CN112891375A

CN112891375A - 一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法及应用

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Publication number: CN112891375A
Application number: CN202110075580.0A
Authority: CN
Inventors: 张平; 李栋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-01-20
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-01-20
Also published as: CN112891375B

Abstract

本发明提供了一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法及应用，采用无外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到上清液，将上清液差速离心得到外泌体，与天然芳香材料混合制成药物。本发明所述的制备方法通过培养神经干细胞，高效地从神经干细胞培养上清液中通过差速离心提取到高浓度、高纯度的外泌体，此外，从天然植物香料中提取制作天然芳香材料干粉，制作多种气味的药物，通过鼻粘膜给药，药物通过嗅觉传导通路进入海马等学习记忆相关的脑组织部位，通过动员机体的内源性神经干细胞、建立再生微环境，促进神经损伤修复，用于防治老年痴呆的认知功能障碍、延缓中年记忆减退和提高青少年学习能力。

Description

一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法及应用。

背景技术

老年性痴呆又叫阿尔茨海默病，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年人群最常见的一种痴呆类型。主要表现为智力减退、渐进性记忆障碍、认知功能障碍、行为及人格改变、语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。痴呆导致了大脑功能全面减退，表现为记忆、日常生活能力、已习惯的技能、正确的社交技巧和控制情绪反应能力的全面障碍。

老年性痴呆的患病率与年龄密切相关。目前，全球每3秒钟就有一例痴呆患者产生。现阶段的中国，阿尔茨海默病患者人数已居世界第一，同时中国也是全球增速最快的国家之一。有数据统计，目前中国痴呆患者超过1000 万人，其中有60％为阿尔茨海默病。65岁以上人群发病率为5％，80岁以上发病率超过30％。世界卫生组织预测，2050年全世界老年人口将达到20.2 亿，其中，中国老年人口将达到4.8亿，几乎占全球老年人口的四分之一，中国痴呆患者将超过2000万；75岁以上的老人10％患有智能障碍，85岁以上的老人中1/3为失智老人。

老年性痴呆发病后，患者一般存活年限平均仅为5.5年，且绝大部分患者生活质量低下。有的痴呆患者甚至受到各种人身限制，不能享有正常的基本权利和自由。老年性痴呆是造成老年人失去日常生活能力的最常见疾病，同时也是导致老年人死亡的第五位病因。老年性痴呆不仅给患者带来巨大的痛苦，也给家庭和社会也带来沉重精神压力和医疗、照料负担。因此，老年性痴呆已经成为影响全球公共健康的重大社会问题。

老年性痴呆的病因及发病机制尚未阐明，引起痴呆的原因很多，主要有多种因素造成的中枢神经系统退行性疾病。此外，随着生活水平的提高和工作压力的增加，脑血管病导致的血管性痴呆也大量增加，因为长期脑缺血缺氧导致脑细胞营养不良，脑功能下降，从而出现记忆、智能障碍，部分患者伴有肢体瘫痪、语言障碍等。另外，颅脑创伤和感染相关的疾病、肿瘤和脑积水、代谢障碍、酒精中毒等因素均可导致痴呆。例如，全世界每年有 5400-6000万人发生颅脑创伤，每年有220-360万人为中重度损害。急性期治愈后，常发生健忘症、智力低下、痴呆等脑外伤后遗症。痴呆的特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失并发生胶质细胞增生等。

尽管老年性痴呆高发于老年期，但目前已不是老年人的专利，不断趋于年轻化，四五十岁就被诊断为痴呆的人群数量也在逐年增加。有调查数据表明，在天津、上海、广州等大城市，在近20年期间老年性痴呆患者平均年龄由65岁提前至55岁，年轻了10岁，这可能与饮食、压力及环境污染有关，例如，大量饮酒会影响大脑，而长时间的压力过大也可能导致老年性痴呆提前出现。此外，现在高血压、高血脂病人越来越年轻化，这也在一定程度上导致发生痴呆年龄的提前。目前，随着社会进步，各种高科技产品的应用和工作压力的增加，记忆减退是困扰中年就业人群的重大社会问题。

当前，对青少年智力发育也逐渐受到关注。在青少年生长发育阶段，通过本发明的神经干细胞外泌体经鼻吸收给药、药物通过嗅觉传导通路进入海马等学习记忆相关的脑组织部位、动员使用者机体的内源性神经干细胞、提高学习记忆能力、增强智力很有必要。

在学习和记忆功能密切相关的脑区，突触和神经元的变性及功能失调是老年性痴呆和智力障碍的特征。尽管老年性痴呆病因尚不十分清楚，一般认为与遗传和环境因素有关。迄今为止，老年性痴呆的传统治疗药物包括碱酯酶抑制剂、神经生长因子、脑细胞活化剂等，主要是改善患者的临床症状，而不是针对老年性痴呆的发病机制、阻断其病理过程，并不能有效的阻断老年性痴呆的发展，因而疗效有限。

