CN116077531A - 外泌体在制备脑卒中治疗用产品中的用途 - Google Patents

外泌体在制备脑卒中治疗用产品中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种治疗脑卒中的方法，所述方法是联合使用外泌体和针刺治疗。本发明还提供了用于所述方法的治疗用组合产品或组合套装，包括含有外泌体的药物组合物和针刺装置。本发明的治疗方法对脑卒中患者神经功能损伤的改善具有协同效果，可以降低脑卒中患者的神经元凋亡，抑制小胶质细胞的激活，抑制星形胶质细胞的激活，调节脑卒中导致的T细胞免疫应答的紊乱，降低脑梗死体积，改善脑卒中患者脑卒中后认知障碍、肢体运动功能等。

Description

外泌体在制备脑卒中治疗用产品中的用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及外泌体以及针刺在治疗脑卒中的应用，以及包含外泌体和针刺的治疗用产品在制备治疗脑卒中的产品中的用途。
背景技术
脑卒中(stroke)又称“中风”，是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞，导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性卒中和出血性卒中。缺血性脑卒中一般是由于脑的供血动脉狭窄或闭塞，脑供血不足导致的脑组织坏死的总称，又叫脑梗死。
近年来，卒中已成为导致我国居民死亡的主要原因之一。据全球疾病负担工作组估算卒中终生风险：全球为24.9％，中国为39.3％，中国已成为卒中终生风险最高和疾病负担最重的国家。
在卒中的预防和治疗中，预防和改善脑血管狭窄或闭塞，预防脑血管破裂是一方面，卒中发生后脑组织损伤的修复是另一方面。
外泌体是细胞释放的细胞外囊泡的一种，是一种双磷脂膜囊泡，直径在30～150nm，含有蛋白、脂质及核酸等多种成分。几乎所有的细胞都分泌外泌体，在细胞间连接中发挥重要作用，在多种体液中可检测到。外泌体的功能表现为细胞间连接、免疫调节、细胞再生及分化的信号传导、血管形成、凋亡、抗原呈递等。
发明内容
本发明提供一种治疗脑卒中的方法，包括给有需要的患者联合使用治疗有效量的外泌体和针刺治疗。
本发明还提供一种治疗脑卒中的组合产品或套装产品，包括含有外泌体的药物组合物以及针刺装置。
本发明还提供外泌体在制备与针刺治疗联合使用的治疗脑卒中的药物中的用途。
本发明还提供外泌体在制备包括针刺装置的治疗脑卒中的组合产品或套装产品中的用途，优选，所述组合产品或套装产品包括含有外泌体的药物组合物。
根据本发明，所述外泌体可以是人或哺乳动物的细胞的外泌体。
所述哺乳动物，包括但不限于牛、羊、马、猪等有蹄类，兔、大鼠、小鼠、豚鼠等啮齿类，猴、猩猩等灵长类，猫、狗等。在本发明的一个实施方式中，所述外泌体是人的细胞的外泌体。
所述细胞可以是正常体细胞或/和干细胞，细胞包括但不限于血管内皮细胞、树突状细胞、T细胞(例如Foxp3+Treg细胞)、神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、胚胎干细胞、成体干细胞(例如造血干细胞，神经干细胞，来源于骨髓、脐带、脂肪、脐带血、羊膜、(胎盘)绒毛膜、牙髓、胸腺、滑膜等的间充质干细胞等)等。
还可以利用诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)技术通过导入特定的基因(如Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等)将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞，以iPSCs得到来源于iPSCs的外泌体，在本发明中将iPSCs的外泌体简写为“iPSC-Exos”。利用iPSCS技术可以用病人自己的体细胞制备专有的诱导性多能干细胞，再由患者的专有诱导性多能干细胞获得外泌体，用于患者自身可以大大降低免疫排斥反应发生的可能性。
所述细胞还可以通过生物工程技术改造，以高表达某个或某些蛋白质、RNA，或/和，低表达另一个或另一些蛋白质、RNA，以实现来源于被改造细胞的外泌体中所述的蛋白质含量增高或/和降低，以达到更优的治疗目的或活性。可以采用本领域已知的生物工程技术，例如，将携带目标蛋白质DNA的载体或mRNA转染细胞，在细胞中实现目标蛋白质表达量的提高。将携带目标基因的siRNA或shRNA的载体转染细胞，在细胞中实现沉默目标基因表达，以降低相应蛋白质的表达量。
外泌体可以通过体外培养相应的细胞，经细胞自分泌的方式，从细胞培养液中分离制备得到。每类细胞的培养可以采用本领域已知的方法和培养基进行。例如：人皮肤成纤维细胞培养基可以是DMEM+15％FBS+NEAA，脐带间充质干细胞培养基可以是DMEM+10％FBS，神经元细胞培养基可以是B27+Neurobasal+GlutaMAX。
为了提高细胞培养物中外泌体的产量，可以根据被培养细胞的特点，调整其培养基中化学物质的含量，例如：保留培养基中细胞生长必需的化学物质，去除或降低培养中细胞生长非必需化学物质或其含量，使细胞生长处于“饥饿”状态，以达到提高培养物中外泌体产量的效果。例如，对于培养干细胞以获得干细胞外泌体为例，可以在干细胞的基础培养基，例如DMEM，F12或者DMEM/F12的基础上，添加L-抗坏血酸或其盐、硒或其盐、胰岛素等，诱导干细胞大量分泌外泌体。例如中国专利申请CN112920991A中记载的外泌体分泌诱导剂，该专利申请的全文引入本申请。
