CN113980144B

CN113980144B - 一种多肽类似物及其应用

Info

Publication number: CN113980144B
Application number: CN202111293896.3A
Authority: CN
Inventors: 骆倩倩; 杨万萍; 姜辉; 王国华; 陈忠平; 朱俐
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-11-03
Also published as: CN113980144A

Abstract

本发明公开了一种多肽类似物及其应用，所述多肽类似物中多肽为Tat‑Sam68，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，Tat为11个氨基酸的穿膜结构序列，具体如SEQ ID NO.1所示；Sam68为与MD2亲和力最高的Sam68蛋白序列上的15个氨基酸片段，具体如SEQ ID NO.2所示。该多肽类似物可以应用于制备干预治疗冻伤的药物。本发明的多肽类似物可通过特异性靶向MD2，结合内源性MD2，从而抑制低温诱导下的MD2介导的细胞损伤，并有望改善冻伤。

Description

一种多肽类似物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及冻伤药物技术领域，具体涉及一种多肽类似物及其应用。

背景技术

冻伤或高原冷损伤是我国寒区和高原地区的常见病，可发生于日常生活和职业生产活动中，致残率和死亡率均较高，研究并提出冻伤救治方案不仅可为高原作业人群、更可为军事化演练及战备人员提供医疗保障和救治办法。

冻伤或低温症是由于人体在高原或者冷暴露后热量不断散失，核心体温逐渐降低至35℃以下而产生。冻伤的细胞机制目前认为主要是由于受损的微血管内皮细胞释放多种血管活性物质和细胞毒性介质。可以引起血小板聚集和黏附、凝血机制障碍和血栓形成，造成局部组织微血管循环障碍，组织细胞因缺血缺氧而坏死。Sam68是一种应激蛋白，广泛表达于各种组织细胞中，广泛参与体内各种生理和病理过程。Sam68蛋白由443个氨基酸组成，包含一个NK、KH和CK区域。众多研究发现Sam68在细胞应激、炎症反应、神经保护、生物节律调节、肿瘤发生发展中均发挥着重要作用。

Science Translational Medicine上的一项研究证实Sam68的其中一段氨基酸序列(SRGRG VPVRG RGAAP PPPPV)可以通过结合MD2抑制内源性Sam68与MD2结合从而抑制TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症反应。研究证实Tat携带的多肽序列可在静脉注射后不仅具备良好的穿膜性能和安全性，还有较好的成药应用前景。目前尚未有运用多肽类似物治疗冻伤的炎症反应的研究报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种多肽类似物及其应用，此多肽可通过特异性靶向MD2，结合内源性MD2，从而抑制低温诱导下的MD2介导的细胞损伤，并有望改善高原冷损伤。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种多肽类似物，所述多肽类似物中多肽为Tat-Sam68，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；其中，Tat为11个氨基酸的穿膜结构序列，具体如SEQ ID NO.1所示；Sam68为与MD2亲和力最高的Sam68蛋白序列上的15个氨基酸片段，具体如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述Tat位于所述多肽类似物的N端，所述Sam68位于所述多肽类似物的C端。

一种多肽类似物在制备干预治疗冻伤的药物中的应用。

一种干预治疗冻伤的药物组合物，包括上述的多肽类似物。

优选地，还包括药学上可接受的载体。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明的多肽类似物在冻伤模型上取得了很好的治疗效果。

(2)目前尚未有运用多肽类似物治疗冻伤的炎症反应的研究报道，此研究的多肽类似物可能进一步起到有效的药物作用。

(3)本发明的多肽类似物为临床治疗冻伤提供策略，具有很重要的实用价值。

(4)使用本发明的多肽类似物治疗的冻伤小鼠可有效改善冻伤后继发性炎症损伤。

(5)本发明的多肽类似物治疗作用与抑制炎症反应、促进皮肤表层细胞增殖有关。

附图说明

图1为实施例2中冻伤不同时间小鼠体重、血清炎症相关因子MD2及TNF-α的mRNA的表达变化图(^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)：(a)为小鼠体重变化图，(b)为MD2的mRNA的表达变化图，(c)为TNF-α的mRNA的表达变化图；

图2为实施例2中Tat-Sam68抑制冻伤后小鼠MD2及TNF-α的表达分泌结果图(^*P<0.05，^**P<0.01)：(a)为MD2的表达分泌结果图，(b)为TNF-α的表达分泌结果图；

图3为实施例2中Tat-Sam68对于冻伤小鼠冻伤皮肤愈合恢复情况的结果图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅用于对本发明进行说明，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他替代手段，均在本发明权利要求范围内。

实施例1

一种多肽类似物，所述多肽类似物中多肽为Tat-Sam68；其中，Tat为11个氨基酸的穿膜结构序列；Sam68为与MD2亲和力最高的Sam68蛋白序列上的15个氨基酸片段。

