CN111588792B - 一种治疗中风后吞咽困难的中成药 - Google Patents

一种治疗中风后吞咽困难的中成药 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗中风后吞咽困难的中成药，由下述重量份数的原料药配制而成：黄芪、红花、巴戟天、川芎、水蛭、二丑、石菖蒲、冰片、桔梗、薄荷、猪牙皂、壁虎、马钱子、西洋参，瓜蒌、桑寄生、木蝴蝶、楮实子、络石藤、苍耳子、穿山龙、丁香、诃子、降香、珍珠、水牛角。本发明的临床总有效率为88.67%，对照组为57.58%，疗效优于对照组P＜0.05。

Description

一种治疗中风后吞咽困难的中成药
技术领域
本发明属于医药类技术领域，尤其涉及一种治疗中风后吞咽困难的中成药。
背景技术
近年来，有关脑卒中的病理生理学研究取得了重大进展，但在脑卒中治疗上，特别是脑梗死恢复期的治疗进展缓慢。吞咽困难是脑卒中后常见的并发症之一，据统计，51％-73％的中风患者遗留吞咽困难，饮水呛咳等后遗症，且易出现吸入性肺炎、营养不良、支气管痉挛、气道阻塞等并发症，既往解决治疗吞咽障碍多采用鼻饲方法，导致许多患者长期靠胃管生活，生活不能自理，严重影响患者生存质量。如何改善脑梗死患者神经功能，及时有效地治疗吞咽障碍对提高患者生存质量有重要意义。
脑梗死后脑组织主要病理变化包括原发性神经元丢失、继发性神经元丢失、脑水肿、神经炎症、死亡细胞清除、神经元功能重塑和神经网络重新连接。脑梗死恢复期神经重塑的基础是突触结构的重新建立，新突触形成、突触数量增加以及突触传递效能增强，突触素(Synaptophysin,Syp)作为突触前囊泡膜的分子标记是突触重建的标志指标，Syp含量的高低预示着突触的传递功能的强弱，突触后致密物质(Post Sypaptic Density-95,PSD-95)为突触后膜的结构蛋白，对损伤后突触结构可塑性有重要意义，越来越多的研究表明，脑梗死后的缺血缺氧打破了神经—血管微环境的平衡，造成神经细胞所处的微环境中的多种细胞因子改变、信号通路异常，导致神经系统结构和功能的损伤。信号通路作为细胞间及细胞与微环境之间沟通的方式，参与调控细胞增殖、凋亡、衰老等全过程，细胞生存的微环境内一些可溶性细胞因子及其相关信号通路与干细胞衰老存在密切联系，细胞生存微环境变化引起一些信号通路异常是神经细胞损伤、衰老的关键环节。如EGFR/PI3K/AKT信号通路与细胞代谢、细胞生存、细胞凋亡密切相关，又是调节细胞周期的重要细胞内信号通路。Raf-MAPK/ERK信号通路在调控细胞增殖、分化和存活方面有重要作用，干预ERK1/2表达可以抑制细胞凋亡；MAPK/ERK信号通路还能调控p16,p53等下游靶基因表达。同时缺血缺氧微环境中存在抑制因子Nogo，髓磷脂相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)等，对神经再生均有重要影响，Nogo基因通过可变启动子和可变RNA剪接方式，转录的mRNA有3种，对应的蛋白质分子有A,B和C三个不同的异构体，已证实Nogo-A抑制神经生长的作用最强，Nogo-A通过与NgR结合发挥抑制神经再生的作用，启动下游Rho/Rock信号通路导致神经突起生长的抑制。
中风后吞咽障碍虽是中风病的症状，但其有独特病理演变过程，吞咽困难虽源于中风之因，但又别于中风之机，“饮水呛咳，吞咽困难”是在中风病机气血冲逆，痰瘀胶结脑络，蒙蔽清窍的基础上，进一步演变导致咽喉神机失用，咽部阴阳升降失职而现吞咽功能失约或失用引起，故有“一阴一阳结，谓之呛咳”之说。本发明课题组认为咽喉者，阴阳升降之路，为一身气机之要道，清阳升，浊阴降则咽喉通利而不闭，若清阳不升，浊阴不降则咽喉壅塞而不通，有“一阴一阳结，谓之呛咳”之说。故有“人之一身，百病皆可致危，独咽喉之症，为危中之危”之说。因此，中风后吞咽障碍多是内伤积损，日积渐加，复加诱因而致虚火挟痰，气血冲逆，痰瘀胶结脑络，蒙蔽清窍，闭阻咽关舌根，导致神机失用，咽喉升降失职所致。吞咽活动为不同分层投射模式，这为通过多角度各个层次功能重建提供可能，首先强化吞咽动作正确习惯模式，促进咽部神经支配恢复，改善吞咽肌的无力状态。再者加强吞咽动作启动、改善味及口咽部感觉，逆向促进脑干功能恢复，使上下运动神经元功能以及大脑皮质对皮质脑干束的恢复正常调节，重建被破坏的神经反射弧，使吞咽功能得以改善和重建。总之，中风后吞咽障碍功能恢复通过多种疗法的联合应用以增强脑卒中患者的神经可塑性，促进神经功能的全面康复的一个综合性治疗过程。达到有效改善症状，缩短病程，防止复发的多重治疗效果。
现有中风后吞咽障碍治疗缺乏针对性药物，单纯用治疗脑梗塞的药物，虽然可以改善中风后吞咽障碍，但临床效果不是很满意。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗中风后吞咽困难的中成药。
为实现上述发明目的，本发明采取以下技术方案：
一种治疗脑梗塞后遗症的中成药，是由下述重量份数的原料配制而成：黄芪9～18份、红花9～18份，巴戟天7～15份、川芎9～18份、水蛭9～18份、二丑3～12份、石菖蒲7～15份、冰片1～6份，桔梗9～18份、薄荷9～18份、猪牙皂1～6份、壁虎1～6份、马钱子1～6份、西洋参9～18份，瓜蒌9～18份、桑寄生9～18份、木蝴蝶9～18份、楮实子9～18份、络石藤9～18份，苍耳子9～18份，穿山龙9～18份，丁香9～18份、诃子1～6份、降香1～6份、珍珠1～6份、水牛角9～18份。
所述中成药为片剂。
本发明提供治疗脑梗塞后遗症的中成药的制备方法如下：
1)按取芪、红花、巴戟天、川芎、水蛭、二丑、石菖蒲、冰片，桔梗、薄荷、猪牙皂、壁虎、马钱子、西洋参，瓜蒌、桑寄生、木蝴蝶、楮实子、络石藤，苍耳子，穿山龙，丁香、诃子、降香、珍珠、水牛角混合粉碎成细粉，将该细粉过100目筛，得粉末混合物，将冰片粉碎得冰片粉末另存备用；
2)将步骤1)中所得粉末采用双提法连续回流提取，第一次提取加8倍于粉末重量的水，第二次提取加6倍于粉末重量的水，采用电热套加热，每次提取先用270～300℃的高温烧开然后用150～200℃的低温维持沸腾30min，采用挥发油提取器提取挥发油，制得挥发油另存备用，把两次提取后的水煎液合并过滤得水提液，把水提液放入离心机以每分钟4000转的速度离心处理，离心15min后得上清液；
3)将步骤2)中制得的上清液放入旋蒸仪，蒸发除去水分，得浸膏含水量为60％，干燥浸膏得干浸膏；
4)将步骤3)中所述干浸膏与步骤1)中所述冰片粉末按1：1的重量比混合研磨成细粉，将该细粉过100目筛，得粉末颗粒；
5)将步骤4中制得的粉末颗粒与适量5～10ml 95％乙醇(95％乙醇与粉末颗粒1：3的容量比)混合制成软材，用14目筛将该软材挤成颗粒，把所得颗粒摊于白瓷盘内放入烤箱烘干；
