KR101688696B1 - 엔케팔린 변이체를 함유하는 상처 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엔케팔린 변이체를 유효성분으로 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 보습용 화장료 조성물, 및 상기 엔케팔린 변이체 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 엔케팔린 변이체를 포함하는 조성물은 각질형성세포주의 세포 이동 및 콜라겐 증식을 유도함으로써 상처 치료 효능이 뛰어나, 상처 치료를 위한 피부 외용제를 비롯한 의약품 등에 적용되어 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

엔케팔린 변이체를 함유하는 상처 치료용 조성물{Composition for Wound Healing Comprising Enkephalin Variant}

본 발명은 엔케팔린 변이체를 함유하는 상처 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 엔케팔린 변이체를 유효성분으로 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 보습용 화장료 조성물, 및 상기 엔케팔린 변이체 펩타이드에 관한 것이다.

피부는 신체를 보호하는 방어막 역할을 수행하고 질환에 대한 신체의 일차 방어선이며, 표피(epidermis)가 미생물 침입에 대한 장벽을 제공한다. 따라서 창상(創傷)이라고 칭해지기도 하는 상처, 화상, 찰과상 및 피부에 대한 기타 손상의 치료에서 일차적인 목적은 감염을 예방하기 위한 신속한 봉합(closure) 및 상처 치유이다. 상처 치유는 일반적으로, 염증(inflammation), 증식(proliferation) 및 재형성(remodelling)의 3가지 단계를 수반하는 복잡한 과정이다. 첫 번째 단계는 지혈(haemostasis)을 달성하기 위한 응고(clotting), 그리고 세균 및 괴사 조직을 파괴하기 위한 호중구의 보충, 그 이후에 대식세포의 보충을 수반한다. 두 번째 단계 동안, 혈관신생(angiogenesis)이 발생하고, 이때 내피 세포가 상처 부위로 들어가고, 이와 동시에 섬유아세포가 상처 부위로 들어가고 육아 조직(granulation tissue)을 생산하는데 도움을 준다. 육아 조직의 형성은 재상피화(reepithelialisation)가 일어날 수 있도록 한다. 최종 단계 동안, 콜라겐 생산과 파괴의 수준이 균등해지고, 그리고 치유된 상처는 최대 강도를 달성하기 위하여 천천히 변경된다. 상처 치유는 이들 과정 중에서 임의의 한 가지가 적절하게 또는 시기적절한 방식으로 기능하지 않을 때, 지연되거나 손상된다. 이것은 만성적인 상처를 유발할 수 있는데, 이러한 상처는 개인에게 중요한 문제일 뿐만 아니라 비용이 많이 드는 임상적 문제점일 수 있다. 따라서, 피부 및 표피 조직을 재생시키는 신체의 자연 과정을 가속화시키는 조성물이 필요하다.

상기 상처 치유(wound healing)는 임상적으로 피부가 완전하게 봉합되는 것을 의미하며, 각질세포(keratinocyte), 섬유모세포(fibroblast), 혈관내피세포(endothelial cell), 대식세포(macrophage), 혈소판(platelet) 등 여러 종류의 세포가 상호작용하며 조절하는 복잡한 과정이다. 각각의 과정은 많은 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine)이 조절하는 복잡한 신호전달망에 의해 조절된다.

상처는 빠르게 치료해야 2차 감염의 위험을 줄일 수 있다. 또한, 상처치료 과정에서 염증반응이 지속되면 염증기에서 증식기로의 진행이 이루어지지 않아 정상적인 상처치유가 지연된다. 이러한 이유로 염증반응을 유도하지 않는 상처치료제의 개발이 활발하게 진행되고 있다.

상처 치료제는 상처 부위의 세균에 의한 2차 감염을 막는 항생제로 인류의 역사와 함께 발전하여 다양한 치료 제재가 개발되고 사용되어져 왔다. 20세기 플레밍에 의한 항생제의 발견과 더불어 비약적으로 발전한 상처 치료제는 초기에는 단순히 항생제만을 포함하고 있었으나, 최근에는 항생제와 함께 손상된 세포의 재생을 촉진시켜 주는 물질인 EGF (epidermal growth factor), 사이토카인 (cytokine), 인터루킨 (interlukin), TGF-β(transforming growth factor-beta) 등과 같은 단백질 등을 첨가하여 상처 치유력을 높이고 있다.

