CN109876074A - 一种中药提取物在制备治疗认知障碍药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种中药提取物在制备用于认知障碍药物中的应用，其特征在于，所述中药提取物为龙血竭酚类提取物。本发明并利用东莨菪碱建立了认知障碍模型，通过实验表明本发明的中药提取物在治疗东莨菪碱致认知障碍模型学习以及能力衰退方面表现出一定的优势，其对于东莨菪碱所致脑组织BDNF减少、NGF减少、5‑HT减少、ACh减少均有明显的改善作用，因而其可被用于制备治疗或预防认知障碍的药物。

Description

一种中药提取物在制备治疗认知障碍药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物，具体涉及一种中药提取物在制药中的应用，尤其涉及一种中药提取物在制备治疗认知障碍药物中的应用。

背景技术

中国作为世界上人口最多的国家，受社会、经济和人口政策等因素的影响，其老龄化的速度比西方发达国家更快。2010年第六次人口普查结果表明，我国60岁以上人口已达13.3％(1.8亿)。伴随着快速老年化，痴呆作为老年人常见的神经精神障碍性疾病，其发病和患病将随着快速的人口老龄化而逐渐增加。轻度认知障碍(Mild CognitiveImpairment，MCI)是介于正常老化与老年痴呆之间的一种临床状态，患者一般的认知功能和生活能力保持完好，尚未达到老年痴呆(AD)的诊断标准。MCI患者每年有10％-15％转化为AD，是AD的高危人群。由于MCI被认为是AD的前期状态，而AD中晚期疗效不佳，若能在MCI阶段即对患者进行干预，对降低AD发病率将大有裨益，亦能延迟或阻止其他类型痴呆的发生和发展，有助于提高老年人的生活质量，减轻社会和家庭负担，故对MCI研究已成为国内外研究的热点。MCI的临床表现与中医的“呆证”、“健忘”的范畴相符合。本病的病因在中医看来大多数是因为久病损耗、年老体虚，或者七情内伤等诸多原因导致机体肾精亏损，气血不足，使得脑髓失养，又或者是因为痰阻、气滞、血瘀于脑而成。脑为髓海，元神之府，神机之用。久病耗损，损伤正气，使得诸脏亏损，髓海失养，或者久病入络，脑脉痹阻，发为痴呆。

目前，国际上最常用的轻度认知障碍的诊断标准主要是参考Petersen等提出的关于轻度认知障碍的5项诊断标准，主要包括：1.患者主诉是记忆障碍，还要有其他知情者的证实；2.患者可以有某一认知方面的变化，不过总体认知功能方面是正常的；3.不影响患者的基本日常生活能力；4.患者与同年龄并且同等教育程度者比较而言，存在有一定的记忆损害，并且记忆测查分值在1.5个标准差以下；5.要排除由其他可能所引起的脑功能紊乱的疾病及因素，并且尚达不到AD的诊断标准。

MCI的临床表现主要表现为3方面：记忆受损，执行功能受损，及其它认知障碍、神经精神心理异常。记忆受损是MCI的核心问题，其重要性不仅仅是治疗的需要同时也是因为伴记忆障碍的MCI患者会以38％发病率发展为AD。在遗忘性MCI患者中影响最大的为情节记忆问题，表现为信息采集、延迟回忆(故事记忆)，和联想记忆(名脸配对)的损害，其次为日常记忆和空间记忆能力的损害。执行功能障碍是指解决问题的决策能力，包括策划，发起和行为的监管，工作记忆，反应抑制和任务切换，与日常生活能力密切相关。其它认知障碍是指MCI患者的抽象思维能力降低，并且发现其识别面部表情和熟悉人物出现问题，这可能会给患者本人带来社会交往困难，并给患者治疗和日常生活带来不良影响，MCI患者常见的神经精神症状：抑郁(39％)，淡漠(39％)，易激惹(29％)和焦虑(25％)。

因此，提供一种新的治疗认知障碍的药物及其用途具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种治疗认知障碍的药物及其用途。具体地，

本发明提出了一种中药提取物在制备治疗或预防认知障碍药物中的应用，其特征在于，所述中药提取物为龙血竭酚类提取物，该提取物可以通过市售或自制而来。具体地，其含总酚以7,4’-二羟基黄酮(C₁₅H₁₀O₄)计为60％～85％。