目前对内源性脑保护因子如内源性神经干细胞、神经营养因子的基础和临床应用研究逐渐受到重视。内源性神经干细胞是指来源于机体自身的神经干细胞，正常情况下处于静息状态。内源性神经干细胞广泛存在于成年哺乳动物的海马、脑室下区、纹状体、嗅球、室管膜、脉络丛、大脑皮质等区域。在成人脑内，内源性神经干细胞分布于海马齿状回颗粒下层、侧脑室室管膜下区、皮质、杏仁核、小脑、纹状体、下丘脑、嗅球和胼胝体下区，其中海马齿状回颗粒下层和侧脑室下区是成体大脑内源性神经干细胞存在的主要脑区。侧脑室下区的内源性神经干细胞经吻侧迁移流迁移至嗅球，在此过程中神经干细胞经过不断增殖、分化、发育为成熟的嗅球中间神经元，并整合填补入皮质的气味分辨区，参与嗅神经的再生。而海马齿状回颗粒下层的内源性神经干细胞定向迁移至颗粒细胞层后分化发育为成熟神经元，并整合入海马神经环路，参与学习和记忆。

最近研究显示：在成体大鼠、非人灵长类及人类大脑的侧脑室下区和海马齿状回颗粒下层存在神经干细胞。新生成的细胞在颗粒下层能够分化为成熟、具有功能的神经元并作为颗粒细胞融入齿状回参与记忆形成。

神经干细胞最基本的生物学特征是能够自我更新，进行多潜能分化。神经干细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。例如，内源性神经干细胞正常情况下处于静息状态，一旦中枢神经系统受到缺血性损伤等刺激后，海马齿状回颗粒下层和侧脑室下区等区域中的神经干细胞被动员和激活，在缺血信号的刺激下可以迁移至相应的受损神经区域，进行增殖、分化以弥补神经元的数量和促进功能恢复，并与周围神经元建立突触联系，修复受损的神经功能。但是内源性神经干细胞的修复能力有限，不足以抵抗缺血性脑卒中导致的神经损伤。因而，如何通过动员内源性神经干细胞修复损伤神经元仍有待进一步探索。

在老年性痴呆治疗中，可以通过刺激成体大脑室管膜下区和颗粒下层神经干/祖细胞的增殖，由此产生的新生细胞迁移到受损的大脑区域，在那里他们表达成熟神经元，以修复老年性痴呆患者损伤的环路并恢复学习和记忆能力。这些发现推翻了成立于20世纪初的神经细胞不能再生这一“教条”，这表明用内源性神经干细胞有可能替代死亡或损伤的神经细胞。然而，机体自我修复的能力显然是不够的。因此，目前学者们正探索运用外源性干预手段促进内源性神经干细胞的动员、增殖、归巢、迁移、分化等，以期达到有效治疗老年性痴呆的目标。此外，内源性神经干细胞没有伦理及发生免疫排斥的优点，应用前景乐观，但在它们成为有效治疗手段前有许多问题有待克服。

目前利用干细胞干预治疗脑梗死后脑组织缺血损伤的方法主要有两种：一种方法是移植外源性的神经干细胞，将来源于胚胎或成年脑细胞的干细胞，甚至将胚胎干细胞直接移植到脑受损部位；另一种方法是动员机体内源性的神经干细胞，是指将位于侧脑室壁的室管膜下区和海马齿状回的颗粒下区区域内的内源性神经干细胞激活。移植干细胞技术为脑梗死治疗带来了生机，但由于受到干细胞的来源、伦理、移植排斥反应及潜在的致肿瘤性等因素的制约，其目前在临床的应用有很大局限性。在这种背景下，国内外的专家学者提出了一种新的理论，即通过动员机体内源性神经干细胞来治疗脑梗死疾病。利用一定的外源性趋化因子，包括药物或者神经营养因子等方法和手段动员内源性神经干细胞的增殖、归巢、迁移、分化和表达，使其最终发挥神经再生和神经修复的作用，这已经成为内源性神经干细胞的重点研究方向。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法及应用，以动员机体的内源性神经干细胞，防治老年痴呆的认知功能障碍、延缓中年记忆减退和提高青少年学习能力。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，包括以下步骤：

a.采用无外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到含有神经干细胞外泌体的培养上清液，将培养上清液差速离心得到外泌体，将外泌体制成外泌体冻干粉；

b.将外泌体冻干粉、天然芳香材料干粉及混合介质混合，得到神经干细胞外泌体经鼻吸收药物。

优选的，步骤a中神经干细胞的培养方法包括以下步骤：

a.分离胎脑的前脑及中脑，将前脑及中脑分别研碎后得到研碎产物，以 DMEM培养基在离心管内对研碎产物重悬，吹打均匀后，过滤，得到滤液；

b.以1500rpm对滤液离心5min，吸弃上层的上清液，加入神经干细胞原代培养基，混匀并计数；

c.以3x10⁶-5x10⁶cells/mL的浓度将神经干细胞接种于培养瓶中，将培养瓶至于37℃、5％CO₂培养箱中原代培养；

d.原代培养7天后，每隔2-3天进行半量换液，换液时以1000rpm、5min 离心收集神经干细胞；

e.当神经干细胞球培养至直径大于0.3mm，进行传代培养，在培养瓶中加入细胞消化液，在37℃的培养箱中消化5min，吹打消化后的细胞悬液至细胞悬液内无肉眼可见神经球，对神经干细胞计数；

f.以3x10⁶-5x10⁶cells/mL的浓度将神经干细胞接种于培养瓶中，采用无外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到神经干细胞培养液。

