CN116999465A - 脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用 - Google Patents
脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体具有以下优势：(1)易于保存，性质稳定；(2)体积小，穿透力，易吸收；(3)不引起体内的免疫排斥反应；(4)无基因突变等致瘤性。研究结果表明，本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体能够恢复或明显降低脑梗死面积，提高神经功能，恢复运动功能，显著减轻脑组织水肿。因此，本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体能够有效预防和治疗缺血性脑卒中，为临床上选择治疗缺血性脑卒中的药物提供了一种创新的选择。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
背景技术
脑卒中，也被称为脑中风，具有高发病率、死亡率、复发率和致残率的特点，因此给全球社会带来了沉重的经济负担。脑卒中主要分为两种，即缺血性脑卒中和出血性脑卒中，在所有卒中病例中缺血性卒中的比例大于85％。为了减少缺血性卒中的原发损伤，限制梗死面积，需要及时进行再灌注治疗(溶栓或取栓)。然而，缺血再灌注本身会在脑缺血再灌注损伤过程中引起损伤和功能障碍。因此寻找治疗缺血性脑卒中的药物迫在眉睫。
间充质干细胞主要是通过其旁分泌作用而发挥其治疗能力，旁分泌作用也被认为是在维持细胞内环境平衡及疾病转归过程中细胞间通讯的重要环节。而这其中，外泌体在细胞的旁分泌作用中发挥了极大的作用。外泌体是一种由细胞分泌的直径约为30～150nm的囊泡，属于细胞外囊泡的一种，包含了丰富的RNA、蛋白质、脂质等。外泌体参与了许多复杂的生理过程，诸如其可在细胞间通讯中起到至关重要的作用，还参与细胞衰老、分化以及免疫应答等过程。而关于脐带间充质干细胞来源的外泌体治疗缺血性脑卒中尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗脑梗死中药物中的应用。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗脑水肿药物中的应用。
优选的，所述脐带间充质干细胞来源的外泌体改善了神经功能。
优选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供了一种预防和/或治疗缺血性脑卒中的药物，所述药物包括有效成分和药学上可接受的辅料，所述有效成分为脐带间充质干细胞来源的外泌体。
优选的，所述脐带间充质干细胞来源的外泌体的有效含量占药物的质量百分数为20％～80％。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用，本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体具有以下优势：(1)易于保存，性质稳定；(2)体积小，穿透力，易吸收；(3)不引起体内的免疫排斥反应；(4)无基因突变等致瘤性。研究结果表明，本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体能够显著减轻脑组织水肿，还能恢复或明显降低脑梗死面积，改善神经功能，恢复运动功能。因此，本发明的间充质干细胞的外泌体能够有效预防和/或治疗缺血性脑卒中，为临床上选择治疗缺血性脑卒中的药物提供了一种创新的选择。
附图说明
图1中A为透射电镜测定的脐带间充质干细胞的外泌体的形态；B为脐带间充质干细胞的外泌体粒径结果图；C为脐带间充质干细胞的外泌体膜表面上的CD63、Alix和TSG101的表达结果；
图2中A为不同组别大鼠的脑组织经TTC实验后的对比结果图；B为不同组别大鼠的脑梗死面积对比结果；
图3为不同组别大鼠的神经行为学评分对比结果；
图4为不同组别大鼠的左侧和右侧大脑的含水量量化后的数据结果；
