BR112016016969B1 - Método para selecionar um agente para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo, uso de uma cepa bacteriana ou meio condicionado de dita cepa bacteriana, e, uso de uma composição - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA SELECIONAR UM AGENTE PARA USO NA REDUÇÃO OU PREVENÇÃO DA DOR GASTROINTESTINAL EM UM INDIVÍDUO, CEPA BACTERIANA OU MEIO CONDICIONADO DE DITA CEPA BACTERIANA, COMPOSIÇÃO, E, USO DE UMA CEP A BACTERIANA OU MEIO CONDICIONADO DE DITA CEPA BACTERIANA. As presentes modalidades se referem à seleção de agentes eficazes na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo. Um tal agente é selecionado e identificado se o mesmo for capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida do receptor transitório potencial vaniloide 1 (TRPV1).

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere primariamente à modulação da dor gastrointestinal e em particular à seleção de agentes, tais como bactérias do Ácido Lático, capazes de modular a dor gastrointestinal e ao uso de tais agentes.

FUNDAMENTOS

[002] Dor gastrointestinal é um sintoma de muitas condições, doenças e distúrbios associados com o trato gastrointestinal. A dor abdominal funcional se refere à dor abdominal recorrente. A vasta maioria dos pacientes com dor abdominal recorrente tem dor “funcional” ou “não orgânica”, significando que a dor não é causada pelas anormalidades físicas. Vários distúrbios de motilidade também estão associados com a dor e constipação ou diarreia. O termo é usado para descrever uma variedade de distúrbios em que o intestino não se desenvolveu adequadamente ou perdeu a sua capacidade para coordenar a atividade muscular devido a várias causas.

[003] Tais distúrbios podem se manifestar em uma variedade de modos, e incluem, mas não são limitados aos seguintes: • Distensão abdominal • Obstrução recorrente • Dor abdominal relativa à cólica • Constipação • Doença do refluxo gastresofágico • Vômito intratável, recorrente • Diarreia • Síndrome do intestino irritável (IBS) • Doença inflamatória intestinal • Incontinência fecal • Cólica infantil • Dor abdominal frequente recorrente (FRAP) • Regurgitação • Intolerância alimentar

[004] Em um sentido amplo, qualquer alteração significante no trânsito de alimentos e secreções no trato digestivo pode ser considerada um distúrbio de motilidade intestinal e este é o tipo de distúrbio que é frequentemente associado com a dor gastrointestinal.

[005] Os movimentos coordenados apropriados do estômago e intestinos são requeridos para digerir e empurrar os conteúdos intestinais ao longo do trato digestivo. Os padrões de contração e relaxação necessários para a motilidade apropriada do trato gastrointestinal (GI) são complexos e usam os nervos e músculos dentro das paredes GI. Diariamente, em qualquer tempo, muitos fatores podem influencia a motilidade GI, por exemplo, exercício físico e angústia emocional. As crianças recém-nascidas têm que desenvolver o sistema complexo da motilidade no trato GI. A motilidade gastrointestinal disfuncional é frequentemente associada com a dor GI.

[006] O envelhecimento, demência, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, lesões da medula espinhal, dilaceração retal durante o nascimento, diabete, complicações cirúrgicas e distúrbios neuromusculares, por exemplo, miastenia grave, podem causar distúrbios de motilidade que estão associados com a dor.

[007] A síndrome do intestino irritável (IBS), um distúrbio habitualmente diagnosticado de motilidade intestinal e dor GI, foi considerada uma doença do cólon por décadas, mas pesquisas sobre a motilidade GI demonstraram que as perturbações de motilidade subjacentes podem ocorrer também no intestino delgado. IBS frequentemente pode ser acompanhado pela dor GI e a imunorreatividade de TRPV1 foi mostrada ser acentuadamente aumentada em pacientes com IBS (Akbar, Yiangou et al, Gut 2008).

[008] A constipação, frequentemente associada com a dor GI, é a queixa digestiva mais comum nos Estados Unidos, mas a despeito da sua frequência, frequentemente permanecem não reconhecidos até que o paciente desenvolve distúrbios secundários, tais como distúrbios anorretais ou doença diverticular. Como anteriormente mencionados, a dor GI é um sintoma comum de constipação.

[009] A constipação é bastante comum durante a gravidez. As contrações musculares que normalmente movem o alimento através dos intestinos diminuem por causa dos níveis mais altos da progesterona hormonal e possivelmente ferro extra tomado coo vitamina pré-natal. Isto é frequentemente também acompanhado pela dor abdominal inferior.

[0010] A constipação também está associada com a idade aumentada e o chamado “intestino envelhecido” habitualmente encontrado especialmente nas pessoas acima dos 70 anos e nas instituições de cuidado crônico.

[0011] Na outra extremidade do espectro de envelhecimento distúrbios de motilidade intestinal, o choro persistente ou excessivo da cólica infantil é um dos problemas mais angustiante da infância. A mesma é angustiante para a criança, para os pais, e para os profissionais de cuidado de saúde envolvidos. A dor cólica frequentemente começa e para abruptamente.

[0012] A hipermotilidade intestinal secundária a um desequilíbrio autonômico presumido também foi proposto como uma etiologia para a cólica. Muitos dos mecanismos que regulam a atividade motora são imaturos nas crianças. A imaturidade destes mecanismos pode resultar na vulnerabilidade aumentada para a intolerância alimentar. Assim, a cólica pode ser uma manifestação clínica comum na subpopulação de crianças que tenham disfunção maturacional em um ou mais dos aspectos de regulagem da motilidade e frequentemente levando à dor GI para a criança.

[0013] Os distúrbios de motilidade intestinal se aplicam às contrações intestinal anormal frequentemente associados com a dor GI, existem muitos tipos diferentes de tratamentos e recomendações para os distúrbios diferentes, alguns que funcionam melhor do que muitos outros.

[0014] Assim existe uma necessidade global e problemas específicos para solucionar quanto a vários distúrbios de motilidade e distúrbios de dor a saber: Como melhor selecionar os agentes para prevenir ou reduzir a dor gastrointestinal?

[0015] O receptor transitório potencial vaniloide 1 (TRPV1) é um canal catiônico de permeação de Ca2+expresso por exemplo, no sistema nervoso periférico (PNS), no sistema nervoso central (CNS), no sistema respiratório e no trato gastrointestinal. O TRPV1 é ativado pelos estímulos físicos e químicos, por exemplo, temperatura, mudança de pH e capsaicina, e é crítico para a detecção de dor inflamatória nociceptiva e térmica. No trato gastrointestinal, a imunorreatividade de TRPV1 por exemplo, pode ser encontrada nos aferentes sensoriais viscerais e as células de TRPV1 transmitem por exemplo, sensação de dor gástrica para os centros superiores do cérebro. O TRPV1 é considerado estar envolvido em várias condições gastrointestinais que estão associadas com as sensações de dor e a imunorreatividade de TRPV1 foi mostrada ser acentuadamente aumentada por exemplo, em IBS (Akbar, Yiangou et al, Gut 2008). Como um exemplo disto, pacientes diagnosticados com doença inflamatória intestinal ativa demonstram uma imunorreatividade de TRPV1 enormemente aumentada nas fibras de nervo colônico (Wang, Miyares e Ahern, 2005 J. Physiol.).

[0016] Embora o TRPV1 seja considerado ser um alvo potencial para o desenvolvimento de drogas para tratar modalidades diferentes de dor, a expressão amplamente difundida do receptor pode resultar em eventos adversos limitando o uso de antagonistas de TRPV1 sistêmicos no tratamento da dor gastrointestinal. Em particular, antagonizar o receptor levaria potencialmente às complicações cardiovasculares como um resultado da liberação de peptídeo vasoativo diminuída.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0017] É um objetivo geral encontrar agentes adequados para reduzir ou prevenir dor gastrointestinal.

[0018] É um objetivo particular fornecer um método para selecionar agentes, preferivelmente cepas bacterianas e mais preferivelmente Bactérias do Ácido Láctico, eficazes na redução ou prevenção da dor gastrointestinal.

[0019] Estes e outros objetivos são atingidos pelas modalidades como aqui divulgadas.

[0020] Um aspecto das modalidades se refere a um método para selecionar um agente eficaz na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo. O método compreende selecionar um agente capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida do receptor transitório potencial vaniloide 1 (TRPV1).

[0021] Um outro aspecto das modalidades se refere a um agente selecionado pelo método identificado acima.

[0022] Um outro aspecto das modalidades se refere a um agente obtenível pelo método de seleção identificado acima para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo.

[0023] Já um outro aspecto das modalidades se refere a uma composição compreendendo um agente obtenível pelo método de seleção identificado acima e pelo menos um componente adicional selecionado de um grupo consistindo em um carreador farmaceuticamente aceitável, um diluente farmaceuticamente aceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável, um gênero alimentício, um suplemento alimentar e um outro agente preventivo ou terapêutico.

[0024] Um aspecto relacionado das modalidades define um agente como definido acima ou uma composição como definido acima para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo.

[0025] Um outro aspecto relacionado das modalidades define o uso de um agente obtenível pelo método de seleção identificado acima ou como definido acima ou uma composição como definido acima para a fabricação de uma droga, um produto alimentício ou um produto de suplemento alimentar para a redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo.

[0026] Já um outro aspecto das modalidades se refere a um método de redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo. O método compreende administrar uma quantidade eficaz de um agente obtenível pelo método de seleção identificado acima ou como definido acima ou uma composição como definida acima para o indivíduo.

[0027] As presentes modalidades fornecem uma tecnologia eficiente que podem ser usadas para selecionar ou identificar agentes, em particular cepas bacterianas, tais como bactérias de Ácido Lático, que pode ser usado para reduzir ou prevenir a dor gastrointestinal nos indivíduos, preferivelmente indivíduos humanos, que sofrem de um distúrbio ou doença que causam ou estão associados com dor gastrointestinal.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0028] As modalidades, junto com outros objetivos e vantagens das mesmas, podem ser melhor entendidas fazendo-se referência à seguinte descrição quando junto com as figuras anexas, em que: a Figura 1 mostra o disparo espontâneo de unidade múltipla mesentérica depois da adição de 1 x 108unidades (cfu)/ml de DSM 17938 (a), 1 x 109cfu/ml de DSM 17938 (B), meio condicionado em DSM 17938 diluído (1:5) (C), 1 x 109 cfu/ml de DSM 17938 Y-irradiado (D), e meio diluído sozinho (1:5) (E) (testes de Wilcoxon).