优选的，步骤a中差速离心得到外泌体的方法包括以下步骤：

a.将无外泌体血清培养的神经干细胞上清液(含有神经干细胞外泌体的培养上清液)放入台式离心机，在4℃温度下以400g以下转速离心15min，得到离心液；

b.将离心液在4℃温度下，以10000g以上转速离心15min，得到超滤液；

c.将超滤液用0.22μm过滤器过滤，得到浓缩液；

d.将浓缩液在4℃温度下，使用超速离心机，以100000g以上转速离心 90min，弃除上清液得到所需的外泌体。

优选的，所述天然芳香材料干粉的制备方法包括以下步骤：

a.过滤：在香料中加入等重量的蒸馏水，搅拌均匀，100目尼龙纱网过滤，将过滤后的香料以8-10mm的厚度装入冻干机的冷冻干燥室内；

b.开启冻干机，将真空干燥室的温度降为-40℃，真空度调整为133kpa，冷凝器的温度调整为-50℃，同时对冷冻干燥室加热，持续12小时以上，之后调整干燥室温度至30-40℃，持续4-5小时，得到干燥后的香料块；

c.将干燥后的香料块粉碎、过筛，得到所需天然芳香材料干粉。

优选的，所述混合介质包括纯化水、维生素E、壳聚糖及胺化明胶中的一种或多种的混合物。

根据上述任一所述的神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法制得的药物在防治老年痴呆、延缓记忆减退和提高学习能力中的应用。

相对于现有技术，本发明所述的神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法及应用具有以下优势：

本发明所述的制备方法通过培养神经干细胞，高效地从神经干细胞培养上清液中通过差速离心提取到高浓度、高纯度的外泌体。此外，从天然植物香料中提取制作天然芳香材料干粉，制作多种气味的药物，通过鼻粘膜给药，药物通过嗅觉传导通路进入海马等学习记忆相关的脑组织部位，通过动员机体的内源性神经干细胞、建立再生微环境，促进神经损伤修复，用于防治老年痴呆的认知功能障碍、延缓中年记忆减退和提高青少年学习能力。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例所述的体外培养神经干细胞球的显微镜观察示意图 (×100)；

图2为本发明实施例所述的神经干细胞球干性基因免疫荧光检测结果， A.NESTIN阳性表达；B.Musashi-1阳性表达；

图3为本发明实施例所述的神经干细胞多向分化能力鉴定，神经干细胞分化为神经元细胞过程示意图(TUJ-1染色阳性)；

图4为本发明实施例所述的神经干细胞多向分化能力鉴定，神经干细胞分化为星形胶质细胞过程示意图(GFAP染色阳性)；

图5为本发明实施例所述的神经干细胞多向分化能力鉴定，神经干细胞分化为少突胶质前体细胞过程示意图(PDGFR染色阳性)；

图6为本发明实施例所述的神经干细胞外泌体的透射电镜图；

图7为本发明实施例中通过纳米颗粒跟踪分析测量外泌体粒径分布示意图；

图8为本发明实施例中蛋白质免疫印迹实验结果示意图，Western Blotting分析显示神经干细胞外泌体(NSCs-EXOs)表面表达CD63、CD9、 Hsp70、CD81蛋白，与神经干细胞(NSC)膜表面标记一致；

图9为本发明实施例所述的人体鼻腔解剖结构示意图；

图10为本发明实施例所述的人体中的嗅感受神经元嗅细胞、嗅毛、嗅丝、嗅神经、嗅球、嗅束等嗅觉传导通路；

图11为本发明实施例所述的人体与嗅觉相关的海马等大脑部位，包括 A.冠状切面，B&C.不同部位的矢状切面；

图12为本发明实施例所述的通过大鼠颈总动脉结扎制作血管性痴呆模型示意图；

图13为本发明实施例所述的Morris水迷宫系统示意图；

图14为本发明实施例所述的大鼠逃避潜伏期时间分布示意图；

图15为本发明实施例所述的视频采集运动轨迹示意图，曲线是大鼠游泳轨迹，左上象限中圆圈为平台所在位置；

图16为本发明实施例所述的与学习记忆相关的海马CA1、海马CA3和齿状回结构；

图17为本发明实施例所述的各组大鼠海马神经元光镜照片(HE，×40)；

图18为本发明实施例所述的各组大鼠海马CA1区神经元光镜照片(HE， ×200)；

图19为本发明实施例所述的各组大鼠海马的CA1形态变化示意图(尼氏染色，×1000)；

图20为本发明实施例所述的各组大鼠海马CA1区GFAP表达示意图(免疫组化染色，×200)。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

1、神经干细胞的采集与提取、培养与扩增

通过胎脑培养得到神经干细胞，具体操作步骤如下：

1)将镊子的一脚探入枕骨大孔然后夹紧镊子以固定胚胎头部，以小剪刀于枕骨大孔处下刀向枕骨侧剪开整个颅腔，暴露出脑部。观察脑膜清晰可见，胎脑的脑结构完整，无明显液化现象时，可进行后续操作；

2)以镊子将胎脑轻轻剥出颅腔，置于一次性无菌培养皿中，加入少量 PBS缓冲液清洗。以小镊子剥去脑膜，去除小脑。于大脑脚处将中脑与前脑分离，将中脑与前脑分别研碎后，以少量DMEM培养基在50mL离心管内将二者重悬。吹打均匀后，用100μm筛网过滤悬液，之后再用40μm筛网过滤；

