第二个用于比较。在膨胀期间多单位放电是111.5 ± 16.7 Hz，但加入DSM 17938 20 min后，膨胀增加放电至仅仅86.5 ± 10.6 Hz (N = 5, P = 0.31)。在膨胀期间脊髓单-单位放电频率是3.01± 0.44 Hz，但在DSM 17938的存在下，在膨胀期间放电是1.71 ± 0.16 (n = 28, P =0.008, 图4A)。对于对照对比加入的DSM 17938，前-膨胀放电频率是0.31 ± 0.05对比0.25 ± 0.07 Hz (n = 28, P = 0.053, 图4A)。TRPV1拮抗剂6-碘代降二氢辣椒碱(10μM)通过降低对膨胀的应答从3.26 ± 0.73至2.23 ± 0.50 Hz，模拟DSM 17938对单-单位应答的影响(n = 13, P = 0.0002, Wilcoxon检验, 图4B，在尼卡地平的不存在下)。
实施例2
DSM 17938阻断在DRG神经元原代培养物中由辣椒碱诱导的Ca2+升高
背根神经节(DRG)原代培养物
从身体移出脊柱，转移至含有冰冷的Krebs的烧杯中，并纵向切成两半。暴露DRG并从胸腰椎水平收集。全部DRG用无菌Leibovitz’s L-15培养基(GIBCO, Gaithersburg, MD)洗涤两次，并在1型胶原酶(按1 mg/ml) (Sigma-Aldrich；Oakville, ON, Canada)和0.5 ml胰蛋白酶(0.25 %, GIBCO)的20 ml L-15中于37℃温育40 min。在进一步加入含10 %胎牛血清的5 ml L-15 (FBS, GIBCO)后，将神经节(ganglia)以1,000 rpm离心5 min，然后用生长培养基(L-15, 含10 % FBS、1 %青霉素/链霉素/谷氨酰胺、1 % HEPES和1 %丙酮酸钠)洗涤两次。将DRG放在2 ml生长培养基中并研磨10次。然后将神经节以500 rpm离心10 s并将上清液转移至无菌管中。使它们再悬浮于2 ml生长培养基中，重复研磨直至转移的上清液体积是10 ml，以1,000 rpm离心5 min，并使最终的沉淀再悬浮于3 ml生长培养基中。将神经元平铺到3块涂布有聚-d-赖氨酸的玻璃底陪替氏培养皿(MatTek, Ashland, MA)上。在30min后，将另外1.5 ml生长培养基加入到各培养皿中并全部于37℃用卡波金(carbogen)培养24 h。
Ca2+成像
于37℃，将DRG神经元放置在一个有机玻璃的记录培养皿中并装载在Krebs中用0.1 %普流罗尼克酸(pluronic acid) (在DMSO中)稀释的Ca2+指示剂Fluo-4-AM (8μM) 60 min。将培养皿放进记录室并用新鲜的Krebs (~34℃)灌注15 min以使染料被洗掉。细胞在倒置显微镜(Nikon eclipse TE 2000-S, Melville, NY)下观察并使用Rolera-XR照相机(Surrey, BC, Canada)成像。各神经元中的荧光强度通过简单PCI 6软件(Compix Inc,Imaging systems, Sewickley, PA)记录。经由附接于电子控制压力脉冲发出器的微吸液管(Picospritzer II；General Valve, Fairfield, NJ) (自细胞的尖嘴<100μm)递送药物。图像，以0.9帧/秒记录，存储在本地硬盘驱动器上。使用图像J软件(NIH, USA, http:// imagej.nih.gov/ij)，离线分析图像文件。当应用辣椒碱时，Fluo-4 Ca2+的增加被测定为在辣椒碱之后(F)的荧光强度除以辣椒碱之前(F0)的强度的比率(F/F0)。细菌和药物如在实施例1中所述处理。
结果
通过检测细菌抑制TRPV1受体激动剂辣椒碱的反应的能力，进一步研究DSM 17938对脊髓神经元的作用的特异性。在这些实验中，也包括JB-1。JB-1 (鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus))先前已显示减轻疼痛和由胃胀诱导的DRG单一纤维的放电(Duncker等.，Journal of Nutrition 2011)。因为TRPV1通道的开放升高细胞内Ca2+浓度，发明人使用DRG神经元原代培养物的Ca2+成像用于这些实验。在~30 s内，将1μM辣椒碱喷到DRG神经元诱导细胞内Ca2+的增加(图5A)。因为TRPV1通道可用反复的配体暴露来脱敏，发明人仅应用辣椒碱于各培养皿一次。发明人在应用辣椒碱之前30 min加入DSM17938或者JB-1。1x109 cfu/ml的DSM 17938降低荧光升高率从2.36 ± 0.31 (对照组，N =14)至1.25 ± 0.04 F/F0。但1x108 cfu/ml DSM 17938改变F/F0至2.67 ± 0.35和1x108.5cfu/ml DSM 17938改变F/F0至2.07 ± 0.27。加入1×109 cfu/ml的JB-1具有极少的作用并改变F/F0比率至2.48 ± 0.19 (N= 9)，其类似于用辣椒碱单独获得的比率(图5B)。这些结果证实，DSM 17938可阻断由辣椒碱诱导的在DRG神经元原代培养物中的Ca2+升高。