[0029] A Figura 2 mostra efeitos de DSM 17938 sobre a taxa de disparo espontâneo de aferentes espinhais. A) Taxa de disparo de unidade múltipla diminuída quando 1 x 109cfu/ml de DSM 17938 foram adicionados ao lúmen (teste de Wilcoxon). B) Painel esquerdo, o disparo de unidade única espinhal foi reduzido pelo DSM 17938 (teste de Wilcoxon). C) Painéis superiores, traços representativos de descarga de unidade múltipla espontânea antes e depois da adição de DSM 17938; painéis inferiores, formas de onda sobrepostas de uma unidade única que ocorreu nos tempos marcados por “0” nos traços superiores.

[0030] A Figura 3 mostra que DSM 17938 antagonizou a resposta excitatória de fibras espinhais pela adição de capsaicina ao superperfusado seroso. A) A curva de dose-resposta de capsaicina de 113 unidades únicas individuais espinhais foi plotada (•) e ajustada com uma equação logística de três parâmetros, EC50 = 200 nM. Max = 238 ± 27%; com 116 fibras adicionais uma curva de dose-resposta para a capsaicina na presença de l x 109 cfu/ml de DSM 17938 foi adicionalmente plotada (¦) e ajustada com a mesma equação logística, para a qual EC50 = 500 nM e Max = 129 ± 17% (P= 0,7 e P= 0,004 para diferenças na EC50 e Max respectivamente, teste F da soma dos quadrados extra). B) Sumário de plotagens de dispersão com meios e SEMs mostrando como as respostas de unidade única variaram com doses crescentes de capsaicina na ausência ou presença de 1 x 109cfu/ml de DSM. (n) indica a proporção de unidades únicas para cada grupo.

[0031] A Figura 4 mostra que DSM 17938 ou um antagonista de TRPV1 reduzem a resposta excitatória evocada pela distensão em unidades únicas espinhais. A) Os gráficos de dispersão mostrando que adicionar 1 x 109 de DSM 17938 ao lúmen reduziu o aumento na taxa de disparo na unidade única espinhal evocado pela elevação da pressão intraluminal para 48 hPa. B) A adição de 10 µM do antagonista de TRPV1 6-Iodonordi-hidrocapsaicina ao lúmen imitou o efeito de adicionar DSM 17938 (testes de Wilcoxon).

[0032] A Figura 5 mostra que DSM 17938 reduziu a elevação de Ca2+ evocada pela capsaicina nos somas neuronais dos gânglios da raiz dorsal. A) 1 µM de capsaicina evocou um aumento na entrada de Ca2+nos neurônios DRG que foram dependentes da dose diminuída pelo DSM 17938 intraluminal e não afetada por 1 x 109cfu/ml de JB-1. B) Sumário da plotagem mostrando como a razão (F/F0) da fluorescência de Ca2+máxima (F) evocada pela capsaicina para a fluorescência de Ca2+da linha de base (F0) variou com a concentração de DSM 17938 ou JB-1. (valores P, teste das comparações múltiplas de Bonferroni).

[0033] A Figura 6 mostra que a alimentação de 9 dias com DSM 17938 reduziu a bradicardia evocada pela distensão gástrica. A) Sumário de valores para as diminuições percentuais na frequência cardíaca no repouso evocada por 40 e 60 mmHg de distensão gástrica (valores P, testes t não emparelhados). B) Sumário das plotagens mostrando como a frequência cardíaca no repouso mudou com o tempo em resposta a 60 mmHg de distensão gástrica. (P = 0,01, teste ANOVA de duas vias).

[0034] A Figura 7 mostra que a diminuição induzida pelo DSM 17938 das ações excitatórias da capsaicina sobre os aferentes espinhais foi imitada pelo meio condicionado em DSM 17938. O sumário da plotagem mostrando o aumento da frequência de disparo de fibras espinhais unitárias únicas induzido por 1 µM de capsaicina nas condições de controle, com meio condicionado com DSM 17938 (1:5) ou com l x 109cfu/ml de DSM 17938 (P = 0,02, teste de ANOVA de uma via; valores P post-hoc, teste das comparações múltiplas de Holm-Sidak).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0035] Para facilitar o entendimento da invenção, vários termos são definidos abaixo.

[0036] “Dor gastrointestinal”, também aludida como dor GI, indica dor no sistema gastrointestinal de um indivíduo. Tal dor gastrointestinal é frequentemente causada por ou é associada com, isto é, é um sintoma de ou um componente de indisposição de, várias doenças e distúrbios, tipicamente do sistema gastrointestinal. A dor gastrointestinal inclui dor geral no sistema gastrointestinal, frequentemente indicada por dor gastrointestinal geral na técnica, dor associada com distúrbios de motilidade intestinal, dor de doenças inflamatórias intestinais e síndrome do intestino irritável, dor gástrica, dor abdominal geral, dor visceral, dor abdominal funcional, dor abdominal recorrente frequente e dor em outros distúrbios gastrointestinais funcionais.

[0037] “Dor abdominal funcional” se refere à dor abdominal recorrente. A vasta maioria de pacientes com dor abdominal recorrente têm dor “funcional” ou “não orgânica”, significando que a dor não é causada pelas anormalidades físicas.

[0038] “Distúrbios de motilidade intestinal” é usado para descrever uma variedade de distúrbios em que o intestino não se desenvolveu apropriadamente ou perdeu a sua capacidade para coordenar a atividade muscular devido a várias causas. Tais distúrbios podem se manifestar em uma variedade de modos, e incluem, mas não são limitadas aos seguintes: Distensão abdominal • Obstrução recorrente • Dor cólica abdominal • Constipação • Doença do refluxo gastresofágico • Vômito intratável, recorrente • Diarreia • Síndrome do intestino irritável (IBS) • Doença inflamatória intestinal • Incontinência fecal • Cólica infantil • Dor abdominal recorrente frequente (FRAP) • Regurgitação • Intolerância alimentar

[0039] Em um sentido amplo, qualquer alteração significante no trânsito de alimentos e secreções no trato digestivo pode ser considerada um distúrbio de motilidade intestinal e este está frequentemente associado com dor gastrointestinal.

[0040] “Dor gástrica” é um termo coletivo usado para descrever dor ou desconforto no abdômen superior.

[0041] Em uma modalidade, a causa da dor gástrica é selecionada do grupo compreendendo, tal como consistindo em, dispepsia não ulcerativa, úlcera péptica, doença do refluxo gastresofágico e gastrite.

[0042] Em uma modalidade particular, a causa da dor gástrica é a dispepsia não ulcerativa e/ou gastrite.

[0043] Como aqui usado o termo “frequência de disparo” é usado para medir os trens de espínula sensorial para o cérebro.

[0044] Como aqui usado o termo “pressão de pico intraluminal” (PPr) está fundamentado com base nos registros de pressão intraluminal, onde as mudanças de pressão intraluminal são medidos no ponto intermediário do eixo longitudinal do segmento intestinal. O sinal de pressão é analisado e a pressão de pico intraluminal (PPr) é identificada e medida.

[0045] Como aqui usado o termo “frequência do complexo motor migratório” (frequência de MMC) é calculado contando-se o número de faixas MC escuras nos mapas espaço-temporais.

[0046] Como aqui usado o termo “velocidade do complexo motor migratório” (velocidade de MMC) é medida a partir de inclinação(ões) de cada faixa no mapa espaço-temporal gerado pelos complexos motores migratórios.

[0047] Como aqui usado o termo “agente” é usado para significar qualquer substância ou material incluindo células inteiras; micro-organismos; meio condicionado; proteínas, peptídeos, enzimas, e/ou moléculas derivadas de um tal meio condicionado; proteínas, peptídeos, enzimas e/ou moléculas secretadas ou derivadas de células inteiras ou micro-organismos; ou outro material biológico ou químico que possa ser usado para modular a dor gastrointestinal no sistema gastrointestinal de um mamífero. Um exemplo de agentes preferidos são cepas bacterianas, por exemplo, cepas bacterianas probióticas, e em particular cepas bacterianas do Ácido Láctico. Um outro exemplo de agente preferido é um meio condicionado de cepas bacterianas, por exemplo, cepas bacterianas probióticas, e em particular cepas bacterianas do Ácido Láctico.

[0048] Um meio condicionado, algumas vezes também aludido como meio de cultura condicionado, é um meio (cultura) em que as células foram cultivadas por um período de tempo. As células cultivadas no meio “condicionam” o meio pela liberação ou secreção de vários componentes ou moléculas, tais como proteínas, peptídeos, enzimas, citocinas, quimiocinas, produtos químicos, etc.

[0049] Está começando a ser aceito que os micro-organismos intestinais sinalizam para o cérebro como parte do chamado eixo microbioma- intestino-cérebro. Entretanto, muito pouco é conhecido acerca do papel do microbioma intestinal no desenvolvimento ou função do sistema nervoso. Presentemente apenas pouco é conhecido acerca da natureza quantitativa do sinal nervoso restabelecido do intestino para o sistema nervoso central.

[0050] Os neurônios sensoriais únicos, incluindo aqueles entre as fibras do vago, representam estímulos físicos contínuos como trens de espínula padronizados que codificam a natureza e intensidade do estímulo. Além disto, os estímulos podem ser representados em um código de população determinado pelo número de fibras ativas no feixe. Toda a informação que atinge o cérebro por intermédio dos aferentes primários tem que ser codificada na linguagem de trens de espínula neuronal. Portanto, sabendo como os trens de espínula sensorial são afetados pelos vários agentes, tais como comensais, cepas probióticas e substâncias diferentes, nos permite identificar novos micro-organismos intestinais benéficos e as suas moléculas ativas por seus efeitos sobre o disparo aferente primária assim como novas drogas e outros compostos que em várias maneiras podem intervir neste sistema de sinalização, particularmente pela ativação dos moduladores de TRPV1.

[0051] O método das modalidades aqui é utilizado para selecionar um agente para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal pela inibição da sinalização através do receptor de TRPV1. O método das modalidades deste modo pode ser usado para avaliar agentes que potencialmente seriam eficazes na prevenção da dor gastrointestinal e/ou eficaz na redução, inibição ou tratamento da dor gastrointestinal. Assim, o método pode ser usado para identificar agentes eficazes capazes de modular a dor gastrointestinal associada com o sistema periférico (entérico) e/ou o sistema nervoso central.

[0052] Assim, um aspecto das modalidades se refere a um método para selecionar um agente eficaz na, isto é, para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo. O método compreende selecionar um agente capaz de reduzir a ativação do receptor transitório potencial vaniloide 1 (TRPV1) espontâneo e/ou induzido.