3)以1500rpm、5min离心滤液，吸弃上层的上清液，补加神经干细胞原代培养基(Neural Basal Medium(500mL)，basic FGF(200ng/mL)，EGF (200ng/mL)，B27(10mL，1:50))至20mL，混匀并进行计数；

4)以3x10⁶-5x10⁶cells/mL的浓度接种于T75培养瓶中，每瓶培养体系为15mL。将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中进行培养；

5)第一次换液前用100μm筛网过滤培养体系，去除杂质和死细胞，然后以1000rpm、5min离心滤液收集细胞；

6)原代培养7d后，观察如无大量细胞死亡现象，则每隔2-3d进行半量换液，换液时以1000rpm、5min离心收集细胞；

7)当神经干细胞球培养至直径大于0.3mm时，进行传代培养；

8)每瓶细胞加入37℃的1ml Accutase^TM消化液，将离心管置于37℃培养箱内消化5min。吹打消化后的细胞悬液，直至悬液内无肉眼可见神经球，此时进行细胞计数；

9)根据计量的细胞数，以3x10⁶-5x10⁶cells/mL的浓度接种于T75培养瓶中，每瓶培养体系为15mL；

10)显微镜下观察，证实培养获得的神经干细胞扩增后形态学；

11)通过RT-PCR检验，以Oct4、Sox2为代表的干性基因在RNA水平上呈现明显高表达；

12)通过免疫荧光染色实验，观察从神经干细胞样细胞分化形成的神经元，分析功能性神经元的分泌产物，如多巴胺、乙酰胆碱等。

2、神经干细胞的鉴定及分化能力检测

用特异性的抗体标记相关蛋白对神经干细胞球进行鉴定，并对神经干细胞的多向分化潜能进行检测。

如图1所示，神经干细胞体外能聚球培养，随着球直径增大，显微镜下观察到神经干细胞球呈圆形、有毛刺，直径100-300μm。

如图2所示，选取不同直径大小的神经球制备成冰冻切片，用特异性的抗体标记相关蛋白，检测并计算相关蛋白的表达率。结果显示，干性标记染色NESTIN、Musashi-1阳性率大于90％。

在特定的诱导培养条件下，神经干细胞能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能。本发明采用分化培养基，定向诱导神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质前体细胞，从而检测神经干细胞的多向分化潜能。

本发明实验结果表明，在向神经元诱导分化后，细胞表达神经元特异性标志物TUJ-1，着色细胞为典型的神经元形态结构，免疫荧光染色结果显示神经元分化比率约为20％-30％，如图3所示。在向星形胶质细胞诱导分化后， GFAP呈阳性表达，分化所得阳性细胞占比高，约为90％，如图4所示。向少突胶质细胞诱导分化后，细胞形态观察多有双极或者三极突触，且PDGFR 免疫荧光染色良好，表明分化所得细胞为少突胶质前体细胞，阳性率>95％，如图5所示。

3、神经干细胞外泌体的提取和鉴定

本发明采用无外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到培养上清液，所述培养上清液中含有神经干细胞外泌体，然后采用差速离心提取外泌体，其步骤如下：

1)用台式离心机，将所述无外泌体血清培养的神经干细胞培养上清液 (含有神经干细胞外泌体的培养上清液)，在4℃温度下，以400g以下转速离心15min，以去除漂浮细胞及部分细胞碎片，得到离心液；

2)将离心液在4℃温度下，以10000g以上转速离心15min，去除细胞碎片，得到超滤液；

3)将超滤液用0.22μm过滤器过滤，进一步去除细胞碎片，得到浓缩液；

4)将所述浓缩液在4℃条件下，使用超速离心机，以100000g以上转速离心90min，弃除上清液，得到所需的神经干细胞外泌体。

本发明的外泌体提取方法，具有操作简单、成本低，适合产业化生产。本发明先用无外泌体血清的培养基对胎脑来源神经干细胞进行饥饿培养，使神经干细胞处于正常生长状态，然后将获得的含有神经干细胞外泌体的培养上清液进行低速离心以去除死细胞，用超离管对离心液进行超滤浓缩，将超滤液经过第二离心处理，再用0.22μm过滤器过滤掉细胞碎片，进一步得到含颗粒粒径小于220nm的浓缩液，再将浓缩液进行超速离心的第三离心处理，最后分离提取到外泌体。该外泌体的提取方法，既结合了差速离心，又结合了超滤和超速离心，通过该提取流程，最终可高效地从胎脑来源的神经干细胞培养上清液中提取到高浓度、高纯度的外泌体。

神经干细胞外泌体的鉴定步骤如下：

1)采用上述方法提取的神经干细胞外泌体(NSC-exosomes； NSCs-EXOs)，其超速离心管的管底沉淀即为NSC-exosomes，用200-500μL PBS轻轻将沉淀吹起以脱离超速离心管的管底，注意切勿使劲吹吸与震荡，收集到1mL EP管中，备于后续实验；

