CN112675294B

CN112675294B - 一种成纤维细胞的制备及在整形外科修复中的应用

Info

Publication number: CN112675294B
Application number: CN202110268103.6A
Authority: CN
Inventors: 吕达; 马宏磊
Original assignee: Nuosa Union Beijing Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Nuosa Union Beijing Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2041-03-12
Also published as: CN112675294A

Abstract

本发明涉及一种成纤维细胞的制备及在整形外科修复中的应用。本发明发现了一种能够有效的促进成纤维细胞的刺激肽，所述刺激肽在促进成纤维细胞增殖的同时，还能够对与创伤愈合密切相关的TGF‑β1、SOD的表达具有显著的促进作用。通过小鼠伤口愈合实验，也证明了所述的刺激肽具有在动物实验上显著的促进作用，具有较好的应用价值和前景。

Description

一种成纤维细胞的制备及在整形外科修复中的应用

技术领域

本申请涉及制药领域，更具体的，涉及一种成纤维细胞的制备及在整形外科修复中的应用。

背景技术

整形外科修复中，最常见的伤害是皮肤受损，皮肤创面修复是一个复杂的生物学过程，涉及创面炎性翻译、肉芽组织增生以及再上皮化等主要过程。成纤维细胞应用于创面总的效应是促进创面修复，主要表现在促进新生肉芽组织生长。成纤维细胞是最主要的修复细胞，是构成肉芽组织的主要成分之一。损伤刺激后，成纤维细胞在趋化因子的作用下进入创口并分裂增殖，与毛细血管及渗出的炎细胞构成肉芽组织。在伤后5～7d 肉芽组织达到高峰，成纤维细胞数量剧增，功能活跃。

成纤维细胞具有分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活、增殖较快等优点，可进行一般创伤修复和骨创伤修复。现已有专家学者提出成纤维细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）可增强成纤维细胞的活性。他们认为有针对性地应用生长因子，治疗既可最大限度发挥生长因子本身的生物学作用，同时也会避免或预防许多可能的不良反应，以达到经济与最佳的促修复效果。因此，在临床应用中成纤维细胞可广泛应用于体表创面修复的研究及医疗的其他领域。

近年来，国内外关于胶原蛋白肽的研究极为活跃，因其弱的抗原性和良好的生物相容性，胶原蛋白肽在美容祛皱、保护皮肤、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域应用广泛。越来越多的证据表明，在膳食中补充胶原蛋白肽能够促进关节、指甲和毛发中的细胞外基质合成，减少骨质丢失，改善皮肤的屏障功能，修复骨、肌腱损伤。因此，胶原蛋白肽很可能会在伤口愈合过程中起到重要作用。然而，目前关于胶原蛋白肽对创伤愈合作用的研究较少。伤口愈合涉及复杂的生理和生物学机制，包括炎性反应、细胞增殖和创面重塑3个阶段。其中，成纤维细胞不仅在细胞增殖期，而且在整个创面重塑阶段都发挥重要作用。已有研究表明胶原蛋白肽以及鹿茸多肽均能够有效的刺激成纤维细胞的增殖，进而促进伤口的愈合，所述多肽促进效果还不显著，而且在糖尿病伤口的促进方面，也没有相应的研究。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种促进成纤维细胞快速增殖的方法。

一方面，本发明提供了一种促进成纤维细胞增殖的刺激肽，所述刺激肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示。所述刺激肽是从本公司的肽库中筛选获得的。

在本发明的特定实施例中，本文所述和提供的多肽包含或由至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.3%，99.5%，99.7%，99.8%，99.9%或100%的氨基酸组成（对于SEQ ID NO:1:优选至少98%；对于SEQ ID NO:1:优选至少99.9%或100%），与SEQ IDNO:1的氨基酸序列相似或相同（例如相同）。例如，本发明的多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。

本发明还涉及编码本文所述和提供的本发明多肽的多核苷酸。在本文中，编码本发明多肽的的核苷酸序列可以全部具有相同的核苷酸序列或具有不同的序列，优选地，至少1个氨基酸序列与其它氨基酸序列不同，最优选它们都相差至少一个核苷酸，但是可以（优选地）编码相同的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码与SEQ ID NO：1至少80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.3%，99.5%，99.7%，99.9%或100%相同的氨基酸序列。

本文描述的是包含至少一种本文重组或合成多肽和治疗性，治疗性皮肤损伤治疗性制剂。

在一些实施方案中，本发明的多肽与赋形剂一起被配置用于局部应用。在一些实施方案中，赋形剂被配置为局部补充剂。在进一步的实施方案中，配制该制剂以应用于人的损伤皮肤。更具体地，该制剂可被配置成局部地从表皮渗透到真皮。在一些实施方案中，制剂可以被配置成局部地穿透表皮和真皮层。在一些实施方案中，所述制剂可以被配置成局部地穿透表皮层，并且具有低的进入真皮层的渗透。通常，可以使用各种渗透研究来评估制剂中组分的渗透。在一些实施方案中，所述制剂包含载体，微球，脂质体或胶束，以便携带所述多肽和控制所述多肽通过皮肤的释放时间和/或渗透深度。在一些情况下，本文的制剂是乳膏，软膏，凝胶，液体，油，粉末，洗剂，血清，乳液，保湿剂，泡沫，面膜，摩丝，气雾剂，喷雾剂，清洁剂，调色剂，局部贴剂，水凝胶贴剂或洗发剂。