进一步地，所述中药提取物包含不低于0.60％重量的7,4’-二羟基黄酮，以及不低于0.50％的龙血素B。

进一步地，所述中药提取物可以是龙血竭酚类提取物。

进一步地，所述治疗或预防认知障碍药物为选自口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

具体地，所述治疗或预防认知障碍药物选自汤剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂、口服液。

进一步地，所述治疗或预防认知障碍药物为龙血通络胶囊。

具体地，所龙血竭酚类提取物由以下方法制备而来：

龙血竭药材粉碎，加乙酸乙酯回流提取，滤过，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物干燥粉碎，以NaOH溶液搅拌30分钟使溶解，滤过；滤液调pH至1～2，静置12小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，洗至pH为中性，真空干燥，粉碎即得。

优选地，所龙血竭酚类提取物的制备包括：

龙血竭药材400g粉碎成粗粉，加8倍量乙酸乙酯回流提取2次，每次1小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以30倍提取物量的0.35％NaOH溶液搅拌30分钟使溶解，滤过；滤液用10％HCl调pH至1～2，静置12小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，60℃以下真空干燥，粉碎，过80目筛，即得。

本发明提出了一种龙血竭酚类提取物，该提取物可以通过市售或自制而来。本发明利用东莨菪碱建立了认知障碍模型，并通过实验表明本发明的中药提取物在治疗东莨菪碱致认知障碍模型学习以及能力衰退方面表现出一定的优势，其对于东莨菪碱所致脑组织BDNF减少、NGF减少、5-HT减少、ACh减少均有明显的改善作用。因而可被用于制备治疗或预防认知障碍的药物。

具体实施方式

本发明提供了一种中药提取物在制备治疗认知障碍药物中的应用，本领域技术人员也可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除有特别说明，本发明采用的药品、生物材料或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

发明人对本发明提供的技术方案进行了实验研究，用来证明本发明的技术效果，下述实验用于进一步说明本发明的技术效果，但不限制本发明：

实施例本发明中药提取物对东莨菪碱致认知障碍的影响

本发明中药提取物可以通过如下方法制备：

龙血竭药材粉碎成粗粉，加8倍量乙酸乙酯回流提取2次，每次1小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以30倍提取物量的0.35％NaOH溶液搅拌30分钟使溶解，滤过；滤液用10％HCl调pH至1～2，静置12小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，60℃以下真空干燥，粉碎，过80目筛，即得。

经检测，所得中药提取物含总酚以7,4’-二羟基黄酮(C₁₅H₁₀O₄)计，为60％～85％；含7,4’-二羟基黄酮(C₁₅H₁₀O₄)不低于0.60％；含龙血素B(C₁₈H₂₀O₅)不低于0.50％。

利用上述提取物与20％的淀粉浆混合、制粒、干燥后装入胶囊中，即可制得龙血通络胶囊。

1、材料及方法

1.1实验动物

昆明种小鼠，SPF级，体重18.0-22.0g，雌雄各半，SPF级，南京中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(苏)2002-0031。

1.2实验药物及试剂

龙血竭酚类提取物，江苏康缘药业股份有限公司自制；

盐酸多奈哌齐分散片，山东罗欣药业股份有限公司；

东莨菪碱氢溴酸盐，苏州亚科化学试剂有限公司，YK2011031201。

1.3实验器材

电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

MT-200Morris水迷宫视频跟踪分析系统，成都泰盟科技有限公司；

DT-200小鼠跳台测试箱自动记录系统，成都泰盟科技有限公司。

1.4实验方法

1.4.1训练及筛选方法

小鼠稳定3天后，进行Morris水迷宫筛选实验2次。小鼠进行水迷宫筛选前先将小鼠放在平台上10s，让其认知平台，然后将小鼠从平台对角象限头朝臂放入水中，观察其2min内能否找到平台，能找到平台的纳入正式实验，不能找到平台的小鼠人为将其引导上平台停留10s，10min后进行第二次筛选实验，能找到的纳入正式实验，两次都不能找到平台的小鼠剔除出实验。

将筛选合格的小鼠进行水迷宫训练实验，每天4次，上午下午各2次，训练实验同筛选实验方法相同，如此连续训练10-15次，确保每只小鼠都能在规定的时间内找到平台。

实验时，平台低于水面1cm，水温25.0±1.0℃，水中加入漂白剂，充分混匀，使水呈乳白色，实验期间迷宫外参照物保持不变。将小鼠分别由平台对角象限头朝桶臂放入水迷宫中，记录小鼠在2min内寻找平台的时间(潜伏期)及经过平台次数，作为学习记忆能力的指标，找到平台后允许动物在平台上停留30s；如果小鼠在120s内未找到平台，记为120s。测试过程中保持实验室内灯光、物品等空间参照物摆放位置不变，排除干扰因素。