6)控制步骤5)中从烤箱出来的干颗粒的含水量在5％；
7)把步骤6)中制得到的干颗粒与其重量的3％的滑石粉混合，将步骤2)中制得的挥发油与95％的乙醇按1：4的容量比混合，得混合液，把该混合液喷入加了滑石粉的干颗粒中，混合均匀，然后用14目筛作整粒处理，整粒后压片，制得片重为0.5g的片剂。
本发明具有以下优点：
本发明本各种药材使用配伍合理，经科学方法制备、药效稳定，具有制备工艺科学、没有任何毒副作用、使用方便等优点，经临床验证对各种类型的脑梗塞后遗症有效，可用于治疗中风后吞咽障碍。故谓之“吞咽困难片”。
吞咽困难片不仅是现代医学理念与传统医学思想的完美融合，体现了吞咽困难片治疗中风后吞咽困难的独特优势；更是中医发展过程中“古医今用”的大胆创新，在临床应用中具有独特的优势与显著的疗效，为今后治疗中风后吞咽困难多种疗法联合运用及临床进一步研究提供理论依据。
吞咽困难片能够改善脑缺血小鼠记忆障碍及提高行为活动准确率，能够提高咽喉部相关肌肉协调及运动控制准确性，提高了咽喉部敏感性，使得与吞咽相关的神经肌肉兴奋性提高，吞咽功能得到改善，使吞咽反射更加强烈。
吞咽困难片是近几年来临床治疗中风后吞咽困难的新药，不仅能有效改善脑神经功能，促进神经代谢以及减轻细胞损伤，也能有效改善中风后吞咽困难相关症状，而且使用简便、安全可靠、成本低、疗效明显。
本发明无毒副作用，所采用的配方中的药物药理为：综观配方，诸药配伍合理，不仅使“真气”化源不绝，又可使“关卡”闭合有序，畅通无阻，共唱启屏开障、生新有力之功，方中，巴戟天、楮实子滋补肾阴，温壮肾阳，桑寄生、木蝴蝶补肝肾、启音开窍，助力言语恢复，石菖蒲开窍醒神，健脑益智，丁香、诃子降逆止呕、顺咽利气，诸药相伍，阴阳相配，水火相济，共为君药；红花、川芎活血行气，水蛭、壁虎破血化瘀，有“破瘀血而不伤新血”之能，降香、珍珠宽胸纳气，镇静安神，陆药相伍,活血而不耗血，祛瘀又能生新，安神有定志，共为臣药；二丑、猪牙皂、瓜蒌、水牛角攻积导滞、逐瘀通络，清心火，安神志；黄芪、西洋参益气固脱，二药合用，一防攻伐太过、二防活血乏力，冰片、薄荷“芳香走窜，引药上行”，桔梗、苍耳子，穿山龙利气开窍，共佐君臣畅通阴阳升降之路，马钱子解痉熄风通络、络石藤镇静安神，舒筋活络，担当理顺气机之要道，诸药合用，直达病所，可使痰瘀胶消失，咽关舌根灵活，标本兼治，吞咽功能恢复。
研究表明：本发明吞咽困难片的临床总有效率为88.67％，对照组为57.58％，疗效优于对照组P＜0.05，说明“吞咽困难片”对吞咽功能、营养状况、精神心理等疗效可靠性；吞咽困难片没有不良事件及并发症。
附图说明
图1两组患者洼田饮水评级随治疗时间的变化；
图2两组患者藤岛一郎评分随治疗时间变化；
图3两组患者生活质量评分随时间变化；
图4两组卒中神经功能评分随时间变化；
图5两组疗效对比；
图6两组临床疗效比较构成；
图7CCR-8检测不缺氧时间点细胞活力变化；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组12h相比(P﹥0.05)；
图8 24h不同代次凋亡率变化(n＝5，ˉx±s％)注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图972h不同代次凋亡率变化(n＝5，ˉx±s％)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图10 5d不同代次细胞凋亡率变化(n＝5ˉx±s％)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图11 24h时同一代次细胞周期变化(P3)注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；
图12 24h时同一代次细胞周期变化(P5)注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；
图13 24h时同一代次细胞周期变化(P7)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；
图14 72h时同一代次细胞周期变化(P3)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；
图15 72h时同一代次细胞周期变化(P5)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；
图16 72h时同一代次细胞周期变化(P7)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；
图17 5d时同一代次细胞周期变化(P3)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；
图18 5d时同一代次细胞周期变化(P5)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；
图19 5d时同一代次细胞周期变化(P7)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；
图20microRNA-124a标准曲线图；
图21Survivn标准曲线图；
图22Caspase-3标准曲线图；
图23PARP标准曲线图；
图24β-actin标准曲线图；
图25不同时间点microRNA-124表达变化(n＝5，ˉx±s％)注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图26不同时间点Survivn表达变化(n＝5，ˉx±s％)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图27不同时间点Caspase-3表达变化(n＝5，ˉx±s％)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图28不同时间点PARP表达变化(n＝5，ˉx±s％)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图29不同时间点microRNA-124蛋白表达变化(n＝5，ˉx±s％)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图30不同时间点Caspase-3蛋白表达变化(n＝5，ˉx±s％)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图31不同时间点PARP蛋白表达变化(n＝5，ˉx±s％)；注：＊与正常组相比(P＜0.05)，#与模型组相比(P＜0.05)；※与治疗组相比(P＜0.05)；◎与对照组相比(P＞0.05)；