所述多肽类似物包括：转录反式激活蛋白Tat中的第47-57位氨基酸片段、Sam68蛋白序列上的第281-295位氨基酸片段。

所述转录反式激活蛋白Tat中的第47-57位氨基酸片段位于所述多肽类似物的N端，所述Sam68蛋白序列上的第281-295位氨基酸片段位于所述多肽类似物的C端。

所述转录反式激活蛋白Tat能够跨膜进入细胞内部，具有很强的内化作用；Tat蛋白由86-102个氨基酸残基组成，选取Tat蛋白中的第47-57位氨基酸片段，所述第47-57位氨基酸片段如SEQ ID NO.1所示，缩写为YGRKKRRQRRR，具体为Try-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。

所述Sam68蛋白序列上的第281-295位氨基酸片段能够有效识别出MD2并与MD2进行结合，片段如SEQ ID NO.2所示，缩写为SRGRGVPVRGRGAAP，具体为Ser-Arg-Gly-Arg-Gly-Val-Pro-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Ala-Ala-Pro。

即该多肽类似物中多肽Tat-Sam68的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，缩写为YGRKKRRQRRRSRGRGVPVRGRGAAP，具体为：

Try-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Arg-Gly-Val-Pro-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Ala-Ala-Pro。

实施例2

实施例1所述多肽类似物在干预治疗冻伤药物中的应用，具体步骤如下：

1、在冻伤小鼠模型上研究冻伤不同时间后小鼠体重、冻伤区皮肤组织炎症相关因子MD2及TNF-α的mRNA的表达变化情况。

基于冻伤后血清中MD2含量与冻伤时间可能存在的关系，实验研究首先构建了小鼠背部皮肤组织冻伤模型，并检测冻伤不同时间后相关指标的变化情况。

整体实验分为四组：采用常压常氧模拟的对照组，冻伤1天组(模型组)，冻伤3天组(模型组)，冻伤7天组(模型组)。

冻伤小鼠模型具体为：将ICR小鼠的颈背部的毛剔除干净后，画上直径3cm的标准化圆圈。使用在干冰(-78.5℃)中冷冻15min的磁铁在圆圈内的皮肤上进行连续5min的冷冻处理制构建冻伤模型。

如图1所示，冻伤1天后小鼠体重下降，冻伤3天下降最为明显，冻伤7天后体重增加；与对照组相比，冻伤1天后冻伤区组织炎症相关因子MD2及TNF-α的mRNA表达显著增加，随后降低。

2、在冻伤小鼠模型上研究多肽给药治疗对MD2及TNF-α的抑制情况。

基于冻伤后血清中MD2及TNF-α在冻伤1天后表达最高，后续对多肽的治疗研究时在冻伤1天时，给冻伤组小鼠尾静脉注射Tat-Sam68(10mg/kg)，1h后分离血清，用Elisa检测MD2及TNF-α的分泌情况。

整体实验分为三组：对照组(常压常氧)，模型组(冻伤1天)，治疗组(给冻伤1天的小鼠尾静脉注射Tat-Sam68)。

如图2所示，与对照组相比，冻伤1天的模型组小鼠血清中MD2和TNF-α含量显著增加，而给予多肽治疗后则可以显著降低模型组小鼠血清中MD2和TNF-α含量，说明多肽能显著抑制冻伤后皮肤组织中的MD2和TNF-α的分泌。

3、在冻伤小鼠模型上研究多肽给药对冻伤小鼠的治疗效果。

基于冻伤后血清中MD2及TNF-α在冻伤1天后表达最高，后续对多肽的治疗研究时在冻伤1天时，给冻伤组小鼠尾静脉注射Tat-Sam68(10mg/kg)，隔天1次，持续3天。拍照观察冻伤小组背部皮肤愈合情况。

实验分为两组：对照组(冻伤1天)，治疗组(给冻伤1天的小鼠尾静脉注射Tat-Sam68)。

如图3所示，从小鼠给予多肽治疗之日开始进行持续拍照观察冻伤周围皮肤愈合情况，与对照组相比，治疗组恢复情况明显好于对照组，在第17天时背部皮肤痂已脱落，在第29天时，治疗组的老鼠冻伤区皮肤表面已经全部愈合并长出了新的皮肤组织；而对照组小鼠背部冻伤区皮肤在第29天时痂还没有脱落。

经过以上实验证明：实施例1所述多肽类似物中，转录反式激活蛋白Tat中的氨基酸片段带动所述多肽类似物穿透并进入细胞中，Sam68蛋白序列上的氨基酸片段能够识别出MD2并与MD2进行结合抑制其促炎功能，从而改善冻伤后继发性炎症损伤促进皮肤愈合。

序列表

<110> 南通大学

<120> 一种多肽类似物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro

1 5 10 15

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ser Arg Gly Arg Gly

1 5 10 15

Val Pro Val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro

20 25

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽为Tat-Sam68，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，Tat为11个氨基酸的穿膜结构序列，具体如SEQ ID NO.1所示；Sam68为与MD2亲和力最高的Sam68蛋白序列上的15个氨基酸片段，具体如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种多肽，其特征在于，所述Tat位于所述多肽的N端，所述Sam68位于所述多肽的C端。

3.如权利要求1或2所述的一种多肽在制备干预治疗冻伤的药物中的应用。

4.一种干预治疗冻伤的药物组合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的多肽。

5.根据权利要求4所述的一种干预治疗冻伤的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体。