在本发明的一些实施方式中，所述外泌体是人间充质干细胞或ESC(胚胎干细胞)或iPSC的外泌体。所述外泌体的制备方法可以为：在相应细胞的基础培养基中加入L-抗坏血酸或其盐、硒或其盐、以及胰岛素，调节培养基pH为7.0-7.5，得到能获得高产量外泌体的细胞培养基，采用所述细胞培养基培养人间充质干细胞或ESC(胚胎干细胞)或iPSC，获取细胞培养上清，从中分离得到相应细胞的外泌体。所述获取细胞培养上清的操作，可以在培养结束前，间隔适当时间重复进行，例如培养期间每天获取细胞培养上清。可采用本领域常用的pH调节剂对培养基pH进行调节，包括但不限于碳酸盐或碳酸氢盐，例如Na2CO3、K2CO3、NaHCO3、KHCO3等。在本发明的一个实施方式中，在基础培养基中加入浓度为30-100mg/L的L-抗坏血酸或其盐、浓度为5-50μg/L的硒或其盐、浓度为10-30mg/L的胰岛素，并调节培养基pH为7.0-7.5。在本发明的一个实施方式中，所述基础培养基是DMEM。在本发明的另一个实施方式中，所述基础培养基是DMEM/F12。在本发明的一个具体实施方式中，所述外泌体是iPSC(例如可以是从人外周血细胞诱导而来的iPSC)的外泌体，以DMEM/F12为基础培养基，在基础培养基中加入浓度为50-75mg/L的L-抗坏血酸或其盐(例如L-抗坏血酸二磷酸镁盐)、浓度为10-20μg/L的硒或其盐(例如钠硒)、浓度为15-25mg/L的胰岛素，调节pH为7.0-7.5，得到能获得高产量外泌体的细胞培养基，用所述细胞培养基培养iPSC，从培养开始后的15～30小时开始，至培养结束，每间隔20～25小时，获取细胞培养上清，从中分离得到外泌体。
可以采用本领域的各种外泌体分离方法，从细胞培养液中分离获得外泌体。
外泌体可通过差速超速离心在不同离心力下沉淀样品中不同的杂质组分,并在100000×g～200000×g的转速下获取较纯的外泌体，是目前最常用的外泌体分离和浓缩方法。该方法可通过结合0.22μm或0.45μm孔径滤膜进行超滤来提高产物纯度减少外泌体的聚集。密度梯度离心是基于差速超高速离心的改良技术。先利用常用的梯度液介质如蔗糖、碘克沙醇和氯化铯等，在离心管中构筑从底部到顶部密度逐渐降低的密度梯度带。根据密度梯度构建和沉降方式的不同，又可以分为速率区带离心法和等密度梯度离心法，前者主要根据颗粒的沉降速率分离，介质密度均小于外泌体密度，离心时样品在向超速离心管底部移动时，会通过密度不断增加的密度梯度区带，密度大的颗粒更容易穿过密度更高的梯度层，更快地到达管底；等密度梯度离心法中的密度梯度区带，则会根据样品液中各种溶质成分来进行组合，离心过程中，无论离心时间多久，不同密度颗粒仅会富集到具有相同密度的梯度区带，而不会沉淀到底部。
外泌体作为细胞外囊泡的一个亚群，直径集中于30～150nm，还可以基于粒径大小分离外泌体，方法有超滤法、尺寸排除色谱法、静水过滤透析法和非对称场流分离法等。超滤法利用不同孔径的滤膜，对样品进行选择性分离以获得外泌体，一般分为压力超滤和离心超滤。其中离心超滤效果更好，不仅能减轻力对外泌体的破坏，而且可通过增大离心力和延长离心时间提高外泌体产物浓度。此外，超滤法可以和切向流过滤法、微控流法、超速离心法或凝胶过滤色谱法等方法结合进一步提高分离效率。尺寸排除色谱法是使用聚合物凝胶或类似的固定相柱进行外泌体分离的技术，样品以重力滴落的方式收集。流体力学半径较小的样品组分进入凝胶孔隙后，需耗费相对较长的时间通过凝胶柱，导致延迟洗脱，实现不同粒径大小颗粒分离。尺寸排除色谱法可以与差速离心法结合而不会明显损失外泌体，保证产量的同时可有效去除杂质蛋白。静水过滤透析法主要利用静水压力迫使样品中不同特定大小分子先后通过透析管，其中溶剂和小溶质很容易通过透析管，而较大的颗粒，如外泌体和其他囊泡，仍留在透析管中而被收集。在静水过滤透析法分离后使用超速离心方法可进一步将外泌体与滞留在透析管中的其他颗粒分离。非对称场流分离技术应用不同方向上的力场作用如离心力、引力场、温差、电场等作用力使得通道内不同体积大小的组分以不同的速度通过，最后通过评估检测器检测到的样品组分通过顺序以及颗粒在通道上的存留分布对组分进行分析分离。该技术具有在大尺寸范围内高分辨分离纳米颗粒的优势，可用于分离不同的细胞外囊泡亚群。
通过改变外泌体的溶解性或者分散性，可以将它们从体液或细胞培养液中沉淀出来。常见的方法是使用聚乙二醇或凝集素来沉淀样品中的外泌体。还可使用鱼精蛋白、醋酸钠、有机溶剂沉淀等方法进行沉淀分离。目前，几种商业化外泌体提取试剂盒如Exo-spinTM、ExoQuickTM、InvitrogenTM等产品均应用聚合物沉淀法来分离外泌体。
外泌体中存在着某些特定的蛋白质、脂质和多糖，基于抗原-抗体特异性识别和结合作用原理，可将外泌体从其他组分中分离出来。四次跨膜蛋白家族、脂膜、膜联蛋白、上皮细胞黏附分子或肝素等都可以作为抗原，而捕获外泌体的抗体可以附着在平板、磁珠、二氧化硅、树脂、膜亲和过滤器、纤维素滤膜、聚酰氨基胺树状聚合物表面和微流控器件上。常用方法有酶联免疫吸附法和磁珠法等。
微流控芯片是一种可兼容多种外泌体分离方法的新兴检测平台，这些方法包括免疫亲和分离、膜过滤、纳米线捕获、声纳米过滤和确定性侧向位移分选等。
提取后的外泌体可以悬浮于缓冲液中，例如磷酸盐缓冲液，在-80℃～4℃下冷冻保存。也可以在添加冷冻保护剂的情况下经冻干以冻干形式保存，冷冻保护剂例如海藻糖等。