图32不同时间点的TEER值(
Figure BDA0002510956490000071
,n＝6))；注：*与单层BMEC组相比，各时间点均有有差异(P＜0.05)；
图33各组对体外模拟BBB模型不同时间点TEER值的影响(
Figure BDA0002510956490000072
,n＝6)；注：在同一时间点，各组#与模型组比较(P＜0.05)；＊与对照组、正常组比较(P＜0.05)；
图34第1天各组对Occludin mRNA和claudin-5mRNA表达量(
Figure BDA0002510956490000073
,n＝8)注：#与模型组比较(P＜0.05；※与治疗组比较(P＜0.05)；
图35第3天各组对大鼠脑组织Occludin和claudin-5mRNA的表达影响；注：#与模型组比较(P＜0.05)；※与治疗组比较(P＜0.05)；
图36第7天各组对大鼠脑组织Occludin和claudin-5mRNA的表达影响，注：#与模型组比较(P＜0.05)；※与治疗组比较(P＜0.05)；
图37第14天各组对大鼠脑组织Occludin和claudin-5mRNA的表达影响，注：#与模型组比较(P＜0.05)；※与治疗组比较(P＜0.05)。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种治疗脑梗塞后遗症的中成药，由下述重量份数的原料配制而成：黄芪12份、红花12份，巴戟天10份、川芎12份、水蛭12份、二丑7份、石菖蒲10份、冰片4份，桔梗13份、薄荷138份、猪牙皂4份、壁虎4份、马钱子4份、西洋参12份，瓜蒌12份、桑寄生12份、木蝴蝶12份、楮实子12份、络石藤12份，苍耳子12份，穿山龙12份，丁香12份、诃子4份、降香4份、珍珠4份、水牛角12份。
本发明提供治疗脑梗塞后遗症的中成药的制备方法如下：
1)按黄芪、红花、巴戟天、川芎、水蛭、二丑、石菖蒲、冰片，桔梗、薄荷、猪牙皂、壁虎、马钱子、西洋参，瓜蒌、桑寄生、木蝴蝶、楮实子、络石藤，苍耳子，穿山龙，丁香、诃子、降香、珍珠、水牛角混合粉碎成细粉，将该细粉过100目筛，得粉末混合物，将冰片粉碎得冰片粉末另存备用；
2)将步骤1)中所得粉末采用双提法连续回流提取，第一次提取加8倍于粉末重量的水，第二次提取加6倍于粉末重量的水，采用电热套加热，每次提取先用270～300℃的高温烧开然后用150～200℃的低温维持沸腾30min，采用挥发油提取器提取挥发油，制得挥发油另存备用，把两次提取后的水煎液合并过滤得水提液，把水提液放入离心机以每分钟4000转的速度离心处理，离心15min后得上清液；
3)将步骤2)中制得的上清液放入旋蒸仪，蒸发除去水分，得浸膏含水量为60％，干燥浸膏得干浸膏；
4)将步骤3)中所述干浸膏与步骤1)中所述冰片粉末按1：1的重量比混合研磨成细粉，将该细粉过100目筛，得粉末颗粒；
5)将步骤4中制得的粉末颗粒与适量5～10ml 95％乙醇(95％乙醇与粉末颗粒1：3的容量比)混合制成软材，用14目筛将该软材挤成颗粒，把所得颗粒摊于白瓷盘内放入烤箱烘干；
6)控制步骤5)中从烤箱出来的干颗粒的含水量在5％；
7)把步骤6)中制得到的干颗粒与其重量的3％的滑石粉混合，将步骤2)中制得的挥发油与95％的乙醇按1：4的容量比混合，得混合液，把该混合液喷入加了滑石粉的干颗粒中，混合均匀，然后用14目筛作整粒处理，整粒后压片，制得片重为0.5g的片剂。
实施例2
一种治疗脑梗塞后遗症的中成药，由下述重量份数的原料配制而成：黄芪9份、红花9份，巴戟天7份、川芎9份、水蛭9份、二丑3份、石菖蒲7份、冰片1份，桔梗9份、薄荷9份、猪牙皂1份、壁虎1份、马钱子1份、西洋参9份，瓜蒌9份、桑寄生9份、木蝴蝶9份、楮实子9份、络石藤9份，苍耳子9份，穿山龙9份，丁香9份、诃子1份、降香1份、珍珠1份、水牛角9份。其制备方法同实施例1。
实施例3
一种治疗脑梗塞后遗症的中成药，由下述重量份数的原料配制而成：黄芪18份、红花18份，巴戟天15份、川芎18份、水蛭18份、二丑12份、石菖蒲15份、冰片6份，桔梗18份、薄荷18份、猪牙皂6份、壁虎6份、马钱子6份、西洋参18份，瓜蒌18份、桑寄生18份、木蝴蝶18份、楮实子18份、络石藤18份，苍耳子18份，穿山龙18份，丁香18份、诃子6份、降香6份、珍珠6份、水牛角18份。
其制备方法同实施例1。
实验例1中风后吞咽障碍治疗中风后吞咽障碍临床研究
诊断标准
⑴西医诊断标准：参照2017年版“中国吞咽障碍康复评定与治疗专家共识组通过的中国吞咽障碍评估与治疗专家共识”，并经头部CT或磁共振成像(MRI)确诊。同时具有：
①发音及语言障碍，咀嚼及吞咽障碍，饮水呛咳；
②软腭、咽喉肌、舌肌、咬肌或面肌运动障碍，但无舌肌萎缩及束颤；
③咽反射存在,或减弱或消失，软腭反射减弱或消失；
④锥体束征(一侧或双侧肢体瘫痪)或情感障碍(淡漠、痴呆或强哭强笑)；
⑤或具备上述主症中2项且合并吞咽障碍。
⑵中医诊断标准:参照2008年中华中医药学会发布的《中医内科常见病诊疗指南》：
①主症：偏瘫、神识昏蒙、言语謇涩或不语、偏身感觉异常、口舌歪斜；
②次症：头痛、眩晕、瞳神变化、饮水发呛、目偏不瞬、共济失调；
③急性起病，发病前多有诱因，常有先兆症状；
④发病年龄多在35岁以上；
⑤具备两个主症以上，或一个主症两个次症，结合起病诱因、先兆症状、年龄即可确诊；
⑥不具备上述条件，结合影像学检査结果亦可确诊。
⑶纳入标准:
①符合卒中诊断标准；
②伴有不同程度吞咽功能障碍；
③洼田饮水试验吞咽困难评级异常或藤岛一郎吞咽障碍评价标准评分异常；
④年龄<85岁；
⑤患者神志正常，行为配合；
⑥自愿受试，签署知情同意书，依从性好能随访。
研究方案
1、病人收入情况：
1.1、病例来源：于2016年09月至2019年03月的河南中医药大学第三附属医院脑病科住院和门诊病人。均符合纳入标准和排除标准的中风后吞咽困难患者，采用随机对照试验的方法分为治疗组和对照组，两组病人在年龄、性别、病程、中医证型、洼田吞咽能力及吞咽困难分级等方面P＞0.05，无显著性差异。所有入组的病例均对本研究知情并签署知情同意书。
2、病人分组：两组均接受神经内科常规基础治疗。神经内科常规治疗:包括抗凝、抗血小板凝集、脑保护、改善脑循环、控制血压、血糖及对症治疗；
对照组：基础治疗，配合血塞通胶囊，每次2两粒，一日三次。
治疗组：基础治疗，配合吞咽困难片，每次2两粒，一日三次。15天/疗程，均进行3疗程。
3、临床评价方法
3.1、中风后中医症状改善评价
根据中风后症状评价积分量表，按照量表评价打分。
3.2、卒中后患者神经功能评价
根据病人治疗前后头晕目眩、吞咽困难、饮水呛咳、言语障碍等症状和神经功能变化情况，按照量表评价打分。