2)将100-200μl预冷的RIPA裂解液(含蛋白抑制剂混合物)加入沉淀中，充分混匀，冰上裂解30min后，在4℃温度下，以12000g离心20min。吸出上清置于EP管中，利用少量进行BCA蛋白定量。调整蛋白浓度后加入蛋白上样缓冲液(5×Loading Buffer)，100℃煮10min，用于Western Blotting 蛋白上样；

3)神经干细胞(NSC)采用膜蛋白提取试剂盒，同样收集NSC膜蛋白并调整蛋白浓度后加入蛋白上样缓冲液(5×Loading Buffer)，100℃煮 10min，用于Western Blotting蛋白对照组上样；

4)选用CD63、CD9、Hsp70和CD81蛋白作为检测指标，其蛋白分子量分别为26kDa、25kDa、65kDa、26kDa。上述蛋白一抗的稀释比均为1:1000；

5)上样：小心拔掉梳子，上样前将上样孔处的气泡排尽，所有蛋白样品调至等浓度上样，每孔上样约50μg蛋白，最两侧的泳道用等体积的1× Loading Buffer上样，蛋白Marker也用1×Loading Buffer调整与蛋白样品等体积。从左到右上样顺序为Marker、NSCs、NSCs-EXOs、Marker；

6)电泳：采用恒压电泳。用12％的分离胶。初始电压为80V，待蛋白 Marker移动至分离胶刚刚分散开后，电压转为120V，直到目的蛋白运动至分离胶下缘1-2cm处停止电泳；

7)转膜：采用恒流湿转。取适当大小的PVDF膜浸泡在预冷的甲醇中以去除膜上的电荷和油脂，浸泡5min。小心起胶，依次将滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸按从上到下的顺序夹好，注意凝胶和PVDF膜之间切勿有气泡。将夹板小心放入电转槽，使其完全浸入转膜缓冲液中，注意膜在正极一侧，胶在负极一侧。将电泳槽浸于冰水混合物中，250mA恒流转膜70min。此处蛋白CD63、CD9、Hsp70、CD81分子较小，转膜时用0.22μm的PVDF膜， Calnexin和Lamp 1用0.44μm的PVDF膜转膜；

8)封闭：将夹板从电转槽中取出，小心取出PVDF膜，用TBST漂洗 5min×3次；用TBST配制质量分数为5％脱脂奶粉的封闭液，PVDF膜蛋白面朝下浸入封闭液，在摇床上室温封闭70-80min。封闭结束后TBST漂洗 5min×3次；

9)孵育一抗：用一抗稀释液配制一抗工作液，上述抗体稀释浓度均为 1:1000。按分子大小将目的蛋白的条带分别剪开，将膜的蛋白面朝下浸入各目的蛋白对应的一抗工作液中，置于摇床上轻柔振荡30min后，放于4℃，孵育过夜；

10)孵育二抗：小心取出各条膜，TBST漂洗5min×3次。用TBST配置二抗工作液(根据一抗种属来选择二抗，此处为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗)，稀释浓度为1:10000，置于摇床上轻柔振荡，室温孵育70-80 min；

11)上机曝光：取出各条膜，TBST漂洗5min×3次。发光液A和B按 1:1配制，4℃避光放置。PVDF膜蛋白面朝上，均匀滴加配制好的发光工作液，室温避光孵育3-5min。将膜蛋白面朝下置于曝光板上，上机曝光。使用 LI-COR 3600曝光仪曝光，用Image Studio DigitsVer 4.0软件对结果进行分析。

本发明通过培养神经干细胞，提取外泌体。如图6所示，本实施例提取到神经干细胞外泌体，使用透射电子显微镜观察，呈均一大小的圆杯形态， CD63、CD81、FLOT1、ICAM1、ALIX、EpCAM、ANXA5、TSG101等外泌体相关蛋白呈阳性表达，表明成功分离到神经干细胞外泌体。电镜结果图可以发现该实施例提取的外泌体背景干净，具有明显的膜边界，呈典型的杯状结构，所获的外泌体形态结构典型，表明损伤较小。

如图7所示，本发明使用纳米颗粒跟踪分析测定细胞外囊泡的浓度和颗粒大小分布，表明外泌体的平均粒径在30-150nm范围，证实本发明提取的外泌体质量良好。

如图8所示，Western Blotting蛋白分析显示神经干细胞外泌体表面表达 CD63、CD9、Hsp70、CD81蛋白，这些蛋白都是神经干细胞外泌体的表面标记蛋白，与神经干细胞膜表面标记一致，说明采用上述方法富集的神经干细胞外泌体是成功的。