根据本发明，所述含有外泌体的药物组合物，包含外泌体以及药学上可接受的赋形剂。在本发明的一种实施方式中，所述含有外泌体的药物组合物是混悬液，含有外泌体和缓冲液，所述缓冲液可以是本领域常用的缓冲液，包括但不限于PBS缓冲液，DPBS缓冲液，Tris缓冲液，Hepes缓冲液，磷酸钠，柠檬酸钠，琥珀酸钠，组氨酸(或组氨酸-HCl)，苹果酸钠，碳酸钠等。在本发明的一种实施方式中，所述含有外泌体的药物组合物是冻干制剂，含有外泌体和冷冻保护剂，所述冷冻保护剂可以是本领域常用的冷冻保护剂，包括但不限于甘露醇，蔗糖，海藻糖，乳糖，甘油，右旋糖等。对于冻干制剂，可以在使用前添加注射用水或缓冲液复建成混悬液。
根据本发明，所述药物或含有外泌体的药物组合物中，外泌体的含量可以为100～50000μg，例如200～40000μg，350～35000μg。当药物或所述药物组合物为混悬液时，外泌体的浓度可以为0.01-20μg/mL，例如0.01-10μg/mL，0.1-5μg/mL等。
根据本发明，针刺治疗包括但不限于传统的针灸治疗，电针治疗，穴位埋线，穴位注射，火针疗法，头针疗法，揿针疗法和浮针疗法等。针刺治疗的穴位包括但不限于百会、足三里、曲池、合谷、肩髃、手三里、内关、水沟、委中、环跳、三阴交、阳陵泉、风市、血海、太冲等。
根据本发明，所述针刺装置是用于进行针刺治疗的装置。对于传统针灸和头针疗法而言，针刺装置包括针灸用针。对于电针治疗而言，针刺装置包括电针治疗用针，任选包括电针机。对于穴位埋线治疗而言，针刺装置包括药线，任选包括穿刺针。对于穴位注射治疗而言，针刺装置包括注射用针头，任选包括注射器。对于火针疗法而言，针刺装置包括火针用针，其可以是常规的针灸用针，也可以是专门设计用于火针疗法的针。对于揿针治疗而言，针刺装置包括揿针。对于浮针治疗而言，针刺装置包括浮针。上述各类针刺装置均是本领域已知的，可以使用本领域已有的各种具体样式或/和材质的针刺装置。在本发明的一个实施方式中，所述针刺装置是针灸用针。在本发明的一个实施方式中，所述针刺装置是电针治疗用针。在本发明的一个实施方式中，所述针刺装置是穴位埋线的药线。在本发明的一个实施方式中，所述针刺装置是穴位注射用针头。在本发明的一个实施方式中，所述针刺装置是火针用针。在本发明的一个实施方式中，所述针刺装置是揿针。在本发明的一个实施方式中，所述针刺装置是浮针。
根据本发明，外泌体或包含外泌体的药物组合物的给药方式可以是鼻腔给药或静脉注射给药，优选为静脉注射给药。
根据本发明，外泌体的治疗用量为5-500μg外泌体/kg体重/次，具体治疗用量依据患者的病情、一般性的身体状况等进行调整。外泌体的给药频率为每天一次或每隔一天一次或每隔两天一次。给予外泌体的治疗可以在脑卒中发生后0-96小时开始。
根据本发明，针刺治疗的频率为每天一次。一次治疗持续20分钟-360分钟。采用电针治疗时，频率为1～3Hz，例如可以为2Hz。针刺治疗可以在脑卒中急性期内即可开始。
根据本发明，给予外泌体治疗和进行针刺治疗可以顺序开展：先给予外泌体，随后或间隔10分钟～1天再进行针刺治疗，或者，先进行针刺治疗，随后或间隔10分钟～1天再给予外泌体；也可以给予外泌体和进行针刺治疗同时进行。
根据本发明，给予外泌体和针刺治疗可以与脑卒中的其他治疗方法或药物联合使用，其他治疗药物包括但不限于活血化瘀类中药(例如：灯盏细辛注射液、参芎葡萄糖注射液、补阳还五汤、丹参类注射剂(包括：注射用丹参多酚酸盐、复方丹参注射液、丹参酮ⅡA磺酸钠注射液)、三七制剂(包括：血栓通注射液、血塞通注射液、复方血栓通胶囊、三七通舒胶囊、血塞通滴丸)、银杏叶类注射剂(包括：银杏内酯注射液、舒血宁注射剂、银杏达莫注射剂、金纳多)等)，溶血栓药物(例如，阿替普酶、尿激酶、链激酶、瑞替普酶、拉诺替普酶等)、抗凝药物(例如阿司匹林、氯吡格雷)、神经保护药物等。
根据本发明，所述脑卒中是出血性脑卒中或缺血性脑卒中。
所述治疗是改善脑卒中患者的神经功能损伤。
所述治疗是改善脑卒中患者的肢体运动功能。
所述治疗是改善脑卒中患者脑卒中后认知障碍。
所述治疗是降低脑卒中患者的脑梗死体积。
所述治疗是降低脑卒中患者的神经元凋亡。
所述治疗是调节脑卒中导致的T细胞免疫应答的紊乱。例如，所述治疗降低IFN-γ+Th细胞或/和IL-17+Th细胞的数量，或/和提高Foxp3+Treg细胞的数量。
所述治疗是抑制小胶质细胞的激活。
所述治疗是抑制星形胶质细胞的激活。
本发明中“组合产品”、“套装产品”的含义与成套产品、试剂盒、产品组合、产品套装的含义相同。其产品形式可以是但不限于：带有多个隔室的装置，每个隔室中独立装填有包含外泌体的药物组合物、针刺装置；也可以是由多个独立的容器包装而成的产品，每个独立容器中分别装填有包含外泌体的药物组合物、针刺装置。
术语定义：
“和/或”将被视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，在诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
“包括”和“包含”具有相同的含义，旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。当在本文中使用术语“包括”或“包含”时，因此也包括和公开了术语“由......组成”和/或“基本上由……组成”。