[0053] As modalidades são deste modo fundamentadas com base no uso do caminho de sinalização de TRPV1 como uma ferramenta de seleção na identificação de agentes que são eficazes em moduladores, na prevenção ou redução particulares, tais como inibição ou tratamento, da dor gastrointestinal em indivíduos que sofrem de doenças ou distúrbios envolvendo ou causando tal dor gastrointestinal e que seria indicada por doenças ou distúrbios com dor gastrointestinal.

[0054] O método das modalidades é tipicamente realizado in vitro ou ex vivo como é ainda aqui divulgado. Entretanto, o agente é preferivelmente capaz de redução da ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 no indivíduo quando administrado ao indivíduo.

[0055] O método das modalidades pode, assim, ser usado para encontrar agentes adequados para a redução ou prevenção da dor gastrointestinal em diferentes distúrbios e doenças com dor gastrointestinal. Agentes são escolhidos para afetar a ativação de TRPV1 do indivíduo em um modo benéfico de modo a modular, isto é, preferivelmente prevenir, reduzir ou tratar a dor gastrointestinal.

[0056] Em uma modalidade, o distúrbio ou doença associados com dor gastrointestinal a serem prevenidos ou tratados com um agente selecionado pelo método é um distúrbio ou doença com dor gastrointestinal.

[0057] Em uma modalidade, a dor gastrointestinal é dor gástrica.

[0058] Em uma modalidade, a dor gastrointestinal é dor visceral.

[0059] Em uma modalidade, a dor gastrointestinal pode estar presente em um indivíduo que sofre de cólica.

[0060] Em uma modalidade, a dor gastrointestinal pode estar presente em um indivíduo que sofre da síndrome do intestino irritável (IBS).

[0061] Em uma modalidade, a dor gastrointestinal pode estar presente em um indivíduo que sofre de constipação. A dor gastrointestinal pode estar presente em indivíduos que sofrem de distúrbios de motilidade intestinal como definido no precedente.

[0062] Assim, em uma modalidade o indivíduo está sofrendo de um distúrbio de motilidade intestinal com dor gastrointestinal associada.

[0063] O método das modalidades está fundamentado na descoberta inesperada de que a dor gastrointestinal incluindo a dor associada com condições e distúrbios diferentes tais como distúrbios de motilidade, e central ou perifericamente manifestados, estão conectados com a ativação de TRPV1, que pode ser modulado pelos agentes anteriormente desconhecidos, tais como bactérias do Ácido Láctico.

[0064] Um tipo de dor gastrointestinal é a dor visceral que resulta da ativação de nociceptores da víscera abdominal (órgãos). As estruturas viscerais são altamente sensíveis à distensão (estiramento), isquemia e inflamação, mas relativamente insensível a outros estímulos que normalmente evocam a dor. A dor visceral é difusa, difícil de localizar e frequentemente aludida como uma estrutura distante, usualmente superficial. A mesma pode ser acompanhada pelos sintomas tais como náusea, vômito, mudanças nos sinais vitais assim como manifestações emocionais. A dor pode ser descrita como nauseante, profunda, de compressão, e indistinta. As lesões estruturais distintas ou anormalidades bioquímicas explicam este tipo de dor em apenas uma proporção de pacientes. Estas doenças são algumas vezes agrupadas sob doenças neuromusculares gastrointestinais (GINMD). As pessoas também podem experimentar dores viscerais, frequentemente muito intensas por natureza, sem qualquer evidência de razões estruturais, bioquímicas ou histopatológicas para tais sintomas.

[0065] Um nociceptor é um receptor sensorial que responde para potencialmente danificar estímulos pelo envio de potenciais de ação aos neurônios nociceptivos específicos (M ou C) que transmitem para os tratos anterolaterais da medula espinhal (mais uma projeção vagal menor) e depois para o tálamo, e prosencéfalo incluindo os córtices insular e cingulado. Crítico para a percepção da dor que se origina na patologia intestinal é a ativação de mensagens de dor do intestino para o sistema nervoso central por intermédio de fibras aferentes primárias extrínsecas que viajam nos feixes de nervo aferente mesentérico.

[0066] O método pode ser usado para triar agentes de modo a selecionar agentes com propriedades desejadas, por exemplo, redução na ativação de TRPV1, para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal. O parâmetro a ser medido no método, isto é, ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1, pode ser monitorada e determinada em modelos e sistemas diferentes. Usando esta informação, um perfil pode ser obtido útil para a definição dos efeitos detalhados e potencialmente nuançados que agentes específicos têm sobre a sinalização da dor na dor gastrointestinal.

[0067] Outros parâmetros que podem ser medidos no método incluem sinalização de dor geral, atividade de disparo de nervo, por exemplo, análise de feixe de nervo mesentérico, e possivelmente usando modelos in vivo diferentes de dor gastrointestinal.

[0068] Em uma modalidade, a ativação de TRPV1 é medida em células expressando TRPV1, tal como neurônios de gânglio da raiz dorsal (DRG), células CaCo2 ou uma outra linhagem de célula epitelial intestinal humana padrão. Tanto a ativação de TRPV1 espontânea quanto a ativação de TRPV1 depois da indução por exemplo, pela capsaicina, a mudança de pH ou temperatura pode ser medida. Geralmente, qualquer célula ou tecido que expressa TRPV1 pode ser usada para medir a ativação de TRPV1 de acordo com as modalidades.

[0069] Assim, em uma modalidade o método compreende contactar uma célula que expressa TRPV1 com um agente a ser testado. O método também compreende medir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 na célula a seguir, isto é, depois, de contactar a célula com o agente a ser testado. O método compreende ainda comparar a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 medida com uma ativação de TRPV1 de controle. Nesta modalidade, o método compreende ainda selecionar o agente a ser testado como um agente eficaz na redução ou prevenção da dor gastrointestinal se a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 medida é mais baixa do que a ativação de TRPV1 de controle.

[0070] A ativação de TPRV1 de controle pode ser determinada de acordo com várias modalidades. Por exemplo, a ativação de TRPV1 pode ser predefinida e determinada a partir de células que expressam TRPV1 com um nível de ativação que representa a ativação normal ou de linha de base correspondendo a por exemplo, substancialmente nenhuma dor gastrointestinal.

[0071] Entretanto, uma modalidade preferida de determinar a ativação de TRPV1 de controle é usar a célula que expressa TRPV1 como um controle interno. Consequentemente, em uma modalidade o método compreende medir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 na célula antes de contactar a célula com o agente a ser testado. O método também compreende determinar a ativação de TRPV1 de controle com base na ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 medida na célula antes de contactar a célula com o agente a ser testado.

[0072] Neste método, as medições da ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 são, portanto, preferivelmente realizadas duas vezes: antes de contactar a célula com o agente a ser testado e a seguir contactar a célula com o agente a ser testado.

[0073] Alternativamente, as medições da ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 podem ser realizadas em dois experimentos paralelos: um experimento onde uma célula é contactada com o agente a ser testado e um experimento de controle onde uma célula não é contactada com o agente. As células usadas nos dois experimentos são depois do mesmo tipo, tal como ambos os neurônios DRG, células CaCo2 ou uma outra linhagem de célula epitelial intestinal humana padrão. A ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 é medida em ambos os experimentos e depois comparados entre si.

[0074] A célula a ser usada no método pode ser qualquer célula expressando TRPV1 incluindo, mas não limitada, às preparações ex vivo, linhagens de célula expressando TRPV1, tais como linhagens de célula epitelial intestinal humana expressando TRPV1, e células primárias expressando TRPV1.

[0075] A ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 medida e a ativação de TRPV1 de controle geralmente podem ser expressas como um respectivo valor de parâmetro ou métrica, incluindo um valor representando o nível de ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1.

[0076] Em uma modalidade, as células primárias tais como por exemplo, neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) são usados para analisar a ativação de TRPV1.

[0077] Em uma outra modalidade, as linhagens de célula que expressam TRPV1 tais como CaCo2 ou uma outra linhagem de célula epitelial intestinal humana padrão são usadas para analisar a ativação de TRPV1.

[0078] Em outras modalidades, as linhagens de célula que expressam TRPV1 comercialmente disponíveis são usadas para analisar a ativação de TRPV1, ver por exemplo, cat: no CT6105 da Chantest.

[0079] Também é possível usar células de gene repórter, também designadas células repórter na técnica, que podem ser usadas para monitorar e medir a expressão de TRPV1 e/ou ativação de TRPV 1 espontânea e/ou induzida.

[0080] Vários métodos diferentes podem ser usados para estudar a ativação de TRPV1, incluindo, mas não limitadas à análise funcional usando por exemplo, influxo de cálcio induzido por exemplo, pela capsaicina e/ou a sua prevenção por um agente em células que expressam TRPV1 e frequências de disparo de feixes de nervo mesentérico, espontânea e/ou induzida por exemplo, pela capsaicina. Em uma outra modalidade, a avaliação funcional da atividade de canal iônico ativado pela temperatura usando uma máquina de PCR em tempo real, como descrito em Reubish, Emerling et al., BioTechniques 2009, pode ser usado para analisar a ativação de TRPV1. Em uma outra modalidade, camundongos repórter para o canal TRPV1 pode ser usado para investigar a ativação de TRPV1. Vários paradigmas in vivo também podem ser usados para analisar efeitos sobre a dor na invenção. Estes métodos incluem por exemplo, distensão gástrica e efeitos sobre a frequência cardíaca (ver o Exemplo 3) e modelos de distensão colorretal.

[0081] Consequentemente, em uma modalidade, o método compreende medir o influxo de Ca2+na célula induzida pela capsaicina ou uma outra substância capaz de induzir a ativação de TRPV1, por exemplo, um análogo de capsaicina ou outras substâncias capazes de ativar TRPV1. Também expor a célula às condições físicas selecionadas pode ser usado para induzir a ativação de TRPV1, incluindo a mudança do pH ou temperatura. Assim, expor a célula ao pH ácido, pH básico e/ou calor (temperaturas elevadas, tipicamente acima de cerca de 42°C) pode induzir a ativação de TRPV1. Nesta modalidade, o influxo de Ca2+na célula que expressa TRPV1 é deste modo usado como um parâmetro representando a ativação de TRPV1. Uma redução na ativação de TRPV1, e em particular uma redução na ativação de TRPV1 induzida pelo pH, induzida por calor e/ou induzida por capsaicina, pode ser depois medida como uma redução no influxo de Ca2+. Em uma outra modalidade, o método compreende medir a atividade do canal iônico ativado pela temperatura na célula. Nesta modalidade, a atividade do canal iônico ativado pela temperatura na célula que expressa TRPV1 é usada como um parâmetro representando a ativação de TRPV1. A atividade do canal iônico ativado pela temperatura pode ser espontânea ou induzida, tal como induzida pela temperatura aumentada. Uma redução na ativação de TRPV1 pode ser depois medida como uma redução na atividade do canal iônico ativado pela temperatura na célula.