3.3、洼田饮水试验评价
洼田氏饮水试验：首先准备30ml左右温开水、水杯、纸巾等。让病人取得合适体位，站在患者健侧，帮助患者取坐位或坐卧位，肩部垫高，颈部稍前倾。经口摄入30ml左右温开水，一次摄入5-10ml，观察全部吞咽需要的时间及呛咳的情况，按照量表评价打分。
3.4、藤岛一郎吞咽困难评价
藤岛一郎吞咽困难评价标准：嘱患者端坐，咽下汤汁状、糊状等不同状态的食物，观察患者能否经口咽顺利安全进食，期间有无咀嚼、吞咽障碍，咽下时有无误吸、呛咳等，判断患者能否经口咽顺利安全摄食，按照量表评价打分。
3.5、患者生活质量改善情况
根据患者治疗前后进食方式、营养状况、活动度、言语功能、精神心理方面改善情况，按照量表评价打分判断患者治疗前后的生活质量改善情况。
3.6、吞咽X线透视检查(VFSS)评价吞咽功能
患者在踏板上取站位或坐位，头部自然直立，吞咽时尽量避免头部大幅度摆动。让患者口含一口钡剂，尽可能地一次吞下，然后再让患者于正位、侧位重复操作一次，再做不服造影剂的空吞咽动作3次，在操作过程中一旦患者出现误咽应即刻停止操作。通过电视录像观察造影剂在口腔、咽喉、食管这三个阶段整个推送情况，用电子秒表记录受试者在治疗前、后口服钡剂通过咽腔期的过程，同时评价受试者咽腔部功能，观察并记录在梨状隐窝及会厌谷处是否有造影剂残留，是否存在误吸的情况。
4、疗效判定标准
痊愈：吞咽功能接近正常，洼田饮水试验评定1级或藤岛一郎吞咽评分为10分；或吞咽X线电视透视检查评分9分。
有效：吞咽困难明显改善，并符合洼田饮水试验评定较治疗前提高1级或1级以上、和藤岛一郎吞咽评分较治疗前提高≥2分和吞咽X线电视透视检查评分较治疗前提高≥2分；
无效：吞咽障碍改善不明显，饮水试验或藤岛一郎吞咽评分无变化或评分较治疗前降低者，或吞咽X线电视透视检查评分4分以下。
5、统计分析
数据均采用SPSS20.0软件进行统计学分析，对于计量资料进行正态检验，以均数±标准差
Figure BDA0002510956490000113
表示，组内比较选用配对t检验，组间比较选用独立样本t检验，不符合正态分布的采用秩和检验；计数资料选用X2检验，有序分类资料选用秩和检验，统计检验均采取双侧检验，检验水准取0.05。
6、研究结果
1、病情程度资料
入组患者的洼田饮水评分、藤岛一郎吞咽评价评分，治疗前病情P＞0.05，差异无统计学意义。
2、评级比较
2.1洼田饮水试验评级比较
表1两组间洼田饮水评级比较
Figure BDA0002510956490000111
Figure BDA0002510956490000112
Figure BDA0002510956490000121
注：两组间洼田饮水吞咽评级秩和检验P＞0.05。
2.2藤岛一郎吞咽评级比较
表2两组间藤岛一郎吞咽评级比较
Figure BDA0002510956490000122
Figure BDA0002510956490000123
注：两组间藤岛一郎吞咽评级比较，秩和检验P＞0.05。
3、临床观察指标情况
3.1两组洼田饮水评级比较
治疗前两组患者的洼田饮水评级经秩和检验P＞0.05，没有统计学意义；治疗组患者的洼田饮水评分在第一、二、三疗程后相比治疗前均有所进步P＜0.05；对照组在同一时段评分较治疗前进步较慢，说明吞咽困难片对中风后吞咽困难效果明显；在同一时间点治疗组与对照组比较P＜0.05，进一步验证吞咽困难片对中风后吞咽困难治疗优势；第一疗程和第二疗程治疗组较对照组恢复更明显，提示吞咽困难片早期参与病人治疗效果更明显。随着治疗时间延长，第三疗程较第一疗程和第二疗程恢复较慢，但治疗组病人症状好转程度仍明显优于对照组P＜0.05；说明吞咽困难片在中风后吞咽困难康复的全程均有效改善症状。具体见表3和图1所示。
表3两组患者洼田饮水评级比较
Figure BDA0002510956490000124
组别 治疗前 治疗10天 治疗20天 治疗30天
治疗组 4.17±0.66＊ 2.97±0.62#※ 2.26±0.74#※ 2.03±0.71#※
对照组 4.30±0.64 4.08±0.17※ 3.95±0.83※ 3.32±0.04※
P P＞0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05
注：与对照组相比＊P＞0.05；与对照组相比#P＞0.05；与治疗前相比※P＜0.05。
3.2、两组患者藤岛一郎评分
治疗前两组患者的藤岛一郎评分经秩和检验P＞0.05，没有统计学意义；治疗组患者的藤岛一郎评分在第一、二、三疗程后相比治疗前均有所进步P＜0.05；对照组在同一时段评分较治疗前进步较慢，说明吞咽困难片对中风后吞咽困难效果明显；在同一时间点治疗组与对照组比较P＜0.05，进一步验证吞咽困难片对中风后吞咽困难治疗优势；第一疗程和第二疗程治疗组较对照组恢复更明显，提示吞咽困难片早期参与病人治疗效果更明显。随着治疗时间延长，第三疗程较第一疗程和第二疗程恢复较慢，但治疗组病人症状好转程度仍明显优于对照组P＜0.05；说明吞咽困难片在中风后吞咽困难康复的全程均有效改善症状。具体间表4和图2所示。
表4两组患者藤岛一郎评分比较
Figure BDA0002510956490000131
组别 治疗前 治疗10天 治疗20天 治疗30天◎
治疗组 2.40±0.88＊ 4.03±0.75#※ 4.60±0.60#※ 4.97±0.71#※
对照组 2.33±0.78 2.83±0.21※ 3.28±0.34※ 3.88±0.35※
P P＞0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05
注：与对照组相比＊P＞0.05；与对照组相比#P＞0.05；与治疗前相比※P＜0.05。
3.3、两组患者生活质量评分
两组患者治疗前生活质量评分，秩和检验显示两者之间P＞0.05，差异没有统计学意义；同一组病人治疗前与治疗后10天、20天、30天进行生活质量评分比较P＜0.05，说明吞咽困难片对中风后吞咽困难有效，提高病人生活质量；随着治疗时间延长，治疗组病人生活质量提高程度明显优于对照组，显示吞咽困难片可靠的疗效。见表5和图3所示。
表5两组患者生活质量评分比较
Figure BDA0002510956490000132
组别 治疗前 治疗10天 治疗20天 治疗30天
治疗组 4.71±0.67＊ 7.69±0.51#※ 9.91±0.22#※ 11.60±0.59#※
对照组 4.64±0.98 5.76±0.75※ 6.67±0.80※ 7.82±0.65※
P P＞0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05
注：与对照组相比＊P＞0.05；与对照组相比#P＞0.05；与治疗前相比※P＜0.05.