图5为不同组别大鼠脑组织的HE染色结果对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗脑梗死中药物中的应用。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗脑水肿药物中的应用。
在本发明中，所述脐带间充质干细胞优选地取自人源，与其他组织来源的间充质干细胞相比较，人脐带间充质干细胞具有以下优势：(1)无伦理学争议、分离简便、来源丰富，脐带为临床上的医疗废弃物，胎儿生产后丢弃的脐带组织均可用于人脐带间充质干细胞的分离，不会对捐赠者产生伤害；(2)增殖速度快，扩展能力强；(3)无致瘤性；(4)低组织抗原性，高组织相容性。所述脐带间充质干细胞来源的外泌体改善了神经功能，所述神经功能包括神经行为能力。
在本发明中，所述药物还优选的包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供了一种预防和/或治疗缺血性脑卒中的药物，所述药物包括有效成分和药学上可接受的辅料，所述有效成分为脐带间充质干细胞来源的外泌体。
本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式，具体地说本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体制成的药物剂型可为颗粒型、片剂、胶囊或注射剂，所述脐带间充质干细胞来源的外泌体的有效含量占药物的质量百分数为20％～80％。本发明所述的“有效含量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。
在以下的实施例中，脐带间充质干细胞无血清培养基购自北京友康。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
人脐带间充质干细胞来源的外泌体(Human Umbilical cord MesenchymalStemCells-Derived Exosome，HUC-MSC-Exos，又称MSC-EVs)的制备方法，步骤如下：
S1、脐带间充质干细胞的分离
(1)将新鲜脐带组织放在100mm培养皿中，倒入加有双抗的生理盐水，没过脐带即可。使用手术剪剪去两头结扎部分后，用止血钳向下挤出淤血，挤出淤血后更换生理盐水、重复操作3～4次，尽量将淤血清理干净。
(2)用手术剪将清洗过的脐带剪成2～3cm小段放入新鲜的加有双抗的生理盐水中，如仍有淤血残留，使用上一步骤相同的方法将淤血清理干净，直到脐带中的淤血全部清理干净为止。
(3)在100mm的培养皿中倒入1mL的无血清培养基(北京友康，脐带间充质干细胞无血清培养基)，以便为脐带提供一个湿润的环境。取一段脐带，寻找到两根脐动脉和一根脐静脉所在之处。用手术剪剪开脐带，用钩齿镊将静脉血管的粘膜清除及血管剔除干净，然后清除动脉血管及其粘膜。
(4)剔除血管后用钩齿镊子仔细将华通氏胶部分剥离下来，放入干净的50mL离心管。
(5)使用弯窄头综合组织剪将离心管中的组织剪碎，直至组织呈匀浆状。
(6)向离心管中加入45mL的无血清培养基，混匀。
(7)将离心管放至离心机中，300g，离心5min后弃去上清。
(8)剪去巴氏吸管(3mL)的前端，将剪碎的组织块平均转移至已加入培养的T75培养瓶内(每瓶约1mL组织块，大约1个/cm2)。用1mL枪尖使组织块均匀分布，标记好脐带组织名称、分离时间与日期、操作人员姓名后将培养瓶置于CO2培养箱内，静置20min后，取出培养瓶，每瓶加入3mL无血清完全培养基，使得培养基能够完全覆盖整个细胞培养瓶底面即可。
(9)4天后补液。每瓶补加1mL无血清完全培养基，置于CO2培养箱内，期间不要晃动培养瓶，避免组织块脱落。
(10)从第5天起观察细胞爬出情况，若组织块的细胞爬出面积达到30％～50％，使用1mL枪尖将组织块轻轻拨离至其他空白区域，以便细胞更好爬出与生长。
(11)当爬出的细胞覆盖细胞培养瓶底面积的90％左右时，进行原代细胞的传代。
S2、脐带间充质干细胞细胞的扩大培养