한편, 엔케팔린은 뉴로펩타이드의 한 종류로서, 피부세포와 신경세포는 배엽 발달 과정 중 공통적으로 외배엽에서 유래하며, 최근 피부세포 막에서 발현되는 뉴로펩타이드 수용체들이 보고되어 있다.

뉴로펩타이드 변이체와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1410589호 에서는 벤조산 유도체에 결합된 뉴로펩타이드의 피부 항염, 항산화 및 콜라겐 합성 효과 등에 효능을 가짐을 개시하고 있다. 또한 합성 펩타이드(대한민국 공개특허 제10-2012-0036526호) 또는 EGF(대한민국 공개특허 제10-2014-0090752호)로부터 유래된 펩타이드등의 상처 치료용 조성물에 대해 개시되어 있다. 그러나, 상기 뉴로펩타이드의 상처 치유 효능에 대해서는 기존에 전혀 알려진 바가 없었다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 상처 치료에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 세포 중에서 각질형성세포주에 주목하여, 이를 이용한 상처 치료 효능을 갖는 펩타이드를 찾기 위해 예의 노력한 결과, 상기 엔케팔린 변이체가 각질형성세포주의 세포 이동(migration), 콜라겐(collagen) 증식 활성, 보습능 및 렛(rat) 전층 결손 모델에서 창상 치유 효능을 나타냄으로써 상처 치유 효능을 가진다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 엔케팔린 변이체를 유효성분으로 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 엔케팔린 변이체를 유효성분으로 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 엔케팔린 변이체를 유효성분으로 포함하는, 보습용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 유효성분으로서의 엔케팔린 변이체 펩타이드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 엔케팔린 변이체를 유효성분으로 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학적 조성물을 제공한다. 구체적으로 상기 엔케팔린 변이체는 엔케팔린의 특정 아미노산이 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 서열번호 2 또는 5의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.

본 발명의 엔케팔린(Enkephalin)은 신경말단에서 분비하는 신경 펩타이드의 일종으로, 일반적으로 통각전달에 관여하는 등 억제성 신경전달조절물질로 알려져 있으며, 오피오이스(opioid) 수용체와 특히적으로 결합하는 내인성(內因性) 펩타이드로 알려져 있으며, 메티오닌-엔케팔린 및 류신-엔케팔린이 알려져 있다. 본 발명에서는 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu의 아미노산 5개로 구성된 류신-엔케팔린(서열번호 1)에 대해 알라닌 스캔(Alanine scan) 방법을 통한 선도 펩타이드(lead peptide)를 도출하고, 이를 바탕으로 효능이 극대화된 엔케팔린 변이체를 선별하였다.

종래에 엔케팔린 변이체에 대한 상처 치유와 같은 효능에 대해서는 전혀 알려진 바 없었다. 이에, 본 발명에서는 상기 엔케팔린 변이체의 상처 치료 효능을 새롭게 밝힌 것이다. 특히, 본 발명에서는 엔케팔린의 각각의 아미노산을 알라닌으로 치환하여 제조한 5개의 엔케팔린 변이체가 모두 동일한 수준의 상처 치료 효능을 가지지는 않는 것을 확인하였으며, 서열번호 2 및 5의 아미노산 서열을 가지는 변이체, 즉, 첫 번째 아미노산인 류신을 알라닌으로 치환시킨 변이체 및 네 번째 아미노산인 페닐알라닌을 알라닌으로 치환시킨 변이체가 특히 우수한 상처 치료 또는 상처 치료의 촉진 효능을 가짐을 확인한 것이다.

본 발명의 엔케팔린 변이체는 상처 치료 또는 그의 촉진에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 상처는 생체가 손상된 것을 모두 아우르는 의미로서, 창상(創傷)이라고도 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 먼저 상처 치유에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 각질형성세포주(keratinocyte, HaCaT cell)를 이용하여, 엔케팔린 변이체의 세포 안정성을 평가하고(도 1), 각각 각질형성세포주의 세포 이동(migration)을 유도하는 활성이 뛰어남을 확인함으로써(도 2), 상처 치유 효능을 유추할 수 있었다. 또한, 다른 일 실시예에서는 이러한 확인을 바탕으로, 각질형성세포주에 엔케팔린 변이체를 각각 처리함으로써 프로콜라겐 타입I 씨-펩타이드(procollagen type I C-peptide, PIP)의 분비 정도를 통해 콜라겐(collagen)의 증식능을 확인하였고(도 3), 보습과 관련있는 유전자인 AQP3의 발현량을 비교하여 보습 효능이 뛰어남을 확인하였다(도 4). 특히, 본 발명의 서열번호 2 및 5의 아미노산 서열을 가지는 변이체가 상대적으로 우수한 상처 치유 효능을 가짐을 확인하였다.