3.4、两组VFSS评分比较：
两组患者治疗前与治疗后30天进行的VFSS评分经秩和检验P＞0.05，没有统计学意义；治疗组患者的VFSS评分在30天后相比治疗前均有所进步P＜0.05；对照组在同一时段评分较治疗前进步较慢，说明“吞咽困难片”对中风后吞咽困难效果明显；在同一时间点治疗组与对照组比较P＜0.05，进一步验证吞咽困难片对中风后吞咽困难治疗优势。
表6两组VFSS评分比较
Figure BDA0002510956490000141
组别 治疗前 治疗后
治疗组 3.31±0.21＊ 6.77±0.29#
对照组 3.12±0.27 4.23±0.51※
注：与对照组相比＊P＞0.05；与对照组相比#P＞0.05；与治疗前相比※P＜0.05。
3.5、治疗前两组误吸评级比较：
两组患者治疗前误吸评级，秩和检验显示两者之间P＞0.05，差异没有统计学意义。
表7治疗前两组误吸评级比较
Figure BDA0002510956490000142
注：秩和检验P＞0.05，具有可比性。
3.6、治疗后两组误吸评级比较：
两组患者治疗前与治疗后30天进行误吸评级比较P＜0.05，说明吞咽困难片对中风后吞咽困难有效，明显减少病人误吸发生；随着治疗时间延长，治疗组减少病人误吸明显优于对照组，说明“吞咽困难片”可以缩短吞咽反射的延迟时间，从而逐渐恢复吞咽功能，显示吞咽困难片可靠的疗效。
表8治疗后两组误吸评级比较
Figure BDA0002510956490000143
注：秩和检验P＜0.05，差异有统计学意义。
3.7、两组卒中神经功能评分比较：
两组患者治疗前卒中神经功能评分，秩和检验显示两者之间P＞0.05，差异没有统计学意义；对同一组病人治疗前与治疗后10天、20天、30天进行卒中神经功能评分比较P＜0.05，说明吞咽困难片不仅对中风后吞咽困难有效，也能促进脑梗塞患者的神经功能恢复，在同一时间点及治疗前后，治疗组较对照组均有优势；而且前10天治疗组与对照组的吞咽困难患者卒中神经功能恢复均最快，且治疗组较对照组恢复更快；随着治疗时间延长，治疗组病人卒中神经功能好转程度仍明显优于对照组；说明吞咽困难片在改善中风后吞咽困难症状同时，也能促进脑梗塞患者的神经功能恢复。具体间表9和图4。
表9两组卒中神经功能评分比较
Figure BDA0002510956490000151
组别 治疗前 治疗10天 治疗20天 治疗30天
治疗组 21.54±0.86＊ 15.40±0.80#※ 11.94±0.03#※ 11.17±0.04#※
对照组 21.82±0.22 19.45±0.35※ 17.61±0.12※ 15.39±0.09※
P P＞0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05
注：与对照组相比＊P＞0.05；与对照组相比#P＞0.05；与治疗前相比※P＜0.05。
3.8综合临床疗效比较
两组病人通过治疗前后的洼田饮水试验、藤岛一郎吞咽功能评定法、VFSS评分、床旁吞咽评分、营养评分、生活质量评分及中风后神经症状的比较，治疗组总有效率为88.67％，对照组为57.58％，治疗组疗效明显优于对照组，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)，说明吞咽困难片治疗中风后吞咽困难效果明显。具体见表10和图5、图6。
表10两组临床疗效比较
Figure BDA0002510956490000152
组别 例数 痊愈(％) 有效(％) 无效(％) 总有效率(％)
治疗组 35 10(28.57) 21(60.00) 4(11.43) 88.67※
对照组 33 3(9.09) 16(48.48) 14(42.42) 57.58
注：※与对照组比较P＜0.05。
实验小结：
1、吞咽困难片的临床总有效率为88.67％，对照组为57.58％，疗效优于对照组P＜0.05，说明吞咽困难片对吞咽功能、营养状况、精神心理等疗效可靠性；
2、吞咽困难片没有的不良事件及并发症。
实验例2吞咽困难片对骨髓间充质干细胞增值分化的体外研究
1、实验动物
SPF级SD大鼠雄性：成年鼠100只，体重(200±10)g；新生2周内乳鼠100只。新生2周内乳鼠由郑州大学医学院实验动物中心提供，成年鼠由山东省鲁抗动物实验室提供。所有的动物实验均得到河南中医学院动物伦理委员会的批准，所有实验操作均按照《河南实验动物管理条理》的相关规定。
2、实验药品
吞咽困难片，每片0.5克。课题组监制。
3、实验方法
3.1、含药血清的制备
将SPF级SD雄性大鼠40只，随机分为生理盐水组、吞咽困难片组，每组20只。各用药组剂量按照成人每日给药量18倍计算(即每日灌胃剂量为：吞咽困难片组12.29g/mL/100g、对照组按平均剂量灌胃)。早晚各一次，连续灌胃七天，第八天上午末次给药90分钟后麻醉(4％水合氯醛：0.3mL/100g)，腹主动脉一次采血8-10mL，室温静置30min后，3500转/min离心15min，再将离心过的血清小心吸入15mL离心管中，56℃恒温水箱灭活30min，然后超净台内0.22um过滤器过滤到无菌的15mL离心管中，标记，密封后-80℃冰箱保存备用。
3.2BMSCs的提取、培养及分离纯化
SD新生大鼠2周内，脱颈处死后，迅速剥离两侧股骨及胫骨，剔去表面骨膜肌肉，放入盛有75％酒精的消毒好的培养皿中，放入超净台中。用消毒好的无菌眼科镊将骨头放入盛有PBS的小玻璃瓶中，冲洗3-5遍，用无菌眼科剪小心剪去骨头两端的骨骺，充分暴露骨髓腔，继用15mL注射器抽取适量的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入15mL无菌离心管中，直至骨头呈透明状。移液枪充分混匀悬液后，200目钢筛过滤至15mL离心管中，1000转，5min离心。小心弃去上清后，加5mL完全培养基混匀后种入细胞瓶中。倒置显微镜下观察细胞数量和细胞状态；恒温培养箱(37℃、5％C02)内培养，48小时首次换液。首次换液后隔1天换液，每天倒置显微镜下观察细胞的生长情况。将大部分分选后的细胞先移入12孔培养板继续培养，1周后移入6孔培养板，然后逐渐移入较大容积的培养皿。分选后的细胞培养液为生长培养基，每3天换液一次。培养备用。
4、实验方法：
4.1、模拟缺血缺氧微环境细胞模型建立
参考文献并结合课题组前期研究，采用无血清(serum deprivation,SD)和缺氧(1％O2,5％CO2,94％N2)模拟缺血缺氧微环境。采用英国Don Whitley Scientific公司生产的低氧细胞工作站，设定低氧细胞工作站温度为37℃,5％CO2浓度分别设为4％和1％，通过释放N2自动调整CO2和O2至设定浓度，低氧细胞工作站达到设定的条件，模拟细胞缺氧环境。
4.2、分组、给药：以1xl05密度接种到6孔板于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养24h后取出，镜下观察细胞密度适中、形态正常，状态良好，移液枪缓慢吸出各孔培养基后加入2ml PBS缓冲液轻柔清洗2遍以去残留血清，枪缓慢吸出各孔pbs缓冲液。移至超净台，将6孔培养板中BMSCs随机分为正常组、对照组、模型组、治疗组，每组加入培养基如下：
1)正常组:以完全培养基培养(L-DMEM+10％FBS)正常培养
2)对照组：加入生理盐水血清培养基，放入低氧细胞工作站培养24h；
3)模型组：以完全培养基培养(L-DMEM+10％FBS)，低氧细胞工作站培养24h；
4)治疗组：加入含有吞咽困难片含药血清培养基，低氧细胞工作站培养24h；
5、观察指标
5.1、CCK-8法检测BMSCs的细胞活力变化
5.2、采用Hoechst 33342染色及荧光显微镜观察凋亡细胞形态变化；
5.3、采用AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况；
5.4、流式细胞术测定不同代次BMSCs细胞周期的变化；
5.5、实时荧光PCR技术检测microRNA-124a及Caspase-3、Survivn、PARP-MRNA表达情况。
5.6、Western blot检测microRNA-124a及其Caspase-3、PARP蛋白表达。
6、结果
6.1、CCR-8检测不缺氧时间点细胞活力变化
图7所示，6h组与正常组比较细胞活力明显降低，有统计学意义，12h组细胞活力较正常组相比显著降低,24h组细胞活力较正常组相比显著降低，而处理12h与24h组间比较无显著差异(P﹥0.05)，最终选择缺血缺氧24h作为诱导细胞损伤及检测其他指标的时相点。