4、药物经鼻吸收转运到脑组织的途径

采用人体标本研究了鼻腔与脑部在解剖学上的通道，以及药物经鼻吸收后进入颅内脑组织的途径。

如图9所示，人类鼻腔由鼻中隔分为左右两个腔，内面覆以粘膜。根据功能及组织结构的不同可将其分为三个部分：鼻前庭、呼吸部和嗅部。鼻腔与脑部在解剖学上存在独特的直接通道，药物经鼻吸收后可以通过嗅觉神经通路途径进入脑组织，具有一定的脑内靶向分布特性。人脑有12对脑神经，其中只有嗅神经是裸露在鼻腔粘膜的浅表层。如图10所示，与中枢神经系统递药相关的主要是嗅部的嗅粘膜，人体的嗅粘膜位于鼻腔顶部，含有嗅细胞，该细胞是一种双极神经元，一端与外环境相通，另一端在固有层内形成嗅神经，嗅神经连接中枢神经系统的嗅球。嗅神经由特殊内脏感觉纤维组成，由上鼻甲和鼻中隔上部粘膜内的嗅细胞中枢突聚集而成20多条嗅丝，穿过鼻顶壁的筛板筛孔进入颅前窝连于嗅球，嗅神经的主要功能是将气味的感觉传递给大脑半球的嗅球，鼻腔给药时，药物通过嗅觉通路包括嗅感受神经元嗅细胞、嗅毛、嗅丝、嗅神经、嗅球、嗅束及与嗅觉相关的海马等大脑部位发挥作用，如图11所示。此外，鼻腔给药较其他给药途径还具有吸收快、生物利用度较高、给药安全方便、大众易于接受等特点。并且，鼻腔给药具有可避免药物的胃肠道刺激和降解、可避免肝脏首过效应、实现脑靶向等优势。

研究证实，鼻腔给药是向脑内输送药物的有效途径。一些难以透过血脑屏障的药物，在有渗透促进剂存在的情况下，在该部位可以直接进入大脑，故经鼻腔给药特别适合脑靶向的药物需要。此外，人的鼻腔粘膜表面积大，毛细血管和淋巴管非常丰富，药物在鼻粘膜的穿透性较高而且酶相对较少。

5、鼻腔给药的剂型分析

对滴鼻剂、干粉吸入剂、喷雾剂药物等鼻腔给药剂型进行分析。

从吸收效果看，滴鼻剂由于受到接触鼻腔表面积小及容易流淌的因素，限制了药物的吸收，因此疗效较差。干粉吸入剂和鼻腔喷雾剂的吸收效果相当。干粉吸入剂的滞留时间长，吸收好，药物含量高，给药体积小，有利于药物稳定，但是由于干粉给药需要特别装置送入鼻腔，用药不便，并且药物刺激鼻粘膜，因而疗效和应用并不理想。鼻腔喷雾剂制备方法简单、鼻粘膜刺激性小，使用安全、有效、顺应性好、患者接受度高、服药的依从性高。

本发明药物可以制成常规的鼻腔喷雾剂外，还可以制成滴鼻剂、鼻液、鼻软膏、鼻霜、鼻悬液、微球制剂(粒径在40-60μm)、鼻凝胶制剂(用卡波姆、聚丙烯酸、聚乙烯醇等制成亲水凝胶)、脂质体等。

本发明配合使用一些刺激嗅觉的天然芳香气味材料(薰衣草、薄荷、丁香酚、丁香酚盐、乳香、檀香、麝香、茉莉、夜来香、玫瑰、白玉兰、冰片，以及其他天然香料提取物)，开发多种气味的香料类型，以迎合不同人群的市场需求。本发明中使用的天然香料选用可作为药品、食品、化妆品、香水的天然香料提取物或天然有效成分。天然香料可以改善患者心理状态，并且具有天然药物渗透促进、天然抗氧化及杀菌等功效。

本发明结果表明，当神经干细胞外泌体和配合使用的香料气味分子被嗅觉感受器识别后，信号被传输到大脑的嗅球，并传递到海马等其他脑部区域，嗅觉相关信号能够引起神经突触的重塑，直接参与了学习记忆的识别、编码和储存过程。

本发明的神经干细胞外泌体和香料经过鼻粘膜给药，刺激嗅球，动员机体的内源性神经干细胞，抑制神经细胞衰老变性，防止记忆降低，改善智力。

6、建立大鼠痴呆模型，通过学习记忆的神经行为学观察，验证经鼻吸收药物的疗效。

使用12周龄的雄性SD大鼠30只，体重250-300g，分为对照组、痴呆组、治疗组，每组10只。对照组大鼠仅分离双侧颈总动脉，未结扎血管；痴呆组大鼠分离大鼠双侧颈总动脉后永久性结扎血管，建立血管性痴呆模型，治疗组大鼠在建立痴呆动物模型后进行鼻粘膜给药干预。

Morris水迷宫系统已经成为评估啮齿类动物空间学习记忆能力的经典行为学实验之一，广泛应用于神经生物学、药理学等领域的基础和应用科学研究。Morris水迷宫测试是基于啮齿类动物对水中游泳行为本能的厌恶，要求动物利用自身视觉空间线索去寻找隐藏于水下平台的位置，并利用平台从水中逃生。通过Morris水迷宫系统，研究者可以随时观察及记录动物在水池内游泳的轨迹和运动情况，分析出从入水到找到水下平台所用的时间、完整的寻找过程中的游泳轨迹，分析并以数据客观评价动物的学习记忆和认知功能等方面的能力。动物在水迷宫测试的结果高度依赖海马的功能，海马出现损伤和病变时在两阶段测试中的表现是不同的。本发明使用Morris水迷宫测试，观察了实验动物学习记忆的神经行为学。