“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述外泌体之外的任何成分，并且在患者中具有基本上无毒和非炎性的性质，包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质或其他液体载体、分散或悬浮助剂、稀释剂、等渗剂、防腐剂、着色剂、甜味剂或调味剂、稳定剂、抗氧化剂、抗微生物剂或抗真菌剂、摩尔渗透压浓度调节剂、pH调节剂、缓冲剂、螯合剂、冷冻保护剂和/或填充剂，如适合于所需的特定剂型的。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的。示例性抗微生物剂或抗真菌剂包括但不限于苯扎氯铵，苄索氯铵，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯，苯甲酸，羟基苯甲酸，苯甲酸钾或苯甲酸钠，山梨酸钾或钠，丙酸钠，山梨酸等，以及它们的组合。示例性防腐剂包括但不限于，维生素A，维生素C，维生素E，β-胡萝卜素，柠檬酸，抗坏血酸等，以及它们的组合。控制pH的示例性缓冲液可包括但不限于磷酸钠，柠檬酸钠，琥珀酸钠，组氨酸(或组氨酸-HCl)，苹果酸钠，碳酸钠等，和/或其组合。示例性的冷冻保护剂包括但不限于甘露醇，蔗糖，海藻糖，乳糖，甘油，右旋糖等，以及它们的组合。
附图说明
图1：本发明中脑缺血再灌注小鼠模型的建立和治疗处理的流程图。其中a是电针处理和外泌体给药方式示意，图中“GV20”是电针刺百会穴，“ST36”是电针刺足三里穴，“Non-acupoint”是假电针组的针刺位点。b是各实验组的处理方式及其程序，从上至下“Sham”是假手术组，“MCAO”是缺血再灌注对照组，“Sham Acu”是假针组，“EA”是电针组，“iPSC-Exos”是外泌体组，“EA+iPSC-Exos”是外泌体和电针联合治疗组；每个组的处理程序中“Sham”是假手术，“Sacrifice”是处死，“MACO”是大脑中动脉闭塞处理，“Sham Acu”是假针刺，“EA”是进行电针刺，“iPSC-Exos”是给予外泌体，“EA+iPSC-Exos”是进行外泌体和电针刺联合治疗。
图2：小鼠采用大脑中动脉闭塞(MCAO)前，闭塞过程中，以及闭塞1小时后再灌注后5分钟的脑血流情况，其中左边三张照片分别为基线时(Baseline)、缺血时(Ischemia)和再灌注后5分钟(Reperfusion)的局部脑血流量的激光多普勒图；右边柱状统计图是前述三个时间点局部脑血流量的统计结果，***表示差异十分显著(P值<0.001)。
图3：各组小鼠Clark评分结果统计图，***表示差异十分显著(P值<0.001)。
图4：各组小鼠圆筒试验结果统计图，纵坐标为对侧肢体使用频次。
图5：各组小鼠旷场实验结果统计图，左边柱状图为移动总距离(cm)的统计图，中间柱状图为移动时间(sec)的统计图，右边柱状图为移动速度(cm/s)的统计图。
图6：各组小鼠用TTC染色分析脑梗死体积的结果，其中a是脑切片TTC染色后照片，b是各组小鼠皮质(左侧柱状统计图)、纹状体(中间柱状统计图)和半球(右侧柱状统计图)的梗死体积，c是各组小鼠脑冠状切片的皮质(左侧柱状统计图)、纹状体(中间柱状统计图)和半球(右侧柱状统计图)的梗死面积。
图7：各组小鼠TUNEL实验结果，其中d是TUNEL染色后荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜照片，e是TUNEL染色后TUNEL阳性细胞的百分比。
图8：各组小鼠Th细胞的分析结果，其中，a是IFN-γ+Th细胞分析结果，其中左侧是流式细胞仪分析结果图，右侧是对应流式细胞分析的IFN-γ+Th细胞百分比计数结果统计图；b是IL-17+Th细胞分析结果，其中左侧是流式细胞仪分析结果图，右侧是对应流式细胞分析的IL-17+Th细胞百分比计数结果统计图；c是Foxp3+Treg细胞分析结果，其中左侧是流式细胞仪分析结果图，右侧是对应流式细胞分析的Foxp3+Treg细胞百分比计数结果统计图；d是IL-4+Th细胞分析结果，其中左侧是流式细胞仪分析结果图，右侧是对应流式细胞分析的IL-4+Th细胞百分比计数结果统计图。
图9：各组小鼠IL-33免疫阳性细胞数量、IL-33蛋白表达水平的研究结果图。其中，a是各组小鼠IL-33免疫染色荧光照片；b是IL-33免疫阳性细胞统计图；c是GFAP阳性细胞统计图；d是IL-33蛋白表达水平研究图，其中上图是western blot结果图，下图是蛋白表达相对量统计图；e是IL-33免疫染色荧光照片局部放大图。
图10：各组小鼠ST2表达的研究结果图。其中，a是各组小鼠ST2免疫染色荧光照片；b是ST2免疫阳性细胞统计图；c是ST2蛋白表达水平研究图，其中上图是western blot结果图，下图是蛋白表达相对量统计图。
图11：各组小鼠脑梗死区Iba1+细胞的研究结果图。其中，a是各组小鼠的Iba1免疫染色荧光照片；b是Iba1+细胞计数统计图；c是活化的Iba1+细胞计数统计图；d是静息状态的Iba1+细胞计数统计图。
图12：实施例1制备得到的外泌体分析结果。其中a是人iPSC培养24h和48h后的照片；b中左图是采用流式纳米分析仪(NanoFCM，中国)对iPSC-Exos粒径的分析，右图是透射电子显微镜(TEM，Thermo Scientific，MA)下的iPSC-Exos形态；c是表面标记物(CD9和CD63)的阳性颗粒浓度分析。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
以下实施例所用到的常规试剂均可商购获得。
实施例1外泌体的制备