6.2、Hoechst染色荧光显微镜观察结果
荧光显微镜观察：正常组细胞的细胞核形态为圆形或卵圆形，染色后呈均一蓝色荧光，模型组和对照组；开始可见细胞核界限清晰，呈圆形或椭圆形，为均匀蓝色荧光，染色质分布均匀，少见凋亡细胞。渐渐出现凋亡细胞，凋亡细胞数量开始增多，染色质开始出现凝集现象，并且成颗粒团状分布，细胞核发生皱缩，染色质浓集或颗粒状，散在碎片，荧光染色明显增强，呈亮蓝色且随着代次增加，凋亡的细胞数目不断增加，部分可见凋亡小体出现，亮蓝色细胞核数目也逐渐增多。治疗组较模型组细胞核染色质的形态上有很大的改变，但接近于正常组，凋亡现象较模型组轻。
6.3、双染流式细胞仪检测不同代次细胞凋亡情况
结果见图8、图9、图10所示。
6.4、不同代次BMSCS细胞周期变化
结果见图11-图19所示。
6.5、不同时间点microRNA-124a、Survivn、Caspase-3、PARP-mRNA表达软件生成的各组基因及内参的标准曲线R2均大于0.99，扩增效率为90％-110％，说明以上反应条件及体系能够较为准确的测定目的基因的相对表达量。各组样本RNA经过纯度检测后，逆转录为cDNA，然后real-time-PCR检测各组细胞microRNA-124a、Survivn、Caspase-3、PARP-mRNA的表达，可见：各溶解曲线无杂峰，呈单一峰，扩增曲线显示无非特异性扩增或者出现引物二聚体，表明产物特异性良好。具体见图20-图28所示。
6.7、采用Western blotting法检测不同时间点microRNA-124a、Survivn、Caspase-3、PARP蛋白表达
结果见图29-图31所示。
实验小结：
1、正常条件下培养的细胞凋亡率极低，模型组与正常组相比细胞凋亡率明显增加(P﹤0.05))；治疗组细胞凋亡率与模型组相比显著降低(P﹤0.05))，说明吞咽困难片可以降低缺血缺氧环境条件细胞凋亡率，但随着缺氧时间的延长，各组细胞发生凋亡，存活率逐渐明显下降。
2、模型组与正常组相比Survivn、Caspase-3、PARP-mRNA和蛋白表达均增加(P<0.05)，治疗组与模型组相比Caspase-3、PARP-mRNA和蛋白表达量降低，说明BMSCs在缺血缺氧环境下凋亡增强，并随缺血缺氧时间延长呈加重动态变化，给予药物干预后Survivn、Caspase-3、PARP-mRNA和蛋白表达降低。提示吞咽困难片可减轻缺血缺氧环境下BMSCs凋亡，可能与其抑制Survivn、Caspase-3、PARP等凋亡相关蛋白表达水平表达有关。
3、模型组与正常组相比microRNA-124-mRNA和蛋白表达均增加(P<0.05)，治疗组与模型组相比microRNA-124-mRNA和蛋白表达量降低，说明给予吞咽困难片干预后microRNA-124-mRNA和蛋白表达降低。提示microRNA-124不仅能够提高缺血缺氧环境下BMSCs的存活能力，还能通过抑制Caspase-3的活化有效抵抗缺血缺氧诱导的BMSCs凋亡，实现提高BMSCs抗凋亡作用。
4、同一代次模型组与正常组比较，S期细胞数增多(P<0.05)，表明低氧可诱导细胞周期显著阻滞于S期，治疗组与模型组比较，S期细胞数减少。不同时间，治疗组与对照组细胞相比较GO/GI期细胞增多，表明发生GO/GI期阻滞，说明吞咽困难片可以提高细胞增殖能力，降低细胞死亡率。
实验例3：吞咽困难片药调控干细胞的旁分泌效应对脑梗死大鼠模型损伤脑组织的保护作用
1、实验动物
健康SpragueDawzey(SD)雄性大鼠158只，体重280～300g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2006-0009，动物级别：SPF级。饲养于河南中医学院动物实验中心，饲养室内氨浓度小于20ppm，室内温度为18～22℃，通风，清洁，相对湿度40％～70％。明暗周期各12h，自由摄食和饮水，定期更换垫料，喂养1周后分组饲养。
2、大脑中动脉栓塞大鼠模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)制作
大鼠脑缺血再灌注损伤模型主要步骤为：10％水合氯醛(35mg/100g)腹腔麻醉后，常规消毒，取颈正中切口，依次分离左侧颈总动脉(CCA),颈外动脉(ECA)与颈内动脉(ICA)，结扎ECA、CCA,在颈总与颈内分叉处系一活结。血管夹夹闭分叉口远心端，提起CCA，以血管剪在CCA至ICA分叉口处剪一小口。镊子夹持线栓将其圆钝一头自剪口处插入CCA，然后将线栓送至ICA。线栓碰到血管夹时，系紧ICA上的丝线。松开血管夹，将线栓继续送向颅内，入颅时稍遇阻力则止，计算栓线插入深度距离ICA、ECA分叉处(约18±0.5mm)。ICA上丝线打一死结。线栓尾部留在皮肤表面，逐层缝合皮肤，消毒伤口。术后大鼠侧卧，注意保暖。
在缺血2小时时，将尼龙线轻轻外抽，感到阻力时，表明线栓的头端已回到ICA的主干中，实现大脑中动脉的再灌注。术后大鼠自由吃食、饮水。并连续三天给予青霉素抗感染。
3、分组、给药
术后存活24小时的大鼠随机分为模型组、吞咽困难片高、中、低剂量组；正常组不灌胃。模型组与吞咽困难片组分别给予生理盐水、吞咽困难片高剂量、吞咽困难片中剂量、吞咽困难片低剂量灌胃。各组再随机按1d、3d、7d、14d、28d时点分为亚组，实验结束时保证每亚组仍有8只存活大鼠。根据《药理实验方法学》所示体表面积剂量换算法计算，参考前期预实验结果，将实验用药吞咽困难片以生理盐水分别配置成20mg/ml,40mg/ml,60mg/ml,对应吞咽困难片高、中、低剂量，用药组大鼠每100克体重灌胃1ml，现配现用。模型组给予生理盐水1ml每100克体重。正常组不给药。所有用药动物均采用灌胃的给药方式。
4、结果：
4.1、神经功能缺损变化
正常组大鼠无神经功能缺损；模型组大鼠出现明显的肢体瘫痪，表现为对侧前肢内收，行走时向患侧转圈甚至倾倒，提尾悬空时对侧前肢紧贴胸壁，不能伸直，且该组大鼠活动、进食和饮水少，用药组大鼠神经功能缺损评分获得不同程度的改善，肌力有明显增加，同时精神状态也有好转，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。
1d各组间大鼠现神经功能缺损比较差异无显著性(P>0.05)，说明各组脑缺血状况基本一致；随着缺血/再灌注时间的延长，各组神经功能缺失症状逐渐减轻；低剂量组和模型组比较差异无显著性(P>0.05，但模型组各时相点神经功能评分均低于其他组，比较差异有显著性(P<0.05)，提示模型组能有效改善大鼠脑缺血/再灌注后的神经功能缺损。具体见表11所示。
表11神经功能评分(NDS)(
Figure BDA0002510956490000211
n＝8)
组别 1d 3d 7d 14d 28d
正常组 0 0 0 0 0
模型组 3.71±0.23 3.23±0.92 3.21±0.83 2.87±0.55 2.67±0.35
血低组 3.52±0.81 3.01±0.21<sup>△</sup> 2.91±0.32<sup>△</sup> 2.23±0.87<sup>△</sup> 1.76±0.91
血中组 3.70±0.44 2.95±0.50<sup>△</sup> 2.15±0.71<sup>△</sup> 2.02±0.50<sup>△</sup> 1.52±0.24
血高组 3.68±0.17 2.76±0.03<sup>△</sup> 1.85±0.97<sup>△</sup> 1.65±0.27△ 0.85±0.32
注：1d时间点高、中、低剂量组与模型组无统计学差异(P>0.05)。高、中剂量组与模型组比有统计学差异(P<0.05),低剂量组与模型组比无统计学差异(P>0.05)。
4.2、不同时间点MCAO脑梗死边缘区CD105的表达
CD105阳性细胞主要分布于脑梗死边缘区，镜下呈棕黄色或棕褐色颗粒，正常组大鼠CD105有弱阳性表达；模型组、吞咽困难片低、中、高剂量组各时间点梗死边缘区CD105阳性细胞数均比正常组增多；模型组、吞咽困难片低、中、高剂量组脑梗死边缘区CD105阳性细胞数在1－7天有增多趋势，7天达到高峰，其后CD105阳性细胞数降低；吞咽困难片中、高剂量组3d、7d、15d、28d时间点CD105阳性细胞数比模型组显著增多，有统计学意义(P＜0.05)；但吞咽困难片低剂量组3d、7d、15d、28d时间点CD105阳性细胞数比模型组增多不显著，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表12所示。