이에, 각질형성세포주의 세포 이동 및 콜라겐 증식능에서 뛰어난 효능을 보인 서열번호 2의 AS10 및 서열번호 5의 AS13 변이체에 대하여 추가적으로 마우스 전층 피부 결손모델에서 결손 부위에 상기 엔케팔린 변이체를 주입하여, 수술 후 10일이내 창상 면적이 크게 감소함을 확인함으로써(도 5a 내지 6b), 최종적으로 본 발명의 엔케팔린 변이체가 상처 치료 용도에 적합하다는 것을 밝혔다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물은 상처 치료라는 목적상 피부 외용제의 형태로 제공되는 것이 가장 바람직할 수 있다. 구체적으로, 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 겔제 또는 에어로졸제 등의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다.

또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다. 예컨대, 상처 부위에 국부적으로 사용되는 피부 외용제인 경우에는 통상적인 첨가제, 예를 들어 보존제, 의약 침투를 보조하는 용매, 연고 및 크림의 경우 연화제 등을 포함할 수 있으며, 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 통상적 담체를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물에는, 상처 치료에 일반적으로 사용되는 화합물, 예컨대 항생제, 항염증제, 피부치료용 조제, 마취제 및 진통제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이는, 각각의 제형에 따라 약간씩 변화될 수 있으며, 바람직하게는 피부 외용제의 형태로 제공되는 경우에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 상처부위의 감염을 방지하거나 감염으로 인한 상처의 악화를 방지하기 위하여 상처부위에 항생제, 항균제 등의 약제를 공급할 수 있고, 또한 통증의 완화를 위하여 국소 마취제 및 진통제 등을 공급할 수 있으며, 상처 치유시 과도한 염증반응을 방지하기 위하여 항히스타민제와 같은 항염증제를 공급할 수 있다. 다양한 기능성 약제들을 함유시켜 공급함으로써, 사용상의 편리성을 도모하고, 효율적인 상처치유에 도움이 되는 환경을 조성함으로써 상처치유 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 상처의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 엔케팔린의 변이체를 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 엔케팔린 변이체와 그의 상처 치료 효능에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 본 발명의 조성물은 상처의 치료 또는 개선을 목적으로 의약외품에 첨가될 수 있다. 구체적으로 상기 엔케팔린 변이체는 엔케팔린의 특정 아미노산이 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 서열번호 2 또는 5의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.

본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 구강 청정제(가그린), 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 엔케팔린 변이체를 포함하는 보습용 화장료 조성물을 제공한다. 구체적으로 상기 보습 효능이 뛰어난 엔케팔린 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부재생뿐만 아니라, 피부보습 개선, 및 상처치료 효과를 나타내는 것이며, 이에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드를 함유하는 향장 제품, 화장수, 크림, 로오숀 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 펩타이드의 함량은 피부재생 및 상처제거를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ∼ 10 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01 ∼ 1 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 또는 스프레이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 무기염류, 색소, 산화방지제, 살균제, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 엔케팔린 변이체인 서열번호 2 또는 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 제공한다. 상기 서열번호 2 및 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 전술한 바와 같이, 우수한 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 용도, 및 보습 용도 등을 가지며, 본 발명자들에 의해 최초로 제조된 펩타이드이다.

본 발명에 따른 펩타이드는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 펩타이드 합성기를 이용한 화학합성 방법으로 제조할 수 있다. 본 합성에 사용된 아미노산 잔기는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기가 모두 가능하다.