S2.1细胞复苏
(1)实验开始前，开启紫外照射超净工作台30min，开启水浴锅，设置为37℃，提前预热，在超净工作台内往15mL离心管内放入3mL完全培养基；
(2)戴上专业护目镜及手套，从液氮罐里取出冻存的细胞并将其放入透明无酶PE手套内，喷75％酒精消毒后拿入工作台内快速拧松放气，再贴好封口膜，迅速放入水浴锅中进行摇晃解冻；
(3)待细胞解冻至黄豆粒大小时，从水浴锅取出，喷75％酒精消毒后快速拿进超净台，将细胞移至步骤(1)中准备好的15mL离心管内，放入离心机，配平，以800rpm转速离心3min；
(4)离心完成后，吸弃上清液，用1mL无血清培养基重悬细胞沉淀，重悬均匀后转移至含有无血清培养基的培养皿或培养瓶中，上下左右摇晃使细胞均匀分布在培养皿或培养瓶中，然后放置在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。
S2.2细胞传代
(1)用显微镜观察细胞长至对数生长期时，吸弃培养皿或培养瓶里的旧培养基，用PBS缓冲液轻柔洗涤两次；
(2)视培养皿或培养瓶的规格加入适量胰酶消化细胞(北京友康的温和消化酶)；
(3)放在倒置显微镜载物台上查看细胞的形态，当大约有75％的细胞变圆悬浮后，快速放回超净工作台并向内添加无血清培养基(以1：2消化酶与无血清培养基的比例)结束消化过程；轻柔吹打培养皿或培养瓶底壁，待细胞完全离壁后移至15mL无菌离心管，以800rpm转速离心3min；
(4)离心后在工作台内吸弃上清液，加入1mL无血清培养基重悬细胞后按比例转移至含有培养基的培养皿或培养瓶中，上下左右摇晃使细胞均匀分布在培养皿或培养瓶中，然后放置在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。
S2.3细胞冻存
(1)HUC-MSCs使用无血清细胞冻存液(北京友康，无血清冻存液NC1001.1)，放入4℃冰箱里保存；
(2)同细胞传代的(2)(3)步骤一致；
(3)加入干细胞专用冻存液重悬细胞并吹打均匀，按照每支冻存管细胞数量为5×106个/mL的规格进行冻存。贴好封口膜，在冻存管上标记好细胞名称，代数以及冻存日期；
(4)将标记好的冻存管放入事先准备好的冻存盒中并放入-80℃冰箱中进行梯度降温，过夜后转移至液氮罐内长久保存。
S4、脐带间充质干细胞来源的外泌体的分离
本实验MSC-EVs的分离通过使用超高速离心机进行超高速离心法进行分离，具体实验步骤如下：
(1)待脐带间充质干细胞密度生长至70％～80％时，弃旧培养基，更换新鲜培养基(北京友康，脐带间充质干细胞无血清培养基)，放入细胞培养箱中培养72h，培养72h后收集培养基，若不立即进行后续分离实验放入-80℃冰箱保存；
(2)离心前一天需将超速离心机的转子以及配套离心管设备放入4℃冰箱预冷；
(3)将步骤(1)中收集的培养基以4℃，300×g 10min离心后取上清，2000×g10min离心后取上清，10000×g 1h条件进行继续离心，离心完成后弃沉淀，以去除培养基中含有的死细胞碎片、细胞碎片以及其他小颗粒碎片，收集上清液；
(4)取出步骤(2)中提前遇冷好的转子以及设备，将步骤(3)中所得的上清液吸至离心管中，以4℃，150000×g离心2h，离心完成后尽快取出离心管，吸弃大部分上清，再加入PBS重悬沉淀后同样以4℃，150000×g离心2h，离心完成后尽快取出离心管，吸弃上清，视沉淀量加入PBS重悬溶解，放入-80℃冰箱保存备用。
采用透射电镜、ZeTa电位分析仪以及westernblot方法对上述分离得到的脐带间充质干细胞来源的外泌体进行测定。
由图1结果表明，本发明分离得到的脐带间充质干细胞来源的外泌体形状呈圆形或者典型的茶托状(图1中的A)，纳米粒径结果图显示脐带间充质干细胞的外泌体的大小在100nm左右(图1中的B)，并且脐带间充质干细胞的外泌体膜表面含有CD63，TSG101，Alix标志蛋白(图1中的C)，表明本发明成功分离得到脐带间充质干细胞来源的外泌体。
实施例2
本发明利用MCAO(Middle CerebralArtery Occlusion，大脑中动脉栓塞，MCAO)动物构建缺血性脑卒中动物模型