iPSC-Exos的提纯与鉴定
每天用新鲜的GDEV培养基(GDSJ0040，国典(北京)医药科技有限公司)对从人外周血细胞诱导得到的iPSC进行培养(图12的a)。从第2天至培养结束，每天收集培养液，300g离心5min，2000g离心10min，去除较大颗粒和细胞碎片。然后用0.22μm注射器过滤器过滤上清，使用Amicon Ultra-15离心过滤器(Ultracel-100kDa，Merck Millipore，MA)浓缩外泌体并过滤。弃去上清后，将沉淀物重悬在PBS中，收集的iPSC-Exos保存在-80℃，以便进一步的分析。采用流式纳米分析仪(NanoFCM，中国)对iPSC-Exos的粒径(图12的b中左图)、颗粒浓度和表面标记物(CD9或CD63)进行分析(图12的c)。通过透射电子显微镜(TEM，ThermoScientific，MA)鉴定iPSC-Exos的形态(图12的b中右图)。iPSCs-Exos的粒子浓度和细胞表面标记物CD9和CD63的浓度分别是100％，27％和13.5％。
实施例2实验动物模型与处理
成年雄性C57BL/6小鼠(每组10只，6-8周龄)购自北京维通利华生物科技有限公司。所有动物均保持在22±2℃的洁净室适应性培养，可自由获取水和食物。将小鼠随机分为6组：(1)假手术组(sham)，(2)MCAO组(MCAO)，(3)假针组(sham Acu)，(4)电针组(EA)，(5)iPSC-Exos组(iPSC-Exos)，(6)电针+iPSC-Exos组(EA+iPSC-Exos)。处理方式如图1所示。
采用大脑中动脉闭塞(MCAO)1小时后再灌注72小时来模拟脑缺血再灌注过程。用1.5-2％异氟醚麻醉小鼠，暴露右侧颈动脉区域。通过从右侧颈外动脉(ECA)穿过右侧颈内动脉(ICA)至大脑中动脉(MCA)插入硅橡胶涂层的7-0线栓(Doccol Corporation，Sharon，USA)进行大脑中动脉闭塞。阻断1小时后，取出线栓实现再灌注。再灌注72小时后处死小鼠取材。除了MCA未被阻断外，假手术组所有操作与MCAO组一致。使用perimer 5000激光多普勒系统(perimer，Stockholm，Sweden)监测所有小鼠的局部脑血流量(rCBF)，光纤探头直接放置在外露的颅骨上。基线值在颈内动脉结扎前进行测量(认为是100％的血流)。死亡或rCBF水平下降＜80％的动物被排除。整个过程中，小鼠体温保持在37℃。在缺血前、缺血期间以及再灌注后5分钟监测脑血流量，造模过程中脑血流情况如图2所示，在整个缺血期间，脑血流量的降低是稳定的，而在拔出线栓后立即恢复到缺血前水平，表明造模成功。
MCAO再灌注后2小时、24小时、48小时根据分组情况处理小鼠，外泌体治疗方式是通过小鼠尾静脉注射iPSC-Exos，每次注射20μg。
电针和假针刺的治疗：MCAO再灌注后即刻、24小时和48小时分别进行电针或假针刺治疗共3次。电针组在小鼠皮肤上指定位置剃光并消毒后，一次性无菌针(直径0.13mm，长30mm，ZhongYan TaiHe，China)在“百会”穴(GV20，头部正中，两耳连线的中点)和左侧“足三里”穴(ST36，髌下腓骨头远端5mm，胫骨结节外侧2mm)针刺约2mm深。采用电针装置(KWD-808II，Great Wall Brand，China)以2Hz频率连续电刺激30分钟。假针刺组选择髂前上棘上方10mm处作为针刺点，但不接通电刺激。
实施例3神经功能缺损的评估
对实施例2的实验动物进行神经功能缺损评估。
通过局灶性神经评分(Clark局灶评分)评估小鼠神经功能损伤，该评分显示与潜在梗死体积高度相关。测试包括以下七项测试：身体对称、步态、攀爬、转圈行为、前肢对称性、强迫转圈和胡须反应性。将七个项目得分相加，得出一个从0到28的总分。功能正常的小鼠得分最低，0分，功能障碍最严重的小鼠得分最高，28分。
Clark小鼠一般功能损伤评分标准(0～28分)
Figure BDA0003340363210000101
Clark小鼠局灶功能损伤评分标准(0～28分)
Figure BDA0003340363210000111
各实验组小鼠的评估统计结果如图3所示(图中*表示p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，MCAO组小鼠的Clark评分明显高于假手术组。经电针、iPSC-Exos或两者联合治疗后，小鼠的Clark评分分别与MCAO组的相比均有显著降低，表明小鼠的神经损伤明显减轻，而假针组的Clark评分与MACO组的没有差异，说明假针刺治疗对神经损伤没有明显的改善作用。
实施例4行为学测试
对实施例2的实验动物进行行为学测试。
采用圆筒试验评价小鼠前肢功能恢复情况。将小鼠放在一个透明的玻璃量筒中(直径12cm，高30cm)，让小鼠自由活动并用视频录制10分钟。小鼠对同侧(右)或对侧(左)的使用倾向由对小鼠治疗和分组完全不知情的观察者进行观察分析。对侧(左)肢体使用频次越高，表明前肢功能恢复越好。对侧(左)肢体使用频次＝观察期内对侧(左)肢体和同时使用同侧对侧肢体的次数/观察期内同侧和对侧肢体和同时使用同侧对侧肢体的总次数。
同时进行旷场试验，观察小鼠的自发活动能力。所有小鼠分别在一个黑色的旷场反应箱中(长50cm×宽50cm×高60cm)进行测试，并由正上方的数码摄像机监控。测试开始将一只老鼠放在场地中央，然后记录活动5分钟。通过Labmaze V3.0分析了移动总距离(cm)、移动时间(sec)和速度(cm/s)。