본 발명의 엔케팔린 변이체를 포함하는 조성물은 인간 각질형성세포주의 세포 이동 및 콜라겐 증식을 유도함으로써 상처 치료 효능이 뛰어나, 상처 치료를 위한 피부 외용제를 비롯한 의약품 등에 적용되어 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 엔케팔린 변이체에 대한 세포독성을 확인한 그래프이다. MTT assay를 통해 세포 생존율(%)을 분석하였다.
도 2a은 본 발명의 엔케팔린 변이체에 의한 각질형성세포주의 세포 이동을 촉진하는 효능을 확인하기 위해 긁힌 면적을 형태학적으로 비교한 사진이며, 도 2b는 상기 결과를 Image J 프로그램을 이용하여 회복한 면적비를 구하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명의 엔케팔린 변이체에 의한 각질형성세포주의 콜라겐 증식능을 나타낸 그래프이다. Procollagen Type Ⅰ C-Peptide EIA kit(Takara, Cat.# MK101)를 사용하여 Procollagen Type Ⅰ C-Peptide(PIP)의 secretion 되는 정도를 측정하였다.
도 4은 본 발명의 엔케팔린 변이체에 의한 각질형성세포주의 보습 효능을 나타낸 그래프이다. RT-PCR을 통해 보습과 관련있는 유전자인 AQP3의 mRNA 발현량을 비교하였다.
도 5a 및 5b은 마우스 전층 피부 결손 모델에서 엔케팔린 변이체 투여군의 상처 크기 시간 감소 효과를 나타내는 그래프이다. 각각 수술 후 2일, 4일, 7일 및 10일에 상처 크기를 측정하였으며, 도 5a는 AS10 변이체, 5b는 AS13 변이체 투여군에 관한 그래프이다.
도 6a 및 6b은 마우스 전층 피부 결손 모델에서 대조군과 엔케팔린 변이체 투여군의 상처 치료 효과를 나타내는 사진이다. 도 6a는 왼쪽부터 각각 수술 후 0일, 2일, 4일, 7일 및 10일의 사진으로, 사진별로 좌측이 AS10 변이체 투여군, 우측이 대조군을 나타내며, 도 6b는 왼쪽부터 각각 수술 후 2일, 4일, 7일 및 10일의 사진으로, 사진별로 좌측이 대조군, 우측이 AS13 변이체 투여군을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 엔케팔린 변이체 합성

엔케팔린 변이체의 상처 치유 효능을 확인하기 위해, 류신-엔케팔린(YGGFL, 서열번호 1)을 기본으로 하여 각 아미노산을 알라닌으로 치환하여 엔케팔린 펩타이드 변이체를 합성하였다. 본 발명의 엔케팔린 펩타이드 변이체의 합성은 다음의 단계를 거쳐 완성할 수 있다. 1) 통상의 고체상 펩타이드 합성법(Solid-phase peptide synthesis;SPPS)에 의해 NH2-보호된 아미노산 잔기-레진을 수득하는 단계; 2) Cleavage 용액을 이용하여 레진으로부터 보호기가 제거된 펩타이드를 수득하는 단계; 3) 얻어진 정제되지 않은 펩타이드를 hplc를 이용하여 정제하는 단계를 포함하여 제조 할 수 있다.

보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 서열번호 1의 루신-엔케팔린(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)을 기본으로 하여 각 아미노산의 위치를 알라닌으로 치환한 펩타이드를 합성하였다.

서열번호 2의 엔케팔린 변이체는 9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하여 통상의 고체상 펩타이드 합성법에 의해 합성하였으며, 레진은 Fmoc으로 아미노기가 보호된 루신이 결합된 Wang레진을 사용하였다. 아미노산 잔기의 연장은 N-히드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole; HOBt)과 N.N'-디이소프로필카보다이이미드(N,N'-Diisopropyl carbodiimide; DIC)를 활성제로 사용하여 반응하였다. 각 단계별 결합시 사용된 아미노산과 HOBt, DIC는 레진의 5당량을 사용하였고, 실온에서 2시간동안 반응하였다. 반응 종료 후 DMF(Dimethylformamide)로 6회 세척 후 DCM(Dichloromethane)으로 6회 세척한 다음 레진을 건조 시켰다.

건조된 펜타펩타이드인 AGGFL-Resin을 트리플루오로아세트산:트리아이소프로필실란:물(90:5:5(v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2시간 동안 반응시켜 펩타이드를 레진으로부터 분리시킨 다음 차가운 에테르(Ether)로 상기 펩타이드를 침전시켜 원심분리기를 이용하여 crude peptide를 얻었다. 수득한 AGGFL 펜타펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse-phase high performance liquid chromatography, column: Gemini, C18, 5 μ, 110Å, 250*21.2mm)로 분리 정제하였다(수율 : 60.1 %).