[0082] Em uma modalidade, a ativação de TRPV1 é medida usando experimentos de feixe de nervo aferente mesentérico. Assim, um outro parâmetro que pode ser medido é a frequência de disparo espontâneo e/ou induzido, por exemplo, pela capsaicina, mudança de pH ou calor de feixes de nervo aferente mesentérico. Esta técnica pode ser usada para determinar mudanças na excitabilidade das fibras do nervo mesentérico induzidas pelos diferentes agentes a serem testados. Em uma modalidade, um segmento gastrointestinal é excisado com ou sem a arcada mesentérica contendo o feixe de nervo que fornece o segmento composto de fibras tanto espinhal quanto vagal para os registros de feixe de nervo ex vivo (ver o Exemplo 1).

[0083] Em algumas modalidades, a especificidade regional do trato gastrointestinal é de importância. Segmentos apropriados para a análise de nervo mesentérico do método preferivelmente compreende um feixe de nervo apropriado para permitir a medição do disparo de nervo aferente mesentérico. Isto pode ser convenientemente fornecido tendo-se um segmento gastrointestinal com tecido mesentérico ligado (ver o Exemplo 1). Assim, esta modalidade é convenientemente realizada nos segmentos ex vivo de um animal experimental apropriado, por exemplo nos segmentos gastrointestinais de camundongo (por exemplo, o cólon de camundongo ou segmentos do jejuno). A capacidade para realizar uma comparação do efeito de um agente sobre o intestino delgado versus o grosso seria vantajosa, particularmente como, dependendo do distúrbio de motilidade intestinal a ser tratado e do estágio clínico e sintomas do mesmo, um tratamento que fosse específico da região, por exemplo, específico para o intestino delgado ou grosso seria benéfico.

[0084] Em uma modalidade o tráfico espinhal do nervo mesentérico aferente é analisado quanto às partes específicas e selecionadas do intestino. Foi surpreendentemente descoberto que agentes diferentes, tais como as bactérias do Ácido Láctico, pode influenciar ou modular os sistemas de sinalização da dor gastrointestinal em uma parte, mas não em uma outra parte do trato GI, e por intermédio de caminhos nervosos diferentes tais como vagal ou para a dor visceral através do gânglio da raiz dorsal.

[0085] Assim, em uma modalidade o método compreende contactar um segmento gastrointestinal ex vivo com tecido mesentérico ligado com um agente a ser testado. O método também compreende medir o disparo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido no segmento gastrointestinal ex vivo a seguir do contato do segmento gastrointestinal ex vivo com o agente a ser testado. O método compreende ainda comparar o disparo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido medido com um disparo aferente mesentérico de controle. Nesta modalidade, o método compreende ainda selecionar o agente a ser testado como um agente eficaz na redução ou prevenção da dor gastrointestinal se o disparo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido medido é mais baixo do que o disparo aferente mesentérico de controle.

[0086] O disparo aferente mesentérico de controle pode ser determinado como debatido no precedente usando o segmento gastrointestinal ex vivo como um controle interno. Em tal caso, o método compreende medir o disparo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido no segmento gastrointestinal ex vivo antes de contactar o segmento gastrointestinal ex vivo com o agente a ser testado. O método também compreende determinar o disparo aferente mesentérico de controle com base no disparo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido medido no segmento gastrointestinal ex vivo antes de contactar o segmento gastrointestinal ex vivo com o agente a ser testado.

[0087] Alternativamente, dois experimentos paralelos podem ser conduzidos. Em um de um segmento gastrointestinal ex vivoé contactado com o agente a ser testado e no outro um, experimento de controle, um segmento gastrointestinal ex vivonão é contactado com o agente. O disparo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido é medido em ambos os experimentos e comparados entre si.

[0088] Analisar um ou mais destes parâmetros acima resultará em um método de selecionar agentes eficazes na redução ou prevenção da dor gastrointestinal.

[0089] Em uma modalidade particular, o segmento gastrointestinal ex vivoé selecionado de um segmento colônico ou jejunal ex vivo. Em tal caso, o método compreende contactar um segmento colônico ou jejunal ex vivo com tecido mesentérico ligado com o agente a ser testado.

[0090] Os exemplos de métodos e aparelho apropriados para analisar a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 são descritos nos Exemplos e Figuras.

[0091] Assim, em métodos preferidos, a análise apresentada fornecerá dados dobre a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1. A análise de um ou vários destes parâmetros resultará em um método preferido para selecionar agentes eficazes na redução e/ou prevenção da dor gastrointestinal.

[0092] O método das modalidades, assim, pode ser usado para descobrir agentes adequados para o tratamento, prevenção e/ou redução da dor gastrointestinal, usando-se o modelo aqui.

[0093] O método apresentado fornecerá dados sobre a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 usando modelos diferentes. Analisar este parâmetro resultará em um método de selecionar quanto a agentes eficazes na redução ou prevenção da dor gastrointestinal.

[0094] Em uma modalidade, o método analisa o efeito de um agente sobre a ativação de TRPV1 (espontânea e/ou induzida por exemplo, pela capsaicina, mudança de pH e/ou calor e a sua prevenção por um agente) e pode assim ser usado como uma leitura para a sinalização da dor gastrointestinal, isto é, se um agente é provável de ter um efeito sobre a dor gastrointestinal, por exemplo, a dor visceral ou não. Um aumento ou nenhum efeito significante na atividade de TRPV1 espontânea ou induzida (por exemplo, pela capsaicina, mudança de pH e/ou calor) são indicativos de um agente que é provável resultar em um aumento na dor gastrointestinal, ou nenhum efeito significante sobre a dor gastrointestinal, respectivamente, ao passo que uma diminuição na atividade de TRPV1 espontânea e/ou induzida (por exemplo, pela capsaicina, mudança de pH e/ou calor) é indicativo de um agente que reduzirá a dor gastrointestinal. Os agentes preferidos são assim aqueles que resultam em uma diminuição na atividade TRPV1 espontânea e/ou induzida (por exemplo, pela capsaicina).

[0095] Em uma outra modalidade o método analisa o efeito de um agente sobre a atividade de TRPV1 analisando-se o disparo de nervo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido (por exemplo, pela capsaicina, mudança de pH e/ou calor) (sinalização de dor) e assim pode ser usado como uma leitura para a dor gastrointestinal, isto é, se um agente é provável ter um efeito sobre a dor gastrointestinal, por exemplo, dor visceral ou não. Um aumento ou nenhum efeito significante sobre o disparo de nervo aferente é indicativo de um agente que é provável resultar em um aumento na dor gastrointestinal, ou nenhum efeito significante sobre a dor gastrointestinal, respectivamente, ao passo que uma diminuição no disparo de nervo aferente é indicativo de um agente que reduzirá a dor gastrointestinal. Os agentes preferidos são assim aqueles que resultam em uma diminuição no disparo de nervo aferente, por exemplo, uma diminuição na frequência de disparo espontâneo e/ou induzido dos feixes de nervo aferente.

[0096] O agente a ser testado é adicionado ao sistema escolhido para a análise da atividade de TRPV1 em qualquer maneira apropriada. De modo a analisar o efeito do agente sobre a sinalização da dor, os métodos são convenientemente realizados na presença e na ausência do agente. Por exemplo, a etapa do método é realizada antes e depois que o agente é aplicado. Assim, em tais métodos o efeito do agente é comparado a um controle apropriado, por exemplo os resultados na presença do agente de teste são comparados com os resultados na ausência de um agente de teste, por exemplo, resultados apenas com tampão como oposto ao tampão mais agente.

[0097] Os inventores surpreendentemente descobriram que certas cepas de Bactérias do Ácido Láctico, por exemplo, DSM 17938, podem reduzir a ativação de TRPV1 em modelos ex vivo e in vitro diferentes (ver os Exemplos 1 e 2). Consequentemente, em uma modalidade preferida o agente é uma cepa bacteriana, mais preferivelmente uma das bactérias do Ácido Láctico. Assim, o método das modalidades pode ser vantajosamente usado para testar várias bactérias do Ácido Láctico de modo a identificar e selecionar uma ou mais cepas bacterianas do Ácido Láctico que são eficazes na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo como determinado pelo método em termos de serem capazes de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1.

[0098] Um outro aspecto das modalidades é um agente selecionado pelo método das modalidades, isto é, obtenível pelo método de seleção.

[0099] Um agente preferido é um micro-organismo, mais preferivelmente uma cepa bacteriana, preferivelmente uma das bactérias do Ácido Láctico, incluindo partes ou metabólitos das mesmas.

[00100] Um outro agente preferido é um meio condicionado de um tal micro-organismo.

[00101] Um aspecto relacionado das modalidades define um agente obtenível pelo método de seleção das modalidades para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo.

[00102] Em uma modalidade particular, o agente é obtenível pelo método de seleção das modalidades para ser capaz de reduzir a ativação de RPTV1 espontânea e/ou induzida para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo.

[00103] Em uma modalidade, para a redução ou prevenção da dor gastrointestinal um agente será selecionado que preferivelmente atua para diminuir a sinalização da dor como avaliado monitorando-se o efeito do agente sobre a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1. Um tal agente preferivelmente atuará para reduzir ou diminuir a ativação de TRPV1 em neurônios DRG, ou outras células ou tecido que expressam TRPV1. Preferivelmente o agente atuará para reduzir a atividade de TRPV1 espontânea e/ou induzida (por exemplo, pela capsaicina, mudança de pH e/ou calor) usando sistemas ou modelos in vitro diferentes incluindo, mas não limitados às células primárias e linhagens de célula que expressam o receptor de TRPV1 como anteriormente debatido.

[00104] Em uma modalidade, um agente será selecionado que preferivelmente atua para reduzir ou diminuir a ativação de TRPV1 nos feixes de nervo aferente mesentérico. O agente atuará para reduzir as frequências de disparo espontâneo e/ou induzido (por exemplo, pela capsaicina, mudança de pH e/ou calor) de feixes de nervo aferente mesentérico.