在一些实施方案中，所述制剂被配置为片剂，胶囊，凝胶，胶状物或粉末。本文描述了治疗有此需要的受试者的皮肤损伤的治疗方法，所述方法包括给予所述受试者包含SEQID NOs:1中氨基酸序列的治疗制剂。

进一步的，本发明还提供一种药物组合物，所述组合物中含有刺激肽以及其他要用辅料。

所述药物组合物中还可以有第二治疗药剂，所述第二治疗药剂为生长因子。

本发明中，基于100重量份的刺激肽而言，其他药用辅料的量为100～500重量份，其他药用辅料包括崩解剂、填充剂、粘合剂、溶胀辅料、润滑剂、矫味剂、或甜味剂及其组合。各种药用辅料的用量可以由本领域技术人员根据各辅料在分散片制剂中的常规用量进行选择，这在本领域技术人员的能力范围内。

本发明进一步的，提供了刺激肽在制备皮肤损伤修复的药物中的用途。

其中，刺激肽的给药量为刺激肽10-100mg/kg/d。

有益效果

本发明通过研发发现了一种能够有效的促进成纤维细胞的刺激肽，所述刺激肽在促进成纤维细胞增殖的同时，还能够对与创伤愈合密切相关的TGF-β1、SOD的表达具有显著的促进作用。通过小鼠伤口愈合实验，也证明了所述的刺激肽具有在动物实验上显著的促进作用，具有较好的应用价值和前景。

附图说明

图1 刺激肽对创面愈合的效果图

具体实施方式

如下文中所用，术语“优选地”，“更优选地”，“最优选地”，“特别地”，“更特别地”，“特别地”，“更特别地”或类似术语与可选特征结合使用，而不限制进一步的可能性。因此，由这些术语引入的特征是可选特征，并不意欲以任何方式限制权利要求的范围。正如本领域技术人员将认识到的，本发明可以通过使用可替换的特征来执行。类似地，由“在一个实施例中”或类似表达式引入的特征旨在是可选特征，对本发明的其它实施例没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，对以这种方式引入的特征与本发明的其它可选或非可选特征相结合的可能性没有任何限制。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 成纤维细胞的制备

皮肤组织碎块用无菌PBS洗涤数遍后，用小镊子将其放入50ml离心管中，加入0.2%I型胶原酶10ml，37℃水浴摇床以100r/min，振摇消化45min，收集上清液中的细胞，放入15ml离心管中，加人0.25%胰蛋白酶10ml，进行第2次消化20min，再加含10%血清的DMEM/F12培养基1ml终止消化，与第1次消化的细胞悬液混合，收集细胞悬液于2个15ml离心管中，1000r/min离心8min，弃去上清液，加1ml含10%FBS和青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml的DMEM/F12培养基，细胞计数。按10⁵个/ml细胞接种于培养瓶中，正常培养24h后换液，此后隔日换液。

细胞传代细胞长成致密单层后，用0.25%胰蛋白酶消化。在前3次传代时，待细胞刚变圆即终止消化，收集脱壁细胞，得到纯化的成纤维细胞。

将分离的成纤维细胞采用免疫荧光细胞化学染色鉴定成纤维细胞。成纤维细胞接种至6孔板中，每孔2×10⁵个细胞。次日，细胞长满至培养皿80%～90%时，移液管吸弃培养基，PBS洗涤2次。每孔加入40g/L多聚甲醛溶液1mL，室温固定20min后，PBS洗涤细胞3次，加入1mL5mL/L的TritonX-100孵育15min。PBS洗涤3次，加2mL 50g/LBSA/PBST(含5mL/LTween20)室温封闭2h。PBST洗2次，加1mL 5g/L BSA/PBST稀释的兔抗人vimentin抗体(1∶500)，室温孵育1h;PBST洗涤3次，加1mLAlexFlour 488标记山羊抗兔IgG(1∶200)，室温避光孵育1h;PBST洗涤3次，最后用5μg/mL的DAPI复染细胞核5min;PBST洗涤3次后，避光保存，用荧光显微镜观察细胞形态，计数vimentin阳性细胞。

荧光显微镜下观察发现vimentin 阳性细胞发出绿色荧光，同时DAPI染核计数总细胞，算出vimentin 阳性细胞比率为99.87±0.23% ，说明细胞纯度好，可以用于后续实验。

实施例2 成纤维细胞刺激肽促进成纤维细胞增殖的实验

第3代成纤维细胞经胰蛋白酶消化后，将细胞接种至96孔板中，200μL/孔。每孔1000个细胞，5个平行孔。各组分别加入0、5、10、20、50、100mg/L的刺激肽（SEQ ID NO：1）溶液待细胞培养48h后，吸出培养液，每孔加入100μL的CCK8，于CO₂恒温培养箱中培养2h，用酶标仪检测细胞的吸光度来计算细胞的存活率，每组设6个复孔，取平均值。结果如表1所示。