서열번호 3의 엔케팔린 변이체는 상기 서술된 방법에 따라 NH2-보호된 펩타이드(Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu)-레진을 합성하였다. 반응 종료 후 DMF(Dimethylformamide)로 6회 세척 후 DCM(Dichloromethane)으로 6회 세척한 다음 레진을 건조 시켰다. 건조된 펜타펩타이드인 YAGFL-Resin을 트리플루오로아세트산:트리아이소프로필실란:물(90:5:5(v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2시간 동안 반응시켜 펩타이드를 레진으로부터 분리시킨 다음 차가운 에테르(Ether)로 상기 펩타이드를 침전시켜 원심분리기를 이용하여 crude peptide를 얻었다. 수득한 YAGFL 펜타펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse-phase high performance liquid chromatography, column: Gemini, C18, 5 μ, 110Å, 250*21.2mm)로 분리 정제하였다(수율 : 56.2 %)

서열번호 4의 엔케팔린 변이체는 상기 서술된 방법에 따라 NH2-보호된 펩타이드(Tyr-Gly-Ala-Phe-Leu)-레진을 합성하였다. 반응 종료 후 DMF(Dimethylformamide)로 6회 세척 후 DCM(Dichloromethane)으로 6회 세척한 다음 레진을 건조 시켰다. 건조된 펜타펩타이드인 YGAFL-Resin을 트리플루오로아세트산:트리아이소프로필실란:물(90:5:5(v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2시간 동안 반응시켜 펩타이드를 레진으로부터 분리시킨 다음 차가운 에테르(Ether)로 상기 펩타이드를 침전시켜 원심분리기를 이용하여 crude peptide를 얻었다. 수득한 YGAFL 펜타펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse-phase high performance liquid chromatography, column: Gemini, C18, 5 μ, 110Å, 250*21.2mm)로 분리 정제하였다(수율 : 63.5 %)

서열번호 5의 엔케팔린 변이체는 상기 서술된 방법에 따라 NH2-보호된 펩타이드 (Tyr-Gly-Gly-Ala-Leu)-레진을 합성하였다. 반응 종료 후 DMF(Dimethylformamide)로 6회 세척 후 DCM(Dichloromethane)으로 6회 세척한 다음 레진을 건조 시켰다. 건조된 펜타펩타이드인 YGGAL-Resin을 트리플루오로아세트산:트리아이소프로필실란:물(90:5:5(v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2시간 동안 반응시켜 펩타이드를 레진으로부터 분리시킨 다음 차가운 에테르(Ether)로 상기 펩타이드를 침전시켜 원심분리기를 이용하여 crude peptide를 얻었다. 수득한 YGGAL 펜타펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse-phase high performance liquid chromatography, column: Gemini, C18, 5 μ, 110Å, 250*21.2mm)로 분리 정제하였다(수율 : 54.8 %)

서열번호 6의 엔케팔린 변이체는 상기 서술된 방법에 따라 NH2-보호된 펩타이드 (Tyr-Gly-Gly-Phe-Ala)-레진을 합성하였다. 반응 종료 후 DMF(Dimethylformamide)로 6회 세척 후 DCM(Dichloromethane)으로 6회 세척한 다음 레진을 건조 시켰다. 건조된 펜타펩타이드인 YGGFA-Resin을 트리플루오로아세트산:트리아이소프로필실란:물(90:5:5(v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2시간 동안 반응시켜 펩타이드를 레진으로부터 분리시킨 다음 차가운 에테르(Ether)로 상기 펩타이드를 침전시켜 원심분리기를 이용하여 crude peptide를 얻었다. 수득한 YGGFA 펜타펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse-phase high performance liquid chromatography, column: Gemini, C18, 5 μ, 110Å, 250*21.2mm)로 분리 정제하였다(수율 : 62.6 %)

상기에서 합성한 엔케팔린 변이체를 다음 표 1에 나타내었다.