6.1大鼠痴呆模型的制作

如图12所示，实验大鼠2.5％异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定于手术台上，常规备皮、消毒、铺巾，暴露大鼠颈部右侧，在右侧正中位置切一小口，顺延皮肤向下将浅筋膜剪一小口，充分暴露视野，再分离胸锁乳突肌及肩胛舌骨肌，可以观察到伴行的颈总动脉和迷走神经，充分暴露后仔细分离，避免损伤血管和神经，用5号缝线将颈总动脉前后双重结扎。1周左右，按上述手术方法取左侧正中切口，结扎左侧颈总动脉。

6.2Morris水迷宫测试检测实验动物学习记忆能力

如图13所示，Morris水迷宫实验系统包括圆形水池、大鼠平台、电脑及一套图像采集处理分析系统，图像的采集、处理分析系统主要由摄像头、视频采集卡等组成并连接电脑使用，录入实验固定参数、调好设置，动物入水后本系统自动启动，采集并记录动物在水下的运动轨迹。实验开始前在水池的周边上缘等距离的画出4个点，作为大鼠的入水点，以这4个入水点所在的平面将水面和水池部分平均分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限。根据实验要求和进行的时间点，可将平台放置于任意象限的中间。摄像头垂直放置于水池上方约2.5米处，保证拍摄视野能够完全覆盖整个水池。水迷宫图像采集及处理分析系统能自动地采集动物的入水位置，找到平台所需的时间、百分比、游泳距离、游泳速度和运行轨迹等数据，并可对所采集的各种数据进行统计和分析。

Morris水迷宫测试包括两个部分：定位航行实验和空间探索实验。

(1)定位航行实验。每只大鼠每天训练2次，共连续训练5天：所有实验设备调试稳妥，实验人员就位后，先将大鼠头朝池壁方向依次从4个不同象限(第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限)的入水点入水，记录大鼠从入水至找到并爬上平台所需的时间，即为逃避潜伏期。计算2次逃避潜伏期的平均值作为这一天的成绩表现；同时记录此过程中大鼠的游泳距离，即大鼠从实验开始到实验结束游泳的总路程。设定大鼠在平台上停留时间超过2秒即为找到平台。若大鼠用时超过了规定的120秒且仍未找到平台，则引导大鼠游至平台上并停留10秒以熟悉环境及平台的位置，此时逃避潜伏期记为120秒。连续训练5天进行统计分析。

本发明的Morris水迷宫定位航行实验共进行了5天，如图14所示，各组大鼠逃避潜伏期随着训练时间的增加均有逐渐缩短的趋势，各组大鼠均有一定的学习记忆能力，但各组之间由于不同的干预方式而学习记忆能力也不同。从第2天开始，痴呆组大鼠逃避潜伏期较对照组相比明显延长，而治疗组大鼠逃避潜伏期较痴呆组大鼠明显缩短，差异均有统计学意义(p<0.05)。

(2)空间探索实验。定位航行实验结束后，在第6天撤去平台。大鼠头朝池壁从平台对侧象限入水点入水，记录每只动物在120秒内穿越原平台次数和停留平台象限时间，采集大鼠在水池中的运动轨迹图像。

本发明的Morris水迷宫空间探索实验中，穿越平台的次数越多、停留于平台象限的时间越长，则表明大鼠的记忆能力越强。如图15所示，痴呆组大鼠在120秒内穿越平台的次数和停留平台象限时间均较对照组明显降低(p ＜0.05)，而治疗组大鼠在120秒内穿越平台次数和停留平台象限时间较痴呆组大鼠明显增加，差异有统计学意义(p<0.01)。

本发明采用的动物模型是目前国际上公认的痴呆模型。本发明结果显示，施加药物干预后，治疗组大鼠逃避潜伏期明显缩短，停留于原平台时间增加，表明经本发明的经鼻吸收药物可以显著改善学习记忆能力，起到神经保护的作用。

7、经鼻吸收药物减缓脑组织病理损伤

使用水迷宫测试结束后的30只实验大鼠，4％多聚甲醛灌注后取材，动物脑组织固定48小时，石蜡包埋切片，片厚5μm，使用HE染色和尼氏染色，观察经鼻吸收药物对脑组织病理损伤的修复作用。

如图16所示，海马各区对缺血的敏感性有很大差异,海马CA1区锥体神经元对缺血损伤十分敏感，其次是CA3区。研究发现，海马齿状回颗粒下层的内源性神经干细胞可以定向迁移至颗粒细胞层后分化发育为成熟神经元，并整合入海马神经环路，参与学习和记忆。

如图17所示，HE染色显示了3组实验动物海马的病理组织形态学变化。光镜下可以观察到，对照组大鼠海马神经元结构完整，清晰度高，排列整齐，存活状态好，痴呆组大鼠海马神经元结构有缺失，清晰度差，排列散乱，存活状态不佳，然而，治疗组大鼠海马神经元形态结构完整。如图18所示，对照组大鼠海马CA1区神经元核仁清晰，核大而圆，未见核固缩现象。痴呆组大鼠海马CA1区细胞皱缩，核不规则，核固缩、深染的变形神经元增多。但是，与痴呆组大鼠相比，治疗组大鼠海马CA1区神经元存活状态明显改善，排列整齐，核固缩、深染变形的神经元数目明显减少。