[00105] Está claro a partir do acima que o método das modalidades também pode ser usado para selecionar ou identificar agentes que não são apropriados para o tratamento da dor gastrointestinal, por exemplo agentes que não têm um efeito benéfico sobre a redução da sinalização da dor. Em particular aqueles agentes que não apresentam nenhum efeito sobre este parâmetro são improváveis de serem adequados para a redução ou prevenção da dor gastrointestinal. Além disso, aqueles agentes que têm um efeito de aumentar a sinalização da dor como medida por um aumento na atividade de TRPV1 espontânea e/ou induzida são improváveis de serem adequados para a redução ou prevenção da dor gastrointestinal.

[00106] Um outro aspecto das modalidades se refere a uma composição compreendendo um agente selecionado pelo método das modalidades e pelo menos um componente adicional. Assim pelo menos um componente adicional é preferivelmente selecionado de um grupo consistindo em um carreador farmaceuticamente aceitável, um diluente farmaceuticamente aceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável, um gênero alimentício, um suplemento alimentar e um outro agente preventivo ou terapêutico.

[00107] Assim, uma modalidade se refere a uma composição compreendendo um agente obtenível pelo método de seleção das modalidades e pelo menos um componente adicional selecionado de um grupo consistindo em um carreador farmaceuticamente aceitável, um diluente farmaceuticamente aceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável, um gênero alimentício, um suplemento alimentar e um outro agente preventivo ou terapêutico para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo.

[00108] O pelo menos um componente adicional pode ser administrado junto com o agente selecionado de acordo com as modalidades ou pode ser administrado separadamente. Além disso, o pelo menos um componente adicional pode ser administrado ao mesmo tempo como o agente selecionado de acordo com as modalidades ou em pontos de tempo diferentes. Os regimes e cronometragens de administração adequados podem ser facilmente determinados pela pessoa habilitada dependendo do componente adicional em questão.

[00109] Em uma modalidade, o pelo menos um componente adicional é qualquer componente nutricional apropriado, por exemplo, um gênero alimentício ou um suplemento alimentar.

[00110] Em uma modalidade, o outro agente preventivo ou terapêutico pode ser qualquer outro agente, que seja útil na prevenção ou redução, tal como tratamento, da dor gastrointestinal em questão.

[00111] Em uma outra modalidade, o outro agente preventivo ou terapêutico é um agente capaz de afetar a motilidade e/ou mistura gastrointestinal. O outro agente preventivo ou terapêutico é depois preferivelmente capaz de modular (aumentar ou reduzir, dependendo da condição a ser tratada como é conhecida na técnica e descrita abaixo) a motilidade e/ou mistura gastrointestinais.

[00112] Em uma outra modalidade, o agente das modalidades pode ter funções duplas, isto é, ter função tanto sobre a dor gastrointestinal quanto a motilidade e/ou mistura gastrointestinal.

[00113] O agente selecionado de acordo com as presentes modalidades com o propósito de ser eficaz na redução ou prevenção da dor gastrointestinal também pode ser submetido a uma outra ou análise adicional ou método de seleção com o propósito de determinar se o agente é adicionalmente eficaz nos moduladores da motilidade e/ou mistura gastrointestinais. Um tal agente pode ser interessante usar para a prevenção ou tratamento por exemplo, de distúrbios de motilidade visto que o mesmo trata tanto a dor gastrointestinal quanto a alteração na motilidade em conjunção. Os modos de analisar a motilidade e/ou mistura são conhecidos na técnica. Os parâmetros a serem analisados incluem, mas não são limitados à frequência de MMC, velocidade de MMC, pressão intraluminal tal como PPr e outros modelos funcionais.

[00114] Nas análises de motilidade, mudanças na motilidade gastrointestinal induzida por um agente pode ser detectada por exemplo, como uma alteração no padrão de motilidade ou amplitudes de contração. Alguns agentes absolutamente não terão nenhum efeito. Um agente que possa aumentar a motilidade gastrointestinal, por exemplo aumentando-se a frequência de MMC e/ou velocidade de MMC e/ou a pressão intraluminal tal como PPr provavelmente será útil para tratar distúrbios associados com a dor gastrointestinal em que seria vantajoso aumentar a motilidade propulsiva ao longo do tubo digestivo tal como constipação e cólica.

[00115] Alternativamente, se por exemplo, o distúrbio de motilidade intestinal para o tratamento é um em que é desejado aumentar o tempo de trânsito de material através do intestino, por exemplo, distúrbios envolvendo o trânsito de passagem rápida, tal como IBS ou diarreia, então um agente de interesse além dos seus efeitos sobre a modulação da dor gastrointestinal atuará para diminuir motilidade gastrointestinal, por exemplo pela diminuição da frequência de MMC ou velocidade de MMC ou pressão intraluminal, por exemplo, PPr. Os agentes preferidos diminuirão pelo menos a velocidade de MMC. Os agentes preferidos diminuirão dois ou mais destes parâmetros, por exemplo diminuirão a velocidade de MMC e a frequência de MMC ou diminuirão a frequência de MMC e a pressão intraluminal (por exemplo, PPr) ou diminuirão a velocidade de MMC e a pressão intraluminal (por exemplo, PPr). Os agentes mais preferidos diminuirão todos destes parâmetros, por exemplo diminuirão a frequência de MMC, a velocidade de MMC e a pressão intraluminal (por exemplo, PPr). A análise de motilidade pode ser avaliada em um segmento gastrointestinal apropriado do intestino delgado ou grosso, por exemplo um segmento jejunal para o intestino pequeno ou um segmento de cólon para o intestino grosso. Em algumas modalidades, o uso de segmentos do intestino grosso, por exemplo, do cólon, é preferido.

[00116] Um outro aspecto das modalidades se refere a um agente selecionado pelo método das modalidades ou uma composição como definida acima para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo.

[00117] Um aspecto relacionado das modalidades define o uso de um agente selecionado pelo método das modalidades, por exemplo, obtenível pelo método de seleção de acordo com as modalidades, ou uma composição como definida acima para a fabricação de um medicamento, um produto alimentício ou um produto de suplemento alimentar para a redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo.

[00118] Um outro aspecto relacionado das modalidades define um método de redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo. O método compreende administrar uma quantidade eficaz de um agente selecionado pelo método das modalidades, por exemplo, obtenível pelo método de seleção de acordo com as modalidades, ou uma composição como definida acima ao indivíduo.

[00119] Em uma modalidade destes aspectos, o agente é uma cepa bacteriana, preferivelmente uma cepa bacteriana do Ácido Láctico e mais preferivelmente uma cepa de Lactobacillus reuteri, tal como uma cepa bacteriana capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1, preferivelmente uma cepa bacteriana do Ácido Láctico capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 e mais preferivelmente uma cepa de Lactobacillus reuteri capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1.

[00120] Em uma modalidade destes aspectos, o agente é preferivelmente Lactobacillus reuteri DSM 17938. Em outra modalidade, o agente é uma outra cepa bacteriana do Ácido Láctico, isto é, o agente é uma cepa bacteriana de outra que não a DSM 17938 de Lactobacillus reuteri, preferivelmente uma cepa de Lactobacillus reuteri outra que não a DSM 17938 de Lactobacillus reuteri.

[00121] Em uma modalidade destes aspectos, o agente é um meio condicionado de uma cepa bacteriana, preferivelmente de uma cepa bacteriana do Ácido Láctico e mais preferivelmente de uma cepa de Lactobacillus reuteri, tal como um meio condicionado de uma cepa bacteriana capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1, preferivelmente de uma cepa bacteriana do Ácido Láctico capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 e mais preferivelmente de uma cepa de Lactobacillus reuteri capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1.

[00122] Em uma modalidade, o agente é um meio condicionado de cepas bacterianas do Ácido Láctico, preferivelmente da DSM 17938 de Lactobacillus reuteri ou uma cepa de Lactobacillus reuteri outra que não a DSM 17938 de Lactobacillus reuteri. O meio usado para tal meio condicionado pode ser qualquer meio apropriado para cultivar cepas bacterianas do Ácido Láctico conhecido na técnica. Em uma modalidade, o meio MRS (de Man, Rogosa & Sharpe) é usado como material de partida para produzir meio condicionado de cepas bacterianas do Ácido Láctico, preferivelmente da DSM 17938 de Lactobacillus reuteri. Em uma modalidade da invenção, o meio condicionado de cepas bacterianas do Ácido Láctico, preferivelmente da DSM 17938 de Lactobacillus reuteri, é seco por congelamento antes de ser introduzido ou usado como uma composição.

[00123] Em uma outra modalidade, um ou vários componentes do meio condicionado de cepas bacterianas do Ácido Láctico, preferivelmente da DSM 17938 de Lactobacillus reuteri, são isolados e administrados como componentes purificados e/ou enriquecidos a um indivíduo na forma de uma composição adequada. Os exemplos de tais componentes incluem proteínas, peptídeos, enzimas e outras moléculas preferivelmente secretadas da cepa bacteriana do Ácido Láctico no meio. Também tais componentes extraídos diretamente das cepas bacterianas do Ácido Láctico podem ser usados de acordo com as modalidades.

[00124] Um modo apropriado de administração e formulação do agente ou composição, é escolhido dependendo do local da doença. Um modo preferido de administração é oral, entretanto, igualmente para alguns tratamentos a injeção intravenosa ou intramuscular será apropriada.

[00125] As doses apropriadas do agente ou composição podem ser facilmente escolhidas ou determinadas por uma pessoa habilitada dependendo do distúrbio a ser tratado, do modo de administração e da formulação envolvida.

[00126] Em uma modalidade, o receptor de TRPV1 é modulado localmente, por exemplo, usando-se as bactérias de Ácido Láctico peroralmente administradas que podem modular a ativação de TRPV1 seletivamente no trato GI, em um indivíduo que sofre de dor gastrointestinal e minimizando deste modo quaisquer efeitos adversos no dito indivíduo. Acredita-se que esta via de administração preferida do agente, em particular uma cepa bacteriana do Ácido Láctico selecionada pelo método das modalidades, afetará principalmente a ativação de TRPV1 localmente, isto é, dentro do sistema gastrointestinal. Assim, o agente depois terá um efeito benéfico na prevenção ou redução da dor gastrointestinal enquanto minimiza qualquer modulação de TRPV1 indesejada fora do sistema gastrointestinal.

[00127] Nos métodos e usos das presentes modalidades aqui descritas, os termos “aumentar”, “diminuir”, “reduzir”, etc., se referem a uma mudança mensurável nos níveis, preferivelmente uma mudança significante nos níveis, mais preferivelmente uma mudança estatisticamente significante, preferivelmente com um valor de probabilidade de <0,05.

[00128] Os indivíduos preferidos são mamíferos, mais preferivelmente seres humanos.