서열번호	이름	아미노산 서열
1	L-Enk	YGGFL
2	AS10	AGGFL
3	AS11	YAGFL
4	AS12	YGAFL
5	AS13	YGGAL
6	AS14	YGGFA

실시예 2: 엔케팔린 변이체의 세포독성 확인

상기 실시예 1에서 제조한 엔케팔린 변이체의 상처 치료 효능을 확인하기 위하여, 먼저 각질형성세포주에 미치는 세포 독성을 확인하였다.

구체적으로, 1.0ㅧ10⁵ 세포/24 well 플레이트로 분주한 인간 각질형성세포주 HaCat 세포를 우태아 혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)을 포함하지 않는 DMEM 배지에서 24시간동안 배양하였다. 이어서, 상기 배지에 엔케팔린 변이체 5종을 각각 10, 25, 50 또는 100 μM의 농도로 처리하였다. 시료 처리 24시간 후 5 mg/ml MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl Tetrazolium Bromide) 시약을 40μl/well 처리하고 4시간 동안 배양하였다. 4시간 뒤 배지를 제거하고, DMSO를 1 ml씩 넣고 10분간 흔들어 세포내 형성된 포르마잔 결정을 용해시키고 이를 각각 96well에 200μl씩 취하여 Spectrophotometer(Thermo)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도는 물질을 녹인 용매를 대조군으로 하여 측정된 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

세포안정성 (%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) × 100 (%)

시료 자체의 세포 독성을 확인하고자 인간 각질형성세포주를 사용하여 MTT assay를 수행하였다. 그 결과 엔케팔린과 엔케팔린 변이체 모두 세포 독성에 큰 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다(도 1). AS12의 경우 오히려 세포생존율이 증가하여 세포증식에 영향을 미침을 예상할 수 있다. 이러한 독성을 보이지 않는 결과를 토대로 10, 25, 50μM의 농도에서 이후의 실험을 진행하였다.

실시예 3: 엔케팔린 변이체의 세포 이동(cell migration) 효능 확인

엔케팔린 변이체의 상처 회복능과 관련하여, 각질형성세포주의 세포 이동 효능을 확인하였다.

구체적으로, 1.5×10⁵ 세포/12 well 플레이트로 분주한 각질형성세포주 HaCat 세포를 10%(v/v)의 우태아 혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)을 포함하는 DMEM 배지에서 24시간동안 배양한 후, FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고 각 well에 p200 피펫 칩으로 "긁힘-손상"을 유도하였다. "긁힘-손상"된 HaCat 세포층에 상기 엔케팔린 변이체를 20 μM의 농도로 처리한 후, 0시간대(T0)에 세포층의 이미지를 광학 현미경 사진으로 찍고, 20시간 동안 37℃, 5% CO₂의 조건으로 추가배양하였다. 20시간 동안 추가배양 후 배지를 제거하고, 고정액(4% 파라포름알데히드)을 넣고 15분간 상온에서 인큐베이션하고 PBS로 3번 세척하였다. 고정화된 세포는 광학 현미경으로 찍었다(Digital inverted microscope, AME-12111; Advanced Microscopy Group, USA).

그 결과, 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, 엔케팔린 변이체 5종을 처리한 실험군에서, 20시간 추가 배양한 경우 음성 대조군(T20)과 비교하였을 때, 상기 "긁힘-손상"이 치유되어 긁힌 면적이 감소되었음을 확인할 수 있었다. 도 2a는 긁힌 면적을 형태학적으로 비교한 사진이며, 도 2b는 상기 결과를 Image J 프로그램을 이용하여 회복한 면적비를 구하여 그래프로 나타낸 결과이다. 다만, 모든 변이체가 동등한 수준의 효과를 보이지는 않으며, AS10 및 AS13 변이체가 상대적으로 높은 수준의 효능을 가져, 류신-엔케팔린 양성 대조군(L-ENK)과 유사한 수준의 세포 이동 촉진 효능을 가짐을 확인할 수 있었다. 반면, AS12, AS14 변이체의 경우는 음성 대조군과 비슷한 정도로 거의 세포 이동에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 2a 및 2b).