实施例3
DSM 17938抑制由胃胀诱导的心率减慢
将总共17只大鼠分配到2个组。一旦到达，使大鼠适应1周，接着处理1周(10 min/d)，以在实验期间尽量减少紧张效应。用在Krebs中的0.2 ml (1x109 cfu/ml)活DSM 17938或者仅用作为对照(媒介)的Krebs，于每天早晨管饲大鼠9天。用于GD的方法先前已经公开(Tougas, Wang, American Journal of Physiology 1999;277:R272-8)。简言之，使大鼠禁食过夜，用盐酸氯胺酮(ketamine hydrochloride) (75 mg/kg体重)和甲苯噻嗪(xylazine) (10 mg/kg体重)的混合物经腹膜内给予麻醉。必要时给予补充麻醉。中线剖腹术后，由一个附接于聚四氟乙烯导管(20 cm)的球形胃气球(2-cm i.d.)组成的膨胀装置通过十二指肠近端的小切口被插入到胃中并连接到恒压系统(Distender, G&J Electronic,Toronto, Canada)。测定心响应，同时用空气充气气球至40和60 mm Hg压力达60秒。每次膨胀后允许10分钟的休息以便恢复。只有一套膨胀应用于每只大鼠，以避免可能的补偿机制并在获得意识之前，经测量后处死大鼠。通过由施加于左和右肩和右后腿的3针电极组成的体表心电图进行心率的连续记录。将信号放大，并使用商业数据采集程序(Experimenter’sWorkbench, DataWave Technologies, Loveland, CO)记录在个人电脑上。在每次膨胀之前、期间和之后测定心率60 s，总共180 s。由于水平麻醉的变化，在每次膨胀前允许校正心率(HR)记录的可能的基线变化，并确保任何心率响应都可能与膨胀有关。为控制GD随着时间推移的效果，数据被表示为使用在膨胀期间10 s (10、20、30、40、50和60 s)时间段记录的平均HR，从静息HR (100 % =静息)获得的平均变化。在每次膨胀(40和60 mm Hg)的60 s期间，使用在相同组的所有大鼠中的平均HR改变(静息HR的百分率)比较各组。细菌和药物如在实施例1中所述处理。
结果
由40 mm Hg诱导的心率降低不受管饲DSM 17938的改变(P = 0.121, 图6A) (N = 8和9，分别用媒介和DSM 17938)。具有60 mm Hg的膨胀在10 s内降低心率，这在膨胀期间持续30 s (图6B)。在检测之前用DSM 17938管饲9 d调节响应至60 mm Hg (P = 0.028，未配对t-检验，图6A, 6B)。对于胃胀压力为40或60 mm Hg，在用媒介或DSM 17938处理的动物之间，胃依从性(容量/压力)没有不同(数据未显示)。这些结果证实通过细菌的抗伤害感受作用。

Claims (31)

1.一种选择用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的药物的方法，所述方法包括：
选择能够减少自发的和/或诱导的瞬时受体电位香草素1 (TRPV1)激活作用的药物。
2.依据权利要求1的方法，其中选择所述药物包括选择能够在所述受试者中减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的药物。
3.依据权利要求1或2的方法，其还包括：
使表达TRPV1的细胞与待测的药物接触；
在所述细胞与待测的所述药物接触后，测定所述细胞的自发的和/或诱导的TRPV1激活作用；和
比较所述测定的自发的和/或诱导的TPRV1激活作用与对照TPRV1激活作用，其中选择所述药物包括，如果所述测定的自发的和/或诱导的TPRV1激活作用低于所述对照TPRV1激活作用，则选择待测的所述药物作为有效减轻或预防胃肠道疼痛的药物。
4. 依据权利要求3的方法，其还包括：
在所述细胞与待测的所述药物接触之前，测定所述细胞的自发的和/或诱导的TPRV1激活作用；和
在所述细胞与待测的所述药物接触之前，基于在所述细胞中测定的所述自发的和/或诱导的TPRV1激活作用，测定所述对照TPRV1激活作用。
5.依据权利要求3的方法，其还包括：
通过在未与待测的所述药物接触的表达TRPV1的细胞中测定自发的和/或诱导的TRPV1激活作用，测定所述对照TRPV1激活作用。
6.依据权利要求3-5的任一项的方法，其中接触所述细胞包括使背根神经节(DRG)、神经元或CaCo2细胞与待测的所述药物接触。
7.依据权利要求3-6的任一项的方法，其中测定所述自发的和/或诱导的TRPV1激活作用包括测定在通过辣椒碱、pH变化和/或热诱导的所述细胞中的Ca2+流入。
8. 依据权利要求3-6的任一项的方法，其中测定所述自发的和/或诱导的TRPV1激活作用包括测定所述细胞的温度门控离子通道活性。
9.依据权利要求1或2的方法，其还包括
使具有连接的肠系膜组织的离体胃肠道段与待测的药物接触；
在所述离体胃肠道段与待测的所述药物接触后，在所述离体胃肠道段中测定自发的和/或诱导的肠系膜传入放电；和
比较所述自发的和/或诱导的测量的肠系膜传入放电与对照肠系膜传入放电，其中选择所述药物包括，如果所述测定的自发的和/或诱导的肠系膜传入放电低于所述对照肠系膜传入放电，则选择待测的所述药物作为有效减轻或预防胃肠道疼痛的药物。