圆筒试验的结果如图4所示：MCAO组对侧(左)肢体的使用频次显著低于sham组，假针组的与MCAO组的则无显著性差异，电针组与MACO组和假针组的相比均有显著性差异，说明电针治疗能促进小鼠前肢功能恢复；外泌体组对侧(左)肢体的使用频次非常显著地高于MCAO组，也显著高于电针组，说明外泌体促进小鼠前肢功能恢复的效果好于电针治疗；外泌体和电针联合治疗组的对侧(左)肢体的使用频次非常显著的高于MCAO组，也高于电针组和外泌体组，并且与电针组相比有非常显著性差异，说明外泌体和电针联合治疗产生了更好的促进小鼠前肢功能恢复的效果。
旷场实验的结果如图5所示：MACO组的移动总距离、移动时间和移动速度均显著低于sham组，假针组的与MCAO组的则无显著性差异，电针组的移动总距离与假针组和MCAO组相比均有显著性差异(图中：*表示p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，但移动时间和移动速度与假针组和MCAO组相比没有显著性差异；外泌体组的移动总距离和移动时间都显著高于MCAO组，并且移动总距离比电针组有提高但没有显著性，移动时间与电针组相比增加并有显著性差异，但移动速度与电针组相比有所降低但没有显著性差异；外泌体和电针联合治疗组的移动总距离、移动时间和移动速度都非常显著的高于MCAO组，并且移动时间和移动速度都比电针组和外泌体组有显著提高。
圆筒试验和旷场试验也表明，电针组、iPSC-Exos组和电针+iPSC-Exos组小鼠在MCAO后的运动功能均有显著改善。其中，联合治疗组的改善作用更为明显，说明电针联合iPSC-Exos治疗对改善缺血性脑卒中后的神经功能和运动功能有更好的作用。
实施例5小鼠脑梗死体积和神经元凋亡情况
对实施例2的实验动物进行脑梗死体积和神经元凋亡情况分析。
分别用TTC染色和免疫荧光法检测MCAO小鼠脑梗死体积和神经元凋亡数量，探讨电针和iPSC-Exos在缺血性脑损伤中的作用。
TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)是脂溶性光敏感复合物，用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。TTC是呼吸链中吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。TUNLE染色即原位末端转移酶标记技术。凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3’末端，从而进行凋亡细胞的检测。TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。
小鼠MCAO造模并再灌注72h后，将动物麻醉处死后立即取出大脑，在-80℃冷冻2分钟，然后切成2mm厚的冠状切片。脑切片分别在37℃，无光照条件下浸泡在2％TTC(G3005，Solarbio，China)中30min，然后4％多聚甲醛浸泡1小时。拍照，并使用ImageJ软件进行分析。梗死体积(％)按以下公式计算：(对侧半球体积-同侧半球未受损体积)/对侧半球体积×100％，以消除脑水肿的影响。
小鼠MCAO造模并再灌注72h后，将动物麻醉处死后立即取出大脑，4％多聚甲醛固定12μm脑组织进行免疫荧光染色。采用细胞凋亡检测试剂盒(Roche)进行TUNEL染色。细胞核染色后，用荧光显微镜(Carl Zeiss Imager M1；Carl Zeiss，Inc.，Gottingen，Germany)和激光扫描共聚焦显微镜(LSM 510；Carl Zeiss，Inc.)拍照。
脑梗死体积的结果如图6所示：脑卒中72小时后，MCAO组小鼠的脑梗死体积显著增大，图6中a的MCAO组的脑切片苍白色面积较sham组高。而电针和iPSC-Exos治疗后梗死体积和面积均显著降低，假针刺治疗则没有明显改变，按区域分析，电针组小鼠的皮质、纹状体和整个半球的梗死体积和面积都显著低于MCAO组和假针组，也低于外泌体组，但没有显著性差异；电针+外泌体联合治疗组的皮质、纹状体和整个半球的梗死体积和面积都显著低于MCAO组和假针组，也低于电针组和外泌体组，并且有显著性(图6的b和图6的c)。进一步的，与MCAO组相比，电针组小鼠的脑梗死体积在皮层减少了15.5％，在纹状体减少了12.6％，在整个半球减少了14.5％。而iPSC-Exos组和联合治疗组，小鼠脑梗塞体积在大脑皮层分别降低了14.4％和24.7％，在纹状体分别降低了9.3％和18.9％，在整个半球分别降低了11.4％和26.5％(图6的b)。此外，梗死面积的缩小并没有偏向某一特定水平，即，大脑皮层、纹状体、海马的梗死体积均降低了(图6的c)。
TUNEL实验结果如图7所示：与假手术组相比，MCAO组在再灌注72小时后脑梗死区神经元凋亡数量显著增加，假针组脑梗死区神经元凋亡数量与MCAO组无显著差异，电针组、外泌体组和电针联合iPSC-Exos治疗组脑梗死区神经元凋亡数量与MCAO组相比，均非常显著降低(图7的d)，并且单独电针组和单独iPSC-Exos组之间治疗效果无显著差异，而联合治疗组与两组单独治疗组相比均有非常显著的降低(图7的e)。
综上所述，电针和iPSC-Exos均可缓解缺血性脑损伤，且电针联合iPS-Exos的整体治疗效果优于其他两个单独治疗组。
实施例6小鼠Th细胞的增殖和分化分析