表1 成纤维细胞增殖结果

成纤维细胞增殖速度随着胶原蛋白肽浓度的增高而加快，呈现剂量效应关系。经过0、5、10、20、50mg/L的刺激肽处理人皮肤成纤维细胞48h后，细胞存活率分别为100％、（116.2±8.9）％、（192.4±7.6）％、（289.5±6.8）％、（395.2±11.2）％、（423.9±9.7）％。在刺激肽浓度为100mg/L时，成纤维细胞增殖速度最快。

实施例3 ELISA检测TGF－β1和SOD的表达

用适量胰酶消化细胞后，轻轻吹打混悬制成单细胞悬液，将细胞悬液均匀铺于培养皿中，待细胞培养12h完全贴壁后吸出培养液，各组分别加入0、5、10、20、50、100mg/L的刺激肽（SEQ ID NO：1）溶液。次日换液，待培养48h细胞基本融合后，吸除培养液，用PBS洗涤3次，每小皿加1mL的PBS，刮下细胞，置于EP管中。以3000～5000r/min离心5min，弃上清液，每管加入150μL细胞裂解液，冰浴30min，中间涡旋1次，以12000r/min离心10min，取上清液，根据试剂盒操作说明分别检测TGF－β1和SOD的表达。结果如表2所示。

表2 不同浓度刺激肽对人皮肤成纤维细胞的影响

从表2的结果表明，刺激肽能对TGF-β1、SOD的表达具有显著的促进作用。而这些因素均与创伤愈合密切相关，提示刺激肽很可能对伤口愈合具有明显的促进效应。

实施例4 刺激肽对皮肤损伤小鼠的治疗研究

ICR雄性小鼠， 8周龄，清洁级，北京华阜康生物科技股份有限公司提供。适应性饲养1周后，禁食12h，腹腔注射STZ(150mg／kg)诱导小鼠糖尿病模型，注射3d后，小鼠禁食12h，测定小鼠尾静脉血糖浓度，以空腹血糖浓度≥13．875mmoL／L作为糖尿病造模成功的标准。造模成功的糖尿病小鼠饲养3周后，将小鼠麻醉，剪除背部毛发，然后用活检穿孔器在其背部正中做一直径0.6cm的圆形创口(切除皮肤全层，深达筋膜)，切创后清洁创口，进行敷料敷贴。为了让敷料不易脱落，敷贴前将安息香酊乙醇溶液均匀涂抹于距创口边缘1.5cm处，待其干燥后，3M无菌透明生物敷料敷贴创口。

动物分组：对照组：正常血糖小鼠在相同部位制作相同大小的创口作为对照；刺激肽处理组及阴性对照组：糖尿病小鼠于切创5d后开始腹腔注射刺激肽100mg/kg/d(生理盐水稀释)或等量生理盐水，分别于切创后10d、14d和21d(每个时段5只小鼠)提取创口样本。创口愈合形态学观察采用拍摄图像，按以下公式计算创面愈合率。创面愈合率(％)=(创面初始面积-创面形成后第n天的面积)／创面初始面积×100％；结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，糖尿病对照组（没有给药）与正常小鼠空白对照组相比，创面愈合明显延迟。而采用刺激肽给药后，可以明显的促进了糖尿病小鼠的创面愈合速度，具有较好的促进糖尿病小鼠皮肤损伤修复的效果。

采用将21d各组的损伤修复后的皮肤去样，每管加入100mg以及裂解液，冰浴30min，中间涡旋1次，以12000r/min离心10min，取上清液，根据试剂盒操作说明分别检测TGF－β1和SOD的表达。结果如表3所示。

表3刺激肽对各组相应TGF－β1和SOD表达的影响

从表3可以看出，刺激肽实验组能够有效的促进糖尿病小鼠皮肤损伤部位相应的TGF－β1和SOD的表达，进而提高了小鼠的损伤治愈率。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

<110> 诺赛联合（北京）生物医学科技有限公司

<120> 一种成纤维细胞的制备及在整形外科修复中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Leu Trp Ala Tyr Lys Cys Arg Asp Ala Leu Trp Trp Trp Ala Lys

1 5 10 15

Val Asn Gln Asn Ala Pro Met His Gly His Arg Trp Phe Ala His Ser

20 25 30

Claims

1.SEQ ID NO：1所示的刺激肽在制备用于促进伤口愈合的药物中的用途，其中，所述药物能够提高成纤维细胞的TGF－β1和SOD的表达，同时能够促进成纤维细胞的增殖，所述药物还包括药学上可接受的载体。

2.SEQ ID NO：1所示的刺激肽在制备用于促进糖尿病患者伤口愈合的药物中的用途，其中，所述药物能够提高成纤维细胞的TGF－β1和SOD的表达，同时能够促进成纤维细胞的增殖，所述药物还包括药学上可接受的载体。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述药物的制剂是乳膏，凝胶，喷雾剂，或局部贴剂。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述药物中还有第二治疗药剂，所述第二治疗药剂为生长因子。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述第二治疗药剂为bFGF。