[00129] Onde o distúrbio de motilidade intestinal associado com dor gastrointestinal a ser tratado é constipação então os indivíduos preferidos são pacientes idosos ou mulheres grávidas. Um paciente idoso geralmente será entendido ser um paciente na idade de 70 ou acima.

[00130] Onde o distúrbio de motilidade intestinal associado com dor gastrointestinal a ser tratado é cólica, preferivelmente esta é cólica infantil.

[00131] Os usos dos agentes, preferivelmente cepas bacterianas do Ácido Láctico, selecionados de acordo com o método das modalidades incluem a redução, prevenção ou alívio do distúrbio relevante ou sintomas do distúrbio (por exemplo, pode resultar na modulação de sintomas da doença). Tal redução, prevenção ou alívio de um distúrbio ou sintomas do mesmo podem ser medidos por qualquer ensaio apropriado.

[00132] É um objetivo de uma modalidade descobrir agentes, tais como Bactérias do Ácido Láctico, incluindo partes ou metabólitos dos mesmos, tais como presentes ou extraídos de um meio condicionado, adequados para o tratamento, redução, prevenção ou modulação da dor gastrointestinal por exemplo, nos distúrbios de motilidade específicos e/ou outros distúrbios/doenças com dor gastrointestinal, usando-se o modelo aqui com base no efeito do agente sobre a atividade de TRPV1 espontânea e/ou induzida.

[00133] Em uma modalidade o objetivo é selecionar uma cepa bacteriana probiótica, tal como cepa bacteriana do Ácido Láctico, que pode ser eficaz na prevenção ou redução da dor gastrointestinal associada com constipação nos seres humanos, especialmente indivíduos idosos ou mulheres grávidas.

[00134] Em uma modalidade, o objetivo é selecionar um agente, por exemplo uma cepa bacteriana do Ácido Láctico, que possa ser eficaz na prevenção ou redução da dor gastrointestinal associada com a cólica infantil.

[00135] Em uma modalidade o objetivo é selecionar um agente, por exemplo uma cepa bacteriana do Ácido Láctico, que possa ser eficaz no tratamento, prevenção ou redução de sintomas da dor gastrointestinal da Síndrome do Intestino Irritável (IBS).

[00136] Os seguintes são alguns exemplos das modalidades, que não são intencionadas a serem limitantes do uso das modalidades aqui mas apresentam exemplos práticos em detalhes de como a invenção pode ser usada. O Exemplo 1 se refere a um experimento de feixe de nervo mesentérico mostrando que a DSM 17938 inibe a frequência de disparo do nervo mesentérico. O Exemplo 2 mostra que a DSM 17938 bloqueia o influxo de cálcio induzido pela capsaicina em culturas primárias de DRG. O Exemplo 3 demonstra que a DSM 17938 inibe a diminuição da frequência cardíaca evocada pela distensão gástrica.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Experimentos com feixe de nervo mesentérico Registros extracelulares

[00137] Camundongos Swiss Webster machos adultos (20 a 30 g) foram adquiridos da Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Os camundongos foram mortos pelo deslocamento cervical. Todos os procedimentos subsequentes foram ex vivo.

[00138] Os segmentos do jejuno distal (~2,5 cm) com tecido mesentérico ligado foram removidos de animais recém mortos e colocados em uma placa de Petri revestida com Silgard enchida com tampão de Krebs (em mM): 118 de NaCl, 4,8 de KCl, 25 de NaHCO3, 1,0 de NaH2PO4, 1,2 de MgSO4, 11,1 de glicose, e 2,5 de CaCl2 borbulhado com carbogênio (95% de O2 - 5% de CO2). As extremidades oral e anal de cada segmento foram canuladas com tubo plástico e esvaziadas. O tecido foi preso ao Silgard, e o feixe de nervo mesentérico exposto. A placa de Petri foi colocada no estágio de um microscópio invertido e o lúmen perfusado por gravidade de 0,5 a 1 ml/min com Krebs oxigenado ou Krebs com aditivos (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20). O compartimento seroso foi separadamente perfusado com Krebs pré-aquecido (34°C) de 3 a 5 ml/min. O feixe de nervo foi suavemente sugado dentro de uma pipeta de vidro ligada a um suporte de eletrodo de clampe de contato (CV-7B; Molecular Devices, Sunnyvale, CA), e os registros do nervo extracelular feitos usando um amplificador MultiClamp 700B e conversor de sinal Digidata 1440A (Molecular Devices). Os sinais elétricos foram filtrados com passagem de faixa de 0,1 a 2 kHz, amostrados a 20 kHz, e armazenados em um computador pessoal rodando o software pClamp 10 (Molecular Devices). Distensões repetidas dos segmentos foram feitas elevando-se a pressão intraluminal acima de 2 hPa. Uma espínula de pressão de gravidade constante de 48 hPa foi aplicada ao Krebs perfusando o lúmen e a pressão elevada fechando-se o tubo de saída de fluxo por 1 min para um máximo de 3 distensões consecutivas. Os segmentos foram deixados repousar por 9 min entre as distensões. A atividade elétrica de unidade múltipla constitutiva foi registrada na ausência de pressão intraluminal positiva.

Vagotomia

[00139] A vagotomia subdiafragmática foi realizada como anteriormente descrita (van der Kleij H, O’Mahony C et al. American journal of physiology Regulatory, integrative and comparative physiology 2008; 295: R1131-7). Os animais foram deixados recuperar durante 10 a 14 dias antes de colher o jejuno e tecido mesentérico para experimentos eletrofisiológicos. Vagotomias simuladas foram realizadas em 3 animais. Pós operativamente, o peso corporal e a saúde geral dos camundongos foram medidos diariamente. Não encontramos nenhuma evidência de diferenças significantes no ganho de peso 1 semana após a cirurgia nos animais vagotomizados ou tratados simulado (dados não mostrados). Todos os camundongos vagotomizados foram testados quanto à inteireza do procedimento pelo registro depois de cada experimento das respostas à aplicação serosa de colecistocinina (CCK). A vagotomia foi apenas julgada ter sido eficaz quando CCK não aumentou a taxa de disparo do nervo mesentérico (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20).

Drogas e bactérias

[00140] DSM 17938 foi doada pela BioGaia AB (Stockholm, Suécia), ao passo que a JB-1 de Lactobacillus rhamnosus foi tirada de um estoque na Brian-Body Institute na McMaster University (Ontario, Canadá). Todos os procedimentos foram como anteriormente relatados (Kunze WA, Mao YK et al., Journal of cellular and molecular medicine 2009; 13: 2261-70, Ma X, Mao YK et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2009; 296: G868-75, Wang B, Mao YK, FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 2010; 24: 4078-88). Os números bacterianos foram determinados opticamente, e a viabilidade checada depois de plaquear nas placas de ágar com meio de crescimento. As bactérias dos estoques congelados foram descongeladas, centrifugadas a 2000 rpm por 15 min, e o grânulo colocado em suspensão em Krebs e mais uma vez centrifugado e recolocado em suspensão. Antes de usar, as bactérias foram diluídas nas concentrações de trabalho com Krebs. A colecistocinina (2533) sulfatada (CCK) foi obtida da AnaSpec (Fremont, CA); nicardipina, capsaicina e 6-Iodonordi- hidrocapsaicina da Sigma-Aldrich, e o-conotoxina GVIA (w-Cg-GVIA) e o- conotoxina MVIIC (w-Cg-MVIIC) da Alomone Labs (Jerusalém, Israel). 6- Iodonordi-hidrocapsaicina e CCK foram dissolvidos em DMSO; a capsaicina foi dissolvida em etanol para fabricar alíquotas da solução de estoque. No dia do experimento as alíquotas foram diluídas em Krebs até as concentrações de trabalho com concentrações finais de DMSO e etanol de < 0,01% e < 0,1%, respectivamente.

Análise de Dados OFF-LINE

[00141] As frequências de disparo espontâneo de unidade múltipla e única foram medidas usando os softwares Clampfit 10.2 (Molecular Devices) e Origin 8.5 (Northampton, MA). Os registros de espículas de unidade múltipla e única foram rotineiramente usados para determinar mudanças nas taxas de disparo da fibra de nervo mesentérico induzido pela exposição do intestino aos estímulos ou agentes farmacológicos diferentes (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20). A cronometragem das espínulas no registro de unidade múltipla foi determinada usando o módulo de detecção de pico de Clampfit, e a frequência de disparo média foi calculada a partir dos intervalos interespínula. As unidades únicas foram extraídas do sinal de unidade múltipla pelo emparelhamento na forma de espínula usando a ferramenta de detecção padrão da forma de espínula de Clampfit (análise da forma de onda computadorizada). Depois de conduzir o algoritmo de detecção padrão, a discriminação de espínula de unidade única foi sempre checada pela inspeção visual, e os eventos de espínula não emparelhados foram descartados (<0,2%) (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20).

Estatísticas

[00142] Os dados são expressos como meio ± SE com N referindo-se ao número total dos segmentos jejunais registrados, e n referindo-se ao número de atividade de fibras únicas extraído dos registros de unidade múltipla. Nós extraímos um máximo de 6 unidades únicas de cada registro de unidade múltipla. Os testes de Wilcoxon ou r desemparelhado foram usados para comparações de dados emparelhados e não emparelhados, respectivamente; ANOVA de uma via e duas vias com teste post hoc de Bonferroni foram usados para comparar grupos múltiplos como apropriado. Porque variações grandes na atividade espontânea pode ocorrer entre uma preparação e uma outra em comparações de atividade neural de unidade múltipla comparações foram emparelhadas com registros de tratamento antes e depois feitas onde cada feixe de nervo serviu como o seu próprio controle para assegurar mudanças significantes em cada tratamento ou dose de droga. A porcentagem de aumento no disparo acima na frequência de linha de base vs. concentração de capsaicina (na presença ou ausência de bactérias) foi plotada e esta adaptada por uma equação de dose-resposta logística [Y = Fundo + (Topo — Fundo/1 + 10LogEC50-X)]. Os parâmetros que descrevem os ajustes logísticos foram comparados usando um teste F da soma dos quadrados extra. Todos os testes estatísticos foram realizados usando o software Prism 5.0 (software GraphPad, San Diego, CA).