为了研究电针或/和iPSC-Exos是否能够调节MCAO诱导的T淋巴细胞免疫应答，对实施例2的实验动物我们采用流式细胞术分析MCAO小鼠72小时后外周血Th细胞亚群(即IFN-γ+Th细胞、IL-4+Th细胞、IL-17+Th细胞和Foxp3+Treg细胞)的百分比。
处死小鼠后取出小鼠脾脏并用40μm尼龙网过滤。然后收集每只小鼠的外周血，悬浮在PBS缓冲液中。为了确定Th1，Th2和Th17细胞的百分比，用细胞刺激剂(00-4975-93，eBioscience)刺激脾细胞。然后使用固定/破膜试剂盒(426803，BioLegend)对细胞进行固定和破膜。接下来，用以下抗小鼠抗体(BioLegend，USA)对细胞染色：抗CD3-FITC(100204)，抗CD4-Brilliant Violet 650TM(100545)，抗IFN-γ-APC(505810)，抗IL-4-PE-Cy7(504118)和抗IL-17a-Brilliant Violet 421TM(506926)。为了确定Treg细胞的百分比，用以下抗小鼠抗体(BioLegend，USA)清洗细胞并染色：抗CD3-FITC(100204)，抗CD4-Brilliant Violet 650TM(100545)和抗Foxp3-PE(320008)。采用FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences)进行流式细胞术，使用CellQuest软件(Beckman CoulterBrea，USA)进行分析。
结果如图8所示，与sham组相比，MCAO组IFN-γ+Th细胞(图8的a)和IL-17+Th细胞(图8的b)水平显著升高，而在电针、iPSC-Exos或联合治疗组的小鼠，这种异常升高被显著抑制，联合治疗组的降低效果更明显，三个治疗组之间无显著差异，单独电针组与假针刺组之间有显著差异。与sham组相比，MCAO组术后Foxp3+Treg细胞的水平没有显著变化(图8的c)，但电针组、iPSC-Exos组和联合治疗组的Foxp3+Treg细胞的水平均有提高，并且联合治疗的与MCAO组、电针组、iPSC-Exos组相比均有显著性差异，说明电针和iPSC-Exos的联合治疗具有显著的协同作用，可以提高Foxp3+Treg细胞的数量。MCAO术后各组间IL-4+Th细胞水平无显著差异(图8的d)。这些结果表明，电针和iPSC-Exos联合治疗相比单独治疗能够更有效地调节MCAO诱导的T细胞免疫应答。
实施例7星形胶质细胞内IL-33/ST2轴活化的研究
IL-33通过结合ST2受体参与调节Th细胞免疫应答。为探讨电针或/和iPSC-Exos调控的Th细胞免疫应答是否与IL-33/ST2的激活有关，我们对实施例2的实验动物采用免疫荧光和Western blot检测IL-33和ST2的表达。
免疫荧光染色：小鼠MCAO造模并再灌注72h后，将动物麻醉处死后立即取出大脑，4％多聚甲醛固定12μm脑组织进行免疫荧光染色。冷冻切片用以下一抗孵育：兔抗NeuN(ab177487，Abcam，USA)、山羊抗IL-33(AF3626，R&D Systems，USA)、兔抗SULT2A1/ST2(ab194113，Abcam，USA)、山羊抗GFAP(ab68428，Abcam，USA)。用相应的二抗在室温下孵育1小时后，用DAPI染色标记细胞核。细胞核染色后，用荧光显微镜(Carl Zeiss Imager M1；Carl Zeiss，Inc.，Gottingen，Germany)和激光扫描共聚焦显微镜(LSM 510；Carl Zeiss，Inc.)。
Western blot：从小鼠脑缺血区提取总蛋白，用BCA试剂盒(23250，Thermo FisherScientific，USA)定量。12％SDS-PAGE凝胶分离等量的蛋白，电转移至NC膜。用以下一抗孵育：山羊抗IL-33抗体(AF3626，R&D Systems，USA)和兔抗SULT2A1/ST2抗体(ab194113，Abcam，USA)。然后在室温下二抗孵育1小时。利用ECL试剂(32109，Thermo FisherScientific，USA)和Bio-Rad ChemiDocTM XRS+系统进行化学发光检测后，利用Image J软件分析蛋白条带灰度值。管家蛋白为β-actin(ab8227，Abcam，USA)。
统计分析：所有数据均以均数±均数标准误差(SEM)表示，并使用SPSS 26.0软件(SPSS Inc.Chicago，USA)进行分析。采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey-Kramer分析后显著性差异最小检验进行统计比较。P值＜0.05为有统计学意义。
结果如图9和10所示：与sham组相比，MCAO小鼠病变部位的IL-33免疫阳性细胞数量(图9的a和b)和IL-33蛋白表达水平(图9的d)均显著升高。与单独电针或单独iPSC-Exos组相比，联合治疗对MCAO诱导的IL-33表达增加有更好的显著性降低作用。虽然电针和iPSC-Exos都能显著抑制梗死区IL-33的上调，但两者之间没有显著差异。小鼠脑梗死区内IL-33的显著表达伴随着星形胶质细胞的强烈激活，电针、iPSC-Exos或联合治疗都可以明显缓解这种变化，其中联合治疗的效果更为显著，而假针刺处理的小鼠与MCAO小鼠没有明显差异(图9的c)。此外，免疫荧光结果显示IL-33免疫染色(红色)主要与GFAP(绿色)共定位，提示IL-33主要表达于星形胶质细胞内(图9的e)。ST2的表达也有同样的趋势(图10的a-c)，说明电针或/和iPSC-Exos治疗后，病变部位的ST2表达增加被逆转，尤其是在联合治疗组，这种抑制作用更明显。以上结果表明，电针联合iPSC-Exos治疗能够通过促进星形胶质细胞内IL-33/ST2轴的激活来调节T细胞免疫应答。