将水迷宫筛选训练合格的小鼠分别放入跳台不同的反应箱内适应3min，让其认知环境，然后立即通以28V交流电，定时5min，将5min内能够认知平台并进行躲避电刺激的小鼠纳入正式实验。将不能认知平台的小鼠人工引导其跳上平台躲避电刺激，再次适应3min，进行第二次跳台实验筛选，将两次都不能找到平台并躲避电刺激的小鼠剔除出实验。

将筛选合格的小鼠进行跳台训练实验，训练方法同筛选方法，每天4次，上午下午各2次，训练实验同筛选实验方法相同，如此连续训练10次。

1.4.2给药及分组

将水迷宫和跳台筛选训练合格的雄性小鼠80只，按体重随机分为正常对照组、模型组(2mg/kg，3ml/kg体积腹腔注射给药)、阳性药(多奈哌齐，1.3mg/kg，25ml/kg体积灌胃)组及高、中、低计量组(0.4、0.2、0.1mg/kg，25ml/kg体积灌胃)，正常对照组给予相同体积生理盐水，连续给药30天。

1.4.3造模及行为学观察

第31天给药后30min除正常对照组外，腹腔注射东莨菪碱造模，给药剂量为2mg/kg，注射体积为3.0ml/kg。造模30min后进行Morris水迷宫实验，观察记录各组小鼠在2min之内的潜伏期及经过平台次数。

第32-33天进行跳台学习实验，给药方法及时间同上。其中第32天为跳台学习实验，第33天为跳台记忆实验，实验时，将6只小鼠分别放入不同的反应箱内适应3min，然后立即通以28V交流电。动物受到电击，正常的反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台。定时5min，分别记录这两天小鼠第一次跳下平台的时间(潜伏期)以及5min内小鼠跳下平台受到电击的次数(错误次数)。

1.4.4指标检测

1.4.4.1对学习记忆行为学的影响

记录：小鼠水迷宫实验的潜伏期；小鼠跳台实验时的错误反应总次数。

1.4.4.2对脑神经因子的影响

酶联免疫法检测：第33天跳台记忆实验结束后，小鼠脑组织中脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的含量。

1.4.4.3对与学习记忆有关神经介质的影响

酶联免疫法检测：第33天跳台记忆实验结束后，小鼠脑组织中五羟色胺(5-HT)、乙酰胆碱(ACh)的含量；

1.5数据统计

实验数据统计处理用表示，采用t检验进行统计分析

2实验结果

2.1一般情况观察

治疗给药期间，正常对照组一般活动正常、毛色光亮、进食饮水均正常、未见粪尿的异常改变；东莨菪碱模型组小鼠腹腔注射东莨菪碱后出现兴奋、烦躁症状，给药30min后恢复，并且表现为镇静、怠动。各组动物在实验期内体重、食量、水量的变化呈现一定的组间差异。

2.2龙血竭酚类提取物对轻度认知障碍小鼠Morris水迷宫学习记忆能力的影响

表1结果显示，通过对各组小鼠Morris水迷宫潜伏期的比较分析,发现与正常对照组比较，模型组潜伏期明显增大，呈现显著差异性；表明东莨菪碱致认知障碍模型在造模给药后30min学习记忆能力明显下降。与模型组比较，龙血竭酚类提取物各剂量组潜伏期明显缩短，并且随着给药剂量的增大，潜伏期逐渐缩小，呈现明显的剂量依赖性，表明龙血竭酚类提取物在治疗东莨菪碱致认知障碍模型学习以及能力衰退方面表现出一定的优势。

表2、3结果显示，与正常对照组比较发现，模型组跳台潜伏期明显缩小，错误次数(受电击次数)显著增加，并且呈现显著性差异，表明东莨菪碱致认知障碍小鼠学习记忆能力明显减退，表现为一定的痴呆症状。与模型组比较，龙血竭酚类提取物各剂量组小鼠潜伏期延长，错误次数减小，各剂量组由高到低，潜伏期逐渐缩短，呈现明显的剂量依赖性。

表1龙血竭酚类提取物对轻度认知障碍小鼠Morris水迷宫学习记忆能力的影响

注：与正常对照组相比，△p<0.05,△△p<0.01，与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01。

表2龙血竭酚类提取物对轻度认知障碍小鼠跳台实验第一天学习的影响

注：与正常对照组相比，△p<0.05,△△p<0.01，与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01。

表3龙血竭酚类提取物对轻度认知障碍小鼠跳台实验第二天记忆的影响

注：与正常对照组相比，△p<0.05,△△p<0.01，与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001