表12不同时间点CD105阳性细胞数的表达(个/视野)(
Figure BDA0002510956490000212
n＝8)
组别 1d 3d 7d 14d 28d
正常组 1.34±0.22 1.32±0.31 1.44±0.61 1.34±0.41 1.33±0.51
模型组 2.74±0.51 5.60±2.70<sup>*</sup> 8.60±2.70<sup>*</sup> 6.60±2.88 4.66±0.37
低剂量 3.54±0.32 7.80±1.79 11.00±2.23 9.20±3.19 5.94±0.61
中剂量 4.68±0.48 9.60±2.70 13.00±3.16 10.80±1.79 8.54±0.33
高剂量 9.64±0.51 12.80±2.59<sup>#</sup> 15.60±2.70 13.80±2.28 10.84±0.51
注：各时间点模型组阳性细胞与正常组相比有差异(P＜0.05)；各时间点高、中剂量组阳性细胞数与模型组相比有差异(P＜0.05)。各时间点低剂量组与模型组相比无显著差异(P＞0.05)。
4.3不同时间点脑梗死边缘区GFAP阳性细胞表达变化
GFAP标记细胞镜下观可见星形胶质细胞胞浆着色，呈现黄色或棕黄色，数目多少不等，主要表达在缺血区周围星形胶质细胞的突起和胞质中，毛细胞血管及神经元也有少量表达。正常组：偶见GFAP阳性细胞，模型组、吞咽困难片低、中、高剂量组各时间点梗死周边GFAP阳性细胞数均比正常组明显增多；模型组、吞咽困难片低、中、高剂量组大鼠缺血周围区GFAP阳性细胞数随缺血时间延长有增多趋势，在7天达到高峰，其后降低；吞咽困难片中、高剂量组3d、7d、15d、28d时间点CD105阳性细胞数比模型组相应时间点显著增多，差异有统计学意义(P＜0.05)；低剂量组比相应模型组增多则不显著P＞0.05。
表13：不同时间点GFAP阳性细胞数的表达情况(个/视野)(
Figure BDA0002510956490000221
n＝5)
组别 1d 3d 7d 14d 28d
正常组 4.62±0.57 4.83±1.47 5.50±1.64 5.33±1.75 5.17±1.16
模型组 5.72±0.57 7.33±1.21 13.17±2.47 8.83±1.50 4.17±1.83
血低组 5.77±0.36 7.83±0.26 16.26±1.78 9.50±1.51 5.33±1.57
血中组 6.23±0.52 8.50±0.74 18.50±1.04 11.50±1.78 6.65±0.23
血高组 6.92±0.47 8.83±1.13 20.00±1.41 12.17±1.47 7.17±1.72
注：各时间点模型组阳性细胞与正常组相比有差异(P＜0.05)；各时间点高、中剂量组阳性细胞数与模型组相比有差异(P＜0.05)。各时间点低剂量组与模型组相比无显著差异(P＞0.05)。
4.2不同时间点脑梗死边缘区Map-2的表达变化
MAP-2标记细胞镜下观可见神经元胞浆着色。正常组大鼠脑组织内的MAP-2呈低表达状态，在不同时相无明显变化。模型大鼠脑梗死后3d时，脑组织MAP-2表达即达到高峰，与正常组比较差异有显著性意义(P<0.05)，后逐渐下降，至第14天时降至正常水平，与正常组比较差异无显著性意义(P>0.05)，说明脑内神经元在正常状态下无明显分化，在脑缺血刺激下可引起神经元分化。吞咽困难片中、高剂量组大鼠缺血周围区MAP-2阳性细胞数随缺血时间延长有增多趋势，在14天达到高峰，其后降低；吞咽困难片中、高剂量组3d、7d、15d、28d时间点CD105阳性细胞数比模型组相应时间点显著增多，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明吞咽困难片能促进神经元分化，并使其处于持续较长时间分化状态，低剂量组与模型组相比增多则不显著，差异无统计学意义(P＞0.05)。
表14：不同时间点Map-2阳性细胞数的表达情况(个/视野)(
Figure BDA0002510956490000231
n＝8)
组别 1d 3d 7d 14d 28d
正常组 5.68±1.90 5.61±2.80 5.77±1.69 5.59±2.38 5.93±0.34
模型组 7.41±1.06 20.69±3.50 22.26±2.39 14.51±1.98 5.00±1.03
血高组 13.16±5.20 31.06±5.95 3 34.58±5.16 38.65±5.85 28.04±5.77
血中组 11.18±1.27 27.12±1.23 31.27±4.27 34.62±1.03 25.23±0.74
血低组 8.18±1.60 22.87±1.70 23.71±1.39 15.27±0.98 8.21±4.15
注：各时间点模型组阳性细胞与正常组相比有差异(P＜0.05)；各时间点高、中剂量组阳性细胞数与模型组相比有差异(P＜0.05)。各时间点低剂量组与模型组相比无显著差异(P＞0.05)
4.1不同时间点脑梗死边缘区Brdu的表达变化
BrdU标记细胞镜下观可见神经细胞成椭圆形或不规则状，胞体较大，核膜核仁明显，深染成黄棕色，核仁可见分裂相。模型组、吞咽困难片低、中、高剂量组各时间点梗死周边BrdU阳性细胞数均比正常组明显增多；模型组、吞咽困难片低、中、高剂量组大鼠缺血周围区BrdU阳性细胞数随缺血时间延长有增多趋势，在14天达到高峰，其后BrdU阳性细胞数降低；吞咽困难片中、高剂量组3d、7d、15d、28d时间点BrdU阳性细胞数比模型组相应时间点显著增多，差异有统计学意义(P＜0.05)；低剂量组比相应时间点模型组增多不显著，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表15。
表15：不同时间点BrdU阳性细胞数的表达情况(个/视野)(
Figure BDA0002510956490000232
n＝5)
Figure BDA0002510956490000233
Figure BDA0002510956490000241
注：各时间点模型组阳性细胞与正常组相比有差异(P＜0.05)；各时间点高、中剂量组阳性细胞数与模型组相比有差异(P＜0.05)。各时间点低剂量组与模型组相比无显著差异(P＞0.05)。
实验例4吞咽困难片对体外模拟BBB模型通透性的调控作用
1、建立体外血脑屏障细胞模型。
1.1、内皮细胞、星型胶质细胞培养、鉴定：
将1月龄SD幼鼠脱臼处死、断头,置于75％乙醇中浸泡3min后开颅取脑、将大脑皮层剪成1mm3的碎块,皮质匀浆后，依次经100目、200目筛网过滤，收集200目滤网上物质，DMEM/F12培养液悬浮后、离心。再将沉淀用1ml培养液悬浮，percoll密度梯度离心分离、接种于涂有多聚赖氨酸的塑料培养瓶中，置孵箱中培养备用，并对细胞进行观察。
脑微血管内皮细胞的鉴定:免疫组织化学染色方法检测内皮细胞特异性抗原-Ⅷ因子和星形胶质细胞特异性抗原-胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic porteinGFAP)表达情况。光镜下记数Ⅷ因子和GFAP阳性细胞数
1.2、建立体外模拟血脑屏障(BBB)细胞模型
将孔径0.4um Transwell小室倒置于中号称量瓶中，取传代AC，密度调整到1×106/mL，含20％血清的DMEM培养基重悬后，取1mL种植于Transwell小室下层，37℃、5％CO2条件下，利用表面张力继续培养24h后，将Transwell小室小心翻转放入预先添加培养基的六孔细胞培养板中，保持小室内外的培养基液平一致，继续培养，倒置显微镜观察AC融合至60％左右时，在小室上层种植BMEC，密度为1×107/mL，37℃、5％CO2继续培养，倒置显微镜观察双层细胞生长情况。
2、模型构建成功鉴定
2.1、细胞形态学观察
取底层AC贴壁生长以及共培养双层细胞融合后两个阶段的Transwell小室，将六孔板放置于倒置显微镜下观察其形态并拍照。
2.2、跨内皮细胞间电阻(TEER)测定
共培养模型组与单层BMEC组，在种植BMEC后分别于2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h测量TEER值，测量时将校正后的Millicell-ERS-2仪电极浸入70％乙醇中15min，在空气中干燥15s。用灭菌的电解质溶液冲洗电极。电极短端与长端分别浸入Transwell小室内外侧的培养基中，电极与液面垂直，读取数值并记录.