10.依据权利要求9的方法，其中接触所述离体胃肠道段包括使具有连接的肠系膜组织的离体结肠或空肠段与待测的所述药物接触。
11.依据权利要求1-10的任一项的方法，其中选择所述药物包括选择能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的细菌菌株。
12.依据权利要求11的方法，其中选择所述药物包括选择能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的乳酸菌菌株。
13.依据权利要求1-10的任一项的方法，其中选择所述药物包括选择来自能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的细菌菌株的条件培养物。
14.依据权利要求13的方法，其中选择所述药物包括选择来自能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的乳酸菌菌株的条件培养物。
15. 依据权利要求12或14的方法，其中所述乳酸菌菌株是能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用的路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。
16.依据权利要求1-15的任一项的方法，其中所述受试者患有引起所述受试者的所述胃肠道疼痛的肠道运动障碍。
17.依据权利要求1-16的任一项的方法，其中所述受试者患有选自引起所述受试者的所述胃肠道疼痛的疝痛、肠易激综合征和便秘的疾病。
18.依据权利要求1-17的任一项的方法，其中选择所述药物包括选择能够减少自发的和/或诱导的TRPV1激活作用和能够调节胃肠道运动和/或混合的药物。
19.一种通过依据权利要求1-18的任一项的选择方法可获得的药物，其用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛。
20.依据权利要求19的应用的药物，其中所述药物是细菌菌株。
21.依据权利要求20的应用的药物，其中所述药物是乳酸菌菌株。
22.依据权利要求19的应用的药物，其中所述药物是来自细菌菌株的条件培养物。
23.依据权利要求22的应用的药物，其中所述药物是来自乳酸菌菌株的条件培养物。
24. 依据权利要求21或23的应用的药物，其中所述乳酸菌菌株是路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。
25.一种组合物，其包含通过依据权利要求1-18的任一项的选择方法可获得的药物和至少一种另外的组分，所述组分选自药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、食品、食物补充剂和另一种预防剂或治疗剂，用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛。
26.依据权利要求25的应用的组合物，其中所述组合物包括所述另一种预防剂或治疗剂，其中所述另一种预防剂或治疗剂能够调节所述受试者的胃肠道运动和/或混合。
27. 依据权利要求19-26的任一项的应用的药物或组合物，其中所述药物是路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) DSM 17938或来自路氏乳杆菌DSM 17938的条件培养物。
28.通过依据权利要求1-18的任一项的选择方法可获得的药物或包含所述药物和至少一种另外的组分的组合物在制备用于减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的药物、食物产品或食物补充剂产品中的用途，所述另外的组分选自药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、食品、食物补充剂和另一种预防剂或治疗剂。
29. 依据权利要求28的用途，其中所述药物是路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) DSM17938或来自路氏乳杆菌DSM 17938的条件培养物。
30.一种减轻或预防受试者的胃肠道疼痛的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的通过依据权利要求1-18的任一项的选择方法可获得的药物或包含所述药物和至少一种另外的组分的组合物，所述另外的组分选自药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、食品、食物补充剂和另一种预防剂或治疗剂。
31. 依据权利要求30的方法，其中所述药物是路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) DSM 17938或来自路氏乳杆菌DSM 17938的条件培养物。
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