2.1大脑中动脉栓塞(MCAO)的动物模型构建：
本实验采用SPF级健康雄性SD大鼠(体重200～230g，鼠龄7～8周)，实验前，所有大鼠在12h明暗交替的环境适应7天，并可以自由地获取食物和水。
将大鼠随机分为4组，假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、MCAO+PBS组、MCAO+EVs组，每组30只大鼠，除假手术组外，其他各组大鼠进行MCAO动物模型构建，而假手术组只进行术前麻醉以及血管分离，不结扎及导入线栓。构建MCAO动物模型手术完成1小时内，各组尾静脉注射药物，即假手术组和模型组不注射任何药物，MCAO+PBS组每只注射200μLPBS，每天注射一次，连续处理3天，MCAO+EVs组的处理方式为将实施例1制备得到的脐带间充质干细胞来源的外泌体用PBS配制成2mg/mL脐带间充质干细胞来源的外泌体，然后对每只大鼠注射200μL的2mg/mL脐带间充质干细胞来源的外泌体，每天注射1次，连续处理3天。
MCAO动物模型构建：取200～230g健康雄性SD大鼠，术前禁食12小时，可自由饮水。使用1％戊巴比妥钠(5mL/kg)进行腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后，将大鼠取仰卧位，固定头部及四肢，剃去颈部的毛发，用碘伏对大鼠颈部进行消毒。眼科剪做颈部正中切口，小拉勾拉开皮肤和软组织暴露血管。分离出左颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA)。在CCA打一个活结，避免刺激和颈总动脉伴行的迷走神经和气管。在ECA远心端打结结扎，ECA近心端靠近分叉处打活结，在ECA脉中间用缝合线打活结。在CCA分叉处近端的ECA周围打一活结，ECA的远端靠近头端打一死结并固定于胶布上起轻微的牵拉作用，颈内动脉(ICA)近端打一活结。取与大鼠体重匹配的线栓，在ECA远端第一二根线之间用眼科剪斜行45度向ECA分叉方向剪小口，不能剪断；从开口处向ECA分叉方向插入线栓，并用第二根线固定线栓防止滑脱；松开ECA近心端的线，离断ECA远心端，线拴转向ICA方向，沿着ICA线栓继续缓慢插入，当插入遇到阻力时立即停止插入，缝合伤口，术中用恒温垫维持大鼠肛温在37℃左右，术后将大鼠置于保温毯中，直至苏醒。
2.2脐带间充质干细胞来源的外泌体对大鼠脑梗死面积的影响
构建MCAO动物模型手术3天后，分别对假手术组大鼠、模型组大鼠、MCAO+PBS组大鼠和MCAO+EVs组大鼠进行脑组织解剖分离，对各组脑组织切片、TTC染色、拍照，结果如图2所示。
TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)是一种脂溶性光敏感复合物，它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。所以通过TTC染色观察梗死病变及梗死体积，非梗死区染为红色，梗死区呈白色。
TTC染色的具体实验过程如下：
分别取假手术组、模型组、MCAO+PBS组和MCAO+EVs组大鼠的脑组织切片，将获得的脑组织放在-80℃冰箱中快速冰冻5min，然后再冰上将脑组织切成2mm厚度的切片。使用2％TTC染料对脑组织切片进行染色，在37℃恒温箱孵育20min，注意避光，中间可翻面。染色结束后，将脑组织切片置于4℃冰箱使用4％多聚甲醛固定24h，然后拍照。
由图2结果可以明显看出假手术组没有发生梗塞，脑组织中未见白色梗塞区域，而MCAO模型组出现明显的白色梗死区域，这表明，MCAO大鼠模型构建成功；与模型组相比，注射脐带间充质干细胞来源的外泌体后可以有效的减少梗死面积。
2.3脐带间充质干细胞来源的外泌体对大鼠神经行为能力的影响
给药3天后，对各组大鼠进行神经行为学评分，评判标准依据Longa评分法。
Longa评分标准为0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前肢；2分：行走时身体向对侧转圈；3分：行走时身体向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。