Efeitos de DSM 17938 sobre a frequência do disparo espontâneo de nervo mesentérico

[00143] A DSM 17938 luminal influenciou a descarga de unidade múltipla espontânea do nervo mesentérico (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20). 1 x 109cfu/ml de DSM 17938 intraluminal causaram uma diminuição na frequência de disparo espontâneo de unidade múltipla em 22% de 36,3 ± 8,4 para 28,2 ± 7,2 Hz (N= 7, P= 0,02, Figura 1A); DSM 17938 a 1 x 108cfu/ml mudou a descarga espontânea em 19% de 21,6 ± 5,1 a 17,6 ± 6 Hz, N= 6, P= 0,09, Figura 1B). O meio condicionado com DSM 17938 (1:5) também diminuiu a descarga espontânea em 37% de 22,6 ± 4,2 para 14,17 ± 2,4 Hz (N = 7, P = 0,03, Figura 1C). Entretanto, DSM 17938 morto y- irradiado ou apenas caldo não diminuiu a excitabilidade aferente: de 17,84 ± 5,3 para 18,25 ± 4,1 Hz (N = 6, P = 0,84), e de 20,48 ± 1,6 para 21,49 ± 2,8 Hz (N = 6, P = 0,10) respectivamente (Figuras 1D-E).

Vagotomia e paralisia muscular não inibiram a redução pela DSM 17938 de disparo espontâneo de nervo mesentérico

[00144] Nós investigamos se o efeito de DSM 17938 1 x 109cfu/ml sobre a descarga espontânea foi anulada pela vagotomia anterior. Para controlar ações diretas possíveis de DSM 17938 sobre as células de músculo liso, nós adicionamos aqui e em todos os experimentos subsequentes de disparo espontâneo o bloqueador do canal de Ca2+tipo L nicardipina (3 nM) que inibe as contrações musculares. Assim, depois da vagotomia e adição de nicardipina, a DSM 17938 reduziu a frequência de disparo de unidade múltipla em 18% de 16,72 ± 1,9 para 13,77 ± 1,9 Hz (N = 17, P = 0,001, Figura 2A, 2C). Os dados de animais vagotomizados e muscularmente paralisados foram depois analisados com respeito às taxas de disparo de unidade única. DSM 17938 reduziu a frequência de disparo de unidade única em 19% de 0,36 ± 0,05 a 0,29 ± 0,03 Hz (n = 30, P = 0,02, Figura 2B, 2C); destas fibras, a maioria (20/30) apresentou uma diminuição na frequência de 36% de 0,42 ± 0,06 para 0,27 ± 0,04 Hz (P< 0,0001), mas a fração menor das fibras remanescentes aumentou a sua taxa de disparo em 29% de 0,24 ± 0,04 para 0,31 ± 0,06 Hz (n = 10/30, P = 0,006).

DSM 17938 diminuiu a frequência de disparo de unidade única espinhal e a resposta à capsaicina pelo antagonismo parcial insuperável dos receptores de TRPV1

[00145] Nós testamos se DSM 17938 modificaria o aumento da frequência de disparo induzido pela capsaicina na excitação de unidade única em tecido tirado de camundongos anteriormente vagotomizados. A capsaicina aplicada ao compartimento seroso aumentou a taxa de disparo espontâneo de unidade múltipla e simples, com latências de início de ~60 s e em uma maneira dependente da dose. Dado que os receptores de TRPV1 sensíveis à capsaicina dessensibilizam, e aplicações subsequentes do agonista pode dar origem a um efeito diminuído, nós examinamos respostas para uma faixa de doses de capsaicina (100 nM-100 nM) em segmento jejunal individual. Nós fizemos isto com e sem 20 min de aplicação intraluminal anterior de DSM 17938 1 x 109cfu/ml (N = 25 para cada curva, 5 segmentos por cada concentração; ~6 unidades únicas espinhais foram analisadas para cada segmento). A porcentagem de aumento na frequência de disparo versus a concentração de capsaicina ou capsaicina mais a concentração de DSM 17938 foram plotadas e ajustadas com uma equação logística de três parâmetros da forma Y = Fundo + (Topo-Fundo)/(1+10LogEC50-X). EC50 para capsaicina sozinha foi de 200 nM comparado a 500 nM para a capsaicina na presença de DSM 17938 (P = 0,71). A resposta máxima (Topo) obtida com a capsaicina foi de 238,4 ± 27,5% vs. 129 ± 17% obtida com a capsaicina mais DSM 17938 (P = 0,004, Figura 3A). De acordo com os relatos anteriores, algumas fibras espinhais não foram excitadas pela capsaicina. Nós examinamos se a capsaicina excitou as fibras espinhais diretamente, ou se a excitação dependeu da transmissão sináptica intramural de neurônios entéricos para as extremidades espinhais intraganglionárias. Nós adicionamos 1 µM de capsaicina no compartimento seroso depois que a transmissão sináptica intramural foi bloqueada pela adição de 500 nM cada dos bloqueadores de Ca2+w-Cg-GVIA e co-Cg-MVIIC. O bloqueio sináptico intramural não diminuiu a excitação evocada capsaicina que foi de 187,5 ± 42,9% (n = 17) na ausência das conotoxinas e 219,1 ± 72,6 (n = 12) na sua presença (P = 0,947, Figura 3B). Nós concluímos que a ação da DSM 17938 sobre os aferentes espinhais não envolve a transmissão sináptica intramural.

Efeitos de meio condicionado de DSM 17938 contendo produtos liberados pela DSM 17938 bacteriana reduziram as ações da capsaicina sobre as fibras espinhais

[00146] Nós testamos se os produtos bacterianos de DSM 17938 sustenta o antagonismo de TRPV1 nos aferentes mesentéricos. O alvo DSM 17938 nos aferentes mesentéricos são predominantemente fibras espinhais, dado que a porcentagem de redução induzida por DSM 17938 de frequência de disparo espontâneo foi muito similar com e sem vagotomia anterior (18% vs. 22% respectivamente); depois, nós aplicamos 1 µM de capsaicina em fibras mesentéricas não vagotomizadas que receberam uma aplicação intraluminal anterior de meio condicionado com DSM 17938 por 20 min. O meio condicionado com DSM 17938 (1:5) inibiu o aumento da frequência de disparo induzido pela capsaicina (%) nas fibras únicas mesentéricas de 187,5 ± 43% (grupo de controle, N = 17) para 74,89 ± 22% (N = 14), e foi similar para a porcentagem de aumento induzido pela capsaicina nas fibras espinhais com tratamento com 1 x 109cfu/ml de DSM 17938 (80,29 ± 22%, N = 17) (P = 0,02, teste de ANOVA de uma via; Figura 7).

O antagonismo de DSM 17938 ou TRPV1 reduziu o disparo evocado pela distensão

[00147] Na ausência de nicardipina para permitir a contração muscular, nós registramos a frequência de disparo de unidade múltipla e única de fibras presumidos ser nociceptores (Grundy D, Gut 2004;53 Supl 2:ii5-8). Nós testamos se DSM 17938 reduziria a sua resposta excitatória evocada pela elevação da pressão intraluminal para uma intensidade nociceptiva de 48 hPa (36 mmHg) (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20). A primeira resposta destas fibras para distensão intestinal é geralmente mais alta do que aquela obtida com uma distensão subsequente, mas permanece constante por até 3 distensões adicionais (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211- 20). Nós assim usamos a 2adas 3 distensões sucessivas para comparações. O disparo de unidade múltipla foi 111,5 ± 16,7 Hz durante a distensão, mas depois adicionando DSM 17938 por 20 min, a distensão aumentou o disparo para apenas 86,5 ± 10,6 Hz (N = 5, P = 0,31). A frequência do disparo de unidade única espinhal foi de 3,01 ± 0,44 Hz durante a distensão, mas na presença de DSM 17938 o disparo foi de 1,71 ± 0,16 durante a distensão (n = 28, P = 0,008, Figura 4A). A frequência de disparo na pré-distensão foi de 0,31 ± 0,05 vs. 0,25 ± 0,07 Hz (n = 28, P = 0,053, Figura 4A) para controle vs. DSM 17938 adicionado. O antagonista de TRPV1 6- Iodonordi- hidrocapsaicina (10 µM) imitou o efeito de DSM 17938 sobre a resposta de unidade única pela diminuição da resposta para distensão de 3,26 ± 0,73 para 2,23 ± 0,50 Hz (n = 13, P = 0,0002, teste de Wilcoxon, Figura 4B na ausência de nicardipina).

EXEMPLO 2 DSM 17938 bloqueou a elevação do Ca2+ induzida pela capsaicina em culturas primárias neuronais de culturas primárias de gânglio da raiz dorsal DRG (DRG)

[00148] A coluna espinhal foi removida do corpo, transferida para um béquer contendo Krebs gelado, e longitudinalmente cortada. Os DRG foram expostos e coletados dos níveis toracolombar. O DRG inteiro foram lavado duas vezes com meio L-15 de Leibovitz estéril (GIBCO, Gaithersburg, MD), e incubado por 40 min em colagenase tipo 1 a 1 mg/ml (Sigma-Aldrich; Oakville, ON, Canadá) e 0,5 ml de tripsina (0,25%, GIBCO) em 20 ml de L- 15 a 37°C. Depois de outra adição de 5 ml de L15 contendo 10% de soro bovino fetal (FBS, GIBCO), os gânglios foram centrifugados por 5 min a 1.000 rpm, depois lavados duas vezes com meio de crescimento (L-15, contendo 10% de FBS, 1% de Penicilina/Estreptomicina/Glutamina, 1% de HEPES e 1% de Piruvato de Na). Os DRG foram colocados em 2 ml de meio de crescimento e triturados 10 vezes. Os gânglios foram depois centrifugados por 10 s a 500 rpm e o sobrenadante transferido para um tubo estéril. Eles foram recolocados em suspensão em 2 ml de meio de crescimento, triturados repetidamente até que o volume de sobrenadante transferido fosse de 10 ml, centrifugados por 5 min a 1.000 rpm, e o grânulo final recolocado em suspensão em 3 ml de meio de crescimento. Os neurônios foram plaqueados em 3 placas de Petri de fundo de vidro revestidas com poli-d-lisina (MatTek, Ashland, MA). Um adicional de 1,5 ml de meio de crescimento foi adicionado a cada placa depois de 30 min e o todo incubado por 24 h a 37°C com carbogênio.