2.3龙血竭酚类提取物对轻度认知障碍小鼠脑神经因子的影响

BDNF，即脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor)，是机体中含量最多的神经营养因子，是一种分泌性蛋白。其主要是在中枢神经系统内表达，在海马以及皮质中的含量最高。在基底前脑区比较活跃，这些对学习记忆乃至高等思维至关重要。通过酶联免疫法检测各组大鼠脑组织BDNF含量变化。实验结果显示与正常对照组相比，模型组脑组织BDNF含量明显降低，表明东莨菪碱明显导致大鼠脑源性神经营养因子的减少。龙血竭酚类提取物和阳性药组动物脑组织BDNF含量明显增高。表明受试药物对于东莨菪碱所致脑组织BDNF减少有明显的改善作用。

NGF，即神经生长因子(Nerve growth factor)，是一种蛋白质，主要分布在神经系统内，在神经系统发育以及正常生理功能当中起重要的作用。可以调节机体的周围神经元还有中枢神经元的生长、发育，维持神经元的活性。在神经营养因子中NGF是最早被发现的，也是研究最为透彻的，它具有双重生物学功能，可以促进突起生长、营养神经元。NGF能够对机体中枢神经元以及周围神经元的生长、发育、分化、再生，还有功能特性的表达进行调控。实验结果显示与正常对照组相比，模型组大鼠脑组织中的NGF水平明显降低。表明东莨菪碱明显导致大鼠脑源性神经生长因子的减少。与模型组相比较，龙血竭酚类提取物各给药组和阳性药组动物脑组织NGF含量明显增高。表明受试药物对于东莨菪碱所致脑组织NGF减少有明显的改善作用。

表4龙血竭酚类提取物对轻度认知障碍小鼠脑神经因子的影响

注：与正常对照组相比，△p<0.05,△△p<0.01，与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001

2.4龙血竭酚类提取物对轻度认知障碍小鼠脑神经因子的影响

5-HT，即五羟色胺，是一种抑制性的神经递质，在哺乳动物的组织中广泛存在，尤其是神经突触和大脑皮层质中，能够增强机体的记忆力，并且能避免兴奋神经毒素对神经元的损害，从而防止脑损害发生在老化的过程中。实验结果显示与正常对照组相比，模型组脑组织中的5-HT水平明显降低。表明东莨菪碱明显导致大鼠脑中神经介5-HT的减少。与模型组相比较，阳性药组、龙血竭酚类提取物高剂量给药组以及低剂量给药组动物脑组织5-HT含量明显增高。表明受试药物对于东莨菪碱致脑组织5-HT减少有明显的改善作用。

ACh，即乙酰胆碱(acetylcholine)，是一种在神经细胞中由乙酰辅酶A以及胆碱在相关酶的催化作用下合成的神经递质，可以迅速被胆碱酯酶在机体组织内破坏掉。生物认知过程和机体脑内的胆碱能递质系统活动关系密切，而基底前脑胆碱能神经元的纤维投射则是脑区皮层以及海马内ACh的主要来源，因此ACh的水平可以反映机体内胆碱能神经元的变化。当机体需要对新刺激进行分析时，会在学习记忆等认知的活动中，激活机体基底前脑的胆碱能神经元，同时改变脑内ACh的释放。实验结果显示与正常对照组相比，模型组脑组织ACh含量明显降低，表明东莨菪碱可以明显导致大鼠脑组织中ACh的减少。与模型组相比较，龙血竭酚类提取物各剂量给药组和阳性药组动物脑组织ACh含量明显增高。表明受试药物对于东莨菪碱所致脑组织ACh减少有明显的改善作用。

表5龙血竭酚类提取物对轻度认知障碍小鼠脑神经介质的影响

注：与正常对照组相比，△p<0.05,△△p<0.01，与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种中药提取物在制备用于认知障碍药物中的应用，其特征在于，所述中药提取物为龙血竭酚类提取物。

2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述中药提取物含总酚以7,4’-二羟基黄酮(C₁₅H₁₀O₄)计为60％～85％。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述中药提取物包含不低于0.60％重量的7,4’-二羟基黄酮，以及不低于0.50％的龙血素B。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，所述用于认知障碍药物为选自口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于认知障碍药物选自汤剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂、口服液。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于认知障碍药物为龙血通络胶囊。

7.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所龙血竭酚类提取物由以下方法制备而来：

龙血竭药材粉碎，加乙酸乙酯回流提取，滤过，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物干燥粉碎，以NaOH溶液搅拌30分钟使溶解，滤过；滤液调pH至1～2，静置12小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，洗至pH为中性，真空干燥，粉碎即得。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所龙血竭酚类提取物的制备包括：

龙血竭药材粉碎成粗粉，加8倍量乙酸乙酯回流提取2次，每次1小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以30倍提取物量的0.35％NaOH溶液搅拌30分钟使溶解，滤过；滤液用10％HCl调pH至1～2，静置12小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，60℃以下真空干燥，粉碎，过80目筛，即得。