실시예 4: 엔케팔린 변이체의 콜라겐 증식능 확인

엔케팔린 변이체의 프로콜라겐(procollagen) 합성 분석은 Procollagen Type Ⅰ C-Peptide EIA kit(Takara, Cat.# MK101)를 사용하여 측정하였다. 인간섬유아세포(CCD986sk, fibroblast)를 5 × 10⁴세포/well로 48 well 플레이트에 분주한 후, 24시간동안 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하고, 24시간이 지난 후 FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고 엔케팔린 변이체 5종을 각각 농도별로 처리하였다. 시료 처리 48시간 후 항체가 코팅된 마이크로티터플레이트(microtiterplate)를 얼음에 둔 상태에서 100 μl의 항체-POD 컨쥬게이트 용액을 각 well에 넣고 세포가 평판되어 있는 well에서 배지를 E-tube에 옮긴 후 원심분리하여 상층액 20μl를 각각 넣어 잘 흔들어 섞어준 뒤 랩(wrap)으로 덮어 37℃에서 3시간동안 인큐베이션시켰다. 용액을 제거하고 300μl의 냉각시킨 PBS로 4회 세척하였다. 마지막 세척 한 후 PBS를 완전히 제거하였다. 각 well에 100ul 기질 용액을 벽면에 떨어뜨린 후, 15분간 호일로 덮은 채 실온에서 반응시켰다. 색이 변하는 것을 확인한 후 100ul 반응종결 용액(1N H₂SO₄)을 각 well의 벽면에 떨어뜨린 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포내 콜라겐 합성율(%) = (각 시료액의 흡광도/음성 대조군의 흡광도) × 100(%)

그 결과, AS10을 50μM 처리하였을 때 PIP 값이 확연히 증가하는 것을 관찰하였다. 또한 AS13의 경우에도 변이체의 처리 농도가 증가할수록 PIP 양이 증가하였다. 반면에 엔케팔린(L-Enk) 및 AS12, AS14 변이체를 처리하였을 때 PIP 양에 큰 변화가 없음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 서열번호 2의 엔케팔린 변이체(AS10) 및 서열번호 5의 엔케팔린 변이체(AS13)가 콜라겐 증식능에 영향을 미침을 확인하였다(도 3).

실시예 5: 엔케팔린 변이체의 보습 효능 확인

인간 각질형성세포주(HaCaT)를 96 well 플레이트에 5 × 10⁴세포/well로 분주하고 24시간 후 배지를 제거한 다음, FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교환 후 엔케팔린 변이체 5종을 각각 농도별로 처리하고 24시간동안 추가 배양하였다. 24시간 후 RNA를 추출하여 원하는 mRNA level에서 확인하였다.

RNA 추출과 cDNA 합성은 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO Cat.# SCQ-101)이용하였다. 배지를 제거한 세포는 PBS로 한번 세척하고, 50μl 세포 용해용 혼합물(lysis buffer에 gDAN remover를 첨가한 mixture)을 넣고 실온에서 5분간 인큐베이션한 후 반응종결 버퍼를 넣어 반응을 멈추게 하여 얼음에 보관하였다. RT 반응 혼합물 32μl에 추출한 mRNA 8μl를 취하여 넣고 PCR를 수행하여 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 37℃ 15min, 50℃ 5min, 98℃ 5min에서 수행하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 템플레이트로 하여 Thunderbird™ SYBR qPCR Mix(TOYOBO Cat.# QPS-201)의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine(Qiagen)으로 진행하였다. 실험에 사용한 프라이머들은 Qiagen의 QuantiTect primer assays를 사용하였다. 상대적인 발현율은 Housekeeping gene (GAPDH, Cat.# QT01192646)로 표준화하였다. Real-time PCR 조건은 역전사 단계(50℃ 30분) 및 PCR 초기 반응 단계(95℃ 15분) 후, 변성(denaturation) 94℃ 15초, 풀림(annealing) 60℃ 30초 및 확장(extension) 72℃ 30초, 3단계를 45회 반복하여 수행하였다.

발현율(fold) = (시료 처리군의 발현율)/(대조군의 발현율)

보습과 관련있는 유전자인 AQP3의 발현량을 비교하여 시료에 의한 보습 효능을 확인하고자 실험을 수행하였으며. 그 결과 엔케팔린 변이체에서 무처리군에 비해 AQP3의 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 특히 AS13 변이체의 경우 무처리군보다 2배 이상 AQP3의 mRNA 발현이 증가하는 것을 관찰하였고, 이를 통해 서열번호 5의 엔케팔린 변이체(AS13)가 보습관련 효능에 가장 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있었다(도 4).