Formação da imagem de Ca2+

[00149] Os neurônios DRG foram colocados dentro de uma placa de registro de acrílico e carregada com o indicador de Ca2+Fluo-4-AM (8 µM) diluído em Krebs com 0,1% de ácido plurônico (em DMSO) a 37°C por 60 min. A placa foi colocada no compartimento de registro e superfundido com Krebs fresco (~34°C) por 15 min para permitir que o corante seja removido. As células foram observadas em um microscópio invertido (Nikon eclipse IE 2000S, Melville, NY) e tiveram imagem formada usando uma câmera Rolera- XR (Surrey, BC, Canadá). A intensidade de fluorescência nos neurônios individuais foi registrada pelo software Simple PCI 6 (Compix Inc, Imaging systems, Sewickley, PA). As drogas foram liberadas através de uma micropipeta ligada a um assoprador pulsátil com pressão eletronicamente controlada (Picospritzer II; General Valve, Fairfield, NJ) com a ponta <100 µm da célula. As imagens, registradas a 0,9 quadros/s, foram armazenadas em um disco rígido local. Os arquivos de imagem foram analisados off-line usando o software Image J (NTH, USA, http://imagej.nih.gov/ij). O aumento no Fluo-4 Ca2+quando da aplicação da capsaicina foi medido como a razão (F/F0) da intensidade de fluorescência depois da capsaicina (F) dividida pela intensidade antes da capsaicina (F0). As bactérias e drogas foram manuseadas como no Exemplo 1.

Resultados

[00150] A especificidade do efeito de DSM 17938 sobre os neurônios espinhais foi investigada ainda se testando a capacidade das bactérias para inibir a resposta do agonista do receptor de TRPV1 capsaicina. Nestes experimentos, JB-1 também foi incluída. JB-1 (Lactobacillus rhamnosus) foi anteriormente mostrada reduzir a dor e descarga de disparo de fibras únicas de DRG induzido pela distensão gástrica (Duncker et al., The Journal of Nutrition 2011). Visto que a abertura dos canais de TRPV1 elevam a concentração de Ca2+intracelular nós usamos a formação de imagem de Ca2+ de cultura primária DRG neuronal para estes experimentos. Soprar 1 µM de capsaicina nos neurônios de DRG evocou um aumento no Ca2+intracelular dentro de ~30 s (Figura 5A). Visto que o canal de TRPV1 pode dessensibilizar com exposição de ligante repetida, nós apenas aplicamos capsaicina uma vez a cada placa de cultura. Nós depois adicionamos DSM 17938 ou JB-1 30 min antes de aplicar a capsaicina. O DSM 17938 a 1 x 109 cfu/ml diminuiu a razão de elevação da fluorescência de 2,36 ± 0,31 (grupo de controle, N = 14) para 1,25 ± 0,04 F/F0. Mas, 1 x 108cfu/ml de DSM 17938 mudou F/F0 para 2,67 ± 0,35 e 1 x 1085cfu/ml de DSM 17938 para 2,07 ± 0,27. A adição de 1 x 109cfu/ml de JB-1 teve pouco efeito e mudou a razão F/F0 para 2,48 ± 0,19 (N = 9), que é similar à razão obtida com a capsaicina sozinha (Figura 5B). Estes resultados demonstram que DSM 17938 pode bloquear a elevação de Ca2+induzida pela capsaicina nas culturas primárias neuronais de DRG.

EXEMPLO 3 DSM 17938 inibiu a diminuição da frequência cardíaca evocada pela distensão gástrica

[00151] Um total de 17 ratos foram designados para 2 grupos. Na chegada os ratos foram deixados aclimatizar por 1 semana seguida pelo manuseio por 1 semana (10 min/d) para minimizar os efeitos de estresse durante os experimentos. Os ratos foram submetidos à alimentação forçada a cada manhã por 9 d com 0,2 ml (1 x 109cfu/ml) de DSM 17938 viva em Krebs ou apenas Krebs como controle (veículo). Os métodos para GD foram anteriormente publicados (Tougas, Wang, American Journal of Physiology 1999; 277: R272-8). Em resumo, os ratos foram jejuados durante a noite, anestesiados com uma mistura de cloridrato de cetamina (75 mg/kg de peso corporal) e xilazina (10 mg/kg de peso corporal) intraperitonealmente. A anestesia suplementar foi dada como necessário. Depois de uma laparotomia de linha intermediária, um dispositivo de distensão consistindo em um balão gástrico na forma de bola (2 cm de diâmetro interno) fixo a um cateter de Teflon (20 cm) foi inserido dentro do estômago através de uma incisão pequena no duodeno proximal e conectado a um sistema barostático (Distender, G&J Electronic, Toronto, Canadá). A resposta cardíaca foi medida durante a inflação do balão com ar nas pressões de 40 e 60 mm Hg por 60 s. Dez min de repouso foram deixados para recuperação depois de cada distensão. Apenas um conjunto de distensões foi aplicado a cada rato para evitar possíveis mecanismos compensatórios e os ratos foram mortos depois das medições antes de recuperar a consciência. Registros contínuos da frequência cardíaca foram realizados através de um eletrocardiograma de superfície consistindo em 3 eletrodos de agulha aplicados nos ombros esquerdo e direito e nas patas traseiras direitas. O sinal foi amplificado e registrado em um computador pessoal usando um programa de aquisição de dados comercial (Experimenter’s Workbench, DataWave Technologies, Loveland, CO). A frequência cardíaca foi medida por 60 s antes, durante, e depois de cada distensão por um total de 180 s. O registro de frequência cardíaca (HR) antes de cada distensão permitiu a correção quanto a possíveis mudanças na linha de base devido às variações nos níveis de anestesia e garantiram que qualquer resposta de frequência cardíaca seria ligada à distensão. Para controlar o efeito de GD com o tempo, os dados são apresentados como mudança média de HR no repouso (100% = repouso) usando a HR média registrada por um período de 10 s durante a distensão (10, 20, 30, 40, 50, e 60 s). Grupos foram comparados usando a média de mudanças na HR (porcentagem de HR no repouso) em todos os ratos do mesmo grupo durante os 60 s de cada distensão (40 e 60 mm Hg). As bactérias e drogas foram manuseados como no Exemplo 1.

Resultados

[00152] A diminuição na frequência cardíaca evocada em 40 mm Hg não foi mudada pela gavagem de DSM 17938 (P = 0,121, Figura 6A) (N = 8 e 9 com veículo e DSM 17938 respectivamente). A inflação com 60 mm Hg diminuiu a frequência cardíaca dentro de 10 s que persistiu por 30 s durante a distensão (Figura 6B). A gavagem com DSM 17938 por 9 d antes de testar moderou a resposta para 60 mm Hg (P = 0,028, teste t não emparelhado, Figura 6A, 6B). A conformidade gástrica (volume/pressão) não diferiu entre os animais tratados com veículo ou DSM 17938, para as pressões de distensão gástrica de 40 ou 60 mm Hg (dados não mostrados). Estes resultados demonstram um efeito antinociceptivo pelas bactérias.

Claims (9)

1. Método para selecionar um agente para uso na redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo, o dito método caracterizadopelo fato de que compreende: selecionar, como dito agente, uma cepa bacteriana capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida do receptor transitório potencial vaniloide 1, TRPV1 ou um meio condicionado de dita cepa bacteriana capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1, em que a dita cepa bacteriana é uma cepa LACTOBACILLUS REUTERI; contactar uma célula que expressa TRPV1 com uma cepa bacteriana ou um meio condicionado de dita cepa bacteriana a ser testado; medir a ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 na dita célula a seguir do contato da dita célula com a dita cepa bacteriana ou dito meio condicionado de dita cepa bacteriana a ser testado; e comparar a dita ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 medida com uma ativação de TRPV1 de controle, em que selecionar a dita cepa bacteriana ou dito meio condicionado de dita cepa bacteriana compreende selecionar a dita cepa bacteriana ou dito meio condicionado de dita cepa bacteriana a ser testado como uma cepa bacteriana ou um meio condicionado de dita cepa bacteriana eficaz na redução ou prevenção da dor gastrointestinal se a dita ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 medida é mais baixa do que a dita ativação de TRPV1 de controle.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que medir a dita ativação espontânea e/ou induzida de TRPV1 compreende medir o influxo de Ca2+ na dita célula induzido pela capsaicina, mudança de pH e/ou calor.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda contactar um segmento gastrointestinal ex vivo com tecido mesentérico ligado com uma cepa bacteriana ou um meio condicionado de dita cepa bacteriana a ser testado; medir o disparo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido no dito segmento gastrointestinal ex vivo a seguir do contato do dito segmento gastrointestinal ex vivo com a dita cepa bacteriana ou dito meio condicionado de dita cepa bacteriana a ser testado; e comparar o dito disparo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido medido com um disparo aferente mesentérico de controle, em que selecionar a dita cepa bacteriana ou dito meio condicionado de dita cepa bacteriana compreende selecionar a dita cepa bacteriana ou dito meio condicionado de dita cepa bacteriana a ser testado como uma cepa bacteriana ou um meio condicionado de dita cepa bacteriana eficaz na redução ou prevenção da dor gastrointestinal se o dito disparo aferente mesentérico espontâneo e/ou induzido medido for mais baixo do que o dito disparo aferente mesentérico de controle.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que dita cepa Lactobacillus reuteri é LACTOBACILLUS REUTERI DSM 17938.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo está sofrendo de um distúrbio de motilidade intestinal causando a dita dor gastrointestinal no dito indivíduo.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo está sofrendo de uma doença selecionada de um grupo consistindo em cólica, síndrome do intestino irritável e constipação causando a dita dor gastrointestinal no dito indivíduo.

7. Uso de uma cepa bacteriana capaz de reduzir a ativação espontânea e/ou induzida do receptor transitório potencial vaniloide 1, TRPV1, ou meio condicionado de dita cepa bacteriana obtenível pelo método de seleção como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para reduzir ou prevenir dor gastrointestinal em um indivíduo, em que a dita cepa bacteriana é uma cepa LACTOBACILLUS REUTERI; em que a referida cepa de LACTOBACILLUS REUTERI é LACTOBACILLUS REUTERI DSM 17938.

8. Uso de uma composição compreendendo uma cepa bacteriana ou um meio condicionado de dita cepa bacteriana obtenível pelo método de seleção como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 e pelo menos um componente adicional selecionado de um grupo consistindo em um carreador farmaceuticamente aceitável, um diluente farmaceuticamente aceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável, um gênero alimentício, um suplemento alimentar e um outro agente preventivo ou terapêutico, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para redução ou prevenção da dor gastrointestinal em um indivíduo, em que a referida cepa bacteriana é uma cepa de LACTOBACILLUS REUTERI; em que a referida composição compreende o referido outro agente preventivo ou terapêutico, em que o referido outro agente preventivo ou terapêutico é capaz de modular a motilidade gastrointestinal e/ou se misturar no referido indivíduo.

9. Uso de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a referida cepa de LACTOBACILLUS REUTERI é LACTOBACILLUS REUTERI DSM 17938.