2.3、液面试漏实验
待检测的TEER值保持恒定不增长后，添加Transwell小室内侧的培养基，使内侧与外侧培养基的液面差＞O.5cm，37℃、5％CO2培养4h后再次测量液面差，如Transwell小室内外侧的液面仍保持明显差距(液面差浮动≤0.lcm)，说明细胞已形成致密的屏障。
3、分组、给药：
收集对数生长期AC,BMEC细胞，分别调整细胞浓度约1×104个/mL,1×105个/mL，每孔取100uL接种于96孔细胞培养板中，待24h细胞贴壁后，再饥饿24h。随机分为：
1)正常组:以完全培养基培养(L-DMEM+10％FBS)正常培养
2)对照组：加入生理盐水血清培养基；
3)模型组：以完全培养基培养(L-DMEM+10％FBS)；
4)治疗组：加入含有吞咽困难片含药血清培养基；
每组设3个复孔，各组按对倍稀释终浓度为208.69ug/mL、104.35ug/mL、52.17ug/mL、26.09ug/mL、13.04ug/mL、6.52ug/mL 6个剂量组。每组设10个平行孔，处理24h后，加入5g/L MTT溶液20uL,37 0C,5％CO2培养4h后，吸去上清液，每孔加入150uL DMSO，水平振荡10min，使之充分溶解，在酶标仪490nm波长处读取各孔吸光度值，计算平均值和细胞存活率。根据细胞存活率确定各组最佳实验药物剂量。细胞存活率％＝(实验组OD值一空白对照组OD值)/(正常组OD值一空白对照组OD值)Ⅹ100％
4、实验方法：
4.1、跨内皮细胞间电阻(TEER)测定
待4h液面试漏实验确定体外BBB初步形成后，设模型组、总方组、吞咽困难片组4，每组3个复孔。将Transwell小室内外侧培养基弃去，小室内侧按照分组分别加入2mL新鲜培养基及各含药剂量的培养基，外侧全部更换新鲜培养基，使Transwell小室内外侧培养基液平保持一致。处理后37℃、5％CO2培养，分别于2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h测量TEER值，比较不同时间TEER值差异和同一时间不同组TEER值差异。
4.2、荧光黄透过率的检测
待4h液面试漏实验确定体外BBB初步形成后，设模型组、总方组、吞咽困难片组，每组3个复孔。药物作用24h后，吸去Transwell小室内外侧的培养基，PBS冲洗细胞3次。将含有终浓度1OOug/mL荧光黄的PBS 1mL加入至Transwell小室内侧，外侧添加PBS保持内外液平一致，37℃、5％CO2培养，4h后收集外侧液体，荧光分光光度计(激发波长427nm，发射波长513nm)下测定吸光度。计算各组荧光黄透过率，比较差异。荧光黄透过率(％)＝外侧荧光黄浓度/内侧加入的荧光黄浓度(100％)
5、结果
5.1、跨内皮细胞间电阻(TEER)测定
共培养模型组与单层BMEC组，每组6个复孔，在Transwell上种植BMEC后分别测量2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h时两组TEER值，结果可见，共培养模型组与单层BMEC组的TEER值都随着时间呈现上升趋势，共培养模型组更为明显，每一时间段TEER值较单层BMEC组TEER值都存在明显差异(P<0.05)。到达72h左右时，两组TEER值都进入稳定状态。见图32所示。
5.2、各组对体外模拟BBB模型TEER影响
将共培养模型分为模正常组、对照组、模型组、治疗组，每组3个复孔。在共培养至72h，4h试漏试验阳性后加药，加药后24h内不同时间段不同组的TEER值测定。与模型组相比，总方组、活血组、补气组的TEER值在各个时间段均显著降低(P﹤0.05)；从趋势图可见，总方组、活血组、补气组均发生了不同程度的降低，尤以总方组最为显著。见图33所示。
5.3、不同时间点各组对大鼠脑组织Occludin和claudin-5mRNA的表达影响
见图34-图37所示。
软件生成的各组基因及内参的标准曲线R2均大于0.99，扩增效率为90％-110％,说明以上反应条件及体系能够较为准确的测定目的基因的相对表达量。各组样本RNA经过纯度检测后，逆转录为cDNA，然后real-time-PCR检测各组细胞Occludin和claudin-5mRNA的表达，可见：各溶解曲线无杂峰，呈单一峰，扩增曲线显示无非特异性扩增或者出现引物二聚体，表明产物特异性良好。
实验小结：
1、模型组TEER值基本恒定，有微微的上浮；与模型组相比，治疗组、正常组、对照组的TEER值在各个时间段均显著降低(P﹤0.05)；活血化瘀方药作用后BBB模型对荧光黄的透过率发生了改变，治疗组与正常组比较透过率差异显著(P﹤0.05)，显示吞咽困难片可以使体外BBB模型的通透性增加。
2、脑缺血后1d，大鼠脑组织Occludin和Claudin-5mRNA转录水平降低，并于损伤后7d降至最低，之后逐渐上调，14d仍低于1d和3d，提示脑缺血引起Occludin和Claudin-5mRNA转录水平的降低，造成TJ断裂是导致BBB通透性改变、损伤程度加重的原因之一。
3、与模型组比较，正常组、对照组、治疗组Occludin和claudin-5mRNA表达显著增加(P﹤0.05)。治疗组与对照组Occludin和claudin-5mRNA表达显著增加(P﹤0.05)，随着时间推进Occludin和claudin-5mRNA表达降低明显。表明活血化瘀方药协同干细胞移植Occludin和Claudin-5mRNA转录水平均较模型组有不同程度改善，吞咽困难片能有效调控脑缺血后BBB通透性，促进BMSCs移植入脑作用。

Claims (2)

1.一种治疗中风后吞咽困难的中成药，其特征在于，由下述重量份数的原料药配制而成：黄芪9～18份、红花9～18份、巴戟天7～15份、川芎9～18份、水蛭9～18份、二丑3～12份、石菖蒲7～15份、冰片1～6份，桔梗9～18份、薄荷9～18份、猪牙皂1～6份、壁虎1～6份、马钱子1～6份、西洋参9～18份，瓜蒌9～18份、桑寄生9～18份、木蝴蝶9～18份、楮实子9～18份、络石藤9～18份，苍耳子9～18份，穿山龙9～18份，丁香9～18份、诃子1～6份、降香1～6份、珍珠1～6份、水牛角9～18份。
2.如权利要求1所述的治疗中风后吞咽困难的中成药，其特征在于，所述中成药为片剂。
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