상기 본 발명의 실시형태에 따라 동일하게 알라닌으로의 치환을 일으킨 5개의 엔케팔린 변이체가 모두 동일한 수준의 상처 치료 효능을 가지지는 않는 것을 확인하였으며, 서열번호 2(AS10) 및 5(AS13), 즉, 첫 번째 아미노산인 류신을 알라닌으로 치환시킨 변이체 및 네 번째 아미노산인 페닐알라닌을 알라닌으로 치환시킨 변이체가 특히 세포 이동 유도 및 콜라겐 증식을 통한 우수한 상처 치료 효능을 가짐을 확인하였으며, 추가적으로 서열번호 5의 변이체가 보습관련 효능에 효과가 있음을 밝혔다. 따라서 이하에서, 상기 서열번호 2 및 5의 변이체에 대한 in vivo 실험을 통해 상처 치료의 효과를 확인하고자 하였다.

실시예 6: 피부 상처 마우스 모델에서 엔케팔린 변이체의 상처 치료 효과 확인

상처 재생 실험을 위하여 20 마리의 마우스(C57BL/6N, 5 week males, 18g)를 졸레틸과 럼푼을 이용하여 마취하였다. 등 부분의 털을 제모기와 제모크림을 이용하여 완전히 제거한 후 피부 생검펀치(직경 8mm)와 수술용 칼을 이용하여 등 피부 조직의 좌 (실험군 또는 대조군), 우(실험군 또는 대조군)에 각각 8mm 직경의 전층 피부 결손을 만들었다. 실험군(좌 또는 우)은 피부 결손 부위에 엔케팔린 변이체를 100ul 주입 (200ug/ml)하고 대조군는 100 ul 의 생리식염수를 주입하였다. 피부결손 부위는 탈수를 막기 위하여 Tegaderm (3M Health Care, St. Paul) 붙여 놓았다. 상처의 크기를 10일에 걸쳐서 2~3일 간격으로 디지털 카메라를 통해 측정하였다. 카메라의 위치에 따른 오차를 줄이기 위하여 스탠드를 이용하여 특정 거리에 카메라를 고정시켰다. 디지털 사진은 Image J program 을 통해 확인하여 상처 크기를 계산하였으며, 수술 후 2일, 4일, 7일 및 10일에 상처의 크기를 측정하여 평균을 계산하였다.

그 결과, 도 5a(AS10 변이체) 및 5b(AS13 변이체)에 나타난 바와 같이, 엔케팔린 변이체를 투여한 군에서는 대조군에 비하여 상처 크기가 빠르게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 6a(AS10 변이체) 및 도 6b(AS13 변이체)에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 엔케팔린 변이체를 투여한 군(도 6a, 좌측; 6b, 우측)에서 상처 치료 효과가 육안 상으로 관찰될 정도로 우수한 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는, 상기의 in vitro 실험 결과를 뒷받침하는 것으로서, 본 발명의 서열번호 2(AS10) 및 5(AS13)의 엔케팔린 변이체가 우수한 상처 치료 효능을 가진다는 것을 입증하는 것이다.

<110> GIL MEDICAL CENTER BIO-FD&C <120> Composition for Wound Healing Comprising Enkephalin Variant <130> KPA141194-KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu-Enkephalin <400> 1 Tyr Gly Gly Phe Leu 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AS10 Enkephalin Variant <400> 2 Ala Gly Gly Phe Leu 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AS11 Enkephalin Variant <400> 3 Tyr Ala Gly Phe Leu 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AS12 Enkephalin Variant <400> 4 Tyr Gly Ala Phe Leu 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AS13 Enkephalin Variant <400> 5 Tyr Gly Gly Ala Leu 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AS14 Enkephalin Variant <400> 6 Tyr Gly Gly Phe Ala 1 5

Claims (7)

1. 서열번호 2 또는 5의 아미노산 서열로 구성된 엔케팔린 변이체를 유효성분으로 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용제의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 겔제 또는 에어로졸제인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 서열번호 2 또는 5의 아미노산 서열로 구성된 엔케팔린 변이체를 유효성분으로 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 의약외품 조성물.
   
5. 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 엔케팔린 변이체를 유효성분으로 포함하는, 보습용 화장료 조성물.
   
6. 엔케팔린 변이체인 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 용도를 가지는 것인 펩타이드.

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