尼氏染色是检测神经元胞质中的尼氏体，通常用于脑组织中的神经元形态结构的鉴定与分析。如图19所示，光镜下，可见对照组大鼠海马CA1区锥体细胞层次饱满，分布均匀，排列整齐，结构完整，基本没有尼氏体破裂现象。痴呆组大鼠海马CA1区锥体细胞数目与对照组相比明显减少，细胞皱缩，排列散乱，形态不规则，分布不均匀，有些细胞带出现缺失和中断，出现尼氏体碎裂现象，部分细胞可见细胞肿大、核碎裂现象。然而，与痴呆组大鼠相比，治疗组大鼠海马CA1区神经元病理损伤明显减轻，细胞存活状态明显恢复，尼氏体较完整清晰，海马锥体细胞数目明显增多。

本发明通过建立血管性痴呆动物模型并实施药物干预，造模后大鼠出现明显的神经病理改变和脑损伤，这些改变与脑血管疾病患者的病理变化非常相似。血管性痴呆是仅次于阿尔茨海默病的第二大老年性痴呆疾病，其发病率逐年升高。血管性痴呆以缺血缺氧性脑损伤造成的病理组织学损伤和学习记忆障碍为特征，已经逐渐成为一个重要的社会问题。海马是学习记忆的关键部位，其CA1区的锥体细胞是形成记忆的重要区域，且CA1区对缺血缺氧极其敏感。脑缺血极易导致海马神经元的损伤，从而使学习记忆能力下降。海马区神经元的形态和功能完整是学习和记忆的重要基础，神经元的存活数量直接影响神经元突触的可塑性。本研究通过病理组织学观察，证明神经干细胞外泌体经鼻吸收药物可以减轻缺血缺氧对神经元的损伤，改善其存活状态，使神经元形态结构恢复正常，促进脑损伤后细胞增殖，并抑制神经元凋亡。本发明结果证实了神经干细胞外泌体经鼻吸收药物对痴呆动物具有良好的治疗效果。

8、神经干细胞外泌体经鼻吸收药物抑制脑组织胶质细胞的活性

使用上述水迷宫测试结束后的30只实验大鼠，石蜡包埋切片，切片经 37℃过夜，梯度乙醇水化，PBS冲洗3次，微波修复2min×3，每张切片滴加3％H₂O₂室温孵育15min，封闭用血清工作液孵育15min，滴加一抗4℃ 过夜，二抗工作液孵育15min，辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育15min，滴加DAB液同步显色，中性树胶封片。每张切片随机取5个视野，显微镜下观察视野中棕染的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞。

如图20所示，对照组大鼠海马CA1区可见少量GFAP阳性细胞，细胞胞体较小。与对照组相比，痴呆组大鼠海马CA1区中GFAP阳性细胞明显增多，细胞呈蜘蛛状，胞体较大，突起较粗长。但是，与痴呆组大鼠相比，治疗组大鼠海马CA1区中GFAP阳性细胞数目明显减少。

神经胶质细胞是神经系统的重要组成部分，具有神经发生、发育与再生、合成和分泌细胞因子、血脑屏障、神经传递等重要作用。GFAP是星形胶质细胞标志蛋白之一，其参与了神经元内环境的维持和血脑屏障通透性的调节。在脑损伤的炎症中会出现以GFAP高表达为特征的纤维化，其表达量的高低反映了星形胶质细胞的功能状态。当神经元损伤后，星形胶质细胞活化增多，GFAP表达上调。研究显示，胶质细胞与认知功能障碍密切相关，海马损伤后机体的学习记忆能力与海马CA1区GFAP阳性细胞数呈负相关，海马胶质细胞参与了学习记忆过程。本发明结果表明，神经干细胞外泌体经鼻吸收药物可以通过抑制胶质细胞的活化，改善痴呆动物的学习记忆能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，其特征在于，步骤a中神经干细胞的培养方法包括以下步骤：

a.分离胎脑的前脑及中脑，将前脑及中脑分别研碎后得到研碎产物，以DMEM培养基在离心管内对研碎产物重悬，吹打均匀后，过滤，得到滤液；

c.以3x10⁶-5x10⁶cells/mL的浓度将神经干细胞接种于培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5％CO₂培养箱中原代培养；

d.原代培养7天后，每隔2-3天进行半量换液，换液时以1000rpm、5min离心收集神经干细胞；

f.以3x10⁶-5x10⁶cells/mL的浓度将神经干细胞接种于培养瓶中，采用无外泌体血清的培养基培养神经干细胞，得到含有神经干细胞外泌体的培养上清液。

3.根据权利要求1所述的神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，其特征在于，步骤a中差速离心得到外泌体的方法包括以下步骤：

a.将含有神经干细胞外泌体的培养上清液放入台式离心机，在4℃温度下以400g以下转速离心15min，得到离心液；

c.将超滤液用0.22μm过滤器过滤，得到浓缩液；

d.将浓缩液在4℃温度下，使用超速离心机，以100000g以上转速离心90min，弃除上清液，得到所需的外泌体。

4.根据权利要求1所述的神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，其特征在于，所述天然芳香材料干粉的制备方法包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法，其特征在于：所述混合介质包括纯化水、维生素E、壳聚糖及胺化明胶中的一种或多种的混合物。

6.根据权利要求1-5任一所述的神经干细胞外泌体经鼻吸收药物的制备方法制得的药物在防治老年痴呆、延缓记忆减退和提高学习能力中的应用。