图3结果表明，与Sham组相比，MCAO组大鼠的神经功能评分显著升高；与MCAO组相比，MCAO+PBS组评分无显著差异，MCAO+EVs组神经评分表现出显著的下降趋势，表明注射脐带间充质干细胞来源的外泌体后，显著改善了大鼠的神经行为能力。
2.4脐带间充质干细胞来源的外泌体对大鼠脑梗死后脑水肿的影响
脑水肿是MCAO模型典型的病理特征，脑梗发生后由于血流的阻断，脑细胞会出现缺血、坏死，出现缺血、坏死后脑细胞首先出现肿胀，从而发生脑水肿。
构建MCAO动物模型手术3天后，采用了干-湿重对大鼠梗死脑组织进行称重，将各组别大鼠深度麻醉后，分别对假手术组大鼠、模型组大鼠、MCAO+PBS组大鼠和MCAO+EVs组大鼠进行脑组织解剖分离，取出脑组织，用PBS清洗并用吸水纸吸干脑组织表面的水分，然后将脑组织去除嗅球和小脑，将大脑分为左右两部分，左右两部分分别取0.2g，各组做好标记，放于100℃烘箱中烘干24h，记录各个脑组织的干重，含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％。
由图4结果表明，MCAO组大鼠与Sham组相比，脑组织水肿明显，而MCAO+EVs组水肿程度明显减轻，表明注射脐带间充质干细胞来源的外泌体后，显著减轻了大鼠的脑组织水肿。
2.5脐带间充质干细胞来源的外泌体对大鼠脑梗死后神经元的影响
为了进一步验证不同组别对损伤脑组织病理水平的影响，分别取构建MCAO动物模型手术3天后的脑组织进行HE染色，并对损伤边缘图像进行截取与放大展示。
由图5所示，Sham组脑组织染色均匀，神经元数目丰富，排列规则，形态结构正常，胞核胞质分界清晰、核仁明显，未见明显炎症。MCAO组脑组织梗死侧可见大面积组织染色变浅，大量神经元坏死，核固缩深染或溶解，胞质嗜酸性增强(黑色箭头)，局部可见轻度的粒细胞、淋巴细胞与巨噬细胞浸润(黄色箭头)。MCAO+PBS组脑组织梗死侧可见大面积组织染色变浅、软化，大量神经元坏死，核固缩深染或溶解，胞质嗜酸性增强(黑色箭头)，局部可见少量淋巴细胞与巨噬细胞浸润(黄色箭头)；脑膜下可见多处水肿(红色箭头)，并可见毛细血管淤血扩张(蓝色箭头)；局部可见出血(绿色箭头)。MCAO+EVs组脑组织梗死侧可见较小范围的组织染色变浅，相比于模型组神经元坏死较少，核固缩深染或溶解(黑色箭头)，伴有较多淋巴细胞浸润(黄色箭头)，局部可见较多空洞结构(红色箭头)。上述结果表明，注射脐带间充质干细胞来源的外泌体后，上述结果表明脐带间充质干细胞来源的外泌体可以通过减少神经元坏死和变形来减少对大脑造成的损伤。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
2.脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗脑梗死中药物中的应用。
3.脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗脑水肿药物中的应用。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞来源的外泌体改善了神经功能。
5.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
6.一种预防和/或治疗缺血性脑卒中的药物，其特征在于，所述药物包括有效成分和药学上可接受的辅料，所述有效成分为脐带间充质干细胞来源的外泌体。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述脐带间充质干细胞来源的外泌体的有效含量占药物的质量百分数为20％～80％。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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