实施例8对脑缺血诱导的小胶质细胞活化的影响研究
近年来的研究证实，脑缺血再灌注损伤后，小胶质细胞的形态和功能发生了一系列变化。小胶质细胞处于“静息”状态时，以分支形态为特征，利用这些高度分支的突起来观察周围环境。活化的小胶质细胞形态发生显著变化，缺血再灌注后，梗死周围区域小胶质细胞迅速增殖活化，形态变化为变形虫样细胞。活化的小胶质细胞的细胞核逐渐变大，其分支逐渐变小。
为了验证电针或/和iPSC-Exos治疗是否也能抑制小胶质细胞的激活，我们对实施例2的实验动物，在小鼠MCAO术后72小时采用免疫荧光法检测小胶质细胞表面标志物Iba1。
免疫荧光染色：小鼠MCAO造模并再灌注72h后，将动物麻醉处死后立即取出大脑，4％多聚甲醛固定12μm脑组织进行免疫荧光染色。冷冻切片用以下一抗孵育：兔抗Iba1(019-019741，Wako，Japan)。用相应的二抗在室温下孵育1小时后，用DAPI染色标记细胞核。细胞核染色后，用荧光显微镜(Carl Zeiss Imager M1；Carl Zeiss，Inc.，Gottingen，Germany)和激光扫描共聚焦显微镜(LSM 510；Carl Zeiss，Inc.)。
结果如图11所示，MCAO诱导了Iba1+细胞总数的显著升高，并激活了Iba1+细胞，使得活化的Iba1+细胞数量显著升高，而在单独电针、单独iPSC-Exos和联合治疗组，这两种升高的趋势均被显著抑制，尤其是在联合治疗组(图11的a-c)，联合治疗组的抑制效果与电针组和iPSC-Exos组均有显著性差异；电针组和假针刺组之间也有显著差异。相比之下，MCAO术后，静息状态的Iba1+细胞的数量显著下降，电针组、iPSC-Exos组和联合治疗组，这一下降趋势均被显著缓解(图11的d)，且联合治疗组的缓解效果与电针组和iPSC-Exos组均有显著性差异；电针组与iPSC-Exos组之间无显著差异。这些数据表明，电针联合iPSC-Exos治疗能够显著抑制MCAO诱导的小胶质细胞的激活，具有协同作用。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种治疗脑卒中的组合产品或套装产品，其特征在于，包括含有外泌体的药物组合物以及针刺装置。
2.外泌体在制备与针刺治疗联合使用的治疗脑卒中的药物中的用途。
3.外泌体在制备包括针刺装置的治疗脑卒中的组合产品或套装产品中的用途，优选，所述组合产品或套装产品包括含有外泌体的药物组合物。
4.如权利要求1所述的组合产品或套装产品或权利要求2或3所述的用途，其中，所述外泌体是人或哺乳动物的细胞的外泌体；优选，所述细胞选自血管内皮细胞、树突状细胞、T细胞、神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、胚胎干细胞、成体干细胞；优选，所述T细胞是Foxp3+Treg细胞；优选，所述成体干细胞选自造血干细胞，神经干细胞，间充质干细胞；优选，所述间充质干细胞来源于骨髓、脐带、脂肪、脐带血、羊膜、绒毛膜、牙髓、胸腺或滑膜。
5.如权利要求1所述的组合产品或套装产品或权利要求2或3所述的用途，其中，所述外泌体是诱导性多能干细胞的外泌体或人间充质干细胞或胚胎干细胞的外泌体。
6.如权利要求1-5任一项所述的组合产品或套装产品或用途，其中，所述药物或药物组合物中，外泌体的含量为100～50000μg。
7.如权利要求1-5任一项所述的组合产品或套装产品或用途，其中，所述药物或药物组合物为混悬液，外泌体的浓度为0.01-20μg/mL。
8.如权利要求1-7任一项所述的组合产品或套装产品或用途，其中，所述针刺装置选自针灸用针、电针治疗用针、药线、穴位注射用针头、火针用针、揿针和浮针的任一种或任意两种以上的组合；任选包括电针机、穿刺针和/或注射器。
9.如权利要求1-8任一项所述的组合产品或套装产品或用途，其中，所述针刺治疗选自传统的针灸治疗，电针治疗，穴位埋线，穴位注射，火针疗法，头针疗法，揿针疗法和浮针疗法的任一种或任意两种以上的组合。
10.如权利要求1-8任一项所述的组合产品或套装产品或用途，其中，所述脑卒中是出血性脑卒中或缺血性脑卒中；优选，所述治疗是改善脑卒中患者的神经功能损伤；优选，所述治疗是改善脑卒中患者的肢体运动功能；优选，所述治疗是改善脑卒中患者脑卒中后认知障碍；优选，所述治疗是降低脑卒中患者的脑梗死体积；优选，所述治疗是降低脑卒中患者的神经元凋亡；优选，所述治疗是调节脑卒中导致的T细胞免疫应答的紊乱；优选，所述治疗是降低IFN-γ+Th细胞或/和IL-17+Th细胞的数量，或/和提高Foxp3+Treg细胞的数量；优选，所述治疗是抑制小胶质细胞的激活；优选，所述治疗是抑制星形胶质细胞的激活。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116999465A (zh) * 2023-09-19 2023-11-07 河北中琨生物工程有限责任公司 脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用

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